DE69408527T2 - Makromolekulare mikropartikel und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents
Makromolekulare mikropartikel und verfahren zu ihrer herstellungInfo
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Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren auf dem Gebiet der Biochemie und insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln zur Anwendung bei der Diagnose, Therapie sowie in der Forschung.
- Mikropartikel, Mikrokugeln und Mikrokapseln, die hier gemeinsam als Mikropartikel bezeichnet werden, sind feste Partikel mit einem Durchmesser von weniger als einem Millimeter und insbesondere weniger als 100 µm, die aus einer Vielzahl verschiedener Materialien, einschließlich synthetischer Polyrnere, Proteine und Polysaccharide hergestellt werden können. Mikropartikel sind für viele verschiedene Anwendungen, insbesondere Abscheidungen, diagnostische Zwecke und zur Medikamentenzuführung eingesetzt worden.
- Die bekanntesten Beispiele für Mikropartikel, die bei Abscheidungsverfahren verwendet werden, sind diejenigen, die aus Polymeren mit synthetischem Ursprung oder solchen auf der Basis von Proteinen hergestellt werden, wie Polyacrylamide, Hydroxyapatite oder Agarose, die zum Abscheiden von Molekülen wie z.B. Proteinen auf der Basis des Molekulargewichtes und/oder lonenveränderungen oder durch das Zusammenwirken mit Molekülen, die chemisch mit den Mikropartikel verbunden sind, verwendet werden.
- Auf dem Gebiet der Diagnose werden Mikropartikel sehr häufig in Form eines Mikropartikels verwendet, das zum Immobilisieren eines Enzyms, eines Substrates für das Enzym oder eines markierten Antikörpers dient, das/der dann entweder direkt oder indirekt mit einem nachzuweisenden Molekül zusammenwirkt.
- Auf dem Gebiet der kontrollierten Zuführung von Medikamenten werden Mikropartikel mit Molekülen gemischt, die in die Mikropartikel einzukapseln sind, um nachfolgend freigesetzt zu werden. Es werden zahlreiche verschiedene Verfahren angewendet, um diese Mikropartikel aus synthetischen Polymeren, natürlichen Polymeren, Proteinen und Polysacchariden herzustellen, zu denen auch Phasenabscheidungen, Lösungsmittelverdampfungen, Emulgierungen und Sprühtrocknungen gehören.
- Mikropartikel können auch als Nebenprodukt von Abscheidungsverfahren zum Beispiel bei einigen Ausfällungen, wie Ausfällungen mit Ammoniumsulfat entstehen. In diesen Fällen wird die Ausfällung gesammelt und durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren verdichtet, anschließend wieder in einem Lösungsmittel aufgelöst, um das Mittel zur Ausfällung, nämlich das Salz, aus den mit dem Salz ausgefällten Molekülen abzuscheiden. Dementsprechend sind die Mikropartikel unstabil und dienen nur als Zwischenprodukt und nicht als das Endprodukt per se.
- Kugelförmige Teilchen (Perlen) oder Partikel sind seit vielen Jahren als Hilfsmittel für Biochemiker allgemeinen erhältlich. Zum Beispiel sind Antikörper häufig an Kügelchen konjugiert, um relativ große Partikel zu bilden, die für bestimmte Ligands spezifisch sind. Die großen, mit Antikörpern bedeckten Partikel werden üblicherweise mit vernetzten Rezeptoren an der Oberfläche einer Zelle zwecks zellularer Aktivierung verwendet, zur Immunoaffinitätsreinigung an eine feste Phase gebunden, oder zur Zuführung eines therapeutischen Mittels verwendet, das während einer bestimmten Zeitdauer an einer entfernten Stelle langsamen freigesetzt wird&sub1; und zwar unter Verwendung von Geweben oder spezifischen Tumor-Antikörpern, die an die Partikel konjugiert sind, um das Mittel zielgerichtet an die gewünschte Stelle zu bringen.
- Ein sehr verbreitetes Verfahren zur kovalenten Bindung eines Antikörpers an eine feste Phasenmatrix besteht in der Aktivierung eines Kügelchens mit einem chemischen Konj ugationsmittel und anschließendes Binden des Antikörpers an das aktivierte Kügelchen (Perlen). Die Verwendung eines synthetischen Polymerkügelchens anstelle eines Proteinmoleküls ermöglicht die Anwendung von wesentlich härteren Aktivierungsbedingungen, als sie viele Proteine aushalten können, ist relativ kostengünstig und führt häufig zu einer Verbindung, die gegenüber einem großen Bereich von Denaturierungsbedingungen stabil ist. Es ist eine Anzahl von aktivierten Perlen verfügbar, die alle verschiedene Bestandteile und Größen haben. Perlen, die aus synthetischen Polymeren wie Polyacrylamiden, Polyacrylen, Polystyrenen oder Latex hergestellt sind, sind allgemein bei vielen Quellen, wie z.B. den Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien und LKB Produkter, Stockholm, Schweden erhältlich. Perlen, die aus natürlichen Makromolekülen und Partikeln wie Agarose, (guer-)vernetzter Agarose, Globulin, Deoxyribose- Nukleinsäure und Liposomen hergestellt sind, sind allgemein bei verschiedenen Quellen wie den Bio-Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien; Pharmacia, Piscataway, NY und IBF, Frankreich erhältlich. Perlen, die aus Copolymeren von Polyacrylamiden und Agarose hergestellt sind&sub1; sind allgemein z.B. von IBF und Pharmacia erhältlich. Magnetische Perlen kann man z.B. von Dynal Inc., Great Neck, NY beziehen.
- In der GB 2.079.937 wird die Bindung eines Antikörpers oder Antigens an die Wandoberfläche einer Mikrokapsel über ein vernetzendes Mittel wie Glutaraldehyd beschrieben. Eine Mikrokapsel setzt sich aus einem Wandmaterial mit einer davon eingeschlossenen öligen Substanz als Kern zusammen. Das Wandmaterial wird durch Reaktion einer polyfunktionalen Verbindung wie polyfunktionales Isozyanat, Isothiozyanat, Säurechlorid oder Epoxyverbindungen mit einer Substanz, die die gewünschte funktionale Gruppe wie eine Aminogruppe, eine Karboxy- oder Hydroxygruppe oder eine Mercaptorgruppe aufweist, hergestellt.
- In der EP 0.106.495 wird ein Reagens zum Nachweis von viralen Antikörpern beschrieben, bei dem ein virales Antigen unter Verwendung eines vernetzenden Mittels wie Glutaraldehyd kovalent an ein Trägerpartikel gebunden ist. Die Trägerpartikel können danch ein Gelatinepartikel, ein Polyacrylamidpartikel, Polyurethan-Mikrokapseln und mikrobiologische Zellen wie Serratia, sowie Polystyrenlatex und Kohlenstoffpuder sein.
- In der GB 2.002.319 wird ein Verfahren zur Dehydrierung von Liposomen durch Lyophilisation beschrieben. Die Liposome werden vor der Lyophilisation zunächst mit einer hydrophilen Verbindung wie Polyvinylpyrrolidon gemischt. Die hydrophile Verbindung wird als stabilisierender Zusatz beschrieben, der die Liposome des dehydrierten Produktes schützt und diese in einem für die weitere Verwendung geeigneten Zustand hält.
- In der EP 0.414.223 wird die Bindung eines immunologisch aktiven Materials an feste feine Partikel und anschließendes Trocknen der Partikel durch Lyophilisation beschrieben. Die Partikel stammen aus Organismen wie Bakterien, die in Erythrozyten verteilt sind, anorganischen Partikeln wie Kieselerde, Aluminiumoxyd und Bentonit, sowie organischen Partikeln wie Homopolymeren und Kopolymeren von Vinylmonomeren wie Styrenen, Vinylchloriden, Acrylonitrilen, Vinylacetaten, Acrylsäureestern, Methacrylatestern usw. Diese Partikel werden entweder vor oder nach der Bindung des immunologisch aktiven Materials an die Oberfläche der Partikel mit einem vernetzenden Mittel wie Glutaraldehyd lyophilisiert.
- In der Datenbank WPI AN88-136322/JP 86 223230 wird der Zusatz von Prostaglandin E zu Ethanol, das Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglykol enthält, zur Herstellung einer stabilen Prostaglandinschicht beschrieben.
- Wie die große Vielzahl von Materialien und Anwendungen zeigt, besteht ein fortgesetzter Bedarf nach der Entwicklung von neuen Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Mikropartikeln, und zwar insbesondere solchen, die anstelle für nur eine Anwendung zur Verwendung bei Abscheidungen, im diagnostischen Bereich und zur Zuführung von Medikamenten geeignet sind.
- Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, stabile Mikropartikel und ein Verfahren zur Herstellung von Mikropartikeln zu schaffen, das relativ einfach, schnell und kostengünstig ausführbar ist.
- Ferner sollen mit der Erfindung Mikropartikel geschaffen werden, die eine hohe Affinität und Spezifizität für ein Zielmolekül aufweisen.
- Weiterhin sollen mit der Erfindung Mikropartikel geschaffen werden, die nicht absorbiert werden, wenn sie in vivo verabreicht werden.
- Mit der Erfindung sollen auch Mikropartikel geschaffen werden, die zur Anwendung bei Abscheidungsverfahren, insbesondere in der Affinitäts-Chromatographie vorgesehen sind.
- Schließlich sollen mit der Erfindung Mikropartikel zur Verwendung bei medizinischen und diagnostischen Anwendungen, wie der zielspezifischen Zuführung von Medikamenten und der Abbildung von histopathologischen oder in vivo Geweben oder Tumoren geschaffen werden.
- Die Aufgabe wird durch eine Mikropartikel- Zusammensetzung mit vernetzten Makromolekülen nebeneinander mit einem dehydrierenden Mittel gelöst, bei der das dehydrierende Mittel eine Lösung mit Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglycol ist und bei der die Mikropartikel-Zusammensetzung durch Inkubation der Makromoleküle mit dem dehydrierenden Mittel bei einer Temperatur erzeugt werden kann, die höher ist, als Zimmertemperatur, und/oder bei Vorhandensein eines vernetzenden Mittels für eine ausreichend lange Zeit, um die Mikropartikel zu bilden.
- Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Mikropartikels mit vernetzten Makromolekülen, nebeneinander mit einem dehydrierenden Mittel, mit folgenden Schritten:
- a) Inkubieren eines Makrornoleküls mit einem dehydrierenden Mittel bei einer Temperatur, die größer ist, als Zimmertemperatur und/oder bei Vorhandensein eines vernetzenden Mittels für eine ausreichend lange Zeit, um die Mikropartikel zu bilden, wobei das dehydrierende Mittel eine Lösung ist, die Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglycol aufweist und
- b) Trennen der Partikel von der Inkubationsmischung.
- Unter einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Isolieren eines Zielmoleküls aus einer Komplexmischung, die das Molekül enthält, mit folgenden Schritten:
- a) Mischen der Komplexmischung mit einem makromolekularen Mikropartikel mit einer Affinität für das Zielmolekül für eine ausreichend lange Zeit, damit sich das Zielmolekül an das Makromolekül binden kann, wobei das Mikropartikel Makromoleküle in einer flüssigen Phase aufweist, die nebeneinander mit einem dehydrierenden Mittel vernetzt sind, wobei das vernetzende Mittel eine Lösung ist, die Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglycol aufweist und wobei das Mikropartikel durch Inkubation des Makromoleküls mit dem dehydrierenden Mittel bei einer Temperatur erzeugt werden kann, die höher ist, als Zimmertemperatur, und/oder bei Vorhandensein eines vernetzenden Mittels für eine ausreichend lange Zeit, um die Mikropartikel zu bilden, und
- b) Trennen der gebundenen Zielmoleküle von der Komplexmischung.
- Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erfassen eines Zielbiomoleküls in einer Probe mit folgenden Schritten:
- a) Kombinieren der Probe mit einer Mikropartikel- Zusammensetzung, die ein Makromolekül aufweist, das nebeneinander mit einem dehydrierenden Mittel vernetzt ist, wobei das dehydrierende Mittel eine Lösung ist, die Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglycol aufweist, wobei die Mikropartikel-Zusammensetzung durch Inkubation des Makromoleküls mit dem dehydrierenden Mittel bei einer Temperatur, die höher ist, als Zimmertemperatur, und/oder bei Vorhandensein eines vernetzenden Mittels für eine ausreichend lange Zeit, um die Mikropartikel zu bilden, erzeugt werden kann, und wobei das Makromolekül ein Affinitätsmolekül aufweist, das spezifisch für das mit einem detektierbaren abbildenden Mittel markierte Zielbiomolekül ist und
- b) Erfassen des detektierbaren abbildenden Mittels.
- Unter einem weiteren Gesichtspunkt betrifft die Erfindung einen Satz zur Zubereitung eines Mikropartikels mit vernetzten Makromolekülen nebeneinander mit einem dehydrierenden Mittel, mit
- a) einem dehydrierenden Mittel mit einer Lösung aus Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglycol und
- b)einem vernetzenden Mittel, das aus einer Gruppe ausgewählt ist, die Dialdehyde, Amine, mehrwertige Ionen, N-substituierte Maleimide, bifunktionale Alkylhalide, Arylhalide, Isocyanate, aliphatische oder aromatische dicarboxylische Säuren, aliphatische oder aromatische disulphonische Säuren, bifunktionale Imidoester und Vinylsulphone aufweist.
- Mikropartikel, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie Verfahren zu ihrer Verwendung werden auf der Basis von Verfahren zur "Dehydration" von Makromolekülen wie Proteinen, Kohlenhydraten, Polysacchariden, Nukleinsäuren, Viren, Viruspartikeln, organischen oder anorganischen, synthetischen pharmazeutischen Medikamenten oder jeder Mischung daraus geschaffen, wobei die makromolekularen Mikropartikel durch Inkubation in Anwesenheit von Hitze oder "Vernetzung der Makromoleküle in einer flüssigen Phase gebildet werden. Die Makromoleküle werden dehydriert, und zwar unter Verwendung eines Mittels, das mit Ausnahme der "Taschen" von Makromolekülen, die in einer wässrigen Phase gelöst oder suspendiert bleiben, alle Makromoleküle wirksam dehydriert, wobei die Dehydration mit einer Lösung erfolgt, die Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglykol enthält. Die Makromoleküle können aus Medikamenten, biologisch aktiven Molekülen, Trägermolekülen, Affinitätsmolekülen oder Mischungen daraus bestehen.
- Mikropartikel werden durch Inkubation von dehydrierten Makromolekülen für eine vorbestimmte Zeitdauer bei einer Temperatur gebildet, die über der Zimmertemperatur liegt. Alternativ dazu werden die Makromoleküle bei verschiedenen Temperaturen vernetzt, um Mikropartikel unter Verwendung eines vernetzenden Mittels wie Glutaraldehyd oder anderer Mittel wie Ammen, mehrwertigen Ionen und multifunktionalen Molekülen, die eine "Affinität" für spezifische reaktive Gruppen an den vernetzten Makromolekülen haben, zu bilden.
- Die Mikropartikel werden dann von dem dehydrierenden Mittel und überschüssigem vernetzendem Mittel, sofern dies vorhanden ist, durch Abscheidungsverfahren, wie Filtration oder Zentrifugation getrennt. Die Mikropartikel können dann mit einem lösenden Reagens gewaschen werden, das sich an alle nichtreagierten Bindungsstellen an den vernetzenden Mitteln bindet, um wirksam alle nachfolgenden nichtspezifischen Bindungen der Mikropartikel zu reduzieren, wenn sie mit einem Zielmolekül reagieren.
- Die Mikropartikel sind für eine große Vielzahl von Abscheidungen, diagnostischen und therapeutischen Zwecken sowie für Forschungszwecke nützlich.
- Nachfolgend werden spezifische Beispiele beschrieben, in denen die Mikropartikel gebildet werden aus (1) Proteinen wie Antikörpern, die mit einer hohen Konzentration einer linearen Polymermischung dehydriert wurden, die Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglykol enthält, die dann mit Glutaraldehyd vernetzt wurden; (2) Polysacchariden wie Alginaten, die mit biologisch aktiven Molekülen gemischt sind, die mit einer hohen Konzentrationen einer linearen Polymermischung dehydriert wurden, die Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglykol enthält und mit mehrwertigen Ionen wie Polyaminosäuren oder zweiwertigen Kationen vernetzt ist; (3) Peptidhormonen wie Insulin, vernetzt mit Glutaraldehyd, gefolgt von einer Dehydration mit einer Mischung aus Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglykol und (4) Proteinen wie Albumin, die mit einer linearen Polymermischung dehydriert werden, die Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglykol enthält und bei Vorhandensein von Hitze inkubiert werden.
- Figur 1 zeigt eine Kurve der Zählwerte pro Minute (Zählungen) von gebundenen radioaktiven karzinogenen embryonen Antigenen über einer anti-karzinogenen embryonen antigenen Mikropartikel-Konzentration.
- Figur 2 zeigt eine Darstellung der Antikörper-Titer gegenüber der Anzahl von Wochen nach der Immunisierung mit primären und sekundären Dosen von Tetanus-toxoid Partikeln.
- Es werden Mikropartikel, Verfahren zu ihrer Herstellung und Sätze für diagnostische und therapeutische Anwendungen sowie für die Forschung zur Verfügung gestellt. Die Mikropartikel sind vernetzte makromolekulare Strukturen mit einem großen Oberflächenbereich. Die die Mikropartikel bildenden Makromoleküle umfassen unter anderem Proteine, Kohlenhydrate, Polysaccharide, Nukleinsäuren, Viren, Viruspartikel, organische oder anorganische synthetische pharmazeutische Medikamente oder Mischungen daraus, die in einer flüssigen Phase unter den Bedingungen einer Dehydration vernetzt werden können.
- Die Mikropartikel werden durch Inkubation von Makromolekülen in Lösung oder in einer flüssigen Phase in Anwesenheit eines dehydrierenden Mittels und Hitze oder eines vernetzenden Mittels für eine ausreichend lange Zeit, um die Partikel auszubilden, hergestellt. Die Makromoleküle werden zunächst in einem wässrigen Lösungsmittel aufgelöst. Dann wird entweder die makromolekulare Lösung dem dehydrierenden Mittel oder das dehydrierende Mittel der makromolekularen Lösung zugesetzt, wobei die zuletzt genannte Alternative vorgezogen wird. Die Lösung der dehydrierten Makromoleküle wird dann vorzugsweise für eine vorbestimmte Zeitdauer erhitzt, um die Mikropartikel entstehen zu lassen. Alternative dazu wird der Lösung aus dehydrierten Makromolekülen zur Erzeugung der Mikropartikel bei verschiedenen Temperaturen über, unter oder bei Zimmertemperatur ein vernetzendes Mittel zugesetzt. Die sich ergebenden Mikropartikel werden dann von allen nichtreagierten Komponenten getrennt, die in der Inkubationsmischung vorhanden sind, und zwar mittels physikalischer Abscheidungsverfahren, die allgemein bekannt sind.
- Die die Mikropartikel bildenden Makromoleküle können solche Moleküle sein, die in flüssiger Phase vernetzt werden konnen. Das Makromolekül ist vorzugsweise ein Biomolekül wie ein Protein, ein Kohlenhydrat, ein Polysaccharid, ein Nukleinsäuremolekül, ein Virus, ein Viruspartikel oder Mischungen daraus. Das Makromolekül kann auch eine natürliche oder synthetische pharmazeutische Verbindung sein, die vernetzbar ist. Für einen Fachmann ist klar, daß eine Verbindung, die nicht vernetzbar ist, zu einem Mikropartikel umgesetzt werden kann, indem eine Verbindung in ein Trägermolekül eingebracht wird&sub1; das dann in Übereinstimmung mit den hier beschriebenen Verfahren vernetzt werden kann. Für einen Fachmann ist es auch klar, daß das Makromolekül auch ein Teil eines Moleküls sein kann, das die erforderliche Aktivität zum Binden oder Zusammenwirken mit einem Ligand, wie zum Beispiel einem Peptid, einem Einzelstrangsegment eines doppelsträngigen Nukleinsäuremoleküls oder ein Viruspartikel, aufweist. Weiterhin ist es für einen Fachmann klar, daß der Begriff "Makromolekül" eine Mehrzahl von verschiedenen Makromolekülen sowie Kombinationen von verschiedenen Makromolekülen umfaßt, wie zum Beispiel eine Kombination einer pharmazeutischen Verbindung mit einem Affinitätsmolekül, mit dem die pharmazeutische Verbindung auf ein eine Behandlung erforderndes Gewebe, Organ oder einen Tumor gerichtet wird.
- Schließlich ist es für einen Fachmann auch klar, daß ein Affinitätsmakromolekül entweder ein Rezeptorabschnitt oder der Ligandabschnitt einer Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung sein kann. Beispiele für Liganden, die mit anderen Biomolekülen in Wechselwirkung treten, sind Viren, Bakterien, Polysaccharide oder Toxine, die als Antigene wirken, um eine Immunantwort zu erzeugen, wenn sie einem Tier verabreicht werden und die Produktion von Antikörpern bewirken.
- Die Konzentration der Makromoleküle in der Inkubationsmischung liegt in Abhängigkeit von den Inkubationsbedingungen vorzugsweise zwischen 0,1 und 100 mg/mL.
- Die Makromoleküle können mit einer detektierbaren Marke markiert werden. Die verschiedenen Arten von Marken und die Verfahren zur Markierung von Proteinen und Nukleinsäuremolekülen sind dem einschlägigen Fachmann allgemein bekannt. Es ist auch klar, daß eine magnetische Substanz, wie zum Beispiel ein Metall, ebenfalls unter den Begriff der Marke (Label) fällt. Makromoleküle können zum Beispiel mit einer metallischen Substanz, wie einem Metall markiert werden, so daß die Mikropartikel von anderen Substanzen in einer Lösung mit Hilfe einer magnetischen Einrichtung getrennt werden können.
- Nachfolgend werden mehrere andere spezifische Marken oder Reportergruppen erläutert.
- Die Marke kann zum Beispiel eine Radiomarke sein, zu der unter anderem ³²p, ³H, ¹&sup4;C, ³&sup5;S, ¹²&sup5;I oder ¹³¹I gehört. Eine ³²p Marke kann mit einem konjugierenden Reagens an ein Protein konjugiert .9der durch nick-Übersetzung, Endmarkierung oder Einführung von markierten Nukleotiden in die Sequenz eines Nukleinsäuremoleküls eingeführt werden. Zum Beispiel kann eine ³H, ¹&sup4;C oder ³&sup5;S Marke durch Einführung eines markierten Precursors oder durch chemische Modifikation in eine Nukleotidsequenz eingebracht werden, während eine ¹²&sup5;I oder ¹³¹I Marke im allgemeinen durch chemische Modifikation in eine Nukleotidsequenz eingebracht wird. Die Detektion einer Marke kann durch bestimmte Verfahren wie Scintillationszählung, Gammastrahlenspektrometrie oder Autoradiographie erfolgen.
- Die Marken können auch in Form einer Massen- oder Kernmagnetresonanz (NMR), zum Beispiel 130, ¹&sup5;N oder ¹&sup9;O vorliegen. Die Feststellung einer solchen Marke kann durch Massenspektrometrie oder NMR erfolgen.
- Farbstoffe, chemolumineszierende Mittel und Fluoreszenzmittel (Fluorogene) können ebenfalls zur Markierung von Makromolekülen verwendet werden. Beispiele für Farbstoffe, die zur Markierung von Nukleinsäuren verwendet werden können, sind Ethidiumbromid, Actidine, Propidium und andere eingelagerte Farbstoffe, sowie 4', 6'-diamidino-2- phenyllindole (DAPI) (Sigma Ohemical Company,. St. Louis, MO) oder andere proprietäre Nukleinsäure- Farbstoffe. Beispiele für Fluoreszenzmittel sind Fluorescein und Derivate, Phycoerythrin, Allo- Phycocyanin, Phycocyanin, Rhodamin, Texas Red oder andere proprietäre Fluoreszenzmittel. Die Fluoreszenzmittel werden im allgemeinen durch chemische Modifikation eingebettet. Die Farbstoffmarken können mit einem Spektrofotometer, die Fluoreszenzmittel mit einem Fluoreszenzdetektor erfaßt werden.
- Die Makromoleküle können alternativ mit einem Chromogen (Enzymsubstrat) markiert werden, um eine Enzym- oder Affinitätsmarke zu schaffen, oder auch mit einem Enzym. Die Makromoleküle können zum Beispiel biologisch zerkleinert (biotinylated) werden, so daß sie in einer Biotin-Avidin-Reaktion verwendet und auch an eine Marke wie ein Enzym oder Fluorogen gekoppelt werden können. Die Makromoleküle können mit Peroxydase, Alkalin- Phosphatase oder anderen Enzymen markiert werden, was bei Zusatz von Substrat zu einer chromogenen oder fluorogenen Reaktion führt. Zum Beispiel können Additive wie 5-Amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione (auch als Luminol bekannt) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) und Ratenbeschleuniger wie P- hydroxybiphenyl (auch als P-phenylphenol bekannt) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) zur Verstärkung der Enzyme wie Meerrettich-Peroxydase durch eine Lumineszenzreaktion verwendet werden. Lurninogene oder fluorogene Dioxetan-Derivate von Enzymsubstraten können auch verwendet werden.
- In ein Makromolekül können zur Schaffung einer detektierbaren Marke auch Erkennungsstellen für Enzyme wie Beschränkungs-Enzymstellen oder Nukleinsäuremoleküle eingebracht werden. Eine Marke kann auch durch Einführen einer modifizierten Base, Aminosäure oder eines eine Marke enthaltenden Vorläufers (precursor), durch Einführen einer modifizierten Base oder Aminosäure, die eine durch spezifische Antikörper erkennbare chemische Gruppe enthält, oder durch Detektion jedes gebundenen Antikörperkomplexes durch verschiedene Mittel einschließlich Immunofluoreszenz- oder Immunoenzymatische Reaktionen geschaffen werden. Solche Marken können unter Verwendung von Enzym-ähnlichen Immunoprüfungen (ELISA) oder durch Detektion einer Farbänderung mit Hilfe eines Spektrofotometers erfaßt werden
- Das dehydrierende Mittel ist eine chemische Verbindung oder eine Mischung aus Verbindungen, die Wasser aus den Makromolekülen in ein hochionisches Medium diffundieren können.
- Das dehydrierende Mittel ist eine Mischung aus zwei oder mehr löslichen linearen Polymeren, nämlich Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglykol. Eine solche Polymermischung kann mit den in der Patentanmeldung WO 93/14110 von James E. Woiszwillo beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Für einen Fachmann ist es klar, daß zusätzlich zu PVP und PEG andere lösliche lineare Polymere wie Dextran, Nonylphenol-ethoxylat, Polyvinylalkohol und Mischungen daraus verwendet werden können.
- PVP ist ein nichtionogener hydrophiler Polymer mit einem mittleren Molekulargewicht im Bereich von näherungsweise 10.000 bis 700.000 und der chemischen Formel (C&sub6;H&sub9;NO)n. PVP ist auch als Poly[1-(2-oxo-1- pyrrolidinyl)ethylen], Povidon , Polyvidon , RP 143 , Kollidon , Peregal St , Periston , Plasdon , Plasmosan , Protagent , Subtosan und Vinisil bekannt. PVP ist nicht toxisch, stark hygroskopisch und leicht in Wasser oder organischen Lösungsmitteln auf lösbar.
- Polyethylenglykol (PEG), das auch als Poly(oxyethylen)glykol bekannt ist, ist ein Kondensationspolymer von Ethylenoxid und Wasser mit der allgemeinen chemischen Formel HO(CH&sub2;CH&sub2;O)nH.
- Dextran ist ein Begriff 1 der zur Bezeichnung von Polysacchariden verwendet wird, die von auf einem Sucrosesubstrat wachsenden Bakterien erzeugt werden. Native Dextrane, die von Bakterien wie Leuconostoc mesenteroides und Lactobacteria dextranicum erzeugt werden, haben im allgemeinen ein hohes Molekulargewicht.
- Nonylphenol-ethoxylate (NPEs) sind eine Klasse von langkettigen Verbindungen, die häufig als Oberflächenmittel (surfactants) verwendet werden. Sie sind üblicherweise derivatisiert, um die gewünschten Anforderungen im Hinblick auf die Löslichkeit zu erfüllen.
- Polyvinylalkohol (PVA) ist ein Polymer, der aus Polyvinylacetaten durch Austausch der Acetatgruppen gegen Hydroxylgruppen hergestellt wird und die Formel (CH&sub2;CHOH)n hat. Die meisten Polyvinylalkohole sind in Wasser löslich.
- PEG, Dextran, PVA und PVP sind allgemein bei einschlägigen Lieferanten wie Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) erhältlich. NPEs erfordern eine spezielle Synthese und können bei bestimmten Herstellern chemischer Produkte bestellt werden.
- Das dehydrierende Mittel ist vorzugsweise eine Polymermischung, die eine wässrige Lösung aus PVP mit einem Molekulargewicht von zwischen 10.000 und 360.000, vorzugsweise 40.000, und PEG mit einem Molekulargewicht von zwischen 200 und 35.000 enthält. PVP mit einem Molekulargewicht von 40.000 und PEG mit einem Molekulargewicht von 3.500 werden bevorzugt. Alternativ dazu wird zur Erzeugung von Mikropartikeln mit gleichmäßigen Größe PVP mit einem Molekulargewicht von 360.000 bevorzugt. PVP wird vorzugsweise in einem Acetat-Puffer aufgelöst, und PEG wird der wassrigen PVP-Lösung zugesetzt. Die Konzentration jedes Polymers liegt in Abhängigkeit von dem Molekulargewicht jedes Polymers vorzugsweise zwischen 1 und 40g/100ml. Besonders bevorzugt wird eine Konzentration jedes Polymers von 24g/100ml oder 24%. Gleiche Konzentrationen von PVP und PEG erzeugen die für die Bildung von Polymer-Mikropartikeln am besten geeignete Polymermatrix. Das Volumen des den Makromolekülen zugesetzten Polymers schwankt in Abhängigkeit von der Größe und der Menge der Makromoleküle. Vorzugsweise werden drei Volumina der Polymermischung einem Volumen einer die Makromoleküle enthaltenden Lösung zugesetzt.
- Die Mikropartikel werden durch Inkubation einer Mischung der Makromoleküle und eines dehydrierenden Mittels für eine vorbestimmte Zeitdauer bei einer Temperatur erzeugt, die über der Zimmertemperatur liegt. Die Mischung wird vorzugsweise in einem Wasserbad bei einer Temperatur von 37ºC oder mehr und 80ºC oder weniger für eine Zeitdauer von zwischen näherungsweise fünf Minuten und zwei Stunden inkubiert. Die Mischung wird besonders bevorzugt 15 bis 30 Minuten bei einer Temperatur von zwischen 50ºC und 70ºC inkubiert
- Die Größe der Mikropartikel kann durch Einstellung der Inkubationsbedingungen beeinflußt werden. Die Inkubationstemperatur kann zum Beispiel allmählich oder stufenweise von Zimmertemperatur auf die gewünschte erhöhte Inkubationstemperatur gesteigert werden, oder die Gesamtinkubationszeit kann verlängert werden. Zusätzlich kann das Ausmaß der Mikropartikel- Aggregation durch Veränderung der Konzentration, des Volumens oder der Zusammensetzung des dehydrierenden Mittels beeinflußt werden.
- Mikropartikel werden alternativ durch Zusatz eines vernetzenden Reagens gebildet, um die dehydrierten Makromoleküle zu vernetzen. Das vernetzende Reagens ist ein bi- oder multifunktionales chemisches Reagens, das die Makromoleküle und in einigen Fällen das dehydrierende Mittel physikalisch verkettet. Beispiele für geeignete vernetzende Mittel sind Dialdehyde oder andere Mittel wie Amine, multivalente Ionen und multifunktionale Moleküle, die eine "Affinität" für spezifische reaktive Gruppen an den vernetzten Makromolekülen haben.
- Bei der bevorzugten Ausführungsform verbindet das vernetzende Mittel die Makromoleküle zu einer stabilen dreidimensionalen Struktur. Das vernetzende Mittel ist besonders bevorzugt ein bifunktionales Reagens wie Glutaraldehyd; p,p'-Difluoro-m,m'-dinitro diphenyl sulphon; Hexamethylen diisocyanat; n,n'-(1,3-Phenylen)- bis-maleimid; n,n'-Ethylen-bis-iodoacetamid; 3,6-bis(mecurimethyl)-dioxan; bis-Diazobenzidin; Woodward's K; Bis-oxirane; Dimethyl adipimidate; Dimethyl suberimidate; Diethyl malonimidate; Phenol-2,4- disulphonyl-chlorid; Divinylsulphon; und Carbodiimides.
- Es wird besonders bevorzugt, als vernetzendes Mittel ein Dialdehyd wie Glutaraldehyd zu verwenden, das eine "Schiff base" mit primären Ammen bildet, die bei Reduktion mit Borohydrid unter gemäßigten Bedingungen ein stabiles sekundäres Amin erzeugen.
- Ein Beispiel für eine andere Art eines vernetzenden Mittels sind N-substituierte Maleimide, die für Sulphydryl-Gruppen unter gemäßigten Bedingungen spezifisch sind. Es sind mehrere N-aryl und N-alkylbis-maleimide allgemein erhältlich, einschließlich Azophenyldimaleimide. Diese sind in Wasser unlöslich und werden im allgemeinen in stöchiometrischen Mengen als fester Stoff in eine wässrigen Lösung bei einem pH- Wert des Reaktionsmittels von 7 oder 8 gegeben.
- Bifunktionale Alkyl-halogene reagieren primär mit Thiol, Imidazol und Aminogruppen. Bei neutralem bis geringfügig alkalischem pH-Wert ist die Reaktion mit Sulphydryl-Gruppen begünstigt, während bei höheren pH- Werten die Reaktion mit Aminogruppen bevorzugt abläuft. Andere Verbindungen sind Aryl-halogene wie 1,5- Difluoro-2,4-dinitrobenzen, die in Wasser unlöslich sind und vorzugsweise mit Aminogruppen und Tyrosinphenolgruppen reagieren, die jedoch auch mit Sulphydryl- und Imidazolgruppen reagieren. Für eine schnelle Reaktion sind relativ hohe pH-Werte erforderlich. Das Reagens wird im allgemeinen als konzentrierte Acetonlösung einer wässrigen Lösung der Reagenzien und der Produktformation zugesetzt. Isozyanate reagieren mit Ammen, um Ersatzharnstoffe (urea) zu bilden, mit Alkoholen, um Urethane zu bilden und mit Wasser, um Amine und Kohlendioxid zu erzeugen. Bei alkalischem pH-Wert. ist die Reaktion mit Ammen bevorzugt. 2,2-Dicarboxy-4,4'-azophenyldiisozyanat ist wasserlöslich und hat den Vorteil, daß die Brücke, die es bildet, leicht durch Reduktion der Azogruppe mit Dithionit aufgespalten werden kann. Es können auch acrylierende Mittel verwendet werden, wie z.B. viele aliphatische oder aromatische dicarboxylische oder disulphonische Säuren, die aktiviert werden, um bifunktionale acrylierende Mittel zu schaffen, die unter gemäßigten Bedingungen reagieren können. Die Nitrophenylester der dicarboxylischen Säuren und die aromatisch-bis-sulphonyl Chloride sind Beispiele hierfür. Diese sind in Wasser unlöslich und hydrolisieren schnell. Die bis-sulphonyl Chloride reagieren mit Aminogruppen, um stabile Suphonamid- Verkettungen zu bilden, die anschließend mit HBR in glazialer Essigsäure aufgespalten werden können. Es können auch bifunktionale Imidoester verwendet werden, die in Wasser löslich sind und mit Aminogruppen unter gemäßigten Bedingungen und mit einem hohen Grad an Spezifizität reagieren. Dimethylsuberimidate können in 0,2 M Triethanolamin HCl Puffer mit einem pH-Wert von 8,5 für drei Stunden bei Zimmertemperatur verwendet werden. Das sich ergebende Amid ist stabil gegenüber Säurehydrolyse, kann jedoch mit Ammoniak aufgespalten werden. Es können Vinylsulphone verwendet werden, die primär mit Aminogruppen reagieren, die jedoch bei hohen pH-Werten mit carbohydraten, Phenolen und Alkoholen reagieren.
- Die Konzentration des vernetzenden Reagensmittels in der Inkubationsmischung sollte ausreichend hoch sein, um alle aktiven Gruppen der Makromoleküle zu binden. Es besteht ein direkter Zusammenhang zwischen der Konzentration des vernetzenden Mittels und der Anzahl von nach der Inkubation gebildeten Mikropartikeln. Im allgemeinen werden um so mehr Mikropartikel gebildet, desto höher die Konzentration des vernetzenden Mittels in der Inkubationsmischung ist. Die Konzentration des vernetzenden Mittels in der Inkubationsmischung liegt vorzugsweise zwischen etwa 5 und 200 Mikrolitern einer 25%igen Lösung von Glutaraldehyd pro Milliliter der Inkubationsmischung.
- Bei Verwendung von dehydrierenden Mitteln, die nicht zu den Polymerlösungen gehören, wie Ammonium- oder Natriumsalze, organische Lösungsmittel, zweiwertige Ionen wie Zink, oder chaotropische Mittel, muß zur Erzeugung von Mikropartikeln sehr sorgfältig die richtige Kombination von vernetzenden Reagensmitteln gewählt werden, da zwischen dem dehydrierenden Mittel und dem vernetzenden Mittel eine Wechselwirkung auftreten kann. Die Mikropartikel werden unter Verwendung von Ammoniumsulfat, Glutaraldehyd und Protein gebildet, die Konzentrationen der Reagensraittel unterscheiden sich jedoch von denjenigen, die bei Verwendung von linearen Polymeren zur Erzeugung von Mikropartikeln notwendig sind.
- Das dehydrierende Mittel ist vorzugsweise eine Polymerlösung, in der die Makromoleküle, das Polymer und die Lösung des vernetzenden Mittels kräftig gerührt werden, um eine ausreichende Wechselwirkung zwischen den Makromolekülen, den Polymeren und dem vernetzenden Mittel sicherzustellen, wobei während des Mischens bei Zimmertemperatur (20ºC) oder einer geringeren Temperatur für eine ausreichend lange Zeit inkubiert wird, um möglichst viele Mikropartikel zu bilden. Alternativ dazu können die Mikropartikel auch unter Verwendung einer Kombination aus einem vernetzenden Mittel und Hitze, vorzugsweise durch Inkubation bei einer Temperatur von 37ºC oder mehr und 80ºC oder weniger, gebildet werden.
- Die Länge der Inkubationszeit ist abhängig von den entsprechenden Konzentrationen des Polymers und der Affinitätsmoleküle, sowie der Inkubationstemperatur. Die Polymermischung und die Makromoleküle werden vorzugsweise zwischen 30 Minuten und 24 Stunden inkubiert. Besonders bevorzugt werden die Polymermischung und die Makromoleküle 120 Minuten bei Zimmertemperatur durch Rühren oder Schütteln gemischt und dann über Nacht ohne Rühren auf 4ºC gehalten.
- Der pH-Wert der Inkubationsmischung wird im allgemeinen durch den pH-Wert des dehydrierenden Mittels bestimmt und kann durch Zusatz einer geeigneten Menge einer Säure oder eines basischen Puffers zu der dehydrierenden Lösung oder der Lösung mit den Makromolekülen oder beiden eingestellt werden, bevor diese gemischt werden. Da das dehydrierende Mittel eine lineare Polymermischung ist, besteht ein direkter Zusammenhang zwischen der Größe der am Ende des Inkubationsschrittes gebildeten Mikropartikel und dem pH-Wert der Inkubationsmischung. Bei einem höheren (stärker basischen) pH-Wert werden größere Mikropartikel gebildet. Bei einem niedrigeren pH-Wert sind die erzeugten Mikropartikel kleiner. Der pH-Wert der linearen Polymer-Inkubationsmischung liegt vorzugsweise zwischen näherungsweise 5 und 8.
- Es ist klar, daß nach der Inkubation den erzeugten Mikropartikeln ein Löschungsreagens zugesetzt werden kann, um alle nichtreagierten Bindungsstellen des vernetzenden Reagens' zu blockieren und dadurch die nachfolgende nichtspezifische Bindung zu reduzieren. Geeignete Löschungsreagenzien sind Verbindungen, wie Aminosäuren oder Albumine, die eine wesentliche Anzahl von Aminogruppen enthalten. Das Löschungsreagens ist vorzugsweise eine Lösung, die Lysin oder Glycin enthält. Das Löschungsreagens ist besonders bevorzugt das Aminosäureglycin mit einer Konzentration im Bereich zwischen 0,1 und 0,5 M.
- Die erzeugten Mikropartikel werden von den nicht reagierten Komponenten der Inkubationsmischung mit bekannten Trennungsverfahren getrennt. Die Inkubationsmischung wird vorzugsweise zentrifugiert, so daß die Mikropartikel auf den Boden der Zentrifuge gedrückt werden und die nicht reagierten Komponenten oben bleiben, wo sie anschließend dekantiert werden. Alternativ dazu wird die die erzeugten Mikropartikel enthaltende Inkubationsmischung gefiltert, so daß die Mikropartikel in dem Filter zurückgehalten werden und die nicht reagierten Komponenten durch das Filter hindurchgelangen.
- Eine weitere Reinigung der Mikropartikel wird durch Waschen in einer geeigneten Menge einer Waschlösung herbeigeführt. Die bevorzugte Waschlösung ist eine Puffer, und zwar besonders bevorzugt eine Phosphat gepufferte Salzlösung, die das Löschungsreagens enthält. Sofern es erforderlich ist, kann wiederholt gewaschen werden.
- Für einen Fachmann ist es klar, daß ein Anteil des dehydrierenden Mittels in die makromolekulare Struktur eingeführt werden kann und einen wirksamen Beitrag zu der molekularen Zusammensetzung jedes Mikropartikels leistet.
- Die durch die oben genannten Verfahren hergestellten Mikropartikel können in Abhängigkeit von der Temperatur, der Größe des Polymers und der Mischung sowie der Proteinkonzentration kugelförmig oder nicht kugelförmig sein, wobei sich auf der Oberfläche jedes Mikropartikels eine oder mehrere aktive Stellen befinden können. Durch die elliptische Form und die Art der Mikropartikel wird ein Partikel geschaffen, das eine größere Oberfläche aufweist, als kugelförmige Mikropartikel-Perlen, so daß eine größere Anzahl von Makromolekülen pro Mikropartikel eingebracht werden kann, als dies bei bekannten kugelförmigen Perlen der Fall ist.
- Darüberhinaus sind bei dem Beispiel, bei dem die Mikropartikel aus Makromolekülen wie Immunoglobin, das mit Glutaraldehyd in Anwesenheit von PVP/PEG vernetzt ist, gebildet werden, diese Mikropartikel bei alkalischem und saurem pH-Wert stabil und werden nicht absorbiert, wenn sie in vivo verabreicht werden.
- Die Mikropartikel sind für einen weiten Bereich von diagnostischen und therapeutischen Anwendungen sowie für Forschungszwecke gemäß nachfolgender detaillierte Beschreibung nützlich. Für diagnostische in vivo Zwecke können die Mikropartikel zum Beispiel ein Makromolekül wie ein Immunoglobin oder einen Zellrezeptor aufweisen, das mit einer detektierbaren Marke markiert ist. Eine Injektion der markierten Mikropartikel bei einem Patienten führt zur Erzeugung eines abbildenden Mittels für die Diagnose einer um sich greifenden Funktionsstörung wie Krebs oder eines Hilfsmittels zur Abschätzung des Erfolges eines therapeutischen Mittels bei der Verringerung der Ausbreitung einer bestimmten störenden Zelle oder eines ungünstigen Organismus. Für die in vitro Diagnose werden die Mikropartikel, die ein Makromolekül wie zum Beispiel ein Immunoglobulin, einen Zellrezeptor oder eine für die untersuchte Zelle oder den untersuchten Organismus spezifische Oligonukleotid- Sonde umfassen, mit einer Testprobe kombiniert. Die Mikropartikel werden von allen nicht gebundenen Komponenten der Probe getrennt, und die gebundenen Moleküle werden mit bekannten Verfahren detektiert. Die Mikropartikel sind auch dann als therapeutisches Mittel nützlich, wenn sie ein therapeutisches Medikament aufweisen und einem Patienten injiziert werden, um langsam freigesetzt oder gezielt der Stelle zugeführt zu werden, die eine Therapie benötigt.
- Die Mikropartikel sind auch zur Reinigung von Molekülen aus einer komplexen Mischung, als Reagens zum Nachweis oder zur Quantifizierung eines spezifischen Moleküls oder zur Herstellung von Molekülen wie Antikörpern nützlich. Zum Beispiel können Mikropartikel, die ein Makromolekülen wie ein Immunoglobin enthalten, an einer Ohromatographensäule angebracht und zur Immunoaffinitäts-Chromatographie verwendet werden, um eine Bindung (ligand) aus einer komplexen Mischung zu trennen. Alternativ dazu. können Mikropartikel, die ein markiertes Makromolekül oder eine Mischung aus markierten Makromolekülen aufweisen, die für verschiedene Zellen oder Biomoleküle spezifisch sind, wie zum Beispiel Zellrezeptoren, zur Detektion von Anderungen in der Anzahl von Zellen oder den Biomolekülen in Abhängigkeit von einer bestimmten Testbedingung verwendet werden, wobei Verfahren, wie zum Beispiel die Flußcytometrie angewendet werden. Weiterhin können die Mikropartikel als Verstärker bei der Herstellung von Impfstoffen dienen, wobei Antigene enthaltende Mikropartikel in ein Versuchstier wie eine Maus oder ein Kaninchen injiziert werden, um eine verstärkte Immunantwort zur Erzeugung von Antikörpern für das Antigen auszulösen.
- Die hier beschriebenen Mikropartikel sind als feste Phasenpartikel in einer Untersuchung, wie zum Beispiel einer Enzym-verketteten Immunosorbant Prüfung (Analyse, Probe, assay), Dot-Blot oder Western Blot, zur Detektion eines bestimmten Ziels, wie zum Beispiel einer Zelle, eines Biomoleküls oder eines Medikamentes in einer biologischen Probe nützlich. Die für diesen Zweck vorgesehenen Mikropartikel sind aus Affinitätsmolekülen zusammengesetzt, die für das Zielmolekül spezifisch sind. Das Makromolekül ist zum Beispiel ein Immunoglobulin, ein Zellrezeptor oder eine Oligonukleotid-Sonde und an ein Untersuchungsrohr oder eine Mikrotiter-Platte gebunden.
- Zur Detektion oder Quantifikation eines interessierenden Zielmoleküls wird eine Probe mit einer die Mikropartikel enthaltenden Lösung kombiniert. Die Makromoleküle an den Mikropartikeln reagieren mit dem Zielmolekül. Die Mikropartikel werden von allen nichtgebundenen Komponenten der Probe getrennt, und die Mikropartikel, die gebundene Moleküle enthalten, werden mit bekannten Verfahren detektiert. Fluoreszierend gefärbte Mikropartikel sind besonders gut für die Flußcytometrie-Analyse mit allgemein bekannten Verfahren geeignet.
- Die hier beschriebenen Mikropartikel können auch bei visuellen Untersuchungen oder als Marken bei der Pathologie von Gewebeproben nützlich sein. Die Makromoleküle der für diese Anwendung vorgesehenen Mikropartikel sind für Biornoleküle spezifisch, die während eines bestimmten pathologischen Zustandes ausgedrückt werden und mit einer detektierbaren Marke markiert sind. Das Makromolekül ist zum Beispiel ein Immunoglobulin, ein Zellrezeptor oder eine Oligonukleotidsonde, die für eine abnorme Zelle, wie zum Beispiel eine sich schnell ausbreitende Zelle oder einen pathologischen Organismus, zum Beispiel einen Virus, spezifisch ist.
- Zur Feststellung eines pathogenen Zustandes wird eine Gewebeprobe mit einer die Mikropartikel enthaltenden Lösung kombiniert. Die markierten Makromoleküle an den Mikropartikeln reagieren dann mit den interessierenden Zielmolekülen, und die gebundenen Mikropartikel werden durch Detektion der Marke mittels bekannter Verfahren erfaßt.
- Die hier beschriebenen Mikropartikel sind auch als abbildende Mittel für die in vivo Lokalisation eines bestimmten Moleküls, einer Zellart oder eines pathologischen Zustandes in einer Weise geeignet, die ähnlich der oben in Bezug auf die Anwendung der Mikropartikel bei der Histopathologie beschriebenen ist. Die Makromoleküle an den für diese Anwendung vorgesehenen Mikropartikeln sind für Moleküle spezifisch, die durch eine bestimmte Zelle oder einen pathologischen Organismus ausgedrückt werden und mit einer detektierbaren Marke markiert sind. Das Makromolekül ist zum Beispiel ein Immunoglobulin, ein Zellrezeptor oder eine Oligonukleotidsonde, die für eine Tumorzelle oder einen pathologischen Organismus, zum Beispiel einen Virus, spezifisch ist.
- Die Mikropartikel werden entweder zur Erfassung eines pathologischen Zustandes oder zur Überwachung des Erfolges einer Therapie, wie zum Beispiel einer Chemotherapie oder einer Operation verwendet, um sicherzustellen, daß sich das abnorme Tumorgewebe verkleinert hat oder vollständig verschwunden ist. Für diese Anwendung wird einem Patienten eine Mikropartikel-Lösung vorzugsweise intravenös verabreicht. Den markierten Makromolekülen an den Mikropartikeln wird ausreichend Zeit gegeben, um das betreffende Organ oder den betreffenden Bereich des Körpers zu lokalisieren. Das Makromolekül reagiert mit einem Zielmolekül, das von einer Zelle oder einem untersuchten Organismus ausgedrückt wird, und die gebundenen Mikropartikel werden durch Detektion der Marke mit bekannten Abbildungsverfahren, wie zum Beispiel mit Röntgenstrahlen, aufgefunden.
- Die Mikropartikel sind vorteilhaft auch für die Therapie anwendbar, wenn sie sich aus einer vernetzten pharmazeutischen Verbindung oder einem vernetzten Träger, wie Albumin, zusammensetzen, der ein therapeutisches Mittel enthält. Die Mikropartikel können entweder zum langsamen Freisetzen des Mittels in dem Körper vorgesehen sein, oder es kann ein Affinitätsmolekül aufweisen, das für ein Zielgewebe oder einen Tumor spezifisch ist und einem Patienten zur gezielten Zuführung des therapeutischen Mittels, bei dem es sich um ein Antitumormittel, ein antivirales, ein antibakterielles, ein antiparasitisches oder ein antiarthritisches Mittel, ein Zytokin, Hormon oder Insulin handelt, direkt an die die Therapie erfordernde Stelle injiziert wird.
- Die Mikropartikel sind vorteilhaft auch als Hilfsmittel in der Forschung zur Reinigung eines Biomoleküls aus einer komplexen Mischung, als Reagens zur Detektion oder Quantifikation eines Biomoleküls, oder zur Erzeugung von Biomolekülen wie Antikörpern anwendbar.
- Zum Beispiel werden Mikropartikel, die aus einem Makromolekül wie einem Immunoglobulin zusammengesetzt sind, an einer Chromatographensäule angebracht und zur Immunoaffinitäts-Chromatographie verwendet, um eine Verbindung (ligand) aus einer komplexen Mischung zu trennen. Für einen Fachmann ist es klar, daß ein für die Anwendung in der Hochdruck- Flüssigkeitschromatographie vorgesehenes Mikropartikel zunächst an ein nichtkomprimierbares Kügelchen mit fester Phase oder eine Perle geheftet werden muß, so daß die Säulenpackung ihre feste Struktur auch unter Druck beibehält.
- Alternative dazu werden Mikropartikel, die ein markiertes Makromolekül oder eine Mischung aus markierten Makromolekülen aufweisen, die für verschiedene Zellen oder Zellrezeptoren spezifisch sind, zur Detektion von Anderungen der Anzahl von Zellen oder der Rezeptoren der Zelloberfläche als Antwort auf eine bestimmte Testbedingung unter Verwendung von Verfahren wie der Flußzytometrie verwendet.
- Weiterhin sind die Mikropartikel als Verstärker für die Erzeugung von Antikörpern nützlich, wobei Mikropartikel, die Antigene enthalten, einem Tier, wie zum Beispiel einer Maus oder einem Kaninchen zur Erzeugung von Impfstoffen oder einem Menschen zur Anregung einer Immunität gegenüber dem Antigen injiziert werden, um eine verstärkte Antwort auszulösen, mit der Antikörper gegen das Antigen erzeugt werden.
- Es wird auch ein Satz zur Herstellung von Mikropartikeln bereitgestellt. Der Satz enthält folgende Reagenzien: ein dehydrierendes Mittel und ein vernetzendes Mittel. Der Anwender des Satzes kann diesen zur bedarfsgerechten Zubereitung von Mikropartikeln verwenden, wobei der Anwender die Makromoleküle zuführt, die zu Mikropartikeln gebildet werden. Alternativ dazu kann der Satz auch ein oder mehrere Makromoleküle in Lösung oder in lyophilisierter Form zur Zubereitung der von dem Anwender gewünschten Mikropartikel enthalten. Die entstandenen Mikropartikel können dann für die Forschung oder für therapeutische oder diagnostische Zwecke gemäß obiger Beschreibung verwendet werden. Der Satz enthält vorzugsweise auch einen Puffer, wie eine Phosphat gepufferte Salzlösung mit einem löschenden Reagens wie Glycin, um nichtspezifische Bindungen durch das vernetzende Reagens zu blockieren. Eine detektierbare Marke oder ein vormarkiertes Makromolekül kann ebenfalls Bestandteil des Satzes sein, um ein Mittel zur Detektion des Vorhandenseins des Mikropartikels in einer Probe oder einem Patienten zur Verfügung zu haben.
- Die oben beschriebenen Polymer-Mikropartikel sowie die Verfahren sollen nachfolgend in Form von Beispielen erläutert werden.
- Mikropartikel werden durch Kombination von Gammaglobulin, Zubereitungen mit einem Molekulargewicht von eins bis fünf (MW von 10.000 bis 360.000) einer 5 bis 25%igen Polyvinylpyrrolidon-Lösung und einer Zubereitung mit konstantem Molekulargewicht (MW 3.500) einer 25%igen Polyethylenglykol-Lösung (beide werden gemäß obigem Beispiel 2 zubereitet) in Anwesenheit von Glutaraldehyd bei einem Reaktions-pH-Wertebereich von zwischen 6,9 und 7,75 nach folgendem Verfahren hergestellt. Die Mikropartikel waren in alkalischen und basischen Lösungen stabil.
- Fünf Polymermischungen, die jeweils eine Zubereitung aus Polyvinylpyrrolidon mit verschiedenem Molekulargewicht enthielten, wurden gemäß der Darstellung in der folgenden Tabelle 1 zubereitet. Jeder Polymermischung wurden 20 Mikroliter Glutaraldehyd (25%, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) zugesetzt. 1 Milliliter gereinigtes Ziegen- Gammaglobulin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), das in Übereinstimmung mit den in der WO 93/14110 von James E. Woiszwillo beschriebenen Verfahren gereinigt wurde, reagierte mit jeder der fünf Polymermischungen während schnellen Rührens Die Reaktionslösungen wurden 40 Minuten lang bei 20ºC gemischt und dann über Nacht bei 4ºC inkubiert.
- Alle fünf Reaktionslösungen wurden wieder auf 20º0 eingestellt. Jeder Lösung wurden 100 µl DL-Lysin (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) zugesetzt, und die Lösung wurde 90 Minuten lang bei 20ºC gemischt.
- Die Lösungen wurden dann 30 Minuten lang bei 20º0 mit 5.000 Udr/min zentrifugiert. Die aufschwimmenden Anteile wurden dekantiert und die Niederschläge in 1 ml einer Pufferlösung, die 1,0 ml Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) mit 0,2 % Tweenr (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) enthielt, resuspendiert.
- Mikroliter jedes resuspendierten Niederschlages reagierten dann 15 Minuten lang bei 20ºC mit 100 µl einer verdünnung von 1 : 2.000 eines anti-Ziegen IgG Peroxydase-Konjugats. Jeder Reaktionsmischung wurde 1 ml des PBS/Tween -Puffers zugesetzt. Die Mischungen wurden über Nacht bei 4ºC inkubiert.
- Die Proben wurden zentrifugiert, und 100 µl der jeweiligen aufschwimmenden Anteile wurden entfernt und reagierten mit 300 µl TM Blau. Die übrigen aufschwimmenden Anteile wurden vorsichtig dekantiert, und die Niederschläge wurden in 1 ml einer PBS/Tween Lösung resuspendiert.
- Die resuspendierten Proben wurde wieder zentrifugiert. 100 µl wurden entfernt und reagierten mit 300 µl TM Blau. Die aufschwimmenden Anteile wurden dekantiert, und die Niederschläge in 1 ml PBS/Tween resuspendiert. Ein 100 µl Aliquot des resuspendierten Niederschlags reagierte mit 300 µl TM Blau.
- Die resuspendierten Proben wurden wieder zentrifugiert, 100 µl wurden entfernt und reagierten mit 300 µl TM Blau, die aufschwimmenden Anteile wurden dekantiert und die Niederschläge in 1 ml PBS/Tween resuspendiert. Ein 100 µl Aliquot des resuspendierten Niederschlags reagierte mit 300 µl TM Blau. Die Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 1 und 2 gezeigt: Tabelle 1: Menge und Eigenschaften von Mikropartikeln, die mit fünf verschiedenen MW Zubereitungen von PVP hergestellt wurden: Tabelle 2: Relative Gammaglobulin-Konzentration in aufschwimmenden (Sup.) und niedergeschlagenen (Ppt.) Fraktionen nach der Erzeugung der Mikropartikel und dem Waschen:
- Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, daß bei allen fünf Lösungen, die Zubereitungen von PVP mit verscheidenem Molekulargewicht enthielten, in Anwesenheit von Glutaraldehyd Mikropartikel erzeugt wurden.
- Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, daß sogar nach dreirnaligem Waschen Gammaglobulin an den in dem Niederschlag vorhandenen Mikropartikeln angeheftet war.
- Mit dem ersten, resuspendierten Niederschlag der Reaktion #3 wurden drei Reaktionen durchgeführt, um die Wirkungen der sauren und basischen Lösungen auf die Stabilität der Mikropartikel zu analysieren.
- 100 Mikroliter des ersten, resuspendierten Niederschlags der Redaktion #3 wurden in drei Testrohre eingebracht. 200 Mikroliter deionisiertes Wasser wurden dem ersten Rohr zugesetzt. Anschließend wurden die Partikel beobachtet. 200 Mikroliter einer 1 N Essigsäure wurden dem zweiten Rohr zugesetzt. Die Partikel, die die gleiche Größe hatten, wie die Partikel in dem ersten Rohr, wurden beobachtet. 200 Mikroliter von 1% NaOH wurden dem dritten Rohr zugesetzt. Es wurden die Partikel, die die gleiche Größe wie diejenigen in dem ersten Rohr hatten, beobachtet.
- Alle drei Rohre wurden über Nacht bei 4ºC gehalten und am nächsten Tag erneut beobachtet. In den Rohren 1 und 2 hatte sich offenbar nichts verändert. In Rohr 3 schienen kleinere Partikel zu sein, als in den Rohren 1 und 2.
- Die Ergebnisse zeigten, daß saure oder basische pH- Werte die Stabilität der Partikel nicht veränderten.
- Anti-CEA (Carcinogenic Embryonic Antigen) Mikropartikel wurden gemäß der allgemeinen Beschreibung für Reaktion #3 und der detaillierten nachfolgenden Beschreibung hergestellt. Die erzeugten Mikropartikel wurden dann mit verschiedenen Konzentrationen von radioaktivem CEA kombiniert, um zu bestimmen, ob die in die Mikropartikel eingeführten anti-CEA Antikörper ihre Affinität für CEA-Liganden behalten hatten.
- Eine 14,3%ige Lösung von jeweils Polymer, Polyvinylpyrrolidon (MW 40.000) und Polyethylenglykol (MW 3.500), bezogen von der Firma Sigma, St. Louis, MO, wurde durch Zusatz von 14,3 g Polymer zu 100 ml destilliertem Wasser zubereitet. Der pH-Wert jeder 14,3 %igen Polymerlösung wurde auf einen Wert von näherungsweise 6,25 eingestellt. Die Polymerlösungen wurden zur Herstellung einer PVP/PEG Polymermischung im Verhältnis 1 : 1 gemischt.
- Als Kontrolle reagierte ein 0,45 ml Aliquot aus gereinigtem Ziegen anti-CEA Gammaglobulin mit 3,6 ml einer PVP/PEG Polymermischung durch Rühren während des Zusatzes der Polymermischung zu dem Gammaglobulin bei Abwesenheit von Glutaraldehyd. Die Reaktionsmittel wurden 30 Minuten bei 3ºC gehalten Die Reaktionsmittel (Reagenzien) wurden 60 Minuten bei 20ºC und 2.300 Udr./min. zentrifugiert. Die aufschwimmenden Anteile wurden dekantiert, und die Niederschläge in 0,9 ml Phosphat gepufferter Salzlösung resuspendiert.
- Die resuspendierten Niederschläge wurden mit 1,8 ml einer Polymermischung gewaschen, auf einen pH-Wert von 6,25 voreingestellt, 29 Minuten bei 3ºC stehen gelassen und 30 Minuten bei 20ºC mit 5.000 Udr./min. zentrifugiert.
- 0,9 ml gereinigtes Ziegen anti-CEA Gammaglobulin reagierte mit 2 ml der PVP/PEG Polymermischung mit einem pH-Wert von 6,25, die 20 µl Glutaraldehyd enthielt, durch Rühren, während die Polymermischung/Glutaraldehyd dem Gammaglobulin zugesetzt wurde. Die Reaktionsrnittel wurden 90 Minuten bei 20ºC gemischt. Die Reaktionsmittel wurden 60 Minuten bei 20ºC mit 2.300 Udr./min. zentrifugiert. Die aufschwirnmenden Anteile wurden dekantiert und der Niederschlag in 1 ml Phosphat gepufferter Salzlösung resuspendiert. 8 Mikroliter DL-Lysine wurden dem resuspendierten Niederschlag zugesetzt und gemischt. Die Reaktionsmittel wurden über Nacht bei 4ºC stehen gelassen.
- Die Reaktionsmittel wurden 30 Minuten lang bei 20º0 mit 5.000 Udr./min. zentrifugiert. Die Probe wurde 60 Stunden bei 4ºC gehalten und anschließend erneut zentrifugiert. Die aufschwimmenden Anteile schienen klar zu sein und wurden dekantiert. Der die anti-CEA Mikropartikel enthaltende Niederschlag wurde in 10 ml Phosphat gepufferter Salzlösung resuspendiert (1x).
- Radioaktives CEA (I¹²&sup5;) wurde mit Phosphat gepufferter Salzlösung verdünnt, die 10% flüssige Fischgelatine enthält. Das verdünnte I¹²&sup5;CEA hatte 39313 Zählwerte pro 100 µl.
- Zehn Reaktionsrohre, die jeweils 100 µl der verdünnten I¹²&sup5;CEA enthielten, wurden durch Zusatz der geeigneten Menge von resuspendierten anti-CEA Mikropartikeln gemäß den Angaben in Tabelle 3 zubereitet.
- Die radioaktiven CEA/ anti-CEA Mikropartikelmischungen in den Rohren 1 bis 5 wurde zwei Stunden in einem Kühlschrank inkubiert, während sie geschüttelt wurden. Die radioaktiven CEA/anti-CEA Mikropartikelmischungen in den Rohren 6 bis 9 wurden 15 Minuten bei Zimmertemperatur inkubiert, während sie geschüttelt wurden. Die Reaktionsmittel wurden dreimal mit Phosphat gepufferter Salzlösung gewaschen, die 10% flüssige Fischgelatine enthielt, eine Minute in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge zentrifugiert und dann erneut in Phosphat gepufferter Salzlösung suspendiert. Die Ergebnisse zeigen, daß die anti-CEA Mikropartikel immunologisch aktiv sind und mit CEA gemäß der numerischen Darstellung in Tabelle 3 und der grafischen Darstellung Figur 1 reagieren. Tabelle 3: Quantitative Analyse der Bindungen von anti-CEA Mikropartikeln an radioaktives CEA:
- Dieser Versuch zeigte den Einfluß des pH-Wertes auf die Fähigkeit, IgG Mikropartikel zu bilden.
- Eine Polymermischung aus PVP/PEG wurde gemäß der allgemeinen Beschreibung in Beispiel 2 (48% Gesamtpolymer) zubereitet und auf den in Tabelle 4 angegebenen pH-Wert eingestellt. 1 Milliliter jeder Lösung wurde in jede der sieben Zentrifugenrohre eingebracht: Tabelle 4: Eingestellter pH-Wert der PVP/PEG Mischung:
- 100 µl einer 5,0%igen Glutaraldehydlösung (Sigma, St. Louis&sub1; MO) in deionisiertem Wasser wurden jedem Rohr zugesetzt und gut vermischt.
- 300 µl einer 3x konzentrierten Probe von menschlichem IgG, gereinigt aus menschlichem Plasma, wurden während des Rührens gemäß obiger Beschreibung unter Beispiel 2 zugesetzt. Die Mischung wurde bei 20ºC eine Stunde gemischt, und das Material wurde 30 Minuten lang bei 20ºC mit 3.800 Udr./min. zentrifugiert. Die aufschwimmenden Anteile wurden dekantiert und die Partikel in 5 ml 0,5 M Glycine in 1x PBS Puffer gewaschen, dann 60 Minuten bei 2000 gemischt und 30 Minuten bei 20ºC mit 3.800 Udr./min. zentrifugiert. Die auf schwimmenden Anteile wurden dekantiert, und die Partikel in 5,0 ml von 0,5 M Glycine in 1x PBS gewaschen.
- Nach dem Zusatz von gereinigtem IgG zu den Rohren und 20 Minuten langem Mischen wurde ein Trend im Hinblick auf die Gesamtgröße beobachtet. Wenn sich der pH-Wert der PVP/PEG Mischung erhöhte, vergrößerte sich auch die Gesamtmenge.
- Wenn sich der pH-Wert der PVP/PEG Mischung erhöhte, wurden die Niederschläge kleiner und feuchter und nahmen eine orangene Farbe an. Eine beträchtliche Änderung dieser Eigenschaften zeigte sich bei einem pH- Wert von 6,6. Rohr #7 mußte sehr vorsichtig behandelt werden, da sich der Niederschlag nicht an der Wand des Rohres anheftete. 90 % der auf schwimmenden Anteile wurden mit einer auswechselbaren Pipette vorsichtig entfernt.
- Es besteht ein direkter Zusammenhang zwischen dem pH- Wert der PVP/PEG Mischung und der Größe der entstandenen Partikel. Wenn sich der pH-Wert vergrößerte, vergrößerten sich auch die Partikel. Bei einem pH-Wert von 6,6 waren die Partikel wesentlich größer als bei einem pH-Wert von 5,8.
- Bei einem pH-Wert von 6,6 und größer hafteten die Niederschläge nicht an der Wand des Rohres an und glitten an der Seite des Rohres relativ leicht herab. Bei einem Ansteigen des pH-Wertes wechselten die Niederschläge ihre Farbe von gelb auf orange.
- Identisch mit der ersten Resuspension.
- Die Partikel wurden auf Zimmertemperatur gebracht, gut gemischt und dann 30 Minuten lang bei 20ºC und 2.600 Udr./min. zentrifugiert. Die aufschwimmenden Anteile wurden dekantiert und die Niederschläge in 5,0 ml 0,5 M Glycine in 1 x PBS Puffer bei einem pH-Wert von 5,6 resuspendiert. Der Waschvorgang wurde dann drei weitere Male wiederholt, bis die aufschwimmenden Anteile klar waren
- Wenn der pH-Wert der PVP/PEG Mischung von 9,2 auf 4,6 abfällt, werden die Größen der durch die Vernetzungswirkung von Glutaraldehyd gebildeten Partikel geringer, und die Größen werden gleichförmiger
- 1. 60 Milligramm Hühnerei-Albumin wurden in 2 ml einer Polymermischung aus PVP/PEG, die gemäß Beispiel 2 zubereitet wurde, aufgelöst. Der pH-Wert wurde mit 1 N HCl auf 4,5 eingestellt. 200µl Cappell-Affinitätsgereinigte Kaninchen-anti-Ziegen IgG Meerrettich- Peroxydase (HRP)-Konjugat wurde zugesetzt.
- 2. Die Mischung wurde 30 Minuten lang im Kreis gedreht.
- 3. Eine 100%ige Glutaraldehyd-Lösung wurde 1 : 4 verdünnt. 200µl davon wurden der Mischung zugesetzt.
- 4. Die Mischung wurde 30 Minuten lang im Kreis gedreht.
- 5. Die Mischung wurde 30 Minuten lang bei 20ºC und 1.500 Udr. /min. zentrifugiert. Die auf schwimmenden Anteile wurden entfernt.
- 6. Der Niederschlag wurde in Glycinpuffer resuspendiert und zweimal durch 10 Minuten langes Zentrifugieren bei 1.500 Udr./min. und 20ºC gewaschen.
- 7. Der Niederschlag wurde in 0,15 M Tris Salzlösung mit einem pH-wert von 7,4, die bei einem Gesamtvolumen von 2 ml 1% Fischgelatine und Partikel enthielt, resuspendiert.
- 1. 4 Tropfen des HRP Substrates wurden in 2 Glasrohre eingebracht.
- 2. 4 Tropfen des resuspendierten Niederschlages aus obigem Schritt 7 wurden einem Rohr zugesetzt und vermischt
- 3. 4 Tropfen der auf schwimmenden Anteile aus obigem Schritt 5 wurden in das andere Glasrohr eingegebenen und vermischt.
- 1. Das die aufschwirnmenden Anteile aus Schritt 5 enthaltende Rohr war klar (keine Färbung).
- 2. Das den resuspendierten Niederschlag aus Schritt 7 enthaltende Rohr hatte innerhalb von fünf Minuten eine marineblaue Farbe, die anzeigte, daß die Partikel mit HRP markiert worden waren.
- Fluoreszenz-markierte anti-Human Chorionic Gonadotropin (anti-HCG) Mikropartikel wurden einer Balb/c Maus injiziert, um die Beseitigung zu überprüfen:
- Einer weiblichen Maus mit einem Gewicht von 35 g wurde 5 Minuten lang Phenobarbital injiziert. Der ventrale Hohlraum wurde operativ freigelegt, und der Aorta wurden unter Verwendung einer 27 1/2 Meßnadel 100 µl eines fluoreszierend markierten anti-HCG injiziert.
- Fünf Minuten später wurden 50 µl Blut entnommen.
- Zehn Minuten später wurden 50 µl Blut entnommen.
- Es soll darauf hingewiesen werden, daß das Tier bei der Entnahme des Blutes lebte, sein Herz jedoch stark schlug.
- Die Maus wurde anschließend durch zervikale Verrenkung getötet.
- 1. Ein Tropfen Blut (5 und 10 Minuten) wurde auf einem Glasschieber in eine dafür vorgesehene Vertiefung eingebracht. Die Probe wurde mit einer gleitenden Glasabdeckung bedeckt. Auf die verschiebbare Abdeckung wurde ein Tropfen Öl aufgebracht.
- 2. Die Blutprobe wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop mit hoher Leistung untersucht.
- 3. In der 5 Minuten-Probe wurde um die Zellen eine starke Fluoreszenz beobachtet, die anzeigte, daß die Mikropartikel durch das Tier nicht schnell absorbiert wurden.
- 4. In der 10 Minuten-Probe wurde eine schwache Fluoreszenz beobachtet.
- Beispiel 6: Einfluß der Konzentration der Polymermischung auf das Entstehen von fluoreszierend markierten menschlichen IGG Mikropartikeln
- Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die Wirkungen der Konzentration einer PVP/PEG Polymermischung auf das Entstehen von Antikörper-Mikropartikeln zu untersuchen.
- Eine bestimmte Menge einer PVP/PEG Polymermischung wurde gemäß der Beschreibung unter Beispiel 2 zubereitet, so daß eine Polymermischung mit einer Polymerkonzentration von 53,3% entstand, die auf einen pH-Wert von 4,8 eingestellt wurde. Polymerverdünnungen wurden gemäß den Angaben in der nachfolgenden Tabelle 5 unter Verwendung von 0,1 M Natriumacetat mit einem pH- Wert von 5,0 hergestellt: Tabelle 5: Volumen- und Prozentangaben der Polymermischung:
- 1 ml jeder der in Tabelle 5 genannten Verdünnungen wurde in ein Zentrifugenrohr eingebracht. Jedem Rohr wurden dann 100 µl einer 5%igen Glutaraldehyd-Lösung zugegeben&sub1; die durch Zusatz von 400 µl 25%iger Glutaraldehyd-Lösung zu 2 ml H&sub2;O und anschließendes Mischen zubereitet wurde. Die Zusammensetzung aus Polymermischung und Glutaraldehyd-Lösungen wurde gründlich verrührt.
- Die Rohrinhalte reagierten dann mit 300 µl fluoreszierend markiertem menschlichen IgG. Der gereinigte menschliche Antikörper wurde in einer 0,1 M Glycin-Lösung in PBS-Puffer bei einem pH-Wert von 11,0 dreifach konzentriert und mit Fluorescein-Isothiozyanat in dem 0,1 M Glycin-Puffer bei einer Konzentration von 3 mg/ml markiert. Der Antikörper wurde den Polymermischungsverdünnungen während des Rührens zugesetzt, und die Rohrinhalte wurden eine Stunde lang gemischt. Anschließend folgte eine 30 minütige Zentrifugation bei 20ºC.
- Nach der Zenrifugation wurden die aufschwimmenden Anteile dekantiert und die Niderschläge in 5 ml 0,5 M Glycin in PBS resuspendiert. Die Niederschläge wurden aufgebrochen und gut geschüttelt. Sie wurden dann 30 Minuten bei 3000 mit 2.500 Udr./min. zentrifugiert. Dieser Waschvorgang wurde viermal wiederholt.
- Jedes Rohr hatte seit Beginn der Reaktion eine andere Erscheinung. Das den 5,3% Polymer enthaltende Rohr hatte nur einen leichten Niederschlag, von dem einiges an den Wänden des Rohres zusarnmengeklumpt war. Das den 53,3% Polymer enthaltende Rohr zeigte sehr feine Partikel, die nicht zusammenklebten oder sich an die Wände des Rohres hefteten.
- Insgesamt wurde bei ansteigender Konzentration des Polymers das Niederschlagsmaterial feiner und weniger klebrig. Das feste Reaktionsmaterial in der Natriumacetat-Kontrollprobe war klein und klebrig.
- Nach der Zentrifugation zeigte sich, daß die Größe des Niederschlags in direkt proportionalem Verhältnis zu der Polymerkonzentration anstieg. Die Helligkeit der orangenen Farbe der Niederschläge war umgekehrt proportional zu der Polymerkonzentration.
- Die Kontrollniederschläge waren sehr klein und zeigten eine helle orangene Farbe wie die Rohre mit den sehr geringen Polymerkonzentrationen. Die Leichtigkeit, mit der die Niederschläge in dem 0,5 M Glycin-Waschpuffer aufgebrochen wurden, wurde auch in Zusammenhang mit der Polymerkonzentration gebracht. Der Niederschlag in dem die nur 5,3 %ige Polymermischung enthaltenden Rohr war klebrig und schwierig aufzubrechen, in aufeinanderfolgenden Rohren wurden die Partikel jedoch weniger klebrig. Bei einer Polymerkonzentration von 31,8 % oder mehr konnten die Partikel sehr leicht getrennt werden.
- Nach dem ersten Waschvorgang und der Zentrifugation war immer noch ein Gradient der Farbhelligkeit in den Niederschlägen vorhanden, auch wenn die Unterschiede nicht mehr so groß waren. Die aufschwirnrnenden Anteile hatten eine helle orangene Farbe, da das Fluorescein- Isothiozyanat aus der Probe ausgewaschen wurde. Nach dem dritten Waschvorgang waren die aufschwimmenden Anteile klar und die Farbe der Niederschläge gleichförmig. Die Unterschiede hinsichtlich der Größe der Niederschläge veränderten sich nicht.
- Die Polymerkonzentration spielt eine wesentliche Rolle bei der Festlegung der Eigenschaften von Antikörper- Partikeln, die mit der Polymermischung hergestellt werden. Polymerkonzentrationen von 40% und mehr führen zu sehr feinen Partikeln, die nicht kleben. Um so höher die Konzentration der Polymere in der Polymermischung ist, um so größer ist außerdem die Anzahl von Antikörper-Partikeln, die erzeugt werden können.
- Dieses Experiment wurde durchgeführt, um die Einflüsse des pH-Wertes der Polymermischung auf die Erzeugung von Antikörper-Partikeln zu bestimmen.
- Acht Zentrifugenrohre wurden jeweils mit 1 ml eines Aliquots von Ziegenserum gefüllt. Das Serum wurde 15 Minuten mit 1,8% Triton / 3% Brij (Sigma, St. Louis, MO) -Lösung inkubiert. Darauffolgte eine Reaktion mit 2 ml einer 40%igen Polymermischung. Die Zugabe der Polymermischung erfolgte während des Rührens Der Inhalte der Rohre wurde 30 Minuten lang vermischt. Die Rohre wurden dann 30 Minuten lang bei 20ºC mit 3.600 Udr./min. zentrifugiert. Die aufschwimmenden Anteile wurden dekantiert und die Niederschläge in 1 ml 0,5 M Imidazol (Baker Chemical Co.) resuspendiert. Alle Proben resuspendierten leicht und klar.
- Nach einer Inkubation von 15 Minuten in der Imidazol- Lösung wurde den Proben während des Rührens 1 ml der Polymermischung zugesetzt. Die Rohrinhalte wurden 30 Minuten lang vermischt und dann 30 Minuten lang bei 20ºC mit 3.600 Udr./min. zentrifugiert. Die aufschwimmenden Anteile. wurden dekantiert, und die Niederschläge wurden einfach und klar in 1 ml deionisiertem Wasser resuspendiert. Die Proben reagierten mit einem pH Gradient der Polymermischung, wobei der pH-Wert nach unten mit Salzsäure und nach oben mit 3 M Imidazol eingestellt wurde. Die eingestellten pH-Werte sind in der folgenden Tabelle 6 angegeben: Tabelle 6: Eingestellte pH-Werte für jede Probe:
- Jedem Rohr wurde 1 ml der Polymermischung mit eingestelltem pH-Wert zugesetzt. Anschließend wurde 10 Minuten lang gemischt. Nach dem Mischen wurden in jedes Rohr 40 µl von 25% Glutaraldehyd, 1 : 10 mit deionisiertem Wasser verdünnt, eingebracht. Die Rohrinhalte wurden wieder 10 Minuten lang gemischt und Minuten lang bei 20ºC mit 3.600 Udr./min. zentrifugiert. Die Rohre wurden dann dekantiert und die Partikel in 1 ml 1 x PBS resuspendiert.
- Nach der Zentrifugation zeigten die Proben einen klaren Gradient im Verhältnis zu dem pH-Wert sowohl im Hinblick auf die Größe, als auch die Farbe. Vor der Resuspension in 1 x PBS waren die Niederschläge in den Proben 1, 2 und 7 geringfügig kleiner, als diejenigen in den anderen Rohren. In der Probe mit dem pH-Wert von 9,3 befand sich kein sichtbarer Niederschlag, da das stark alkalische Millieu die Fähigkeit der Polymermischung, Proteine auszufällen, unterdrückt. Die Proben mit den sauren pH-Werten waren weiß, wobei die Proben über dem Gradient zunehmend gelb-orange wuchsen. Auch die Partikelgröße verhielt sich direkt proportional zu dem pH-Wert, wobei die Partikel in Probe 1 sehr fein waren. Mit steigendem pH-Wert wuchsen die Partikel größer und neigten in stärkerem Maße zur Bildung von Klumpen.
- Die Größe der Antikörper-Partikel kann in einfacher Weise durch Veränderung des pH-Wertes der Polymermischung beeinflußt (gesteuert) werden. Bei einem hohen pH-Wert bildet Glutaraldehyd sehr starke Bindungen mit den Aminogruppen der Proteine. Dies ist der Grund für die geib-orangene Farbe und die Gesamt- Klebrigkeit der zunehmend basischen Proben. Bei alkalischen pH-Werten sind die Einflüsse von Glutaraldehyd jedoch wesentlich vermindert. Es können sich zwar immer noch Partikel bilden, diese sind jedoch wesentlich feiner und haben wesentlich geringere Neigung zur Bildung von Klumpen als diejenigen Partikel, die mit der basischen Polymermischung hergestellt wurden.
- Dieser Versuch wurde ausgeführt, um die Wirkung einer Erhöhung der Menge von Glutaraldehyd auf die Erzeugung von IgG Mikropartikeln zu zeigen.
- In sieben Zentrifugenrohre wurde 1,0 ml der in Beispiel 2 beschriebenen Polymermischung, die 48% Gesamtpolymere bei einem pH-Wert von 4,8 enthielt, eingebracht. Außerdem wurden die verschiedenen, in Tabelle 7 genannten Volumina von Glutaraldehyd jedem Rohr zugesetzt: Tabelle 7: Konzentration von Glutaraldehyd in jedem Rohr:
- Die Inhalte der Rohre wurden gut vermischt, und es wurden 300 µl gereinigtes IgG, 3x konzentriert in 0,1 M Glycin, mit einem pH-Wert von 11,2, wobei der Puffer 2 ng/ml Fluorescein-Isothiozyanat (FITC) enthielt, jedem Rohr zugegeben. Die Inhalte aller Rohre wurden eine Stunde lang bei 20ºC gemischt und anschließend 30 Minuten lang bei 20ºC mit 3.600 Udr./min. zentrifugiert.
- Die aufschwimrnenden Anteile wurden dekantiert, und die Partikel wurden in 5,0 ml 0,5 M Glycin in 1 x PBS Puffer bei einem pH-Wert von 7,0 gewaschen. Anschließend wurde 30 Minuten lang bei 20ºC gemischt sowie 30 Minuten bei 20ºC mit 2.600 Udr./min. zentrifugiert. Dieser Waschvorgang wurde zwei weitere Male wiederholt.
- Die Partikel wurden bei 400 in 5,0 ml 0,5 M Glycin in 1 x PBS Puffer bei einem pH-Wert von 7,0 gelagert.
- Mit der Erhöhung der Menge von Glutaraldehyd wurde die Anzahl von Partikeln sowie eine stärkere Orangefärbung festgestellt.
- Die Partikel wurden wiederholt gewaschen, bis die aufschwimmenden Anteile klar erschienen.
- Die abschließende Zentrifugation ergab Kügelchen, die nicht vollständig an der Wand des Rohres anklebten. Die aufschwimmenden Anteile mußten vorsichtig mit einer austauschbaren Pipette entfernt werden, wobei 1,0 ml des Puffers zurückgelassen wurde.
- Es besteht eine direkte Beziehung zwischen dem Ansteigen der der Polymermischung (48% Gesamtpolymere) zugesetzten Menge von Glutaraldehyd und dem Ansteigen der Menge von erzeugten Partikeln. Die Menge von Glutaraldehyd (zwischen 2 µl und 200 µl einer 25%igen wässrigen Lösung) hatte offenbar keinen Einfluß auf eine Zunahme oder Abnahme der Größe der Partikel.
- Dieses Experiment wurde ausgeführt, um menschliche chorionic gonadotropin (HCG) spezifische monoklonale Antikörper-Mikropartikel mit einer PVP/PEG Polymermischung und verschiedenen Konzentrationen von Glutaraldehyd herzustellen und die Fähigkeit der Mikropartikel zur Bindung von HCG angezeigten Antigenen bei einer Immunitätsprüfung (assay) zu zeigen.
- Es wurden zwei Proben mit 1 ml gereinigten HCG Antikörpern, die gemäß den Verfahren unter Beispiel 2 zubereitet wurden, erwärmt, zusammengebracht und gut gemischt. Wie in der nachfolgenden Tabelle 8 angegeben ist, entstanden zunehmend geringer werdende prozentuale Lösungen von Glutaraldehyd (von einer 25% wassrigen Lösung). Tabelle 8: Endgültiger prozentualer Anteil von Glutaraldehyd in jedem Rohr:
- Es wurden 150 µl der zusammengebrachten HCG Probe jedem Rohr zugesetzt, das 100 µl der prozentualen Glutaraldehyd-Lösungen enthielt und dabei gerührt. Es wurde 45 Minuten lang bei Zimmertemperatur gemischt.
- Es wurden 0,5 ml der Polymermischung (40% Gesamtpolymere mit einem pH-Wert von 6,6) schnell jedem Rohr zugesetzt und 30 Minuten lang bei 20ºC vermischt. Anschließend wurde drei Minuten lang bei 400 mit 3.500 Udr./min. zentrifugiert. Die aufschwimmenden Anteile wurden dekantiert. Es wurden 2 mis 0,5 M Glycin in 1 x PBS mit einem pH-Wert von 7,0 in jedes Rohr eingebracht und 30 Minuten lang bei 20ºC gemischt. Dann wurde 30 Minuten lang bei 4ºC mit 3.000 Udr./min. zentrifugiert. Die auf schwimmenden Anteile wurden dekantiert und die Partikel in 2,0 ml 01,5 M Glycin in 1 x PBS resuspendiert. Es wurde schnell und kurz gemischt. Anschließend wurde 30 Minuten lang bei 4ºC mit 3.000 Udr./min. zentrifugiert. Dieser Waschvorgang wurde ein weiteres Mal wiederholt. Die Mischung wurde dann bei 4ºC über Nacht gelagert.
- Die Partikel wurden bei 3.000 Udr./min. und 4ºC für 12 Minuten zentrifugiert. Die aufschwimmenden Anteile wurden dekantiert, und die Partikel in 2,0 ml 1 x PBS resuspendiert.
- Hinsichtlich der Größe der Partikel wurde ein bestimmter Trend festgestellt. Mit dem Absinken der Glutaraldehyd-Konzentration verringerte sich auch die Anzahl der Partikel, ihre Größe nahm jedoch zu. In Rohr #7 (Kontrollrohr) wurden keine Partikel beobachtet.
- Es wurden 50 µl jeder Probe, die die wie oben zubereiteten Partikel enthielt, in drei Sätze mit sechs Rohren (A, B, C) (18 Rohre insgesamt) eingebracht.
- Anschließend wurden 25 µl HCG Tracer (jodiniertes HCG Antigen, Becton Dickinson, San Jose, CA) in die Rohre 1 bis 6 des Satzes A sowie ein weiteres Rohr eingebracht, das die HCG Antikörper zur Kontrolle der Gesamtzählungen enthielt.
- Weiterhin wurden 25 µl follikel stimulierter Hormon (FSH)-Tracer (jodiniertes FSH Antigen) in die Rohre 1 bis 6 des Satzes B sowie ein weiteres Rohr eingebracht, das die FSH Antikörper zur Kontrolle der Gesamtzählungen enthielt.
- 25 µl Estradiol Tracer (jodiniertes Estradiol Antigen) wurde in die Rohre 1 bis 6 in Satz C sowie ein weiteres Rohr eingebracht, das die Estradiol Antikörper zur Kontrolle der Gesamtzählungen enthielt.
- Alle Rohrinhalte wurden kurz durchgerührt und 60 Minuten bei Zimmertemperatur abgestellt. Anschließend wurden 2,0 mls deionisiertes Wasser zugesetzt und gemischt und 30 Minuten lang bei 3.000 Udr./min. zentrifugiert. Die Rohre wurden vorsichtig dekantiert (näherungsweise 100 Mikroliter Restwasser wurden in jedem Rohr belassen).
- Für alle Rohre wurden eine Minute lang Zählungen in einem Scintillationszähler durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 9 aufgeführt. Tabelle 9: Bindung von radioaktivem Antigen an anti-HCG Mikropartikel:
- In dem Maße, in dem die Konzentration von Glutaraldehyd vermindert wird, werden weniger anti-HCG monoklonale Antikörper-Mikropartikel gebildet, wobei diese Partikel allerdings größere Abmessungen haben. Die anti-HCG Mikropartikel können jodiniertes HCG Antigen in einer Immunoprüfung binden. Die anti-HCG Mikropartikel können jedoch keine nichtspezifischen Bindungen mit anderen jodinierten Antigenen wie FSH und Estradiol in einer Immunoprüfung eingehen.
- Dieser Versuch wurde ausgeführt, um Tetanus Toxoid Mikropartikel mit einer Polymermischung aus PVP und PEG sowie Glutaraldehyd zuzubereiten.
- Es wurden 1,0 ml einer 54 %igen Polymermischung aus PVP/PEG in zwei Zentrifugenrohre eingebracht. In das eine Rohr wurden 100 µl Glutaraldehyd (25% wässrige Lösung) und in das andere Rohr 10 µl Glutaraldehyd eingegeben und gründlich verrührt.
- Beide Rohre erhielten eine 0,5 ml Tetanus Toxoid Impfung (110 mg/ml) (Dept. of Public Health) und wurden anschließend gründlich gerührt.
- Anschließend wurde vier Stunden und 15 Minuten bei Zimmertemperatur gemischt. Dann wurde 30 Minuten bei 4ºC mit 3.000 Udr./min. zentrifugiert. Die aufschwimmenden Anteile wurden dekantiert und die Partikel in 2,0 ml 015 M Glycin in 1 x PBS Puffer resuspendiert. Über Nacht erfolgte dann eine Ablagerung bei 4ºC.
- Der Waschvorgang wurde zwei weitere Male wiederholt. Die Partikel wurden schließlich in 0,5 ml 1 x PBS Puffer resuspendiert.
- Die Reaktion mit 100 µl Glutaraldehyd enthielt mehr Partikel, als die Reaktion mit 10 µl Glutaraldehyd. Die Partikel aus beiden Reaktionen hatten sehr ähnliche Größe. Dem Auge erscheinen die Partikel sehr klein.
- Dieser Versuch wurde ausgeführt, um die Ausbildung von Rinderserum Albumin (BSA) Mikropartikeln mit einer Polymermischung aus PVP/PEG und Glutaraldehyd zu zeigen und die Wirkung von verschiedenen Volumina von Glutaraldehyd zu untersuchen, die in diesem Verfahren verwendet werden.
- Es wurden 110 mg BSA in 11 ml 0,1 M Tris Basis mit einem pH-wert von 9,0 eingebracht. Dann wurden 11 mg FITC zugesetzt, der pH-Wert auf 9,5 eingestellt, wobei mit der Basis 30 Minuten bei 20ºC gemischt wurde, um fluoreszierend markiertes BSA zu bilden.
- Anschließend wurden acht Rohre mit jeweils 1 ml der Polymermischung (pH-Wert 5,0, 48% Gesamtpolymere) bereitgestellt und die in der nachfolgenden Tabelle 10 genannten Mengen von Glutaraldehyd (25% wässrige Lösung) zugesetzt. Tabelle 10: Konzentration von Glutaraldehyd pro Rohr
- In jedem Rohr wurden Rinderserum Albumin Mikropartikel gebildet. Wenn die Menge von Glutaraldehyd vermindert wurde, wurden zusätzlich zu kleinen feinen Partikeln, die bei allen Mengen von Glutaraldehyd (1 µl bis 200 erzeugt wurden, Anhäufungen mit größeren Abmessungen gebildet. Bei einer Erhöhung der Menge von Glutaraldehyd erhöhte sich auch die Anzahl von kleinen feinen Partikeln.
- Dieser Versuch wurde durchgeführt, um Insulin Mikropartikel mit einer Polymermischung aus PVP und PEG sowie Glutaraldehyd zuzubereiten, die Konzentration der entstandenen Mikropartikel zu messen und ihre immunologische Aktivität zu prüfen.
- In 3,0 ml 3 M HCl wurden 30 mg Insulin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) aus Rinderpankreas eingebracht, um das getrocknete Insulin löslich zu machen. Der pH-Wert wurde in 25 µl Schritten mit 2 N NaOH auf zwischen 8,4 und 9,0 eingestellt.
- In drei Zentrifugenrohre wurde ein 1,0 ml Aliquot einer 54%igen Polymermischung aus PVP/PEG mit einem pH-Wert von 5,0 eingebracht. Jedem Rohr wurden die folgenden Mengen von Glutaraldehyd (Grad II, 25%ige wässrige Lösung, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) zugesetzt: 25 µl Glutaraldehyd in Rohr A, 50 µl Glutaraldehyd in Rohr B, 100 µl Glutaraldehyd in Rohr C.
- Jedem Rohr wurde während des Rührens 1,0 ml des löslich gemachten Insulins zugesetzt. Es wurde sechs bis acht Stunden bei 20ºC gemischt. Anschließend wurden die Rohre über Nacht stehen gelassen.
- Die Partikel wurden neun Mal unter Verwendung von 5,0 ml Lysin-Lösung mit einem pH-Wert von 9, 4, die 1 mg/ml Natriumazid (10mg Lysin / ml deionisiertes Wasser) enthält, gewaschen. Der Waschvorgang umfaßte einen Zusatz von 5,0 ml Lysin-Lösung zu den Partikeln sowie ein kurzes aber gründliches Mischen. Anschließend wurde 30 Minuten lang bei 20ºC mit 2.300 Udr./min. zentrifugiert. Die aufschwimmenden Anteile wurden aspiriert und der Vorgang wurde wiederholt. Die gesammelten Partikel wurden über Nacht bei 4ºC in einer Lysin-Lösung stehen gelassen.
- Die zentrifugierten Partikel, die aufschwimmenden aspirierten Anteile und die resuspendierten Partikel wurden in 5,0 ml einer 1 x Phosphat gepufferten Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,0 eingebracht. Die Resuspensionen hatten folgende pH-Werte: Rohr A einen pH-Wert von 9,2, Rohr B einem pH-Wert von 9,2 und Rohr C einen pH-Wert von 8,8.
- Die zentrifugierten Partikel, die aufschwimmenden aspirierten Anteile und die resuspendierten Partikel wurden in 5,0 ml einer 1 x Phosphat gepufferten Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,0 eingebracht. Die Resuspensionen hatten folgende pH-Werte: Rohr A einen pH-Wert von 8,0, Rohr B einem pH-Wert von 7,4 und Rohr C einen pH-Wert von 7,2.
- Die zentrifugierten Partikel, die aufschwimmenden aspirierten Anteile und die resuspendierten Partikel wurden in 5,0 ml einer 1 x Phosphat gepufferten Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,0 eingebracht. Die Resuspensionen hatten endgültig folgende pH-Werte: Rohr A einen pH-Wert von 7,4, Rohr B einem pH-Wert von 7,2 C und Rohr C einen pH-Wert von 7,2.
- Die erzeugten Partikel waren sehr klein und fein. Während der Zentrifugation der Lysin-Lösung konnten sich die Partikel nicht vollständig verdichten. Nach dem Waschen mit der Phosphat gepufferten Salzlösung konnten die Partikel in einem größeren Maße verdichtet werden und bildeten auch Anhäufungen von Partikeln.
- In Rohr C befanden sich die meisten Partikel, während Rohr B mehr Partikel enthielt, als Rohr A. Somit stieg die Menge der gebildeten Partikel mit der Menge des jedem Rohr zugesetzten Glutaraldehyds.
- Die immunologische Aktivität der Insulin-Mikropartikel wurde durch Messen der Fähigkeit der Mikropartikel zur Bindung von Anti-Schafsinsulin in einer Schaf Anti- Insulin Peroxydaseprüfung untersucht.
- Es wurden drei Reihen von jeweils vier Rohren bereitgestellt. In die entsprechenden Rohre jeder Reihe wurden gemäß der Angabe in Tabelle 13 folgende Volumina von Insulinpartikeln aus jedem der oben genannten Rohre A, B und C eingebracht.
- Jedem Rohr wurde zur Erzielung eines endgültigen Volumens von 1,0 ml die geeignete Menge von 1 x Phosphat gepufferter Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,0 zugesetzt. Alle Rohrinhalte wurden kurz und gründlich gemischt. Dann wurde 100 µl von Schaf anti- Insulin Peroxydase (Biodesign International, Kennebunkport, ME, 5 mg/ml Protein) zugesetzt und gut gemischt. Die inkubierten Rohre wurden vier Stunden und 10 Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen und über Nacht bei 4ºC gelagert.
- Sämtliche Rohre aller Reihen wurden 30 Minuten lang bei 20ºC mit 3.000 Udr./min. zentrifugiert. Vorsichtig wurden nur 90% der aufschwimmenden Anteile entfernt, um einen unbeabsichtigten Verlust von Partikeln zu vermeiden. 1,0 ml 0,2% Tween Reinigungsmittel wurde in 1 x Phosphat gepufferter Salzlösung den aspirierten Rohren zugesetzt und durch Rühren vermischt. 100 µl der jeweiligen aufschwimmenden Anteile reagierte mit 0,5 ml ohromogen TM Blau (Tetramethylbenzidin, Center for Diagnostic Products, Milford, MA). Alle aufschwimmenden Anteile waren positiv. Dieser gesamte Waschvorgang wurde zwei weitere Male wiederholt, um die überschüssige ungebundene Schaf Anti-Insulin Peroxydase vollständig zu entfernen.
- Nach dem letzten Waschvorgangs waren 90% der aufschwimmenden Anteile aspiriert, und 50 µl der Partikel wurden aus jedem Rohr entfernt und reagierten mit 0,2 ml des TM Blau Chromogens.
- Die in der folgenden Tabelle 12 genannten Ergebnisse zeigen, daß die Insulin-Mikropartikel das Anti-Schaf Insulin binden können. Dies bedeutet, daß diese Partikel immunologisch aktiv sind. Tabelle 12: Fähigkeit der unter Verwendung verschiedener Mengen von Glutaraldehyd gebildeten Insulin-Partikel zur Bindung von Anti-Schaf Insulin:
- Die immunologische Aktivität der Insulin-Mikropartikel wurde durch Messung der Fähigkeit der Mikropartikel, anti-Schaf Insulin zu binden, mit einer Inhibitionsprüfung bestimmt.
- Zwei Reihen von fünf Rohren wurden jeweils wie folgt bereitgestellt. Es wurden die nachfolgend genannten Mengen von Insulin-Partikeln aus den obigen Reaktionen A und C gemäß der Angabe in der nachfolgenden Tabelle 14 in geeignete Zentrifugenrohre eingebracht.
- Allen Rohren in beiden Reihen wurden 100 µl Immunophase Insulin Tracer (jodiniertes Insulin, Ciba Corning) zugesetzt. Es wurde gerührt, 1,0 µl Immunophase Insulin Antikörper (Ciba Corning) zugegeben und wieder gerührt. Die Rohre wurden dann vier Stunden und 30 Minuten bei Zimmertemperatur stehen gelassen. Anschließend wurde 30 Minuten lang bei 20ºC mit 3.000 Udr. /min. zentrifugiert.
- Die Rohre wurden eine Minute lang in einem Scintillationszähler ausgezählt.
- Die in Tabelle 13 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß bei Verwendung einer Inhibitionsprüfung die Insulin- Mikropartikel Anti-Schaf Insulin binden können, wodurch angezeigt wird, daß diese Partikel aktiv sind. Tabelle 13: Fähigkeit von unter Verwendung verschiedener Mengen von Glutaraldehyd gebildeter Insulin-Partikel, Anti-Schaf Insulin bei Anwesenheit von radioaktivem Insulin zu binden:
- Dieser Versuch diente zur Bestimmung der in vivo Wirkungen einer Immunisierung mit Tetanus Toxoid Mikropartikeln.
- Der Ablauf, die Ergebnisse und die Schlußfolgerungen des Versuchs lauten wie folgt:
- Tetanus Toxoid Mikropartikel wurden gemäß der allgemeinen Beschreibung unter Beispiel 10 wie folgt zubereitet:
- Eine 27% Lösung aus jeweils Polymer, Polyvinylpyrrolidon (MW 40.000) und Polyethylenglykol (MW 3.500), erhältlich von der Firma Sigma, St. Louis, MO, wurde durch Zusatz von 27 g Polymer zu 100 ml destilliertes Wasser zubereitet. Der pH-Wert jeder Polymerlösung wurde auf näherungsweise 6,2 eingestellt. Die Polymerlösungen wurden im Verhältnis 1:1 gemischt, um eine PVP/PEG Polymermischung (54% Gesamtpolymere) zu erhalten.
- 100 µl einer 5,0%igen Glutaraldehyd (Sigma, St. Louis, MO) -Lösung in deionisiertem Wasser wurden zu 1,0 ml der PVP/PEG Polymermischung gegeben und gründlich gerührt. 0,5 ml Tetanus Toxoid (1,0 mg/ml), erhältlich von Dept. of Public Health, wurden der PVP/PEG-Glutaraldehyd- Mischung zugesetzt und gründlich vermischt.
- Die Kombination wurde vier Stunden und 15 Minuten bei Zimmertemperatur gemischt und dann 30 Minuten lang bei 4ºC mit 3.000 Udr./min. zentrifugiert. Die aufschwimmenden Anteile wurden dekantiert, die Partikel in 2,0 ml 0,5 M Glycin in 1 x PBS Puffer resuspendiert und über Nacht bei 4ºC stehen gelassen.
- Der Waschvorgang wurde zwei Mal wiederholt. Die Tetanus Toxoid Partikel wurden schließlich in 0,5 ml 1 x PBS Puffer resuspendiert. Die Partikel hatten eine Partikelgröße von zwischen näherungsweise 50 und 100 Mikron.
- Einer Gruppe von 32 Mäusen wurde jeweils subcutan, gefolgt von einem FDA Protokoll, eine primäre Dosis mit 2 µg Tetanus Toxoid Partikeln injiziert. Eine sekundäre Injektion mit 2 µg Tetanus Toxoid Partikeln wurde sieben Wochen nach der primären Injektion verabreicht. Den Mäusen wurden 2, 4, 5, 8 und 10 Wochen nach der primären Injektion Blutproben entnommen, und die Antikörper-Titer in dem Blut wurden durch eine Immunoprüfung bestimmt. 14 Wochen nach der primären Injektion wurde den Mäusen eine lethale Dosis von Tetanus Toxoid verabreicht.
- Wie in Figur 2 zu erkennen ist, stiegen die Antikörper- Titer von näherungsweise 10 zum Zeitpunkt vier Wochen nach der primären Injektion auf näherungsweise 3.000 zum Zeitpunkt zehn Wochen nach der primären Injektion an. Die gestrichelte Linie bezeichnet Titer, die zwei Antitoxin-Einheiten des Schutzes von Tetanus Toxoid übertragen. Die Titer über der gestrichelten Linie bezeichnen entsprechend den FDA Standards eine positive Immunantwort. Wie in Figur 2 zu erkennen ist, hatten die Mäuse also schon vier Wochen nach der Injektion mit Tetanus Toxoid Mikropartikeln eine positive Immunantwort. Das Ansteigen der Antikörper-Titer im Zeitraum zwischen vier und zehn Wochen zeigt, daß die Mikropartikel eine langsame Freigabe des Tetanus Toxoid-Antigens bewirkten.
- 100% der Mäuse überlebten eine Verarbeitung einer lethalen Dosis von Tetanus Toxoid nach 14 Wochen. Diese Überlebensrate zeigt die starke Immunantwort, die Schutz gegen Tetanus Toxoid verleiht.
- Am Schluß des Versuchs schienen alle Mäuse gesund zu sein. An der Injektionsstelle konnte keine Entzündung oder Narbe festgestellt werden. Nach der Impfung trat kein wesentlicher Gewichtsverlust auf. Somit waren die Tetanus Toxoid Mikropartikel im allgemeinen nicht toxisch, wenn sie subcutan verabreicht wurden.
- Mit diesem Versuch wurden in vivo Daten gewonnen, die zeigen, daß die Verarbeitung von Tetanus Toxoid Mikropartikeln, die nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellten sind, eine langsame Freigabe eines Tetanus Toxoid Antigens ermöglicht, das eine positive Immunantwort bewirkt und gegen eine lethale Dosis von Tetanus Toxoid schützt, ohne daß nachteilige Wirkungen auftreten.
- Dieser Versuch wurde ausgeführt, um Albumin- Mikropartikel durch Inkubation von Albumin mit Polymermischungen aus PVP und PEG bei verschiedenen Temperaturen zu gewinnen.
- In jedes der vier Reaktionsrohre wurde 1,0 ml einer Rinerserum Albumin-FITC Lösung eingebracht, die 1% Rinderserum Albumin (BSA) und 10 µl dialysiertes Fluorescein-Isothiozyanat (FITC) Albumin enthielt. Jedem Rohr wurden unter Verrühren 2,0 ml einer Polymermischung zugesetzt, die 8,0% PVP und 20% PEG in 0,1 M Natriumazetat bei einem pH-Wert von 5,0 enthielt.
- Die Reaktion 1 wurde 1,5 Stunden bei Zimmertemperatur gemischt. Die Reaktion 2 wurde 30 Minuten bei Zimmertemperatur gemischt und dann 30 Minuten in einem Wasserbad bei 58ºC inkubiert. Die Reaktion 3 wurde sofort für 30 Minuten in ein Wasserbad vom 58ºC eingebracht. Die Reaktion 4 wurde 30 Minuten bei Zimmertemperatur gemischt, dann in einem Wasserbad mit 37ºC für 30 Minuten inkubiert und schließlich in einem Wasserbad von 58ºC für 30 Minuten inkubiert.
- Jeder Reaktionsmischung wurden 2,0 ml 10%iges Ethanol zugesetzt und kurz gemischt. Anschließend wurde 30 Minuten lang bei 20ºC mit 3.000 Udr./min. zentrifugiert. Die aufschwimmenden Anteile wurden vorsichtig aspiriert. Die Niederschläge wurden in 2, ml Ethanol resuspendiert. Die Reaktionsmischung 1 war klar, während die Reaktionsmischungen 2, 3 und 4 trüb erschienen. Schließlich wurde zentrifugiert und in 2,0 ml deionisiertem Wasser resuspendiert und das Ergebnis unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht.
- In der Reaktionsmischung 1 wurden keine Mikropartikel gefunden. Die Reaktionsmischung 2 enthielt nicht zusammengeballte Mikropartikel mit Durchmessern zwischen näherungsweise 1 µm und 10 µm. Die Reaktionsmischung 3 enthielt nicht zusammengeballte Mikropartikel mit einem Durchmesser von näherungsweise 10 µm, wobei viele Mikropartikel einen Durchmesser von weniger als 1 µm hatten. Die Reaktionsmischung 4 enthielt nicht zusammengeballte Mikropartikel, deren Durchmesser zwischen näherungsweise 10 µm und 25 µm lagen, wobei einige Mikropartikel einen Durchmesser von weniger als 1 µm hatten.
- In zwei Reihen von sechs Reaktionsrohren wurden 1,0 ml einer Rinderserum Albumin-FITC Lösung eingebracht, die 1% Rinderserum Albumin (BSA) und 10 µl dialysiertes Fluorescein-Isothiozyanat (FITC) Albumin enthielt. Jedem Rohr in der Reihe A wurden unter Verrühren 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml oder 5,0 ml einer Polymermischung mit 8,0% PVP (MW 90.000) und 20% PEG (MW 3.350) mit einem pH-Wert von 5,0 zugesetzt. Jedem Rohr in der Reihe B wurden unter Verrühren 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml oder 5,0 ml einer Polymermischung mit 20% PVP (MW 40.000) und 20% PEG (MW 3.350) mit einem pH-Wert von 5,0 zugesetzt.
- Die Reaktionsmischungen wurden bei Zimmertemperatur 30 Minuten lang stehen gelassen. Anschließend wurden die Rohre für 30 Minuten in ein Wasserbad von 37ºC bis 40ºC und dann für 30 Minuten in ein Wasserbad von 56ºC bis eingebracht. Es wurden 2 ml 10%iges Ethanol zugesetzt und nun 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur mit 3.000 Udr./min. zentrifugiert. Die aufschwimmenden Anteile wurden aspiriert, und die Mikropartikel in 2,0 ml 10%igem Ethanol resuspendiert. Es wurde wieder 15 Minuten lang zentrifugiert, in 2,0 ml deionisiertem Wasser resuspendiert und dann unter einem Fluoreszenzmikroskop das Ergebnis geprüft.
- Die unter Verwendung von 0,5 ml der Polymermischung erzeugten Mikropartikel waren in den meisten Fällen gleichförmig und hatten einen Durchmesser im Bereich zwischen 1 und 3 µm. Es wurden kleine Anhäufungen beobachtet. Man konnte auch wenige große Mikropartikel erkennen, die einen Durchmesser von näherungsweise 25 µm hatten.
- Die unter Verwendung von 1,0 ml der Polymermischung erzeugten Mikropartikel waren weniger gleichförmig als diejenigen, die mit 0,5 ml entstanden waren und hatten einen Durchmesser im Bereich von zwischen weniger als 1 µm und 10 µm. Es wurden weniger Anhäufungen beobachtet, als im obigen Fall. Außerdem konnten keine großen Mikropartikel gefunden werden.
- Die unter Verwendung von 2,0 ml der Polymermischung erzeugten Mikropartikel waren weniger gleichförmig, als diejenigen, die mit 0,5 ml entstanden waren und hatten einen Durchmesser im Bereich von zwischen weniger als 1 µm und 15 µm. Es wurden nur sehr wenige Anhäufungen beobachtet. Außerdem konnten keine großen Mikropartikel gefunden werden.
- Die unter Verwendung von 3,0 ml der Polymermischung erzeugten Mikropartikel waren weniger gleichförmig, als diejenigen, die mit 0,5 ml entstanden waren und hatten einen Durchmesser im Bereich von zwischen weniger als 1 µm und 20 µm. Es wurden nur sehr wenige Anhäufungen beobachtet. Außerdem konnten keine großen Mikropartikel gefunden werden.
- Die unter Verwendung von 4,0 ml der Polymermischung erzeugten Mikropartikel waren weniger gleichförmig, als diejenigen, die mit 0,5 ml entstanden waren und hatten einen Durchmesser im Bereich von zwischen weniger als 1 µm und 25 µm. Außerdem wurden keine Anhäufungen und keine großen Mikropartikel gefunden.
- Die unter Verwendung von 5,0 ml der Polymermischung erzeugten Mikropartikel waren weniger gleichförmig, als diejenigen, die mit 0,5 ml entstanden waren und hatten einen Durchmesser im Bereich von zwischen weniger als 1 µm und 30 µm. Außerdem wurden keine Anhäufungen und keine großen Mikropartikel gefunden.
- Die unter Verwendung von 0,5 ml der Polymermischung erzeugten Mikropartikel hatten die Form von kleinen Zusammenballungen, die zwischen 10 und 20 Mikropartikeln enthielten, die jeweils einen Durchmesser von weniger als 1 µm hatten. Es wurden auch einige große Mikropartikel beobachtet, deren Durchmesser näherungsweise zwischen 5 µm und 20 µm lagen.
- Die unter Verwendung von 1,0 ml der Polymermischung erzeugten Mikropartikel hatten die Form von kleinen Zusammenballungen, die zwischen 10 und 20 Mikropartikeln enthielten, die jeweils einen Durchmesser von weniger als 1 µm hatten. Große Mikropartikel mit einem Durchmesser von näherungsweise zwischen 5 µm und 50 µm wurden häufig beobachtet.
- Die unter Verwendung von 2,0 ml der Polymermischung erzeugten Mikropartikel hatten die Form von großen Zusammenballungen, die Mikropartikel enthielten, deren Durchmesser im Submikron-Bereich lag. Einige Mikropartikel hatten einen Durchmesser von zwischen 1 µm und 10 µm.
- Die unter Verwendung von 3,0 ml der Polymermischung erzeugten Mikropartikel hatten die Form von großen und kleinen Zusammenballungen. Gelegentlich wurden einzelne Mikropartikel mit einem Durchmesser von näherungsweise 5 µm beobachtet.
- Die unter Verwendung von 4,0 ml der Polymermischung erzeugten Mikropartikel hatten die Form von kleinen Zusammenballungen mit 10 bis 20 Mikropartikeln, die jeweils einen Durchmesser hatten, der kleiner war als derjenige, der bei Verwendung von 0,5 ml der Polymermischung beobachtet wurde. Es wurden keine einzelne Mikropartikel gesehen.
- Die unter Verwendung von 5,0 ml der Polymermischung erzeugten Mikropartikel hatten die Form von kleinen und großen Zusammenballungen, die sehr kleine Mikropartikel enthielten. Es wurden keine einzelnen Mikropartikel beobachtet.
- In sieben Reaktionsrohre wurde jeweils 1,0 ml einer Rinderserum Albumin-FITC Lösung eingebracht. Jedem Rohr wurden unter Verrühren 0,5 µm, 0,75 µl, 1,0 µl, 1,25 µl, 1,5 µl, 1,75 µl oder 2,0 µl einer Polymermischung zugesetzt, die 20% PVP (MW 40.000) und 20% PEG (MW 3.350) in 0,1 M Natriumacetat bei einem pH-Wert von 5, enthielt.
- Die Reaktionsmischungen wurden bei Zimmertemperatur 30 Minuten lang stehen gelassen. Die Rohre wurden dann für 30 Minuten in ein Wasserbad mit 37ºC bis 40ºC und anschließend für 30 Minuten in ein Wasserbad mit 56ºC bis 60ºC eingebracht. Es wurde 2 ml 10%iges Ethanol zugesetzt und für 30 Minuten bei 20ºC mit 3.000 Udr./min. zentrifugiert. Die auf schwimmenden Anteile wurden aspiriert und die Mikropartikel in 2,0 ml 10%igem Ethanol resuspendiert. Es wurde wieder 15 Minuten lang zentrifugiert, in 2, ml deionisiertem Wasser resuspendiert und unter einem Fluoreszenzmikroskop geprüft.
- Die unter Verwendung von 0,5 ml der Polymermischung gebildeten Mikropartikel hatten die Form von kleinen Zusammenballungen von winzigen Mikropartikeln mit weniger als 1 µm Durchmesser und näherungsweise zwischen 10 und 20 Stück pro Anhäufung. Gelegentlich wurden einzelne größere Mikropartikel mit einem Durchmesser von zwischen 1 µm und 10 µm beobachtet.
- Die unter Verwendung von 0,75 ml der Polymermischung gebildeten Mikropartikel hatten die Form von kleinen Zusammenballungen mit näherungsweise zwischen 1 und 10 Mikropartikeln pro Anhäufung. Gelegentlich wurden einzelne größere Mikropartikel mit einem Durchmesser von zwischen 1 µm und 10 µm beobachtet.
- Die unter Verwendung von 1,0 ml der Polymermischung erzeugten Mikropartikel bildeten große zusammenhaftende Anhäufungen während der Inkubation bei 37ºC bis 40ºC. Die Anhäufungen enthielten näherungsweise jeweils zwischen 1 und 5 Mikropartikeln. Gelegentlich wurden einzelne größere Partikel mit einem Durchmesser von zwischen 1 µm und 10 µm beobachtet.
- Die unter Verwendung von 1,25 ml der Polymermischung erzeugten Mikropartikel bildeten während der Inkubation bei 56ºC bis 60ºC Anhäufungen. Die Anhäufungen enthielten jeweils näherungsweise zwischen 1 und 5 Mikropartikeln. Gelegentlich wurden einzelne größere Partikel mit einem Durchmesser von zwischen 1 µm und 10 µm beobachtet.
- Die unter Verwendung von 1,5 ml der Polymermischung erzeugten Mikropartikel bildeten während der Inkubation bei 56ºC bis 60ºC Anhäufungen. Die Anhäufungen enthielten jeweils näherungsweise zwischen 1 und 5 Mikropartikeln. Es wurden mehrere größere einzelne Mikropartikel mit einem Durchmesser von zwischen 1 µm und 10 µm beobachtet.
- Die unter Verwendung von 1,75 ml der Polymermischung erzeugten Mikropartikel bildeten sich während der Inkubation bei 56ºC bis 60ºC. Aufgrund ihrer geringen Größe war es schwierig festzustellen, ob die Mikropartikel als Anhäufungen vorhanden waren. Es wurden mehrere größere einzelne Mikropartikel mit einem Durchmesser von zwischen 1 µm und 10 µm beobachtet.
- Die unter Verwendung von 2,0 ml der Polymermischung erzeugten Mikropartikel bildeten große Anhäufungen von 10 bis 100 Mikropartikeln. Einige einzelne Mikropartikel hatten einen Durchmesser von 1 µm.
- Dieser Versuch zeigte, daß Albumin-Mikropartikel durch Inkubation von Albumin und einer PVP/PEG Mischung bei einer Temperatur von 37ºC bis 60ºC und einer Zeitdauer von näherungsweise 30 Minuten zubereitet werden können. Die Größe der Mikropartikel und der Grad der Ausbildung von Anhäufungen (Zusammenballungen) kann durch Veränderung der Zusammensetzung oder des Volumens der dem Albumin hinzugefügten PVP/PEG Polymermischung verändert werden.
Claims (30)
1. Mikropartikel-Zusammensetzung mit quervernetzten
Makromolekülen nebeneinander mit einem
dehydrierenden Mittel, bei der das dehydrierende
Mittel eine Lösung mit Polyvinylpyrrolidon und
Polyethylenglycol ist und bei der die
Mikropartikel-Zusammensetzung durch Inkubation der
Makromoleküle mit dem dehydrierenden Mittel bei
einer Temperatur erzeugt werden kann, die höher
ist, als Zimmertemperatur, und/oder bei
Vorhandensein eines quervernetzenden Mittels für
eine ausreichend lange Zeit, um die Mikropartikel
zu bilden.
2. Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei
der das Makromolekül aus einer Gruppe ausgewählt
ist, die Protein, Kohlenhydrat, Polysaccharide,
Nukleinsäuremoleküle, Viren, Viruspartikel,
pharmazeutische Medikamente und Mischungen davon
aufweist.
3. Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 2, bei
der das Protein aus einer Gruppe ausgewählt ist,
die Immunoglobulin, Antigen und einen Zellrezeptor
aufweist.
4. Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 2, die
ein therapeutisches Molekül aufweist.
5. Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 4, bei
der das therapeutische Moleküle aus einer Gruppe
ausgewählt ist, die chemotherapeutische Mittel,
antivirale Mittel, antibakterielle Mittel,
antiparasitische Mittel, Immuno-unterdrückende
Mittel, Zytokine, Hormone, Enzyme und Mischungen
davon aufweist.
6. Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 1, die
eine magnetische Substanz aufweist.
7. Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei
der die Makromoleküle mit einer detektierbaren
Markierung versehen sind.
8. Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 7, bei
der die detektierbare Markierung aus einer Gruppe
ausgewählt ist, die Fluorochrom, eine
chemiluminescente Markierung, magnetische
Partikel, Enzyme, Enzymsubstrate und eine
radioaktive Markierung aufweist.
9. Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei
der die Mikropartikel in vitro und in vivo stabil
sind.
10. Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei
der das dehydrierende Mittel eine Mischung aus
Polyvinylpyrrolidon mit einem Molekulargewicht von
näherungsweise 40.000 und Polyethylenglykol mit
einem Molekulargewicht von näherungsweise 3.500
ist.
11. Mikropartikel-Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei
der die Makromoleküle mit einer Verbindung
quervernetzt sind, die aus einer Gruppe ausgewählt
ist, die Dialdehyde, Amine, mehrwertige Ionen,
multifunktionale Moleküle mit einer Affinität für
spezifische reaktive Gruppen an quervernetzten
Makromolekülen, N-substituierte Maleimide,
bifunktionale Alkylhalide, Arylhalide, Isocyanate,
aliphatische oder aromatische dicarboxylische
Säuren, aliphatische oder aromatische
disulphonische Säuren, bifunktionale Imidoester
und Vinylsulphone aufweist, die in der
Inkubationsmischung enthalten ist.
12. Verfahren zur Herstellung eines Mikropartikeis mit
quervernetzten Makromolekülen, nebeneinander mit
einem dehydrierenden Mittel, mit folgenden
Schritten:
a) Inkubieren eines Makromoleküls mit einem
dehydrierenden Mittel bei einer Temperatur, die
größer ist, als Zimmertemperatur und/oder bei
Vorhandensein eines quervernetzenden Mittels für
eine ausreichend lange Zeit, um die Mikropartikel
zu bilden, wobei das dehydrierende Mittel eine
Lösung ist, die Polyvinylpyrrolidon und
Polyethylenglycol aufweist und
b) Trennen der Partikel.von der Inkubationsmischung.
13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die
Inkubationstemperatur größer oder gleich 37ºC und
kleiner oder gleich 80ºC ist.
14. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die
Inkubationsmischung für zwischen 5 Minuten und 24
Stunden inkubiert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem die
Inkubationstemperatur kleiner oder gleich der
Zimmertemperatur ist, wenn ein quervernetzendes
Mittel vorhanden ist.
16. Verfahren nach Anspruch 12, das den Schritt des
Waschens der Partikel mit einem Puffer aufweist,
der ein abschreckendes Reagens enthält.
17. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem der
Inkubationsschritt bei einem pH-Wert von zwischen
5 und 8 durchgeführt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das
dehydrierende Mittel eine Mischung aus
Polyvinylpyrrolidon mit einem Molekulargewicht von
näherungsweise 40.000 und Polyethylenglycol mit
einem Molekulargewicht von näherungsweise 3.500
ist.
19. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem das
quervernetzende Mittel aus einer Gruppe ausgewählt
ist, die Dialdehyde, Amine, mehrwertige Ionen,
multifunktionale Moleküle mit einer Affinität für
spezifische reaktive Gruppen an den quervernetzten
Makromolekülen, N-substituierte Maleimide,
bifunktionale Alkylhalide, Arylhalide, Isocyanate,
aliphatische oder aromatische dicarboxylische
Säuren, aliphatische oder aromatische
disulphonische Säuren, bifunktionale Imidoester
und Vinylsulphone aufweist.
20. Verfahren nach Anspruch 12, bei das die
Makromolekül aus einer Gruppe ausgewählt ist, die
ein Protein, Kohlenhydrat, Polysaccharide,
Nukleinsäuremolekül, Virus, Viruspartikel,
pharmazeutisches Medikament und Mischungen davon
aufweist.
21. Verfahren zum Isolieren eines Zielmoleküls aus
einer Komplexmischung, die das Molekül enthält,
mit folgenden Schritten:
a) Mischen der Komplexmischung mit einem
makromolekularen Mikropartikel mit einer Affinität
für das Zielmolekül für eine ausreichend lange
Zeit, damit sich das Zielmolekül an das
Makromolekül binden kann, wobei das Mikropartikel
Makromoleküle in einer flüssigen Phase aufweist,
die nebeneinander mit einem dehydrierenden Mittel
quervernetzt sind, wobei das quervernetzende
Mittel eine Lösung ist, die Polyvinylpyrrolidon
und Polyethylenglycol aufweist und wobei das
Mikropartikel durch Inkubation des Makromoleküls
mit dem dehydrierenden Mittel bei einer Temperatur
erzeugt werden kann, die höher ist, als
Zimmertemperatur, und/oder bei Vorhandensein eines
quervernetzenden Mittels fur eine ausreichend
lange Zeit, um die Mikropartikel zu bilden, und
b) Trennen der gebundenen Zielmoleküle von der
Komplexmischung.
22. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem das
Mikropartikel immobilisiert ist.
23. Verfahren nach Anspruch 22, bei dem das mag
somolekül aus einer Gruppe ausgewählt ist, die ein
Protein, Kohlenhydrat, Polysaccharide,
Nukleinsäuremolekül, Virus, Viruspartikel,
pharmazeutische Medikamente und Mischungen davon
aufweist.
24. Verfahren nach Anspruch 21, bei dem das
Zielmolekül aus einer Gruppe ausgewählt ist, die
ein Protein, Kohlenhydrat, Nukleinsäuremolekül,
Virus und Zellen aufweist.
25. Verfahren zum Erfassen eines Zielbiomoleküls in
einer Probe mit folgenden Schritten:
a) Kombinieren der Probe mit einer Mikropartikel-
Zusammensetzung, die ein Makromolekül aufweist,
das nebeneinander mit einem dehydrierenden Mittel
quervernetzt ist, wobei das dehydrierende Mittel
eine Lösung ist, die Polyvinylpyrrolidon und
Polyethylenglycol aufweist, wobei die
Mikropartikel-Zusarnmensetzung durch Inkubation des
Makromoleküls mit dem dehydrierenden Mittel bei
einer Temperatur, die höher ist, als
Zimmertemperatur, und/oder bei Vorhandensein eines
quervernetzenden Mittels für eine ausreichend
lange Zeit, um die Mikropartikel zu bilden,
erzeugt werden kann, und wobei das Makromolekül
ein Affinitätsmolekül aufweist, das spezifisch für
das mit einem detektierbaren abbildenden Mittel
markierte Zielbiomolekül ist und
b) Erfassen des detektierbaren abbildenden Mittels.
26. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem das
detektierbare abbildende Mittel aus einer Gruppe
ausgewählt ist, die ein Fluorochrom, eine
chemiluminescente Markierung, magnetische
Partikel, Enzyme, Enzymsubstrate und eine
radioaktive Markierung aufweist.
27. Verfahren nach Anspruch 25, bei dem die
Makromoleküle aus einer Gruppe ausgewählt sind,
die ein Protein, Kohlenhydrat, Polysaccharide,
Nukleinsäuremolekül, Virus, Viruspartikel, und
Mischungen davon aufweist.
28. Satz zur Zubereitung eines Mikropartikeis mit
quervernetzten Makromolekülen nebeneinander mit
einem dehydrierenden Mittel, mit
a) einem dehydrierenden Mittel mit einer Lösung aus
Polyvinylpyrrolidon und Polyethylenglycol und
b) einem quervernetzenden Mittel, das aus einer
Gruppe ausgewählt ist, die Dialdehyde, Amine,
mehrwertige Ionen, N-substituierte Maleimide,
bifunktionale Alkylhalide, Arylhalide, Isocyanate,
aliphatische oder aromatische dicarboxylische
Säuren, aliphatische oder aromatische
disuiphonische Säuren, bifunktionale Imidoester
und Vinylsulphone aufweist.
29. Satz nach Anspruch 28, der ferner ein Makromolekül
aufweist, das aus einer Gruppe ausgewählt ist, die
ein Protein, Kohlenhydrat, Polysaccharide,
Nukleinsäuremolekül, Virus, Viruspartikel,
pharmazeutisches Medikament und Mischungen davon
umfaßt
30. Satz nach Anspruch 28, bei dem das quervernetzende
Mittel aus einer Gruppe ausgewählt ist, die
Glutaraldehyde, p,p'-difluoro-m,m'-dinitro
diphenyl sulphone, hexamethylen diisozyanate,
n,n'-(1,3-phenylen)-bis-maleimide, n,n'ethylen-
bis-iodoacetamide; 3,6-bis-(mecurimethyl)-dioxan;
bis-diazobenzidine; Woodward's K; bis-oxiranes;
Dimethyl adipimidate; Dimethyl suberimidate;
Diethyl malonimidate;
Phenol-2,4-disulphonylchloride; Divinylsulphone und Carbodiimide
aufweist.
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