DE2366615C2 - Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in einer biologishen Probe und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in einer biologishen Probe und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens

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DE2366615C2
DE2366615C2 DE2366615A DE2366615A DE2366615C2 DE 2366615 C2 DE2366615 C2 DE 2366615C2 DE 2366615 A DE2366615 A DE 2366615A DE 2366615 A DE2366615 A DE 2366615A DE 2366615 C2 DE2366615 C2 DE 2366615C2
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Description

Dicke, eine lange Zeit. Aus wirtschaftlichen Gründen ist daher der Nachweis immunologischer Reaktionen auf einer Oberfläche unter Verwendung eines Ellipsumeters nicht für diagnostische Zwecke verwendet worden (vgl.). Americ. Chem. Soc. Vol. 59. 1937, S. 1406 u. HeI- * vetica Chimica Acta, VoI. 54/4, ? 971, S. 1208 -1217).
Es ist auch schon das als Radioimmu.ioassay bekannte Verfahren angewendet worden, um die Anwesenheit und Menge eines Proteins in einer Probe zu Lestimmen (vergl. US-PS 36 46 346, die Zeitschrift »Science«, Band 158, Seiten 1570-1572 vom 22.12.1967 und in dem Buch »Radioimmunoassay Metnods«, Herausgeber K. E. Kiikham und W. M. Hunter, Churchill Livingstone Verlag, 1971, den Artikel von Leif Wide »Solid Phase Antigen-Antibody Systems«, Seiten 405—412). In diesem Verfahren, für das es mehrere Ausführungsformen gibt, adsorbiert man z. B. ein radioaktiv markiertes Protein an einem mit Antikörper überzogenen Rohr, bestimmt das adsorbierte, radioaktiv markierte Protein anhand seiner Strahlung und errechnet daraus seine *'' Konzentration in der zu untersuchenden Probe, Allen „ Ausführungsformen ist der Einsatz radioaktiv markier-' ter Proteine gemeinsam. Das heißt, daß man immer die zum Markieren erforderlichen Isotope sowie die zur Messung der radioaktiven Strahlung erforderlichen Vorrichtungen benötigt. Damit ist dieses Verfahren relativ aufwendig.
. Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, Verfahren und Vorrichtung zum wirtschaftlichen Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in einer biologischen Probe zu schaffen.
Diese Aufgabe wird ausgehend von dem Ver/ahren der eingangs genannten Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß
35
40
a) auf das mit Protein beschichtete Substrat ein zweiter Metallüberzug aufgebracht wird, und
b) daß das Untersuchen des mit Protein beschichteten und den beiden durch die Proteinschicht/en getrennten Metallüberzügen versehenen Substrats dahingehend erfolgt, um festzustellen, ob eine oder zwei Proteinschichten auf dem Substrat vorhanden sind.
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Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Vorrichtung aus einem Substrat, das mit einem Metallüberzug versehen ist, an dem das spezifisch reagierende Protein und ggf. ein spezifisches Protein haftet, zur Durchführung des Verfahrers, dadurch gekennzeichnet, daß auf der/ den Proteinschicht/en noch ein zweiter Metallüberzug vorhanden ist.
Vorteilhafte Ausführungsformen des Verfahrens finden sich in den Unteransprüchen.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert Im einzelnen zeigt
F i g. 1 einen Ablaufplan für die Verfahrensstufen der verschiedenen Ausiührungsiormen der Erfindung,
F i g. 2 eine Seitenansicht der diagnostischen Vorrichtung entsprechend den Kästen 11 bis 14 nach F i g. 1. eo
F i g. 1 gibt einen Ablaufplan wieder, der die einzelnen Verfahrensstufen bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung zeigt Beim Lesen des Ablaufplanes von oben nach unten gibt jede vertikale Stufe eine in der Zeit nachfolgende Stufe des Verfahrens wieder. Die einzelncn horizontal angeordneten Stufen auf einer gegebenen vertikalen Höhe im Ablaufplan zeigen die alternativen Möglichkeiten für eine der angegebenen Stufen gemäß den verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung.
Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfinduni; beginnt das Verfahren mit dem Block !! oder 12 der Fig. 1, bei dem eine Platte eines Substratmaterials,das Glas, Glimmer, Kunststoff, gesintertes Siliciumdioxid, Quarz oder ein ähnliches Material sein kann, mit Metall überzogen wird, so daß man vorzugsweise einen metallisierten Glas-Objektträger erhält, der gemäß Block 13 in eine Lösung eingetaucht wird, die ein erstes interessierendes Protein enthält, das biologisch ein Antigen oder ein Antikörper sein kann und das in reiner Form erhältlich ist und das verwendet werden soll, sein entsprechendes spezifisch reagierendes Protein nachzuweisen, wobei letzteres biologisch ein Antikörper bzw. ein Antigen ist. Das erste Protein wird an den Substrat in einer monomolekularen Schicht adsorbiert. Jedes Protein wird in einer solchen monomolekularen Schicht adsorbiert, wobei eine weitere Adsorption nicht stattfindet. Das heißt, das Protein haftet am Substrat, nicht jedoch an sich selbst. Nachdem sich eine monomolekulare Schicht des Proteins auf der ganzen Oberfläche des Substrates gebildet hat, wird das beschichtete Substrat aus der Lösung des ersten Proteins herausgenommen. Die für die vollständige Beschichtung des Substrates erforderliche Zeit ist eine Funktion der Konzentration des Proteins in der Lösung und des Maßes, mit dem die Lösung gerührt wird. Beispielsweise beschichtet eine 1 °/oige Rinderserum-Albuminlösung einen Objektträger in ungefähr 30 Minuten mit einer monomolekularen Proteinschicht vollständig.
Bei der nächsten Stufe, die in Block 14 der F i g. 1 dargestellt ist, wird das Protein-beschichtete Substrat in eine Lösung eingetaucht, in der man das mit dem ersten Protein spezifisch reagierende Protein vermutet. Diese Lösung kann, und tut es üblicherweise auch, viele Bestandteile außer dem spezifisch reagierenden Protein enthalten, dessen Anwesenheit man nachweisen möchte. Es wird jedoch kein anderes als ein spezifisch reagierendes Protein an der ersten Proteinschicht auf dem Substrat haften. Ist demgemäß das spezifisch reagierende Protein nicht vorhanden, dann weist das Substrat nach dem Eintauchen in die zweite Lösung immer noch nur eine monomolekulare Proteinschicht auf. Ist andererseits das spezifisch reagierende Protein in der Lösung vorhanden, dann findet ein immunologisches Komplexieren zwischen dem ersten Protein und seinem spezifisch reagierenden Protein statt und das Substrat trägt nach einer bestimmten Zeit eine bimolekulare Proteinschicht.
Es ist zu erwähnen, daß die in den Blocks 13 und >4 der F i g. 1 dargestellten Schritte für alle Ausführungsformen der Erfindung die gleichen sind. Die für die Adhäsion einer vollständigen zweiten molekularen Schicht an dem beschichteten Substrat erforderliche Zeit ist wieder eine Funktion der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der Lösung. Für Antikörper in Blutserum kann diese Zeit bis zu 1 Tag betragen.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Bestimmung relativer Proteinfilmdicken durch elektrische Maßnahmen. Bei dieser Ausführungsform wird entweder ein metallisches Substrat ausgewählt oder ein Substrat aus einem anderen Material wird erst, wie in Block 11 der Fig. 1 gezeigt, mit einem Metallfilm beschichtet. Das Metallsubstrat oder das Metall-beschichtete Substrat wird dann gemäß den Blöcken 13 und 14, wie oben beschrieben, in Proteinlösungen eingetaucht. Die an dem Substrat haftenden
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Proteinschichten sind elektrisch isolierend. Als nächstes etwa 5 - 10~5 mm Hg auf das Glassubstrat aufgebracht,
wird eine Quecksilber- oder eine andere Elektrode auf Da die Indiumatome auf der Oberfläche des Substrates
der oberen an dem Substrat haftenden Proteinschicht eine hohe Beweglichkeit haben und das Glassubstrat
angebracht, wie in Block 16 der F i g. 1 gezeigt Die obe- nicht merklich benetzen, agglomeriert das auf das Sub-
re Proteinschicht ist entweder das erste Protein, wenn 5 strat aufgedampfte Indium zu kleinen Teilchen. Jedes
die zweite Lösung nicht das erwartete spezifisch reagie- Metall, das ähnliche Eigenschaften hat und Kügelchen
rende Protein enthalten hatte, oder die oberste Schicht auf dem Substrat bildet, wenn es durch Aufdampfen
ist das spezifisch reagierende Protein, wenn die zweite dort aufgebracht wird, kann hier verwendet werden.
Lösung ein solches enthielt. Der Metallfilm oder das Außer Indium sind Gold, Silber, Zinn und Blei erfolg-
Metallsubstrat und der Quecksilbertropfen bilden daher lo reich verwendet worden.
die beiden leitenden Platten eines elektrischen Konden- Bei einer Modifikation dieser Ausführungsform, die
sators, der durch eine isolierende Schicht getrennt ist, eine medizinisch diagnostische Vorrichtung schafft,
die entweder eine monomolekulare oder eine bimoleku- wird das die Metallkügelchen aufweisende Substrat teil-
lare Proteinschicht umfaßt. Die elektrische Kapazität weise bis zu einer ersten Tiefe in eine Lösung eines
dieses Kondensators wird dann, wie in Block 19 der 15 ersten Antigens eingetaucht Das Substrat wird in einer
Fig. 1 angegeben, unter Verwendung irgendeines ge- monomolekularen Schicht durch das erste Antigen in
eigneten bekannten Instrumentes für die Kapazitäts- dem Bereich beschichtet, der in die Lösung eingetaucht
messung bestimmt z. B. mit einer Heathkit-Impedanz- war. Dann trocknet man das Substrat und taucht bis zu
brücke, Modell IB-28. Die elektrische Kapazität solcher einer zweiten Tiefe tiefer in eine Lösung eines zweiten
Kondensatoren mit einer bimolekularen Proteinschicht 20 Antigens ein. Das zweite Antigen haftet nicht an dem
als Dielektrikum hatte einen Faktor von ungefähr 2 bis 5 ersten Antigen, wohl aber an dem durch das erste Anti-
gegenüber der Kapazität solcher Kondensatoren mit gen nicht bedeckten Teil des Substrates, der in die Lö-
einer monomolekularen Proteinschicht sung des zweiten Antigens eingetaucht wird. Danach
Es ist dem Fachmann klar, daß die Kapazitätsmes- trocknet man das Substrat wieder und taucht bis zu
sung bei der zuvor beschriebenen Ausführungsform in- 25 einer dritten und größeren Tiefe in eine Lösung eines
nerhalb 1 Minute vom Anordnen des Quecksilbert. <>p- dritten Antigens ein. Das dritte Antigen haftet an dem
fens auf der oberen Proteinschicht durchgeführt sein Teil und nur an dem Teil des Substrates, der noch nicht
muß, da die Quecksilberelektrode durch die isolierende mit dem ersten oder zweiten Antigen bedeckt ist. Das
Proteinschicht diffundiert und den Kondensator kurz- Verfahren kann für irgendeine Zahl interessierender
schließt Andererseits kann das Kurzschließen dadurch 30 Antigene wiederholt werden. Man erhält ein Substrat,
verhindert werden, daß man das Metall mit einer isolie- das mit einer Vielzahl von monomolekularen streifen-
renden Metalloxidschicht bedeckt und das Protein an förmigen Schichten verschiedener Antigene bedeckt ist.
dem Metalloxid haften läßt Durch Herstellen einer Dieser beschichtete Objektträger ist das für diagnosti-
Vielzahl von Substraten nach der in Block 13 beschrie- sehe Zwecke einsetzbare Werkzeug. Bei dem medizi-
benen Stufe und deren gleichzeitiges Eintauchen in die 35 nisch diagnostischen Verfahren wird dieser Objektträ-
Lösung, in der ein spezifisch reagierendes Protein er- ger in eine Probe von z. B. Blut üblicherweise mehrere
wartet wird, wie in Block 14 angegeben, wobei man die Stunden lang eingetaucht.
einzelnen Substrate jedoch während einer gewissen F i g. 2 gibt eine stark vergrößerte Seitenansicht eines
Dauer nacheinander aus der Lösung herauszieht kann Teiles des in der vorgenannten Ausführungsform dieser
man eine rohe quantitative Bestimmung der Konzentra- 40 Erfindung beschriebenen diagnostischen Vorrichtung
tion des spezifisch reagierenden Proteins durchführen. wieder. F i g. 2 zeigt einen Teil des Substratmaterials 31
Die Geschwindigkeit mit der sich die Schicht aus spezi- mit einer Vielzahl von darauf durch Aufdampfen aufge-
fisch reagierendem Protein bildet, ist eine Funktion der brachten Metallkügelchen 32. Die Teilchen 32 sind vor-
Knn'enü-ation des spezifisch reaeierenden Proteins in zugsweise durch Aufdampfen von Indium auf das Sub-
der Lösung. *" 45 strat 31 hergestellt wie oben beschrieben, doch können
In einer anderen verwandten Ausführungsform wird sie auch durch Verdampfen von Gold, Silber, Zinn, Blei ein Substrat mit einem Metallfilm beschichtet wie in oder eines anderen Metalles hergestellt sein, das ähnli-Block 11 der F i g. 1 abgebildet und wie bei der letzten ehe nicht benetzende und eine atomare Beweglichkeit Ausführungsform beschrieben. Dann taucht man das aufweisende Eigenschaften hat Irgendeines einer gro-Substrat in Lösungen ein, wie in den Blöcken 13 und 14 50 ßen Zahl von Metallen zeigt solche Eigenschaften, wenn dargestellt und oben beschrieben. Die nächste Stufe die Temperatur des Substrates verändert wird. Nach nach dieser Ausführungsform besteht im Beschichten dem Eintauchen in eine Lösung eines ersten Proteins der oberen Proteinschicht mit einer zweiten Metall- wird das Segment des Objektträgers, der das Substrat schicht, wie in Block 17 der F i g. 1 dargestellt und dann 31 und die Metallkügelchen 32 umfaßt mit einer monowird die so erhaltene Struktur mit reflektiertem Licht 55 molekularen Schicht von Molekülen 34 des ersten Probetrachtet wie in Block 21 der Fig. 1 dargestellt Das teins bedeckt wie in F i g. 2 allgemein bei 33 angegeben, zweite Metall wird vorzugsweise durch Elektroplattie- Die mit 33 bezeichnete Vorrichtung ist das diagnostiren aufgebracht Im wesentlichen führt diese Ausfüh- sehe Instrument, das zum Untersuchen von Lösungen rungsform zu einer Struktur, die als Diffraktionsraster auf die Anwesenheit des mit den Proteinmolekülen 34 arbeitet und der Unterschied zwischen einer monomo- 60 spezifisch reagierenden Proteins verwendet wird. Wird lekularen und einer bimolekularen Protein-Isolations- die allgemein mit 33 bezeichnete Vorrichtung dem mit schicht ist bestimmbar aus den Spektralanteilen, die im dem Protein der Moleküle 34 spezifisch reagierenden reflektierten Licht festgestellt werden können. Protein ausgesetzt dann nimmt die Vorrichtung ein
Das Aufbringen des ersten Metallüberzuges kann Aussehen an, wie es allgemein bei 35 gezeigt ist bei dem
auch dadurch erfolgen, daß man ein Metall, z. B. Indium, 65 das Substrat 31 und die Metallkügelchen 32 mit einer
wie in Block 12der Fig. 1 angegeben, durch Verdamp- bimolekularen Proteinschicht bedeckt sind, welche die
fen auf das Substrat aufbringt Das Indium z. B. wird Moleküle 34 des ersten Proteins, die die erste monomo-
langsam aus einem Tantaltiegel in einem Vakuum von Iekulare Schicht auf dem Substrat 31 und den Kugel-
chen 32 bilden und eine zweite monomolekulare Schicht
eines Proteins aus den Molekülen 36 des mit dem ersten
Protein spezifisch reagierenden Proteins umfaßt, wobei
die Moleküle 36 immunologisch mit den Molekülen 34
des ersten Proteins verbunden sind und diese erste Proteinschicht, die Metallkiigelchen und das Substrat überlagern.
Hierzu 2 Blatt Zeichnungen
10
45
50
«0
•5

Claims (7)

1 2 sehen Protein spezifisch reagierenden Proleins, um das Patentansprüche: Substratmaterial mit dem spezifisch reagierenden Pro tein zu beschichten,
1. Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit Inberührungbringen des beschichteten Subsiratmate- oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in ei- 5 rials mit der biologischen Probe und
ner biologischen Probe, mit den folgenden Stufen: Untersuchen des beschichteten Substratmaterials, um
Aufbringen eines Metallüberzuges auf ein Sub- zu bestimmen, ob das spezifische Protein daran haftet
stratmaterial, oder nicht.
Inberührungbringen des überzogenen Substrat- Die Erfindung betrifft weiter eine Vorrichtung zur
materials mit einer Lösung eines mit dem genannten io Durchführung des Verfahrens.
spezifischen Protein spezifisch reagierenden Prote- Immunologische Reaktionen sind hochspezifische ins, um das Substratmaterial mit dem spezifisch rea- biochemische Reaktionen, in denen ein als Antigen begierenden Protein zu beschichten, zeichneies erstes Protein Dich mit einem zweiten Protein
Inberührungbringen des beschichteten Substrat- verbindet, das für dieses Antigen spezifisch ist und des-
materials mit der biologischen Probe und 15 sen Antikörper genannt wird, wobei ein immunologisch
Untersuchen des beschichteten Substratmaterials, komplexiertes Protein gebildet wird. Immunologische
um zu bestimmen, ob das spezifische Protein daran Reaktionen, die innerhalb eines biologischen Systems,
haftet oder nicht, dadurch gekennzeich- wie einem tierischen Lebewesen, stattfinden, sind von
net, daß großer Bedeutung für das Tier bei der Bekämpfung von
20 Krankheit. In einem biologischen System veranlaßt der
a) auf das mit Protein beschichtete Substrat ein Eintritt eines fremden Proteins, d. h. des Antigens, das zweiter Metallüberzug aufgebracht wird und biologische System zur Erzeugung der für das entspre-
b) daß das Untersuchen des mit Protein beschich- chende Antigen spezifischen Antikörper-Proteine in eiteten und den beiden durch die Proteinschich- netn Verfahren, das bisher noch nicht vollständig vert/en getrennten Metallüberzügen versehenen 25 standen wird. Die Antikörper-Proteinmoleküle weisen Substrates dahingehend erfolgt, um festzustel- verfügbare chemische Bindestellen auf, die die am Antilen, ob eine oder zwei Proteinschichten auf dem genmolekül ergänzen, und so können das Antigen und Substrat vorhanden sind. der Antikörper sich chemisch unter Bildung eines immunologisch komplexierten Proteins verbinden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- 30 Da Antikörper durch biologische Systeme als Antzeichnet, daß das Untersuchen des beschichteten wort auf das Eindringen von fremden Proteinen erzeugt Substratmaterials mittels einer Einrichtung zum Be- werden, ist der Nachweis von in einem biologischen stimmen der elektrischen Kapazität erfolgt. System vorhandenen Antikörpern von medizinisch dia-
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekenn- gnostischem Wert bei der Bestimmung der Antigene, zeichnet, daß der erste Metallüberzug eine erste 35 denen das System ausgesetzt wurde. Umgekehrt hat Elektrode und der zweite Metallüberzug eine zweite auch der Nachweis bestimmter Antigene in einem biolo-Elektrode auf der Proteinschicht bildet und die elek- gischen System medizinisch diagnostischen Wert. Beitrische Kapazität zwischen der ersten und zweiten spiele des diagnostischen Nachweises von Antigenen Elektrode gemessen wird. sind eier Nachweis von HCG-Proteinmolekülen im Urin
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekenn- 40 zur Feststellung der Schwangerschaft und der Nachweis zeichnet, daß die zweite Elektrode durch Aufbringen der mit der Hepatitis verbundenen Antigenmoleküle im eines Quecksilbertropfens auf die Proteinschicht ge- Blut von in Aussicht genommenen Blutspendern,
bildet wird. Es ist bekannt, daß die Antikörpar-Antigen-Komple-
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- xierungsreaktion stattfindet, wenn ein Antigen an einer zeichnet, daß man das Substrat im reflektierten Licht 45 Oberfläche absorbiert ist. Die Komplexierungsreaktion betrachtet. an einer Oberfläche ist mittels eines Eilipsometers beob-
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- achtet worden. Ein Eilipsometer ist ein komplexes, spezeichnet, daß das Aufbringen der zweiten Metall- ziell zur Bestimmung der Elliptizität polarisierten Lichschicht durch Elektroplattieren erfolgt. tes brauchbares optisches Instrument, mit dessen Hilfe
7. Vorrichtung aus einem Substrat, das mit einem 50 man Filmdicken in der Größenordnung von 0,1 A mes-Metallüberzug versehen ist, an dem ein spezifisch sen kann. Eilipsometer sind teuer und erfordern ausgereagierendes Protein und ggf. ein spezifisches Prote- bildetes Bedienungspersonal. Bei Untersuchungen iniin haftet, zur Durchführung des Verfahrens nach ei- munologischer Reaktionen unter Verwendung von Einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, lipsometern, soweit sie bisher durchgeführt wurden, daß auf der/den Proteinschicht/en noch ein zweiter 55 verwendete man zwei Verfahren. Nach dem einen VerMetallüberzug vorhanden ist. fahren ließ man die zu uniersuchende Reaktion ablaufen
und ordnete dann den Objektträger, auf dem die Reak-
tion stattgefunden hatte, in einem Eilipsometer an, um
die Filmdicke zu bestimmen. Bei dem anderen Verfah-60 ren wurde der Objektträger von vornherein im Ellipso-
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen meter befestigt und man beobachtete mit dem Ellipsoder Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen meter die sich mit dem Fortschreiten der immunologi-Proteins in einer biologischen Probe mit den folgenden sehen Reaktion ändernde Filmdicke. Die Bestimmung Stufen: der absoluten Dicke erfordert eine außerordentliche
Aufbringen eines Metallüberzuges auf ein Substrat- 65 Sorgfalt. Ist andererseits die Konzentration der Antirnaterial, körper in der Lösung gering, dan erfordert die Messung
Inberührungbringen des überzogenen Substratmate- der relativen Dickenänderung, obwohl sie leichter rials mit einer Lösung eines mit dem genannten spezifi- durchzuführen ist als die Bestimmung der absoluten
DE2366615A 1972-06-26 1973-06-16 Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen Proteins in einer biologishen Probe und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens Expired DE2366615C2 (de)

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