CH695632A5 - Support portant des antigènes ou des anticorps immobilisés et procédé pour sa fabrication. - Google Patents

Description

CH 695 632 A5

Description

[0001] La présente invention a pour objet un support qui porte des antigènes ou anticorps immobilisés, qui est utile dans le diagnostic de diverses maladies telles que les maladies infectieuses en utilisant la réaction antigène-anticorps, et un procédé pour sa production. On notera que, dans la description suivante, le support qui porte des antigènes ou anticorps immobilises est désigné également sous le nom de «support au niveau duquel sont immobilisés des antigènes ou anticorps».

[0002] On sait que les composés du type phosphate de calcium ont pour caractéristique d'adsorber non seulement les anticorps mais également les protéines et leurs protéines conjuguées pouvant consister en divers antigènes. En raison de cette caractéristique, il est considéré qu'une entité obtenue en immobilisant (adsorbant) des antigènes ou des anticorps sur un composé du type phosphate de calcium peut être utilisée pour diverses réactions antigène-anticorps.

[0003] Ces dernières années, pour le diagnostic de diverses maladies telles que les maladies infectieuses, il a été effectué diverses propositions concernant un procédé dans lequel, après immobilisation d'antigènes ou d'anticoprs sur un support constitué d'un composé du type phosphate de calcium, un échantillon à étudier est amené en contact avec le support pour observer une image d'agglutination provoquée par la réaction antigène-anticorps.

[0004] Cependant, une réaction suffisante ne se produit pas en immobilisant simplement les antigènes ou anticorps sur le support en raison de la médiocre capacité de liaison entre le support et les antigènes ou anticorps (ohjets à lier) dans l'échantillon examiné.

[0005] En conséquence, un objectif de la présente invention consiste à proposer un support qui porte des antigènes ou anticorps immobilisés, qui présente une grande capacité de liaison aux antigènes ou anticorps (objets à lier) dans l'échantillon à étudier, et un procédé pour sa production.

[0006] Afin d'atteindre l'objectif précité, la présente invention concerne un support qui porte des antigènes ou anticorps immobilisés, comprenant un support comportant une surface gui est formée d'un composé à base de phosphate de calcium, et des antigènes ou anticorps ayant chacun une partie qui est sans rapport avec la réaction antigène-anticorps, chacun desdits antigènes, ou anticorps étant immobilisé à la surface du support par sa partie sans rapport, la surface du support comportant une portion où les antigènes ou anticorps ne sont pas immobilisés, et au moins une partie de la portion de la surface est revêtue d'une protéine présentant une faible interaction avec les antigènes ou anticorps.

[0007] Conformément à la présente invention, il est possible de produire un support qui porte des antigènes ou anticorps immobilisés, qui présente une grande capacité de liaison aux antigènes ou anticorps (objets à lier) dans un échantillon à étudier.

[0008] Dans la présente invention, il est préférable que le support porte des antiligands et chaque antigène ou anticorps comporte un ligand lié, chaque antigène ou anticorps étant immobilisé sur le support par le ligand et l'antiligand. Cela permet d'immobiliser les antigènes ou anticorps sur le support tout en maintenant la grande capacité de liaison aux antigènes ou anticorps dans l'échantillon à étudier.

[0009] En outre, il est préférable que chaque antiligand soit porté par la surface du support par adsorption. Cela permet de produire le support portant des antigènes ou anticorps immobilisés.

[0010] Dans ce cas, il est préférable que chaque anticorps comporte une région constante, et quelle ligand soit lié à la région constante de l'anticorps. Suivant cette caractéristique, les antigènes deviennent liés plus préférentiellement aux anticorps.

[0011] En outre, il est préférable que le revêtement de la protéine soit préparé par adsorption du support à la partie de la portion de la surface, Au moyen de cette caractéristique, il devient possible d'effectuer aisément le revêtement de la surface du support.

[0012] En outre, dans la présente invention, il est préférable que la protéine consiste en caséine. La caséine est la protéine (matière de revêtement) préférée comme substance de revêtement pour le support.

[0013] En outre, dans la présente invention, il est préférable que les antigènes ou anticorps soient stabilisés. Cela permet d'éviter la détérioration au cours du temps du support qui porte les antigènes ou anticorps immobilisés.

[0014] Dans ce cas, il est préférable que les antigènes ou anticorps soient stabilisés en traitant le support avec un agent stabilisant. Ce procédé est le plus simple et plus efficace pour stabiliser les antigènes ou anticorps.

[0015] En outre, dans la présente invention, il est préférable que les antigènes ou anticorps soient stabilisés en traitant le support avec un agent de réticulation qui provoque la réticulation des antigènes ou anticorps et des ligands et/ou antiligands. Cela permet d'éviter de manière plus fiable l'élimination des antigènes ou anticorps du support.

[0016] Dans ce cas, il est préférable que l'agent de réticulation soit un agent de réticulation bivalent. Cela permet de stabiliser les antigènes ou anticorps de manière plus fiable.

[0017] En outre, dans la présente invention, il est préférable qu'une portion du support qui est à proximité de sa surface soit sous forme d'une structure dense. Cela permet d'immobiliser les antigènes ou anticorps de telle sorte que leurs parties réactives soient éloignées de la surface du support, d'une distance pratiquement constante.

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[0018] En outre, dans la présente invention, il est préférable que le support comprenne un corps de support présentant une surface, et un revêtement constitué d'un composé à base de phosphate de calcium présent sur la surface du corps du support. Au moyen de cette caractéristique, il est possible d'ajuster la densité du support qui porte des antigènes ou anticorps immobilisés de manière à obtenir les conditions optimales pour la réaction d'agglutination.

[0019] Dans ce cas, il est préférable que le support soit produit en soumettant le corps du support à des collisions avec des particules poreuses du composé à base de phosphate de calcium. Cela permet de transformer aisément et de manière fiable la région proche de la surface du support en une structure dense.

[0020] En outre, dans ce cas, il est également préférable que les particules poreuses soient produites en liant par agglutination les particules primaires du composé a base de phosphate de calcium. Cela permet de transformer plus aisément la région proche de la surface du support en une structure dense.

[0021] En outre, dans la présente invention, il est préférable que les anticorps consistent en IgG. Cela permet d'augmenter les possibilités de choix des antigènes.

[0022] Un autre aspect de la présente invention concerne un procédé pour la production d'un support qui porte des antigènes ou anticorps immobilisés, procédé comprenant les étapes suivantes: une étape d'immobilisation pour immobiliser les antigènes ou anticorps sur une surface d'un support qui est formée d'un composé à base de phosphate de calcium par des portions des antigènes ou anticorps qui sont sans rapport avec la réaction antigène-anticorps, et une étape de revêtement pour revêtir au moins une partie d'une portion de la surface du support, où les antigènes ou anticorps ne sont pas immobilisés, avec une protéine présentant une faible interaction avec les antigènes ou anticorps.

[0023] Conformément à la présente invention, il est possible de mettre en œuvre un procédé pour la production d'un support qui porte des antigènes ou anticorps immobilisés, qui présente une grande capacité de liaison pour antigènes ou anticorps (objets à lier) dans un échantillon à étudier.

[0024] Dans ce procédé, il est préférable que l'étape d'immobilisation comprenne: une étape permettant d'entraîner des antiligands sur la support du support; et une étape de mise en contact d'antigènes ou d'anticorps, auquel sont liés des ligands présentant une affinité pour les antiligands, avec le support. Cela permet d'immobiliser les antigènes ou anticorps sur le support tout en maintenant la grande capacité de liaison pour les antigènes ou anticorps dans l'échantillon à étudier.

[0025] En outre, dans ce procédé, il est préférable que les antiligands soient portés par le support en étant adsorbés par la surface du support. Cela permet de produire aisément un support qui porte des antigènes ou anticorps immobilisés.

[0026] En outre, il est également préférable que les ligands soient liés à des régions constantes des anticorps. Au moyen de cette caractéristique, les antigènes sont liés préférentiellement aux anticorps.

[0027] En outre, dans ce procédé, il est également préférable que l'étape de revêtement soit mise en œuvre en amenant la protéine à être adsorbée à la partie de la portion de la surface du support. Cela permet d'effectuer aisément le revêtement de la surface du support.

[0028] En outre, dans ce procédé, il est également préférable que la protéine consiste en caséine. La caséine est la protéine (matière de revêtement) hautement préférable comme substance de revêtement pour le support.

[0029] En outre, dans ce procédé, il est préférable que le procédé comprenne de plus, après l'étape d'immobilisation, une étape de stabilisation des antigènes ou anticorps. Cela permet d'éviter la détérioration au cours du temps du support qui porte les antigènes ou anticorps immobilisés.

[0030] Dans ce cas, il est préférable que l'étape de stabilisation soit mise en œuvre en' traitant le support avec un agent stabilisant. Ce procédé est le procédé le plus simple et efficace pour stabiliser les antigènes ou anticorps.

[0031] En outre, dans ce procédé, il est préférable que l'étape de stabilisation soit mise en œuvre en traitant le support avec un agent de réticulation pour lier les antigènes ou anticorps aux ligands et/ou antiligands. Cela permet d'éviter de manière plus fiable l'élimination des antigènes ou anticorps du support.

[0032] Dans ce cas, il est préférable que l'agent de réticulation soit un agent de réticulation bivalent. Cela permet de stabiliser les antigènes ou anticorps de manière plus fiable.

[0033] En outre, dans ce procédé, il est préférable qu'une portion du support qui est à proximité de la surface de ce support soit sous forme d'une structure dense. Cela permet d'immobiliser les antigènes ou anticorps de telle sorte que leurs parties réactives soient éloignées de la surface du support, d'une distance pratiquement constante.

[0034] De plus, dans ce procédé, il est également préférable que le support comprenne un corps de support comportant une surface, et un revêtement constitué d'un composé a base de phosphate de calcium, présent sur la surface du corps du support. Au moyen de cette caractéristique, il est possible d'ajuster la densité du support qui porte des antigènes ou anticorps immobilisés de manière à obtenir les conditions optimales pour la réaction d'agglutination.

[0035] Dans ce cas, il est préférable que le support soit produit en soumettant le corps du support à une collision avec des particules poreuses du composé à base de phosphate de calcium. Cela permet de transformer aisément et de manière fiable la région proche de la surface du support en une structure dense.

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[0036] En outre, dans ce cas, il est également préférable que les particules poreuses soient produites en liant par agglutination les particules primaires du composé à base de phosphate de calcium. Cela permet de transformer plus aisément la région proche de la surface du support en une structure dense.

[0037] En outre, dans ce procédé, il est également préférable que les anticorps consistent en IgG. Cela permet d'accroître les possibilités de choix, des antigènes.

[0038] Ces objectifs, structures et avantages, parmi d'autres, de la présente invention apparaîtront mieux en prenant en considération la description suivante des formes de réalisation préférées et des exemples, conjointement avec le dessin annexé.

[0039] La fig. 1 est un graphique qui représente le degré d'adsorption d'antigènes dans chacun des supports comportant des anticorps immobilisés de l'exemple, et des exemples comparatifs respectifs, et d'un support utilisé comme témoin.

[0040] Après des études et considérations approfondies, les inventeurs de la présente invention ont émis l'hypothèse que, lorsque les antigènes ou anticorps sont simplement immobilisés (adsorbés) sur un support, les antigènes ou anticorps sont amenés à un état rendant difficile la conduite de la réaction antigène-anticorps.

[0041] De manière plus détaillée, les portions réactives des antigènes ou anticorps immobilisés (appelées simplement ci-après «portions réactives») pour les anticorps ou antigènes (objets à lier) dans un échantillon à étudier sont adsorbées

[0042] Eu égard à ce qui précède, les inventeurs ont conçu que, si des antigènes ou anticorps peuvent être immobilisés sur un support dans un état' tel que leurs portions réactives ne soient pas adsorbées par la surface du support, il peut être possible d'obtenir un support qui porte des antigènes ou anticorps immobilisés, présentant une grande capacité de liaison pour les objets à lier.

[0043] La présente invention a été réalisée en rapport avec le concept précité.

[0044] Une explication est présentée ci-dessous en ce qui concerne les formes préférées de réalisation de la présente invention. A cet égard, il faut noter que la description suivante est effectuée dans le cas illustratif où des anticorps sont immobilisés sur un support, mais il va sans dire que cela s'applique également dans le cas d'antigènes immobilisés sur un support.

[0045] Dans le cas du support portant des anticorps immobilisés, conformément à la présente invention, des anticorps sont immobilisés sur un support par leurs portions respectives qui sont sans rapport avec leur réaction antigène-anticorps, et au moins une partie d'une portion de la surface du support au niveau de laquelle les anticorps ne sont pas immobilisés est couverte d'une protéine.

[0046] Plus précisément, les inventeurs ont effectué des études et recherches approfondies pour résoudre le problème précité et, en résultat, sont parvenus à la conclusion que des anticorps doivent être immobilisés sur un support par leurs portions respectives qui sont sans rapport avec la réaction antigène-anticorps, en particulier, des anticorps doivent être immobilisés sur un support par des ligands et antiligands au niveau de ces portions. De cette manière, une portion de liaison (portion réactive) de chaque anticorps pour l'antigène est difficile à adsorber ou mettre en contact directement avec la surface du support, ce qui fait qu'il est considéré que la capacité de liaison à l'antigène (capacité de liaison) que présente l'anticorps peut être difficilement supprimée.

[0047] En conséquence, conformément à la présente invention, il est possible d'obtenir un support qui porte des anticorps immobilisés, qui présente une grande capacité de liaison vis-à-vis d'antigènes, en particulier d'antigènes spécifiques contre les anticorps portés par le support.

[0048] Dans ce cas, il faut noter que la forme du support de la présente invention n'est pas limitée à une forme spécifique, et qu'il est possible d'utiliser différentes formes telles qu'une forme sphérique ou une forme aplatie. Si le support est mis sous une forme sphérique, il est aisé d'immobiliser des anticorps sur un support avec une grande uniformité. En outre, si le support est mis sous une forme aplatie, il est aisé d'observer la réaction d'agglutination à l'œil nu puisque l'agglutination se produit aisément.

[0049] Lorsqu'un support ayant une forme sphérique est utilisé, il est préférable que le diamètre moyen soit compris dans l'intervalle de 1 à 100 pm, de préférence dans l'intervalle de 3 à 20 pm. Lorsque le diamètre moyen est compris dans cet. intervalle, il est possible d'obtenir une grande capacité de support d'anticorps, et il est également possible de confirmer aisément la réaction d'agglutination. Si le diamètre des particules du support est trop grand, l'agglutination se produit difficilement. D'autre part, si le diamètre des particules du support est trop petit, l'interaction entre les supports devient forte, avec ainsi pour résultat l'agglutination aisée de supports non spécifiques.

[0050] Dans la présente invention, le support est constitué d'un composé du type phosphate de calcium et, de préférence, au moins une partie de la surface du support est constituée d'un composé du type phosphate de calcium. Les présents inventeurs ont trouvé que ces composés du type phosphate de calcium peuvent adsorber de manière appropriée des antiligands. En outre, ces composés du type phosphate de calcium présentent une excellente capacité d'agglutination.

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[0051] Des exemples d'un tel support comprennent un support dont la totalité est constituée d'un composé du type phosphate de calcium, et un support qui est obtenu en couvrant ou revêtant un corps de support constitué d'une résine, d'une matière céramique ou d'une matière similaire avec un composé du type phosphate de calcium.

[0052] Parmi ces supports, un support qui est obtenu en couvrant ou revêtant un corps de support avec un composé du type phosphate de calcium, c'est-à-dire un support constitué d'un corps de support, et d'une couche de revêtement constituée d'un composé du type phosphate de calcium présente sur la surface extérieure du corps du support, peut être utilisé. Lorsqu'un tel support est utilisé, les trois avantages suivants sont obtenus.

[0053] (1) Il est aisé d'ajuster la densité de chaque support à une valeur optimale pour l'apparition d'une réaction d'agglutination des supports portant des anticorps immobilisés.

[0054] (2) Dans un tel support, le corps du support, avant l'application du revêtement constitué du composé du type phosphate de calcium, ou bien le support, après la production, peut être coloré avec une matière colorante telle qu'un pigment ou un colorant. L'utilisation d'un tel support coloré améliore la visualisation du support.

[0055] (3) De la manière décrite plus loin, il est préférable que le support utilisé dans la présente invention porte une couche de revêtement dense, ce qui signifie que la surface extérieure du support est sous forme d'une surface extrêmement lisse. Dans le cas d'un support obtenu en couvrant un corps de support avec un composé du type phosphate de calcium, il est relativement aisé d'obtenir une telle surface extérieure lisse.

[0056] Il est préférable que la masse volumique d'un tel support soit comprise dans l'intervalle de 0,7 à 2,0 g/cm3, de préférence dans l'intervalle de 0,9 à 1,2 g/cm3. Cela permet au support qui porte les anticorps immobilisés de provoquer une réaction d'agglutination dans l'eau (ou dans une solution aqueuse).

[0057] En outre, dans un tel support, une portion à proximité de la surface extérieure peut être dense ou poreuse, mais il est préférable que cette portion soit dense, c'est-à-dire que la surface soit sous forme d'une surface relativement lisse. De cette manière, dans le cas du support obtenu qui porte des anticorps immobilisés, il est possible d'immobiliser les anticorps respectifs à un état tel que leurs portions de liaison d'antigènes soient éloignées de la surface du support, d'une distance pratiquement constante. A ce propos, il est possible de réduire la restriction des positions tridimensionnelles des anticorps respectifs qui sont susceptibles d'être influencés par la forme de la surface extérieure du support. Par conséquent, les antigènes (objets à lier) dans l'échantillon à étudier seront liés de manière sûre aux anticorps.

[0058] A cet égard, il faut noter que, lorsqu'un support obtenu en couvrant un corps de support avec un composé du type phosphate de calcium est utilisé, la couche de revêtement du composé du type phosphate de calcium doit être transformée en une structure dense.

[0059] En ce qui concerne le composé du type phosphate de calcium qui peut être utilisé dans la présente invention, il est possible d'utiliser divers composés ayant un rapport Ca/P de 1,0 à 2,0. Des exemples de tels composés comprennent Ca10 (P04)6(0H)2, Ca10 (P04) 6F2, Ca10 (P04) 6C2, Ca3(P04)2, Ca2P207, Ca(P03)2, CaHP04, etc. Il est possible également d'utiliser des mélanges de deux ou plus de deux types de ces composés.

[0060] Parmi ces composés, un composé 1 du type phosphate de calcium contenant de l'hydroxyapatite (Ca10 (P04)6(0H)2) comme constituant principal est hautement préférable. L'hydroxy-apatite présente une aptitude particulièrement excellente à porter des antiligands et elle présente également une excellent capacité d'agglutination.

[0061] En outre, lorsque de la fluoro-apatite (Ca10 (P04) 6F2) est utilisée, il est préférable que la quantité de fluor dans la totalité des composés à base de phosphate de calcium soit inférieure à 5% en poids. De cette manière, l'élution du fluor du support peut, être évitée, ce qui permet d'éviter une diminution d'efficacité de la réaction antigène-anticorps.

[0062] On notera que ces composés du type phosphate de calcium peuvent être synthétisés par un procédé connu de synthèse par voie humide ou un procédé connu de synthèse par voie sèche.

[0063] En outre, dans ce cas, le composé du type phosphate de calcium peut contenir des substances (matières premières ou substances similaires) qui peuvent persister dans le procédé de synthèse ou les produits de réaction secondaires qui sont formés dans le procédé de synthèse.

[0064] De la manière décrite ci-dessus, des anticorps sont immobilisés sur un tel support par l'intermédiaire d'antiligands qui sont portés par le support et de ligands qui sont liés aux anticorps.

[0065] Un antiligand du type qui a pour propriété d'être adsorbé sur un composé du type phosphate de calcium est utilisé de préférence. A ce propos, il est préférable d'utiliser un antiligand du type qui peut être adsorbé à la surface du support. En utilisant un tel antiligand, il devient possible d'obtenir un support portant des antiligands par un procédé simple, tel que la mise en contact des antiligands avec le support (de la manière décrite plus loin).

[0066] En outre, il est préférable que Pantiligand puisse être lié spécifiquement à un ligand lié à l'anticorps. De ce point de vue, l'avidine (y compris ses dérivés) ou la streptavidine ou bien des substances similaires sont utilisées de préférence comme antiligand. Parmi ces substances, l'avidine est préférée comme antiligand.

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[0067] Les inventeurs ont trouvé que l'avidine peut être adsorbée particulièrement efficacement à la surface de composés à base de phosphate de calcium. En outre, l'avidine présente une capacité de liaison particulièrement forte vis-à-vis d'un ligand (en particulier la biotine) d'une manière spécifique.

[0068] D'autre part, il est préférable qu'un ligand puisse être lié de manière satisfaisante à un anticorps. En outre, il est également préférable qu'il présente une affinité pour l'antiligand. Un tel ligand peut être lie de manière fiable à l'antiligand. En conséquence, en mettant en contact l'anticorps auquel le ligand est lié avec le support qui porte l'antiligand, le ligand est lié à l'antiligand, ce qui fait que l'anticorps est immobilisé au support. En d'autres termes, lorsqu'un anticorps auquel un ligand est lié est amené à entrer en contact avec un support qui porte un antiligand, l'anticorps est immobilisé sur le support par l'intermédiaire du ligand et de l'antiligand.

[0069] De ce point de vue, la biotine, la protéine A ou la protéine G ou une substance similaire est utilisée de préférence comme ligand. Parmi ces substances, la biotine est préférée. Cela est dû au fait que la biotine peut être liée aisément à un anticorps (en particulier à une région constante d'un anticorps). En outre, la biotine présente une aptitude particulièrement forte de liaison à un antiligand (en particulier à l'avidine) d'une manière spécifique.

[0070] De plus, il est préférable que, lorsqu'un ligand est lié à un anticorps, le ligand soit lié à la région constante de l'anticorps. Lorsque le ligand est lié à la région constante de l'anticorps, là région constante de l'anticorps est située à une position relativement proche du support, tandis que les portions de liaison à l'antigène (portions réactionnelles) dê l'anticorps sont situées à des positions relativement éloignées du support. Cela signifie que les portions de liaison à l'antigène de l'anticorps sont situées à des positions qui font saillie vers l'extérieur de la surface du support. En conséquence, à proximité des portions de liaison à l'antigène dans l'anticorps, un espace qui est suffisant pour la réaction antigène-anticorps est établi. En outre, il est possible d'éviter que les portions de liaison à l'antigène de l'anticorps soient mises en contact avec la surface du support par adsorption par le support. Pour ces raisons, lorsque le ligand est lié à la région constante de l'anticorps, les antigènes dans l'échantillon à étudier sont mis en contact de manière appropriée avec l'anticorps.

[0071] On notera que la liaison du ligand à l'anticorps peut être effectuée au moyen d'un procédé de marquage connu. En outre, des marqueurs disponibles dans le commerce, par exemple «un anticorps anti-immunglobuline G humaine, marqué avec de la biotine (A-130BC)» produit par American Qualex Co., Ltd. peuvent être utilisés.

[0072] En particulier, dans la présente invention, en utilisant une association dans laquelle de l'avidine est utilisée comme antiligand qui doit être porté par un support et de la biotine est utilisée comme ligand qui doit être lié à l'anticorps, il est possible d'obtenir un effet particulièrement excellent. Cela est dû au fait que l'avidine possède un site de liaison dans lequel une molécule d'avidine peut être liée à quatre molécules de biotine. Pour cette raison, l'avidine peut être liée à une quantité de biotine égale à 4 fois la quantité d'avidine, ce qui fait que le support peut porter un nombre considérable d'anticorps par la liaison avidine-biotine.

[0073] A cet égard, il faut noter que, dans la présente invention, les termes antiligand et «ligand» désignent des substances qui peuvent être liées l'une â l'autre d'une manière spécifique en formant une paire. En conséquence, ces termes peuvent avoir une signification seulement lorsqu'ils sont utilisés sous forme d'une paire, et ils n'ont aucune signification lorsqu'ils sont utilisés séparément.

[0074] En outre, il faut également noter que, dans la présente invention, il est possible d'utiliser n'importe quel anticorps tel que des IgG, IgM, IgA, IgE, etc. Parmi ces anticorps, les IgG conviennent le mieux comme anticorps. Cela est dû au fait que des IgG peuvent être aisément produites. En outre, lorsqu'une IgG est utilisée, les types d'antigènes qui peuvent être détectés par le support qui porte des anticorps immobilisés conformément à la présente invention sont accrus.

[0075] En outre, dans le cas du support qui porte des anticorps immobilisés, une portion de la surface du support à laquelle les anticorps ne sont pas immobilisés, à savoir au moins une partie d'une portion de la surface du support qui est une région autre que la région portant des antiligands (de préférence la totalité d'une telle portion) est couverte d'une protéine (c'est-à-dire d'un agent de blocage) qui présente une faible interaction avec les antigènes ou anticorps.

[0076] A cet égard, l'expression «antigènes ou anticorps» désigne non seulement des antigènes ou anticorps qui doivent être immobilisés sur un support conformément à la présente invention mais également d'autres antigènes ou anticorps généraux. En outre, l'expression «faible interaction avec l'antigène ou anticorps» signifie que l'aptitude à adsorber des antigènes ou anticorps ou l'aptitude à lier des antigènes ou anticorps est absente ou bien que cette aptitude est extrêmement faible.

[0077] En formant un tel revêtement de protéine, il devient possible d'éviter efficacement que les anticorps soient adsorbés de manière non spécifique au support lorsque les anticorps sont immobilisés sur le support. A ce propos, il est possible d'éviter que les anticorps soient adsorbés au support directement sans utiliser les ligands ou anti-ligands. Par conséquent, le support qui porte les anticorps immobilisés peut présenter une aptitude accrue à la liaison d'antigènes.

[0078] En outre, lorsque la détection d'antigènes, qui présentent une caractéristique à être adsorbée à un composé du type phosphate de calcium, est effectuée en utilisant le support obtenu qui porte des anticorps immobilisés, il est possible d'éviter que les antigènes soient liés (adsorbés) de manière non spécifique au support.

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[0079] En ce qui concerne la protéine, on utilise de préférence n'importe quelle protéine ayant une caractéristique d'adsorption à un composé du type phosphate de calcium. A ce propos, il est préférable qu'une portion de la surface du support à laquelle les anticorps ne sont pas immobilisés soit couverte d'une protéine par adsorption de la protéine à la surface du support. Au moyen d'une telle protéine, il devient possible de couvrir la surface extérieure du support avec la protéine en utilisant un procédé simple, par exemple en mettant seulement en contact la protéine avec le support (de la manière décrite ci-après plus en détail).

[0080] Des exemples d'une telle protéine comprennent des protéines métalliques telles que la caséine, la transférine, les ferrédoxines, etc., l'albumine, la gélatine, la vitelline, la phosvitine, etc. Parmi ces protéines, la caséine, l'albumine et la gélatine sont utilisées de préférence. Ces protéines présentent une excellente capacité d'adsorption aux composés du type phosphate de calcium. En outre, parmi ces protéines, la caséine est hautement préférable puisque la caséine présente une excellente capacité d'absorption aux composés à base de phosphate de calcium et présente une interaction extrêmement faible avec les anticorps.

[0081] En outre, lorsqu'une protéine comprenant un ion métallique tel qu'une protéine métallique ou une protéine similaire est utilisée, il est préférable que la protéine ait été soumise â un traitement pour éliminer ou réduire l'ion métallique. Par ce traitement, le revêtement de protéine pour la surface du support peut être produit sous forme d'un revêtement pratiquement total.

[0082] En ce qui concerne le procédé pour éliminer l'Ion métallique, un procédé dans lequel une solution d'une telle protéine (solution d'agent de blocage) est traitée par un agent chélatant tel que l'éthylêné-diamine-tétra-acétate (EDTA) peut être mentionné. Dans ce cas, à titre d'exemple du traitement de la solution de protéine avec l'agent chélatant, le procédé suivant peut être mentionné. A ce propos, après addition d'un agent chélatant à une solution de protéine, l'agent chélatant est éliminé de la solution de protéine par filtration sur gel, Ultrafiltration, dialyse ou un procédé similaire.

[0083] En outre, dans le cas du support qui porte des anticorps immobilisés, il est préférable que les anticorps aient été soumis à un traitement de stabilisation. Par ce traitement, les anticorps immobilisés au support sont stabilisés, ce qui permet d'éviter l'élimination d'un anticorps du support.

[0084] En outre, si le support est soumis à un traitement de stabilisation après revêtement de la surface du support avec une protéine, un avantage consiste également en la difficulté d'élimination de la protéine de la surface du support. Dans ce cas, il est préférable qu'un tel traitement de stabilisation soit effectué en traitant le support avec un agent stabilisant. Cela permet d'obtenir aisément un support qui porte des anticorps immobilisés.

[0085] Dans le cas où des anticorps sont immobilisés à la surface d'un support par des ligands et antiligands, il est préférable d'utiliser, comme agent stabilisant, un agent de réticulation qui provoque le couplage des ligands ou des antiligands ou bien à la fois des ligands et des antiligands au support. De cette manière, une liaison covalente est formée entre le support et les ligands ou les anti-ligands ou bien à la fois les ligands et les antiligands, ce qui fait qu'il est possible de les lier ou immobiliser solidement. Par conséquent, il est possible d'éviter de manière plus fiable que les anticorps soient éliminés du support.

[0086] Il est possible d'utiliser comme agent de réticulation divers types d'agents de réticulation, mais il est particulièrement préférable d'utiliser un agent de réticulation bivalent. En utilisant un tel agent de réticulation bivalent, il est possible de stabiliser de manière fiable les anticorps.

[0087] Des exemples d'un tel agent de réticulation bivalent comprennent le glutaraldéhyde, la benzoquinone, l'acide m-maléimidobenzoïque, le N,N'-o-phénylènedimaléimide, etc. Il est possible d'utiliser un type ou une association de deux ou plus de deux types de ces composés.

[0088] En outre, comme pour l'agent stabilisant, il est possible d'utiliser des liants tels que le formaldéhyde, des agents de couplage du type silane et des agents similaires, le tétrachlorure d'osmium, et des composés similaires.

[0089] Le procédé pour la production d'un tel support qui porte des anticorps immobilisés, c'est-à-dire un procédé pour immobiliser des anticorps, est décrit ci-dessous.

[0090] Tout d'abord, avant la. production du support qui porte des anticorps immobilisés, un support répondant à la description précitée est préparé.

[0091] Un support dont la surface extérieure est constituée ou revêtue d'un composé du type phosphate de calcium peut être obtenu en soumettant un corps de support à une collision avec des particules poreuses d'un composé du type phosphate de calcium (appelées ci-aprês «particules de composé du type phosphate de calcium»). Par ce procédé, des particules d'un composé du type phosphate de calcium sont brisées et ensuite transformées en particules ayant des diamètres relativement plus petits lors de leur collision avec le corps du support, et ces particules de plue petit diamètre couvrent la surface du corps du support. Par conséquent, la portion à proximité de la surface extérieure peut être transformée aisément d'une manière fiable en une structure dense.

[0092] A ce propos, il est préférable d'utiliser des particules de composés du type phosphate de calcium qui sont produites en liant par agglutination des particules primaires de ces composés. Ces particules de composés du type phosphate de calcium sont aisément transformées en particules plus petites lors de leur collision avec le corps du support, ce qui fait

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qu'il devient possible de transformer la portion à proximité de la surface extérieure du support en une structure dense de manière plus aisée et fiable.

[0093] Dans ce cas, lorsque le diamètre moyen des particules du composé du type phosphate de calcium utilisées pour la collision est réglé dans l'intervalle de 0,1 à 50 pm, l'effet décrit ci-dessus est plus net. A cet égard, il faut noter que, si le diamètre moyen des particules du composé du type phosphate de calcium est trop grand, l'écrasement approprié ne se produira pas lorsque les particules entreront en collision avec le corps du support.

[0094] Les particules du composé du type phosphate de calcium peuvent être des particules de corps non frittes ou de corps frittes (c'est-à-dire de matières céramiques), mais il est préférable d'utiliser des corps non frittes ou des corps frittes qui ont été frittes â une température relativement basse (200 à 900°C).

[0095] On notera que le procédé pour la production des particules de composés du type phosphate de calcium n'est pas limité au procédé décrit ci-dessus, et qu'il est également possible de produire des particules de composés du type phosphate de calcium par le procédé connu suivant. A ce propos, des particules cristallines (particules primaires) d'un composé du type phosphate de calcium qui a été synthétisé par un procédé de mouillage connu sont utilisées comme matière première pour les particules d'un composé du type phosphate de calcium. Une suspension dans laquelle les particules de matière première sont mises en suspension est granulée en particules secondaires par un procédé de séchage par pulvérisation directe ou un procédé similaire. En variante, la suspension peut être transformée en particules d'ajustement de viscosité et de particules ou fibres d'un composé organique qui seront dissipés par chauffage de la suspension. Puisque les particules secondaires sont transformées en particules poreuses, il est possible d'utiliser ces particules secondaires telles quelles pour produire un support.

[0096] En outre, dans le cas ou des particules d'un composé du type phosphate de calcium ayant une plus forte porosité sont préférées, ces particules peuvent être produites par le procédé suivant. Tout d'abord, les particules secondaires décrites ci-dessus sont mises en suspension dans une solution pour former de nouveau une suspension, et la suspension est transformée en un bloc par un procédé de moulage par voie humide ou moulage, par voie sèche sous pression. Dans cette étape, un composé organique qui sera dissipé au cours de l'étape ultérieure de frittage peut être ajouté pour la formation de pores. En variante, le diamètre des pores peut être régulé en ajustant d'autres conditions telles que la température de frittage ou une condition similaire sans ajouter un tel composé organique. Puis, le bloc ainsi obtenu est fritté à une température comprise dans l'intervalle de 400 à 1300°C. A cet égard, si la température de frittage est inférieure à 400°C, il est possible que la dissipation du composé organique et le frittage du bloc soient insuffisants. D'autre part, si la température de frittage est supérieure à 1300°C, le corps fritté devient trop dense ou bien il se produit une décomposition du composé du type phosphate de calcium. Puis, le bloc fritté ainsi obtenu est broyé et ensuite calibré pour obtenir des particules ayant un diamètre désiré. A cet égard, il faut noter que le diamètre des pores des particules du composé du type phosphate de calcium peut être ajusté en modifiant de manière appropriée le diamètre des particules primaires, la viscosité de la suspension, le type d'additif, etc.

[0097] (1) Des antiligands sont ensuite portés sur la surface de chacun des supports. Cela peut être réalisé en traitant les supports avec une solution d'antiligands. A cette fin, les supports peuvent être introduits dans la solution d'antiligands pour leur mélange.

[0098] Dans ce cas, il est préférable que la concentration de la solution d'antiligands soit comprise dans l'intervalle de 0,001 à 100 mg/ml, de préférence dans l'intervalle de 0,01 à 10 mg/ml. En outre, il est également préférable que la quantité des antiligands dans la solution d'antiligands par quantité de 1 g de support soit comprise dans l'intervalle de 0,01 à 100 mg. En outre, il est également préférable que le volume de la solution d'antiligands pour 1 g de support soit compris dans l'intervalle de 1 à 100 mg. De plus, il est également préférable que le pH de la solution d'antiligands soit compris dans la plage de 5,5 à 9, En choisissant ces facteurs, il devient possible d'obtenir de manière appropriée des antiligands portés par les supports respectifs.

[0099] (2) Puis, la surface extérieure de chaque support est revêtue ou couverte d'une protéine (ce qui signifie qu'un traitement de blocage est effectué). Cela peut être réalisé en traitant les supports avec la solution de protéine (c'est-à-dire la solution d'agent de blocage). A cette fin, les supports peuvent être introduits dans la solution de protéine pour leur mélange.

[0100] Dans ce cas, il est préférable que la concentration de la solution de protéine soit comprise dans l'intervalle de 0,1 à 100 mg/ml, de préférence dans l'intervalle de 1 à 50 mg/ml. En outre, il est également préférable que la quantité de protéine dans la solution de protéine pour 1 g de support soit comprise dans l'intervalle de 1 à 100 mg. De plus, il est également préférable que le volume de la solution de protéine pour 1 g de support soit compris dans l'intervalle de 1 à 100 ml. En outre, il est également préférable que le pH de la solution de la protéine soit compris dans la plage de 5,5 à 9. En choisissant ces facteurs, il devient possible de couvrir de manière appropriée les supports avec la protéine.

[0101] (3) Puis, les anticorps auxquels les ligands sont liés sont immobilisés à la surface des supports. Cela peut être réalisé en mélangeant les supports qui portent les anti-ligands avec une solution d'anticorps contenant les anticorps auxquels les ligands sont liés.

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[0102] Dans ce cas il est préférable que la concentration de la solution d'anticorps soit comprise dans l'intervalle de

0.001 à 10 mg/ml, de préférence dans l'intervalle de 0,01 à1 mg/ml. En outre, il est également préférable que la quantité d'anticorps dans la solution d'anticorps soit comprise dans l'intervalle de 0,01 à 100 mg pour 1 g de support. De plus, il est également préférable que le volume de la solution d'anticorps pour 1 g de support soit compris dans l'intervalle de 1 à 100 ml. En outre, il est également préférable que le pH de la solution d'anticorps soit compris dans la plage de 5,5 à 9. En choisissant ces facteurs, il devient possible d'immobiliser de manière appropriée les anticorps sur les supports.

[0103] (4) Puis, les supports sur lesquels les anticorps sont immobilisés sont stabilisés. Cela peut être effectué en traitant les supports sur lesquels l'es anticorps sont immobilisés avec un agent stabilisait. A cette fin, les supports sur lesquels les anticorps sont immobilisés peuvent être mélangés à un agent stabilisant (agent d'immobilisation).

[0104] Dans ce cas, il est préférable que la concentration d'agent stabilisant dans la solution d'agent stabilisant soit comprise dans l'intervalle dei 0,1 à 1 mg/ml, de préférence dans l'intervalle de 0,05 à 0,1 mg/ml. En outre, il est également préférable que la quantité d'agent stabilisant dans la solution d'agent stabilisant soit comprise dans l'intervalle de 0,1 à 10 mg pour 1 g de support. En outre, il est également préférable que le volume de la solution d'agent stabilisant pour 1 g de support soit compris dans l'intervalle de 1 à 100 ml. De plus, il est également préférable que le pH de la solution d'anticorps soit compris dans la plage de 5,5 à 9. En choisissant ces facteurs, il devient possible de stabiliser de manière appropriée les anticorps qui ont été immobilisés à la surface des supports, de telle sorte que la détérioration au cours du temps du support obtenu portant les anticorps immobilisés soit difficile.

[0105] Les anticorps sont immobilisés à la surface des supports par les procédés précités, ce qui signifie qu'il est possible d'obtenir des supports qui portent les anticorps immobilisés.

[0106] Dans la présente invention, une opération qui est identique au procédé (4) décrit ci-dessus peut être effectuée avant ou après le procédé (2) ci-dessus. En outre, une autre opération qui est identique au procédé (2) décrit ci-dessus peut être effectuée avant ou après le procédé (4) ci-dessus. De plus, les procédés (2) et (4) peuvent être omis.

[0107] En outre, il est préférable que ces procédés (1) à (4) soient mis en œuvre à température ambiante (par exemple à une température comprise dans l'intervalle de 0 à 40°C), par exemple.

[0108] Bien que la description précédente ait été effectuée d'après le cas illustratif d'utilisation d'anticorps, la présente invention peut être appliquée au cas où des antigènes sont utilisés.

[0109] Lorsque la présente invention est appliquée à des supports qui portent des antigènes immobilisés, des exemples d'antigènes qui doivent être immobilisés à la surface des supports comprennent des virus responsables d'infections, telles que la grippe, l'encéphalite japonaise, la dingue, la rougeole, la rubéole, les oreillons, etc., et des bactéries, ainsi que des organismes similaires.

[0110] Précédemment, les supports qui portent des antigènes ou anticorps immobilisés, conformément à la présente invention, et leur procédé de production ont été décrits, mais la présente invention n'est pas limitée a ceux-ci.

[0111] Par exemple, dans le procédé pour la production des supports qui portent des antigènes ou anticorps immobilisés, conformément à la présente invention, un ou plusieurs procédés supplémentaires peuvent être ajoutés de la manière requise à différentes fins.

Exemples

[0112] La présente invention est décrite maintenant en détail au moyen d'exemples réels. Cependant, la présente invention n'est pas limitée à ces exemples.

(Exemple)

[0113] Un support qui porte des anticorps immobilisés a été obtenu de la manière suivante.

1. Production du support

[0114] Avant l'immobilisation d'anticorps à la surface d'un support, le support a été préparé de la manière suivante. Tout d'abord, 50 g de billes, de Nylon (ayant un diamètre moyen de particules de 5 |jm et une masse volumique de 1,02 g/cm3) et 10 g de particules d'hydroxyapatite (ayant un rapport Ca/P de 1,57, un diamètre moyen de particules de 5 pm, une surface spécifique de 45 m2/g et un diamètre moyen des pores de 600 Â) ont été préparés.

[0115] Puis ces billes de Nylon et ces particules d'hydroxy-apatite ont été introduites dans un système d'hybridation NARA (produit et commercialisé par Nara Machinery Co., Ltd, avec le code de produit NHS-1, ayant une puissance nominale de 5,5 kW et une intensité nominale de 23 A) et la machine a été soumise à un fonctionnement à 8000 tr/min à des températures comprises dans l'intervalle de 32 à 50°C pendant 5 minutes. Ainsi, des billes de Nylon (particules complexes) ayant chacune une, surface revêtue d'hydroxyapatite ont été obtenues.

[0116] Puis ces billes de Nylon et ces particules d'hydroxy-apatite ont été introduites dans un système d'hybridation NARA (produit et commercialisé par Nara Machinery Co., Ltd, avec le code de produit NHS-1, ayant une puissance nominale de 5,5 kW et une intensité nominale de 23 A) et la machine a été soumise à un fonctionnement à 8000 tr/min à des

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températures comprises dans l'intervalle de 32 à 50°C pendant 5 minutes. Ainsi, des billes de Nylon (particules complexes) ayant chacune une surface revêtue d'hydroxyapatite ont été obtenues.

[0117] A cet égard, il faut noter que la particule complexe obtenue a un diamètre moyen de 5,8 pm et une masse volumique de 1,13 g/cm3. En outre, l'épaisseur moyenne de la couche de revêtement constituée d'hydroxyapatite de ces particules complexes était égale à 0,45 pm.

2. Production d'un support qui porte des anticorps immobilisée

[0118] Dans l'opération décrite ci-dessous, la température ambiante était égale à 20°C.

[0119] Avant la description de l'immobilisation d'anticorps à la surface du support, une explication est fournie en ce qui concerne la caséine dissoute dans une solution de caséine qui est utilisée dans le procédé (2) suivant, A ce propos, la caséine dissoute dans la solution de caséine destinée a être utilisée dans le procédé (2) suivant a été soumise préalablement à un traitement pour éliminer l'ion calcium présent dans la caséine. Le traitement pour éliminer l'ion calcium a été effectué de la manière suivante.

[0120] (1) Tout d'abord, 2,5 ml d'une solution à 40 mg/ml de caséine ont été préparés et un volume de 0,5 ml de solution d'EDTA 500 mM a été ajouté a la solution de caséine. Ainsi, on a obtenu 25 ml d'une solution mixte de caséine/EDTA dans laquelle la concentration de caséine était égale à 4 mg/ml et la concentration d'EDTA était égale à 10 mM. A cet égard, il faut noter que la solution de caseine préparée a été obtenue en ajustant la concentration de «Block Ace» (marque commerciale) produit et commercialisé par Snow Bland Milk Products Co., Ltd.

[0121] (2) Puis, afin d'éliminer l'EDTA de la solution mixte, la solution mixte a été soumise à une chromâtographie de filtration sur gel. En outre, le tampon de la solution de caséine a été soumis à un échange, en plus de l'élimination de l'EDTA décrite ci-dessus. (A ce moment, avant et après la chromâtographie de filtration sur gel, la concentration d'ion calcium dans la solution mixte et la concentration d'ion calcium dans la solution de caséine résultante ont été mesurées, respectivement. En résultat, la concentration d'ion calcium dans la solution de caséine a diminué à une valeur égale ou inférieure à 1/6. D'après ce résultat, il a été confirmé que la plus grande partie de l'ion calcium présent dans la caséine avait été éliminée. A cet égard, il faut noter que la concentration d'ion calcium a été obtenue en mesurant l'absorbance de la solution à 423 nm).

[0122] (3) Finalement, la solution de caséine obtenue a été concentrée de telle sorte que la concentration en caséine de cette solution soit approximativement égale à 4 mg/ml.

[0123] (1) 1 ml d'une solution à 0,1 mg/ml d'avidine (produite et commercialisée par Pierce Chemical Company) a été ajouté â 10 mg des particules complexes obtenues de la manière décrite ci-dessus.

[0124] Puis, ce mélange a été mélangé à température ambiante pendant 60 minutes et centrifugé à 1000 tr/min pendant 5 minutes pour éliminer l'excès d'avidine. Puis les particules complexes ainsi obtenues ont été rincées.

[0125] (2) Puis, 1 ml d'une solution à 4 mg/ml de caséine ajustée de la manière décrite ci-dessus a été ajouté aux particules complexes obtenues en (1). Les particules complexes et la caséine ont été ensuite amenées à réagir mutuellement à une température de 37°C pendant 60 minutes, puis ont été centrifugées à 1000 tr/min pendant 5 minutes pour éliminer l'excès de caséine. Puis les particules complexes ainsi obtenues ont été rincées.

[0126] (3) Ensuite, 1 ml d'une solution à 0,01 mg/ml d'anticorps anti-immunglobuline G humaine (sérum de chèvre) marqué (conjugué) avec de la biotine a été ajouté aux particules complexes obtenues en (2). A cet égard, il faut noter que l'anticorps anti-immunglobuline G humaine marqué avec de la biotine (produit et commercialisé par American Qualex Co. Ltd.) a été produit en liant de la biotine à la région constante de l'IgG.

[0127] Puis ce mélange a été mélangé à température ambiante pendant 60 minutes et centrifugé à 1000 tr/min pendant 5 minutes pour éliminer l'excès d'anticorps. Puis les particules complexes ainsi obtenues ont été rincées.

[0128] (4) Puis, 1 ml d'une solution à 1 mg/ml de glutaraldéhyde (produit et commercialisé par Wako Pure Chemical Industries, Ltd) a été ensuite ajouté aux particules complexes obtenues en (3).

[0129] Puis les particules complexes et le glutaraldéhyde (agent de réticulation bivalent) ont été amenés à réagir mutuellement à une température de 37°C pendant 30 minutes et ont été centrifugés à 1000 tr/min pendant 5 minutes pour éliminer l'excès de glutaraldéhyde. Les particules complexes ainsi obtenues ont été ensuite rincées.

[0130] (5) Puis, 1 ml d'une solution à 4 mg/ml de caséine a été ajouté aux particules complexes obtenues en (4). Puis, ce mélange a été abandonné à une température de 37°C pendant 60 minutes et a été centrifugé à 1000 tr/min pendant 5 minutes pour éliminer le surnageant.

[0131] Par conséquent, on a obtenu des supports portant chacun des anticorps immobilisés, dans lesquels des anticorps anti-lgG humaine (IgG) ont été immobilisés à la surface de chaque bille de Nylon revêtue d'hydroxyapatite par l'intermédiaire de l'avidine et de la biotine.

[0132] A cet égard, il faut noter qu'une solution de sel tampon au phosphate (pH 6,8) a été utilisée pour soumettre à un ajustement la solution d'avidine, la solution d'anticorps anti-immunglobuline G humaine marqué avec de la biotine et la

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solution de glutaraldéhyde, et pour rincer les particules complexes dans chaque traitement décrit dans les étapes (1) à (5) ci-dessus.

(Exemple comparatif 1)

[0133] Un support portant des anticorps immobilisés, dans lequel les anticorps étaient immobilisés directement à la surface du support sans utiliser d'avidine et de biotine, a été produit. Ce support qui portait des anticorps immobilisés a été produit de la manière suivante.

[0134] Tout d'abord, 10 mg de billes de Nylon ayant chacune une surface revêtue d'hydroxyapatite ont été préparés. Les billes préparées étaient identiques à celles décrites ci-dessus.

[0135] Puis, 1 ml d'une solution à 0,01 mg/ml d'anticorps anti-immunglobuline G humaine (sérum de chèvre) a été ajouté à ces particules complexes, A cet égard, il faut noter que l'anticorps anti-immunglobuline G humaine (produit et commercialisé par Cappel, Inc.) n'était pas conjugué à la biotine.

[0136] Puis, ce mélange a été mélangé à température ambiante pendant SO minutes et centrifugé à; 1000 tr/min pendant 5 minutes pour éliminer l'excès d'anticorps. Les particules complexes ainsi obtenues ont été ensuite rincées.

[0137] Puis, 1 ml d'une solution à 4 mg/ml de caséine a été ajouté aux particules complexes obtenues. La solution de caséine utilisée a été identique à celle décrite ci-dessus.

[0138] Puis, les particules complexes et la caséine ont été amenées à réagir mutuellement à une température de 37°C pendant 60 minutés et ont été centrifugées à 1000 tr/min pendant 5 minutes pour éliminer l'excès de caséine. Les particules complexes ainsi obtenues ont été ensuite rincées.

[0139] Après ces opérations, les opérations identiques â celles décrites en (4) et (5) ci-dessus ont été traitées et effectuées sur les particules complexes, dans cet ordre.

[0140] Ainsi, on a obtenu des supports portant chacun des anti-corps immobilisés, dans lesquels les anticorps anti-im-munglobuline G humaine (igG) étaient immobilisés à la surface de chaque bille de Nylon revêtue d'hydroxyapatite sans utiliser d'avidine et de biotine.

(Exemple comparatif 2)

[0141] Un support portant des anticorps immobilisés, dans lequel la protéine A était portée par la surface du support et les anticorps étaient immobilisés au support par l'intermédiaire de la protéine A, a été produit. Ce support portant des anticorps immobilisés à été produit de la manière suivante.

[0142] Tout d'abord, 10 mg de billes de Nylon ayant chacune une surface revêtue d'hydroxyapatite ont été préparés. Les billes préparées étaient identiques à celles décrites ci-dessus.

[0143] Une opération identique à celle décrite en (1) ci-dessus a été effectuée sur les billes préparées en utilisant 1 ml d'une solution à 0,1 mg/ml de protéine A (produit et commercialisé par Cappel, Inc.) au lieu d'utiliser une solution d'avidine. Après cette opération, une opération identique à celle décrite en (2) ci-dessus a été également effectuée sur les billes portant la protéine A.

[0144] Puis, 1 ml d'une solution à 0,01 mg/ml d'anticorps anti-immunglobuline G humaine (sérum de chèvre) a été ajouté aux particules complexes obtenues. A cet égard, il faut noter que l'anticorps anti-immunglobuline G humaine (produit et commercialisé par Cappel, Inc.) n'était pas conjugué â la biotine.

[0145] Puis, ce mélange a été mélangé à température ambiante pendant 60 minutes et centrifugé à 1000 tr/min pendant 5 minutes pour éliminer l'excès d'anticorps. Puis les particules complexes ont été rincées.

[0146] Après ces opérâtions, les opérations identiques à celles décrites en (4) et (5) ci-dessus ont été effectuées sur les particules complexes dans cet ordre.

[0147] Par conséquent, on a obtenu des supports portant chacun des anticorps immobilisés, dans lesquels les anticorps anti-lgG humaine (IgG) étaient immobilisés à la surface de chaque bille de Nylon revêtue d'hydroxyapatite par l'inermédiaire de la protéine A.

[0148] A cet égard, il faut noter qu'une solution de sel tampon au phosphate (pH 6,8) a été utilisée pour soumettre à un ajustement la solution de protéine A.

(Témoin)

[0149] Tout d'abord, 10 mg de billes die Nylon ayant chacune une surface revêtue d'hydroxyapatite ont été préparés. Les billes préparées étaient identiques à celles décrites ci-dessus.

[0150] Puis, des opérations identiques à celles décrites en (2), (4) et (5) ci-dessus ont été effectuées sur les billes préparées, dans cet ordre.

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[0151] Ainsi, on a obtenu un support qui a été produit seulement en couvrant la surface de la bille de Nylon revêtue d'hydroxyapatite avec de, la caséine et en stabilisant ensuite la caséine avec du glutaraldéhyde.

(Evaluation)

[0152] En ce qui concerne chaque support portant des anticorps immobilisés, obtenu dans l'exemple et les exemples comparatifs, et le support obtenu à titre de témoin, l'aptitude à la liaison à des antigènes a été mesurée, respectivement.

[0153] Tout d'abord, 1 ml de sérum humain normal (produit et commercialisé par Rockland, Inc.) dilué au 10 millième a été ajouté à 1 mg de chaque support portant des anticorps immobilisés obtenu dans l'exemple et les exemples comparatifs et du support obtenu à titre de témoin, respectivement.

[0154] Puis, chaque solution ainsi obtenue a été mélangée à température ambiante pendant 30 minutes et centrifugé à 1000 tr/min pendant 5 minutes pour éliminer l'excès de sérum. Puis, chaque support portant des anticorps immobilisés et le support ont été rincés.

[0155] Ensuite, 1 ml d'une solution à 0,0005 mg/ml d'anticorps anti-immunglobuline G humaine (sérum de chèvre) marqué avec de la HRP (Peroxydase de raifort) a été ajouté à chaque support portant les anticorps immobilisés et au support, respectivement. A cet égard, il faut noter que, dans l'anticorps anti-immunglobuline G humaine marqué avec de la HRP (produit et commercialisé par Cappel. Inc.). la HRP était liée à l'IaG.

[0156] Puis, chaque support portant des anticorps immobilisés et le support ainsi que l'anticorps anti-immunglobuline G humaine marqué avec de la HRP ont été amenés a réagir mutuellement à température ambiante pendant 30 minutes et ont été centrifugés à 1000 tr/min pendant 5 minutes pour éliminer l'excès d'anticorps. Puis, chaque support portant des anticorps immobilisés et le support ont été rincés.

[0157] Puis, un volume de 0,5 ml d'une solution de 0,3 ml/ml de 3,3', 5,5'-tétraméthylbenzidine (produite et commercialisée par Moss Inc.) a été ensuite ajouté â chaque support portant des anticorps immobilisés et au support, respectivement, pour produire une réaction colorée à température ambiante pendant 30 minutes.

[0158] Puis, chaque solution obtenue a été centrifugée à 1000 tr/min pendant 5 minutes pour corriger le volume de 100 pm de surnageant de cette solution. 20 pi de HCl 1N ont été ajoutés à chaque surnageant obtenu, respectivement, pour interrompre la réaction colorée, puis l'absorbance de chaque échantillon a été mesurée à 456 nm, respectivement.

[0159] A cet égard, il faut noter qu'une solution de sel tampon au phosphate (pH 6,8) a été utilisée pour soumettre à un ajustement le sérum humain normal, la solution d'anticorps anti-immunglobuline G humaine marqué avec de la HRP et la solution de 3,3', 5,5'-tétraméthylbenzidine, et pour rincer les particules complexes dans chaque traitement décrit ci-dessus.

[0160] Les résultats des mesures décrites ci-dessus sont présentés sur le tableau 1 suivant et la fig. 1 est un graphique qui représente les résultats.

[0161]

Témoin

Protéine A anti-lgG Hu ex.

anti-lgG Hu

Avidinebiotine anti-lgG Hu

comp. 2

Ex. comp. 1

Exemple

Absorbance

0,132

0,208

0,389

2,493

(D.O. 450)

[0162] Comme le montre le tableau 1 et la fig. 1, dans le cas de chaque support portant des anticorps immobilisés obtenu dans les exemples comparatifs respectifs, seuls quelques anticorps igG présents dans le sérum humain normal (antigène) étaient liés à ce support. D'autre part, dans le cas du support portant des anticorps immobilisés obtenu dans l'exemple, une grande quantité d'anticorps IgG immobilisés présents dans le sérum humain normal était liés à ce support. Il est supposé que cela est dû aux raisons suivantes. A ce propos, dans le cas du support portant des anticorps immobilisés obtenu dans l'exemple, les portions de liaison à l'antigène (portions réactives) de chaque anticorps immobilisé à la surface du support font saillie vers l'extérieur à partir de la surface du support, ce qui fait que la grande capacité de liaison de l'anticorps pour les antigènes est maintenue.

[0163] Pour cette raison, il est confirmé que le support portant des anticorps immobilisés, obtenu dans l'exemple, présente une capacité de liaison aux antigènes extrêmement forte.

[0164] En outre, les supports portant chacun des anticorps immobilisés ont été produits de la même manière que dans l'exemple décrit ci-dessus, sauf que de l'albumine et de la gélatine ont été utilisées, respectivement, au lieu de la caséine comme protéine pour le revêtement de la portion d'un support où les anticorps n'étaient pas immobilisés. En outre, des supports portant chacun des anticorps immobilisés ont été également produits de la même manière que dans l'exemple décrit ci-dessus, sauf que de la p-benzoquinone, de l'acide m-maléimidobenzoïque et du N,N'-o-phénylènedimaléimide ont été utilisés, respectivement, au lieu du glutaraldéhyde comme agent de réticulation bivalent (agent stabilisant) pour stabiliser les anticorps.

[0165] Puis, en ce qui concerne ces supports produits portant chacun des anticorps immobilisés, leur capacité de liaison aux antigènes a été mesurée de la manière décrite ci-dessus. En résultat, il a été confirmé que tous les supports portant

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chacun des anticorps immobilisés présentaient une capacité de liaison extrêmement forte aux antigènes, comme cela était le cas dans l'exemple.

Effets de l'invention

[0166] De la manière décrite ci-dessus, conformément à la présente invention, il est possible d'immobiliser des antigènes ou anticorps à la surface d'un support tout en maintenant une grande capacité de liaison aux antigènes ou anticorps (qui sont les objets à lier) présents dans un échantillon à étudier.

[0167] En conséquence, conformément a la présente invention, il est possible d'obtenir un support portant des antigènes ou anticorps immobilisés qui présenté une grande capacité de liaison aux antigènes ou anticorps présents dans un échantillon à étudier. En outre, en utilisant un tel support portant des antigènes ou, anticorps immobilisés, il devient possible de détecter des antigènes ou anticorps présents dans un échantillon à étudier avec une grande sensibilité, ce qui fait que le support portant, des antigènes ou anticorps immobilisés est extrêmement utilisé dans le diagnostic de divers types de maladies telles que des infections et maladies similaires en utilisant la réaction antigène-anticorps.

[0168] Enfin, il doit être entendu que de nombreuses modifications et additions peuvent être apportées aux formes de réalisation décrites ci-dessus sans s'écarter du cadre et de l'esprit de la présente invention.

[0169] En outre, il doit être également entendu que la description de la présente invention est en rapport avec le sujet présent dans la demande de brevet japonais N° üuuu-abü /62 (déposée le Novembre üuuuj et la demande de brevet japonais N° 2001-349 447 (déposée le 14 Novembre 2001), qui sont expressément cités dans leur intégralité â titre de référence dans le présent mémoire.

Claims (30)

Revendications

1. Support portant des antigènes ou anticorps immobilisés, caractérisé en ce qu'il comprend: un support ayant une surface qui est formée d'un composé à base de phosphate de calcium, et des antigènes ou anticorps comprenant chacun une portion gui est sans rapport avec la réaction antigène-anticorps, chacun de ces antigènes ou anticorps étant immobilisé à la surface du support par sa partie sans rapport, la surface du support comprenant une portion où les antigènes ou anticorps ne sont pas immobilisés, et au moins une partie de la portion de la surface étant revêtue avec une protéine présentant une faible interaction avec les antigènes ou anticorps.

2. Support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le support porte des antiligands et chaque antigène ou anticorps comprend un ligand lié à celui-ci, chaque antigène ou anticorps étant immobilisé au support par le ligand et l'antiligand.

3. Support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 2, caractérisé en ce que chaque antiligand est porté par la surface du support par adsorption.

4. Support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 2, caractérisé en ce que chaque anticorps comprend une région constante et le ligand est lié à la région constante de l'anticorps.

5. Support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le revêtement constitué de la protéine est formé par adsorption du support au niveau de la partie de la portion de la surface.

6. Support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la protéine est la caséine.

7. Support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les antigènes ou anticorps sont stabilisés.

8. Support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 7, caractérisé en ce que les antigènes ou anticorps sont stabilisés par traitement du support avec un agent stabilisant.

9. Support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 7, caractérisé en ce que les antigènes ou anticorps sont stabilisés en traitant le support avec un agent de réticulation qui provoque la réticulation des antigènes ou anticorps et des ligands et/ou antiligands,

10. Support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 9, caractérisé en ce que l'agent de réticulation est un agent de réticulation bivalent.

11. Support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'une portion du support qui est à proximité de la surface de ce support est transformée en une structure dense.

12. Support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le support comprend un corps de support comprenant une surface, et un revêtement constitué d'un composé à base de phosphate de calcium qui est présent sur la surface du corps du support.

13. Support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 12, caractérisé en ce que le support est produit par collision de particules poreuses du composé à base de phosphate de calcium à la surface du corps du support.

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CH 695 632 A5

14. Support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 13, caractérisé en ce que les particules poreuses sont produites en liant par agglutination des particules primaires du composé à base de phosphate de calcium.

15. Support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les anticorps consistent en IgG.

16. Procédé pour la production d'un support portant des antigènes ou anticorps immobilisés, procédé gui comprend les étapes suivantes: une étape d'immobilisation pour immobiliser des antigènes ou anticorps à une surface d'un support qui est formée d'un composé à base de phosphate de calcium par l'intermédiaire de portions des antigènes ou anticorps qui sont sans rapport avec la réaction antigène-anticorps, et une étape de revêtement pour revêtir au moins une partie d'une portion de la surface du support, où les antigènes ou anticorps ne sont pas immobilisés, avec une protéine présentant une faible interaction avec les antigènes ou anticorps.

17. Procédé pour la production d'un support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 16, caractérisé en ce que l'étape d'immobilisation comprend: une étape amenant des antiligands à être portés par la surface d'un support, et une étape de mise en contact d'antigènes ou d'anticorps auxquels sont liés des ligands présentant une affinité pour les antiligands, avec le support.

18. Procédé pour la production d'un support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 17, caractérisé en ce que les antiligands sont portés par le support en étant adsorbés par la surface du support.

19. Procédé pour la production d'un support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 17, caractérisé en ce que les antiligands sont liés à des régions constantes des anticorps.

20. Procédé pour la production d'un support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 16, caractérisé en ce que l'étape de revêtement est mise en oeuvre en amenant la protéine à être adsorbée à la partie de la portion de la surface du support.

21. Procédé pour la production d'un support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 16, caractérisé en ce que la protéine est la caséine.

22. Procédé pour la production d'un support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 16, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, après l'étape d'immobilisation, une étape de stabilisation des antigènes ou anticorps.

23. Procédé pour la production d'un support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 22, caractérisé en ce que l'étape de stabilisation est mise en œuvre en traitant le support avec un agent stabilisant.

24. Procédé pour la production d'un support portant des antigènes où anticorps immobilisés suivant la revendication 22, caractérisé en ce que l'étape de stabilisation est mise en œuvre en traitant le support avec un agent de réticulation pour lier les antigènes ou anticorps aux ligands et/ou antiligands.

25. Procédé pour la production d'un support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant, la revendication 24, caractérisé en ce que l'agent de réticulation est un agent de réticulation bivalent.

26. Procédé pour la production d'un support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 16, caractérisé en ce qu'une portion du support qui est à proximité de sa surface est transformée en une structure dense.

27. Procédé pour la production d'un support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 16, caractérisé en ce que le support comprend un corps de support ayant une surface, et un revêtement constitué d'un composé à base de phosphate de calcium qui est présent sur la surface du corps du support.

28. Procédé pour la production d'un support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 27, caractérisé en ce que le support est produit par collision de particules poreuses du composé à base de phosphate de calcium avec le corps du support.

29. Procédé pour la production d'un support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 28, caractérisé en ce que les particules poreuses sont produites en liant par agglutination des particules primaires du composé à base de phosphate de calcium.

30. Procédé pour la production d'un support portant des antigènes ou anticorps immobilisés suivant la revendication 16, caractérisé en ce que les anticorps sont des IgG.

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