JP3958478B2 - 担体の被覆方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、担体の被覆方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
リン酸カルシウムで構成された担体に抗原を吸着させたものに、かかる抗原に対する特異抗体（以下、「特異抗体」と略す。）を反応させた場合、特異抗体が抗原と抗原抗体反応を起こし、これにより担体は凝集反応を起こすことが知られている。
【０００３】
このため、担体に抗原を吸着させたものは、血液などに特異抗体が存在するか否かを検出する試薬として利用されている。
【０００４】
この場合、特異抗体を検出するためには、抗原を吸着させた担体に対して特異抗体以外の抗体が、非特異的に結合してはならない。すなわち、吸着させた抗原に対する特異抗体のみが、担体と結合することが特異抗体検出の条件である。
【０００５】
そこで、本発明者らは、これまで担体に対して特異抗体のみを結合させる機構を検討してきた。
【０００６】
その結果、担体に抗原を吸着させ、さらに抗原が吸着していない部分を、抗体との相互作用が低いタンパク質で被覆すれば、担体に対し特異抗体以外の抗体が非特異的に結合するのを防止できることを見出した。
【０００７】
しかしながら、この方法では、特異抗体を高い感度で検出するには、未だ不十分であった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、抗体が担体に非特異的に結合しにくい担体の被覆方法を提供することにある。
【０００９】
【問題を解決するための手段】
このような目的は、下記（１）〜（６）の本発明により達成される。
【００１０】
（１） カルシウムイオンを含む金属イオンを有するリン酸化タンパク質を、少なくとも表面がリン酸カルシウムで構成された担体に吸着させる担体の被覆方法であって、
前記リン酸化タンパク質を含有する溶液にキレート剤を添加し、次いで、該溶液中から前記キレート剤を除去することにより、前記カルシウムイオンの少なくとも一部を除去し、その後、このリン酸化タンパク質で前記担体の表面を被覆することを特徴とする担体の被覆方法。
これにより、抗体が非特異的に結合しにくい担体を提供することができる。
【００１１】
（２） 前記キレート剤の除去は、ゲルろ過クロマトグラフィーにより行う上記（１）に記載の担体の被覆方法。
これにより、タンパク質から金属イオンを好適に除去できる。
【００１２】
（３） 前記キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸である上記（１）または（２）に記載の担体の被覆方法。
エチレンジアミン四酢酸は金属イオンと好適に錯塩を形成することができる。このため、タンパク質から金属イオンを好適に除去できる。
【００１３】
（４） 前記リン酸化タンパク質は、金属酵素である上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の担体の被覆方法。
これにより、担体を好適に被覆できる。
【００１４】
（５） 前記リン酸化タンパク質は、カゼインである上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の担体の被覆方法。
カゼインは、リン酸カルシウムで構成された担体を被覆するタンパク質として最適である。
【００１５】
（６） 前記リン酸カルシウムは、ハイドロキシアパタイトである上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の担体の被覆方法。
【００１６】
ハイドロキシアパタイトは、担体として最適である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
上記の担体に対して特異抗体のみを結合させる機構では、特異抗体のみを高い感度で検出するには未だ不十分であった。これは、抗原が吸着していない担体の表面を抗体との相互作用が低いタンパク質で、完全に被覆できないことに起因するものだと考えられる。
【００１８】
ところで、上記のタンパク質の中には、その分子内に金属イオンを有するものがある。
【００１９】
また、担体は静電的な結合により、タンパク質をその表面に吸着する。
したがって、このようなタンパク質が分子内に金属イオンを有している場合、金属イオンが担体とタンパク質との静電的な結合に作用し、担体とタンパク質との間で強い結合能が得られないものと考えられる。
【００２０】
このことが原因となり、上述の如く担体の表面をタンパク質で、完全に被覆できないものと推察される。
【００２１】
そこで、本発明者は、キレート剤で金属イオンを有するタンパク質から金属イオンを除去すれば、このタンパク質でリン酸カルシウムで構成された担体の表面を完全に被覆できるものと考えた。
本発明は、本発明者のかかる知見に基づいてなされたものである。
【００２２】
以下、本発明の担体の被覆方法を添付図面に示す好適実施例に基づいて詳細に説明する。
【００２３】
図１は、担体の被覆方法の工程を示す図である。
本発明の担体の被覆方法は、金属イオンを有するタンパク質を含有する溶液にキレート剤を添加し、次いで、この溶液中からキレート剤を除去することにより、金属イオンを除去し、その後、このタンパク質でリン酸カルシウムで構成された担体の表面を被覆することを特徴とする。
【００２４】
（第一工程）
まず、第一段階は、金属イオンを有するタンパク質を含有する溶液にキレート剤を添加する工程である。
【００２５】
タンパク質溶液にキレート剤を添加することにより、キレート剤はタンパク質が有する金属イオンと錯塩を形成し、このタンパク質から金属イオンを除去することができる。
【００２６】
ここで、本発明におけるタンパク質としては、抗体との相互作用が低いタンパク質が好ましく用いられ、例えば、カゼイン、アルブミン（例えばウシ血清由来）、ゼラチン等が挙げられる。
【００２７】
このようなタンパク質の中でも、金属酵素が好ましく用いられる。金属酵素は、その分子内に金属イオンを有しているため、金属イオンとの親和性が高い。そして、リン酸カルシウムは、金属イオンであるカルシウムイオンおよびリン酸イオンよりなる。このため、リン酸カルシウムで構成された担体は、金属酵素を強く吸着する。したがって、金属酵素はリン酸カルシウムで構成された担体の表面を被覆するのに好適である。
【００２８】
このような金属酵素としては、例えば、カゼイン、トランスフェリン、フェレドキシン等が挙げられる。
【００２９】
また、タンパク質としては、タンパク質の一部がリン酸化されているリン酸化タンパク質であることが好ましい。上述の如く担体（リン酸カルシウム）は静電的な結合によりタンパク質をその表面に吸着する。特に、リン酸化タンパク質のリン酸基は担体（リン酸カルシウム）の表面のカルシウムイオンと強く結合すると考えられる。このため、担体（リン酸カルシウム）はこのようなリン酸化タンパク質を比較的強く吸着し、担体の表面は好適に被覆されるようになる。
【００３０】
このようなリン酸化タンパク質としては、例えば、カゼイン、ビテリン、ホスビチン等が挙げられる。
【００３１】
以上述べた事項を総合して考慮すると、タンパク質としてはカゼインが最適である。カゼインは金属イオンとしてカルシウムイオンを有する金属酵素であり、カルシウムイオンとの親和性が極めて高い。さらに、カゼインは哺乳類の乳に含まれるタンパク質であり、抗体との相互作用が極めて低い。すなわち、カゼインは、担体（リン酸カルシウム）への吸着能が極めて高く、かつ抗体との相互作用が低いので、担体の表面を被覆するタンパク質として最適である。
【００３２】
金属イオンとしては、上記のタンパク質が有する金属イオン、例えば、カルシウムイオン（Ｃａ2+）、マグネシウムイオン（Ｍｇ2+）、ストロンチウムイオン（Ｓｒ2+）等が挙げられる。
【００３３】
その中でも、除去すべき金属イオンとしては、カルシウムイオンが好ましい。カルシウムイオンを有するタンパク質は、カルシウムイオンとの親和性が極めて高く、その分子内にカルシウムイオンを強く結合している。そこで、このタンパク質からカルシウムイオンを除去すれば、タンパク質はその分子内でカルシウムイオンと結合することがなくなり、担体（リン酸カルシウム）の表面に存在するカルシウムイオンと強く結合できるようになる。このため、担体（リン酸カルシウム）は、上記のタンパク質をより強く吸着することが可能となり、担体の表面は好適に被覆される。
【００３４】
ここでキレート剤とは、金属イオンに配位してキレート化合物を生成する多座配位子をいい、例えば、エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコール四酢酸、ジメチルグリオキシム、ジチゾン、アセチルアセトン、グリシン等が挙げられる。
【００３５】
この中でも、キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（以下「ＥＤＴＡ」と略す。）が最適である。ＥＤＴＡは、水への高い溶解度と金属イオンとの高い結合能を有し、特にカルシウムイオン等の２価金属イオンと選択的に錯塩の形成が可能である。このため、ＥＤＴＡは、上記のタンパク質からカルシウムイオンを効率的に除去することができる。
【００３６】
タンパク質溶液のタンパク質濃度は、０．１〜１０００ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、特に１〜５０ｍｇ／ｍＬであることがより好ましい。
【００３７】
タンパク質濃度がこの範囲の下限値未満であると、添加量に見合う効果が期待できない場合がある。一方、この範囲の上限値を超えると、未反応タンパク質が残る場合がある。
【００３８】
一方、キレート剤は、タンパク質溶液中での最終濃度が１〜１０００ｍＭとなるように添加することが好ましく、特に、１〜１０ｍＭとなるように添加することがより好ましい。
【００３９】
タンパク質溶液中でのキレート剤濃度が低すぎると、キレート剤が十分に金属イオンを除去できない場合がある。一方、キレート剤濃度を上限値を超えて高くしても、添加量に見合う効果を期待できない場合がある。
【００４０】
なお、キレート剤は、固体（粉体、粒体等）の状態でタンパク質溶液に添加してもよいし、キレート剤溶液の状態でタンパク質溶液に添加してもよい。
【００４１】
（第二工程）
次に、第二段階は上記のタンパク質溶液中からキレート剤を除去することにより、金属イオンを除去する工程である。
【００４２】
タンパク質溶液中からキレート剤を除去すれば、タンパク質溶液中から金属イオンが除去される。これに伴ってタンパク質中の金属イオンも除去される。このため、担体（リン酸カルシウム）はタンパク質を強く吸着できるようになる。
【００４３】
ここで、本発明における「金属イオンの除去」とは、タンパク質溶液中の金属イオンを、タンパク質溶液中から完全に消失させることをいうのではなく、タンパク質溶液中の金属イオンの大部分を除くことを意味する。このような観点から、本発明における「金属イオンの除去」とは、タンパク質溶液中の金属イオンを四分の一以下程度にまで減少させることを目安とすることができる。
【００４４】
なお、キレート剤を分離する方法としては、ゲルろ過クロマトグラフィー、限外ろ過、透析等が挙げられる。
【００４５】
この中でも、キレート剤を分離する方法としては、ゲルろ過クロマトグラフィーが最適である。ゲルろ過クロマトグラフィーによるキレート剤の分離は、タンパク質溶液中からキレート剤を効率的に除去することが可能であり、さらに操作が簡便であるという利点がある。
【００４６】
ゲルろ過クロマトグラフィーに用いるゲルはタンパク質およびキレート剤の種類、分子量等により適宜選択可能である。好適には、デキストランが用いられる。
【００４７】
また、タンパク質溶液のボリューム等により、限外ろ過、透析等が適宜選択可能である。
【００４８】
（第三工程）
第三段階は、リン酸カルシウムで構成された担体の表面をタンパク質で被覆する工程である。
【００４９】
この工程では、担体（リン酸カルシウム）はタンパク質を強く吸着するので、タンパク質と担体とを接触させるだけで、容易にタンパク質で担体の表面を被覆することができる。したがって、例えば、タンパク質溶液中に担体を添加することにより、担体の表面をタンパク質で被覆することができる。
【００５０】
本発明に用いられる担体（リン酸カルシウム）は、球状であることが好ましい。球状とすることにより、被覆の均一性が向上するという利点が得られる。
【００５１】
担体が球状である場合、かかる担体の平均粒径は、２〜１００μｍ程度であることが好ましく、５〜８０μｍ程度であることがより好ましい。粒径が小さすぎると、軽量になるため効果が期待できない場合がある（例えば、本発明を利用して特異抗体のみを担体に結合させる機構を実施し、凝集の有無を検査しようとする場合、担体の粒径が小さすぎると、担体の凝集が起きにくくなる場合がある。）。一方、粒径が大きすぎると、担体どうしの相互作用が強くなる場合がある（本発明を実施する前に、すでに担体が凝集してしまっている場合がある。）。
【００５２】
また、本発明に用いられる担体（リン酸カルシウム）は、二次粒子であることが好ましい。これにより、均質な担体が得られ、担体をタンパク質で均一に被覆することが容易となる。
【００５３】
さらに、本発明に用いられる担体（リン酸カルシウム）には、多孔質粒子または緻密質粒子を適宜選択可能である。
【００５４】
なお、担体を構成するリン酸カルシウム（リン酸系化合物）としては、例えば、Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2、Ｃａ10（ＰＯ4）6Ｆ2、Ｃａ10（ＰＯ4）6Ｃ12、Ｃａ3（ＰＯ4）2、Ｃａ2Ｐ2Ｏ7およびＣａ4（ＰＯ4）2等が挙げられる。また、これらのリン酸カルシウムの中でもＣａ／Ｐモル比が１．０〜２．０のものが好ましく、１．４〜１．８のものがより好ましい。
【００５５】
このようなリン酸カルシウムのうち、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2）が最適である。ハイドロキシアパタイトは、タンパク質の吸着能に優れる。この場合、ハイドロキシアパタイトの合成の際に残存する物質（原料等）または合成の過程で生じる二次反応生成物等が含まれていてもよい。
【００５６】
なお、リン酸カルシウム（担体）の球状二次粒子は、例えば下記の方法により製造することができる。まず、公知の湿式法により得られたリン酸カルシウムスラリーを直接噴霧乾燥することにより造粒し、球状の二次粒子とすることができる。あるいは、リン酸カルシウムスラリーに粘度調整剤、熱分解性有機化合物粒子または繊維等の添加物を加え噴霧乾燥することにより球状の二次粒子を造粒することができる。
【００５７】
このようなリン酸カルシウムは、４００〜１３００℃程度で焼成されたものであることが好ましく、６５０〜１０５０℃で焼成されたものであることがより好ましい。
【００５８】
かかる温度範囲で焼成されたリン酸カルシウムは、熱分解することなく、しかもタンパク質に対し優れた吸着能を有する。
【００５９】
なお、このような担体は、ナイロン等の樹脂（ポリマー）で構成されたビーズ（粒体）の表面を、リン酸カルシウムで被覆した複合粒子であってもよい。
【００６０】
以上の工程を行うことにより、タンパク質で担体（リン酸カルシウム）の表面を効率良く被覆できる。
【００６１】
【実施例】
以下、本発明を実施例および比較例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６２】
（実施例）
［１］ まず、４ｍｇ／ｍＬのカゼイン水溶液（雪印乳業（株）「ブロックエース」の濃度を調整したもの）２．５ｍＬに、カゼイン水溶液中でのＥＤＴＡの最終濃度が１０ｍＭとなるように、ＥＤＴＡ７．３ｍｇを添加した。その後、かかる液を１分間攪拌した後、１０分間静置した。
【００６３】
［２］ 次に、上記［１］で得たカゼイン水溶液をゲルろ過クロマトグラフィー（ファルマシア社製「Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５Ｍ」）にかけ、流速１ｍＬ／ｍｉｎで溶出し、カゼインを含む画分を分取した。
【００６４】
ここで、ゲルろ過クロマトグラフィーの前後において、カゼイン水溶液中の金属イオン濃度（カルシウムイオンは４２３ｎｍの吸光度、マグネシウムイオンは２８５ｎｍの吸光度、ストロンチウムイオンは４６１ｎｍの吸光度）を、原子吸光分析器により測定した。
その結果を下記表１に示す。
【００６５】
【表１】
【００６６】
表１より明らかなように、カゼイン水溶液をＥＤＴＡで処理することにより、カゼイン水溶液中の金属イオン濃度、特に目的とするカルシウムイオン濃度が低下した。このことは、カゼインのカルシウムイオンが除去されていることを示すものである。
【００６７】
［３］ 次に、上記の［２］で得られたカゼイン水溶液１ｍＬに、ハイドロキシアパタイトビーズ１０ｍｇを添加した。ここで使用したハイドロキシアパタイトビーズは７００℃で焼成され、平均粒径１０μｍ、Ｃａ／Ｐモル比＝１．６７のものである。その後、かかる混合物を１分間の攪拌の後、６０分間静置した。
【００６８】
以上の操作により、カゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズを得た。
【００６９】
（比較例１）
上記の実施例における［１］の工程および［２］の工程を行わず、［３］の工程を実施した。つまり、ＥＤＴＡで処理していないカゼイン水溶液にハイドロキシアパタイトビーズを直接添加することにより、カゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズを作成した。
【００７０】
（比較例２）
上記の実施例における［２］の工程を行わなかった以外は、つまり、カゼイン水溶液にＥＤＴＡを添加した後、かかるカゼイン水溶液に対してゲルろ過クロマトグラフィーを実施しなかった以外は、上記の実施例と同様にして、カゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズを作成した。
【００７１】
（評価）
［ハイドロキシアパタイトビーズへのカゼインの吸着量］
上記の［３］の工程において、ハイドロキシアパタイトビーズへのカゼインの吸着量を以下の方法で調べた。
【００７２】
実施例および比較例１において、［３］の工程を実施する前のカゼイン水溶液中のカゼイン濃度および［３］の工程を実施した後のカゼイン水溶液上清中のカゼイン濃度を測定した。なお、カゼイン濃度の確認には、２８０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果を表２に示す。
【００７３】
【表２】
【００７４】
実施例では、比較例１に比較して、上清中のカゼイン濃度がより低下していることが窺える。これは、上清中のカゼイン濃度が低下した分だけ、カゼインがハイドロキシアパタイトビーズに吸着したことになる。つまり、比較例１に比し、実施例においてはより多くのカゼインがハイドロキシアパタイトビーズに吸着し、ハイドロキシアパタイトビーズをより効率良くカゼインで被覆することができたことを示す結果が得られた。
【００７５】
［カゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズへのヒト免疫グロブリンＧの結合］
実施例で得られたカゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズに、ヒト免疫グロブリンＧ（以下、「ヒトＩｇＧ」と略す。）が結合するか否かを検討した。
【００７６】
まず、上記の［３］の工程で得られたカゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズ１ｍｇに０、２．５、５．０、１０．０μｇ／ｍＬの各濃度のヒトＩｇＧ水溶液を５００μＬ添加した。
【００７７】
かかる混合物を１分間攪拌した後、３０分間静置した。その後、１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、かかる液からハイドロキシアパタイトビーズを回収した。
【００７８】
次に、これらのハイドロキシアパタイトビーズに結合したヒトＩｇＧ量を、以下の方法にて測定した。
【００７９】
まず、回収したハイドロキシアパタイトビーズに０．０００５ｍｇ／ｍＬのHorseradish Peroxidase（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体水溶液５００μＬを添加し、かかる混合物を１分間攪拌した後、３０分間静置した。
【００８０】
次に、かかる液にＨＲＰの基質（発色剤）として3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine（ＴＭＢ；Ｍｏｓｓ社製「ＴＭＢＥ−５００」）を５００μＬ添加した。
【００８１】
かかる液を１分間攪拌した後、１Ｎ ＨＣｌ（塩酸）にて反応を停止させ、反応溶液上清の４５０ｎｍの吸光度を測定した。
この結果を図２に示す。
【００８２】
また、比較例１および比較例２で得られたカゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズについても同様の実験を行った。
【００８３】
その結果、比較例１では、添加した２．５、５．０、１０．０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ水溶液の各濃度における吸光度は、実施例における吸光度のそれぞれ４倍程度であった。
【００８４】
比較例２では、添加した２．５、５．０、１０．０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ水溶液の各濃度における吸光度は、実施例における吸光度のそれぞれ１０倍程度であった。
【００８５】
以上の結果から判るように、添加したヒトＩｇＧ水溶液のいずれの濃度においても、本実施例で得られたカゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズの吸光度は、各比較例のそれに比し低いものであった。このことは、実施例で得られたカゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズへのヒトＩｇＧの吸着量が少なかったことを示している。つまり、カルシウムイオンを除去したカゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズへは、ヒトＩｇＧの結合が抑制されていることが判った。
【００８６】
一方、これに対し、比較例１および比較例２では、明らかに、より多くのヒトＩｇＧが、カゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズに結合していることを示唆する結果であった。
【００８７】
［カゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズへのヒト免疫グロブリンＭの結合］
実施例および比較例１、２で得られたカゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズに、ヒト免疫グロブリンＭ（以下、「ヒトＩｇＭ」と略す。）が結合するか否かを調べた。
【００８８】
この実験では、ヒトＩｇＧおよびＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体の代わりに、ヒトＩｇＭおよびＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＭ抗体を用いた以外は、上記のヒトＩｇＧ結合実験で行った操作に従い実施した。
【００８９】
その結果、ヒトＩｇＭの場合も前記のヒトＩｇＧの場合と同様の結果が得られた。
【００９０】
以上の結果をまとめると、カゼインが有するカルシウムイオンをＥＤＴＡで除去すれば、ハイドロキシアパタイトビーズはより多くのカゼインで被覆され、また、このように作成されたハイドロキシアパタイトビーズへは、抗体が非特異的に結合しにくいことが明らかとなった。これは、カゼインでハイドロキシアパタイトビーズをほぼ完全に被覆できたことによるものと推察された。
【００９１】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、抗体が非特異的に結合しにくい担体（リン酸カルシウム）を作成することが可能である。
【００９２】
したがって、抗原を担体（リン酸カルシウム）へ吸着させ、本発明を利用して担体の抗原が吸着していない部分を、抗体との相互作用が低いタンパク質で被覆すれば、目的とする特異抗体のみを結合させる機構が実現できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】金属イオンを有するタンパク質によるリン酸カルシウムで構成された担体の被覆方法の工程を示す図である。
【図２】実施例で作成されたカゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズへのヒトＩｇＧの結合量を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、担体の被覆方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
リン酸カルシウムで構成された担体に抗原を吸着させたものに、かかる抗原に対する特異抗体（以下、「特異抗体」と略す。）を反応させた場合、特異抗体が抗原と抗原抗体反応を起こし、これにより担体は凝集反応を起こすことが知られている。
【０００３】
このため、担体に抗原を吸着させたものは、血液などに特異抗体が存在するか否かを検出する試薬として利用されている。
【０００４】
この場合、特異抗体を検出するためには、抗原を吸着させた担体に対して特異抗体以外の抗体が、非特異的に結合してはならない。すなわち、吸着させた抗原に対する特異抗体のみが、担体と結合することが特異抗体検出の条件である。
【０００５】
そこで、本発明者らは、これまで担体に対して特異抗体のみを結合させる機構を検討してきた。
【０００６】
その結果、担体に抗原を吸着させ、さらに抗原が吸着していない部分を、抗体との相互作用が低いタンパク質で被覆すれば、担体に対し特異抗体以外の抗体が非特異的に結合するのを防止できることを見出した。
【０００７】
しかしながら、この方法では、特異抗体を高い感度で検出するには、未だ不十分であった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、抗体が担体に非特異的に結合しにくい担体の被覆方法を提供することにある。
【０００９】
【問題を解決するための手段】
このような目的は、下記（１）〜（６）の本発明により達成される。
【００１０】
（１） カルシウムイオンを含む金属イオンを有するリン酸化タンパク質を、少なくとも表面がリン酸カルシウムで構成された担体に吸着させる担体の被覆方法であって、
前記リン酸化タンパク質を含有する溶液にキレート剤を添加し、次いで、該溶液中から前記キレート剤を除去することにより、前記カルシウムイオンの少なくとも一部を除去し、その後、このリン酸化タンパク質で前記担体の表面を被覆することを特徴とする担体の被覆方法。
これにより、抗体が非特異的に結合しにくい担体を提供することができる。
【００１１】
（２） 前記キレート剤の除去は、ゲルろ過クロマトグラフィーにより行う上記（１）に記載の担体の被覆方法。
これにより、タンパク質から金属イオンを好適に除去できる。
【００１２】
（３） 前記キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸である上記（１）または（２）に記載の担体の被覆方法。
エチレンジアミン四酢酸は金属イオンと好適に錯塩を形成することができる。このため、タンパク質から金属イオンを好適に除去できる。
【００１３】
（４） 前記リン酸化タンパク質は、金属酵素である上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の担体の被覆方法。
これにより、担体を好適に被覆できる。
【００１４】
（５） 前記リン酸化タンパク質は、カゼインである上記（１）ないし（４）のいずれかに記載の担体の被覆方法。
カゼインは、リン酸カルシウムで構成された担体を被覆するタンパク質として最適である。
【００１５】
（６） 前記リン酸カルシウムは、ハイドロキシアパタイトである上記（１）ないし（５）のいずれかに記載の担体の被覆方法。
【００１６】
ハイドロキシアパタイトは、担体として最適である。
【００１７】
【発明の実施の形態】
上記の担体に対して特異抗体のみを結合させる機構では、特異抗体のみを高い感度で検出するには未だ不十分であった。これは、抗原が吸着していない担体の表面を抗体との相互作用が低いタンパク質で、完全に被覆できないことに起因するものだと考えられる。
【００１８】
ところで、上記のタンパク質の中には、その分子内に金属イオンを有するものがある。
【００１９】
また、担体は静電的な結合により、タンパク質をその表面に吸着する。
したがって、このようなタンパク質が分子内に金属イオンを有している場合、金属イオンが担体とタンパク質との静電的な結合に作用し、担体とタンパク質との間で強い結合能が得られないものと考えられる。
【００２０】
このことが原因となり、上述の如く担体の表面をタンパク質で、完全に被覆できないものと推察される。
【００２１】
そこで、本発明者は、キレート剤で金属イオンを有するタンパク質から金属イオンを除去すれば、このタンパク質でリン酸カルシウムで構成された担体の表面を完全に被覆できるものと考えた。
本発明は、本発明者のかかる知見に基づいてなされたものである。
【００２２】
以下、本発明の担体の被覆方法を添付図面に示す好適実施例に基づいて詳細に説明する。
【００２３】
図１は、担体の被覆方法の工程を示す図である。
本発明の担体の被覆方法は、金属イオンを有するタンパク質を含有する溶液にキレート剤を添加し、次いで、この溶液中からキレート剤を除去することにより、金属イオンを除去し、その後、このタンパク質でリン酸カルシウムで構成された担体の表面を被覆することを特徴とする。
【００２４】
（第一工程）
まず、第一段階は、金属イオンを有するタンパク質を含有する溶液にキレート剤を添加する工程である。
【００２５】
タンパク質溶液にキレート剤を添加することにより、キレート剤はタンパク質が有する金属イオンと錯塩を形成し、このタンパク質から金属イオンを除去することができる。
【００２６】
ここで、本発明におけるタンパク質としては、抗体との相互作用が低いタンパク質が好ましく用いられ、例えば、カゼイン、アルブミン（例えばウシ血清由来）、ゼラチン等が挙げられる。
【００２７】
このようなタンパク質の中でも、金属酵素が好ましく用いられる。金属酵素は、その分子内に金属イオンを有しているため、金属イオンとの親和性が高い。そして、リン酸カルシウムは、金属イオンであるカルシウムイオンおよびリン酸イオンよりなる。このため、リン酸カルシウムで構成された担体は、金属酵素を強く吸着する。したがって、金属酵素はリン酸カルシウムで構成された担体の表面を被覆するのに好適である。
【００２８】
このような金属酵素としては、例えば、カゼイン、トランスフェリン、フェレドキシン等が挙げられる。
【００２９】
また、タンパク質としては、タンパク質の一部がリン酸化されているリン酸化タンパク質であることが好ましい。上述の如く担体（リン酸カルシウム）は静電的な結合によりタンパク質をその表面に吸着する。特に、リン酸化タンパク質のリン酸基は担体（リン酸カルシウム）の表面のカルシウムイオンと強く結合すると考えられる。このため、担体（リン酸カルシウム）はこのようなリン酸化タンパク質を比較的強く吸着し、担体の表面は好適に被覆されるようになる。
【００３０】
このようなリン酸化タンパク質としては、例えば、カゼイン、ビテリン、ホスビチン等が挙げられる。
【００３１】
以上述べた事項を総合して考慮すると、タンパク質としてはカゼインが最適である。カゼインは金属イオンとしてカルシウムイオンを有する金属酵素であり、カルシウムイオンとの親和性が極めて高い。さらに、カゼインは哺乳類の乳に含まれるタンパク質であり、抗体との相互作用が極めて低い。すなわち、カゼインは、担体（リン酸カルシウム）への吸着能が極めて高く、かつ抗体との相互作用が低いので、担体の表面を被覆するタンパク質として最適である。
【００３２】
金属イオンとしては、上記のタンパク質が有する金属イオン、例えば、カルシウムイオン（Ｃａ2+）、マグネシウムイオン（Ｍｇ2+）、ストロンチウムイオン（Ｓｒ2+）等が挙げられる。
【００３３】
その中でも、除去すべき金属イオンとしては、カルシウムイオンが好ましい。カルシウムイオンを有するタンパク質は、カルシウムイオンとの親和性が極めて高く、その分子内にカルシウムイオンを強く結合している。そこで、このタンパク質からカルシウムイオンを除去すれば、タンパク質はその分子内でカルシウムイオンと結合することがなくなり、担体（リン酸カルシウム）の表面に存在するカルシウムイオンと強く結合できるようになる。このため、担体（リン酸カルシウム）は、上記のタンパク質をより強く吸着することが可能となり、担体の表面は好適に被覆される。
【００３４】
ここでキレート剤とは、金属イオンに配位してキレート化合物を生成する多座配位子をいい、例えば、エチレンジアミン四酢酸、エチレングリコール四酢酸、ジメチルグリオキシム、ジチゾン、アセチルアセトン、グリシン等が挙げられる。
【００３５】
この中でも、キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（以下「ＥＤＴＡ」と略す。）が最適である。ＥＤＴＡは、水への高い溶解度と金属イオンとの高い結合能を有し、特にカルシウムイオン等の２価金属イオンと選択的に錯塩の形成が可能である。このため、ＥＤＴＡは、上記のタンパク質からカルシウムイオンを効率的に除去することができる。
【００３６】
タンパク質溶液のタンパク質濃度は、０．１〜１０００ｍｇ／ｍＬであることが好ましく、特に１〜５０ｍｇ／ｍＬであることがより好ましい。
【００３７】
タンパク質濃度がこの範囲の下限値未満であると、添加量に見合う効果が期待できない場合がある。一方、この範囲の上限値を超えると、未反応タンパク質が残る場合がある。
【００３８】
一方、キレート剤は、タンパク質溶液中での最終濃度が１〜１０００ｍＭとなるように添加することが好ましく、特に、１〜１０ｍＭとなるように添加することがより好ましい。
【００３９】
タンパク質溶液中でのキレート剤濃度が低すぎると、キレート剤が十分に金属イオンを除去できない場合がある。一方、キレート剤濃度を上限値を超えて高くしても、添加量に見合う効果を期待できない場合がある。
【００４０】
なお、キレート剤は、固体（粉体、粒体等）の状態でタンパク質溶液に添加してもよいし、キレート剤溶液の状態でタンパク質溶液に添加してもよい。
【００４１】
（第二工程）
次に、第二段階は上記のタンパク質溶液中からキレート剤を除去することにより、金属イオンを除去する工程である。
【００４２】
タンパク質溶液中からキレート剤を除去すれば、タンパク質溶液中から金属イオンが除去される。これに伴ってタンパク質中の金属イオンも除去される。このため、担体（リン酸カルシウム）はタンパク質を強く吸着できるようになる。
【００４３】
ここで、本発明における「金属イオンの除去」とは、タンパク質溶液中の金属イオンを、タンパク質溶液中から完全に消失させることをいうのではなく、タンパク質溶液中の金属イオンの大部分を除くことを意味する。このような観点から、本発明における「金属イオンの除去」とは、タンパク質溶液中の金属イオンを四分の一以下程度にまで減少させることを目安とすることができる。
【００４４】
なお、キレート剤を分離する方法としては、ゲルろ過クロマトグラフィー、限外ろ過、透析等が挙げられる。
【００４５】
この中でも、キレート剤を分離する方法としては、ゲルろ過クロマトグラフィーが最適である。ゲルろ過クロマトグラフィーによるキレート剤の分離は、タンパク質溶液中からキレート剤を効率的に除去することが可能であり、さらに操作が簡便であるという利点がある。
【００４６】
ゲルろ過クロマトグラフィーに用いるゲルはタンパク質およびキレート剤の種類、分子量等により適宜選択可能である。好適には、デキストランが用いられる。
【００４７】
また、タンパク質溶液のボリューム等により、限外ろ過、透析等が適宜選択可能である。
【００４８】
（第三工程）
第三段階は、リン酸カルシウムで構成された担体の表面をタンパク質で被覆する工程である。
【００４９】
この工程では、担体（リン酸カルシウム）はタンパク質を強く吸着するので、タンパク質と担体とを接触させるだけで、容易にタンパク質で担体の表面を被覆することができる。したがって、例えば、タンパク質溶液中に担体を添加することにより、担体の表面をタンパク質で被覆することができる。
【００５０】
本発明に用いられる担体（リン酸カルシウム）は、球状であることが好ましい。球状とすることにより、被覆の均一性が向上するという利点が得られる。
【００５１】
担体が球状である場合、かかる担体の平均粒径は、２〜１００μｍ程度であることが好ましく、５〜８０μｍ程度であることがより好ましい。粒径が小さすぎると、軽量になるため効果が期待できない場合がある（例えば、本発明を利用して特異抗体のみを担体に結合させる機構を実施し、凝集の有無を検査しようとする場合、担体の粒径が小さすぎると、担体の凝集が起きにくくなる場合がある。）。一方、粒径が大きすぎると、担体どうしの相互作用が強くなる場合がある（本発明を実施する前に、すでに担体が凝集してしまっている場合がある。）。
【００５２】
また、本発明に用いられる担体（リン酸カルシウム）は、二次粒子であることが好ましい。これにより、均質な担体が得られ、担体をタンパク質で均一に被覆することが容易となる。
【００５３】
さらに、本発明に用いられる担体（リン酸カルシウム）には、多孔質粒子または緻密質粒子を適宜選択可能である。
【００５４】
なお、担体を構成するリン酸カルシウム（リン酸系化合物）としては、例えば、Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2、Ｃａ10（ＰＯ4）6Ｆ2、Ｃａ10（ＰＯ4）6Ｃ12、Ｃａ3（ＰＯ4）2、Ｃａ2Ｐ2Ｏ7およびＣａ4（ＰＯ4）2等が挙げられる。また、これらのリン酸カルシウムの中でもＣａ／Ｐモル比が１．０〜２．０のものが好ましく、１．４〜１．８のものがより好ましい。
【００５５】
このようなリン酸カルシウムのうち、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2）が最適である。ハイドロキシアパタイトは、タンパク質の吸着能に優れる。この場合、ハイドロキシアパタイトの合成の際に残存する物質（原料等）または合成の過程で生じる二次反応生成物等が含まれていてもよい。
【００５６】
なお、リン酸カルシウム（担体）の球状二次粒子は、例えば下記の方法により製造することができる。まず、公知の湿式法により得られたリン酸カルシウムスラリーを直接噴霧乾燥することにより造粒し、球状の二次粒子とすることができる。あるいは、リン酸カルシウムスラリーに粘度調整剤、熱分解性有機化合物粒子または繊維等の添加物を加え噴霧乾燥することにより球状の二次粒子を造粒することができる。
【００５７】
このようなリン酸カルシウムは、４００〜１３００℃程度で焼成されたものであることが好ましく、６５０〜１０５０℃で焼成されたものであることがより好ましい。
【００５８】
かかる温度範囲で焼成されたリン酸カルシウムは、熱分解することなく、しかもタンパク質に対し優れた吸着能を有する。
【００５９】
なお、このような担体は、ナイロン等の樹脂（ポリマー）で構成されたビーズ（粒体）の表面を、リン酸カルシウムで被覆した複合粒子であってもよい。
【００６０】
以上の工程を行うことにより、タンパク質で担体（リン酸カルシウム）の表面を効率良く被覆できる。
【００６１】
【実施例】
以下、本発明を実施例および比較例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００６２】
（実施例）
［１］ まず、４ｍｇ／ｍＬのカゼイン水溶液（雪印乳業（株）「ブロックエース」の濃度を調整したもの）２．５ｍＬに、カゼイン水溶液中でのＥＤＴＡの最終濃度が１０ｍＭとなるように、ＥＤＴＡ７．３ｍｇを添加した。その後、かかる液を１分間攪拌した後、１０分間静置した。
【００６３】
［２］ 次に、上記［１］で得たカゼイン水溶液をゲルろ過クロマトグラフィー（ファルマシア社製「Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５Ｍ」）にかけ、流速１ｍＬ／ｍｉｎで溶出し、カゼインを含む画分を分取した。
【００６４】
ここで、ゲルろ過クロマトグラフィーの前後において、カゼイン水溶液中の金属イオン濃度（カルシウムイオンは４２３ｎｍの吸光度、マグネシウムイオンは２８５ｎｍの吸光度、ストロンチウムイオンは４６１ｎｍの吸光度）を、原子吸光分析器により測定した。
その結果を下記表１に示す。
【００６５】
【表１】
表１より明らかなように、カゼイン水溶液をＥＤＴＡで処理することにより、カゼイン水溶液中の金属イオン濃度、特に目的とするカルシウムイオン濃度が低下した。このことは、カゼインのカルシウムイオンが除去されていることを示すものである。
【００６７】
［３］ 次に、上記の［２］で得られたカゼイン水溶液１ｍＬに、ハイドロキシアパタイトビーズ１０ｍｇを添加した。ここで使用したハイドロキシアパタイトビーズは７００℃で焼成され、平均粒径１０μｍ、Ｃａ／Ｐモル比＝１．６７のものである。その後、かかる混合物を１分間の攪拌の後、６０分間静置した。
【００６８】
以上の操作により、カゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズを得た。
【００６９】
（比較例１）
上記の実施例における［１］の工程および［２］の工程を行わず、［３］の工程を実施した。つまり、ＥＤＴＡで処理していないカゼイン水溶液にハイドロキシアパタイトビーズを直接添加することにより、カゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズを作成した。
【００７０】
（比較例２）
上記の実施例における［２］の工程を行わなかった以外は、つまり、カゼイン水溶液にＥＤＴＡを添加した後、かかるカゼイン水溶液に対してゲルろ過クロマトグラフィーを実施しなかった以外は、上記の実施例と同様にして、カゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズを作成した。
【００７１】
（評価）
［ハイドロキシアパタイトビーズへのカゼインの吸着量］
上記の［３］の工程において、ハイドロキシアパタイトビーズへのカゼインの吸着量を以下の方法で調べた。
【００７２】
実施例および比較例１において、［３］の工程を実施する前のカゼイン水溶液中のカゼイン濃度および［３］の工程を実施した後のカゼイン水溶液上清中のカゼイン濃度を測定した。なお、カゼイン濃度の確認には、２８０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果を表２に示す。
【００７３】
【表２】
実施例では、比較例１に比較して、上清中のカゼイン濃度がより低下していることが窺える。これは、上清中のカゼイン濃度が低下した分だけ、カゼインがハイドロキシアパタイトビーズに吸着したことになる。つまり、比較例１に比し、実施例においてはより多くのカゼインがハイドロキシアパタイトビーズに吸着し、ハイドロキシアパタイトビーズをより効率良くカゼインで被覆することができたことを示す結果が得られた。
【００７５】
［カゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズへのヒト免疫グロブリンＧの結合］
実施例で得られたカゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズに、ヒト免疫グロブリンＧ（以下、「ヒトＩｇＧ」と略す。）が結合するか否かを検討した。
【００７６】
まず、上記の［３］の工程で得られたカゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズ１ｍｇに０、２．５、５．０、１０．０μｇ／ｍＬの各濃度のヒトＩｇＧ水溶液を５００μＬ添加した。
【００７７】
かかる混合物を１分間攪拌した後、３０分間静置した。その後、１２００ｒｐｍ、５分間遠心分離し、かかる液からハイドロキシアパタイトビーズを回収した。
【００７８】
次に、これらのハイドロキシアパタイトビーズに結合したヒトＩｇＧ量を、以下の方法にて測定した。
【００７９】
まず、回収したハイドロキシアパタイトビーズに０．０００５ｍｇ／ｍＬのHorseradish Peroxidase（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体水溶液５００μＬを添加し、かかる混合物を１分間攪拌した後、３０分間静置した。
【００８０】
次に、かかる液にＨＲＰの基質（発色剤）として3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine（ＴＭＢ；Ｍｏｓｓ社製「ＴＭＢＥ−５００」）を５００μＬ添加した。
【００８１】
かかる液を１分間攪拌した後、１Ｎ ＨＣｌ（塩酸）にて反応を停止させ、反応溶液上清の４５０ｎｍの吸光度を測定した。
この結果を図２に示す。
【００８２】
また、比較例１および比較例２で得られたカゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズについても同様の実験を行った。
【００８３】
その結果、比較例１では、添加した２．５、５．０、１０．０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ水溶液の各濃度における吸光度は、実施例における吸光度のそれぞれ４倍程度であった。
【００８４】
比較例２では、添加した２．５、５．０、１０．０μｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ水溶液の各濃度における吸光度は、実施例における吸光度のそれぞれ１０倍程度であった。
【００８５】
以上の結果から判るように、添加したヒトＩｇＧ水溶液のいずれの濃度においても、本実施例で得られたカゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズの吸光度は、各比較例のそれに比し低いものであった。このことは、実施例で得られたカゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズへのヒトＩｇＧの吸着量が少なかったことを示している。つまり、カルシウムイオンを除去したカゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズへは、ヒトＩｇＧの結合が抑制されていることが判った。
【００８６】
一方、これに対し、比較例１および比較例２では、明らかに、より多くのヒトＩｇＧが、カゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズに結合していることを示唆する結果であった。
【００８７】
［カゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズへのヒト免疫グロブリンＭの結合］
実施例および比較例１、２で得られたカゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズに、ヒト免疫グロブリンＭ（以下、「ヒトＩｇＭ」と略す。）が結合するか否かを調べた。
【００８８】
この実験では、ヒトＩｇＧおよびＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体の代わりに、ヒトＩｇＭおよびＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＭ抗体を用いた以外は、上記のヒトＩｇＧ結合実験で行った操作に従い実施した。
【００８９】
その結果、ヒトＩｇＭの場合も前記のヒトＩｇＧの場合と同様の結果が得られた。
【００９０】
以上の結果をまとめると、カゼインが有するカルシウムイオンをＥＤＴＡで除去すれば、ハイドロキシアパタイトビーズはより多くのカゼインで被覆され、また、このように作成されたハイドロキシアパタイトビーズへは、抗体が非特異的に結合しにくいことが明らかとなった。これは、カゼインでハイドロキシアパタイトビーズをほぼ完全に被覆できたことによるものと推察された。
【００９１】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明によれば、抗体が非特異的に結合しにくい担体（リン酸カルシウム）を作成することが可能である。
【００９２】
したがって、抗原を担体（リン酸カルシウム）へ吸着させ、本発明を利用して担体の抗原が吸着していない部分を、抗体との相互作用が低いタンパク質で被覆すれば、目的とする特異抗体のみを結合させる機構が実現できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】金属イオンを有するタンパク質によるリン酸カルシウムで構成された担体の被覆方法の工程を示す図である。
【図２】実施例で作成されたカゼインで被覆されたハイドロキシアパタイトビーズへのヒトＩｇＧの結合量を示す図である。
Claims (6)
- カルシウムイオンを含む金属イオンを有するリン酸化タンパク質を、少なくとも表面がリン酸カルシウムで構成された担体に吸着させる担体の被覆方法であって、
前記リン酸化タンパク質を含有する溶液にキレート剤を添加し、次いで、該溶液中から前記キレート剤を除去することにより、前記カルシウムイオンの少なくとも一部を除去し、その後、このリン酸化タンパク質で前記担体の表面を被覆することを特徴とする担体の被覆方法。 - 前記キレート剤の除去は、ゲルろ過クロマトグラフィーにより行う請求項１に記載の担体の被覆方法。
- 前記キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸である請求項１または２に記載の担体の被覆方法。
- 前記リン酸化タンパク質は、金属酵素である請求項１ないし３のいずれかに記載の担体の被覆方法。
- 前記リン酸化タンパク質は、カゼインである請求項１ないし４のいずれかに記載の担体の被覆方法。
- 前記リン酸カルシウムは、ハイドロキシアパタイトである請求項１ないし５のいずれかに記載の担体の被覆方法。
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