AT405767B - Verfahren zur herstellung eines optischen sensors sowie schichtstruktur zur verwendung in analytischen prozessen - Google Patents
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Description
AT 405 767 B
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines optischen Sensors mit einem Substrat für grenzflächenaktive (surface enhanced) analytische Prozesse, welches Substrat auf der Oberfläche eines Trägerelementes eine Inselschicht aus voneinander getrennten Metallinsein aufweist sowie eine Schichtstruktur zur Verwendung in analytischen Prozessen.
Metallinseln in der Größe von 5 bis 50 nm, aufgebracht auf Oberflächen bzw. Grenzflächen von Trägermaterialien, können zur Verstärkung chemischer bzw. physikalischer Prozesse, beispielsweise der Fluoreszenzemission von an die Inselschicht gebundenen Fluorophoren verwendet werden. Wenn sich die Fluorophore innerhalb einer bestimmten Distanz von ca. 5 bis 25 nm von der Inselschicht befinden, treten Fluoreszenzverstärkungseffekte Surface Enhanced Fluorescence (SEF)) auf, welche das Resultat einer erhöhten lokalen elektromagnetischen Feldintensität und/oder elektromagnetischen Resonanz der Metallpartikel mit dem Fluorophor darstellen. Sie sind geeignet, die Bindung des Fluorophors an die Oberfläche des Substrates in Gegenwart von ungebundenem Fluorophor (Bulk Solution) zu messen, welcher im Gegensatz zum gebundenen nicht oder nur schwach von der Fluoreszenzverstärkung beeinflußt ist.
Die beschriebene Methode ist vor allem hilfreich in der Bestiminung jeglicher Liganden, (z. B. Antikörper, Proteine, Hormone) in einer Probe, welche mit einem oberflächengebundenen Molekül, einem sogenannten Effektor (z. B. Antigen, Antikörper oder Rezeptor) reagieren und durch Komplexbildung mit einem Fluorophor detektiert werden. Es werden somit alle Varianten der Fluoreszenz-Immunoassays (FIA) abgedeckt. Die für derartige Verfahren notwendigen Schichten aus Metallinseln wurden bisher - wie beispielsweise aus der EP-A2 0 732 583 bekannt - aufgedampft, aufgesputtert oder durch elektronenstrahllithographische Verfahren hergestellt. Die Inseln bestehen aus einem elektrisch leitenden Material und weisen einen Durchmesser <300 nm auf.
Eine biorekognitive Schicht (Schicht mit Molekülen, welche den zu messenden Analyten selektiv zu binden vermögen) ist direkt auf oder mittels einer Spacer-Schicht an der Inselschicht angeordnet. Bei der Messung wird der zu messende Analyt mit einem Fluorophor markiert und dockt an der biorekognitiven Schicht an, wo es zur Fluoreszenzverstärkung kommt. Die gemessene Fluoreszenzintensität ist ein Maß für die Analytkonzentration.
Weiters ist eine Fluoreszenzverstärkung mit Hilfe von Inselschichten aus Metallinseln auch aus der WO 93/02362 bekannt. Ein Trägerelement weist eine Inselstrukur von voneinander getrennten Metallinseln auf, welche von einer kontinuierlichen Kopplungsschicht bedeckt sind. Die Kopplungsschicht trägt erste Partner eines Immunoassays, dessen zweiter Partner in der Probe vorliegt oder als Produkt eines analytischen Verfahrens anfällt. Die Dicke der Kopplungsschicht ist auf die optimale Verstärkung, bespielsweise der Fluoreszenzausbeute, optimiert. Als besonders vorteilhaft wird die Aufbringung der Metallinseln durch Aufdampfen in Vakuum beschrieben.
In einem anderen Zusammenhang sind derartige Inselschichten auch aus der EP-A1 0 677 738 bekannt geworden. Dieser Sensor ist schichtförmig aufgebaut, und besteht aus einer Spiegelschicht, einer reaktiven, insbesondere quellfähigen Matrix und einer Schicht aus einer Vielzahl von Inseln aus elektrisch leitendem Material, wobei der Durchmesser der Inseln kleiner ist, als die Wellenlänge des für die Betrachtung bzw. Auswertung verwendeten Lichtes. Bei einem derartigen Sersor wird die Eigenschaft von Sensormaterialien ausgenutzt, unter dem Einfluß der jeweils vorliegenden chemischen Umgebung das Volumen reversibel zu verändern, d. h. zu quellen bzw. zu schrumpfen. Ein derartiges Quellen bzw. Schrumpfen führt beim optochemischen Sensor gemäß EP 0 677 738 zu einer Veränderung der optischen Dicke zwischen der Spiegelschicht und der Inselschicht und dadurch zu meßbaren optischen Veränderungen. Die Inselschicht wird aufgedampft, aufgesputtert oder durch elektronenstrahllithographische Verfahren hergestellt.
Nachteilig bei diesen Verfahren sind die technisch aufwendigen Prozesse zur Herstellung der Inselschicht, die inhomogene Verteilung der Partikel sowie die inhomogene Partikelgröße und deren teilweise geringe chemische Stabilität.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines optischen Sensors mit einem Substrat für grenzflächenaktive analytische Prozesse, insbesondere mit einem fluoreszenzverstärkenden Substrat sowie eine Schichtstruktur zur Verwendung in analytischen Prozessen vorzustellen, welcher bzw. welche billig und einfach herzustellen sind, wobei die Inselschicht chemisch stabil sowie homogen sein soll und nur geringfügige Abweichungen in der Partikelgröße auftreten sollen.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird dadurch gelöst, - daß ein Trägerelement verwendet wird, welches Kopplungsgruppen aufweist oder zur Herstellung von Kopplungsgruppen chemisch behandelt wird, - daß eine Metallkolloidlösung hergestellt und mit der Oberfläche des Trägerelementes in Kontakt gebracht wird, - wobei die Metallkolloide mit Hilfe der Kopplungsgruppen an das Trägerelement gebunden werden und so eine homogene Inselschicht bilden, sowie 2
AT 405 767 B - daß der Überschuß an ungebundenem Kolloid entfernt wird und - daß in an sich bekannter Weise an das Substrat eine molekular rekognitive, vorzugsweise biorekogniti-ve, Schicht gebunden wird.
Allgemein wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung unter einer rekognitiven bzw. biorekognitiven Wechselwirkung die hochspezifisehe Wechselwirkung zwischen einem Effektormolekül und einem Liganden verstanden. Die Bindung der Effektor/Liganden-Paare erfolgt an sogenannten Bindungszentren des Effektormoleküls, in die der Ligand genau hineinpaßt. Eine rekognitive Schicht besteht entweder aus den Effektormolekülen oder den Liganden eines Effektor/Liganden-Paares.
Beispiele für Effektor/Liganden-Paare.
Effektor Ligand Hormonrezeptor Hormon Antikörper Antigen DNA RNA/DNA Protein DNA/RNA Enzym Substrat, Coenzym
Eine erfindungsgemäße Schichtstruktur zur Verwendung in analytischen Prozessen, welche aus einem Trägerelement besteht, an dessen Oberfläche eine Inselschicht mit einer molekular rekognitiven, vorzugsweise biorekognitiven Schicht vorliegt, ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Trägerelementes chemische Kopplungsgruppen aufweist, mit deren Hilfe Metallkolloide an das Trägerelement gebunden sind, welche die Inselschicht aus voneinander getrennten Metallinseln bilden.
Eine derartige Schiehtstruktur kann eben oder gekrümmt (z. B. Beads aus Glas oder Kunststoff) sein.
Die erfindungsgemäße Schichtstruktur eignet sich zum Aufbau verschiedener Assay-Typen, insbesondere Fluoreszenzimmunoassays, bei welchen die Immunreaktion an einer Festphase abläuft: I. Sandwich-Immunoassay:
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, daß die biorekognitive Schicht der Schichstruktur in an sich bekannter Weise aus Capture-Molekülen besteht, wobei jedes Capture-Molekül ein Analytmolekül einer zu vermessenden Probe zu binden vermag und das Analytmolekül mit einem fluoreszenzmarkierten Detektionsmolekül wechselwirkt.
Markierter Detektionsantikörper Analytmolekül (Antigen) Captu re-Antikörper
Der Analyt (z. B. Antigen), wird durch Bindung zwischen einem oberflächengebundenen Capture-Molekül (z. B. Antikörper) und einem mit einem Enzym oder Fluorophor markierten Detektionsmolekül (Detektionsantikörper) detektiert. Die Signalhöhe ist proportional zur Menge an gebundenem Analyt.
In diesem Zusammenhang ist aus der EP 0 290 269 ein Reaktionsverfahren bekannt geworden, bei welchem eine reaktive Schicht, welche Antikörpermoleküle aufweist, Analytmoleküle der zu vermessenden Probe zu binden vermag. Das Analytmolekül seinerseits wechselwirkt mit einem fluoreszenzmarkierten Detektionsmolekül, beispielsweise mit einem zweiten Antikörpermolekül. 3
AT 405 767 B II. Kompetitiver Immunoassay A:
In einer Ausführungsvariante der Erfindung ist vorgesehen, daß die biorekognitive Schicht der Schichtstruktur aus Capture-Molekulen besteht, welche kompetitiv ein Analytmolekül einer zu vermessenden Probe oder ein fluoreszenzmarkiertes Detektionsmolekül zu binden vermögen.
Der Analyt verhindert die Bindung eines fluoreszenzmarkierten Detektionsmoleküls an die mit einem Capture-Molekül (Antigen, Antikörper etc.) beschichtete Oberfläche durch direkte Konkurrenz um die Oberflächenbindungsstellen. Die Signalhöghe ist umgekehrt proportional zur Menge an gebundenem Analyt. Dabei kann das Detektionsmolekül ein Analytanalogon oder ein fluoreszenzmarkiertes Analytmolekül sein. III. Kompetitiver Immunoassay B:
In einer weiteren Ausführungsvariante der Erfindung ist vorgesehen, daß die biorekognitive Schicht der Schichtstruktur in an sich bekannter Weise aus Molekülen des zu bestiminenden Analyten besteht, welcher ein fiuoreszenzmarkiertes Detektionsmolekül zu binden vermag.
r Fiuoreszenzmarkiertes Detektionsmolekül
Analytmolekül
Bei dieser Ausführungsvariante kann das fluzoreszenzmarkierte Detektionsmolekül nur dann an ein Analytmolekül der biorekognitiven Schicht andocken, wenn nicht vorher eine Reaktion mit einem Analytmolekül in der zu vermessenden Probe erfolgt ist. Die Signalhöhe ist auch hier umgekehrt proportional zur Menge an gebundenem Analyt.
Als Trägerelement für die Schichtstruktur bzw. zur Herstellung des optischen Sensors verwendbar sind alle Materialien, an welche mit bekannten chemischen Prozessen Kopplungsgruppen, wie -OH, -NH2 oder -SH, erzeugt werden können, weiters Trägerelemente, die mit Polymeren, welche die genannten Kopplungsgruppen aufweisen, beschichtet sind, bzw. die aus Polymeren bestehen, welche die genannten Kopplungsgruppen aufweisen. In Frage kommen beispielsweise Glas, Metalle und Kunststoffe.
Erfindungsgemäß ist es insbesonders vorgesehen, daß als Trägerelement Glas oder transparente Polymere, vorzugsweise Polystyrol, Polycarbonat, PVC oder PMMA verwendet werden, welche einer Silanisierungsreaktion unterzogen werden. Unter der Voraussetzung, daß der Verstärkungsfaktor für die 4
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Fluoreszenzverstärkung durch die Metallinseln an der Oberfläche des Trägerelementes hinreichend hoch ist (bzw. wenn Fluorophore mit geringer Fluoreszenzausbeute verwendet werden), können auch opake Träger eingesetzt werden. Bei zu geringem Verstärkungsfaktor bzw. zu großer Fluoreszenzausbeute der verwendeten Fluorophore würde eine zu hohe Fluoreszenz in der Lösung (Bulk-Fluoreszenz) entstehen und die Sensibilität der Messung beeinträchtigen.
Die Metallkolloidlösung kann vorzugsweise in einer Reduktionsreaktion hergestellt werden, wobei stabilisierende Liganden, vorzugsweise EDTA, Citrat, Polyvinylalkohol oder Di- bzw. Triphenylphosphine eingesetzt werden. Durch die Gegenwart der stabilisierenden Liganden wird die Aggregations- bzw. Präzipitationsneigung der Kolloide stark gesenkt. Für die Aufbringung der Metallkolloidlösung auf die Trägerelemente können unterschiedliche Verfahren angewende werden. So kann der ggf. chemisch modifizierte Träger in die Metallkolloidlösung getaucht oder auch die Metallkolloidlösung auf das Trägerelement aufgetropft bzw. aufgesprüht werden. Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden mit Silberkolloidlösungen erzielt. Es können jedoch auch andere Edelmetallkolloide oder Aluminiumkolloid verwendet werden.
Schließlich ist in einer Ausführungsvariante der Erfindung vorgesehen, daß zur Vergrößerung der aktiven Oberfläche des Substrates Beads aus Kunststoff oder Glas als Trägerelemente verwendet werden, welche ihrerseits mittels bifunktioneller Reagentien an eine Trägerschicht gebunden werden.
1.) HERSTELLUNG EINER METALLKOLLOIDLÖSUNG
Die Herstellung erfolgt beispielsweise durch Reduktion einer AgN03-Lösung. a) Reduktion mit Natriumzitrat:
Eine Lösung aus 100 mg AgNOe in 250 ml bidestilliertem Wasser wird zum Kochen gebracht und 10 ml 1%iges Natriumzitrat (w/v) zugesetzt. Nach 5 minütiger Kochzeit erhält man eine grüne opake Lösung, welche für drei Stunden im Dunkeln gekühlt wird. UV-Spektrum: Emax = 17,8 bei 420 nm. b) Reduktion mit Natriumborhydrid (NaBH*): 100 mg AgN03 werden in 1% EDTA gelöst (w/v, bidestilliertes Wasser) und 1 ml NaBH4 (3 mg/ml, in bidestilliertem Wasser, 4'C) in Teilen zu 100 ul unter konstantem Rühren zugesetzt. Die entstehende klare gelbe Lösung wird bis zum Gebrauch kühl und dunkel gelagert. UV-Spektrum: Emax = 11,08 bei 404nm.
2.) CHEMISCHE BEHANDLUNG DER TRÄGERELEMENTE
Die Kopplungsgruppen zur Bindung der Metallkolloide an die Trägerelemente können beispielsweise durch Behandlung der Träger mit Amino- od^E Merkaptosilanen (z. B. 3-aminopropyl-methyldiethoxysilan) oder (3-merkaptopropyl-trimethoxysilan) und fluchen der Trägerelemente in Polystyrol/Amimosilan-Mi-schungen hergestellt werden. :...· a) Silanisierung bei erhöhter Temperatur:
Glasträger wurden in einen geeigneten GHsubehälter, welcher eine 10%ige (v/v) Lösung aus Silan in Toluol enthielt gegeben und im Wasserbad auf 60 *C erhitzt. Die Reaktion wurde für 45 min durchgeführt, gefolgt von intensiver Reinigung dee.Trlgers mit Azeton und Äthanol und einer 30 minütigen Trocknung bei Raumtemperatur. b) Silanisierung bei Raumtemperatur:
Glasträger wurden in eine 20%ige (v/v) Lösung aus Silan in Toluol getaucht (2 Minuten) langsam herausgezogen und eine Stunde bei Raumtemperatur getrocknet. Ein anaolger Tauchprozeß mit deioni-siertem Wasser wurde durchgeführt und eine 30 minütige Trocknungsperiode angeschlossen. c) Silanisierung in wässriger Lösung:
Eine 1 bis 10%ige wässrige Silanlösung wurde mit HCl auf einen pH = 3 eingestellt und damit 20 Minuten Polystyrol-Träger behandelt. Nach extensiver Reinigung mit deionisiertem Wasser wurden die Träger mit Druckluft getrocknet. d) Tauchüberzug aus Polystyrol:
Polystyrole unterschiedlichen Molekulargewichts (800 bis 45.000 g/mol) wurden in Azeton oder Toluol (0,3g/ml) gelöst und einer Silanisierungsmiechung aus Punkt a) oder b) in Mengen von 1 bis 10% (v/v) zugesetzt. Glasträger wurden in diese Mischung für 2 Minuten eingetaucht, langsam herausgezogen und eine Stunde bei Raumtemperatur getrocknet. Nach dem Waschen mit deionisiertem Wasser unter heftiger Bewegung der Träger wurden diese mit Druckluft getrocknet. 5
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3.) AUFBRINGUNG DER METALLKOLLOIDE AUF DIE CHEMISCH BEHANDELTEN TRÄGERELEMENTE
Das Aufbringen der Metallkolloide wurde durch Eintauchen (doppelseitig) oder durch Auftropfen der Metallkolloidlösung (einseitig) erreicht. Abhängig von der gewünschten Belegungsdichte wurden die Träger für eine Zeit von 10 bis 45 Minuten in die Kolloidlösung ein-getaucht. Die so produzierten kolloidalen Inselsubstrate wurden extensiv mit deionisierten Wasser gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet.
4.) CHARAKTERISTISCHE EIGENSCHAFTEN DER KOLLOIDALEN INSELSUBSTRATE
Die Homogenität der Kolloidschicht wurden mittels UV-Spektroskopie bei Xmax = 400 bis 420 nm, Emax = 0,3 bis 0,488 (Referenz: silanisierter, transparenter Träger) abhängig von der Tauchzeit bestirnt. Substrate mit identischem Herstellungsverfahren zeigten eine Emax-Standardabweichung von 5%.
Partikelgröße und Form der Metallkolloide: Die Bestimmung dieser Parameter kann z. B. mittels Transmissionselektronenmikroskopie durchgeführt werden.
Partikelgröße: Bei Reduktion mit NaBHi 10nm, bei Reduktion mit Natriumzitrat 50nm.
Form: sphärisch
Verteilung auf der Oberfläche des Trägerelementes: Gleichförmig, keine Cluster, Ausmaß der Bedek-kung abhängig von der Konzentration der Metallkolloidlösung und der Tauchzeit.
Chemische Stabilität: Im Absorptionsspektrum wurde nach einer einwöchigen trockenen Lagerung im Dunkeln keine Änderungen festgestellt. Weiters hat auch die Lagerung in Pufferlösungen (0,1 M Phosphatpuffer pH = 7,3, 100mM NaCI) für einige Stunden bis zu einem Tag die Substratparameter nicht geändert. Weiters wurde das Subsrat auch durch Lösungen, welche 0,05% Detergenzien enthalten, nicht angegriffen.
Im folgenden werden beispielhaft einige mögliche Bindungsmechanismen der Metallkolloide am Träger anhand der schematischen Zeichnungen Fig. 1 bis Fig. 3 beschrieben. Fig. 4 zeigt die Signalverstärkung fluoresceinmarkierter, adsorbierter Antikörper, wobei auf der Abszisse die Antikörperkonzentration in nM und auf der Ordinate die Intensität in relativen Fluoreszenzeinheiten (F.U.) angegeben ist, Fig. 5 zeigt den Signalanstieg (F.U.) über der Zeit in Sekunden für verschiedene Antigenkonzentrationen für Assays mit Kolloid (durchgezogene Linie) bzw. ohne Kolloid (strichlierte Linie) und Fig 6 einen Vergleich eines erfindungsgemäßen Sandwich-Immunoassays in Pufferlösung und einem Humanplasma-Standard.
Gemäß Fig. 1 erfolgt die Bindung der Metallkolloide M an die Oberfläche des Trägers T über ionische Wechselwirkungen, bei denen solubilisierende Liganden L1 durch oberflächengebundene Liganden L2 verdrängt werden. Es handelt sich dabei um ionische und chemisorptive Wechselwirkungen, wobei erstere dominieren dürften.
Gemäß Abbildung Fig. 2 können zur Vergrößerung der aktiven Oberfläche die Metallkolloide M auch an handelsüblichen Kunststoftbeads B, welche Kopplungsgruppen K tragen, gebunden werden, die ihrerseits mittels bifunktioneller Reagentien an eine Trägerschicht S gebunden sind.
Derivate der oben genannten stabilisierenden Liganden mit kopplungsaktiven Gruppen oder andere bifunktionelle Reagentien, die mit Metallkolloiden M, die in Fig. 1 beschriebene Ligandenverdrängungsreaktion eingehen, können gemäß Fig. 3 ebenfalls zur kovalenten Beschichtung des Trägerelementes T benutzt werden.
Aufgrund der Festigkeit und Geschwindigkeit der beschriebenen Bindungsreaktionen der Metallkolloide sind auch diverse Printmethoden (z. B. Piezodruck) auf die Trägerelemente mit oben genannten Eigenschaften anwendbar.
5.) MESSDATEN 5.1 Quantifizierung des Verstärkungseffektes
Zur Bestimmung der Größenordnung des Verstärkungseffektes wurden fluoresceinmarkierte Antikörper an einen Kunststoffträger mit und ohne Kolloid adsorbiert. Nach Entfernung überschüssiger Antikörpermo-lelküle erfolgte die Messung bei 35 *C in 25mM Phosphatpuffer/1 OOmM NaCI pH 7.0.
Meßparameter:
Lichtquelle: Xenon Blitz Lampe
Excitation/Emission: 485/535nm
Detektor: Photomultiplier
Die Signale werden als relative Fluoreszenzeinheiten (F.U.) angegeben (MW = Mittelwert, SD = Standardabweichung): 6
Claims (11)
- AT 405 767 B FITC-Antikörper (nM) 14,5 2,9 0,29 0,03 0,003 0 Kolloid auf Polystyrol MW 17117 3714 297 32 -65 0 SD.., 1394 552 102 165 165 99 Polystyrol MW 216 -70 -73 -75 -65 0 SD_, 171 56 101 87 82 121 x fache Verstärkung 79 — — — — — Es konnten somit auf Kolloid-Oberflächen Verstärkungsfaktoren von annähernd 2 Größenordnungen gefunden werden (siehe Fig. 4), und ein Detektionslimit, das 2 Zehnerpotenzen unter dem auf der Kunststoffoberfläche liegt. Vorteilhafterweise kann ohne die in der Literatur im Zusammenhang mit hei-kömmlichen Inselschichten beschriebene kohärente Anregung und ohne Totalreflexions-Geometrie gemessen werden. 5.2. Kinetische Fluoreszenz-Assays. Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung des Kolloid-Surface Enhancement Effektes liegt in der Unterscheidbarkeit des Signals oberflächengebundener fluoreszenzmarkierter Antikörper von dem der ungebundenen Moleküle, da nur das Signal ersterer durch die Metallpartikel verstärkt wird. Man spricht in diesem Zusammenhang auch von einer "Bulkunterdrückung", oder einer "Kontrasterhöhung" durch die Kolloide. Daher ist es möglich, auf kolloidbeschichteten Oberflächen die Kinetik einer Biorekognition fluoreszenzmarkierter Effektor/Liganden-Paare (z.B. Antikörper/Antigen) zu untersuchen, ohne die ungebundenen, überschüssigen Moleküle zu entfernen, die normalerweise das spezifische Oberflächensignal überdecken. Dies erlaubt die äußerst schnelle Bestimmung der Konzentration eines entsprechenden Analyten z.B. mittels Sandwich- oder kompetitiver Assay wie unter (l-lll) beschrieben. Fig. 5 zeigt das Ergebnis eines kinetischen Fluoreszenzassay, bei dem die Konzentration eines oberflächengebundenen Antigens durch Reaktion mit fluoreszenzmarkiertem Antikörper bestimmt wurde. Die dargestellten Mitteiwertkurven ergeben sich aus jeweils acht Bestimmungen pro Analytkonzentration. Es ist klar ersichtlich, daß nur auf kolicidbeschichteten Oberflächen die Kinetik der Immunreaktion verfolgbar ist, während auf den unbeschichteten Oberflächen keinerlei Signalanstieg zu beobachten ist. Es handelt sich bei dem beobachteten Effekt also eindeutig um eine oberflächenvermittelte Diskriminierung zwischen freiem und gebundenem Antikörper. 5.3. Stabilität in biologischer Matrix Einen außerordentlichen Vorteil der vorliegenden Erfindung gegenüber bereits dokumentierten Systemen stellt die Stabilität der Kolloidschichten und der vollständige Erhalt des SEF in biologischen Matrices wie Blut oder Serum ohne jegliche Art von Scfpfaschicht (z.B. Polyglutaraldehyd, Silanen, Quarzschichten etc.) dar. Fig. 6 zeigt das Meßsignal eines Sindwich-Immunoassays auf Glas/Kolloid-Substraten in 0.1 M Phosphatpuffer pH 7.3/1 OOmM NaCI/3%Milchpulver (MP/PBS) und käuflichem Humanplasma-Standard (SIGMA) mit und ohne Zusatz von 25nM Antigen. Es ist ersichtlich, daß der SEF-Effekt in bieiegischer Matrix vollständig erhalten bleibt. Der erhöhte Wert im Plasma ohne Antigenzusatz ist dadurch erfdärbar, daß der Plasma-Standard als Kontrolle für Plasmen mit erhöhtem Antigengehalt benutzt wird. Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung eines optischen Sensors mit einem Substrat für grenzflächenaktive (surface enhanced) analytische Prozesse, welches Substrat auf der Oberfläche eines Trägerelementes eine Inselschicht aus voneinander getrennten Metallinseln aufweist, dadurch gekennzeichnet, - daß ein Trägerelement verwendet wird, welches Kopplungsgruppen aufweist oder zur Herstellung von Kopplungsgruppen chemisch behandelt wird, - daß eine Metallkolloidlösung hergestellt und mit der Oberfläche des Trägerelementes in Kontakt gebracht wird, 7 AT 405 767 B - wobei die Metallkolloide mit Hilfe der Kopplungsgruppen an das Trägerelement gebunden werden und so eine homogene Inselschicht bilden, sowie - daß der Überschuß an ungebundenem Kolloid entfernt wird und - daß in an sich bekannter Weise an das Substrat eine molekular rekognitive, vorzugsweise biorekognitive, Schicht gebunden wird.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägerelement aus einem Material besteht oder mit einem Material beschichtet ist, an welches mit Hilfe chemischer Prozesse Kopplungsgruppen vorzugsweise -OH, -NH2 oder -SH, erzeugt werden, bzw. welches Material derartige Kopplungsgruppen aufweist.
- 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägerelement Glas oder transparente Polymere, vorzugsweise Polystyrol, Polycarbonat, PVC oder PMMA verwendet werden, welche einer Silanisierungsreaktion unterzogen werden.
- 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallkolloidlösung in einer Reduktionsreaktion hergestellt wird, wobei stabilisierende Liganden, vorzugsweise EDTA, Citrat, Polyvinylalkohol, Diphenylphosphine oder Triphenylphosphine eingesetzt werden.
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägerelement in die Metallkolloidlösung eingetaucht oder die Metallkolloidlösung auf das Trägerelement aufgesprüht bzw. aufgetropft wird.
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vergrößerung der aktiven Oberfläche des Substrates Beads aus Kunststoff oder Glas als Trägerelemente verwendet werden, welche ihrerseits mittels bifunktioneller Reagentien an eine Trägerschicht gebunden werden.
- 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Metallkolloidlösung eine Silberkolloidlösung verwendet wird.
- 8. Schichtstruktur zur Verwendung in analytischen Prozessen, welche aus einem Trägerelement besteht, an dessen Oberfläche eine Inselschicht mit einer molekular rekognitiven, vorzugsweise bioregkognitive Schicht vorliegt, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Trägerelementes chemische Kopplungsgruppen aufweist, mit deren Hilfe Metallkolloide an das Trägerelement gebunden sind, welche die Inselschicht aus voneinander getrennten Metallinseln bilden.
- 9. Schichtstruktur nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die biorekognitive Schicht in an sich bekannter Weise aus Capture-Molekülen besteht, wobei jedes Capture-Molekül ein Analytmolekül einer zu vermessenden Probe zu binden vermag und das Analytmolekül mit einem fluoreszenzmarkierten Detektionsmolekül wechselwirkt.
- 10. Schichtstrktur nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die biorekognitive Schicht aus Capture-Molekülen besteht, welche kompetitiv ein Analytmolekül einer zu vermessenden Probe oder ein fluoreszenzmarkiertes Detektionsmolekül zu binden vermögen.
- 11. Schichtstrutur nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die biorekognitive Schicht in an sich bekannter Weise aus Molekülen des zu bestimmenden Analyten besteht, welcher ein fluoreszenzmarkiertes Detektionsmolekül zu binden vermag. Hiezu 3 Blatt Zeichnungen 8
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EP0732583A2 (de) * | 1995-03-17 | 1996-09-18 | AVL Medical Instruments AG | Optochemischer Fluoreszenzsensor sowie ein Verfahren zur Messung der Konzentration zumindest eines Analyten in einer Probe |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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- 1998-09-17 WO PCT/AT1998/000222 patent/WO1999013993A1/de active Application Filing
Patent Citations (3)
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Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATA157497A (de) | 1999-03-15 |
WO1999013993A1 (de) | 1999-03-25 |
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