DE19533346B4

DE19533346B4 - Nachweis von Antigenen und Antikörpern in einem Testmedium

Info

Publication number: DE19533346B4
Application number: DE1995133346
Authority: DE
Inventors: Tadahiko Hachioji Kitano; Ayumi Mito; Mikio Narashino Nakayama; Tetsuro Ogawa; Tsuneo Hiraide
Original assignee: Pentax Corp
Current assignee: KITANO, TADAHIKO, HACHIOJI, JP; Pentax Corp
Priority date: 1994-09-08
Filing date: 1995-09-08
Publication date: 2007-03-15
Anticipated expiration: 2015-09-09
Also published as: JPH0875747A; GB2293009B; JP3300542B2; GB9518440D0; DE19533346A1; GB2293009A

Abstract

Nachweisblatt zum Nachweis eines in einem Testmedium erwarteten Antigens oder Antikörpers, bestehend aus einem faserigen Träger, auf dem Teilchen aus einer Kalziumphosphatverbindung mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 0,01 bis 200 Mikron und einem Ca/P-Verhältnis von 1,0 bis 2,0 vorhanden sind, wobei ein bekanntes Antigen oder ein bekannter Antikörper an der Kalziumphosphatverbindung immobilisiert ist.

Description

Die Erfindung betrifft ein Nachweisblatt, einen Nachweissatz und ein Nachweisverfahren für ein Antigen oder einen Antikörper in einem Testmedium wie einer biologischen Flüssigkeit, beispielsweise Speichel, Blut, Lymphflüssigkeit und andere.
In der Medizin ist es sehr wichtig, eine klinische Prüfung in einem externen oder extrakorporalen diagnostischen Verfahren auszuführen. Bei diesem externen diagnostischen Prozeß gehören zu den bekannten Methoden zum Nachweis von Antigenen oder Antikörpern beispielsweise der Radioimmuntest, Enzymimmuntest und andere. Da hierbei Radioisotope verwendet werden, kann der Radioimmuntest nicht allgemein in Hospitälern und anderen Einrichtungen angewendet werden. Ferner ist es in Kliniken oder kleinen Krankenhäusern schwierig, einen solchen Immuntest sofort bei Bedarf durchzuführen, da diese Einrichtungen manchmal keinen Medizintechniker oder Experten beschäftigen. Ferner ist es als Alternativlösung möglich, in solchen Kliniken oder Krankenhäusern einen Immuntest bei anderen Organisationen durchzuführen. Es erfordert jedoch eine längere Zeit, bis die Prüfungsergebnisse vorliegen. Es ist daher ein Bedarf vorhanden für ein neuartiges Material oder einen Gegenstand zur Anwendung bei der Diagnose verschiedener Krankheiten, wobei ein Prüfungsergebnis schnell und sehr genau auf einfache Weise erzielbar sein soll.

Zum Stand der Technik wird auf die Druckschrift JP 01038658 A verwiesen, aus der die Immobilisierung von Antikörpern auf Hydroxyapatitkügelchen bekannt ist. Ferner wird auf die Druckschriften EP 0 420 053 A1 und US 4 975 366 verwiesen, die Testelemente mit faserigen Trägermaterialien und partikelförmigen Beschichtungen zur Immobilisierung von Antikörpern betreffen.

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Nachweisblatt, einen Nachweissatz und ein Nachweisverfahren anzugeben, wodurch ein Antigen oder Antikörper in einem Testmedium wie z.B. einer biologischen Flüssigkeit schnell und mit hoher Genauigkeit auf einfache Weise erfaßbar ist.

Die Erfindung löst diese Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1, 6 oder 11. Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand jeweiliger Unteransprüche.

Anspruch 1 gibt ein Nachweisblatt für ein Antigen oder einen Antikörper in einem Testmedium an. Dieses Blatt enthält ein faseriges Material, auf dem Teilchen aus einer Kalziumphosphatverbindung mit einer mittleren Teilchengröße von 0,01 bis 200 Mikron und einem Verhältnis von Kalzium zu Phosphor (Ca/P-Verhältnis) von 1,0 bis 2,0 vorhanden sind, wobei ein bekanntes Antigen oder ein bekannter Antikörper an der Kalziumphosphatverbindung immobilisiert ist.

Bei der Lösung gemäß Anspruch 6 ist ein Nachweissatz für ein Antigen oder einen Antikörper in einem Testmedium vorgesehen. Dieser Nachweissatz enthält das Nachweisblatt vorstehend beschriebener Art und eine Lösung aus einer Markierverbindung für das erwartete Antigen oder den Antikörper in Zuordnung zu dem Nachweisblatt.

Ein Verfahren zur Lösung der gestellten Aufgabe wird in Anspruch 11 angegeben, und bei diesem Verfahren sind folgende Schritte vorgesehen:
Immobilisieren eines bekannten Antigens oder Antikörpers auf Teilchen aus einer Kalziumphosphatverbindung mit einer mittleren Teilchengröße von 0,01 bis 200 Mikron und einem Ca/P-Verhältnis von 1,0 bis 2,0, die auf einem faserigen Material vorhanden sind, um ein Nachweisblatt zu bilden,
Maskieren der Teile des Nachweisblatts, die kein Antigen oder keinen Antikörper aufweisen, mit einem Blockmittel mit Adsorptionsfähigkeit für die Kalziumphosphatverbindung, das mindestens ein Protein mit einer geringen Spezifizität für das immobilisierte Antigen oder den immobilisierten Antikörper hat,
Berühren des Nachweisblatts mit dem Testmedium zum Einleiten einer Reaktion zwischen dem immobilisierten Antigen oder dem immobilisierten Antikörper und dem erwarteten Antigen oder Antikörper, und
weiteres Kontaktieren des Nachweisblatts, das einen in der Reaktion gebildeten Antigen-Antikörper-Komplex enthält, mit einer Lösung einer Markierverbindung, die spezifisch mit dem erwarteten Antigen oder Antikörper verbindbar ist, um den Antigen-Antikörper-Komplex nachzuweisen.

Wie ferner aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen hervorgeht, basiert die Erfindung auf der Erkenntnis, daß ein befriedigender Nachweis von Antigenen und Antikörpern möglich ist, wenn eine Antigen-Antikörper-Reaktion in dem Immuntest auf einem blattförmigen Gegenstand erfolgt, der aus einem faserigen Material besteht, auf dem Teilchen der Kalziumphosphatverbindung mit einer Adsorptionsfähigkeit für die Antigene und Antikörper vorhanden sind. Die Teilchen der Kalziumphosphatverbindung, die hier verwendet und im folgenden noch beschrieben wird, haben einen mittleren Teilchendurchmesser von 0,01 bis 200 Mikron und ein Ca/P-Verhältnis von 1,0 bis 2,0.

Bei Verwendung des blattförmigen Gegenstandes oder Nachweisblatts nach der Erfindung ist es möglich, jedes vermutete Antigen oder vermuteten Antikörper aus einem Testmedium mit einfachen Schritten und schnell sowie mit hoher Erfassungsgenauigkeit nachzuweisen. Zusätzlich ist ein billiger Nachweissatz realisierbar, der einen leichten, schnellen und genauen Nachweis des Antigens oder des Antikörpers in Kliniken und kleinen Krankenhäusern ermöglicht, die keine Experten wie Medizintechniker u.ä. beschäftigen. Unter einem Testmedium wird im folgenden ein weiter Bereich flüssiger Stoffe verstanden, mit denen die Erfindung vorteilhaft anwendbar ist. Typische Beispiele sind biologische Flüssigkeiten wie z.B. Speichel, Blut, Lymphflüssigkeit und andere.

Bei dem Nachweisblatt nach der Erfindung werden die Teilchen der Kalziumphosphatverbindung auf dem faserigen Material als Mittel zum Adsorbieren und Immobilisieren eines bekannten Antigens oder Antikörpers verwendet. Die Kalziumphosphatverbindungen sind nicht begrenzt, soweit sie ein Ca/P-Verhältnis im Bereich von 1,0 bis 2,0 haben. Entsprechend können die Kalziumphosphatverbindungen wahlweise aus einer großen Zahl bekannter Kalziumphosphatverbindungen abhängig von Eigenschaften des Nachweisblatts und anderen Faktoren gewählt werden. Beispielsweise können eine oder mehrere der folgenden Kalziumphosphatverbindungen verwendet werden: Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂, Ca₁₀(PO₄)₆F₂, Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂, Ca₁₀(PO₄)₂, Ca₂P₂O₇, Ca₄O(PO₄)₂ und CaHPO₄. Unter diesen Kalziumphosphatverbindungen werden vorzugsweise Hydroxyapatit und Trikalziumphosphat eingesetzt, dabei ist die günstigste eine Kalziumphosphatverbindung, die Hydroxyapatit als Hauptkomponente enthält. Wird Fluorapatit als Kalziumphosphatverbindung verwendet, so sollte der Fluoranteil in allen Kalziumphosphatverbindungen nicht mehr als 5 Gew% betragen, weil ein Fluoranteil über 5 Gew% ein unerwünschtes Auswaschen von Fluor aus solchen Verbindungen hervorrufen kann.

Die Kalziumphosphatverbindungen können auf jede geeignete Weise hergestellt werden, dazu gehören ein Naßverfahren, ein Trockenverfahren und andere.

Die Teilchen der Kalziumphosphatverbindung können auf jede geeignete Weise hergestellt sein. Beispielsweise können sie durch Sprühtrocknung eines Schlamms der Kalziumphosphatverbindung und anschließendes Sintern des trockenen Produkts hergestellt werden. Es ist auch möglich, andere Granulierverfahren anzuwenden, falls dies erwünscht ist. Vorzugsweise können Sieb- und andere Trennverfahren zum wahlweisen Erhalten der Teilchen aus der Kalziumphosphatverbindung mit dem vorbestimmten Bereich der Teilchengröße abhängig von dem beabsichtigten Einsatzzweck angewendet werden.

Vorzugsweise haben die Teilchen aus der Kalziumphosphatverbindung einen mittleren Durchmesser von 0,01 bis 200 Mikron. Der mittlere Teilchendurchmesser von weniger als 0,01 Mikron verursacht eine leichte Aggregation der Teilchen, wodurch ihre gleichmäßige Verteilung auf dem faserigen Material mit z.B. nicht gewebter Struktur verhindert wird. Eine mittlere Teilchengröße von mehr als 200 Mikron führt zu einer unzureichenden Verteilung der Teilchen auf dem faserigen Material, d.h. es zeigt sich ein merklich verringerter Teilchenanteil auf dem Material.

Ferner sind die Teilchen der Kalziumphosphatverbindung vorzugsweise poröse Teilchen. Diese enthalten agglomerierte Primärteilchen mit einer spezifischen Oberfläche von nicht weniger als 10 m²/g und einer Porengröße von 500 bis 1000 Angström. Eine spezifische Oberfläche von weniger als 10 m²/g sollte vermieden werden, da dann eine befriedigende Adsorptionsfähigkeit nicht gegeben ist. Um eine Einführung der adsorbierten Proteine und anderer Substanzen in die Poren oder Zellen der Teilchen zu erreichen, sollen sie vorzugs weise Poren oder Zellen mit der obengenannten Porengröße von 500 bis 1000 Angström haben.

Die porösen Teilchen der Kalziumphosphatverbindung können nach jedem bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können sie aus Anfangsteilchen hergestellt sein, die kristalline Teilchen aus der Kalziumphosphatverbindung sind, welche nach einem bekannten Naßverfahren synthetisiert sind. Ein Schlamm der Anfangsteilchen als Suspension wird direkt sprühgetrocknet oder anderen Behandlungen unterzogen, um Sekundärteilchen zu erzeugen. Der Schlamm kann auch sprühgetrocknet und nach anderen Verfahren bearbeitet werden, um die Sekundärteilchen zu erhalten, nachdem ein die Viskosität änderndes Mittel, Teilchen oder Fasern einer organischen Verbindung, die bei Erhitzen verdampfen, dem Schlamm beigegeben sind.

Die erhaltenen Sekundärteilchen haben bereits eine poröse Struktur, so daß sie als Startmaterial bei der Herstellung des Nachweisblatts dienen können. Alternativ können solche porösen Teilchen, falls Teilchen der Kalziumphosphatverbindungen mit stark erhöhter Porosität gewünscht sind, hergestellt werden durch Zubereiten eines Schlamms der Sekundärteilchen als Suspension und anschließendes Formen des Schlamms in einem Naßverfahren oder in einem Trockenverfahren unter Anwendung von Druck zum Herstellen eines Körpers aus den Kalziumphosphatverbindungen. Bei dem Zubereiten des Schlamms kann jede organische Verbindung, die aus dem Blockkörper während des nachfolgenden Sinterns verdampft, beigegeben werden, um die Ausbildung fein verteilter Poren oder Zellen in den erhaltenen Teilchen zu unterstützen. Eine solche Beigabe einer organischen Verbindung erfolgt wahlweise, sie kann auch unterbleiben, weil eine Porengröße oder ein Durchmesser der Teilchen durch Ändern der einwirkenden Sintertemperatur und anderer Bedingungen beeinflußbar ist. Der erhaltene blockartige Körper wird dann bei einer Temperatur von 500 bis 1300°C gesintert. Eine Temperatur unter 500°C ist zur vollständigen thermischen Verflüchtigung der organischen Verbindung und zum Sintern des blockförmigen Körpers unzureichend. Falls das Sintern des Körpers bei einer Temperatur über 1300°C erfolgt, kann sich ein zu dicht gesinterter Körper oder ein Zerfall des Kalziumphosphats ergeben. Der so gesinterte Körper wird pulverisiert und dann klassiert, um poröse Teilchen der gewünschten Größe zu erhalten. Die Porengröße der Teilchen kann durch geeignetes Ändern der Größe der kristallinen Teilchen der Kalziumphosphatverbindungen in dem Anfangsschlamm zur Herstellung der Sekundärteilchen, der Viskosität des Schlamms, der Eigenschaften von Zusatzstoffen und anderer Faktoren verändert werden.

Bei dem Nachweisblatt nach der Erfindung befinden sich die vorstehend beschriebenen Teilchen aus der Kalziumphosphatverbindung auf einem faserigen Material. Das hier verwendete Material besteht aus einer großen Vielfalt von Stoffen, typische Beispiele sind Papiere und nicht gewebte Strukturen natürlicher oder synthetischer Stoffe.

Die Ausbildung des faserigen Materials mit den darauf enthaltenen Teilchen der Kalziumphosphatverbindung erfolgt nach jedem geeigneten Papier- oder Blattherstellungsverfahren. Ist das faserige Material ein Papier, so kann es mit den darauf vorhandenen Teilchen der Kalziumphosphatverbindung beispielsweise durch Anwenden der Teilchen als Füllmaterial und Aufbringen dieses Füllmaterials auf das Papierherstellmaterial nach einem internen Zusatz- oder Einlagerungsverfahren oder durch Zufügen des Füllmaterials zu dem Rohpapier in einem Beschichtungsverfahren hergestellt werden. Wird das Einlagern des Füllmaterials bei der Herstellung des Papiers angewendet, so können die Teilchen der Kalziumphosphatverbindung und weitere Zusatzstoffe zu dem Papierherstellmate rial hinzugefügt werden, das nach eingehendem Vermischen einer Papiermaschine üblicher Art zum Herstellen des beschickten Papiers zugeführt wird. Ferner können bei Anwendung des Füllstoff-Beschichtungsverfahrens die Teilchen der Kalziumphosphatverbindung zusammen mit einem Bindemittel auf das Rohpapier als Schicht aufgebracht werden, um das beschickte Papier herzustellen. Als Bindemittel können typischerweise Natriumpolyacrylat, Polyvinylalkohol, Latex, Polyacrylsäure, Polyethylenoxyd, Carboxymethylzellulose, Polyester und ähnliche eingesetzt werden.

Wie bei der vorstehend beschriebenen Herstellung des beschickten Papiers können ähnliche Verfahren auch bei der Herstellung eines nicht gewebten Materials angewendet werden, auf dem die Teilchen der Kalziumphosphatverbindung vorhanden sind. Vorzugsweise kann ein solches Material hergestellt werden durch Aufbringen der Teilchen der Kalziumphosphatverbindung auf mindestens eine Fläche des faserigen, nicht gewebten Materials, wobei mindestens ein Teil der Fasern thermoplastische Polymerfasern sind und ein Naßverfahren oder ein Trockenverfahren angewendet wird. Nach dem Herstellen dieses Materials erfolgt eine Wärmebehandlung, um mindestens einen Flächenteil der polymeren Fasern des nicht gewebten Materials zu erweichen, wodurch die Teilchen der Kalziumphosphatverbindung auf dem Oberflächenteil der Fasern fixiert werden.

Bei dem faserigen Material mit den darauf vorhandenen Teilchen aus der Kalziumphosphatverbindung liegt der Anteil der Teilchen allgemein im Bereich von 1 bis 65 Gew%, vorzugsweise im Bereich von 5 bis 50 Gew%. Liegt der Anteil unter 1 Gew%, so ist eine Adsorption eines Antigens oder Antikörpers nur schwierig zu erreichen. Übersteigt der Anteil 65 Gew%, so können die Kosten erhöht werden, da der Anteil des Anti gens oder Antikörpers sowie die Konzentration des Blockmittels erhöht sind.

Bei dem so hergestellten faserigen Material mit darauf getragenen Teilchen enthält mindestens ein Oberflächenteil, wie beschrieben, eine Schicht der Kalziumphosphatverbindung und entsprechend kann das faserige Material eine ausgezeichnete Adsorptionsfähigkeit für die Antigene und Antikörper wie Bakterien, Viren u.ä. haben. Das faserige Material mit den darauf vorhandenen Teilchen wird als Nachweisblatt nach der Erfindung zum wirksamen Adsorbieren der Antigene oder Antikörper eingesetzt.

Das Nachweisblatt nach der Erfindung kann hergestellt werden durch Adsorbieren eines bekannten Antigens oder Antikörpers auf dem faserigen Material mit den darauf vorhandenen Teilchen und anschließendes Immobilisieren der adsorbierten Antigene oder Antikörper zum Ausbilden eines immobilisierten Antigens oder Antikörpers. Die Antigene und Antikörper, die zum Immobilisieren verwendet werden, können frei aus einer großen Menge bekannter Antigene und Antikörper gewählt werden, abhängig von den Eigenschaften der vermuteten Antigene und Antikörper bei dem Testmedium sowie von anderen Faktoren. Das Immobilisierverfahren ist gleichfalls nicht beschränkt, es kann jedes bisher übliche Verfahren angewendet werden. Jedes übliche Immobilisierungsmittel kann zum Immobilisieren eingesetzt werden. Vorzugsweise wird ein Vernetzungsmittel mit mindestens einem Aldehyd oder einer Epoxygruppe in einem Molekül verwendet. Typische Beispiele geeigneter Mittel sind Glutaraldehyd, Formaldehyd, 3-Glycidoxypropyltrimethoxysilan, Bisoyxsilan, Epichlorhydrin u.ä.

Nach dem Immobilisieren werden vorzugsweise die Stellen des Nachweisblatts, an denen Antigene oder Antikörper nicht ad sorbiert sind, mit einem Blockmittel behandelt, um sie zu maskieren. Das hierzu verwendete Mittel ist nicht beschränkt, soweit es an solchen Stellen des Nachweisblatts adsorbiert werden kann und eine geringere Spezifizität für die immobilisierten Antigene oder Antikörper hat. Vorzugsweise werden jedoch Proteine wie Kasein, Albumin und Gelatine als Blockmittel eingesetzt.

Wenn die so immobilisierten Antigene oder Antikörper mit einem Testmedium wie z.B. einer Testlösung kontaktiert werden, in der Antigene oder Antikörper vermutet werden, so können diese mit einer hohen Empfindlichkeit leicht nachgewiesen werden, nachdem eine weitere Kontaktierung mit einer Lösung eines geeigneten Markiermittels erfolgt. Ferner bewirkt das vorstehend beschriebene Maskieren der Stellen ohne Antigene oder Antikörper eine Verringerung der Tendenz einer unerwünschten nichtspezifischen Reaktion auf einen merklich verringerten Grad. Das Nachweisblatt nach der Erfindung mit solchen immobilisierten Antigenen oder immobilisierten Antikörpern kann vorteilhaft beim Nachweis jeglicher Antigene oder Antikörper in einem Testmedium eingesetzt werden. Um die Handhabung zu verbessern, kann das Nachweisblatt ferner ein Versteifungselement auf seiner Rückseite enthalten. Dieses hat vorzugsweise die Form eines Films oder einer Folie. Das Versteifungselement kann aus verschiedenen Materialen wie Papier, Kunststoff, Keramik, Metall oder anderen Materialien bestehen und nach einem geeigneten Formverfahren ausgebildet sein. Zusätzlich kann ein Nachweissatz für Antigene oder Antikörper vorgesehen sein, in dem das vorstehend beschriebene Nachweisblatt mit einer Lösung eines Markiermittels für die vermuteten Antigene oder Antikörper zusammengebracht wird. Hierunter ist zu verstehen, daß bei der Realisierung der Erfindung jede Kombination des Nachweisblatts und der Lösung des Markiermittels verwendbar ist, um den gewünschten Nachweissatz zu realisieren.

Die bei der Herstellung des Nachweissatzes verwendete Markierverbindung kann aus verschiedenen Verbindungen ausgewählt sein, die auf dem Gebiet der Immuntests bekannt sind. Typische Beispiele geeigneter Verbindungen sind Enzym-markierte Antikörper oder Antigene, Isotop-markierte Antikörper oder Antigene und andere, mit denen eine spezielle Verbindung mit einem vermuteten Antigen oder Antikörper in einem Testmedium möglich ist. Vorzugsweise werden die Enzym-markierten Antikörper oder Antigene als Markierverbindung verwendet, da sie keine speziell aufgebauten Installationen benötigen, wie sie zur Verwendung mit den Isotop-markierten Antikörpern oder Antigenen nötig sind, zusätzlich zu der vereinfachten Nachweismethode.

Wenn die Enzym-markierten Antikörper oder Antigene als Markierverbindung dienen, sollte die Unterlage für das Markier-Enzym mit einer Farbe mit der Wellenlänge des sichtbaren oder ultravioletten Lichts zusammen mit der Markierverbindung verwendet werden, so daß vermutete Antigene oder Antikörper leicht nach einem einfachen Verfahren erfaßt werden, wie Sichtprüfung, Bestimmen einer Absorption u.ä. Geeignete Kombinatonen des Enzyms und der Unterlage sind beispielsweise

Enzym	Unterlage
Alkaliphospat	BCIP und NBT
dito	DNP
Meerrettichperoxidase	OPD
dito	DAB
dito	4CN
β-D-Galactosidase	pNPG
dito	X-gal
dito	Bluo-gal

Das Nachweisblatt und das Nachweisverfahren nach der Erfindung können prinzipiell zum Bestätigen verwendet werden, ob ein Antigen oder ein Antikörper in einem Testmedium enthalten ist oder nicht. Ferner können sie zur quantitativen Analyse des Antigens oder des Antikörpers mit befriedigenden Ergebnissen angewendet werden, wenn ein Vergleich der Farbdichte der angezeigten Farben oder eine Bestimmung der Absorption nach dem Erfassungsschritt durchgeführt wird.

Die Erfindung wird im folgenden weiter anhand einiger Arbeitsbeispiele erläutert. Sie ist hierauf aber nicht beschränkt.
Beispiel 1
Herstellen des Nachweisblatts:
Poröse Teilchen aus Hydroxyapatit mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 3,5 Mikron und einem Ca/P-Verhältnis von 1,67 wurden auf ein nicht gewebtes faseriges Material mit einer Dicke von 0,2 mm und einer Größe von 5 × 10 mm aufgebracht, das aus 50 Gew% Polyethylen und 50 Gew% Polyethylenterephtalat besteht. Das Material wurde thermisch behandelt, um ein faseriges, mit Keramik versetztes Material zu bilden, auf dem gleichmäßig 24 Gew% der Hydroxyapatitteilchen verteilt waren. Ein A-Typ Grippevirus mit einem Wert von 256 HA (Hämagglutination) wurde auf das faserige Material aufgebracht und dieses dann in eine viermal verdünnte Lösung aus einem Blockmittel mit Kasein, Handelsname "Block Ace" der Snow Brands Milk Products Co., Ltd. eingebracht, um die nicht mit dem Grippevirus versehenen Stellen des Materials selektiv zu maskieren. Das Nachweisblatt nach der Erfindung, d.h. ein faseriges Material mit daran gebundenen Grippeviren, wurde auf diese Weise hergestellt.
Auswertung des Nachweisblatts:
Das Blatt wurde hinsichtlich seiner Adsorptionsempfindlichkeit für einen Virus geprüft. Es wurde in eine variierte Lösung von Tollwut-Antiserum für das vorstehend genannte Grippevirus (Testmedium) eingetaucht, und seine Virus-Adsorptionsempfindlichkeit wurde in einem Enzym-Immuntest mit einem Alkali-Phosphatase-gebundenen Antikörper und DNP als Substrat bestimmt. Die Entscheidung "positiv" oder "negativ" wurde auf einem Absorptionsmeter des Systems Microwell der Firma Organon Teknika Co. getroffen, und die Entscheidung "positiv" wurde dem getesteten Blatt zugeordnet, wenn es eine Absorption von 0,2 oder mehr zeigte, d.h. wenn es eine gelbe Färbung hatte. Die Entscheidung wurde zweimal für jedes Blatt getroffen, und die erste Entscheidung wurde zehn Minuten nach dem Einleiten der Enzym-Antikörper-Reaktion und die zweite Entscheidung eine Stunde später getroffen.
Zum Vergleich wurde das vorstehende Verfahren wiederholt unter Verwendung einer variierten Lösung normalen Tollwutserums anstelle der Lösung des oben beschriebenen Antiserums.
Die Ergebnisse der vorstehenden Auswertungen zeigten, daß das Nachweisblatt nach der Erfindung eine ausgezeichnete Empfindlichkeit und Spezifizität hat. Bei dem Auswertungstest mit Antiserum für den Grippevirus wurde zehn Minuten nach Einleitung der Reaktion die Entscheidung "positiv" getroffen, bis die Antiserumverdünnung weiter auf ein Volumen von 6400 mal gelöst war, und in der Stunde nach Einleitung der Reaktion wurde die Entscheidung "positiv" getroffen, bis die Antiserumlösung weiter auf ein Volumen von 51200 mal oder mehr verdünnt war. Im Gegensatz zu diesen befriedigenden Ergebnissen wurde bei dem Auswertungstest unter Verwendung des normalen Serums die Entscheidung "negativ" bei einem Auflösungsgrad von nur 10 mal oder weniger getroffen.
Beispiel 2
Herstellung des Nachweisblatts:
Poröse Körner aus Hydroxyapatit mit einer mittleren Teilchengröße von 80 Mikron und einem Ca/P-Verhältnis von 1,67 wurden zusammen mit Natriumpolyacrylat als Bindemittel auf ein nicht gewebtes faseriges Material mit einer Dicke von 0,3 mm und einer Größe von 5 × 10 mm aufgebracht, das zu 100 Gew% aus Rayon bestand. Hierdurch wurde ein mit Keramik versetztes faseriges Material gebildet, auf dem weitgehend gleichmäßig 16 Gew% der Hydroxyapatitteilchen verteilt waren.
Ein Grippevirus vom Typ A mit einem Wert von 256 HA wurde auf dem faserigen Material ähnlich wie in Beispiel 1 immobilisiert, um das Nachweisblatt nach der Erfindung zu bilden, d.h. ein faseriges Material mit darauf gebundenen Grippeviren.
Auswertung des Nachweisblatts:
Das in vorstehend beschriebener Weise hergestellte Nachweisblatt wurde in dem Verfahren nach Anspruch 1 verwendet. Das Testmedium war eine 100fache Verdünnung von Tollwut-Antiserum für den Grippevirus und zum Vergleich eine 100fache Verdünnung normalen Tollwutserums. Die Ergebnisse zeigten, daß für die Auswertung mit dem Antiserum für den Grippevirus eine völlig klare positive Reaktion zu beobachten war, während die Stärke der Farbanzeige des Substrats ungefähr auf die Hälfte derjenigen reduziert war, die sich bei Verwendung des mit dem Grippevirus versehenen faserigen Materials nach Beispiel 1 ergab. Für die Auswertung mit dem Normalserum mußte die Entscheidung "negativ" getroffen werden.
Beispiel 3
Herstellung des Nachweisblatts:
Poröse Körner aus Tetrakalziumphosphat mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 4,0 Mikron und einem Ca/P-Verhältnis von 2,0 wurden auf ein nicht gewebtes faseriges Material mit einer Dicke von 0,2 mm und einer Größe von 5 × 10 mm aufgebracht, das zu 100 Gew% aus Polypropylen bestand. Das nicht gewebte Material wurde thermisch behandelt, um eine mit Keramik versehene faserige Unterlage zu bilden, auf der 28 Gew% des Tetrakalziumphosphats praktisch gleichmäßig verteilt waren.
Ein Grippevirus vom Typ A mit einem 256 HA-Wert wurde auf dem faserigen Material ähnlich wie in Beispiel 1 immobilisiert, um das Nachweisblatt nach der Erfindung herzustellen, d.h. ein faseriges Material mit darauf gebundenen Grippeviren.
Auswertung des Nachweisblatts:
Das Verfahren nach Anspruch 2 wurde wiederholt. Die Auswertungsergebnisse waren leicht verschlechtert im Vergleich zu den Ergebnissen des Beispiels 1, jedoch war die Entscheidung selbst vollständig gut (positiv).
Beispiel 4
Herstellung des Nachweisblatts:
Poröse Teilchen aus Trikalziumphosphat mit einem Teilchendurchmesser von 100 bis 200 Mikron und einem Ca/P-Verhältnis von 1,5 wurden auf ein nicht gewebtes faseriges Material mit einer Dicke von 0,4 mm und einer Größe von 5 × 10 mm aufgebracht, das zu 50 Gew% aus Polyethylen und zu 50 Gew% aus Polyethylenterephtalat bestand. Das nicht gewebte Material wurde wärmebehandelt, um einen Träger mit Keramikmaterial zu erzeugen, auf dem 28 Gew% des Tetrakalziumphosphats praktisch gleichmäßig verteilt waren.
Ein Grippevirus vom Typ A mit einem Wert 256 HA wurde auf dem faserigen Material ähnlich wie in Beispiel 1 immobilisiert, um das Nachweisblatt nach der Erfindung herzustellen, d.h. eine Zusammensetzung aus Fasermaterial, auf dem Grippeviren gebunden sind.
Auswertung des Nachweisblatts:
Das Verfahren nach Beispiel 2 wurde wiederholt. Die Ergebnisse der Auswertungen waren gut und vergleichbar mit den Ergebnissen der Auswertung aus Beispiel 1.
Beispiel 5
Herstellung des Nachweisblatts:
Poröse Körner aus Monokalziumphosphat mit einem mittleren Durchmesser von 0,05 Mikron und einem Ca/P-Verhältnis von 1,0 wurden zusammen mit Polyvinylalkohol als Bindemittel auf ein nicht gewebtes faseriges Material mit einer Dicke von 0,1 mm und einer Größe von 5 × 10 mm aufgebracht, das zu 100 Gew% aus Polyethylenterephtalat bestand, um ein Material als Träger für Keramik herzustellen, auf dem 16 Gew% Hydroxyapatitteilchen praktisch gleichmäßig verteilt waren.
Ein Grippevirus vom Typ A mit einem Wert von 256 HA wurde auf dem faserigen Material ähnlich wie in Beispiel 1 immobilisiert, um das Nachweisblatt nach der Erfindung herzustellen, d.h. ein faseriges Material mit daran gebundenen Grippeviren.
Auswertung des Nachweisblatts:
Das Verfahren nach Beispiel 2 wurde wiederholt. Die Auswertungsergebnisse zeigten, daß die Empfindlichkeit leicht reduziert war im Vergleich zu den Ergebnissen nach Beispiel 1.
Es konnte jedoch eine zufriedenstellender Test ausgeführt werden.
Beispiel 6
Herstellung des Nachweisblatts
Eine Suspension mit 0,7 Gew% Pülpe aus Koniferen und 0,3 Gew% porösen Teilchen aus Hydroxyapatit mit einem mittleren Durchmesser von 3,5 Mikron und einem Ca/P-Verhältnis von 1,67 wurde einem Papierherstellungsverfahren entsprechend JIS-P8209 unterzogen, um ein faseriges Material mit darauf enthaltenem Keramikmaterial (Größe 5 × 10 mm) herzustellen, auf dem 30 Gew% Hydroxyapatit praktisch gleichmäßig verteilt waren.
Ein Grippevirus vom Typ A mit einem Wert von 256 HA wurde auf dem faserigen Material ähnlich wie in Beispiel 1 immobilisiert, um das Nachweisblatt nach der Erfindung herzustellen, d.h. ein faseriges Material mit daran gebundenen Grippeviren.
Auswertung des Nachweisblatts:
Das Verfahren nach Anspruch 2 wurde wiederholt. Die Auswertungsergebnisse waren gut und mit den Ergebnissen aus Beispiel 1 vergleichbar.
Beispiel 7
Das Verfahren nach Anspruch 1 wurde wiederholt mit dem Unterschied, daß hier ein Wert von 40 HA eines japanischen Encephalitisvirus auf dem faserigen Material immobilisiert wurde. Die Ergebnisse der Auswertungen zeigten, daß für die Verdünnung des Antiserums in den zehn Minuten nach Einleiten der Reaktion die Entscheidung "positiv" bis zu einer Verdünnung von 3200 mal getroffen wurde, und in der Stunde nach Einleiten der Reaktion wurde die Entscheidung "positiv" getroffen bis zu einer Verdünnung von 51200 mal oder mehr.
Ferner wurde für die Verdünnung des Normalserums innerhalb von zehn Minuten und einer Stunde nach Einleitung der Enzym-Antikörper-Reaktion keine nichtspezifische positive Reaktion beobachtet, auch wenn eine geringe Verdünnung von nur 20 mal oder weniger angewendet wurde.
Beispiel 8
Das Verfahren aus Beispiel 1 wurde wiederholt mit dem Unterschied, daß ein Tollwutvirus mit einem Wert von 256 HA auf dem faserigen Material immobilisiert wurde. Die Ergebnisse der Auswertungen zeigten, daß für die Verdünnung des Antiserums in den zehn Minuten nach Einleiten der Enzym-Antikörper-Reaktion die Entscheidung "positiv" getroffen wurde, bis zu einer Verdünnung von 200 mal, und in der Stunde nach der Einleitung der Reaktion wurde die Entscheidung "positiv" getroffen bis zu einer Verdünnung von 51200 mal oder mehr. Ferner konnte keine nichtspezifische positive Reaktion innerhalb von zehn Minuten und einer Stunde nach Einleiten der Reaktion beobachtet werden, auch wenn eine geringe Verdünnung von nur 20 mal oder weniger angewendet wurde.
Vergleichsbeispiel 1
Die Testplatte für die ELISA, Linbro/Titertek, erhältlich von Linbro Co., und ein Nachweisblatt aus faserigem Material mit Hydroxyapatit mit einer Größe von 5 × 10 mm gemäß Beispiel 1 wurden Vergleichstests unterzogen, um Unterschiede der Empfindlichkeit zwischen beiden festzustellen.
Der Grippevirus Typ A, der japanische Encephalitisvirus und der Tollwutvirus wurden separat auf der Testplatte und dem Nachweisblatt ähnlich wie in Beispiel 1 adsorbiert, und es wurde der Titer des Antiserums bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, daß das Nachweisblatt nach Beispiel 1 eine Empfindlichkeit äquivalent oder größer als diejenige der Testplatte für ELISA hatte.
Vergleichsbeispiel 2
Zwei Arten nicht gewebten faserigen Materials, d.h. das Material mit einer Dicke von 0,2 mm und einer Größe von 20 × 20 mm mit 50 Gew% Polyethylen und 50 Gew% Polyethylenterephtalat sowie das nicht gewebte faserige Material derselben Dicke und Größe mit Unterlage, nämlich das Material mit Hydroxyapatit mit 22 Gew% Hydroxyapatitteilchen in praktisch gleichmäßiger Verteilung, hergestellt nach Beispiel 1, wurden in den Vergleichstests eingesetzt, um die Wirkung bei der Virusadsorption des nicht gewebten faserigen Materials mit Hydroxyapatit festzustellen.
Die Adsorption des Virus auf dem Material mit und ohne Unterlage wurde ähnlich wie in Beispiel 1 durchgeführt. Der Testvirus war eine schwebende Lösung eines Grippevirus vom Typ A, und gemäß Tabelle 1 wurden vier verschiedene Verdünnungen des Virus verwendet, d.h. 10, 20, 40 und 80 mal, und entsprechend vier unterschiedliche HI-Titer, d.h. 1024, 512, 256 und 128. HI ist eine Abkürzung für Hämagglutinationshemmung.
Jedes faserige Material wurde in 1 ml der oben genannten Virusverdünnung eingetaucht und bei Raumtemperatur eine Stunde lang geschüttelt. Ein Überstand wurde separiert und einem Hämagglutinationstest unter Verwendung von Erythrocyt (rote Blutzellen) von Hühnern ausgesetzt. Die Ergebnisse des Tests enthält die folgende Tabelle 1. Hier enthielt das Vergleichsmaterial nur eine schwebende Lösung vom A-Typ-Grippevirus.
Tabelle 1 Titer des Überstandes nach Kontakt
Aus Tabelle 1 geht hervor, daß das nicht gewebte faserige Material mit Hydroxyapatit eine ausgezeichnete Virus-Adsorptionskraft hat.
Vergleichsbeispiel 3
Zwei Arten nicht gewebter faseriger Stoffe, d.h. das reine Material mit einer Dicke von 0,2 mm und einer Größe von 20 × 20 mm aus 50 Gew% Polyethylen und 50 Gew% Polyethylenterephtalat und das nicht gewebte faserige Material derselben Dicke und Größe mit Hydroxyapatit mit 22 Gew% Hydroxyapatitteilchen in praktisch gleichmäßiger Verteilung, hergestellt nach Beispiel 1, wurden in den Vergleichstests verwendet, um die Wirkung der Virusadsorption des mit Hydroxyapatit versehenen Materials festzustellen.
Der Test der Adsorption des Virus auf dem nicht mit Hydroxyapatit und auf dem mit Hydroxyapatit versehenen Material wurde ähnlich wie in Beispiel 1 durchgeführt. Der Testvirus war eine schwebende Lösung eines A-Grippevirus bei fünfmaliger Verdünnung mit einem HI-Titer von 2048. Das Testmedium war eine 100fache Verdünnung aus einem menschlichen Serum, das eine positive Reaktion bei der Bestimmung der Testplatte für ELISA bis zu einem Verdünnungsgrad von 1600 mal zeigt. Die Ergebnisse zeigten, daß das mit Hy droxyapatit versehene Material eine positive Reaktion zeigte, während das andere Material eine negative Reaktion zeigte.

Claims

Nachweisblatt zum Nachweis eines in einem Testmedium erwarteten Antigens oder Antikörpers, bestehend aus einem faserigen Träger, auf dem Teilchen aus einer Kalziumphosphatverbindung mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 0,01 bis 200 Mikron und einem Ca/P-Verhältnis von 1,0 bis 2,0 vorhanden sind, wobei ein bekanntes Antigen oder ein bekannter Antikörper an der Kalziumphosphatverbindung immobilisiert ist.
Nachweisblatt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen oder der Antikörper mit einem Vernetzungsmittel mit mindestens einer Aldehyd- oder Epoxygruppe immobilisiert ist.
Nachweisblatt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß seine Teile ohne Antigen oder Antikörper mit einem Blockmittel maskiert sind, das eine Adsorptionsfähigkeit für die Kalziumphosphatverbindung hat und mindestens ein Protein mit geringer Spezifizität für das immobilisierte Antigen oder den immobilisierten Antikörper hat.
Nachweisblatt nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch ein Versteifungselement auf seiner Rückseite.
Nachweisblatt nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Versteifungselement ein Film oder eine Folie ist.
Nachweissatz zum Nachweis eines Antigens oder eines Antikörpers in einem Testmedium, mit einem Nachweisblatt und einer Lösung einer Markierverbindung für das erwar tete Antigen oder Antikörper in Zuordnung zu dem Nachweisblatt, wobei das Nachweisblatt aus einem faserigen Material besteht, auf dem Teilchen einer Kalziumphosphatverbindung mit einem mittleren Teilchendurchmesser von 0,01 bis 200 Mikron und einem Ca/P-Verhältnis von 1,0 bis 2,0 vorhanden sind, und ein bekanntes Antigen oder ein bekannter Antikörper auf der Kalziumphosphatverbindung immobilisiert ist.
Nachweissatz nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen oder der Antikörper mit einem Vernetzungsmittel mit mindestens einer Aldehyd- oder Epoxygruppe immobilisiert ist.
Nachweissatz nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Teile des Nachweisblatts, die kein Antigen oder Antikörper haben, mit einem Blockmittel maskiert sind, das eine Adsorptionsfähigkeit für die Kalziumphosphatverbindung hat und mindestens ein Protein mit geringer Spezifizität für das immobilisierte Antigen oder den immobiliserten Antikörper enthält.
Nachweissatz nach Anspruch 6, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Nachweisblatt auf seiner Rückseite ein Versteifungselement hat.
Nachweissatz nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Versteifungselement ein Film oder eine Folie ist.
Verfahren zum Erfassen eines Antigens oder Antikörpers in einem Testmedium, gekennzeichnet durch Immobilisieren eines bekannten Antigens oder Antikörpers auf Teilchen einer Kalziumphosphatverbindung mit einem mittleren Durchmesser von 0,01 bis 200 Mikron und einem Ca/P-Verhältnis von 1,0 bis 2,0, die auf einem faserigen Material vorhanden sind, zum Bilden eines Nachweisblatts, Maskieren der Teile des Nachweisblatts, die kein Antigen oder keinen Antikörper aufweisen mit einem Blockmittel, das eine Adsorptivität für die Kalziumphosphatverbindung hat und mindestens ein Protein mit geringer Spezifizität für das immobilisierte Antigen oder den immoblisierten Antikörper hat, Kontaktieren des Nachweisblatts mit dem Testmedium zum Einleiten einer Reaktion zwischen dem immobilisierten Antigen oder dem immobilisierten Antikörper und dem vermuteten Antigen oder Antikörper, und weiteres Kontaktieren des Nachweisblatts, das einen Antigen-Antikörper-Komplex enthält, der in der Reaktion gebildet wurde, mit einer Lösung einer Markierverbindung, die spezifisch mit dem vermuteten Antigen oder Antikörper verbindbar ist, um den Antigen-Antikörper-Komplex nachzuweisen.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen oder der Antikörper mit einem Vernetzungsmittel mit mindestens einer Aldehyd- oder Epoxygruppe immobilisiert ist.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß das faserige Material auf seiner Rückseite ein Versteifungselement hat.