EP0874990A1 - Lagerstabiles partikel, insbesondere träger für trägergebundene reaktionen sowie verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Lagerstabiles partikel, insbesondere träger für trägergebundene reaktionen sowie verfahren zu seiner herstellung

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EP0874990A1
EP0874990A1 EP96939898A EP96939898A EP0874990A1 EP 0874990 A1 EP0874990 A1 EP 0874990A1 EP 96939898 A EP96939898 A EP 96939898A EP 96939898 A EP96939898 A EP 96939898A EP 0874990 A1 EP0874990 A1 EP 0874990A1
Authority
EP
European Patent Office
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component
particle
carrier
particles
reactive
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP96939898A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Dmitri Plaksine
Elena Gromakovskaia
Christoph ABION Beteiligungs ERHARDT
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Abion Beteiligungs und Verwaltungs GmbH
Original Assignee
Abion Beteiligungs und Verwaltungs GmbH
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • Y10T428/2985—Solid-walled microcapsule from synthetic polymer
    • Y10T428/2987—Addition polymer from unsaturated monomers only

Definitions

  • Particle that is stable on storage in particular carrier for carrier-bound reactions and method for its production
  • the present invention relates to a storage-stable particle, in particular a particulate carrier for carrier-bound reactions, detection and / or isolation methods, a process for the production of this storage-stable particle and uses of the particle according to the invention
  • Particulate carriers consisting of a solid none and a polymer
  • Particulate carriers consisting of a solid none and a polymer
  • such particles have been used for markers for immunoassays in order to connect a solid core to an affection component via polymers, for example biopolymers
  • brine of metal particles for example magnetic iron particles or colored gold particles
  • non-metal particles for example selenium, coal dust, SiO 2 or ceramic particles
  • blood cells or even latex particles of another polymer with different (binding) properties were used as the particulate material
  • No. 4,230,685 describes an improvement in the attachment of specific binders to magnetic particles, wherein a particle is coated with an acrylate polymer or a polysaccharide, protein A being bound to this coating by means of glutaraldehyde
  • No. 4,452,773 describes the production of magnetic iron-dextran microparticles. These particles have a size of 100 to 700 ⁇ , in particular 300 to 400 ⁇ . Many of the particles are colloidal and ferromagnetic with one. Dextran shell The particles obtained are functionalized by periodate oxidation
  • EP-B-452 342 relates to super-paramagnetic particles coated with polysaccharides, colloidal particles.
  • the particles can be connected to other groups.
  • compositions are obtained which have homogeneous properties with regard to their retardation in have a magnetic field
  • Gioße The possibility of separation according to Gioße is mentioned.
  • Preferred are coatings of polysaccharides or proteins.
  • Polysaccharides are functionalized by peilodate oxidation. Functionalization with cyanogen bromide is also possible.
  • the piotein shell can be bound to certain molecules via side-chain amino groups or sul fhydiyl groups take place
  • DE-A-40 37 724 relates to devices for immunoassays in which direct or indirect markers are used. Direct markers are preferred since they do not require any additional steps to make test results visible. Examples of direct markers are metal sols, dye sols, latex particles and color indicators , colored substances, which are located in liposomes, and non-metal sols such as a carbon sol.
  • EP-A-0 410 893 describes a method for determining and recognizing an antibody in biological fluids which is directed against a specific antigen.
  • the insoluble carrier particles mentioned are composed of cells, gelatin particles, microcapsules, organic polyme, anoiganic fine particles or colloidal of Metal or metal compounds that are finely dispersed with bovine serum albumin or cholesterol.
  • EP-A-0 032 270 also describes a quantitative and / or qualitative determination of an immunological component, in which one or more labeled compounds are used, which by direct or indirect coupling of such a component or components to particles from an aqueous dispersion ⁇ sion of a hydrophobic dye or pigment or polymeric cores, which smd coated with such dyes or pigments, is or will be obtained.
  • EP-A-0 321 008 relates to a method for determining one or more components of a reaction between a specifically binding protein and the corresponding bindable substance in a sample, the mutual activity of such components and at least one labeled component being obtained by coupling or adsorption of sol particles of the label directly or indirectly onto the component.
  • sol particles smd phosphorus, carbon and / or silicon. Agglutination and aggregation can be prevented by coating the particles with macromolecules which contain polar groups, such as proteins, polyethylene glycols, polymeric carbohydrates, polyhydric alcohols and the like. Suitable protection pro- tems are antigens, antibodies and anti-antibodies.
  • Immunochemical inert materials such as albumin, polyethylene glycol or other polar macromolecules can also be used. The test sensitivity is given for example for rabbit immunoglobulin G with 1.5 ng absolute.
  • EP-A-0 184 710 relates to magnetic microsphere (MIMS), a process for its production from water-in-oil emulsion and its use for the separation and isolation of biological particles, in particular natural or artificial cells.
  • the magnetic microspheres obtained by the process according to the invention are stabilized by crosslinking and carry functional groups on the surface which are the covalent ones Allow binding of biologically active ligands
  • the magnetic microspheres described above consist of a magnetic component which is incorporated in a coagulated matrix protein.
  • the surface of the matrix protein is activated by functional groups for binding biological particles.
  • the matrix protein is a globular protein such as alumni the matrix protene is preferably activated by aldehyde groups
  • WO-A-92/08134 relates generally to colloidal particles with a crosslinked coating on which there are functional groups.
  • Magnetic or non-magnetic particles with biodegradable crosslinked gelatin coating smd are preferred, to which biological substances or molecules are covalently bound. These include, in particular, monoclonal ones Anticoipei The monoclonal antibodies, which are bound to the particles in this way, are used in various positive and negative biological assays
  • EP-A-0 298 368 relates to a method for carrying out a diagnostic immunoassay using colloidal iron-metal-containing particles with conjugates bound to them, which are able to specifically recognize the analyte to be determined.
  • the test sensitivity for hCG is in the mlU / ml - Area
  • EP-A-0 280 560 discloses Streptococcus A antigen antibodies which have been covalently bound to core / shell polymer particles, the shell made of poly (mp-chloromethylstyrene) and the core made of poly (styrene-co-2-acetoacetoxydethyl methylacrylate) ) was built up containing Oil Red EGN in the core in order to obtain an agglutination reagent
  • the US-A-4, 452, 886 describes the polymerization of lysine with glutaraldehyde and Congo red to color particles.
  • the test sensitivity for hCG is in the 1000 lU / ml range
  • DIA Dispose Dye Immunoassay
  • JP-A-0686771 relates to encapsulated toners and their production
  • the inert cores described in the prior art have significant disadvantages. If the cores are polymerized in, the desired core property is affected very badly. When the polymer is adsorbed onto the core with subsequent covalent or other binding of the affinity component, the binding of the core is usually weak , so that long-term stability is not guaranteed. In addition, the methods according to the prior art only bind one or a few reactive or affmitate components
  • the technical problem on which the invention is based is to provide stable particles with characteristic properties which can be used, in particular marker properties, to which, if appropriate, many reactive components can also be bound at the same time.
  • the stability should in particular also include long-term storage stability
  • a storage-stable particle in particular particle-shaped carrier according to the features of claim 1.
  • the subclaims 2 to 18 relate to preferred embodiments of the invention appropriate particle.
  • Claim 19 with the associated subclaims 20 and 22 relates to a method for producing the storage-stable particle according to the invention.
  • Claims 23 to 31 relate to uses of the particle according to the invention.
  • the storage-stable particle according to the invention is particularly intended for carrier-bound reactions, detection and / or isolation processes. It consists of at least a first and a second component, the particle being suitable for being provided with a reactive component, in particular a specific reactive component.
  • the second component consists of a crosslinkable polymer and virtually forms a shell which at least partially envelops and / or envelops the first component as a core.
  • the first component has at least one detectable property.
  • Reactive components can be arranged on the second component.
  • the storage-stable particle is characterized by its production process and can be obtained by reacting the first component with the crosslinkable polymer, then reacting the product formed with a crosslinking agent, so that the first component is arranged in the second component in a stable manner.
  • the feature of the storage-stable arrangement of the first component m of the second component means that even in the case of prolonged storage, under possibly unfavorable conditions, the first component remains in the casing. In an embodiment of the method according to the invention, this means, for example, that the first component is an elutable dye, that this dye remains essentially quantitatively in the shell which is formed from the second component. Bleeding of the dye is thus prevented.
  • the sheath, formed from the second component encloses the first component sufficiently tightly.
  • the condition to be observed according to the invention that the first component can be arranged in the second component in a stable manner is achieved, for example, by that the crosslinking agent is used in a large excess.
  • the crosslinking agents can typically be present in ten times the concentration of the respective reactive group of the second component.
  • the crosslinking agent preferably contains more than 10 to 100 times more reactive groups than corresponding groups of the second component. who react to one another with networking
  • reaction conditions are preferably set in such a way that the second component is enveloped or enveloped by the second component
  • the second component which forms the carrier according to the invention is preferably a polymer which has active or activatable functional groups which can react with the crosslinking agent or with the reactive components, or both, since the second component of the polymer according to the invention can form the carrier
  • the polymer can also be formed from proteins and / or polyamides with functional groups. Basically, other polymers such as biopolymers or monomers are also conceivable, as long as crosslinking is possible second component can be networked with at least bifunctional connections
  • Polymers are preferably used which adsorptively stabilize the aqueous suspension of component 1, in particular polar polymers
  • the reactive components arranged on the second component of the particle according to the invention are, in particular, molecules or groups of molecules which have affine properties for other substances. These include, in particular, enzymes and substrates interacting with enzymes. On the one hand, the substrate or, on the other hand, the enzyme as a reactive component on the second Component arranged
  • the same applies with antibodies / antigen, Biotm / Streptavidm systems Strep tavidm or biotin as a specific reaction component firmly bound to the dye has the advantage that the dye can be used universally as a reaction partner for biotinylated or streptavidin-linked components. These in turn can have very different functions, for example, again specifically against another component or act as a catalyst.
  • nucleic acids of the RNA or DNA type can be used as reactive components in the sense of the carrier according to the invention.
  • the nucleic acids are able to react with the corresponding ones to hybridize complementary or partially complementary strands, depending on the stringency of the reaction conditions, and to form stable complexes. It is therefore possible to identify specific strands of nucleic acid in a sample to be examined and to process them further on the basis thereof.
  • Combinations of the reactive components can also be arranged on or on the second component. Carriers according to the invention are then obtained which can be used for various problems
  • the crosslinking reaction can be controlled so that the second component envelops the first component quasi in a molecular network, the mesh of which has a narrow mesh size distribution
  • the number of free binding sites on the particle surface can be set, which remains free by binding the least bifunctional crosslinker with only one function to the surface for further binding, in particular of reactive components.
  • the number of binding sites that are created can be full or, after partial saturation, to a defined extent
  • the thickness of the shell can be determined by the process conditions, the homogeneous valley of which still leaves can be improved by a fractionation.
  • a multi-stage process of the coating can further improve the inclusion of the first component.
  • the first component of the particle according to the invention preferably has at least one detectable property which, at least in its quality, is not inherent in component 2 and / or the reactive components bonded to it, such as absorption or emissivity of electromagnetic waves, mass, magnetism, dielectric.
  • Radioactivity, high and / or density on detectable properties which can have the core as the first component of the carrier according to the invention, is also understood to mean a pharmacological-biological effect and a catalytic effect or combinations thereof.
  • the absorption or emission capability can be electromagnetic Waves are produced by appropriate chromophores or fluorophores.
  • the properties of mass, size and density are physically related and can be adjusted accordingly, for example by specifically heavy particles.
  • the property size can be advantageous for the Using agglomeration and the property mass for gravimetry
  • the agglomeration is advantageous for the specific precipitation of components in solutions or microemulsions.
  • the first component can be provided with the property radioactivity by radioactively marked structures. The other properties mentioned can be similarly done with the first component connect
  • the first component can also be a capsule and contain liquids or particles that are not sufficiently enveloped (eg extremely small or unstable in solution)
  • the carrier is designed such that the first and second components are separably connected to one another.
  • the connection between the first and second components is made by wrapping the first component with the second principle. It is possible to remove the second component to expose the most iconic component, possibly for a mechanical engineering
  • the properties associated with the core are easier to remove.
  • the second component can be removed by appropriate proteolytic enzymes. This degrades the shell so that the core remains. This can then be treated further according to its property to be measured.
  • the storage-stable, particle-shaped carriers appear in a plurality of populations in appearance.
  • the carriers are present in populations which are characterized by a narrow distribution of the size of the individual carrier particles according to the invention
  • the population has carrier particles which have both a narrow range of the size distribution of the shell and a narrow range of the size distribution of the core and thus a narrow distribution of the size ratio shell / core.
  • the particle aL carrier according to the invention it is advantageous to use a or the second form component to arrange a high concentration of reactive components.
  • a or the second form component to arrange a high concentration of reactive components.
  • relatively high binding constants for corresponding complementary structures can be achieved, for example, in immunoassays, although the individual reactive component may have only an average binding constant for the corresponding complementary structure.
  • increasing the number of binding sites the effectiveness of education (avidity) is reached
  • a method for producing the carrier according to the invention comprises the steps of reacting the first component at least once with a crosslinkable polymer.
  • the polymer can be physically adsorbed on the surface of the first component.
  • the crosslinkable polymer will form the second component after further treatment steps treatment with crosslinking agent as crosslinking agent, in particular, bifunctional molecules such as glutardialdehyde, dicarboxylic acids, acrylates, methacrylates are suitable.
  • crosslinking agents carrying the olefinic groups can be activated, for example, by photoreactions or other radical chain reactions network
  • the first component can be subjected to a separation according to size and / or another property before the treatment and / or the intermediate product with the second component and / or the particle in order to achieve a distribution of the size and / or another property that is as homogeneous as possible
  • the treatment of the first component with polymers is preferably carried out two to three times and particularly preferably a separation according to size
  • the method is particularly advantageous since, regardless of the reaction, the first component is first homogenized and its concentration in the suspension is adjusted 1 af t Depending on the first component used, SMII are common Use method to homogenize and stabilize the suspension.
  • the second component is preferably used to stabilize the suspension if it is a polar compound with sufficiently good adsorption on the first component.
  • the ratio of the concentrations of the first and second components is chosen so that a suitable shell thickness is achieved by adsorption In the multi-stage process, the shell thickness is chosen to be rather thin. Other parameters such as time and temperature can also be used to influence the adsorption.
  • the intermediate product can be homogenized again in order to achieve good crosslinking of the shell, in particular in the inner region near the first component calibration, the crosslinking component is then used in a crossover of several orders of magnitude.
  • the effect of the crosslinking component can also be influenced by other parameters, in particular the exposure time, just like the number of reactive groups formed on the surface by one-sided g bound crosslinker molecules, which can subsequently be reduced by partial blocking
  • the carriers according to the invention are preferably used in assay methods such as immunoassay, solid-phase assays and / or chromatographic assay. They can also be used as vehicles for the transport of active substances if the first component, for example, is enveloped by the second component and the second component, for example Afmatate transport means, for example, transport of pharmacologically active substances by means of antibodies which are arranged on the second component and bind specifically to a specific target structure
  • Particles with a radioactive nucleus can also be used advantageously because they act or are concentrated mainly at the place of use due to the transport of the afflicate and therefore overall lower amounts of radioactivity can be used, so that a systemic load can be kept within narrow limits
  • the use of the storage-stable, particle-shaped supports according to the invention as a catalyst for chemical reactions is also advantageous.
  • a magnetic core can be used for rapid mixing of the carrier-bound catalyst (biocatalyst) with the reaction solution, the weight of which then ensures rapid segregation
  • the suspension was divided into two centrifuge tubes and centrifuged in a centrifuge precooled to 4 ° C. for 5 minutes at 1000 rpm, at 2000 rpm and at 3000 rpm, followed by a second filtration.
  • Tubes No. 1-10 and 23-30 each 4 ml; No. 11 and 22 4.5 ml, No. 12 and 21 5 ml; No. 13 and 20 5.5 ml; No. 14-19 6 ml
  • each 5 ⁇ l of each fraction was diluted (1 1000) with 5 ml PBS buffer for each optical-visual color strength assessment and vortexed for 5 seconds (Vorfex).
  • the evaluation of the fractions according to their color strength led to a broad central peak area with high color strength and clearly falling color in the fractions before and after.
  • the broad peak area of approx. 140 ml was used. Its fractions were pooled, distributed into 3 50 ml tubes, centrifuged for 5 minutes at 2500 rpm and then coarsely filtered
  • Steps 2 and 3 were repeated one or more times if needed for a thicker and / or more secure shell
  • streptavidm 100 mg streptavidm were dissolved in 6 ml PBS buffer, for quality control the protein concentration was determined with the optical density at 280 nm and compared with the manufacturer's specification.
  • the streptavid solution was placed in a 6 mm dialysis tube and at 4 ° C. overnight against 1 1 PBS buffer dialyzed The solution was placed in a tube, the tube was rinsed with 4 ml PBS buffer, and the protein concentration was checked again with the 0D ⁇ O ( to check the concentration).
  • the streptavid solutions were centrifuged for 5 minutes at 4000 rpm and the Supernatant for conjugation is used after determining the 0D 2 ⁇ C again
  • the size after approx. One coating is approx. 51 to 200 nm, after a second coating at 300 to 400 nm
  • the lower reaction field (comparison field) of the reaction column is loaded with protein G and bound to it a defined amount of anti-tetanus human IgG, which corresponds to adequate vaccination protection m IU (International Units) of the blood amount m of the capillaries for the blood application Serum diluted accordingly and the entire human IgG including the tetanus-specific bound in flow to the protein G of this reaction field (protein G coupled to CNBi - activated agarose, see DE-A-195 00 862, example 2 there)
  • m IU International Units
  • the middle negative control field contains CNBr-activated Sepha rose 4b with covalently coupled BSA
  • An upper reaction field (test field) of the reaction unit contains only protein G coupled to CNBr-activated agarose
  • a defined amount of blood is applied to the column with a capillary. After washing with washing buffer, 250 ⁇ l of a solution of 5 ⁇ g / m] of biotinylated tetanase toxoid (degree of breadmylation 50) are applied in washing buffer. After washing again, a 1 20 -washing buffer dilution of the streptavidm dye emulsion is applied applied and washed again
  • the entire human IgG of the sample is bound in the test carrier bed during its passage.
  • a corresponding amount of biotmylieitetetanus toxoid is bound during the passage of the previously bound anti-tetanus human IgG.
  • Unspecifically bound proteins are released from the The subsequent puff is washed out.
  • the amount of streptavid-coupled dye corresponding to the amount of tetanus toxoid bound is also bound.
  • unspecific bound protein is washed out by the washing buffer.
  • the semi-quantitative evaluation is carried out by visual color comparison. If the color of the test field is the same or stronger than that of the comparison field, the vaccination status is sufficient. If it is below this, vaccination should be carried out, and the greater the difference in color, the more urgent it is (fine subdivisions of comparison fields) , eg two years of protection, after five years of protection, vaccination recommended, vaccination strongly recommended, can be prepared according to medical or WHO information.
  • Eme alternative is the evaluation of the depth of penetration of the colors into the test field with appropriate markings. Then a comparison point d can be omitted or serve as protection)
  • test field is not required for this, but positive and negative control fields can be built in for safety
  • the field is loaded with mouse anti human IgG in accordance with DE-A-195 00 862, Example 2.
  • the evaluation is carried out by photometric absorption measurement at 520 nm or 492 nm after elution with alcoholic alcohol Solution
  • Elution with alcohol is necessary because, owing to the high number of binding sites, the dye marker sits on the gel bed with such stability that it cannot be detached from the gel bed like other markers with the aid of pH changes or by displacement with a competition molecule. also not partially, but in this case only by means of a resolution
  • test sensitivity for both evaluations is in the mlU / ml range for anti-tetanus-human IgG
  • further test optimization amounts below 10 pg IgG can be determined qualitatively (visually) and quantitatively, even less when enriched with the column (pg / ml Area)
  • the ongoing quality control showed that the emulsion remained stable for at least 1 .. months
  • 0.1 to 2 g of carbon are added to 20 ml of BSA solution in a concentration range of 1 to 50 mg / ml in 0.01-0.2 M phosphate buffer solution, pH 6-8.5.
  • the mixture is placed on a magnetic stirrer or a Vortex mixer mixed until the protein is adequately adsorbed (peptized).
  • the suspension obtained is centrifuged at 6000x g for 5 to 10 minutes
  • the carbon particles from 50 to 350 nm on which BSA is adsorbed are activated in the next step with glutardialdehyde.
  • the glutardialdehyde concentration for this is in the range of 1 to 25%, the activation time is 20 to 120 minutes.
  • the activated suspension is purified by centrifuging 3 to 4 times and by gel filtration with Sepharose 6B, 4B, 2B, CL-6B, CL-4B, CL-2B Sepharcryl S300 or with other gels (Toyoperl, Ultragel etc.) , the exclusion limit must not be less than 1 million Daltons for globular proteins.
  • black dye particles are obtained.
  • the production of other dye particles takes place analogously, with instead of carbon e.g. Sudan II is used for red, Sudan III for dark red, Sudan-black for gray, Tetiazolformazanvrolett for violet, Neotetrozoldiformazan for dark violet and Tetrazoldiformazan blue for blue.
  • the working range for these conjugates in suspension is 0.08% based on the dry weight.
  • the dye labels are produced by conjugation with anti-analytes such as protein A, streptavidin or antibodies.
  • Polystyrene ELISA plates with adsorbed synthetic peptides of HIV-1 and HIV-2 were used as the solid phase.
  • a Kanmchen anti-HIV serum was then added in a dilution series. After an incubation of 15 minutes and a washing step, protein A-carbon conjugate was added and the result spot was read after 15 minutes after a washing step.
  • a strip of 2x16 mm nitrocellulose is glued to transparent PVC 0.5 mm. The end of the strip was glued with a 1 x 1 cm piece of chromatography paper as a suction element.
  • a solution of anti-HCG was used in the middle of the nitrocellulose strip with a Hamilton syringe.
  • Antibody (1 mg / ml in phosphate buffer) added. After 30 minutes, blocking with 1% case solution (phosphate buffer with Tween) (hour), then washing and drying
  • the HCG standard is diluted once in phosphate / Tween puffer, then again in urine from healthy people, with up to 0.1% Tween 20 being added to 50 ⁇ l of this standard solution, 50 ⁇ l carbon conjugate with anti HCG added The free end of the strip is immersed in this solution, after 2 to 3 minutes the result is visually read as a black line.
  • the sensitivity of 50 mlU / ml is sufficient for a pregnancy test after one week

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Abstract

Lagerstabiles Partikel aus mindestens einer ersten und mindestens einer zweiten Komponente, wobei die zweite Komponente aus mindestens einem vernetzbaren Polymeren als Hülle die erste Komponente als Kern mindestens teilweise ein- und/oder umhüllt und die erste Komponente mindestens eine erfassbare Eigenschaft aufweist, erhältlich durch Umsetzung der ersten Komponente mit dem vernetzbaren Polymeren und danach Umsetzung des gebildeten Produkts mit einem Vernetzungsmittel, so dass die erste Komponente lagerstabil in der zweiten Komponente verbleibt.

Description

Lagerstabiles Partikel, insbesondere Träger für trägergebundene Reaktionen sowie Verfahren zu seiner Herstellung
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist em lagerstabiles Partikel, insbesondere em partikelförmiger Trager für trager¬ gebundene Reaktionen, Nachweis- und/oder Isolierungεverfahren, ein Verfahren zur Herstellung dieses lagerstabilen Partikels sowie Verwendungen des erfmdungsgemaßen Partikels
Partikelformige Träger , bestehend auε einem festen Kein und einem Polymeren, sind an sich bekannt und wurden bereits für viele Zwecke verwendet Insbesondere wurden solche Partikel für Marker für Immunoassayε verwendet, um emen festen Kern über Polymere, beispielsweise Biopolymere, mit einer Affmitatskom- ponente zu verbinden Als partikelformiges Material wurden insbesondere Sole von Metallteilchen, z B magnetischen Eisen- teilchen oder farbigen Goldteilchen, Nichtmetall-Teilchen, z B Selen, Kohlenstaub, Sι02 oder Keramikteilchen, Blutkörperchen oder sogar Latexteilchen eines anderen Polymeren mit anderen (Bindungs- ) Eigenschaften verwendet
So beschreibt US 4,230,685 eine Verbesserung der Befestigung spezifischer Bindemittel an magnetische Partikel, wobei em Partikel mit einem Acrylatpolymer oder emem Polysaccharid beschichtet wird, wobei an diese Beschichtung mittels Glutaral - dehyd Protein A gebunden wird
Die US 4,452,773 beschreibt die Herstellung von magnetischen Eisen-Dextran-Mikropartikeln Diese Partikel weisen eine Große von 100 bis 700 Ä, insbesondere 300 bis 400 Ä auf Viele dei Paitikel sind kolloidal und ferromagnetisch mit eine. Dextran- hülle Die erhaltenen Partikel werden funktionalisiert durch Periodatoxidation
Die EP-B-452 342 betrifft mit Polysacchariden überzogene super- paramagnetische Partikel kolloidalei Große Die Partikel können mit weiteren Gruppen verbunden werden Durch Aussortieren der Partikelmischung in Unterfraktionen, die gleichformiqe Magne¬ tisierung aufweisen, werden Zusammenstellungen erhalten, die homogene Eigenschatten hinsichtlich ihrer Retardierung in einem magnetischen Feld aufweisen Die Möglichkeit der Trennung nach Gioße wird erwähnt Bevorzugt sind Beεchichtungen aus Poly¬ sacchariden oder Proteinen Polysacchaπde werden funktionali eiert durch Peilodatoxidation Ebenfalls ist eine Funktionali- sierunq mit Cyanbromid möglich Die Bindung dei Pioteinhülle zu bestimmten Molekülen kann über Seitenketten-Ammogruppen oder Sul fhydiylgiuppen erfolgen
Die DE-A-40 37 724 betrifft Vorrichtungen für Immunoaεεays, m denen direkte oder indirekte Marker eingesetzt werden Direkte Marker sind bevorzugt, da sie keine zusätzlichen Schritte erfordern, um Testergebnisεe sichtbar zu machen Beispiele für direkte Marker sind Metallεole, Farbstoffεole, Latexpartikel, Farbindikatoren, farbige Stoffe, die sich m Liposomen befinden, und Nichtmetallsole wie em Kohlenstoffsol In einem weiteren Aspekt betrifft die DE-A-40 37 724 einen immunchemisch aktiven Marker Dabei ist em Kohlenstaubpartikel adsorptiv an einen Liganden bzw ein Liganden-Konjugat gebunden Die Testempfind lichkeit wird z B für human-Choriongonadotropm hCG mit 25 mlU/ml (IU = Internationale Einheiten) angegeben
In der EP-A-0 410 893 wird em Verfahren beschrieben zui Bestim¬ mung und Erkennung eines Antikörpers in biologischen Flüssigkei¬ ten, das gerichtet ist gegen em spezifisches Antigen Die genannten unlöslichen Tragerpartikel smd zusammengesetzt aus Zellen, Gelatmepartikeln, Mikrokapseln, organischen Polymeien, anoiganischen feinen Partikeln oder kolloidalen von Metall oder Metallverbindungen, die mit Rinderserumalbumin oder Cholesterin fein dispergiert werden.
Auch die EP-A-0 032 270 beschreibt eine quantitative und/oder qualitative Bestimmung einer immunologischen Komponente, bei der eme oder mehrere markierte Verbindungen verwendet werden, die durch direkte oder indirekte Kopplung einer solchen Kom¬ ponente oder Komponenten an Partikel auε einer wäßrigen Disper¬ sion eines hydrophoben Farbstoffs oder Pigmentes oder polymeren Kernen, die mit solchen Farbstoffen oder Pigmenten beschichtet smd, erhalten wird oder werden.
Die EP-A-0 321 008 betrifft em Verfahren zur Bestimmung einer oder mehrerer Komponenten emer Reaktion zwischen einem spezi¬ fisch bindenden Protein und der korrespondierenden bindbaren Substanz in einer Probe, wobei die gegenseitige Aktivität solcher Komponenten und mindestens einer markierten Komponente erhalten wird durch Koppeln oder Adsorption von Solpartikeln der Markierung direkt oder indirekt an die Komponente. Bevor¬ zugte Solpartikel smd Phosphor, Kohlenstoff und/oder Silicium. Agglutination und Aggregation kann verhindert werden durch Umhüllen der Partikeln mit Macromolekülen, welche polare Gruppen enthalten, wie Proteine, Polyethylenglycole, polymere Kohle¬ hydrate, Polyvmylalkohole und ähnliche. Geeignete Schutzpro- teme sind Antigene, Antikörper und Anti-Antikörper. Auch im- munochemische Inertmaterialien, wie beispielsweise Albumin, Polyethylenglycol oder andere polare Macromoleküle können ein¬ gesetzt werden. Die Testempfindlichkeit wird z.B. für Kaninchen- Immunglobulin G mit 1,5 ng absolut angegeben.
Die EP-A-0 184 710 betrifft magnetische Microsphereε (MIMS) , ein Verfahren zu ihrer Herstellung aus Wasser-in-όl-Emulsion εowie ihre Verwendung zur Trennung und Isolierung biologischer Partikeln, insbesondere natürlicher oder artifizieller Zellen. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen magnetischen Microspheres sind durch Quervernetzung stabilisiert und tragen an der Oberflache funktionelle Gruppen, die die kovalente Bindung von biologisch aktiven Liganden erlauben Die doit beschriebenen magnetischen Microspheres bestehen aus emei magnetischen Komponente, die in em koaguliertes Matrixprotein inkorporiert ist Die Oberflache des Matrixprotems ist durch funktionelle Gruppen zur Bindung biologischer Partikeln akti¬ viert Insbesondere ist das Matrixprotein ein globulareε Protein wie Alumni Die Oberflache des Matrixprotems ist vorzugsweise durch Aldehydgruppen aktiviert
Die WO-A-92/08134 betrifft im allgemeinen kolloidale Partikel mit einer quervernetzten Umhüllung, an der sich funktionale Gruppen befinden Magnetische oder nicht magnetische Partikel mit biologisch abbaubarer quervernetztei Gelatineumhullung smd bevorzugt, an welche biologische Substanzen odei Moleküle kovalent gebunden smd Dazu gehören insbesondere monoklonale Antikoipei Die monoklonalen Antikörper, die dergestalt an die Partikeln gebunden smd, werden m verschiedenen positiven und negativen biologischen Assayε verwendet
Die EP-A-0 298 368 betrifft em Verfahren zui Durchfuhrung eines diagnostischen Immunoassays unter Verwendung kolloidaler eisen- metallhaltiger Partikel mit daran gebundenen Konjugaten, die in der Lage sind, spezifisch den zu bestimmenden Analyt zu erkennen Die Testempfindlichkeit für hCG liegt im mlU/ml- Bereich
Die EP-A-0 280 560 offenbart Streptococcus A Antigen-Antikorper die kovalent an Kern/Hulle Polymerpartikeln kovalent gebunden wurden, wobei die Hülle aus Poly (mp-Chloromethylstyrol) und der Kern aus Poly (Styrol-co-2-acetoacetoxιdethyl-methylacrylat) aufgebaut war enthaltend Oil Red EGN im Kern, um em Agglutina¬ tionsreagenz zu erhalten
Die US-A-4 , 452 , 886 beschreibt die Polymerisation von Lysin mit Glutaraldehyd und Kongo-Rot zu Farbpartikeln Die Testempfind lichkeit fui hCG liegt im 1000 lU/ml-Bereich W P Collms beschreibt m seinem Buch "Alternative Immunoas- sayε", John Wiley & Sonε, Chicheεtei , New York usw , im Kapitel "Disperse Dye Immunoassay (DIA) " auf Seite 48-49 die Vorteile von Partikel-Markern und hebt die Bedeutung der essentiellen Parameter hervor wie Teilchengroße, Verteilung und Form, Los¬ lichkeit m organischen Lösungsmitteln, Kolloidstabilitat und Bmdungskapazitat z.B für Antikörper Die von ihm erwähnten Testempfmdlichkeiten liegen im mlU/ml-Bereich Die Konjugate sind für mindestens 15 Monate stabil, wenn sie im lyophilisier- ten Zustand bei -20°C oder 4°C aufbewahrt werden, wäßrige Konjugate sollten innerhalb von 6 Tagen nach der Herstellung verbraucht werden
Die JP-A-0686771 betrifft verkapselte Toner und deren Herstel¬ lung
Die im Stand der Technik beschriebenen inerten Kerne weisen deutliche Nachteile auf Werden die Kerne einpolymerisiert, wird die gewünschte Kerneigenεchaft zu sehr m Mitleidenschaft gezogen Bei Adsorption des Polymeren an den Kern mit nachfol¬ gender kovalenter oder anderer Bindung der Affmitatskomponente ist die Bindung des Kerns meist schwach, so daß eine langerfri- stige Stabilität nicht gewährleistet ist. Außerdem wird mit den Methoden nach dem Stand der Technik nur die Bindung von einem oder wenigen Reaktiv- oder Affmitatskomponenten erreicht
Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht darin, stabile Partikel mit charakteristischen verwendbaren Ei¬ genschaften, insbesondere Markereigenschaften zur Verfugung zu stellen, an die stabil gegebenenfalls auch viele Reaktivkomponen¬ ten gleichzeitig gebunden werden können Die Stabilität sollte insbesondere auch eine langerfristige Lagerstabilitat umfassen
Gelost wird das der Erfindung zugrundeliegende Problem durch einen lagerstabilen Partikel, insbesondere partikelformigen Trager gemäß den Merkmalen des Anspruchs 1 Die Unteranεpruche 2 bis 18 betreffen bevorzugte Ausfuhrungsformen des erfmdungs gemäßen Partikels. Patentanspruch 19 mit den dazugehörigen Unteransprüchen 20 und 22 betrifft ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen lagerεtabilen Partikels. Die Ansprüche 23 bis 31 betreffen Verwendungen des erfindungsgemaßen Par¬ tikels .
Der erfindungsgemäße lagerstabile Partikel ist insbesondere bestimmt für trägergebundene Reaktionen, Nachweis- und/oder Isolierungsverfahren. Er besteht auε mindestenε einer ersten und einer zweiten Komponente, wobei der Partikel geeignet ist, mit einer Reaktivkomponente, insbesondere einer spezifischen Reaktivkomponenten versehen zu werden. Die zweite Komponente besteht auε einem vernetzbaren Polymeren und bildet quasi eine Hülle, welche die erste Komponente als Kern mindestens teilweise em- und/oder umhüllt .
Die erste Komponente weist mindestens eme erfaßbare Eigenschaft auf . An der zweiten Komponente können Reaktivkomponenten an¬ geordnet sein. Der lagerstabile Partikel ist gekennzeichnet durch sein Herstellungsverfahren und erhältlich durch Umsetzung der ersten Komponente mit dem vernetzbaren• Polymeren, danach der Umsetzung des gebildeten Produktes mit einem Vernetzungsmit¬ tel, so daß die erste Komponente lagerεtabil in der zweiten Komponente angeordnet ist. Das Merkmal der lagerεtabilen Anord¬ nung der ersten Komponente m der zweiten Komponente bedeutet, daß auch bei längerer Lagerung, unter gegebenenfalls ungünstigen Bedingungen, die erste Komponente m der Umhüllung verbleibt. So bedeutet dies in einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die beispielsweise dadurch charakterisiert ist, daß die erste Komponente em eluierbarer Farbstoff ist, daß dieser Farbεtoff in der Hülle, die auε der zweiten Komponente gebildet wird, im wesentlichen quantitativ verbleibt. Ein Ausbluten des Farbstoffs wird somit verhindert. Dies bedeutet, daß die Hülle, gebildet aus der zweiten Komponenten, die erste Komponente hin¬ reichend dicht umschließt. Die erfmdungεgemäß einzuhaltende Bedingung, daß die erste Komponente lagerstabil in der zweiten Komponente angeordnet werden kann, wird z.B dadurch bewerkstel - ligt , daß das Vernetzungsmittel m einem hohen Überschuß ein¬ gesetzt wird So können typischerweise die Vernetzungsmittel in zehnfacher Konzentration zur jeweils reaktiven Gruppe der zweiten Komponente vorliegen Vorzugsweise sind mehr als 10 bis 100 mal mehr reaktive Gruppen im Vernetzungsmittel enthalten als korrespondierende Gruppen der zweiten Komponente, die miteinander untei Vernetzung reagieren
Vorzugsweise werden die Reaktionsbedingungen so eingestellt, daß die eiste Komponente netzartig von der zweiten Komponente ein oder umhüllt wird
Die zweite Komponente, die den erfindungsgemaßen Tragei bildet, ist vorzugsweise ein Polymer das aktive oder aktivierbare funktionelle Gruppen aufweist, welche zum emen mit dem Vernet zungsmittel odei aber mit den Reaktivkomponenten oder beidem reagieren können Daε die zweite Komponente deε erfindungsge¬ maßen Trägers bildende Polymer kann auch auε mehreren vernet∑ba ren Polymeren und/oder vernetzbaren Monomeren entstanden sein Das Polymer Kann dabei aus Proteinen und/oder Polyamiden mit funktionellen Gruppen gebildet werden Grundsätzlich smd auch andere Polymere wie Biopolymere oder auch Monomere denkbar , solange eine Vernetzung möglich ist Vorzugsweise ist die zweite Komponente mit mindestens bifunktionellen Verbmdungen ver - netzbar
Bevorzugt werden Polymere eingesetzt, die die wäßrige Suspension der Komponente 1 adsorptiv stabilisieren, d h insbesondere polare Polymere
Die an der zweiten Komponente des erfindungsgemaßen Partikels angeordneten Reaktivkomponenten sind insbesondere Moleküle oder Molekulgruppen, die affine Eigenschaften zu anderen Substanzen aufweiεen Dazu gehören insbesondere Enzyme und mit Enzymen wechselwirkende Substrate Dabei kann zum einen das Substrat oder zum anderen das Enzvm als Reaktivkomponente an odei auf der zweiten Komponente angeordnet sein Ähnlich verhalt es sich mit Antikorper/Antigen, Biotm/Streptavidm-Systemen Strep tavidm bzw. Biotin hat als an den Farbstoff fest gebundene, spezifische Reaktionskomponente den Vorteil, daß der Farbstoff universell einsetzbar ist als Reaktionspartner für biotinylierte oder mit Streptavidin gekoppelte Komponenten. Diese können ihrerseits ganz unterschiedliche Funktionen haben, z B wieder gegen eme andere Komponente spezifisch oder als Katalysator wirken Ebenfalls smd Nuclemsauren vom RNA- oder DNA-Typ alε Reaktivkomponenten im Sinne des erfindungsgemaßen Tragers einsetzbar Die Nuclemsauren sind in der Lage, mit den entspre¬ chenden komplementären oder teilkomplementaren Strängen zu hybridisieren, je nach Stringenz der Reaktionsbedmgungen, und stabile Komplexe zu bilden. Es ist mithin möglich, spezifische Nuclemsaurestrange in einer zu untersuchenden Probe zu iden¬ tifizieren und davonausgehend weiter zu prozeεsieren Es können auch Kombinationen der Reaktivkomponenten an oder auf der zweiten Komponente angeordnet werden Man erhalt dann erfm¬ dungsgemaß Trager die für verschiedene Fragestellungen ein¬ setzbar smd
Durch die Wahl des Vernetzungsmittels und dessen Konzentration und Einstellung bestimmter Verfahrensbedingungen kann die Ver¬ netzungsreaktion so gesteuert werden, daß die zweite Komponente die erste Komponente quasi m einem molekularen Netz einhüllt, dessen Maschen eine enge Maschenweitenverteilung aufweist
Mit den Verfahrensbedmgungen der Vernetzung laßt sich zugleich die Zahl der freien Bmdungsstellen an der Partikeloberflache einstellen, die durch die Bindung deε mindeεtenε bifunktionellen Vernetzers mit nur einer Funktion an die Oberflache für eine weitere Bindung insbesondere von Reaktivkomponenten, frei bleiben Die entstandene Zahl von Bindungsstellen kann voll oder, nach teilweiser Absattigung, zu einem definierten Anteil genutzt werden
Insbesondere kann durch die Verfahrensbedmgungen die Dicke der Hülle emgestellt werden, deren Homogenrtal ansohl leßenα noch durch eme Fraktionierung verbessert werden kann Ein mehrstu¬ figes Verfahren der Umhüllung kann den Einschluß der ersten Komponente noch verbessern.
Die erste Komponente des erfmdungsgemaßen Partikels weist vor¬ zugsweise mindestens eine erfaßbare Eigenschaft, die zumindest in ihrer Qualltat der Komponente 2 und/oder den darauf gebun¬ denen Reaktivkomponenten nicht eigen ist, wie Absorptions oder Emissionsfahigkeit elektromagnetiεcher Wellen, Masse, Magnetis mαs, Dielektrizitat, Radioaktivität, Große und/odei Dichte auf Unter erfaßbaren Eigenschaften, welcher dei Kern als erste Komponente des erfindungsgemaßen Trägers aufweisen kann, wird auch eine pharmakologisch-biologische Wirkung sowie katalytische Wirkung oder Kombinationen davon verstanden So kann beispiels weise die Absorptions- oder Emissionsfahigkeit elektromagneti- schei Wellen durch entsprechende Chromophore oder Fluorophore hergestellt werden Die Eigenεchaften Masse, Große, Dichte hangen physikalisch zusammen und können durch beispielsweise spezifisch schwere Teilchen entsprechend eingestellt werden Die Eigenschaft Große laßt sich vorteilhaft für die Agglomera¬ tion und die Eigenschaft Masse für Gravimetπe ausnutzen Die Agglomeration ist vorteilhaft zur εpezifiεchen Ausfallung von Komponenten m Losungen oder Mikroemulsionen Die erste Korn ponente kann durch radioaktivmarkierte Strukturen mit der Eigenschaft Radioaktivität versehen werden In ähnlicher Weise lassen sich die anderen genannten Eigenschaften mit der ersten Komponente verbinden Die erste Komponente kann auch eme Kapsel sein und Flüssigkeiten oder nicht hinreichend umhullbare (z B extrem kleine oder m Losung instabile) Partikel enthalten
In einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfmdungsgemaßen Tragers ist dieser so beschaffen, daß die erste und zweite Komponenten trennbar miteinander verbunden smd Die Verbindung zwischen erster und zweiter Komponenten erfolgt durch Umhüllung der ersten Komponente mit der zweiten Grundsatz] ich ist es möglich, durch Entfernung der zwerten Komponente die eiste Komponente freizulegen um gegebenenfalls eine mcftechnische Eitassung der mit dem Kern verbundenen Eigenschaften zu erleich¬ tern Eine Entfernung der zweiten Komponente kann beispielsweise bei Proteinen durch entsprechende proteolytische Enzyme erfol¬ gen Diese baut die Hülle ab, so daß der Kern übrig bleibt. Dieser kann dann entsprechend seiner zu messenden Eigenschaft weiter behandelt werden. Es ist ebenfalls möglich, den Kern durch Behandlung mit einem Medium, m dem sich dei Kern bevor zugt lost auε dem Verband erster/zweiter Komponente zu losen, so daß letzlich eme "leere" Hülle zurückbleibt, odei mit einem Gesamtlosungsmittel den gesamten Partikel aufzulösen Su kann beispielsweise, wenn em Farbstoff, der m Ethanol loslich ist, von der zweiten Komponente umhüllt wird, mit dem Lösungsmittel behandelt werden und die erhaltene ethanoliεcht- Lösunq spektros- kopisch vermessen werden Werden die Bedingungen standardisiert und gegebenenfalls geeicht, kann eine entsprechende Verfärbung als Maß für quantitative Bestimmungen herangezogen werden
Große Bedeutung kommt neben den individuellen lagerstabilen, partikelformigen Tragern auch deren Erscheinungsform bei Durch fuhrung von Anwendungsverfahren zu. Dabei treten die lagerstabi- len, partikelformigen Trager m einer Mehrzahl m torm von Populationen m Erscheinung. Für eme Anwendung der erfindungs gemäßen Partikel ist es bevorzugt, daß die Träger in Populatio¬ nen vorliegen, die sich durch eine enge Verteilung der Große der individuellen, erfindungsgemaßen Tragerpartikel auεzeichnet
Insbesondere bevorzugt ist, daß die Population Tragerpartikel aufweist, welche sowohl einen engen Bereich der Großenverteilung der Hülle als auch einen engen Bereich der Großenverteilung des Kerns und damit eine enge Verteilung des Großenverhaltnisses Hulle/Kern aufweist Auch bei anderen Eigenschaften ist eme homogene Verteilung, z.B. der Farbintensität oder der Magneti¬ sierbarkeit, beim Kern insbesondere beim gesamten Partikel erwünscht
ϊ ur die praktische Verwendung des erfindungsgemaßen Partikels a-L- Trager ist es vorteilhaft, an oder aul dei zweiten Fom ponente eine hohe Konzentration von Reaktivkomponenten anzuord¬ nen Dadurch können beispielsweise m Immunoaεsays relativ hohe Bmdungskonstanten zu entsprechenden komplementären Strukturen erreicht werden, obwohl möglicherweise die einzelne Reaktivkom¬ ponente eine nur durchschnittliche Bmdungεkonstante zu der entsprechenden komplementären Struktur aufweist Durch die Vielzahl dei Bindungsstellen wird jedoch eine Eihohung der Bmdungseffektivitat (Aviditat) erreicht
Em Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemaßen Tragerε umfaßt die Schritte der Umεetzung der erεten Komponente minde¬ stens einmal mit einem vernetzbaren Polymeren Dabei kann das Polymere an dei Oberflache der ersten Komponente physikalisch adsorbiert werden Das vernetzbare Polymere wird dabei nach weiteren Behandlungsschπtten die zweite Komponente bilden Dies erfolgt durch Behandlung mit Vernetzungsmittel Alε Vernet¬ zungsmittel kommen insbesondere bifunktionelle Moleküle wie Glutardialdehyd, Dicarbonsauren, Acrylaten, Methacrylaten in Frage Dabei smd die olefmische Gruppen tragenden Vernet¬ zungsmittel beispielsweise durch Fotoreaktionen oder andere Radikalkettenreaktionen aktivierbar Die funktionellen Moleküle können insbesondere über Kondenεations- oder Additionsreaktionen die Polymere vernetzen
Gegebenenfalls können die erste Komponente vor der Behandlung und/oder daε Zwischenprodukt mit der zweiten Komponente und/oder daε Partikel emer Trennung nach Große und/oder einer anderen Eigenschaft unterzogen werden, um eme möglichst homogene Verteilung der Große und/oder einer anderen Eigenεchaft zu erreichen Vorzugεweise wird die Behandlung dei ersten Kom¬ ponente mit Polymeren zwei bis dreimal durchgeführt und insbe¬ sondere bevorzugt eme Trennung nach Großen durchgeführt
Das Verfahren ist besonders vorteilhaft, da sich zunächst unabhängig von emer Reaktion die erste Komponente homogenisie- lfii und in ihrer Konzentration in der Suspension einstellen 1 af t Je nach verwendeter erster Komponente lassen SMII gängige Verfahren zur Homogenisierung und Stabilisierung der Suspension verwenden. Bevorzugt wird zur Stabilisierung der Suspension die zweite Komponente eingesetzt, wenn es sich um eme polare Verbindung mit hinreichend guter Adsorption an die erste Kom¬ ponente handelt Daε Verhältnis der Konzentrationen von erster und zweiter Komponenten wird so gewählt, daß eme geeignete Hullendicke durch Adsorption erreicht wird Beim mehrstufigen Verfahren wild die Hullendicke eher dünn gewählt Auch andere Parameter wie Zeit und Temperatur lassen sich zui Beeinflussung der Adsorption verwenden Danach kann daε Zwischenprodukt wieder homogenisiert werden Um eme gute Vernetzung der Hülle, insbe sondere im inneren Bereich nahe der ersten Komponente zu er - ι eichen, wird dann die VernetZungskomponente in einem Uberrchuf von mehreren Größenordnungen eingesetzt Auch die Vernetzungs komponente laßt sich m ihrer Wirkung durch andere Parameter, insbesondere die Einwirkzeit, beeinflussen, ebenso wie die Zahl dei entstehenden reaktiven Gruppen an der Oberflache durch einseitig gebundene Vernetzermolekule, die nachher auch noch durch teilweise Blockung verringert werden kann
Die erfindungsgemaßen Trager werden vorzugsweise m Asεayverfah- ren wie Immunoassay, Festphasenassays und/oder chromatographi¬ schen Assayε eingesetzt Sie können auch als Vehikel zum Af tmitatstransport von wirksamen Substanzen verwendet werden, wenn alε erste Komponente beispielsweise pharmakologisch aktive Substanzen von der zweiten Komponente umhüllt smd Unter Af- fmitatstransport sind beispielsweise Transporte von pharmakolo- giεch-aktiven Subεtanzen mittels Antikörper, die an der zweiten Komponente angeordnet sind und spezifisch an eine bestimmte Zielstruktur binden, zu verstehen
Auch Partikel mit radioaktiven Kern lassen sich vorteilhaft verwenden, da sie wegen dem Äffmitatstransport vor allem am Einsatzort wirken bzw konzentriert werden und deshalb insgesamt niedrigere Radioaktivitatsmengen verwendbar sind, wodurch eine systemische Belastung m engen Grenzen gehalten werden kann Auch die Verwendung der erfindungsgemaßen lagerstabilen, par tikelformigen Trager alε Katalysator für chemische Reaktionen ist vorteilhaft. So laßt sich für eme εchnelle Durchmiεchung deε tragergebundenen Katalysators (Biokatalyεatorε) mit der Reaktionslosung ein magnetischer Kern verwenden, dessen Gewicht anschließend für eine schnelle Entmischung εorgt
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele nahe] er läutert
Beispiel 1
Herstellung eines Sudan IV-Farbstoffpartikels mit hoher Beladung an Streptavidin als spezifischer Reaktivkomponente für biotmy lierte Komponenten
1 Peptisation
10,0 g Sudan IV wurden zu 100 ml PBS-Puffer (Phosphate Buffer Solution) mit 2 % BSA (Bovine Serum Albumin, sterilflltriert über 2 μm) gegeben und mit hoher Ruhrgeschwmdigkeit zu emei homogenen Suspension gerührt. Die Suspension wurde dann grobfil- tπert (Filterpapier BioRad Modell 543)
Die Suspension wurde auf zwei Zentrifugenrohrchen verteilt und in einer auf 4°C vorgekuhlten Zentrifuge je 5 Minuten bei 1000 Upm, bei 2000 Upm und bei 3000 Upm zentrifugiert Danach erfolgte eme zweite Filtration.
2 Vernetzung und Aktivierung.
50 ml 50%ιge wäßrige Glutaraldehydlosung wurden auf Raumtempera¬ tur gebracht (Abzug) und mit ca 11 ml 0,3 M Na2HPOι-Puffer auf pH 7,3 eingestellt (Überprüfung mit pH-Meter) Danach wurden 25 ml PBS-Puffer sowie 5 ml einer 1 1-Mιschung von PBS-Puffer und bidest lllieitem II π zugegeben Die gesamte Losung (pH 7,3) wurde sterilflltileit (0,2 μm) Zu jeweils 20 ml dieser Glutaraldehyd-Pufferlosung wurden unter Verwirbelung (Vortex) jeweils 20 ml der peptisierten Sudan IV- Suspension gegeben (4 parallele Ansätze) (in der Reaktionslosung ca. 1,5 M Glutaraldehyd bzw. 2,8 M Aldehydgruppen ca l,5xl0"4 M BSA bzw. bei ca 300 Aminosäuren pro BSA ca. 4,5x10 " M reaktive Aminosäure, d.h. ca. 60 Aldehydgruppen pro Aminogruppe) und 4 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt
Jeweils 40 ml aktivierte Suspension wurde im Zentπfugationε- rohrchen mit 2,2 ml 2% BSA-Losung (0,2 μm filtriert) stabili siert Anschließen wurden die Anεatze 5 Minuten bei 2500 Upm zentrifugiert und danach grobfiltriert
3 Saulenremigung (Gelflltration)
Eine Säule mit CL-4B-Sepharose (Pharmacia) wurde gut regeneriert und mindestens eme Stunde bei Raumtemperatur mit PBS-Puffer aquilibriert, dann wurde der Rundfilter aufgegeben und daε überstehenden Puffervolumen abgesaugt bzw ablaufen gelassen Die 160 ml der stabilisierten Suspension wurden auf die Säule aufgegeben und die Säule abgedeckt Nach dem Einsickern (ca 25 Minuten) wurden die Säulenrander mit PBS-Puffer gespült und eine Pumpe angestellt
Für die Fraktionierung wurden konische 12-ml-Röhrchen mit Strichmarkierungen für die Auffangvolumina vorbereitet .
Rohrchen Nr. 1-10 und 23-30 je 4 ml; Nr. 11 und 22 4,5 ml, Nr 12 und 21 5 ml; Nr 13 und 20 5,5 ml; Nr. 14-19 6 ml
Sobald die rote Lauffront im Auslauf erschien, wurden die Frak¬ tionen aufgefangen. Die Gelflltration dauerte ca. 30 Minuten
Je 5 μl jeder Fraktion wurden zur optisch-visuellen Farbstarken- beurteilung mit je 5 ml PBS-Puffer verdünnt (1 1000) und 5 Sekunden verwirbelt (Vorfex) Die Beurterlung der Fraktionen nach ihrer Farbstarke führte zu emem breiten zentralen Peak bereich mit hoher Farbstarke und deutlich abfallende Färbung m den Fraktionen davor und danach Der breite Peakbereich von ca 140 ml wurde verwendet Dessen Fraktionen wurden gepoolt, auf 3 50ml-Rohrchen verteilt, 5 Minuten bei 2500 Upm zentrifu¬ giert und danach grobflltriert
(Bei Bedarf für eme dickere und/oder sicherere Hülle wurden die Schritte 2 und 3 einmal oder mehrere Male wiederholt )
4 Koniugation mit Streptavidm als spezifischer Reaktivkom¬ ponente
100 mg Streptavidm wurden m 6 ml PBS-Puffer gelost, zur Qualitätsprüfung wurde die Proteinkonzentration wurde mit der optischen Dichte bei 280 nm bestimmt und mit der Herεtelleran qabe verglichen Die Streptavidmloεung wurde rn einen 6 mm- Dialyseschlauch gegeben und über Nacht bei 4°C gegen 1 1 PBS- Puffer dialysiert Die Losung wurde m Rohrchen gegeben, der Schlauch mit 4 ml PBS-Puffer nachgespult, und die Proteinkon¬ zentration zur Überprüfung der Ankonzentrierung erneut mit der 0DπO( bestimmt Die Streptavidmlosungen wurden 5 Minuten bei 4000 Upm zentrifugiert und der Überstand zur Konjugation verwen det nach erneuter Bestimmung der 0D2ÖC
Die grobfiltrierte Suspension des mit vernetztem BSA mit aktiven Restaldehydgruppen umhüllten Sudan IV-Farbstoffε wurde m 4 Ansätzen mit dem Streptavidm-Uberstand gekoppelt wie folgt
Ca 3 ml Streptavidmlosung (mit ca. 11 mg/ml Protein) wurden im 50-ml-Rohrchen vorgelegt Dazu wurden unter Verwirbelung ca 30 ml der Suspension gegeben (d h ca 33 mg Streptavidm pro 33 ml Suspension) Die Losungen wurden über Nacht bei Raum temperatur im Uber-Kopf-Schuttler belassen und am nächsten Morgen 5 Minuten bei 2500 Upm zentrifugiert und danach grob filtriert Das gesamte Suεpensionsvolumen betrug danach cd 130 ml
1 Saulenreinigung CL 6B-Sepharosc Farbtest Die Säule wurde wie unter 3 vorbereitet und aquilibriert Daε Einsickern der 130 ml Suspension dauerte ca 25 Minuten, die Gelflltration ca 30 Minuten Rohrchen zur Fraktionierung wurden wie unter 3 vorbereitet Die Fraktionen wurden entweder wie unter 3 verdünnt und nur optisch-visuell beurteilt Bei höherem Anspruch an die Farbqualitat wurden die Fraktionen in einer 1 50-Verdünnung in einem Test entsprechend der DE AI-195 00 862, Beispiel 1, auf ihrer Verwendbarkeit getestet Auf eine Säule mit einem Gelbett mit monoklonalem Maus-anti-human IgG-Antikor pei wurden 250 μl einer 1 5000 verdünnten gepoolten Serumprobe mit ursprünglich 8 4 lU/ml Human-anti-Tetanus IgG gegeben (Empfindlichkeit 1,7 mlU/ml , absolut ca 0,4 mlU, International Units) , gefolgt von 250 μl einer Losung von 5 μg/ml biotmylier lern fetanustoxoid Nach Aufgabe von 250 μ l der 1 50 verdünnten Surpension des mit Streptavidm gekoppelten Farbstoffs mußte noch eine deutliche Färbung erkennbar sein Der zentrale gepool t <^- Bereich mit hoher Absorption umfaßte einen breiten Peak- bereich von ca 100ml, für geringere Ansprüche wurden auch die beiden Schulterbeieiche links und rechts von je ca i O ml getrennt gepoolt Nach Verwirbelung (Vortex) und Grobflltration wurden beide Pools bis zur Stabilisierung bei 4°C (evtl über Nacht) gelagert
6 Stabilisation
20%ιge BSA-Losung m PBS-Puffer wurde auf 0,2 μm sterilfil- triert In mit BSA-Losung gespulten 50-ml-Rohrchen wurden zu 22 ml 20%ιge BSA-Losung unter Verwirbelung (Vortex) 18 ml der grobfiltrierten Suspension gegeben Die Suspensionen wurden dann nochmals grobflltπert
7 Lagerung
In gut verschlossenen 50-ml-Rohrchen ist die Suspension, εtabi- lιc ICI t mit 0,09% Natnumazid, bei 4°C mindestens 12 Monate ""Labil mit tabilem Abεoiptionswert 8. Eigenschaften
Gegenüber einer durchschnittlichen Große von ca 50 nm der Sudan IV-Partikeln liegt die Große nach einmaliger Beεchichtung bei ca 51 bis 200 nm, nach zweimaliger bei 300 bis 400 nm
Beispiel 2
Immunassay mit den eifmdungsgemaßen lagerstabilen, partikel- iomugen Tiagermaterialien gemäß Beispiel 1
Semi-quantitative und quantitative Messung des Tetanus Impfsta tus, d h der Konzentration an anti-Tetanus-IgG in Blut
a) Semi-quantitativer Test
Für den semi-quantitativen Teεt zur visuellen Auswirkung wurde eine Reaktionssaule für simultane Mehrfachmeεεung entsprechend der DE-Al-195 009 862 mit 3 Feldern verwendet
Das untere Reaktionsfeld (Vergleichsfeld) der Reaktionssaule ist mit Protein G und darauf gebunden einer definierten Menge anti Tetanus human IgG beladen, die einem ausreichenden Impf¬ schutz m IU (International Units) der Blutmenge m der Kapil lare für den Blutauftrag entspricht Dafür wurde em gepoolteε Serum entsprechend verdünnt und daε gesamte human-IgG ein¬ schließlich dem tetanus-spezifischen im Durchfluß an daε Protein G dieses Reaktionεfeldes gebunden (Protein G gekoppelt an CNBi - aktivierte Agarose, siehe DE-A-195 00 862, dortiges Beispiel 2)
Das mittlere Negativkontrollfeld enthalt CNBr-aktivierte Sepha rose 4b mit kovalent gekoppeltem BSA Ein oberes Reaktionsfeld (Testfeld) der Reaktionseinheit enthalt nui Protein G gekoppelt an CNBr-aktivierte Agarose
Mit einer Kapillare wird eine definierte Menge Blut auf die Säule aufgetragen Nach dem Waschen mit Waschpuffer werden 250 μl einer Losung von 5 μg/m] biotinyliertem Tetanuεtoxoid (Brotmylierungεgrad 50) in Waschpuffer aufgetragen Nach abermaligem Waschen wird eine 1 20-Waεchpufferverdunnung der Streptavidm-Farbεtoffemulsion aufgetragen und noch einmal gewaεchen
Das gesamte human IgG der Probe wird wahrend ihres Durchlaufs im Test -Tragerbett gebunden In beiden Feldern im Testfeld und im Vergleichsteld wird wahrend des Durchlaufs emer dei jeweils vorher gebundenen anti-Tetanus human IgG entsprechende Menge an biotmylieitem Tetanus Toxoid gebunden Unspezifisch gebun dene Proteine werden vom nachfolgenden Puffei ausgewaschen Danach wird wahrend deε Durchlaufε der Farbεtoffemulεion im Testfeld und im Vergleichsteld eme der jeweils gebundene Menge an Tetanus-Toxoid entsprechende Menge von Streptavidm-gekoppel- tem Farbstoff gebunden Auch hier wird unspezifiεch gebundenes Protein durch den Waschpuffer ausgewaschen Im Negativkontroll- feld wird nichts gebunden
Die semi-quantitative Auswertung erfolgt durch visuellen Farb¬ vergleich Ist die Färbung deε Testfelds gleich oder starker als die des Vergleichsteldε, reicht der Impfεtatuε aus Liegt sie darunter, sollte geimpft werden und zwar um so dringender je großer die Farbdifferenz ist (feinere Unterteilungen von Vergleichεfeidern, z B noch zwei Jahre Schutz, nach fünf Jahre Schutz, Impfung empfohlen, Impfung dringend empfohlen, lassen sich entsprechend arztlichen oder WHO-Angaben erstellen Eme Alternative ist die Auswertung der Eindringtiefe der Farben in das Testfeld mit entsprechenden Markierungen Dann kann ein Vergleichstel d entfallen oder der Absicherung dienen)
\jι Quantitativer Test Hierfür wird nui ein Testfeld benotigt, aber positive und negative Kontrollfelder können zur Sicherheit eingebaut werden
Das Feld wird entsprechend DE-A-195 00 862, Beispiel 2 mit Maus- anti human IgG beladen Die Auftragεfolge und die Reaktionen smd wie untei lit a) beschrieben Die Auswertung erfolgt durch photometrische Absorptionsmeεsung bei 520 nm oder 492 nm nach Eluieren mit emer alkoholischen Losung
Die Eluieiung mit Alkohol ist erforderlich, da wegen dei hohen Zahl an Bindungsεtellen der Farbstoffmarker mit einei solchen Stabilität auf dem Gelbett sitzt, daß er nicht wie andeie Marker mit Hilfe von pH-Änderungen oder durch Verdrängung mit einem Y onkurrenzmolekul vom Gelbett gelost werden kann, auch nicht teilweise, sondern m diesem Fall nur durch Auflosung
Die Testempfindlichkeit liegt für beide Auswertungen in mlU/ml- bereich fui anti-Tetanus-human IgG Absolut lassen sich onne weitere Testoptimierung Mengen unter 10 pg IgG qualitativ (visuell) und quantitativ bestimmen, bei Anreicherung m dei Säule auch noch weniger (pg/ml-Bereich) Die laufende Qualitäts¬ kontrolle ergab eine Stabilität der Emulεion über mindestens 1.. Monate
Beispiel 3
Synthese emes aktivierten Farbstoffpartikelε
Zu 20 ml BSA Losung m einem Konzentrationsbereich von 1 bis 50 mg/ml in 0,01-0,2 M Phosphatpufferlosung, pH 6-8,5, werden 0,1 bis 2 g Kohlenstoff gegeben Die Mischung wird auf einem Magnetruhrer oder einem Vortexmischer gemischt, bis eine aus¬ reichende Adsorption des Proteins (Peptiεation) erfolgt lεt Die erhaltene Suspension wird 5 bis 10 Minuten bei 6000x g zentrifugiert Die Kohlenstoffpartikel von 50 bis 350 nm, auf denen BSA adsor¬ biert iεt, werden im nächsten Schritt mit Glutardialdehyd aktiviert. Die Glutardialdehyd-Konzentration dafür liegt im Bereich von 1 biε 25%, die Aktivierungszeit bei 20 bis 120 Minuten.
Die aktivierte Suspension wird durch 3- bis 4-maliges Zentrifu¬ gieren und durch Gelflltration mit Sepharose 6B, 4B, 2B, CL-6B, CL-4B, CL-2B Sepharcryl S300 oder mit anderen Gelen (Toyoperl, Ultragel etc.) gereinigt, wobei die Ausschlußgrenze nicht kleiner alε 1 Mill. Dalton für globuläre Proteine sein darf. Mit dieser Methode werden schwarze Farbstoffpartikel erhal ten Die Herεtellung anderer Farbstoffpartikel erfolgt analog, wobei an Stelle von Kohlenstoff z.B. für Rot Sudan II genommen wird, für Dunkelrot Sudan III, für Grau Sudan-Schwarz, für Violett Tetiazolformazanvrolett, für Dunkelviolett Neotetrozoldiformazan und für Blau Tetrazoldiformazan Blau. Der Arbeitsbereich für diese Konjugate m Suspension liegt bei 0,08% bezogen auf das Trockengewicht Die Farbstofflabel werden durch Konjugation mit Antianalyten wie Protein A, Streptavidin oder Antikörpern hergestellt .
Beispiel 4
Serologische Bestimmung von anti-HIV-Antikörpern auf nichtporö- ser Festphaεe mit einem Protein A-Kohlenεtoff-Konjugat .
Als Festphase wurden Polystyrol-ELISA-Platten mit adsorbierten synthetischen Peptiden von HIV-1 und HIV-2 eingesetzt. Anschlie¬ ßend wurde in einer Verdünnungsreihe ein Kanmchen-anti-HIV- Serum zugegeben. Nach einer Inkubation von 15 Minuten und eine Waεchschritt wurde Protein A-Kohlenstoff-Konjugat zugegeben und nach 15 Minuten nach einem Waεchεchritt der Ergebnis-Spot abgelesen .
Parallel wurden analoge Experimente mit käuflichem Protein A Gold- Kolloid (40 nm Teilchengrόße) und Protein A POD durchge- fuhrt Der Vergleich der visuellen Auswertung ergab eine Emp findlichkeit der beiden anderen Marker für eme Verdünnung von 1/1280, für daε Kohlenεtoff-Konjugat von 1/20480
Beispiel 5
Bestimmung von HCG mit Kohlenεtoff-Konjugat mit Dunnεchichtchro- matographie
An transparentes PVC 0,5 mm wird em Strip von 2x16 mm Nitrozel¬ lulose angeklebt, Em Ende des Stripε wurde mit einem lxl cm Stückchen Chromatographiepapier als Saugelement verklebt In die Mitte des Nitrozelluloεestrips wurde mit emer Hamilton- Spritze eine Losung von anti-HCG-Antikorper (1 mg/ml in Phos- phatpuffer) gegeben Nach 30 Minuten wird mit 1% Casemlosung (Phosphatpuffer mit Tween) geblockt (eme Stunde) , danach gewaschen und getrocknet
Dei HCG-Standard wird einmal m Phosphat/Tween-Pυffer verdünnt, nachfolgend noch einmal m Urin von gesunden Menschen, wobei bis zu 0,1% Tween 20 zugegeben werden Zu 50 μl dieser Stan- dardlosung werden 50 μl Kohlenstoff-Konjugat mit anti-HCG zugegeben Daε freie Ende deε Strips wird m diese Losung eingetaucht, nach 2 biε 3 Minuten wird daε Ergebniε visuell als schwarze Linie abgelesen. Die Empfindlichkeit reicht mit 50 mlU/ml für einen Schwangerschaftεtest nach einer Woche aus

Claims

Ansprüche
1 Lagerstabiles Partikel auε mmdeεtens einer ersten und mindestens einer zweiten Komponente, wobei die zweite Komponente aus mindestens einem vernetzba¬ ren Polymeren als Hülle die erste Komponente als Kern mindeεtenε teilweise em- und/oder umhüllt und die erste Komponente mindestens eme erfaßbare Eigen¬ schaft aufweist, erhältlich durch Umsetzung einer ersten Komponente mit dem ver¬ netzbaren Polymeren und danach Umsetzung deε gebil¬ deten Produkts mit einem Vernetzungεmittel , so daß die erste Komponente lagerstabil in der zweiten Komponente verbleibt .
2. Partikel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Partikel ein lagerstabiler Träger für trägergebundene Reaktionen, Nachweis- und/oder Isolierverfahren ist, wobei der Träger geeignet ist, mit mindestens einer Reaktivkom¬ ponente, insbesondere einer spezifischen Reaktivkomponente, versehen zu werden.
3. Partikel nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeich¬ net, daß die erste Komponente netzartig von der zweiten Komponente em- oder umhüllt wird.
4. Partikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Komponente mindes¬ tens em Polymer ist, daε aktive oder aktivierbare funk¬ tionelle Gruppen aufweist. Partikel nach Anεpruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Polymer aus einem oder mehreren vernetzbaren Polymeren und/oder vernetzbaren Monomeren entstanden ist
Partikel nach mindeεtenε einem der Anεpruche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer auε mindeεtenε einem Polyamid, bevorzugt einem Protein, oder mindeεtenε einem anderen Biopolymeren mit funktionellen Gruppen gebildet lεt
Partikel nach mmdeεtens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Komponente mit mindestens bifunktionellen Verbindungen vernetzbar ist
Partikel nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet daß an der Oberflache gebundene mindeεtenε bifunktionelle Verbin¬ dungen noch mindestenε eme reaktive Gruppe aufweisen, und daß diese reaktiven Gruppen insgesamt oder zum Teil ab gesattigt werden können und/oder insgesamt oder zum Teil, vorzugsweiεe zu einem bestimmten Anteil, zur kovalenten Bindung von Reaktivkomponenten oder einer weiteren Schicht der zweiten Komponente verwendet werden können
Trager nach mindeεtenε einem der Anεpruche 2 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktivkomponente em Molekül oder eme Molekulgruppe mit affinen Eigenschaften zu arideren Substanzen ist
Trager nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß minde¬ stens eme Reaktivkomponente em Enzym, em mit Enzymen wechselwirkendeε Subεtrat, ein Antikörper, Antigene, Biotin oder Streptavidm, eme Nuclemsaure vom RNA- oder DNA-Typ ist, die hybridisierbar mit einer anderen Nuclemsaure ist Partikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Komponente die erste Komponente in emem molekularen Netz einhüllt, dessen Maschen eme enge Maschenweitenverteilung aufweisen
Partikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die erfaßbaren Eigenschaften der erεten Komponente mindestens eine ist auε der Liste Absorptions- oder Emissionsfahigkeit elektromagnetischer Wellen, Masse, Magnetismus, Dielektrizitat, Radioaktivität, Große, Dichte sowie pharmakologische, biologische und/odei katalytische Wirkung
Partikel nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und zweite Komponente trennbar miteinander verbunden smd
Partikel nach mindestenε einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Trager in Populationen vorliegt und die Populationen nach der Große des Partikels nach der Umhüllung und/oder nach einer dei erfaßbaren Ergenschaften der ersten Komponente vor, wahrend und/oder nach der Umhüllung mindestens einmal fraktioniert sind
Partikel nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß daε Partikel m einer Population mit einer engen Verteilung der Große und/oder der erfaßbaren Eigenεchaft, insbesondere der Große und/oder Farbe, vorliegt
Partikel nach Anspruch 14 und/oder 15, dadurch gekenn zeichnet, daß daε Partikel einen engen Bereich für die Verteilung einer erfaßbaren Eigenεchaft der ersten Kom¬ ponente, insbesondere der Große und/oder der Farbe, voi - liegt Partikel nach mindestens einem der Ansprüche 2 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Trager eine hohe Belegung der zweiten Komponente mit mindestens einer Reaktivkom¬ ponente, bevorzugt spezifischen Reaktivkomponenten, auf¬ weist
Partikel nach mindestens emem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktivkomponente (n) über Spacer mit der Hülle und dem Kern verknüpft ist
v/erfahren zur Herεtellung eines Partikels aus mindestens einer ersten und mindestenε einer zweiten Komponente, wobei die erste Komponente mindeεtenε einmal behandelt wird mit mindestens einem vernetzbaren Polymeren als zweiter Kom¬ ponente und das jeweilige Produkt und/oder des Endprodukt mit mindestens einer mindestens bifunktionellen Verbindung vernetzt wird
Verfahren nach Anεpruch 19, gekennzeichnet dadurch, daß in dem Verfahren mindestens einmal eine Fraktionierung dei unbehandelten ersten Komponente, eines Zwischenproduktes und/odei deε Partikels nach der Große und/oder einer anderen erfaßbaren Ergenschaft durchgeführt wird
Verfahren nach Anspruch 19 und/oder 20, wobei die minde¬ stens bifunktionelle Verbindung eme Verbindung ist wie z.B em Dialdehyd, insbesondere Glutardialdehyd, eme Dicarbonsaure, em Acrylat oder eme DivmylVerbindung, und das vernetzbare Polymere über Kondensations-, Addi- tionε- oder Substitutionsreaktionen vernetzt wird
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung mit dem Polyme¬ ren und/oder dem Vernetzungsmittel und/oder eme Frak tionierung zweimal odei mehrfach durcngefuhrt werden 23. Verwendung des Partikels gemäß mindestens einem der Ansprü¬ che 2 bis 18 in Assayverfahren, insbesondere qualitativen, semi-quantitativen und quantitativen Saulenfestphasen- Immunoassayε .
24 Verwendung des Partikels gemäß Anspruch 23, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die erfaßbare Eigenschaft manuell und/oder visuell qualitativ ausgewertet wird, oder semi quantitativ über Vergleichsteider und/oder Konzentrationszonen
25 Verwendung des Partikels gemäß Anεpruch 23, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die erfaßbare Eigenschaft meftechnisch quantitativ ausgewertet wird, bei Bedarf nach Auflorung der zweiten Komponente und/oder des gesamten Partikels in einem anderen Lösungsmittel oder unter anderen Bedingungen wie anderer pH und/oder andere SalzkonzentratICH
26 Verwendung deε Partikels gemäß mindestens einem der Ansprü¬ che 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß mindeεtenε zwei erfaßbare Eigenschaften verwendet werden, z.B Magnetismus zur Verbesserung der Durchmischung und/oder der εpateien Abtrennung der Festphase von der fluiden Phase und/oder Absorption zur Quantifizierung.
27 Verwendung eines Partikels nach mindeεtenε einem der Ansprüche 1 bis 15 für den Einsatz pharmakologischer und/oder biologischer Wirksubstanzen, gekennzeichnet durch eine Auflösung oder Abtrennung mindestenε dei zweiten Komponente .
28 Verwendung des Partikels nach Anspruch 2 ~> , dadurch gekenn¬ zeichnet, daß eine enge Großenverteilung der zweiten Kom¬ ponente die Zeit bis zur Auflösung und/oder eine enge Verteilung mindestens einer erfaßbaren Eigenschaft der ersten Komponente die Wirkung in einem engen Bereich bestimmt Verwendung eines Partikels nach Anspruch 27 und/oder 28 als Vehikel zum Äffmitatstransport von wirksamen Substan¬ zen
Verwendung eines Partikels gemäß mindestens einem der Ansprüche 2 bis 15 alε Katalyεator für chemiεche und/oder biochemische Reaktionen.
Verwendung des Partikels gemäß Anspruch 30, gekennzeichnet dadurch, daß mindestenε zwei erfaßbare Eigenschaften ver¬ wendet werden, z.B Magnetiεmuε zur εchnellen Durchmischung und Gewicht zur schnellen Abtrennung
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