JP2013502458A - 凝固第vii因子組成物ならびにそれを製造および使用する方法 - Google Patents
凝固第vii因子組成物ならびにそれを製造および使用する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013502458A JP2013502458A JP2012526708A JP2012526708A JP2013502458A JP 2013502458 A JP2013502458 A JP 2013502458A JP 2012526708 A JP2012526708 A JP 2012526708A JP 2012526708 A JP2012526708 A JP 2012526708A JP 2013502458 A JP2013502458 A JP 2013502458A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- xten
- sequence
- factor
- factor vii
- cfxten
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/001—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof by chemical synthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Abstract
Description
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与されたSBIR助成金2R44GM079873‐02の下で政府の支援により実施された。政府は、本発明においてある権利を有する。
本出願は、2009年8月24日に出願された米国仮出願シリアル番号第61/236,493号、2009年8月25日に出願された第61/236,836号、2009年11月10日に出願された第61/280,955号、2009年11月10日に出願された第61/280,956号、および2010年2月3日に出願された米国出願シリアル番号第12/699,761号の優先権の利益を主張するものであり、これらのすべて、および本明細書とともに出願される米国弁護士整理番号(docket number)32808‐726.201の下での同時係属出願は、それらの内容が全体としてすべての目的のために引用により本明細書に組み込まれる。
(XTEN)x−CF−(XTEN)y I
の融合タンパク質を提供し、式中、各発生について独立して、CFは凝固因子であり;xは0または1のいずれかであり、かつyは0または1のいずれかであり、式中、x+y≧1であり;かつXTENは伸長組換えポリペプチド(XTEN)である。
(XTEN)x−(CF)−(S)y−(XTEN)y II
の融合タンパク質を提供し、式中、各発生について独立して、CFは凝固因子であり;Sは、開裂配列を任意に含むことのできる1〜約50のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり;xは0または1のいずれかであり、かつyは0または1のいずれかであり、式中、x+y≧1であり;かつXTENは伸長組換えポリペプチドである。
(XTEN)x−(S)x−(CF)−(S)y−(XTEN)y III
に属し、式中、各発生について独立して、CFは凝固因子であり;Sは、開裂配列を任意に含むことのできる1〜約50のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり;xは0または1のいずれかであり、かつyは0または1のいずれかであり、式中、x+y≧1であり;かつXTENは伸長組換えポリペプチドである。
(Gla)−(XTEN)u−(EGF1)−(XTEN)v−(EGF2)−(XTEN)w−(AP)−(XTEN)x−(Pro)−(S)y−(XTEN)z IV
の単離された融合タンパク質を提供し、式中、各発生について独立して、Glaは、FIXのGlaドメインであり;EGF1は、FIXのEGF1ドメインであり;EGF2は、FIXのEFG2ドメインであり;APは、FIXの活性化因子ペプチドであり;PROは、FIXのプロテアーゼドメインであり;Sは、開裂配列を任意に含むことのできる1〜約50のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり;uは0または1のいずれかであり;vは0または1のいずれかであり;xは0または1のいずれかであり;yは0または1のいずれかであり;zは0または1のいずれかであり、ただし、u+v+w+x+z≧1という条件付きであり;かつXTENは伸長組換えポリペプチドである。
(Gla)−(XTEN)u−(EGF1)−(XTEN)v−(EGF2)−(AP1)−(XTEN)w−(AP2)−(XTEN)x−(Pro)−(S)y−(XTEN)z V
の単離された融合タンパク質を提供し、式中、各発生について独立して、Glaは、FIXのGlaドメインであり;EGF1は、FIXのEGF1ドメインであり;EGF2は、FIXのEFG2ドメインであり;APは、APドメインの第一の天然開裂配列を含むFIXの活性化因子ペプチドドメインのN末端配列部分であり;PROは、FIXのプロテアーゼドメインであり;Sは、開裂配列を任意に含むことのできる1〜約50のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり;uは0または1のいずれかであり;vは0または1のいずれかであり;xは0または1のいずれかであり;yは0または1のいずれかであり;zは0または1のいずれかであり、ただし、u+v+w+x+z≧1という条件付きであり;かつXTENは伸長組換えポリペプチドである。
(Gla)−(XTEN)u−(EGF1)−(XTEN)v−(EGF2)−(XTEN)w−(Pro)−(S)x−(XTEN)y VI
の単離された融合タンパク質を提供し、式中、各発生について独立して、Glaは、FVIIのGlaドメインであり;EGF1は、FVIIのEGF1ドメインであり;EGF2は、FVIIのEFG2ドメインであり;PROは、FVIIのプロテアーゼドメインであり;Sは、開裂配列を任意に含むことのできる1〜約50のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり;uは0または1のいずれかであり;vは0または1のいずれかであり;xは0または1のいずれかであり;yは0または1のいずれかであり、ただし、u+v+w+y≧1という条件付きであり;かつXTENは伸長組換えポリペプチドである。
(Gla)−(XTEN)t−(EGF1)−(XTEN)u−(EGF2)−(AP1)v−(XTEN)w−(AP2)x−(Pro)−(S)y−(XTEN)z VII
の単離された融合タンパク質を提供し、式中、各発生について独立して、Glaは、FVIIのGlaドメインであり;EGF1は、FVIIのEGF1ドメインであり;EGF2は、FVIIのEFG2ドメインであり;PROは、FVIIのプロテアーゼドメインであり;AP1は、天然の開裂配列を含むFIXの活性化因子ペプチドドメインのN末端配列部分であり;AP2は、天然開裂配列を含むFIXの活性化因子ペプチドドメインのC末端配列部分であり;Sは、開裂配列を任意に含むことのできる1〜約50のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり;tは0または1のいずれかであり;uは0または1のいずれかであり;vは0または1のいずれかであり;xは0または1のいずれかであり;yは0または1のいずれかであり;zは0または1のいずれかであり、ただし、t+u+w+z≧1という条件付きであり;かつXTENは伸長組換えポリペプチドである。本実施態様において、CFXTEN組成物には、先により完全に説明した通り、FIX活性化因子ペプチドドメイン配列の全部または第IX因子の活性化因子ペプチドドメイン由来の片側のもしくは両方の開裂配列、例えば、R145‐A146開裂部位と隣接する少なくとも約3〜約12のアミノ酸の配列、およびR180‐V181開裂部位と隣接する少なくとも約1〜約5のアミノ酸の配列を含むことができる。また、本発明は、AP開裂配列について表7のその他の任意の開裂配列の置換を意図する。
本明細書において記載されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願が、引用により組み込まれるよう具体的かつ個々に示されたのと同じ程度まで、引用により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用する場合、以下の用語は、別段の指定がない限り、該用語に帰する意味を有する。
本明細書で提供されるCFXTENポリペプチドの形態(複数可)に適用される場合の「治療効果」は、ヒトもしくは他の動物における疾患もしくは容態の治癒、緩和、逆転、寛解、もしくは予防を含むがこれらに限定されない生理学的効果、またはさもなければヒトもしくは動物の身体的もしくは精神的健康を指す。「治療有効量」は、疾患もしくは容態(例えば、出血症状)の症状を予防、軽減、逆転、もしくは寛解させるのに、または治療途中の対象の生存を長期化させるのに有効な化合物の量を指す。治療有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示に照らして、当業者の能力内に十分にある。
本発明の実施は、別段の記載がない限り、当該技術分野の技術内である免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノム科学、および組換えDNAに関する従来技術を採用する。それらの内容がすべて引用により本明細書に組み込まれているSambrook, J. et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual,” 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001; “Current protocols in molecular biology”, F. M. Ausubel, et al. eds.,1987; the series “Methods in Enzymology,” Academic Press, San Diego, CA.; “PCR 2: a practical approach”, M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., Oxford University Press, 1995; “Antibodies, a laboratory manual” Harlow, E. and Lane, D. eds., Cold Spring Harbor Laboratory,1988; “Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics,” 11th Edition, McGraw−Hill, 2005; and Freshney, R.I., “Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique,” 4th edition, John Wiley & Sons, Somerset, NJ, 2000を参照されたい。
本発明は、凝固因子(CF)を含む融合タンパク質組成物に一部関する。本明細書で使用する場合、「凝固因子」または「CF」は、第IX因子(FIX)、第VII因子(FVII)、FVIIおよびFIXの配列組み合わせ、またはそれらの模倣体、配列バリアント、および切り詰められたバージョンを指す。
「第IX因子」または「FIX」は、凝固因子タンパク質ならびにそれらの種および配列バリアントを意味し、ヒトFIX前駆体ポリペプチド(「プレプロ」)の461の一本鎖アミノ酸配列および成熟ヒトFIXの415の一本鎖アミノ酸配列を含むがこれらに限定されない。FIXには、血液凝固因子IXの典型的な特徴を有する第IX分子の任意の形態を含む。本明細書で使用する場合、「第IX因子」および「FIX」は、Glaドメイン(γ−カルボキシグルタミン酸残基を含む領域)、EGF1ドメインおよびEGF2ドメイン(ヒト表皮増殖因子に相同の配列を含む領域)、活性化ペプチドドメイン(成熟FIXの残基R136〜R180によって形成)、ならびにC末端プロテアーゼドメイン(「Pro」)、または当該技術分野で公知のこれらのドメインの同義語を含む、あるいはこの天然タンパク質の生物活性の少なくとも一部を保有する切り詰められた断片または配列バリアントであり得る、ポリペプチドを包含するよう意図される。FIXまたは配列バリアントは、米国特許第4,770,999号、第7,700,734号に説明されるようにクローン化されており、ヒト第IX因子をコードするcDNAは単離され、特徴づけられ、発現ベクターへとクローン化されている(例えば、Choo et al., Nature 299:178−180 (1982); Fair et al., Blood 64:194−204 (1984); and Kurachi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 79:6461−6464 (1982)参照)。
「第VII因子」または「FVII」は、凝固因子のタンパク質および種ならびにその配列バリアントを意味し、ヒトFVIIの406の一本鎖アミノ酸配列ならびに前駆体タンパク質の444のアミノ酸配列の不活性型および活性化型(相反する性質に対して別段の記載がない限り)の両方を含むがこれらに限定されない。本明細書で使用する場合、第VII因子およびFVIIは、Glaドメイン(γ‐カルボキシグルタミン酸残基を含む領域)、EGF1ドメインおよびEGF2ドメイン(ヒト表皮増殖因子と相同の配列を含む領域)、EGF2ドメインとProドメインの間の配列にわたる活性化ペプチドドメイン、ならびに触媒ドメインまたはペプチドダーゼS1ドメイン(セリンプロテアーゼ触媒三連構造)、あるいは当該技術分野で公知のこれらのドメインの同義語を含むポリペプチドを包含するか、あるいは天然タンパク質の生物活性の少なくとも一部を保有する切りつめられた断片または配列バリアントであり得る。肝臓によって産生されるビタミンK依存性血漿タンパク質である第VII因子(FVII)はまず、酵素前駆体として血中で循環する。第VII因子の主要な役割は、組織因子(TF)とともに凝固の過程を開始することである。血管の損傷の際に、組織因子は血液に曝露され、第VII因子を循環させる。一旦、TFに結合すると、FVIIは、異なるプロテアーゼによって第VII因子(FVIIa)の活性化型となるよう活性化され、これには、トロンビン(第IIa因子)、第Xa因子、第IXa因子、第XIIa因子、およびFVIIa−TF複合体自体がある。FVII酵素前駆体は、単一の部位であるArg152−Ile153におけるタンパク質分解性開裂によって活性化され、単一のジスルフィド結合によって連結される二本鎖プロテアーゼを結果的に生じる。FVIIaは、その補助因子である組織因子(TF)を結合して、第X因子(FX)をFXaに活性化することのできる複合体を形成し、それにより、フィブリン形成および止血を結果として生じる凝固カスケードを惹起する。ヒト第VII因子についての完全なヌクレオチドおよびアミノ酸の配列は公知であり、ヒトFVIIまたは配列バリアントは米国特許第4,784,950号、第5,833,982号、第6911323号、および第7,026,524号に説明される通りクローン化されている。
本発明は、凝固因子(CF)を含む融合タンパク質組成物を提供する。治療用タンパク質の循環半減期を延長させる1つの方法は、タンパク質の腎クリアランスを低下させることである。このことは、増大した分子サイズ(または水力学的半径)をタンパク質に与えることのできる、それゆえ腎クリアランスを低下させるポリマーに対してタンパク質を抱合することによって達成され得る。したがって、本発明の1つの目的は、より長い循環または終末半減期を有し、天然凝固因子の活性の少なくとも一部を保有する改良したFIXまたはFVII(またはFVIIa)分子を提供することであり(それにより、必要な投与回数を低下させる)、そのことが、それにより凝固欠乏および制御されていない出血をより効率的に治療することである。一態様において、本発明は、伸長した組換えポリペプチド(「XTEN」または「XTEN類」)に共有結合したFIXまたはFVIIなどのCFの全長の配列または配列バリアントを含むCFの単離された単量体融合タンパク質を提供する。下記でより完全に説明されるように、融合タンパク質には任意に、プロテアーゼによって作用される場合、融合タンパク質からCFを放出する開裂配列をさらに含むスペーサー配列を含む。
一態様において、本発明は、CFの連結された融合タンパク質パートナーとして有用なXTENポリペプチド組成物を提供し、結果的にCFXTEN融合タンパク質を生じる。XTENは一般的に、小さな親水性アミノ酸から主として構成される非天然の実質的に非反復性の配列を有する一般的に伸長した長さのポリペプチドであり、該配列は、生理学的条件下で低い程度の構造も、二次構造も三次構造も有さない。
いくつかの実施態様において、組成物のXTEN配列は、実質的に非反復性である。一般に、反復性アミノ酸配列は、コラーゲンおよびロイシンジッパーなどの天然の反復性配列によって具現化されるように、より高次の構造を凝集または形成する傾向を有する。これらの反復性アミノ酸はまた、結晶性のまたは偽結晶性の構造を結果的に生じる接触を形成する傾向にあり得る。対照的に、非反復性配列が凝集する低い傾向は、配列が反復性である場合にさもなくば凝集しがちであろう比較的低頻度の帯電したアミノ酸を有する長い配列のXTENの設計を可能にする。典型的には、CFXTEN融合タンパク質は、配列が実質的に非反復性である約100超〜約3000のアミノ酸残基のXTEN配列を含む。一実施態様において、XTEN配列は、配列中の3つの連続したアミノ酸がセリンでない限り(この場合、3つ以下の連続したアミノ酸はセリン残基である)、同一のアミノ酸種類である約100超〜約3000のアミノ酸残基を有する。前述の実施態様において、XTEN配列は、「実質的に非反復性で」ある。
本発明は、モチーフのアミノ酸配列が非反復性である、複数単位のより短い配列またはモチーフを含む融合パートナーとして用いられるXTENを包含する。非反復性基準は、XTEN配列を作製するために多量体化される配列モチーフのライブラリーを用いた「構築ブロック」アプローチにもかかわらず適合することができる。したがって、モチーフ自体が一般t値基に非反復性のアミノ酸配列からなるので、XTEN配列は、4つの異なる種類の配列モチーフと同じくらい少数の複数単位からなり得るのに対し、全体的なXTEN配列は実質的に非反復性にされる。
本発明の別の態様において、本発明は、伸長した長さの配列を有するXTENポリペプチドの担体を含むCFXTEN組成物を包含する。本発明は、非反復性の構造化されていないポリペプチドの長さを増大させると、XTENの構造化されていない性質を亢進し、相応して、XTEN担体を含む融合タンパク質の生物学的特性及び薬物動態特性を高めるという発見を用いる。実施例においてより完全に説明されるように、XTEMの長さにおける比例的延長は、単一のファミリー配列モチーフ(例えば、表3の4つのAEモチーフ)の固定された反復順序によって作製される場合でさえ、GORアルゴリズムによって決定される時、より短いXTEN長と比較して、より高い百分率のランダムコイル形成を有する配列を結果的に生じる。一般に、実施例において説明されるように、構造化されていないポリペプチド融合パートナーの長さを増大させると、結果的に、配列長のより短い構造化されていないポリペプチドパートナーとの融合タンパク質と比較して、終末半減期の不相応な延長を有する融合タンパク質を結果的に生じる。
一実施態様において、本発明は、単離されたCFXTEN融合タンパク質を提供し、この場合、XTEN成分の累積的な長さは、表4、9、10、11、12、および13から選択される少なくとも1つのポリペプチド配列セグメントを含む約100超〜約3000のアミノ酸残基であり、かつXTEN配列の残りの少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、またはそれより多くは、親水性アミノ酸を含み、かつXTENの残りの約2%未満は、疎水性アミノ酸もしくは芳香族アミノ酸もしくはシステインからなる。いくつかの実施態様において、XTENは、セグメントが同一かまたは異なる複数のセグメントを含む。別の実施態様において、本発明は、単離されたCFXTEN融合タンパク質を提供し、この場合、XTEN成分の累積的な長さは、約100超〜約3000のアミノ酸残基であり、かつ少なくとも約200〜約923、または少なくとも約200〜約875、または少なくとも約200〜約576、または少なくとも約200〜約288のアミノ酸残基の少なくとも1つの配列セグメントを含み、この場合配列セグメント(複数可)、配列セグメント(複数可)におけるグリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、グルタミン酸(E)、およびプロリン(P)の残基の合計は、配列セグメントの全アミノ酸配列の少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%、または少なくとも約99%を構成し、かつこの場合、該セグメントのサブシーケンススコアは、12未満、より好ましくは10未満、より好ましくは9未満、より好ましくは8未満、より好ましくは7未満、より好ましくは6未満、最も好ましくは5未満であり、かつXTEN配列(複数可)の残りの少なくとも約90%、または少なくとも約91%、または少なくとも約92%、または少なくとも約93%、または少なくとも約94%、または少なくとも約95%、または少なくとも約96%、または少なくとも約97%、または少なくとも約98%が親水性アミノ酸からなり、かつXTEN配列(複数可)の残りの約2%未満が疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸、またはシステインアミノ酸からなる。
いくつかの実施態様において、本発明は、CFXTEN融合タンパク質のN末端部分として組み込まれた短い長さのXTEN配列を提供する。融合タンパク質の発現は、結合している融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに組み込まれた(N末端XTENをコードする)最適化されたN末端リーダーポリヌクレオチド配列を含む好適な発現ベクターで形質転換された宿主細胞において亢進することが発見された。実施例14〜17において説明されるように、結合している融合タンパク質遺伝子における最適化されたN末端リーダー配列(NTS)を含むこのような発現ベクターで形質転換された宿主細胞は結果的に、NTSを含まないポリヌクレオチドからの相応する融合タンパク質の発現と比較して、融合タンパク質の非常に亢進した発現を生じ、発現を亢進するために用いられる非XTENリーダー配列の組み込みの必要性を除去する。一実施態様において、本発明は、NTSを含むCFXTEN融合タンパク質を提供し、この場合、宿主細胞におけるコード遺伝子からの結合している融合タンパク質の発現は、(コード遺伝子がNTSを欠失する)N末端XTEN配列を含まないCFXTEN融合タンパク質の発現と比較して約50%、または約75%、または約100%、または約150%、または約200%、または約400%亢進する。
AE48:MAEPAGSPTSTEEGTPGSGTASSSPGSSTPSGATGSPGASPGTSSTGS
AM48:MAEPAGSPTSTEEGASPGTSSTGSPGSSTPSGATGSPGSSTPSGATGS
別の実施態様において、短い鎖のN末端XTENは、より長い長さのXTENに連結され、CFXTEN融合タンパク質のN末端領域を形成し、この場合、短い長さのN末端XTENをコードするポリヌクレオチド配列は、宿主細胞における亢進した発現の特性を与え、かつこの場合、発現したXTENの長い長さは、先に説明した通り、融合タンパク質におけるXTEN担体の亢進した特性に起用する。前述において、短い長さのXTENは、本明細書に開示される任意のXTEN(例えば、表3のXTEN)に連結され、結果として生じるXTENは順に、融合タンパク質の成分としての本明細書に開示される任意のCF(例えば、表1または表2のCF)のN末端に連結される。あるいは、短い長さのXTENをコードするポリヌクレオチド(またはその相補体)は、本明細書に開示される任意のXTENをコードするポリヌクレオチド(またはその相補体)に連結され、結果として生じるN末端XTENコード遺伝子は順に、本明細書に開示される任意のCFをコードするポリヌクレオチドの5’に(またはその相補体の3’末端に)連結される。いくつかの実施態様において、長い長さのN末端XTENポリペプチドは、配列AE624、AE912、およびAM923からなる群から選択されるアミノ酸配列と比較して、少なくとも約80%、もしくは少なくとも約90%、もしくは少なくとも約91%、もしくは少なくとも約92%、もしくは少なくとも約93%、もしくは少なくとも約94%、もしくは少なくとも約95%、もしくは少なくとも約96%、もしくは少なくとも約97%、もしくは少なくとも約98%、もしくは少なくとも99%を呈するか、または100%の配列同一性を呈する。
他の実施態様において、XTENポリペプチドは、XTEN配列における正味の電荷を有するおよび/または疎水性アミノ酸の比を低下させるアミノ酸残基の組み込みによって与えられる構造化されていない特徴を有する。全体的な正味の電荷および正味の電荷密度は、XTEN配列における帯電したアミノ酸の含有量を修飾することによって制御される。いくつかの実施態様において、組成物のXTENの正味の電荷密度は、+0.1電荷/残基を上回り得るかまたは−0.1電荷/残基を下回り得る。本明細書のタンパク質またはペプチドの「正味の電荷密度」によって意味されるのは、該タンパク質またはペプチドにおけるアミノ酸の総数によって除される正味の電荷である。他の実施態様において、XTENの正味の電荷密度は、約0%、約1%、約2%、約3%、約4%、約5%、約6%、約7%、約8%、約9%、約10%、約11%、約12%、約13%、約14%、約15%、約16%、約17%、約18%、約19%、または約20%、またはそれより多くあり得る。
別の態様において、本発明は、XTEN配列が、低い程度の免疫原性を有するかまたは実質的に非免疫原性である組成物を提供する。いくつかの因子は、XTENの低免疫原性に寄与することができ、例えば、XTEN配列における、非反復性配列、構造化されていない立体配座、高い程度の溶解度、低い程度の自己凝集もしくは自己凝集の欠失、配列内のタンパク質分解性部位の低い程度もしくは欠失、およびエピトープの低い程度もしくは欠失である。
別の態様において、本発明は、XTENポリペプチドが、XTENを組み込んでいるCFXTEN融合タンパク質に相応の増大した見かけの分子量を与える高い水力学的半径を有する、XTENを提供する。実施例38に詳述されるように、FIX配列またはFVII配列など、CF配列に対するXTENの連結は結果的に、XTENに連結されていないCFと比較して、増大した水力学的半径、増大した見かけの分子量、および増大した見かけの分子量因子を結果的に生じる。例えば、長期化した半減期が所望である治療適用において、高い水力学的半径を有するXTENが、CFを含む融合タンパク質に組み込まれている組成物は、(天然のFIXおよびFVIIの両方よりも大きな、約70kDAの見かけの分子量に相当する)およそ3〜5nmの糸球体の孔サイズを超えて、該組成物の水力学的半径を効果的に拡大することができ(Caliceti. 2003. Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)−protein conjugates. Adv Drug Deliv Rev 55:1261−1277)、結果的に循環しているタンパク質の低下した腎クリアランスを生じる。タンパク質の水力学的半径は、その分子量によっておよび、形状またはコンパクトさを含めたその構造によって決定される。特定の理論に結び付けられることなく、XTENは、ペプチドの個々の電荷間の静電反発力、または二次構造を与える能力を欠失する配列中の特定のアミノ酸によって与えられる固有の柔軟性により、開いた立体配座を採用することができる。XTENポリペプチドの開いた、伸長した、および構造化されていない立体配座は、典型的な球状タンパク質などの二次および/または三次構造を有するかなりの配列長および/または分子量のポリペプチドと比較してより大きな比例した水力学的半径を有することができる。米国特許第6,406,632号および第7,294,513号において説明されるような分子ふるいクロマトグラフィー(SEC)の使用などによる、水力学的半径を決定するための方法は、当該技術分野で周知である。実施例38の結果が示すように、XTENの増大する長さの付加は結果的に、水力学的半径、見かけの分子量、および見かけの分子量因子のパラメータにおける比例的な増大を生じ、CFXTENを所望の特徴的なカットオフの見かけの分子量または水力学的半径に仕立てることができる。したがって、ある実施態様において、CFXTEN融合タンパク質は、該融合タンパク質が少なくとも約5nm、または少なくとも約8nm、または少なくとも約10nm、または12nm、または少なくとも約15nmの水力学的半径を有することができるよう、XTENを用いて構成されることができる。先の実施態様において、CFXTEN融合タンパク質におけるXTENによって与えられる大きな水力学的半径は、結果として生じる融合タンパク質の低下した腎クリアランスをもたらし、終末半減期の相応する延長、平均滞留時間の延長、および/または腎クリアランス速度の低下をもたらす。
対象の組成物のCFは、天然の全長のFIXポリペプチドまたはFVIIポリペプチドに限定されないだけでなく、組換えバージョン、ならびに配列バリアント、FVII配列およびFIX配列の組み合わせ、またはそれらの断片を有する生物学的におよび/または薬理学的に活性のある形態も含む。例えば、種々のアミノ酸の欠失、挿入、および置換がCFにおいて実施され、CFの生物学的活性または薬理学的特性に関して本発明の精神から逸脱せずにバリアントを作製することは認識される。ポリペプチド配列におけるアミノ酸についての保存的置換の例を表5に示す。しかしながら、CFの配列同一性が、本明細書に開示される具体的な配列と比較して100%未満であるCFXTENの実施態様において、本発明は、その他の任意の19の天然L−アミノ酸と、隣接するアミノ酸残基を含めたCFの配列内の任意の位置にあり得る所与のCF(例えば、FIXまたはFVII)の所与のアミノ酸残基との置換を熟慮する。任意の1つの置換が、生物活性における望ましくない変化を結果的に生じる場合、代替的なアミノ酸のうちの1つを採用することができ、本明細書に説明される方法によって、または例えばそのすべての内容が全体として引用により組み込まれている米国特許第5,364,934号において示される保存的突然変異および非保存的突然変異についての任意の技術およびガイドラインを用いて、または当該技術分野で一般的に公知の方法を用いて、コンストラクトを評価する。加えて、バリアントには、例えばポリペプチドを含むことができ、この場合、1つ以上のアミノ酸残基が、天然ペプチドの生物活性のすべてではないにしてもいくらかを保有するCFの全長の天然アミノ酸配列のN末端またはC末端において付加または欠失され;例えば、凝固カスケードにおいて別の凝固因子を活性化させるおよび/または該カスケードに関与する能力は、フィブリン形成および止血をもたらす。
本発明は、CF配列に対して内部に配置された1つ以上のXTEN配列を含むCFXTENを包含する。1つ以上の内部に配置されたXTENは、36〜≧1000のアミノ酸残基の配列長であり得る。いくつかの実施態様において、CFXTENは、表4、9、10、11、12、および13から選択される1つ以上のXTENと比較して、少なくとも約80%の配列同一性を、またはそれに代わるものとして、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性を有する1または2または3または4またはそれより多くのXTEN配列を有することができ、この場合、XTEN配列は、CF配列に対して内部に配置される。前述の一実施態様において、1つ以上の内部XTENを有するCFXTENは、表4から選択される1つ以上のXTENと比較して、少なくとも約80%の配列同一性を、またはそれに代わるものとして、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の配列同一性を有する融合タンパク質のN末端またはC末端に配置される追加的なXTENを有する。別の実施態様において、本発明は、プロテアーゼによって作用される場合にXTENが放出されることができるよう、開裂配列(例えば、表7の開裂配列)によってCFに連結されたC末端XTENをさらに含む(下記に詳述されるような)内部XTENを有するCFXTENを提供した。開裂配列によるXTENの連結は、下記におよび実施例においてより完全に説明される。
本発明は、野生型第VII因子を活性化しない凝血原プロテアーゼによって開裂可能な少なくとも1つの異種性配列を含む単離された第VII因子ポリペプチドを提供し、この場合、開裂の際に異種性配列である第VII因子ポリペプチドが活性化される。例えば、配列の一部に組み込まれまたは配列の一部を第IX因子由来の活性化ペプチドドメイン(AP)配列の第VII因子コンストラクト部分と置き換える第VII因子‐第IX因子複合配列バリアントを有するCFXTENは結果的に、凝固カスケードの内在性システムの一部として活性化されることのできる複合組成物を生じる。融合タンパク質のCF成分と同じ第VII因子‐第IX因子配列バリアントを組み込むCFXTENは、CF成分が活性化されない組成物の対象への投与を可能にし、内在性凝固カスケードの惹起によってまたは自己活性化によって(後者は遅い過程である)活性化されるまで、プロテアーゼ阻害剤による不活性化に大きく抵抗性のある不活性の循環するデポーとしてとどまるので多量で投薬することができる。FVII/FIX複合配列に関する非限定例を、天然FIXおよびFVIIのものとの相同性を有する複合アミノ酸配列の当該部分を示す図36に示す。いくつかの実施態様において、CFXTENは、FIX活性化ペプチド配列の部分または全体を、FVIIのプロテアーゼドメインのN末端側への、すなわち、全長の前駆体ポリペプチドの位置212におけるアルギニンまたは位置213におけるイソロイシンで始まるN末端に向けてのFVII配列についての1つまたは両方のFIX AP開裂部位と置き換える第VII因子‐第IX因子配列バリアントを含む。一実施態様において、第VII因子‐第IX因子配列CFは、完全長のFIX APドメインに加え、FIXのR145‐A146開裂部位およびR180‐V181開裂部位の片側または両側において隣接するアミノ酸残基に接する少なくとも約2、または少なくとも約3、または少なくとも約4、または少なくとも約5、または少なくとも約6、または少なくとも約7、または少なくとも約8、または少なくとも約9、または少なくとも約10、または少なくとも約11、または少なくとも約12のアミノ酸を組み込む(例えば、N末端側における12の隣接するアミノ酸およびC末端側の5の隣接するアミノ酸の場合における配列RVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGE)。別の実施態様において、CFXTENは、R145‐A146開裂部位に隣接する少なくとも約2、または少なくとも約3、または少なくとも約4、または少なくとも約5の配列を含むAPの一部を組み込む第VII因子‐第IX因子配列バリアントを含む(例えば、開裂部位のいずれかの側にある6の隣接するアミノ酸の場合におけるTSKLTRAETVFP)。別の実施態様において、CFXTENは、R180‐V181 AP開裂部位の片側または両側に隣接する少なくとも約2、または少なくとも約3、または少なくとも約4、または少なくとも約5のアミノ酸の配列を含むAPの一部を組み込む第VII因子‐第IX因子配列バリアントを含む(例えば、FIX由来の開裂部位のN末端隣接における4のアミノ酸およびC末端としてのバリンの場合における該配列およびDFTRV)。別の実施態様において、CFXTENは、融合タンパク質のFVII成分のC末端とXTEN成分との間のリンカーと同じAP配列をさらに含む本節の前述の任意の実施態様の第VII因子‐第IX因子配列バリアント;例えば、FVIIバリアント‐AP配列‐XTENのN末端からC末端への立体配置を含み、それによりFVIIからFVIIaへの移行のものによる同じ内在性凝固因子によるCFXTEN融合タンパク質からの第VII因子‐第IX因子配列バリアント成分の放出を可能にする。別の実施態様において、CFXTENは、FVIIバリアント配列とXTENとの間のリンカーとしての第XI因子開裂配列KLTRAETをさらに含む本節の前述の任意の実施態様の第VII因子‐第IX因子配列バリアントを含み、それにより内在性の凝固カスケードの開始によるCFXTEN融合タンパク質からの第VII因子‐第IX因子配列バリアント成分の放出を可能にする。第VII因子‐第IX因子配列バリアントからのXTENの放出とともに、活性化された第VII因子‐第IX因子配列バリアントが、無処置のCFXTENと比較してより短い半減期を有し、それにより対象における組成物の安全性および許容性の余地を増大させるであろうことが期待される。本節の実施態様において、活性化された第VII因子‐第IX因子配列バリアント分子は、適切な任意のアッセイまたは本明細書で開示されるパラメータ(例えば、プロトロンビン時間または出血時間アッセイ)によって測定されるように、天然FVIIaとして生物活性の少なくとも約60%、または少なくとも約70%、または少なくとも約80%、または少なくとも約90%、または少なくとも約95%を有することができる。
本発明は、特異的なN末端からC末端への立体配置において連結されたCF成分およびXTEN成分を有するCFXTEN融合タンパク質組成物を提供する。いくつかの実施態様において、1つ以上のCFは、1つ以上のXTENに、N末端またはC末端のいずれかにおいて、スペーサーを用いてまたは用いずに連結され、ブロックコポリマーを形成し、CFXTEN融合タンパク質におけるCFおよびXTENの配列配置は、ブロックコポリマー化学物質において公知の立体配置と同じである。2つ以上のCF、XTEN、またはスペーサーがある場合、CF、XTENまたはスペーサーの各々は、同じかまたは異なる配列を有し、CFおよび/またはXTENは、連続的にまたは交互に(規則的にまたは不規則に)のいずれかで連結される。したがって、本明細書に提供される処方すべてにおいて、2つ以上のCF、XTEN、またはスペーサーがある場合、CF、XTEN、およびスペーサーの各々は同じかまたは異なる。いくつかの実施態様において、CFXTENは、1つのXTENポリペプチドに連結されたCFとの単量体融合タンパク質である。他の実施態様において、CFXTENは、2つ以上のXTENポリペプチドに連結されたCFとの単量体融合タンパク質である。さらに他の実施態様において、CFXTENは、1つのXTENポリペプチドに連結された2つ以上のCFとの単量体融合タンパク質である。さらに他の実施態様において、CFXTENは、2つ以上のXTENポリペプチドに連結された2つ以上のCFとの単量体融合タンパク質である。さらに他の実施態様において、CFXTENは、XTENがCF配列内に(例えば、図2および図5に示されるような1つ以上のドメイン間などのFIX配列内に)配置された単一のCFとの単量体融合タンパク質である。表6は、本発明のCFXTEN融合タンパク質によって包含される立体配置の非限定例を提供し、本明細書に開示されるまたは当該技術分野で公知のスペーサーおよび開裂配列の組み込みを含む数多くの他の変形は、当業者に明らかである。
**増殖因子成分およびXTEN成分のN末端からC末端への立体配置を反映
(XTEN)x−CF−(XTEN)y I
式中、各発生について独立して、CFは凝固因子であり、xは0または1のいずれかであり、かつyは0または1のいずれかであり、この場合x+y≧1であり、かつXTENは伸長した組換えポリペプチドである。
(XTEN)x−(CF)−(S)y−(XTEN) y II
式中、各発生について独立して、CFは凝固因子aであり、Sは、開裂配列を任意に含むことのできる1〜約50のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、xは0または1のいずれかであり、かつyは0または1のいずれかであり、この場合x+y≧1であり、かつXTENは伸長した組換えポリペプチドである。
(XTEN)x−(S)x−(CF)−(S)y −(XTEN)y III
式中、各発生について独立して、CFは凝固因子であり、Sは開裂配列を任意に含むことのできる1〜約50のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、xは0または1のいずれかであり、かつyは0または1であり、この場合x+y≧1であり、かつXTENは、伸長した組換えポリペプチドである。
(Gla)−(XTEN)u−(EGF1)−(XTEN)v−(EGF2)−(XTEN)w−(AP)−(XTEN)x−(Pro)−(S)y−(XTEN)z IV
式中、各発生について独立して、GlaはFIXのGlaドメインであり、EGF1は、FIXのEGF1ドメインであり、EGF2は、FIXのEFG2ドメインであり、AP1は、APドメインの第一の天然開裂配列を含むFIXの活性化因子ペプチドドメインのN末端配列部分であり、AP2は、APドメインの第二の天然開裂配列を含むFIXの活性化因子ペプチドドメインのC末端配列部分であり、PROは、FIXのプロテアーゼドメインであり、Sは、開裂配列を任意に含むことのできる1〜約50のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、uは、0または1のいずれかであり、vは0または1のいずれかであり、wは0または1のいずれかであり、xは0または1のいずれかであり、yは0または1のいずれかであり、zは0または1のいずれかであり、ただし、u+v+w+x+z≧1でありかつXTENが伸長した組換えポリペプチドであることという条件付きである。
(Gla)−(XTEN)u−(EGF1)−(XTEN)v−(EGF2)−(XTEN)w−(Pro)−(S)x−(XTEN)y VI
式中、各発生について独立して、GlaはFVIIのGlaドメインであり、EGF1は、FVIIのEGF1ドメインでありEGF2はFVIIのEFG2ドメインであり、PROはFVIIのプロテアーゼドメインであり、Sは、開裂配列を任意に含むことのできる1〜約50のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、uは0または1のいずれかであり、vは0または1のいずれかであり、xは0または1のいずれかであり、yは0または1のいずれかであり、かつXTENは伸長した組換えポリペプチドである。
(Gla)−(XTEN)t−(EGF1)−(XTEN)u−(EGF2)−(AP1)v−(XTEN)w−(AP2)x−(Pro)−(S)y−(XTEN)z VII
式中、各発生について独立して、GlaはFVIIのGlaドメインであり、EGF1はFVIIのEGF1ドメインであり、EGF2はFVIIのEFG2ドメインであり、PROは、FVIIのプロテアーゼドメインであり、AP1は、天然開裂配列を含むFIXの活性化因子ペプチドドメインのN末端配列部分であり、AP2は、天然開裂配列を含むFIXの活性化因子ペプチドドメインのC末端配列部分であり、Sは、開裂配列を任意に含むことのできる1〜約50のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり、tは0または1のいずれかであり、uは0または1のいずれかであり、vは0または1のいずれかであり、xは0または1のいずれかであり、yは0または1のいずれかであり、zは0または1のいずれかであり、XTENは伸長した組換えポリペプチドである。該実施態様において、第VII因子バリアントには、第IX因子の活性化因子ペプチドドメイン由来の1つまたは両方の開裂配列、例えば、下記により完全に説明されるように、R145‐A146開裂部位に隣接する少なくとも約2、または少なくとも約3、または少なくとも約4、または少なくとも約5のアミノ酸からなる配列(例えば、5の隣接するアミノ酸の場合、配列TSKLTRAETVFP)、およびR180‐V181開裂部位に隣接する少なくとも約2、または少なくとも約3、または少なくとも約4、または少なくとも約5のアミノ酸からなる配列(例えば、5の隣接するアミノ酸の場合、配列FNDFTRVVGGED)を含むことができる。、あた、本発明は、第VII因子バリアントのAP配列についての表7の任意の他の開裂配列の置換を熟慮する。
*スラッシュの前、間、または後の複数のアミノ酸の列挙は、該位置において置換されることのできる代替アミノ酸を示し、「−」は、任意のアミノ酸が、中央の列に示される相応のアミノ酸と置換され得ることを示す。
本発明は、XTENに連結されていないCFと比較して増大した薬物動態を有するCFXTEN融合タンパク質を提供する。所与のXTENをCFに連結することによって増大することのできるCFの薬物動態特性には、終末半減期、曲線下面積(AUC)、Cmax、分布の大きさ、および生物学的利用能;凝固因子と関連した障害、疾患、および関連した容態の治療において増大した有用性を提供する特性が挙げられるが、これらに限定されない。増大した特性の結果として、CFXTENは、本明細書に説明される方法によって組成物に適切であると決定された用量および用量投与計画で用いられる場合、所望の薬理学的効果を結果的に生じる循環濃度を達成することができ、XTENに連結されていないCFの比較可能な用量と比較して、組成物の生物活性成分についての安全な範囲内に延長した時間、なおもとどまる。このような場合、CFXTENは、XTENに連結されていないCFと比較して融合タンパク質組成物のための治療ウィンドウ内に延長した時間とどまり、対象に比較可能な用量で投与される。本明細書で使用する場合、「比較可能な用量」は、比較可能な様式で対象に投与される活性のあるCFファルマコフォア(例えば、FIXまたはFVII)について等価のモル/kgの用量を意味する。CFXTEN融合タンパク質の「比較可能な薬用量」が、薬剤のより大きな重量を表すであろうが、投与される融合タンパク質の用量におけるCFの本質的に同じモル当量を有するであろうことは、当該技術分野において理解される。
本発明は、XTEN に連結されていないCFと比較して亢進した特性を有することのできるXTENに共有結合したCFを含むCFXTEN組成物、ならびに該組成物の個々の2つのCF成分の治療的および/もしくは生物学的活性もしくは効果を亢進する方法を提供する。加えて、本発明は、アルブミン、免疫グロブリンポリペプチドパートナー、より短い長さのポリペプチド、および/または反復性配列を有するポリペプチドパートナーを含む当該技術分野で公知の融合タンパク質と比較して、亢進した特性を有するCFXTEN組成物を提供する。加えて、CFXTEN融合タンパク質は、ペグ化したコンストラクトなど、化学的抱合体を上回る有意な利点を提供し、組換えCFXTEN融合タンパク質が、生成物の研究および開発および製造のいずれの段階の時間および経費も削減することができる細菌細胞発現系において作製されることができ、結果的に、ペグ化した抱合体と比較してCFXTENの生成物および代謝産物の両方についての毒性のあまりない、より均質な規定された生成物を生じるという事実で明らかである。
別の態様において、本発明は、出血障害においておよび/またはFIXもしくはFVIIによって仲介される凝固因子と関連した疾患、障害、もしくは容態において有益な効果を達成するための方法を提供する。本明細書で使用する場合、「凝固因子と関連した疾患、障害、または容態」は、出血障害(例えば、欠陥性血小板機能、血小板減少症、またはフォン‐ウィルブランド病)、凝固障害(凝固因子欠乏症を含む血液凝固に関する任意の障害)、血友病B(別名クリスマス病)、第IX因子関連出血障害、第VII因子欠乏症、血友病A、脈管性損傷、血友病に苦しんでいない対象における制御されていない出血、外傷または手術由来の出血、抗凝固薬治療法による出血、およびFIXまたはFVIIの対象への投与によって寛解または矯正することのできる肝臓の疾患または容態による出血を含むよう意図されるが、これらに限定されない。本発明は、比較的短い終末半減期および/または狭い治療ウィンドウを有する第IX因子または第VII因子を用いた治療の他の方法の不利および/または限界に対処する。
本発明は、CFXTENキメラ融合タンパク質をコードする単離されたポリ核酸、およびその相同的バリアントを含むCFXTENキメラ融合タンパク質をコードするポリ核酸分子を提供する。別の態様において、本発明は、CFXTENキメラ融合タンパク質をコードするポリ核酸、およびその相同的バリアントを含むCFXTENキメラ融合タンパク質をコードするポリ核酸分子と相補的な配列を作製する方法を包含する。一般に、および図4〜図6において示されるように、CFXTEN融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を作製し、およびその結果として生じる遺伝子産物を発現する方法には、CFおよびXTENをコードするヌクレオチドを構築すること、フレームにおいて成分を連結すること、コード遺伝子を宿主細胞に適切な発現ベクターに組み込むこと、適切な宿主細胞を発現ベクターで形質転換すること、および形質転換した宿主細胞において融合タンパク質を発現させるまたは発現させることのできる条件下で、宿主細胞を培養し、それにより生物活性のあるCFXTENポリペプチドを産生し、該ポリペプチドが、単離された融合タンパク質として、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製方法によって回収されることを含む。分子生物学における標準的な組み換え技術を用いて、本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクターを作製する。
別の態様において、本発明は、所望の長さおよび配列のXTENを個0−度する遺伝子を構築するために用いられるXTEN配列をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを提供する。
原核宿主との発現ベクターの使用に好適なプロモーターには、β−ラクタマーゼ系およびラクトースプロモーター系[Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)]、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776]、およびtacプロモーターなどのハイブリッドプロモーター[deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21−25 (1983)]が含まれ、すべて、CFXTENポリペプチドをコードするDNAに作用可能に連結される。細菌系における使用のためのプロモーターは、CFXTENポリペプチドをコードするDNAに作用可能に連結されたシャイン・ダルガルノ(S.D.)配列も含むことができる。
AE 48: 5’− ATGGCTGAACCTGCTGGCTCTCCAACCTCCACTGAGGAAGGTACCCCGGGTAGCGGTACTGCTTCTTCCTCTCCAGGTAGCTCTACCCCTTCTGGTGCAACCGGCTCTCCAGGTGCTTCTCCGGGCACCAGCTCTACCGGTTCTCCA−3’
および
AM 48: 5’− ATGGCTGAACCTGCTGGCTCTCCAACCTCCACTGAGGAAGGTGCATCCCCGGGCACCAGCTCTACCGGTTCTCCAGGTAGCTCTACCCCGTCTGGTGCTACCGGCTCTCCAGGTAGCTCTACCCCGTCTGGTGCTACTGGCTCTCCA−3’
から選択される配列またはその相補体と比較して、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を呈する配列を含む。
本発明は、CFXTENを含む医薬組成物を提供する。一実施態様において、医薬組成物は、CFXTEN融合タンパク質と少なくとも1つの医薬として許容し得る担体とを含む。本発明のCFXTENポリペプチドは、医薬として有用な組成物を調製するために、公知の方法に従って製剤化されることができ、それにより該ポリペプチドが、水性の溶液もしくは緩衝液、医薬として許容し得る懸濁液、およびエマルションなど、医薬として許容し得る担体ビヒクルとの混合において組み合わされる。非水性溶媒の例には、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコール、および植物油が挙げられる。治療用製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)において説明されるように、凍結乾燥した製剤もしくは水溶液の形態において、所望の程度の純度を有する活性成分を、任意の生理学的に許容し得る担体、賦形剤、もしくは安定剤と混合することによって、貯蔵のために調製される。
被膜、抗菌薬および抗真菌薬、等張剤、および吸収遅延剤も含み得る。医薬として許容し得る塩は、これらの遅延放出剤において使用することもでき、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、または硫酸塩などの鉱物塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩などの有機酸の塩である。組成物は、水、塩類溶液、グリセロール、およびエタノールなどの液体、ならびに湿潤剤、乳化剤、またはpH緩衝剤などの物質も含み得る。リポソームも担体として用いてもよい。
別の態様におおいて、本発明は、CFXTENポリペプチドの使用を容易にするためのキットを提供する。該キットは、本明細書に提供される医薬組成物、該医薬組成物を同定するラベル、ならびに貯蔵、再構成、および/または該医薬組成物の対象への投与についての説明書を含む。いくつかの実施態様において、該キットは好ましくは、注射のためにまたは滅菌水、緩衝液、もしくはデキストロースによる再構成のために用意ができている製剤において互いに、(a)疾患、容態、または障害を治療するのに十分な量のCFXTEN融合タンパク質組成物を必要とする対象への投与の際の該CFXTEN融合タンパク質組成物、および(b)ある量の医薬として許容し得る担体を、CFXTEN薬物ならびに貯蔵条件および取り扱い条件を同定するラベル、ならびに薬物について認可された適応症に関するシート、認可された適応症の予防および/または治療のための使用のためのCFXTEN薬物の再構成および/または投与、適切な薬用量および安全情報、ならびに薬物のロットおよび有効期限を同定する情報についての説明書とともに含む。前述の別の実施態様において、該キットは、CFXTEN組成物に好適な希釈剤を保持することのできる第二の容器を含み、該容器の使用は、ユーザーに、対象に送達されるべき適切な濃度のCFXTENを提供する。
(実施例1:XTEN_AD36モチーフセグメントの構築)
以下の実施例は、36のアミノ酸のモチーフ配列をコードするコドンの最適化された遺伝子の収集物の集まりを説明する。第一の工程として、スタッファーベクターpCW0359をpETベクターに基づいて構築し、それは、T7プロモーターを含む。pCW0359は、セルロース結合ドメイン(CBD)およびTEVプロテアーゼ認識部位の後の、BsaI部位、BbsI部位、およびKpnI部位によって隣接されるスタッファー配列をコードする。BsaI部位およびBbsI部位が消化後に適合性のあるオーバーハングを生じるよう、該部位を挿入した。スタッファー配列に、GFP遺伝子の切りつめられたバージョンおよびHisタグが続く。スタッファー配列は終止コドンを含み、したがってスタッファープラスミドpCW0359を保持する大腸菌細胞は、非蛍光性コロニーを形成する。スタッファーベクターpCW0359をBsaIおよびKpnIで消化して、スタッファーセグメントを取り出し、結果として生じるベクター断片をアガロースゲル精製によって単離した。配列は、XTEN_AD36と命名され、モチーフのADファミリーを反映した。そのセグメントは、アミノ酸配列[X]3を有し、式中Xは、配列GESPGGSSGSES、GSEGSSGPGESS、GSSESGSSEGGP、またはGSGGEPSESGSSを有する12マーペプチドである。インサートを、以下の対のリン酸化型合成オリゴヌクレオチド対をアニーリングすることによって得た:
AD1for:AGGTGAATCTCCDGGTGGYTCYAGCGGTTCYGARTC
AD1rev:ACCTGAYTCRGAACCGCTRGARCCACCHGGAGATTC
AD2for:AGGTAGCGAAGGTTCTTCYGGTCCDGGYGARTCYTC
AD2rev:ACCTGARGAYTCRCCHGGACCRGAAGAACCTTCGCT
AD3for:AGGTTCYTCYGAAAGCGGTTCTTCYGARGGYGGTCC
AD3rev:ACCTGGACCRCCYTCRGAAGAACCGCTTTCRGARGA
AD4for:AGGTTCYGGTGGYGAACCDTCYGARTCTGGTAGCTC
本発明者らは、リン酸化型オリゴヌクレオチド3KpnIストッパーfor:AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTAC、および非リン酸化型オリゴヌクレオチドpr_3KpnIストッパーrev:CCTCGAGTGAAGACGAもアニーリングした。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対を連結し、結果的に、1つのBbsI/KpnIセグメントに連結した変動する数の12マー反復を表す変動する長さの産物の混合物を生じた。36アミノ酸の長さに相応する産物を混合物から、調製用アガロースゲル電気泳動法によって単離し、BsaI/KpnIで消化したスタッファーベクターpCW0359へと連結した。結果として生じるLCW0401と命名されたライブラリーにおけるクローンのほとんどは、誘導後に緑色蛍光を示し、このことは、XTEN_AD36の配列が、GFP遺伝子とフレーム内でt連結し、かつXTEN_AD36のほとんどの配列が良好な発現レベルを有していたことを示す。
36のアミノ酸長のXTEN配列をコードするコドンライブラリーを構築した。XTENヒア列をXTEN_AE36と命名した。そのセグメントは、アミノ酸配列[X]3を有し、式中、Xは、配列GSPAGSPTSTEE、GSEPATSGSE TP、GTSESA TPESGP、またはGTSTEPSEGSAPを有する12マーのペプチドである。インサートを、以下に対のリン酸化型合成オリゴヌクレオチド対をアニーリングすることによって得た:
AE1for: AGGTAGCCCDGCWGGYTCTCCDACYTCYACYGARGA
AE1rev: ACCTTCYTCRGTRGARGTHGGAGARCCWGCHGGGCT
AE2for: AGGTAGCGAACCKGCWACYTCYGGYTCTGARACYCC
AE2rev: ACCTGGRGTYTCAGARCCRGARGTWGCMGGTTCGCT
AE3for: AGGTACYTCTGAAAGCGCWACYCCKGARTCYGGYCC
AE3rev: ACCTGGRCCRGAYTCMGGRGTWGCGCTTTCAGARGT
AE4for: AGGTACYTCTACYGAACCKTCYGARGGYAGCGCWCC
AE4rev: ACCTGGWGCGCTRCCYTCRGAMGGTTCRGTAGARGT
本発明者らは、リン酸化型オリゴヌクレオチド3KpnIストッパーfor: AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTACおよびひリン酸化型オリゴヌクレオチドpr_3KpnIストッパーrev: CCTCGAGTGAAGACGAもアニーリングした。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対を連結し、結果的に、1つのBbsI/KpnIセグメントに連結された12マーの変動する数の反復を表す変動する長さの産物の混合物を生じた。36アミノ酸の長さに相応する産物を調製用アガロースゲル電気泳動法によって混合物から単離し、BsaI/KpnIで消化したスタッファーベクターpCW0359へと連結した。LCW0402と命名された、結果として生じるライブラリーにおけるクローンのほとんどは、誘導後に緑色蛍光を示し、このことは、XTEN_AE36がGFP遺伝子とフレームにおいて連結され、XTEN_AE36のほとんどの配列が良好な発現を示すことを示す。
36のアミノ酸長の配列をコードするコドンライブラリーを構築した。該配列をXTEN_AF36と命名した。そのセグメントは、アミノ酸配列[X]3を有し、式中Xは配列GSTSESPSGTAP、GTSTPESGSASP、GTSPSGESSTAP、またはGSTSSTAESPGPを有する12マーのペプチドである。インサートを、以下の対のリン酸化型合成オリゴヌクレオチド対をアニーリングすることによって得た:
AF1for: AGGTTCTACYAGCGAATCYCCKTCTGGYACYGCWCC
AF1rev: ACCTGGWGCRGTRCCAGAMGGRGATTCGCTRGTAGA
AF2for: AGGTACYTCTACYCCKGAAAGCGGYTCYGCWTCTCC
AF2rev: ACCTGGAGAWGCRGARCCGCTTTCMGGRGTAGARGT
AF3for: AGGTACYTCYCCKAGCGGYGAATCTTCTACYGCWCC
AF3rev: ACCTGGWGCRGTAGAAGATTCRCCGCTMGGRGARGT
AF4for: AGGTTCYACYAGCTCTACYGCWGAATCTCCKGGYCC
AF4rev: ACCTGGRCCMGGAGATTCWGCRGTAGAGCTRGTRGA
本発明者らは、リン酸化型オリゴヌクレオチド3KpnIストッパーfor: AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTACおよび非リン酸化型オリゴヌクレオチドpr_3KpnIストッパーrev: CCTCGAGTGAAGACGAもアニーリングした。アリーニングしたオリゴヌクレオチド対を連結し、結果的に、1つのBbsI/KpnIセグメントに連結した12マーの変動する数の反復を表す変動する長さの産物の混合物を生じた。36のアミノ酸の長さに相応する産物を、調製用アガロースゲル電気泳動法によって混合物から単離し、BsaI/KpnIで消化したスタッファーベクターpCW0359へと連結した。LCW0403と命名された結果として生じるライブラリーにおけるクローンのほとんどは、誘導後に緑色蛍光を示し、このことは、XTEN_AF36の配列がGFP遺伝子とフレーム内で連結され、かつXTEN_AF36のほとんどの配列が良好な発現を示すことを示す。
36のアミノ酸長の配列をコードするコドンライブラリーを構築した。該配列をXTEM_AG36と命名した。そのセグメントは、アミノ酸配列[X]3を有し、式中Xは配列GTPGSGTASSSP、GSSTPSGATGSP、GSSPSASTGTGP、またはGASPGTSSTGSPを有する12マーのペプチドである。インサートを、以下の対のリン酸化型合成オリゴヌクレオチド対をアニーリングすることによって得た:
AG1for: AGGTACYCCKGGYAGCGGTACYGCWTCTTCYTCTCC
AG1rev: ACCTGGAGARGAAGAWGCRGTACCGCTRCCMGGRGT
AG2for: AGGTAGCTCTACYCCKTCTGGTGCWACYGGYTCYCC
AG2rev: ACCTGGRGARCCRGTWGCACCAGAMGGRGTAGAGCT
AG3for: AGGTTCTAGCCCKTCTGCWTCYACYGGTACYGGYCC
AG3rev: ACCTGGRCCRGTACCRGTRGAWGCAGAMGGGCTAGA
AG4for: AGGTGCWTCYCCKGGYACYAGCTCTACYGGTTCTCC
AG4rev: ACCTGGAGAACCRGTAGAGCTRGTRCCMGGRGAWGC
本発明者らは、リン酸化型オリゴヌクレオチド3KpnIストッパーfor: AGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTACおよび非リン酸化型オリゴヌクレオチドpr_3KpnIストッパーrev: CCTCGAGTGAAGACGAもアニーリングした。アリーニングしたオリゴヌクレオチド対を連結し、結果的に、1つのBbsI/KpnIセグメントに連結した12マーの変動する数の反復を表す変動する長さの産物の混合物を生じた。36のアミノ酸の長さに相応する産物を、調製用アガロースゲル電気泳動法によって混合物から単離し、BsaI/KpnIで消化したスタッファーベクターpCW0359へと連結した。LCW0404と命名された結果として生じるライブラリーにおけるクローンのほとんどは、誘導後に緑色蛍光を示し、このことは、XTEN_AG36の配列がGFP遺伝子とフレーム内で連結され、かつXTEN_AG36のほとんどの配列が良好な発現を示すことを示す。
XTEN_AE864を、XTEN_AE36からAE72、144、288、576、および864への連続的な二量体化から構築した。XTEN_AE72セグメントの収集物をXTEN_AE36の37の異なるセグメントから集めた。37の異なる36アミノ酸セグメントすべてを保有する大腸菌の培養物を混合し、プラスミドを単離した。このプラスミドプールをBsaI/NcoIで消化し、小さな断片をインサートとして生じた。同じプラスミドプールをBbsI/NcoIで消化し、大きな断片をベクターとして生じた。インサート断片およびベクター断片を連結し、結果的に長さを二倍にし、連結混合物をBL21Gold(DE3)細胞へと形質転換して、XTEN_AE72のコロニーを得た。
XTEN_AE36の37の異なるセグメント、XTEN_AF36の44のセグメント、およびXTEN_AG36の44のセグメントから出発して、XTEN_AM144セグメントの収集物を集めた。
ライブラリーLCW0462全体を実施例6において説明される通り二量体化し、結果的に、LCW0463と命名されたXTEN_AM288クローンのライブラリーを生じた。ライブラリーLCW0463由来の1512の単離物を、実施例6において説明されるプロトコールを用いてスクリーニングした。176の高度に発現するクローンを配列決定し、40の好ましいXTEN_AM288セグメントを、288のアミノ酸残基を有する複数のXTENセグメントを含む多機能性タンパク質の構築のために選択した。
本発明者らは、segments from library of XTEN_AM144セグメントのライブラリーLCW0462由来のセグメントおよびXTEN_AM288セグメントのライブラリーLCW0463由来のセグメントを組み換えることによって、XTEN_AM432セグメントのライブラリーを生じた。このXTEN_AM432セグメントの新たなライブラリーをLCW0464と命名した。プラスミドを、LCW0462およびLCW0463をそれぞれ有する大腸菌の培養物から単離した。ライブラリーLCW0464からの1512の単離物を、実施例6において説明されるプロトコールを用いてスクリーニングした。176の高度に発現するクローンを配列決定し、39の好ましいXTEN_AM432セグメントを、より長いXTENの構築のために、および432のアミノ酸残基を有する複数のXTENセグメントを含む多機能性タンパク質の構築のために選択した。
スタッファーベクターpCW0359をBsaIおよびKpnIで消化してスタッファーセグメントを取り出し、結果として生じるベクター断片を、アガロースゲル精製によって単離した。
本発明者らは、アミノ酸GPEPTGPAPSGをコードしかつ制限酵素FseI認識ヌクレオチド配列GGCCGGCCを内側に有する配列決定アイランドB(SI‐B)を導入するために、リン酸化型オリゴヌクレオチドBsaI−FseI−KpnIforP: AGGTCCAGAACCAACGGGGCCGGCCCCAAGCGGAGGTTCGTCTTCACTCGAGGGTACおよび非リン酸化型オリゴヌクレオチドBsaI−FseI−KpnIrev: CCTCGAGTGAAGACGAACCTCCGCTTGGGGCCGGCCCCGTTGGTTCTGGをアニーリングした。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対を、実施例9において用いたようなBsaIおよびKpnIで消化したスタッファーベクターpCW0359と連結し、SI‐Bを含むpCW0467を生じた。次に、本発明者らは、実施例8由来の43の好ましいXTEN_AM432セグメントおよびpCW0467由来のSI‐Bセグメントを、実施例5に説明された同じ二量体化過程を用いてC末端において組み換えることによって、XTEN_AM443セグメントのライブラリーを生じた。この新たなXTEN_AM443セグメントのライブラリーをLCW0480と命名した。
いくつかの連続した回数の二量体化を用いて、本発明者らは、実施例1に列挙されたXTEN_AD36のセグメントから出発するXTEN_AD864の収集物を集めた。これらの配列を実施例5に説明されるように構築した。XTEN_AD864由来のいくつかの単離物を評価し、生理学的条件下で良好な発現および優れた溶解度を示すことが分かった。XTEN_AD576の1つの中間体コンストラクトを配列決定した。このクローンを、カニクイザルにおけるPK実験において評価し、約20時間の半減期を測定した。
いくつかの連続した回数の二量体化を用いて、本発明者らは、実施例3に列挙されたXTEN_AF36のセグメントから出発するXTEN_AF864の収集物を集めた。これらの配列を実施例5に説明される通り集めた。XTEN_AF864由来のいくつかの単離物を評価し、生理学的条件下で良好な発現および優れた溶解度を示すことが分かった。XTEN_AF540の1つの中間体コンストラクトを配列決定した。このクローンをカニクイザルにおけるPK実験において評価し、約20時間の半減期を測定した。XTEN_AF864の全長のクローンは、優れた溶解度を有し、カニクイザルにおいて60時間超の半減期を示した。実施例9に説明されるような配列決定アイランドを含む第二のセットのXTEN_AF配列を構築した。
いくつかの連続した回数の二量体化を用いて、本発明者らは、実施例1に列挙されたXTEN_AD36のセグメントから出発するXTEN_AG864配列の収集物を集めた。これらの配列を実施例5において説明される通り集めた。XTEN_AG864由来のいくつかの単離物を評価し、生理学的条件下で良好な発現および優れた溶解度を示すことが分かった。XTEN_AG864の全長のクローンは、優れた溶解度を有し、カニクイザルにおいて60時間超の半減期を示した。
本実施例は、ヘルパードメインの存在なしで融合タンパク質のN末端にけるXTEN融合体の発現を可能にするよう翻訳の開始を促進するためのXTENタンパク質のN末端の最適なの工程を詳述する。歴史的に、N末端にXTENを有するタンパク質の発現は乏しく、GFP蛍光アッセイにおいて本質的に検出できないであろう値を生じる(N末端CBDヘルパードメインによる発現の25%未満)。コドンレベルで多様性を作製するために、7のアミノ酸配列を選択し、コドンの多様性を用いて調製した。コドン多様性を有する12のアミノ酸をコードする7対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングし、NdeI/BsaI制限酵素で消化したスタッファーベクターpCW0551(スタッファー−XTEN_AM875−GFP)へと連結し、大腸菌BL21Gold(DE3)コンピテント細胞へと形質転換して、7ライブラリーのコロニーを得た。結果として生じるクローンは、発現をスクリーニングするためにGFP蛍光の使用を可能にするよう、XTEN_AM875−GFPにフレーム内で融合したN末端XTEN12マーを有する。7の作製されたライブラリー由来の個々のコロニーを拾い、96穴深皿プレートにおける500μLのスーパーブロス培地において飽和するまで一晩増殖させた。拾ったコロニー数は、ライブラリーの理論的多様性のおよそ半分〜1/3に及んだ(表14を参照されたい)。
本実施例は、ヘルパードメインの存在なしでタンパク質のN末端においてXTEN融合体の発現を可能にするための翻訳の開始を促進するためのXTENタンパク質のN末端の最適化における工程を詳述する。確立された第一の2つのコドンについての優先性とともに(上述の実施例を参照されたい)、第三および第四のコドンを無作為化して優先性を決定した。LCW546、LCW547、およびLCW552由来の最良のクローンに基づいた3つのライブラリーを、許容可能なXTENコドンのすべての組み合わせが第三および第四の残基の位置に存在するよう修飾されたこれらの残基を用いて設計した。各ライブラリーについて許容可能なXTENコドンすべてを含むために、第三および第四の残基のコドン多様性を有する12のアミノ酸をコードする9対のオリゴヌクレオチド設計し、アニールし、NdeI/BsaI制限酵素で消化したスタッファーベクターpCW0551(Stuffer−XTEN_AM875−GFP)へと連結し、大腸菌BL21Gold(DE3)コンピテント細胞へと形質転換し、3つのライブラリーLCW0569〜0571のコロニーを得た。作製した3つのライブラリー由来の合計504の個々のコロニーを拾い、96穴深皿プレートにおける500μLのスーパーブロス培地において飽和するまで一晩増殖させた。このことは、相対的なライブラリー性能および配列優先性を理解するのに十分な適用範囲を提供した。飽和した一晩培養物を用いて、新たな500μLの培養物を自己誘導培地において接種し、該培地において26℃で一晩増殖させた。これらの発現培養物を次に、蛍光プレートリーダー(励起395nm、発光510nm)を用いてアッセイして、存在するGFPリポーターの量を決定した。スクリーン由来の上位75クローンを配列決定し、GFPリポーター発現対基準点試料について再度試験した(図28を参照されたい。)。52のクローンは、使用可能な配列決定データを生じ、その後の分析に用いた。結果は、ライブラリーによって分類され、LCW546が優れたライブラリーであったことを示す。結果を表16に呈する。驚くべきことに、最良のクローンについての基本的な蛍光読み取りは〜900AUであるのに対し、CBD N末端基準点は〜600AUに過ぎないことが発見された。このことは、このライブラリーが、CBD N末端基準点に対して発現においてほぼ等しい先行ライブラリー由来の最良クローンを上回るおよそ33%の改良を生じた(実施例14)。
本実施例は、ヘルパードメインの存在なしでタンパク質のN末端においてXTEN融合体の発現を可能にするための翻訳の開始を促進するためのXTENタンパク質のN末端の最適化における工程を詳述する。確立された第一の2つのコドンについての優先性とともに(上述の実施例を参照されたい)、まさにN末端における12の選択された12マー配列(上述の実施例を参照されたい)に続いて、125の既に構築された36マーセグメント(上述の実施例を参照されたい)を組み合わせ様式によって組み合わせることによって、N末端をより広範な文脈において検討した。このことは、XTENタンパク質のN末端における新規の48マーを作製し、より長い配列の発現に及ぼすN末端におけるより長い範囲の相互作用の影響の評価を可能にした(図29)。36マーを組み立てるのに用いられた二量体化手順と同様に(上述の実施例を参照されたい)、125の選択された36マーセグメントを含むプラスミドを制限酵素BbsI/NcoIで消化し、適切な断片をゲル精製した。クローンAC94由来のプラスミド(CBD−XTEN_AM875−GFP)もBsaI/NcoIで消化し、適切な断片をゲル精製した。これらの断片を互いに連結し、大腸菌BL21Gold(DE3)コンピテント細胞へと形質転換し、まさにN}末端における12の選択された12マーをさらにクローニングするためのベクターとしても機能するライブラリーLCW0579のコロニーを得た。LCW0579のプラスミドをNdeI/EcoRI/BsaIで消化し、適切な断片をゲル精製した。12の選択された12マー配列をコードする12対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングし、NdeI/EcoRI/BsaIで消化したLCW0579ベクターと連結し、大腸菌BL21Gold(DE3)コンピテント細胞へと形質転換し、ライブラリーLCW0580のコロニーを得た。1500の独特なクローンの理論的多様性とともに、作製されたライブラリー由来の合計1512の個々のコロニーを拾い、96穴深皿プレートにおける500μLのスーパーブロス培地において飽和するまで一晩増殖させた。このことは、相対的なライブラリーの性能および配列の優先性を理解するのに十分な適用範囲を提供した。一晩飽和させた培養物を用いて、自己誘導培地に新たな500μL培養物を摂取し、26℃で一晩増殖させた。次に、これらの発現培養物を、蛍光プレートリーダー(励起395nm、発光510nm)を用いてアッセイし、存在するGFPリポーターの量を決定した。上位90のクローンを配列決定し、GFPリポーター発現について再試験した。83のクローンは、使用可能な配列決定データを生じ、その後の分析に用いた。配列決定データを用いて、各クローンに存在する導出12マーを決定し、発現に及ぼす各12マーの影響を評価した。クローンLCW546_06およびLCW546_09は、優れたN末端であるとして際立っていた(表18を参照されたい)。
本実施例は、ヘルパードメインの存在なしでタンパク質のN末端におけるXTEN融合体の発現を可能にするための翻訳の開始を促進するためのXTENタンパク質のN末端の最適化における工程を詳述する。N末端の最初の4つのコドンについての(上述の実施例を参照されたい)、ならびに確立されたN末端の12マーおよび36マーの最良の対形成のための優先性とともに、組み合わせアプローチに取り掛かり、これらの優先性の合体を検討した。このことは、XTENタンパク質のN末端において新規の48マーを作製し、先行する結論の合流性の試験を可能にした。加えて、これらのリーダー配列がすべてのXTENタンパク質の一般的な解決策である能力を、XTEN−AE864およびXTEN−AM875の両方の前に新たな48マーを配置することによって評価した。36マーセグメントの125のクローンすべてを用いる代わりに、最良のGFP発現を有する36マーセグメントの6の選択されたクローン由来のプラスミドをNdeI/EcoRI/BsaIで消化し、適切な断片をゲル精製した。クローンAC94(CBD−XTEN_AM875−GFP)およびAC104(CBD−XTEN_AE864−GFP)由来のプラスミドをNdeI/EcoRI/BsaIで消化し、適切な断片をゲル精製した。これらの断片を出該に連結し、大腸菌BL21Gold(DE3)コンピテント細胞へと形質転換し、ライブラリーLCW0585(−XTEN_AM875−GFP)およびLLCW0586(−XTEN_AE864−GFP)のコロニーを得、これも、まさにN末端における8の選択された12マーをさらにクローニングするためのベクターとして機能することができた。LCW0585およびLCW0586のプラスミドをNdeI/EcoRI/BsaIで消化し、適切な断片をゲル精製した。先の(発生2)のスクリーニングにおいて最良のGFP発現を有する8の選択された12マー配列をコードする8対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングし、NdeI/EcoRI/BsaIで消化したLCW0585およびLCW0586ベクターと連結し、大腸菌BL21Gold(DE3)コンピテント細胞へと形質転換し、最終的なライブラリーLCW0587(XTEN_AM923−GFP)およびLCW0588(XTEN_AE912−GFP)のコロニーを得た。48の独特なクローンの理論的多様性とともに、作製されたライブラリー由来の合計252の個々のコロニーを拾い、96穴深皿プレートにおいて500μLのスーパーブロス培地において飽和するまで一晩増殖させた。このことは、相対的なライブラリー性能および配列優先性を理解するのに十分な適用範囲を提供した。一晩飽和させた培養物を用いて、新たな500μLの培養物を自己誘導培地に接種し、これを26℃で一晩増殖させた。これらの発現培養物を次に、蛍光プレートリーダー(励起395nm、発光510nm)を用いてアッセイし、存在するGFPリポーターの量を決定した。上位36のクローンを配列決定し、GFPリポーター発現について再試験した。36のクローンは、使用可能な配列決定データを生じ、これらの36をその後の分析に用いた。配列決定データは、クローンに存在する12マー、第三のコドン、第四のコドン、および36マーを決定し、クローンの多くが、同じ配列の独立した複製物であることを明らかにした。加えて、これらのクローンについての再試験結果は値が近く、スクリーニング手順が頑強であったことを示す。N末端におけるある組み合わせについての優先性を観察し、該優先性は、基準点対照よりもおよそ50%大きなより高い蛍光値を一致して生じた(表20および表21を参照されたい)。これらのデータは、最適化されたN末端XTENをコードする配列の融合タンパク質遺伝子への包含が、融合タンパク質の発現に顕著な亢進を与えるという結論を支持する。
CFXTEN組成物を作製および評価するための一般的なスキームは図33に呈され、本実施例の一般的な説明についての基礎を形成する。実例となる実施例に提供されるガイダンスとともに、開示された方法および当業者に公知の方法を用いて、当業者は、XTENとCFと当該技術分野で公知のCFのバリアントとを含むある範囲のCFXTEN融合タンパク質を作製および評価することができる。本実施例はそれゆえ、単に説明目的として解釈されるべきであり、任意のやり方の方法は何でも制限されず、幾多の変法は、当業者に明らかである。本実施例において、モチーフのAEファミリーのXTENに連結された凝固因子のCFXTENを作製する。
FVII−TEV−XTEN864の発現ベクターの構築
FVIIをコードする遺伝子を含むクローニングベクターをOriGene(SC109205)から購入した。PCR反応を実施して、FVIIコード領域内のBbsIおよびBsaI制限部位を消滅させた。結果として生じるFVIIコード領域を次に、5’末端および3’末端にそれぞれNheIおよびTEV−BsaI配列を導入したプライマーを用いて増幅した。消化したFVII断片を、BsaI/HindIIIで消化したXTEN_AE864断片に融合して、NheI/HindIIIで消化したpSecTag2C発現ベクターへと挿入した。連結したDNA混合物をXL1‐Blue細菌細胞へと電気穿孔した。形質転換体をDNAミニプレップによってスクリーニングし、所望のコンストラクトをDNA配列決定によって確認した。最終的なコンストラクトは、FVII−TEV−XTEN_AE864タンパク質をコードするpCW0647.001である(表23)。
pCW0647.001をテンプレートとして用いて、FVIIを増幅した。PCRプライマーは、5’末端および3’末端にそれぞれNheIおよびBsaI制限酵素認識配列を導入し、TEV部位を欠失した。NheI/BsaIで消化したFVII断片をBsaI/HindIIIで消化したXTEN_AE864断片に融合し、NheI/HindIIIで消化したpSecTag2C発現ベクターへと挿入した。連結したDNA混合物をXL1‐Blue細菌細胞へと電気穿孔した。形質転換体をDNAミニプレップによってスクリーニングし、所望のコンストラクトをDNA配列決定によって確認した。最終的なコンストラクトは、FVII−XTEN_AE864タンパク質をコードするpCW0645.001である(表23)。
発現ベクターpCW0645.001をNheIおよびSalIで消化した。結果として生じる4091bp断片は、FVII−XTEN_AE864タンパク質をコードするヌクレオチドを含んでいた。この断片をNheI/SalIで消化したCET1019−AS−puro、CET1019−HS−puro、SC AS−puro、またはDC HS−puro(Milliporeから認可)と連結した。これらのベクターは、遺伝子挿入部位の上流に存在するCMVプロモーターを特長とし、CET1019ベクターは、該プロモーターの上流にUCOE要素も含む。連結したDNA混合物をXL1‐Blue細菌細胞に電気穿孔した。形質転換体をDNAミニプレップによってスクリーニングし、所望のコンストラクトをDNA配列決定によって確認した。結果として生じる発現ベクターは、AC397(pBC0013、SC AS puro−FVII−XTEN_AE864)、AC402(pBC0014、SC HS puro−FVII−XTEN_AE864)、AC403(pBC0015、CET1019 AS puro−FVII−XTEN_AE864)、およびAC404(pBC0016、CET1019 HS puro−FVII−XTEN_AE864)であった。
発現ベクターpCW0645.001をBsaIおよびHindIIIで消化した。結果として生じる6400bp断片をBsaI/HindIIIで消化したXTEN_AE288断片と連結した。連結したDNA混合物をXL1‐Blue細菌細胞に電気穿孔した。形質転換体をDNAミニプレップによってスクリーニングし、所望のコンストラクトをDNA配列決定によって確認した。結果として生じる発現ベクターは、pBC0019(pSecTag2C−FVII−XTEN_AE288)であった。
FIX−XTEN864遺伝子およびベクターの構築
FIXをコードする遺伝子を含むクローン化ベクターをOriGeneから購入した(SC126517)。PCR反応を実施して、FIXコード領域内の2つのBbsI制限部位を消滅させた。結果として生じるFIXコード領域を次に、5’末端および3’末端のそれぞれにおけるNheIおよびBsaI制限酵素認識配列を導入するプライマーを用いて増幅した。消化したFIX断片をBsaI/HindIIIで消化したXTEN_AM864、AE864、AF864、またはAG864断片に融合し、NheI/HindIIIで消化したpSecTag2C発現ベクターへと挿入した。最終的なコンストラクトは、AC282(pCW0562、FIX− XTEN_AM864)、AC283(pCW0563、FIX−XTEN_AE864)、pCW0564(FIX−XTEN_AF864)、およびpCW0565(FIX−XTEN_AG864)である(表24)。
PC5をコードする遺伝子を含むクローン化ベクターをOriGeneから購入した(SC310051)。PC5コード領域を、NotIおよびBstBI制限酵素認識配列を導入するプライマーを用いて増幅した。NotI/BstBIで消化したPC5断片を、NotI/BstBIで消化したCET1019−HD−puroベクターまたはDC−HD−puroベクターと連結した。CET1019−HD−puroもDC−HD−puroも、CMVプロモーターが遺伝子挿入部位の上流に存在する二重カセットを特長とし、CET1019−HD−puroは、該プロモーターの上流にUCOE要素も含む。連結したDNA混合物をXL1‐Blue細菌細胞に電気穿孔した。形質転換体をDNAミニプレップによってスクリーニングし、所望のコンストラクトをDNA配列決定によって確認した。結果として生じる発現ベクターは、pBC0037(DC−HD−puro−PC5)およびpBC0038(CET1019 HD−puro−PC5)である。
pBC0037およびpBC0038コンストラクトをNheIおよびSalIで消化して、NheI/SalIで消化したFIX−XTEN_AE864と連結した。連結したDNA混合物をXL1‐Blue細菌細胞に電気穿孔した形質転換体をDNAミニプレップによってスクリーニングし、所望のコンストラクトをDNA配列決定によって確認した。結果として生じる発現ベクターは、pBC0035(DC−HD−puro−FIX−XTEN_AE864−PC5)およびpBC0036(CET1019−HD−puro−FIX−XTEN_AE864−PC5)であった。
FIX−TEV−XTEN_AE864遺伝子およびベクターの構築
FIXをコードする遺伝子を含むクローン化ベクターをOriGeneから購入した(SC126517)。PCR反応を実施して、FIXコード領域内の2つのBbsI制限部位を消滅させた。結果として生じるFIXコード領域を次に、5’末端および3’末端のそれぞれにNheIおよびSfiI−TEV−BsaI配列を導入するプライマーを用いて増幅した。消化したFIX断片を、BsaI/HindIIIで消化したXTEN_AE864断片に融合し、NheI/HindIIIで消化したpSecTag2C発現ベクターへと挿入した。連結したDNA混合物をXL1‐Blue細菌細胞に電気穿孔した。形質転換体をDNAミニプレップによってスクリーニングし、所望のコンストラクトをDNA配列決定によって確認した。最終的なコンストラクトは、FIX−TEV−XTEN_AE864タンパク質をコードするpCW0648.001である(表25)。
SfiIおよびBsaIを用いてpCW0648発現ベクターを消化することによって、TEV部位を除去した。SfiI−KLTRAET−BsaI、SfiI−DFTRVVG−BsaI、またはSfiI−/FXI/−BsaIをコードするオリゴ含有配列をアニーリングし、消化したpCW0648ベクターと連結した。連結したDNA混合物をXL1‐Blue細菌細胞に電気穿孔した。形質転換体をDNAミニプレップによってスクリーニングし、所望のコンストラクトをDNA配列決定によって確認した。結果として生じる発現ベクターは、FIX−KLTRAET−XTEN_AE864(pCW0735)、FIX−DFTRVVG−XTEN_AE864(pCW0736)、およびFIX−/FXI/−XTEN_AE864(pCW0737)をコードする。
発現ベクターpCW0735をNheIおよびSalIで消化した。結果として生じる4181bp断片は、FIX−KLTRAET−XTEN_AE864タンパク質をコードするヌクレオチドを含んでいた。この断片を、NheI/SalIで消化したCET1019−HD−puro(Millipore)またはDC HD−puro(Millipore)と連結した。CET1019−HD−puroもDC−HD−puroも、CMVプロモーターが遺伝子挿入部位の上流に存在する二重カセットを特長とし、CET1019−HD−puroは、該プロモーターの上流にUCOE要素も含む。連結したDNA混合物をXL1‐Blue細菌細胞に電気穿孔した。形質転換体をDNAミニプレップによってスクリーニングし、所望のコンストラクトをDNA配列決定によって確認した。結果として生じる発現ベクターは、pBC0033(DC−HD−puro−FIX−KLTRAET−XTEN _AE864)およびpBC0034(CET1019−HD−puro−FIX− KLTRAET−XTEN _AE864)であった(表25)。
哺乳類細胞の一過性トランスフェクション
CHO‐K1、BHK、COS‐7、およびHEK293を含む哺乳類細胞は、形質移入すると異なるXTEN長を用いてFVII−XTENまたはFIX−XTENを発現することが発見された。以下は、一過性トランスフェクションによって種々のFVII−XTENおよびFIX−XTEN融合タンパク質コンストラクトを発現するのに用いられる方法についての詳細である。
細胞:ATCCから購入したCHO‐K1細胞(カタログCCL‐61、ロット58078551)を完全培地(F‐12K、10%FBS、および1×ペニシリン/ストレプトマイシン、付録1)において回復させ、4世代経代した後に、複数のバイアルを5%DMSOを有する完全培地において凍結した。1つのバイアルを完全培地と類似だが5%FBSを有する培地において回復させ、1回以上経代した後トランスフェクションをした。
CHO‐K1細胞の安定したプールまたはクローンをT175において、フラスコあたり35mLの選択培地において増量した。細胞をトリプシン処理によって収穫し、該細胞を用いて、ローラーボトルごとにつき1〜2のT175フラスコ由来の細胞を用いた300mLの選択培地のローラーボトルに初日に蒔種した(ボトルあたり1700cm2表面積)。消費済み培地/馴らし培地を取り出して除去し(またはこの培地におけるXTEN融合タンパク質が精製されることができる場合収穫し)、300mLの移行培地(1%FBS、0.1%Ex‐Cyte、5mg/mLビタミンK、および1×ペニシリン/ストレプトマイシン)を各ローラーボトルに添加した。7(または8)日後、消費済み培地を取り出して除去し(またはXTEN融合タンパク質がこの培地から精製されることができる場合収穫し)、発現培地(0.1%Ex‐Cyte、1%ITS‐A、5mg/mLビタミンK、および1×ペニシリン/ストレプトマイシンを含むOptiMEM)を、ボトルあたり300mLまたは、最適化からの結果に応じた他の容積ほど添加した。馴らし培地は、所望の産物力価および品質に応じて、1日1回、または2、もしくは3、もしくは4日に1回収穫することができた。収穫するために、馴らし培地を遠心ボトルに注ぎ、新鮮な発現培地をボトルあたり300mLまたは最適化からの結果に応じた他の容積ほど添加した。消費済み培地を収穫して新鮮な培地で再充填するこの製造は、ローラーボトルを終止した時に力価および/または産物の質があまりにも低いと考えられるまで、2〜4週間持続できた。次に、馴らし培地を卓上遠心機において3500rpm、4〜8℃で10分間遠心分離した。次に、0.2mmフィルターを用いて上清を濾過した。濾液を即時処理したかまたは、精製のための正接流濾過(tangential flow filtration, TFF)による処理の前に−80℃の冷凍庫において保存したかのいずれかであった。
正接流濾過および透析濾過によるFVII−XTEN_AE864の濃縮および緩衝液交換
FVII−AE864(AC404)を発現する安定したCHO細胞株由来の総容積10.7Lの上清バッチS279、S281、S282、およびS287を、Cuno ZetaPlus BiocapフィルターおよびCuno BioAssureカプセルを用いて濾過した。該バッチをその後、30,000Da MWCOを有するMillipore Pellicon 2 Miniカートリッジを用いた正接流濾過によっておよそ20倍濃縮した。同じ正接流濾過カートリッジを用いて、試料を10mMトリスpH7.5、1mM EDTAで、5容積分の緩衝液交換を伴って透析濾過した。試料を50mLの一定分量に分け、−80℃で凍結させた。FVII活性は、濾過由来の透過画分において検出できず、活性の〜75%の回収が、濃縮され緩衝液交換された材料においてみられた。
上清を含むFVII−AE864(AC404)を濃縮し、緩衝液を10mMトリスpH7.5、1mM EDTAに交換した。その後、5mLのこの試料をPBSにおいて10倍希釈し、追加的なNaClを50mMまで添加した後、BaSO4を20mg/mLまで添加した。試料を振蘯機において室温で30分間弾ませた。次に、試料を3000rpmで5分間遠心分離して、BaSO4をペレット化した。上清を廃棄し、ペレットを5mLの200mM酢酸ナトリウムにおいて再懸濁し、室温で30分間弾ませた。これを2回以上反復した。第三の洗浄後、ペレットを0.8mLの100mMクエン酸三ナトリウムpH7.0に再懸濁し、室温で30分間弾ませた。これを1回反復した。ブラッドフォードアッセイを実施して、試料におけるタンパク質の総量を決定し、Innovinを活性化型トロンボプラスチンとして用いるPTベースの因子アッセイにおいてFVII活性をアッセイした(表27)。層タンパク質に対する活性の比は、この精製工程からの〜12倍の正味の精製を示した。
カルシウム依存性様式でFVIIのGLAドメインを結合するモノクローナル抗体(クローンID CaFVII‐22)を、Pierce製のUltralinkビーズに共役させた。PBSにおける10mgの抗体を1.25の樹脂に添加し、最終容積を共役緩衝液(100mM MOPS、700mMクエン酸ナトリウム、pH8.0)で15mLにすることによって、共役を実施した。このことは、10mLの樹脂スラリーおよび1mg:1mLの抗体質量:ビーズスラリー容積の比を生じた。該スラリーを室温で2時間インキュベートした後、ビーズを共役緩衝液で洗浄した。BCAアッセイは、〜70%の抗体がビーズと共役することを示した。ビーズを次に1MトリスpH8.0で室温で2時間クエンチした。ビーズを10mMトリスpH7.5および10mM CaCl2へと平衡化し、5.5mLのビーズを10mMトリスpH7.5および〜10mM CaCl2における濃縮され緩衝液交換したFVII−AE864(AC404)50mLと混合した。試料を4℃で一晩、振蘯機上でインキュベートして、FVII−XTENを樹脂に結合させた。翌日、ビーズを45mLの10mMトリス、500mM NaCl、10mM CaCl2、pH7.5で3回洗浄した後、20mLの10mMトリス、100mM EDTA、pH7.5で溶出した。SDS‐PAGE分析は、純度が90%を超過することを示す(図15)。
アフィニティ精製したFVII−AE864(AC404)およびFVII−AE288(AC398)をFXaの添加によってFVIIa−AE864およびFVIIa−AE288へと活性化した。FVII−XTENタンパク質を10mMトリス、10mM CaCl2、pH7.5へと、Amicon限外10,000Da MWCO濃縮機における反復した回数の濃縮を介して緩衝液交換し、その後希釈した。終容積は、〜0.4mg/mLにおいて1mLであった。Novagen製のFXaを10単位/mLの終濃度に添加し、試料を4℃で一晩インキュベートした。還元型SDS‐PAGEは、活性化の際に生じるに過ぎ得ない、分子からの軽鎖の損失を表す非還元型試料と比較して、DTTを用いた上部バンドにおける下方向の移行によるFVII−XTENタンパク質からFVIIa−XTENタンパク質への完全な変換を示した(図16)。加えて、軽鎖は、ゲル上でより低く表れるように見え、対照のFVIIaの軽鎖と同じ位置に泳動し、FVIIからFVIIaへのFVIIドメインの移行をさらに確認した。類似の緩衝液条件のもとで、FVII−XTEN融合体は、トロンビン、FIXam、FXIIa、またはR152とI153の間のペプチド結合を選択的に切断することのできる任意の他のプロテアーゼの添加によって、FVIIa−XTENへと活性化される。
アフィニティ精製したFVII−AE864(AC404)およびFVII−XTEN_AE288(AC398)をFVIIa−AE864およびFVIIa−AE288へ、試料を4℃で1週間インキュベートすることによって活性化した。FVII−XTENタンパク質を10mMトリス、10mM CaCl2、pH7.5へと、Amicon限外10,000Da MWCO濃縮機における反復した回数の濃縮を介して緩衝液交換し、その後希釈した。インキュベーション後、タンパク質をSDS‐PAGEによってアッセイし、上部バンドは、分子からの軽鎖の損失を表す非還元型試料と比較して、DTTを用いて上部バンドにおける特徴的な下方向の移行を示した(図17)。加えて、軽鎖は、FXaにより活性化された材料の2つのロットと同じ点におけるゲルにおいてより低く表れるのを見ることができ、該タンパク質がFVIIa−XTENに自己活性化したという結論をさらに確証する。
上清を含むFVII−AE864(AC404)の試料を濃縮し、10mMトリスpH7.5、1mM EDTAへと緩衝液交換した後、1M CaCl2を添加して〜5mMのCaCl2の終濃度に調整した。試料を、Aktaクロマトグラフィーシステムにおいて平衡化した2mLのマクロキャップQカラムに負荷した。タンパク質を0〜100%の直線勾配の緩衝液Bで20カラム容積にわたって溶出した。緩衝液Aはm、20mM MES、5mM CaCl2 pH6.0を含み、緩衝液Bは、20mM MES、5mM CaCl2 pH6.0、および500mM NaClを含んだ。画分を、Innovinを活性化型トロンボプラスチンとして用いるPTベースの因子アッセイを用いてFVII活性についてアッセイした。活性の単一の締まったピークは、47.9mLと52.4mLの間で、または23.2〜27.8mS/cmで溶出しながら観察された(図19)。ブラッドフォードアッセイを実施して、負荷および溶出画分におけるタンパク質の総量を決定した。活性と総タンパク質との比は、カラムからの〜5倍の正味の精製を示した。
上清を含むFVII−AE864(AC404)の試料を濃縮し、10mMトリスpH7.5、1mM EDTAへと緩衝液交換した後、1M CaCl2の添加によって〜5mM CaCl2の終濃度に調整した。試料をAktaクロマトグラフィーシステムにおいて平衡化した2mLトヨパールフェニルカラムへと負荷した。タンパク質を0〜100%の緩衝液Bの直線勾配を用いて20カラム容積にわたって溶出した。緩衝液Aは、10mMトリス、5mM CaCl2、3M NaCl、pH7.5を含み、緩衝液Bは、10mMトリス、5mM CaCl2、pH7.5を含んだ。画分を、Innovinを活性化型トロンボプラスチンとして用いるPTベースの因子アッセイを用いてFVII活性についてアッセイした。活性の単一のピークは、1Mと2MのNaClの間で溶出されるのが観察された(図20)。ブラッドフォードアッセイを実施して、負荷および溶出画分におけるタンパク質の総量を決定した。活性と総タンパク質との比は、カラムからの〜2倍の正味の精製を示した。
アフィニティ精製したFVII−AE864(AC404)を負荷し、1mL緩衝液と10mL試料との比で、200mM MES、210mM CaCl2 pH6.0の添加によってpH6.0に調整した。Akta FPLCシステムを用いて、試料を2mLマクロキャップQカラムを用いて精製した。カラムを緩衝液A(20mM MES、1mM CaCl2、pH6.0)へと平衡化し、試料を負荷した。試料を、30%〜80%の緩衝液B(20mM MES、1mM CaCl2、pH6.0+500mM NaCl)の直線勾配を用いて、20カラム容積にわたって溶出した。215nmのクロマトグラムは、溶出特性において2つのピークを示した(図21のA)。初期ピークおよび後期ピークに相応する画分をプールし、60cmのBioSep G4000カラムを用いた分子ふるいクロマトグラフィー(SEC)を介して分析した。初期ピークは、単量体AE864タンパク質の特徴的な水力学的半径を有する単分散した集団を含んでいた(10.1nmまたは1.9MDaの見かけの分子量)(図21のB)。後期ピークは、2つの集団を含んでおり、より小さな単量体ピークは、初期ピークにおける凝集体の不在を示し、カラムの空隙容積(22mL)においてより早期に溶出するより大きなピークは、凝集したタンパク質の特徴である。
FVII−AE864(AC404)およびFVII−AE288(AC398)をアフィニティおよび陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製し、特徴づけた。60cmのBioSep G4000カラムを用いる分子ふるいクロマトグラフィーは、単量体AE864タンパク質(15.2の見かけの分子量因子について10.1nmまたは1.9MDaの見かけの分子量)または単量体AE288タンパク質(9.0の見かけの分子量因子について8.2nmまたは650kDaの見かけの分子量)のいずれかについて特徴的な水力学的半径を有する単分散した集団を示した。最小の凝集は、いずれかの試料において観察された。SDS‐PAGEは、90%超の純粋なタンパク質を示し、最小の宿主細胞タンパク質の混入を伴った。
活性を、以下の通りPTベースの第VII因子アッセイによってアッセイした:標準曲線を、正常血漿をFVII欠乏性血漿で10倍希釈した後、第VII因子欠乏性血漿を用いてさらに4、5倍の連続希釈を実施することによって調製した。これは、活性の100、20、4、0.8、および0.16m単位/mLにおける点で標準曲線を作成し、ここで、活性の1単位を1mLの正常ヒト血漿におけるFVII活性の量として定義する。また、FVII欠乏性血漿は、無血漿(null plasma)における活性の背景レベルを決定するために含まれた。1:10の容積比で試料を、FVII−XTENをFVII欠乏性血漿に添加することによって調製した。試料を37℃で分子デバイスプレートリーダー分光計において3分間インキュベートし、その点において、凝固反応を試料1容積あたり2容積のトロンボプラスチン(Dade Innovin, B4212‐50)の添加によって開始した。濁度を405nmで5分間モニターして、反応特性を作成した。。PT時間または凝固活性の開始する時間は、OD405nmがベースラインを0.06ほど上回って増大する第一の時間として定義した。対数‐直線標準曲線を、PT時間に対して直線的に関連する活性の対数を用いて作成した。これから、プレートウェルにおける試料の活性を決定した後、試料における活性を、FVII欠乏性血漿への希釈を説明するために11ほど乗じることによって決定した。四つ組の測定結果に基づいて、FVII−AE864(AC404)の融合体の活性は、30単位/mLであり、FVII−AE288(AC398)は15U/mLであった。加えて、凝固に関するこの脂質付加した組織因子の活性化を用いて、トロンビン発生アッセイ、TEGアッセイ、ローテム(rotem)アッセイ、および基質のターンオーバー、機械的凝固形成、または光凝固検出による凝固酵素機能の検出を包含する他のインビトロ/エクスビボのようにより洗練された読み出しを伴う凝固アッセイにおけるFVII−XTEN融合体の活性をアッセイする。
FVIIa−AE288に対するFVII−AE288(AC398)の活性化の後、活性を、可溶性組織因子(sTF)誘導性凝固によって測定した。このことは、Stago STA‐Clot FVIIa活性アッセイキットを用いて実施される。簡潔には、FIIaを結合しFVIIa活性を亢進するが、FVIIからFVIIaに変化しないをsTFとともに試料をインキュベートした。FVII無血漿における凝固を誘導する時間を、分子デバイスプレートリーダーにおいてモニターされる場合、ベースラインを上回って0.06ほどOD405nmが増大する第一の時間として定義した。この時間を、FVII無血漿へ添加した既知のFVIIa量を含む標準曲線と比較し、活性数を算出した。FVIIa−AE288試料は、112U/mLのFVIIa活性と等価の活性を含んだ。加えて、凝固に関するこの可溶性組織因子の活性化を用いて、凝固アッセイにおけるFVII−XTEN融合体の活性をアッセイし、該アッセイには、トロンビン発生アッセイ、TEGアッセイ、ローテムアッセイ、および基質のターンオーバー、機械的凝固形成、または光凝固検出による凝固酵素機能の検出を包含する他のインビトロ/エクスビボのようにより洗練された読み出しを伴う。
FVII−XTEN融合体濃度を、アフィニティ精製したポリクローナルヒツジ抗ヒトFVII抗体を用いるELISAアッセイを用いて決定し、ここで、修飾されていない形態の抗体を用いて、該タンパク質を捕捉し、HRP抱合した形態を用いて、該タンパク質を検出した。捕捉抗体を4℃で一晩、高結合96ウェルアッセイプレート(Corning3690)へと被覆した。プレートを3%BSA含有PBSを用いて室温で1時間ブロッキングした。プレートをPBSTにおいてプレート洗浄機を用いて6回洗浄した。次に、PBSTに希釈した試料または標準物質を適切なウェルへと室温で2時間結合させた。10ng/mL〜1pg/mL未満に及ぶ標準曲線を、PBSTにおける既知の濃度の市販の血漿由来のFVII(Abcamカタログ番号ab62386)を連続希釈することによって調製した。プレートをPBSTでプレート洗浄機を用いて再度6回洗浄した。FVII−XTENを次に、検出抗体を用いて検出し、該抗体を37℃で1時間結合させた。プレートをPBSTでプレート洗浄機を用いて再度6回洗浄し、水でさらに1回洗浄した。次に、シグナルをTMB基質で顕色させ、分子デバイスプレートリーダー分光計において405nmで読み取ることによって定量した。次に、4パラメータ適合を標準物質、および標準曲線との比較によって決定される試料の濃度に関して実施する。
FVII−XTEN融合体活性を、基質D−FPR−6−アミノ−1−ナフタレンスルホンアミド(D−FPR−ANSN)におけるペプチド結合の開裂をモニターすることによって決定し、式中、DFPR部分は、ANSH部分における第二級アミンに連結されたペプチド鎖である。アルギニン残基とANSH部分の間の結合が、FVII触媒ドメインのセリンプロテアーゼ活性によって開裂される場合、ANSHは放出され、強いフルオロフォアとなる。FVII−XTEN活性は、20mMトリスpH8.0、135mM NaClにおける50μM〜100μMに及ぶ基質濃度で50pM〜1μMに及ぶ酵素濃度で測定される。ANSN蛍光(励起352nm、発光470nm)の変化を経時的にモニターすることによって、FVIIa触媒ドメインの活性を決定することができる。この活性をFVIIa由来の標準曲線と比較して、試料におけるFVIIa等価物の量を決定することができ、またはkcatおよびKmなどの動態特性を決定することができる。
リン脂質およびカルシウムの存在下で組織因子(TF)と複合体形成する場合、FVIIおよびFVII−XTENは、第X因子を第Xa因子へと活性化する。Biophen第VII因子は、第VII因子活性を試験するための色素発生アッセイである。第VII因子は、ウサギトロンボプラスチンによって提供される組織因子と酵素複合体を形成する。次に、定常濃度でアッセイに存在する第X因子を活性化させ、過剰量で第Xa因子となる。FXaの濃度は、具体的な第Xa因子色素発生基質(SXa‐11)に及ぼす活性によって実際に測定される。第Xa因子は、基質を開裂し、pNAを生じる。生じたpNAの量は、第Xa因子活性に直接的に比例する。最終的に、アッセイされる試料における第VII因子活性の量と、生じた第Xa因子の活性の間には直接的な関連性があり、放出されるpNAの量によって測定され、405nmにおける色素顕色によって決定される。未知の試料由来のシグナルを既知のFVII活性の標準曲線由来のシグナルと比較することによって、未知の試料におけるFVII活性の量を算出することは可能である。
FIX−XTEN濃度を、具体的な符合した対の抗体によるELISAアッセイを用いて決定し、害アッセイにおいて、検出抗体をHRPと抱合させ、検出を簡素化した(Affinity Biologicalsカタログ番号FIX‐EIA)。高結合96ウェルアッセイプレート(Corning 3690)に捕捉抗体を4℃で一晩被覆させた。プレートを3%BSA含有PBSで室温で1時間ブロッキングした。プレートをプレート洗浄機を用いてPBSTにおいて6回洗浄した。PBSTに希釈した試料または標準物質を次に、適切なウェルへと室温で2時間結合させた。標準曲線は、25ng/mL〜1pg/mL未満におよび、PBSTにおける既知の濃度の市販の血漿由来のFIX(Abcamカタログ番号ab62544)を連続希釈することによって調製した。プレートをプレート洗浄機を用いてPBSTで再度6回洗浄した。次に、FIXを、37℃で1時間結合させる検出抗体を用いて検出した。プレートをプレート洗浄機を用いてPBSTで再度6回洗浄し、水でさらに1回洗浄した。次に、シグナルをTMB基質を用いて顕色させ、分子デバイスプレートリーダー分光計において405nmで読み取ることによって定量した。次に、4パラメータ適合を、標準物質および標準曲線との比較によって決定した試料の濃度に関して実施する。
FIX−XTENは、内在的なまたは接触で活性化された凝固経路におけるFIXを置き換えるよう作用するであろう。この凝固経路の活性を、活性化型部分的トロンボプラスチン時間アッセイ(aPTT)を用いて評価する。FIX活性を以下のとおり具体的に測定し、標準曲線を、正常対照血漿(Pacific Hemostasisカタログ番号100595)をFIX欠乏性血漿(カタログ番号100900)で2倍希釈し、次に、第IX因子欠乏性血漿で6、4倍連続希釈を再度実施することによって調製した。このことは、活性の500、130、31、7.8、2.0、0.5、および0.1m単位/mLにおける点での標準曲線を作成し、ここで、活性の1単位を1mLの正常ヒト血漿におけるFIX活性の量として定義する。また、FIX欠乏性血漿は、無血漿における活性の背景レベルを決定するために含まれた。FIX−XTENをFIX欠乏性血漿に、1;10の容積比で添加することによって試料を調製した。試料を以下の通りaPTTアッセイを用いて試験した。試料を分子デバイスプレートリーダー分光計において37℃で2分間インキュベートし、その点において等容積のaPTT試薬(Pacific Hemostasisカタログ番号100402)を添加し、さらに3分間の37℃インキュベーションを実施した。インキュベーション後、1容積の塩化カルシウム(Pacific Hemostasisカタログ番号100304)を添加することによって、該アッセイを活性化させた。濁度を450nmにおいて5分間モニターして、反応特性を作成した。aPTT時間、または凝固活性の開始する時間を、OD405nmがベースラインを0.06ほど上回って増大する最初の時点として定義した。対数‐直線標準曲線を、aPTT時間と直線的に関連する活性の対数を用いて作成した。これから、プレートウェルにおける試料の活性を決定した後、試料における活性を、FIX欠乏性血漿への希釈を説明するために11ほど乗じることによって決定した。
FIX(pCW0596)、FIX−XTEN(pCW0597)、FIX/cFXI1/XTEN(pCW0735)、FIX/cFXI2/XTEN(pCW0736)およびFIX/cFXI3/XTEN(pCW0737)を、CHO‐K1細胞において一過性に発現させた。一過性トランスフェクションの上清を30,000MWCO濃縮装置においておよそ15倍ほど濃縮した。濃縮した試料および非濃縮試料の濃度をELISAによって決定した。次に、濃縮した試料の凝固活性を、aPTTベースの因子アッセイを用いて決定した。含有するXTENについて、活性は、任意のFXIc開裂部位の存在によって劇的に変化した。3つの場合すべてにおいて、FXI開裂部位の存在は、凝固活性を30倍超ほど亢進した(図22および表28を参照されたい)。相対的に一致するELISAの測定結果は、このことが、力価の変化よりもむしろ比活性の亢進であることを示す。加えて、FXI開裂部位コンストラクトについてのELISA濃度に対する活性測定結果の比は今や、FIXに対する比と類似しており、FIX−FXIc−XTENが、XTENの不在下で発現したFIXドメインと類似の特性のFIXドメインを含むことを示した。
FVII単独と比較して、CFXTEN FVII−XTEN_AE864の薬物動態をスプラーグ・ドーリーにおいて試験した。FVII−XTEN_AE864およびFVIIを雌のスプラーグ・ドーリー系ラット(n=3)に、頚静脈カテーテルを通じて3μg/個体で静脈内投与した。血液試料(0.2mL)を予冷しておいたヘパリン処理済みチューブへと投与前、0.08、0.5、1、2、4、8、24、48、72時間の時点で回収し、血漿へと処理した。試験品の定量を、捕捉および検出の両方について抗FVII抗体を用いるELISAアッセイによって実施した。非コンパートメント分析をWinNonLinにおいて実施し、すべての時点は、PKパラメータを決定するための適合に含まれていた。
マクロキャップQ精製したFIX−XTEN_AE864の薬物動態を、スプラーグ・ドーリー系ラット(n=3)において試験し、未精製のFIX−XTEN、開裂したFIX−XTEN TEV(XTENをTEVプロテアーゼの使用によって融合タンパク質から除去する調製)、および市販のFIX Benefixと比較した。化合物を雌のスプラーグ・ドーリーラットに頚静脈カテーテルを通じて3μg/個体で静脈内投与した。血液試料(0.2mL)を、予冷しておいたヘパリン処理済みチューブへと投与前、0.08、0.5、1、2、4、8、24、48、72時間の時点で回収し、血漿へと処理した。試験品の定量を、捕捉および検出の両方について抗FVII抗体を用いるELISAアッセイによって実施した。非コンパートメント分析をWinNonLinにおいて実施し、すべての時点は、PKパラメータを決定するための適合に含まれていた。
FVIIa−XTENコンストラクトのインビボでの薬理活性を、血友病、手術、外傷、血小板減少/血小板機能不全、クロピドグレル/ヘパリン誘発性出血、および水力学的注射のものを含むがこれらに限定されない出血の種々の臨床前モデルを用いて評価する。これらのモデルは、他のFVIIaアプローチのために使用および公表されたものと等価の方法を用いて、マウス、ラット、ウサギ、およびイヌを含む複数の種において開発されることができる。FVIIa−XTEN組成物は、インビボでの投与に適合した水性緩衝液(例えば、リン酸緩衝塩類溶液、またはトリス緩衝塩類溶液)において提供される。組成物は、特定のモデルのために最適化された適切な用量、投薬頻度、投薬スケジュール、および投与経路で投与される。効能の決定には、とりわけ、FVIIa活性の測定、プロトロンビン時間(PT)、活性化型部分プロトロンビン時間(aPTT)、出血回数、全血凝固時間(WBCT)、トロンボエラストグラフィー(TEGまたはROTEM)を含む。
FIX−XTENコンストラクトのインビボでの薬理活性を、血友病、手術、外傷、血小板減少/血小板機能不全、クロピドグレル/ヘパリン誘発性出血、および水力学的注射のものを含むがこれらに限定されない出血に関する種々の臨床前モデルを用いて評価する。これらのモデルは、他のFIXアプローチについて使用および公表されたものと等価の方法を用いて、マウス、ラット、ウサギ、およびイヌを含む複数種において開発されることができる。FIX−XTEN組成物は、インビボでの投与に適合した水性緩衝液(例えば、リン酸緩衝塩類溶液またはトリス緩衝塩類溶液)において提供される。組成物は、特定のモデルのために最適化された適切な用量、投薬頻度、投薬スケジュール、および投与経路で投与される。効能の読み出しには、とりわけ、FIX活性の測定、PT、aPTT、出血回数、全血凝固時間(WBCT)、トロンボエラストグラフィー(TEGまたはROTEM)を含む。
FXIaによって放出可能なC末端XTEN
FIXのC末端に融合したXTENタンパク質からなるFIX−XTEN融合タンパク質は、図2のFにおいて図示されるように、FIX成分とXTEN成分の間に配置されたXTEN放出部位開裂配列を用いて作製されることができる。例示的な配列を表42に提供する。この場合、放出部位開裂配列は、FXIaプロテアーゼ(EC 3.4.21.27, Uniprot P03951)によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含むFIX−XTENに組み込まれることができる。具体的には、アミノ酸配列KLTRAETは、FXIaプロテアーゼによって該配列のアルギニンの後ろで切断される。FXIは、内在性凝固経路または接触で活性化した凝固経路におけるFIXの直前に配置された凝血原プロテアーゼである。活発なFXIaは、FXIIaによる酵素前駆体のタンパク質分解性開裂によって、FXIから生じる。一旦活性化されると、凝固におけるその天然の役割はFIXの位置R191およびR226におけるタンパク質を切断し、次に、このことが凝固経路を永続化させることによって、酵素前駆体からペプチドを切り出すことによってFIXを活性化することである。FXIaの生成はきっちりと制御されており、凝固が適切な止血に必要なときにのみ生じる。それゆえ、KLTRAET開裂配列の組み込みによって、XTENドメインは、内在性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理学的に必要とされる場合に、FIXから取り出されるに過ぎないであろう。このことは、FIX−XTEN融合タンパク質が、内在性経路の活性化の間に1つの追加的な様式で加工される状況を作る。FXIaによってFIXドメインのR191およびR226において生じる天然の開裂に加えて、第三の開裂が、XTENタンパク質から今や活性化されたFIXaを脱共役するであろうXTEN放出部位において生じるであろう。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、分子が遊離FIXaを生じるよう加工され、遊離FIXaが、それを必要とする対象における凝固機能を再構成または増強する凝固の活性化まで、FIX−XTENがプロドラッグとして無処置のままであろう状況を作る。
FIXのC末端に融合したXTENタンパク質からなるFIX−XTEN融合タンパク質は、図2のFに図示されるように、FIX成分とXTEN成分の間に配置されたXTEN放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表42に提供する。この場合、XTEN放出部位配列は、FXIIaプロテアーゼ(EC 3.4.21.38, Uniprot P00748)によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含むことができる。具体的には、配列TMTRIVGGは、該配列の位置4におけるアルギニンの後ろで切断される。FXIIは、内在性凝固経路または接触で活性化した凝固経路におけるFIXの前に配置された凝血原プロテアーゼである。活発なFXIaは、非自己表面との接触によって、およびカリクレインによる開裂によって、FXIIから生じる。一旦活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、酵素前駆体のタンパク質分解性開裂によってFXIを活性化することであり(図3)、次に、このことが凝固経路を永続化させる。FXIIaの生成はきっちりと制御されており、凝固が適切な止血に必要なときにのみ生じる。それゆえ、TMTRIVGG開裂配列の組み込みによって、XTENドメインは、内在性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理学的に必要とされる場合に、FIXから取り出されるに過ぎないであろう。このことは、FIX−XTEN融合体が、内在性経路の活性化の間に1つの追加的な様式で加工される状況を作る。FXIaによってFIXドメインのR191およびR226において生じる天然の開裂に加えて、第三の開裂が、XTENタンパク質から今や活性化されたFIXaを脱共役するであろうXTEN放出部位において生じるであろう。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、分子が遊離FIXaを生じるよう加工され、遊離FIXaが、それを必要とする対象における凝固機能を再構成または増強する凝固の活性化まで、FIX−XTENがプロドラッグとして無処置のままであろう状況を作る。
FIXのC末端に融合したXTENタンパク質からなるFIX−XTEN融合タンパク質を、図2のFに図示されるように、FIX成分とXTEN成分の間に配置されたXTEN放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表42に提供する。この場合、XTEN放出部位配列は、カリクレインプロテアーゼ(EC 3.4.21.34, Uniprot P03952)によって認識および開裂されるアミノ酸配列であり得る。具体的には、配列SPFRVVGG[Rawlings N.D., et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320]は、該配列の位置4におけるアルギニンの後ろで切断される。カリクレインは、内在性凝固経路または接触で活性化した凝固経路におけるFIXの前に配置された凝血原プロテアーゼである。活発なカリクレインは、非自己表面との接触によって、血漿カリリエン(Kallirien)から生じる。一旦活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、酵素前駆体のタンパク質分解性開裂によってFXIIを活性化することであり(図3)、次に、このことが凝固経路を永続化させる。カリクレインの生成はきっちりと制御されており、凝固が適切な止血に必要なときにのみ生じる。それゆえ、SPFRVVGG開裂配列の組み込みによって、XTENドメインは、内在性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理学的に必要とされる場合に、FIXから取り出されるに過ぎないであろう。このことは、FIX−XTEN融合体が、内在性経路の活性化の間に1つの追加的な様式で加工される状況を作る。FXIaによってFIXドメインのR191およびR226において生じる天然の開裂に加えて、第三の開裂が、XTENタンパク質から今や活性化されたFIXaを脱共役するであろうXTEN放出部位において生じるであろう。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、分子が遊離FIXaを生じるよう加工され、遊離FIXaが、それを必要とする対象における凝固機能を再構成または増強する凝固の活性化まで、FIX−XTENがプロドラッグとして無処置のままであろう状況を作る。
FIXのC末端に融合したXTENタンパク質からなるFIX−XTEN融合タンパク質を、図2のFに図示されるように、FIX成分とXTEN成分の間に配置されたXTEN放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表42に提供する。この場合、該放出部位配列は、FVIIaプロテアーゼ(EC 3.4.21.21, Uniprot P08709)によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含む。具体的には、配列LQVRIVGG [Rawlings N.D., et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320]は、該配列の位置4におけるアルギニンの後ろで切断される。FVIIaは、外来性凝固経路または細胞の損傷で活性化した凝固経路におけるFIXの前に配置された凝血原プロテアーゼである。活発なFVIIaは、組織因子、リン脂質、およびカルシウムに対する結合によって促進される自己触媒過程においてFVIIから生じる。一旦活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、酵素前駆体のタンパク質分解性開裂によってFIXおよびFXを活性化することであり(図3)、次に、このことが凝固経路を永続化させる。FVIIa活性はきっちりと制御されており、凝固が適切な止血に必要なときにのみ生じる。それゆえ、LQVRIVGG開裂配列の組み込みによって、XTENドメインは、内在性凝固経路の活性化と同時に、および凝固が生理学的に必要とされる場合に、FIXから取り出されるに過ぎないであろう。このことは、FIX−XTEN融合体が、内在性経路の活性化の間に1つの追加的な様式で加工される状況を作る。FVIIaによってFIXドメインのR191およびR226において生じるであろう天然の開裂に加えて、第三の開裂が、XTENタンパク質から今や活性化されたFIXaを脱共役するであろうXTEN放出部位において生じるであろう。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、分子が遊離FIXaを生じるよう加工され、遊離FIXaが、それを必要とする対象における凝固機能を再構成または増強する凝固の活性化まで、FIX−XTENがプロドラッグとして無処置のままであろう状況を作る。
FIXのC末端に融合したXTENタンパク質からなるFIX−XTEN融合タンパク質を、図2のFに図示されるように、FIX成分とXTEN成分の間に配置されたXTEN放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表42に提供する。この場合、該放出部位開裂配列は、FIXaプロテアーゼ(EC 3.4.21.22, Uniprot P000740)によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含む。具体的には、配列PLGRIVGG[Rawlings N.D., et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320]は、該配列の位置4におけるアルギニンの後ろで切断される。活発なFIXaは、リン脂質およびカルシウムの存在下でFXIaまたはFVIIaのいずれかによるFIXの開裂によって生じる。一旦活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、酵素前駆体のタンパク質分解性開裂によってFXを活性化することであり(図3)、次に、このことが凝固経路を永続化させる。FIXa活性はきっちりと制御されており、凝固が適切な止血に必要なときにのみ生じる。それゆえ、PLGRIVGG配列の組み込みによって、XTENドメインは、外来性凝固経路または内在性凝固経路のいずれかの活性化と同時に、および凝固が生理学的に必要とされる場合に、FIXから取り出されるに過ぎないであろう。このことは、FIX−XTEN融合体が、内在性経路の活性化の間に1つの追加的な様式で加工される状況を作る。FVIIaまたはFXIaによってFIXドメインのR191およびR226において生じるであろう天然の開裂に加えて、第三の開裂が、XTENタンパク質から今や活性化されたFIXaを脱共役するであろうXTEN放出部位において生じるであろう。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、分子が遊離FIXaを生じるよう加工され、遊離FIXaが、それを必要とする対象における凝固機能を再構成または増強する凝固の活性化まで、FIX−XTENがプロドラッグとして無処置のままであろう状況を作る。
FIXのC末端に融合したXTENタンパク質からなるFIX−XTEN融合タンパク質を、図2のFに図示されるように、FIX成分とXTEN成分の間に配置されたXTEN放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表42に提供する。この場合、該放出部位は、FXaプロテアーゼ(EC 3.4.21.6, Uniprot P00742)によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含む。具体的には、配列IEGRTVGG[Rawlings N.D., et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320]は、該配列の位置4におけるアルギニンの後ろで切断される。活発なFXaは、リン脂質およびカルシウムの存在下でFIXaによるFXの開裂によって生じ、凝固経路における第IX因子からすぐ下流の工程である。一旦活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、酵素前駆体のタンパク質分解性開裂によってFIIを活性化することであり(図3)、次に、このことが凝固経路を永続化させる。FXa活性はきっちりと制御されており、凝固が適切な止血に必要なときにのみ生じる。それゆえ、IEGRTVGG配列の組み込みによって、XTENドメインは、外来性凝固経路または内在性凝固経路のいずれかの活性化と同時に、および凝固が生理学的に必要とされる場合に、FIXから取り出されるに過ぎないであろう。このことは、FIX−XTEN融合体が、凝固の活性化の間に1つの追加的な様式で加工される状況を作る。FVIIaまたはFXIaによってFIXドメインのR191およびR226において生じるであろう天然の開裂に加えて、第三の開裂が、XTENタンパク質から今や活性化されたFIXaを脱共役するであろうXTEN放出部位において生じるであろう。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、分子が遊離FIXaを生じるよう加工され、遊離FIXaが、それを必要とする対象における凝固機能を再構成または増強する凝固の活性化まで、FIX−XTENがプロドラッグとして無処置のままであろう状況を作る。
FIXのC末端に融合したXTENタンパク質からなるFIX−XTEN融合タンパク質を、図2のFに図示されるように、FIX成分とXTEN成分の間に配置されたXTEN放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表42に提供する。この場合、該放出部位は、FIIaプロテアーゼ(EC 3.4.21.5, Uniprot P00734)によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含む。具体的には、配列LTPRSLLV[Rawlings N.D., et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320]は、該配列の位置4におけるアルギニンの後ろで切断される。活発なFIIaは、リン脂質およびカルシウムの存在下でFXaによるFIIの開裂によって生じ、凝固経路における第IX因子から下流にある。一旦活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、酵素フィブリノーゲンを開裂させることであり(図3)、次に、このことが凝固経路を開始する。FIIa活性はきっちりと制御されており、凝固が適切な止血に必要なときにのみ生じる。それゆえ、LTPRSLLV配列の組み込みによって、XTENドメインは、外来性凝固経路または内在性凝固経路のいずれかの活性化と同時に、および凝固が生理学的に必要とされる場合に、FIXから取り出されるに過ぎないであろう。このことは、FIX−XTEN融合体が、凝固の活性化の間に1つの追加的な様式で加工される状況を作る。FVIIaまたはFXIaによってFIXドメインのR191およびR226において生じるであろう天然の開裂に加えて、第三の開裂が、XTENタンパク質から今や活性化されたFIXaを脱共役するであろうXTEN放出部位において生じるであろう。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、分子が遊離FIXaを生じるよう加工され、遊離FIXaが、それを必要とする対象における凝固機能を再構成または増強する凝固の活性化まで、FIX−XTENがプロドラッグとして無処置のままであろう状況を作る。
FIXのC末端に融合したXTENタンパク質からなるFIX−XTEN融合タンパク質を、図2のFに図示されるように、FIX成分とXTEN成分の間に配置されたXTEN放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表42に提供する。この場合、該放出部位は、エラスターゼ‐2プロテアーゼ(EC 3.4.21.37, Uniprot P08246)によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含む。具体的には、配列LGPVSGVP[Rawlings N.D., et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320]は、該配列の位置4の後ろで切断される。エラスターゼは、好中球によって構成的に発現され、循環におけるすべての場合に存在する。その活性はセルピンによってきっちりと制御されており、それゆえ、ほとんどの場合最小に活発である。それゆえ長い寿命のFIX−XTENが循環すると、その画分が開裂され、凝固に用いられるためのより短い寿命のFIXのプールを作製する。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、予防量のFIXを定常的に放出する循環するプロドラッグデポーを作る。
FIXのC末端に融合したXTENタンパク質からなるFIX−XTEN融合タンパク質を、図2のFに図示されるように、FIX成分とXTEN成分の間に配置されたXTEN放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表42に提供する。この場合、該放出部位は、MMP‐12プロテアーゼ(EC 3.4.24.65, Uniprot P39900)によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含む。具体的には、配列GPAGLGGA[Rawlings N.D., et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320]は、該配列の位置4の後ろで切断される。MMP‐12は、全血において構成的に発現される。それゆえ、長い寿命のFIX−XTENが循環すると、その画分が開裂され、凝固に用いられるためのより短い寿命のFIXのプールを作製する。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、予防量のFIXを定常的に放出する循環するプロドラッグデポーを作る。
FIXのC末端に融合したXTENタンパク質からなるFIX−XTEN融合タンパク質を、図2のFに図示されるように、FIX成分とXTEN成分の間に配置されたXTEN放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表42に提供する。この場合、該放出部位は、MMP‐13プロテアーゼ(EC 3.4.24.−, Uniprot P45452)によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含む。具体的には、配列GPAGLRGA[Rawlings N.D., et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320]は、該配列の位置4の後ろで切断される。MMP‐13は、全血において構成的に発現される。それゆえ、長い寿命のFIX−XTENが循環すると、その画分が開裂され、凝固に用いられるためのより短い寿命のFIXのプールを作製する。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、予防量のFIXを定常的に放出する循環するプロドラッグデポーを作る。
FIXのC末端に融合したXTENタンパク質からなるFIX−XTEN融合タンパク質を、図2のFに図示されるように、FIX成分とXTEN成分の間に配置されたXTEN放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表42に提供する。この場合、該放出部位は、MMP‐20プロテアーゼ(EC.3.4.24.−, Uniprot Q9ULZ9)によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含む。具体的には、配列APLGLRLR[Rawlings N.D., et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320]は、該配列の位置4の後ろで切断される。MMP‐17は、全血において構成的に発現される。それゆえ、長い寿命のFIX−XTENが循環すると、その画分が開裂され、凝固に用いられるためのより短い寿命のFIXのプールを作製する。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、予防量のFIXを定常的に放出する循環するプロドラッグデポーを作る。
FIXのC末端に融合したXTENタンパク質からなるFIX−XTEN融合タンパク質を、図2のFに図示されるように、FIX成分とXTEN成分の間に配置されたXTEN放出部位開裂配列を用いて作製することができる。例示的な配列を表42に提供する。この場合、該放出部位は、MMP‐20プロテアーゼ(EC.3.4.24.−, Uniprot O60882)によって認識および開裂されるアミノ酸配列を含む。具体的には、配列PALPLVAQ[Rawlings N.D., et al. (2008) Nucleic Acids Res., 36: D320]は、(矢印によって示される)位置4の後ろで切断される。MMP‐20は、全血において構成的に発現される。それゆえ、長い寿命のFIX−XTENが循環すると、その画分が開裂され、凝固に用いられるためのより短い寿命のFIXのプールを作製する。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、予防量のFIXを定常的に放出する循環するプロドラッグデポーを作る。
C末端XTENの放出速度を変更した前述の実施例のバリアントを作製することができる。XTEN放出プロテアーゼによるXTEN放出の速度が、XTEN放出部位の配列に依存するので、XTEN放出部位におけるアミノ酸配列を変動させることによって、XTEN放出速度を制御することができる。多くのプロテアーゼの配列特異性は当該技術分野で周知であり、いくつかのデータベースにおいて記録されている。この場合、プロテアーゼのアミノ酸特異性は、基質の組み合わせライブラリーを用いて[Harris, J. L., et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97: 7754]、または[Schellenberger, V., et al. (1993) Biochemistry, 32: 4344]に示されるように基質混合物の開裂に従うことによってマッピングされる。代替案は、ファージディスプレイによる最適なプロテアーゼ開裂配列の同定である[Matthews, D., et al. (1993) Science, 260: 1113]。コンストラクトを、バリアント配列を用いて作製し、XTENポリペプチドの検出のための標準的なアッセイを用いてXTEN放出についてアッセイする。
KNSADKループへの内部XTEN融合
FIXのループに挿入されたXTENタンパク質からなるFIX−XTEN融合タンパク質を、図2のFに示されるように作製することができる。具体的には、XTEN配列を融合体として、EGF2ドメインのKNSADNKループ(残基146〜152)へと挿入し、該ループは、公知の血友病Bの突然変異を有さず、FIX結晶構造において高度に構造化されていない。この場合、該挿入は、ループ配列のSA結合における天然配列を分割することによって、およびXTEN配列を間隙へと融合させることによって作製される。このことは、ループ配列KN−XTEN−ADNKを生じるであろう。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、FIX−XTENが凝固の活性化までプロドラッグとして無処置のままであろう状況を作り、この場合において分子は、それを必要とする対象における凝固機能を再構成または増強するFIXa−XTENを生じるよう加工される。
FIXのループに挿入されたXTENタンパク質からなるFIX−XTEN融合タンパク質を、図2のFに示されるように作製することができる。具体的には、XTEN配列を融合体として、EGF2ドメインのLAENループ(残基163〜166)へと挿入し、該ループは、公知の血友病Bの突然変異を有さず、FIX結晶構造において高度に構造化されていない。この場合、該挿入は、該配列のAE結合における天然配列を分割することによって、およびXTEN配列を間隙へと融合させることによって作製される。このことは、ループ配列LA−XTEN−ENを生じるであろう。本発明の組成物の所望の特長において、このことは、FIX−XTENが凝固の活性化までプロドラッグとして無処置のままであろう状況を作り、この場合において分子は、それを必要とする対象における凝固機能を再構成または増強するFIXa−XTENを生じるよう加工される。
FIXのループに挿入されたXTENタンパク質からなるFIX−XTEN融合タンパク質を、図2のDに示されるように作製することができる。具体的には、XTEN配列を活性化ペプチド(残基192〜226)へと配置し、それにより2つの天然FXIa開裂部位のいずれも破壊されないようになっている。挿入は、該配列のT209‐I210における天然配列を分割し、およびXTEN配列を間隙へと融合させることによってなされる。このことは、KLTRAETVFPDVDYVNSTEAET−XTEN−ILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEの残基188において開始する配列を生じる。活発なFXIaは、FXIIaによる酵素前駆体のタンパク質分解性開裂によってFXIから生じる。一旦活性化されると、凝固におけるその天然の役割は、タンパク質を位置R191およびR226において切断することによってFIX酵素前駆体から活性化ペプチドを切り出すことによって、FIXを活性化することである(図4)。これらの切断部位を矢印によって示し、配列は、凝固カスケードの間に天然の開裂活性を可能にするよう変更されないP4‐P4’部位を残すよう設計される。それゆえ、XTENドメインは、内在性凝固経路内の正常な活性化過程の一部として、FIXから除去されるに過ぎないであろう。
FIXのループに挿入されたXTENタンパク質からなるFIX−XTEN融合タンパク質を、図2のCに示されるように作製することができる。具体的には、XTEN配列をFIXの2つのEGF様ドメイン(接合部は残基129と残基130の間である)の間に配置する。挿入は、E129‐L130における天然の配列を分割し、XTEN配列を間隙に融合させることによってなされる。このこてゃ、の残基121において開始する配列を生じるであろう。それにより2つの天然FXIa開裂部位のいずれも破壊されないようになっている。挿入は、該配列のT209‐I210における天然配列を分割し、およびXTEN配列を間隙へと融合させることによってなされる。このことは、FGFEGKNCE − XTEN − LDVTCNIKNGRの残基121において開始する配列を生じるであろう。実際、このことは、凝固の活性化までFIX−XTENが無処置で循環するであろう状況を作り、この場合、該分子は、個体における凝固機能を再構成または増強するFIXa−XTENを生じるよう加工される。
NovoSeven(登録商標)は、凝固カスケードの外来性経路を活性化させることによって止血を促進するよう意図された組換えヒト第VIIa凝固因子(rFVIIa)である。その短い半減期により、NovoSevenは、止血が達成されるまで2時間ごと〜6時間ごとに静脈内に投薬される。XTENのFVIIへの融合は、該タンパク質の半減期を改良し、したがって、このようなFVII含有融合タンパク質組成物を用いて低下した投薬頻度を可能にする。
凝固第IX因子(組換え)であるBeneFIX(登録商標)は、手術設定における出血の制御および予防を含む血友病(先天的第IX因子欠乏症またはクリスマス病)を有する患者における出血症状の制御および予防のために示される。すべての第IX因子産物についての治療の薬用量および期間は、第IX因子欠乏症の重症度、出血の位置および程度、ならびに患者の臨床的容態、齢、および第IX因子の回復による。XTENのFIXへの融合は、該タンパク質の半減期を改良し、したがって低下した投薬頻度を可能にする。
分子ふるいクロマトグラフィー分析を、増大する長さの種々の治療用タンパク質および構造化されていない組換えタンパク質を含む融合タンパク質に関して実施した。例示的なアッセイは、1mg/mLの濃度で40μgの精製済みグルカゴン融合タンパク質を20mMリン酸pH6.8、114mM NaClにおいて0.6mL/分の流速で分離するTSKGel‐G4000 SWXL(7.8mm×30cm)カラムを用いた。クロマトグラム特性を、OD214nmおよびOD280nmを用いてモニターした。すべてのアッセイのためのカラム較正を、BioRad製の分子ふるい構成標準物質を用いて実施し、マーカーには、チログロブリン(670kDa)、ウシガンマグロブリン(158kDa)、ニワトリ卵白アルブミン(44kDa)、ウマミオグロビン(17kDa)、およびビタミンB12(1.35kDa)を含む。グルカゴン‐Y288、グルカゴン‐Y144、グルカゴン‐Y72、グルカゴン‐Y36の代表的なクロマトグラフィー特性を、図35における重ね合わせとして示す。本データは、各化合物の見かけの分子量が、付着したXTEN配列の長さに比例することを示す。しかしながら、本データは、各コンストラクトの見かけの分子量が、(同じアッセイにおいて分析される標準物質との比較によって示されるように)球状タンパク質について期待されるものよりも有意に大きいことも示す。CFXTEN組成物を含む評価されるすべてのコンストラクトについてのSEC分析に基づいて、見かけの分子量、(算出された分子量に対する見かけの分子量の比として表される)見かけの分子量因子、および水力学的半径(nmにおけるRH)を表31に示す。本結果は、576以上のアミノ酸の異なるXTEの組み込みが、およそ339kDa〜760の融合タンパク質についての見かけの分子量を与え、かつ864以上のアミノ酸のXTENがおよそ800kDAよりも大きな見かけの分子量を与えることを示す。実際の分子量に対する見かけの分子量における比例的増大に関する結果は、いくつかの異なるモチーフファミリー由来のXTENを用いて作製された融合タンパク質と一致し、すなわち、AD、AE、AF、AG、およびAMは、少なくとも4倍の増加および約17倍高い比を有する。加えて、576以上のアミノ酸(およびY288に融合したグルカゴンの場合288残基)を有するXTEN融合パートナーの、種々の負荷量を有する融合タンパク質への組み込みは結果的に、およそ3〜5nmの糸球体の孔サイズを十分に超えている7nm以上の水力学的半径とともに生じた。したがって、増殖およびXTENを含む融合タンパク質は、延長した終末半減期の一因となり、相応の融合していない生物学的負荷量のタンパク質に対する治療効果または生物学的効果を改良する、腎クリアランスを低下させたことが期待される。
GFP−L288、GFP−L576、GFP−XTEN_AF576、GFP−XTEN_Y576、およびXTEN_AD836−GFPの薬物動態をカニクイザルにおいて試験し、PKパラメータに及ぼす構造化されていないポリペプチドの組成および長さの効果を決定した。血液試料を注射後の種々の時点で分析し、血漿中のGFP濃度を、捕捉のためのGFPに対するポリクローナル抗体を用いたELISAによって、検出のための同じポリクローナル抗体のビオチン化調製物を用いたELISAによって測定した。結果を図25に要約する。本結果は、XTEN配列の長さを増大させると半減期の驚くべき延長を示す。例えば、10時間の半減期が、(XTENにおいて288アミノ酸残基を有する)GFP−XTEN_L288について決定された。576のアミノ酸まで構造化されていないポリペプチド融合パートナーの長さを二倍にすると、複数の融合タンパク質コンストラクト、すなわちGFP−XTEN_L576、GFP−XTEN_AF576、GFP−XTEN_Y576について20〜22時間まで半減期を延長した。836の残基まで構造化されていないポリペプチド融合パートナーの長さをさらに伸長すると、XTEN_AD836−GFPについて72〜75時間の半減期を結果的に生じた。したがって、288残基から576残基までポリマー長を伸長すると、インビボでの半減期が約10時間延長した。しかしながら、ポリペプチドの長さを576残基から836残基まで260残基ほど伸長すると、インビボでの半減期の比例的であることを超える延長を結果的に生じた。したがって、伸長した構造化されていないポリペプチドを含む融合タンパク質は、より短い長さのポリペプチドと比較して亢進した薬物動態の特性を有すると期待される。
GFPのN末端に融合したXTEN_AE864を含む融合タンパク質を、サル血漿およびラット腎臓可溶化液において37℃で最大7日間インキュベートした。試料を時点0、1日後、および7日後に抜き取り、SDS PAGE後にウェスタン分析を用いた検出およびGFPに対する抗体を用いた検出によって、図26に示す通り分析した。XTEN_AE864の配列は、血漿において8日間を超える無視できる分解の兆候を示した。しかしながら、XTEN_AE864は、ラット腎臓可溶化液において3日間にわたって迅速に分解した。融合タンパク質のインビボでの安定性を血漿試料において試験し、この場合、GFP_AE864を、先に説明した通り、免疫沈降させ、SDS PAGEによって分析した。注射後最大7日間抜き取られた試料は、分解の非常にわずかな兆候を示した。本結果は、CFXTEN融合タンパク質の薬物動態特性の亢進における一因子である、血清プロテアーゼによる分解に対するCFXTENの耐性を示す。
溶解度および安定性の物理的/化学的特性を亢進するXTENの能力を評価するために、グルカゴンとより短い長さのXTENとの融合タンパク質を調製および評価した。試験品を中性pHにおけるトリス緩衝塩類溶液において調製し、Gcg−XTEN溶液の特徴づけを逆相HPLCおよび分子ふるいクロマトグラフィーによって実施し、該タンパク質が溶液中で均質かつ非凝集性であることを確認した。本データを表32に呈する。比較目的のために、同じ緩衝液中で修飾されていないグルカゴンの溶解度限界を60μM(0.2mg/mL)で測定し、本結果は、添加したXTENのすべての長さについて、溶解度における実質的な増大が達成されたことを示す。重要なことに、ほとんどの場合、グルカゴン−XTEN融合タンパク質を調製して、標的濃度を達成し、所与のコンストラクトについての最大溶解度限界を決定するために評価されなかった。しかしながら、AF−144XTENに連結されたグルカゴンの場合、溶解度限界を決定し、結果は、XTENに連結されていないグルカゴンと比較して、溶解度における60倍の亢進が達成された。加えて、グルカゴン−AF144 CFXTENを安定性について評価し、冷蔵条件の下で少なくとも6ヶ月間、および37℃でおよそ1ヶ月間、液体製剤において安定であることが認められた(データ非表示)。
アミノ酸配列は、周知のChou‐Fasmanアルゴリズム(Chou, P. Y., et al. (1974) Biochemistry, 13: 222−45)およびGarnier‐Osguthorpe‐Robson、または「GOR」法(Garnier J, Gibrat JF, Robson B. (1996). GOR method for predicting protein secondary structure from amino acid sequence. Methods Enzymol 266:540−553)など、あるコンピュータプログラムまたはアルゴリズムを介して二次構造について評価されることができる。所与の配列について、アルゴリズムは、いくつかの二次構造が存在するかまたはまったく存在しないかを推定することができ、例えば、アルファ−ヘリックスまたはベータ−シートまたは、ランダムコイル形成を結果として生じるよう推定された配列の残基の百分率を形成する配列の合計および/または百分率として表されることができる。
実施例43:反復性についてのポリペプチド配列の分析
ポリペプチドアミノ酸配列を、全体的なポリペプチド内により短いサブシーケンスが現れる回数を定量することによって、反復性について評価することができる。例えば、200アミノ酸残基のポリペプチドは、192の重複する9アミノ酸サブシーケンス(または9マー「フレーム」を有するが、独特な9マーサブシーケンスの数は、配列内の反復性の量に依存する。本分析において、200アミノ酸配列内の独特な3マーサブシーケンスの絶対数によって除されたポリマー部分の最初の200アミノ酸にわたる各3アミノ酸フレームについての独特な3マーサブシーケンスすべての発生を合計することによって、異なる配列を反復性について評価した。結果として生じるサブシーケンススコアは、ポリペプチド内の反復性の程度の反映である。
を有する。
Sturniolo[Sturniolo, T., et al. (1999) Nat Biotechnol, 17: 555]によって説明されるように、ポケットポテンシャル(pocket potential)を加算することによって、9マーペプチド配列のTEPITOPEスコアを算出することができる。本実施例において、個別のTepitopeスコアを個々のHLA対立遺伝子について算出した。表35は、HLA×0101Bについてのポケットポテンシャルを一例として示し、これは、コーカサス人の集団において高い頻度で生じる。配列P1−P2−P3−P4−P5−P6−P7−P8−P9を有するペプチドのTEPITOPEスコアを算出するために、表35における相応の個々のポケットポテンシャルを加算した。配列FDKLPRTSGを有する9マーのペプチドのHLA*0101Bスコアは、0、−1.3、0、0.9、0、−1.8、0.09、0、0の合計である。
** 必ずしもすべての配列がXTENを組み込んでいるわけではない。
(項目1)
伸長した組換えポリペプチド(XTEN)を含む単離された第VII因子ポリペプチドであって、該XTENが少なくとも200のアミノ酸残基を含み、この場合、該第VII因子ポリペプチドは、対象に投与される場合に約12時間よりも長い終末半減期を呈する、該第VII因子ポリペプチド。
前記第VII因子ポリペプチドが、最適に整列した場合に、表2から選択される配列と比較して少なくとも90%の配列同一性を呈する、項目1に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
前記第VII因子が、そのC末端で前記XTENに連結する、項目1または2に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
第XIa因子、第XIIa因子、カリクレイン、第VIIa因子、第IXa因子、第Xa因子、第IIa因子(トロンビン)、エラスターゼ‐2、MMP‐12、MMP13、MMP‐17、およびMMP‐20からなる群から選択される哺乳類プロテアーゼによって開裂可能な開裂配列を介して前記XTENに連結される、項目1〜3のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
前記哺乳類プロテアーゼによる前記開裂配列における開裂が、前記第VII因子ポリペプチドから前記XTENを放出する、項目4に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
前記XTENが前記第VII因子に含まれる任意の2つの隣接したドメイン間に組み込まれ、この場合、該2つの隣接したドメインは、Gla、EGF1、EGF2、活性化型ペプチド(AP)、およびペプチダーゼS1(Pro)からなる群から選択される、項目1〜5のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
前記XTENが以下を特徴とする、項目1〜6のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド:
(a)XTENアミノ酸残基の累積合計が、200超〜約3000アミノ酸残基であり:
(b)アスパラギン残基およびグルタミン残基の合計が、該XTENの全アミノ酸配列の10%未満であり;
(c)メチオニン残基およびトリプトファン残基の合計が、該XTENの全アミノ酸配列の2%未満であり;
(d)該XTEN配列が、10未満のサブシーケンススコアを有し;
(e)該XTEN配列が、GORアルゴリズムによって決定される時、90%超のランダムコイル形成を有し;かつ
(f)該XTEN配列が、Chou‐Fasmanアルゴリズムによって決定される時、2%未満のアルファヘリックスおよび2%のベータ‐シートを有する。
少なくとも約4の見かけの分子量因子を呈する、項目1〜7のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
前記XTENが、表4、表9、表10、表11、表12、または表13から選択されるアミノ酸配列の比較可能な長さと少なくとも90%の配列同一性を呈する、項目1〜8のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
式VIIに従って構成された、項目1〜9のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド:
(Gla)−(XTEN)u−(EGF1)−(XTEN)v−(EGF2)−(AP1)−(XTEN)w−(AP2)−(XTEN)x−(Pro)−(S)y−(XTEN)z VII。
(a)Glaが、第VII因子のGlaドメインであり;
(b)EGF1が、第VII因子のEGF1ドメインであり;
(c)EGF2が、第VII因子のEGF2ドメインであり;
(d)AP1が、第VII因子の活性化因子ペプチドドメインの一部であり;
(e)AP2が、少なくとも第一の開裂配列を含む第IX因子の活性化ペプチドドメインの一部であり;
(f)PROが、第VII因子のプロテアーゼドメインであり;
(g)Sが、開裂配列を任意に含むことのできる1〜約50のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり;
(h)XTENが、表4、表9、表10、表11、表12、または表13から選択されるアミノ酸配列の比較可能な長さと少なくとも90%の配列同一性を呈する伸長した組換えポリペプチドであり、
(i)uが、0または1のいずれかであり;
(j)vが、0または1のいずれかであり;
(k)xが、0または1のいずれかであり;
(l)yが、0または1のいずれかであり;かつ
(m)zが、0または1のいずれかであり、ただし、u+v+x+y+z≧1という条件付きである。
2つ以上のXTENを含む、項目1〜10のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
異種性配列の開裂の際に活性化される、野生型第VII因子を活性化しない凝固前駆体プロテアーゼによって開裂可能な少なくとも1つの異種性配列を含む、単離された第VII因子ポリペプチド。
組織因子の不在下で活性化可能な、項目12に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
前記異種性配列が、活性化型第XI因子によって開裂可能である、項目12または13に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
少なくとも2つの異種性配列を含み、該異種性配列の各々が同じかまたは異なる凝固前駆体プロテアーゼによって開裂可能である、項目12〜14のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
伸長した組換えポリペプチド(XTEN)を含む、項目12〜15のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
前記少なくとも1つの異種性配列の開裂の際に、前記XTENも開裂される、項目12〜16のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
前記異種性配列が、配列KLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVと少なくとも90%の配列同一性を呈する、項目12〜17のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
前記異種性配列が、最適に整列した場合にTSKLTRAETVFPおよびFNDFTRVから選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を呈する、項目12〜18のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
前記第VII因子ポリペプチドが、ポリエチレングリコール(PEG)、アルブミン、抗体、および抗体断片からなる群から選択される成分を含まない、項目12〜19のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
少なくとも約4の見かけの分子量因子を呈する、項目12〜10のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
治療有効量の項目1〜21のいずれか一項に記載の第VII因子を含む組成物を対象に投与することを含む、該対象における凝固障害を治療する方法。
前記凝固障害が、血友病Aまたは血友病Bである、項目22に記載の方法。
前記治療有効量の第VII因子は、外来的に投与された第VIII因子および/または第IX因子が、比較可能な治療効果を生じる必要性を回避するのに十分である、項目22または23に記載の方法。
治療有効量の項目1〜21のいずれか一項に記載の第VII因子を含む組成物を対象に投与することを含む、該対象における出血症状を治療する方法。
治療有効量の項目1〜21のいずれか一項に記載の第VII因子を含む組成物を凝固タンパク質の欠乏した対象に投与することを含む、該対象を治療する方法。
前記凝固タンパク質が、野生型の第VII因子、第IX因子、または第XI因子に置き換わる、項目26に記載の方法。
Claims (29)
- 伸長した組換えポリペプチド(XTEN)を含む単離された第VII因子ポリペプチドであって、該XTENが少なくとも36のアミノ酸残基を含み、この場合、該第VII因子ポリペプチドは、対象に投与される場合に約12時間よりも長い終末半減期を呈する、該第VII因子ポリペプチド。
- 前記第VII因子ポリペプチドが、最適に整列した場合に、表1から選択される配列と比較して少なくとも90%の配列同一性を呈する、請求項1に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
- 前記第VII因子が、そのC末端で前記XTENに連結される、請求項1または2に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
- 第XIa因子、第XIIa因子、カリクレイン、第VIIa因子、第IXa因子、第Xa因子、第IIa因子(トロンビン)、エラスターゼ‐2、MMP‐12、MMP13、MMP‐17、およびMMP‐20からなる群から選択される哺乳類プロテアーゼによって開裂可能な開裂配列を介して前記XTENに連結される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
- 前記哺乳類プロテアーゼによる前記開裂配列における開裂が、前記第VII因子ポリペプチドから前記XTENを放出する、請求項4に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
- 前記XTENが、前記第VII因子において含まれる任意の2つの隣接したドメイン間に組み込まれ、この場合、該2つの隣接したドメインが、Gla、EGF1、EGF2、活性化型ペプチド(AP)、およびペプチダーゼS1(Pro)からなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
- 前記XTENが以下を特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド:
(a)XTENアミノ酸残基の累積合計が、200超〜約3000アミノ酸残基であり:
(b)アスパラギン残基およびグルタミン残基の合計が、該XTENの全アミノ酸配列の10%未満であり;
(c)メチオニン残基およびトリプトファン残基の合計が、該XTENの全アミノ酸配列の2%未満であり;
(d)該XTEN配列が、10未満のサブシーケンススコアを有し;
(e)該XTEN配列が、GORアルゴリズムによって決定される時、90%超のランダムコイル形成を有し;かつ
(f)該XTEN配列が、Chou‐Fasmanアルゴリズムによって決定される時、2%未満のアルファヘリックスおよび2%のベータ‐シートを有する。 - 少なくとも約4の見かけの分子量因子を呈する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
- 前記XTENが、表4、表9、表10、表11、表12、または表13から選択されるアミノ酸配列の比較可能な長さと少なくとも90%の配列同一性を呈する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
- 式VIIに従って構成された、請求項1〜9のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド:
(Gla)−(XTEN)u−(EGF1)−(XTEN)v−(EGF2)−(AP1)−(XTEN)w−(AP2)−(XTEN)x−(Pro)−(S)y−(XTEN)z VII
この場合、各発生について独立して、
(a)Glaが、第VII因子のGlaドメインであり;
(b)EGF1が、第VII因子のEGF1ドメインであり;
(c)EGF2が、第VII因子のEGF2ドメインであり;
(d)AP1が、第VII因子の活性化因子ペプチドドメインの一部であり;
(e)AP2が、少なくとも第一の開裂配列を含む第IX因子の活性化因子ペプチドドメインの一部であり;
(f)PROが、第VII因子のプロテアーゼドメインであり;
(g)Sが、開裂配列を任意に含むことのできる1〜約50のアミノ酸残基を有するスペーサー配列であり;
(h)XTENが、表4、表9、表10、表11、表12、または表13から選択されるアミノ酸配列の比較可能な長さと少なくとも90%の配列同一性を呈する伸長した組換えポリペプチドであり、
(i)uが、0または1のいずれかであり;
(j)vが、0または1のいずれかであり;
(k)xが、0または1のいずれかであり;
(l)yが、0または1のいずれかであり;かつ
(m)zが、0または1のいずれかであり、ただし、u+v+x+y+z≧1という条件付きである。 - 2つ以上のXTENを含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
- 異種性配列の開裂の際に活性化される、野生型第VII因子を活性化しない凝固前駆体プロテアーゼによって開裂可能な少なくとも1つの異種性配列を含む、単離された第VII因子ポリペプチド。
- 組織因子の不在下で活性化可能な、請求項12に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
- 前記異種性配列が、活性化型第XI因子によって開裂可能である、請求項12または13に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
- 少なくとも2つの異種性配列を含み、該異種性配列の各々が同じかまたは異なる凝固前駆体プロテアーゼによって開裂可能である、請求項12〜14のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
- 伸長した組換えポリペプチド(XTEN)を含む、請求項12〜15のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
- 前記少なくとも1つの異種性配列の開裂の際に、前記XTENも開裂される、請求項12〜16のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
- 前記異種性配列が、配列KLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVと少なくとも90%の配列同一性を呈する、請求項12〜17のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
- 前記異種性配列が、最適に整列した場合にTSKLTRAETVFPおよびFNDFTRVから選択される配列と少なくとも90%の配列同一性を呈する、請求項12〜18のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
- 前記第VII因子ポリペプチドが、ポリエチレングリコール(PEG)、アルブミン、抗体、および抗体断片からなる群から選択される成分を含まない、請求項12〜19のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
- 少なくとも約4の見かけの分子量因子を呈する、請求項12〜10のいずれか一項に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
- 治療有効量の請求項1〜21のいずれか一項に記載の第VII因子を含む組成物を対象に投与することを含む、該対象における凝固障害を治療する方法。
- 前記凝固障害が、血友病Aまたは血友病Bである、請求項22に記載の方法。
- 前記治療有効量の第VII因子は、外来的に投与された第VIII因子および/または第IX因子が、比較可能な治療効果を生じる必要性を回避するのに十分である、請求項22または23に記載の方法。
- 治療有効量の請求項1〜21のいずれか一項に記載の第VII因子を含む組成物を対象に投与することを含む、該対象における出血症状を治療する方法。
- 治療有効量の請求項1〜21のいずれか一項に記載の第VII因子を含む組成物を、凝固タンパク質の欠乏した対象に投与することを含む、該対象を治療する方法。
- 前記凝固タンパク質が、野生型の第VII因子、第IX因子、または第XI因子に置き換わる、請求項26に記載の方法。
- 前記XTENが、少なくとも100のアミノ酸残基を含む、請求項1に記載の単離された第VII因子ポリペプチド。
- XTENが以下を特徴とする、伸長した組換えポリペプチド(XTEN)を含む単離された第VII因子ポリペプチド:
(a)該XTENが、少なくとも36のアミノ酸残基を含み;
(b)前記URPにおいて含まれるグリシン(G)、アスパラギン酸(D)、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、グルタミン酸(E)、およびプロリン(P)の残基の合計が、該XTENの全アミノ酸の少なくとも80%を構成し;
(c)(i)該XTENの配列が、3つの連続したアミノ酸がセリンでない限り、同一である該アミノ酸を含まないように、または(ii)該XTEN配列の少なくとも約80%が、非重複配列モチーフからなり、該配列モチーフの各々が約9〜約14のアミノ酸残基を含み、この場合、任意の2つの連続したアミノ酸残基が、該配列モチーフの各々の2倍以下しか生じないように、該XTEN配列が実質的に非反復性であり;
(d)該XTEN配列が、TEPITOPEアルゴリズムによって分析される場合、推定T細胞エピトープを欠失し、この場合、該XTEN配列内のエピトープについての該TEPITOPEアルゴリズム推定が、−9のスコアに基づいており;
(e)該XTEN配列が、GORアルゴリズムによって決定される時、90%超のランダムコイル形成を有し;かつ
(f)該XTEN配列が、Chou‐Fasmanアルゴリズムによって決定される時、2%未満のアルファヘリックスおよび2%のベータ‐シートを有する。
Applications Claiming Priority (11)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US23649309P | 2009-08-24 | 2009-08-24 | |
US61/236,493 | 2009-08-24 | ||
US23683609P | 2009-08-25 | 2009-08-25 | |
US61/236,836 | 2009-08-25 | ||
US28095609P | 2009-11-10 | 2009-11-10 | |
US28095509P | 2009-11-10 | 2009-11-10 | |
US61/280,955 | 2009-11-10 | ||
US61/280,956 | 2009-11-10 | ||
US12/699,761 US8673860B2 (en) | 2009-02-03 | 2010-02-03 | Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same |
US12/699,761 | 2010-02-03 | ||
PCT/US2010/002147 WO2011028228A1 (en) | 2009-08-24 | 2010-08-02 | Coagulation factor vii compositions and methods of making and using same |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014236458A Division JP2015042679A (ja) | 2009-08-24 | 2014-11-21 | 凝固第vii因子組成物ならびにそれを製造および使用する方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013502458A true JP2013502458A (ja) | 2013-01-24 |
JP2013502458A5 JP2013502458A5 (ja) | 2013-05-30 |
Family
ID=43605834
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012526709A Active JP5813641B2 (ja) | 2009-08-24 | 2010-08-02 | 凝固第ix因子組成物ならびにそれを製造および使用する方法 |
JP2012526708A Pending JP2013502458A (ja) | 2009-08-24 | 2010-08-02 | 凝固第vii因子組成物ならびにそれを製造および使用する方法 |
JP2014236458A Pending JP2015042679A (ja) | 2009-08-24 | 2014-11-21 | 凝固第vii因子組成物ならびにそれを製造および使用する方法 |
JP2014246138A Pending JP2015052015A (ja) | 2009-08-24 | 2014-12-04 | 凝固第ix因子組成物ならびにそれを製造および使用する方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012526709A Active JP5813641B2 (ja) | 2009-08-24 | 2010-08-02 | 凝固第ix因子組成物ならびにそれを製造および使用する方法 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014236458A Pending JP2015042679A (ja) | 2009-08-24 | 2014-11-21 | 凝固第vii因子組成物ならびにそれを製造および使用する方法 |
JP2014246138A Pending JP2015052015A (ja) | 2009-08-24 | 2014-12-04 | 凝固第ix因子組成物ならびにそれを製造および使用する方法 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (10) | US8716448B2 (ja) |
EP (3) | EP2470670A4 (ja) |
JP (4) | JP5813641B2 (ja) |
CN (2) | CN102741275B (ja) |
AU (2) | AU2010290077C1 (ja) |
BR (2) | BR112012004094A2 (ja) |
CA (2) | CA2772051C (ja) |
WO (2) | WO2011028229A1 (ja) |
Families Citing this family (72)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7855279B2 (en) | 2005-09-27 | 2010-12-21 | Amunix Operating, Inc. | Unstructured recombinant polymers and uses thereof |
EP3178835B1 (en) * | 2009-02-03 | 2019-04-10 | Amunix Pharmaceuticals, Inc. | Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same |
US8703717B2 (en) | 2009-02-03 | 2014-04-22 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same |
US9849188B2 (en) | 2009-06-08 | 2017-12-26 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same |
JP5839597B2 (ja) | 2009-06-08 | 2016-01-06 | アムニクス オペレーティング インコーポレイテッド | グルコース調節ポリペプチド並びにその作成及び使用方法 |
EP2470670A4 (en) | 2009-08-24 | 2013-07-10 | Amunix Operating Inc | COAGULATION FACTOR VII COMPOSITIONS AND METHODS OF PREPARATION AND USE THEREOF |
WO2011123830A2 (en) | 2010-04-02 | 2011-10-06 | Amunix Operating Inc. | Alpha 1-antitrypsin compositions and methods of making and using same |
PT2717898T (pt) | 2011-06-10 | 2019-05-20 | Bioverativ Therapeutics Inc | Compostos pró-coagulantes e processos para a sua utilização |
EA028914B1 (ru) * | 2011-07-25 | 2018-01-31 | Байоджен Хемофилия Инк. | Исследования для мониторинга нарушений свертываемости крови |
CN103945861B (zh) * | 2011-09-12 | 2018-06-05 | 阿穆尼克斯运营公司 | 胰高血糖素样肽-2组合物及其制备和使用方法 |
EP2804623B1 (en) | 2012-01-12 | 2019-08-07 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Chimeric factor viii polypeptides and uses thereof |
EP2822577B1 (en) | 2012-02-15 | 2019-02-06 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Recombinant factor viii proteins |
HUE046848T2 (hu) | 2012-02-15 | 2020-03-30 | Bioverativ Therapeutics Inc | VIII. faktor készítmények és eljárások elõállításukra és alkalmazásukra |
CA3179537A1 (en) | 2012-02-27 | 2013-09-06 | Amunix Pharmaceuticals, Inc. | Xten conjugate compositions and methods of making same |
WO2013162078A1 (ja) * | 2012-04-27 | 2013-10-31 | 学校法人日本大学 | 上皮及び内皮損傷の治療剤 |
CN104519897A (zh) | 2012-06-08 | 2015-04-15 | 比奥根艾迪克Ma公司 | 促凝血化合物 |
US10202595B2 (en) | 2012-06-08 | 2019-02-12 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Chimeric clotting factors |
SG10201701037WA (en) | 2012-07-11 | 2017-03-30 | Amunix Operating Inc | Factor viii complex with xten and von willebrand factor protein, and uses thereof |
CN102876695A (zh) * | 2012-09-12 | 2013-01-16 | 天津工业生物技术研究所 | 一种含有Z-Tag蛋白融合标签的快速克隆及表达质粒载体 |
WO2014100913A1 (en) * | 2012-12-24 | 2014-07-03 | Beijing Anxinhuaide Biotech. Co., Ltd | Improving the half life of a therapeutic polypeptide by fusing with a trimeric scaffold protein via a spacer |
RS64664B1 (sr) | 2013-02-15 | 2023-11-30 | Bioverativ Therapeutics Inc | Gen optimizovanog faktora viii |
TWI745671B (zh) | 2013-03-15 | 2021-11-11 | 美商百歐維拉提夫治療公司 | 因子ix多肽調配物 |
SG11201509313PA (en) * | 2013-06-28 | 2016-01-28 | Biogen Ma Inc | Thrombin cleavable linker with xten and its uses thereof |
US10947269B2 (en) | 2013-08-08 | 2021-03-16 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Purification of chimeric FVIII molecules |
EP4108254A1 (en) | 2013-08-14 | 2022-12-28 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Recombinant factor viii proteins |
US10548953B2 (en) | 2013-08-14 | 2020-02-04 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof |
EP3048899B1 (en) * | 2013-09-25 | 2021-09-08 | Bioverativ Therapeutics Inc. | On-column viral inactivation methods |
US10584147B2 (en) | 2013-11-08 | 2020-03-10 | Biovertiv Therapeutics Inc. | Procoagulant fusion compound |
HUE059820T2 (hu) | 2014-01-10 | 2022-12-28 | Bioverativ Therapeutics Inc | VIII-as faktor kimérafehérjéi és azok alkalmazása |
KR20230136616A (ko) | 2014-02-04 | 2023-09-26 | 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 | 번역 후 변형을 강화시키기 위한 통류 방식 양이온교환 크로마토그래피의 용도 |
US11181534B2 (en) * | 2014-04-04 | 2021-11-23 | Bloodworks | Routine laboratory and point-of-care (POC) testing for hemostasis |
CN105294857B (zh) * | 2014-06-18 | 2019-02-19 | 上海交通大学 | 基于fix的抗原表位及其应用 |
US11008561B2 (en) | 2014-06-30 | 2021-05-18 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Optimized factor IX gene |
WO2016028872A2 (en) * | 2014-08-19 | 2016-02-25 | The Children's Hospital Of Philadelphia | Compositions and methods for modulating factor ix function |
US9616114B1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-11 | David Gordon Bermudes | Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity |
TN2017000109A1 (en) | 2014-09-26 | 2018-07-04 | Bayer Pharma AG | Stabilized adrenomedullin derivatives and use thereof |
KR102122463B1 (ko) | 2014-10-14 | 2020-06-15 | 할로자임, 아이엔씨 | 아데노신 디아미네이즈-2(ada2)의 조성물, 이의 변이체 및 이를 사용하는 방법 |
MA40835A (fr) | 2014-10-23 | 2017-08-29 | Biogen Ma Inc | Anticorps anti-gpiib/iiia et leurs utilisations |
MA40861A (fr) | 2014-10-31 | 2017-09-05 | Biogen Ma Inc | Anticorps anti-glycoprotéines iib/iiia |
MA40864A (fr) | 2014-10-31 | 2017-09-05 | Biogen Ma Inc | Hypotaurine, gaba, bêta-alanine et choline pour la régulation de l'accumulation de sous-produits résiduaires dans des procédés de culture de cellules mammifères |
JP6909203B2 (ja) * | 2015-08-03 | 2021-07-28 | バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド | 第ix因子融合タンパク質及びそれらの製造方法及び使用方法 |
CN108135968A (zh) | 2015-08-28 | 2018-06-08 | 阿穆尼克斯运营公司 | 嵌合多肽组装体及其制备和使用方法 |
CN105524147B (zh) * | 2015-10-15 | 2020-06-09 | 中国药科大学 | 重组聚多肽及其应用 |
CA3007364A1 (en) * | 2015-12-03 | 2017-06-08 | Baxalta Incorporated | Factor viii with extended half-life and reduced ligand-binding properties |
JP6844890B2 (ja) * | 2016-01-07 | 2021-03-17 | 藤森工業株式会社 | 採血管、試薬及びそれらを利用した血液性状分析方法 |
JP7217630B2 (ja) | 2016-02-01 | 2023-02-03 | バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド | 最適化第viii因子遺伝子 |
US10738338B2 (en) | 2016-10-18 | 2020-08-11 | The Research Foundation for the State University | Method and composition for biocatalytic protein-oligonucleotide conjugation and protein-oligonucleotide conjugate |
JP2020500874A (ja) | 2016-12-02 | 2020-01-16 | バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド | キメラ凝固因子を使用して血友病性関節症を処置する方法 |
MX2019006446A (es) | 2016-12-02 | 2019-12-11 | Bioverativ Therapeutics Inc | Métodos para inducir tolerancia inmunológica a factores de coagulación. |
US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
US20200031895A1 (en) | 2016-12-16 | 2020-01-30 | Biogen Ma Inc. | Stabilized proteolytically activated growth differentiation factor 11 |
CA3051862A1 (en) | 2017-01-31 | 2018-08-09 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor ix fusion proteins and methods of making and using same |
KR20180118550A (ko) | 2017-04-21 | 2018-10-31 | 주식회사유한양행 | 이중 작용 단백질 및 그의 유도체의 제조방법 |
WO2019032898A1 (en) | 2017-08-09 | 2019-02-14 | Bioverativ Therapeutics Inc. | NUCLEIC ACID MOLECULES AND USES THEREOF |
AU2018341227A1 (en) * | 2017-09-27 | 2020-04-09 | Ohio State Innovation Foundation | Tissue factor-targeting CAR-NK and CAR-T cell therapy |
EP3746136A1 (en) | 2018-02-01 | 2020-12-09 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Use of lentiviral vectors expressing factor viii |
EP3774861A1 (en) | 2018-03-28 | 2021-02-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Interleukin-2/interleukin-2 receptor alpha fusion proteins and methods of use |
WO2019222682A1 (en) | 2018-05-18 | 2019-11-21 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Methods of treating hemophilia a |
BR112020026512A2 (pt) | 2018-07-03 | 2021-04-06 | Bristol-Myers Squibb Company | Formulações de fgf-21 |
CN113227385A (zh) | 2018-08-09 | 2021-08-06 | 比奥维拉迪维治疗股份有限公司 | 核酸分子及其用于非病毒基因疗法的用途 |
BR112021008105A2 (pt) | 2018-10-29 | 2021-08-03 | Biogen Ma Inc. | variantes de fc5 humanizadas e estabilizadas para intensificação de transporte através de barreira hematoencefálica |
US20200199626A1 (en) | 2018-12-06 | 2020-06-25 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Use of lentiviral vectors expressing factor ix |
US20220323519A1 (en) | 2019-04-17 | 2022-10-13 | Codiak Biosciences, Inc. | Compositions of exosomes and aav |
CA3143584A1 (en) | 2019-06-18 | 2020-12-24 | Bayer Aktiengesellschaft | Adrenomedullin-analogues for long-term stabilization and their use |
CA3152600A1 (en) | 2019-09-30 | 2021-04-08 | Andrew KROETSCH | Lentiviral vector formulations |
US20230287040A1 (en) | 2019-11-13 | 2023-09-14 | Amunix Pharmaceuticals, Inc. | Barcoded xten polypeptides and compositions thereof, and methods for making and using the same |
CN116033927A (zh) | 2020-06-24 | 2023-04-28 | 比奥维拉迪维治疗股份有限公司 | 从经修饰以表达因子viii的慢病毒载体的制剂中去除游离因子viii的方法 |
AR126846A1 (es) | 2021-08-23 | 2023-11-22 | Bioverativ Therapeutics Inc | Genes del factor viii optimizados |
AU2022334711A1 (en) | 2021-08-23 | 2024-04-04 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Baculovirus expression system |
TW202346327A (zh) | 2021-09-30 | 2023-12-01 | 美商百歐維拉提夫治療公司 | 編碼具有降低免疫原性的因子viii多肽之核酸 |
EP4342460A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-27 | NovoArc GmbH | Lipid nanoparticle with nucleic acid cargo |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007103515A2 (en) * | 2006-03-06 | 2007-09-13 | Amunix, Inc. | Unstructured recombinant polymers and uses thereof |
JP2009525724A (ja) * | 2006-02-06 | 2009-07-16 | ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー | 半減期が延長された改変凝固第VIIa因子 |
Family Cites Families (352)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
US3992518A (en) | 1974-10-24 | 1976-11-16 | G. D. Searle & Co. | Method for making a microsealed delivery device |
GB1478759A (en) | 1974-11-18 | 1977-07-06 | Alza Corp | Process for forming outlet passageways in pills using a laser |
US4284444A (en) | 1977-08-01 | 1981-08-18 | Herculite Protective Fabrics Corporation | Activated polymer materials and process for making same |
US4200098A (en) | 1978-10-23 | 1980-04-29 | Alza Corporation | Osmotic system with distribution zone for dispensing beneficial agent |
US4200984A (en) | 1979-03-12 | 1980-05-06 | Fink Ray D | Detachable tool combining bracket and method |
US4342832A (en) | 1979-07-05 | 1982-08-03 | Genentech, Inc. | Method of constructing a replicable cloning vehicle having quasi-synthetic genes |
US4215051A (en) | 1979-08-29 | 1980-07-29 | Standard Oil Company (Indiana) | Formation, purification and recovery of phthalic anhydride |
ZA811368B (en) | 1980-03-24 | 1982-04-28 | Genentech Inc | Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator |
US4398908A (en) | 1980-11-28 | 1983-08-16 | Siposs George G | Insulin delivery system |
US4456591A (en) | 1981-06-25 | 1984-06-26 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Therapeutic method for activating factor VII |
US4435173A (en) | 1982-03-05 | 1984-03-06 | Delta Medical Industries | Variable rate syringe pump for insulin delivery |
US4542025A (en) | 1982-07-29 | 1985-09-17 | The Stolle Research And Development Corporation | Injectable, long-acting microparticle formulation for the delivery of anti-inflammatory agents |
US4599311A (en) | 1982-08-13 | 1986-07-08 | Kawasaki Glenn H | Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor |
US4713339A (en) | 1983-01-19 | 1987-12-15 | Genentech, Inc. | Polycistronic expression vector construction |
US4870008A (en) | 1983-08-12 | 1989-09-26 | Chiron Corporation | Secretory expression in eukaryotes |
US4757006A (en) | 1983-10-28 | 1988-07-12 | Genetics Institute, Inc. | Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production |
US7138505B1 (en) | 1984-01-12 | 2006-11-21 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Factor VIII:C nucleic acid molecules |
US5004804A (en) | 1984-01-12 | 1991-04-02 | Nordisk Gentofte | Method and composition for preparation of factor VIIIC |
EP0154316B1 (en) | 1984-03-06 | 1989-09-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified lymphokine and production thereof |
US5231112A (en) | 1984-04-12 | 1993-07-27 | The Liposome Company, Inc. | Compositions containing tris salt of cholesterol hemisuccinate and antifungal |
US5916588A (en) | 1984-04-12 | 1999-06-29 | The Liposome Company, Inc. | Peptide-containing liposomes, immunogenic liposomes and methods of preparation and use |
US4965199A (en) | 1984-04-20 | 1990-10-23 | Genentech, Inc. | Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection |
US4931373A (en) | 1984-05-25 | 1990-06-05 | Zymogenetics, Inc. | Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin |
WO1986000814A1 (en) | 1984-07-24 | 1986-02-13 | Key Pharmaceuticals, Inc. | Adhesive transdermal dosage layer |
US4766073A (en) | 1985-02-25 | 1988-08-23 | Zymogenetics Inc. | Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells |
US4885249A (en) | 1984-12-05 | 1989-12-05 | Allelix, Inc. | Aspergillus niger transformation system |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4965188A (en) | 1986-08-22 | 1990-10-23 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US5981216A (en) | 1985-04-01 | 1999-11-09 | Alusuisse Holdings A.G. | Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same |
DE3683980D1 (de) | 1985-04-12 | 1992-04-02 | Genetics Inst | Neue prokoagulierungsproteine. |
GR860984B (en) | 1985-04-17 | 1986-08-18 | Zymogenetics Inc | Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells |
EP0218713B1 (en) | 1985-04-22 | 1992-03-25 | Genetics Institute, Inc. | High yield production of active factor ix |
US4684479A (en) | 1985-08-14 | 1987-08-04 | Arrigo Joseph S D | Surfactant mixtures, stable gas-in-liquid emulsions, and methods for the production of such emulsions from said mixtures |
KR910006424B1 (ko) | 1985-08-21 | 1991-08-24 | 인코텍스 비.브이 | 편성브리프(brief) 제조방법 |
US4882279A (en) | 1985-10-25 | 1989-11-21 | Phillips Petroleum Company | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
US5198349A (en) | 1986-01-03 | 1993-03-30 | Genetics Institute, Inc. | Method for producing factor VIII:C and analogs |
US5250421A (en) | 1986-01-03 | 1993-10-05 | Genetics Institute, Inc. | Method for producing factor VIII:C-type proteins |
WO1987004187A1 (en) | 1986-01-03 | 1987-07-16 | Genetics Institute, Inc. | METHOD FOR PRODUCING FACTOR VIII:c-TYPE PROTEINS |
US4935349A (en) | 1986-01-17 | 1990-06-19 | Zymogenetics, Inc. | Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus |
US5595886A (en) | 1986-01-27 | 1997-01-21 | Chiron Corporation | Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof |
US4800159A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
DK122686D0 (da) | 1986-03-17 | 1986-03-17 | Novo Industri As | Fremstilling af proteiner |
GB8610600D0 (en) | 1986-04-30 | 1986-06-04 | Novo Industri As | Transformation of trichoderma |
US6759057B1 (en) | 1986-06-12 | 2004-07-06 | The Liposome Company, Inc. | Methods and compositions using liposome-encapsulated non-steroidal anti-inflammatory drugs |
US5610278A (en) | 1986-06-24 | 1997-03-11 | Novo Nordisk A/S | Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments |
IE60901B1 (en) | 1986-08-21 | 1994-08-24 | Vestar Inc | Improved treatment of systemic fungal infections with phospholipid particles encapsulating polyene antifungal antibiotics |
US4933185A (en) | 1986-09-24 | 1990-06-12 | Massachusetts Institute Of Technology | System for controlled release of biologically active compounds |
US6024983A (en) | 1986-10-24 | 2000-02-15 | Southern Research Institute | Composition for delivering bioactive agents for immune response and its preparation |
US4912040A (en) | 1986-11-14 | 1990-03-27 | Genetics Institute, Inc. | Eucaryotic expression system |
US6406713B1 (en) | 1987-03-05 | 2002-06-18 | The Liposome Company, Inc. | Methods of preparing low-toxicity drug-lipid complexes |
US4775207A (en) | 1987-03-17 | 1988-10-04 | Bell Communications Research, Inc. | Electro-optical switch |
DE3883899T3 (de) | 1987-03-18 | 1999-04-22 | Sb2 Inc | Geänderte antikörper. |
CA1331157C (en) | 1987-04-06 | 1994-08-02 | Randal J. Kaufman | Method for producing factor viii:c-type proteins |
US6060447A (en) | 1987-05-19 | 2000-05-09 | Chiron Corporation | Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof |
US6346513B1 (en) | 1987-06-12 | 2002-02-12 | Baxter Trading Gmbh | Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
IE69026B1 (en) | 1987-06-12 | 1996-08-07 | Immuno Ag | Novel proteins with factor VIII activity process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them |
DE3720246A1 (de) | 1987-06-19 | 1988-12-29 | Behringwerke Ag | Faktor viii:c-aehnliches molekuel mit koagulationsaktivitaet |
US4897268A (en) | 1987-08-03 | 1990-01-30 | Southern Research Institute | Drug delivery system and method of making the same |
US4976696A (en) | 1987-08-10 | 1990-12-11 | Becton, Dickinson And Company | Syringe pump and the like for delivering medication |
FR2619314B1 (fr) | 1987-08-11 | 1990-06-15 | Transgene Sa | Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant |
US4861800A (en) | 1987-08-18 | 1989-08-29 | Buyske Donald A | Method for administering the drug deprenyl so as to minimize the danger of side effects |
US4994371A (en) | 1987-08-28 | 1991-02-19 | Davie Earl W | DNA preparation of Christmas factor and use of DNA sequences |
AU598958B2 (en) | 1987-11-12 | 1990-07-05 | Vestar, Inc. | Improved amphotericin b liposome preparation |
US5270176A (en) | 1987-11-20 | 1993-12-14 | Hoechst Aktiengesellschaft | Method for the selective cleavage of fusion proteins with lysostaphin |
GB8807504D0 (en) | 1988-03-29 | 1988-05-05 | Sandoz Ltd | Improvements in/relating to organic compounds |
US5037743A (en) | 1988-08-05 | 1991-08-06 | Zymogenetics, Inc. | BAR1 secretion signal |
JP2717808B2 (ja) | 1988-08-10 | 1998-02-25 | テルモ株式会社 | シリンジポンプ |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
US5534617A (en) | 1988-10-28 | 1996-07-09 | Genentech, Inc. | Human growth hormone variants having greater affinity for human growth hormone receptor at site 1 |
US6780613B1 (en) | 1988-10-28 | 2004-08-24 | Genentech, Inc. | Growth hormone variants |
US5004803A (en) | 1988-11-14 | 1991-04-02 | Genetics Institute, Inc. | Production of procoagulant proteins |
CA2006596C (en) | 1988-12-22 | 2000-09-05 | Rika Ishikawa | Chemically-modified g-csf |
EP0461200B1 (en) | 1989-02-21 | 1997-01-22 | Washington University | Modified forms of reproductive hormones |
US5017378A (en) | 1989-05-01 | 1991-05-21 | The University Of Virginia Alumni Patents Foundation | Intraorgan injection of biologically active compounds contained in slow-release microcapsules or microspheres |
EP0471036B2 (en) | 1989-05-04 | 2004-06-23 | Southern Research Institute | Encapsulation process |
US5599907A (en) * | 1989-05-10 | 1997-02-04 | Somatogen, Inc. | Production and use of multimeric hemoglobins |
US5298022A (en) | 1989-05-29 | 1994-03-29 | Amplifon Spa | Wearable artificial pancreas |
FR2647677B1 (fr) | 1989-05-31 | 1991-09-27 | Roussel Uclaf | Nouvelles micro-proteines, procede de preparation et application a titre de medicaments de ces nouvelles micro-proteines |
US7413537B2 (en) | 1989-09-01 | 2008-08-19 | Dyax Corp. | Directed evolution of disulfide-bonded micro-proteins |
SE465222C5 (sv) | 1989-12-15 | 1998-02-10 | Pharmacia & Upjohn Ab | Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning |
US5492534A (en) | 1990-04-02 | 1996-02-20 | Pharmetrix Corporation | Controlled release portable pump |
US5318540A (en) | 1990-04-02 | 1994-06-07 | Pharmetrix Corporation | Controlled release infusion device |
US6552170B1 (en) | 1990-04-06 | 2003-04-22 | Amgen Inc. | PEGylation reagents and compounds formed therewith |
US5176502A (en) | 1990-04-25 | 1993-01-05 | Becton, Dickinson And Company | Syringe pump and the like for delivering medication |
US6517859B1 (en) | 1990-05-16 | 2003-02-11 | Southern Research Institute | Microcapsules for administration of neuroactive agents |
US5215680A (en) | 1990-07-10 | 1993-06-01 | Cavitation-Control Technology, Inc. | Method for the production of medical-grade lipid-coated microbubbles, paramagnetic labeling of such microbubbles and therapeutic uses of microbubbles |
US5583107A (en) | 1990-09-04 | 1996-12-10 | Cor Therapeutics, Inc. | Agents affecting thrombosis and hemostasis |
EP0561971A1 (en) | 1990-12-13 | 1993-09-29 | PHARMACIA & UPJOHN COMPANY | Fusion polypeptides |
US5206161A (en) | 1991-02-01 | 1993-04-27 | Genentech, Inc. | Human plasma carboxypeptidase B |
US20060122376A1 (en) | 1991-02-07 | 2006-06-08 | Chiron Corporation | Protein complexes having factor VIII:C activity and production thereof |
US5833982A (en) | 1991-02-28 | 1998-11-10 | Zymogenetics, Inc. | Modified factor VII |
ES2199935T3 (es) | 1991-03-15 | 2004-03-01 | Amgen Inc. | Pegilacion de polipeptidos. |
US5846951A (en) | 1991-06-06 | 1998-12-08 | The School Of Pharmacy, University Of London | Pharmaceutical compositions |
IE922437A1 (en) | 1991-07-25 | 1993-01-27 | Idec Pharma Corp | Recombinant antibodies for human therapy |
US6376463B1 (en) | 1992-04-07 | 2002-04-23 | Emory University | Modified factor VIII |
US5859204A (en) | 1992-04-07 | 1999-01-12 | Emory University | Modified factor VIII |
US5364771A (en) | 1992-04-07 | 1994-11-15 | Emory University | Hybrid human/porcine factor VIII |
HU220194B (hu) | 1992-10-02 | 2001-11-28 | Genetics Institute Inc. | Koagulációs faktor VIII-at tartalmazó készítmény és eljárás előállítására |
US5563045A (en) | 1992-11-13 | 1996-10-08 | Genetics Institute, Inc. | Chimeric procoagulant proteins |
US5573776A (en) | 1992-12-02 | 1996-11-12 | Alza Corporation | Oral osmotic device with hydrogel driving member |
US5981719A (en) | 1993-03-09 | 1999-11-09 | Epic Therapeutics, Inc. | Macromolecular microparticles and methods of production and use |
JPH08507806A (ja) | 1993-03-09 | 1996-08-20 | ミドルセツクス・サイエンシーズ・インコーポレーテツド | 高分子の微粒子および調製法 |
US5554730A (en) | 1993-03-09 | 1996-09-10 | Middlesex Sciences, Inc. | Method and kit for making a polysaccharide-protein conjugate |
US6090925A (en) | 1993-03-09 | 2000-07-18 | Epic Therapeutics, Inc. | Macromolecular microparticles and methods of production and use |
SE504074C2 (sv) | 1993-07-05 | 1996-11-04 | Pharmacia Ab | Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering |
US5576291A (en) | 1993-09-13 | 1996-11-19 | Baxter International Inc. | Activated factor VIII as a therapeutic agent and method of treating factor VIII deficiency |
US5643575A (en) | 1993-10-27 | 1997-07-01 | Enzon, Inc. | Non-antigenic branched polymer conjugates |
US20020042079A1 (en) | 1994-02-01 | 2002-04-11 | Sanford M. Simon | Methods and agents for measuring and controlling multidrug resistance |
US5660848A (en) | 1994-11-02 | 1997-08-26 | The Population Council, Center For Biomedical Research | Subdermally implantable device |
GB9422383D0 (en) | 1994-11-05 | 1995-01-04 | Wellcome Found | Antibodies |
SE503424C2 (sv) | 1994-11-14 | 1996-06-10 | Pharmacia Ab | Process för rening av rekombinant koagulationsfaktor VIII |
US6818439B1 (en) | 1994-12-30 | 2004-11-16 | Chiron Corporation | Methods for administration of recombinant gene delivery vehicles for treatment of hemophilia and other disorders |
US6086875A (en) | 1995-01-17 | 2000-07-11 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of immunogens |
US6030613A (en) | 1995-01-17 | 2000-02-29 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
US6485726B1 (en) | 1995-01-17 | 2002-11-26 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
US5739277A (en) | 1995-04-14 | 1998-04-14 | Genentech Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
US6121022A (en) | 1995-04-14 | 2000-09-19 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
US5869046A (en) | 1995-04-14 | 1999-02-09 | Genentech, Inc. | Altered polypeptides with increased half-life |
US6096871A (en) | 1995-04-14 | 2000-08-01 | Genentech, Inc. | Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life |
US7846455B2 (en) | 1996-07-15 | 2010-12-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Attenuated chimeric respiratory syncytial virus |
SE9503380D0 (sv) | 1995-09-29 | 1995-09-29 | Pharmacia Ab | Protein derivatives |
GB9526733D0 (en) | 1995-12-30 | 1996-02-28 | Delta Biotechnology Ltd | Fusion proteins |
US6441025B2 (en) * | 1996-03-12 | 2002-08-27 | Pg-Txl Company, L.P. | Water soluble paclitaxel derivatives |
EA002400B1 (ru) | 1996-03-12 | 2002-04-25 | Пи Джи-Ти Экс Эл Компани, Л.П. | Водорастворимые пролекарства противоракового действия |
US8183344B2 (en) | 1996-04-24 | 2012-05-22 | University Of Michigan | Inactivation resistant factor VIII |
US6458563B1 (en) | 1996-06-26 | 2002-10-01 | Emory University | Modified factor VIII |
US7560107B2 (en) | 1996-06-26 | 2009-07-14 | Emory University | Modified factor VIII |
EP0918872B1 (en) | 1996-08-02 | 2008-02-20 | Bristol-Myers Squibb Company | A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis |
JP2001501173A (ja) | 1996-08-23 | 2001-01-30 | アルザ コーポレイション | シスプラチン化合物を含有するリポソーム |
US6056973A (en) | 1996-10-11 | 2000-05-02 | Sequus Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutic liposome composition and method of preparation |
EP0932390A1 (en) | 1996-10-11 | 1999-08-04 | Sequus Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutic liposome composition and method |
HUP0000522A3 (en) | 1996-10-15 | 2000-10-30 | Transave Inc Monmouth Junction | N-acyl phoshpatidylethanolamine-mediated liposomal drug delivery |
ATE314054T1 (de) | 1996-10-25 | 2006-01-15 | Shire Lab Inc | Osmotisches verabreichungssystem für lösliche dosen |
US6361796B1 (en) | 1996-10-25 | 2002-03-26 | Shire Laboratories, Inc. | Soluble form osmotic dose delivery system |
AU5065198A (en) | 1996-11-15 | 1998-06-10 | Maria Grazia Masucci | Fusion proteins having increased half-lives |
EP0842657A1 (en) | 1996-11-19 | 1998-05-20 | OctoPlus B.V. | Microspheres for controlled release and processes to prepare these microspheres |
US6395302B1 (en) | 1996-11-19 | 2002-05-28 | Octoplus B.V. | Method for the preparation of microspheres which contain colloidal systems |
WO1998023289A1 (en) | 1996-11-27 | 1998-06-04 | The General Hospital Corporation | MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn |
US6294170B1 (en) | 1997-08-08 | 2001-09-25 | Amgen Inc. | Composition and method for treating inflammatory diseases |
AT405516B (de) * | 1997-02-27 | 1999-09-27 | Immuno Ag | Faktor x-analoge mit modifizierter proteasespaltstelle |
US6277375B1 (en) | 1997-03-03 | 2001-08-21 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Immunoglobulin-like domains with increased half-lives |
CA2225189C (en) | 1997-03-06 | 2010-05-25 | Queen's University At Kingston | Canine factor viii gene, protein and methods of use |
ATE319745T1 (de) | 1997-05-21 | 2006-03-15 | Biovation Ltd | Verfahren zur herstellung von nicht-immunogenen proteinen |
US7786070B2 (en) * | 1997-09-10 | 2010-08-31 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Subcutaneous administration of coagulation factor VII |
US6310183B1 (en) | 1997-09-10 | 2001-10-30 | Novo Nordisk A/S | Coagulation factor VIIa composition |
DE19747261A1 (de) | 1997-10-25 | 1999-04-29 | Bayer Ag | Osmotisches Arzneimittelfreisetzungssystem |
GB9722131D0 (en) | 1997-10-20 | 1997-12-17 | Medical Res Council | Method |
US6309370B1 (en) | 1998-02-05 | 2001-10-30 | Biosense, Inc. | Intracardiac drug delivery |
US20050260605A1 (en) | 1998-02-11 | 2005-11-24 | Maxygen, Inc. | Targeting of genetic vaccine vectors |
CA2320958A1 (en) | 1998-02-11 | 1999-08-19 | Maxygen, Inc. | Antigen library immunization |
DE69937291T2 (de) | 1998-04-02 | 2008-07-10 | Genentech, Inc., South San Francisco | Antikörpervarianten und fragmente davon |
US6528624B1 (en) | 1998-04-02 | 2003-03-04 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
US6242195B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-06-05 | Genentech, Inc. | Methods for determining binding of an analyte to a receptor |
US6194551B1 (en) | 1998-04-02 | 2001-02-27 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants |
US6406632B1 (en) | 1998-04-03 | 2002-06-18 | Symyx Technologies, Inc. | Rapid characterization of polymers |
GB9809951D0 (en) | 1998-05-08 | 1998-07-08 | Univ Cambridge Tech | Binding molecules |
US7090976B2 (en) | 1999-11-10 | 2006-08-15 | Rigel Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions comprising Renilla GFP |
GB9815157D0 (en) | 1998-07-13 | 1998-09-09 | Metron Designs Ltd | High resolution pulse width setting from relatively low frequency clocks |
AU770555B2 (en) | 1998-08-17 | 2004-02-26 | Abgenix, Inc. | Generation of modified molecules with increased serum half-lives |
US20030190740A1 (en) | 1998-10-13 | 2003-10-09 | The University Of Georgia Research Foundation, Inc | Stabilized bioactive peptides and methods of identification, synthesis, and use |
PT1129186E (pt) | 1998-11-10 | 2007-12-07 | Sanquin Bloedvoorziening | Um polipéptido factor viii com actividade de factor viii-c |
EP1006183A1 (en) | 1998-12-03 | 2000-06-07 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Recombinant soluble Fc receptors |
US6329186B1 (en) | 1998-12-07 | 2001-12-11 | Novozymes A/S | Glucoamylases with N-terminal extensions |
US6358703B1 (en) | 1998-12-10 | 2002-03-19 | Bayer Corporation | Expression system for factor VIII |
US6713086B2 (en) | 1998-12-18 | 2004-03-30 | Abbott Laboratories | Controlled release formulation of divalproex sodium |
EP2386574A3 (en) | 1999-01-15 | 2012-06-27 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
US6737056B1 (en) | 1999-01-15 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
DE60045216D1 (de) | 1999-03-03 | 2010-12-23 | Optinose As | Nasales Verabreichungsgerät |
US6183770B1 (en) | 1999-04-15 | 2001-02-06 | Acutek International | Carrier patch for the delivery of agents to the skin |
US7666400B2 (en) | 2005-04-06 | 2010-02-23 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | PEGylation by the dock and lock (DNL) technique |
US6743211B1 (en) | 1999-11-23 | 2004-06-01 | Georgia Tech Research Corporation | Devices and methods for enhanced microneedle penetration of biological barriers |
US7829085B2 (en) | 1999-07-14 | 2010-11-09 | Life Sciences Research Partners Vzw | Methods of treating hemostasis disorders using antibodies binding the C1 domain of factor VIII |
ATE279437T1 (de) | 1999-08-06 | 2004-10-15 | Genentech Inc | Peptidantagonisten des faktors viia |
US6458387B1 (en) | 1999-10-18 | 2002-10-01 | Epic Therapeutics, Inc. | Sustained release microspheres |
US20030109428A1 (en) | 1999-12-01 | 2003-06-12 | John Bertin | Novel molecules of the card-related protein family and uses thereof |
US20050287153A1 (en) | 2002-06-28 | 2005-12-29 | Genentech, Inc. | Serum albumin binding peptides for tumor targeting |
US6352721B1 (en) | 2000-01-14 | 2002-03-05 | Osmotica Corp. | Combined diffusion/osmotic pumping drug delivery system |
HUP0204475A2 (en) | 2000-02-11 | 2003-04-28 | Merck Patent Gmbh | Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins |
JP2003521930A (ja) * | 2000-02-11 | 2003-07-22 | マキシゲン・エイピーエス | 第VII因子または第VIIa因子様分子 |
JP2003530839A (ja) * | 2000-04-12 | 2003-10-21 | プリンシピア ファーマスーティカル コーポレイション | アルブミン融合タンパク質 |
US6905683B2 (en) | 2000-05-03 | 2005-06-14 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Human coagulation factor VII variants |
EP1335931B1 (en) | 2000-05-16 | 2005-12-21 | Lipoxen Technologies Limited | Derivatisation of proteins in aqueous solution |
KR100867392B1 (ko) | 2000-08-15 | 2008-11-06 | 더 보드 오브 트러스티즈 오브 더 유니버시티 오브 일리노이 | 마이크로입자 |
KR100882482B1 (ko) | 2000-09-13 | 2009-02-06 | 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 | 사람 응고 인자 vii 변이체 |
CN1205221C (zh) | 2000-09-19 | 2005-06-08 | 埃默里大学 | 修饰的凝血因子ⅷ |
DE10053224A1 (de) | 2000-10-26 | 2002-05-08 | Univ Goettingen Georg August | Verfahren zur Exposition von Peptiden und Polypeptiden auf der Zelloberfläche von Bakterien |
US20030228309A1 (en) | 2000-11-08 | 2003-12-11 | Theodora Salcedo | Antibodies that immunospecifically bind to TRAIL receptors |
WO2002040544A2 (en) | 2000-11-14 | 2002-05-23 | Board Of Regents, University Of Texas Systems | Mutant human factor ix with an increased resistance to inhibition by heparin |
GB0029407D0 (en) | 2000-12-01 | 2001-01-17 | Affitech As | Product |
EP2357187A1 (en) | 2000-12-12 | 2011-08-17 | MedImmune, LLC | Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof |
US20030049689A1 (en) * | 2000-12-14 | 2003-03-13 | Cynthia Edwards | Multifunctional polypeptides |
US20030104591A1 (en) | 2000-12-14 | 2003-06-05 | Murray Christopher J. | Methods and compositions for grafting functional loops into a protein |
EP1354042A2 (en) * | 2000-12-29 | 2003-10-22 | Curagen Corporation | Proteins and nucleic acids encoding same |
IN190699B (ja) | 2001-02-02 | 2003-08-16 | Sun Pharmaceutical Ind Ltd | |
AU2002229510A1 (en) * | 2001-02-05 | 2002-08-19 | Novo Nordisk Health Care Ag | Combined use of factor vii polypeptides and factor viii polypeptides |
US6888319B2 (en) | 2001-03-01 | 2005-05-03 | Palomar Medical Technologies, Inc. | Flashlamp drive circuit |
JP4336771B2 (ja) | 2001-03-09 | 2009-09-30 | モルフォシス アーゲー | 血清アルブミン結合部分 |
US20020169125A1 (en) | 2001-03-21 | 2002-11-14 | Cell Therapeutics, Inc. | Recombinant production of polyanionic polymers and uses thereof |
US6992174B2 (en) | 2001-03-30 | 2006-01-31 | Emd Lexigen Research Center Corp. | Reducing the immunogenicity of fusion proteins |
US20040106794A1 (en) | 2001-04-16 | 2004-06-03 | Schering Corporation | 3,4-Di-substituted cyclobutene-1,2-diones as CXC-chemokine receptor ligands |
US20050048512A1 (en) | 2001-04-26 | 2005-03-03 | Avidia Research Institute | Combinatorial libraries of monomer domains |
EP1397160A1 (en) | 2001-04-30 | 2004-03-17 | Shire Laboratories Inc. | Pharmaceutical composition including ace/nep inhibitors and bioavailability enhancers |
US6838093B2 (en) | 2001-06-01 | 2005-01-04 | Shire Laboratories, Inc. | System for osmotic delivery of pharmaceutically active agents |
EP1397496A2 (en) | 2001-06-15 | 2004-03-17 | Andre Schuh | Gene therapy for hemophilia a |
KR100407467B1 (ko) | 2001-07-12 | 2003-11-28 | 최수봉 | 리모컨 방식의 인슐린 자동주사기 |
WO2003011213A2 (en) * | 2001-07-30 | 2003-02-13 | Eli Lilly And Company | Method for treating diabetes and obesity |
US7125843B2 (en) * | 2001-10-19 | 2006-10-24 | Neose Technologies, Inc. | Glycoconjugates including more than one peptide |
PT2279755E (pt) | 2001-10-10 | 2014-06-04 | Ratiopharm Gmbh | Remodelação e glicoconjugação do factor de crescimento de fibroblastos (fgf) |
US6960657B2 (en) | 2001-11-02 | 2005-11-01 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Human coagulation factor VII polypeptides |
JP2005511049A (ja) | 2001-12-07 | 2005-04-28 | トゥールゲン・インコーポレイテッド | キメラタンパク質の表現型スクリーニング |
US20080167238A1 (en) | 2001-12-21 | 2008-07-10 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin Fusion Proteins |
US20080194481A1 (en) | 2001-12-21 | 2008-08-14 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin Fusion Proteins |
KR101271635B1 (ko) | 2001-12-21 | 2013-06-12 | 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 | 알부민 융합 단백질 |
EP2261250B1 (en) | 2001-12-21 | 2015-07-01 | Human Genome Sciences, Inc. | GCSF-Albumin fusion proteins |
US20040002587A1 (en) | 2002-02-20 | 2004-01-01 | Watkins Jeffry D. | Fc region variants |
US20040132101A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-07-08 | Xencor | Optimized Fc variants and methods for their generation |
US7317091B2 (en) | 2002-03-01 | 2008-01-08 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
AU2003209446B2 (en) | 2002-03-01 | 2008-09-25 | Immunomedics, Inc. | Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance |
WO2003077834A2 (en) | 2002-03-15 | 2003-09-25 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Central airway administration for systemic delivery of therapeutics |
AU2003221469A1 (en) | 2002-04-30 | 2003-11-17 | Bayer Healthcare Llc | FACTOR VII OR VIIa POLYPEPTIDE VARIANTS |
US6945952B2 (en) | 2002-06-25 | 2005-09-20 | Theraject, Inc. | Solid solution perforator for drug delivery and other applications |
US7294513B2 (en) | 2002-07-24 | 2007-11-13 | Wyatt Technology Corporation | Method and apparatus for characterizing solutions of small particles |
US7425620B2 (en) | 2002-08-14 | 2008-09-16 | Scott Koenig | FcγRIIB-specific antibodies and methods of use thereof |
US7198867B2 (en) | 2002-09-17 | 2007-04-03 | Diffusion Science, Inc. | Electrochemical generation, storage and reaction of hydrogen and oxygen |
US6911323B2 (en) | 2002-09-25 | 2005-06-28 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Human coagulation factor VII polypeptides |
DK1553975T3 (da) | 2002-09-27 | 2012-05-07 | Xencor Inc | Optimerede Fc-varianter og fremgangsmåder til generering heraf. |
PT1562972E (pt) | 2002-10-15 | 2010-11-10 | Facet Biotech Corp | Alteração de afinidades de ligação ao fcrn ou semi-vidas séricas de anticorpos por mutagénese |
GB2395337B (en) | 2002-11-14 | 2005-12-28 | Gary Michael Wilson | Warning Unit |
EP2368578A1 (en) | 2003-01-09 | 2011-09-28 | Macrogenics, Inc. | Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same |
US7041635B2 (en) | 2003-01-28 | 2006-05-09 | In2Gen Co., Ltd. | Factor VIII polypeptide |
CN102139114A (zh) | 2003-02-26 | 2011-08-03 | 尼克塔治疗公司 | 聚合物-因子viii部分缀合物 |
US7632895B2 (en) | 2003-02-28 | 2009-12-15 | Kuraray Co., Ltd. | Curable resin composition |
US20090010920A1 (en) | 2003-03-03 | 2009-01-08 | Xencor, Inc. | Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb |
US8388955B2 (en) | 2003-03-03 | 2013-03-05 | Xencor, Inc. | Fc variants |
US20050176108A1 (en) * | 2003-03-13 | 2005-08-11 | Young-Min Kim | Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life |
TWI353991B (en) | 2003-05-06 | 2011-12-11 | Syntonix Pharmaceuticals Inc | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
US7132398B2 (en) | 2003-05-06 | 2006-11-07 | Dendreon Corporation | Method of treatment of hemorrhagic disease using a factor VIIa/tissue factor inhibitor |
US7348004B2 (en) | 2003-05-06 | 2008-03-25 | Syntonix Pharmaceuticals, Inc. | Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids |
US20070161087A1 (en) * | 2003-05-29 | 2007-07-12 | Wolfgang Glaesner | Glp-1 fusion proteins |
WO2005017149A1 (en) | 2003-06-03 | 2005-02-24 | Cell Genesys, Inc. | Compositions and methods for enhanced expression of recombinant polypeptides from a single vector using a peptide cleavage site |
EP1654290B1 (en) | 2003-08-12 | 2019-03-13 | Lipoxen Technologies Limited | Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation |
EP1706079B1 (en) | 2003-08-14 | 2013-02-20 | ThromboGenics N.V. | Antibodies against factor viii with modified glycosylation in the variable region |
US20050152979A1 (en) | 2003-09-05 | 2005-07-14 | Cell Therapeutics, Inc. | Hydrophobic drug compositions containing reconstitution enhancer |
EP2392655A3 (en) | 2003-09-09 | 2012-02-29 | Novo Nordisk Health Care AG | Coagulation factor VII polypeptides |
SI2932981T1 (sl) * | 2003-09-19 | 2021-11-30 | Novo Nordisk A/S | Albumin-vezavni derivati GLP-1 |
GB0324368D0 (en) | 2003-10-17 | 2003-11-19 | Univ Cambridge Tech | Polypeptides including modified constant regions |
EP1682106A4 (en) * | 2003-10-30 | 2008-06-11 | Univ Emory | MODIFIED FVIII FACTOR WITH REDUCED IMMUNOGENICITY THROUGH MUTAGENESIS OF A2 AND C2 EPITOPES |
US7211559B2 (en) | 2003-10-31 | 2007-05-01 | University Of Maryland, Baltimore | Factor VIII compositions and methods |
CA2545603A1 (en) | 2003-11-12 | 2005-05-26 | Biogen Idec Ma Inc. | Neonatal fc receptor (fcrn)-binding polypeptide variants, dimeric fc binding proteins and methods related thereto |
WO2005051289A2 (en) | 2003-11-18 | 2005-06-09 | Iconic Therapeutics, Inc. | Homogeneous preparations of chimeric proteins |
US20060040856A1 (en) * | 2003-12-03 | 2006-02-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor IX |
US20050249723A1 (en) | 2003-12-22 | 2005-11-10 | Xencor, Inc. | Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites |
BRPI0506771A (pt) | 2004-01-12 | 2007-05-22 | Applied Molecular Evolution | anticorpo, e, composição farmacêutica |
WO2005069845A2 (en) | 2004-01-14 | 2005-08-04 | Ohio University | Methods of producing peptides/proteins in plants and peptides/proteins produced thereby |
SI1729795T1 (sl) * | 2004-02-09 | 2016-04-29 | Human Genome Sciences, Inc. | Albuminski fuzijski proteini |
US8076288B2 (en) | 2004-02-11 | 2011-12-13 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | Hybrid polypeptides having glucose lowering activity |
AU2005227326B2 (en) | 2004-03-24 | 2009-12-03 | Xencor, Inc. | Immunoglobulin variants outside the Fc region |
WO2005123780A2 (en) | 2004-04-09 | 2005-12-29 | Protein Design Labs, Inc. | Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis |
US20080233100A1 (en) | 2004-06-30 | 2008-09-25 | Yiyou Chen | Targeted enzymes |
WO2006085967A2 (en) | 2004-07-09 | 2006-08-17 | Xencor, Inc. | OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS |
EP3342782B1 (en) | 2004-07-15 | 2022-08-17 | Xencor, Inc. | Optimized fc variants |
US7566701B2 (en) | 2004-09-07 | 2009-07-28 | Archemix Corp. | Aptamers to von Willebrand Factor and their use as thrombotic disease therapeutics |
WO2006036834A2 (en) * | 2004-09-24 | 2006-04-06 | Amgen Inc. | MODIFIED Fc MOLECULES |
WO2006047350A2 (en) | 2004-10-21 | 2006-05-04 | Xencor, Inc. | IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION |
EP1824988B1 (en) | 2004-11-12 | 2017-04-19 | Bayer HealthCare LLC | Site-directed modification of fviii |
KR20070092754A (ko) | 2004-12-27 | 2007-09-13 | 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 | 중합체 - 폰 빌레브란트 인자 - 접합체 |
RU2007132188A (ru) | 2005-01-25 | 2009-03-10 | Селл Терапьютикс, Инк. (Us) | Конъюгаты биологически активных белков, имеющие модифицированное время полужизни in vivo |
US8263545B2 (en) * | 2005-02-11 | 2012-09-11 | Amylin Pharmaceuticals, Inc. | GIP analog and hybrid polypeptides with selectable properties |
JP2008534559A (ja) | 2005-04-01 | 2008-08-28 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト | 血液凝固fviii類似体 |
US20110124565A1 (en) | 2005-04-14 | 2011-05-26 | Hans-Peter Hauser | Modified Coagulation Factor VIII With Enhanced Stability and Its Derivatives |
WO2007021494A2 (en) | 2005-08-12 | 2007-02-22 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
JP2009508510A (ja) | 2005-09-21 | 2009-03-05 | ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー | ヒト凝固第vii因子ポリペプチド |
US7846445B2 (en) * | 2005-09-27 | 2010-12-07 | Amunix Operating, Inc. | Methods for production of unstructured recombinant polymers and uses thereof |
US20090099031A1 (en) * | 2005-09-27 | 2009-04-16 | Stemmer Willem P | Genetic package and uses thereof |
US7855279B2 (en) * | 2005-09-27 | 2010-12-21 | Amunix Operating, Inc. | Unstructured recombinant polymers and uses thereof |
JP2009509535A (ja) | 2005-09-27 | 2009-03-12 | アムニクス, インコーポレイテッド | タンパク様薬剤およびその使用 |
EP1971355B1 (en) | 2005-12-20 | 2020-03-11 | Duke University | Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties |
US20130172274A1 (en) | 2005-12-20 | 2013-07-04 | Duke University | Methods and compositions for delivering active agents with enhanced pharmacological properties |
US8048848B2 (en) | 2006-02-03 | 2011-11-01 | Prolor Biotech Ltd. | Long-acting interferons and derivatives thereof and methods thereof |
FR2897868B1 (fr) | 2006-02-24 | 2012-08-31 | Lab Francais Du Fractionnement | Anticorps anti-idiotypiques neutralisant l'activite inhibitrice d'un anticorps inhibiteur dirige contre le domaine c1 du facteur viii. |
CN101406105B (zh) | 2006-03-13 | 2010-11-10 | 皇家飞利浦电子股份有限公司 | 用于固态照明系统的自适应控制装置和方法 |
EP2010222A1 (en) | 2006-03-31 | 2009-01-07 | Baxter International Inc. | Pegylated factor viii |
US7645860B2 (en) * | 2006-03-31 | 2010-01-12 | Baxter Healthcare S.A. | Factor VIII polymer conjugates |
WO2007130535A2 (en) | 2006-05-04 | 2007-11-15 | Molecular Innovations | Novel protein fusion/tag technology |
PL3896090T3 (pl) | 2006-06-14 | 2022-05-02 | Csl Behring Gmbh | Rozszczepialne proteolitycznie białko fuzyjne zawierające czynnik krzepnięcia krwi |
EP1867660A1 (en) | 2006-06-14 | 2007-12-19 | CSL Behring GmbH | Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor |
US7939632B2 (en) * | 2006-06-14 | 2011-05-10 | Csl Behring Gmbh | Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity |
US7812121B2 (en) | 2006-08-31 | 2010-10-12 | Baker Audrey E | GLP-2 mimetibodies, polypeptides, compositions, methods and uses |
US20100254944A1 (en) | 2006-09-14 | 2010-10-07 | Mani Subramanian | Albumin Fusion Proteins |
US7985783B2 (en) | 2006-09-21 | 2011-07-26 | The Regents Of The University Of California | Aldehyde tags, uses thereof in site-specific protein modification |
WO2008049711A1 (en) | 2006-10-27 | 2008-05-02 | Novo Nordisk A/S | Peptide extended insulins |
CN101190945A (zh) * | 2006-11-29 | 2008-06-04 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 特异性抗凝血物质的制备及其应用 |
EP1935430A1 (en) | 2006-12-22 | 2008-06-25 | CSL Behring GmbH | Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life |
EP2097096B1 (en) | 2006-12-22 | 2017-05-31 | CSL Behring GmbH | Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life |
NZ577728A (en) | 2006-12-27 | 2012-01-12 | Baxter Int | Von willebrand factor- and factor viii-polymer conjugates having a releasable linkage |
EP2099475B1 (en) | 2007-01-03 | 2016-08-24 | Novo Nordisk Health Care AG | Subcutaneous administration of coagulation factor viia-related polypeptides |
US7700734B2 (en) | 2007-01-09 | 2010-04-20 | Shu-Wha Lin | Recombinant human factor IX and use thereof |
EP2108045B1 (en) | 2007-02-01 | 2013-12-11 | Baxter International Inc. | Improved fix-mutant proteins for hemophilia b treatment |
WO2008134665A1 (en) | 2007-04-26 | 2008-11-06 | Inspiration Biopharmaceuticals, Inc. | Recombinant vitamin k dependent proteins with high sialic acid content and methods of preparing same |
DK2369005T3 (da) | 2007-06-21 | 2013-06-24 | Univ Muenchen Tech | Biologisk aktive proteiner med forøget stabilitet in vivo og/eller in vitro |
BRPI0815416A2 (pt) | 2007-08-15 | 2014-10-21 | Amunix Inc | Composições e métodos para modificar propriedades de polipeptídeos biologicamente ativos |
WO2009058446A1 (en) | 2007-11-01 | 2009-05-07 | University Of Rochester | Recombinant factor viii having increased stability |
US8173597B2 (en) | 2007-11-09 | 2012-05-08 | Baxter International Inc. | Modified recombinant factor VIII and von Willebrand factor and methods of use |
ES2887187T3 (es) | 2007-12-28 | 2021-12-22 | Takeda Pharmaceuticals Co | Formulaciones de VWF recombinante |
JP5444629B2 (ja) | 2008-04-03 | 2014-03-19 | 富士通株式会社 | 照度センサ用光案内機構及び携帯電話機 |
TWI573806B (zh) | 2008-04-17 | 2017-03-11 | 巴克斯歐塔公司 | 生物活性胜肽 |
KR20110017420A (ko) | 2008-06-04 | 2011-02-21 | 바이엘 헬스케어 엘엘씨 | 폰 빌레브란트 질환의 치료를 위한 fviii 뮤테인 |
US8575104B2 (en) | 2008-06-24 | 2013-11-05 | Csl Behring Gmbh | Factor VIII, von willebrand factor or complexes thereof with prolonged in vivo half-life |
EP2352515A4 (en) | 2008-11-03 | 2012-04-25 | Bayer Healthcare Llc | METHOD FOR TREATING HEMOPHILIA |
EP2368124A4 (en) | 2008-11-24 | 2012-09-19 | Bayer Healthcare Llc | METHOD FOR DETERMINING THE ACTIVITY OF A PEGYLATED BLOOD GENERATION FACTOR IN A SILICON-BASED ACTIVATED PART THROMBOPLASTINE TIME ASSAY |
EP3178835B1 (en) | 2009-02-03 | 2019-04-10 | Amunix Pharmaceuticals, Inc. | Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same |
US8680050B2 (en) | 2009-02-03 | 2014-03-25 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same |
US8703717B2 (en) | 2009-02-03 | 2014-04-22 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same |
WO2010111414A1 (en) | 2009-03-24 | 2010-09-30 | Bayer Healthcare Llc | Factor viii variants and methods of use |
JP5839597B2 (ja) | 2009-06-08 | 2016-01-06 | アムニクス オペレーティング インコーポレイテッド | グルコース調節ポリペプチド並びにその作成及び使用方法 |
LT2440241T (lt) | 2009-06-08 | 2017-10-10 | Amunix Operating Inc. | Augimo hormonų polipeptidai ir jų gamybos bei panaudojimo būdai |
KR20120061898A (ko) | 2009-08-20 | 2012-06-13 | 체에스엘 베링 게엠베하 | 출혈성 장애의 치료요법 및 예방 치료에 있어서의 비정맥내 투여를 위한 알부민 융합 응고 인자 |
EP2470670A4 (en) * | 2009-08-24 | 2013-07-10 | Amunix Operating Inc | COAGULATION FACTOR VII COMPOSITIONS AND METHODS OF PREPARATION AND USE THEREOF |
WO2011028344A2 (en) | 2009-08-25 | 2011-03-10 | Amunix Operating Inc. | Interleukin-1 receptor antagonist compositions and methods of making and using same |
MX2012005527A (es) | 2009-11-13 | 2012-08-08 | Grifols Therapeutics Inc | Preparaciones que contienen el factor de von willebrand (fvw) procedimientos, kits y aplicaciones relacionados con las mismas. |
BR112012013502A2 (pt) | 2009-12-06 | 2017-01-10 | Biogen Idec Hemophilia Inc | "polipeptídeos quiméricos e híbridos de fator viii-fc, e métodos de uso dos mesmos". |
US20110312881A1 (en) * | 2009-12-21 | 2011-12-22 | Amunix, Inc. | Bifunctional polypeptide compositions and methods for treatment of metabolic and cardiovascular diseases |
EP2536754A1 (en) | 2010-02-16 | 2012-12-26 | Novo Nordisk A/S | Factor viii fusion protein |
EP2536753B1 (en) | 2010-02-16 | 2017-12-20 | Novo Nordisk A/S | Factor viii molecules with reduced vwf binding |
WO2011123830A2 (en) | 2010-04-02 | 2011-10-06 | Amunix Operating Inc. | Alpha 1-antitrypsin compositions and methods of making and using same |
EP2552967A4 (en) | 2010-04-02 | 2014-10-08 | Amunix Operating Inc | BINDING FUSION PROTEINS, BINDING FUSION PROTEIN MEDICINAL CONJUGATES, XTEN MEDICAMENT CONJUGATES, AND METHOD FOR THEIR PREPARATION AND USE |
CA3050896C (en) | 2010-04-21 | 2023-01-24 | Erik Berntorp | Genetic factors associated with inhibitor development in hemophilia a |
CN103140237A (zh) | 2010-07-09 | 2013-06-05 | 比奥根艾迪克依蒙菲利亚公司 | 因子ix多肽及其使用方法 |
PT2591006T (pt) | 2010-07-09 | 2019-07-29 | Bioverativ Therapeutics Inc | Moléculas de cadeia simples processáveis e polipéptidos preparados utilizando as mesmas |
EP3508573A1 (en) | 2010-07-09 | 2019-07-10 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Systems for factor viii processing and methods thereof |
WO2012007324A2 (en) | 2010-07-15 | 2012-01-19 | Novo Nordisk A/S | Stabilized factor viii variants |
US20130017997A1 (en) | 2010-08-19 | 2013-01-17 | Amunix Operating Inc. | Factor VIII Compositions and Methods of Making and Using Same |
PT2717898T (pt) | 2011-06-10 | 2019-05-20 | Bioverativ Therapeutics Inc | Compostos pró-coagulantes e processos para a sua utilização |
EP2804623B1 (en) | 2012-01-12 | 2019-08-07 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Chimeric factor viii polypeptides and uses thereof |
EP2822577B1 (en) | 2012-02-15 | 2019-02-06 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Recombinant factor viii proteins |
HUE046848T2 (hu) | 2012-02-15 | 2020-03-30 | Bioverativ Therapeutics Inc | VIII. faktor készítmények és eljárások elõállításukra és alkalmazásukra |
EP2841451A1 (en) | 2012-04-24 | 2015-03-04 | Novo Nordisk A/S | Compounds suitable for treatment of haemophilia |
WO2013160005A1 (en) | 2012-04-24 | 2013-10-31 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical composition suitable for treatment of haemophilia |
SG10201701037WA (en) | 2012-07-11 | 2017-03-30 | Amunix Operating Inc | Factor viii complex with xten and von willebrand factor protein, and uses thereof |
US9416070B2 (en) | 2012-07-18 | 2016-08-16 | Northwestern University | Forming ethylene |
WO2014100913A1 (en) | 2012-12-24 | 2014-07-03 | Beijing Anxinhuaide Biotech. Co., Ltd | Improving the half life of a therapeutic polypeptide by fusing with a trimeric scaffold protein via a spacer |
ES2657291T3 (es) | 2013-04-22 | 2018-03-02 | Csl Ltd. | Un complejo covalente de factor de von Willebrand y factor VIII asociado por un puente disulfuro |
TW201536811A (zh) | 2013-05-31 | 2015-10-01 | Biogen Idec Inc | 嵌合fvii-xten分子及其用途 |
CN105452289A (zh) | 2013-06-12 | 2016-03-30 | 诺和诺德股份有限公司 | 适用于治疗血友病的化合物 |
SG11201509313PA (en) | 2013-06-28 | 2016-01-28 | Biogen Ma Inc | Thrombin cleavable linker with xten and its uses thereof |
US10548953B2 (en) | 2013-08-14 | 2020-02-04 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Factor VIII-XTEN fusions and uses thereof |
US10584147B2 (en) * | 2013-11-08 | 2020-03-10 | Biovertiv Therapeutics Inc. | Procoagulant fusion compound |
HUE059820T2 (hu) | 2014-01-10 | 2022-12-28 | Bioverativ Therapeutics Inc | VIII-as faktor kimérafehérjéi és azok alkalmazása |
US11008561B2 (en) * | 2014-06-30 | 2021-05-18 | Bioverativ Therapeutics Inc. | Optimized factor IX gene |
JP6909203B2 (ja) * | 2015-08-03 | 2021-07-28 | バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド | 第ix因子融合タンパク質及びそれらの製造方法及び使用方法 |
-
2010
- 2010-08-02 EP EP10814048.4A patent/EP2470670A4/en not_active Withdrawn
- 2010-08-02 WO PCT/US2010/002148 patent/WO2011028229A1/en active Application Filing
- 2010-08-02 JP JP2012526709A patent/JP5813641B2/ja active Active
- 2010-08-02 BR BR112012004094A patent/BR112012004094A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-08-02 CA CA2772051A patent/CA2772051C/en active Active
- 2010-08-02 CA CA2771999A patent/CA2771999A1/en not_active Abandoned
- 2010-08-02 CN CN201080047903.5A patent/CN102741275B/zh active Active
- 2010-08-02 WO PCT/US2010/002147 patent/WO2011028228A1/en active Application Filing
- 2010-08-02 CN CN201080047919.6A patent/CN102741422B/zh active Active
- 2010-08-02 AU AU2010290077A patent/AU2010290077C1/en not_active Ceased
- 2010-08-02 US US12/806,005 patent/US8716448B2/en active Active
- 2010-08-02 US US13/392,509 patent/US20120263701A1/en not_active Abandoned
- 2010-08-02 BR BR112012004104-5A patent/BR112012004104B1/pt active IP Right Grant
- 2010-08-02 US US13/392,511 patent/US9062299B2/en active Active
- 2010-08-02 EP EP10814049.2A patent/EP2470559B1/en not_active Not-in-force
- 2010-08-02 JP JP2012526708A patent/JP2013502458A/ja active Pending
- 2010-08-02 US US12/806,004 patent/US20110046060A1/en not_active Abandoned
- 2010-08-02 AU AU2010290131A patent/AU2010290131C1/en active Active
- 2010-08-02 EP EP17155615.2A patent/EP3222287A1/en active Pending
-
2013
- 2013-12-18 US US14/132,415 patent/US20140186327A1/en not_active Abandoned
-
2014
- 2014-03-18 US US14/218,524 patent/US20140328819A1/en not_active Abandoned
- 2014-11-21 JP JP2014236458A patent/JP2015042679A/ja active Pending
- 2014-12-04 JP JP2014246138A patent/JP2015052015A/ja active Pending
-
2015
- 2015-05-12 US US14/710,077 patent/US9376672B2/en active Active
-
2016
- 2016-05-24 US US15/163,603 patent/US9758776B2/en active Active
-
2017
- 2017-02-08 US US15/427,763 patent/US20170247676A1/en not_active Abandoned
-
2021
- 2021-01-19 US US17/152,239 patent/US20210277378A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2009525724A (ja) * | 2006-02-06 | 2009-07-16 | ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー | 半減期が延長された改変凝固第VIIa因子 |
WO2007103515A2 (en) * | 2006-03-06 | 2007-09-13 | Amunix, Inc. | Unstructured recombinant polymers and uses thereof |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5813641B2 (ja) | 凝固第ix因子組成物ならびにそれを製造および使用する方法 | |
JP2013502459A5 (ja) | ||
JP6527918B2 (ja) | 第viii因子組成物、ならびに組成物の作製方法および用途 | |
US8557961B2 (en) | Alpha 1-antitrypsin compositions and methods of making and using same | |
RU2731507C1 (ru) | Gla домены в качестве нацеливающих агентов | |
US20150038421A1 (en) | Factor viii compositions and methods of making and using same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130402 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130402 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140821 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141121 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150316 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150616 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20151113 |