ES2215207T3 - Microparticulas de macromoleculas y metodos de produccion. - Google Patents

Abstract

COMPOSICION DE MICROPARTICULAS, QUE COMPRENDE MACROMOLECULAS RETICULADAS, EN YUXTAPOSICION CON UN AGENTE DE DESHIDRATACION, SIENDO SELECCIONADO DICHO AGENTE, A PARTIR DEL GRUPO FORMADO POR POLIMEROS SOLUBLES, LINEALES Y RAMIFICADOS. DICHA COMPOSICION DE MICROPARTICULAS, SE PUEDE OBTENER INCUBANDO LA MACROMOLECULA CON EL AGENTE DESHIDRATANTE, A UNA TEMPERATURA SUPERIOR A LA TEMPERATURA AMBIENTE Y/O EN PRESENCIA DE UN AGENTE RETICULANTE, DURANTE UN PERIODO DE TIEMPO SUFICIENTE PARA FORMAR MICROPARTICULAS. SE PROPORCIONA ASIMISMO UN METODO DE FORMACION DE DICHAS MICROPARTICULAS, ASI COMO METODOS DE UTILIZACION DE LAS MISMAS.

Description

Micropartículas de macromoléculas y métodos de producción.

El presente método se refiere al campo de la bioquímica, y más específicamente se refiere a un método de preparar micropartículas para su utilización en diagnóstico, terapéutica e investigación.

Antecedentes de la invención

La micropartículas, microesferas y microcápsulas, colectivamente denominadas aquí como "micropartículas", son partículas sólidas que tienen un diámetro de menos de un milímetro, mas preferiblemente de menos de 1 x 10^{-4} (100 micras), que pueden formarse con diversos materiales, incluyendo polímeros sintéticos, proteínas y polisacáridos. Las micropartículas se han utilizado en muchas aplicaciones diferentes, primariamente en separaciones, diagnósticos y liberación de fármacos.

Los ejemplos mejor conocidos de micropartículas utilizadas en técnicas de separación son las que se forman a partir de polímeros de origen sintético o proteico, tales como poliacrilamida, hidroxiapatita o agarosa, que se utilizan para separar moléculas tales como proteínas, tomando como base su peso molecular y/o carga iónica, o mediante la interacción con moléculas químicamente acopladas a las micropartículas.

En el área diagnóstica, las micropartículas se utilizan más frecuentemente en forma de una micropartícula que sirve para inmovilizar una enzima, un sustrato para una enzima, o un anticuerpo marcado, que después interactúa con una molécula para ser detectado, directa o indirectamente.

El Documento GB 1.079.937, por ejemplo, describe microcápsulas para utilización en ensayos inmunológicos, especialmente en reacciones de aglutinación, que comprenden un antígeno o un anticuerpo unido a la superficie de la pared de las microcápsulas. El documento EP 0.106.495 describe un reactivo para detectar anticuerpos antivirus, que comprenden partículas trasportadoras sensibilizadas con un antígeno viral. El Documento 0.414.223 describe un método para medir un material inmunológicamente activo, utilizando partículas finas sólidas deshidratadas, tales como microorganismos, que tienen un anticuerpo unido covalentemente.

En el área de liberación controlada de fármacos, las micropartículas se forman mezcladas con moléculas que van a ser encapsuladas dentro de las micropartículas, para la consecuente liberación. Un número de diferentes técnicas se utilizan rutinariamente para preparar esas micropartículas a partir de polímeros sintéticos, polímeros naturales, proteínas y polisacáridos, incluyendo separación de fases, evaporación de disolventes, emulsión y secado por aerosol.

El Documento GB 2.002.319, por ejemplo, describe un procedimiento para deshidratar una dispersión coloidal de liposomas en un medio acuoso líquido, que comprende mezclar la dispersión de liposomas con un compuesto hidrófilo, y después liofilizar la mezcla resultante para formar un polvo estable que contiene liposomas. Los liposomas pueden utilizarse para abarcar sustancias biológicamente activas.

Las micropartículas también pueden crearse como un producto auxiliar para tecnología de separación, por ejemplo, en algunos procesos de precipitación, tal como la precipitación con sulfato amónico. Sin embargo, en estos casos, el precipitado se recolecta y se compacta mediante centrifugación y/o filtración, después se redisuelve en un disolvente para separar el agente precipitante, la sal, de la molécula precipitada con la sal. Según esto, las micropartículas son inestables y funciona únicamente como un producto intermedio, no como el producto final per se.

Las bolas o partículas esféricas han estado disponibles comercialmente como una herramienta para los bioquímicos durante muchos años. Por ejemplo, los anticuerpos frecuentemente se conjugan con bolas para crear partículas relativamente grandes, específicas para ligandos particulares. Las partículas grandes revestidas de anticuerpo se utilizan rutinariamente para reticular receptores sobre la superficie de una célula para la activación celular, se unen a una fase sólida para purificación mediante inmunoafinidad, o se utilizan para liberar un agente terapéutico que se libera lentamente durante un tiempo en un lugar distante, utilizando anticuerpos específicos de tejido o tumor, conjugados a las partículas, para llevar el agente al lugar deseado.

El método más común de unir covalentemente un anticuerpo a una matriz de fase sólida, es activar una bola con un agente de conjugación química, y después unir el anticuerpo a la bola activada. La utilización de una bola polimérica sintética mejor que una molécula de proteína, permite la utilización de condiciones de activación mucho más duras, que muchas proteínas pueden soportar, es relativamente barato, y frecuentemente proporciona una unión que es estable, en un amplio intervalo de condiciones desnaturalizantes. Un número de bolas activadas están disponibles comercialmente, todos con varios constituyentes y tamaños. Las bolas formadas a partir de polímeros sintéticos, tales como poliacrilamida, poliacrílico, poliestireno, o látex, están disponibles comercialmente de numerosas fuentes, tales como Bio-Rad Laboratories, Richmond, California y LKB Produkter, Estocolmo, Suecia. Las bolas formadas a partir de macromoléculas y partículas naturales, tales como agarosa, agarosa reticulada, globulina, ácido nucleico de desoxi-ribosa, y liposomas, están disponibles comercialmente de fuentes tales como Bio-Rad Laboratories, Richmond, California; Pharmacia, Piscataway, NY; e IBF (Francia). Bolas formadas a partir de copolímeros de poliacrilamida y agarosa, están disponibles comercialmente de fuentes tales como IBF y Pharmacia. Bolas magnéticas están disponibles comercialmente de fuentes tales como Dynal Inc., Great Neck, NY.

Como indica la amplia variedad de materiales e indicaciones, existe una necesidad creciente de desarrollo de nuevos métodos para preparar y utilizar micropartículas, particularmente aquellas que puedan adaptarse para utilizar en el área de separaciones, diagnóstico y liberación de fármacos, más que solo en una aplicación.

Es por lo tanto un objetivo de la presente invención, proporcionar micropartículas estables, y un procedimiento para preparar micropartículas que sea relativamente sencillo, rápido y barato.

Es un objetivo más de la presente invención, proporcionar micropartículas que tengan una elevada afinidad y especificidad por una molécula diana.

Es un objetivo más de la presente invención, proporcionar micropartículas que no se absorban cuando se administran in vivo.

Es un objetivo más de la presente invención, proporcionar micropartículas para utilizar en técnicas de separación, especialmente en cromatografía de afinidad.

Es un objetivo más de la presente invención, proporcionar micropartículas para utilizar en aplicaciones médicas y diagnósticas, tales como liberación de fármacos específica de una diana e imagen histopatológica o de tejido in vivo.

Resumen de la invención

Se proporcionan micropartículas, métodos de producción, y métodos para su utilización, basados en métodos para "deshidratar" macromoléculas tales como proteínas, carbohidratos, polisacáridos, ácidos nucleicos, virus, partículas virales, fármacos farmacéuticos sintéticos orgánicos o inorgánicos, o cualquiera de sus mezclas; y formar las micropartículas de macromoléculas mediante incubación, en presencia de calor, o "reticular" las macromoléculas mientras están en fase líquida. Las moléculas se deshidratan utilizando un agente que deshidrata efectivamente todo excepto "bolsillos" de fase acuosa, por ejemplo, mediante deshidratación con elevada concentración de polímeros lineales o ramificados. Las macromoléculas pueden consistir en fármacos, moléculas biológicamente activas, moléculas trasportadoras, moléculas de afinidad o sus mezclas.

La micropartículas se forman mediante incubación de las moléculas deshidratadas durante una cantidad predeterminada de tiempo y a una temperatura superior a la temperatura ambiente. Alternativamente, a diversas temperaturas, las macromoléculas están reticulados para formar micropartículas, utilizando un agente de reticulación tal como glutaraldehído u otros agentes tales como aminas, iones multivalentes y moléculas multifuncionales que tienen una "afinidad" para grupos reactivos específicos sobre la macromolécula que está siendo reticulada.

Las micropartículas se separan después del agente de deshidratación y el exceso de agente de reticulación, si está presente, mediante métodos de separación tales como filtración o centrifugación. Las micropartículas pueden después lavarse con un reactivo de extinción, que se une a cualquier lugar de unión que no ha reaccionado con los agentes de reticulación, para reducir efectivamente cualquier unión no específica de la micropartícula cuando reacciona con la molécula diana.

Las micropartículas son útiles para una amplia variedad de propósitos de separación, diagnóstico, terapéutico y de investigación.

Más adelante se describen ejemplos específicos en los que las micropartículas se forman a partir de (1) proteínas tales como anticuerpos que han sido deshidratados con una elevada concentración de una mezcla de polímeros lineales que contiene polivinilpirrolidona y polietilen glicol, que después se reticularon con glutaraldehido; (2) polisacáridos tales como alginato mezclado con moléculas biológicamente activas que se han deshidratado con una elevada concentración de una mezcla de polímeros lineales que contienen polivinilpirrolidona y polietilen glicol y reticulados con iones multivalentes, tales como poliaminoácidos o cationes divalentes; (3) hormonas peptídicas, tales como insulina, reticuladas con glutaraldehído después de deshidratación con una mezcla de polivinilpirrolidona y polietilen glicol; y (4) proteínas tales como albúmina, que se deshidratan con una mezcla de polímeros lineales que contiene polivinilpirrolidona y polietilen glicol y se incuban en presencia de calor.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico que muestra cuentas por minuto (cuentas) de antígeno carcinogénico embrionario radiactivo unido, contra la concentración de micropartículas de anti-antígeno carcinogénico embrionario.

La Figura 2 es un gráfico que muestra el título de anticuerpos, contra las semanas después de la inmunización con dosis primaria y secundaria de partículas de toxoide tetánico.

Descripción detallada de la invención

Se proporcionan micropartículas, métodos de producción y kits para uso diagnóstico, terapéutico y de investigación. Las micropartículas son estructuras macromoleculares reticuladas que tienen un área de superficie grande. Las macromoléculas que forman las micropartículas incluyen, pero no se limitan a proteínas, carbohidratos, polisacáridos, ácidos nucleicos, virus, partículas virales, fármacos farmacéuticos sintéticos orgánicos e inorgánicos o sus mezclas, que pueden reticularse en una fase líquida bajo condiciones de deshidratación.

Formación de polímeros de micropartículas

La micropartícula se forma mediante incubación de macromoléculas en solución o en fase líquida, en presencia de un agente deshidratante y calor o un agente de reticulación, durante una cantidad suficiente de tiempo para formar partículas. La macromolécula se disuelve primero en un disolvente acuoso, después o bien la solución de macromoléculas se añade al agente deshidratante, o bien el agente deshidratante se añade a la solución de macromoléculas, preferiblemente esto último. La solución de macromoléculas deshidratada después preferiblemente se calienta durante una cantidad de tiempo predeterminada para la formación de micropartículas. Alternativamente, se añade un agente de reticulación a la solución de macromoléculas deshidratada, para la formación de micropartículas a diversas temperaturas, por encima, por debajo o a temperatura ambiente. Las micropartículas resultantes se separan después de cualquier componente no reactivo presente en la mezcla de incubación, mediante métodos de separación física bien conocidos por los expertos en la técnica.

Macromolécula

La macromolécula que forma la micropartícula es cualquier molécula capaz de reticularse en fase líquida. Más preferiblemente, la macromolécula es una biomolécula tal como una proteína, carbohidrato, polisacárido, molécula de ácido nucleico, virus, partícula viral, o sus mezclas. La macromolécula puede también ser un compuesto farmacéutico natural o sintético, que es capaz de reticularse. Los expertos en la técnica entenderán que un compuesto incapaz de reticularse puede formar una micropartícula, mediante la incorporación del compuesto en una molécula vehículo, que después se reticula según los métodos proporcionados aquí. También entenderán los expertos en la técnica, que la macromolécula puede también ser una parte de una molécula que tiene la actividad requerida para unirse o interactuar con un ligando, tal como, por ejemplo, un péptido, un segmento de cadena sencilla de una molécula de ácido nucleico de doble cadena, o una partícula viral. También entenderán los expertos en la técnica que el término "macromolécula" incluye una pluralidad de macromoléculas, e incluye combinaciones de diferentes macromoléculas tales como una combinación de un compuesto farmacéutico y una molécula de afinidad para enviar el compuesto farmacéutico a un tejido, órgano o tumor que requiere tratamiento.

También entenderán los expertos en la técnica que una molécula de afinidad puede ser la parte del receptor o la parte del ligando de una interacción receptor-ligando. Ejemplos de ligandos que interactúan con otras biomoléculas incluyen virus, bacterias, polisacáridos o toxinas que actúan como antígenos para generar una respuesta inmune, cuando se administran a un animal y ocasionan la producción de anticuerpos.

La concentración de macromoléculas en la mezcla de incubación está preferiblemente entre 0,1 y 100 mg/ml, dependiendo de las condiciones de incubación.

Macromolécula marcada

La macromolécula puede marcarse con un marcador detectable. Los diversos tipos de marcadores y métodos de marcaje de proteínas y moléculas de ácido nucleico son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica entenderán que en la definición del término marcador está incluida una sustancia magnética, tal como un metal. Por ejemplo, la macromolécula puede marcarse con una sustancia metálica, tal como un metal, de tal forma que la micropartícula puede separarse de otras sustancias en una solución, con la ayuda de un aparato magnético.

Otros diversos marcadores o grupos reporteros específicos se describen más adelante.

Por ejemplo, el marcador puede ser un radiomarcador tal como, pero no restringido a, ^{32}P, ^{3}H, ^{14}C, ^{35}S, ^{125}I, o ^{131}I. Un marcador ^{32}P puede conjugarse a una proteína con un reactivo de conjugación, o incorporarse dentro de una secuencia de una molécula de ácido nucleico mediante traducción nick, marcaje final o incorporación del nucleótido marcado. Por ejemplo, un marcador ^{3}H, ^{14}C o ^{35}S puede incorporarse a una secuencia de nucleótidos mediante incorporación de un precursor marcado o mediante modificación química, mientras que un marcador ^{125}I o ^{131}I se incorpora generalmente en una secuencia de nucleótidos mediante modificación química. La detección de un marcador puede hacerse por métodos tales como el conteo de escintilación, la espectrometría de rayos gamma o la autorradiografía.

El marcador también puede ser un marcador de Masa o de Resonancia Magnética Nuclear (NMR), tal como, por ejemplo, ^{13}C, ^{15}N, o ^{19}O. La detección de dicho marcador puede realizarse mediante espectrometría de Masa o NMR.

También pueden utilizarse tinciones, agentes quimioluminiscentes y fluorógenos para marcar la macromolécula. Ejemplos de tinciones útiles para marcar ácidos nucleicos incluyen bromuro de etidio, actidinas, propidio y otras tinciones intercalantes, y 4', 6'-diamino-2-fenilindol (DAPI) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) u otras tinciones de ácidos nucleicos apropiadas. Ejemplos de fluorógenos incluyen fluoresceína y derivados, ficoeritrina, alo-ficocianina, ficocianina, rodamina, Rojo Texas u otros fluorógenos apropiados. Los fluorógenos se unen generalmente mediante modificación química. Los marcadores de tinción pueden detectarse mediante un espectrofotómetro y los fluorógenos pueden detectarse mediante un detector de fluorescencia.

La macromolécula puede marcarse alternativamente con un cromógeno (sustrato enzimático), para proporcionar un marcador enzimático o de afinidad, o una enzima. Por ejemplo,la macromolécula puede biotinilarse de tal forma que pueda utilizarse en una reacción de biotina-avidina, que puede también asociarse a un marcador tal como una enzima o un fluorógeno. La macromolécula puede marcarse con peroxidasa, fosfatasa alcalina u otras enzimas que proporcionen una reacción cromogénica o fluorogénica después de la adición de un sustrato. Por ejemplo, pueden utilizarse aditivos tales como 5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazinediona (también conocido como Luminol^{TM}) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) y aumentadores de rendimiento tales como p-hidroxibifenil (también conocido como p-fenilfenol) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), para amplificar enzimas tales como la peroxidasa de rábano picante, a través de una reacción luminiscente; y también pueden utilizarse derivados de dioxetano luminogénicos o fluorogénicos de sustratos enzimáticos.

También pueden incorporarse lugares de reconocimiento para enzimas, tales como lugares de enzimas de restricción en las moléculas de ácidos nucleicos, en una macromolécula, para proporcionar un marcador detectable. Un marcador también puede hacerse mediante la incorporación de una base modificada, un aminoácido, o un precursor que contiene cualquier marcador, incorporación de una base o aminoácido modificado que contiene un grupo químico reconocible por anticuerpos específicos, o mediante detección de cualquier complejo anticuerpo unido, mediante varios métodos, incluyendo reacciones de inmunofluorescencia o inmuno-enzimáticas. Tales marcadores pueden detectarse utilizando inmunoanálisis ligado a enzima (ELISA) o mediante detección de un cambio de color con la ayuda de un espectrofotómetro.

Agente deshidratante

El agente deshidratante es un compuesto químico o una mezcla de compuestos capaz de difundir agua desde la macromolécula hacia un medio con contenido iónico más elevado. Agentes deshidratantes adecuados incluyen polímeros lineales o ramificados de alto peso molecular, no ionizables, solubles en agua.

Preferiblemente, el agente deshidratante es una mezcla de dos o más polímeros lineales solubles, tales como polivinilpirrolidona y polietilen glicol. Tal mezcla de polímeros pueden prepararse según métodos conocidos. Los expertos en la técnica entenderán que podrían utilizarse otros polímeros lineales solubles, tales como dextrano, nonilfenol-etoxilatos, poli(alcohol vinílico) y sus mezclas, además de PVP y PEG, o en lugar de PVP o PEG.

La PVP es un polímero hidrófilo, no ionógeno, que tiene un peso molecular medio que va desde aproximadamente 10.000 hasta 700.000, y la fórmula química (C_{6}H_{9}NO)_{2}. La PVP también se conoce como poli[1-(2-oxo-1-pirrolidin)etileno], Povidone^{TM}, Plividone^{TM}, RP 143^{TM}, Kollidon^{TM}, Peregal ST^{TM}, Periston^{TM}, Plasdone^{TM}, Plasmosan^{TM}, Protagent^{TM}, Subtosan^{TM}, y Vinisil^{TM}. La PVP es no tóxica, altamente higroscópica y se disuelve rápidamente en agua o en disolventes orgánicos.

El polietilen glicol (PEG), también conocido como poli(oxietilén)-glicol, es un polímero de condensación de óxido de etileno y agua, que tiene la fórmula química general HO(CH_{2}CH_{2}O)_{2}H.

Dextrano es un término aplicado a polisacáridos producidos por bacterias que crecen sobre un sustrato de sacarosa. Los dextranos naturales producidos por bacterias tales como Leuconostoc mesenteroides y Lactobacteria dextranicum, generalmente tienen un alto peso molecular.

Los nonilfenol-etoxilatos (NPEs) son una clase de compuestos de cadena larga, frecuentemente utilizados como surfactantes. Generalmente se forman derivados que cumplen los requerimientos de solubilidad deseados.

El poli(alcohol vinílico) (PVA) es un polímero preparado a partir de poli(acetatos de vinilo), mediante reemplazamiento de los grupos acetato con grupos hidroxilo, y tiene la fórmula (CH_{2}CHOH)_{\theta}. La mayoría de los poli(alcoholes vinílicos) son solubles en agua.

PEG, dextrano, PVA y PVP están disponibles comercialmente de proveedores químicos tales como Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). Los NPE requieren síntesis personalizada y pueden solicitarse a productores químicos especiales.

Más preferiblemente, el agente deshidratante es una mezcla de polímeros que contiene una solución acuosa de PVP con un peso molecular entre 10.000 y 360.000, más preferiblemente 40.000, y PEG con un peso molecular entre 200 y 35.000. Se prefiere PVP con un peso molecular de 40.000 y PEG con un peso molecular de 3500. Alternativamente, se prefiere PVP con un peso molecular de 360.000, para obtener micropartículas que tengan tamaño uniforme. Preferiblemente, el PVP se disuelve en una solución de tampón de acetato y el PEG se añade a la solución acuosa de PVP. La concentración de cada polímero está preferiblemente entre 1 y 40 g/100 ml, dependiendo del peso molecular de cada polímero. Más preferiblemente, la concentración de cada polímero es de 24 g/100 ml o 24%. Concentraciones iguales de PVP y PEG generalmente proporcionan la matriz de polímeros más favorable para la formación de micropartículas de polímero. El volumen de polímero añadido a la macromolécula varía dependiendo del tamaño y la cantidad de la macromolécula. Preferiblemente, se añaden tres volúmenes de mezcla de polímeros a un volumen de una solución que contiene la macromolécula.

Condiciones de incubación utilizando calor

Las micropartículas se forman mediante incubación de la macromolécula y la mezcla de agentes deshidratantes a una temperatura mayor que la temperatura ambiente, durante una cantidad predeterminada de tiempo. Preferiblemente, la mezcla se incuba en un baño de agua a una temperatura mayor o igual a 80ºC durante entre aproximadamente 5 minutos y 2 horas. Más preferiblemente, la mezcla se incuba durante 15-30 minutos a una temperatura entre 50ºC y 70ºC.

El tamaño de las micropartículas puede controlarse ajustando las condiciones de incubación. Por ejemplo, las temperaturas de incubación pueden aumentarse gradualmente o mediante incrementos, desde temperatura ambiente hasta la temperatura elevada de incubación deseada, o el tiempo total de incubación puede aumentarse. Además, la cantidad de agregación de micropartículas puede controlarse variando la concentración, el volumen o la composición del agente de deshidratación.

Reactivo de reticulación

Las micropartículas se forman alternativamente mediante la adición de un reactivo de reticulación, para reticular la macromolécula deshidratada. El reactivo de reticulación es un reactivo químico bi- o multi-funcional, que se une físicamente a las macromoléculas, y, en algunos casos, al agente deshidratante. Ejemplos de agentes de reticulación adecuados incluyen dialdehídos u otros agentes tales como aminas, iones multivalentes, y moléculas multifuncionales que tienen una "afinidad" por grupos reactivos específicos sobre la macromolécula que está siendo reticulada.

En una realización preferida, el agente de reticulación conecta covalentemente las macromoléculas en una estructura tridimensional estable. Más preferiblemente, el agente de reticulación es un agente bifuncional tal como glutaraldehido; p,p'-difluoro-m,m'-dinitro-difenil-sulfona; diisocianato de hexametileno; n,n'-(1,3-Fenilen)-bis-maleimida; n,n'-etilén-bis-yodoacetamida; 3,6-bis-(mecurimetil)-dioxano: bis-diazobencidina; K de Woodward; bis-oxiranos; dimetil-adipimidato; dimetil-suberimidato; dietil-malonimidato; fenol-2,4-disulfonil-cloruro; divinilsulfona; y carbodiimidas.

Más preferiblemente, el agente de reticulación es un dialdehído tal como glutaraldehído, que forma una base de Schiff con aminas primarias, que en reducción con borohidruro proporciona aminas secundarias estables bajo condiciones suaves.

Un ejemplo de otro tipo de agente de reticulación son las maleimidas N-sustituidas, que son específicas para grupos sulfidrilos bajo condiciones suaves. Varias N-aril y N-alquil-bis-maleimidas están disponibles comercialmente, incluyendo la azofenildimaleimida. Estas son insolubles en agua y generalmente se añaden en cantidades estoiquiométricas como un sólido a una solución acuosa a pH 7 a 8 de los reactivos.

Los haluros de alquilo bifuncionales reaccionan primariamente con grupos tiol, imidazol y amino. A pH neutro o levemente alcalino, se favorece la reacción con grupos sulfidrilo, mientras que un pH mayor estimula la reacción con grupos amino. Otros compuestos incluyen aril-haluros, tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno, que son insolubles en agua y reaccionan preferentemente con grupos amino y grupos tirosín-feólicos, pero que también reaccionarán con grupos sulfidrilo e imidazol. Se requieren valores de pH relativamente altos para una reacción rápida. El reactivo se añade generalmente como una solución de acetona concentrada, a una solución acuosa de los reactivos y el producto en formación. Los isocianatos reaccionan con aminas para formar ureas sustituidas, con alcoholes para formar uretanos y con agua para proporcionar aminas y dióxido de carbono. A pH alcalino, se prefiere la reacción con aminas. El 2,2-dicarboxi-4,4'-azofenildiisocianato es soluble en agua, y tiene la ventaja de que el puente que forma puede escindirse fácilmente mediante reducción del grupo azo mediante ditionita. También pueden utilizarse agentes acilantes, tales como muchos de los ácidos dicarboxílicos o disulfónicos alifáticos o aromáticos, que se activan para proporcionar agentes acilantes bifuncionales capaces de reaccionar bajo condiciones suaves. Los nitrofenilésteres de ácidos dicarboxílicos y los cloruros aromáticos bis-sulfonilo son ejemplos. Estos son insolubles en agua y se hidrolizan rápidamente. Los cloruros de bis-sulfonilo reaccionan con grupos amino para formar uniones sulfonamida estables que pueden subsecuentemente escindirse con HBr en ácido acético glacial. También pueden utilizarse imidoésteres bifuncionales que son solubles en agua y reaccionan con grupos amino bajo condiciones suaves y con un alto grado de especificidad. Puede utilizarse dimetilsuberimidato en solución de tampón de trietanolamina HCl 0,2 M, pH 8,5, durante tres horas a temperatura ambiente. La amida resultante es estable a la hidrólisis ácida, pero puede escindirse con amonio. Pueden utilizarse vinilsulfonas, que reaccionan primariamente con grupos amino pero, a pH elevado, reaccionan con carbohidratos, fenoles y alcoholes.

La concentración del reactivo de reticulación en la mezcla de incubación debería ser suficiente para unir todos los grupos activos de la macromolécula. Hay una relación directa entre la concentración del agente de reticulación y el número de micropartículas formadas después de la incubación. Generalmente, se forman más micropartículas según aumenta la concentración del agente de reticulación en la mezcla de incubación. Preferiblemente, la concentración del agente de reticulación en la mezcla de incubación está entre aproximadamente 5 y 200 microlitros de una solución al 25% de glutaraldehído por mililitro de mezcla de incubación.

Condiciones de incubación para el reticulación

Preferiblemente, el agente deshidratante es una solución de polímero, donde la mezcla de macromolécula, polímero y agente de reticulación se mezclan juntos vigorosamente, mediante agitación con vórtice, para proporcionar interacción suficiente entre la macromolécula, los polímeros y el agente de reticulación, y se incuban, mientras se mezclan, a temperatura ambiente (20ºC), o a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente, durante una cantidad de tiempo suficiente para permitir la formación máxima de micropartículas. Alternativamente, las micropartículas pueden formarse utilizando una combinación de agente de reticulación y calor, preferiblemente mediante incubación a una temperatura superior o igual a 37ºC, e inferior o igual a 80ºC.

La cantidad de tiempo de incubación depende de las respectivas concentraciones de polímero y molécula de afinidad y de la temperatura de incubación. Preferiblemente, la mezcla de polímeros y macromoléculas se incuba entre 30 minutos y 24 horas. Más preferiblemente, la mezcla de polímeros y macromoléculas se mezclan, mediante agitación, durante 120 minutos a temperatura ambiente, y después se deja a 4ºC durante la noche, sin agitar.

El pH de la mezcla de incubación se determina generalmente mediante el pH del agente deshidratante, y puede ajustarse añadiendo la cantidad apropiada de una solución de tampón ácida o básica, a cualquiera o a ambas soluciones de agente deshidratante o macromoléculas, antes de que se mezclen. Cuando el agente deshidratante es una solución de polímero lineal, hay una relación directa entre el tamaño de la micropartícula formada al final de la etapa de incubación y el pH de la mezcla de incubación. A un pH mayor (más básico), se forman micropartículas más grandes. A un pH menor, las micropartículas formadas son más pequeñas. El pH de la mezcla de incubación del polímero lineal está preferiblemente entre aproximadamente 5 y 8.

Extinción de los lugares de unión

Los expertos en la técnica entenderán que puede añadirse un reactivo de extinción a las micropartículas resultantes después de la incubación, para bloquear cualquier lugar de unión del reactivo de reticulación que no haya reaccionado, para reducir la subsecuente unión no específica. En el caso de que el agente deshidratante sea una solución de polímero lineal tal como PVP/PEG, reactivos de extinción adecuados son compuestos, tales como aminoácidos o albúmina, que contienen números sustanciales de grupos amino. Preferiblemente, el reactivo de extinción es una solución que contiene lisina o glicina. Más preferiblemente el reactivo de extinción es el aminoácido glicina en una concentración que va desde 0,1 hasta 0,5 M.

Purificación de las micropartículas

Las micropartículas formadas se separan de los componentes que no han reaccionado de la mezcla de incubación, mediante métodos de separación convencionales, bien conocidos por los expertos en la técnica. Preferiblemente, la mezcla de incubación se centrífuga hasta que las micropartículas caen al fondo del tubo de centrífuga, y los componentes que no han reaccionado permanecen en el sobrenadante, que después se decanta. Alternativamente, la mezcla de incubación que contiene las micropartículas formadas, se filtra de tal forma que las micropartículas se retienen en el filtro y los componentes que no han reaccionado pasan a través del filtro.

Se consigue mayor purificación de las micropartículas mediante lavado en un volumen apropiado de solución de lavado. La solución de lavado preferida es una solución de tampón, más preferiblemente una solución salina tamponada con fosfato, que contiene el reactivo de extinción. Pueden utilizarse lavados repetidos si es necesario.

Los expertos en la técnica entenderán que algunos de los agentes deshidratantes pueden incorporarse en la estructura de la macromolécula y contribuir realmente a la composición molecular de cada micropartícula.

Características de la micropartícula

Las micropartículas formadas mediante el proceso precedente pueden ser de forma esférica o no esférica, dependiendo de la temperatura, el tamaño y la mezcla del polímero, y a la concentración de proteína, con uno o más lugares activos presentes en la superficie de la micropartícula. La forma elíptica y la granularidad de la micropartícula crea una partícula que tiene una mayor área de superficie que las bolas de micropartícula esférica, y permite la incorporación de un mayor número de macromoléculas por micropartícula que la que puede conseguirse con bolas esféricas convencionales.

Además, en el ejemplo en el que las micropartículas se forman de macromoléculas tales como inmunoglobulinas reticuladas con glutaraldehído en presencia de PVP/PEG, las micropartículas son estables a pH alcalino y ácido, y se absorben cuando se administran in vivo.

Las micropartículas son útiles para una amplia variedad de propósitos diagnósticos, terapéuticos y de investigación, como se discute con más detalle más adelante. Por ejemplo, para propósitos diagnósticos in vivo, las micropartículas pueden incluir una macromolécula tal como una inmunoglobulina o un receptor celular, marcados con un marcador detectable. La inyección de las micropartículas marcadas en un paciente, crea un agente de imagen para el diagnóstico de una enfermedad proliferativa tal como el cáncer, o una herramienta para la evaluación del éxito de una gente terapéutico en la reducción de la proliferación de una célula u organismo particularmente adverso. Para diagnóstico in vitro, micropartículas que contienen una macromolécula, tal como una inmunoglobulina, receptor celular o sonda de oligonucleótido específica para la célula u organismo que está en investigación, se combinan con una muestra a analizar, las micropartículas se separan de cualquier componente de la muestra no unido, y las moléculas unidas se detectan mediante métodos convencionales. Las micropartículas son útiles como agentes terapéuticos cuando las micropartículas incluyen un fármaco terapéutico, y se inyectan en un paciente para liberación lenta o liberación dirigida del fármaco al lugar que requiere la terapia.

Las micropartículas también son útiles para la purificación de moléculas de una mezcla compleja, como un reactivo para la detección o cuantificación de una molécula específica, o para la producción de moléculas, tales como anticuerpos. Por ejemplo, micropartículas que contienen una macromolécula, tal como una inmunoglobulina, pueden ligarse a una columna de cromatografía y utilizarse en cromatografía de inmunoafinidad, para separar un ligando de una mezcla compleja. Alternativamente, micropartículas que incluyen una macromolécula marcada o una mezcla de macromoléculas marcadas específicas para diferentes células o biomoléculas, tales como receptores celulares, pueden utilizarse para detectar cambios en un número de células o biomoléculas en respuesta a una condición particular de análisis, utilizando técnicas tales como la citometría de flujo. Además, las micropartículas pueden utilizarse como adyuvantes para producción de vacuna, en las que micropartículas que contienen antígeno se inyectan en un animal de investigación, tal como un ratón o un conejo, para producir o aumentar la respuesta inmune para la producción de anticuerpos al antígeno.

Diagnósticos in vitro Análisis in vitro

Las micropartículas aquí descritas son útiles como partículas de fase sólida en un análisis, tal como un análisis inmunabsorbente ligado a enzima, dot-blot o Western blot, para la detección de una diana particular, tal como una célula, biomolécula o fármaco, en una muestra biológica. Las micropatículas diseñadas para este uso, se componen de moléculas de afinidad específicas para la molécula diana. Por ejemplo, la macromolécula es una inmunoglobulina, un receptor celular o una sonda de oligonucleótido, y esta unida a un tubo de ensayo o placa de microtitulación.

Para la detección o cuantificación de una molécula diana de interés, una muestra se combina con una solución que contiene las micropartículas, las macromoléculas sobre las micropartículas se hacen reaccionar con la molécula diana, las micropartículas se separan de cualquier componente de la muestra no unido, y las micropartículas que contienen moléculas unidas se detectan por métodos convencionales. Las micropartículas teñidas con fluorescencia son particularmente adecuadas para análisis mediante citometría de flujo, según métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.

Histopatología

Las micropartículas descritas aquí son útiles como agentes de imagen para localización in vivo de una molécula, tipo de célula o enfermedad patológica particular, de una forma similar a la descrita previamente con respecto a la utilización de micropartículas para histopatología. Las macromoléculas sobre las micropartículas diseñadas para este uso, son específicas para moléculas expresadas por una célula o un organismo patológico particular, y están marcadas con un marcador detectable. Por ejemplo, la macromolécula es una inmunoglobulina, un receptor celular o una sonda de oligonucleótido específica para una célula tumoral o un organismo patológico, tal como un virus.

Las micropartículas se usan para detectar una situación patológica o para monitorizar el éxito de una terapia, tal como quimioterapia o cirugía, para asegurar que el tamaño de un tumor de tejido anormal ha disminuido, o éste ha desaparecido completamente. Para este uso, un paciente recibe una administración de una solución de micropartículas, preferiblemente intravenosamente, las macromoléculas marcadas sobre las micropartículas se proporcionan durante una cantidad suficiente de tiempo, para que se localicen en el órgano afectado o región del organismo, la macromolécula reacciona con una molécula diana expresada por la célula u organismo que está en investigación, y las micropartículas unidas se detectan, detectando el marcador por técnicas de imagen convencionales, bien conocidas por los expertos en la técnica, tales como los rayos X.

Sistemas de liberación terapéutica de fármaco

Las micropartículas son útiles para terapia, cuando están compuestas de compuestos farmacéuticos reticulados o un vehículo reticulado, tal como albúmina, que contiene el agente terapéutico. La micropartícula puede proporcionar la liberación lenta del agente a lo largo de todo el cuerpo, o la micropartícula puede incluir una molécula de afinidad, específica para un tejido diana, o un tumor, e inyectarse a un paciente para la liberación dirigida del agente terapéutico, tal como un agente antitumoral, antiviral, antibacteriano, antiparasitario o antiartrítico, una citoquina, hormona o insulina, directamente al lugar que requiere la terapia.

Aplicaciones de investigación

Las micropartículas son también útiles como herramientas de investigación para la purificación de una biomolécula de una mezcla compleja, como un reactivo para la detección o la cuantificación de una biomolécula, o para la producción de biomoléculas, tales como anticuerpos.

Por ejemplo, micropartículas compuestas de una macromolécula, tal como una inmunoglobulina, se unen a una columna de cromatografía y se utilizan en cromatografía de inmunoafinidad, para separar un ligando de una mezcla compleja. Los expertos en la técnica entenderán que la micropartícula para utilizar en cromatografía líquida de alta presión, debería ligarse primero a una esfera o bola de fase sólida no compresible, de tal forma que el empaquetamiento de la columna mantiene su estructura rígida bajo la presión.

Alternativamente, micropartículas que incluyen una macromolécula marcada o una mezcla de macromoléculas marcadas específicas para diferentes células o receptores celulares, y se utilizan para detectar cambios en el número de células o de receptores de superficie celular, en respuesta a una condición particular a analizar, utilizando técnicas tales como la citometría de flujo.

Además, las micropartículas son adyuvantes útiles para la producción de anticuerpos, en la que micropartículas que contienen antígeno, se inyectan a un animal, tal como un ratón o un conejo, para la producción de vacuna, o a un ser humano, para inducir inmunidad contra un antígeno, para producir o aumentar una respuesta inmune, para la producción de anticuerpos contra el antígeno.

Kit para la producción de micropartículas

Se proporciona un kit para la producción de micropartículas. El kit contiene los siguientes reactivos: un agente deshidratante y un agente de reticulación. El usuario del kit puede utilizarlo para la preparación de micropartículas personalizadas, en las que el usuario proporcionará la macromolécula que se formará en las micropartículas. Alternativamente, el kit puede contener una o más macromoléculas, en solución o liofilizadas, para la preparación de micropartículas de interés para el usuario. Las micropartículas formadas pueden entonces utilizarse para investigación, terapéutica o diagnóstico, como se ha descrito previamente. El kit preferiblemente también contiene una solución de tampón, tal como solución salina tamponada con fosfato, que contiene un reactivo de extinción, tal como glicina, para bloquear la unión inespecífica mediante el agente de reticulación. Puede también incluirse con el kit un marcador detectable, o una macromolécula premarcada, para proporcionar un medio para detectar la presencia de la micropartícula en una muestra o en un paciente.

Las micropartículas de polímero y los métodos descritos previamente, se entenderán mejor mediante la referencia de los siguiente ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 Preparación de micropartículas con gammaglobulina y una mezcla de polímeros de polivinilpirrolidona y polietilen glicol, y uno de sus análisis de estabilidad Formación de micropartículas

Las micropartículas se formaron combinando de gammaglobulina, una de cinco preparaciones de peso molecular (MW 10.000-360.000), de una solución de polivinilpirrolidona al 5-25%, y una preparación de peso molecular constante (MW 3500) de una solución de polietilen glicol al 25% (ambas preparadas como se describe más adelante en el Ejemplo 2), en presencia de glutaraldehído, a un pH de reacción en el intervalo entre 6,9 y 7,75, mediante el siguiente procedimiento. Las micropartículas eran estables tanto en soluciones ácidas como básicas.

Cinco mezclas de polímeros, cada una conteniendo una preparación de polivinilpirrolidona de un peso molecular diferente, se prepararon como se indica más adelante en la Tabla 1. Se añadieron veinte microlitros de glutaraldehído (25%, Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), a cada mezcla de polímero. Un mililitro de gammaglobulina de cabra purificada (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO), purificada según métodos conocidos, se hizo reaccionar con cada uno de las cinco mezclas de polímero, agitándolos brevemente. Las soluciones de reacción se mezclaron durante 40 minutos a 20ºC y después se incubaron a 4ºC durante la noche.

Las cinco soluciones de reacción se calentaron de nuevo hasta 20ºC, se añadieron 100 \mul de DL-lisina (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) a cada solución, y la solución se mezcló durante 90 minutos a 20ºC.

Las soluciones se centrifugaron a 5000 rpm durante 30 minutos a 20ºC. Los sobrenadantes se decantaron y los precipitados se resuspendieron en 1 ml de una solución de tampón que contenía 1,0 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), que contenía Tween al 0,2% (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO).

Cien microlitros de cada precipitado resuspendido se hicieron reaccionar con 100 \mul de una dilución 1:2000 de conjugado IgG anti-cabra peroxidasa, durante 15 minutos a 20ºC. Se añadió 1 ml de la solución de tampón PBS/Tween a cada mezcla de reacción, y las mezclas se incubaron a 4ºC durante la noche.

Las muestras se centrifugaron, se cogieron 100 \mul de cada uno de los sobrenadantes, y se hicieron reaccionar con 300 \mul de Azul TM. El resto de los sobrenadantes se decantaron cuidadosamente y los precipitados se resuspendieron en 1 ml de solución PBS/Tween.

Las muestras resuspendidas se centrifugaron otra vez, se cogieron 100 \mul y se hicieron reaccionar con 300 \mul de Azul TM, se decantaron los sobrenadantes, y los precipitados se resuspendieron en 1 ml de PBS/Tween. Una parte alícuota de 100 \mul de los precipitados resuspendidos se hizo reaccionar con 300 \mul de azul TM.

Las muestras resuspendidas se centrifugaron otra vez, se cogieron 100 \mul y se hicieron reaccionar con 300 \mul de Azul TM, se decantaron los sobrenadantes, y los precipitados se resuspendieron en 1 ml de PBS/Tween. Una parte alícuota de 100 \mul de los precipitados resuspendidos se hizo reaccionar con 300 \mul de Azul TM. Los resultados se muestran a continuación en las Tablas 1 y 2.

TABLA 1 Cantidad y características de las micropartículas formadas con cinco preparaciones de diferente peso molecular de PVP

1

TABLA 2 Concentración relativa de gammaglobulina en las fracciones de sobrenadante y precipitado después de la formación de micropartículas y lavado

2

Los resultados presentados en la Tabla 1 indican que las micropartículas se formaron en las cinco soluciones que contenían preparaciones de diferente peso molecular de PVP en presencia de glutaraldehído.

Los resultados presentados en la Tabla 2 indican que la gammaglobulina se ligó a las micropartículas presentes en el precipitado, incluso después de tres lavados.

Análisis de estabilidad de las micropartículas

Se realizaron tres reacciones sobre el primer precipitado resuspendido de la reacción nº 3, para analizar los efectos de soluciones ácidas o básicas, sobre la estabilidad de las micropartículas, como sigue.

Cien microlitros del primer precipitado resuspendido de la reacción nº 3 se colocaron en tres tubos de ensayo. Se añadieron doscientos microlitros de agua desionizada al primer tubo. Se observaron partículas. Se añadieron doscientos microlitros de ácido acético 1 N al segundo tubo. Se observaron partículas que tenían el mismo tamaño que el observado en el primer tubo. Se añadieron doscientos microlitros de NaOH al 1% al tercer tubo. Se observaron partículas que tenían el mismo tamaño que las observadas en el primer tubo.

Los tres tubos se dejaron a 4ºC durante la noche y se observaron de nuevo al día siguiente. Los tubos 1 y 2 no cambiaron. El tubo 3 parecía tener partículas más pequeñas que los tubos 1 ó 2.

Los resultados indican que el pH ácido o básico no alteraba la estabilidad de las partículas.

Ejemplo 2 Preparación y análisis in vitro de la unión de micropartículas Anti-CEA a CEA radiactivo

Se formaron micropartículas anti-CEA (antígeno carcinogénico embrionario), como se describió generalmente para la reacción nº 3 del ejemplo 1, y como se describe en más detalle más adelante. Las micropartículas resultantes se combinaron después con diversas concentraciones de CEA radiactivo, para determinar si los anticuerpos anti-CEA incorporados a las micropartículas retenían la afinidad por el ligando CEA.

Preparación de micropartículas anti-CEA

Se preparó una solución al 14,3% de cada polímero, polivinilpirrolidona (MW 40.000) y polietilen glicol (MW 3500), obtenidos de Sigma, St. Louis, MO, añadiendo 14,3 gramos de polímero a 100 ml de agua destilada. El pH de cada solución al 14,3% de cada polímero se ajustó a un pH de aproximadamente 6,25. Las soluciones de polímero se mezclaron 1:1 para crear una mezcla de polímeros PVP/PEG.

Como testigo, se hizo reaccionar una parte alícuota de 0,45 ml de gammaglobulina de cabra anti-CEA, con 3,6 ml de mezcla de polímeros PVP/PEG, mediante agitación, mientras se añadía la mezcla de polímeros a la gammaglobulina, en ausencia de glutaraldehído. Los reactivos se dejaron a 3ºC durante 30 minutos. Los reactivos se centrifugaron a 2300 rpm durante 60 minutos a 20ºC. Los sobrenadantes se decantaron, y los precipitados se resuspendieron en 0,9 ml de solución salina tamponada con fosfato.

Los precipitados resuspendidos se lavaron con 1,8 ml de mezcla de polímeros, preajustada a pH 6,25, se les dejó a 3ºC durante 20 minutos, y se centrifugaron a 5000 rpm durante 30 minutos a 20ºC.

Se hicieron reaccionar 0,9 ml de gammaglobulina de cabra anti-CEA purificada, con 2 ml de mezcla de polímeros PVP/PEG, pH 6,25, que contenía 20 \mul de glutaraldehído, mediante agitación, mientras se añadía la mezcla de polímeros/glutaraldehído a la gammaglobulina. Los reactivos se mezclaron a 20ºC durante 90 minutos. Los reactivos se centrifugaron a 2300 rpm durante 60 minutos a 20ºC. El sobrenadante se decantó y el precipitado se resuspendió en
1 ml de solución salina tamponada con fosfato. Se añadieron 80 microlitros de DL-lisina al precipitado resuspendido y se mezclaron. Los reactivos se dejaron a 4ºC durante la noche.

Los reactivos se centrifugaron a 5000 rpm durante 30 minutos a 20ºC. La muestra se dejó a 4ºC durante 60 horas y después se re-centrifugó. El sobrenadante aparecía claro y se decantó. El precipitado, que contenía micropartículas anti-CEA, se resuspendió en 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (1 X).

Análisis de unión

Se diluyó CEA radiactivo (^{125}I) con solución salina tamponada con fosfato, que contenía gelatina de pescado líquida al 10%. El ^{125}I CEA contenía 39313 cuentas por cada 100 \mul.

Se prepararon diez tubos de reacción, cada uno conteniendo 100 \mul del ^{125}I CEA diluido, como se indica más adelante en la Tabla 3, añadiendo el volumen apropiado de micropartículas anti-CEA resuspendidas.

Las mezclas de micropartículas anti-CEA/CEA radiactivo en los tubos 1-5, se incubaron durante 2 horas en el refrigerador mientras se agitaban. Las mezclas de micropartículas anti-CEA/CEA radiactivo en los tubos 6-9 se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente, mientras se agitaban. Los reactivos se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato, que contenía gelatina de pescado líquida al 10%, se centrifugaron durante 1 minuto en una centrífuga de alta velocidad, y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato. Los resultados indican que las micropartículas anti-CEA son activas inmunlógicamente y reaccionan con CEA como se muestra numéricamente en la Tabla 3 y gráficamente en la Figura 1.

TABLA 3 Análisis cuantitativo de la unión de micropartículas anti-CEA a CEA radiactivo

Nº de tubo	Micropartículas CEA (\mul)	Cpm
1	0	105
2	10	1286
3	20	1936

TABLA 3 (continuación)

Nº de tubo	Micropartículas CEA (\mul)	Cpm
4	40	2912
5	80	3406
6	10	1377
7	20	1259
8	40	2977
9	80	4715

Ejemplo 3 Efecto del pH en la formación de micropartículas

Este experimento demostró el efecto del pH en la capacidad de formar micropartículas de IgG.

Procedimiento experimental

Se preparó una mezcla de polímeros de PVP/PEG, como se describió generalmente en el Ejemplo 2 (48% total de polímeros), y se ajustó al pH indicado en la Tabla 4. Se puso un mililitro de cada solución en cada uno de 7 tubos de centrífuga:

TABLA 4 pH ajustado de la mezcla de PVP/PEG

Nº de tubo	pH de PVP/PEG
1	4,6
2	5,2
3	5,8
4	6,6
5	7,4
6	8,1
7	9,2

Se añadieron 100 \mul de una solución de glutarladehído al 5,0% (Sigma, St. Louis, MO), en agua desionizada, a cada tubo, y se mezclaron bien.

Se añadieron 300 \mul de una muestra concentrada 3 X de IgG humana purificado a partir de plasma humano, como se describió previamente en el Ejemplo 2, mientras se agitaban. La mezcla se mezcló a 20ºC durante 1 hora, y el material se centrífugo a 3800 RPM durante 30 minutos a 20ºC. Los sobrenadantes se decantaron y las partículas se lavaron en 5 ml de glicina 0,5 M en solución de tampón PBS 1 X, después se mezclaron durante 60 minutos a 20ºC, y se centrifugaron a 3800 RPM durante 30 minutos a 20ºC. Los sobrenadantes se decantaron y las partículas se lavaron en 5 ml de glicina 0,5 M en PBS 1 X.

Observaciones

Después de la adición de IgG purificada a los tubos, y de mezclaros durante 20 minutos, se observó una tendencia a un tamaño de agregados. Según aumentaba el pH de la mezcla de PVP/PEG, aumentaba el tamaño de los agregados formados.

Primeros precipitados

Según el pH de la mezcla de PVP/PEG aumentaba, los precipitados eran más pequeños, más húmedos y de color naranja. Ocurría una diferencia perceptible en estas características a pH de 6,6.

El tubo nº 7 tenía que ser tratado con mucho cuidado, ya que el precipitado no era adherente a la pared del tubo. El 90% del sobrenadante se eliminó cuidadosamente con una pipeta desechable.

Primera resuspensión

Hay una relación directa entre el pH de la mezcla de PVP/PEG y el tamaño de las partículas formadas. Según el pH aumentaba, aumentaba el tamaño de las partículas. A pH 6,6 las partículas eran visiblemente mayores que a pH 5,8.

Segundo precipitado

A pH 6,6 y mayor, los precipitados no se adherían a la pared del tubo, y se deslizaban hacia abajo por la pared del tubo bastante fácilmente. Según aumentaba el pH, el precipitado iba de amarillo a naranja.

Segunda resuspensión

Idéntica a la primera resuspensión.

Las partículas se llevaron a temperatura ambiente, se mezclaron bien, y después se centrifugaron a 2600 RPM a 20ºC durante 30 minutos. Los sobrenadantes se decantaron y los precipitados se resuspendieron en 5,0 ml de glicina 0,5 M en solución de tampón PBS, pH 5,6, 1 X. El procedimiento de lavado se repitió después 3 veces más, hasta que los sobrenadantes estaban claros.

Conclusión

Según el pH de la mezcla PVP/PEG disminuía desde 9,2 hasta 4,6, el tamaño de las partículas formadas por la acción de reticulación del glutaraldehído, se hacía menor y más uniforme en tamaño.

Ejemplo 4 Preparación de micropartículas de albúmina marcadas con enzima

1. Se disolvieron sesenta miligramos de albúmina de huevo de gallina en 2 ml de una mezcla de polímeros de PVP/PEG preparada como se describió en el Ejemplo 2. El pH se ajustó a 4,5 con HCl 1 N. Se añadieron 200 \mul de conjugado de IgG anti-cabra de conejo, purificada por afinidad de Cappell y peroxidasa de rábano picante (HRP).

2. La mezcla se dejó rotando durante 30 minutos.

3. Se diluyó una solución de glutaraldehído al 10% 1:4, y se añadieron 200 \mul a la mezcla.

4. La mezcla se dejó rotando durante 30 minutos.

5. La mezcla se centrífugo a 1500 rpm durante 30 minutos a 20ºC y se eliminó el sobrenadante.

6. El precipitado se resuspendió en solución de tampón de glicina y se lavó 2 veces mediante centrifugación a 1500 rpm durante 10 minutos a 20ºC.

7. El precipitado se resuspendió en solución salina Tris 0,15 M, pH 7,4, que contenía gelatina de pescado al 1%, en un volumen total de 2 ml y las partículas contenidas.

Análisis

1. Se añadieron 4 gotas de sustrato HRP a dos tubos de cristal

2. Se añadieron 4 gotas del precipitado resuspendido de la etapa 7 anterior a un tubo, y se mezcló todo.

3. Se añadieron 4 gotas del sobrenadante de la etapa 5 anterior al otro tubo, y se mezcló todo.

Resultados

1. El tubo que contenía el sobrenadante de la etapa 5 estaba claro (sin color)

2. El tubo que contenía el precipitado resuspendido de la etapa 7 era de color azul marino a los 5 minutos, lo que indicaba que las partículas estaban marcadas con la HRP.

Ejemplo 5 Administración in vivo de micropartículas de polímero anti-HCG

Se inyectaron micropartículas anti-gonadotropina coriónica humana (anti-HCG) marcadas fluorescentemente, en un ratón Balb/c para controlar el aclaramiento:

A un ratón hembra que pesaba 35 gramos, se le inyectó con fenobarbital durante 5 minutos. La cavidad ventral se expuso quirúrgicamente, y la aorta se inyectó con 100 microlitros de anti-HCG marcado fluorescentemente, utilizando una aguja de calibre 27 y ½.

Cinco minutos después, se extrajeron 50 \mul de sangre.

Diez minutos más tarde, se extrajeron 50 \mul de sangre.

Debe observarse que el animal estaba todavía vivo en el momento de la recolección de sangre, con el corazón latiendo fuertemente.

El ratón se sacrificó después mediante dislocación cervical.

Análisis

1. Una gota de sangre (5 minutos y 10 minutos), se depositó sobre un portaobjetos de cristal que tenía una depresión para la muestra, y la muestra se cubrió con un cubre-portaobjetos de cristal. Se puso una gota de aceite sobre el cubre-portaobjetos.

2. La muestra de sangre se examinó con un microscopio de fluorescencia (Zeiss IIIRS), utilizando alto poder.

3. Se observó fluorescencia fuerte alrededor de las células en la muestra de 5 minutos, lo que indicaba que las micropartículas no eran rápidamente absorbidas por el animal.

4. Se observó fluorescencia débil en la muestra de 10 minutos.

Ejemplo 6 Efecto de la concentración de la mezcla de polímeros en la formación de micropartículas de IgG humana marcada fluorescentemente

Este experimento se realizó para determinar los efectos de la concentración de una mezcla de polímeros PVP/PEG sobre la formación de micropartículas de anticuerpo.

Procedimiento

Se preparó un volumen de mezcla de polímeros PVP/PEG como se describió en el Ejemplo 2, para formar una mezcla de polímeros que tiene una concentración de polímeros de 53,3%, ajustada a pH 4,8. Se hicieron diluciones de polímeros como se indica más adelante en la Tabla 5, utilizando acetato sódico 0,1 M a pH 5,0:

TABLA 1 Volumen y porcentaje de al mezcla de polímeros

Mezcla de polímeros (mls)	Acetato sódico (mls)	Polímeros %
10	0	53,3%
9	1	48,0%
8	2	42,4%
7	3	37,1%
6	4	31,8%
5	5	26,7%
4	6	21,3%
3	7	15,9
2	8	10,7%
1	9	5,3%
0	10	0%

Se puso una parte alícuota de 1 ml de cada una de las diluciones indicadas en la Tabla 5 en un tubo de centrífuga. A cada tubo se le añadieron después 100 \mul de una solución de glutaraldehído al 5%, preparada añadiendo 400 \mul de glutaraldehído al 25% a 2,0 ml de H_{2}O, y mezclando. Las soluciones de mezclas de polímeros/glutaraldehído se agitaron concienzudamente.

Los tubos se hicieron reaccionar con 300 \mul de IgG humana marcada fluorescentemente. El anticuerpo humano purificado se concentró 3 X en una solución de glicina 0,1 M en solución de tampón PBS a pH 11,0, y se marcó con isotiocianato de fluoresceína en la solución de tampón de glicina 0,1 M a una concentración de 3 mg/ml. El anticuerpo se añadió a las diluciones de la mezcla de polímeros mientras se agitaban, y los tubos se mezclaron durante 1 hora, seguido de 30 minutos de centrifugación a 2500 rpm a 20ºC.

Después de la centrifugación, los sobrenadantes se decantaron y los precipitados se resuspendieron en 5 ml de glicina 0,5 M en PBS. Los precipitados se rompieron y se agitaron bien. Se centrifugaron después durante 30 minutos a 30ºC, a 2500 RPM. Este proceso de lavado se repitió cuatro veces.

Resultados

Cada tubo tenía una apariencia diferente desde el comienzo de la reacción. El tubo que contenía 5,3% de polímero tenía solo una leve precipitación, la mayoría de la cual se situaba junta en las paredes del tubo. El tubo que contenía 53,3% de polímero tenía partículas muy finas, que no se agregaban entre ellas ni se pegaban a las paredes del tubo.

En general, según aumentaba la concentración de los polímeros, la materia precipitada se volvía más fina y menos pegajosa. La materia de reacción sólida en el testigo de acetato sódico era pequeña y pegajosa.

Después de la centrifugación, el tamaño del precipitado se veía aumentar en proporción directa a la concentración de polímero. La brillantez del color naranja de los precipitados era inversamente proporcional a la concentración de polímeros.

El precipitado testigo era muy pequeño y exhibía un color naranja brillante, así como los tubos con concentraciones muy bajas de polímero. La facilidad con la que los precipitados se rompían en la solución de tampón de lavado de glicina 0,5 M, también se relacionaba con la concentración de polímero. El precipitado del tubo que contenía solo 5,3% de la mezcla de polímeros, era pegajoso y difícil de romper, pero cada tubo sucesivo las partículas eran menos pegajosas. A una concentración de polímero de 31,8% o mayor, las partículas se separaban muy fácilmente.

Después del primer lavado y centrifugación, todavía existía un gradiente de brillantez de color en los precipitados, aunque las diferencia era de pequeña magnitud. Los sobrenadantes eran de color naranja pálido porque el isotiocianato de fluoresceína se estaba eliminado de la muestra con los lavados. Después del tercer lavado, los sobrenadantes eran claros y el color de los precipitados era uniforme. Las diferencias de tamaño entre los precipitados no cambió.

Conclusión

La concentración de polímero juega un papel definitivo para determinar las características de las partículas de anticuerpo hechas con la mezcla de polímero. Concentraciones de polímero del 40% y mayores proporcionan partículas muy finas que no se adhieren. También, cuanto mayor es la concentración de polímeros en la mezcla de polímeros, mayor es el número de partículas de anticuerpo que pueden formarse.

Ejemplo 7 Efecto del pH en la formación de micropartículas de gammaglobulina

Este experimento se realizó para determinar los efectos del pH de la mezcla de polímeros sobre la formación de partículas de anticuerpos.

Procedimiento

Se puso una parte alícuota de 1 ml de suero de cabra en cada uno de ocho tubos de centrífuga. El suero se incubó 15 minutos con una solución de Triton al 1,8%/Brij al 3% (Sigma, St. Louis, MO). Esto se siguió de una reacción con 2 ml de una mezcla de polímeros al 40%. La adición de la mezcla de polímeros se realizó mientras las muestras se agitaban, y los tubos se mezclaron durante treinta minutos. Los tubos se centrifugaron durante 30 minutos a
3600 RPM, a 20ºC. Los sobrenadantes se decantaron, y los precipitados se resuspendieron en 1 ml de Imidazole
0,5 M (Baker Chemical Co.). Todas las muestras se resuspendieron fácil y claramente.

Después de 15 minutos de incubación en la solución de Imidazole, las muestras recibieron, mientras se agitaban,
1 ml de mezcla de polímeros. Los tubos se mezclaron durante 30 minutos y se centrifugaron durante 30 minutos a 20ºC, a 3600 RPM. Los sobrenadantes se decantaron, y los precipitados se resuspendieron fácil y claramente en 1 ml de agua desionizada. Las muestras se hicieron reaccionar con un gradiente de pH de la mezcla de polímeros, ajustando el pH hacia abajo con ácido clorhídrico y hacia arriba con Imidazole 3 M. Los valores de pH ajustados son los indicados a continuación en la Tabla 6.

TABLA 6 pH ajustado para cada muestra

Nº de tubo	pH
1	4,1
2	4,8
3	5,8
4	6,6
5	7,2
6	8,0
7	8,7
8	9,3

Se añadió 1 ml de mezcla de polímeros con el pH ajustado, y se dejó mezclar durante 10 minutos. Después de la mezcla, se añadieron a cada tubo 40 \mul de glutaraldehído al 25%, diluido 1:10 con agua desionizada. Los tubos se mezclaron de nuevo durante 10 minutos, y se centrifugaron durante 30 minutos a 20ºC, a 3600 RPM. Los tubos se decantaron y las partículas se resuspendieron en 1 ml de PBS 1 X.

Resultados

Después de la centrifugación las muestras mostraron un claro gradiente en relación al pH, tanto en el tamaño como en el color. Antes de la resuspensión en PBS 1 X, los precipitados en las muestras 1, 2 y 7 eran levemente menores que los de los otros tubos. No había precipitación aparente en la muestra de pH 9,3, porque la alta alcalinidad inhibe la capacidad de la mezcla de polímeros para precipitar proteínas. Las muestras de valores de pH ácidos eran blancas, y las muestras crecían cada vez más a amarillo-naranja a lo largo del gradiente. También, el tamaño de las partículas era directamente proporcional al pH, siendo las partículas de la muestra 1 muy finas. Según aumentaba el pH, las partículas eran mayores y tendían a agruparse más.

Conclusión

El tamaño de las partículas de anticuerpo puede controlarse fácilmente alterando el pH de la mezcla de polímero. A pH alto, las formas de glutaraldehído se unen muy fuertemente con los grupos amino de las proteínas, siendo las responsables del color amarillo-naranja y de la pegajosidad global de las muestras crecientemente básicas. Sin embargo, a valores de pH ácidos, los efectos del glutaraldehído están disminuidos. Las partículas todavía pueden formarse, pero son mucho más finas, con menos tendencia a agregarse que las partículas hechas con la mezcla de polímeros básica.

Ejemplo 8 Efecto de la concentración de glutaraldehído sobre la formación de micropartículas de IgG

Este experimento se realizó para mostrar el efecto del incremento de la cantidad de glutaraldehído sobre la formación de micropartículas de IgG.

Procedimiento experimental

Se añadió 1,0 ml de la mezcla de polímeros descrita en el Ejemplo 2, que contenía 48% de polímeros en total, pH 4,8, a 7 tubos de centrífuga. Se añadieron varios volúmenes de glutaraldehído, como se indica en la Tabla 7, a cada tubo.

TABLA 7 Concentración de glutaraldehído por tubo

Volumen de glutaraldehído	Nº de tubo
2 \mul	1
5 \mul	2
10 \mul	3
20 \mul	4

TABLA 7 (continuación)

Volumen de glutaraldehído	Nº de tubo
50 \mul	5
100 \mul	6
200 \mul	7

Se mezcló cada tubo bien, y se añadieron 300 \mul de IgG purificada, concentrada 3 x, en glicina 0,1 M, pH 11,2, solución de tampón que contenía 2 ng/ml de isotiocianato de fluoresceína (FITC) a cada tubo. Todos los tubos se mezclaron durante 1 hora a 20ºC, después se centrifugaron a 3600 RPM durante 30 minutos.

Los sobrenadantes se decantaron y las partículas se lavaron en 5 ml de glicina 0,5 M en solución de tampón PBS 1 X, pH 7,0. Se dejaron mezclar durante 30 minutos a 20ºC. Se centrifugaron a 2600 RPM, a 20ºC, durante 30 minutos. Este procedimiento de lavado se repitió dos veces más.

Las partículas se guardaron a 4ºC en 5,0 ml de glicina 0,5 M, en solución de tampón PBS 1 X, pH 7,0.

Observaciones

Según aumentaba la cantidad de glutaraldehído, se percibía más el número de partículas y un mayor color naranja.

Las partículas se lavaron repetidamente hasta que los sobrenadantes estuvieron claros.

La centrifugación final proporcionó precipitados que no se adherían del todo a la pared del tubo. Los sobrenadantes tenían que retirarse cuidadosamente con una pipeta desechable, y se dejaba detrás 1 ml de solución de tampón.

Conclusiones

Hay una relación directa entre el incremento de la cantidad de glutaraldehído añadido a la mezcla de polímeros (48% de polímeros en total), y el incremento en la cantidad de partículas formadas. La cantidad de glutaraldehído (entre 2 \mul y 200 \mul de una solución acuosa al 25%), parece no tener efecto sobre el aumento o la disminución del tamaño de las partículas.

Ejemplo 9 Preparación y análisis in vitro de la unión de micropartículas de anticuerpo monoclonal anti-HCG a HCG yodada

Este experimento se realizó para formar micropartículas de anticuerpo monoclonal específico anti gonadotropina coriónica humana (HCG), con mezcla de polímeros PVP/PEG, y diferentes concentraciones de glutaraldehído, y para demostrar la capacidad de las micropartículas para unirse a los antígenos de HCG indicados en un inmunoanálisis.

Procedimiento experimental

Se descongelaron dos tubos de 1 ml de muestra de anticuerpo anti-HCG purificado, preparado según los métodos especificados en el Ejemplo 2, y se combinaron ambos. Se mezclaron bien. Se crearon soluciones con porcentaje progresivamente menor de glutaraldehído (a partir de una solución acuosa al 25%), como se indica en la Tabla 8.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 8 Porcentaje final de glutaraldehído por tubo

3

Se añadieron 150 \mul de la muestra de HCG combinada a cada tubo que contenía 100 \mul de la solución de glutaraldehído al porcentaje indicado, mientras se agitaba. Se dejaron mezclar a temperatura ambiente durante 45 minutos.

Se añadieron 0,5 ml de la mezcla de polímeros (40% total de polímeros, pH 6,6), rápidamente a cada tubo, y se dejaron mezclaron a 20ºC durante 30 minutos. Se centrifugaron a 3500 RPM a 4ºC durante 3 minutos. Se decantaron los sobrenadantes. Se añadieron 2 ml de glicina 0,5 M en PBS 1 X, pH 7,0 a cada tubo, y se dejaron mezclar durante 30 minutos a 20ºC. Se centrifugaron a 3000 RPM durante 30 minutos a 4ºC. Se decantaron los sobrenadantes y se resuspendieron las partículas en 2,0 ml de glicina 0,5 M en PBS 1 X. Se mezclaron bien pero brevemente. Se centrifugaron a 3000 RPM durante 30 minutos a 4ºC. Se repitió el procedimiento de lavado una vez más. Se dejaron los tubos a 4ºC durante la noche.

Se centrifugaron las partículas a 3000 RPM a 4ºC durante 12 minutos. Se decantaron los sobrenadantes y se resuspendieron las partículas en 2,0 ml de PBS 1 X.

Observaciones

Se observó una tendencia en el tamaño de las partículas. Según disminuía la concentración de glutaraldehído, el número de partículas disminuía, pero el tamaño de las partículas aumentaba. No se observaron partículas en el tubo
nº 7 (testigo).

Inmunoanálisis

Se añadieron 50 \mul de cada muestra, que contenía las partículas preparadas como se explicó anteriormente, a 3 grupos de 6 tubos (A, B y C) (18 tubos en total).

Se añadieron 25 \mul de trazador de HCG (antígeno HCG yodado, Becton Dickinson, San Jose, CA) a los tubos 1-6 del grupo A, y además a un tubo testigo que contenía anticuerpo anti-HCG, para cuenteo total.

Se añadieron 25 \mul de trazador de hormona estimulante de folículos (FSH) (antígeno de FSH yodado) a los tubos 1-6 del grupo B y a un tubo testigo que contenía anticuerpo anti-FSH para cuenteo total.

Se añadieron 25 \mul de trazador de estradiol (antígeno de estradiol yodado) a los tubos 1-6 del grupo C y a un tubo testigo que contenía anticuerpo anti-estradiol, para cuenteo total.

Se agitaron todos los tubos brevemente, y se los dejó a temperatura ambiente durante 60 minutos. Se añadieron 2,0 ml de agua desionizada, se mezclaron y se centrifugaron durante 30 minutos a 3000 RPM. Se dacantaron los tubos cuidadosamente (se dejaron aproximadamente 100 microlitros de agua residual en los tubos).

Se realizó el cuenteo de todos los tubos durante 1 minuto en un contador de escintilación. Los resultados se indican a continuación en la Tabla 9.

TABLA 9 Unión de antígeno radiactivo a las micropartículas de anti-HCG

4

Conclusión

Según decrece la concentración de glutaraldehído, se forman menos micropartículas de anticuerpo monoclonal anti-HCG, pero estas partículas son de tamaño mayor. Las micropartículas anti-HCG son capaces de unirse a antígeno HCG yodado en un inmunoanálisis. Las micropartículas anti-HCG no son capaces de unirse inespecíficamente a otros antígenos yodados, tales como FSH y estradiol en un inmunoanálisis.

Ejemplo 10 Preparación de micropartículas de toxoide tetánico

Este experimento se realizó para preparar micropartículas de toxoide tetánico con una mezcla de polímeros de PVP y PEG y glutaraldehído.

Procedimiento experimental

Se añadió 1 ml de una mezcla de polímeros de PVP/PEG al 54% en dos tubos de centrífuga. Se añadieron
100 \mul de glutaraldehído (solución acuosa al 25%), a uno de los tubos, y 10 \mul de glutaraldehído al otro, y se agitaron concienzudamente.

Se añadieron 0,5 ml de toxoide tetánico (1,0 mg/ml) (Dept. of Public Health) en ambos tubos y se agitaron concienzudamente.

Se dejaron mezclar durante 4 horas y 15 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugaron a 3000 RPM a 4ºC durante 30 minutos. Se decantaron los sobrenadantes y se resuspendieron las partículas en 2,0 ml de glicina 0,5 M en solución de tampón PBS 1X. Se dejaron a 4ºC durante la noche.

Se repitió el procedimiento de lavado dos veces más. Las partículas se resuspendieron finalmente en 0,5 ml de solución de tampón PBS 1 X.

Observaciones

La reacción que contenía 100 \mul de glutaraldehído que contenía más partículas que la reacción con 10 \mul de glutaraldehído. Las partículas de ambas reacciones eran similares de tamaño. Las partículas parecen muy pequeñas a simple vista.

Ejemplo 11 Preparación de micropartículas de polímero de albúmina sérica bovina

Este experimento se realizó para demostrar la formación de micropartículas de albúmina sérica bovina (BSA) con una mezcla de polímeros de PVP/PEG y glutaraldehído y para observar el efecto de diferentes volúmenes de glutaraldehído utilizados en este proceso.

Procedimiento experimental

Se colocaron 110 mg de BSA en 11 ml de base Tris™ 0,1 M, pH 9,0. Se añadieron 11 mg FITC, se ajustó a pH 9,5 con base, se mezcló con base durante 30 minutos a 20ºC para formar BSA marcada fluorescentemente.

Se prepararon 8 tubos y se añadió a cada uno 1 ml de mezcla de polímeros (pH 5,0, 48% en total de polímeros), y se añadieron las siguientes cantidades de glutaraldehído (solución acuosa al 25%), como se indica en la Tabla 10.

TABLA 10 Concentración de glutaraldehído por tubo

Nº de tubo	Volumen de glutaraldehído
1	200 \mul
2	100 \mul
3	50 \mul
4	25 \mul
5	12 \mul
7	6 \mul
7	3 \mul
8	1 \mul

Se mezclaron breve pero concienzudamente, mediante agitación con vórtice. Se añadieron 300 \mul de solución BSA-FITC. Se mezclaron durante 7,5 horas.

Conclusiones

Se formaron micropartículas de albúmina sérica bovina en cada tubo. Según disminuía la cantidad de glutaraldehído, se formaban agregados de mayor tamaño, además de partículas finas pequeñas, visibles con todos los volúmenes de glutaraldehído (1 \mul a 200 \mul). También, según aumentaba la cantidad de glutaraldehído, aumentaba en número de partículas finas pequeñas.

Ejemplo 12 Preparación de micropartículas de inmunoglobulinas con sulfato amónico saturado como agente deshidratante

Este experimento se realizó para preparar micropartículas de inmunoglobulinas, utilizando sulfato amónico saturado, sobre un gradiente de pH, como agente deshidratante, y glutaraldehído como agente de reticulación.

Procedimiento experimental

Se prepararon 100 ml de una solución de sulfato amónico saturado, disolviendo 76,1 g de sulfato amónico (Fisher Scientific, Pittsburg, PA), en agua desionizada, pH 5,2, hasta un total de 100 ml.

Se prepararon soluciones de sulfato amónico con diferentes pH, ajustando partes alícuotas de la solución preparada previamente, con ácido acético glacial, para pH de valores bajos, y con hidróxido sódico 2 N para los valores de pH más altos, como se indica a continuación en la Tabla 11.

TABLA 11 pH ajustado de la solución de sulfato amónico saturado por tubo

pH	Número de tubo
4,2	1
5,2	2
6,5	3
7,1	4
8,1	5
9,2	6

Se añadió una parte alícuota de 0,3 ml de cada solución de sulfato amónico saturado a un tubo de centrífuga de

\hbox{15 ml.}

Se añadieron 50 ml de glutaraldehído (solución acuosa al 25%) a cada tubo, y se mezclaron bien.

Se añadió a cada tubo una muestra de 0,3 ml de IgG purificada de plasma humano, purificada con los métodos indicados en el Ejemplo 2. Todos los tubos se mezclaron después durante 15 minutos a temperatura ambiente. La formación de partículas se observó inmediatamente, después de la adición de la mezcla de IgG purificada.

Se añadieron 5,0 ml de glicina 0,5 M en solución de tampón PBS 1 X, pH 7,0, a cada tubo. Los tubos se mezclaron bien, y se centrifugaron a 2600 RPM a 20ºC durante 30 minutos.

Se decantaron los sobrenadantes y se lavaron las partículas en 5 ml de glicina 0,5 M en solución de tampón PBS 1 X, pH 7,0. Se mezclaron durante 30 minutos a 20ºC, y después se centrifugaron a 2600 RPM a 20ºC durante 30 minutos. Este procedimiento de lavado se repitió tres veces más.

Observaciones

Inmediatamente después de que la IgG purificada se añadieron a las soluciones de sulfato amónico (saturado) que contenían glutaraldehído, se observaron partículas mientras se mezclaban los tubos.

Se encontró una relación directa entre el aumento del pH de la solución de sulfato amónico saturado y un aumento en la cantidad de partículas formadas.

El tamaño de las partículas no difería entre el intervalo de pH de las soluciones de sulfato amónico saturado.

Ejemplo 13 Preparación de micropartículas de inmunoglobulina con una mezcla de sulfato amónico saturado y polietilen glicol como agente deshidratante

Este experimento se realizó para preparar micropartículas de inmunoglobulina utilizando una mezcla de sulfato amónico saturado y polietilen glicol (PEG) como agente deshidratante, y glutaraldehído como agente de reticulación.

Procedimiento experimental

Se preparó un volumen de 100 ml de sulfato amónico saturado como se describió en el Ejemplo 12. También se preparó una solución al 20% de polietilen glicol (Sigma, St. Louis, MO), en acetato sódico 0,1 M, pH 4,8. Se añadió la solución de sulfato amónico, en pequeños incrementos, a 10 ml de solución de PEG, hasta que el sulfato amónico precipitó. El mayor volumen de sulfato amónico que podía permanecer en solución era 1,2 ml. Un ml de esta solución de sulfato amónico/PEG se separó en partes alícuotas en ocho tubos. Se añadió a los tubos glutaraldehído al 25% (Sigma, St. Louis, MO), en las cantidades especificadas en la Tabla 12, a continuación

TABLA 12 Cantidad de glutaraldehído añadido a la solución de sulfato amónico/PEG

Número de tubo	Glutaraldehído
1	0 \mul
2	2 \mul
3	5 \mul
4	10 \mul
5	20 \mul
6	50 \mul
7	100 \mul
8	200 \mul

Los tubos 5-8 mostraron una reacción de color que aumentaba de intensidad a través del gradiente. La brillantez del color también aumentaba a lo largo del tiempo. Esto era el resultado del glutaraldehído reaccionando con la amina del sulfato amónico. Los tubos 1-4 no cambiaron de color, porque las concentraciones de glutaraldehído en estos tubos era muy baja.

Se añadió a cada tubo una parte alícuota de 300 \mul de anticuerpo IgG porcino purificado, concentrado 3 veces, mientras se agitaba con vórtice. Los tubos se mezclaron después durante 60 minutos y se centrifugaron durante 30 minutos a 3600 RPM a 20ºC.

Los sobrenadantes se decantaron se añadieron 10 ml de glicina 0,5 M (Sigma, St. Louis, MO), pH 7,0, en solución salina tamponada con fosfato, a cada precipitado. Los tubos se agitaron bien para romper los precipitados y se guardaron a 4ºC durante la noche.

A la mañana siguiente, los tubos se centrifugaron durante 30 minutos a 3600 RPM a 20ºC. Los sobrenadantes se decantaron y los precipitados se lavaron con 5 ml de la solución de tampón de glicina 0,5 M. Después de agitarlos bien, los tubos se centrifugaron durante 30 minutos a 3600 RPM a 20ºC. Después de la centrifugación, los sobrenadantes se decantaron y se añadieron 5 ml de solución de tampón de glicina 0,5 M a los precipitados. Los tubos se agitaron bien.

Resultados

Después de la primera centrifugación, los precipitados diferían en tamaño y en color, siendo los precipitados mayores y más oscuros según aumentaba la concentración de glutaraldehído. Después de romper los precipitados y mezclarlos bien, las partículas eran aparentes en todos los tubos, excepto en el tubo nº 1, que no contenía glutaraldehído. Había finas partículas, que parecían tener un tamaño uniforme, en los tubos 2-7. Sin embargo, las partículas eran pegajosas y tendían a agregarse en todos los tubos. Parecía haber una mayor proporción de agregación, relativa a la cantidad de partículas en el tubo, en aquellos tubos que recibieron menos de 20 \mul de glutaraldehído. Estos resultados eran consistentes después del final de dos lavados.

Ejemplo 14 Preparación de micropartículas de insulina

Este experimento se realizó para preparar micropartículas de insulina con una mezcla de polímeros de PVP y PEG y glutaraldehído, medir la concentración de micropartículas formadas, y analizar su actividad inmunológica.

Preparación de micropartículas

Se disolvieron 30 mg de insulina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), de páncreas bovino, en 3,0 ml de HCl 3 M, para disolver la insulina desecada. Se ajustó el pH a entre 8,4 y 9,0, utilizando incrementos de 25 \mul de NaOH 2 N.

Se añadió una parte alícuota de 1 ml de una mezcla de polímeros de PVP/PEG al 54%, pH 5,0, en tres tubos de centrífuga. Se añadieron las siguientes cantidades de glutaraldehído (Grado II, solución acuosa al 25%, Sigam Chemical Co., St. Louis, MO), a cada uno de los tubos: 25 \mul de glutaraldehído al tubo A, 50 \mul de glutarladehído al tubo B, 100 \mul de glutaraldehído al tubo C.

Se añadió 1,0 ml de la insulina disuelta a cada tubo, mientras se agitaba con vórtice. Se dejaron mezclar durante 6 a 8 horas a 20ºC, y se les dejó estar durante la noche.

Las partículas lavadas nueve veces, utilizando 5,0 ml de solución de lisina, pH 9,4, que contenía 1 mg/ml de azida sódica (10 mg de lisina/ml de agua desionizada). El procedimiento de lavado consistía en añadir 5,0 ml de solución de lisina a las partículas, mezclarlas bien pero brevemente. Se centrifugaron a 2300 rpm durante 30 minutos a 20ºC. Se aspiraron los sobrenadantes y se repitió el procedimiento. Se guardaron las partículas en la solución de lisina durante la noche a 4ºC.

Se centrifugaron las partículas, se aspiraron los sobrenadantes, y las partículas se resuspendieron en 5,0 ml de solución salina tamponada con fosfato 1 X, pH 7,0. El pH final de cada resuspensión era el siguiente: en el tubo A era pH 7,4, en el tubo B era pH 7,2 en el tubo C era ph 7,2.

Resultados

Las partículas formadas eran muy pequeñas y muy finas. Durante la centrifugación en la solución de lisina, las partículas eran incapaces de compactarse completamente. Después de un lavado con la solución salina tamponada con fosfato, las partículas eran capaces de compactarse en un grado mayor, y también formaban agregados de partículas.

El tubo C tenía la mayor cantidad de partículas. El tubo B tenía más partículas que el tubo A. Así, la formación de partículas aumentaba con la cantidad de glutaraldehído añadido a cada tubo.

Ensayo de peroxidasa anti-insulina de oveja

La actividad inmunológica de las micropartículas de insulina se determinó midiendo la capacidad de las micropartículas para unirse a anti-insulina de oveja, en un ensayo de peroxidasa anti-insulina de oveja.

Se prepararon tres series de cuatro tubos cada una. Se añadieron los siguientes volúmenes de partículas de insulina de cada uno de los tubos A, B y C anteriores, en el tubo apropiado para cada serie, como se muestra más adelante en la Tabla 13.

Se añadieron las cantidades apropiadas de solución salina tamponada con fosfato 1 x, pH 7,0, a cada uno de los tubos, para conseguir un volumen final de 1,0 ml. Se mezclaron bien todos los tubos, pero brevemente. Se añadieron 100 \mul de peroxidasa anti-insulina de oveja (Biodesign International, Kenebunkport, ME, 5 mg/ml de proteína). Se mezclaron bien. Se incubaron los tubos a temperatura ambiente durante 4 horas y diez minutos. Se dejaron los tubos a 4ºC durante la noche.

Se centrifugaron todos los tubos de todas las series a 3000 rpm a 20ºC durante 30 minutos. Se retiró cuidadosamente solo el 90% de los sobrenadantes, para prevenir la pérdida accidental de partículas. Se añadió 1,0 ml de detergente Tween™ al 0,2% en solución salina tamponada con fosfato 1 X a los tubos aspirados, y se mezclaron mediante agitación con vórtice. Se hicieron reaccionar 100 \mul de cada uno de los sobrenadantes con 0,5 ml de cromógeno
TM Blue™ (tetrametilbencidina, Center for Diagnostic Products, Milford, MA). Todos los sobrenadantes fueron positivos. Se repitió el procedimiento de lavado completo dos veces más, para eliminar todo el exceso de peroxidasa anti-insulina de oveja no unida.

Después del lavado final, se aspiró el 90% de los sobrenadantes, y se retiraron 50 \mul de partículas de cada tubo, y se hicieron reaccionar con 0,2 ml de cromógeno TM Blue™.

Resultados

Los resultados, mostrados más abajo en la Tabla 13, demostraban que las micropartículas de insulina son capaces de unirse a anti-insulina de oveja, lo que indica que estas partículas son inmunológicamente activas.

TABLA 13 Capacidad de las partículas de insulina formadas utilizando varias cantidades de glutaraldehído, par unirse a anti-insulina de oveja

Partículas de insulina	Glutaraldehído
(volumen)	25 \mul	50 \mul	100 \mul
100 \mul	+++++++++	+++++++	+++++
50 \mul	+++++++	+++++	++++
20 \mul	+++++	+++	++
10 \mul	+++	++	+

Ensayo de inhibición

La actividad inmunológica de las micropartículas de insulina se determinó midiendo la capacidad de las micropartículas para unirse anti-insulina de oveja en un ensayo de inhibición.

Dos series de 5 tubos cada una se prepararon como sigue. Se añadieron los siguientes volúmenes de partículas de insulina, de las reacciones A y C anteriores, a los tubos de centrífuga apropiados, como se muestra más adelante en la Tabla 14.

Se añadieron 100 \mul de Immunophase Insulin Tracer™ (insulina yodada, Ciba Corning) a todos los tubos en ambas series. Se agitaron con vórtice. Se añadió 1,0 \mul de anticuero anti-insulina Immunophase™ (Ciba Corning). Se agitaron con vórtice. Se les dejó permanecer durante 4 horas y 30 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugaron a 3000 rpm durante 30 minutos a 20ºC

Se contaron los tubos en un contador gamma de escintilación durante 1 minuto.

Resultados

Los resultados, mostrados en la Tabla 14 demostraron, utilizando un ensayo de inhibición, que las micropartículas de insulina eran capaces de unirse a anti-insulina de oveja, lo que indica que estas partículas son inmunológicamente activas.

TABLA 14 Capacidad de las partículas de insulina formadas utilizando varias cantidades de glutaraldehído, para unirse a anti-insulina de oveja en presencia de insulina radiactiva.

Partículas de insulina	cpm
(volumen)	Reacción A	Reacción B
100 \mul	4235,5	1266,0
50 \mul	1460,1	1594,5
25 \mul	1573,6	1724,0
10 \mul	1958,4	2291,6
0 \mul	3192,6	3119,6

Ejemplo 15 Inmunización de ratones con micropartículas de toxoide tetánico

Este experimento se realizó para determinar los efectos in vivo de la inmunización con micropartículas de toxoide tetánico.

Los procedimientos, resultados y conclusiones de los experimentos fueron como sigue:

Procedimientos

Se prepararon micropartículas de toxoide tetánico como se describió generalmente anteriormente en el Ejemplo 10 como sigue:

Se preparó una solución al 27% de cada polímero, polivinilpirrolidina (MW 40.000) y polietilen glicol (MW 3500), obtenidos de Sigma, St. Louis, MO, añadiendo 27 gramos de polímero a 100 ml de agua destilada. El pH de cada solución de polímeros se ajustó a un pH de aproximadamente 6,25. Las soluciones de polímero se mezclaron 1:1, para crear una mezcla de polímeros (54% total de polímeros).

Se añadieron 100 \mul de una solución de glutarladehído al 5,0% (Sigma, St. Louis, MO), en agua desionizada, a 1,0 ml de la mezcla de polímeros PVP/PEG y se agitaron concienzudamente con vórtice.

Se añadieron 0,5 ml de toxoide tetánico (1,0 mg/ml), obtenido del Department of Public Health, a la mezcla de PVP/PEG-glutaraldehído y se agitaron concienzudamente con vórtice.

La combinación se mezcló durante 4 horas y 15 minutos a temperatura ambiente y después se centrifugó a 3000 RPM a 4ºC durante 30 minutos. Los sobrenadantes se decantaron, se resuspendieron las partículas en 2,0 ml de glicina 0,5 M en solución de tampón PBS 1 X, y se dejó permanecer durante la noche a 4ºC.

El procedimiento de lavado se repitió dos veces más. Las partículas de toxoide tetánico se resuspendieron finalmente en 0,5 ml de solución de tampón PBS 1 X. Las partículas tenían un tamaño de partícula de entre aproximadamente 50 y 100 micras.

Se inyectó subcutáneamente a cada uno de un grupo de treinta y dos ratones, siguiendo el protocolo de la FDA, una dosis primaria que contenía 2 \mug de las partículas de toxoide tetánico. Siete semanas después de la primera inyección, se administró una dosis secundaria que contenía 2 \mug de partículas de toxoide tetánico. Se extrajeron muestras de sangre de los ratones 2, 4, 5, 8 y 10 semanas después de la inyección primaria, y se determinaron los títulos de anticuerpo en la sangre mediante inmunoanálisis. A los ratones se les administró una dosis letal de toxoide tetánico catorce semanas después de la inyección primaria.

Resultados

Como se muestra en la Figura 2, los títulos de anticuerpos aumentaron desde aproximadamente 10, 4 semanas después de la inyección primaria, hasta aproximadamente 3000, 10 semanas después de la inyección primaria. La línea de puntos indica los títulos que confieren 2 unidades antitoxina de protección contra el toxoide tetánico. Los títulos por encima de la línea de puntos indican una respuesta inmune positiva, según los estándares de la FDA. De este modo, como se muestra en la Figura 2, los ratones tenían una respuesta inmune positiva tan precozmente como cuatro semanas después de la inyección con micropartículas de toxoide tetánico. El aumento de los títulos de anticuerpos desde la semana dos a la diez indica que las micropartículas pueden estar proporcionando liberación lenta del antígeno del toxoide tetánico.

El 100% de los ratones sobrevivieron a la inyección letal de toxoide tetánico administrado a las catorce semanas. Esta tasa de supervivencia indica una respuesta inmune fuerte, que confiere protección contra el toxoide tetánico.

A la conclusión de este experimento, todos los ratones parecían sanos. No había inflamación ni cicatriz visible en el lugar de la inyección, y no había pérdida significativa de peso después de la inoculación. De este modo, las micropartículas de toxoide tetánico fueron generalmente no tóxicas cuando se administraron subcutáneamente.

Este experimento proporciona datos in vivo, que muestran que la administración de micropartículas de toxoide tetánico, preparadas según el método descrito previamente, proporciona una liberación lenta de antígeno de toxoide tetánico, produce una respuesta inmune positiva, y protege contra una dosis letal de toxoide tetánico, en ausencia de efectos adversos.

Ejemplo 16 Preparación de micropartículas de albúmina utilizando polímeros lineales y calor

Este experimento se realizó para preparar micropartículas de albúmina, incubando albúmina con mezclas de polímeros de PVP y PE a diversas temperaturas.

Procedimiento experimental

Se añadió a cada uno de cuatro tubos de reacción, 1,0 ml de una solución de albúmina de suero bovino-FITC, que contenía albúmina sérica bovina (BSA) al 1%, más 10 \mul de albúmina isotiocianato de fluoresceína dializado (FITC). Se añadieron a cada tubo 2,0 ml de una mezcla de polímeros que contenía 8% de PVP y 20% de PEG en acetato sódico 0,1 M, pH 5,0, mientras se agitaban con vórtice.

La reacción 1 se mezcló a temperatura ambiente durante 1,5 horas. La reacción 2 se mezcló a temperatura ambiente durante 30 minutos, y después se incubó en un baño de agua a 58ºC durante 30 minutos. La reacción 3 se colocó inmediatamente en un baño de agua a 58ºC durante 30 minutos. La reacción 4 se mezcló a temperatura ambiente durante 30 minutos, después se incubó en un baño de agua a 37ºC durante 30 minutos, y después se incubó en un baño de agua a 58ºC durante 30 minutos.

Se añadieron 2,0 ml de etanol al 10% a cada mezcla de reacción, y se mezclaron brevemente. Se centrifugaron durante 30 minutos a 3000 rpm a 20ºC. se aspiraron los sobrenadantes cuidadosamente. Se resuspendieron los precipitados en 2,0 ml de etanol. La mezcla de reacción 1 estaba clara, mientras que las mezclas 2, 3 y 4 estaban turbias. Se centrifugaron y se resuspendieron en 2,0 ml de agua desionizada y se examinaron bajo un microscopio de fluorescencia.

Resultados

No se encontraron micropartículas en la mezcla de reacción 1. La mezcla de reacción 2 contenía micropartículas no agregadas de un diámetro aproximado de entre 1 y 10 \mum. La mezcla de reacción 3 contenía micropartículas no agregadas de un diámetro aproximado de 10 \mum, con muchas micropartículas menores de 1 \mum de diámetro. La mezcla de reacción 4 contenía micropartículas no agregadas de un diámetro aproximado de entre 10 y 25 \mum, con algunas micropartículas menores de 1 \mum de diámetro.

Procedimiento experimental

Se añadió a cada uno de dos series de seis tubos de reacción, 1,0 ml de una solución de albúmina sérica bovina-FITC, que contenía albúmina sérica bovina (BSA) al 1%, más 10 \mul de albúmina isotiocianato de fluoresceína dializado (FITC). Se añadieron 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml, o 5,0 ml de una mezcla de polímeros que contenía 8,0% de PVP (MW 90.000) y 20% de PEG (MW 3500), pH 5,0, a cada tubo de la serie A, mientras se agitaban con vórtice. Se añadieron 0,5 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 3,0 ml, 4,0 ml, o 5,0 ml de una mezcla de polímeros que contenía 20% de PVP (MW 40.000) y 20% de PEG (MW 3350), pH 5,0, a cada tubo de la serie B, mientras se agitaba con vórtice.

Se dejaron las mezclas de reacción durante 30 minutos a temperatura ambiente, y después se colocaron los tubos en un baño de agua a 37-40ºC durante 30 minutos, y después se trasfirieron los tubos a un baño de agua a 56-60ºC durante 30 minutos. Se añadieron 2,0 ml de etanol al 10% y se centrifugaron a 3000 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se aspiraron los sobrenadantes y se resuspendieron las micropartículas en 2,0 ml de etanol al 10%. Se centrifugaron otra vez durante 15 minutos, se resuspendieron en 2,0 ml de agua desionizada y se examinaron bajo un microscopio de fluorescencia.

Resultados Serie A (8% PVP/20% PEG)

Las micropartículas formadas utilizando 0,5 ml de mezcla de polímeros eran mayoritariamente uniformes, y tenían un diámetro en un intervalo entre 1 y 3 \mum Se observaron pequeños agregados. Se vieron algunas micropartículas mayores, que tenían un diámetro de aproximadamente 25 \mum.

Las micropartículas formadas utilizando 1,0 ml de mezcla de polímeros eran menos uniformes que las formadas utilizando 0,5 ml, y tenían un diámetro en el intervalo entre menos de 1 y 10 \mum. Se observaron menos agregados que en el anterior. No se vieron micropartículas mayores.

Las micropartículas formadas utilizando 2,0 ml de mezcla de polímeros eran menos uniformes que las formadas utilizando 0,5 ml, y tenían un diámetro en el intervalo de entre menos de 1 y 15 \mum. Se observaron muy pocos agregados. No se vieron micropartículas grandes.

Las micropartículas formadas utilizando 3,0 ml de mezcla de polímeros eran menos uniformes que las formadas utilizando 0,5 ml, y tenían un diámetro en el intervalo de entre menos de 1 y 20 \mum. Se observaron muy pocos agregados. No se vieron micropartículas grandes.

Las micropartículas formadas utilizando 4,0 ml de mezcla de polímeros eran menos uniformes que las formadas utilizando 0,5 ml, y tenían un diámetro en el intervalo de entre menos de 1 y 25 \mum. No se observaron agregados ni micropartículas grandes.

Las micropartículas formadas utilizando 5,0 ml de mezcla de polímeros eran menos uniformes que las formadas utilizando 0,5 ml, y tenían un diámetro en el intervalo de entre menos de 1 y 30 \mum. No se observaron agregados ni micropartículas grandes.

Serie B (20% PVP/20% PEG)

Las micropartículas formadas utilizando 0,5 ml de mezcla de polímeros tenían la forma de pequeños agregados que contenían entre 10 y 20 micropartículas, cada una con un diámetro de menos de 1 \mum. Se observaron algunas micropartículas grandes que tenían un diámetro de aproximadamente entre 5 y 20 \mum.

Las micropartículas formadas utilizando 1,0 ml de mezcla de polímeros tenían la forma de pequeños agregados que contenían entre 10 y 20 micropartículas, cada una con un diámetro de menos de 1 \mum. Se observaron frecuentemente micropartículas grandes que tenían un diámetro de aproximadamente entre 5 y 50 \mum.

Las micropartículas formadas utilizando 2,0 ml de mezcla de polímeros tenían la forma de grandes agregados que contenían micropartículas, con un diámetro por debajo de la micra. Se observaron algunas micropartículas que tenían un diámetro de aproximadamente entre 1 y 10 \mum.

Las micropartículas formadas utilizando 3,0 ml de mezcla de polímeros tenían la forma de pequeños y grandes agregados. Ocasionalmente se vieron micropartículas individuales que tenían un diámetro de aproximadamente 5 \mum.

Las micropartículas formadas utilizando 4,0 ml de mezcla de polímeros tenían la forma de pequeños agregados que contenían 10-20 micropartículas cada uno, que tenían un diámetro menor que las observadas cuando se utilizaron 0,5 ml de mezcla de polímeros. No se observaron micropartículas individuales.

Las micropartículas formadas utilizando 5,0 ml de mezcla de polímeros tenían la forma de pequeños y grandes agregados, que contenían micropartículas muy pequeñas. No se observaron micropartículas individuales.

Procedimiento experimental

Se añadió a cada uno de siete tubos de reacción, 1,0 ml de solución de albúmina sérica bovina-FITC. Se añadieron 0,5 ml, 0,75 ml, 1,0 ml, 1,25 ml, 1,5 ml, 1,75 ml o 2,0 ml de una mezcla de polímeros que contenía 20% de PVP (MW 40.000) y 20% de PEG (MW 3500), en acetato sódico 0,1 M, pH 5,0, a cada tubo, mientras se agitaba con vórtice.

Se dejaron las mezclas de reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos, después se colocaron los tubos en un baño de agua a 37-40ºC durante 30 minutos, y después se transfirieron los tubos a un baño de agua de 56 a 60ºC durante 30 minutos. Se añadieron 2 ml de etanol al 10% y se centrifugaron a 3000 rpm durante 30 minutos a 20ºC. Se aspiraron los sobrenadantes y se resuspendieron las micropartículas en 2,0 ml de etanol al 10%. Se centrifugaron otra vez durante 15 minutos, se resuspendieron en 2,0 ml de agua desionizada y se examinaron bajo un microscopio de fluorescencia.

Resultados

Las micropartículas formadas utilizando 0,5 ml de mezcla de polímeros tenían la forma de pequeños agregados de minúsculas micropartículas menores de 1 \mum de diámetro, con aproximadamente entre 10 y 20 por agregado. Ocasionalmente, se observaron micropartículas grandes únicas, que tenían un diámetro de entre 1 y 10 \mum.

Las micropartículas formadas utilizando 0,75 ml de mezcla de polímeros tenían la forma de pequeños agregados, con aproximadamente entre 10 y 20 micropartículas por agregado. Ocasionalmente, se observaron micropartículas grandes únicas, que tenían un diámetro de entre 1 y 10 \mum.

Las micropartículas formadas utilizando 1,0 ml de mezcla de polímeros, formaban agregados adherentes grandes durante la incubación de 37 a 40ºC. Los agregados contenían aproximadamente entre 1 y 5 micropartículas por agregado. Ocasionalmente, se observaron micropartículas grandes únicas que tenían un diámetro de entre 1 y 10 \mum.

Las micropartículas formadas utilizando 1,25 ml de mezcla de polímeros, formaban agregados durante la incubación de 56 a 60ºC. Los agregados contenían aproximadamente entre 1 y 5 micropartículas por agregado. Ocasionalmente, se observaron micropartículas grandes únicas que tenían un diámetro de entre 1 y 10 \mum.

Las micropartículas formadas utilizando 1,5 ml de mezcla de polímeros, formaban agregados durante la incubación de 56 a 60ºC. Los agregados contenían aproximadamente entre 1 y 5 micropartículas por agregado. Se observaron varias micropartículas únicas, mayores, que tenían un diámetro de entre 1 y 10 \mum.

Las micropartículas formadas utilizando 1,75 ml de mezcla de polímeros, formaban agregados durante la incubación de 56 a 60ºC. Debido a su pequeño tamaño, era difícil determinar si las micropartículas estaban presentes en los agregados. Se observaron varias micropartículas únicas, mayores, que tenían un diámetro de entre 1 y 10 \mum.

Las micropartículas formadas utilizando 2,0 ml de mezcla de polímeros, formaban agregados adherentes grandes de 10 a 100 micropartículas por agregado. Se observaron algunas micropartículas únicas, que tenían un diámetro de
1 \mum.

Este experimento demostraba que podían prepararse micropartículas de albúmina, incubando albúmina y una mezcla de PVP/PEG a una temperatura entre 37ºC y 60ºC, durante aproximadamente 30 minutos. El tamaño de las micropartículas y el grado de formación de agregados podía cambiarse alterando la composición o el volumen de la mezcla de polímeros de PVP/PEG añadida a la albúmina.

Claims (25)

1. Una composición de micropartículas que comprende macromoléculas en yuxtaposición con un agente deshidratante, en la que el agente deshidratante está seleccionado del grupo que consiste en polímeros solubles lineales y ramificados, y en la que la composición de micropartículas se obtiene incubando la macromolécula con el agente deshidratante, a una temperatura mayor que la temperatura ambiente, o en presencia de un agente de reticulación, durante una cantidad de tiempo suficiente para formar micropartículas.

2. La composición de micropartículas de la reivindicación 1, en la que la macromolécula está seleccionada del grupo que consiste en una proteína, carbohidrato, polisacárido, molécula de ácido nucleico, virus, partícula viral, fármaco, y sus mezclas.

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, en la que la proteína está seleccionada de un grupo que consiste en una inmunoglobulina, antígeno y receptor celular.

4. La composición de micropartículas de la reivindicación 1, que además comprende una molécula terapéutica.

5. La composición de micropartículas de la reivindicación 4, en la que la molécula terapéutica está seleccionada del grupo que consiste en agentes quimioterapéuticos, agentes antivirales, agentes antibacterianos, agentes antiparasitarios, inmunosupresores, citoquinas, hormonas, enzimas, y sus mezclas.

6. La composición de micropartículas de la reivindicación 1, que además comprende una sustancia magnética.

7. La composición de micropartículas de la reivindicación 1, en la que la macromolécula está marcada con un marcador detectable.

8. La composición de micropartículas de la reivindicación 7, en la que el marcador detectable está seleccionado de un grupo que consiste en un fluorocromo, marcador quimioluminiscente, partículas magnéticas, enzima, sustrato enzimático, y un marcador radiactivo.

9. La composición de micropartículas de la reivindicación 1, en la que la micropartícula es estable in vitro e in vivo.

10. La composición de micropartículas de la reivindicación 1, en la que el agente deshidratante es un polímero soluble lineal seleccionado del grupo que consiste en polivinilpirrolidona, polietilen glicol, dextrano, nonilfenol-etoxilatos, poli(alcohol vinílico), y sus mezclas y derivados.

11. La composición de micropartículas de la reivindicación 1, en la que las macromoléculas están reticuladas con un compuesto seleccionado del grupo que consiste en dialdehídos, aminas, iones multivalentes, moléculas multifuncionales que tienen afinidad por grupos reactivos específicos sobre la molécula que está siendo reticulada, maleimidas N-sustituidas, haluros de alquilo bifuncionales, haluros de arilo, isocianatos, ácidos dicarboxílicos alifáticos o aromáticos, ácidos disulfónicos alifáticos o aromáticos, imidoésteres bifuncionales, carbodiimidas y vinilsulfonas, los cuales se incluyen en las mezclas de incubación.

12. Un método para preparar la composición de micropartículas según la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

a.

incubar una macromolécula con un agente deshidratante a una temperatura mayor que la temperatura ambiente, o en presencia de un agente de reticulación, durante una cantidad suficiente de tiempo para formar micropartículas, en el que el agente de reticulación está seleccionado de polímeros solubles lineales o ramificados, y

b.

separar las partículas de la mezcla de incubación.

13. El método de la reivindicación 12, en el que la temperatura de incubación es mayor o igual a 37ºC y menor o igual a 80ºC.

14. El método de la reivindicación 12, en el que la mezcla de incubación se incuba durante entre 5 minutos y 24 horas.

15. El método de la reivindicación 12, en el que la temperatura de incubación es menor o igual a la temperatura ambiente, cuando está presente un agente de reticulación.

16. El método de la reivindicación 12, que además comprende la etapa de lavar las partículas con una solución de tampón que contiene un agente de extinción.

17. El método de la reivindicación 12, en el que la etapa de incubación se realiza a un pH entre 5 y 8.

18. El método de la reivindicación 12, en el que el agente deshidratante es un polímero lineal soluble, seleccionado del grupo que consiste en polivinilpirrolidona, polietilen glicol, dextrano, nonilfenol-etoxilatos, poli(alcohol vinílico) y sus mezclas y derivados.

19. El método de la reivindicación 12, en el que el agente de reticulación está seleccionado del grupo que consiste en dialdehídos, aminas, iones multivalentes, moléculas multifuncionales que tienen afinidad por grupos reactivos específicos sobre la molécula que está siendo reticulada, maleimidas N-sustituidas, haluros de alquilo bifuncionales, haluros de arilo, isocianatos, ácidos dicarboxílicos alifáticos o aromáticos, ácidos disulfónicos alifáticos o aromáticos, imidoésteres bifuncionales, carbodiimidas y vinilsulfonas.

20. El método de la reivindicación 12, en el que la macromolécula está seleccionada del grupo que consiste en una proteína, carbohidrato, polisacárido, molécula de ácido nucleico, virus, partícula viral, fármaco, y sus mezclas.

21. Un método para aislar una molécula diana de una mezcla compleja que contiene la molécula, que comprende las etapas de:

a.

mezclar la mezcla compleja con una composición de micropartículas macromoleculares según la reivindicación 1, que tienen afinidad por la molécula diana, durante una cantidad de tiempo suficiente para permitir a la molécula diana unirse a la macromolécula, en el que la composición de micropartículas puede obtenerse incubando la macromolécula con un agente deshidratante, a una temperatura mayor que la temperatura ambiente, o en presencia de un agente de reticulación, durante una cantidad de tiempo suficiente para formar micropartículas, en el que el agente deshidratante está seleccionado de polímeros solubles lineales y ramificados, y en el que la macromolécula comprende una molécula de afinidad, específica para la molécula diana, y

b.

separar la molécula diana unida de la mezcla compleja.

22. El método de la reivindicación 21, en el que la micropartícula está inmovilizada.

23. El método de la reivindicación 21, en el que la molécula diana está seleccionada del grupo que consiste en una proteína, carbohidrato, molécula de ácido nucleico, virus, y células.

24. Un método para detectar una biomolécula diana en una muestra, que comprende:

a.

combinar con la muestra una composición de micropartículas según la reivindicación 1, en el que la composición de micropartículas puede obtenerse incubando la macromolécula con un agente deshidratante, a una temperatura mayor que la temperatura ambiente, o en presencia de un agente de reticulación, durante una cantidad de tiempo suficiente para formar micropartículas, en el que el agente deshidratante está seleccionado de polímeros solubles lineales o ramificados, y en el que la macromolécula comprende una molécula de afinidad específica para la biomolécula diana marcada con un agente formador de imagen detectable, y

b.

detectar el agente formador de imagen detectable.

25. El método de la reivindicación 24, en el que el agente formador de imagen detectable está seleccionado del grupo que consiste en un fluorocromo, marcador quimioluminiscente, partículas magnéticas, enzima, sustrato enzimático, y un marcador radiactivo.