DE10158713A1

DE10158713A1 - Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern und Verfahren zu dessen Herstellen

Info

Publication number: DE10158713A1
Application number: DE10158713A
Authority: DE
Inventors: Akira Yamamoto
Original assignee: Asahi Kogaku Kogyo Co Ltd
Current assignee: Hoya Corp
Priority date: 2000-11-29
Filing date: 2001-11-29
Publication date: 2003-01-09
Also published as: US7399836B2; AU784421B2; US20020114800A1; US20060051342A1; DE10158713A8; AU9515901A; CH695632A5; FR2817348A1; FR2817348B1

Abstract

Es wird ein Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern beschrieben, der eine hohe Bindungsfähigkeit für Antigene oder Antikörper (Bindungsobjekt) in der zu untersuchenden Probe hat, sowie ein Verfahren zu dessen Herstellen. Der Träger mit immobilierten Antigenen oder Antikörpern enthält einen Träger mit einer Oberfläche, die aus einer Calciumphosphatverbindung besteht, und Antigene oder Antikörper jeweils mit einem Bereich, der für die Antigen-Antikörper-Reaktion irrelevant ist. Die Antigene oder die Antikörper sind an der Trägeroberfläche über den irrelevanten Bereich immobilisiert. Die Trägeroberfläche hat einen Bereich, in dem die Antigene oder Antikörper nicht immobilisiert werden, und mindestens ein Teil des Bereichs der Oberfläche ist mit einem Protein mit geringer Wechselwirkung für Antigene oder Antikörper beschichtet. Die Antigene oder Antikörper sind durch eine Stabilisierungsbehandlung stabilisiert. Der Träger mit den immobolisierten Antigenen oder Antikörpern kann durch die folgenden Schritte hergestellt werden, nämlich (1) Anbringen von Antiliganden wie Avidin an der Trägeroberfläche, (2) Beschichten der Trägeroberfläche mit einem Protein wie Kasein, (3) Immobilisieren von Antigenen oder Antikörpern an dem Träger, an denen Liganden wie Biotin gebunden sind, und (4) Stabilisieren der an dem Träger immobilisierten Antigene oder Antikörper.

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern, der nützlich ist bei der Diagnose verschiedener Krankheiten wie Infektionen unter Anwendung der Antigen-Antikörper-Reaktion, und ein Verfahren zu dessen Herstellung. In der folgenden Beschreibung wird der Körper mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern auch als ein Körper bezeichnet, an dem Antigene oder Antikörper immobilisiert sind.

Beschreibung des Standes der Technik

Es ist bekannt, dass Calciumphosphatverbindungen die Eigenschaft haben, nicht nur Antikörper, sondern auch Proteine und deren konjugierte Proteine zu adsorbieren, die verschiedene Antigene sein könnten. Wegen dieser Eigenschaft glaubt man, dass ein Träger, der sich durch Immobilisieren (Adsorbieren) von Antigenen oder Antikörpern an einer Calciumphosphatverbindung ergibt, für verschiedene Antigen-Antikörper-Reaktionen eingesetzt werden kann.
In den letzten Jahren hat man sich zur Diagnose verschiedener Krankheiten wie Infektionen mit einem Verfahren beschäftigt, bei dem nach Immobilisieren von Antigenen oder Antikörpern an einem Träger aus einer Calciumphosphatverbindung eine zu untersuchende Probe mit dem Träger in Berührung gebracht wird, um ein Agglutinationsbild zu beobachten, das durch die Antigen-Antikörper- Reaktion verursacht wird.
Durch einfaches Immobilisieren der Antigene oder Antikörper an dem Träger tritt jedoch durch das schlechte Bindungsvermögen zwischen dem Träger und den Antigenen oder Antikörpern (Bindungsobjekte) bei der untersuchten Probe eine unzureichende Reaktion ein.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern, der ein hohes Bindungsvermögen für Antigene oder Antikörper (Bindungsobjekte) in der zu untersuchenden Probe hat, sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung anzugeben.
Um dies zu erreichen, ist die vorliegende Erfindung auf einen Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern gerichtet, dessen Oberfläche aus einer Verbindung auf Calciumphosphatbasis gebildet ist und der Antigene oder Antikörper trägt, die jeweils einen für die Antigen-Antikörper-Reaktion irrelevanten Teil haben. Dabei ist jedes Antigen oder jeder Antikörper an der Oberfläche des Trägers über den irrelevanten Teil immobilisiert, und die Oberfläche des Trägers hat einen Bereich, wo die Antigene oder Antikörper nicht immobilisiert sind. Mindestens ein Teil dieses Bereiches ist mit einem Protein beschichtet, das geringe Wechselwirkung mit Antigenen oder Antikörpern hat.
Bei der vorliegenden Erfindung ist es möglich, einen Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern vorzusehen, der ein hohes Bindungsvermögen für Antigene oder Antikörper (Bindungsobjekte) in einer zu untersuchenden Probe hat.
Bei dieser Erfindung trägt der Träger vorzugsweise Antiliganden, und jedes Antigen oder jeder Antikörper ist mit einem Liganden verbunden, wobei jedes Antigen oder jeder Antikörper an den Träger über den Liganden und den Antiliganden immobilisiert ist. Dies macht es möglich, die Antigene oder die Antikörper an dem Träger zu immobilisieren und dabei das hohe Bindungsvermögen für Antigene oder Antikörper in der zu untersuchenden Probe beizubehalten.
Ferner wird vorzugsweise jeder Antiligand an der Oberfläche des Trägers durch Adsorption gehalten. Dies ermöglicht das Erzeugen des Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern.
In diesem Fall hat jeder Antikörper vorzugsweise einen konstanten Bereich, und der Ligand ist an dem konstanten Bereich des Antikörpers gebunden. Dadurch werden die Antigene noch besser an den Antikörpern gebunden.
Ferner soll die Beschichtung des Proteins vorzugsweise durch Adsorption des Trägers an dem genannten Teil des Bereichs der Oberfläche erfolgen. Dadurch ist es möglich, die Beschichtung der Oberfläche des Körpers leicht durchzuführen.
Bei der vorliegenden Erfindung ist das Protein vorzugsweise Kasein. Kasein ist das am besten geeignete Protein (Schichtmaterial) für die Beschichtung des Trägers.
Ferner sind bei der vorliegenden Erfindung die Antigene oder Antikörper vorzugsweise stabilisiert. Dies ermöglicht es, eine im Laufe der Zeit auftretende Verschlechterung des Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern zu verhindern.
In diesem Fall werden die Antigene oder Antikörper vorzugsweise durch Behandeln des Trägers mit einem Stabilisierungsmittel stabilisiert. Dies ist das einfachste und wirksamste Verfahren zum Stabilisieren der Antigene oder Antikörper.
Ferner werden bei der vorliegenden Erfindung die Antigene oder Antikörper vorzugsweise durch Behandeln des Trägers mit einem Querverbindungsmittel stabilisiert, das Querverbindungen der Antigene oder Antikörper mit den Liganden und/oder Antiliganden erzeugt. Dies ermöglicht, dass ein Entfernen der Antigene oder Antikörper von dem Träger zuverlässiger verhindert wird.
In diesem Fall ist das Querverbindungsmittel vorzugsweise eine bivalente Substanz. Dies ermöglicht ein zuverlässigeres Stabilisieren der Antigene oder Antikörper.
Ferner wird bei der vorliegenden Erfindung ein Bereich des Trägers in der Nachbarschaft seiner Oberfläche mit einer dichten Struktur erzeugt. Dies ermöglicht das Immobilisieren der Antigene oder Antikörper derart, dass ihre Reaktionsteile weitgehend übereinstimmende Abstände zu der Oberfläche des Trägers haben.
Ferner hat bei der vorliegenden Erfindung der Träger vorzugsweise einen Trägerkörper, auf dessen Oberfläche eine Schicht aus einer Calciumphosphatverbindung vorgesehen ist. Dadurch ist es möglich, die Dichte des Trägers für immobilisierte Antigene oder Antikörper so einzustellen, dass sich optimale Bedingungen für die Agglutinationsreaktion ergeben.
In diesem Fall wird der Träger vorzugsweise durch Kollision poröser Teilchen der Calciumphosphatverbindung mit dem Trägerkörper erzeugt. Dies ermöglicht ein leichtes und zuverlässiges Bilden der dichten Struktur nahe der Oberfläche des Trägers.
Ferner werden in diesem Fall gleichfalls vorzugsweise die porösen Teilchen durch Agglutinationsbindung primärer Teilchen der Calciumphosphatverbindung erzeugt. Dies ermöglicht ein leichteres Ausbilden der dichten Struktur nahe der Oberfläche des Trägers.
Ferner sind bei der vorliegenden Erfindung die Antikörper vorzugsweise IgG. Dies ermöglicht eine Zunahme des Selektionsgrades der Antigene.
Die Erfindung ist gemäß einem weiteren Aspekt auf ein Verfahren zum Herstellen eines Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern gerichtet. Dieses Verfahren enthält die Schritte: Immobilisieren von Antigenen oder Antikörpern an einer Trägeroberfläche aus einer Calciumphosphatverbindung über Teile der Antigene oder Antikörper, die für die Antigen-Antikörper-Reaktion irrelevant sind, und Beschichten mindestens eines Teils eines Bereichs der Trägeroberfläche, in dem die Antigene oder Antikörper nicht immobilisiert sind, mit einem Protein mit geringer Wechselwirkung für Antigene oder Antikörper.
Durch die Erfindung ist es möglich, ein Herstellverfahren für einen Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern vorzusehen, der ein hohes Bindungsvermögen für Antigene oder Antikörper (Bindungsobjekte) in einer zu untersuchenden Probe hat.
Bei diesem Verfahren enthält der Immobilisierungsschritt vorzugsweise einen Schritt, bei dem man das Tragen von Antiliganden an der Trägeroberfläche ermöglicht, und einen Schritt des Kontaktierens von Antigenen oder Antikörpern mit dem Träger, an denen Liganden mit einer Affinität für die Antiliganden gebunden sind. Dies ermöglicht das Immobilisieren der Antigene oder Antikörper an dem Träger und das Beibehalten des hohen Bindungsvermögens für Antigene oder Antikörper in der zu untersuchenden Probe.
Ferner werden bei diesem Verfahren die Antiliganden an dem Träger durch Adsorption an der Trägeroberfläche gehalten. Dies erleichtert das Herstellen des Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern.
Ferner sind die Liganden vorzugsweise in konstanten Bereichen der Antikörper gebunden. Dadurch können die Antigene besser an den Antikörpern gebunden werden.
Ferner wird bei diesem Verfahren der Beschichtungsschritt vorzugsweise dadurch ausgeführt, dass man das Protein in dem genannten Teil des Bereichs der Trägeroberfläche adsorbieren lässt. Dies ermöglicht ein leichtes Beschichten der Trägeroberfläche.
Ferner ist bei diesem Verfahren das Protein vorzugsweise Kasein. Kasein ist das als Beschichtungssubstanz für den Träger am besten geeignete Protein (Beschichtungsmaterial).
Ferner wird bei diesem Verfahren vorzugsweise nach dem Immobilisierungsschritt ein Stabilisierungsschritt für die Antigene oder Antikörper durchgeführt. Dies ermöglicht eine im Laufe der Zeit auftretende Verschlechterung des Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern zu verhindern.
In diesem Fall wird der Stabilisierungsschritt vorzugsweise durch Behandeln des Trägers mit einem Stabilisierungsmittel durchgeführt. Dies ist das einfachste und wirksamste Verfahren zum Stabilisieren der Antigene oder Antikörper.
Ferner wird bei diesem Verfahren der Stabilisierungsschritt vorzugsweise durch Behandeln des Trägers mit einem Querverbindungsmittel zum Binden der Antigene oder Antikörper an den Liganden und/oder Antiliganden durchgeführt. Dies ermöglicht es, das Entfernen der Antigene oder Antikörper von dem Träger zuverlässiger zu verhindern.
In diesem Fall ist das Querverbindungsmittel vorzugsweise eine bivalente Substanz. Dies ermöglicht ein zuverlässigeres Stabilisieren der Antigene oder Antikörper.
Ferner wird bei diesem Verfahren vorzugsweise ein Bereich des Trägers nahe seiner Oberfläche mit einer dichten Struktur ausgebildet. Dies ermöglicht das Immobilisieren der Antigene oder Antikörper derart, dass ihre Reaktionsteile weitgehend übereinstimmende Abstände von der Trägeroberfläche haben.
Ferner hat bei diesem Verfahren gleichfalls vorzugsweise der Träger einen Trägerkörper, dessen Oberfläche mit einer Beschichtung aus einer Calciumphosphatverbindung versehen ist. Dadurch ist es möglich, die Dichte des Trägers für immobilisierte Antigene oder Antikörper so einzustellen, dass sich optimale Bedingungen für die Agglutinationsreaktion ergeben.
In diesem Fall wird der Träger vorzugsweise durch Kollision poröser Teilchen der Calciumphosphatverbindung mit dem Trägerkörper erzeugt. Dies ermöglicht ein leichtes und zuverlässiges Ausbilden des Bereichs nahe der Trägeroberfläche mit einer dichten Struktur.
Ferner werden in diesem Fall gleichfalls vorzugsweise die porösen Teilchen durch Agglutinationsbindung primärer Teilchen der Calciumphosphatverbindung erzeugt. Dies ermöglicht ein leichteres Ausbilden des Bereichs nahe der Trägeroberfläche mit einer dichten Struktur.
Außerdem sind bei diesem Verfahren die Antikörper vorzugsweise IgG. Dies ermöglicht eine Zunahme des Selektionsgrades der Antigene.
Diese und andere Wesenszüge, Strukturen und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung vorzugsweiser Ausführungsbeispiele und Beispiele unter Bezugnahme auf die beigefügte Zeichnung.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG

Fig. 1 zeigt in grafischer Darstellung eine Adsorptionsmenge von Antigenen in jedem Träger mit immobilisierten Antikörpern des Beispiels und jeweiliger Vergleichsbeispiele, und in einem Kontrollträger.

EINGEHENDE BESCHREIBUNG VORZUGSWEISER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Nach wiederholten Studien und Überlegungen kamen die Erfinder der vorliegenden Erfindung zu der Erkenntnis, dass bei einem einfachen Immobilisieren (Adsorbieren) der Antigene oder Antikörper an einem Träger die Antigene oder Antikörper in einen Zustand kommen, der die Antigen-Antikörper-Reaktion erschwert.
Genauer gesagt, werden reagierende Bereiche der immobilisierten Antigene oder Antikörper (im Folgenden einfach als "Reaktionsbereiche" bezeichnet) für Antikörper oder Antigene (Bindungsobjekte) in einer zu untersuchenden Probe an der Trägeroberfläche adsorbiert, so dass sie keine ausreichende Bindungskraft für die Bindungsobjekte haben.
Im Hinblick darauf kamen die Erfinder zu der Überlegung, dass sich ein Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern mit hoher Bindungskraft für die Bindungsobjekte ergeben kann, wenn Antigene oder Antikörper an einem Träger so immobilisiert werden, dass ihre Reaktionsbereiche nicht durch die Trägeroberfläche adsorbiert werden.
Die vorliegende Erfindung basiert auf dieser Überlegung.
Im Folgenden wird eine Erläuterung an Hand vorzugsweiser Ausführungsformen der Erfindung gegeben. In diesem Zusammenhang ist zu bemerken, dass die folgende Beschreibung den Beispielsfall betrifft, dass die Antikörper an einem Träger immobilisiert sind, wobei dies natürlich auch für den Fall gilt, dass Antigene an einem Träger immobilisiert sind.
Bei dem erfindungsgemäßen Träger mit immobilisierten Antikörpern sind die Antikörper an dem Träger über Bereiche immobilisiert, die für die Antigen- Antikörper-Reaktion irrelevant sind, und mindestens ein Teil eines Bereichs der Trägeroberfläche, an dem die Antikörper nicht immobilisiert sind, ist mit einem Protein beschichtet.
Die Erfinder haben insbesondere wiederholte Studien und Forschungen zum Lösen des vorstehend beschriebenen Problems durchgeführt, und mit diesem Ergebnis sind sie zu dem Schluss gekommen, dass die Antikörper an einem Träger über Bereiche immobilisiert werden sollten, die für die Antigen-Antikörper- Reaktion irrelevant sind. Insbesondere sollten Antikörper an einem Träger über Liganden und Antiliganden in diesen Bereichen immobilisiert werden. Auf diese Weise wird das direkte Adsorbieren oder Kontaktieren mit der Trägeroberfläche für jeden Antikörper oder jedes Antigen in dessen Bindungsbereich (Reaktionsbereich) erschwert, so dass man annimmt, dass ein Verlust des Bindungsvermögens für das Antigen (Bindungsvermögen), welches der Antikörper besitzt, erschwert wird.
Deshalb ist es gemäß der Erfindung möglich, einen Träger mit immobilisierten Antikörpern zu erzeugen, der ein hohes Bindungsvermögen gegen Antigene hat, insbesondere bestimmte Antigene gegen die an dem Träger getragenen Antikörper.
Hier ist zu bemerken, dass die Form des Trägers nach der vorliegenden Erfindung nicht auf eine bestimmte Form beschränkt ist, es können verschiedene Formen wie kugelige oder abgeflachte Formen angewendet werden. Hat der Träger eine kugelige Form, so ist es leicht, Antikörper mit hoher Gleichmäßigkeit an ihm zu immobilisieren. Hat der Träger eine abgeflachte Form, so ist es leicht, die Agglutinationsreaktion mit bloßem Auge zu beobachten, da die Agglutination leicht auftreten kann.
Wird ein Träger mit Kugelform verwendet, so sollte der mittlere Durchmesser vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100 µm liegen, insbesondere im Bereich von 3 bis 20 µm. Liegt der mittlere Durchmesser in diesem Bereich, so ergibt sich ein hohes Trägervermögen für Antikörper, und es ist gleichfalls möglich, die Agglutinationsreaktion leicht zu erkennen. Ist die Teilchengröße des Trägers zu groß, so kann die Agglutination kaum auftreten. Ist die Teilchengröße des Trägers andererseits zu klein, so wird die Wechselwirkung zwischen den Trägern stark, was dazu führt, dass die Agglutination unspezifischer Träger leicht eintreten kann.
Bei der vorliegenden Erfindung besteht der Träger aus einer Calciumphosphatverbindung, und vorzugsweise ein Teil der Trägeroberfläche besteht aus einer Calciumphosphatverbindung. Die Erfinder haben erkannt, dass derartige Calciumphosphatverbindungen die Antiliganden in geeigneter Weise adsorbieren können. Ferner haben solche Calciumphosphatverbindungen eine ausgezeichnete Agglutinationsfähigkeit.
Beispiele solcher Träger sind ein Träger insgesamt aus einer Calciumphosphatverbindung und ein Träger mit einem Körper aus einem Kunstharz oder Keramik o. ä., der mit einer Calciumphosphatverbindung beschichtet ist.
Von diesen wird vorzugsweise ein Träger verwendet, der sich durch Beschichten eines Trägerkörpers mit einer Calciumphosphatverbindung ergibt, d. h. ein Träger, der aus einem Trägerkörper und einer Schicht aus einer Calciumphosphatverbindung auf seiner Oberfläche besteht. Bei Verwenden eines solchen Trägers werden die folgenden drei Vorteile realisiert.

1. Es ist leicht, die Dichte eines jeden Trägers auf einen optimalen Wert für die Agglutinationsreaktion der Träger mit immobilisierten Antikörpern einzustellen.
2. Bei einem solchen Träger kann der Trägerkörper vor dem Aufbringen der Schicht der Calciumphosphatverbindung oder der Träger nach seiner Herstellung mit einem Pigment oder einem Farbstoff eingefärbt werden. Die Verwendung eines solchen gefärbten Trägers verbessert seine Sichtbarkeit.
3. Wie noch beschrieben wird, hat der bei dieser Erfindung angewendete Träger vorzugsweise eine dichte Beschichtung, d. h. die Oberfläche des Trägers ist sehr glatt. Bei einem Trägerkörper, der mit einer Calciumphosphatverbindung beschichtet ist, kann eine solche glatte Außenfläche vergleichsweise leicht erzeugt werden.

Vorzugsweise liegt die Dichte eines solchen Trägers im Bereich von 0,7 bis 2,0 g/cm³, insbesondere im Bereich von 0,9 bis 1,2 g/cm³. Dies ermöglicht eine Agglutinationsreaktion für den Träger mit immobilisierten Antikörpern in Wasser (oder in einer wässrigen Lösung).
Ferner kann bei einem solchen Träger ein Bereich nahe seiner Oberfläche entweder dicht oder porös sein, vorzugsweise ist er jedoch dicht, d. h. die Oberfläche ist relativ glatt. Auf diese Weise ist es bei einem solchen Träger mit immobilisierten Antikörpern möglich, die Antikörper in einem Zustand zu immobilisieren, in dem ihre Bindungsbereiche für Antigene von der Trägeroberfläche weitgehend übereinstimmende Abstände haben. Es ist nämlich möglich, Einschränkungen der dreidimensionalen Positionen der jeweiligen Antikörper zu reduzieren, die leicht durch die Form der Oberfläche des Trägers beeinträchtigt werden können. Dadurch werden die Antigene (Bindungsobjekte) in der zu untersuchenden Probe sicher an den Antikörpern gebunden.
In diesem Zusammenhang ist zu bemerken, dass bei einer Beschichtung eines Trägerkörpers mit einer Calciumphosphatverbindung die Calciumphosphatschicht eine dichte Struktur haben sollte.
Als Calciumphosphatverbindung können bei dieser Erfindung verschiedene Verbindungen mit einem Ca/P-Verhältnis von 1,0 bis 2,0 verwendet werden. Beispiele solcher Verbindungen sind Ca₁₀(PO₄)₆(OH)2, Ca₁₀(PO₄)₆F₂, Ca₁₀(PO₄)₆C₂, Ca₃(PO₄)₂, Ca₂P₂O₇, Ca(PO₃)₂, CaHPO₄ und ähnliche. Mischungen zweier oder mehr dieser Verbindungen können gleichfalls verwendet werden.
Unter diesen wird besonders vorzugsweise eine Calciumphosphatverbindung verwendet, die als Hauptbestandteil Hydroxylapatit (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂) enthält. Hydroxylapatit hat eine besonders ausgezeichnete Trägereigenschaft für Antiliganden und eine ausgezeichnete Agglutinationsfähigkeit.
Wenn Fluorapatit (Ca₁₀(PO₄)₆F₂) verwendet wird, sollte der Fluoranteil in allen Calciumphosphatverbindungen kleiner als 5 Gewichts-% sein. Dadurch kann ein Auslösen des Fluors aus dem Träger verhindert werden, so dass es möglich ist, ein Absinken des Wirkungsgrades der Antigen-Antikörper-Reaktion zu verhindern.
Diese Calciumphosphatverbindungen können nach einem bekannten Nass- Syntheseverfahren oder Trocken-Syntheseverfahren synthetisiert werden.
Ferner kann in diesem Fall die Calciumphosphatverbindung Substanzen (Rohmaterialien o. ä.) enthalten, die in dem Syntheseverfahren noch verbleiben, oder Sekundärreaktionsprodukte, die in dem Syntheseprozess erzeugt werden, u. ä.
Wie vorstehend beschrieben, werden die Antikörper an einem solchen Träger über Antiliganden immobilisiert, die an dem Träger vorgesehen sind, und über Liganden, die an den Antikörpern gebunden sind.
Es wird vorzugsweise ein Antiligand der Art verwendet, der an einer Calciumphosphatverbindung adsorbiert werden kann. Es ist vorzugsweise also ein Antiligand der Art zu verwenden, der an der Trägeroberfläche adsorbiert werden kann. Bei Einsatz eines solchen Antiliganden wird es möglich, diesen nach einem einfachen Verfahren an dem Träger zu binden, beispielsweise durch Berühren des Antiliganden mit dem Träger (noch zu beschreiben).
Ferner sollte der Antiligand vorzugsweise an einem Liganden zu binden sein, der an dem Antikörper gebunden ist.
Unter diesem Gesichtspunkt wird als Antiligand vorzugsweise Avidin (einschließlich seiner Derivate) oder Streptavidin o. ä. verwendet. Dabei wird Avidin als Antiligand insbesondere eingesetzt.
Die Erfinder haben gefunden, dass Avidin besonders wirksam an Calciumphosphatverbindungen adsorbiert wird. Außerdem hat Avidin ein besonders hohes Bindungsvermögen für einen Liganden (besonders Biotin) in spezieller Weise.
Andererseits sollte ein Ligand zufriedenstellend an einem Antikörper gebunden werden. Ferner sollte er eine Affinität für den Antiliganden haben. Ein solcher Ligand kann zuverlässig an dem Antiliganden gebunden werden. Deshalb wird der Antikörper mit dem daran gebundenen Liganden an dem Träger mit dem daran gebundenen Antiliganden kontaktiert, und dadurch wird der Ligand an dem Antiliganden gebunden, so dass der Antikörper an dem Träger immobilisiert wird. Mit anderen Worten: wenn ein Antikörper mit daran gebundenem Liganden mit einem Träger mit daran gebundenem Antiliganden in Berührung gebracht wird, so wird der Antikörper an dem Träger über den Liganden und den Antiliganden immobilisiert.
Unter diesem Gesichtspunkt wird Biotin, Protein A oder Protein G o. ä. vorzugsweise als Ligand verwendet. Davon wird insbesondere Biotin verwendet. Dies liegt daran, dass Biotin leicht an einem Antikörper (insbesondere in einem konstanten Bereich des Antikörpers) gebunden werden kann. Außerdem hat Biotin in spezieller Weise ein besonders hohes Bindungsvermögen für einen Antiliganden (insbesondere Avidin).
Ferner wird der Ligand an einem Antikörper vorzugsweise in dem konstanten Bereich des Antikörpers gebunden. In diesem Fall ist der konstante Bereich des Antikörpers relativ nahe dem Träger angeordnet, während die Bindungsbereiche (Reaktionsbereiche) des Antikörpers für Antigene relativ weit von dem Träger entfernt sind. Dies bedeutet, dass die Antigen-Bindungsbereiche des Antikörpers an Stellen angeordnet sind, die von der Oberfläche des Trägers nach außen abstehen. Entsprechend wird in der Nachbarschaft der Antigen-Bindungsbereiche des Antikörpers ein Raum gesichert, der für die Antigen-Antikörper-Reaktion ausreicht. Zusätzlich ist es möglich, ein Kontaktieren der Antigen- Bindungsbereiche des Antikörpers mit der Trägeroberfläche infolge Adsorption zu verhindern. Aus diesen Gründen werden bei Bindung des Liganden an den konstanten Bereich des Antikörpers die Antigene in der zu untersuchenden Probe in geeigneter Weise mit dem Antikörper in Berührung gebracht.
Das Binden des Liganden an dem Antikörper kann nach einem bekannten Markierverfahren erfolgen. Ferner können handelsübliche Marker, z. B. "biotin labeled anti-human immunoglobulin G antibody (A-130BC)" der Firma American Qualex Co., Ltd., verwendet werden.
Insbesondere erhält man bei der vorliegenden Erfindung einen besonders ausgezeichneten Effekt, wenn eine Kombination verwendet wird, bei der Avidin als Antiligand dient, der an einem Träger vorzusehen ist, und Biotin als Ligand verwendet wird, der an einem Antikörper zu binden ist. Dies liegt daran, dass Avidin eine Bindungsstelle hat, an der ein Avidin-Molekül an vier Biotin-Molekülen gebunden werden kann. Deshalb kann Avidin mit der vierfachen Menge Biotin verbunden werden, so dass der Träger durch die Avidin-Biotin-Bindung so viele Antikörper tragen kann.
In diesem Zusammenhang ist zu bemerken, dass in dieser Beschreibung die Bezeichnungen "Antiligand" und "Ligand" Substanzen beschreiben, die Paare bilden, welche miteinander in bestimmter Weise gebunden werden können. Deshalb können diese Bezeichnungen nur dann eine Bedeutung haben, wenn sie gemeinsam verwendet werden, sie haben keine Bedeutung bei Alleinverwendung.
Ferner ist auch darauf hinzuweisen, dass bei der vorliegenden Erfindung jegliche Antikörper wie IgG, IgM, IgA, IgE und ähnliche verwendet werden können. Unter diesen Antikörpern ist IgG am besten geeignet. Dies liegt an seiner leichten Herstellung. Bei Einsatz von IgG werden Antigenarten vermehrt, die durch den erfindungsgemäßen Träger mit immobilisierten Antikörpern erfasst werden können.
Ferner ist bei dem Träger mit immobilisierten Antikörpern ein Bereich der Trägeroberfläche, an dem die Antikörper nicht immobilisiert sind, nämlich mindestens ein Teil eines Bereichs der Trägeroberfläche anders als der Bereich, an dem Antiliganden vorgesehen sind (vorzugsweise der gesamte derartige Bereich) mit einem Protein (d. h. einem Blockierungsmittel) beschichtet, das geringe Wechselwirkung mit den Antigenen oder Antikörpern hat.
In diesem Zusammenhang bezeichnet "Antigene oder Antikörper" nicht nur Antigene oder Antikörper, die an einem Träger nach der Erfindung zu immobilisieren sind, sondern auch andere allgemeine Antigene oder Antikörper. Ferner bedeutet "geringe Wechselwirkung mit dem Antigen oder Antikörper", dass das Adsorptionsvermögen für Antigene oder Antikörper oder das Bindungsvermögen für Antigene oder Antikörper fehlt oder extrem gering ist.
Durch eine solche Proteinschicht ist es möglich, ein unspezifisches Adsorbieren der Antikörper an dem Träger zu verhindern, wenn sie an ihm immobilisiert werden. Es kann nämlich ein direktes Adsorbieren der Antikörper an dem Träger ohne Anwenden der Liganden und Antiliganden verhindert werden. Dadurch erhält der Träger mit den immobilisierten Antikörpern ein erhöhtes Antigen- Bindungsvermögen.
Wenn das Erfassen der Antigene, die an einer Calciumphosphatverbindung adsorbiert werden können, mit dem so erhaltenen Träger für immobilisierte Antikörper durchgeführt wird, kann ein unspezifisches Binden (Adsorbieren) an dem Träger verhindert werden.
Als Protein wird vorzugsweise jedes Protein verwendet, das an einer Calciumphosphatverbindung adsorbiert werden kann. Es ist nämlich vorzuziehen, dass ein Bereich der Trägeroberfläche, an dem die Antikörper nicht immobilisiert werden, durch ein Protein durch Adsorption des Trägers an die Trägeroberfläche bedeckt wird. Durch ein solches Protein ist es möglich, die Außenfläche des Trägers durch ein einfaches Verfahren mit dem Protein zu beschichten, indem nur das Protein und der Träger in Kontakt gebracht werden (noch eingehend zu beschreiben).
Beispiele eines solchen Proteins sind metallische Proteine wie Kasein, Transferin, Ferredoxine u. ä., Albumin, Gelatin, Vitellin, Phosvitin u. ä. Unter diesen Proteinen werden vorzugsweise Kasein, Albumin und Gelatin verwendet. Diese Proteine haben ausgezeichnete Adsorptionsfähigkeit an Calciumphosphatverbindungen.
Ferner ist unter diesen Proteinen Kasein am günstigsten, da es eine ausgezeichnete Adsorptionsfähigkeit an Calciumphosphatverbindungen hat und eine extrem geringe Wechselwirkung mit Antikörpern zeigt.
Wenn ein Protein mit einem Metallion wie metallisches Protein o. ä. verwendet wird, sollte es zum Entfernen oder Reduzieren des Metallions behandelt worden sein. Durch diese Behandlung kann die Proteinschicht der Trägeroberfläche weitgehend vollständig erzeugt werden.
Zum Entfernen des Metallions kann ein Verfahren in Betracht kommen, bei dem eine Lösung eines solchen Proteins (Blockmittellösung) mit einem Chelator wie Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat (EDTA) bearbeitet wird. In diesem Fall kann als Beispiel der Behandlung der Proteinlösung mit dem Chelator das folgende Verfahren in Betracht kommen. Nachdem der Chelator der Proteinlösung beigefügt wurde, wird er aus der Proteinlösung durch eine Gelfilterung, eine Ultrafilterung oder eine Dialyse o. ä. entfernt.
Ferner wurden die Antikörper in dem Träger mit immobilisierten Antikörpern vorzugsweise einer Stabilisierungsbehandlung ausgesetzt. Durch diese Behandlung werden die an dem Träger immobilisierten Antikörper stabilisiert, so dass eine Entfernung eines Antikörpers von dem Träger verhindert ist.
Wenn die Stabilisierungsbehandlung für den Träger nach dem Beschichten seiner Oberfläche mit einem Protein erfolgt, ist es gleichfalls vorteilhaft, dass das Protein schwierig von der Trägeroberfläche zu entfernen ist.
In diesem Fall wird eine solche Stabilisierungsbehandlung vorzugsweise durch Behandeln des Trägers mit einem Stabilisierungsmittel durchgeführt. Dies führt in einfacher Weise zu einem Träger mit immobilisierten Antikörpern.
Wenn die Antikörper an einem Träger über Liganden und Antiliganden immobilisiert sind, wird als Stabilisierungsmittel vorzugsweise ein Querverbindungsmittel verwendet, das entweder die Liganden oder die Antiliganden oder beide an dem Träger bindet. Auf diese Weise wird zwischen dem Träger und den Liganden oder Antiliganden oder beiden eine covalente Bindung erzeugt, so dass sie fest gebunden oder immobilisiert werden. Dadurch wird ein Entfernen der Antikörper von dem Träger zuverlässiger verhindert.
Verschiedene Arten von Querverbindungsmitteln können eingesetzt werden, insbesondere wird aber ein bivalentes Querverbindungsmittel verwendet. Durch ein solches bivalentes Querverbindungsmittel ist es möglich, die Antikörper zuverlässig zu stabilisieren.
Beispiele eines solchen bivalenten Querverbindungsmittels sind Glutaraldehyd, p- Benzochinon, m-Maleimidbenzoesäure, N,N'-o-Phenylendimaleimid u. ä. Eines oder eine Kombination zweier oder mehr dieser Verbindungen kann verwendet werden.
Für das Stabilisierungsmittel können Bindemittel wie Formaldehyd, Silankopplungsmittel u. ä., Osmiumtetrachlorid u. ä. verwendet werden.
Im Folgenden wird das Herstellverfahren für einen solchen Träger mit immobilisierten Antikörpern, d. h. ein Verfahren zum Immobilisieren von Antikörpern, beschrieben.
Vor dem Herstellen des Trägers mit immobilisierten Antikörpern wird ein Träger oben beschriebener Art erzeugt.
Ein Träger, dessen Oberfläche aus einer Calciumphosphatverbindung besteht oder mit ihr beschichtet ist, kann durch Kollision poröser Teilchen einer Calciumphosphatverbindung (im Folgenden als "Calciumphosphatverbindungsteilchen") mit einem Trägerkörper erzeugt werden. Bei diesem Verfahren werden Calciumphosphatverbindungsteilchen zertrümmert und dann zu relativ kleineren Teilchen geformt, wenn sie mit dem Trägerkörper kollidieren, und diese Teilchen kleinerer Größe bedecken die Oberfläche des Trägerkörpers. Dadurch kann der Bereich nahe der Außenfläche leicht und zuverlässig eine dichte Struktur erhalten.
Unter diesem Gesichtspunkt ist es vorteilhaft, Calciumphosphatverbindungsteilchen zu verwenden, die durch Agglutinationsbindung von Primärteilchen erzeugt werden. Solche Calciumphosphatverbindungsteilchen werden leicht zu kleineren Teilchen geformt, wenn sie mit dem Trägerkörper kollidieren, so dass es möglich ist, dem Bereich nahe der Außenfläche des Trägers leichter und zuverlässiger eine dichte Struktur zu geben.
Wenn in diesem Fall die mittlere Teilchengröße der zu kollidierenden Calciumphosphatverbindungsteilchen im Bereich von 0,1 bis 50 µm liegt, wird der vorstehend beschriebene Effekt besser erkennbar. Hier ist zu bemerken, dass bei einer zu großen mittleren Teilchengröße der Calciumphosphatverbindungsteilchen kein ausreichendes Zertrümmern auftritt, wenn die Teilchen mit dem Trägerkörper kollidieren.
Die Calciumphosphatverbindungsteilchen können entweder ungesinterte Körper oder gesinterte Körper (d. h. Keramik) sein, jedoch werden vorzugsweise ungesinterte Körper oder gesinterte Körper verwendet, die bei relativ geringer Temperatur (200 bis 900°C) gesintert wurden.
Das Herstellverfahren der Calciumphosphatverbindungsteilchen ist nicht auf das vorstehend beschriebene Verfahren beschränkt, es ist auch möglich, Calciumphosphatverbindungsteilchen nach dem folgenden bekannten Verfahren herzustellen.
Kristalline Teilchen (Primärteilchen) einer Calciumphosphatverbindung, die nach einem bekannten Nassverfahren synthetisiert wurde, werden als Rohmaterial für die Calciumphosphatverbindungsteilchen verwendet. Eine Schlämme, in der die Rohmaterialteilchen suspendiert sind, wird zu Sekundärteilchen in einem Direkt- Sprühtrocknungsverfahren u. ä. granuliert. Alternativ kann die Schlämme durch ein Direkt-Sprühtrocknungsverfahren u. ä. zu Sekundärteilchen verarbeitet werden, nachdem ein Einstellmittel für die Viskosität und organische Verbindungsteilchen oder Fasern beigegeben wurden, die durch Erhitzen in der Schlämme aufgelöst werden. Da die Sekundärteilchen zu porösen Teilchen werden, ist es möglich, diese Sekundärteilchen in dieser Form für einen Träger zu verwenden.
Werden Calciumphosphatverbindungsteilchen mit höherer Porosität vorgezogen, können sie nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden. Zunächst werden die oben beschriebenen Sekundärteilchen in einer Lösung zur Bildung einer Schlämme mehrmals suspendiert, und die Schlämme wird durch Nassformung oder Trockenformung unter Druck zu einem Block geformt. In diesem Schritt kann eine organische Verbindung, die während des nachfolgenden Sinterschrittes aufgelöst wird, zur Porenbildung hinzugefügt werden. Alternativ kann der Porendurchmesser durch Einstellen anderer Bedingungen wie der Sintertemperatur o. ä. ohne eine solche organische Verbindung bestimmt werden. Dann wird der so erhaltene Block bei einer Temperatur von 400 bis 1300°C gesintert. Liegt die Sintertemperatur unter 400°C, so ist die Auflösung der organischen Verbindung und das Sintern des Blocks unzureichend. Liegt die Sintertemperatur andererseits über 1300°C, so wird der gesinterte Körper zu dicht oder die Calciumphosphatverbindung zerfällt. Dann wird der so erhaltene gesinterte Block zerkleinert und dann klassifiziert, um Teilchen mit einem gewünschten Durchmesser zu erhalten. In diesem Zusammenhang ist zu bemerken, dass der Porendurchmesser der Calciumphosphatverbindungsteilchen durch geeignetes Ändern der Teilchengröße der Primärteilchen, der Viskosität der Schlämme, der Art des Zusatzstoffs u. ä. eingestellt werden kann.

1. Dann werden Antiliganden an der Oberfläche eines jeden Trägers gebunden. Dies kann durch Behandeln der Träger mit einer Antiligandenlösung realisiert werden. Hierzu können die Träger in die Antiligandenlösung eingegeben und darin vermischt werden.

In diesem Fall liegt die Konzentration der Antiligandenlösung vorzugsweise im Bereich von 0,001 bis 100 mg/mL, insbesondere im Bereich von 0,01 bis 10 mg/mL. Ferner sollte der Anteil der Antiliganden in der Lösung pro 1 g Träger vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 100 mg liegen. Außerdem liegt das Volumen der Antiligandenlösung pro 1 g Träger im Bereich von 1 bis 100 mg. Außerdem sollte der pH-Wert der Antiligandenlösung vorzugsweise im Bereich von 5,5 bis 9 liegen. Durch Einstellen dieser Faktoren ist es möglich, die Antiliganden in geeigneter Weise auf den jeweiligen Trägern vorzusehen.

1. Dann wird die Außenfläche eines jeden Trägers mit einem Protein beschichtet oder bedeckt (d. h. es wird eine Blockbehandlung durchgeführt). Dies kann durch Behandeln der Träger mit der Proteinlösung (d. h. der Blockmittellösung) erfolgen. Hierzu können die Träger in die Proteinlösung eingegeben werden, um sie zu vermischen.

In diesem Fall liegt die Konzentration der Proteinlösung vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 100 mg/mL, insbesondere im Bereich von 1 bis 50 mg/mL. Ferner liegt der Proteinanteil in der Proteinlösung pro 1 g Träger vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100 mg. Außerdem liegt das Volumen der Proteinlösung pro 1 g Träger vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100 mL. Außerdem liegt der pH-Wert der Proteinlösung vorzugsweise im Bereich von 5,5 bis 9. Durch Einstellen dieser Faktoren ist es möglich, die Träger in geeigneter Weise mit dem Protein zu bedecken.

1. Dann werden Antikörper, an denen Liganden gebunden sind, an den Trägern immobilisiert. Dies kann durch Mischen der Träger, auf denen die Antiliganden getragen sind, mit einer Antikörperlösung erfolgen, die die Antikörper mit daran gebundenen Liganden enthält.

In diesem Fall liegt die Konzentration der Antikörperlösung vorzugsweise im Bereich von 0,001 bis 10 mg/mL, insbesondere im Bereich von 0,01 bis 1 mg/mL. Ferner liegt der Antikörperanteil in der Antikörperlösung vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 100 mg pro 1 g Träger. Außerdem liegt das Volumen der Antikörperlösung pro 1 g Träger vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100 mL. Außerdem liegt der pH-Wert der Antikörperlösung vorzugsweise im Bereich von 5, 5 bis 9. Durch Einstellen dieser Faktoren ist es möglich, die Antikörper an den Trägern in geeigneter Weise zu immobilisieren.

1. Dann werden die Träger mit den daran immobilisierten Antikörpern stabilisiert. Dies erfolgt mit einem Stabilisierungsmittel. Hierzu werden die Träger mit den daran immobilisierten Antikörpern mit einem Stabilisierungsmittel (Immobilisierungsmittel) gemischt.

In diesem Fall liegt die Konzentration des Stabilisierungsmittels in der Stabilisierungsmittellösung vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 1 mg/mL, insbesondere im Bereich von 0,05 bis 0,1 mg/mL. Ferner liegt der Stabilisierungsmittelanteil in der Stabilisierungsmittellösung vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 10 mg pro 1 g Träger. Außerdem liegt das Volumen der Stabilisierungsmittellösung pro 1 g Träger vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100 mL. Außerdem liegt der pH-Wert der Antikörperlösung vorzugsweise im Bereich von 5,5 bis 9. Durch Einstellen dieser Faktoren ist es möglich, die an den Trägern immobilisierten Antikörper in geeigneter Weise zu stabilisieren, so dass der erhaltene Träger mit den immobilisierten Antikörpern im Laufe der Zeit kaum verschlechtert wird.
Die Antikörper werden an den Trägern nach den vorstehenden Verfahren immobilisiert, so dass sich die Träger mit den immobilisierten Antikörpern ergeben. Bei der vorliegenden Erfindung kann vor oder nach dem vorstehenden Prozess (2) eine weitere Operation eingefügt werden, die mit dem Prozess (4) übereinstimmt. Ferner kann eine weitere Operation, die mit dem Prozess (2) übereinstimmt, vor oder nach dem vorstehenden Prozess (4) vorgesehen sein. Außerdem können der Prozess (2) und der Prozess (4) entfallen.
Außerdem werden die Prozesse (1) bis (4) beispielsweise bei einer Raumtemperatur (z. B. 0 bis 40°C) ausgeführt.
Obwohl die vorstehende Beschreibung auf dem Beispielsfall basiert, dass Antikörper verwendet werden, kann die vorliegende Erfindung auch bei Antigenen angewendet werden.
Wird die vorliegende Erfindung auf Träger mit immobilisierten Antigenen angewendet, so sind Beispiele für an den Trägern zu immobilisierende Antigene Viren, die zu Infektionen wie Grippe, Japanische Enzephalitis, Knochenfieber, Rubella, Rubeola, Mumps u. ä. führen, sowie Bakterien u. ä.
Vorstehend wurden Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern und deren Herstellungsverfahren nach der Erfindung beschrieben, jedoch ist die Erfindung darauf nicht begrenzt.
Beispielsweise können beim Herstellverfahren der Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern ein oder mehrere weitere Prozesse je nach Erfordernis für verschiedene Zwecke vorgesehen sein.

BEISPIELE

Die Erfindung wird im Folgenden an Hand der tatsächlichen Beispiele eingehend beschrieben. Die Erfindung ist auf diese Beispiele aber nicht beschränkt.

(BEISPIEL)

Ein Träger mit immobilisierten Antikörpern wurde folgendermaßen erhalten.

1. Herstellen des Trägers

Vor der Immobilisierung von Antikörpern an einem Träger wurde der Träger folgendermaßen hergestellt.
Zunächst wurden 50 g Nylonkörper (mittlere Teilchengröße 5 µm und Dichte 1,02 g/cm³) und 10 g Hydroxylapatitteilchen (Ca/P-Verhältnis 1,67, mittlere Teilchengröße 5 µm, spezifische Oberfläche 45 m²/g und mittlere Porengröße 600 Å) bereitgestellt.
Dann wurden diese Nylonkörper und Hydroxylapatitteilchen in ein NARA- Hybridisiersystem eingegeben (hergestellt und vertrieben von Nara Machinery Co., Ltd. unter Produktbezeichnung NHS-1 mit einer Speiseleistung von 5,5 kW und einem Speisestrom von 23 A), und diese Maschine wurde bei 8000 U/min bei Temperaturen im Bereich von 32 bis 50°C für eine Zeit von 5 Minuten betrieben. Daraus ergaben sich Nylonkörper (Komplexteilchen), deren Oberfläche jeweils mit Hydroxylapatit beschichtet war.
Hier ist zu bemerken, dass die erhaltenen Komplexteilchen eine mittlere Teilchengröße von 5,8 µm und eine Dichte von 1,13 g/cm³ hatten. Außerdem betrug die mittlere Dicke der Schicht aus Hydroxylapatit auf den Komplexteilchen 0,45 µm.

2. Herstellen des Trägers mit immobilisierten Antikörpern

Bei der folgenden Operation war die Raumtemperatur 20°C.
Vor der Erläuterung der Immobilisierung von Antikörpern an dem Träger wird Kasein, gelöst in einer Kaseinlösung zur Verwendung in dem folgenden Prozess <2> erwähnt. Dieses gelöste Kasein wurde zur Entfernung des Calciumions aus dem Kasein vorbehandelt. Die Entfernung des Calciumions wurde folgendermaßen durchgeführt.

1. Zunächst wurden 2,5 ml Kaseinlösung mit 40 mg/ml hergestellt und 0,5 ml einer EDTA-Lösung mit 500 mM wurden der Kaseinlösung hinzugefügt. Dadurch ergaben sich 25 ml einer gemischten Lösung von Kasein/EDTA, in der die Kaseinkonzentration 4 mg/ml und die EDTA-Konzentration 10 mM betrug. Hier ist zu bemerken, dass sich die Kaseinlösung durch Einstellen der Konzentration von "Block Ace" (Handelsmarke), hergestellt und vertrieben von Snow Bland Milk Products Co., Ltd., ergab.
2. Zum Entfernen des EDTA aus der Mischlösung wurde eine Gelfiltrationschromatografie durchgeführt. Ferner wurde der Puffer der Kaseinlösung zusätzlich zu der Entfernung von EDTA ausgetauscht (zu diesem Zeitpunkt wurden vor und nach der Gelfiltrationschromatografie die Konzentration des Calciumions in der Mischlösung und die Konzentration des Calciumions in einer resultierenden Kaseinlösung jeweils gemessen. Die Konzentration des Calciumions in der Kaseinlösung verringerte sich auf 1/6 oder weniger. Daraus ergab sich, dass die meisten Calciumionen in dem Kasein entfernt waren. Hier ist zu bemerken, dass die Konzentration des Calciumions durch Messen der Absorptionsfähigkeit der Lösung bei 423 nm erhalten wurde).
3. Schließlich wurde die erhaltene Kaseinlösung so konzentriert, dass die Kaseinkonzentration etwa 4 mg/ml betrug.
4. 1 ml einer Avidinlösung von 0,1 mg/ml (hergestellt und vertrieben von Pierce Chemical Company) wurden 10 mg der oben beschriebenen Komplexteilchen hinzugefügt.

Dann wurde diese Mischung bei Raumtemperatur für 60 Minuten gemischt und mit 1000 U/min für 5 Minuten zum Entfernen überschüssigen Avidins zentrifugiert. Danach wurden die so erhaltenen Komplexteilchen gewaschen.

1. Dann wurde 1 ml einer Kaseinlösung von 4 mg/ml, die in oben beschriebener Weise eingestellt war, zu den in <1 > erhaltenen Komplexteilchen hinzugefügt.

Dann wurden die Komplexteilchen und das Kasein bei einer Temperatur von 37°C für 60 Minuten zur Reaktion gebracht und bei 1000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert, um überschüssiges Kasein zu entfernen. Dann wurden die so erhaltenen Komplexteilchen gewaschen.

1. Dann wurde 1 ml einer Biotin-markierten (konjugierten) Anti-Humanimmunoglobulin-G-Antikörper(Ziegenserum)-Lösung von 0,01 mg/ml den Komplexteilchen aus <2> hinzugefügt. Hier ist zu bemerken, dass der Biotin-markierte Anti-Humanimmunoglobulin-G-Antikörper (hergestellt und vertrieben von American Qualex Co., Ltd.) durch Binden von Biotin an den konstanten Bereich des IgG hergestellt wurde.

Dann wurde diese Mischung bei Raumtemperatur für 60 Minuten gemischt und für 5 Minuten bei 1000 U/min zentrifugiert, um überschüssige Antikörper zu entfernen. Dann wurden die so erhaltenen Komplexteilchen gewaschen.

1. Dann wurden 1 ml einer Glutaraldehyd (hergestellt und vertrieben von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) -Lösung von 1 mg/ml zu den Komplexteilchen aus <3> hinzugefügt.

Dann wurden die Komplexteilchen und das Glutaraldehyd (bivalentes Querverbindungsmittel) bei einer Temperatur von 37°C für 30 Minuten zur Reaktion gebracht und für 5 Minuten bei 1000 U/min zentrifugiert, um überschüssiges Glutaraldehyd zu entfernen. Dann wurden die so erhaltenen Komplexteilchen gewaschen.

1. Dann wurde 1 ml einer Kaseinlösung von 4 mg/ml zu den Komplexteilchen aus <4> hinzugefügt.

Danach wurde diese Mischung für 60 Minuten bei einer Temperatur von 37°C belassen und für 5 Minuten bei 1000 U/min zentrifugiert, um den Überstand zu entfernen.
Dadurch ergaben sich Träger mit immobilisierten Antikörpern, bei denen an der Oberfläche eines jeden Nylonkörpers, beschichtet mit Hydroxylapatit, Anti-Human- IgG-Antikörper (IgG) über Avidin und Biotin immobilisiert waren.
In diesem Zusammenhang ist zu bemerken, dass eine Phosphat-Puffersalzlösung (pH 6,8) zum Einstellen der Avidinlösung, der Biotin-markierten Anti- Humanimmunoglobulin-G-Antikörperlösung und der Glutaraldehydlösung sowie zum Waschen der Komplexteilchen in jeder Behandlung <1> bis <5> verwendet wurde.

(Vergleichsbeispiel 1)

Ein Träger mit immobilisierten Antikörpern, bei dem die Antikörper direkt ohne Verwendung von Avidin und Biotin immobilisiert waren, wurde hergestellt. Ein solcher Träger mit immobilisierten Antikörpern wurde folgendermaßen hergestellt.
Zunächst wurden 10 mg Nylonkörper jeweils mit einer Oberflächenschicht aus Hydroxylapatit hergestellt. Diese Körper entsprachen den oben beschriebenen.
Dann wurde 1 ml einer Anti-Humanimmunoglobulin-G-Antikörper(Ziegenserum)- Lösung von 0,01 mg/ml zu diesen Komplexteilchen hinzugefügt. Hier ist zu bemerken, dass der Anti-Humanimmunoglobulin-G-Antikörper (hergestellt und vertrieben von Cappel, Inc.) nicht mit Biotin konjugiert war.
Dann wurde diese Mischung für 60 Minuten bei Raumtemperatur gemischt und für 5 Minuten bei 1000 U/min zentrifugiert, um die überschüssigen Antikörper zu entfernen. Dann wurden die so erhaltenen Komplexteilchen gewaschen.
Danach wurde 1 ml einer Kaseinlösung von 4 mg/ml zu den erhaltenen Komplexteilchen hinzugefügt. Die Kaseinlösung entsprach der oben beschriebenen.
Danach wurden die Komplexteilchen und das Kasein bei einer Temperatur von 37°C für 60 Minuten zur Reaktion gebracht und für 5 Minuten bei 1000 U/min zentrifugiert, um das überschüssige Kasein zu entfernen. Dann wurden die so erhaltenen Komplexteilchen gewaschen.
Nach diesen Operationen wurden dieselben Operationen wie oben unter <4> und <5> beschrieben für die Komplexteilchen in dieser Reihenfolge ausgeführt.
Dadurch ergaben sich Träger mit immobilisierten Antikörpern, bei denen die Anti- Humanimmunoglobulin-G-Antikörper (IgG) an der Oberfläche eines jeden Nylonkörpers, beschichtet mit Hydroxylapatit, ohne Avidin und Biotin immobilisiert waren.

(Vergleichsbeispiel 2)

Ein Träger mit immobilisierten Antikörpern, bei dem ein Protein A an der Oberfläche vorhanden war und die Antikörper über das Protein A immobilisiert waren, wurde hergestellt. Dieser Körper mit den immobilisierten Antikörpern wurde folgendermaßen hergestellt.
Zunächst wurden 10 mg Nylonkörper jeweils mit einer Oberflächenschicht aus Hydroxylapatit hergestellt. Die hergestellten Körper entsprachen den oben beschriebenen.
Dieselbe Operation wie oben unter <1> beschrieben wurde unter Verwendung von 1 ml einer Protein A (hergestellt und vertrieben von Cappel, Inc.) -Lösung von 0,1 mg/ml an Stelle der Avidinlösung durchgeführt. Nach dieser Operation wurde dieselbe Operation wie oben unter <2> beschrieben mit den Körpern durchgeführt, auf denen das Protein A vorhanden war.
Danach wurde 1 ml einer Anti-Humanimmunoglobulin-G-Antikörper-(Ziegenserum)-Lösung von 0,01 mg/ml zu den erhaltenen Komplexteilchen hinzugefügt. Hier ist zu bemerken, dass der Anti-Humanimmunoglobulin-G-Antikörper (hergestellt und vertrieben von Cappel, Inc.) nicht mit Biotin konjugiert war.
Dann wurde diese Mischung für 60 Minuten bei Raumtemperatur gemischt und für 5 Minuten bei 1000 U/min zentrifugiert, um die überschüssigen Antikörper zu entfernen. Dann wurden die erhaltenen Komplexteilchen gewaschen.
Nach diesen Operationen wurden dieselben Operationen wie oben unter <4> und <5> beschrieben für die Komplexteilchen in dieser Reihenfolge ausgeführt.
Dadurch ergaben sich Träger jeweils mit immobilisierten Antikörpern, bei denen an der Oberfläche eines jeden Nylonkörpers, beschichtet mit Hydroxylapatit, die Anti-Human-IgG-Antikörper (IgG) über das Protein A immobilisiert waren.
Hier ist zu bemerken, dass eine Phosphatpuffersalzlösung (pH 6,8) zum Einstellen der Protein A-Lösung verwendet wurde.

(Kontrolle)

Zunächst wurden 10 mg Nylonkörper jeweils mit einer Oberflächenschicht aus Hydroxylapatit hergestellt. Diese Körper entsprachen den oben beschriebenen.
Danach wurden dieselben Operationen wie oben unter <2>, <4> und <5> beschrieben in dieser Reihenfolge ausgeführt. Es ergab sich ein Träger, der hergestellt war nur durch Beschichten des mit Hydroxylapatit versehenen Nylonkörpers mit Kasein und anschließendes Stabilisieren des Kaseins mit Glutaraldehyd.

(Auswertung)

Für jeden Träger mit immobilisierten Antikörpern gemäß dem Beispiel und den Vergleichsbeispielen sowie den Kontrollträger wurde das Bindungsvermögen für Antigene gemessen.
Zunächst wurde 1 ml normalen Humanserums (hergestellt und vertrieben von Rockland, Inc.) auf 10/1000 verdünnt und zu 1 mg eines jeden Trägers mit immobilisierten Antikörpern hinzugefügt, der sich aus dem Beispiel und den Vergleichsbeispielen sowie aus der Kontrolle ergab.
Dann wurde die so erhaltene jeweilige Lösung für 30 Minuten bei Raumtemperatur gemischt und für 5 Minuten bei 1000 U/min zentrifugiert, um das überschüssige Serum zu entfernen. Danach wurde jeder gegebenenfalls mit immobilisierten Antikörpern versehene Träger gewaschen.
Danach wurde 1 ml einer HRP-(Meerrettich-Peroxidase)-markierten Anti- Humanimmunoglobulin-G-Antikörper(Ziegenserum)-Lösung von 0,0005 mg/ml zu jedem Träger mit immobilisierten Antikörpern und dem Kontrollträger hinzugefügt. In diesem Zusammenhang ist zu bemerken, dass in dem HRP-markierten Anti- Humanimmunoglobulin-G-Antikörper (hergestellt und vertrieben von Cappel, Inc.) das HRP an dem IgG gebunden war.
Dann wurden jeder Träger mit immobilisierten Antikörpern sowie der Kontrollträger und der HRP-markierte Anti-Humanimmunoglobulin-G-Antikörper für 30 Minuten bei Raumtemperatur zur Reaktion gebracht und für 5 Minuten bei 1000 U/min zentrifugiert, um die überschüssigen Antikörper zu entfernen. Danach wurden jeder Träger mit immobilisierten Antikörpern sowie der Kontrollträger gewaschen.
Dann wurden 0,5 ml einer 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidinlösung (hergestellt und vertrieben von Moss Inc.) von 0,3 mg/ml zu jedem Träger mit immobilisierten Antikörpern sowie dem Kontrollträger hinzugefügt, um bei Raumtemperatur für 30 Minuten eine Farbreaktion durchzuführen.
Dann wurde jede erhaltene Lösung für 5 Minuten bei 1000 U/min zentrifugiert, um die 100 µL Überstand zu korrigieren. 20 µL von 1 N HCl wurden zu jedem erhaltenen Überstand hinzugefügt, um die Farbreaktion zu stoppen, und dann wurde deren Absorptionsfähigkeit jeweils bei 450 nm gemessen.
Hier ist zu bemerken, dass eine Phosphatpuffersalzlösung (pH 6,8) zum Einstellen des normalen Humanserums, der HRP-markierten Anti-Humanimmunoglobulin-G- Antikörperlösung und der 3,3',5,5'-Tetramethylen-benzidinlösung sowie zum Waschen der Komplexteilchen in jeder oben beschriebenen Behandlung verwendet wurde.
Die Ergebnisse der oben beschriebenen Messungen sind in der folgenden Tabelle 1 enthalten, und Fig. 1 zeigt die Ergebnisse in grafischer Darstellung. Tabelle 1
Wie sich aus Tabelle 1 und Fig. 1 ergibt, waren an jedem Träger mit immobilisierten Antikörpern nach den Vergleichsbeispielen nur wenige IgG-Antikörper des normalen Humanserums (Antigen) gebunden. Andererseits waren bei dem Träger mit immobilisierten Antikörpern aus dem Beispiel eine große Menge IgG- Antikörper gebunden, die in normalem Humanserum enthalten sind. Dies wird auf die folgenden Gründe zurückgeführt. Bei dem Träger mit immobilisierten Antikörpern nach dem Beispiel stehen die Antigen-Bindungsbereiche (Reaktionsbereiche) eines jeden Antikörpers von der Trägeroberfläche nach außen, so dass ein hohes Bindungsvermögen für Antikörper oder Antigene beibehalten wird.
Deshalb bestätigt sich, dass der nach dem Beispiel erhaltene Träger mit immobilisierten Antikörpern eine extrem hohe Bindungsfähigkeit für Antigene hat.
Ferner wurden Träger jeweils mit immobilisierten Antikörpern in derselben Weise wie in dem Beispiel beschrieben hergestellt, jedoch mit dem Unterschied, dass Albumin und Gelatine jeweils an Stelle des Kaseins als Protein zum Beschichten des Bereichs eines Trägers verwendet wurden, in dem die Antikörper nicht immobilisiert wurden. Ferner wurden Träger jeweils mit immobilisierten Antikörpern wie in dem obigen Beispiel hergestellt, jedoch mit dem Unterschied, dass jeweils p- Benzochinon, m-Maleimidbenzoesäure und N,N'-o-Phenylendimaleimid an Stelle von Glutaraldehyd als bivalentes Querverbindungsmittel (Stabilisierungsmittel) zum Stabilisieren der Antikörper verwendet wurden.
Dann wurde für jeden dieser Träger mit immobilisierten Antikörpern das Bindungsvermögen für Antigene in derselben Weise wie oben beschrieben gemessen. Es bestätigte sich, dass alle Träger mit immobilisierten Antikörpern eine extrem hohe Bindungskraft für Antigene hatten, wie es auch bei dem Beispiel der Fall war.

EFFEKTE DER ERFINDUNG

Wie oben beschrieben, ist es durch die Erfindung möglich, Antigene oder Antikörper an einem Träger zu immobilisieren, während ein hohes Bindungsvermögen für Antigene oder Antikörper (die Bindungsobjekte sind) in einer zu untersuchenden Probe beibehalten wird.
Deshalb ist es bei der Erfindung möglich, einen Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern zu erhalten, der ein hohes Bindungsvermögen für Antigene oder Antikörper hat, die in einer zu untersuchenden Probe enthalten sind. Ferner wird es durch Verwenden eines solchen Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern möglich, Antigene oder Antikörper in einer zu untersuchenden Probe mit hoher Empfindlichkeit zu erfassen, so dass der Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern extrem nützlich bei der Diagnose verschiedener Arten von Krankheiten ist, beispielsweise bei Infektionen u. ä., indem die Antigen-Antikörper-Reaktion angewendet wird.
Ferner ist darauf hinzuweisen, dass viele Änderungen und Zusätze an den oben beschriebenen Ausführungsformen möglich sind, ohne vom Umfang und Grundgedanken der Erfindung abzuweichen, wie er in den folgenden Ansprüchen definiert ist.
Außerdem wird darauf hingewiesen, dass sich die vorliegende Beschreibung auf den Inhalt der Japanischen Patentanmeldung 2000-362762 (eingereicht am 29. November 2000) und der Japanischen Patentanmeldung 2001-349447 (eingereicht am 14. November 2001) bezieht, der hier ausdrücklich in seiner Gesamtheit eingeführt wird.

Claims

1. Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern, umfassend:
einen Träger mit einer Oberfläche aus einer Calciumphosphatverbindung und
Antigene oder Antikörper jeweils mit einem für die Antigen-Antikörper- Reaktion irrelevanten Bereich, die jeweils an der Oberfläche des Trägers über den irrelevanten Bereich immobilisiert sind,
wobei die Trägeroberfläche einen Bereich ohne immobilisierte Antigene oder Antikörper hat und mindestens ein Teil des Bereichs mit einem Protein mit geringer Wechselwirkung für Antigene oder Antikörper beschichtet ist.

2. Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 1, bei dem der Träger Antiliganden trägt und jedes Antigen oder jeder Antikörper einen gebundenen Liganden hat, wobei jedes Antigen oder jeder Antikörper an dem Träger über den Liganden und den Antiliganden gebunden ist.

3. Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 2, bei dem jeder Antiligand an der Trägeroberfläche durch Adsorption getragen wird.

4. Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 2, bei dem jeder Antikörper einen konstanten Bereich hat und der Ligand an diesem konstanten Bereich gebunden ist.

5. Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 1, bei dem die Proteinschicht durch Adsorption des Trägers an dem Teil des Bereichs der Oberfläche gebildet ist.

6. Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 1, bei dem das Protein Kasein ist.

7. Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 1, bei dem die Antigene oder Antikörper stabilisiert sind.

8. Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 7, bei dem die Antigene oder Antikörper durch Behandeln des Trägers mit einem Stabilisierungsmittel stabilisiert sind.

9. Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 7, bei dem die Antigene oder Antikörper durch Behandeln des Trägers mit einem Querverbindungsmittel stabilisiert sind, das die Antigene oder Antikörper mit den Liganden und/oder Antiliganden querverbindet.

10. Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 9, bei dem das Querverbindungsmittel ein bivalentes Querverbindungsmittel ist.

11. Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 1, bei dem ein Teil des Trägers nahe seiner Oberfläche mit einer dichten Struktur gebildet ist.

12. Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 1, bei dem der Träger einen Trägerkörper hat, auf dessen Oberfläche eine Schicht aus einer Calciumphosphatverbindung vorgesehen ist.

13. Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 12, bei dem der Träger durch Kollision poröser Teilchen der Calciumphosphatverbindung mit dem Trägerkörper gebildet ist.

14. Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 13, bei dem die porösen Teilchen durch Agglutinationsbindung von Primärteilchen der Calciumphosphatverbindung gebildet sind.

15. Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 1, bei dem die Antikörper IgG sind.

16. Verfahren zum Herstellen eines Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern, umfassend die folgenden Schritte:
einen Immobilisierungsschritt zum Immobilisieren von Antigenen oder Antikörpern an einer Trägeroberfläche, die aus einer Calciumphosphatverbindung besteht, über Bereiche der Antigene oder Antikörper, die für die Antigen-Antikörper-Reaktion irrelevant sind, und
einen Beschichtungsschritt zum Beschichten mindestens eines Teils eines Bereichs der Trägeroberfläche, in dem die Antigene oder Antikörper nicht immobilisiert werden, mit einem Protein mit geringer Wechselwirkung für Antigene oder Antikörper.

17. Verfahren zum Herstellen eines Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 16, bei dem der Immobilisierungsschritt enthält:
einen Schritt des Anlagerns von Antiliganden an der Trägeroberfläche; und
einen Schritt der Kontaktierung von Antigenen oder Antikörpern, an denen Liganden mit einer Affinität für die Antiliganden gebunden sind, mit dem Träger.

18. Verfahren zum Herstellen eines Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 17, bei dem die Antiliganden an dem Träger durch Adsorption an der Trägeroberfläche angelagert werden.

19. Verfahren zum Herstellen eines Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 17, bei dem die Liganden an konstanten Bereichen der Antikörper gebunden sind.

20. Verfahren zum Herstellen eines Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 16, bei dem der Beschichtungsschritt durch Adsorption des Proteins an den Teil des Bereichs der Trägeroberfläche erfolgt.

21. Verfahren zum Herstellen eines Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 16, bei dem das Protein Kasein ist.

22. Verfahren zum Herstellen eines Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 16, bei dem das Verfahren ferner nach dem Immobilisierungsschritt einen Stabilisierungsschritt für die Antigene oder Antikörper enthält.

23. Verfahren zum Herstellen eines Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 22, bei dem der Stabilisierungsschritt durch Behandeln des Trägers mit einem Stabilisierungsmittel ausgeführt wird.

24. Verfahren zum Herstellen eines Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 22, bei dem der Stabilisierungsschritt durch Behandeln des Trägers mit einem Querverbindungsmittel zum Binden der Antigene oder Antikörper an den Liganden und/oder Antiliganden durchgeführt wird.

25. Verfahren zum Herstellen eines Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 24, bei dem das Querverbindungsmittel ein bivalentes Querverbindungsmittel ist.

26. Verfahren zum Herstellen eines Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 16, bei dem ein Teil des Trägers nahe seiner Oberfläche mit einer dichten Struktur gebildet ist.

27. Verfahren zum Herstellen eines Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 16, bei dem der Träger einen Trägerkörper hat, dessen Oberfläche mit einer Schicht aus einer Calciumphosphatverbindung versehen ist.

28. Verfahren zum Herstellen eines Träger mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 27, bei dem der Träger durch Kollision poröser Teilchen der Calciumphosphatverbindung mit dem Trägerkörper hergestellt ist.

29. Verfahren zum Herstellen eines Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 28, bei dem die porösen Teilchen durch Agglutinationsbindung von Primärteilchen der Calciumphosphatverbindung erzeugt werden.

30. Verfahren zum Herstellen eines Trägers mit immobilisierten Antigenen oder Antikörpern nach Anspruch 16, bei dem die Antikörper IgG sind.