BR112020026512A2 - Formulações de fgf-21 - Google Patents

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BR112020026512A2
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BR
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fgf
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sucrose
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BR112020026512-8A
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Thomas Palm
Mehrnaz Khossravi
Sanket PATKE
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Bristol-Myers Squibb Company
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Publication date
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Abstract

"formulações de fgf-21. a presente invenção refere-se a formulações farmacêuticas compreendendo um polipeptídeo fgf-21, por exemplo, um polipeptídeo fgf-21 modificado, tal como peg-fgf-21, e um ou mais estabilizantes, tais como o quelante dpta. as formulações podem ser ainda estabilizadas incluindo um tensoativo tal como polissorbato 80 e/ou ajustando o ph a cerca de 7,1. a presente invenção também se refere a métodos de fabricação, métodos de tratamento, e kits.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FOR- MULAÇÕES DE FGF-21". REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SUBMETIDA ELE- TRONICAMENTE ATRAVÉS DE EFS-WEB
[001] O conteúdo da listagem de sequências submetida eletroni- camente (Nome: 3338_133PC01_SeqListing.txt; Tamanho: 5.532 bytes; e Data de Criação: 26 de junho de 2019) arquivada com o re- querimento é incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência, em sua totalidade.
ANTECEDENTES Campo
[002] Este requerimento diz respeito, entre outras coisas, a for- mulações compreendendo um polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, estabilizado usando quelantes (por exemplo, DTPA), tensoativos (por exemplo, PS80), e tendo faixas de pH específico (por exemplo, cerca de 7,1), para administração por meio de várias vias, incluindo, por exemplo, administração subcutâ- nea. Antecedentes
[003] Os fatores de crescimento de fibroblastos (FGF) são poli- peptídeos amplamente expressos em tecidos em desenvolvimento e adultos (Baird et al., Cancer Cells, 3:239-243, 1991) que desempe- nham papéis cruciais em múltiplas funções fisiológicas (McKeehan et al., Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 59:135-176, 1998; Burgess, W. H. et al., Annu. Rev. Biochem. 58:575-606 (1989). De acordo com a literatura, a família dos FGF consiste em no mínimo vinte e dois mem- bros (Reuss et al., Cell Tissue Res. 313:139-157 (2003)).
[004] O FGF-21 pode ser usado para o tratamento de doenças e condições associadas com fibrose. Fibrose é a formação de excesso de tecido conjuntivo fibroso em um órgão ou tecido. O excesso de de-
posição de tecido fibroso está associado com condições patológicas que podem levar à diminuição da função de órgãos ou tecidos. Os ór- gãos afetados podem incluir os pulmões (fibrose do pulmão ou pulmo- nar), o fígado (fibrose do fígado ou hepática), os rins (fibrose do rim ou renal), e o coração (fibrose cardíaca). Fibrose também pode afetar ou- tros tecidos e órgãos incluindo as articulações, a pele, os intestinos, a medula óssea, e outros. Exemplos de condições ou doenças fibróticas incluem, mas não estão limitados a, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), a qual afeta o fígado; doença renal diabética e nefropatia dia- bética, as quais afetam o rim; e falência cardíaca metabólica, a qual afeta o coração. Por exemplo, a esteato-hepatite não alcoólica é ca- racterizada por acúmulo de gordura, inflamação e lesão no fígado de pessoas que consomem pouco ou nenhum álcool, e a doença pode levar a cirrose hepática. A esteato-hepatite não alcoólica tende a ser diagnosticada em pessoas de meia idade com sobrepeso ou obesas as quais frequentemente têm níveis sanguíneos elevados de determi- nados lipídeos e diabetes ou pré-diabetes.
[005] Foi reportado que FGF-21 tem uma propensão a sofrer pro- teólise in vivo, formar agregados in vitro, e sofrer desamidação (Gime- no and Moller, Trends Endocrinol Metab. 2014 June; 25(6):303-11; Pat. U.S. No. 8.361.963; Hecht et al., PLoS One. 2012; 7(11):e49345; Publicação de Patente U.S. No. 2007/0293430; Patente Internacional No. WO 2006/0065582), potencialmente limitando a validade de com- posições farmacêticas contendo FGF-21. Agregados e formas desamidados de polipeptídeos terapêuticos podem aumentar poten- cialmente a imunogenicidade (vide U.S. Department of Health and Human Services, "Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products," August 2014; Subramanyam (ed.), "Therapeutic Protein Immunogenicity Focus Group Newsletter," American Association of Pharmaceutical Scientists, Vol. 1, Issue 3 (December 2011)).
[006] A presente divulgação aborda, entre outras coisas, a ne- cessidade de formulações farmacêuticas que tratam os problemas as- sociados com a produção de formulações farmacêuticas compreen- dendo polipeptídeos FGF-21, e em particular, polipeptídeos FGF-21 modificados.
BREVE SUMÁRIO
[007] A presente divulgação proporciona formulações farmacêuti- cas compreendendo um polipeptídeo de fator de crescimento de fi- broblasto 21 (FGF-21), por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modifi- cado, e um quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico, tal como ácido dietilenotriaminapenta-acético (também conhecido como ácido pentético ou DTPA), em que a formulação tem aumento da estabilida- de em comparação com uma formulação de referência que não conte- nha o quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico. Estas formula- ções farmacêuticas mostram um ou mais reforços com respeito a for- mulações alternativas conhecidas na arte, por exemplo, menores taxas de desamidação, por exemplo, quando armazenadas a 40 ºC por cer- ca de um mês, e/ou menores taxas de agregação de alto peso molecu- lar (HMW) quando armazenadas, por exemplo, a 40 ºC por cerca de um mês.
[008] A presença de um quelante de cátion ácido aminopolicar- boxílico na formulação descrita também mitiga a oxidação do polipep- tídeo FGF-21, e em particular a oxidação de metionina. Por exemplo, a presença de DTPA na formulação pode mitigar ou prevenir a oxidação de uma ou mais metioninas do FGF-21 correspondentes ao aminoáci- do 1 e/ou ao aminoácido 169 de SEQ ID NO: 3 (ou metioninas corres- pondentes na SEQ ID NO: 1 e 2) a 25 ºC e/ou 40 ºC.
[009] Em alguns aspectos, o quelante de cátion DTPA está pre- sente em uma quantidade entre cerca de 10 µM e cerca de 100 µM de DTPA, entre cerca de 20 µM e cerca de 90 µM de DTPA, entre cerca de 30 µM e cerca de 80 µM de DTPA, entre cerca de 25 µM e cerca de 75 µM de DTPA, entre cerca de 40 µM e cerca de 60 µM de DTPA, entre cerca de 30 µM e cerca de 70 µM de DTPA, ou entre cerca de 40 µM e cerca de 70 µM de DTPA. Em outros aspectos, o quelante de cátion DTPA está presente em uma quantidade de cerca de 40 µM, cerca de 45 µM, cerca de 50 µM, cerca de 55 µM, ou cerca de 60 µM de DTPA.
[010] Em alguns aspectos das formulações farmacêuticas descri- tas aqui, neste requerimento de patente, o pH da formulação é acima de 6,5, acima de 6,6, acima de 6,7, acima de 6,8, acima de 6,9, acima de 7,0, acima de 7,1, acima de 7,2, acima de 7,3, acima de 7,4, ou acima de 7,5.
[011] Em alguns aspectos, o pH é de entre cerca de 6,7 e cerca de 7,5, entre cerca de 6,8 e cerca de 7,5, entre cerca de 6,9 e cerca de 7,4, entre cerca de 7,0 e cerca de 7,3, entre cerca de 7,1 e 7,2, entre cerca de 7,1 e cerca de 7,3, entre cerca de 7,1 e cerca de 7,4, ou entre cerca de 7,1 e cerca de 7,5. Em alguns aspectos, o pH é de cerca de 6,7, cerca de 6,8, cerca de 6,9, cerca de 7,0, cerca de 7,1, cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,4, ou cerca de 7,5. Em alguns aspectos, a formulação farmacêutica é mais estável do que uma formulação de referência com um pH de 6,5.
[012] Em alguns aspectos, as formulações farmacêuticas descri- tas aqui, neste requerimento de patente, compreendem adicionalmen- te um tensoativo, por exemplo, um tensoativo não iônico. Em alguns aspectos, o tensoativo não iônico é um polissorbato, por exemplo, mo- no-oleato de sorbitano de polioxietileno (20) (polissorbato 80). Em al- guns aspectos, o tensoativo polissorbato 80 está presente em uma quantidade de cerca de 0,01% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,02% a cerca de 0,09% (em peso / vol), cerca de 0,03% a cerca de 0,08% (em peso / vol), cerca de 0,04% a cerca de 0,07% (em peso
/ vol), ou cerca de 0,05% a cerca de 0,06% (em peso / vol).
[013] Em alguns aspectos, o tensoativo polissorbato 80 está pre- sente em uma quantidade de no mínimo cerca de 0,01% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,02% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,03% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,04% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,05% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,06% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,07% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,08% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,09% (em peso / vol) ou no mínimo cerca de 0,1% (em peso / vol). Em alguns aspectos, o tensoativo mitiga a formação de particulados e/ou de bolhas de ar, por exemplo, quando agitado em um shaker.
[014] Em alguns aspectos, as formulações farmacêuticas descri- tas aqui, neste requerimento de patente, compreendem adicionalmen- te um agente de tamponamento de aminoácido, por exemplo, histidina. Em alguns aspectos, o agente de tamponamento de histidina está pre- sente em uma quantidade de cerca de 10 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 20 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 30 mM a cerca de 80 mM de histidina, cerca de 40 mM a cerca de 70 mM de histidina, cerca de 10 mM a cerca de 30 mM de histidina, cerca de 15 mM a cerca de 25 mM de histidina, cerca de 17.5 a cerca de 22.5 histidina, ou cerca de 40 mM a cerca de 60 mM de histidina. Em al- guns aspectos, o agente de tamponamento de histidina está presente em uma quantidade de cerca de 10 mM de histidina, cerca de 15 mM de histidina, cerca de 20 mM de histidina, cerca de 25 mM de histidina, cerca de 30 mM de histidina, cerca de 35 mM de histidina, cerca de 40 mM de histidina, cerca de 45 mM de histidina ou cerca de 50 mM de histidina.
[015] Em alguns aspectos, as formulações farmacêuticas descri- tas aqui, neste requerimento de patente, compreendem adicionalmen- te um regulador osmótico, por exemplo, um açúcar. Em alguns aspec-
tos, o açúcar é sacarose. Em alguns aspectos, o regulador osmótico de sacarose está presente em uma quantidade de cerca de 100 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 200 mM a cerca de 900 mM de sacarose, cerca de 300 mM a cerca de 800 mM de sacarose, cerca de 400 mM a cerca de 700 mM de sacarose, ou cerca de 500 mM a cerca de 600 mM de sacarose. Em alguns aspectos, o regulador osmótico de sacarose está presente em uma quantidade de cerca de 100 mM de sacarose, cerca de 200 mM de sacarose, cerca de 300 mM de sacaro- se, cerca de 400 mM de sacarose, cerca de 500 mM de sacarose, cer- ca de 600 mM de sacarose, cerca de 700 mM de sacarose, cerca de 800 mM de sacarose, cerca de 900 mM de sacarose, ou cerca de 1M de sacarose.
[016] Em alguns aspectos das formulações farmacêuticas descri- tas aqui, neste requerimento de patente, o polipeptídeo FGF-21 com- preende, consiste, ou consiste essencialmente, em um polipeptídeo FGF-21 modificado. Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 modi- ficado compreende um polipeptídeo tendo no mínimo cerca de 80%, no mínimo cerca de 85%, no mínimo cerca de 90%, no mínimo cerca de 95%, no mínimo cerca de 96%, no mínimo cerca de 97%, no míni- mo cerca de 98%, ou no mínimo cerca de 99% de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, em que o polipeptídeo tem uma atividade de FGF-21.
[017] Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 modificado é ligado a uma porção de extensão da meia-vida. Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 modificado é ligado à porção de extensão da meia-vida através da cadeia lateral de um aminoácido codificado não naturalmente na sequência do polipeptídeo FGF-21. Em alguns aspec- tos, a porção de extensão da meia-vida compreende albumina, uma região constante de imunoglobulina ou uma porção das mesmas, um polipeptídeo de ligação a imunoglobulina, uma imunoglobulina G (IgG),
um polipeptídeo de ligação a albumina (ABP), uma porção de PASila- ção, uma porção de HESilação, XTEN, uma região de Fc, e qualquer combinação das mesmas. Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida compreende um polímero hidrossolúvel. Em alguns as- pectos, o polímero hidrossolúvel é um polietileno glicol (PEG). Em al- guns aspectos, o PEG tem um peso molecular médio entre cerca de 10 kDa e cerca de 40 kDa. Em alguns aspectos, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 30 kDa.
[018] Em alguns aspectos das formulações descritas aqui, neste requerimento de patente, o aminoácido codificado não naturalmente é um derivado de fenilalanina. Em alguns aspectos, o derivado de fenila- lanina é para-acetil-L-fenilalanina. Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida é ligada ao aminoácido codificado não natural- mente por meio de uma ligação oxima. Em alguns aspectos, o amino- ácido codificado não naturalmente substitui o aminoácido Glutamina 109 de SEQ ID NO: 3.
[019] Em alguns aspectos das formulações descritas aqui, neste requerimento de patente, o polipeptídeo FGF-21 está presente em uma concentração entre cerca de 1 mg/ml e cerca de 40 mg/ml. Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 está presente em uma con- centração de cerca de 10 mg/ml ou cerca de 20 mg/ml. Em alguns as- pectos, o polipeptídeo FGF-21 está presente em uma quantidade entre cerca de 1 mg e cerca de 40 mg por dose. Em alguns aspectos, o poli- peptídeo FGF-21 está presente em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose, cerca de 5 mg por dose, cerca de 10 mg por dose, cerca de 20 mg por dose, ou cerca de 40 mg por dose.
[020] Em alguns aspectos, a formulação é formulada para admi- nistração subcutânea. Em alguns aspectos, a formulação é formulada para administração subcutânea com uma seringa de segurança. Em alguns aspectos, a formulação é formulada para administração diaria-
mente ou semanalmente. Em alguns aspectos, a formulação é uma formulação aquosa. Em alguns aspectos das formulações descritas aqui, neste requerimento de patente, o polipeptídeo FGF-21 é um PEG-FGF-21 (SEQ ID NO: 2).
[021] A presente divulgação proporciona uma formulação farma- cêutica compreendendo (i) um polipeptídeo FGF-21; (ii) histidina em uma concentração entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM; (iii) saca- rose em uma concentração entre cerca de 100 mM e cerca de 1M; (iv) Polissorbato 80 em uma concentração entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% (em peso / vol); e, (v) DTPA em uma concentração entre cer- ca de 10 µM e cerca de 100 µM; em que o pH da formulação é entre cerca de 6,7 e cerca de 7,5.
[022] A presente divulgação também proporciona uma formula- ção farmacêutica compreendendo (i) um polipeptídeo FGF-21; (ii) his- tidina em uma concentração de cerca de 20 mM; (iii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma con- centração de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma concentração de cerca de 50 µM; em que o pH é de cerca de 7,1. Também é proporcionada uma formulação farmacêutica compreen- dendo (i) um polipeptídeo FGF-21; (ii) histidina em uma concentração de 20 mM; (iii) sacarose em uma concentração de 600 mM; (iv) Polis- sorbato 80 em uma concentração de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma concentração de 50 µM; em que o pH é de 7,1.
[023] A presente divulgação também proporciona uma formula- ção farmacêutica compreendendo (i) um polipeptídeo FGF-21; (ii) his- tidina em uma concentração de cerca de 20 mM; e (iii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; em que o pH é de cerca de 7,0. Também é proporcionada uma formulação farmacêutica compre- endendo (i) um polipeptídeo FGF-21; (ii) histidina em uma concentra- ção de 20 mM; e (iii) sacarose em uma concentração de 600 mM; em que o pH é de 7,0.
[024] Também é proporcionada uma formulação farmacêutica compreendendo (i) PEG-FGF-21 em uma concentração de cerca de 10 mg/mL; (ii) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; (iii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma concentração de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma concentração de cerca de 50 uM; em que o pH é de cerca de 7,1.
[025] Também é proporcionada uma formulação farmacêutica compreendendo (i) PEG-FGF-21 em uma concentração de cerca de 20 mg/mL; (ii) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; (iii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma concentração de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma concentração de cerca de 50 uM; em que o pH é de cerca de 7,1.
[026] Também é proporcionada uma formulação farmacêutica compreendendo (i) PEG-FGF-21 em uma concentração de 10 mg/mL; (ii) histidina em uma concentração de 20 mM; (iii) sacarose em uma concentração de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma concentração de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma concentração de 50 uM; em que o pH é de 7,1.
[027] Também é proporcionada uma formulação farmacêutica compreendendo (i) PEG-FGF21 em uma concentração de 20 mg/mL; (ii) histidina em uma concentração de 20 mM; (iii) sacarose em uma concentração de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma concentração de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma concentração de 50 uM; em que o pH é de 7,1.
[028] A presente divulgação também proporciona métodos para melhorar a estabilidade de uma formulação farmacêutica compreen- dendo um polipeptídeo FGF-21 compreendendo misturar um quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico, em que a formulação tem au- mento da estabilidade em comparação com uma formulação de refe- rência que não contenha o quelante de cátion ácido aminopolicarboxí- lico. Em um aspecto, a melhora na estabilidade compreende (i) um aumento na estabilidade física, (ii) um aumento na estabilidade quími- ca, ou (iii) uma combinação dos mesmos. Em um aspecto, o aumento na estabilidade física compreende (i) prevenção ou diminuição da agregação do polipeptídeo, (ii) prevenção ou diminuição da fragmenta- ção do polipeptídeo, ou (iii) uma combinação dos mesmos. Em alguns aspectos, o aumento na estabilidade química compreende (i) preven- ção ou diminuição da desamidação, (ii) prevenção ou diminuição da oxidação, ou (iii) uma combinação dos mesmos. Em alguns aspectos, a melhora na estabilidade compreende um ou mais de: (a) uma menor taxa de desamidação quando armazenada a 40 ºC por cerca de um mês com respeito à formulação de referência; (b) uma menor taxa de agregação de alto peso molecular (HMW) quando armazenada a 40 ºC por cerca de um mês com respei- to à formulação de referência; ou (c) tanto (a) quanto (b).
[029] Em alguns aspectos dos métodos para melhorar a estabili- dade de uma formulação farmacêutica descrita aqui, neste requeri- mento de patente, o quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico mi- tiga a oxidação de uma ou mais metioninas correspondentes ao ami- noácido 1 e/ou ao aminoácido 169 de SEQ ID NO: 3 (ou metioninas correspondentes em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2, ou outros poli- peptídeos FGF-21 modificados) a 25 ºC e/ou 40 ºC. Em alguns aspec- tos, o quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico é DTPA. Em al- guns aspectos, o quelante de cátion DTPA está presente em uma quantidade entre cerca de 10 µM e cerca de 100 µM de DTPA, entre cerca de 20 µM e cerca de 90 µM de DTPA, entre cerca de 25 µM e cerca de 75 µM de DTPA, entre cerca de 40 µM e cerca de 60 µM de DTPA, entre cerca de 30 µM e cerca de 70 µM de DTPA, entre cerca de 30 µM e cerca de 80 µM de DTPA, ou entre cerca de 40 µM e cerca de 70 µM de DTPA. Em alguns aspectos, o quelante de cátion DTPA está presente em uma quantidade de cerca de 40 µM, cerca de 45 µM, cerca de 50 µM, cerca de 55 µM, ou cerca de 60 µM de DTPA.
[030] Em alguns aspectos, os métodos para melhorar a estabili- dade de uma formulação farmacêutica descrita aqui, neste requeri- mento de patente, compreendem adicionalmente ajustar o pH da for- mulação acima de 6,5, acima de 6,6, acima de 6,7, acima de 6,8, aci- ma de 6,9, ou acima de 7,0. Em alguns aspectos, o pH é ajustado para um valor de pH entre cerca de 6,8 e cerca de 7,5, ou cerca de 6,9 e cerca de 7,4, ou cerca de 7,0 e cerca de 7,3, ou cerca de 7,1 e 7,2, ou cerca de 7,1 e cerca de 7,3, ou cerca de 7,1 e cerca de 7,4, ou cerca de 7,1 e cerca de 7,5. Em alguns aspectos, o pH ajustado é de cerca de 6,8, cerca de 6,9, cerca de 7,0, cerca de 7,1, cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,4, ou cerca de 7,5. Em alguns aspectos, a formulação com pH ajustado é mais estável do que uma formulação de referência (isto é, uma formulação com os mesmos componentes nas mesmas concentrações mas tendo um pH diferente) tendo um pH de 6,5.
[031] Em alguns aspectos, os métodos para melhorar a estabili- dade de uma formulação farmacêutica descrita aqui, neste requeri- mento de patente, compreendem adicionalmente misturar um tensoati- vo. Em alguns aspectos, o tensoativo é um tensoativo não iônico, por exemplo, um polissorbato. Em alguns aspectos, o polissorbato é polis- sorbato 80. Em alguns aspectos, o tensoativo polissorbato 80 é mistu- rado em uma quantidade de cerca de 0,01% a cerca de 0,1% (em pe- so / vol), cerca de 0,02% a cerca de 0,09% (em peso / vol), cerca de 0,03% a cerca de 0,08% (em peso / vol), cerca de 0,04% a cerca de 0,07% (em peso / vol), ou cerca de 0,05% a cerca de 0,06% (em peso
/ vol). Em alguns aspectos, o tensoativo polissorbato 80 é misturado em uma quantidade de no mínimo cerca de 0,01% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,02% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,03% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,04% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,05% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,06% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,07% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,08% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,09% (em peso / vol) ou no mínimo cerca de 0,1% (em peso / vol). Em alguns aspectos, o ten- soativo mitiga a formação de particulados e/ou de bolhas de ar quando a formulação é agitada, por exemplo, em um shaker.
[032] Em alguns aspectos, os métodos para melhorar a estabili- dade de uma formulação farmacêutica descrita aqui, neste requeri- mento de patente, compreendem adicionalmente misturar um agente de tamponamento de aminoácido, por exemplo, histidina. Em alguns aspectos, o agente de tamponamento de histidina é misturado em uma quantidade de cerca de 10 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 20 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 30 mM a cerca de 80 mM de histidina, cerca de 40 mM a cerca de 70 mM de histidina, cerca de 10 mM a cerca de 30 mM de histidina, cerca de 15 mM a cer- ca de 25 mM de histidina, cerca de 17,5 mM a cerca de 22,5 mM de histidina, ou cerca de 40 mM a cerca de 60 mM de histidina. Em al- guns aspectos, o agente de tamponamento de histidina é misturado em uma quantidade de cerca de 10 mM de histidina, cerca de 15 mM de histidina, cerca de 20 mM de histidina, cerca de 25 mM de histidina, cerca de 30 mM de histidina, cerca de 35 mM de histidina, cerca de 40 mM de histidina, cerca de 45 mM de histidina, ou cerca de 50 mM de histidina.
[033] Em alguns aspectos, os métodos para melhorar a estabili- dade de uma formulação farmacêutica descrita aqui, neste requeri- mento de patente, compreendem adicionalmente misturar um regula-
dor osmótico, por exemplo, um açúcar. Em alguns aspectos, o açúcar é sacarose. Em alguns aspectos, o regulador osmótico de sacarose é misturado em uma quantidade de cerca de 100 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 200 mM a cerca de 900 mM de sacarose, cerca de 300 mM a cerca de 800 mM de sacarose, cerca de 400 mM a cerca de 700 mM de sacarose, ou cerca de 500 mM a cerca de 600 mM de sa- carose. Em alguns aspectos, o regulador osmótico de sacarose é mis- turado em uma quantidade de cerca de 100 mM de sacarose, cerca de 200 mM de sacarose, cerca de 300 mM de sacarose, cerca de 400 mM de sacarose, cerca de 500 mM de sacarose, cerca de 600 mM de sacarose, cerca de 700 mM de sacarose, cerca de 800 mM de sacaro- se, cerca de 900 mM de sacarose, ou cerca de 1M de sacarose.
[034] Em alguns aspectos dos métodos para melhorar a estabili- dade de uma formulação farmacêutica descrita aqui, neste requeri- mento de patente, o polipeptídeo FGF-21 é um polipeptídeo FGF-21 modificado. Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 modificado compreende uma sequência de polipeptídeo FGF-21 tendo no mínimo cerca de 80%, no mínimo cerca de 85%, no mínimo cerca de 90%, no mínimo cerca de 95%, no mínimo cerca de 96%, no mínimo cerca de 97%, no mínimo cerca de 98%, ou no mínimo cerca de 99% de identi- dade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, em que o polipeptídeo tem uma atividade de FGF-
21. Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 modificado é ligado a uma porção de extensão da meia-vida. Em alguns aspectos, polipeptí- deo FGF-21 modificado é ligado à porção de extensão da meia-vida através da cadeia lateral de um aminoácido codificado não natural- mente na sequência do polipeptídeo FGF-21.
[035] Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida compreende, por exemplo, albumina, uma região constante de imuno- globulina ou uma porção das mesmas, um polipeptídeo de ligação a imunoglobulina, uma IgG, ABP, uma porção de PASilação, uma por- ção de HESilação, XTEN, uma região de Fc, e qualquer combinação das mesmas. Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida compreende um polímero hidrossolúvel. Em alguns aspectos, o polí- mero hidrossolúvel é um PEG. Em alguns aspectos, o PEG tem um peso molecular médio entre cerca de 10 kDa e cerca de 40 kDa. Em alguns aspectos, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 30 kDa. Em alguns aspectos, o aminoácido codificado não naturalmente é um derivado de fenilalanina. Em alguns aspectos, o derivado de fenila- lanina é para-acetil-L-fenilalanina. Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida é ligada ao aminoácido codificado não natural- mente por meio de uma ligação oxima. Em alguns aspectos, o amino- ácido codificado não naturalmente substitui o aminoácido Glutamina 109 de SEQ ID NO: 3. Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 está presente em uma concentração entre cerca de 1 mg/ml e cerca de 40 mg/ml. Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 está presen- te em uma concentração de cerca de 10 mg/ml ou cerca de 20 mg/ml. Em alguns aspectos, a formulação é uma formulação aquosa. Em al- guns aspectos dos métodos descritos acima, o polipeptídeo FGF-21 é PEG-FGF-21 (SEQ ID NO: 2).
[036] A presente divulgação também proporciona um método pa- ra melhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo um po- lipeptídeo FGF-21, em que o método compreende misturar (i) histidina em uma concentração entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM; (ii) sacarose em uma concentração entre cerca de 100 mM e cerca de 1M; (iii) Polissorbato 80 em uma concentração entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% (em peso / vol); e, (iv) DTPA em uma concentração en- tre cerca de 10 µM e cerca de 100 µM; em que o pH da formulação é entre cerca de 6,7 e cerca de 7,5. Também é proporcionado um méto- do para melhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo um polipeptídeo FGF-21, em que o método compreende misturar (i) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; (ii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; (iii) Polissorbato 80 em uma concentração de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (iv) DTPA em uma concentração de cerca de 50 µM; em que o pH é de cerca de 7,1. Também é proporcionado um método para melhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo um polipeptídeo FGF-21, em que o método compreende misturar (i) histidina em uma concentração de 20 mM; (ii) sacarose em uma concentração de 600 mM; (iii) Polissorbato 80 em uma concentração de 0,05% (em peso / vol); e (iv) DTPA em uma concentração de 50 µM; em que o pH é de 7,1.
[037] A presente divulgação também proporciona um método pa- ra melhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo um po- lipeptídeo FGF-21, em que o método compreende misturar (i) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; (ii) sacarose em uma con- centração de cerca de 600 mM; em que o pH é de cerca de 7,0. A pre- sente divulgação também proporciona um método para melhorar a es- tabilidade de uma formulação compreendendo um polipeptídeo FGF- 21, em que o método compreende misturar (i) histidina em uma con- centração de 20 mM; (ii) sacarose em uma concentração de 600 mM; em que o pH é de 7,0. Também é proporcionado um método para me- lhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo PEG-FGF-21 em uma concentração de cerca de 10 mg/mL, em que o método com- preende misturar (i) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; (ii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; (iii) Po- lissorbato 80 em uma concentração de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (iv) DTPA em uma concentração de cerca de 50 uM; em que o pH é de cerca de 7,1.
[038] A presente divulgação também proporciona um método pa- ra melhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo PEG-
FGF-21 em uma concentração de cerca de 20 mg/mL, em que o mé- todo compreende misturar (i) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; (ii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; (iii) Polissorbato 80 em uma concentração de cerca de 0,05% (em pe- so / vol); e (iv) DTPA em uma concentração de cerca de 50 uM; em que o pH é de cerca de 7,1. Também é proporcionado um método pa- ra melhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo PEG- FGF-21 em uma concentração de cerca de 10 mg/mL, em que o mé- todo compreende misturar (i) histidina em uma concentração de 20 mM; (ii) sacarose em uma concentração de 600 mM; (iii) Polissorbato 80 em uma concentração de 0,05% (em peso / vol); e (iv) DTPA em uma concentração de 50 uM; em que o pH é de 7,1.
[039] Também é proporcionado um método para melhorar a es- tabilidade de uma formulação compreendendo PEG-FGF-21 em uma concentração de cerca de 20 mg/mL, em que o método compreende misturar (i) histidina em uma concentração de 20 mM; (ii) sacarose em uma concentração de 600 mM; (iii) Polissorbato 80 em uma concen- tração de 0,05% (em peso / vol); e (iv) DTPA em uma concentração de 50 uM; em que o pH é de 7,1.
[040] A presente divulgação também proporciona uma formula- ção farmacêutica preparada de acordo com qualquer um dos métodos para melhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo FGF-21 (por exemplo, um FGF-21 modificado tal como PEG-FGF-21) descrita aqui, neste requerimento de patente. Também é proporciona- do um kit compreendendo (i) uma formulação farmacêutica compreen- dendo FGF-21 (por exemplo, um FGF-21 modificado tal como PEG- FGF-21) descrita aqui, neste requerimento de patente, e (ii) instruções para uso.
[041] A presente divulgação também proporciona métodos de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada com fibrose e/ou diabetes em um sujeito que necessite do mesmo compre- endendo a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica compreendendo FGF-21 (por exemplo, um FGF-21 modificado tal como PEG-FGF-21) descrita aqui, neste reque- rimento de patente. Em alguns aspectos, a doença ou condição é dia- betes. Em alguns aspectos, o diabetes é diabetes tipo 2. Em alguns aspectos, a doença ou condição é esteato-hepatite não alcoólica (NASH). Em alguns aspectos, a administração de uma quantidade efi- caz da formulação farmacêutica compreendendo FGF-21 (por exem- plo, um FGF-21 modificado tal como PEG-FGF-21) descrita aqui, nes- te requerimento de patente, ao sujeito diminui a rigidez hepática, dimi- nui a percentagem de gordura corporal, diminui o peso corporal, dimi- nui a proporção de peso fígado - corpo, diminui o conteúdo de lipídeos do fígado, diminui a área de fibrose hepática, diminui os níveis de gli- cose sanguínea em jejum, diminui os níveis de triglicerídeos em jejum, diminui os níveis de colesterol LDL, diminui os níveis de ApoB, diminui os níveis de ApoC, aumenta os níveis de colesterol HDL, ou qualquer combinação dos mesmos. Em alguns aspectos, entre cerca de 1 mg e cerca de 40 mg de polipeptídeo FGF-21 é administrado por dose. Em alguns aspectos, cerca de 1 mg, cerca de 5 mg, cerca de 10 mg, cerca de 20 mg, ou cerca de 40 mg de polipeptídeo FGF-21 é administrado por dose. Em alguns aspectos, a formulação farmacêutica é adminis- trada por via subcutânea. Em alguns aspectos, a formulação farma- cêutica é administrada por via subcutânea usando uma seringa de se- gurança. Em alguns aspectos, a formulação farmacêutica é adminis- trada diariamente ou semanalmente.
[042] Em alguns aspectos, a administração da formulação farma- cêutica compreendendo FGF-21 (por exemplo, um FGF-21 modificado tal como PEG-FGF-21) descrita aqui, neste requerimento de patente, de acordo com os métodos de tratamento descritos aqui, neste reque-
rimento de patente, ao sujeito resulta em (i) redução nos níveis de gordura hepática; (ii) redução nos níveis de lesão hepática; (iii) redu- ção nos níveis de fibrose; (iv) diminuição nos níveis de biomarcador de fibrose sérico Pro-C3 (propeptídeo de colágeno tipo III N-terminal); (v) diminuição nos níveis de alanina aminotransferase (ALT); (vi) diminui- ção nos níveis de aspartato aminotransferase (AST); (vii) aumento nos níveis de adiponectina sérica; (viii) diminuição nos níveis de LDL plas- mático, aumento nos níveis de HDL plasmático; (ix) diminuição nos níveis de triglicerídeos plasmáticos; (x) redução no nível de rigidez he- pática; ou (xi) qualquer combinação das mesmas, comparados com os níveis em sujeitos não tratados ou com o sujeito antes da administra- ção da formulação farmacêutica.
[043] Em alguns aspectos, a formulação farmacêutica é prepara- da pelo processo de misturar (i) PEG-FGF-21 em uma quantidade pa- ra atingir uma concentração final de cerca de 10 mg/mL; (ii) histidina em uma quantidade para atingir uma concentração final de cerca de 20 mM; (iii) sacarose em uma quantidade para atingir uma concentra- ção final de cerca de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma quantidade para atingir uma concentração final de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma quantidade para atingir uma concentração final de cerca de 50 uM; e ajustar o pH a cerca de 7,1.
[044] Em alguns aspectos, a formulação farmacêutica é prepara- da pelo processo de misturar (i) PEG-FGF-21 em uma quantidade pa- ra atingir uma concentração final de cerca de 20 mg/mL; (ii) histidina em uma quantidade para atingir uma concentração final de cerca de 20 mM; (iii) sacarose em uma quantidade para atingir uma concentra- ção final de cerca de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma quantidade para atingir uma concentração final de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma quantidade para atingir uma concentração final de cerca de 50 uM; e ajustar o pH a cerca de 7,1.
[045] Em alguns aspectos, a formulação farmacêutica é prepara- da pelo processo de misturar (i) PEG-FGF-21 em uma quantidade pa- ra atingir uma concentração final de 10 mg/mL; (ii) histidina em uma quantidade para atingir uma concentração final de 20 mM; (iii) sacaro- se em uma quantidade para atingir uma concentração final de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma quantidade para atingir uma concen- tração final de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma quantidade para atingir uma concentração final de 50 uM; e ajustar o pH a 7,1.
[046] Em alguns aspectos, a formulação farmacêutica é prepara- da pelo processo de misturar (i) PEG-FGF-21 em uma quantidade pa- ra atingir uma concentração final de 20 mg/mL; (ii) histidina em uma quantidade para atingir uma concentração final de 20 mM; (iii) sacaro- se em uma quantidade para atingir uma concentração final de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma quantidade para atingir uma concen- tração final de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma quantidade para atingir uma concentração final de 50 uM; e ajustar o pH a 7,1.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[047] As FIGS. 1A e 1B mostram desamidação de PEG-FGF-21 em função da composição da formulação. A FIG. 1A mostra desami- dação em uma formulação sem ácido pentético (DTPA) ou polissorba- to 80. A FIG. 1B mostra desamidação em uma formulação compreen- dendo ácido pentético (DTPA) e polissorbato 80.
[048] As FIGS. 2A e 2B mostram oxidação catalisada por metal de PEG-polipeptídeo FGF-21 em metionina 1 (FIG. 2A) e metionina 169 (FIG. 2B) na presença e na ausência de 50 µM de DTPA (também conhecido como ácido pentético).
[049] As FIGS. 3A e 3B mostram o efeito do pH sobre a agrega- ção de PEG-FGF-21. A FIG. 3A mostra agregação em função do tem- po, do pH, e do sistema tampão usado. A FIG. 3B mostra agregação em diferentes temperatures e tempos (5oC, 14 meses; 25oC, 1 mês;
40oC, 1 dia) e pH diferente.
[050] As FIGS. 4A e 4B mostram agregação de PEG-FGF-21 em função da composição da formulação. A FIG. 4A mostra agregação em uma formulação sem ácido pentético (DTPA) ou polissorbato 80. A FIG. 4B mostra agregação em uma formulação com ácido pentético (DTPA) e polissorbato 80.
[051] A FIG. 5 mostra que PEG-FGF-21 em maior concentração sem PS80 tornou-se turvo depois de 24h em shaker orbital a 300 rpm (esquerda) ou agitação manual (wristaction shaking) por 6h (direita). A adição de polissorbato 80 entre 0,01% e 0,1% (em peso / vol) reduziu a turvação das amostras.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[052] A presente divulgação proporciona uma formulação farma- cêutica estabilizada compreendendo um polipeptídeo de fator de cres- cimento de fibroblasto 21 (FGF-21), por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21 (SEQ ID NO: 2). Observou- se que a presença de um quelante de cátion ácido aminopolicarboxí- lico, tal como DTPA, mitiga a oxidação de um ou mais resíduos de aminoácidos no polipeptídeo FGF-21, por exemplo, metioninas. A in- corporação de DTPA na formulação de FGF-21 também reduz a taxa de desamidação do polipeptídeo FGF-21 durante o armazenamento, e além disso reduz a taxa de agregação de alto peso molecular durante o armazenamento. Pode ser obtida estabilização adicional ajustando o pH da formulação para 7,1. Além disso, a formulação pode ser adicio- nalmente estabilizada adicionando um tensoativo tal como polissorbato
80.
[053] A divulgação também proporciona métodos para fabricar a formulação descrita, bem como formulações produzidas aplicando o método descrito. Também são proporcionados métodos de tratamento ou profilaxia de doenças associadas com fibrose, por exemplo, estea-
to-hepatite não alcoólica e diabetes, compreendendo a administração das formulações estabilizadas da divulgação a um sujeito que necessi- te dos mesmos. Definições
[054] De modo à presente divulgação poder ser mais prontamen- te entendida, são primeiros definidos alguns termos. Conforme usado neste requerimento, exceto caso expressamente proporcionado de modo diverso aqui, neste requerimento de patente, cada um dos ter- mos seguintes vai ter o significado estipulado abaixo. Definições adici- onais são estipuladas do início ao fim do requerimento.
[055] A divulgação inclui aspectos, nos quais exatamente um membro do grupo está presente em, é empregado em, ou é relevante de modo diverso para um dado produto ou processo. A divulgação in- clui aspectos, nos quais mais de um, ou todos os membros do grupo estão presentes em, são empregados em, ou são relevantes de modo diverso para um dado produto ou processo.
[056] As formas do singular "um", "uma" e "o", "a" incluem refe- rentes no plural a menos que o contexto claramente dite de modo di- verso. Os termos "um" (ou "uma"), bem como os termos "um ou mais," e "no mínimo um" podem ser usados de modo intercambiável aqui, neste requerimento de patente. Em alguns aspectos, o termo "um" ou "uma" significa "único." Em outros aspectos, o termo "um" ou "uma" inclui "dois ou mais" ou "múltiplos." Deste modo, por exemplo, referên- cia a um "FGF-21" ou "polipeptídeo FGF-21" é uma referência a uma ou mais proteínas semelhantes e inclui equivalentes das mesmas de conhecimento das pessoas com conhecimento regular da arte, e assim por diante.
[057] Além disso, "e/ou" onde usado aqui, neste requerimento de patente, deve ser tomado como divulgação específica de cada uma das duas características ou de cada um dos dois componentes especi-
ficados com ou sem o outro. Deste modo, o termo "e/ou" conforme usado em uma expressão tal como "A e/ou B" aqui, neste requerimen- to de patente, se destina a incluir "A e B," "A ou B," "A" (isolado), e "B" (isolado). Likewise, o termo "e/ou" conforme usado in a phrase such as "A, B, e/ou C" se destina a englobar cada um dos seguintes aspectos: A, B, e C; A, B, ou C; A ou C; A ou B; B ou C; A e C; A e B; B e C; A (isolado); B (isolado); e C (isolado).
[058] O termo "cerca de" conforme usado aqui, neste requeri- mento de patente, para um valor ou composição que esteja dentro de uma faixa de erro aceitável para o valor ou composição em particular conforme determinado por uma pessoa com conhecimento regular da arte, que vai depender em parte de como o valor ou composição é medido ou determinado, isto é, das limitações do sistema de medição. Por exemplo, "cerca de" pode significar dentro de 1 ou mais de 1 des- vio padrão para a prática na arte. Alternativamente, "cerca de" pode significar uma faixa de até 20%. Além do mais, particularmente com respeito a sistemas ou processos biológicos, os termos podem can significar até uma ordem de magnitude ou até 5 vezes um valor. Quando são proporcionados valores ou composições em particular no requerimento e nas reivindicações, a menos que determinado de modo diverso, o significado de "cerca de" deve ser presumido que esteja dentro de uma faixa de erro aceitável para aquele valor ou composição em particular. Quando o termo "cerca de" é usado em conjunto com um intervalo numérico, modifica a referida faixa estendendo os limites acima e abaixo dos valores numéricos estipulados. Deste modo, "cer- ca de 10 a 20" significa "cerca de 10 a cerca de 20." Em geral, o termo "cerca de" pode modificar um valor numérico acima e abaixo do valor determinado por uma variância de, por exemplo, 10 por cento, para cima ou para baixo (maior ou menor).
[059] A menos que definido de modo diverso, todos os termos técnicos e científicos usados aqui, neste requerimento de patente, têm o mesmo significado, conforme comumente entendido por uma pessoa com conhecimento regular da arte com a qual esta divulgação está relacionada. Por exemplo, o Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dic- tionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; e the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, proporiconam a um perito na arte um dicionário geral de muitos dos termos usados nesta divulgação.
[060] Deve ser entendido que, sempre que são descritos aspec- tos aqui, neste requerimento de patente, com a expressão "compreen- dendo," também são proporcionados de modo diverso aspectos análo- gos descritos em termos de "consistindo em" e/ou "consistindo essen- cialmente em".
[061] Unidades, prefixos, e símbolos são denotados em sua for- ma aceita pelo Sistema Internacional de Unidades (SI, Sistème Inter- national de Unites). Intervalos numéricos incluem os números que de- finem o intervalo. A menos que indicado de modo diverso, as sequên- cias de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orien- tação de amino para carbóxi. Os títulos proporcionados aqui, neste requerimento de patente, não são limitações dos vários aspectos da divulgação, os quais podem ser tidos por meio de referência à especi- ficação como um todo. Por conseguinte, os termos definidos imedia- tamente abaixo são mais plenamente definidos por meio de referência à especificação em sua totalidade.
[062] Aminoácidos são referidos aqui, neste requerimento de pa- tente, ou por seus símbolos de três letras de conhecimento geral ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela Commissão de No- menclatura Bioquímica IUPAC-IUB. A menos que indicado de modo diverso, as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação de amino para carbóxi.
[063] Agregação: O termo "agregação" se refere à tendência de um polipeptídeo, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 descrito aqui, neste requerimento de patente, para formar complexos ligados de mo- do não covalente com outras moléculas (tais como outras moléculas do mesmo polipeptídeo) formando deste modo complexos de alto peso molecular. Exemplos de métodos para mediar a formação de agrega- dos incluem cromatografia de exclusão de tamanho analítica conforme descrito nos Exemplos aqui, neste requerimento de patente. Quantida- des relativas de agregação podem ser determinadas com respeito a um composto de referência, por exemplo, para identificar um polipeptí- deo tendo agregação reduzida. Quantidades relativas de agregação também podem ser determinadas com respeito a uma formulação de referência, por exemplo, para identificar uma formulação na qual um polipeptídeo FGF-21 tem agregação reduzida.
[064] Substituição de aminoácido: O termo "substituição de ami- noácido" se refere a reposição de um resíduo de aminoácido presente em uma sequência de origem ou de referência (por exemplo, uma se- quência selvagem) com outro resíduo de aminoácido. Um aminoácido pode ser substituído em uma sequência de origem ou de referência (por exemplo, uma sequência de polipeptídeo selvagem), por exemplo, através de síntese químjica de peptídeos ou através de métodos re- combinantes conhecidos na arte. Por conseguinte, uma referência a uma "substituição na posição X" se refere à substituição de um amino- ácido presente na posição X com um resíduo de aminoácido alternati- vo. Em alguns aspectos, os padrões de substituição podem ser descri- tos de acordo com o esquema AnY, em que A é o código de letra úni- ca correspondente ao aminoácido presente naturalmente ou original- mente na posição n, e Y é o resíduo de aminoácido substituinte. Em outros aspectos, os padrões de substituição podem ser descritos de acordo com o esquema An(YZ), em que A é o código de letra única correspondente ao aminoácido presente que substitui o aminoácido presente naturalmente ou originalmente na posição n, e Y e Z são re- síduos de aminoácidos substituintes alternativos que podem substituir A.
[065] No contexto da presente divulgação, substituições (mesmo quando são referidas como substituição de aminoácido) são conduzi- das no nível do ácido nucleico, isto é, substituindo um resíduo de ami- noácido com um resíduo de aminoácido alternativo é conduzido substi- tuindo o códon codificando o primeiro aminoácido com um códon codi- ficando o segundo aminoácido.
[066] Aproximadamente: Conforme usado aqui, neste requeri- mento de patente, o termo "aproximadamente," conforme aplicado a um ou mais valores de interesse, se refere a um valor que é similar a um valor de referência declarado. Em alguns aspectos, o termo "apro- ximadamente" se refere a uma faixa de valores que se situam dentro de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ou menos em uma ou outra direção (maior do que ou menor do que) o valor de referência declarado a menos que declarado de modo diverso ou evidente de modo diverso a partir do contexto (exceto onde o número referido ve- nha a exceder 100% de um valor possível).
[067] Associado com: Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, com respeito a uma doença, o termo "associado com" sig- nifica que o sintoma, medição, característica, ou estado em questão é ligado ao diagnóstico, desenvolvimento, presença, ou progressão da- quela doença. Como associação pode ser ou não ligada causativa- mente à doença.
[068] Biologicamente ativa: O termo "biologicamente ativa" con- forme aplicado a uma molécula descrita aqui, neste requerimento de patente, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21, significa qualquer substância a qual pode afetar quaisquer propriedades físicas ou bio- químicas de um sistema biológico, caminho, molécula, ou interação em relação a um organismo vivo. Em particular, conforme usado aqui, neste requerimento de patente, moléculas biologicamente ativas inclu- em, mas não estão limitadas a, qualquer substância destinada para diagnóstico, cura, mitigação, tratamento, ou prevenção de doenças ou condições, por exemplo, doenças ou condições associadas com fibro- se, em seres humanos ou outros animais, ou para reforçar de modo diverso o bem estar físico ou mental de seres humanos ou animais.
[069] Substituição de aminoácido conservadora: Uma "substitui- ção de aminoácido conservadora" uma substituição de aminoácido na qual o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de amino- ácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de amino- ácidos tendo cadeias laterais similares têm sido definidas na arte, in- cluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, ou histi- dina), cadeias laterais acidíferas (por exemplo, ácido aspártico ou áci- do glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, ou cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, iso- leucina, prolina, fenilalanina, metionina, ou triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, ou histidina). Portanto, se um aminoácido em um polipeptídeo é substituí- do com outro aminoácido da mesma família de cadeias laterais, a substituição de aminoácido é considerada como sendo conservadora. Em outro aspecto, um trecho de aminoácidos pode ser substituída conservadoramente com um trecho estruturalmente similar que difere em ordem e/ou composição de membros da família de cadeias late- rais.
[070] Substituições de aminoácidos não conservadoras incluem aquelas nas quais (i) um resíduo tendo uma cadeia lateral eletropositi- va (por exemplo, Arg, His ou Lys) é substituído para, ou por, um resí- duo eletronegativo (por exemplo, Glu ou Asp), (ii) um resíduo hidrofí- lico (por exemplo, Ser ou Thr) é substituído para, ou por, um resíduo hidrofóbico (por exemplo, Ala, Leu, Ile, Phe ou Val), (iii) uma cisteína ou uma prolina é substituída para, ou por, qualquer outro resíduo, ou (iv) um resíduo tendo uma cadeia lateral volumosa hidrofóbica ou aro- mática (por exemplo, Val, His, Ile ou Trp) é substituído para, ou por, um tendo uma cadeia lateral menor (por exemplo, Ala ou Ser) ou ne- nhuma cadeia lateral (por exemplo, Gly).
[071] Também podem ser usadas outras substituições de amino- ácidos. Por exemplo, para o aminoácido alanina, uma substituição po- de ser tomada de qualquer uma de D-alanina, glicina, beta-alanina, L- cisteína e D-cisteína. Para lisina, uma substituição pode ser de qual- quer um de D-lisina, arginina, D-arginina, homo-arginina, metionina, D- metionina, ornitina, ou D-ornitina. De modo geral, substituições em re- giões funcionalmente importantes que se pode esperar que induzam modificações nas propriedades de polipeptídeos isolados são aquelas nas quais (i) um resíduo polar, por exemplo, serina ou treonina, é substituído para (ou por) um resíduo hidrofóbico, por exemplo, leucina, isoleucina, fenilalanina, ou alanina; (ii) um resíduo cisteína é substituí- do para (ou por) qualquer outro resíduo; (iii) um resíduo tendo uma ca- deia lateral eletropositiva, por exemplo, lisina, arginina ou histidina, é substituído para (ou por) um resíduo tendo uma cadeia lateral eletro- negativa, por exemplo, ácido glutâmico ou ácido aspártico; ou (iv) um resíduo tendo uma cadeia lateral volumosa, por exemplo, fenilalanina, é substituído para (ou por) um resíduo não tendo uma cadeia lateral semelhante, por exemplo, glicina. E a probabilidade de que uma das substituições não conservadoras precedentes possa alterar proprieda- des funcionais da proteína também se correlacionou com a posição da substituição com respeito a regiões funcionalmente importantes da proteína: por conseguinte, algumas substituições não conservadoras podem ter pouco ou nenhum efeito sobre propriedades biológicas.
[072] Conservados: Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "conservados" se refere a resíduos de aminoácidos de uma sequência polipeptídica, respectivamente, que são os resíduos de aminoácidos que ocorrem não alterados na mesma posição de du- as ou mais sequências sendo comparadas. Aminoácidos que são rela- tivamente conservados são aminoácidos que são conservados entre sequências mais relacionadas do que nucleotídeos ou aminoácidos que aparecem em outras partes nas sequências.
[073] Em alguns aspectos, diz-se que duas ou mais sequências são "completamente conservadas" ou "idênticas" se forem 100% idên- ticas uma com a outra. Em alguns aspectos, diz-se que duas ou mais sequências são "altamente conservadas" se forem no mínimo 70% idênticas, no mínimo 80% idênticas, no mínimo 90% idênticas, ou no mínimo 95% idênticas uma com a outra. Em alguns aspectos, diz-se que duas ou mais sequências são "altamente conservadas" se forem cerca de 70% idênticas, cerca de 80% idênticas, cerca de 90% idênti- cas, cerca de 95%, cerca de 98%, ou cerca de 99% idênticas uma com a outra. Em alguns aspectos, diz-se que duas ou mais sequências são "conservadas" se forem no mínimo 30% idênticas, no mínimo 40% idênticas, no mínimo 50% idênticas, no mínimo 60% idênticas, no mí- nimo 70% idênticas, no mínimo 80% idênticas, no mínimo 90% idênti- cas, ou no mínimo 95% idênticas uma com a outra. Em alguns aspec- tos, diz-se que duas ou mais sequências são "conservadsa" se forem cerca de 30% idênticas, cerca de 40% idênticas, cerca de 50% idênti- cas, cerca de 60% idênticas, cerca de 70% idênticas, cerca de 80% idênticas, cerca de 90% idênticas, cerca de 95% idênticas, cerca de 98% idênticas, ou cerca de 99% idênticas uma com a outra. Conser-
vação de sequência pode se aplicar ao comprimento inteiro de um po- linucleotídeo ou polipeptídeo ou a uma porção, região ou característica do mesmo.
[074] Desamidação: O termo "desamidação" se refere à tendên- cia de resíduos de aminoácidos dentro de um polipeptídeo para sofrer espontaneamente uma reação de desamidação, deste modo modifi- cando a estrutura química do aminoácido, e potencialmente afetando a função do polipeptídeo. Exemplos de métodos de medir a desamida- ção são descritos nos Exemplos aqui, neste requerimento de patente. A quantidade relativa de desamidação pode ser determinada com res- peito a um composto de referência, por exemplo, para identificar um polipeptídeo tendo desamidação reduzida. As quantidades relativas de desamidação também podem ser determinadas com respeito a uma formulação de referência, por exemplo, para identificar uma formula- ção na qual um polipeptídeo FGF-21 tem desamidação reducida.
[075] Doença associada com fibrose: O termo "doença associada com fibrose" inclui doenças, transtornos, e condições nas quais obser- vou-se que ocorre fibrose ou nas quais se sabe ou se imagina que fi- brose esteja associada com ou contribua para a etiologia da doença, a progressão, ou os sintomas, ou nas quais se sabe ou se imagina que fibrose ocorra à medida que a doença progride.
[076] A fibrose pode afetar um órgão ou tecido, tal como o pân- creas, o pulmão, o coração, os rins, o fígado, os olhos, o sistema ner- voso, a medula óssea, os linfonodos, o endomiocárdio, ou o retroperi- tônio. Exemplos de doenças associadas com fibrose incluem, mas não estão limitados a esteato-hepatite não alcoólica (NASH), fibrose hepá- tica, pré-cirrose, cirrose, doença pulmonar parenquimal difusa, fibrose cística, fibrose de pulmão ou pulmonar, fibrose maciça progressiva, fibrose pulmonar idiopática, fibrose de injeção, fibrose do rim ou renal, doença renal crônica, doença renal diabética, glomerulosclerose seg-
mentar focal, nefropatia membranosa, nefropatia por IgA, mielofibrose, falência cardíaca, falência cardíaca metabólica, fibrose cardíaca, fibro- se após cirurgia de catarata, catarata, cicatriz ocular, fibrose pancreá- tica, fibrose de pele, fibrose intestinal, estenoses intestinais, fibrose endomiocárdica, fibrose atrial, fibrose mediastinal, doença de Crohn, fibrose retroperitoneal, quelóide, fibrose sistêmica nefrogênica, escle- roderma, esclerose sistêmica, artrofibrose, síndrome de Peyronie, con- tratura de Dupuytren, neuropatia diabética, capsulite adesiva, doença hepática alcoólica, hepato esteatose, hepatite viral, doença biliar, he- mocromatose primária, cirrose relacionada com fármacos, cirrose crip- togênica, doença de Wilson, e, deficiência de alfa 1-antitripsina, doen- ça pulmonar intersticial (ILD), doença pulmonar fibrótica humana, de- generação macular, retinopatia retinal, retinopatia vítrea, fibrose do miocárdio, oftalmopatia de Grave, ergotismo induzido por fármacos, doença cardiovascular, aterosclerose / restenose, cicatrizes hipertróifi- cas, mielofibrose primária ou idiopática, e doença intestinal inflamató- ria (incluindo, porém sem limitação, colite colagenosa). Em alguns as- pectos, a doença associada com fibrose pode incluir fibrose hepática, fibrose do rim ou renal, fibrose do pulmão ou pulmonar e fibrose do coração ou cardíaca. Em alguns aspectos, a doença associada com fibrose pode ser fibrose hepática. Em alguns aspectos, a doença as- sociada com fibrose pode ser esteato-hepatite não alcoólica.
[077] Quantidade eficaz: Conforme usado aqui, neste requeri- mento de patente, o termo "quantidade eficaz" de uma formulação de FGF-21 descrita aqui, neste requerimento de patente, é a quantidade suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados, por exem- plo, resultados clínicos, e, como tal, uma "quantidade eficaz" depende do contexto no qual etá sendo aplicada. Por exemplo, no contexto de administrar um polipeptídeo FGF-21 que trata esteato-hepatite não al- coólica, uma quantidade eficaz do polipeptídeo FGF-21 é, por exem-
plo, uma quantidade suficiente para melhorar a gordura hepática, a lesão hepática ou a fibrose (por exemplo, uma redução na gordura he- pática, na lesão hepática ou na fibrose com respeito aos níveis em su- jeitos não tratados ou com respeito aos níveis no sujeito antes da ad- ministração do tratamento).
[078] Em alguns aspectos, uma quantidade eficaz de um polipep- tídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, para tratar esteato-hepatite não alcoólica pode modificar o nível de um ou mais biomarcadores de fibrose: por exemplo, diminuir os níveis séricos de Pro-C3; diminuir a ALT ou a AST; aumentar a adiponectina sérica; diminuir o LDL plasmático; aumentar o HDL plasmático; diminuir os níveis de triglicerídeos plasmáticos, ou qualquer combinação das mesmas, com respeito aos níveis em sujeitos não tratados ou com respeito aos níveis no sujeito antes da administração do tratamento.
[079] O termo "quantidade eficaz" pode ser usado de modo inter- cambiável com "dose eficaz," "quantidade terapeuticamente eficaz," ou "dose terapeuticamente eficaz."
[080] Atividade de FGF-21: O termo "atividade de FGF-21" se refere a no mínimo uma atividade biológica de um polipeptídeo FGF-
21. O termo "atividade biológica" se refere à capacidade de uma molé- cula, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 para afetar quaisquer pro- priedades físicas ou bioquímicas de um sistema biológico, caminho, molécula, ou interação com relação a um organismo, incluindo, mas não limitado a, vírus, bactérias, bacteriófago, transposon, príon, inse- tos, fungos, plantas, animais e seres humanos.
[081] Por exemplo, no contexto de um FGF-21 não modificado ou modificado, atividade biológica inclui qualquer uma das funções bioló- gicas realizadas pelo FGF-21. Exemplos de métodos para determinar se uma molécula possui no mínimo uma atividade biológica de FGF-21 selvagem (tal como o polipeptídeo FGF-21 selvagem de SEQ ID NO:
3) podem incluir quaisquer testes funcionais conhecidos na arte, inclu- indo os métodos descritos nos Exemplos 5 e 17 da Publ. do Requeri- mento de Patente U.S. No. 2017/0189486, a qual é aqui, a este reque- rimento de patente, incorporada por meio de referência em sua totali- dade.
[082] O nível relativo de atividade biológica pode ser determinado com respeito a um composto de referência, por exemplo, para identifi- car um polipeptídeo tendo atividade biológica ou tendo atividade bioló- gica suficientemente elevadas par aum uso terapêutico pretendido, por exemplo, tendo uma EC50 menos de 5 vezes, menos de 10 vezes, me- nos de 20 vezes, menos de 50 vezes, ou menos de 100 vezes maior do que a EC50 de um composto de referência. O nível relativo de ativi- dade biológica também pode ser determinado com respeito a uma formulação de referência, por exemplo, para identificar uma formula- ção na qual um polipeptídeo FGF-21 tenha atividade biológica ou te- nha atividade biológica suficientemente elevada para um uso terapêu- tico pretendido, por exemplo, tendo uma EC50 menos de 5 vezes, me- nos de 10 vezes, menos de 20 vezes, menos de 50 vezes, ou menos de 100 vezes maior do que a EC50 de um polipeptídeo FGF-21 na for- mulação de referência.
[083] O composto de referência descrito aqui, neste requerimento de patente, pode ser uma sequência de FGF-21 carecendo de uma modificação, tal como uma modificação descrita aqui, neste requeri- mento de patente. Por exemplo, o composto de referência pode ser FGF-21 selvagem ou a mesma sequência de polipeptídeo FGF-21 modificado sem um parceiro de fusão, por exemplo, sem PEG. Exem- plos de compostos de referência para PEG-FGF-21 incluem, sem limi- tação, o polipeptídeo FGF-21 selvagem de SEQ ID NO: 3, e o polipep- tídeo FGF-21 modificado de SEQ ID NO: 1.
[084] Em alguns aspectos, o composto de referência pode conter no mínimo um aminoácido codificado não naturalmente, o qual pode ser lighado a um encadeador, um polímero, uma molécula biologica- mente ativa, um peptídeo, um polipeptídeo, ou porção de extensão da meia-vida descrita aqui, neste requerimento de patente, (por exemplo, PEG). Em alguns aspectos, um composto de referência pode conter no mínimo um aminoácido codificado não naturalmente, o qual ñao pode ser ligado a um encadeador, um polímero, uma molécula biologi- camente ativa, um peptídeo, um polipeptídeo, ou uma porção de ex- tensão da meia-vida descrito aqui, neste requerimento de patente, (por exemplo, PEG). Em alguns aspectos, um composto de referência pode conter adicionais substituições, deleções, e/ou inserções de aminoáci- dos. Em alguns aspectos, a comparação pode ser realizada com uma forma peguilada ou não peguilada do polipeptídeo; no primeiro caso, a comparação pode ser realizada com um polipeptídeo compreendendo ou não compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente.
[085] Polipeptídeo FGF-21: O termo "Polipeptídeo FGF-21" se refere a polipeptídeo FGF-21 selvagem e polipeptídeo FGF-21 modifi- cado.
[086] Porção de extensão da meia-vida: O termo "porção de ex- tensão da meia-vida" se refere a uma porção farmaceuticamente acei- tável, um domínio, ou uma molécula ligada de modo covalente ("con- jugada" ou "fundida") a um polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um po- lipeptídeo FGF-21 modificado descrito aqui, neste requerimento de pa- tente, opcionalmente por meio de um aminoácido codificado não natu- ralmente, diretamente ou através de um encadeador, que previne ou mitiga degradação proteolítica in vivo ou ou outra modificação química que diminui a atividade do polipeptídeo FGF-21 modificado, aumenta a meia-vida, e/ou melhora ou altera outras propriedades farmacocinéti- cas ou biofísicas incluindo, mas não limitadas a aumento da taxa de absorção, redução da toxicidade, melhora da solubilidade, redução da agregação de proteína, aumento da atividade biológica e/ou seletivi- dade alvo do polipeptídeo FGF-21 modificado, aumento da manufatu- rabilidade, e/ou redução da imunogenicidade do polipeptídeo FGF-21 modificado, em comparação com um composto de referência, tal como uma forma não conjugada do polipeptídeo FGF-21 modificado ou do polipeptídeo FGF-21 selvagem.
[087] Identidade: Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "identidade" se refere à conservação de monômeros geral entre moléculas poliméricas, por exemplo, entre moléculas de polipeptídeos. O termo "idêntica", sem quaisquer qualificadores adicio- nais, por exemplo, a proteína A é idêntica à proteína B, implica que as sequêncis são 100% idênticas (100% de identidade de sequência). Descrever duas sequências como, por exemplo, "70% idênticas," é equivalente a descrever as mesmas como tendo, por exemplo, "70% de identidade de sequência."
[088] O cálculo da percentagem de identidade de duas sequên- cias polipeptídicas, por exemplo, pode ser realizado alinhando as duas sequências para fins de comparação ótima (por exemplo, podem ser introduzidos intervalos em uma ou em ambas de uma primeira e uma segunda sequências polipeptídicas para alinhamento ótimo e sequên- cias não idênticas podem ser desconsideradas para fins de compara- ção). Em alguns aspectos, o comprimento de uma sequência alinhada para fins de comparação é de no mínimo 30%, no mínimo 40%, no mí- nimo 50%, no mínimo 60%, no mínimo 70%, no mínimo 80%, no mí- nimo 90%, no mínimo 95%, ou 100% do comprimento da sequência de referência. Os aminoácidos nas posições de aminoácidos correspon- dentes são em seguida comparados.
[089] Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pe- lo mesmo aminoácido que a posição correspondente na segunda se- quência, então as moléculas são idênticas naquela posição. A percen-
tagem de identidade entre as duas sequências é uma função do núme- ro de posições idênticas partilhadas pelas sequências, tendo em conta o número de intervalos, e o comprimento de cada intervalo, o qual pre- cisa ser introduzido para alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação de sequências e a determinação da percentagem de identidade entre duas sequências podem ser realizadas usando um algoritmo matemático.
[090] Programas de software adequados estão disponíveis a par- tir de várias fontes, e para alinhamento tanto das sequências de prote- ínas quanto de nucleotídeos. Um programa adequado para determinar a percentagem de identidade de sequência é bl2seq, parte da suite de programa BLAST disponível no site da Internet do National Center for Biotechnology Information BLAST do governo dos Estados Unidos (blast.ncbi.nlm.nih.gov). Bl2seq realiza uma comparação entre duas sequências usando ou o algoritmo BLASTN ou o BLASTP. BLASTN é usado para comparar sequências de ácido nucleico, ao passo que BLASTP é usado para comparar sequências de aminoácidos. Outros programas adequados são, por exemplo, Needle, Stretcher, Water, ou Matcher, parte da suite EMBOSS de programas de bioinformática e também disponíveis no European Bioinformatics Institute (EBI) em www.ebi.ac.uk/Tools/psa. Alinhamentos de sequências podem ser conduzidos usando métodos conhecidos na arte tais como MAFFT, Clustal (ClustalW, Clustal X ou Clustal Omega), MUSCLE, etc.
[091] Diferentes regiões dentro de uma única sequência alvo de polipeptídeo que alinha com uma sequência de referência de polipep- tídeo pode ter cada uma sua própria percentagem de identidade de sequência. Deve ser observado que o valor da percentagem de identi- dade de sequência é arredondado para até o décimo mais próximo. Por exemplo, 80,11, 80,12, 80,13, e 80,14 são arredondados para bai- xo para 80,1, enquanto 80,15, 80,16, 80,17, 80,18, e 80,19 são arre-
dondados para cima para 80,2. Também deve ser observado que o valor do comprimento vai ser sempre um inteiro.
[092] Em alguns aspectos, a percentagem de identidade (%ID) ou de uma primeira sequência de aminoácidos para uma segunda se- quência de aminoácidos é calculada como %ID = 100 x (Y/Z), onde Y é o número de resíduos de aminoácidos pontuados como correspon- dências idênticas no alinhamento da primeira e da segunda sequên- cias (conforme alinhado por inspeção visual ou por um programa de alinhamento de sequências em particular) e Z é o número total de re- síduos na segunda sequência. Se o comprimento de uma primeira se- quência for maior do que o da segunda sequência, a percentagem de identidade da primeira sequência para a segunda sequência vai ser maior do que a percentagem de identidade da segunda sequência pa- ra a primeira sequência.
[093] Uma pessoa versada na arte vai reconhecer que a geração de um alinhamento de sequências para o cálculo de uma percentagem de identidade de sequência não é limitada a comparções binárias de sequência-sequência exclusivamente orientadas pelos dados da se- quência primária. Além disso será reconhecido que podem ser gera- dos alinhamentos de sequências integrando dados de sequências com dados de fontes heterogêneas tais como dados estruturais (por exem- plo, estruturas de proteínas cristalográficas), dados funcionais (por exemplo, localização de mutações), ou dados filogenéticos. Um pro- grama adequado que integra dados heterogêneos para gerar um ali- nhamento de múltiplas sequências é T-Coffee, disponível em www.tcoffee.org, e alternativamente disponível, por exemplo, na EBI. Também será reconhecido que o alinhamento final usado para calcular a percentagem de identidade de sequência pode ser selecionado quer automaticamente ou manualmente.
[094] Degradação proteolítica in vivo: O termo "degradação pro-
teolítica in vivo" se refere à clivagem de um polipeptídeo quando intro- duzido dentro de um sistema vivo (por exemplo, quando injetado den- tro de um organismo) o qual pode resultar de proteases que ocorrem no referido organismo. Proteólise potencialmente pode afetar a ativi- dade biológica ou a meia-vida de um polipeptídeo. Por exemplo, FGF- 21 selvagem pode sofrer clivagem no término carbóxi, resultando em um polipeptídeo truncado, inativo. Um exemplo de método para medir a proteólise in vivo de FGF-21 é o ensaio imunossorvente eletroquimi- luminescente (ECLIA) à base de MSD (Meso Scale Discovery) descrito no Exemplo 10 da Publ. do Requerimento de Patente U.S. No. US2017/0189486. A quantidade relativa de proteólise in vivo ou in vitro pode ser determinada com respeito a um composto de referência, por exemplo, para identificar um polipeptídeo tendo proteólise in vivo dimi- nuída. A quantidade relativa de proteólise in vivo também pode ser de- terminada com respeito a uma formulação de referência, isto é, para identificar uma formulação na qual o polipeptídeo FGF-21 tem proteóli- se in vitro diminuída.
[095] Isolada: Conforme usado aqui, neste requerimento de pa- tente, o termo "isolada" se refere a uma substância ou entidade (por exemplo, um polipeptídeo) que tenha sido separada de no mínimo al- guns dos componentes com os quais foi associada (quer na natureza ou em uma configuração experimental). Substâncias isoladas (por exemplo, proteínas) podem ter níveis variáveis de pureza em referên- cia às substâncias a partir das quais foram associadas.
[096] Ligada: Os termos "ligada" ou "anexada" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a uma sequência de aminoácidos unida de modo covalente ou não covalente a uma molé- cula, por exemplo, um polímero hidrossolúvel. O termo "ligada" signifi- ca não somente uma fusão ou uma concatenação de uma sequência de aminoácidos (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21) com uma se-
gunda sequência de aminoácidos (por exemplo, um prolongador da meia-vida da albumina), no término carbóxi ou no término amino. Também inclui a inserção de uma sequência de aminoácidos inteira (por exemplo, um prolongador da meia-vida XTEN) dentro de quais- quer dois aminoácidos em uma segunda sequência de aminoácidos (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21). Em alguns aspectos, a liga- ção pode ocorrer entre uma cadeia lateral de um aminoácido em uma primeira sequência de aminoácidos (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21) e uma segunda molécula (por exemplo, uma segunda se- quência de aminoácidos ou um polímero solúvel tal como PEG). No contexto da presente divulgação, os termos "fundidas" ou "fusão" indi- cam que no mínimo duas cadeias polipeptídicas foram ligadas opera- cionalmente e expressas de maneira recombinante. Em alguns aspec- tos, duas cadeias polipeptídicas podem ser "fundidas" em conseqüên- cia de síntese química. No contexto da presente divulgação, os termos "conjugado" ou "conjugação" denotam que duas entidades molecula- res (por exemplo, dois polipeptídeos, ou um polipeptídeo e um políme- ro tal como PEG) foram ligadas quimicamente.
[097] Polipeptídeo FGF-21 modificado: Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "polipeptídeo FGF-21 modificado," "fa- tor de crescimento de fibroblasto 21 modificado" ou "FGF-21 modifica- do" e formas não hifenadas do mesmo são usados de modo intercam- biável e vão incluir os polipeptídeos e as proteínas que diferem de FGF-21 selvagem (por exemplo, FGF-21 humano selvagem de SEQ ID NO: 3) e tipicamente têm no mínimo uma atividade biológica de um fator de crescimento de fibroblasto 21, bem como análogos de FGF- 21, isoformas de FGF-21, miméticos de FGF-21, fragmentos de FGF- 21, proteínas de FGF-21 híbridas, proteínas de fusão, oligômeros e multímeros, homólogos, variantes de padrões de glicosilação, varian- tes, variantes de emenda, e muteínas dos mesmos, independente da atividade biológica dos mesmos. Polipeptídeos FGF-21 modificados englobados por esta definição são descritos em mais detalhes abaixo.
[098] Mutação: No conteúdo da presente divulgação, os termos "mutação" e "substituição de aminoácido" conforme definido acima (al- gumas vezes referidos simplesmente como uma "substituição") são considerados intercambiáveis.
[099] Aminoácido codificado não naturalmente: Um "aminoácido codificado não naturalmente" se refere a um aminoácido que é não um dos 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina ou selenocisteína. Outros termos que podem ser usados de maneira sinônima com o termo "aminoácido codificado não naturalmente" são "aminoácido não natu- ral," "aminoácido não natural," "aminoácido que ocorre não natural- mente," e várias versões hifenadas e não hifenadas do mesmo. O ter- mo "aminoácido codificado não naturalmente" também inclui, porém não está limitado a, aminoácidos que ocorrem por modificação (por exemplo, modificações pós-translacionais) de um aminoácido codifica- do naturalmente (incluindo, porém sem limitação, os 20 aminoácidos comuns) mas não são os mesmo incorporados naturalmente em uma cadeia de polipeptídeo em crescimento pelo complexo de translação. Exemplos de semelhantes aminoácidos codificados não naturalmente incluem, mas não estão limitados a, N-acetilglucosaminil-L-serina, N- acetilglucosaminil-L-treonina, e O-fosfotirosina. Em um aspecto espe- cífico da presente divulgação, um aminoácido codificado não natural- mente é para-acetil-L-fenilalanina.
[0100] Paciente: Conforme usado aqui, neste requerimento de pa- tente, "paciente" se refere a um sujeito que pode procurar ou estar precisando de tratamento, requerer tratamento, está recebendo trata- mento, vai receber tratamento, ou um sujeito que esteja sob os cuida- dos de um profissional treinado para uma doença ou condição em par- ticular.
[0101] Composição farmacêutica: O termo "composição farmacêti- ca" se refere a uma preparação a qual está em uma forma tal que permite que a atividade biológica do ingrediente ativo (um polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) seja eficaz, e a qual não contém componentes adicio- nais (por exemplo, excipientes e água) os quais sejam inaceitavelmen- te tóxicos para um sujeito ao qual a composição seria administrada. A composição referida pode ser estéril.
[0102] Farmaceuticamente aceitável: A expressão "farmaceutica- mente aceitável" é empregada aqui, neste requerimento de patente, para se referir aos compostos, materiais, composições, e/ou formas de dosagem que, dentro do âmbito do bom critério médico, são adequa- dos para uso em contato com os tecidos de seres humanos e animais sem excessiva toxicidade, irritação, reação alérgica, ou outro problema ou complicação, proporcional com uma razoável proporção de risco / benefício. Em geral, a aprovação por uma agência reguladora dos go- vernos Federal ou estaduais (ou o fato de estar listada na Farmaco- péia dos Estados Unidos ou em outra farmacopéia reconhecida de modo geral) para uso em animais, e mais particularmente em seres humanos, implica que esses compostos, materiais, composições, e/ou formas de dosagem são farmaceuticamente aceitáveis. Compostos, materiais, composições, e/ou formas de dosagem que são aceitos de modo geral como seguros para fins terapêuticos são "terapeuticamen- te aceitáveis."
[0103] Excipientes farmaceuticamente aceitáveis: A expressão "excipiente farmaceuticamente aceitável," conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a qualquer ingrediente diferente dos compostos ativos descritos aqui, neste requerimento de patente, (por exemplo, um veículo capaz de suspender ou dissolver o composto ativo) e tendo as propriedades de serem substancialmente não tóxicas e não inflamatórias em um sujeito. Excipientes podem incluir, por exemplo, quelantes, tensoativos, agentes de tamponamento, regulado- res osmóticos, antioxidantes, emulsificantes, enchimentos (diluentes), preservantes, sorventes, agentes de suspensão ou de dispersão, ado- çantes, e águas de hidratação. Excipientes que são aceitos de modo geral como seguros para fins terapêuticos são "excipientes terapeuti- camente aceitáveis."
[0104] Sais farmaceuticamente aceitáveis: A presente divulgação também inclui sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos des- critos aqui, neste requerimento de patente. Conforme usado aqui, nes- te requerimento de patente, "sais farmaceuticamente aceitáveis" se refere a derivados dos compostos descritos em que o composto de origem é modificado convertendo uma ácido porção de ácido ou base existente para sua forma de sal (por exemplo, reagindo o grupo de ba- se livre com um ácido orgânico adequado). Exemplos de sais farma- ceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, sais mi- nerais ou de ácidos orgânicos de resíduos básicos tais como aminas; sais de álcali ou orgânicos de resíduos acidíferos tais como ácidos carboxílicos; e semelhantes.
[0105] Polipeptídeo: Os termos "polipeptídeo," "peptídeo," e "prote- ína" são usados de modo intercambiável aqui, neste requerimento de patente, para referir a polímeros de aminoácidos de qualquer compri- mento. O polímero pode compreender aminoácidos modificados. Os termos também englobam um polímero de aminoácido que tenha sido modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligações de dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforila- ção, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjuga- ção com um componente de marcação. Também são incluídos dentro da definição, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análo- gos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não natu-
rais tais como homocisteína, ornitina, p-acetilfenilalanina, D- aminoácidos, e creatina), bem como outras modificações conhecidas na arte.
[0106] O termo, conforme usado aqui, neste requerimento de pa- tente, se refere a proteínas, polipeptídeos, e peptídeos de qualquer tamanho, estrutura, ou função. Polipeptídeos incluem produtos genéti- cos, polipeptídeos que ocorrem naturalmente, polipeptídeos sintéticos, homólogos, ortólogos, parálogos, fragmentos e outros equivalentes, variantes, e análogos dos precedentes. Um polipeptídeo pode ser um único polipeptídeo ou pode ser um complexo multimolecular tal como um dímero, um trímero ou um tetrâmero. Também podem compreen- der polipeptídeos de cadeia única ou multicadeia. Mais comumente ligações de dissulfeto são encontradas em polipeptídeos multicadeia. O termo polipeptídeo também pode se aplicar a polímeros de aminoá- cido nos quais um ou mais resíduos de aminoácidos são um análogo químico artificial de um aminoácido que ocorre naturalmente corres- pondente. Em alguns aspectos, um "peptídeo" pode ter menos de 50 aminoácidos de comprimento ou ter 50 aminoácidos de comprimento, por exemplo, cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ou 50 aminoá- cidos de comprimento.
[0107] Prevenir: Conforme usado aqui, neste requerimento de pa- tente, o termo "prevenir" se refere a retardar parcialmente ou comple- tamente o início de uma doença, distúrbio e/ou condição; retardar par- cialmente ou completamente o início de um ou mais sintomas, caracte- rísticas, ou manifestações clínicas de uma doença, distúrbio, e/ou condição em particular; retardar parcialmente ou completamente o iní- cio de um ou mais sintomas, características, ou manifestações de uma doença, distúrbio, e/ou condição em particular; retardar parcialmente ou completamente a progressão de uma doença, distúrbio, e/ou condi- ção em particular; e/ou diminuir o risco de desenvolver patologia asso-
ciada com a doença, distúrbio, e/ou condição. Em alguns aspectos, a formulação farmacêutica descrita no presente requerimento pode ser usada para prevenir o início, prevenir os sintomas, ou prevenir compli- cações de doenças ou condições associadas com fibrose tais como esteato-hepatite não alcoólica ou diabetes.
[0108] Profilática: Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "profilática" se refere a um fármaco ou curso de ação usado para prevenir o início de uma doença ou condição, ou para prevenir ou retardar um sintoma de uma doença ou condição associada com fibro- se, por exemplo, esteato-hepatite não alcoólica. Em algum aspecto, as formulações farmacêuticas descritas no presente requerimento podem ser usadas profilaticamente.
[0109] Profilaxia: Conforme usado aqui, neste requerimento de pa- tente, uma "profilaxia" se refere a uma medida tomada para manter a saúde e prevenir ou retardar o início de uma doença ou condição as- sociada com fibrose, por exemplo, esteato-hepatite não alcoólica ou diabetes, ou para prevenir ou retardar sintomas associados com uma doença ou condição.
[0110] Recombinante: Um polipeptídeo ou uma proteína "recombi- nante" se refere a um polipeptídeo ou a uma proteína produzido por meio de tecnologia de DNA recombinante. Os polipeptídeos e proteí- nas produzidos de maneira recombinante expressos em células hos- pedeiras manipulados são considerados isolados para o fim da divul- gação, assim como são polipeptídeos nativos ou recombinantes os quais tenham sido separados, fracionados, ou parcialmente ou subs- tancialmente purificados por qualquer técnica adequada. Os polipeptí- deos FGF-21 descritos aqui, neste requerimento de patente, podem ser produzidos de maneira recombinant usando métodos conhecidos na arte. As proteínas e os peptídeos descritos aqui, neste requerimen- to de patente, também podem ser sintetizados quimicamente.
[0111] Similaridade: Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "similaridade" se refere à relação geral entre molécu- las poliméricas, por exemplo, entre moléculas de polipeptídeo. O cál- culo da percentagem de similaridade de moléculas polimeéicas uma com a outra pode ser realizado da mesma maneira que um cálculo de percentagem de identidade, exceto que o cálculo da percentagem de similaridade leva em conta substituições conservadorasa conforme é entendido na arte.
[0112] Solubilidade: O termo "solubilidade" se refere à quantidade de uma substância que pode se dissolver em outra substância, por exemplo, a quantidade de um polipeptídeo FGF-21 não modificado ou modificado que pode se dissolver em uma solução aquosa. Um exem- plo de método para medir a solubilidade de um polipeptídeo FGF-21 não modificado ou modificado é o teste de solubilidade de fluxo de tampão descrito no Exemplo 8 da Publ. do Requerimento de Patente U.S. No. US2017/0189486. A solubilidade relativa pode ser determina- da com respeito a um composto de referência, por exemplo, para iden- tificar um polipeptídeo tendo solubilidade aumentada. Em alguns as- pectos, a solubilidade relativa pode ser determinada com respeito a uma formulação de referência, por exemplo, para identificar uma for- mulação na qual o polipeptídeo tem solubilidade aumentada.
[0113] Sujeito: Por "sujeito" ou "indivíduo" ou "animal" ou "mamífe- ro," se indica qualquer sujeito, particularmente um sujeito mamífero, para o qual se deseja diagnóstico, prognóstico, ou terapia. Sujeitos mamíferos incluem, mas não estão limitados a, seres humanos, ani- mais domésticos, animais de fazenda, animais de zoológico, animais esportivos, animais de estimação tais como cães, gatos, porquinhos da índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, gado, vacas; primatas tais como símios, macacos, orangotangos, e chimpanzés; canídeos tais como cães e lobos; felinos tais como gatos, leões, e tigres; equi-
nos tais como cavalos, jumentos, e zebras; ursos, animais de alimento tais como vacas, porcos, e carneiros; ungulados tais como cervos e girafas; roedores tais como camudongos, ratos, hamsters e porquinhos da índia; e assim por diante. Em alguns aspectos, oe mamífero é um ser humano. Em outros aspectos, um sujeito é um paciente humano. Em um aspecto particular, um sujeito é um paciente humano ou célu- las do mesmo quer in vivo, in vitro ou ex vivo, receptivos para os mé- todos descritos aqui, neste requerimento de patente.
[0114] Sofrendo de: Um indivíduo que esteja "sofrendo de" uma doença, distúrbio, e/ou condição foi diagnosticado com ou apresenta um ou mais sintomas da doença, distúrbio, e/ou condição. Em alguns aspectos, as formulações farmacêuticas descritas aqui, neste requeri- mento de patente, podem ser administradas a um sujeito sofrendo de uma doença ou condição associada com fibrose tais como esteato- hepatite não alcoólica ou diabetes.
[0115] Suscetível a: Um indivíduo que é "suscetível a" uma doen- ça, distúrbio, e/ou condição que não tenha sido diagnosticado com e/ou possa não apresentar sintomas da doença, distúrbio, e/ou condi- ção mas tem uma propensão para desenvolver uma doença ou seus sintomas. Em alguns aspectos, um indivíduo que é suscetível a uma doença, distúrbio, e/ou condição (por exemplo, câncer) pode ser ca- racterizado por um ou mais dos seguintes: (1) uma mutação genética associada com o desenvolvimento da doença, distúrbio, e/ou condi- ção; (2) um polimorfismo genético associado com o desenvolvimento da doença, distúrbio, e/ou condição; (3) aumento e/ou diminuição da expressão e/ou atividade de uma proteína e/ou um ácido nucleico as- sociado com a doença, distúrbio, e/ou condição; (4) hábitos e/ou esti- los de vida associados com o desenvolvimento da doença, distúrbio, e/ou condição; (5) um histórico familiar da doença, distúrbio, e/ou con- dição; e (6) exposição a e/ou infecção com um micro-organismo asso-
ciado com o desenvolvimento da doença, distúrbio, e/ou condição.
[0116] Em alguns aspectos, um indivíduo que é suscetível a uma doença, distúrbio, e/ou condição vai desenvolver a doença, distúrbio, e/ou condição. Em alguns aspectos, um indivíduo que é suscetível a uma doença, distúrbio, e/ou condição não vai desenvolver a doença, distúrbio, e/ou condição. Em alguns aspectos, as formulações farma- cêuticas descritas aqui, neste requerimento de patente, podem ser administradas a um sujeito suscetível a uma doença ou condição as- sociada com fibrose tal como esteato-hepatite não alcoólica ou diabe- tes.
[0117] Agente Terapêutico: Os termos "agente terapêutico" ou "agente" se refere a uma entidade molecular que, quando administrada a um sujeito, tem um efeito terapêutico, diagnóstico, e/ou profilático e/ou provoca um efeito desejado biológico e/ou farmacológico. Por exemplo, em alguns aspectos, um polipeptídeo FGF-21 descrito aqui, neste requerimento de patente, (por exemplo, PEG-FGF-21) pode ser um agente terapêutico. Em alguns aspectos, um agente é outra molé- cula a qual é co-administrada como parte de uma terapia de combina- ção com no mínimo um dos polipeptídeos FGF-21 descritos aqui, nes- te requerimento de patente.
[0118] Quantidade terapeuticamente eficaz: Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "quantidade terapeuticamente eficaz" significa uma quantidade de um agente a ser liberado (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 descrito aqui, neste requerimento de patente, ou uma formulação compreendendo the polipeptídeo) que é suficiente, quando administrada a um sujeito sofrendo de ou suscetí- vel a uma infecção, doença, distúrbio, e/ou condição, para tratar, me- lhorar sintomas de, diagnosticar, prevenir, e/ou retardar o início da in- fecção, doença, distúrbio, e/ou condição. De modo geral, espera-se que a administração da quantidade terapeuticamente eficaz resulte em um resultado terapeuticamente eficaz.
[0119] Resultado terapeuticamente eficaz: Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "resultado terapeuticamente eficaz" significa um resultado que é suficiente em um sujeito sofrendo de ou suscetível a uma infecção, doença, distúrbio, e/ou condição, pa- ra tratar, melhorar sintomas de, diagnosticar, prevenir, e/ou retardar o início da infecção, doença, distúrbio, e/ou condição.
[0120] Tratar, tratamento, terapia: Conforme usado aqui, neste re- querimento de patente, os termos "tratar" ou "tratamento" ou "terapia" ou variantes gramaticais dos mesmos se referem a parcialmente ou completamente, prevenir, aliviar, melhorar, apirmorar, atenuar, retardar o início de, inibir a progressão de, reduzir a gravidade de, e/ou reduzir a incidência de um ou mais sintomas ou características de uma doen- ça ou condição associada com fibrose, por exemplo, esteato-hepatite não alcoólica ou diabetes. Por exemplo, "tratar" uma doença associada com fibrose pode se referir a prevenir sintomas, melhorar sintomas, retardar o início da doença ou condição ou seus sintomas, etc. Pode ser administrado tratamento a um sujeito que não apresente sinais de uma doença, distúrbio, e/ou condição e/ou a um sujeito que apresente somente sinais precoces de uma doença, distúrbio, e/ou condição para o fim de diminuir o risco de desenvolver patologia associada com a doença, distúrbio, e/ou condição.
[0121] ug, uM, uL: Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, os termos "ug," "uM," e "uL" são usados de modo intercambi- ável com "μg," "μΜ," e "μL" respectivamente.
[0122] Polímero hidrossolúvel: Conforme usado aqui, neste reque- rimento de patente, o termo "polímero hidrossolúvel" se refere a qual- quer polímero que seja solúvel em solventes aquosos. A ligação de polímeros hidrossolúveis aos polipeptídeos FGF-21 modificados pode resultar em modificações incluindo, porém sem limitação, meia-vida sérica (in vivo) aumentada ou modulada, ou meia-vida terapêutica au- mentada ou modulada em relação à forma não modificada, imunogeni- cidade ou toxicidade modulada, características de associação física moduladas, tais como agregação e formação de multímeros, ligação alterada a receptores, ligação alterada a um ou mais parceiros de liga- ção, e altered dimerização ou multimerização de receptores alterada.
[0123] O polímero hidrossolúvel pode ter ou não sua própria ativi- dade biológica, e pode ser utilizado como um encadeador para anexar FGF-21 modificado a outras substâncias, incluindo, mas não limitados a, um ou mais polipeptídeos FGF-21 não modificados ou modificados, ou uma ou mais moléculas biologicamente ativas. Polímeros adequa- dos incluem, mas não estão limitados a, polietileno glicol, propionalde- ído de polietileno glicol, mono C1-C10 alcóxi ou arilóxi derivados dos mesmos (descritos na Pat. U.S. No. 5.252.714 a qual é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência), mono- metoxi-polietileno glicol, PEG discreto, polivinil pirrolidona, álcool poli- vinílico, poliaminoácidos, anidrido maléico de éter divinílico, N-(2- Hidroxipropil)-metacrilamida, dextrano, derivados de dextrano incluindo sulfato de dextrano, polipropileno glicol, copolímero de óxido de poli- propileno / óxido de etileno oxide, poliol polioxietilado, heparina, frag- mentos de heparina, polissacarídeos, oligossacarídeos, glicanos, celu- lose e derivados de celulose, incluindo, mas não limitados a metil celu- lose e carboximetil celulose, amido e derivados de amido, polipeptí- deos, polialquileno glicol e derivados dos mesmos, copolímeros de po- lialquileno glicóis e derivados dos mesmos, éteres etílicos de polivinila, e alfa-beta-poli[(2-hidroxietil)-DL-aspartamida, e semelhantes, ou mis- turas dos mesmos. Exemplos de semelhantes polímeros hidrossolú- veis incluem, mas não estão limitados a, polietileno glicol e albumina sérica.
[0124] Vários aspectos da divulgação são descritos em detalhes adicionais nas subseções que se seguem. I. Formulações de FGF-21
[0125] A presente divulgação proporciona formulações farmacêuti- cas compreendendo um polipeptídeo de fator de crescimento de fi- broblasto 21 (FGF-21), por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modifi- cado, tal como PEG-FGF-21, e um quelante de cátion ácido aminopo- licarboxílico, por exemplo, ácido dietilenotriaminapenta-acético (DTPA), em que as formulações têm estabilidade aprimorada em com- paração com uma formulação de referência, isto é, uma formulação correspondente contendo os mesmos componentes exceto que não contém o quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico.
[0126] Os termos "quelante" ou "quelante de cátion" são intercam- biáveis e se referem a qualquer substância que tenha capacidade de remover um íon de metal de um sistema de solução formando um no- vo íon complexo que tenha propriedades químicas diferentes das pro- priedades químicas do íon de metal original. Em particular, os quelan- tes de cátion descritos aqui, neste requerimento de patente, são que- lantes que se ligam especificamente a metais divalentes, por exemplo, Ca++.
[0127] Em alguns aspectos, as formulações farmacêuticas descri- tas aqui, neste requerimento de patente, apresentam uma ou mais me- lhoras na estabilidade, por exemplo, uma menor taxa de desamidação, e/ou uma menor taxa de agregação. Por exemplo, a inclusão de um quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico, tal como DTPA na for- mulação farmacêutica pode reduzir a taxa de desamidação do polipep- tídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) quando armazenada em uma determinada tempe- ratura (por exemplo, 40oC) por um determinado período de tempo (por exemplo, 1 mês) com respeito à formulação de referência.
[0128] Em alguns aspectos, o quelante de cátion ácido aminopoli-
carboxílico (por exemplo, DTPA) pode reduzir a taxa de desamidação de um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) em uma formulação farmacêutica armazenada em cerca de 25 ºC, em cerca de 30 ºC, em cerca de 35 ºC, em cerca de 40 ºC, ou em cerca de 45ºC com respeito à formula- ção de referência. Em alguns aspectos, o quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico (por exemplo, DTPA) pode reduzir a taxa de de- samidação de um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) em uma formulação far- macêutica armazenada em uma temperatura acima de 25 ºC, acima de 30 ºC, acima de 35 ºC, cerca de 40 ºC, ou cerca de 45ºC com res- peito à formulação de referência.
[0129] Em alguns aspectos, o quelante de cátion ácido aminopoli- carboxílico (por exemplo, DTPA) pode reduzir a taxa de desamidação de um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) em uma formulação farmacêutica armazenada entre cerca de 20 ºC e cerca de 25 ºC, cerca de 25 ºC e cerca de 30 ºC, cerca de 30 ºC e cerca de 35 ºC, ou cerca de 40 ºC e cerca de 45 ºC com respeito à formulação de referência.
[0130] Em alguns aspectos, o quelante de cátion ácido aminopoli- carboxílico (por exemplo, DTPA) pode reduzir a taxa de desamidação de um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) em uma formulação farmacêutica em uma temperatura ou em uma faixa de temperatura descrita acima depois de armazenamento por cerca de 1 semana, cerca de 2 sema- nas, cerca de 3 semanas, cerca de 1 mês, cerca de 2 meses, cerca de 3 meses, ou cerca de 4 meses com respeito à formulação de referên- cia. Em um aspecto específico, o quelante de cátion ácido aminopoli- carboxílico (por exemplo, DTPA) pode reduzir a taxa de desamidação de um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) em uma formulação farmacêutica armazenada a 40 ºC por cerca de um mês com respeito à formulação de referência.
[0131] Em alguns aspectos, o quelante de cátion ácido aminopoli- carboxílico (por exemplo, DTPA) pode reduzir a taxa de agregação de alto peso molecular (HMW) de um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) em uma formulação farmacêutica armazenada em cerca de 25 ºC, em cerca de 30 ºC, em cerca de 35 ºC, em cerca de 40 ºC, ou em cerca de 45ºC com respeito à formulação de referência. Em alguns aspectos, o que- lante de cátion ácido aminopolicarboxílico (por exemplo, DTPA) pode reduzir a taxa de agregação de alto peso molecular de um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) em uma formulação farmacêutica armazenada em uma temperatura acima de 25 ºC, acima de 30 ºC, acima de 35 ºC, cerca de 40 ºC, ou cerca de 45ºC com respeito à formulação de referência.
[0132] Em alguns aspectos, o quelante de cátion ácido aminopoli- carboxílico (por exemplo, DTPA) pode reduzir a taxa de agregação de alto peso molecular de um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um po- lipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) em uma formu- lação farmacêutica armazenada entre cerca de 20 ºC e cerca de 25 ºC, cerca de 25 ºC e cerca de 30 ºC, cerca de 30 ºC e cerca de 35 ºC, ou cerca de 40 ºC e cerca de 45 ºC com respeito à formulação de refe- rência.
[0133] Em alguns aspectos, o quelante de cátion ácido aminopoli- carboxílico (por exemplo, DTPA) pode reduzir a taxa de agregação de alto peso molecular de um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um po- lipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) em uma formu- lação farmacêutica em uma temperatura ou em uma faixa de tempera- tura descrita acima depois de armazenamento por cerca de 1 semana,
cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 1 mês, cerca de 2 meses, cerca de 3 meses, ou cerca de 4 meses com respeito à formu- lação de referência. Em um aspecto específico, o quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico (por exemplo, DTPA) pode reduzir a taxa de agregação de alto peso molecular de um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) em uma formulação farmacêutica armazenada a 40 ºC por cerca de um mês com respeito à formulação de referência.
[0134] Em alguns aspectos, o quelante de cátion ácido aminopoli- carboxílico, por exemplo, DTPA, previne ou mitiga a oxidação de um ou mais aminoácidos, por exemplo, metioninas, no polipeptídeo FGF- 21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG- FGF-21). Em aspectos particulares, o quelante de cátion ácido amino- policarboxílico, por exemplo, DTPA, previne ou mitiga a oxidação do aminoácido 1 e/ou do aminoácido 169 de SEQ ID NO: 3 (ou os amino- ácidos correspondentes em SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou qual- quer outro polipeptídeo FGF-21) a 25 ºC e/ou 40 ºC.
[0135] Em alguns aspectos específicos, o quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico é DTPA. Ácido pentético ou ácido dietilenotriami- napenta-acético (DTPA) é um ácido aminopolicarboxílico que consiste em uma espinha dorsal de dietilenotriamina com cinco grupos de car- boximetila. A base conjugada de DTPA tem uma alta afinidade para cátions de metal. Deste modo, o penta-ânion DTPA5− é potencialmente um ligante octadentado assumindo que cada centro de nitrogênio e cada grupo COO− conta como um centro para coordenação. As cons- tantes de formação para seus complexos são cerca de 100 maiores do que as para EDTA. Como um agente quelante, DTPA enrola-se em torno de um íon de metal formando até oito ligações. No entanto, me- tais de transição geralmente formam menos de oito ligações de coor- denação. Portanto, depois de formar um complexo com um metal,
DTPA ainda tem a capacidade de se ligar a outros reagentes, confor- me é mostrado por seu derivado pendetida. Por exemplo, em seu complexo com cobre(II), DTPA se liga em uma maneira hexadentada utilizando os três centros de amina e três dos cinco carboxilatos.
[0136] Em alguns outros aspectos, o quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico pode ser outro quelante de cátion ácido aminopo- licarboxílico, tal como ácido tetra-acético de diamina de etileno (EDTA), ácido etileno glicol-bis(β-aminoetil éter)-N,N,N',N'-tetra-acético (EGTA), ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético (DOTA), ou composto relacionado, por exemplo, tiuxetano (uma ver- são modificada de DTPA cuja espinha dorsal de carbono contém um grupo de isotiocianatobenzil e um grupo de metila). Outros agentes quelantes relacionados com DTPA e EDTA conhecidos na arte são aqueles nos quais os nitrogênios dos grupos de amida podem ser substituídos por um ou mais grupos de C1-18 alquila, por exemplo, DTPA.BMA e EDTA.BMA.
[0137] Em alguns aspectos, o quelante de cátion DTPA está pre- sente em uma quantidade entre cerca de 10 µM e cerca de 100 µM, entre 15 µM e cerca de 95 µM, entre cerca de 20 µM e cerca de 90 µM, entre cerca de 25 µM e cerca de 85 µM, entre cerca de 30 µM e cerca de 80 µM, entre cerca de 35 µM e cerca de 75 µM, entre cerca de 40 µM e cerca de 70 µM, entre cerca de 45 µM e cerca de 65 µM, entre cerca de 50 µM e cerca de 60 µM, entre cerca de 25 µM e cerca de 75 µM, entre cerca de 40 µM e cerca de 60 µM, entre cerca de 30 µM e cerca de 70 µM, ou entre cerca de 40 µM e cerca de 75 µM.
[0138] Em alguns aspectos, o quelante de cátion DTPA está pre- sente em uma quantidade de cerca de 10 µM, cerca de 15 µM, cerca de 20 µM, cerca de 25 µM, cerca de 30 µM, cerca de 35 µM, cerca de 40 µM, cerca de 45 µM, cerca de 50 µM, cerca de 55 µM, cerca de 60 µM, cerca de 65 µM, cerca de 70 µM, cerca de 75 µM, cerca de 80 µM,
cerca de 85 µM, cerca de 90 µM, cerca de 95 µM ou cerca de 100 µM.
[0139] Em alguns aspectos, o quelante de cátion DTPA está pre- sente em uma quantidade de no mínimo cerca de 15 µM, no mínimo cerca de 20 µM, no mínimo cerca de 25 µM, no mínimo cerca de 30 µM, no mínimo cerca de 35 µM, no mínimo cerca de 40 µM, no mínimo cerca de 45 µM, no mínimo cerca de 50 µM, no mínimo cerca de 55 µM, no mínimo cerca de 60 µM, no mínimo cerca de 65 µM, no mínimo cerca de 70 µM, ou no mínimo cerca de 75 µM.
[0140] Em alguns aspectos específicos, o quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico, por exemplo, DTPA, está presente em uma quantidade de 50 µM.
[0141] Em alguns aspectos, o pH de uma formulação descrita aqui, neste requerimento de patente, é acima de cerca de 6,5, acima de cerca de 6,6, acima de cerca de 6,7, acima de cerca de 6,8, acima de cerca de 6,9, acima de cerca de 7,0, acima de cerca de 7,1, acima de cerca de 7,2, acima de cerca de 7,3, acima de cerca de 7,4, ou acima de cerca de 7,5. Em alguns aspectos, o pH da formulação é acima de 6,5, acima de 6,6, acima de 6,7, acima de 6,8, acima de 6,9, acima de 7,0, acima de 7,1, acima de 7,2, acima de 7,3, acima de 7,4, ou acima de 7,5. Em alguns aspectos, o pH da formulação é de cerca de 6,5, cerca de 6,6, cerca de 6,7, cerca de 6,8, cerca de 6,9, cerca de 7,0, cerca de 7,1, cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,4, ou cerca de 7,5.
[0142] Em alguns aspectos, o pH da formulação é entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5, cerca de 6,6 e cerca de 7,5, cerca de 6,7 e cerca de 7,5, cerca de 6,8 e cerca de 7,5, cerca de 6,9 e cerca de 7,5, cerca de 7,0 e cerca de 7,5, cerca de 7,1 e cerca de 7,5, cerca de 7,2 e cer- ca de 7,5, cerca de 7,3 e cerca de 7,5, cerca de 7,4 e cerca de 7,5, cerca de 6,5 e cerca de 7,4, cerca de 6,5 e cerca de 7,3, cerca de 6,5 e cerca de 7,2, cerca de 6,5 e cerca de 7,1, cerca de 6,5 e cerca de
7,0, cerca de 6,5 e cerca de 6,9, cerca de 6,5 e cerca de 6,8, cerca de 6,5 e cerca de 6,7, cerca de 6,6 e cerca de 7,4, cerca de 6,7 e cerca de 7,4, cerca de 6,8 e cerca de 7,4, cerca de 6,9 e cerca de 7,4, cerca de 7,0 e cerca de 7,4, cerca de 7,1 e cerca de 7,4, cerca de 7,2 e cer- ca de 7,4, cerca de 7,3 e cerca de 7,4, cerca de 6,5 e cerca de 7,3, cerca de 6,6 e cerca de 7,3, cerca de 6,7 e cerca de 7,3, cerca de 6,7 e cerca de 7,3, cerca de 6,8 e cerca de 7,3, cerca de 6,9 e cerca de 7,3, cerca de 7,0 e cerca de 7,3, cerca de 7,1 e cerca de 7,3, cerca de 7,2 e cerca de 7,3, cerca de 6,5 e cerca de 7,2, cerca de 6,6 e cerca de 7,2, cerca de 6,7 e cerca de 7,2, cerca de 6,8 e cerca de 7,2, cerca de 6,9 e cerca de 7,2, cerca de 7,0 e cerca de 7,2, cerca de 7,1 e cer- ca de 7,2, cerca de 6,9 e cerca de 7,1, ou cerca de 7,0 e cerca de 7,1.
[0143] Em alguns aspectos, o pH da formulação é de cerca de 6,8, cerca de 6,9, cerca de 7,0, cerca de 7,1, cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,4, ou cerca de 7,5. Em alguns aspectos, a formulação far- macêutica é mais estável do que uma formulação de referência com um pH de 6,5.
[0144] Em alguns aspectos, formulação farmacêutica adicional- mente compreende um tensoativo. O termo "tensoativo" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significa qualquer compos- to, tipicamente uma molécula anfipática, que reduz a tensão superficial quando dissolvido ou suspenso em água ou soluções aquosas, ou o qual reduz a tensão interfacial entre dois líquidos, ou entre um líquido e um sólido. No contexto da presente divulgação, um tensoativo é qualquer composto que diminui o estresse interfacial e o cisalhamento em uma solução compreendendo um polipeptídeo FGF-21, por exem- plo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21.
[0145] Em alguns aspectos, o tensoativo é um tensoativo não iôni- co, isto é, é um tensoativo que tende a não ter carga líquida em solu- ções neutras. Em alguns aspectos, o tensoativo não iônico é um polis-
sorbato. Polissorbatos são uma classe importante de tensoativos não iônicos usados amplamente em fármacos de proteínas para estabilizar as proteínas contra agregação induzida pela interface e para minimizar a adsorção superficial de proteínas (Wang W 2005. Protein aggrega- tion and its inhibition in biopharmaceutics. Int J Pharm 289 (1-2):1-30). Polissorbatos são tensoativos não iônicos e anfifílicos, compostos de ésteres de ácidos graxos de sorbitano de polioxietileno (POE). Os po- lissorbatos disponíveis comercialmente são misturas quimicamente diversas contendo principalmente ésteres de ácidos graxos de sorbita- no de POE.
[0146] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "polissorbato" se refere a ésteres de oleato de sorbitol e seus anidridos, tipicamente copolimerizados com óxido de etileno. Exem- plos de polissorbatos incluem Polissorbato 20 (TWEEN 20; PS20) (monolaurato de sorbitano de polioxietileno (20)); Polissorbato 40 (TWEEN 40; PS40) (monopalmitato de sorbitano de polioxietileno (20)); Polissorbato 60 (TWEEN 60; PS60) (monoestearato de sorbitano de polioxietileno (20)); e Polissorbato 80 (TWEEN 80; PS80) (mono- oleato de sorbitano de polioxietileno (20)).
[0147] O número 20 depois da parte 'polioxietileno' se refere ao número total de grupos oxietileno -(CH2CH2O)- encontrados na molé- cula. O número depois da parte 'polissorbato' se refere ao tipo de áci- do graxo associado com a parte de sorbitano de polioxietileno da mo- lécula. Monolaurato é indicado por 20, monopalmitato é indicado por 40, monoestearato por 60, e mono-oleato por 80. Em alguns aspectos, o tensoativo não iônico está presente em uma quantidade acima da concentração crítica de micelas (CMC), a qual para ésteres de ácidos graxos de sorbitano de polioxietileno é aproximadamente uma quanti- dade de no mínimo 0,01 mg/ml. Vide Wan and Lee, Journal of Pharm Sci, 63, p.136, 1974.
[0148] Em alguns aspectos, o polissorbato é polissorbato 80 (PS80). Em alguns aspectos, o tensoativo polissorbato 80 está presen- te em uma quantidade de cerca de 0,01% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,02% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,03% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,04% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,05% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,06% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,07% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,08% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,09% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,02% a cerca de 0,09% (em peso / vol), cerca de 0,03% a cerca de 0,09% (em peso / vol), cerca de 0,04% a cerca de 0,09% (em peso / vol), cerca de 0,05% a cerca de 0,09% (em peso / vol), cerca de 0,06% a cerca de 0,09% (em peso / vol), cerca de 0,07% a cerca de 0,09% (em peso / vol), cerca de 0,08% a cerca de 0,09% (em peso / vol), cerca de 0,03% a cerca de 0,08% (em peso / vol), cerca de 0,04% a cerca de 0,08% (em peso / vol), cerca de 0,05% a cerca de 0,08% (em peso / vol), cer- ca de 0,06% a cerca de 0,08% (em peso / vol), cerca de 0,07% a cerca de 0,08% (em peso / vol), cerca de 0,04% a cerca de 0,07% (em peso / vol), cerca de 0,05% a cerca de 0,07% (em peso / vol), cerca de 0,06% a cerca de 0,07% (em peso / vol), ou cerca de 0,05% a cerca de 0,06% (em peso / vol).
[0149] Em alguns aspectos, o tensoativo polissorbato 80 está pre- sente em uma quantidade de no mínimo cerca de 0,01% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,02% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,03% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,04% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,05% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,06% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,07% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,08% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,09% (em peso / vol) ou no mínimo cerca de 0,1% (em peso / vol).
[0150] Em alguns aspectos, o tensoativo, por exemplo, polissorba-
to 80, mitiga a formação de particulados e/ou de bolhas de ar, por exemplo, quando a formulação é agitada em um shaker. Em alguns aspectos, a presença do tensoativo, por exemplo, polissorbato 80, na formulação pode reduzir a formação de particulados por no mínimo 10%, no mínimo 15%, no mínimo 20%, no mínimo 25%, no mínimo 30%, no mínimo 35%, no mínimo 40%, no mínimo 45%, no mínimo 50%, no mínimo 55%, no mínimo 60%, no mínimo 65%, no mínimo 70%, no mínimo 75%, no mínimo 80%, no mínimo 85%, no mínimo 90%, no mínimo 95%, ou 100% em comparação com o nível de forma- ção de particulados em uma formulação de referência. Em alguns as- pectos, a presença do tensoativo, por exemplo, polissorbato 80, na formulação pode reduzir a formação de bolhas de ar por no mínimo 10%, no mínimo 15%, no mínimo 20%, no mínimo 25%, no mínimo 30%, no mínimo 35%, no mínimo 40%, no mínimo 45%, no mínimo 50%, no mínimo 55%, no mínimo 60%, no mínimo 65%, no mínimo 70%, no mínimo 75%, no mínimo 80%, no mínimo 85%, no mínimo 90%, no mínimo 95%, ou 100% em comparação com o nível de forma- ção de bolhas em uma formulação de referência.
[0151] Em alguns aspectos, a formulação farmacêutica adicional- mente compreende um agente de tamponamento de aminoácido. Ami- noácidos podem ser usados vantajosamente como tampões em apli- cações farmacêuticas, porque apresentam naturalmente substâncias as quais são facilmente metabolizáveis. Além do mais, aminoácidos usados como tampões também podem proteger as proteínas na fase amorfa se a formulação for seca por congelamento. Um tampão de aminoácido adequado pode conter histidina, lisina, e/ou arginina. Histi- dina tem uma boa capacidade de tamponamento em torno de pH 7.
[0152] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "histidina" compreende ou L-histidina ou D-histidina, uma forma solvatada de histidina, uma forma hidratada (por exemplo, monohidra-
to) de histidina, ou uma forma anídrica de histidina, ou uma mistura das mesmas. Outros tampões adequados nas formulações da presen- te divulgação são glutamato, Tris, ou succinato, para mencionar so- mente alguns.
[0153] Em alguns aspectos específicos, o agente de tamponamen- to de aminoácido é L-histidina.
[0154] Em alguns aspectos, o agente de tamponamento de histidi- na está presente em uma quantidade de cerca de 10 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 15 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 20 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 25 mM a cerca de 100 mM, cerca de 30 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 35 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 40 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 45 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 50 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 55 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 60 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 65 mM a cerca de 100 mM de histidina, cer- ca de 70 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 75 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 80 mM a cerca de 100 mM de histi- dina, cerca de 85 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 90 mM a cerca de 100 mM de histidina, ou cerca de 95 mM a cerca de 100 mM de histidina.
[0155] Em alguns aspectos, o agente de tamponamento de histidi- na está presente em uma quantidade de cerca de 20 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 25 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 30 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 35 mM a cer- ca de 90 mM de histidina, cerca de 40 mM a cerca de 90 mM de histi- dina, cerca de 45 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 50 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 55 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 60 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 65 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 70 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 75 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 80 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 85 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 30 mM a cerca de 80 mM de histidina, cerca de 35 mM a cerca de 80 mM de histidina, cerca de 40 mM a cerca de 80 mM de histidina, cerca de 45 mM a cerca de 80 mM de histidina.
[0156] Em alguns aspectos, o agente de tamponamento de histidi- na está presente em uma quantidade de cerca de 50 mM a cerca de 80 mM de histidina, cerca de 55 mM a cerca de 80 mM de histidina, cerca de 60 mM a cerca de 80 mM de histidina, cerca de 65 mM a cer- ca de 80 mM de histidina, cerca de 70 mM a cerca de 80 mM de histi- dina, cerca de 75 mM a cerca de 80 mM de histidina, cerca de 40 mM a cerca de 70 mM de histidina, cerca de 45 mM a cerca de 70 mM de histidina, cerca de 50 mM a cerca de 70 mM de histidina, cerca de 55 mM a cerca de 70 mM de histidina, cerca de 60 mM a cerca de 70 mM de histidina, cerca de 65 mM a cerca de 70 mM de histidina, cerca de 10 mM a cerca de 30 mM de histidina, cerca de 15 mM a cerca de 30 mM de histidina, cerca de 20 mM a cerca de 30 mM de histidina, cerca de 25 mM a cerca de 30 mM de histidina, cerca de 15 mM a cerca de 25 mM de histidina, ou cerca de 20 mM a cerca de 25 mM.
[0157] Em alguns aspectos, o agente de tamponamento de histidi- na está presente em uma quantidade de cerca de 15 mM a cerca de 20 mM de histidina, cerca de 40 mM a cerca de 60 mM de histidina, cerca de 45 mM a cerca de 60 mM de histidina, cerca de 50 mM a cer- ca de 60 mM de histidina, cerca de 15,5 mM a cerca de 24,5 mM de histidina, cerca de 16 mM a cerca de 24 mM de histidina, cerca de 16,5 mM a cerca de 23,5 mM de histidina, cerca de 17 mM a cerca de 23 mM de histidina, cerca de 17,5 mM a cerca de 22,5 mM de histidi- na, cerca de 18 mM a cerca de 22 mM de histidina, cerca de 18,5 mM a cerca de 21,5 mM de histidina, cerca de 19 mM a cerca de 21 mM de histidina, ou cerca de 19,5 mM a cerca de 20,5 mM de histidina.
[0158] Em alguns aspectos, o agente de tamponamento de histidi- na está presente em uma quantidade de cerca de 10 mM de histidina, cerca de 11 mM de histidina, cerca de 12 mM de histidina, cerca de 13 mM de histidina, cerca de 14 mM de histidina, cerca de 15 mM de his- tidina, cerca de 16 mM de histidina, cerca de 17 mM de histidina, cerca de 18 mM de histidina, cerca de 19 mM de histidina, cerca de 20 mM de histidina, cerca de 21 mM de histidina, cerca de 22 mM de histidina, cerca de 23 mM de histidina, cerca de 24 mM de histidina, cerca de 25 mM de histidina, cerca de 26 mM de histidina, cerca de 27 mM de his- tidina, cerca de 28 mM de histidina, cerca de 29 mM de histidina, cerca de 30 mM de histidina, cerca de 31 mM de histidina, cerca de 32 mM de histidina, cerca de 33 mM de histidina, cerca de 34 mM de histidina, cerca de 35 mM de histidina, cerca de 36 mM de histidina, cerca de 37 mM de histidina, cerca de 38 mM de histidina, cerca de 39 mM de his- tidina, cerca de 40 mM de histidina, cerca de 41 mM de histidina, cerca de 42 mM de histidina, cerca de 43 mM de histidina, cerca de 44 mM de histidina, cerca de 45 mM de histidina, cerca de 46 mM de histidina, cerca de 47 mM de histidina, cerca de 48 mM de histidina, cerca de 49 mM de histidina, ou cerca de 50 mM de histidina.
[0159] Em alguns aspectos, a formulação farmacêutica adicional- mente compreende um regulador osmótico (também conhecidos na arte como agentes de tonicidade). De acordo com a presente divulga- ção o regulador osmótico (agente de tonicidade) pode compreender um poliol, um sacarídeo, um carboidrato, um sal, tal como cloreto de sódio, ou misturas dos mesmos. Exemplos de polióis compreendem os com um peso molecular que é de menos de cerca de 600 kD (por exemplo, em uma faixa de 120 a 400 kD), por exemplo, manitol, trea- lose, sorbitol, eritritol, isomalte, lactitol, maltitol, xilitol, glicerol, lactitol, propileno glicol, polietileno glicol, inositol, ou misturas dos mesmos.
[0160] Reguladores osmóticos de sacarídeos ou carboidratos compreendem monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos ou misturas dos mesmos. Em alguns aspectos, o sacarídeo ou carboidra- to é selecionado entre o grupo que consiste em frutose, glicose, ma- nose, sacarose, sorbose, xilose, lactose, maltose, sacarose, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrinas, amido solúvel, hidroxietil amido, glu- canos hidrossolúveis, e misturas dos mesmos.
[0161] Em alguns aspectos, o regulador osmótico compreende um sacarídeo selecionado entre o grupo de açúcar redutor ou açúcar não redutor ou misturas dos mesmos. Em alguns aspectos, o regulador osmótico ou o agente de tonicidade compreende um sacarídeo o qual é um açúcar não redutor, de modo preferencial um açúcar selecionado entre o grupo que consiste em sacarose, trealose, e misturas dos mesmos. Em alguns aspectos específicos, o açúcar não redutor é sa- carose.
[0162] Em alguns aspectos, o regulador osmótico de sacarose es- tá presente em uma quantidade de cerca de 100 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 200 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 300 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 400 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 500 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 600 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 700 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 800 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 900 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 200 mM a cerca de 900 mM de sacarose, cerca de 300 mM a cerca de 900 mM de sacarose, cerca de 400 mM a cerca de 900 mM de sacarose, cerca de 500 mM a cerca de 900 mM de sacarose, cerca de 600 mM a cerca de 900 mM de sacarose, cerca de 700 mM a cerca de 900 mM de sacarose, cerca de 800 mM a cerca de 900 mM de sacarose, cerca de 300 mM a cerca de 800 mM de sacarose, cerca de 400 mM a cerca de 800 mM de sa- carose, cerca de 500 mM a cerca de 800 mM de sacarose, cerca de 600 mM a cerca de 800 mM de sacarose, cerca de 700 mM a cerca de
800 mM de sacarose, cerca de 400 mM a cerca de 700 mM de saca- rose, cerca de 500 mM a cerca de 700 mM de sacarose, cerca de 600 mM a cerca de 700 mM de sacarose, ou cerca de 500 mM a cerca de 600 mM de sacarose.
[0163] Em alguns aspectos, o regulador osmótico de sacarose es- tá presente em uma quantidade de cerca de 100 mM de sacarose, cerca de 150 mM de sacarose, cerca de 200 mM de sacarose, cerca de 250 mM de sacarose, cerca de 300 mM de sacarose, cerca de 350 mM de sacarose, cerca de 400 mM de sacarose, cerca de 450 mM de sacarose, cerca de 500 mM de sacarose, cerca de 550 mM de sacaro- se, cerca de 600 mM de sacarose, cerca de 650 mM de sacarose, cer- ca de 700 mM de sacarose, cerca de 750 mM de sacarose, cerca de 800 mM de sacarose, cerca de 850 mM de sacarose, cerca de 900 mM de sacarose, cerca de 950 mM de sacarose, ou cerca de 1M de sacarose.
[0164] Em alguns aspectos das formulações farmacêuticas descri- tas aqui, neste requerimento de patente, o polipeptídeo FGF-21 é um polipeptídeo FGF-21 modificado. Numerosos polipeptídeos FGF-21 modificados conhecidos na arte podem ser usados nas formulações descrita aqui, neste requerimento de patente, por exemplo, os descri- tos na Patente U.S. Nos. 8.012.931 e 9.434.788, ambas as quais são aqui, a este requerimento de patente, incorporadas por meio de refe- rência em suas totalidades. O fator de crescimento de fibroblasto 21 (FGF-21) foi descrito na literatura (Nishimura et al., Biochimica et Bi- ophysica Acta, 1492:203-206 (2000); WO 01/36640; e WO 01/18172, e Publicação de Patente U.S. No. 2004/0259780, cada uma das quais é incorporada por meio de referência aqui, a este requerimento de pa- tente, em sua totalidade). Diferentemente de outros FGFs, foi reporta- do que FGF-21 não tem efeitos proliferativos e tumorigênicos (Ornitz and Itoh, Genome Biology 2001, 2(3): reviews 3005.1-3005.12).
[0165] Alguns polipeptídeos FGF-21 e usos dos mesmos são des- critos na Publicação de Patente U.S. No. 2001/0012628, na Publica- ção de Patente U.S. No. 6.716.626, na Publicação de Patente U.S. No. 2004/0259780, WO 03/011213, Kharitonenkov et al. J Clin Invest. 2005 June; 115(6): 1627-35, WO 03/059270, na Publicação de Patente U.S. No. 2005/0176631, WO 2005/091944, WO 2007/0293430, na Publica- ção de Patente U.S. No. 2007/0293430, WO/2008/121563, na Pat. U.S. No. 4.904.584, WO 99/67291, WO 99/03887, WO 00/26354, e na Pat. U.S. No. 5.218.092 cada um dos quais é incorporado por meio de referência aqui, a este requerimento de patente, em sua totalidade.
[0166] FGF-21 adicionais que podem ser formulados conforme descrito no presente requerimento, conforme descrito em mais deta- lhes abaixo.
[0167] Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 modificado compreende um polipeptídeo tendo no mínimo cerca de 70%, no mí- nimo cerca de 75%, no mínimo cerca de 80%, no mínimo cerca de 85%, no mínimo cerca de 90%, no mínimo cerca de 95%, no mínimo cerca de 96%, no mínimo cerca de 97%, no mínimo cerca de 98%, ou no mínimo cerca de 99% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, em que o polipeptídeo tem uma atividade de FGF-21.
[0168] Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 modificado consiste ou consiste essencialmente em um polipeptídeo tendo no mí- nimo cerca de 70%, no mínimo cerca de 75%, no mínimo cerca de 80%, no mínimo cerca de 85%, no mínimo cerca de 90%, no mínimo cerca de 95%, no mínimo cerca de 96%, no mínimo cerca de 97%, no mínimo cerca de 98%, ou no mínimo cerca de 99% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, em que o polipeptídeo tem uma atividade de FGF-21.
[0169] Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 modificado é ligado a uma porção de extensão da meia-vida, por exemplo, através da cadeia lateral de um aminoácido codificado não naturalmente na sequência do polipeptídeo FGF-21. Porções de extensão da meia-vida que podem ser ligadas a um polipeptídeo FGF-21 modificado da pre- sente divulgação, por exemplo, o polipeptídeo FGF-21 de SEQ ID NO: 1, compreendem, por exemplo, albumina, uma região constante de imunoglobulina ou uma porção da mesma, um polipeptídeo de ligação a imunoglobulina, uma imunoglobulina G (IgG), polipeptídeo de ligação a albumina (ABP), uma porção de PASilação, uma porção de HESila- ção, XTEN, uma região de Fc, e qualquer combinação das mesmas. Porções de extensão da meia-vida que podem ser usadas para modifi- car polipeptídeos FGF-21 são descritas em mais detalhes abaixo.
[0170] Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida compreende um polímero hidrossolúvel, por exemplo, um polietileno glicol (PEG). Em alguns aspectos, o PEG tem um peso molecular mé- dio entre cerca de 10 kDa e cerca de 40 kDa. Thus, em alguns aspec- tos, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 10 kDa, cerca de 15 kDa, cerca de 20 kDa, cerca de 25 kDa, cerca de 30 kDa, cerca de 35 kDa, ou cerca de 40 kDa.
[0171] Em alguns aspectos, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 30 kDa. Em alguns aspectos, o PEG tem um peso mole- cular médio entre cerca de 15 kDa e cerca de 40 kDa, entre cerca de 20 kDa e cerca de 40 kDa, entre cerca de 25 kDa e cerca de 40 kDa, entre cerca de 30 kDa e cerca de 40 kDa, entre cerca de 35 kDa e cerca de 40 kDa, entre cerca de 15 kDa e cerca de 35 kDa, entre cer- ca de 15 kDa e cerca de 30 kDa, entre cerca de 15 kDa e cerca de 25 kDa, entre cerca de 15 kDa e cerca de 20 kDa, entre cerca de 20 kDa e cerca de 35 kDa, entre cerca de 25 kDa e cerca de 35 kDa, ou entre cerca de 30 kDa e cerca de 35 kDa.
[0172] Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida, por exemplo, PEG, é ligada ao polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2) por meio de um aminoácido codificado não naturalmente, por exemplo, um derivado de fenilalanina. Em alguns aspectos, o derivado de fenila- lanina é para-acetil-L-fenilalanina. Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida é ligada ao aminoácido codificado não natural- mente por meio de uma ligação oxima. Em alguns aspectos, o amino- ácido codificado não naturalmente substitui o aminoácido Glutamina 109 de SEQ ID NO: 3 (FGF-21 selvagem).
[0173] Em alguns aspectos específicos da presente divulgação, o polipeptídeo FGF-21 é PEG-FGF-21 (SEQ ID NO: 2), isto é, um deri- vado do FGF-21 modificado de SEQ ID NO: 1 na qual glutamina 109 do FGF-21 selvagem (SEQ ID NO: 3) foi substituída com para-acetil-L- fenilalanina e uma cadeia PEG de 30 kDa foi anexada de modo cova- lente à para-acetil-L-fenilalanina na posição 109 por meio de uma liga- ção oxima.
[0174] Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) está presente em uma concentração entre cerca de 1 mg/ml e cerca de 40 mg/ml. Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 está presente em uma concentração de cerca de 10 mg/ml, cerca de 20 mg/ml, cerca de 30 mg/ml, ou cerca de 40 mg/ml. Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG- FGF-21) está presente em uma concentração entre cerca de 1 mg/ml e 5 mg/ml, entre cerca de 5 mg/ml e cerca de 10 mg/ml, entre cerca de 10 mg/ml e cerca de 15 mg/ml, entre cerca de 15 mg/ml e cerca de 20 mg/ml, entre cerca de 20 mg/ml e cerca de 25 mg/ml, entre cerca de 25 mg/ml e cerca de 30 mg/ml, entre cerca de 30 mg/ml e cerca de 35 mg/ml, ou entre cerca de 35 mg/ml e cerca de 40 mg/ml.
[0175] Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) está presente em uma concentração de 1 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 11 mg/ml, 12 mg/ml, 13 mg/ml, 14 mg/ml, 15 mg/ml, 16 mg/ml, 17 mg/ml, 18 mg/ml, 19 mg/ml, 20 mg/ml, 21 mg/ml, 22 mg/ml, 23 mg/ml, 24 mg/ml, 25 mg/ml, 26 mg/ml, 27 mg/ml, 28 mg/ml, 29 mg/ml, 30 mg/ml, 31 mg/ml, 32 mg/ml, 33 mg/ml, 34 mg/ml, 35 mg/ml, 36 mg/ml, 37 mg/ml, 38 mg/ml, 39 mg/ml, ou 40 mg/ml. Em alguns aspectos, a concentração do polipeptídeo FGF-21 é determinada de acordo com métodos co- nhecidos na arte, ou os métodos específicos descritos na seção de Exemplos da presente especificação.
[0176] Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) está pre- sente em uma formulação descrita aqui, neste requerimento de paten- te, em uma quantidade entre cerca de 1 mg e cerca de 40 mg por do- se. Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um po- lipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) está presente em uma formulação descrita aqui, neste requerimento de patente, em uma quantidade entre cerca de 1 mg e cerca de 5 mg por dose, entre cerca de 5 mg e cerca de 10 mg por dose, ou entre cerca de 10 mg e cerca de 15 mg por dose, entre cerca de 15 mg e cerca de 20 mg por dose, ou entre cerca de 20 mg e cerca de 25 mg por dose, entre cerca de 25 mg e cerca de 30 mg por dose, ou entre cerca de 30 mg e cerca de 35 mg por dose, ou entre cerca de 35 mg e cerca de 40 mg por do- se. Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um poli- peptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21, está presente em uma formulação descrita aqui, neste requerimento de patente, em uma quantidade maior do que 40 mg por dose.
[0177] Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 (por exemplo,
um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) está pre- sente em uma formulação descrita aqui, neste requerimento de paten- te, em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose, cerca de 2 mg por dose, cerca de 3 mg por dose, cerca de 4 mg por dose, cerca de 5 mg por dose, cerca de 6 mg por dose, cerca de 7 mg por dose, cerca de 8 mg por dose, cerca de 9 mg por dose, cerca de 10 mg por dose, cerca de 11 mg por dose, cerca de 12 mg por dose, cerca de 13 mg por do- se, cerca de 14 mg por dose, cerca de 15 mg por dose, cerca de 16 mg por dose, cerca de 17 mg por dose, cerca de 18 mg por dose, cer- ca de 19 mg por dose, cerca de 20 mg por dose, cerca de 21 mg por dose, cerca de 22 mg por dose, cerca de 23 mg por dose, cerca de 24 mg por dose, cerca de 25 mg por dose, cerca de 26 mg por dose, cer- ca de 27 mg por dose, cerca de 28 mg por dose, cerca de 29 mg por dose, cerca de 30 mg por dose, cerca de 31 mg por dose, cerca de 32 mg por dose, cerca de 33 mg por dose, cerca de 34 mg por dose, cer- ca de 35 mg por dose, cerca de 36 mg por dose, cerca de 37 mg por dose, cerca de 38 mg por dose, cerca de 39 mg por dose, ou cerca de 40 mg por dose.
[0178] Em alguns aspectos, a formulação farmacêutica é formula- da para administração subcutânea. Conforme discutido abaixo, outras formulações farmacêuticas descritas aqui, neste requerimento de pa- tente, podem ser administradas através de outras vias. Em alguns as- pectos, a formulação farmacêutica é formulada para administração subcutânea, por exemplo, com uma seringa de segurança. Em alguns aspectos, a formulação é formulada para administração diariamente ou semanalmente, por exemplo, a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, dias, a cada se- mana, ou a cada duas semanas. Em alguns aspectos, a formulação é uma formulação aquosa.
[0179] Em alguns aspectos, a presente divulgação proporciona uma formulação farmacêutica compreendendo (i) um polipeptídeo
FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21; (ii) histidina em uma concentração entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM; (iii) sacarose em uma concentração entre cer- ca de 100 mM e cerca de 1M; (iv) Polissorbato 80 em uma concentra- ção entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% (em peso / vol); e, (v) DTPA em uma concentração entre cerca de 10 µM e cerca de 100 µM; em que o pH da formulação é entre cerca de 6,7 e cerca de 7,5.
[0180] Também é proporcionada uma formulação farmacêutica compreendendo (i) um polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipep- tídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21; (ii) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; (iii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma concentração de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma concentração de cerca de 50 µM; em que o pH é de cerca de 7,1.
[0181] Também é proporcionada uma formulação farmacêutica compreendendo (i) um polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipep- tídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21; (ii) histidina em uma concentração de 20 mM; (iii) sacarose em uma concentração de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma concentração de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma concentração de 50 µM; em que o pH é de 7,1.
[0182] Também é proporcionada uma formulação farmacêutica compreendendo (i) um polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipep- tídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21; (ii) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; e (iii) sacarose em uma concentra- ção de cerca de 600 mM; em que o pH é de cerca de 7,0.
[0183] Também é proporcionada uma formulação farmacêutica compreendendo (i) um polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipep- tídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21; (ii) histidina em uma concentração de 20 mM; e (iii) sacarose em uma concentração de 600 mM; em que o pH é de 7,0.
[0184] Em alguns aspectos específicos, a presente divulgação proporciona uma formulação farmacêutica compreendendo (i) PEG- FGF-21 (SEQ ID NO: 2) em uma concentração de cerca de 10 mg/mL; (ii) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; (iii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma concentração de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma concentração de cerca de 50 uM; em que o pH é de cerca de 7,1.
[0185] Também é proporcionada uma formulação farmacêutica compreendendo (i) PEG-FGF-21 em uma concentração de cerca de 20 mg/mL; (ii) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; (iii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma concentração de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma concentração de cerca de 50 uM; em que o pH é de cerca de 7,1.
[0186] Também é proporcionada uma formulação farmacêutica compreendendo (i) PEG-FGF-21 em uma concentração de 10 mg/mL; (ii) histidina em uma concentração de 20 mM; (iii) sacarose em uma concentração de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma concentração de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma concentração de 50 uM; em que o pH é de 7,1.
[0187] Também é proporcionada uma formulação farmacêutica compreendendo (i) PEG-FGF21 em uma concentração de 20 mg/mL; (ii) histidina em uma concentração de 20 mM; (iii) sacarose em uma concentração de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma concentração de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma concentração de 50 uM; em que o pH é de 7,1.
[0188] A presente divulgação também proporciona formulação farmacêutica preparada de acordo com qualquer um dos métodos para melhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo FGF-21
(por exemplo, um FGF-21 modificado tal como PEG-FGF-21) descrita abaixo. II. Métodos de fabricação
[0189] A presente divulgação também proporciona métodos para aprimorar ou reforçar a estabilidade de uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptí- deo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21, compreendendo mis- turar um quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico, por exemplo, DTPA, em que a formulação tem aumento da estabilidade em compa- ração com uma formulação de referência que não contenha o quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico. Estes métodos de estabilização compreendem (i) a mistura de um quelante de cátion ácido aminopoli- carboxílico à formulação, (ii) a mistura de um tensoativo de polissorba- to, por exemplo, polissorbato 80, (iii) ajustar o pH da formulação a aproximadamente 7,1, ou (iv) qualquer combinação dos mesmos.
[0190] Em alguns aspectos, uma formulação farmacêutica descrita aqui, neste requerimento de patente, é preparada pelo processo de misturar (i) PEG-FGF-21 em uma quantidade para atingir uma concen- tração final de cerca de 10 mg/mL; (ii) histidina em uma quantidade para atingir uma concentração final de cerca de 20 mM; (iii) sacarose em uma quantidade para atingir uma concentração final de cerca de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma quantidade para atingir uma concentração final de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma quantidade para atingir uma concentração final de cerca de 50 uM; e ajustar o pH a cerca de 7,1.
[0191] Em alguns aspectos, uma formulação farmacêutica descrita aqui, neste requerimento de patente, é preparada pelo processo de misturar (i) PEG-FGF-21 em uma quantidade para atingir uma concen- tração final de cerca de 20 mg/mL; (ii) histidina em uma quantidade para atingir uma concentração final de cerca de 20 mM; (iii) sacarose em uma quantidade para atingir uma concentração final de cerca de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma quantidade para atingir uma concentração final de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma quantidade para atingir uma concentração final de cerca de 50 uM; e ajustar o pH a cerca de 7,1.
[0192] Em alguns aspectos, uma formulação farmacêutica descrita aqui, neste requerimento de patente, é preparada pelo processo de misturar (i) PEG-FGF-21 em uma quantidade para atingir uma concen- tração final de 10 mg/mL; (ii) histidina em uma quantidade para atingir uma concentração final de 20 mM; (iii) sacarose em uma quantidade para atingir uma concentração final de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma quantidade para atingir uma concentração final de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma quantidade para atingir uma concen- tração final de 50 uM; e ajustar o pH a 7,1.
[0193] Em alguns aspectos, uma formulação farmacêutica descrita aqui, neste requerimento de patente, é preparada pelo processo de misturar (i) PEG-FGF-21 em uma quantidade para atingir uma concen- tração final de 20 mg/mL; (ii) histidina em uma quantidade para atingir uma concentração final de 20 mM; (iii) sacarose em uma quantidade para atingir uma concentração final de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma quantidade para atingir uma concentração final de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma quantidade para atingir uma concen- tração final de 50 uM; e ajustar o pH a 7,1.
[0194] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "misturar" se refere à combinação dos componentes das formu- lações descritas aqui, neste requerimento de patente, em ordem não predeterminada para atingir as concentrações descritas por quaisquer meios conhecidos na arte. Por exemplo, os excipientes em uma formu- lação farmacêutica descrita aqui, neste requerimento de patente, po- dem ser adicionados seqüencialmente ou simultaneamente a uma so-
lução do polipeptídeo FGF-21. Alternativamente, uma solução concen- trada do polipeptídeo FGF-21 pode ser adicionada a uma solução compreendendo todos ou parte dos excipientes na formulação. Em outros aspectos, os excipientes podem ser incorporados à formulação usando, por exemplo, diálise ou filtração.
[0195] Em alguns aspectos, as melhoras na estabilidade resultan- tes da aplicação do método descrito compreendem, por exemplo, (i) um aumento na estabilidade física com respeito a uma formulação de referência, (ii) um aumento na estabilidade química com respeito a uma formulação de referência, ou (iii) uma combinação dos mesmos.
[0196] Em alguns aspectos, o aumento na estabilidade física com- preende (i) prevenção ou diminuição da agregação do polipeptídeo, (ii) prevenção ou diminuição da fragmentação do polipeptídeo, ou (iii) uma combinação dos mesmos. Em alguns aspectos, a agregação do poli- peptídeo observada em uma composição farmacêtica descrita aqui, neste requerimento de patente, é de cerca de 90%, cerca de 85%, cerca de 80%, cerca de 75%, cerca de 70%, cerca de 65%, cerca de 60%, cerca de 55%, cerca de 50%, cerca de 45%, cerca de 40%, cer- ca de 35%, cerca de 30%, cerca de 25%, cerca de 20%, cerca de 15%, ou cerca de 10% da agregação observada em uma formulação de referência. Em alguns aspectos, a agregação do polipeptídeo ob- servada em uma composição farmacêtica descrita aqui, neste reque- rimento de patente, é de menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55%, menos de 50%, menos de 45%, menos de 40%, me- nos de 35%, menos de 30%, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, ou menos de 10% da agregação observada em uma formula- ção de referência. Em alguns aspectos, a fragmentação do polipeptí- deo observada em uma composição farmacêtica descrita aqui, neste requerimento de patente, é de cerca de 90%, cerca de 85%, cerca de
80%, cerca de 75%, cerca de 70%, cerca de 65%, cerca de 60%, cer- ca de 55%, cerca de 50%, cerca de 45%, cerca de 40%, cerca de 35%, cerca de 30%, cerca de 25%, cerca de 20%, cerca de 15%, ou cerca de 10% da fragmentação observada em uma formulação de re- ferência. Em alguns aspectos, a fragmentação do polipeptídeo obser- vada em uma composição farmacêtica descrita aqui, neste requeri- mento de patente, é de menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55%, menos de 50%, menos de 45%, menos de 40%, me- nos de 35%, menos de 30%, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, ou menos de 10% da fragmentação observada em uma for- mulação de referência.
[0197] Em alguns aspectos, o aumento na estabilidade química compreende (i) prevenção ou diminuição da desamidação do polipep- tídeo, (ii) prevenção ou diminuição da oxidação do polipeptídeo, ou (iii) uma combinação dos mesmos. Em alguns aspectos, a desamidação do polipeptídeo observada em uma composição farmacêtica descrita aqui, neste requerimento de patente, é de cerca de 90%, cerca de 85%, cerca de 80%, cerca de 75%, cerca de 70%, cerca de 65%, cer- ca de 60%, cerca de 55%, cerca de 50%, cerca de 45%, cerca de 40%, cerca de 35%, cerca de 30%, cerca de 25%, cerca de 20%, cer- ca de 15%, ou cerca de 10% of a desamidação do polipeptídeo obser- vada em uma formulação de referência. Em alguns aspectos, a desa- midação do polipeptídeo observada em uma composição farmacêtica descrita aqui, neste requerimento de patente, é de menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, me- nos de 65%, menos de 60%, menos de 55%, menos de 50%, menos de 45%, menos de 40%, menos de 35%, menos de 30%, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, ou menos de 10% of a desami- dação do polipeptídeo observada em uma formulação de referência.
Em alguns aspectos, a oxidação do polipeptídeo observada em uma composição farmacêtica descrita aqui, neste requerimento de patente, é de cerca de 90%, cerca de 85%, cerca de 80%, cerca de 75%, cerca de 70%, cerca de 65%, cerca de 60%, cerca de 55%, cerca de 50%, cerca de 45%, cerca de 40%, cerca de 35%, cerca de 30%, cerca de 25%, cerca de 20%, cerca de 15%, ou cerca de 10% da oxidação do polipeptídeo observada em uma formulação de referência. Em alguns aspectos, a oxidação do polipeptídeo observada em uma composição farmacêtica descrita aqui, neste requerimento de patente, é de menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55%, menos de 50%, menos de 45%, menos de 40%, menos de 35%, menos de 30%, me- nos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, ou menos de 10% da oxidação do polipeptídeo observada em uma formulação de referência.
[0198] Em alguns aspectos, os métodos para estabilizar (aprimorar ou reforçar a estabilidade) uma formulação descrita aqui, neste reque- rimento de patente, pode reduzir não somente o nível de degradação mas tambám a taxa de degradação: por exemplo, os métodos descri- tos podem reduzir a taxa de desamidação do polipeptídeo, reduzir a taxa de oxidação do polipeptídeo, reduzir a taxa de agregação do poli- peptídeo, reduzir a taxa de degradação proteolítica, ou qualquer com- binação das mesmas, com respeito a uma formulação de referência.
[0199] Por exemplo, a mistura de um quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico, tal como DTPA em uma formulação farmacêutica descrita aqui, neste requerimento de patente, pode reduzir a taxa de desamidação do polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21, quando armazenada em uma determinada temperatura por um determinado período de tempo com respeito à formulação de referência.
[0200] Em alguns aspectos, a mistura de um quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico (por exemplo, DTPA) a uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) pode re- duzir a taxa de desamidação do polipeptídeo FGF-21 quando a formu- lação farmacêutica é armazenada, por exemplo, em cerca de 25 ºC, em cerca de 30 ºC, em cerca de 35 ºC, em cerca de 40 ºC, ou em cer- ca de 45ºC com respeito à formulação de referência. Em alguns as- pectos, o quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico (por exemplo, DTPA) pode reduzir a taxa de desamidação do polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF- 21, quando a formulação farmacêutica é armazenada em uma tempe- ratura acima de 25 ºC, acima de 30 ºC, acima de 35 ºC, cerca de 40 ºC, ou cerca de 45ºC com respeito à formulação de referência. Em al- guns aspectos, o quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico (por exemplo, DTPA) pode reduzir a taxa de desamidação do polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21, quando a formulação farmacêutica é armazenada entre cerca de 20 ºC e cerca de 25 ºC, cerca de 25 ºC e cerca de 30 ºC, cer- ca de 30 ºC e cerca de 35 ºC, ou cerca de 40 ºC e cerca de 45 ºC com respeito à formulação de referência.
[0201] Em alguns aspectos, a mistura de um quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico (por exemplo, DTPA) a uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) pode re- duzir a taxa de desamidação do polipeptídeo FGF-21 quando a formu- lação farmacêutica é armazenada em uma temperatura ou em uma faixa de temperatura descrita acima por cerca de 1 semana, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 1 mês, cerca de 2 meses, cerca de 3 meses, ou cerca de 4 meses com respeito à formulação de referência.
[0202] Em um aspecto específico, a mistura de um quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico (por exemplo, DTPA) a uma formula- ção farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 (por exem- plo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) pode reduzir a taxa de desamidação do polipeptídeo FGF-21 quando a for- mulação farmacêutica é armazenada a 40 ºC por cerca de um mês com respeito à formulação de referência.
[0203] Em alguns aspectos, a mistura de um quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico (por exemplo, DTPA) a uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) pode re- duzir a taxa de agregação de alto peso molecular (HMW) do polipeptí- deo FGF-21 quando a formulação farmacêutica é armazenada em cer- ca de 25 ºC, em cerca de 30 ºC, em cerca de 35 ºC, em cerca de 40 ºC, ou em cerca de 45ºC com respeito à formulação de referência.
[0204] Em alguns aspectos, a mistura de um quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico (por exemplo, DTPA) a uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) pode re- duzir a taxa de agregação de alto peso molecular do polipeptídeo FGF-21 quando a formulação farmacêutica é armazenada em uma temperatura acima de 25 ºC, acima de 30 ºC, acima de 35 ºC, cerca de 40 ºC, ou cerca de 45ºC com respeito à formulação de referência. Em alguns aspectos, a mistura de um quelante de cátion ácido aminopoli- carboxílico (por exemplo, DTPA) a uma formulação farmacêutica com- preendendo um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) pode reduzir a taxa de agregação de alto peso molecular do polipeptídeo FGF-21 quando a formulação farmacêutica é armazenada entre em uma temperatura de cerca de 20 ºC e cerca de 25 ºC, cerca de 25 ºC e cerca de 30 ºC, cer-
ca de 30 ºC e cerca de 35 ºC, ou cerca de 40 ºC e cerca de 45 ºC com respeito à formulação de referência.
[0205] Em alguns aspectos, a mistura de um quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico (por exemplo, DTPA) a uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) pode re- duzir a taxa de agregação de alto peso molecular do polipeptídeo FGF-21 quando a formulação farmacêutica é armazenada em uma temperatura ou em uma faixa de temperatura descrita acima por cerca de 1 semana, cerca de 2 semanas, cerca de 3 semanas, cerca de 1 mês, cerca de 2 meses, cerca de 3 meses, ou cerca de 4 meses com respeito à formulação de referência.
[0206] Em um aspecto específico, a mistura de um quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico (por exemplo, DTPA) a uma formula- ção farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 (por exem- plo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) pode reduzir a taxa de agregação de alto peso molecular do polipeptídeo FGF-21 quando a formulação farmacêutica é armazenada a 40 ºC por cerca de um mês com respeito à formulação de referência.
[0207] Em alguns aspectos, a mistura de um quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico (por exemplo, DTPA) a uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) pode pre- venir ou mitigar a oxidação de uma ou mais metioninas no polipeptídeo FGF-21.
[0208] Em aspectos particulares, a mistura de um quelante de cá- tion ácido aminopolicarboxílico (por exemplo, DTPA) a uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) pode pre- venir ou mitigar a oxidação do aminoácido 1 e/ou do aminoácido 169 de SEQ ID NO: 3 (ou os aminoácidos correspondentes em SEQ ID NOS:1, 2 ou qualquer outro polipeptídeo FGF-21), por exemplo, a 25 ºC e/ou a 40 ºC.
[0209] Os métodos descritos podem usar o quelante de cátion áci- do aminopolicarboxílico DTPA. No entanto, em alguns outros aspec- tos, o quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico pode ser, por exemplo, outro quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico, tal como EDTA, EGTA, DOTA, um composto relacionado com DTPA, tal como tiuxetano, ou quaisquer agentes quelantes relacionados com DTPA e EDTA conhecidos na arte, por exemplo, DTPA.BMA e EDTA.BMA.
[0210] Em alguns aspectos, o quelante de cátion DTPA pode ser misturado a uma quantidade entre cerca de 10 µM e cerca de 100 µM, entre 15 µM e cerca de 95 µM, entre cerca de 20 µM e cerca de 90 µM, entre cerca de 25 µM e cerca de 85 µM, entre cerca de 30 µM e cerca de 80 µM, entre cerca de 35 µM e cerca de 75 µM, entre cerca de 40 µM e cerca de 70 µM, entre cerca de 45 µM e cerca de 65 µM, entre cerca de 50 µM e cerca de 60 µM, entre cerca de 25 µM e cerca de 75 µM, entre cerca de 40 µM e cerca de 60 µM, entre cerca de 30 µM e cerca de 70 µM, ou entre cerca de 40 µM e cerca de 75 µM.
[0211] Em alguns aspectos, o quelante de cátion DTPA pode ser misturado a uma quantidade de cerca de 10 µM, cerca de 15 µM, cer- ca de 20 µM, cerca de 25 µM, cerca de 30 µM, cerca de 35 µM, cerca de 40 µM, cerca de 45 µM, cerca de 50 µM, cerca de 55 µM, cerca de 60 µM, cerca de 65 µM, cerca de 70 µM, cerca de 75 µM, cerca de 80 µM, cerca de 85 µM, cerca de 90 µM, cerca de 95 µM ou cerca de 100 µM.
[0212] Em alguns aspectos, o quelante de cátion DTPA pode ser misturado a uma quantidade de no mínimo cerca de 15 µM, no mínimo cerca de 20 µM, no mínimo cerca de 25 µM, no mínimo cerca de 30 µM, no mínimo cerca de 35 µM, no mínimo cerca de 40 µM, no mínimo cerca de 45 µM, no mínimo cerca de 50 µM, no mínimo cerca de 55 µM, no mínimo cerca de 60 µM, no mínimo cerca de 65 µM, no mínimo cerca de 70 µM, ou no mínimo cerca de 75 µM.
[0213] Em um aspecto específico, o quelante de cátion ácido ami- nopolicarboxílico, por exemplo, DTPA, é misturado a uma quantidade de 50 µM.
[0214] Em alguns aspectos dos métodos descritos aqui, neste re- querimento de patente, o pH da formulação é ajustado para um pH acima de cerca de 6,5, acima de cerca de 6,6, acima de cerca de 6,7, acima de cerca de 6,8, acima de cerca de 6,9, acima de cerca de 7,0, acima de cerca de 7,1, acima de cerca de 7,2, acima de cerca de 7,3, acima de cerca de 7,4, ou acima de cerca de 7,5.
[0215] Em alguns aspectos, o pH da formulação é ajustado para um pH acima de 6,5, acima de 6,6, acima de 6,7, acima de 6,8, acima de 6,9, acima de 7,0, acima de 7,1, acima de 7,2, acima de 7,3, acima de 7,4, ou acima de 7,5.
[0216] Em alguns aspectos, o pH da formulação é ajustado para um pH de 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, ou 7,5.
[0217] Em alguns aspectos, o pH da formulação é ajustado para um pH entre cerca de 6,5 e cerca de 7,5, cerca de 6,6 e cerca de 7,5, cerca de 6,7 e cerca de 7,5, cerca de 6,8 e cerca de 7,5, cerca de 6,9 e cerca de 7,5, cerca de 7,0 e cerca de 7,5, cerca de 7,1 e cerca de 7,5, cerca de 7,2 e cerca de 7,5, cerca de 7,3 e cerca de 7,5, cerca de 7,4 e cerca de 7,5, cerca de 6,5 e cerca de 7,4, cerca de 6,5 e cerca de 7,3, cerca de 6,5 e cerca de 7,2, cerca de 6,5 e cerca de 7,1, cerca de 6,5 e cerca de 7,0, cerca de 6,5 e cerca de 6,9, cerca de 6,5 e cer- ca de 6,8, cerca de 6,5 e cerca de 6,7, cerca de 6,6 e cerca de 7,4, cerca de 6,7 e cerca de 7,4, cerca de 6,8 e cerca de 7,4, cerca de 6,9 e cerca de 7,4, cerca de 7,0 e cerca de 7,4, cerca de 7,1 e cerca de 7,4, cerca de 7,2 e cerca de 7,4, cerca de 7,3 e cerca de 7,4, cerca de
6,5 e cerca de 7,3, cerca de 6,6 e cerca de 7,3, cerca de 6,7 e cerca de 7,3, cerca de 6,7 e cerca de 7,3, cerca de 6,8 e cerca de 7,3, cerca de 6,9 e cerca de 7,3, cerca de 7,0 e cerca de 7,3, cerca de 7,1 e cer- ca de 7,3, cerca de 7,2 e cerca de 7,3, cerca de 6,5 e cerca de 7,2, cerca de 6,6 e cerca de 7,2, cerca de 6,7 e cerca de 7,2, cerca de 6,8 e cerca de 7,2, cerca de 6,9 e cerca de 7,2, cerca de 7,0 e cerca de 7,2, cerca de 7,1 e cerca de 7,2, cerca de 6,9 e cerca de 7,1, ou cerca de 7,0 e cerca de 7,1,
[0218] Em alguns aspectos, o pH da formulação é ajustado para um pH de cerca de 6,8, cerca de 6,9, cerca de 7,0, cerca de 7,1, cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,4, ou cerca de 7,5. Em alguns aspec- tos, a formulação farmacêutica, depois de ajustar o pH, é mais estável do que uma formulação de referência com um pH de 6,5.
[0219] Em alguns aspectos, o pH da formulação é ajustado para um pH de 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, ou 7,5. Em alguns aspectos, a formulação farmacêutica, depois de ajustar o pH, é mais estável do que uma formulação de referência com um pH de 6,5.
[0220] Em alguns aspectos, o método para melhorar a estabilidade de uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) adicionalmente compreende misturar um tensoativo. Em alguns aspectos, o tensoativo misturado é um tensoativo não iônico, isto é, um tensoativo que tende a não ter carga líquida em soluções neutras. Em alguns aspectos, o tensoativo não aniônico misturado é um polissorbato. Em alguns aspectos, o tensoativo não iônico é mistu- rado em uma quantidade acima da concentração crítica de micelas (CMC), a qual para ésteres de ácidos graxos de sorbitano de polioxieti- leno é uma quantidade de aproximadamente no mínimo 0,01 mg/ml. Vide Wan and Lee, Journal of Pharm Sci, 63, p.136, 1974. Em alguns aspectos dos presentes métodos, o polissorbato é polissorbato 80
(PS80).
[0221] Em alguns aspectos, o tensoativo PS80 é misturado à for- mulação farmacêutica em uma quantidade de cerca de 0,01% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,02% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,03% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,04% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,05% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,06% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,07% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,08% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,09% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,02% a cerca de 0,09% (em peso / vol), cerca de 0,03% a cerca de 0,09% (em peso / vol), cerca de 0,04% a cerca de 0,09% (em peso / vol), cerca de 0,05% a cerca de 0,09% (em peso / vol), cerca de 0,06% a cerca de 0,09% (em peso / vol), cerca de 0,07% a cerca de 0,09% (em peso / vol), cerca de 0,08% a cerca de 0,09% (em peso / vol), cerca de 0,03% a cerca de 0,08% (em peso / vol), cerca de 0,04% a cerca de 0,08% (em peso / vol), cerca de 0,05% a cerca de 0,08% (em peso / vol), cerca de 0,06% a cerca de 0,08% (em peso / vol), cer- ca de 0,07% a cerca de 0,08% (em peso / vol), cerca de 0,04% a cerca de 0,07% (em peso / vol), cerca de 0,05% a cerca de 0,07% (em peso / vol), cerca de 0,06% a cerca de 0,07% (em peso / vol), ou cerca de 0,05% a cerca de 0,06% (em peso / vol).
[0222] Em alguns aspectos, o tensoativo polissorbato 80 é mistu- rado em uma quantidade de no mínimo cerca de 0,01% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,02% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,03% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,04% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,05% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,06% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,07% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,08% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,09% (em peso / vol) ou no mínimo cerca de 0,1% (em peso / vol). Em alguns aspectos, o tensoativo, por exemplo, PS80 é misturado em uma quantidade sufi-
ciente para mitigar ou prevenir a formação de particulados e/ou a for- mação de bolhas de ar, por exemplo, quando a formulação é agitada (por exemplo, em um shaker).
[0223] Em alguns aspectos, o método para melhorar a estabilidade de uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) adicionalmente compreende misturar um agente de tamponamento de aminoácido, por exemplo, histidina (isto é, L- histidina, D-histidina, uma histidina solvatada, uma histidina hidratada, uma histidina anídrica, ou uma mistura das mesmas).
[0224] Em alguns aspectos, o agente de tamponamento de histidi- na é misturado em uma quantidade de cerca de 10 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 15 mM a cerca de 100 mM de histidina, cer- ca de 20 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 25 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 30 mM a cerca de 100 mM de histi- dina, cerca de 35 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 40 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 45 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 50 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 55 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 60 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 65 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 70 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 75 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 80 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 85 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 90 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 95 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 20 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 25 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 30 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 35 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 40 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 45 mM a cer- ca de 90 mM de histidina, cerca de 50 mM a cerca de 90 mM de histi- dina, cerca de 55 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 60 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 65 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 70 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 75 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 80 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 85 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 30 mM a cerca de 80 mM de histidina, cerca de 35 mM a cerca de 80 mM de histidina, cerca de 40 mM a cerca de 80 mM de histidina, cerca de 45 mM a cerca de 80 mM de histidina, cerca de 50 mM a cerca de 80 mM de histidina, cerca de 55 mM a cerca de 80 mM de histidina, cerca de 60 mM a cerca de 80 mM de histidina, cerca de 65 mM a cer- ca de 80 mM de histidina, cerca de 70 mM a cerca de 80 mM de histi- dina, cerca de 75 mM a cerca de 80 mM de histidina, cerca de 40 mM a cerca de 70 mM de histidina, cerca de 45 mM a cerca de 70 mM de histidina, cerca de 50 mM a cerca de 70 mM de histidina, cerca de 55 mM a cerca de 70 mM de histidina, cerca de 60 mM a cerca de 70 mM de histidina, cerca de 65 mM a cerca de 70 mM de histidina, cerca de 10 mM a cerca de 30 mM de histidina, cerca de 15 mM a cerca de 30 mM de histidina, cerca de 20 mM a cerca de 30 mM de histidina, cerca de 25 mM a cerca de 30 mM de histidina, cerca de 15 mM a cerca de 25 mM de histidina, cerca de 20 mM a cerca de 25 mM, cerca de 15 mM a cerca de 20 mM de histidina, cerca de 40 mM a cerca de 60 mM de histidina, cerca de 45 mM a cerca de 60 mM de histidina, cerca de 50 mM a cerca de 60 mM de histidina, cerca de 15,5 mM a cerca de 24,5 mM de histidina, cerca de 16 mM a cerca de 24 mM de histidina, cerca de 16,5 mM a cerca de 23,5 mM de histidina, cerca de 17 mM a cerca de 23 mM de histidina, cerca de 17,5 mM a cerca de 22,5 mM de histidina, cerca de 18 mM a cerca de 22 mM de histidina, cerca de 18,5 mM a cerca de 21,5 mM de histidina, cerca de 19 mM a cerca de 21 mM de histidina, ou cerca de 19,5 mM a cerca de 20,5 mM de histi- dina.
[0225] Em alguns aspectos, o agente de tamponamento de histidi-
na é misturado em uma quantidade de cerca de 10 mM de histidina, cerca de 11 mM de histidina, cerca de 12 mM de histidina, cerca de 13 mM de histidina, cerca de 14 mM de histidina, cerca de 15 mM de his- tidina, cerca de 16 mM de histidina, cerca de 17 mM de histidina, cerca de 18 mM de histidina, cerca de 19 mM de histidina, cerca de 20 mM de histidina, cerca de 21 mM de histidina, cerca de 22 mM de histidina, cerca de 23 mM de histidina, cerca de 24 mM de histidina, cerca de 25 mM de histidina, cerca de 26 mM de histidina, cerca de 27 mM de his- tidina, cerca de 28 mM de histidina, cerca de 29 mM de histidina, cerca de 30 mM de histidina, cerca de 31 mM de histidina, cerca de 32 mM de histidina, cerca de 33 mM de histidina, cerca de 34 mM de histidina, cerca de 35 mM de histidina, cerca de 36 mM de histidina, cerca de 37 mM de histidina, cerca de 38 mM de histidina, cerca de 39 mM de his- tidina, cerca de 40 mM de histidina, cerca de 41 mM de histidina, cerca de 42 mM de histidina, cerca de 43 mM de histidina, cerca de 44 mM de histidina, cerca de 45 mM de histidina, cerca de 46 mM de histidina, cerca de 47 mM de histidina, cerca de 48 mM de histidina, cerca de 49 mM de histidina, ou cerca de 50 mM de histidina.
[0226] Em alguns aspectos, o método para melhorar a estabilidade de uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) adicionalmente compreende misturar um regulador os- mótico (agente de tonicidade). De acordo com a presente divulgação o regulador osmótico (agente de tonicidade) pode compreende um poli- ol, um sacarídeo, um carboidrato, um sal, tal como cloreto de sódio, ou misturas dos mesmos. Exemplos de polióis compreendem os com um peso molecular que é de menos de cerca de 600 kD (por exemplo, em uma faixa de 120 a 400 kD), por exemplo, manitol, trealose, sorbitol, eritritol, isomalte, lactitol, maltitol, xilitol, glicerol, lactitol, propileno gli- col, polietileno glicol, inositol, ou misturas dos mesmos. Sacarídeo ou carboidrato reguladores osmóticos compreendem monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos ou misturas dos mesmos. Em alguns aspectos, o sacarídeo ou carboidrato é selecionado entre o grupo que consiste em frutose, glicose, manose, sacarose, sorbose, xilose, lacto- se, maltose, sacarose, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrinas, amido solúvel, hidroxietil amido, glucanos hidrossolúveis, e misturas dos mesmos. Em alguns aspectos, o regulador osmótico compreende um sacarídeo selecionado entre o grupo de açúcar redutor ou açúcar não redutor ou misturas dos mesmos. Em alguns aspectos, o regula- dor osmótico ou o agente de tonicidade compreende um sacarídeo o qual é um açúcar não redutor, de modo preferencial selecionado entre o grupo que consiste em sacarose, trealose, e misturas dos mesmos. Em alguns aspectos específicos, o açúcar não redutor é sacarose.
[0227] Em alguns aspectos, o regulador osmótico de sacarose é misturado em uma quantidade de cerca de 100 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 200 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 300 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 400 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 500 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 600 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 700 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 800 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 900 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 200 mM a cerca de 900 mM de sacarose, cerca de 300 mM a cerca de 900 mM de sacarose, cerca de 400 mM a cerca de 900 mM de sacarose, cerca de 500 mM a cerca de 900 mM de sacarose, cerca de 600 mM a cerca de 900 mM de sa- carose, cerca de 700 mM a cerca de 900 mM de sacarose, cerca de 800 mM a cerca de 900 mM de sacarose, cerca de 300 mM a cerca de 800 mM de sacarose, cerca de 400 mM a cerca de 800 mM de saca- rose, cerca de 500 mM a cerca de 800 mM de sacarose, cerca de 600 mM a cerca de 800 mM de sacarose, cerca de 700 mM a cerca de 800 mM de sacarose, cerca de 400 mM a cerca de 700 mM de sacarose,
cerca de 500 mM a cerca de 700 mM de sacarose, cerca de 600 mM a cerca de 700 mM de sacarose, ou cerca de 500 mM a cerca de 600 mM de sacarose.
[0228] Em alguns aspectos, o regulador osmótico de sacarose é misturado em uma quantidade de cerca de 100 mM de sacarose, cer- ca de 150 mM de sacarose, cerca de 200 mM de sacarose, cerca de 250 mM de sacarose, cerca de 300 mM de sacarose, cerca de 350 mM de sacarose, cerca de 400 mM de sacarose, cerca de 450 mM de sacarose, cerca de 500 mM de sacarose, cerca de 550 mM de sacaro- se, cerca de 600 mM de sacarose, cerca de 650 mM de sacarose, cer- ca de 700 mM de sacarose, cerca de 750 mM de sacarose, cerca de 800 mM de sacarose, cerca de 850 mM de sacarose, cerca de 900 mM de sacarose, cerca de 950 mM de sacarose, ou cerca de 1M de sacarose.
[0229] Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 é um polipeptí- deo FGF-21 modificado. Numerosos polipeptídeos FGF-21 modifica- dos conhecidos na arte podem ser usados nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente, por exemplo, os descritos nas Paten- tes U.S. Nos. 8.012.931 e 9.434.788, ambas as quais são incorpora- das aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade. FGF-21 adicional que pode ser formulado conforme descrito no presente requerimento é descrito em mais detalhes abaixo.
[0230] Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 modificado útil nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente, compre- ende um polipeptídeo tendo no mínimo cerca de 70%, no mínimo cer- ca de 75%, no mínimo cerca de 80%, no mínimo cerca de 85%, no mí- nimo cerca de 90%, no mínimo cerca de 95%, no mínimo cerca de 96%, no mínimo cerca de 97%, no mínimo cerca de 98%, ou no míni- mo cerca de 99% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (FGF-21 humano selva-
gem), em que o polipeptídeo tem uma atividade de FGF-21.
[0231] Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 modificado útil nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente, consiste ou consiste essencialmente em um polipeptídeo tendo no mínimo cer- ca de 70%, no mínimo cerca de 75%, no mínimo cerca de 80%, no mí- nimo cerca de 85%, no mínimo cerca de 90%, no mínimo cerca de 95%, no mínimo cerca de 96%, no mínimo cerca de 97%, no mínimo cerca de 98%, ou no mínimo cerca de 99% de identidade da sequên- cia de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (FGF-21 humano selvagem), em que o polipeptídeo tem uma ativi- dade de FGF-21.
[0232] Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 modificado útil nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente, é ligado a uma porção de extensão da meia-vida, por exemplo, através da cadeia lateral de um aminoácido codificado não naturalmente na sequência do polipeptídeo FGF-21. Porções de extensão da meia-vida que po- dem ser ligadas a um polipeptídeo FGF-21 da presente divulgação, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado de SEQ ID NO: 1 compreendem, por exemplo, albumina, uma região constante de imu- noglobulina ou uma porção das mesmas, um polipeptídeo de ligação a imunoglobulina, uma IgG, um ABP, uma porção de PASilação, uma porção de HESilação, um XTEN, uma região de Fc, e qualquer combi- nação das mesmas. Porções de extensão da meia-vida que podem ser usadas para modificar polipeptídeos FGF-21 são descritas em mais detalhes abaixo.
[0233] Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida útil nos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente, com- preende um polímero hidrossolúvel, por exemplo, um polietileno glicol (PEG). Em alguns aspectos, o PEG tem um peso molecular médio en- tre cerca de 10 kDa e cerca de 40 kDa, por exemplo, cerca de 10 kDa,
cerca de 15 kDa, cerca de 20 kDa, cerca de 25 kDa, cerca de 30 kDa, cerca de 35 kDa, ou cerca de 40 kDa. Em alguns aspectos, o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 30 kDa. Em alguns aspectos, o PEG tem um peso molecular médio entre cerca de 15 kDa e cerca de 40 kDa, entre cerca de 20 kDa e cerca de 40 kDa, entre cerca de 25 kDa e cerca de 40 kDa, entre cerca de 30 kDa e cerca de 40 kDa, en- tre cerca de 35 kDa e cerca de 40 kDa, entre cerca de 15 kDa e cerca de 35 kDa, entre cerca de 15 kDa e cerca de 30 kDa, entre cerca de 15 kDa e cerca de 25 kDa, entre cerca de 15 kDa e cerca de 20 kDa, entre cerca de 20 kDa e cerca de 35 kDa, entre cerca de 25 kDa e cerca de 35 kDa, ou entre 30 kDa e cerca de 35 kDa.
[0234] Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida, por exemplo, PEG, é ligada ao polipeptídeo FGF-21, por meio de um aminoácido codificado não naturalmente, por exemplo, um derivado de fenilalanina. Em alguns aspectos, o derivado de fenilalanina é para- acetil-L-fenilalanina. Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida é ligada ao aminoácido codificado não naturalmente por meio de uma ligação oxima. Em alguns aspectos, o aminoácido codifi- cado não naturalmente substitui o aminoácido Glutamina 109 de SEQ ID NO: 3. Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 é PEG-FGF-21 (SEQ ID NO: 2), isto é, o FGF-21 de SEQ ID NO: 1 no qual a glutami- na 109 foi substituída com para-acetil-L-fenilalanina e uma cadeia de 30 kDa PEG foi ligada de modo covalente à para-acetil-L-fenilalanina por meio de uma ligação oxima.
[0235] Em alguns aspectos dos métodos descritos aqui, neste re- querimento de patente, o polipeptídeo FGF-21 está presente em uma concentração entre cerca de 1 mg/ml e cerca de 40 mg/ml. Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 está presente em uma concentração de cerca de 10 mg/ml, cerca de 20 mg/ml, cerca de 30 mg/ml, ou cerca de 40 mg/ml. Em alguns aspectos, a concentração do polipeptídeo
FGF-21 é determinada de acordo com métodos conhecidos na arte, ou os métodos específicos descritos na seção de Exemplos da presente especificação.
[0236] Em alguns aspectos dos métodos descritos aqui, neste re- querimento de patente, a formulação é formulada para administração subcutânea. Em alguns aspectos, a formulação é formulada para ad- ministração subcutânea com uma seringa de segurança. Em alguns aspectos, a formulação é formulada para administração diariamente ou semanalmente. Em alguns aspectos, a formulação é uma formulação aquosa.
[0237] A presente divulgação proporciona um método para melho- rar a estabilidade de uma formulação compreendendo um polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21, compreendendo misturar (i) histidina em uma concen- tração entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM; (ii) sacarose em uma concentração entre cerca de 100 mM e cerca de 1M; (iii) Polissorbato 80 em uma concentração entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% (em peso / vol); e, (iv) DTPA em uma concentração entre cerca de 10 µM e cerca de 100 µM; em que o pH da formulação é entre cerca de 6,7 e cerca de 7,5.
[0238] A presente divulgação proporciona um método para melho- rar a estabilidade de uma formulação compreendendo um polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21, compreendendo misturar (i) histidina em uma concen- tração entre cerca de 15 mM e cerca de 45 mM; (ii) sacarose em uma concentração entre cerca de 200 mM e cerca de 900mM; (iii) Polissor- bato 80 em uma concentração entre cerca de 0,02% e cerca de 0,09% (em peso / vol); e, (iv) DTPA em uma concentração entre cerca de 20 µM e cerca de 90 µM; em que o pH da formulação é entre cerca de 6,8 e cerca de 7,4.
[0239] A presente divulgação proporciona um método para melho- rar a estabilidade de uma formulação compreendendo um polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21, compreendendo misturar (i) histidina em uma concen- tração entre cerca de 15 mM e cerca de 40 mM; (ii) sacarose em uma concentração entre cerca de 300 mM e cerca de 800mM; (iii) Polissor- bato 80 em uma concentração entre cerca de 0,03% e cerca de 0,08% (em peso / vol); e, (iv) DTPA em uma concentração entre cerca de 30 µM e cerca de 80 µM; em que o pH da formulação é entre cerca de 6,9 e cerca de 7,3.
[0240] A presente divulgação proporciona um método para melho- rar a estabilidade de uma formulação compreendendo um polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21, compreendendo misturar (i) histidina em uma concen- tração entre cerca de 15 mM e cerca de 30 mM; (ii) sacarose em uma concentração entre cerca de 400 mM e cerca de 800mM; (iii) Polissor- bato 80 em uma concentração entre cerca de 0,04% e cerca de 0,07% (em peso / vol); e, (iv) DTPA em uma concentração entre cerca de 40 µM e cerca de 70 µM; em que o pH da formulação é entre cerca de 7 e cerca de 7,2.
[0241] A presente divulgação proporciona um método para melho- rar a estabilidade de uma formulação compreendendo um polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21, compreendendo misturar (i) histidina em uma concen- tração entre cerca de 15 mM e cerca de 25 mM; (ii) sacarose em uma concentração entre cerca de 500 mM e cerca de 700mM; (iii) Polissor- bato 80 em uma concentração entre cerca de 0,04% e cerca de 0,06% (em peso / vol); e, (iv) DTPA em uma concentração entre cerca de 45 µM e cerca de 55 µM; em que o pH da formulação é entre cerca de 7 e cerca de 7,1.
[0242] A presente divulgação também proporciona um método pa- ra melhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo um po- lipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21, compreendendo misturar (i) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; (ii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; (iii) Polissorbato 80 em uma concentração de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (iv) DTPA em uma concentração de cerca de 50 µM; em que o pH é de cerca de 7,1.
[0243] A presente divulgação também proporciona um método para melhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo um polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modifica- do, tal como PEG-FGF-21, compreendendo misturar (i) histidina em uma concentração de 20 mM; (ii) sacarose em uma concentração de 600 mM; (iii) Polissorbato 80 em uma concentração de 0,05% (em pe- so / vol); e (iv) DTPA em uma concentração de 50 µM; em que o pH é de 7,1.
[0244] A presente divulgação proporciona um método para melho- rar a estabilidade de uma formulação compreendendo um polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21, compreendendo misturar (i) histidina em uma concen- tração de cerca de 20 mM; e (ii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; em que o pH é de cerca de 7,0.
[0245] A presente divulgação proporciona um método para melho- rar a estabilidade de uma formulação compreendendo um polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21, compreendendo misturar (i) histidina em uma concen- tração de 20 mM; e (ii) sacarose em uma concentração de 600 mM; em que o pH é de 7,0.
[0246] A presente divulgação proporciona um método para melho- rar a estabilidade de uma formulação compreendendo um PEG-FGF-
21 (SEQ ID NO: 2) em uma concentração de cerca de 10 mg/mL com- preendendo misturar (i) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; (ii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; (iii) Po- lissorbato 80 em uma concentração de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (iv) DTPA em uma concentração de cerca de 50 uM; em que o pH é de cerca de 7,1.
[0247] A presente divulgação proporciona um método para melho- rar a estabilidade de uma formulação compreendendo um PEG-FGF- 21 (SEQ ID NO: 2) em uma concentração de cerca de 20 mg/mL com- preendendo misturar (i) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; (ii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; (iii) Po- lissorbato 80 em uma concentração de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (iv) DTPA em uma concentração de cerca de 50 uM; em que o pH é de cerca de 7,1.
[0248] A presente divulgação proporciona um método para melho- rar a estabilidade de uma formulação compreendendo um PEG-FGF- 21 (SEQ ID NO: 2) em uma concentração de cerca de 10 mg/mL com- preendendo misturar (i) histidina em uma concentração de 20 mM; (ii) sacarose em uma concentração de 600 mM; (iii) Polissorbato 80 em uma concentração de 0,05% (em peso / vol); e (iv) DTPA em uma concentração de 50 uM; em que o pH é de 7,1.
[0249] A presente divulgação proporciona um método para melho- rar a estabilidade de uma formulação compreendendo um PEG-FGF- 21 (SEQ ID NO: 2) em uma concentração de cerca de 20 mg/mL com- preendendo misturar compreendendo misturar (i) histidina em uma concentração de 20 mM; (ii) sacarose em uma concentração de 600 mM; (iii) Polissorbato 80 em uma concentração de 0,05% (em peso / vol); e (iv) DTPA em uma concentração de 50 uM; em que o pH é de 7,1.
[0250] Em algumas modalidades, a concentração de excipientes individuais incluídos na formulação farmacêutica (por exemplo, DTPA, PS80, Histidina, Sacarose) pode ser determinada / calculada para ser a quantidade (peso, moles etc.) do excipiente individual adicionado à formulação farmacêutica no curso de sua fabricação por unidade de volume final da formulação farmacêutica acabada. Em outras modali- dades, a concentração de excipientes incluídos na formulação farma- cêutica (por exemplo, DTPA, PS80, Histidina, Sacarose) se baseia na quantidade real do excipiente individual na formulação farmacêutica. III. Métodos de tratamento
[0251] A presente divulgação também proporciona métodos de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada com fibrose e/ou diabetes em um sujeito que necessite do mesmo compre- endendo a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica compreendendo FGF-21 (por exemplo, um FGF-21 modificado tal como PEG-FGF-21) descrita aqui, neste reque- rimento de patente.
[0252] Em alguns aspectos, a doença ou condição é diabetes, por exemplo, diabetes tipo 2. Em alguns aspectos, a doença ou condição é esteato-hepatite não alcoólica (NASH).
[0253] Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21, pode ser usado nos métodos de tratamento ou prevenção descritos aqui, neste requerimento de patente, em uma quantidade entre cerca de 1 mg e cerca de 40 mg por dose. Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF- 21, pode ser usado nos métodos de tratamento ou prevenção descri- tos aqui, neste requerimento de patente, em uma quantidade entre cerca de 1 mg e cerca de 5 mg por dose, ou entre cerca de 5 mg e cerca de 10 mg por dose, ou entre cerca de 10 mg e cerca de 15 mg por dose, ou entre cerca de 15 mg e cerca de 20 mg por dose, ou en-
tre cerca de 20 mg e cerca de 25 mg por dose, ou entre cerca de 25 mg e cerca de 30 mg por dose, ou entre cerca de 30 mg e cerca de 35 mg por dose, ou entre cerca de 35 mg e cerca de 40 mg por dose. Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21, pode ser usado nos méto- dos de tratamento ou prevenção descritos aqui, neste requerimento de patente, em uma quantidade maior do que 40 mg por dose.
[0254] Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21, por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21, pode ser usado nos métodos de tratamento ou prevenção descritos aqui, neste requerimento de patente, em uma quantidade de cerca de 1 mg, cerca de 2 mg, cerca de 3 mg, cerca de 4 mg, cerca de 5 mg, cerca de 6 mg, cerca de 7 mg, cerca de 8 mg, cerca de 9 mg, cerca de 10 mg, cerca de 11 mg, cerca de 12 mg, cerca de 13 mg, cerca de 14 mg, cerca de 15 mg, cerca de 16 mg, cerca de 17 mg, cerca de 18 mg, cerca de 19 mg, cerca de 20 mg, cerca de 21 mg, cerca de 22 mg, cerca de 23 mg, cerca de 24 mg, cerca de 25 mg, cerca de 26 mg, cerca de 27 mg, cerca de 28 mg, cerca de 29 mg, cerca de 30 mg, cerca de 31 mg, cerca de 32 mg, cerca de 33 mg, cerca de 34 mg, cerca de 35 mg, cerca de 36 mg, cerca de 37 mg, cerca de 38 mg, cerca de 39 mg, ou cerca de 40 mg por dose.
[0255] Em alguns aspectos, a formulação farmacêutica é adminis- trada por via subcutânea, por exemplo, usando uma seringa de segu- rança. Em alguns aspectos, a formulação farmacêutica é administrada diariamente ou semanalmente.
[0256] Em alguns aspectos, a administração de uma quantidade eficaz da formulação farmacêutica compreendendo FGF-21 (por exemplo, um FGF-21 modificado tal como PEG-FGF-21) descrita aqui, neste requerimento de patente, ao sujeito diminui a rigidez hepática, diminui a percentagem de gordura corporal, diminui o peso corporal,
diminui a proporção de peso fígado - corpo, diminui o conteúdo de lipí- deos do fígado, diminui a área de fibrose hepática, diminui os níveis de glicose sanguínea em jejum, diminui os níveis de triglicerídeos em je- jum, diminui os níveis de colesterol LDL, diminui os níveis de ApoB, diminui os níveis de ApoC, aumenta os níveis de colesterol HDL, ou qualquer combinação dos mesmos.
[0257] Em alguns aspectos, a administração da formulação farma- cêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um polipeptídeo FGF-21 modificado, tal como PEG-FGF-21) descrita aqui, neste requerimento de patente, de acordo com os métodos de trata- mento descritos aqui, neste requerimento de patente, ao sujeito resulta em (i) redução nos níveis de gordura hepática; (ii) redução nos níveis de lesão hepática; (iii) redução nos níveis de fibrose; (iv) diminuição nos níveis de biomarcador de fibrose sérico Pro-C3 (propeptídeo de colágeno tipo III N-terminal); (v) diminuição nos níveis de alanina ami- notransferase (ALT); (vi) diminuição nos níveis de aspartato amino- transferase (AST); (vii) aumento nos níveis de adiponectina sérica; (viii) diminuição nos níveis de LDL plasmático; (ix) aumento nos níveis de HDL plasmático; (x) diminuição nos níveis de triglicerídeos plasmá- ticos; (xi) redução no nível de rigidez hepática; ou (xii) qualquer combi- nação das mesmas, comparados com os níveis em sujeitos não trata- dos ou com o sujeito antes da administração da formulação farmacêu- tica.
[0258] A presente divulgação proporciona um método de tratamen- to de uma doença associada com fibrose compreendendo a adminis- tração, a um sujeito que necessite do mesmo, de uma quantidade efi- caz de uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 descrita aqui, neste requerimento de patente. Em alguns as- pectos, a doença associada com fibrose pode afetar um órgão ou teci- do tal como o pâncreas, o pulmão, o coração, os rins, o fígado, os olhos, o sistema nervoso, a medula óssea, os linfonodos, o endomio- cárdio, e/ou o retroperitônio.
Em alguns aspectos, a doença associada com fibrose pode ser fibrose hepática ou pré-cirrose.
Em alguns as- pectos, a doença associada com fibrose pode ser selecionada entre: esteato-hepatite não alcoólica (NASH), cirrose, doença pulmonar pa- renquimal difusa, fibrose cística, fibrose pulmonar, fibrose maciça pro- gressiva, fibrose pulmonar idiopática, fibrose de injeção, fibrose renal, doença renal crônica, doença renal diabética, glomerulosclerose seg- mentar focal, nefropatia membranosa, nefropatia por IgA, mielofibrose, falência cardíaca, falência cardíaca aguda, falência cardíaca crônica, falência cardíaca metabólica, fibrose cardíaca, fibrose após cirurgia de catarata, catarata, cicatriz ocular, fibrose pancreática, fibrose de pele, fibrose intestinal, estenoses intestinais, fibrose endomiocárdica, fibrose atrial, fibrose mediastinal, doença de Crohn, fibrose retroperitoneal, quelóide, fibrose sistêmica nefrogênica, escleroderma, esclerose sis- têmica, artrofibrose, síndrome de Peyronie, contratura de Dupuytren, neuropatia diabética, capsulite adesiva, doença hepática alcoólica, he- pato esteatose, hepatite viral, doença biliar, hemocromatose primária, cirrose relacionada com fármacos, cirrose criptogênica, doença de Wilson, e, deficiência de alfa 1-antitripsina, doença pulmonar interstici- al (ILD), doença pulmonar fibrótica humana, fibrose hepática, degene- ração macular, retinopatia retinal, retinopatia vítrea, fibrose do miocár- dio, oftalmopatia de Grave, ergotismo induzido por fármacos, doença cardiovascular, aterosclerose / restenose, cicatrizes hipertróificas, mi- elofibrose primária ou idiopática, e doença intestinal inflamatória (inclu- indo, porém sem limitação, colite colagenosa). Em alguns aspectos, a doença associada com fibrose resulta de um ou mais entre doença pulmonar, câncer de pulmão, terapia medicamentosa, quimioterapia, ou terapia de radiação.
Em alguns aspectos, a doença associada com fibrose resulta de um ou mais entre envelhecimento, ataque cardíaco,
derrame, lesão do miocárdio, ou disfunção ventricular esquerda. Em alguns aspectos, a doença associada com fibrose pode ser seleciona- da entre fibrose renal, nefrite glomerular, doença renal crônica, falên- cia renal crônica, e nefrite associada com lúpus sistêmico, câncer, obs- truções físicas, toxinas, doença metabólica, doenças imunológicas, ou nefropatia diabética. Em alguns aspectos, a doença associada com fibrose resulta de um ou mais entre trauma, lesão vertebral, infecção, cirurgia, lesão isquêmica, ataque cardíaco, queimaduras, exposição a poluente ambiental, pneumonia, tuberculose, ou síndrome da angústi- ca respiratória aguda. Em alguns aspectos, a doença associada com fibrose pode ser selecionada entre fibrose pulmonar, doença pulmonar intersticial, doença pulmonar fibrótica humana, fibrose pulmonar idio- pática, fibrose hepática, fibrose cardíaca, fibrose do miocárdio, dege- neração macular, retinopatia retinal, retinopatia vítrea, oftalmopatia de Grave, ergotismo induzido por fármacos, doença cardiovascular, ate- rosclerose / restenose, quelóides e cicatrizes hipertróificas, mielofibro- se primária ou idiopática, doença intestinal inflamatória, colite colage- nosa, cicatriz ocular e fibrose após cirurgia de catarata. Em alguns as- pectos, a doença associada com fibrose pode ser selecionada entre esteato-hepatite não alcoólica, fibrose hepática, e cirrose. Em alguns aspectos, a doença associada com fibrose pode ser esteato-hepatite não alcoólica. Em alguns aspectos, a doença associada com fibrose pode ser selecionada entre doença renal diabética, doença renal crô- nica, e fibrose renal. Em alguns aspectos, a doença associada com fibrose pode ser selecionada entre falência cardíaca metabólica e fi- brose cardíaca. Em alguns aspectos, a doença associada com fibrose pode ser fibrose pulmonar.
[0259] Em alguns aspectos, a presente divulgação proporciona um método de reduzir a a fração de gordura hepática em um sujeito que necessite do mesmo, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica compreen- dendo um polipeptídeo FGF-21 descrito aqui, neste requerimento de patente, em que opcionalmente o sujeito está em risco de desenvolver ou foi diagnosticado com esteato-hepatite não alcoólica.
[0260] Em alguns aspectos, a presente divulgação proporciona um método de reduzir a rigidez hepática, diminuir a percentagem de gor- dura corporal, diminuir o peso corporal, diminuir a proporção de peso de fígado para corpo, diminuir o conteúdo de lipídeos do fígado, dimi- nuir a área de fibrose hepática, diminuir os níveis de glicose sanguínea em jejum, triglicerídeos em jejum, diminuir o colesterol LDL, diminuir os níveis de ApoB, diminuir os níveis de ApoC, e/ou aumentar o colesterol HDL em um sujeito que necessite do mesmo, compreendendo a admi- nistração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma formulação far- macêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 descrito aqui, neste requerimento de patente, em que opcionalmente o sujeito está em risco de desenvolver ou foi diagnosticado com esteato-hepatite não alcoólica.
[0261] Em alguns aspectos, a presente divulgação proporciona um método de aumentar os níveis de adiponectina em um sujeito que ne- cessite do mesmo, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21, em que opcionalmente o referido sujeito está em risco de desenvolver ou foi diagnosticado com esteato-hepatite não alcoólica.
[0262] Em alguns aspectos, a presente divulgação proporciona um método de tratamento de um ou mais sintomas associados com estea- to-hepatite não alcoólica em um sujeito que necessite do mesmo, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21.
[0263] Também são proporiconados aqui, neste requerimento de patente, métodos de tratamento ou prevenção de esteato-hepatite não alcoólica em um sujeito que necessite do mesmo, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação farmacêutica descrita aqui, neste requerimento de patente, compreendendo um polipeptídeo FGF-21 modificado compre- endendo SEQ ID NO: 1, em que o resíduo pAF do mesmo é ligado a uma porção de poli(etileno glicol) com um peso molecular de cerca de 30 kDa (PEG-FGF-21).
[0264] Em alguns aspectos, o sujeito pode apresentar fibrose es- tágio 1 a 3 pelo sistema NASH CRN, a qual opcionalmente é determi- nada por uma biópsia hepática. Em alguns aspectos, antes do trata- mento o sujeito pode apresentar um índice de fígado gorduroso de no mínimo cerca de 60. Em alguns aspectos, antes do tratamento o sujei- to pode apresentar uma percentagem da fração de gordura hepática de no mínimo 10%, a qual opcionalmente é determinada por estudo por imagens de ressonância magnética.
[0265] Em alguns aspectos, a divulgação proporciona um método de tratamento de diabetes tipo 1 ou diabetes tipo 2 em um sujeito que necessite do mesmo, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação farma- cêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 descrito aqui, neste requerimento de patente. Em alguns aspectos, a divulgação proporci- ona um método de tratamento de obesidade em um sujeito que neces- site do mesmo, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 descrito aqui, neste requeri- mento de patente. Em alguns aspectos a divulgação proporciona um método de regulação de no mínimo um de homeostasia de lipídeos e glicose, captação de glicose, expressão de GLUT 1, e/ou concentra-
ções séricas de glicose, triglicerídeos, insulina ou glucagon em um su- jeito que necessite do mesmo, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 descrito aqui, neste requeri- mento de patente.
[0266] Em alguns aspectos, a divulgação proporciona um método de aumentar a sensibilidade a insulina, aumentar os níveis de adipo- nectina, reduzir os níveis de glicose sanguínea, reduzir os níveis de glucagon, reduzir os níveis de triglicerídeos, reduzir os níveis de fruto- samina, reduzir os níveis de colesterol de baixa densidade, ou reduzir os níveis de Proteína C-reativa em um sujeito que necessite do mes- mo, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptí- deo FGF-21 descrito aqui, neste requerimento de patente.
[0267] Em alguns aspectos, a divulgação proporciona um método de tratamento de uma condição ou um distúrbio selecionado entre obesidade, diabetes, pancreatite, resistência a insulina, hiperinsuline- mia, intolerância a glicose, hiperglicemia, síndrome metabólica, tole- rância a glicose prejudicada, clearance de glicose inadequado, alta glicose sanguínea, e síndrome de Prader-Willi em um sujeito que ne- cessite do mesmo, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 descrito aqui, neste requerimento de patente.
[0268] Em alguns aspectos a divulgação proporciona um método de tratamento de uma condição ou um distúrbio relacionado com insu- lina selecionado entre Resistência a insulina Tipo A, Resistência a in- sulina Tipo C (Síndrome AKA HAIR-AN), Síndrome de Rabson- Mendenhall, Síndrome de Donohue ou Leprechaunismo, hiperandro- genismo, hirsuitismo, ou acantose nigricans em um sujeito que neces- site do mesmo, compreendendo a administração ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 descrito aqui, neste requerimento de patente.
[0269] Em alguns aspectos, as formulações farmacêuticas com- preendendo um polipeptídeo FGF-21 descritas aqui, neste requerimen- to de patente, podem ser administradas através de injeção. Em alguns aspectos, as formulações farmacêuticas compreendendo um polipep- tídeo FGF-21 descritas aqui, neste requerimento de patente, podem ser administradas através de injeção subcutânea, injeção IV, injeção intraperitoneal ou injeção intramuscular.
[0270] Em alguns aspectos, as formulações farmacêuticas com- preendendo um polipeptídeo FGF-21 descritas aqui, neste requerimen- to de patente, podem ser administradas em uma frequência de cerca de uma vez ao dia, ou menos frequentemente do que cerca de uma vez ao dia. Em alguns aspectos, as formulações farmacêuticas com- preendendo um polipeptídeo FGF-21 descritas aqui, neste requerimen- to de patente, podem ser administradas em uma frequência de cerca de duas vezes por semana, ou menos frequentemente do que cerca de duas vezes por semana. Em alguns aspectos, as formulações far- macêuticas compreendendo um polipeptídeo FGF-21 descritas aqui, neste requerimento de patente, podem ser administradas em uma fre- quência de cerca de uma vez por semana, ou menos frequentemente do que cerca de duas vezes por semana. Em alguns aspectos, as for- mulações farmacêuticas compreendendo um polipeptídeo FGF-21 descritas aqui, neste requerimento de patente, podem ser administra- das em uma frequência de cerca de uma vez por duas semanas, ou menos frequentemente do que cerca de duas vezes por semana. Em alguns aspectos, as formulações farmacêuticas compreendendo um polipeptídeo FGF-21 descritas aqui, neste requerimento de patente, podem ser administradas em uma frequência de cerca de uma vez por quatro semanas, ou menos frequentemente do que cerca de duas ve-
zes por semana. Em alguns aspectos, as formulações farmacêuticas compreendendo um polipeptídeo FGF-21 descritas aqui, neste reque- rimento de patente, podem ser administradas em uma frequência de cerca de uma vez por mês, ou menos frequentemente do que cerca de uma vez por mês. Em alguns aspectos, as formulações farmacêuticas compreendendo um polipeptídeo FGF-21 descritas aqui, neste reque- rimento de patente, podem ser administradas em uma frequência de uma vez por quatro semanas. Em alguns aspectos, as formulações farmacêuticas compreendendo um polipeptídeo FGF-21 descritas aqui, neste requerimento de patente, podem ser administradas em uma fre- quência de cerca de uma vez ao dia. Em alguns aspectos, as formula- ções farmacêuticas compreendendo um polipeptídeo FGF-21 descritas aqui, neste requerimento de patente, podem ser administradas em uma frequência de cerca de uma vez por semana.
[0271] Em alguns aspectos, as formulações farmacêuticas com- preendendo um polipeptídeo FGF-21 descritas aqui, neste requerimen- to de patente, podem ser administradas em uma quantidade selecio- nada entre cerca de 1 mg, cerca de 2 mg, cerca de 5 mg, cerca de 10 mg, cerca de 15 mg, cerca de 20 mg, cerca de 25 mg, cerca de 30 mg, cerca de 35 mg, cerca de 40 mg, cerca de 45 mg, cerca de 50 mg, cerca de 55 mg, cerca de 60 mg, cerca de 65 mg, cerca de 70 mg, cerca de 75 mg, cerca de 80 mg, cerca de 85 mg, cerca de 90 mg, cerca de 95, e cerca de 100 mg de polipeptídeo FGF-21 por dose.
[0272] Por exemplo, uma formulação farmacêutica compreenden- do um polipeptídeo FGF-21 descrita aqui, neste requerimento de pa- tente, pode ser administrada a um sujeito em uma concentração de polipeptídeo FGF-21 de entre cerca de 0,1 e 100 mg/kg de peso cor- poral do sujeito receptor. Em alguns aspectos, uma formulação farma- cêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 descrita aqui, neste requerimento de patente, pode ser administrada a um sujeito em uma concentração de polipeptídeo FGF-21 de cerca de 0,5 a 5 mg/kg de peso corporal do sujeito receptor. Em outro aspecto, uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21 descrita aqui, neste requerimento de patente, pode ser administrada a um sujeito receptor com uma frequência de entre uma vez ao dia e uma vez por duas semanas, tal como cerca de uma vez ou duas vezes por semana, uma vez a cada dois dias, uma vez a cada três dias, uma vez a cada quatro dias, uma vez a cada cinco dias, ou uma vez a cada seis dias.
[0273] As formulações farmacêuticas da presente divulgação po- dem ser administradas por qualquer via convencional adequada para proteínas ou peptídeos, incluindo, porém sem limitação, por via paren- teral, por exemplo, injeções incluindo, porém sem limitação, por via subcutânea ou por via intravenosa ou qualquer outra forma de injeções ou infusões. IV. Polipeptídeos FGF-21 modificados
[0274] Os polipeptídeos FGF-21 modificados da presente divulga- ção englobam polipeptídeos FGF-21 compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos, adições ou deleções. Por exemplo, os polipeptídeos FGF-21 modificados da presente divulgação compreen- dem uma ou mais substituições de aminoácidos (por exemplo com aminoácidos que ocorrem naturalmente ou que não ocorrem natural- mente), deleções (deleções terminais ou internas), ou modificação tal como a anexação de uma porção heteróloga (C-terminal, N-terminal, ou interna, quer por intercalação / inserção na sequência de aminoáci- dos ou por anexação de cadeia lateral). Em alguns aspectos específi- cos, o polipeptídeo FGF-21 modificado compreende uma versão modi- ficada de SEQ ID NO: 3 (FGF-21 selvagem), ou SEQ ID NO: 1 (se- quência selvagem modificada por substituição da glutamina 109 com para-acetil-L-fenilalanina). Em alguns aspectos específicos, o polipep- tídeo FGF-21 modificado é um derivado de SEQ ID NO: 1, por exem-
plo, por meio de anexação de uma porção heteróloga (por exemplo, PEG). Em um aspecto específico, o FGF-21 modificado é PEG-FGF- 21 (SEQ ID NO: 2). TABELA 1: Sequências de Polipeptídeos FGF-21 SEQ ID Descrição Sequência
NO 1 Q109 FGF- MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRLYTDDAQQTEAH 21 modifica- LEIREDGTVGAADQSPESLLQLKALKPGVIQILG do VKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELL LEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLPGNKSPHRDP
APRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVG
SSDPLSMVGPSQGRSPSYAS pAF = para-acetil-L-fenilalanina 2 PEG-FGF- MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEA 21 HLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQ PEGuilado ILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRE Q109 LLLEDGYNVY(pAF)SEAHGLPLHLPGNKSPHR FGF-21 mo- DPAPRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPD dificado VGSSDPLSMVGPSQGRSPSYAS em que pAF é ligado a um PEG de 30 kDa 3 FGF-21 Na- MHPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEA tivo HLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKALKPGVIQ
ILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRE LLLEDGYNVYQSEAHGLPLHLPGNKSPHRDPA PRGPARFLPLPGLPPAPPEPPGILAPQPPDVGS
SDPLSMVGPSQGRSPSYAS A glutamina (Q) modificada nas SEQ ID NOS:1 e 2 está sublinhada.
[0275] O termo polipeptídeo FGF-21 modificado também engloba polimorfismos (por exemplo, variantes de sequências de FGF-21 que ocorrem naturalmente), por exemplo, a forma P- ou a forma L- de FGF-21.
[0276] Foram descritas substituições em uma ampla variedade de posições de aminoácidos em FGF-21 que ocorre naturalmente. Substi- tuições incluindo, mas não limitadas a, substituições que modulam a solubilidade ou a estabilidade, aumento da atividade agonista, aumen- to da meia-vida in vivo ou in vitro, aumento da resistência a protease, conversão do polipeptídeo em um antagonista, redução da imunogeni- cidade ou toxicidade, facilitação da purificação ou da manufaturabili- dade, ou qualquer combinação das mesmas, e também são engloba- das pelo termo polipeptídeo FGF-21 modificado.
[0277] Em alguns casos, a uma ou mais substituições de aminoá- cidos codificados não naturalmente podem ser combinadas com outras adições, substituições ou deleções dentro do polipeptídeo FGF-21 modificado para afetar outros traços biológicos do polipeptídeo FGF-21 modificado em relação a outro polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, o polipeptídeo FGF-21 selvagem de SEQ ID NO: 3, o polipeptídeo FGF- 21 modificado de SEQ ID NO: 1, o PEG-polipeptídeo FGF-21 de SEQ ID NO: 2, o mesmo polipeptídeo FGF-21 sem a adição, substituição, ou deleção, ou outro FGF-21 não modificado ou modificado ou poli- peptídeo não modificado ou modificado).
[0278] Em alguns casos, as outras adições, substituições ou dele- ções podem aumentar a estabilidade (incluindo, mas não limitada a, resistência a degradação proteolítica) do polipeptídeo FGF-21 modifi- cado ou aumentar a afinidade do polipeptídeo FGF-21 modificado para seu receptor. Em alguns casos, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a estabilidade farmacêutica do polipeptídeo FGF-21 modificado. Em alguns casos, as outras adições, substituições ou deleções podem aumentar a solubilidade do polipeptídeo FGF-21 modificado.
[0279] Em alguns aspectos, são selecionados sítios para substitui- ção com um aminoácido codificado naturalmene ou não natural além de ourto sítio para incorporação de um aminoácido não natural que resulte em aumento da solubilidade do polipeptídeo depois de expres- são em uma célula hospedeira recombinante.
[0280] Em alguns aspectos, os polipeptídeos FGF-21 modificados compreendem outra adição, substituição ou deleção que modula a afi- nidade para o receptor do polipeptídeo FGF-21, proteínas de ligação, ou ligante associado, modula a transdução de sinal depois de ligação ao receptor de FGF-21, modula a meia-vida circulante, modula a libe- ração ou a biodisponibilidade, facilita a purificação, ou melhora ou alte- ra uma via de administração em particular.
[0281] Em alguns aspectos, os polipeptídeos FGF-21 modificados compreendem uma adição, substituição ou deleção que aumenta a afinidade do FGF-21 modificado por seu receptor. De modo similar, polipeptídeos FGF-21 modificados podem compreender sequências de clivagem enzimática ou química, sequências de clivagem de protease, grupos reativos, domínios de ligação ao anticorpo (incluindo, mas não limitados a, FLAG ou poli-His) ou outras sequências baseadas em afi- nidade (incluindo, porém sem limitação, FLAG, poly-His, GST, etc.) ou moléculas ligadas (incluindo, porém sem limitação, biotina) que melho- ram a detecção (incluindo, porém sem limitação, GFP), a purificação, o transporte através dos tecidos ou das membranas celulares, a libera- ção ou ativação de pró-drogas, a redução de tamanho do FGF-21 mo- dificado, ou outros traços do polipeptídeo.
[0282] Foram identificados múltiplos polimorfismos de FGF-21. Leu- cina ou prolina foram descritas na mesma posição na Publicação de Pa- tente U.S. No. 20010012628 e na Pat. U.S. No. 6.716.626. Sequências lider ou de sinal N-terminal que diferrm por 1 aminoácido (leucina) são mostradas na Pat. U.S. No. 6.716.626 e na Publicação de Patente U.S. No. 20040259780. Variantes ou mutantes de polipeptídeos FGF-21 in- cluem, mas não estão limitados a, os descritos na Pat. U.S. No.
6.716.626; na Publicação de Patente U.S. Nos. 2005/0176631, 2005/0037457, 2004/0185494, 2004/0259780, 2002/0164713, e 2001/0012628; WO 01/36640; WO 03/011213; WO 03/059270; WO 04/110472; WO 05/061712; WO 05/072769; WO 05/091944; WO 05/113606; WO 06/028595; WO 06/028714; WO 06/050247; WO 06/065582; WO 06/078463; WO01/018172; WO09/149171; WO10/042747; WO12/066075; WO11/154349; WO13/052311; WO13/188181, as quais são incorporadas por meio de referência em sua totalidade aqui, neste requerimento de patente.
[0283] O termo polipeptídeo FGF-21 modificado também inclui fra- gmentos biológicamente ativos, variantes biológicamente ativas e este- reoisômeros do FGF-21 que ocorre naturalmente bem como variantes agonistas, miméticas, e antagonistas do FGF-21 que ocorrem natural- mente e fusões polipeptídicas das mesmas. Fusões compreendendo aminoácidos adicionais no término amino, no término carboxila, ou ambos, são englobados pelo termo polipeptídeo FGF-21 modificado.
[0284] Exemplos de fusões incluem, mas não estão limitados a, por exemplo, metionil FGF-21 no qual uma metionina é ligada ao tér- mino N de FGF-21 resultante da expressão recombinante da forma madura de FGF-21 carecendo do peptídeo lider ou de sinal ou porção do mesmo (uma metionina é ligada ao término N de FGF-21 resultante da expressão recombinante, por exemplo, em E. coli), fusões para o fim de purificação (incluindo, porém sem limitação, a poli-histidina ou epítopes de afinidade), fusões com peptídeos de ligação a albumina do soro, tais como PKE adnectina e fusões com proteínas do soro tais como albumina do soro, e proteínas de fusão compreendendo FGF-21 e uma ou mais outras moléculas (porções heterólogas), incluindo, po- rém sem limitação, albumina do soro, domínio Fc, região constante de imunoglobulina, polipeptídeos não estruturados tais como XTEN, etc. Quaisquer fragmentos semelhantes podem ser preparados a partir das proteínas por métodos bioquímicos de rotina, ou expressando um poli- nucleotídeo codificando o fragmento.
[0285] O termo polipeptídeo FGF-21 modificado inclui polipeptí- deos conjugados a um polímero tal como PEG e pode compreender opcionalmente uma ou mais derivatizações adicionais de cisteína, lisi- na, ou outros resíduos. Além disso, o polipeptídeo FGF-21 modificado pode compreender um encadeador ou polímero, em que o aminoácido ao qual o encadeador ou polímero é conjugado pode ser um aminoá- cido não natural de acordo com a presente divulgação, ou pode ser conjugado a um aminoácido codificado naturalmente utilizando técni- cas conhecidas na arte tais como ligação a lisina ou cisteína.
[0286] O termo polipeptídeo FGF-21 modificado também inclui FGF-21 modificado glicosilado, tal como, porém sem limitação, poli- peptídeos glicosilados em qualquer posição de aminoácido, formas glicosiladas N-ligadas ou O-ligadas do polipeptídeo. Variantes conten- do modificações de nucleotídeo único também são consideradas como variantes biologicamente ativas do polipeptídeo FGF-21. Além disso, também são incluídas variantes de emenda.
[0287] O termo polipeptídeo FGF-21 modificado também inclui he- terodímeros de polipeptídeo FGF-21, homodímeros, heteromultímeros, ou homomultímeros de qualquer um ou mais polipeptídeos FGF-21 não modificados ou modificados ou qualquer outro polipeptídeo, prote- ína, carboidrato, polimero, molécula pequena, encadeador, ligante, ou outra molécula biologicamente ativa de qualquer tipo, ligada por meio químico ou expressa como uma proteína de fusão, bem como análo- gos de polipeptídeos contendo, por exemplo, deleções específicas ou outras modificações ainda mantêm atividade biológica.
[0288] O termo polipeptídeo FGF-21 modificado também engloba polipeptídeos FGF-21 compreendendo uma ou mais substituições, in- serções ou deleções de aminoácidos. Por exemplo, os polipeptídeos
FGF-21 modificados da presente divulgação podem compreender mo- dificações com um ou mais aminoácidos naturais, opcionalmente em conjunto com modificação de um ou mais aminoácidos não naturais. Exemplos de substituições, inserções ou deleções em uma ampla va- riedade de posições de aminoácidos nos polipeptídeos FGF-21, inclu- indo, mas não limitados a substituições que modulam a estabilidade farmacêutica, que modulam uma ou mais das atividades biológicas do polipeptídeo FGF-21, tais como, mas não limitadas a, aumento da ati- vidade agonista, aumento da solubilidade do polipeptídeo, diminuição da suscetibilidade para protease, diminuição da desamidação, conver- são do polipeptídeo em um antagonista, redução da imunogenicidade ou da toxicidade, ou facilitação da purificação ou da manufaturabilida- de, etc. são englobados pelo termo polipeptídeo FGF-21 modificado.
[0289] Em alguns aspectos, os polipeptídeos FGF-21 modificados compreendem adicionalmente uma inserção, substituição ou deleção adicional que modula a atividade biológica do polipeptídeo FGF-21 modificado. Por exemplo, as adições, substituições ou deleções po- dem modular uma ou mais propriedades ou atividades de FGF-21 mo- dificado. Por exemplo, as adições, substituições ou deleções podem modular a afinidade para o receptor de polipeptídeo FGF-21, modular a meia-vida circulante, modular a meia-vida terapêutica, modular a es- tabilidade do polipeptídeo, modular a clivagem por proteases, modular a dose, modular a liberação ou a biodisponibilidade, facilitar a purifica- ção, diminuir a desamidação, aumentar a validade, ou apirmorar ou alterar uma via de administração em particular. De modo similar, poli- peptídeos FGF-21 modificados podem compreender sequências de clivagem de protease, grupos reativos, domínios de ligação ao anticor- po (incluindo, porém sem limitação, FLAG ou poli-His) ou outras se- quências baseadas em afinidade (incluindo, porém sem limitação, FLAG, poli-His, GST, etc.) ou moléculas ligadas (incluindo, porém sem limitação, biotina) que aprimoram a detecção (incluindo, porém sem limitação, GFP), purificação ou outras trações do polipeptídeo.
[0290] O termo polipeptídeo FGF-21 modificado também engloba homodímeros, heterodímeros, homomultímeros, e heteromultímeros que são formados através de parceiros de fusão, tais como domínios de Fc, ou que são ligados, incluindo, porém sem limitação, os ligados diretamente através de cadeias laterais de aminoácidos codificados não naturalmente, quer às mesmas cadeias laterais de aminoácidos codificados não naturalmente ou a diferentes cadeias laterais de ami- noácidos codificados não naturalmente, a cadeias laterais de aminoá- cidos codificados naturalmente, ou indiretamente através de um enca- deador. Exemplos de encadeadores incluindo, porém sem limitação, compostos orgânicos pequenos, polímeros hidrossolúveis de uma va- riedade de comprimentos tais como poli(etileno glicol) ou polidextrano, ou polipeptídeos de vários comprimentos.
[0291] Em alguns aspectos, um aminoácido codificado não natu- ralmente descrito aqui, neste requerimento de patente, pode compre- ender um grupo carbonila, um grupo aminoóxi, um grupo hidrazida, um grupo hidrazina, um grupo semicarbazida, um grupo azida, ou um gru- po alquina. Em alguns aspectos, o aminoácido codificado não natural- mente compreende uma porção carbonila e é ligado a um encadeador, um polímero, uma molécula biologicamente ativa, ou uma porção de extensão da meia-vida compreendendo uma porção aminoóxi, uma hidrazina, uma hidrazida ou a semicarbazida. Em alguns aspectos, o aminoácido codificado não naturalmente compreende uma porção aminoóxi, hidrazina, hidrazida ou semicarbazida, a qual é ligada a um encadeador, um polímero, uma molécula biologicamente ativa, ou uma porção de extensão da meia-vida através de uma ligação de amida.
[0292] Em alguns aspectos, o aminoácido codificado não natural- mente compreende uma porção de alquina a qual é ligada a um enca-
deador, um polímero, uma molécula biologicamente ativa, ou uma por- ção de extensão da meia-vida através de uma porção azida. Em al- guns aspectos, o aminoácido codificado não naturalmente compreen- de uma porção azida a qual é ligada a um encadeador, um polímero, uma molécula biologicamente ativa, ou uma porção de extensão da meia-vida compreendendo uma porção alquina. Em alguns aspectos, o aminoácido codificado não naturalmente compreende uma porção azi- da ou alquina a qual é ligada a um encadeador, um polímero, uma mo- lécula biologicamente ativa, ou uma porção de extensão da meia-vida através de uma ligação de amida.
[0293] Em alguns aspectos, o aminoácido codificado não natural- mente é ligado a um encadeador, um polímero, uma molécula biologi- camente ativa, ou uma porção de extensão da meia-vida através de uma ligação oxima. Em alguns aspectos, o aminoácido codificado não naturalmente é ligado a um encadeador, um polímero, uma molécula biologicamente ativa, ou uma porção de extensão da meia-vida atra- vés de uma ligação oxima, em que a referida ligação oxima tem a es- trutura resultante da reação de um grupo carbonila e um grupo de aminoóxi. Em alguns aspectos, o aminoácido codificado não natural- mente é ligado a um encadeador, um polímero, uma molécula biologi- camente ativa, ou uma porção de extensão da meia-vida através de uma ligação oxima, em que a referida ligação oxima tem a estrutura resultante da reação de um grupo carbonila contido no referido amino- ácido codificado não naturalmente e grupo aminoóxi contido no referi- do encadeador, no referido polímero, na referida molécula biologica- mente ativa, ou na referida porção de extensão da meia-vida.
[0294] Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 modificado descrito aqui, neste requerimento de patente, possui no mínimo uma atividade biológica do polipeptídeo FGF-21 humano selvagem tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
[0295] Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 modificado compreende no mínimo um ou mais minoádcidos codificados não na- turalmente ligados a um polímero hidrossolúvel compreendendo uma porção de poli(etileno glicol). Em alguns aspectos, um ou mais amino- ácidos codificados não naturalmente são incorporados em uma ou mais das seguintes posições em FGF-21 modificado: antes da posição 1 (isto é no terminal amino), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182 (isto é, no terminal carboxila da proteína) (posições de aminoácidos correspondentes à SEQ ID NO: 3).
[0296] Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 em uma formula- ção farmacêutica descrita aqui, neste requerimento de patente, é um po- lipeptídeo FGF-21 modificado descrito, por exemplo, na Patente U.S. Nos. 9.273.106; 9.458.214; 9.744.213; 8.541.369; 8.188.040; 9.120.871;
9.895.417; 9.266.935; 6.716.626; 4.904.584; ou 8.722.622; na Publicação do Requerimento de Patente U.S. No. 2013/0231277; 2009/0305986; 2011/0195895; 2010/0216715; 2001/0012628; 2004/0259780; 2005/0176631; 20070293430; ou 2012/0035099; ou na Publicação do Requerimento de Patente Internacional PCT Nos. WO2016048999; WO2010065439; WO2017093465; WO2003011213; WO2003059270; WO2005091944; WO2008121563; WO199967291, WO199903887,
WO200026354; ou WO2017220706; todos os quais são incorporados aqui, neste requerimento de patente, por meio de referência em suas to- talidades. V. Porções de extensão da meia-vida
[0297] Os polipeptídeos FGF-21 da presente divulgação podem compreender uma porção heteróloga, a qual em alguns aspectos é uma porção de extensão da meia-vida. Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida é uma porção polipeptídica, ao passo que em alguns outros aspectos a porção de extensão da meia-vida é uma porção não polipeptídica. Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 compreende uma única porção de extensão da meia-vida. No entanto, em outros aspectos, um polipeptídeo FGF-21 descrito aqui, neste re- querimento de patente, pode compreender mais de uma porção de ex- tensão da meia-vida.
[0298] Porções de extensão da meia-vida incluem porções de ex- tensão da meia-vida não proteináceas e proteináceas. Porções de ex- tensão da meia-vida não proteináceas incluem, por exemplo, políme- ros hidrossolúveis tais como polietileno glicol (PEG), hidroxietil amido (HES), lipídeos, grupos de acil ramificados ou não ramificados, grupos de acil C8-C30 ramificados ou não ramificados, grupos de alquil ramifi- cados ou não ramificados, e alguns grupos de alquil C8-C30 ramificados ou não ramificados. Porções proteináceas de extensão da meia-vida incluem, por exemplo, albumina do soro, transferrina, adnectinas (por exemplo, adnectinas de ligação a albumina ou de extensão farmacoci- nética (PKE)), domínios de Fc, e polipeptídeos não estruturados, tais como XTEN e PAS (por exemplo, sequências polipeptídicas desorde- nadas estruturalmente composdas dos aminoácidos Pro, Ala, e/ou Ser), bem como um fragmento de qualquer um dos precedentes.
[0299] Um exame da estrutura de cristal de FGF-21 ou de um ou mais membros da famíolia de FGF e sua interação com o receptor de
FGF pode indicar quais resíduos de aminoácidos determinados têm cadeias laterais que são totalmente ou parcialmente acessíveis para solvente. A cadeia lateral de um aminoácido codificado não natural- mente nestas posições pode apontar para longe da superfície da pro- teína e para o solvente e deste modo ser ligada, por exemplo, a um polímero hidrossolúvel. (a) Região Constante da Imunoglobulina ou Porção da Mesma
[0300] Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 é ligado, por exemplo, fundido ou conjugado, a uma região constante de imunoglo- bulina ou uma porção da mesma. Uma região constante de imunoglo- bulina consiste em domínios denotados domínios CH (pesados cons- tantes) (CH1, CH2, etc.). Dependendo do isótipo, (isto é IgG, IgM, IgA IgD, ou IgE), a região constante pode consistir em três ou quatro do- mínios CH. Algunas regiões constantes de isótipos (por exemplo, IgG) também contêm uma região de articulação. Vide Janeway et al. 2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.
[0301] Uma região constante de imunoglobulina ou uma porção da mesma para produzir a proteína de fusão da presente divulgação pode se obtida a partir de uma série de fontes diferentes. Em alguns aspec- tos, uma região constante de imunoglobulina ou uma porção da mes- ma é derivada de uma imunoglobulina humana. No entanto, deve ser entendido que a região constante de imunoglobulina ou uma porção da mesma pode ser derivada de uma imunoglobulina de outra espécie de mamífero, incluindo, por exemplo, um roedor (por exemplo, um ca- mundongo, um rato, um coelho, um porquinho da índia) ou uma espé- cie de primata não humano (por exemplo, chimpanzé, macaco). Além disso, a região constante de imunoglobulina ou uma porção da mesma pode ser derivada a partir de qualquer classe de imunoglobulina, inclu- indo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isótipo de imunoglobulina, incluindo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Em um aspecto, é usado o isótipo humano IgG1.
[0302] Uma variedade de sequências genéticas de regiões cons- tantes de imunoglobulina (por exemplo, sequências genéticas de regi- ões constantes humanas) está disponível sob a forma de depósitos acessíveis publicamente. Podem ser selecionadas sequências de do- mínios de regiões constantes tendo uma função efetora particular (ou carecendo de uma função efetora particular) ou com uma modificação particular para reduzir a imunogenicidade. Muitas sequências de anti- corpos e genes de codificação de anticorpos foram publicadas e se- quências de regiões constantes de Ig adequadas (por exemplo, se- quências de articulação, CH2, e/ou CH3, ou porções das mesmas) po- dem ser derivadas a partir destas sequências usando técnicas reco- nhecidas na arte. O material genético obtido usando qualquer um dos métodos precedentes pode ser então alterado ou sintetizado para ob- ter os polipeptídeos da presente divulgação. Será adicionalmente re- conhecido que o âmbito desta divulgação engloba alelos, variantes e mutações de sequências de DNA de regiões constantes.
[0303] As sequências da região constante de imunoglobulina ou uma porção da mesma podem ser clonadas, por exemplo, usando a reação de cadeia polimerase e primers os quais são selecionados para amplificar o domínio de interesse. Para clonar uma sequência da regi- ão constante de imunoglobulina ou uma porção da mesma a partir de um anticorpo, pode ser isolado mRNA a partir de células de hibridoma, do baço, ou linfáticas, transcrito reverso em DNA, e genes de anticor- po amplificados por PCR. Métodos de amplificação por PCR são des- critos em detalhes na Pat. U.S. Nos. 4.683.195; 4.683.202; 4.800.159;
4.965.188; e, por exemplo, em "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho et al. 1989. Gene 77:51; Horton et al. 1993. Methods Enzymol. 217:270). A reação de PCR pode ser iniciada por primers de região constante de consenso ou por primers mais específicos com base nas sequências de DNA de cadeias pesadas e leves e de amino- ácidos publicadas. Conforme discutido acima, também pode ser usada PCR para isolar clones de DNA codificando as cadeias leves e pesa- das de anticorpo. Neste caso, as bibliotecas podem ser triadas por primers de consenso ou sondas homólogas maiores, tais como sondas de regiões constantes de camundongo. Numerosos conjuntos de pri- mers adequados para amplificação de genes de anticorpos são co- nhecidos na arte (por exemplo, primers 5’ com base na sequência de terminal amino de anticorpos purificados (Benhar and Pastan. 1994. Protein Engineering 7:1509); rápid amplificação de extremidades do cDNA (Ruberti, F. et al. 1994. J. Immunol. Methods 173:33); sequên- cias líderes de anticorpos (Larrick et al. 1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250). A clonagem de sequências de anticorpos é adi- cionalmente descrita em Newman et al., Pat. U.S. No. 5.658.570, re- gistrada em 25 de janeiro de 1995.
[0304] Uma região constante de imunoglobulina usada aqui, neste requerimento de patente, pode incluir todos os domínios e a região de articulação ou porções da mesma. Em um aspecto, a região constante de imunoglobulina ou uma porção da mesma compreende o domínio CH2, o domínio CH3, e uma região de articulação, isto é, uma região de Fc ou um parceiro de ligação a FcRn.
[0305] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "região de Fc" é definido como a porção de um polipeptídeo que corresponde à região de Fc da imunoglobulina nativa, isto é, conforme formado pela associação dimérica dos domínios Fc respectivos de su- as duas cadeias pesadas. Uma região de Fc nativa forma um homo- dímero com outra região de Fc.
[0306] Em um aspecto, a "região de Fc" se refere à porção de uma única cadeeia pesada de imunoglobulina iniciando na região de articu-
lação logo a montante do sítio de clivagem de papaína (isto é resíduo 216` em IgG, levando o primeiro resíduo de região constante de ca- deia pesada a ser 114) e terminando no término carbóxi do anticorpo. Por conseguinte, um domínio Fc completo compreende no mínimo um domínio de articulação, um domínio CH2, e um domínio CH3.
[0307] A região de Fc de uma região constante de imunoglobulina, dependendo do isótipo de imunoglobulina pode incluem domínios CH2, CH3, e CH4, bem como a região de articulação. Proteínas de fusão compreendendo uma região de Fc de uma imunoglobulina con- ferem várias propriedades desejáveis a uma proteína de fusão incluin- do aumento da estabilidade, aumento da meia-vida sérica (vide Capon et al., 1989, Nature 337:525) bem como ligação a receptores de Fc tais como o receptor de Fc neonatal (FcRn) (Pat. U.S. Nos. 6.086.875,
6.485.726, 6.030.613; WO 03/077834; US2003-0235536A1).
[0308] Em alguns aspectos, a "região de Fc" inclui uma sequência de aminoácidos de um domínio Fc ou derivada de um domínio Fc. Em alguns aspectos, uma região de Fc compreende no mínimo um de: um domínio de articulação (por exemplo, uma região de articulação supe- rior, média, e/ou inferior) (cerca dos aminoácidos 216 a 230 de uma região de Fc de anticorpo de acordo com a numeração UE), um domí- nio CH2 (cerca dos aminoácidos 231 a 340 de uma região de Fc de anticorpo de acordo com a numeração UE), um domínio CH3 (cerca dos aminoácidos 341 a 438 de uma região de Fc de anticorpo de acordo com a numeração UE), um domínio CH4, ou uma variante, porção, ou fragmento do mesmo. Em outros aspectos, uma região de Fc compreende um domínio Fc completo (isto é, um domínio de articu- lação, um domínio CH2, e um domínio CH3). Em alguns aspectos, uma região de Fc compreende, consiste essencialmente em, ou con- siste em um domínio de articulação (ou uma porção do mesmo) fundi- do a um domínio CH3 (ou uma porção do mesmo), um domínio de ar-
ticulação (ou uma porção do mesmo) fundido a um domínio CH2 (ou uma porção do mesmo), um domínio CH2 (ou uma porção do mesmo) fundido a um domínio CH3 (ou uma porção do mesmo), um domínio CH2 (ou uma porção do mesmo) fundido tanto a um domínio de articu- lação (ou uma porção do mesmo) quanto a um domínio CH3 (ou uma porção do mesmo). Em ainda outros aspectos, uma região de Fc care- ce de no mínimo uma porção de um domínio CH2 (por exemplo, todo ou parte de um domínio CH2). Em um aspecto particular, uma região de Fc compreende ou consiste em aminoácidos correspondentes aos números 221 a 447 da numeração UE.
[0309] Os domínios Fc denotados como F, F1, ou F2 aqui, neste requerimento de patente, podem ser obtidos a partir de uma série de fontes diferentes. Em um aspecto, uma região de Fc do polipeptídeo é derivada de uma imunoglobulina humana. No entanto, deve ser enten- dido que uma região de Fc pode ser derivada de uma imunoglobulina de outra espécie de mamífero, incluindo por exemplo, um roedor (por exemplo, um camundongo, um rato, um coelho, um porquinho da índi- da) ou uma espécie de primata não humano (por exemplo, chimpanzé, macaco). Além disso, o polipeptídeo dos domínios Fc ou porções dos mesmos podem ser derivados de qualquer classe de imunoglobulina, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e de qualquer isótipo de imunoglo- bulina, incluindo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Em outro aspecto, é usado o isótipo humano IgG1.
[0310] Em alguns aspectos, a variante de Fc confere uma modifi- cação em no mínimo uma função efetora conferida por uma região de Fc compreendendo o domínio Fc selvagem referido (por exemplo, uma melhora ou redução na capacidade da região de Fc para se ligar a re- ceptores de Fc (por exemplo, FcγRI, FcγRII, ou FcγRIII) ou a proteínas do complemento (por exemplo, C1q), ou para acionar citotoxicidade dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, ou citotoxicidade depen-
dente do complemento (CDCC)). Em outros aspectos, a variante de Fc proporciona um resíduo de cisteína manipulado.
[0311] As regiões de Fc da divulgação podem empregar variantes de Fc reconhecidas na arte, as quais são conhecidas por conferir uma modi- ficação (por exemplo, um aumento ou uma redução) na função efetora e/ou ligação ao FcR. Especificamente, uma molécula de ligação da divul- gação pode incluir, por exemplo, uma modificação (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais das posições de aminoácidos descritas nas Publicações de Requerimento de Patente Internacional PCT WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, e WO06/085967A2; nas Publicações de Patente US Nos. US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056 ; ou nas Patentes US Nos. 5.648.260; 5.739.277; 5.834.250; 5.869.046; 6.096.871;
6.121.022; 6.194.551; 6.242.195; 6.277.375; 6.528.624; 6.538.124;
6.737.056; 6.821.505; 6.998.253; 7.083.784; 7.404.956. e 7.317.091. Em um aspecto, a modificação específica (por exemplo, a substituição espe- cífica de um ou mais aminoácidos descritos na arte) pode ser feita em uma ou mais das posições de aminoácidos descritas. Em outro aspecto, pode ser feita uma modificação diferente em uma ou mais das posições de aminoácidos descritas (por exemplo, a substituição diferente de uma ou mais posições de aminoácidos descritas na arte).
[0312] A região de Fc de IgG pode ser modificada de acordo com procedimentos bem reconhecidos, tais como mutagênese direcionada ao sítio e e semelhantes para produzir fragmentos de Fc ou IgG modi- ficados ou porções dos mesmos que vão ser ligados por receptores de Fc.
As modificações referidas incluem modificações remotas dos sítios de contato com receptores de Fc bem como modificações dentro dos sítios de contato que preservam ou mesmo reforçam ligação aos re- ceptores de Fc.
Por exemplo, os únicos resíduos de aminoácidos se- gujntes em Fc de IgG1 humana (Fcγ1) podem ser substituídos sem perda significativa de afinidade de ligação de Fc para receptores de Fc: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, e K447A, onde, por exemplo, P238A representa prolina selvagem substituída por alanina na posição de número 238. Como um exemplo, um aspecto específico incorpora a mutação N297A, removendo um sítio de N-glicosilação altamente con- servado.
Além de alanina, outros aminoácidos podem ser substituídos pelos aminoácidos selvagens nas posições especificadas acima.
Po- dem ser introduzidas mutações em Fc dando origem a mais de uma centena de regiões de Fc distintas do Fc nativo.
Adicionalmente, com- binações de duas, três, ou mais destas mutações individuais podem ser introduzidas juntas, dando origem a mais centenas de regiões de Fc. Além disso, uma da região de Fc de um constructo da divulgação pode ser mutada e a outra região de Fc do constructo não mutada de modo algum, ou ambas podem ser mutadas, mas com diferentes mu- tações.
[0313] Algumas das mutações acima podem conferir nova funcio- nalidade sobre a região de Fc. Por exemplo, um aspecto incorpora N297A, removendo um sítio de N-glicosilação altamente conservado. O efeito desta mutação é reduzir a imunogenicidade, deste modo au- mentando a meia-vida circulante da região de Fc, e tornando a região de Fc incapaz de ligação ao FcγRI, ao FcγRIIA, ao FcγRIIB, e ao FcγRIIIA, sem comprometer a afinidade (Routledge et al. 1995, Trans- plantation 60:847; Friend et al. 1999, Transplantation 68:1632; Shields et al. 1995, J. Biol. Chem. 276:6591). Como um exemplo adicional de nova funcionalidade originária das mutações descritas acima, a afini- dade por receptores de Fc pode ser aumentada além da afinidade do tipo selvagem em alguns casos. Esta afinidade aumentada pode refle- tir uma taxa "on" aumentada, uma taxa "off" diminuída ou tanto uma taxa "on" aumentada quanto uma taxa "off" diminuída. Exemplos de mutações que se acredita que confiram uma afinidade aumentada pa- ra receptores de Fc incluem, mas não estão limitados a, T256A, T307A, E380A, e N434A (Shields et al. 2001, J. Biol. Chem. 276:6591).
[0314] Adicionalmente, no mínimo três receptores gama de Fc humano parecem reconhecer um sítio de ligação sobre IgG dentro da região de articulação inferior, geralmente os aminoácidos 234 a 237. Portanto, outro exemplo de nova funcionalidade e potencial imunoge- nicidade diminuída pode se originar de mutações desta região, como, por exemplo, substituindo os aminoácidos 233 a 236 da IgG1 humana "ELLG" pela sequência correspondente de IgG2 "PVA" (com uma de-
leção de aminoácido). Foi demonstrado que FcγRII, FcγRII, e FcγRIII, os quais mediam várias funções efetoras não vão se ligar a IgG1 quando as mutações referidas tiverem sido introduzidas. Ward and Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 e Armour et al. 1999, Eur. J. Immunol. 29:2613.
[0315] Em alguns aspectos, a região constante de imunoglobulina ou uma porção da mesma é hemi-glicosilada. Por exemplo, a proteína de fusão compreendendo duas regiões de Fc ou parceiros de ligação a FcRn pode conter uma primeira região de Fc glicosilada (por exemplo, uma região CH2 glicosilada) e uma segunda região de Fc aglicosilada (por exemplo, uma aglicosilada CH2 aglicosilada). Em um aspecto, um encadeador pode ser interposto entre as regiões de Fc glicosiladas e aglicosiladas. Em outro aspecto, uma região de Fc ou parceiro de liga- ção a FcRn é totalmente glicosilada, isto é, todas as regiões de Fc são glicosiladas. Em outros aspectos, uma região de Fc pode ser aglicosi- lada, isto é, nenhuma das porções de Fc são glicosiladas.
[0316] Em alguns aspectos, uma proteína de fusão da divulgação compreende uma substituição de aminoácido para uma região cons- tante de imunoglobulina ou uma porção da mesma (por exemplo, vari- antes de Fc), a qual altera as funções efetoras, independentes de an- tígeno, da região constante de Ig, em particular a meia-vida circulante da proteína.
[0317] As proteínas referidas apresentam ligação ou aumentada ou diminuída a um receptor de Fc quando em comparação com proteí- nas carecendo destas substituições e, portanto, têm uma meia-vida no soro aumentada ou diminuída, respectivamente. É previsto que varian- tes de Fc com aprimorada afinidade para um receptor de Fc tenham meias-vidas séricas mais longas, e as moléculas referidas têm aplica- ções úteis em métodos de tratamento de mamíferos onde se deseja meia-vida longa do polipeptídeo administrado, por exemplo, para tratar uma doença crônica ou um distúirbio crônico (vide, por exemplo, a Pa- tente US Nos. 7.348.004, 7.404.956, e 7.862.820). Em contraste, es- pera-s que variantes de Fc com afinidade de ligação a receptor de Fc diminuída tenham meias-vidas mais curtas, e as moléculas referidas também são úteis, por exemplo, para administração a um mamífero onde um tempo de circulação encurtado pode ser vantajoso, por exemplo, para imagens de diagnóstico in vivo ou em situações onde o polipeptídeo de partida tem efeitos colaterais tóxicos quando presente na circulação por períodos prolongados. Variantes de Fc com afinida- de de ligação ao receptor de Fc diminuída também têm menos proba- bilidade de cruzar a placenta e, portanto, também são úteis no trata- mento de doenças ou transtornos em mulheres grávidas.
[0318] Além disso, outras aplicações nas quais pode ser desejada reduzida afinidade de ligação ao receptor de Fc incluem as applica- ções nas quais se deseja localização no cérebro, no rim, e/ou no fíga- do. Em um aspecto exemplar, as proteínas de fusão da divulgação apresentam transporte reduzido através do epitélio dos glomérulos re- nais a partir da vasculatura. Em outro aspecto, as proteínas de fusão da divulgação apresentam transporte reduzido através da barreira he- matoencefálica (BBB) do cérebro, para dentro do espaço vascular. Em um aspecto, uma proteína com ligação ao receptor de Fc alterada compreende no mínimo uma região de Fc (por exemplo, uma ou duas regiões de Fc) tendo uma ou mais substituições de aminoácidos den- tro do "loop de ligação ao receptor de Fc" de uma região constante de Ig. O loop de ligação ao receptor de Fc consiste nos resíduos de ami- noácidos 280 a 299 (de acordo com a numeração EU) de uma região de Fc selvagem, de comprimento total.
[0319] Em outros aspectos, uma região constante de Ig ou uma porção das mesmas da divulgação tendo afinidade de ligação ao re- ceptor de Fc alterada compreende no mínimo one região de Fc tendo uma ou mais substituições de aminoácidos em uma posição de ami- noácido correspondente a qualquer uma das posições EU seguintes: 256, 277 a 281, 283 a 288, 303 a 309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (por exemplo, N434A ou N434K), e 438. Exemplos de substituições de aminoácidos as quais alteraram a afinidade de ligação ao receptor de Fc são descritos na Publicação de Patente Internacio- nal PCT No. WO05/047327. (b) Albumina ou fragmento, ou variante da mesma
[0320] Em alguns aspectos, o polipeptídeo FGF-21 é ligado, por exemplo, fundido ou conjugado, a albumina ou a um fragmento funcio- nal da mesma.
[0321] A albumina do soro humano (HSA, ou HA), uma proteína de 609 aminoácidos em sua forma de comprimento total, é responsável por uma proporção significativa da pressão osmótica do soro e tam- bém funciona como um veículo de ligantes endógenos e exógenos. O termo "albumina" conforme usado aqui, neste requerimento de paten- te, inclui albumina de comprimento total ou um fragmento funcional, variante, derivado, ou análogo da mesma.
[0322] Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida ligada ao polipeptídeo FGF-21 é albumina ou um fragmento ou varian- te da mesma, a qual prolonga (ou é capaz de prolongar) a meia-vida do polipeptídeo FGF-21. Exemplos adicionais de albumina ou dos fra- gmentos ou variantes da mesma são descritos na Publ. do Requeri- mento de Pat. US Nos. 2008/0194481 A1, 2008/0004206 A1, 2008/0161243 A1, 2008/0261877 A1, ou 2008/0153751 A1 ou na Publ. do Requerimento de Pat. PCT Nos. 2008/033413 A2, 2009/058322 A1, ou 2007/021494 A2. (c) Porção de Ligação a Albumina
[0323] Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida ligada, por exemplo, fundida ou conjugada, ao polipeptídeo FGF-21 é uma porção de ligação a albumina, a qual compreende um peptídeo de ligação a albumina, um domínio de ligação a albumina bacteriano, um fragmento de anticorpo de ligação a albumina, ou quaisquer com- binações dosmesmos. Por exemplo, a proteína de ligação a albumina pode ser uma proteína de ligação a albumina bacteriana, um anticorpo ou um fragmento de anticorpo incluindo anticorpos de domínio (vide a Pat. U.S. No. 6.696.245). Uma proteína de ligação a albumina, por exemplo, pode ser um domínio de ligação a albumina bacteriano, tal como o da proteína G estreptocócica (Konig, T. e Skerra, A. (1998) J. Immunol. Methods 218, 73-83). Outros exemplos de peptídeos de liga- ção a albumina que podem ser usados como parceiro de conjugação são, por exemplo, os peptídeos tendo uma sequência de consenso Cys-Xaa 1 -Xaa 2 -Xaa 3 -Xaa 4 -Cys, em que Xaa 1 é Asp, Asn, Ser, Thr, ou Trp; Xaa 2 é Asn, Gln, H is, Ile, Leu, ou Lys; Xaa 3 é Ala, Asp, Phe, Trp, ou Tyr; e Xaa 4 é Asp, Gly, Leu, Phe, Ser, ou Thr conforme descrito no Requerimento de Patente US No. 2003/0069395 ou Dennis et al. (Dennis et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 35035-35043). (d) Sequência PAS
[0324] Em outros aspectos, a porção de extensão da meia-vida ligada, por exemplo, fundida ou conjugada, ao polipeptídeo FGF-21 é uma sequência PAS. Uma "sequência PAS," conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significa uma sequência de aminoáci- dos compreendendo essencialmente resíduos de alanina e serina ou compreendendo essencialmente resíduos de alanina, serina e prolina, a sequência de aminoácidos formando conformação de espiral aleató- ria sob condições fisiológicas. Por conseguinte, a sequência PAS é um bloco de construção, um polímero de aminoácido, ou um cassete de sequência compreendendo, consistindo essencialmente em, ou con- sistindo em alanina, serina e prolina, o qual pode ser usado como uma parte da porção heteróloga na proteína de fusão. Ainda, o perito na arte está ciente de que um polímero de aminoácido também pode for- mar conformação de espiral aleatória quando resíduos diferenrtes de alanina, serina e prolina são adicionados como um constituinte menor na sequência PAS. O termo "constituinte menor" conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significa que aminoácidos diferentes de alanina, serina e prolina podem ser adicionados na sequência PAS até um certo grau, por exemplo, até cerca de 12%, isto é, cerca de 12 de 100 aminoácidos da sequência PAS, até cerca de 10%, isto é, cer- ca de 10 de 100 aminoácidos da sequência PAS, até cerca de 9%, isto é, cerca de 9 de 100 aminoácidos, até cerca de 8%, isto é, cerca de 8 de 100 aminoácidos, cerca de 6%, isto é, cerca de 6 de 100 aminoáci- dos, cerca de 5%, isto é, cerca de 5 de 100 aminoácidos, cerca de 4%, isto é, cerca de 4 de 100 aminoácidos, cerca de 3%, isto é, cerca de 3 de 100 aminoácidos, cerca de 2%, isto é, cerca de 2 de 100 aminoáci- dos, cerca de 1%, isto é, cerca de 1 de 100 dos aminoácidos. Os ami- noácidos diferentes de alanina, serina e prolina podem ser seleciona- dos entre o grupo que consiste em Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Tyr, e Val.
[0325] Sob condições fisiológicas, o trecho da sequência PAS for- ma uma conformação de espiral aleatória e deste modo pode mediar uma estabilidade aumentada in vivo e/ou in vitro para o polipeptídeo FGF-21. Como o domínio de espiral aleatória não adota uma estrutura ou função estável por si só, a atividade biológica mediada pelo FGF-21 é essencialmente preservada. Em outros aspectos, as sequências PAS que formam domínio de espiral aleatória são biologicamente iner- tes, especialmente com respeito a proteólise no plasma sanguíneo, imunogenicidade, ponto isoelétrico / comportamento eletrostático, liga- ção a receptores da superfície celular ou internalização, mas ainda são biodegradáveis, o que proporciona claras vantagens em relação a po- límeros sintéticos, tais como PEG.
[0326] São proporcionados exemplos de sequências PAS, por exemplo, na Publ. de Pat. US No. 2010/0292130 A1 e na Publ. do Re- querimento de Pat. Internacional PCT No. WO 2008/155134 A1, am- bas as quais são incorporadas por meio de referência em suas totali- dades. (e) Sequência HAP
[0327] Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida ligada, por exemplo, fundida ou conjugada, ao polipeptídeo FGF-21 é um polímero de homo-aminoácidos rico em glicina (HAP). A sequência HAP pode compreender uma sequência repetitiva de glicina, a qual tem no mínimo 50 aminoácidos, no mínimo 100 aminoácidos, 120 aminoácidos, 140 aminoácidos, 160 aminoácidos, 180 aminoácidos, 200 aminoácidos, 250 aminoácidos, 300 aminoácidos, 350 aminoáci- dos, 400 aminoácidos, 450 aminoácidos, ou 500 aminoácidos de com- primento.
[0328] Em um aspecto, a sequência HAP é capaz de prolongar a meia-vida de uma porção fundida ou ligada à sequência HAP. Exem- plos não limitantes da sequência HAP incluem, mas não estão limita- dos a, (Gly)n, (Gly4Ser)n ou S(Gly4Ser)n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20. Em um aspecto, n é 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 26, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40. Em outro aspecto, n é 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, ou 200. (f) Transferrina ou Fragmento da mesma
[0329] Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida ligada, por exemplo, fundida ou conjugada, ao polipeptídeo FGF-21 é transferrina ou um fragmento da mesma. Qualquer transferrina pode ser usada para produzir as proteínas de fusão da divulgação. Como um exemplo, Tf humana selvagem (Tf) é uma proteína de 679 aminoá- cidos, de aproximadamente 75 KDa (não responsável por glicosila-
ção), com dois domíniosa principais, N (cerca de 330 aminoácidos) e C (cerca de 340 aminoácidos), os quais parecem se originar de uma duplicação genética. Vide os números de acesso no GenBank NM001063, XM002793, M12530, XM039845, XM 039847 e S95936 (www.ncbi.nlm.nih.gov/). A transferrina compreende dois domínios, domínio N e domínio C. O domínio N compreende dois subdomínios, domínio N1 e domínio N2, e o domínio C compreende dois subdomí- nios, domínio C1 e domínio C2.
[0330] Em um aspecto, a porção de transferrina da proteína de fusão inclui uma variante de emenda de transferrina. Em um exemplo, uma variante de emenda de transferrina pode ser uma variante de emenda de transferrina human a, por exemplo, Genbank Acesso no. AAA61140. Em outro aspecto, a porção de transferrina da proteína de fusão inclui um ou mais domínios da sequência de transferrina, por exemplo, domínio N, domínio C, domínio N1, domínio N2, domínio C1, domínio C2 ou quaisquer combinações dos mesmos. (g) Polímero, por exemplo, Polietileno glicol (PEG)
[0331] Em outros aspectos, a porção de extensão da meia-vida ligada, por exemplo, fundida ou conjugada, ao polipeptídeo FGF-21 é um polímero solúvel conhecido na arte, incluindo, porém sem limita- ção, polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol / propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrano, ou álcool polivinílico. Derivados quimicamente modificados dos polipeptídeos FGF-21 da divulgação podem proporcionar vantagens adicionais, tais como aumento da so- lubilidade, a estabilidade e o tempo circulante do polipeptídeo, ou di- minuir a imunogenicidade (vide a Pat. U.S. No. 4.179.337). O polímero solúvel pode ser anexado a quaisquer posições dentro do polipeptídeo FGF-21 ou seu término amino ou carbóxi. O polímero solúvel pode ser anexado em posições aleatórias dentro da sequência do polipeptídeo FGF-21 ou em posições predeterminadas dentro do polipeptídeo FGF-
21 e pode incluir uma, duas, três ou mais porções poliméricas solúveis anexadas. Em alguns aspectos, o polímero é anexado a uma cadeia lateral de um aminoácido que ocorre naturalmente. Em outros aspec- tos, o polímero é anexado a uma cadeia lateral de um aminoácido co- dificado não naturalmente, por exemplo, um derivado de fenilalanina tal como para-acetil-L-fenilalanina.
[0332] O polímero solúvel pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. Para PEG, em um aspecto, o peso molecular é entre cerca de 1 kDa e cerca de 100 kDa para facili- dade de manipulação e frbricação. Em alguns aspectos, o peso mole- cular do polímero solúvel, por exemplo, PEG, é de cerca de 30 kDa. Podem ser usados outros tamanhos, dependendo do perfil desejado (por exemplo, a duração da liberação sustentada desejada, os efeitos, se houver algum sobre a atividade biológica, a facilidade de manipula- ção, o grau ou falta de antigenicidade e outros efeitos conhecidos do polietileno glicol para uma proteína ou análogo). Por exemplo, o PEG pode ter um peso molecular médio de cerca de 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10.000, 10.500, 11.000, 11.500,
12.000, 12.500, 13.000, 13.500, 14.000, 14.500, 15.000, 15.500,
16.000, 16.500, 17.000, 17.500, 18.000, 18.500, 19.000, 19.500,
20.000, 25.000, 30.000, 35.000, 40.000, 45.000, 50.000, 55.000,
60.000, 65.000, 70.000, 75.000, 80.000, 85.000, 90.000, 95.000, ou
100.000 Da.
[0333] Em alguns aspectos, o PEG pode ter uma estrutura ramifi- cada. PEGs ramificados são descritos, por exemplo, na Pat. U.S. No.
5.643.575; Morpurgo et al., Appl. Biochem. Biotechnol. 56:59-72 (1996); Vorobjev et al., Nucleosides Nucleotides 18:2745-2750 (1999); e Caliceti et al., Bioconjug. Chem. 10:638-646 (1999).
[0334] O número de porções de PEG amexadas ao polipeptídeo
FGF-21 também podem variar. Por exemplo, as proteínas PEGuiladas da divulgação podem ser ligadas, em média, a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20, ou mais moléculas de PEG. De modo similar, o grau médio de substituição pode se situar dentro de faixas tais como 1 a 3, 2 a 4, 3 a 5, 4 a 6, 5 a 7, 6 a 8, 7 a 9, 8 a 10, 9 a 11, 10 a 12, 11 a 13, 12 a 14, 13 a 15, 14 a 16, 15 a 17, 16 a 18, 17 a 19, ou 18 a 20 por- ções de PEG por molécula de proteína. Métodos para determinar o grau de substituição são descritos, por exemplo, em Delgado et al., Crit. Rev. Thera. Drug Carrier Sys. 9:249-304 (1992).
[0335] Em outros aspectos, o polipeptídeo FGF-21 usado nas for- mulações da presente divulgação é conjugado a um ou mais políme- ros. O polímero pode ser hidrossolúvel e anexado de modo covalente ou de modo não covalente ao polipeptídeo FGF-21 ou a outras por- ções conjugadas ao polipeptídeo FGF-21. Exemplos não limitantes do polímero podem ser poli(alquileno óxido), poli(vinil pirrolidona), po- li(vinil álcool), polioxazolina, ou poli(acriloilmorfolina). (h) Hidroxietil Amido (HES)
[0336] Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida ligada, por exemplo, fundida ou conjugada, ao polipeptídeo FGF-21 é hidroxietil amido (HES) ou um derivado do mesmo. HES é um derivado de amilopectina que ocorre naturalmente e é degradado no corpo pela alfa-amilase. HES é um derivado substituído do carboidrato polímero amilopectina, o qual está presente em amido de milho em uma con- centração de até 95% por peso. O hidroxietil amido apresenta vantajo- sas propriedades biológicas e é usado como um agente de reposição do volume sanguíneo e em terapia de hemodiluição nas clínicas (Sommermeyer et al., Krankenhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987); e Weidler et al., Arzneim.-Forschung/Drug Res., 41, 494-498 (1991)).
[0337] A amilopectina contém porções de glicose, em que na ca- deia principal estão presentes ligações alfa-1,4-glicosídicas e nos sí-
tios de ramificação são encontradas ligações alfa-1,6-glicosídicas. As propriedades físicoquímicas desta molécula são essencialmente de- terminadas pelo tipod e ligações glicosídicas. Devido à ligação alfa- 1,4-glicosídica nicked, são produzidas estruturas helicoidais com cerca de seis monômeros de glicose por vez. As propriedades físicoquímicas bem como as propriedades bioquímicas do polímero podem ser modi- ficadas através de substituição. A introdução de um grupo de hidroxie- tila pode ser realizada por meio de hidroxietilação alcalina. Adaptando as condições de reação, é possível explorar a reatividade diferente do grupo hidróxi respectivo no monômero de glicose não substituído com respeito a uma hidroxietilação. Devido a este fato, uma pessoa versa- da é capaz de influenciar o padrão de substituição até uma extensão limitada.
[0338] O hidroxietil amido é essencialmente caracterizado pela dis- tribuição de peso molecular e pelo grau de substituição. O grau de substituição, denotado como DS, se refere à substituição molar e é de conhecimento do perito na arte. Vide Sommermeyer et al., Kranke- nhauspharmazie, 8(8), 271-278 (1987), conforme citado acima, em particular p. 273.
[0339] Em um aspecto, HES tem um peso molecular médio (peso médio) de a partir de 1 até 300 kD, a partir de 2 a partir de 200 kD, a partir de 3 a partir de 100 kD, ou a partir de 4 a partir de 70 kD. Hidro- xietil amido pode apresentar adicionalmente umg rau molar de substi- tuição de a partir de 0,1 até 3, de modo preferencial 0,1 até 2, mais preferencial, 0,1 até 0,9, de modo preferencial 0,1 até 0,8, e uma pro- porção entre C2:C6 de substituição em uma faixa de a partir de 2 a 20 com respeito aos grupos de hidroxietil. Um exemplo não limitante de HES tendo um peso molecular médio de cerca de 130 kD é um HES com um grau de substituição de 0,2 a 0,8 tal como 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, ou 0,8, de modo preferencial de 0,4 a 0,7 tal como 0,4, 0,5,
0,6, ou 0,7. Em um aspecto específico, HES com um peso molecular médio de cerca de 130 kD é Voluven® da Fresenius. Voluven® é um colóide artificial, empregado, por exemplo, para reposição de volume usado na indicação terapêutica para terapia e profilaxia de hipovole- mia. As características do Voluven® são um peso molecular médio de
130.000 +/− 20.000 D, uma substituição molar de 0,4 e uma proporção de C2:C6 de cerca de 9:1. Em outros aspectos, as faixas do peso mo- lecular médio de hidroxietil amido são, por exemplo, 4 a 70 kD ou 10 a 70 kD ou 12 a 70 kD ou 18 a 70 kD ou 50 a 70 kD ou 4 a 50 kD ou 10 a 50 kD ou 12 a 50 kD ou 18 a 50 kD ou 4 a 18 kD ou 10 a 18 kD ou 12 a 18 kD ou 4 a 12 kD ou 10 a 12 kD ou 4 a 10 kD. Em ainda outros aspectos, o peso molecular médio de hidroxietil amido empregado é em uma faixa de a partir de mais de 4 kD e abaixo de 70 kD, tal como cerca de 10 kD, ou em uma faixa de a partir de 9 a 10 kD ou a partir de 10 a 11 kD ou a partir de 9 a 11 kD, ou cerca de 12 kD, ou em uma faixa de a partir de 11 a 12 kD) ou a partir de 12 a 13 kD ou a partir de 1 l a 13 kD, ou cerca de 18 kD, ou em uma faixa de a partir de 17 a 18 kD ou a partir de 18 a 19 kD ou a partir de 17 a 19 kD, ou cerca de 30 kD, ou em uma faixa de a partir de 29 a 30, ou a partir de 30 a 31 kD, ou cerca de 50 kD, ou em uma faixa de a partir de 49 a 50 kD ou a partir de 50 a 51 kD ou a partir de 49 a 51 kD.
[0340] Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida pode ser uma mistura de HES tendo diferentes pesos moleculares médios e/ou diferentes graus de substituição e/ou diferentes propor- ções de substituição C2: C6. Portanto, misturas de HES podem ser empregadas tendo diferentes pesos moleculares médios e diferentes graus de substituição e diferentes proporções de substituição C2: C6, ou tendo diferentes pesos moleculares médios e diferentes graus de substituição e a mesma proporção ou cerca mesma proporção de substituição C2:C6, ou tendo diferentes pesos moleculares médios e o mesmo ou cerca do mesmo grau de substituição e diferentes propor- ções de substituição C2:C6, ou tendo o mesmo peso molecular médio ou cerca do mesmo peso molecular médio e diferentes graus de subs- tituição e diferentes proporções de substituição C2:C6, ou tendo dife- rentes pesos moleculares médios e o mesmo ou cerca do mesmo grau de substituição e a mesma proporção ou cerca mesma proporção de substituição C2:C6, ou tendo os mesmos pesos moleculares médios ou cerca dos mesmos pesos moleculares médios e diferentes graus de substituição e a mesma proporção ou cerca mesma proporção de substituição C2:C6, ou tendo o mesmo peso molecular médio ou cerca do mesmo peso molecular médio e o mesmo ou cerca do mesmo grau de substituição e diferentes proporções de substituição C2: C6, ou tendo cerca do mesmo peso molecular médio e cerca do mesmo grau de substituição e cerca da mesma proporção de substituição C2:C6. (i) Ácidos Polissiálicos (PSA)
[0341] Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida ligada, por exemplo, fundida ou conjugada, ao polipeptídeo FGF-21 é um ácido polissiálico (PSA) ou um derivado do mesmo. PSAs são po- límeros ramificados que ocorrem naturalmente de ácido siálico produ- ziro por albumas cepas bacterianas e em mamíferos em albumas célu- las (Roth J., et al. (1993) in Polysialic Acid: From Microbes to Man, eds Roth J., Rutishauser U., Troy F. A. (Birkhäuser Verlag, Basel, Suíça), pp 335–348). Podem ser produzidos em vários graus de poli- merização a partir de n = cerca de 80 ou mais resíduos de ácido siálico até n = 2 por limitada hidrólise ácida ou por digestão com neuramini- dases, ou por fracionamento das formas naturais, derivadas bacteria- namente do polímero.
[0342] A composição de diferentes ácidos polissiálicos também varia de tal modo que haja formas homopoliméricas, isto é, o ácido po- lissiálico alfa-2,8-ligado compreendendo o polissacarídeo capsular de
E. coli cepa K1 e os meningococos do grupo B, que também é encon- tado sob a forma embrionária da molécula de adesão a células neuro- nais (N-CAM). Também existem formas heteropoliméricas – tais como o ácido polissiálico alfa-2,8 alfa-2,9 alternado de E. coli cepa K92 e os polissacarídeos do grupo C de N. meningitidis. Ácido siálico também pode ser encontrado em copolímeros alternados com monômeros dife- rentes de ácido siálico tais como o grupo W135 ou o grupo Y de N. meningitidis. Os ácidos polissiálicos têm importantes funções biológi- cas, incluindo a evasão dos sistemas imune e do complemento por bactérias patogênicas e a regulação da adevididade glial de neurônios imaturos durante o desenvolvimento fetal (em que o polímero tem uma função anti-adesiva) Cho e Troy, P.N.A.S., USA, 91 (1994) 11427- 11431, embora não existem receptores conhecidos para ácidos polis- siálicos em mamíferos. O ácido polissiálico alfa-2,8-ligado de E. co- li cepa K1 também é conhecido como ‘ácido colomínico’ e é usado (em vários comprimentos) para exemplificar a presente divulgação.
[0343] Foram descritos vários métodos de anexar ou conjugar áci- dos polissiálicos a um polipeptídeo (por exemplo, vide a Pat. U.S. No.
5.846.951; WO-A-0187922, e US 2007/0191597 A1. (j) Sequências XTEN
[0344] Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida ligada, por exemplo, fundida ou conjugada, ao polipeptídeo FGF-21 é uma sequência XTEN. Conforme usado aqui "sequência XTEN" se re- fere a polipeptídeos de comprimento estendido com sequências que não ocorrem naturalmente, substancialmente não repetitivas, que são compostas essencialmente de pequenos aminoácidos hidrofílicos, com a sequência tendo um baixo grau ou sem estrutura secundária ou ter- ciária sob condições fisiológicas. Como um parceiro de proteína de fusão, XTENs pode servir como um carregador, conferindo albumas propriedades farmacocinéticas, fisicoquímicas e farmacêuticas desejá-
veis, quando ligados ao polipeptídeo FGF-21 para criar uma proteína de fusão. As propriedades desejáveis referidas incluem, mas não es- tão limitadas a, parâmetros farmacocinéticos e características de solu- bilidade reforçados.
[0345] Em alguns aspectos, a sequência XTEN da divulgação é um peptídeo ou um polipeptídeo tendo mais de cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, ou 2000 resíduos de aminoácidos. Em alguns aspectos, XTEN é um peptídeo ou um polipeptídeo tendo mais de cerca de 20 a cerca de 3000 resíduos de aminoácidos, mais de 30 a cerca de 2500 resíduos, mais de 40 a cerca de 2000 resíduos, mais de 50 a cerca de 1500 re- síduos, mais de 60 a cerca de 1000 resíduos, mais de 70 a cerca de 900 resíduos, mais de 80 a cerca de 800 resíduos, mais de 90 a cerca de 700 resíduos, mais de 100 a cerca de 600 resíduos, mais de 110 a cerca de 500 resíduos, ou mais de 120 a cerca de 400 resíduos.
[0346] A sequência XTEN da divulgação pode compreender um ou mais motivos de sequência de 9 a 14 resíduos de aminoácidos ou uma sequência de aminoácidos no mínimo 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica ao motivo de sequência, em que o motivo compreende, consiste essencialmente em, ou consis- te em 4 a 6 tipos de aminoácidos selecionados entre o grupo que con- sistem em glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamato (E) e prolina (P). Vide o requerimento de patente US No. 2010- 0239554 A1.
[0347] Em alguns aspectos, uma sequência XTEN compreende múltiplas unidades de motivos de sequência não se sobrepondo da família de motivos AD, ou da família de motivos AE, ou da família de motivos AF, ou da família de motivos AG, ou da família de motivos AM, ou da família de motivos AQ, ou da família BC, ou da família BD, com o XTEN resultante apresentando a faixa de homologia. Em outros as- pectos, a XTEN compreende múltiplas unidades de sequências de mo- tivo de duas ou mais das famílias de motivos. Estas sequências po- dem ser selecionadas para obter características físico/químicas dese- jadas, incluindo as propriedades referidas como carga líquida, hidrofili- cidade, falta de estrutura secundária, ou falta de repetitividade que são conferidas pela composição de aminoácidos dos motivos, descrito mais plenamente abaixo. Em outros aspectos, os motivos incorpora- dos na XTEN podem ser selecionados e montados usando os métodos descritos aqui, neste requerimento de patente, para obter uma XTEN de cerca de 36 a cerca de 3000 resíduos de aminoácidos.
[0348] Em aspectos adicionais, a sequência XTEN usada na divul- gação afeta as propriedades físicas ou químicas, por exemplo, farma- cocinéticas, da proteína de fusão da presente divulgação. A sequência XTEN usada na presente divulgação pode apresentar uma ou mais das seguintes propriedades vantajosas: flexibilidade conformacional, solubilidade aquosa aumentada, alto grau de resistência a protease, baixa imunogenicidade, baixa ligação a receptores de mamíferos, ou raios hidrodinâmicos (ou Stokes) aumentados.
[0349] Em alguns aspectos, uma sequência XTEN ligada a um po- lipeptídeo FGF-21 pode aumentar as propriedades farmacocinéticas, tais como meia-vida terminal mais longa ou área sob a curva (AUC) aumentada, de modo que o polipeptídeo FGF-21 permanece in vivo por um período de tempo aumentado em comparação com um poli- peptídeo FGF-21 correspondente sem um XTEN. Em aspectos adicio- nais, uma sequência XTEN ligada a um polipeptídeo FGF-21 descrito aqui, neste requerimento de patente, pode aumentar as propriedades farmacocinéticas, tais como meia-vida terminal mais longa ou área sob a curva (AUC) aumentada, de modo que o polipeptídeo FGF-21 per- manece in vivo por um período de tempo aumentado em comparação com um polipeptídeo FGF-21 correspondente sem um XTEN.
[0350] Uma variedade de métodos e ensaios podem ser emprega- dos para determinar as propriedades físico / químicas de proteínas compreendendo a sequência XTEN. Os métodos referidos incluem, mas não estão limitados a centrifugação analítica, EPR, HPLC de permuta de íons, HPLC de exclusão de tamanho, HPLC de fase rever- sa, dispersão de luz, eletroforese capilar, dicroísmo circular, calorime- tria de varredura diferencial, fluorescência, HPLC de permuta de íons, HPLC de exclusão de tamanho, IR, NMR, espectroscopia de Raman, refractometria, e espectroscopia UV/Visível. Métodos adicionais são descritos em Amau et al., Prot Expr e Purif 48, 1-13 (2006).
[0351] Exemplos adicionais de sequências XTEN que podem ser usadas de acordo com a presente divulgação e são descritos na Publi- cação do Requerimento de Patente US Nos. 2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, ou 2011/0172146 A1, ou na Publicação do Reque- rimento de Patente Internacional Nos. WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, ou WO 2011028344 A2, todas as quais são aqui, a este requerimento de patente, incorporadas por meio de referência em suas totalidades. (k) Peptídeo de Ligação a Imunoglobulina (ou Polipeptídeo)
[0352] Em alguns aspectos, a porção de extensão da meia-vida ligada, por exemplo, fundida ou conjugada, ao polipeptídeo FGF-21 é um peptídeo de ligação a imunoglobulina. Os peptídeos de ligação a imunoglobulina podem se ligar a uma região de Fc e podem aumentar a meia-vida da proteína de fusão descrita aqui, neste requerimento de patente.
[0353] Em alguns aspectos, o peptídeo de ligação a imunoglobuli- na útil para a divulgação é um peptídeo ou um polipeptídeo tendo mais de cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, ou 500 resíduos de aminoácidos.
[0354] Em alguns aspectos, o peptídeo de ligação a imunoglobuli- na útil para a divulgação compreende um o peptídeo de ligação ao domínio Fc de IgG de 13-meros (IgGBP). DeLano WL, et al. (2000) Science 287:1279-1283. Em outros aspectos, o peptídeo de ligação a imunoglobulina útil para a divulgação compreende os peptídeos descri- tos na Publicação de Patente US No. 20170334954, na Publicação de Patente US No. 20170210777, ou na Publicação de Patente Internaci- onal PCT No. WO/2017/069158. VI. Artigos de Manufatura e Kits
[0355] A presente divulgação também proporciona um artigo de manufatura ou kit compreendendo (i) uma formulação farmacêutica de FGF-21 compreendendo um polipeptídeo FGF-21 (por exemplo, um FGF-21 modificado tal como PEG-FGF-21) descrito aqui, neste reque- rimento de patente, e (ii) instruções para uso. O artigo de manufatura pode compreender um recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos pequenos, seringas e tubos de teste. O re- cipiente pode ser formado de uma variedade de materiais, tais como vidro, plástico ou metais. O recipiente encerra a formulação farmacêu- tica de FGF-21, por exemplo, uma formulação líquida.
[0356] O rótulo sobre, ou associado com, o recipiente pode indicar instruções para reconstituição e/ou uso. Por exemplo, o rótulo pode indicar que a formulação farmacêutica de FGF-21 deve ser diluída pa- ra concentrações de proteínas conforme descrito acima. O rótulo pode indicar adicionalmente que a formulação subcutânea é útil ou se desti- na para administração subcutânea.
[0357] O recipiente que encerra a formulação pode ser um fras- quinho multi-uso, o qual é adequado para administrações repetidas
(por exemplo, de 2 a 6 administrações, ou mais) de, por exemplo, a formulação subcutânea. Alternativamente, o recipiente pode ser uma seringa preenchida contendo, por exemplo, a formulação subcutânea.
[0358] O artigo de manufatura ou kit pode compreender adicional- mente um segundo recipiente compreendendo, por exemplo, um sol- vente. O artigo de manufatura pode incluir adicionalmente outros mate- riais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, inclusive outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e bulas com ins- truções para uso. ***
[0359] Deve ser reconhecido que a seção de Descrição Detalhada, e não as seções de Sumário e de Resumo, se destina a ser usada pa- ra interpretar as reivindicações. As seções de Sumário e de Resumo podem estipular um ou mais, mas não todos os aspectos de exemplo da presente divulgação, conforme contemplada pelo(s) inventore(s), e, portanto, não se destinam a limitar a presente divulgação e as reivindi- cações anexadas de qualquer modo.
[0360] A presente divulgação foi descrita acima com o auxílio de blocos de construção funcionais ilustrando a implementação de fun- ções especificadas e relações dos mesmos. Os limites destes blocos de construção funcionais foram definidos arbitrariamente aqui, neste requerimento de patente, para a conveniência da descrição. Limites alternativos podem ser definidos, contanto que as funções especifica- das e relações dos mesmos sejam realizadas adequadamente.
[0361] A descrição precedentes dos aspectos específicos vai por- tanto revelar plenamente a natureza geral da divulgação que outros, aplicando o conhecimento dentro da habilidade da arte, podem pron- tamente modificar e/ou adaptar para várias aplicações os referidos as- pectos específicos, sem indevida experimentação, sem se afastar do conceito geral da presente divulgação. Portanto, as referidas adapta-
ções e modificações se destinam a esteram dentro do significado e da faixa de equivalentes dos aspectos descritos, com base no ensina- mento e na orientação apresentados aqui, neste requerimento de pa- tente. Deve ser entendido que a fraseologia ou terminologia aqui, nes- te requerimento de patente, é para o fim de descrição e não de limita- ção, de tal modo que a terminologia ou fraseologia da presente especi- ficação deve ser interpretada pelo perito na arte à luz dos ensinamen- tos e da orientação.
[0362] A extensão e o âmbito da presente divulgação não devem ser limitados por qualquer um dos aspectos de exemplo acima descri- tos, mas devem ser definidos somente de acordo com as reivindica- ções que se seguem e seus equivalentes.
EXEMPLOS Exemplo 1 Desenvolvimento da Formulação de PEG-FGF-21
[0363] Para estudos iniciais, PEG-FGF-21 foi formulado a 7,5 mg/mL em 20 mM de Tris, 250 mM de sacarose, pH 8,3. As altas taxas de desamidação observadas nesta formulação tornaram necessário armazenar o produto farmacológico congelado a -20 °C. Portanto, foi realizado um estudo adicional para desenvolver uma formulação pron- ta para uso (RTU) permitindo armazenamento do produto farmacológi- co a 2 a 8 °C.
[0364] PEG-FGF-21 (SEQ ID NO: 2) foi produzido anexando uma porção PEG linear de 30 kDa ao FGF-21 modificado (SEQ ID NO: 1) em uma maneira específica para o sítio. De modo a obter PEGuilação específica para o sítio, PEG ativado foi reagido por métodos conheci- dos na arte com o aminoácido não natural, para-acetil fenilalanina (pAF), na posição 109 da molécula de FGF-21 para formar um conju- gado quimicamente estável de PEG-proteína ligado a oxima.
[0365] Foi demonstrado que um menor pH da formulação aumenta as taxas de agregação da molécula, ao passo que um maior pH da formulação aumenta as taxas de desamidação. Na concentração de proteína alvo de 10 mg/mL, foi visto que o pH 7,0 é o melhor balanço entre as taxas de agregação e de desamidação. Foi demonstrado que uma concentração crescente de sacarose estabiliza adicionalmente a molécula contra agregação.
[0366] A formulação escolhida para estudos adicionais foi 10 mg/mL de PEG-FGF-21 em 20 mM de L-histidina, 600 mM de sacaro- se, pH 7,0. Dada uma dose de 20 mg contemplada semanalmente, foi desenvolvido um produto farmacológico de maior concentração em uma seringa preenchida. Para permitir a maior concentração do produ- to farmacológico, foi necessária otimização adicional da formulação.
[0367] O desenvolvimento inicial de uma formulação de maior concentração foi conduzido em frascos pequenos de vidro tipo I de 3 mL. Depois de agitação de 15 mg/mL e 22 mg/mL de PEG-FGF-21 em 20 mM de L-histidina, 600 mM de sacarose, pH 7,0 foi observado apri- sionamento de bolhas de ar e as soluções se tornaram cada vez mais turvas (FIG. 5, imagens da esquerda). Em uma tentativa para mitigar o problema, foi usado polissorbato 80. Polissorbato 80 foi capaz de pre- venir o aprisionamento de bolhas de ar (FIG. 5, imagens da direita). Portanto, polissorbato 80 foi adicionado em uma concentração de 0,05% (em peso / vol) até a formulação de PEG-FGF-21 de alta con- centração.
[0368] Oxidação é um atributo de qualidade crucial de PEG-FGF- 21 e a oxidação de metionina-169 próxima ao término carboxila abole ligação ao receptor e deste modo a atividade da molécula. Oxidação catalisada por metal é um dos mecanismos pelos quais a proteína po- de ser oxidada. Concentrações traço de metais podem estar presentes em formulação de proteínas devido a transporte da cultura celular, contato com recipientes de aço inoxidável, impurezas em excipientes,
processo de formação de seringas pré-preenchíveis, etc.
[0369] Para testar se PEG-FGF-21 era sensível a oxidação catali- sada por metal, amostras com e sem adição de um coquetel de metal (250 ppm de Fe, 10 ppm de Cu, 15 ppm de Cr, 15 ppm de Ni, 10 ppm de Mo) na presença ou ausência de 0,05 mM de ácido pentético (ácido dietilenotriaminapenta-acético, DTPA) foram incubadas por um mês a 25 °C e por duas semanas a 40 °C, respectivamente, e foram determi- nados os níveis de oxidação de metionina 1 e metionina 169 por ma- peamento de peptídeos trípticos (FIGS. 2A e 2B).
[0370] Na ausência de ácido pentético (DTPA), foi observada im- portante oxidação de ambos os resíduos de metionina foi uniforme em amostras sem metal adicionado enquanto em amostras cravadas com um coquetel de metal os níveis de oxidação foram ainda maiores. Em amostras com 50 µM de ácido pentético, não foi observado aumento nos níveis de oxidação para uma ou outra metionina. Isto sugere que PEG-FGF-21 é sensível a oxidação catalisada por metal e que já exis- tem níveis traço de metais presentes na formulação. Ácido pentético quelou efetivamente os metais presentes na formulação bem como metais adicionais cravados na formulação e evitou oxidação catalisada por metal das metioninas 1 e 169. Portanto, 50 µM de ácido pentético foi adicionado à formulação de alta concentração de PEG-FGF-21.
[0371] De modo a otimizar o pH para a formulação de maior con- centração, foram revisados os dados de agregação de PEG-FGF-21 coletados entre pH 6,3 e 8,5 mostrando que as taxas de agregação aumentaram rapidamente abaixo de pH 6,8 (FIGS. 3A e 3B). Portanto, foi aumentado o pH alvo para a formulação de alta concentração de pH 7,0 para pH 7,1.
[0372] De modo a comparar a nova formulação de alta concentra- ção com a formulação prévia, PEG-FGF-21 a 20 mg/mL em 20 mM de L-histidina, 600 mM de sacarose, 0,05 mM de ácido pentético, 0,05%
(em peso / vol) de polissorbato 80, pH 7,0 (antes da otimização do pH) foi colocado em estabilidade e em comparação com PEG-FGF-21 a 22,5 mg/mL em 20 mM de L-histidina, 600 mM de sacarose, pH 7,0.
[0373] Conforme mostrado nas FIGS. 4A e 4B, FIGS. 1A e 1B, a adição de polissorbato 80 e ácido pentético à formulação de PEG- FGF-21 resultou em menores taxas de agregação em todas as tempe- raturas e menos desamidação a 40 °C. Métodos de teste
[0374] Agregação: A agregação foi testada por cromatografia lí- quida de alto desempenho de exclusão de tamanho em um sistema disponível comercialmente (por exemplo, o sistema Agilent Technolo- gies 1100 Series HPLC com detector de PDA ou o sistema Waters Al- liance e2695 Series HPLC com detector de PDA) equipado com uma coluna analítica disponível comercialmente (Tosoh TSK gel G3000SWXL, 7,8 x 300 mm, P/N: 08541). Uma fase móvel de 95% de salina tamponada com fosfato (PBS) e 5% de etanol em uma taxa de fluxo de 0,8 ml/min foi usada para separar espécies de alto peso mole- cular de monômero protéico. As amostras foram diluídas até uma con- centração de proteína de 0,5 mg/mL com PBS e 0,01 mg (0,02 mL) foram injetados para cada experimento. A quantidade de agregado foi determinada dividindo a área de picos de alto peso molecular pela área total de todos os picos observados usando o software do instru- mento.
[0375] Desamidação: A desamidação foi testada por cromatografia líquida de alto desempenho de permuta de ânion em um sistema dis- ponível comercialmente (por exemplo, o sistema Agilent Technologies 1100 Series HPLC com detector de PDA ou o sistema Waters Alliance e2695 Series HPLC com detector de PDA) equipado com uma coluna analítica disponível comercialmente (Agilent Bio WAX, coluna não po- rosa de 5 μm, de 4,6 x 250 mm, P/N: 5190-2487). A fase móvel A con-
sistiu em 20 mM de Tris, pH 8,2 e a fase móvel B consistiu rm 20 mM de Tris, 500 mM de Cloreto de Sódio, pH 8,2. Um gradiente linear a partir de 2% de B até 67% de B durante 20 minutos em uma taxa de fluxo de 1,0 ml/min foi usado para separar as variantes de proteínas carregadas. As amostras foram diluídas até uma concentração de pro- teína de 1 mg/mL com a fase móvel A e 0,075 mg (0,075 mL) foram injetados para cada experimento. A quantidade de desamidação foi determinada dividindo a área de picos de variantes acidíferas pela área total de todos os picos observados usando software do instru- mento.
[0376] Oxidação: A oxidação foi testada por mapeamento de pep- tídeos trípticos. Depois das amostras de proteína serem digeridas com tripsina, os peptídeos resultantes foram separados por cromatografia líquida de ultra-alto desempenho de fase reversa em um sistema dis- ponível comercialmente (por exemplo, o sistema Waters Acquity UPLC) equipado com uma coluna analítica disponível comercialmente (Waters Acquity C18 BEH peptídeo RP UPLC coluna, 2,1 × 150 mm, tamanho de partícula 1,7 μm, tamanho do poro 130 Å P/N: 186003556). A fase móvel A consistiu em 0,2% de ácido trifluoroacéti- co (TFA) em água e a fase móvel B consistiu em 0,2% de TFA em acetonitrilo. Um gradiente complexo a partir de 10% de B até 40% de B durante 27 minutos em uma temperatura de 60 °C e uma taxa de fluxo de 0,3 ml/min foi usado para separar peptídeos trípticos. A quan- tidade de oxidação foi determinada dividindo a área de picos de peptí- deos oxidados pela área total de picos oxidados e não oxidados cor- respondentes usando o software do instrumento.
[0377] Formação de particulados e Formação de bolhas de ar: Observação visual.
[0378] Concentração de PEG-FGF-21: A concentração de PEG- FGF-21 na formulação farmacêutica descrita aqui, neste requerimento de patente, foi medida por Espectroscopia de Inclinação (Slope Spec- troscopy) a 280 nm usando um Coeficiente de Extinção de 0,87 (mL/(mg*cm)).
[0379] Determinação de pH: O pH foi determinado de acordo com métodos de rotina (USP<791>).
[0380] Concentração de excipientes: A concentração de excipien- tes individuais na formulação farmacêutica descrita aqui, neste reque- rimento de patente, (por exemplo, DTPA, PS80, Histidina, Sacarose) foi determinada / calculada para ser a quantidade (peso, moles etc.) do excipiente individual adicionado à formulação farmacêutica no curso de sua fabricação por unidade de volume final da formulação farma- cêutica acabada. Alternativamente, a concentração de excipientes po- de ser baseada na quantidade real do excipiente individual na formula- ção farmacêutica.

Claims (130)

REIVINDICAÇÕES
1. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo de fator de crescimento de fibroblasto 21 (FGF-21) e um quelante de cátion ácido aminopolicarboxílico, em que a formulação tem aumento da estabilidade em comparação com uma for- mulação de referência que não contenha o quelante de cátion ácido ami- nopolicarboxílico.
2. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que apresenta um ou mais de: (a) uma menor taxa de desamidação do polipeptídeo quando armazenada a 40 ºC por cerca de um mês com respeito à formulação de referência; (b) uma menor taxa de agregação de polipeptídeos de alto peso molecular (HMW) quando armazenada a 40 ºC por cerca de um mês com respeito à formulação de referência; ou (c) tanto (a) quanto (b).
3. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o quelante de cátion ácido aminopo- licarboxílico mitiga a oxidação de uma ou mais metioninas corresponden- tes ao aminoácido 1 e/ou ao aminoácido 169 de SEQ ID NO: 1 a 25 ºC e/ou 40 ºC.
4. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o quelante de cátion ácido aminopo- licarboxílico é ácido dietilenotriaminapenta-acético (DTPA).
5. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que o quelante de cátion DTPA está presente em uma quantidade entre cerca de 10 µM e cerca de 100 µM de DTPA, entre cerca de 20 µM e cerca de 90 µM de DTPA, entre cerca de 30 µM e cerca de 80 µM de DTPA, entre cerca de 25 µM e cerca de 75 µM de DTPA, ou entre cerca de 40 µM e cerca de 60 µM de DTPA, ou entre cer- ca de 30 µM e cerca de 70 µM de DTPA, ou entre cerca de 40 µM e cerca de 70 µM de DTPA.
6. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que o quelante de cátion DTPA está pre- sente em uma quantidade de cerca de 40 µM, cerca de 45 µM, cerca de 50 µM, cerca de 55 µM, ou cerca de 60 µM de DTPA.
7. Formulação farmacêutica, de qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o pH é de acima de 6,5, acima de 6,6, acima de 6,7, acima de 6,8, acima de 6,9, acima de 7,0, acima de 7,1, acima de 7,2, acima de 7,3, acima de 7,4, ou acima de 7,5.
8. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o pH é de entre cerca de 6,7 e cerca de 7,5, cerca de 6,8 e cerca de 7,5, cerca de 6,9 e cerca de 7,4, cerca de 7,0 e cerca de 7,3, cerca de 7,1 e 7,2, cerca de 7,1 e cerca de 7,3, cerca de 7,1 e cerca de 7,4, ou cerca de 7,1 e cerca de 7,5.
9. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o pH é de cerca de 6,7, cerca de 6,8, cer- ca de 6,9, cerca de 7,0, cerca de 7,1, cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,4, ou cerca de 7,5.
10. Formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que é mais estável do que uma formulação de referência com um pH de 6,5.
11. Formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que ainda compre- ende um tensoativo.
12. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação
11, caracterizada pelo fato de que o tensoativo é um tensoativo não iôni- co.
13. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o tensoativo não iônico é um polissor- bato.
14. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o polissorbato é mono-oleato de sorbi- tano de polioxietileno (20) (polissorbato 80).
15. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o tensoativo polissorbato 80 está pre- sente em uma quantidade de cerca de 0,01% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,02% a cerca de 0,09% (em peso / vol), cerca de 0,03% a cerca de 0,08% (em peso / vol), cerca de 0,04% a cerca de 0,07% (em peso / vol), ou cerca de 0,05% a cerca de 0,06% (em peso / vol).
16. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizada pelo fato de que o tensoativo polissorbato 80 está presente em uma quantidade de no mínimo cerca de 0,01% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,02% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,03% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,04% (em peso / vol), no mí- nimo cerca de 0,05% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,06% (em pe- so / vol), no mínimo cerca de 0,07% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,08% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,09% (em peso / vol) ou no mínimo cerca de 0,1% (em peso / vol).
17. Formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 16, caracterizada pelo fato de que o tensoativo mitiga a formação de particulados e/ou de bolhas de ar quando agitado em um shaker.
18. Formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que ainda compre- ende um agente de tamponamento de aminoácido.
19. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o agente de tamponamento de amino- ácido é histidina.
20. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o agente de tamponamento de histidi- na está presente em uma quantidade de cerca de 10 mM a cerca de 100 mM de histidina, cerca de 20 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 30 mM a cerca de 80 mM de histidina, cerca de 40 mM a cerca de 70 mM de histidina, cerca de 10 mM a cerca de 30 mM de histidina, cerca de 15 mM a cerca de 25 mM de histidina, cerca de 17,5 mM a cerca de 22,5 mM de histidina, ou cerca de 40 mM a cerca de 60 mM de histidina.
21. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizada pelo fato de que o agente de tamponamento de histidina está presente em uma quantidade de cerca de 10 mM de histidi- na, cerca de 15 mM de histidina, cerca de 20 mM de histidina, cerca de 25 mM de histidina, cerca de 30 mM de histidina, cerca de 35 mM de his- tidina, cerca de 40 mM de histidina, cerca de 45 mM de histidina ou cerca de 50 mM de histidina.
22. Formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que ainda compre- ende um regulador osmótico.
23. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o regulador osmótico compreende um açúcar.
24. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o açúcar é sacarose.
25. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o regulador osmótico de sacarose está presente em uma quantidade de cerca de 100 mM a cerca de 1 M de sa- carose, cerca de 200 mM a cerca de 900 mM, cerca de 300 mM a cerca de 800 mM, cerca de 400 mM a cerca de 700 mM, ou cerca de 500 mM a cerca de 600 mM.
26. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizada pelo fato de que o regulador osmótico de sacaro- se está presente em uma quantidade de cerca de 100 mM de sacarose, cerca de 200 mM de sacarose, cerca de 300 mM de sacarose, cerca de 400 mM de sacarose, cerca de 500 mM de sacarose, cerca de 600 mM de sacarose, cerca de 700 mM de sacarose, cerca de 800 mM de saca- rose, cerca de 900 mM de sacarose, ou cerca de 1M de sacarose.
27. Formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo FGF-21 é um polipeptídeo FGF-21 modificado.
28. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo FGF-21 modificado compreende um polipeptídeo tendo no mínimo cerca de 80%, no mínimo cerca de 85%, no mínimo cerca de 90%, no mínimo cerca de 95%, no mínimo cerca de 96%, no mínimo cerca de 97%, no mínimo cerca de 98%, ou no mínimo cerca de 99% de identidade da sequência de amino- ácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, em que o po- lipeptídeo tem uma atividade de FGF-21.
29. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo FGF-21 modifica- do é ligado a uma porção de extensão da meia-vida.
30. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação
29, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo FGF-21 modificado é ligado à porção de extensão da meia-vida através da cadeia lateral de um aminoácido codificado não naturalmente na sequência do polipeptídeo FGF-21.
31. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizada pelo fato de que a porção de extensão da meia- vida compreende albumina, uma região constante de imunoglobulina ou uma porção das mesmas, um polipeptídeo de ligação a imunoglobulina, uma imunoglobulina G (IgG), polipeptídeo de ligação a albumina (ABP), uma porção de PASilação, uma porção de HESilação, XTEN, uma região de Fc, e qualquer combinação das mesmas.
32. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizada pelo fato de que a porção de extensão da meia- vida compreende um polímero hidrossolúvel.
33. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que o polímero hidrossolúvel é um polieti- leno glicol (PEG).
34. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que o PEG tem um peso molecular médio entre cerca de 10 kDa e cerca de 40 kDa.
35. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizada pelo fato de que o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 30 kDa.
36. Formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 35, caracterizada pelo fato de que o aminoácido codificado não naturalmente é um derivado de fenilalanina.
37. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que o derivado de fenilalanina é para-
acetil-L-fenilalanina.
38. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 36 ou 37, caracterizada pelo fato de que a porção de extensão da meia- vida é ligada ao aminoácido codificado não naturalmente por meio de uma ligação oxima.
39. Formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 38, caracterizada pelo fato de que o aminoácido codificado não naturalmente substitui o aminoácido Glutamina 109 de SEQ ID NO: 3.
40. Formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo FGF-21 está presente em uma concentração entre cerca de 1 mg/ml e cerca de 40 mg/ml.
41. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo FGF-21 está presente em uma concentração de cerca de 10 mg/ml ou cerca de 20 mg/ml.
42. Formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 41, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo FGF-21 está presente em uma quantidade entre cerca de 1 mg e cerca de 40 mg por dose.
43. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo FGF-21 está presente em uma quantidade de cerca de 1 mg por dose, cerca de 5 mg por dose, cerca de 10 mg por dose, cerca de 20 mg por dose, ou cerca de 40 mg por dose.
44. Formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 43, caracterizada pelo fato de que a formulação é formulada para administração subcutânea.
45. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que a formulação é formulada para admi- nistração subcutânea com uma seringa de segurança.
46. Formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 45, caracterizada pelo fato de que a formulação é formulada para administração diariamente ou semanalmente.
47. Formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 46, caracterizada pelo fato de que a formulação é uma formulação aquosa.
48. Formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo FGF-21 é um PEG-FGF-21 (SEQ ID NO: 2).
49. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um polipeptídeo FGF-21; (ii) histidina em uma concentração entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM; (iii) sacarose em uma concentração entre cerca de 100 mM e cerca de 1M; (iv) Polissorbato 80 em uma concentração entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% (em peso / vol); e, (v) DTPA em uma concentração entre cerca de 10 µM e cerca de 100 µM; em que o pH da formulação é entre cerca de 6,7 e cerca de 7,5.
50. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um polipeptídeo FGF-21;
(ii) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; (iii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma concentração de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma concentração de cerca de 50 µM; em que o pH é de cerca de 7,1.
51. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um polipeptídeo FGF-21; (ii) histidina em uma concentração de 20 mM; (iii) sacarose em uma concentração de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma concentração de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma concentração de 50 µM; em que o pH é de 7,1.
52. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um polipeptídeo FGF-21; (ii) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; e (iii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; em que o pH é de cerca de 7,0.
53. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um polipeptídeo FGF-21; (ii) histidina em uma concentração de 20 mM; e (iii) sacarose em uma concentração de 600 mM; em que o pH é de 7,0.
54. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) PEG-FGF-21 em uma concentração de cerca de 10 mg/mL; (ii) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; (iii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma concentração de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma concentração de cerca de 50 uM; em que o pH é de cerca de 7,1.
55. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) PEG-FGF-21 em uma concentração de cerca de 20 mg/mL; (ii) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; (iii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma concentração de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma concentração de cerca de 50 uM; em que o pH é de cerca de 7,1.
56. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) PEG-FGF-21 em uma concentração de 10 mg/mL; (ii) histidina em uma concentração de 20 mM; (iii) sacarose em uma concentração de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma concentração de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma concentração de 50 uM; em que o pH é de 7,1.
57. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende:
(i) PEG-FGF21 em uma concentração de 20 mg/mL; (ii) histidina em uma concentração de 20 mM; (iii) sacarose em uma concentração de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma concentração de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma concentração de 50 uM; em que o pH é de 7,1.
58. Método para melhorar a estabilidade de uma formulação farmacêutica compreendendo um polipeptídeo FGF-21, caracterizado pe- lo fato de que compreende misturar um quelante de cátion ácido amino- policarboxílico, em que a formulação tem aumento da estabilidade em comparação com uma formulação de referência que não contenha o que- lante de cátion ácido aminopolicarboxílico.
59. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo fato de que a melhora na estabilidade compreende (i) um aumento na estabilidade física do polipeptídeo, (ii) um aumento na estabilidade química do polipeptídeo, ou (iii) uma combinação dos mesmos.
60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o aumento na estabilidade física compreende (i) preven- ção ou diminuição da agregação do polipeptídeo, (ii) prevenção ou dimi- nuição da fragmentação do polipeptídeo, ou (iii) uma combinação dos mesmos.
61. Método, de acordo com a reivindicação 60, caracterizado pelo fato de que o aumento na estabilidade química compreende (i) pre- venção ou diminuição da desamidação do polipeptídeo, (ii) prevenção ou diminuição da oxidação do polipeptídeo, ou (iii) uma combinação dos mesmos.
62. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
58 a 61, caracterizado pelo fato de que a melhora na estabilidade com- preende um ou mais de: (a) uma menor taxa de desamidação do polipeptídeo quando armazenada a 40 ºC por cerca de um mês com respeito à formulação de referência; (b) uma menor taxa de agregação de polipeptídeos de alto peso molecular (HMW) quando armazenada a 40 ºC por cerca de um mês com respeito à formulação de referência; ou (c) tanto (a) quanto (b).
63. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 62, caracterizado pelo fato de que o quelante de cátion ácido amino- policarboxílico mitiga a oxidação de uma ou mais metioninas correspon- dentes ao aminoácido 1 e/ou ao aminoácido 169 de SEQ ID NO: 3 a 25 ºC e/ou 40 ºC.
64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 63, caracterizado pelo fato de que o quelante de cátion ácido amino- policarboxílico é DTPA.
65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que o quelante de cátion DTPA está presente em uma quan- tidade entre cerca de 10 µM e cerca de 100 µM de DTPA, entre cerca de 20 µM e cerca de 90 µM de DTPA, entre cerca de 25 µM e cerca de 75 µM de DTPA, entre cerca de 40 µM e cerca de 60 µM de DTPA, entre cerca de 30 µM e cerca de 70 µM de DTPA, entre cerca de 30 µM e cerca de 80 µM de DTPA, ou entre cerca de 40 µM e cerca de 70 µM.
66. Método, de acordo com a reivindicação 64 ou 65, caracte- rizado pelo fato de que o quelante de cátion DTPA está presente em uma quantidade de cerca de 40 µM, cerca de 45 µM, cerca de 50 µM, cerca de 55 µM, ou cerca de 60 µM de DTPA.
67. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 66, adicionalmente caracterizado pelo fato de que compreende ajus- tar o pH para acima de 6,5, acima de 6,6, acima de 6,7, acima de 6,8, acima de 6,9, ou acima de 7,0.
68. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que o pH é ajustado para entre cerca de 6,8 e cerca de 7,5, ou entre cerca de 6,9 e cerca de 7,4, ou entre cerca de 7,0 e cerca de 7,3, ou entre cerca de 7,1 e 7,2, ou entre cerca de 7,1 e cerca de 7,3, ou entre cerca de 7,1 e cerca de 7,4, ou entre cerca de 7,1 e cerca de 7,5.
69. Método, de acordo com a reivindicação 67, caracterizado pelo fato de que o pH ajustado é de cerca de 6,8, cerca de 6,9, cerca de 7,0, cerca de 7,1, cerca de 7,2, cerca de 7,3, cerca de 7,4, ou cerca de 7,5.
70. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 a 69, caracterizado pelo fato de que a formulação é mais estável do que a formulação de referência tendo um pH de 6,5.
71. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 70, caracterizado pelo fato de que ainda compreende misturar um tensoativo.
72. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que o tensoativo é um tensoativo não iônico.
73. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o tensoativo não iônico é um polissorbato.
74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que o polissorbato é polissorbato 80.
75. Método, de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que o tensoativo polissorbato 80 é misturado em uma quanti- dade de cerca de 0,01% a cerca de 0,1% (em peso / vol), cerca de 0,02%
a cerca de 0,09% (em peso / vol), cerca de 0,03% a cerca de 0,08% (em peso / vol), cerca de 0,04% a cerca de 0,07% (em peso / vol), ou cerca de 0,05% a cerca de 0,06% (em peso / vol).
76. Método, de acordo com a reivindicação 74 ou 75, caracte- rizado pelo fato de que o tensoativo polissorbato 80 é misturado em uma quantidade de no mínimo cerca de 0,01% (em peso / vol), no mínimo cer- ca de 0,02% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,03% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,04% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,05% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,06% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,07% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,08% (em peso / vol), no mínimo cerca de 0,09% (em peso / vol) ou no mínimo cerca de 0,1% (em peso / vol).
77. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 71 a 76, caracterizado pelo fato de que o tensoativo mitiga a formação de particulados e/ou a formação de bolhas de ar quando agitado em um shaker.
78. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 77, caracterizado pelo fato de que ainda compreende misturar um agente de tamponamento de aminoácido.
79. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que o agente de tamponamento de aminoácido é histidina.
80. Método, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o agente de tamponamento de histidina é misturado em uma quantidade de cerca de 10 mM a cerca de 100 mM de histidina, cer- ca de 20 mM a cerca de 90 mM de histidina, cerca de 30 mM a cerca de 80 mM de histidina, cerca de 40 mM a cerca de 70 mM de histidina, cerca de 10 mM a cerca de 30 mM de histidina, cerca de 15 mM a cerca de 25 mM de histidina, cerca de 17,5 mM a cerca de 22,5 mM de histidina, ou cerca de 40 mM a cerca de 60 mM de histidina.
81. Método, de acordo com a reivindicação 79 ou 80, caracte- rizado pelo fato de que o agente de tamponamento de histidina é mistu- rado em uma quantidade de cerca de 10 mM de histidina, cerca de 15 mM de histidina, cerca de 20 mM de histidina, cerca de 25 mM de histidi- na, cerca de 30 mM de histidina, cerca de 35 mM de histidina, cerca de 40 mM de histidina, cerca de 45 mM de histidina ou cerca de 50 mM de histidina.
82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 81, caracterizado pelo fato de que ainda compreende misturar um regulador osmótico.
83. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que o regulador osmótico compreende um açúcar.
84. Método, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que o açúcar é sacarose.
85. Método, de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que o regulador osmótico de sacarose é misturado em uma quantidade de cerca de 100 mM a cerca de 1 M de sacarose, cerca de 200 mM a cerca de 900 mM de sacarose, cerca de 300 mM a cerca de 800 mM de sacarose, cerca de 400 mM a cerca de 700 mM de sacarose, ou cerca de 500 mM a cerca de 600 mM de sacarose.
86. Método, de acordo com a reivindicação 84 ou 85, caracte- rizado pelo fato de que o regulador osmótico de sacarose é misturado em uma quantidade de cerca de 100 mM de sacarose, cerca de 200 mM de sacarose, cerca de 300 mM de sacarose, cerca de 400 mM de sacarose, cerca de 500 mM de sacarose, cerca de 600 mM de sacarose, cerca de 700 mM de sacarose, cerca de 800 mM de sacarose, cerca de 900 mM de sacarose, ou cerca de 1M de sacarose.
87. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 86, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo FGF-21 é um poli- peptídeo FGF-21 modificado.
88. Método, de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo FGF-21 modificado compreende uma se- quência polipeptídica tendo no mínimo cerca de 80%, no mínimo cerca de 85%, no mínimo cerca de 90%, no mínimo cerca de 95%, no mínimo cer- ca de 96%, no mínimo cerca de 97%, no mínimo cerca de 98%, ou no mínimo cerca de 99% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, em que o polipeptídeo tem uma atividade de FGF-21.
89. Métodom de acordo com a reivindicação 87 ou 88, caracte- rizado pelo fato de que o polipeptídeo FGF-21 modificado é ligado a uma porção de extensão da meia-vida.
90. Método, de acordo com a reivindicação 89, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo FGF-21 modificado é ligado à porção de extensão da meia-vida através da cadeia lateral de um aminoácido codifi- cado não naturalmente na sequência do polipeptídeo FGF-21.
91. Método, de acordo com a reivindicação 89 ou 90, caracte- rizado pelo fato de que a porção de extensão da meia-vida compreende albumina, uma região constante de imunoglobulina ou uma porção das mesmas, um polipeptídeo de ligação a imunoglobulina, uma IgG, ABP, uma porção de PASilação, uma porção de HESilação, XTEN, uma região de Fc, e qualquer combinação das mesmas.
92. Método, de acordo com a reivindicação 89 ou 90, caracte- rizado pelo fato de que a porção de extensão da meia-vida compreende um polímero hidrossolúvel.
93. Método, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que o polímero hidrossolúvel é um PEG.
94. Método, de acordo com a reivindicação 93, caracterizado pelo fato de que o PEG tem um peso molecular médio entre cerca de 10 kDa e cerca de 40 kDa.
95. Método, de acordo com a reivindicação 93 ou 94, caracte- rizado pelo fato de que o PEG tem um peso molecular médio de cerca de 30 kDa.
96. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 90 a 95, caracterizado pelo fato de que o aminoácido codificado não natu- ralmente é um derivado de fenilalanina.
97. Método, de acordo com a reivindicação 96, caracterizado pelo fato de que o derivado de fenilalanina é para-acetil-L-fenilalanina.
98. Método, de acordo com a reivindicação 96 ou 97, caracte- rizado pelo fato de que a porção de extensão da meia-vida é ligada ao aminoácido codificado não naturalmente por meio de uma ligação oxima.
99. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 90 a 98, caracterizado pelo fato de que o aminoácido codificado não natu- ralmente substitui o aminoácido Glutamina 109 de SEQ ID NO: 3.
100. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 99, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo FGF-21 está pre- sente em uma concentração entre cerca de 1 mg/ml e cerca de 40 mg/ml.
101. Método, de acordo com a reivindicação 100, caracteriza- do pelo fato de que o polipeptídeo FGF-21 está presente em uma con- centração de cerca de 10 mg/ml ou cerca de 20 mg/ml.
102. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 101, caracterizado pelo fato de que a formulação é uma formulação aquosa.
103. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
58 a 102, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo FGF-21 é PEG- FGF-21 (SEQ ID NO: 2).
104. Método, caracterizado pelo fato de que é para melhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo um polipeptídeo FGF-21 compreendendo misturar: (i) histidina em uma concentração entre cerca de 10 mM e cerca de 50 mM; (ii) sacarose em uma concentração entre cerca de 100 mM e cerca de 1M; (iii) Polissorbato 80 em uma concentração entre cerca de 0,01% e cerca de 0,1% (em peso / vol); e, (iv) DTPA em uma concentração entre cerca de 10 µM e cerca de 100 µM; em que o pH da formulação é entre cerca de 6,7 e cerca de 7,5.
105. Método, caracterizado pelo fato de que é para melhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo um polipeptídeo FGF-21 compreendendo misturar: (i) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; (ii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; (iii) Polissorbato 80 em uma concentração de cerca de 0,05% (em peso / vol); e, (iv) DTPA em uma concentração de cerca de 50 μM; em que o pH é de cerca de 7,1.
106. Método, caracterizado pelo fato de que é para melhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo um polipeptídeo FGF-21 compreendendo misturar: (i) histidina em uma concentração de 20 mM;
(ii) sacarose em uma concentração de 600 mM; (iii) Polissorbato 80 em uma concentração de 0,05% (em peso / vol); e, (iv) DTPA em uma concentração de 50 uM; em que o pH é de 7,1.
107. Método, caracterizado pelo fato de que é para melhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo um polipeptídeo FGF-21 compreendendo misturar: (i) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; e, (ii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; em que o pH é de cerca de 7,0.
108. Método, caracterizado pelo fato de que é para melhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo um polipeptídeo FGF-21 compreendendo misturar: (i) histidina em uma concentração de 20 mM; e, (ii) sacarose em uma concentração de 600 mM; em que o pH é de 7,0.
109. Método, caracterizado pelo fato de que é para melhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo PEG-FGF-21 em uma concentração de cerca de 10 mg/mL, compreendendo misturar: (i) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; (ii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; (iii) Polissorbato 80 em uma concentração de cerca de 0,05% (em peso / vol); e, (iv) DTPA em uma concentração de cerca de 50 uM; em que o pH é de cerca de 7,1.
110. Método, caracterizado pelo fato de que é para melhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo PEG-FGF-21 em uma concentração de cerca de 20 mg/mL, compreendendo misturar: (i) histidina em uma concentração de cerca de 20 mM; (ii) sacarose em uma concentração de cerca de 600 mM; (iii) Polissorbato 80 em uma concentração de cerca de 0,05% (em peso / vol); e, (iv) DTPA em uma concentração de cerca de 50 uM; em que o pH é de cerca de 7,1.
111. Método, caracterizado pelo fato de que é para melhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo PEG-FGF-21 em uma concentração de cerca de 10 mg/mL, compreendendo misturar: (i) histidina em uma concentração de 20 mM; (ii) sacarose em uma concentração de 600 mM; (iii) Polissorbato 80 em uma concentração de 0,05% (em peso / vol); e, (iv) DTPA em uma concentração de 50 uM; em que o pH é de 7,1.
112. Método, caracterizado pelo fato de que é para melhorar a estabilidade de uma formulação compreendendo PEG-FGF-21 em uma concentração de cerca de 20 mg/mL, compreendendo misturar: (i) histidina em uma concentração de 20 mM; (ii) sacarose em uma concentração de 600 mM; (iii) Polissorbato 80 em uma concentração de 0,05% (em peso / vol); e, (iv) DTPA em uma concentração de 50 uM; em que o pH é de 7,1.
113. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que é preparada de acordo com o método, como definido em qualquer uma das reivindicações 58 a 112.
114. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende (i) a for- mulação farmacêutica, como definida em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 57, ou 113, e (ii) instruções para uso.
115. Método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição associada com fibrose e/ou diabetes em um sujeito que neces- site do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende a administra- ção ao sujeito de uma quantidade eficaz de uma formulação farmacêuti- ca, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 57, ou 113.
116. Método, de acordo com a reivindicação 115, caracteriza- do pelo fato de que a doença ou condição é diabetes.
117. Método, de acordo com a reivindicação 116, caracteriza- do pelo fato de que o diabetes é diabetes tipo 2.
118. Método, de acordo com a reivindicação 115, caracteriza- do pelo fato de que a doença ou condição é esteato-hepatite não alcoóli- ca (NASH).
119. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 115 a 118, caracterizado pelo fato de que administração da quantidade eficaz da formulação farmacêutica ao sujeito diminui a rigidez hepática, diminui a percentagem de gordura corporal, diminui o peso corporal, di- minui a proporção de peso fígado - corpo, diminui o conteúdo de lipídeos do fígado, diminui a área de fibrose hepática, diminui os níveis de glicose sanguínea em jejum, diminui os níveis de triglicerídeos em jejum, diminui os níveis de colesterol LDL, diminui os níveis de ApoB, diminui os níveis de ApoC, aumenta os níveis de colesterol HDL, ou qualquer combinação dos mesmos.
120. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 115 a 119, caracterizado pelo fato de que entre cerca de 1 mg e cerca de 40 mg de polipeptídeo FGF-21 é administrado por dose.
121. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 115 a 120, caracterizado pelo fato de que cerca de 1 mg, cerca de 5 mg, cerca de 10 mg, cerca de 20 mg, ou cerca de 40 mg de polipeptídeo FGF-21 é administrado por dose.
122. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 115 a 121, caracterizado pelo fato de que a formulação farmacêutica é administrada por via subcutânea.
123. Método, de acordo com a reivindicação 122, caracteriza- do pelo fato de que a formulação farmacêutica é administrada por via subcutânea usando uma seringa de segurança.
124. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 115 a 123, caracterizado pelo fato de que a formulação farmacêutica é administrada diariamente ou semanalmente.
125. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 115 a 124, caracterizado pelo fato de que a administração da formulação farmacêutica ao sujeito resulta em: (i) redução nos níveis de gordura hepática; (ii) redução nos níveis de lesão hepática; (iii) redução nos níveis de fibrose; (iv) diminuição nos níveis de biomarcador de fibrose sérico Pro-C3 (propeptídeo de colágeno tipo III N-terminal); (v) diminuição nos níveis de alanina aminotransferase (ALT); (vi) diminuição nos níveis de aspartato aminotransferase (AST), (vii) aumento nos níveis de adiponectina sérica; (viii) diminuição nos níveis de LDL plasmático; (ix) aumento nos níveis de HDL plasmático; (x) diminuição nos níveis de triglicerídeos plasmáticos;
(xi) redução no nível de rigidez hepática; ou (xii) qualquer combinação das mesmas, comparados com os níveis em sujeitos não tratados ou com o sujeito antes da administração da formulação farmacêutica.
126. Método de tratamento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 115 a 125, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo FGF-21 é PEG-FGF-21 (SEQ ID NO: 2)
127. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo processo de misturar: (i) PEG-FGF-21 em uma quantidade para atingir uma concen- tração final de cerca de 10 mg/mL; (ii) histidina em uma quantidade para atingir uma concentração final de cerca de 20 mM; (iii) sacarose em uma quantidade para atingir uma concentra- ção final de cerca de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma quantidade para atingir uma con- centração final de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma quantidade para atingir uma concentração final de cerca de 50 uM; e ajustar o pH a cerca de 7,1.
128. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo processo de misturar: (i) PEG-FGF-21 em uma quantidade para atingir uma concen- tração final de cerca de 20 mg/mL; (ii) histidina em uma quantidade para atingir uma concentração final de cerca de 20 mM; (iii) sacarose em uma quantidade para atingir uma concentra- ção final de cerca de 600 mM;
(iv) Polissorbato 80 em uma quantidade para atingir uma con- centração final de cerca de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma quantidade para atingir uma concentração final de cerca de 50 uM; e ajustar o pH a cerca de 7,1.
129. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo processo de misturar: (i) PEG-FGF-21 em uma quantidade para atingir uma concen- tração final de 10 mg/mL; (ii) histidina em uma quantidade para atingir uma concentração final de 20 mM; (iii) sacarose em uma quantidade para atingir uma concentra- ção final de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma quantidade para atingir uma con- centração final de 0,05% (em peso / vol); e (v) DTPA em uma quantidade para atingir uma concentração final de 50 uM; e ajustar o pH a 7,1.
130. Formulação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo processo de misturar: (i) PEG-FGF-21 em uma quantidade para atingir uma concen- tração final de 20 mg/mL; (ii) histidina em uma quantidade para atingir uma concentração final de 20 mM; (iii) sacarose em uma quantidade para atingir uma concentra- ção final de 600 mM; (iv) Polissorbato 80 em uma quantidade para atingir uma con- centração final de 0,05% (em peso / vol); e
(v) DTPA em uma quantidade para atingir uma concentração final de 50 uM; e ajustar o pH a 7,1.
22,5 mg/mL em 20 mM de L-histidina, 600 mM de sacarose, pH 7,0 30,0 28,5 Petição 870200160750, de 23/12/2020, pág. 178/201 25,0 20,0 15,0 1/9 % acidífera (wrt T0)
D 10,0 4,8 5,0 3,1 0,1 0,0
20 mg/mL em 20 mM de L-histidina, 600 mM de sacarose, 0,05 mM de ácido pentético, 0,05% de PS80, pH 7,0 30,0 Petição 870200160750, de 23/12/2020, pág. 179/201 25,0 20,0 18,7 2/9 15,0 % HMW (wrt T0)
D 10,0 5,0 5,0 3,5 0,5 0,0
Oxidação de Met 1
35,6 34,1
Petição 870200160750, de 23/12/2020, pág. 180/201 19,3 3/9
15,8
% de Oxidação 4,3 4,8 4,7 4,2 4,1
Sem metal Sem metal Sem metal, Coquetel de Coquetel de Sem metal Sem metal, Coquetel de Coquetel de adicionado, adicionado, 50 mM metal, sem M adicionado, metal, 50 m 50 mM metal, sem M metal, 50 m sem quelante sem quelante de DTPA quelante de DTPA sem quelante de DTPA quelante de DTPA
T0, controle
Oxidação de Met 169
39,6
37,5
Petição 870200160750, de 23/12/2020, pág. 181/201 21,3 19,9 4/9
% de Oxidação 8,9 9,1 8,8 9,3 9,0
Sem metal Sem metal Sem metal, Coquetel de Coquetel de Sem metal Sem metal, Coquetel de Coquetel de adicionado, adicionado, 50 mM metal, sem M adicionado, metal, 50 m 50 mM metal, sem M metal, 50 m sem quelante sem quelante de DTPA quelante de DTPA sem quelante de DTPA quelante de DTPA
T0, controle pH alvo
His 6,3
Petição 870200160750, de 23/12/2020, pág. 182/201 His 6,5
His 6,8
His 7,0
His 7,5
% de HMW 5/9
Tris 7
Tris 7,5
Tris 8,3
Tempo (Dias em 40 C)
2,0 1,8 pH 6,5 1,7 pH 7,0 Petição 870200160750, de 23/12/2020, pág. 183/201 pH 7,5 1,5 1,0 0,9 0,7 6/9 de HMW (wrt T0)
D 0,0 0,5 0,5 0,4 0,3 0,2 0,0
22,5 mg/mL em 20 mM de L-histidina, 600 mM de sacarose, pH 7,0 6,0 5,5 Petição 870200160750, de 23/12/2020, pág. 184/201 5,0 4,0 3,0 7/9 % HMW (wrt T0)
D 2,0 1,0 0,6 0,7 0,0 0,0
20 mg/mL em 20 mM de L-histidina, 600 mM de sacarose, 0,05 mM de ácido pentético, 0,05% de PS80, pH 7,0 6,0 Petição 870200160750, de 23/12/2020, pág. 185/201 5,0 4,0 8/9 2,9 3,0 % HMW (wrt T0)
D 2,0 1,0 0,5 0,3 0,1 0,0
PS80 0,1% 0,05% PS80 0,025% PS80 0,01% PS80 Sem PS80
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