DE2638207C2

DE2638207C2 - Verfahren zum Bilden multimolekularer immunologisch komplexierter Filme

Info

Publication number: DE2638207C2
Application number: DE19762638207
Authority: DE
Inventors: Ivar Schenectady N.Y. Giaever
Original assignee: General Electric Co
Current assignee: General Electric Co
Priority date: 1975-08-27
Filing date: 1976-08-25
Publication date: 1985-10-03
Also published as: DE2638207A1; BR7605741A; CH631549A5

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bilden multimolekularer immunologisch komplexierter Filme durch

Überziehen eines Substrates mit einer monomolekularen Schicht eines immunologisch reaktiven Antigens und einer immunologisch inerten organischen Verbindung, so daß die Antigenmoleküle durch die Moleküle der inerten organischen Verbindung voneinander getrennt sind und

Aussetzen des so überzogenen Substrates gegenüber einem wäßrigen Medium, welches den immunologisch reaktiven Antikörper spezifisch für das Antigen enthält, um eine immunologische Reaktion damit zu verursachen, bei der sich die Antikörpermoleküle mit den Antigenmolekülen verbinden und auf dem Substrat eine bimolekulare Schicht bilden.

Ein Verfahren der vorgenannten Art ist in der DE-OS 24 40 367 beschrieben.

Veröffentlichungen, die in bezug auf die vorliegende Erfindung hauptsächlich als Hintergrundmaterialien anzusehen sind, sind die folgenden:
»Optical Measurement of the Thickness of a Film Adsorbed from a Solution« in Irving Langmuir et al, in Journal of the American Chemical Society, Band 59 (JuIi bis Dezember 1937) Seite 1406,

»Immunologie and Enzymatic Reactions carried Out at a Solid-Liquid-Interface« von Alexandre Rothen, in Physiological Chemistry and Physics, Band 5 (1973) Seiten 243-258,

»interactions Among Human Biood Proteins Hi interfaces« von Leo Vroman et al, in Federation Proceedings, Band 30 Nr. 5 (September bis Oktober 1971) Seiten 1494-1502, und

The Antibody-Antigen Reaction: A Visual Observation«, von Ivar Giaevcr in The Journal of Immunology, Band 110Nr. 4 (Mai 1973) Seiten 1424-1426.

Immunologische Reaktionen sind hoch spezifische Wechselwirkungen, in denen ein Antigen mil einem zweiten biologischen Bestandteil, der spezifisch für das Antigen ist und im allgemeinen als dessen Antikörper bekannt ist, unter Bildung eines immunologischen Komplexes in Wechselwirkung tritt. Immunologische Reaktionen, die in einem biologischer. System, wie einem Tier oder Menschen stattfinden, sind lebenswichtig für die Bekämpfung von Krankheit. In einem biologischen System verursacht der Eintritt eines Fremdproteiiis, d. h. des Antigens, die Erzeugung des spezifischen Antikörperproteins für das Antigen in einem Verfahren, das derzeit noch nicht voll verstanden ist. Die Antikörperproteinmoleküle verfügen über chemische Bindestellen, welche diejenigen auf dem Antigenmolekül ergänzen, so daß sich Antigen und Antikörper unter Bildung des immunologischen Komplexes miteinander verbinden.

Die meisten Antigene sind Proteine oder sie enthalten Proteine als wesentlichen Bestandteil, während alle Antikörper Proteine sind. Proteine sind große Moleküle hohen Molekulargewichtes, und im besonderen sind sie aus Ketten von Aminosäuren bestehende Polymere. Das Antigen- und Antikörper-Protein kann je mehrere Bindestellen aufweisen. Die fünf Hauptklassen von Antikörpern (Immunoglobuline Ig G, Ig M, Ig A, Ig E und Ig D) sind augenscheinlich je durch mindestens zwei schwere (lange) Peptidketten von Aminosäuren und mindestens zwei leichte (kurze) Peptidketten von Aminosäuren charakterisiert, in denen die Bindung zwischen den Aminosäureeinheiten als Peptidbindung bekannt ist. Diftse schweren und leichten Peptidketten sind in der allgemeinen Gestalt des Buchstaben »Y« orientiert und die aktiven oder Bindestellen befinden sich an den äußersten Enden der beiden Arme des Y-förmigen Antikörpers beim Ig G Antikörper.
Zusätzlich zu der immunologischen Reaktion, die zwisehen spezifischen Protein-Antigenen und spezifischen Protein-Antikörpern stattfindet und die zur Bildung eines Protein-Antigen/Protein-Antikörper-Komplexes führt, gibt es auch andere immunologisch komplexierende Reaktionen zwischen immunologisch reaktiven Antigenen und Antikörpern. Weiter sind unter der Bezeichnung »immunologische Reaktion« auch spezifische Reaktionen zwischen anderen biologischen Teilchen, wie Enzymen und Substraten, zu verstehen. Die Begriffe »Antigen« und »Antikörper« schließen Enzyme, Substrate und ähnliche biologische Teilchen ein.

So schließen z. B. die folgenden Systeme biologische Teilchen ein, die eine immunologische Reaktion ausführen können:

Viren

Bakterien und Bakteriengifte

Pilze

Parasiten

tierisches Gewebe

tierische Körperflüssigkeiten und ähnliche.

Bei Viren sind die Antigene Virenkulturen oder Teile davon und der dazu spezifische Antikörper kann durch Verabreichen der Antigene an einen lebenden Wirt erzeugt werden. In den folgenden Virus-Systemen werden Antigen-Anlikörper-Komplexe gebildet

Röteln-Viruskultur (Antigen) —
Röteln-Virus-Antikörper,
Polio- Viruskultur (Antigen) —
Polio-Virus-Antikörper,

Kultur des die bläschenförmige Mundschleimhautentzündung verursachenden Virus (Antigen) —
Antikörper zu diesem Virus.

Bei Bakterien und Bakterientoxinen bzw. Giften sind die Antigene die jeweiligen Bakterien oder Bakterientoxine oder Teile davon und der Antikörper wird durch Injektion des Antigens in einen lebenden Wirt erzeugt Die folgenden sind veranschaulichende Beispiele der Antigen-Antikörper-Paare, die in dein erfindungsgemäßen Verfahren Anwendung finden können:

Tetanustoxoidsuspension (Antigen) —

Tetanus-/· ntikörper,

Diphtherietoxinsuspension (Antigen) —

Diphtherie-Antikörper,

Neisseria-Gonorrhocsuspension (Antigen) —

Gonorrhoe-Antikörper,

Treponema pallidumsuspension (Antigen) —

Syphilis-Antikörper.

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Bei Pilzen sind die Antigene die Extrakte von Pilzsuspensionen und der Antikörper ist der Pilz-Antikörper, der durch Injektion der Suspension in einen lebenden Wirt erzeugt wird. Antigen-Aniikörper-Komplexe von Pilz-Systemen sind durch die folgenden Beispiele veranschaulicht:

Aspergillus-Extraktsuspension (Antigen) — Aspergillus-Pilz-Antikörper.
Candida-Extraktsuspension (Antigen) —
Candida-Pilz-Antikörper.

Antigene und Antikörper in Parasiten-Systemen v/erden in ähnlicher Weise wie bei Pilzen getestet. Ein typisches Beispiel ist das System Toxoplasma gondii-Extrakt (Antigen) — Toxoplasma gondii-Antikörper.

Mit dem Begriff »Polysaccharide« wird ein System gemeint, bei dem das Antigen ein Kohlenwasserstoff-Antigen ist. Ein Beispiel eines solchen Antigen-Antikörper enthaltenden Systems ist Pneumococcus polysaccharides (Antigen) — Pneumococcus-Antikörper.

Zusätzlich zu der typischen Enzym-Enzymsubstratreaktion können Enzyme selbst oder Teile davon als Antigene benutzt werden und der Antikörper ist der jeweilige Enzym-Antikörper, der nach der Injektion durch einen lebenden Wirt gebildet wird. Beispielhafte Antigen-Antikörper-Komplexe von Enzym-Systemen sind:

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Trypsin-Extrakt — Trypsin-Antikörper
Chymotrypsin-Extrakt — Chymotrypsin-Antikörper
Pepsin-Extrakt — Pepsin-Antikörper
Ribonuclease-Extrakt — Ribonuclease-Antikörper
Thrombin-Extrakt — Trombin-Antikörper Amylase-Extrakt — Amylase-Antikörper
Penicillinase-Extrakt — Penicilliriase-Antikörper.

Bei Hormonen wird der antigenische Bestandteil üblicherweise in einem Hormon-Extrakt gefunden und der Antikörper ist der jwcilige Hormon-Antikörper, der von einem lebenden Organismus nach der Injektion gebildet wird. Ein bespielhafter Antiger.-Antikörper-Komplex isi:

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Insulin — Insulin-Antikörper.

Immunologische Reaktionen können mit verschiedenen Techniken nachgewiesen werden einschließlich der Verwendung eines geeigneten Substrates, wie eines metallisierten Glas- oder Metall-Objektträgers. Setzt man das Substrat einem wäßrigen Medium aus, welches Antigen enthält, dann wird das Antigen physisch in einer dichten monomolekularen Schicht an der Oberfläche des Substrates adsorbiert Setzt man das Antigen-überzogene Substrat anschließend einem Serum aus, das Antikörper spezifisch zu dem Antigen enthält dann führt die* zu einer immunologischen Reaktion, bei der die Antikörper selektiv über die Bindestellen auf dem Antikörpermolekül, welche diejenigen auf dem Antigenmolekül ergänzen, an den Antigenen haften und dadurch mindestens eine bimolekulare Teilschicht immunologisch komplexierten Antigen-Antikörpers auf der Substratoberfläche bilden.

Setzt man nun das den Antigen-Antikörper-Komplex aufweisende überzogene Substrat erneut einem wäßrigen Medium aus, welches das gleiche Antigen enthält oder von dem man annimmt, daß es dieses enthält dann ergibt sich das Problem, daß nun keine weitere Bindung von Antigen an dem Antikörper stattfinden wird, da alle aktiven Stellen der Antikörper schon an der ersten Antigenschicht gebunden sind, weil die Antigenmoleküle nur einen sehr geringen Abstand voneinander haben. Das Problem bei der Oberflächenimmunologie besteht also darin, daß die an eine Antigenoberfläche gebundenen Antikörper ihre Aktivität verlieren, d. h. die Fähigkeit sich weiter mit einem Antigen, einer Zeile oder einem Virus zu verbinden.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zum Binden der eingangs genannten Art zu schaffen, bei dem das nicht-spezifische Haften weitgehend vermieden wird. Dabei soll ein solches Verfahren zum Binden von Antikörpern an eine adsorbierte Antigenschicht geschaffen werden, bei dem Bindestellen der Antikörper für eine weitere immunologische Reaktion aktiv bleiben.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß die inerte organische Verbindung Insulin ist.

Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert. Im einzelnen zeigt

F i g. 1 eine Seitenansicht eines Substrates nachdem es zuerst mit einem wäßrigen Medium behandelt worden ist, das ein Antigen enthält und danach in ein wäßriges Medium eingetaucht wurde, welches den Antikörper spezifisch zu dem Antigen enthält,

F i g. 2 eine Seitenansicht des Substrates, nachdem die beiden Stufen wie in Fig. 1 ausgeführt wurden, wobei die erste Behandlung jedoch gemäß der vorliegenden Erfindung ausgeführt wurde,

F i g. 3 eine Seitenansicht des Substrates nach F i g. 2 nach einer nachfolgenden immunologischen Reaktion, bei der das überzogene Substrat in ein wäßriges Medium eingetaucht wurde, welches das gleiche Antigen enthält und

Fig.4 eine Seitenansicht des Substrates der Fig.3 nachdem ein weiteres Eintauchen desselben in ein wäßriges Medium stattgefunden hat, das den gleichen Antikörper enthält und wobei die Antikörpermoleküle an den Enden der Ketten der Antigen-Antikörper-Komplexe antigene Stellen auf einem Virus oder einer Zelle finden, um diese immunologisch zu identifizieren.

Fig.1 zeigt eine stark vergrößerte Seitenansicht eines Teiles der diagnostischen Vorrichtung in Form einer dünnen Scheibe 10 aus einem geeigneten Substratmaterial das Metall, Glas, Glimmer, Kunststoff, glasartiges Siliciumdioxid, Quarz oder ein ähnliches Material sein kann, wobei Metall bevorzugt ist, da es den größten Unterschied im Brechungsindex zu Protein aufweist und vorzugsweise wird das Metall in Form eines Metalloder metallisierten Glas-Objektträgers verwendet.

Wird das Substrat 10 mit einem ersten wäßrigen Medium behandelt, das biologisch ein Antigen oder ein Antikörper gelöst in Salzwasser sein kann, dann weist das Substrat eine adsorbierte monomolekulare Schicht

11 davon auf. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann die Behandlung stattfinden durch Aufbringen eines Tropfens des wäßrigen Mediums oder durch teil· weises oder vollständiges Eintauchen in das wäßrige Medium.

Der Einfachheit halber wird die auf der Oberfläche des Substrates 10 adsorbierte Schicht 11 im folgenden einfach als Antigenschicht bezeichnet. Jedes Antigen oder jeder Antikörper wird in einer solchen monomolekularen Schicht adsorbiert, wobei keine weitere Adsorption stattfindet, d. h. Antigen oder Antikörper haften zwar am Substrat, nicht aber an sich selbst. Die Antigenschicht 11 kann daher nur monomolekular sein und nicht von größerer Dicke. Die für das vollständige Überziehen des Substrates mit dem Antigen erforderliche Zeit ist eine Funktion der Konzentration des Antigens in dem wäßrigen Medium, der Stärke mit der das wäßrige Medium gerührt wird und der Temperatur des Mediums. Beispielsweise überzieht eine l%ige Rinderserumalbuminlösung einen Objektträger in etwa 30 Minuten vollständig mit einer monomolekularen Antigenschicht.

Nachdem sich die monomolekulare Antigenschicht 11 auf im wesentlichen der gesamten Oberfläche des Substrates 10 gebildet hat, wird das überzogene Substrat aus dem antigenhaltigen wäßrigen Medium herausgenommen und als nächstes in ein wäßriges Medium eingetaucht, das den spezifisch reagierenden Antikörper zu dem Antigen enthält oder von dem man annimmt, daß es ihn enthält. Dieses zweite wäßrige Medium kann viele Bestandteile zusätzlich zu dem spezifisch reagierenden Antikörper enthalten, dessen Anwesenheit nachgewiesen werden soll. Es wird jedoch kein anderer Antikörper als der spezifisch reagierende Antikörper an der ersten Antigenschicht auf dem Substrat haften. Nur wenn daher der spezifisch reagierende Antikörper in dem zweiten wäßrigen Medium vorhanden ist, wird ein immunologisches Kompiexieren zwischen dem Antigen und seinem spezifisch reagierenden Antikörper stattfinden und das Substrat wird daher nach einer gewissen Zeit eine bimolekulare Schicht aufweisen. Die für das Binden der zweiten (Antikörper) monomolekularen Schicht 12 erforderliche Zeit ist wieder eine Funktion der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in dem wäßrigen Medium, der Rührstärke und der Mediumtemperatur. Für Antikörper im Blutserum kann diese Zeit in Abhängigkeit von der Konzentration Minuten dauern, aber auch bis zu einem Tag Die zweite Schicht kann eine Teilschicht oder eine im wesentlichen vollständige sein, je nach den drei vorgenannten Faktoren.

Wie in Fig. 1 veranschaulicht ist in der Antigenschicht 11, die im wesentlichen das Substrat 10 vollständig überzieht, der Abstand zwischen den benachbarten Antigenmolekülen minimal und die Antikörpermoleküle benutzen daher im wesentlichen all ihre Bindestellen, um sich mit den Antigenmolekülen zu verbinden und verlieren so ihre Aktivität, d. h. im wesentlichen alle aktiven Stellen auf den Antikörpermolekülen 12 verbinden sich mit entsprechenden aktiven Stellen auf den Antigenmolekülen 11.

Da die monomolekulare Antigenschicht 11 auf im wesentlichen der gesamten Oberfläche des Substrates 10 in Fig. 1 adsorbiert ist, verbindet sich die zweite Schicht

12 des spezifischen Antikörpers für ein solches Antigen

unter Bildung der bimolekularen Schicht damit und eine weitere Verbindung mit zusätzlichem Antigen ist nicht möglich, da keine aktiven Stellen auf den Antikörpermolekülen in der Schicht 12 verbleiben.
In der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren offenbart, mit dessen Hilfe die Antikörpermoleküle in der zweiten Schicht 12 mit den Antigenmolekülen in der ersten Schicht 11 verbunden sein können und die Antikörpermoleküle gleichzeitig verbleibende aktive Stellen behalten für ein weiteres Verbinden mit anderen Antigenmolekülen in einer weiteren immunologischen Reaktion.

Die Grundlage dieser Erfindung ist in F i g. 2 veranschaulicht und sie ist in dem Verfahren enthalten, mit dem man die anfängliche momomolekulare Schicht aus Antigenmolekülen 11 bildet, die an der Oberfläche des Substrates 10 adsorbiert ist. Zur Veranschaulichung sind die abgebildeten Antikörper von der Ig G-Klasse, doch gibt es keine Gründe, weshalb Antikörper der anderen vier Hauptklassen, wie sie oben genannt sind, in der vorliegenden Erfindung nicht benutzbar sein sollten.

Nach dem Auswählen des Substrates 10, auf dem der multimolekulare immunologisch komplexierte Film gebildet werden soll, wird das Substrat mit einem ersten wäßrigen Medium behandelt, z. B. einer Salzwasserlösung, die das Antigen enthält, wie im Falle des zu F i g. 1 beschriebenen Verfahrens. Im Gegensatz zu diesem Verfahren ist jedoch vor der Behandlung des Substrates eine immunologisch inerte organische Verbindung zu dem ersten wäßrigen Medium hinzugegeben worden, so daß die auf der Oberfläche des'Substrates 10 gebildete Adsorptionsschicht aus reaktiven Antigenmolekülen 11 besteht, die voneinander durch Moleküle 20 der inerten organischen Verbindung getrennt und von diesen umgeben sind, wie in F i g. 2 ersichtlich. Die Menge der immunologisch inerten organischen Verbindung, die zu dem wäßrigen Medium hinzugegeben wird, reicht aus, daß zwischen benachbarten Antigenmolekülen 11 an dem Substrat 10 im allgemeinen ein Abstand von mehreren hundert Angström besteht.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die inerte organische Verbindung Insulin. Die eingesetzten Konzentrationen liegen im allgemeinen im Bereich von 0,05 bis 100 mg/ml des wäßrigen Mediums, wobei die ausgewählte Konzentration von der des Antigens abhängt.

Das mit der monomolekularen Schicht aus Antigen und inertem Bestandteil überzogene Substrat 10 wird dann in ein zweites wäßriges Medium eingetaucht, welches die zu dem Antigen des ersten Mediums spezifisehen Antikörper enthält Da der Abstand zwischen den aktiven Stellen eines Antikörpermoleküls 12 (der IgG-Klasse) etwa 200 Angström beträgt, weist ein großer Teil der Antikörpermoleküle 12 des zweiten Mediums, die sich mit den Antigenmolekülen 11 verbinden, verfügbare Bindestellen auf (wobei mehr als eine aktive Stelle pro Molekül übrigbleiben kann je nach der besonderen Klasse von Antikörpermolekül) und diese bleiben aktiv für die weitere Kombination mit zusätzlichen Antigenmolekülen bei einer nachfolgenden immunologisehen Reaktion.

Irgendein Antikörpermolekül kann sich im allgemeinen nicht mit mehr als einer aktiven Stelle auf irgendeinem Antigenmolekül verbinden. Aufgrund des ausreichenden Abstandes zwischen den benachbarten Antigenmolekülen aufgrund der Moleküle der immunologisch inerten organischen Verbindung werden die Antikörpermoleküle 12 an die Antigenmoleküle 11 gebunden und im allgemeinen weist jedes Antikörpermolekül

12 noch eine aktive Verbindungsstelle 12a für eine folgende immunologische Reaktion auf.

Nachdem das Substrat 10 aus dem antikörperhaltigen wäßrigen Medium herausgenommen worden ist, wird das mit der bimolekularen Schicht überzogene Substrat 10 als nächstes in ein wäßriges Medium eingetaucht, welches das gleiche Antigen wie das erste wäßrige Medium enthält oder von dem man annimmt, daß es solches Antigen enthält und diese Antigennioleküle 30 werden dann selektiv an die verbleibenden aktiven Stellen 12a der Antikörpermoleküle 12 in einer weiteren immunologischen Reaktion gebunden. Das Ergebnis ist in Fig. 3 gezeigt. Diese Prozedur kann daher zur Analyse einer Lösung zum leichten Nachweisen der Anwesenheit eines bestimmten Antigens darin verwendet werden. Diese Prozedur kann aber auch zum Aufbauen von Ketten abwechselnder Antigen-Antikörpermoleküle verwendet werden, bei denen jede Kette ihren Ausgangspunkt an der Oberfläche des Substrates hat und einen multimolekularen immunologisch komplexierten Film aus mehreren Ketten abwechselnder Antigen-Antikörpermoleküle darauf bildet. Der multimolekular komplexierte Film ist leicht durch Betrachten des überzogenen Substrates mit einem optischen Instrument, wie einem Eilipsometer, überprüft.

Man kann den multimolekular komplexierten Film aber auch elektrisch durch Messen der Kapazität eines Kondensators bestimmen, dessen leitende Platten durch das Metall- oder das metallüberzogene Substrat und einen Quecksilbertropfen oder eine andere geeignete Elektrode gebildet werden, wobei das Kondensatordielektrikum durch die Antigen-Antikörperschichten gebildet wird.

Schließlich kann man den multimolekular komplexierten Film auch optisch mit dem bloßen Auge überprüfen, indem man die Länge der Zeit bestimmt, bevor ein sichtbares Amalgam zwischen einem Quecksilbertropfen und einem auf das Substrat aufgebrachten Metallfilm durch die dazwischen liegenden Schichten hindurch gebildet wird.

Schließlich und bedeutsamer kann der multimolekular komplexierte Film optisch mit reflektiertem oder durchgehendem Licht untersucht werden. Hierfür ist eine erste Technik der Untersuchung im durchgehenden Licht, die erfolgreich angewandt worden ist, die folgende:

Das Substrat 10 muß ein lichtdurchlässiges Substrat sein, wie Glas, Kunststoff, glasartiges Siliciumdioxid, Glimmer, Quarz und ähnliches und es besteht vorzugsweise aus Glas, wobei mikroskopische Objektträger eine bequem erhältliche Quelle sind. Dieses Substrat wird zuerst mit vielen Metallkügelchen durch Aufdampfen eines Metalles, z. B. Indium, überzogen. Das Indium wird z. B. langsam aus einem Tantaldruck in einem üblichen Vakuum von etwa 5 χ 10~⁵ mm HG aufgedampft Da die Indiumatome eine hohe Beweglichkeit auf der Oberfläche des Substrates haben und das Glassubstrat nicht merklich benetzen, agglomeriert das auf das Substrat aufgedampfte Indium zu kleinen Teilchen. Jedes Metall mit ähnlichen Eigenschaften, das Kügelchen auf dem Substrat bildet, wenn es auf dieses aufgedampft wird, kann verwendet werden. So sind außer Indium Gold, Silber, Zinn, Wismuth und Blei erfolgreich eingesetzt worden. Das Aufdampfen des Metalles wird fortgesetzt, bis das Substrat eine leicht bräunliche Farbe zeigt Zu diesem Zeitpunkt haben die Metallkügelchen Durchmesser in der Größenordnung von 1000 Angström. Die genaue Größe der Kügelchen ist nicht kritisch, doch müssen sie Durchmesser haben gleich einem großen Anteil der Wellenlängen des sichtbaren Lichtes. Die nächste Stufe besteht darin, das mit Kügelchen bedeckte Substrat 10 mit einem wäßrigen Medium zu behandeln, welches ein erstes immunologisch reaktives Antigen 11 und die inerte organische Verbindung 20 enthält. Das erste reaktive Antigen und die inerte organische Verbindung haften in einer monomolekularen Schicht auf dem Substrat und den darauf befindlichen

ίο Metallkügelchen. Hat sich eine monomolekulare Schicht gebildet, dann wird das überzogene Substrat aus dem ersten wäßrigen Medium herausgenommen und in ein zweites wäßriges Medium eingetaucht, welches den spezifisch reagierenden Antikörper 12 zu dem ersten Antigen enthält und dies führt zur Bildung einer auf dem Substrat und den Metallkügelchen haftenden bimolekularen Schicht ähnlich der in F i g. 2 gezeigten, wo lediglich die Metallkügelchen fehlen. Das überzogene Substrat wird dann aus dem zweiten wäßrigen Medium herausgenommen und in ein drittes wäßriges Medium eingetaucht, welches das gleiche reaktive Antigen wie das erste wäßrige Medium enthält oder von dem man annimmt, daß es dieses Antigen enthält und wenn das Antigen vorhanden ist, wird eine dritte Schicht oder Teilschicht auf dem Substrat gebildet Das überzogene Substrat wird dann mit durchgehendem Licht betrachtet und aufgrund des Aussehens des überzogenen Substrates wird eine Bestimmung der Dicke der daran haftenden Schicht vorgenommen und damit bestimmt, ob das vermutetete Antigen vorhanden war oder nicht. Der Nachweis der Schichten entspricht Variationen im Braunton, die in dem überzogenen Substrat beobachtet werden. Diese Variationen sind recht deutlich und der Nachweis der Schichten ist daher eine einfache gerade Prozedur. Die Teilchen allein auf dem Substrat erscheinen als ein erster Braunton. Die mit einer monomolekularen Schicht überzogenen Teilchen erscheinen als ein dunklerer Braunton, die mit einer bimolekularen Schicht bedeckten Teilchen erscheinen als ein noch dunklerer Braunton und die mit einer trimolekularen Schicht bedeckten Teilchen erscheinen als ein noch dunklerer Braunton. Dieses Nachweisverfahren beruht auf der Tatsache, daß elektromagnetische Strahlung durch leitende Kugeln mit Durchmessern gleich einem großen Anteil einer Wellenlänge des sichtbaren Lichtes zu einem großen Maße zerstreut wird und daß dieses Zerstreuen stark durch einen dünnen auf die Kugeln

aufgebrachten dielektrischen Überzug beeinflußt wird.

Eine zweite Technik für die optische Untersuchung mit Hilfe reflektierten Lichtes, die erfolgreich angewendet worden ist, ist folgendermaßen:

Ein Goldsubstrat, das aus wirtschaftlichen Gründen vorzugsweise eine auf ein anderes Metall plattierte dünne Goldschicht ist, trägt adsorbiert eine monomolekulare Schicht des ersten reaktiven Antigens 11 und der inerten organischen Verbindung 20 nach der Behandlung des Substrates mit dem oben beschriebenen ersten wäßrigen Medium. Gold weist ein Adsorptionsband innerhalb des sichtbaren Spektrums auf und dies verursacht die charakteristische Goldfarbe und gestattet die Ausführung dieser besonderen optischen Untersuchungstechnik. Das Goldsubstrat kann bequemerweise ein Glastestobjektträger sein, der mit einer dünnen Indiumschicht, überzogen ist, die ihrerseits mit der GoIdschicht überzogen wurde, wobei die Indiumschicht die Adhäsion sowohl zwischen Glas und Gold verbessert als auch die optischen Charakteristika des Objektträgers. Das relative Reflexionsvermögen des Goldsub-

strates als Funktion der Wellenlänge führt zu einem Substrat, welches die charakteristische leuchtendgelbe Farbe des Goldmetalles hat, wenn keine Proteinschicht daran haftet. In Anwesenheit einer monomolekularen Schicht auf dem Substrat hat der Testobjektträger, das Substrat, eine blaßgelbe Farbe. Nachdem der Testobjektträger einem wäßrigen Medium ausgesetzt wurde, welches den immunologisch reagierenden Antikörper 12 zum Antigen 11 enthielt, trägt der Testobjektträger eine bimolekulare Schicht und die Reflektivität ist derart, daß er ein grünliches Aussehen hat. Eine dritte Schicht führt zu einem noch grünlicheren Aussehen. In bisher ausgeführten Tests hat sich gezeigt, daß die optischen Untersuchungen des überzogenen Substrates mit reflektiertem oder durchgehendem Licht bei einem Substrat, welches Metallkügelchen trägt oder ein Goldsubstrat ist, am brauchbarsten sind. Weiter wurde festgestellt, daß diese beiden Techniken verschiedene Empfindlichkeiten haben in Abhängigkeit von den Dicken der interessierenden Proteinfilme. Im besonderen erhält man die größte Empfindlichkeit für die Technik mit einem Substrat, das Metallkügelchen trägt, bei Filmen mit Dicken unterhalb von etwa 200 Ä. Die Goldsubstrattechnik hat die größte Empfindlichkeit für Filme, die 30 Ä in der Dicke übersteigt. Das im besonderen Falle angewendete Nachweisverfahren bestimmt daher die Art des eingesetzten Substrates 10, d. h. ob das Substrat ein Metall- oder metallisierter Glasobjektträger ist mit einem flachen Metall-, beispielsweise Goldüberzug oder mit Metallkugeln, z. B. aus Indium, auf der Oberfläche. Zur Vereinfachung ist das gezeigte Substrat 10 mit einer flachen Oberfläche abgebildet, wobei klar sein sollte, daß die Oberfläche, an der die erste Antigenschicht adsorbiert wird, auch die vorgenannten Metallkügelchen tragen könnte.

Das beschriebene Verfahren der Bildung multimolekularer (dreischichtiger) immunologisch komplexierter Filme, wie in F i g. 3 abgebildet, ist besonders bedeutsam beim Testen eines wäßrigen Mediums auf einen gewissen biologischen Bestandteil, z. B. ein Hormon, da Hormone und Antiseren zu Hormonen allgemein erhältlich sind. Wenn daher die dritte Schicht das interessierende Hormon ist, kann es leicht nachgewiesen werden.

Das Bilden der multimolekularen immunologisch komplexierten Filme gemäß der vorliegenden Erfindung ist auch wichtig beim immunologischen Identifizieren von Zellen oder Vieren. Wie in F i g. 4 veranschaulicht, ist durch das Aufbauen einer Vielzahl von Ketten aus Antigen-Antikörper-Komplexen ausgehend von der Oberfläche des Substrates 10, die Wahrscheinlichkeit relativ hoch, daß mehrere der Antikörpermoleküle am Ende der jeweiligen Ketten eine antigene Stelle auf einer Zelle oder einem Virus 40 finden. Und diese Wahrscheinlichkeit bleibt hoch ungeachtet der Unregelmäßigkeit der Oberfläche der Zelle oder des Virus. Wie bekannt, weist die Zellmembran, die jede Zelle umschließt, sich nach außen erstreckende Moleküle auf, die als Transplantations-Antigene bezeichnet werden. Diese Antigene sind diejenigen, die zum Bilden der ersten Schicht 11 in einem Zweischichtsystem zum immunologischen Identifizieren von Zellen benutzt werden, wobei die interessierende Zelle die dritte Schicht bilden würde. Im Falle eines Vierschichtsystems aus Antigen-Antikörper-Ketten, wie es in F i g. 4 abgebildet ist, würden die erste und die dritte Schicht (11 und 30) aus den Transplantations-Antigenen bestehen. Es ist gleichermaßen bekannt daß ein Virus einen Protein-Überzug aus Proteinmolekülen aufweist der aufgespalten und getrennt werden kann und diese Moleküle bilden die erste bzw. die erste und die dritte in Zwei- bzw. Vierschichtsystemen der Antigen-Antikörper-Ketten, die zum immunologischen Identifizieren eines Virus 40 verwendet werden. Die Antikörper 12 in der zweiten Schicht und 41 in der vierten Schicht wären, natürlich spezifisch zu der jeweiligen Zelle oder dem Virus, nach dem man ν'rhi.

Die Konfiguration des verwendeten Substrates ist für die vorliegende Erfindung nicht kritisch. Vorzugsweise hat es jedoch die Gestalt eines Objektträgers, z. B. in Form von metallisierten Glasobjektträgern, da diese leicht erhältlich sind. Das Substrat kann auch die Form eines Gurtes haben. Die einzige Beschränkung bei der Auswahl des Substrates Im i.e, daß es die Bildung einer monomolekularen Schicht daraul gestatten muß. Die Abmessungen der Form werden durch die Art und Weise vorgeschrieben, in der der Test ausgeführt wird, einschließlich der nachfolgenden Analyse und der Zielsetzung des Tests. Soll ein besonderer immunologisch aktiver biologischer Bestandteil gesammelt werden, dann ist ein Gurt bevorzugt.

Der durch die Multischicht-Adsorption geschaffene Kontrast kann noch verstärkt werden, indem man Antigen und inerte organische Verbindung auf das Substrat 10 in Form eines einzelnen Tropfens des wäßrigen Mediums aufbringt und danach das mit dem Tropfen ü'.ie zogene Substrat in ein wäßriges Medium eintaucht, welches nur die inerte organische Verbindung enthält, um eine monomolekulare Schicht aus dem kleinen Bereich aus Antigen und inerter organischer Verbindung zu bilden, der vollkommen von der inerten organischen Verbindung umgeben ist Damit kann man das Problem des nicht-spezifischen Haftens lösen, wenn die Antikörper in einem Serum vorhanden sind, da die an der übrigen Oberfläche des Substrates adsorbierte inerte organische Verbindung solches nicht-spezifisches Haften von im Serum vorhandenen Bestandteilen verhindert und dadurch den Kontrast verbessert.

Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines Beispiels näher erläutert.

Beispiel

Ein diagnostischer Test auf Hepatitis-Antigen wurde folgendermaßen ausgeführt:

Ein Glasobjektträger wurde mit einer Schicht aus Indium-Metallkügelchen metallisiert Eine Lösung von mit der Hepatitis verbundenem Antigen in 0,85%iger Salzlösung mit einer Konzentration von 1 mg des Antigens pro Milliliter wurde zubereitet und zu dieser Lösung gab man Insulin, um eine Konzentration von 1 mg/ml herzustellen. Ein Tropfen der Lösung aus Antigen und inertem Protein wurde im Zentrum des Objektträgers angeordnet Der Objektträger wurde in einer Feuchtigkeitskammer, einem mit feuchten Schwämmen gefülltem Kunststoffbehälter, bei 23° C inkubiert, bis das Antigen an der metallisierten Oberfläche haftete (10 bis 30 Minuten). Der Objektträger wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen und mit einem Luftstrahl trokken geblasen. Das inerte Protein bedeckte etwa ³A des kreisförmigen Bereiches der trockenen Adsorptionsschicht und das Antigen etwa ¹A, wobei ein Hauptteil der Antigenmoleküle frei zugänglich war. Dieser Objektträger wurde dann einer Zubereitung von einem gegenüber dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen als Antiserum wirkenden Kaninchenserum ausgesetzt, welches Antikörper zu dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen enthielt Dies führte zur Bildung einer

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bimolekularen Schicht, in der ein großer Teil der von außen zugänglichen Antikörpermoleküle freie Bindestellen behielt. Objektträger und Antikörperlösung wurden 10 Minuten bei 20°C inkubiert. Danach wurde der Objektträger wieder mit destilliertem Wasser gewäsehen. Schließlich wurde der Testobjektträger einer Lösung ausgesetzt, von der man annahm, daß sie das mit der Hepatitis verbundene Antigen enthielte. Die Bildung eines scharf kontrastierenden sichtbaren Fleckes auf dem Objektträger zeigte eine positive Reaktion.

Aus der obigen Beschreibung wird klar, daß die vorliegende Erfindung ein neues Verfahren bietet, um Antikörper in einer solchen Weise an eine Oberfläche zu binden, daß sie aktiv bleiben und daß sie ein Verfahren bietet zum Bilden multimolekularer immunologisch kompiexiertcr Fiime auf einem Substrat durch Zugeben einer ausreichenden Menge einer immunologisch inerten organischen Verbindung zu einem ersten wäßrigen Medium, welches ein immunologisch reaktives Antigen enthält. Die Behandlung eines geeigneten Substrates mit dem ersten wäßrigen Medium bildet durch Adsorption auf der Oberfläche des Substrates eine monomolekulare Schicht aus reaktiven Antigenmoleküien, die voneinander durch Moleküle der inerten organischen Verbindung getrennt sind. Die Bildung einer solchen besonderen monomolekularen Schicht gestattet das nachfolgende Eintauchen des überzogenen Substrates in ein zweites wäßriges Medium, welches den für das erste Antigen spezifischen Antikörper enthält, wobei die Antikörpermoleküle sich mit den Antigenmoleküien verbinden, während sie gleichzeitig freie aktive Stellen behalten, um in nachfolgenden immunologischen Reaktionen in Wechselwirkung zu treten. Das überzogene Substrat kann dann nachfolgend in ein wäßriges Medium eingetaucht werden, welches das gleiche Antigen wie die erste Lösung enthält oder von dem man vermutet, daß es dieses Antigen enthält und diese Prozedur kann wiederholt werden, um mehrere Ketten abwechselnder Antigen-Antikörpermoleküle aufzubauen.

Während die Erfindung unter Bezugnahme auf besondere Ausführungsformen und Beispiele beschrieben wurde, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedoch Modifikationen und Variationen möglich. So könnte sich die inerte organische Verbindung in einem wäßrigen Medium getrennt von dem Antigen befinden und das Substrat würde entweder als Vorstufe oder als Zwischenstufe zwischen Behandlungen mit einem verdünnten wäßrigen Medium, welches Antigen und Antikörper enthält, damit behandelt werden.

50 Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Bilden multimolekularer immunologisch komplexicrter Filme durch
Überziehen eines Substrates mit einer monomolekularen Schicht eines immunologisch reaktiven Antigens und einer immunologisch inerten organischen Verbindung, so daß die Antigenmoleküle durch die Moleküle der inerten organischen Verbindung voneinander getrennt sind und

Aussetzen des so überzogenen Substrates gegenüber einem wäßrigen Medium, welches den immunologisch reaktiven Antikörper spezifisch für das Antigen enthält, um eine immunologische Reaktion damit zu verursachen, bei der sich die Antikörpermoleküle mit den Antigenmolekülen verbinden und auf dem Substrat eine bimolekulare Schicht bilden,
dadurch gekennzeichnet, daß die inerte organische Verbindung Insulin ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Substrat erst mit einer Schicht aus Indiummetall versieht, es dann mit Hepatitis-Antigen und Insulin überzieht, und es danach einem Medium, wie Kaninchenblutserum, aussetzt, am etwaige Antikörper zum Hepatitis-Antigen nachzuweisen.