WO1999013993A1 - Verfahren zur herstellung eines optischen sensors sowie schichtstruktur zur verwendung in analytischen prozessen - Google Patents
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Abstract
Bei einem Verfahren zur Herstellung eines optischen Sensors mit einem Substrat für grenzflächenaktive (surface enhanced) analytische Prozesse, welches Substrat auf der Oberfläche eines Trägerelementes eine Inselschicht aus voneinander getrennten Metallinseln aufweist, wird vorgeschlagen, daß ein Trägerelement verwendet wird, welches Kopplungsgruppen aufweist oder zur Hestellung von Kopplungsgruppen chemisch behandelt wird, daß eine Metallkolloidlösung hergestellt und mit der Oberfläche des Trägerelementes in Kontakt gebracht wird, wobei die Metallkolloide mit Hilfe der Kopplungsgruppen an das Trägerelement gebunden werden und so eine homogene Inselschicht bilden, sowie daß der Überschuß an ungebundenem Kolloid entfernt wird und daß an das Substrat eine molekular rekognitive, vorzugsweise biorekognitive, Schicht gebunden wird.
Description
Verfahren zur Herstellung eines optischen Sensors sowie Schichtstruktur zur Verwendung in analytischen Prozessen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines optischen Sensors mit einem Substrat für grenzflächenaktive (surface enhanced) analytische Prozesse, welches Substrat auf der Oberfläche eines Trägerelementes eine Inselschicht aus voneinander getrennten Metallinseln aufweist sowie eine Schichtstruktur zur Verwendung in analytischen Prozessen.
Metallinseln in der Größe von 5 bis 50 nm, aufgebracht auf Oberflächen bzw. Grenzflächen von Trägermaterialien, können zur Verstärkung chemischer bzw. physikalischer Prozesse, beispielsweise der Fluoreszenzemission von an die Inselschicht gebundenen Fluorophoren verwendet werden. Wenn sich die Fluorophore innerhalb einer bestimmten Distanz von ca. 5 bis 25 nm von der Inselschicht befinden, treten Fluoreszenzverstärkungseffekte (Surface Enhanced Fluorescence (SEF) auf, welche das Resultat einer erhöhten lokalen elektromagnetischen Feldintensität und/oder elektromagnetischen Resonanz der Metallpartikel mit dem Flu- orophor darstellen. Sie sind geeignet, die Bindung des Fluorophors an die Oberfläche des Substrates in Gegenwart von ungebundenem Fluorophor (Bulk Solution) zu messen, welcher im Gegensatz zum gebundenen nicht oder nur schwach von der Fluoreszenzverstärkung beeinflußt ist.
Die beschriebene Methode ist vor allem hilfreich in der Bestimmung jeglicher Liganden, (z. B. Antikörper, Proteine, Hormone) in einer Probe, welche mit einem oberflächengebundenen Molekül, einem sogenannten Effektor (z. B. Antigen, Antikörper oder Rezeptor) reagieren und durch Komplexbildung mit einem Fluorophor detektiert werden. Es werden somit alle Varianten der Fluoreszenz-Immunoassays (FIA) abgedeckt. Die für derartige Verfahren notwendigen Schichten aus Metallinseln wurden bisher - wie beispielsweise aus der EP-A2 0 732 583 bekannt - aufgedampft, aufgespürter! oder durch elektronenstrahllithogra- phische Verfahren hergestellt. Die Inseln bestehen aus einem elektrisch leitenden Material und weisen einen Durchmesser <300 nm auf.
Eine biorekognitive Schicht (Schicht mit Molekülen, welche den zu messenden Analyten selektiv zu binden vermögen) ist direkt auf oder mittels einer Spacer-Schicht an der Inselschicht angeordnet. Bei der Messung wird der zu messende Analyt mit einem Fluorophor markiert und dockt an der biorekognitiven Schicht an, wo es zur Fluoreszenzverstärkung kommt. Die gemessene Fluoreszenzintensität ist ein Maß für die Analytkonzentration.
Weiters ist eine Fluoreszenzverstärkung mit Hilfe von Inselschichten aus Metallinseln auch aus der WO 93/02362 bekannt. Ein Trägerelement weist eine Inselstruktur von voneinander getrennten Metallinseln auf, welche von einer kontinuierlichen Kopplungsschicht bedeckt sind. Die Kopplungsschicht trägt erste Partner eines Immunoassays, dessen zweiter Partner in der Probe vorliegt oder als Produkt eines analytischen Verfahrens anfällt. Die Dicke der
Kopplungsschicht ist auf die optimale Verstärkung, beispielsweise der Fluoreszenzausbeute, optimiert. Als besonders vorteilhaft wird die Aufbringung der Metallinseln durch Aufdampfen in Vakuum beschrieben.
In einem anderen Zusammenhang sind derartige Inselschichten auch aus der EP-AI 0 677 738 bekannt geworden. Dieser Sensor ist schichtförmig aufgebaut, und besteht aus einer Spiegelschicht, einer reaktiven, insbesondere quellfähigen Matrix und einer Schicht aus einer Vielzahl von Inseln aus elektrisch leitendem Material, wobei der Durchmesser der Inseln kleiner ist, als die Wellenlänge des für die Betrachtung bzw. Auswertung verwendeten Lichtes. Bei einem derartigen Sensor wird die Eigenschaft von Sensormaterialien ausgenutzt, unter dem Einfluß der jeweils vorliegenden chemischen Umgebung das Volumen reversibel zu verändern, d. h. zu quellen bzw. zu schrumpfen. Ein Derartiges Quellen bzw. Schrumpfen führt beim optochemi sehen Sensor gemäß EP 0 677 738 zu einer Veränderung der optischen Dicke zwischen der Spiegelschicht und der Inselschicht und dadurch zu meßbaren optischen Veränderungen. Die Inselschicht wird aufgedampft, aufgesputtert oder durch elektronenstrahllitho- graphische Verfahren hergestellt.
Nachteilig bei diesen Verfahren sind die technisch aufwendigen Prozesse zur Herstellung der Inselschicht, die inhomogene Verteilung der Partikel sowie die inhomogene Partikelgröße und deren teilweise geringe chemische Stabilität.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung eines optischen Sensors mit einem Substrat für grenzflächenaktive analytische Prozesse, insbesondere mit einem fluoreszenzverstärkenden Substrat sowie eine Schichtstruktur zur Verwendung in analytischen Prozessen vorzustellen, welcher bzw. welche billig und einfach herzustellen sind, wobei die Inselschicht chemisch stabil sowie homogen sein soll und nur geringfügige Abweichungen in der Partikelgröße auftreten sollen.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird dadurch gelöst,
- daß ein Trägerelement verwendet wird, welches Kopplungsgruppen aufweist oder zur Herstellung von Kopplungsgruppen chemisch behandelt wird,
- daß eine Metallkolloidlösung hergestellt und mit der Oberfläche des Trägerelementes in Kontakt gebracht wird,
- wobei die Metallkolloide mit Hilfe der Kopplungsgruppen an das Trägerelement gebunden werden und so eine homogene Inselschicht bilden, sowie
- daß der Überschuß an ungebundenem Kolloid entfernt wird und
- daß an das Substrat eine molekular rekognitive, vorzugsweise biorekognitive, Schicht gebunden wird.
Allgemein wird im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung unter einer rekognitiven bzw. biorekognitiven Wechselwirkung die hochspezifische Wechselwirkung zwischen einem Effektormolekül und einem Lieganden verstanden. Die Bindung der Effektor/Liganden-Paare
erfolgt an sogenannten Bindungszentren des Effektormoleküls, in die der Ligand genau hineinpaßt. Eine rekognitive Schicht besteht entweder aus den Effektormolekülen oder den Liganden eines Effektor/Liganden-Paares.
Beispiele für Effektor/Liganden-Paare.
Eine erfindungsgemäße Schichtstruktur zur Verwendung m analytischen Prozessen, welche aus einem Trägerelement besteht, an dessen Oberfläche eine Inselschicht mit einer molekular rekognitiven, vorzugsweise biorekognitiven Schicht vorliegt, ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Trägerelementes chemische Kopplungsgruppen aufweist, mit deren Hilfe Metallkolloide an das Trägerelement gebunden sind, welche die Inselschicht aus voneinander getrennten Metallinseln bilden.
Eine derartige Schichtstruktur kann eben oder gekrümmt (z. B. Beads aus Glas oder Kunststoff) sein.
Die erfindungsgemäße Schichtstruktur eignet sich zum Aufbau verschiedener Assay-Typen, insbesondere Fluoreszenzimmunoassays, bei welchen die Immunreaktion an einer Festphase abläuft:
I. Sandwich-Immunoassay:
Erfindungsgemäß ist vorgesehen, daß die biorekognitive Schicht der Schichtstruktur aus Capture-Molekülen besteht, wobei jedes Capture-Molekül ein Analytmolekül einer zu vermessenden Probe zu binden vermag und das Analytmolekül mit einem fluoreszenzmarkierten Detektionsmolekül wechselwirkt.
Markierter Detektionsantikörper
Analytmolekül (Antigen) Capture-Antikörper
In diesem Zusammenhang ist aus der EP 0 290 269 ein Reaktionsverfahren bekannt geworden, bei welchem eine reaktive Schicht, welche Antikörpermoleküle aufweist, Analytmole- küle der zu vermessenden Probe zu binden vermag. Das Analytmolekül seinerseits wechselwirkt mit einem fluoreszenzmarkierten Detektionsmolekül, beispielsweise mit einem zweiten Antikörpermolekül.
II. Kompetitiver Immunoassay A:
In einer Ausführungsvariante der Erfindung ist vorgesehen, daß die biorekognitive Schicht der Schichtstruktur aus Capture-Molekülen besteht, welche kompetitiv ein Analytmolekül einer zu vermessenden Probe oder ein fluoreszenzmarkiertes Detektionsmolekül zu binden vermögen.
Analyt
Fluoreszenzmarkiertes Detektionsmolekül
Capture-Molekül
Der Analyt verhindert die Bindung eines fluoreszenzmarkierten Detektionsmoleküls an die mit einem Capture-Molekül (Antigen, Antikörper etc.) beschichtete Oberfläche durch direkte Konkurrenz um die Oberflächenbindungsstellen. Die Signalhöghe ist umgekehrt proportional zur Menge an gebundenem Analyt. Dabei kann das Detektionsmolekül ein Analytanalogon oder ein fluoreszenzmarkiertes Analytmolekül sein.
III. Kompetitiver Immunoassay B:
In einer weiteren Ausfuhrungsvariante der Erfindung ist vorgesehen, daß die biorekognitive Schicht der Schichtstruktur aus Molekülen des zu bestimmenden Analyten besteht, welcher ein fluoreszenzmarkiertes Detektionsmolekül zu binden vermag.
y Fluoreszenzmarkiertes /A. Detektionsmolekül
Analytmolekül
Bei dieser Ausführungsvariante kann das fluzoreszenzmarkierte Detektionsmolekül nur dann an ein Analytmolekül der biorekognitiven Schicht andocken, wenn nicht vorher eine Reaktion mit einem Analytmolekül in der zu vermessenden Probe erfolgt ist. Die Signalhöhe ist auch hier umgekehrt proportional zur Menge an gebundenem Analyt.
Als Trägerelement für die Schichtstruktur bzw. zur Herstellung des optischen Sensors verwendbar sind alle Materialien, an welche mit bekannten chemischen Prozessen Kopplungsgruppen, wie -OH, -NH2 oder -SH, erzeugt werden können, weiters Trägerelemente, die mit Polymeren, welche die genannten Kopplungsgruppen aufweisen, beschichtet sind, bzw. die aus Polymeren bestehen, welche die genannten Kopplungsgruppen aufweisen. In Frage kommen beispielsweise Glas, Metalle und Kunststoffe.
Erfindungsgemäß ist es insbesonders vorgesehen, daß als Trägerelement Glas oder transparente Polymere, vorzugsweise Polystyrol, Polycarbonat, PVC oder PMMA verwendet werden, welche einer Silanisierungsreaktion unterzogen werden. Unter der Voraussetzung, daß der Verstärkungsfaktor für die Fluoreszenzverstärkung durch die Metallinseln an der Oberfläche des Trägerelementes hinreichend hoch ist (bzw. wenn Fluorophore mit geringer Fluoreszenzausbeute verwendet werden), können auch opake Träger eingesetzt werden. Bei zu geringem Verstärkungsfaktor bzw. zu großer Fluoreszenzausbeute der verwendeten Fluorophore, würde eine zu hohe Fluoreszenz in der Lösung (Bulk-Fluoreszenz) entstehen, und die Sensibilität der Messung beeinträchtigen.
Die Metallkolloidlösung kann vorzugsweise in einer Reduktionsreaktion hergestellt werden, wobei stabilisierende Liganden, vorzugsweise EDTA, Citrat, Polyvinylalkohol oder Di- bzw. Triphenylphosphine eingesetzt werden. Durch die Gegenwart der stabilisierenden Liganden wird die Aggregations- bzw. Präzipitationsneigung der Kolloide stark gesenkt.
Für die Aufbringung der Metallkolloidlösung auf die Trägerelemente können unterschiedliche Verfahren angewandt werden. So kann der ggf. chemisch modifizierte Träger in die Metallkolloidlösung getaucht oder auch die Metallkolloidlösung auf das Trägerelement aufgetropft bzw. aufgesprüht werden. Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden mit Silberkolloidlösungen erzielt. Es können jedoch auch andere Edelmetallkolloide oder Aluminiumkolloid verwendet werden.
Schheßhch ist in einer Ausfuhrungsvariante der Erfindung vorgesehen, daß zur Vergrößerung der aktiven Oberflache des Substrates Beads aus Kunststoff oder Glas als Trägerelemente verwendet werden, welche ihrerseits mittels bifunktioneller Reagentien an eine Trägerschicht gebunden werden.
1 ) HERSTELLUNG EINER METALLKOLLOIDLÖSUNG
Die Herstellung erfolgt beispielsweise durch Reduktion einer AgN03-Losung.
a) Reduktion mit Natπumzitrat:
Eine Lösung aus 100 mg AgN03 in 250 ml bidestilliertem Wasser wird zum Kochen gebracht und 10 ml 1 %ιges Natπumzitrat (w/v) zugesetzt. Nach 5 mmütiger Kochzeit erhält man eine grüne opake Losung, welche für drei Stunden im Dunkeln gekühlt wird UV-Spektrum: Emax = 17,8 bei 420 nm.
b) Reduktion mit Natriumborhydrid (NaBH4):
100 mg AgNO3 werden in 1% EDTA gelöst (w/v, bidestilliertes Wasser) und 1 ml NaBH4
(3 mg/ml, in bidestilliertem Wasser, 4°C) in Teilen zu 100 μl unter konstantem Rühren zugesetzt. Die entstehende klare gelbe Lösung wird bis zum Gebrauch kühl und dunkel gelagert.
UV-Spektrum: E^. = 11,08 bei 404nm.
2.) CHEMISCHE BEHANDLUNG DER TRÄGERELEMENTE
Die Kopplungsgruppen zur Bindung der Metallkolloide an die Tragerelemente können beispielsweise durch Behandlung der Trager mit Ammo- oder Merkaptosilanen (z. B. 3-amιno- propyl-methyldiethoxysilan) oder (3-merkaptopropyl)-trimethoxysιlan) und Tauchen der Trägerelemente in Polystyrol/ Aminosilan-Mischungen hergestellt werden. a) Silamsierung bei erhöhter Temperatur:
Glasträger wurden in einen geeigneten Glasbehälter, welcher eine 10%ige (v/v) Lösung aus Silan in Toluol enthielt gegeben und im Wasserbad auf 60°C erhitzt. Die Reaktion wurde für 45 mm durchgeführt, gefolgt von intensiver Reinigung des Trägers mit Azeton und Äthanol und einer 30 minutigen Trocknung bei Raumtemperatur. b) Silamsierung bei Raumtemperatur.
Glasträger wurden in eine 20%ιge (v/v) Losung aus Silan in Toluol getaucht (2 Minuten) langsam herausgezogen und eine Stunde bei Raumtemperatur getrocknet. Ein anaolger Tauchprozeß mit deionisiertem Wasser wurde durchgeführt und eine 30 mmütige Trocknungsperiode angeschlossen
c) Silamsierung in wäßriger Lösung:
Eine 1 bis 10%ige wäßrige Silanlösung wurde mit HC1 auf einen pH=3 eingestellt und damit 20 Minuten Polystyrol-Träger behandelt. Nach extensiver Reinigung mit deionisiertem Wasser wurden die Träger mit Druckluft getrocknet. d) Tauchüberzug aus Polystyrol:
Polystyrole unterschiedlichen Molekulargewichts (800 bis 45.000 g/mol) wurden in Azeton oder Toluol (0,3g/ml) gelöst und einer Silanisierungsmischung aus Punkt a) oder b) in Mengen von 1 bis 10% (v/v) zugesetzt. Glasträger wurden in diese Mischung für 2 Minuten eingetaucht, langsam herausgezogen und eine Stunde bei Raumtemperatur getrocknet. Nach dem Waschen mit deionisiertem Wasser unter heftiger Bewegung der Träger wurden diese mit Druckluft getrocknet.
3.) AUFBRINGUNG DER METALLKOLLOIDE AUF DIE CHEMISCH BEHANDELTEN TRÄGERELEMENTE
Das Aufbringen der Metallkolloide wurde durch Eintauchen (doppelseitig) oder durch Auftropfen der Metallkolloidlösung (einseitig) erreicht. Abhängig von der gewünschten Belegungsdichte wurden die Träger für eine Zeit von 10 bis 45 Minuten in die Kolloidlösung eingetaucht. Die so produzierten kolloidalen Inselsubstrate wurden extensiv mit deionisierten Wasser gewaschen und bei Raumtemperatur getrocknet.
4.) CHARAKTERISTISCHE EIGENSCHAFTEN DER KOLLOIDALEN INSELSUBSTRATE
Die Homogenität der Kolloidschicht wurden mittels UV-Spektroskopie bei λmax = 400 bis 420 nm, Emax = 0,3 bis 0,488 (Referenz: silanisierter, transparenter Träger) abhängig von der Tauchzeit bestimmt. Substrate mit identischem Herstellungsverfahren zeigten eine Ema--Stan- dardab weichung von 5%.
Partikelgröße und Form der Metallkolloide: Die Bestimmung dieser Parameter kann z. B. mittels Transmissionselektronenmikroskopie durchgeführt werden.
Partikelgröße: Bei Reduktion mit NaBH4 lOnm, bei Reduktion mit Natriumzitrat 50nm.
Form: sphärisch
Verteilung auf der Oberfläche des Trägerelementes: Gleichförmig, keine Cluster, Ausmaß der Bedeckung abhängig von der Konzentration der Metallkolloidlösung und der Tauchzeit.
Chemische Stabilität: Im Absorptionsspektrum wurde nach einer einwöchigen trockenen Lagerung im Dunkeln keine Änderungen festgestellt. Weiters hat auch die Lagerung in Pufferlösungen (0,1M Phosphatpuffer pH=7,3, lOOmM NaCl) für einige Stunden bis zu einem Tag die
Substratparameter nicht geändert. Weiters wurde das Substrat auch durch Losungen, welche 0,05% Detergenzien enthalten, nicht angegriffen
Im folgenden werden beispielhaft einige mögliche Bindungsmechanismen der Metallkolloide am Träger anhand der schematischen Zeichnungen Fig. 1 bis Fig 3 beschrieben. Fig. 4 zeigt die Signalverstarkung fluorescemmarkierter, adsorbierter Antikörper, wobei auf der Abszisse die Antikorperkonzentration in nM und auf der Ordinate die Intensität in relativen Fluoreszenzeinheiten (F.U ) angegeben ist, Fig 5 zeigt den Signalanstieg (F.U.) über der Zeit in Sekunden für verschiedene Antigenkonzentrationen für Assays mit Kolloid (durchgezogene Linie) bzw. ohne Kolloid (stπchherte Linie) und Fig 6 einen Vergleich eines erfindungsgemäßen Sandwich-Immunoassays in Pufferlosung und einem Humanplasma-Standard.
Gemäß Fig. 1 erfolgt die Bindung der Metallkolloide M an die Oberfläche des Tragers T über ionische Wechselwirkungen, bei denen solubihsierende Liganden Ll durch oberflächengebundene Liganden L2 verdrängt werden Es handelt sich dabei um ionische und chemisorptive Wechselwirkungen, wobei erstere dominieren dürften.
Gemäß Abbildung Fig. 2 können zur Vergrößerung der aktiven Oberfläche die Metallkolloide M auch an handelsüblichen Kunststoffbeads B, welche Kopplungsgruppen K tragen, gebunden werden, die ihrerseits mittels bifunktioneller Reagentien an eine Trägerschicht S gebunden sind.
Derivate der oben genannten stabilisierenden Liganden mit kopplungsaktiven Gruppen oder andere bifünktionelle Reagentien, die mit Metallkolloiden M, die in Fig. 1 beschriebene Li- gandenverdrängungsreaktion eingehen, können gemäß Fig. 3 ebenfalls zur kovalenten Beschichtung des Trägerelementes T benutzt werden.
Aufgrund der Festigkeit und Geschwindigkeit der beschriebenen Bindungsreaktionen der Metallkolloide sind auch diverse Printmethoden (z. B. Piezodruck) auf die Trägerelemente mit oben genannten Eigenschaften anwendbar
5.) MESSDATEN
5.1 Quantifizierung des Verstarkungseffektes
Zur Bestimmung der Größenordnung des Verstarkungseffektes wurden fluoresceinmarkierte Antikörper an einen Kunststofftrager mit und ohne Kolloid adsorbiert. Nach Entfernung überschüssiger Antikorpermoleküle erfolgte die Messung bei 35°C in 25mM Phosphatpuf- fer/100mM NaCl pH 7.0.
Meßparameter:
Lichtquelle: Xenon Blitz Lampe
Excitation/Emission: 485/535nm
Detektor: Photomultiplier
Die Signale werden als relative Fluoreszenzeinheiten (F.U.) angegeben (MW Mittelwert, SD = Standardabweichung):
Es konnten somit auf Kolloid-Oberflächen Verstärkungsfaktoren von annähernd 2 Größenordnungen gefunden werden (siehe Fig. 4), und ein Detektionslimit, das 2 Zehnerpotenzen unter dem auf der Kunststoffoberfläche liegt. Vorteilhafterweise kann ohne die in der Literatur im Zusammenhang mit herkömmlichen Inselschichten beschriebene kohärente Anregung und ohne Totalreflexions-Geometrie gemessen werden.
5.2. Kinetische Fluoreszenz-Assays.
Ein wesentliche Vorteil der Verwendung des Kolloid-Surface Enhancement Effektes liegt in der Unterscheidbarkeit des Signals oberflächengebundener fluoreszenzmarkierter Antiköφer von dem der ungebundenen Moleküle, da nur das Signal ersterer durch die Metallpartikel verstärkt wird. Man spricht in diesem Zusammenhang auch von einer "Bulkunterdrückung", oder einer "Kontrasterhöhung" durch die Kolloide.
Daher ist es möglich, auf kolloidbeschichteten Oberflächen die Kinetik einer Biorekognition fluoreszenzmarkierter Effektor/Liganden-Paare (z.B. Antiköφer/Antigen) zu untersuchen, ohne die ungebundenen, überschüssigen Moleküle zu entfernen, die normalerweise das spezifische Oberflächensignal überdecken.
Dies erlaubt die äußerst schnelle Bestimmung der Konzentration eines entsprechenden Ana- lyten z.B. mittels Sandwich- oder kompetitiver Assay wie unter (I-III) beschrieben.
Fig. 5 zeigt das Ergebnis eines kinetischen Fluoreszenzassay, bei dem die Konzentration eines oberflächengebundenen Antigens durch Reaktion mit fluoreszenzmarkiertem Antiköφer bestimmt wurde. Die dargestellten Mittelwertkurven ergeben sich aus jeweils acht Bestimmungen pro Analytkonzentration.
Es ist klar ersichtlich, daß nur auf kolloidbeschichteten Oberflächen die Kinetik der Immunreaktion verfolgbar ist, während auf den unbeschichteten Oberflächen keinerlei Signalanstieg zu beobachten ist. Es handelt sich bei dem beobachteten Effekt also eindeutig um eine ober- flächenvermittelte Diskriminierung zwischen freiem und gebundenem Antiköφer.
5.3. Stabilität in biologischer Matrix
Einen außerordentlichen Vorteil der vorliegenden Erfindung gegenüber bereits dokumentierten Systemen stellt die Stabilität der Kolloidschichten und der vollständige Erhalt des SEF in biologischen Matrices wie Blut oder Serum ohne jegliche Art von Schutzschicht (z.B. Poly- glutaraldehyd, Silanen, Quarzschichten etc. ) dar. Fig. 6 zeigt das Meßsignal eines Sandwich- Immunoassays auf Glas/Kolloid-Substraten in 0.1M Phosphatpuffer pH 7.3/100mM NaCl/ 3%Milchpulver (MP/PBS) und käuflichem Humanplasma-Standard (SIGMA) mit und ohne Zusatz von 25nM Antigen.
Es ist ersichtlich, daß der SEF-Effekt in biologischer Matrix vollständig erhalten bleibt. Der erhöhte Wert im Plasma ohne Antigenzusatz ist dadurch erklärbar, daß der Plasma-Standard als Kontrolle für Plasmen mit erhöhtem Antigengehalt benutzt wird.
Claims
1. Verfahren zur Herstellung eines optischen Sensors mit einem Substrat für grenzflächenaktive (surface enhanced) analytische Prozesse, welches Substrat auf der Oberfläche eines Trägerelementes eine Inselschicht aus voneinander getrennten Metallinseln aufweist, dadurch gekennzeichnet.,
- daß ein Trägerelement verwendet wird, welches Kopplungsgruppen aufweist oder zur Herstellung von Kopplungsgruppen chemisch behandelt wird,
- daß eine Metallkolloidlösung hergestellt und mit der Oberfläche des Trägerelementes in Kontakt gebracht wird,
- wobei die Metallkolloide mit Hilfe der Kopplungsgruppen an das Trägerelement gebunden werden und so eine homogene Inselschicht bilden, sowie
- daß der Überschuß an ungebundenem Kolloid entfernt wird und
- daß an das Substrat eine molekular rekognitive, vorzugsweise biorekognitive, Schicht gebunden wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägerelement aus einem Material besteht oder mit einem Material beschichtet ist, an welches mit Hilfe chemischer Prozesse Kopplungsgruppen, vorzugsweise -OH, -NH2 oder -SH, erzeugt werden, bzw. welches Material derartige Kopplungsgruppen aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Trägerelement Glas oder transparente Polymere, vorzugsweise Polystyrol, Polycarbonat, PVC oder PMMA verwendet werden, welche einer Silanisierungsreaktion unterzogen werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallkolloidlösung in einer Reduktionsreaktion hergestellt wird, wobei stabilisierende Liganden, vorzugsweise EDTA, Citrat, Polyvinylalkohol, Diphenylphosphine oder Tri- phenylphosphine eingesetzt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Trägerelement in die Metallkolloidlösung eingetaucht oder die Metallkolloidlösung auf das Trägerelement aufgesprüht bzw. aufgetropft wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Vergrößerung der aktiven Oberfläche des Substrates Beads aus Kunststoff oder Glas als Trägerelemente verwendet werden, welche ihrerseits mittels bifunktioneller Reagentien an eine Trägerschicht gebunden werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Metallkolloidlösung eine Silberkolloidlösung verwendet wird.
8. Schichtstruktur zur Verwendung in analytischen Prozessen, welche aus einem Trägerelement besteht, an dessen Oberfläche eine Inselschicht mit einer molekular rekognitiven, vorzugsweise bioregkognitive Schicht vorliegt, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Trägerelementes chemische Kopplungsgruppen aufweist, mit deren Hilfe Metallkolloide an das Trägerelement gebunden sind, welche die Inselschicht aus voneinander getrennten Metallinseln bilden.
9. Schichtstruktur nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die biorekognitive Schicht aus Capture-Molekülen besteht, wobei jedes Capture-Molekül ein Analytmolekül einer zu vermessenden Probe zu binden vermag und das Analytmolekül mit einem fluoreszenzmarkierten Detektionsmolekül wechselwirkt.
10. Schichtstruktur nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die biorekognitive Schicht aus Capture-Molekülen besteht, welche kompetitiv ein Analytmolekül einer zu vermessenden Probe oder ein fluoreszenzmarkiertes Detektionsmolekül zu binden vermögen.
1 1. Schichtstruktur nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die biorekognitive Schicht aus Molekülen des zu bestimmenden Analyten besteht, welcher ein fluoreszenzmarkiertes Detektionsmolekül zu binden vermag.
Applications Claiming Priority (2)
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| AT157497A AT405767B (de) | 1997-09-17 | 1997-09-17 | Verfahren zur herstellung eines optischen sensors sowie schichtstruktur zur verwendung in analytischen prozessen |
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|---|---|
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| WO (1) | WO1999013993A1 (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000066790A1 (en) * | 1999-05-05 | 2000-11-09 | The Regents Of The University Of California | Method for detecting biological agents |
| US7919333B2 (en) | 2003-11-25 | 2011-04-05 | Magnamedics Gmbh | Spherical and magnetical silicagel carriers having an increase surface for purifying nucleic acids |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996007487A1 (en) * | 1994-09-10 | 1996-03-14 | The University Of Liverpool | Method of synthesising materials having controlled electronic, magnetic and/or optical properties |
| EP0732583A2 (de) * | 1995-03-17 | 1996-09-18 | AVL Medical Instruments AG | Optochemischer Fluoreszenzsensor sowie ein Verfahren zur Messung der Konzentration zumindest eines Analyten in einer Probe |
| US5609907A (en) * | 1995-02-09 | 1997-03-11 | The Penn State Research Foundation | Self-assembled metal colloid monolayers |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT379688B (de) * | 1982-11-22 | 1986-02-10 | List Hans | Sensorelement zur bestimmung des o2-gehaltes einer probe |
| JPS6447952A (en) * | 1987-05-06 | 1989-02-22 | Saibaafuruua Inc | Immunoassay, reagent used therefor and making thereof |
-
1997
- 1997-09-17 AT AT157497A patent/AT405767B/de not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-09-17 WO PCT/AT1998/000222 patent/WO1999013993A1/de active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996007487A1 (en) * | 1994-09-10 | 1996-03-14 | The University Of Liverpool | Method of synthesising materials having controlled electronic, magnetic and/or optical properties |
| US5609907A (en) * | 1995-02-09 | 1997-03-11 | The Penn State Research Foundation | Self-assembled metal colloid monolayers |
| EP0732583A2 (de) * | 1995-03-17 | 1996-09-18 | AVL Medical Instruments AG | Optochemischer Fluoreszenzsensor sowie ein Verfahren zur Messung der Konzentration zumindest eines Analyten in einer Probe |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000066790A1 (en) * | 1999-05-05 | 2000-11-09 | The Regents Of The University Of California | Method for detecting biological agents |
| US6589731B1 (en) * | 1999-05-05 | 2003-07-08 | The Regents Of The University Of California | Method for detecting biological agents |
| US7919333B2 (en) | 2003-11-25 | 2011-04-05 | Magnamedics Gmbh | Spherical and magnetical silicagel carriers having an increase surface for purifying nucleic acids |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATA157497A (de) | 1999-03-15 |
| AT405767B (de) | 1999-11-25 |
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