CN103282055A - 抗糖尿病化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供经由接头共价附着至抗体结合位点的FGF21分子，其中该接头共价附着至FGF21内的连接残基的侧链。本发明提供该化合物的各种用途，包括预防或治疗糖尿病或糖尿病相关病况的方法。

Description

抗糖尿病化合物
本发明涉及用于促进胰岛素分泌和降低血糖水平的新型化合物，以及制备和使用这些化合物的方法。
背景技术
Ⅱ型糖尿病为糖尿病中最普遍的形式。此种疾病是因为胰岛素抗性及胰脏β细胞衰竭，从而减少由葡萄糖刺激的胰岛素分泌所造成。纤维母细胞生长因子（FGF）21（FGF家族成员之一）已被确定为是一种代谢调节剂且优选在肝脏和脂肪组织中表达，并通过细胞表面受体（其由靶细胞上的FGFR1c和β-Klotho所组成，诸如肝脏和脂肪组织）发挥其生物活性（WO0136640及WO0118172）。该受体复合物被认为引发细胞质信号转导并通过Ras/MAP激酶路径上调GLUT1的表达。其提供持续的葡萄糖及血脂控制，并提高胰岛素敏感性及β细胞功能，但不会在临床前设置中造成任何明显的不良反应的能力已使FGF21成为有吸引力的Ⅱ型糖尿病及相关代谢失调的治疗剂。
现已有许多致力于开发基于FGF21为基础的疗法。WO2006065582、WO2006028714、WO2006028595及WO2005061712是关于FGF21的突变蛋白（包括个别氨基酸取代）。WO2006078463是针对使用FGF2治疗心血管疾病的方法。WO2005072769是关于使用FGF21与噻唑啉二酮的组合治疗糖尿病的方法。WO03059270是关于包含施用FGF21来降低危重患者的死亡率的方法。WO03011213是关于包含施用FGF21来治疗糖尿病及肥胖的方法。
然而，这些建议的疗法中有许多均面临FGF21在人类体内的半衰期为1.5至2小时的问题。已有一些尝试企图克服此缺点。WO2005091944、WO2006050247及WO2008121563中分别揭露经由赖氨酸或半胱氨酸残基、葡糖基及非天然氨基酸残基连接PEG的FGF21分子。WO2005113606描述FGF21分子使用聚甘氨酸接头，经由其C端重组融合至白蛋白及免疫球蛋白分子。
然而，开发蛋白缀合物使其成为有用、具成本效益的药物存在着许多严重的且往往是相互竞争的挑战：体内疗效、体内半衰期、体外储存的稳定性及制造的容易性和效率（包括缀合的效率和特异性）间必须达到平衡。一般而言，缀合过程中必须不消除或显著降低所讨论的蛋白质所需的生物功能。功能所需的蛋白质-蛋白质相互作用可能需要蛋白质多个区域协同作用，且以附近出现的缀合物扰乱这些蛋白质区域中任一区域时可能会干扰活性部位或对三级结构造成足够的改变而降低活性部位的功能。除非该缀合作用是通过N’或C’端，否则可能需要促进键连接的内部突变。这些突变对蛋白质的结构和功能可具有不可预测的影响。因此，对于以FGF21为基础的替代疗法的需求仍持续存在。
本说明书中涉及的任何参考不是且不应被视为以任何形式承认或暗示该参考形成通用常识的一部分。
发明概述
本发明涉及包含经由接头共价附着至抗体结合位点的FGF21分子的组合物，其中所述接头共价附着至FGF21内的连接残基的侧链。
所述连接残基可为半胱氨酸或赖氨酸。所述连接残基可位于选自如下的位置：根据SEQ ID NO:1编号的氨基酸残基第56、59、69、79、86、122、125及129号。所述连接残基可位于选自如下的位置：根据SEQ ID NO:1编号的氨基酸残基第56、59、86及122号。所述连接残基可位于选自如下的位置：根据SEQ ID NO:1编号的氨基酸残基第79、125及129号。
在一些方面，本发明提供包含FGF21分子的组合物，所述FGF21分子共价连接至少一个位于根据SEQ ID NO:1编号的残基56、59、69、79、86、122、125和／或129号上的连接残基的半衰期增加部分。在一些方面，所述FGF21分子共价连接一个半衰期增加部分。在一些方面，所述连接残基选自79、125及129号残基。术语“半衰期增加部分”是指当连接FGF21分子时可增加FGF21分子的循环半衰期和／或抑制或降低FGF21分子的肾清除率的任何分子。半衰期增加部分的实例包括PEG、mPEG、含有磷脂酰胆碱的聚合物、Fc结构域、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、ds Fv、scFv、VH、VL、双抗体(diabody)、小体(minibody)、抗体、催化性抗体(于下文讨论)、蛋白质(诸如白蛋白)及其他本领域已知的大分子。
所述连接残基的侧链可包含巯基。所述连接残基可为半胱氨酸。
所述FGF21分子可包含SEQ ID NO：3。所述FGF21分子可包含SEQID NO：4。所述FGF21分子可包含选自如下的序列：SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13。
所述连接残基可位于根据SEQ ID NO：1编号的位置125处。所述FGF21分子可包含选自如下的序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：7。在一些实施方案中，所述FGF21序列为SEQ ID NO：7。
所述连接残基可位于根据SEQ ID NO：1编号的位置129处。所述FGF21分子可包含选自如下的序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10。在一些实施方案中，所述FGF21序列为SEQ ID NO：10。
所述连接残基可位于根据SEQ ID NO：1编号的位置79处。所述FGF21分子可包含选自如下的序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13。在一些实施方案中，所述FGF21序列为SEQ ID NO：13。
在一些实施方案中，所述连接残基可位于选自如下的位置处：根据SEQID NO：1编号的位置1、2、56、59、69及122。在一些实施方案中，所述连接残基可位于选自如下的位置处：根据SEQ ID NO：1编号的位置1、2、56、59及122。所述连接残基可为赖氨酸。所述FGF21分子可包含SEQ IDNO：17。所述FGF21分子可包含选自如下的序列：SEQ ID NO：18、SEQID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21及SEQ ID NO：23。
US2009098130中揭露某些合适的接头，其内容纳入此文中作为参考。特别是，US2009098130中具体及大致涉及描述接头的一般公式、特殊接头结构、接头的合成方法及X、Y和Z基团的不同成分的组合等方面包含在本文中。所述接头可为直链型或支链型，并可任选包括一或多个碳环或杂环基。接头长度可被视为直线原子的数目，其环形部分(诸如芳香环等等)采取围绕所述环的最短路线计算。在一些实施方案中，所述接头具有5-15个原子的线性延伸，在其它实施方案中具有15-30个原子，在其它实施方案中具有30-50个原子，在其它实施方案中具有50-100个原子，而在其它实施方案中具有100-200个原子。其他接头的虑及包括对所产生化合物的物理或药物动力学性质的影响，诸如对溶解度、亲脂性、亲水性、疏水性、稳定性(较稳定或较不稳定，以及计划内的降解)、刚性、弹性、免疫原性及抗体结合的调整作用、被纳入微胞或脂质体的能力等等的影响。
在本发明的一些方面，所述化合物包含共价连接至连接残基的侧链的接头。所述接头可包含式：X-Y-Z；其中X为包括任何选自C、H、N、O、P、S、F、Cl、Br或I的原子的生物相容连接链，并可能包含聚合物或嵌段共聚物，且共价连接其中所述接头为线性的连接残基，Y为任选存在的包含至少一个环状结构的识别基；且Z为连接部分，其包含连接至抗体的结合位点中的氨基酸侧链的共价键。
当存在时，Y可能具有下列任选经取代的结构：
Figure BDA00003461989900041
其中a、b、c、d及e各自独立地为碳或氮；f为碳、氮、氧或硫；Y独立地连接位于任何两个具有足够价数的环位置处的X和Z；且a、b、c、d、e或f中不超过四个同时为氮，且优选地，在环状结构中的a、b、c、d及e均为碳。在一些方面，Y可为苯基。虽然不欲受限于任何理论，据认为所述Y基团可以协助将反应基置入抗体结合位点中，从而使所述Z基团能与反应性氨基酸侧链反应。
所述接头可经过设计从而使其包含能与大分子(诸如抗体、蛋白质或其片段)形成共价或非共价键的反应基团。所述反应基团经过选择以与特殊结合位点中的反应残基一起使用。例如：经由醛缩酶抗体修改的化学部分可为酮、二酮、β内酰胺、活性酯卤代酮、内酯、酐、马来酰亚胺、α-卤代乙酰胺、环己二酮、环氧化物、醛、脒、胍、亚胺、烯胺、磷酸化物、膦酸化物、环氧化物、氮丙啶、硫代环氧化物、经屏蔽或保护的二酮(如缩酮)、内酰胺、卤代酮、醛等等。在本发明的实施方案中以接头连接本发明的肽，Z为反应基团。
在一些实施方案中，在与抗体的结合位点中的残基侧链缀合前，Z包含一或多个C=O基团，所述C=O基团经过安排以形成氮杂环丁酮、二酮、酰基β-内酰胺、活性酯、卤代酮、环己二酮基团、醛、马来酰亚胺、经活化的烯烃、经活化的炔，或者，一般而言，包含容易发生亲核或亲电子取代的脱离基的分子。其他基团可能包括内酯、酐、α-卤代乙酰胺、亚胺、酰肼或环氧化物。示例性的可与抗体结合位点中的反应性亲核基团(如赖氨酸或半胱氨酸侧链)共价键结合的接头亲电子反应基团包括酰基β-内酰胺、单纯二酮、琥珀酰亚胺活性酯、马来酰亚胺、具接头的卤代乙酰胺、卤代酮、环己二酮、醛、脒、胍、亚胺、烯胺、磷酸化物、膦酸化物、环氧化物、氮丙啶、硫代环氧化物、经屏蔽或保护的二酮(例如缩酮)、内酰胺、磺酸化物等等，经屏蔽的C=O基团，诸如亚胺、缩酮、缩醛以及任何其他已知的亲电子基团。在某些实施方案中，所述反应基团包括一或多个C=O基团经安排以形成：酰基β-内酰胺、单纯二酮、琥珀酰亚胺活性酯、马来酰亚胺、具接头的卤代乙酰胺、卤代酮、环己二酮或醛。Z可能为经取代的烷基、经取代的环烷基、经取代的芳基、经取代的芳烷基、经取代的杂环基或经取代的杂环烷基，其中至少一个取代基为1,3-二酮部分、酰基β-内酰胺、活性酯、α-卤代酮、醛、马来酰亚胺、内酯、酐、α-卤代乙酰胺、胺、酰肼或环氧化物。Z基团可能共价连接可增加本发明肽类的半衰期的大分子支架。若存在时，Z基团可共价连接抗体的结合位点。
在一些方面，在缀合(例如与抗体结合位点结合)前，Z具有下列结构：
Figure BDA00003461989900051
其中q=0-5。q可能为1或2。q可能为1。在其他方面，q可能为2。
在一些方面，在与抗体的结合位点缀合之后，Z具有下列结构：
Figure BDA00003461989900052
其中q=0-5，而抗体-N-为结合抗体的结合位点中的侧链的共价键。q可为1或2。q可为1。在其它方面，q可为2。
X可为包含三种组分的基团；Xp-Xs-Xy，其中Xp是经特定改造以适合与FGF21蛋白质连接残基的侧链组合的基团，Xs为X基团的间隔区且Xy为经改造以适合与Y基团结合的基团。在一些方面，Xy选自酰胺键、烯胺键或胍键。Xy可经过选择以提供与Y基团相邻(在两个原子内)的氢分子。虽然不欲受限于理论，据认为H原子可通过氢键相互作用协助Y基团辨认疏水袋(hydrophobic pocket)，尤其是在催化性抗体(诸如h38C2)结合裂缝(binding cleft)的疏水袋方面。因此，例如，酰胺键可经定向从而使所述NH基团直接与Y基团键结，提供NH基团的H供氢键结。或者，所述酰胺的C=O基团可与Y基团键结，使NH基团的H与Y基团至多相隔2个原子，但仍可供H键结。在一些实施方案中，Xy不存在。在一些实施方案中，Xy基团具有下式：
Figure BDA00003461989900061
在一些方面，Xs经选择从而使Xs不会提供过度反应性的基团。Xs可经选择从而提供总长度为2-15个原子的X基团。Xs可经选择从而使X基团的总长度为2至10个原子。Xs可经选择从而使X基团的总长度为4-8个原子。Xs可经选择从而使X基团的总长度为5个原子。Xs可经选择从而使X基团的总长度为6个原子。在一些方面，Xs可包含下列式之一：
Figure BDA00003461989900062
其中n=1、2、3、4、5、6、7、8、9或10且m存在或不存在；n可为1、2、3、4、5或6；n可为1、2、3或4；n可为1；n可为2；n可为3；n可为4。
在一些方面，Xs包含下列式之一：
理想的情况下，Xp经选择从而使得FGF21蛋白质的连接残基可以进行特异定向性共价连接策略。例如，当所述连接残基包含亲核基团时，Xp可为亲电子基团，反之亦然。例如，若所述连接残基侧链包含氨基基团，诸如K、H、Y、鸟氨酸、Dap或Dab，Xp可为COOH，或其它类似的反应性亲电基。若所述连接残基为D或E，Xp可包含亲核基团，诸如氨基基团。这些策略中的任意策略可允许Xp基团与连接残基间经由形成酰胺键的策略来形成共价键。当所述连接基团为氨基基团时，Xp可包含下式：
Figure BDA00003461989900071
其中所述连接残基为C、C的同系物或其它含巯基残基，Xp可包含马来酰亚氨基基团(或类似)，此基团允许硫代马来酰亚胺加成反应策略以使Xp基团共价连接所述连接残基。在一些方面，Xp也可包含巯基，允许所述连接残基与Xp基团间形成二硫键。在一些方面，Xp可为马来酰亚胺：
Figure BDA00003461989900072
其中所述箭头指明连接FGF21连接残基的附着点，且所述平行线代表连接所述接头的Y基团。其中所述FGF21连接残基为半胱氨酸残基，或其它带有侧链的巯基，所述缀合的机制可如下：
Figure BDA00003461989900073
在一些方面，所述Xp基团包含经取代的马来酰亚胺：
Figure BDA00003461989900074
在一些方面，在缀合之前及缀合之后，所述接头的XY组分可选自：
Figure BDA00003461989900081
组分XY-1、XY-2、XY-3及XY-4在缀合至FGF21分子上的带有巯基侧链的实施方案中特别有用。
在一些实施方案中，所述接头可为接头-1(L1)：
Figure BDA00003461989900082
当L1与抗体缀合时，所述抗体-L1复合物可包含下式：
Figure BDA00003461989900083
当L1与FGF21分子缀合时，所述L1-FGF21复合物可包含下式：
Figure BDA00003461989900091
当L1与抗体及FGF21分子缀合时，所述抗体-L1-FGF21复合物可包含下式：
Figure BDA00003461989900092
在一些实施方案中，所述接头可为接头-2(L2)：
Figure BDA00003461989900093
当L2与抗体缀合时，所述抗体-L2复合物可包含下式：
Figure BDA00003461989900094
当L2与FGF21分子缀合时，L2-FGF21复合物可包含下式之一：
Figure BDA00003461989900095
当L2与抗体及FGF21分子缀合时，所述抗体-L2-FGF21复合物可包含下式之一：
Figure BDA00003461989900096
在一些实施方案中，所述接头可为接头-3(L3)：
Figure BDA00003461989900101
当L3与抗体缀合时，所述抗体-L3复合物可包含下式：
Figure BDA00003461989900102
当L3与FGF21分子缀合时，所述L3-FGF21复合物可包含下式之一：
Figure BDA00003461989900103
当L3与抗体及FGF21分子缀合时，所述抗体-L3-FGF21复合物可包含下式：
Figure BDA00003461989900104
在一些实施方案中，所述接头可为接头-4(L4)：
Figure BDA00003461989900105
当与抗体缀合时，所述抗体-L4复合物可包含下式：
Figure BDA00003461989900111
当与FGF21分子缀合时，所述L4-FGF21复合物可包含下式：
Figure BDA00003461989900112
当L4与抗体及FGF21分子缀合时，所述抗体-L4-FGF21复合物可包含下式：
Figure BDA00003461989900113
在一些实施方案中，所述接头可为接头-5(L5)：
当L5与抗体缀合时，所述抗体-L5复合物可包含下式：
Figure BDA00003461989900115
当L5与FGF21分子缀合时，所述L5-FGF21复合物可包含下式：
当L5与抗体及FGF21分子缀合时，所述抗体-L5-FGF21复合物可包含下式：
Figure BDA00003461989900121
在一些方面，所述接头可为接头-6(L6)：
Figure BDA00003461989900122
当L6与抗体缀合时，所述抗体-L6复合物可包含下式：
Figure BDA00003461989900123
当L6与FGF21分子缀合时，所述L6-FGF21复合物可包含与L5-FGF21相同的结构式。类似地，当L6与抗体及FGF21分子缀合时，所述抗体-L6-FGF21复合物可包含与Ab-L5-FGF21相同的结构式。
在一些实施方案中，所述接头可为接头-7(L7)：
Figure BDA00003461989900124
当与抗体缀合时，所述抗体-L7复合物可包含下式：
当与FGF21分子缀合时，所述L7-FGF21复合物可包含下式：
Figure BDA00003461989900126
当与抗体及FGF21分子缀合时，所述抗体-L7-FGF21复合物可包含下式：
在一些实施方案中，所述接头可为接头-8(L8)：
Figure BDA00003461989900131
当L8与抗体缀合时，所述抗体-L8复合物可包含下式：
Figure BDA00003461989900132
当L8与FGF21分子缀合时，所述L8-FGF21复合物可包含下式：
当L8与抗体及FGF21分子缀合时，所述抗体-L8-FGF21复合物可包
Figure BDA00003461989900134
在一些实施方案中，所述Ab-接头-FGF21结合物可具有下式：
Figure BDA00003461989900135
其中所述抗体结合位点共价连接所述接头，S-FGF21为连接FGF21分子上含巯基侧链的共价键，n=1、或2、或3、或4、5、6、7、8、9或10；n可为1、2、3、4、5或6；n可为1；n可为2；n可为3；n可为4，且m为任选的。M可不存在。M可存在。
在一些实施方案中，所述Ab-接头-FGF21结合物可具有下式：
Figure BDA00003461989900136
其中所述抗体结合位点共价连接所述接头，S-FGF21为连接FGF21分子上含巯基侧链的共价键，n=1、或2、或3、或4、5、6、7、8、9或10；n可为1、2、3、4、5或6；n可为1；n可为2；n可为3；n可为4。
在一些实施方案中，所述组合物包含下式：
其中抗体连接抗体结合位点的共价键，S-FGF21为连接FGF21分子上含巯基侧链的共价键。在一些实施方案中，所述FGF21分子包含SEQ ID NO：10。在一些实施方案中，所述FGF21分子包含SEQ ID NO：7。
在一些方面，本发明涉及如本文所述的接头及接头组分，特别是但不限于本文所述的X基团。在一些方面，本发明涉及包含抗体或其抗原结合部分的组合物，所述抗体或其抗原结合部分以共价方式缀合本文所述的接头或接头基团。在一些方面，所述接头或接头基团可进一步直接或间接缀合至肽或蛋白质。很清楚地，所述接头及抗体接头缀合物的用途不限于与FGF21分子一起应用，且所述抗体-接头缀合物可以是与其它肽类、蛋白质及治疗剂和靶向剂结合的缀合物。可理解的是，为了这些目的，与本文所述的S-FGF21及NH-FGF21的结构相同的结构可应用于其它蛋白质、肽类及治疗和靶向分子；按所述蛋白、肽或分子取代的代表结构的FGF21命名。
在一些方面，本发明提供具有下式的接头：
Figure BDA00003461989900142
其中n=1、或2、或3、或4、5、6、7、8、9或10；n可为1、2、3、4、5或6；n可为1；n可为2；n可为3；n可为4。M可不存在。M可存在。
在一些方面，本发明提供具有下式的接头：
Figure BDA00003461989900143
其中n=1、或2、或3、或4、5、6、7、8、9或10；n可为1、2、3、4、5或6；n可为1；n可为2；n可为3；n可为4。M可不存在。M可存在。
在一些实施方案中，本发明涉及包含选自如下的接头的组合物：L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7和L8，以及其它本文所描述的具有特殊及一般接头式的接头。在一些方面，本发明涉及制造所述接头及其抗体-接头，蛋白质-接头或抗体-接头-蛋白质缀合物的方法。
在一些实施方案中，本发明关于包含经由接头共价连接抗体结合位点的FGF21分子的组合物，其中所述接头共价连接在FGF21中连接残基的侧链，形成缀合的蛋白质-抗体复合物，从而使所述经缀合的蛋白质-抗体复合物在鼠模型中皮下半衰期为至少约20小时。在一些实施方案中，所述SC半衰期为至少约25小时。在一些实施方案中，所述SC半衰期为至少约30小时。在一些实施方案中，所述SC半衰期为至少约33小时。在一些实施方案中，在大鼠模型中的SC半衰期为至少约35小时。在一些实施方案中，在大鼠模型中的SC半衰期为至少约36小时。在一些实施方案中，在灵长类动物模型中的SC半衰期为至少约40小时。在一些实施方案中，在灵长类动物模型中的SC半衰期为至少约45小时。在一些实施方案中，本发明提供在鼠模型中的IV半衰期为至少约28小时的经缀合的抗体-蛋白质复合物。在一些实施方案中，本发明提供在大鼠模型中IV半衰期为至少约55小时的经缀合的抗体-蛋白质复合物。在一些实施方案中，本发明提供在大鼠模型中的IV半衰期为至少约55小时的经缀合的抗体-蛋白质复合物。在一些实施方案中，本发明提供在大鼠模型中的IV半衰期为至少约60小时的经缀合的抗体-蛋白质复合物。在一些实施方案中，本发明提供在灵长类动物模型中IV半衰期为至少约60小时的经缀合的抗体-蛋白质复合物。在一些实施方案中，本发明提供在灵长类动物模型中的IV半衰期为至少约65小时的经缀合的抗体-蛋白质复合物。在一些实施方案中，本发明提供于施用单一剂量后在人体内IV半衰期为至少约30小时的经缀合的抗体-蛋白质复合物。在一些实施方案中，本发明提供于施用单一剂量后在人体内IV半衰期为至少约35小时的经缀合的抗体-蛋白质复合物。
在一些实施方案中，本发明关于包含经由接头共价连接抗体结合位点的FGF21分子的组合物，其中所述接头共价连接FGF21内的连接残基的侧链，形成缀合的蛋白质-抗体复合物，从而使所述经缀合的蛋白质-抗体复合物在鼠模型中的皮下生物可利用率为至少约50％。在一些实施方案中，所述SC生物可利用率为至少约55％。在一些实施方案中，所述SC生物可利用率为至少约65％。在一些实施方案中，在大鼠模型中SC生物可利用率为至少约50％。在一些实施方案中，在灵长类动物模型中SC生物可利用率为至少约50％。在一些实施方案中，在灵长类动物模型中SC生物可利用率为至少约60％。在一些实施方案中，在灵长类动物模型中的SC生物可利用率为至少约65％。
在一些实施方案中，本发明关于包含经由接头共价连接抗体结合位点的FGF21分子的组合物，其中所述接头共价连接FGF21内连接残基的侧链，形成缀合的蛋白质-抗体复合物，从而使所述经缀合的蛋白质-抗体复合物在鼠模型中的皮下生物可利用率为至少约50％。在一些实施方案中，所述SC生物可利用率为至少约55％。在一些实施方案中，所述SC生物可利用率为至少约65％。
在一些实施方案中，本发明关于包含经由接头共价连接抗体结合位点的FGF21分子的组合物，其中所述接头共价连接FGF21内连接残基的侧链，形成缀合的蛋白质-抗体复合物，从而使所述经缀合的蛋白质-抗体复合物在Glut1Taqman分析中的EC50效力低于约5nM。在一些实施方案中，在Glut1Taqman分析中的EC50效力低于约4nM。在一些实施方案中，在Glut1Taqman分析中EC50效力低于约3nM。
在一些实施方案中，所述经缀合的蛋白质-抗体复合物结合二种或更多种有利优势，诸如SC半衰期、IV半衰期、葡萄糖摄取、效力、生物可利用率、易于制造、缀合效率、体内稳定性、体外稳定性、对水解的抗性及抗体、接头与蛋白质之间的相容性。
抗体
US2006205670的内容纳入本文作参考-尤其是段落[0153]-[0233]，其描述抗体、其有用的片段和变体及修饰、结合位点和CDR、抗体制备方法、表达、人源化、氨基酸修改、糖基化、ADCC、CDC、增加的抗体的血清半衰期、表达载体、哺乳动物宿主系统及折叠，以及其它抗体技术的要素。
本文所使用的“结合位点”(也称为抗体结合位点)是指与适当抗原(或结构上类似的蛋白质)的决定簇结合(或可结合)的免疫球蛋白区或Ig结构域。此术语通常包括涉及抗原结合的CDR及相邻的框架残基。
本文所使用的“醛缩酶抗体”是指含有结合位点部分的抗体，所述结合位点部份当不受防碍(例如由于缀合)时，其催化脂族酮供体及醛受体之间的醛醇加成反应。醛缩酶抗体可经由以免疫原对免疫反应动物进行免疫来生成，再进一步经由在抗体的结合位点具有赖氨酸(带有反应性ε氨基基团)来表征，所述免疫原包含与载体蛋白耦合的具下式的1,3-二酮半抗原：
Figure BDA00003461989900171
且所述醛缩酶抗体进一步经由所述抗体结合位点中带有反应性ε氨基基团的赖氨酸表征。所述醛缩酶抗体的特性进一步由如下来说明：1,3-二酮半抗原与所述催化性抗体的赖氨酸的ε氨基基团间形成复合物而使其催化活性被1,3-二酮半抗原抑制。
如前述，在某些实施方案中，某些可与本发明化合物结合使用的抗体在抗体结合位点中可能需要一个反应性侧链。反应性侧链可天然存在或可经由突变而被引入抗体中。所述抗体结合位点的反应残基可能与抗体联合，诸如当所述残基是由存在于所述最先被鉴定用于制造抗体的淋巴细胞中的核酸所编码时。或者，所述氨基酸残基可经由有目的地使DNA发生突变，从而编码所述特定残基来产生(如WO01/22922)。所述反应性残基可为非天然残基，其是由，例如：使用如本文所讨论的独特密码子、tRNA及氨酰基-tRNA，经由生物合成并入法产生。在另一种方法中，所述氨基酸残基或其反应性官能团(如：亲核性氨基或巯基)可能连接抗体结合位点的氨基酸残基。因此，本文所使用的“通过抗体结合位点中的氨基酸残基”产生的与抗体的共价键意指所述键可直接连接抗体结合位点中的氨基酸残基或通过连接抗体结合位点的氨基酸残基的侧链的化学部分连接。在一些实施方案中，所述氨基酸为半胱氨酸且所述侧链的反应基团为巯基。在其它实施方案中，所述氨基酸残基为赖氨酸且所述侧链的反应性基团为ε-氨基基团。在一些实施方案中，所述氨基酸为根据Kabat编号的重链上的Lys93。在一些实施方案中，所述氨基酸为HC h38C2(SEQ ID NO：26)上的Lys-99。
催化性抗体为具有包含一或多个反应性氨基酸侧链的合适结合位点的抗体来源之一。这类抗体包括醛缩酶抗体、β内酰胺酶抗体、酯酶抗体及酰胺酶抗体。
一种实施方案涉及醛缩酶抗体(诸如小鼠单株抗体mAb33F12及mAb38C2)，以及这类抗体的适当嵌合及人源化变体(如：h38C2，SEQ ID NO：25及26)。鼠mAb38C2(及h38C2)具有接近但在HCDR3外的反应性赖氨酸并且是经反应性免疫以及机械上模拟天然醛缩酶所产生的新催化性抗体类别的原型。见C.F.Barbas3rd et al.,Science278:2085-2092(1997)。其它可使用的醛缩酶催化性抗体包括由下列所产生的抗体：杂交瘤85A2，ATCC编号为PTA-1015；杂交瘤85C7，ATCC编号为PTA-1014；杂交瘤92F9，ATCC编号为PTA-1017；杂交瘤93F3，ATCC编号为PTA-823；杂交瘤84G3，ATCC编号为PTA-824；杂交瘤84G11，ATCC编号为PTA-1018；杂交瘤84H9，ATCC编号为PTA-1019；杂交瘤85H6，ATCC编号为PTA-825；杂交瘤90G8，ATCC编号为PTA-1016。通过反应性赖氨酸，这些抗体利用天然醛缩酶的烯胺机制催化醛醇及逆醛醇反应。醛缩酶抗体及产生醛缩酶抗体的方法在美国专利案编号6,210,938、6,368,839、6,326,176、6,589,766、5,985,626及5,733,75(其援引加入本文)中有公开。
本发明的化合物也可经连接本发明的化合物与反应性半胱氨酸来形成，诸如那些在硫酯酶及酯酶催化性抗体的结合位点中所发现的。合适的硫酯酶催化性抗体描述于K.D.Janda et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:2532-2536(1994)中。合适的酯酶抗体描述于P.Wirsching et al.,Science270:1775-1782(1995)中。含有反应性氨基酸的抗体可经由本领域所周知的方式制备，包括使抗体结合位点残基突变以编码所述反应性氨基酸或以含有反应性基团的接头在抗体结合位点中化学衍生出氨基酸侧链。
所述抗体可为人源化抗体。当本发明的化合物共价连接抗体结合位点且这类抗体为人源化抗体时，这类抗体被人源化时保留对Z基团的高连接亲和力是重要的。所虑及的人源化小鼠醛缩酶抗体形式有多种。在一个实施方案中使用具有人类恒定区CK及CY11的人源化醛缩酶催化性抗体h38c2IgG1或h38c2Fab。CRader et al.,J.Mol.Bio.332:889-899(2003)中揭露可用于制造h38c2Fab及h38c2IgG1的基因序列及载体。使用人类种系VK基因DPK-9及人类JK基因JK4作为用于将m38c2的κ轻链可变区人源化的框架，并使用人类种系基因DP-47及人JH基因JH4作为用于将m38c2的重链可变区人源化的框架。图1说明m38c2、h38c2及人类种系细胞中的可变轻链和重链之间的序列比对。h38c2可采用IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区，包括其任何同种异型。在本发明化合物的某些实施方案中，其中所述抗体为具有G1m(f)同种异型的h38c2IgG1，Z结合在重链的位置99上的赖氨酸残基的侧链。另一种实施方案采用包含h38c2(SEQ ID NO：27及28)的可变区(VL及VH)及来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区的嵌合抗体。所述抗体可为全长抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、FV、ds FV、sc FV、VH、VL、双抗体或包含来自h38c2的VL及VH结构域的小体。所述抗体可为包含来自h38c2的VH及VL结构域及选自如下的恒定区的抗体：IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。所述抗体可为h38C2IgG1(SEQ ID NO：25及26)。所述抗体可为包含来自人IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的恒定区的小鼠醛缩酶抗体的人源化变体。在另一实施方案中，所述抗体为包含来自小鼠醛缩酶抗体的VL及VH区及来自人IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的恒定区的嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含来自m38C2(SEQ ID NO：29及30)的VL及VH结构域。在另外的实施方案中，所述抗体为包含来自天然或固有的人IgG、IgA、IgM、IgD或IgE抗体的多肽序列的小鼠醛缩酶抗体的全长人类变体。
还虑及了各种形式的人源化的醛缩酶抗体片段。一个实施方案使用h38c2F(ab′)2。h38c2F(ab′)2可经由蛋白质水解h38c2IgG1来产生。另一个实施方案使用包含来自h38c2的VL及VH结构域(其任选经由插入的接头(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：31)连接)的h38c2sc FV。可以产生人抗体作为人源化的替代。例如，现在已可能生产转基因动物(如小鼠)，当被免疫(或者，在催化性抗体的情况中为反应性免疫)时其有能力在缺乏内源性免疫球蛋白生成的情况下制造人类抗体完整集合库。
或者，可使用噬菌体展示技术在体外使用来自未免疫供体免疫球蛋白可变(V)区基因集合库来生成人抗体及抗体片段。如上述，也可经由体外激活的B细胞来产生人抗体，例如美国专利案编号5,567,610及5,229,275所述。
虑及了修改本文所描述的抗体的氨基酸序列。例如：理想的是改良抗体的结合亲和力和／或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体是经由将合适的核苷酸变化引入抗体核酸或经由肽合成来制备。这类修改包括，例如:从抗体的氨基酸序列删除、插入残基和／或取代残基。制造任何删除、插入及取代的组合以取得最终结构，只要所述最终结构拥有所需的特性。所述氨基酸变化也可改变抗体的翻译后加工，诸如改变糖基化部位的数量或位置。
本发明的抗体或抗体部分可从另一个分子(例如另一个肽或蛋白质)衍生或连接至另一个分子。一般而言，所述抗体或其部分经衍生从而使所述接头共价结合抗体结合位点的能力不受衍生作用或标记的影响。因此，本发明的抗体和抗体部分包括了本文所描述的完整和修改形式的抗体。例如：本发明的抗体或抗体部分可功能上连接(经由化学偶联、基因融合、非共价结合或以其它方式)一或多个其它可以调介所述抗体或抗体部分与另一分子(诸如链霉抗生物素(streptavidin)蛋白核心区或聚组氨酸标签)联结的分子实体(诸如另一抗体，如：双特异性抗体或双抗体、检测剂、细胞毒性剂、药剂和／或蛋白质或肽)。
在其它实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合位点可为融合抗体或与另一多肽连接的抗体。在一些方面，仅有抗体的可变区与多肽连接。在一些方面，所述抗体以不会干预所述结合位点结合能力的方式与肽共价结合。
多肽可为一种治疗剂，诸如靶向剂，肽、蛋白质激动剂、蛋白质拮抗剂、代谢标记物、激素、毒素、生长因子或其它标记蛋白，或可为一种诊断剂，诸如可轻易地目测检验的酶(诸如辣根过氧化物酶)。此外，可创造其中两个(或更多个)单链抗体彼此连接的融合抗体。若欲在单一多肽链上创造二价或多价抗体，或若欲创造双特异性抗体则此亦有所助益。
一种类型的衍生抗体是经由将二种或更多种抗体(为相同类型或不同类型，例如：创造双特异性抗体)交联来产生的。合适的交联剂包括那些为异型双功能，具有两个经由合适间隔子分开的不同反应性基团的交联剂(例如间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同型双功能交联剂(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。
另一种类型的衍生抗体为经标记的抗体。可能用来衍生本发明抗体或抗体部分的有用检测剂包括萤光化合物，包括萤光素、萤光素异硫氰酸酯、玫瑰红(rhodamine)、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红素、镧系萤光粉等等。也可有用于检测的酶标记抗体，诸如辣根过氧化物酶、半乳糖苷酶，萤光素酶，碱性磷酸酶，葡萄糖氧化酶等等。当抗体以可检测的酶标记时则经由添加额外试剂使所述酶用来产生可被识别的反应产物来检测抗体。例如：当存在辣根过氧化物酶作用剂时，添加过氧化氢及二氨基联苯胺可产生能被检测到的有色反应产物。也可以生物素标记抗体，并通过间接测量抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合来进行检测。可以磁性剂(诸如钆)来标记抗体。也可以能被第二报导子(例如：亮氨酸拉链对序列、用于第二抗体的结合位点、金属结合区、抗原决定部位标签)辨识的预定多肽抗原决定部位标记抗体。在一些实施方案中，标记经具有各种长度的间隔子连接，以减少潜在的空间阻碍。
还可以化学基团(诸如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基、或碳水化合物基团)衍生抗体。这些基团可用于改良所述抗体的生物学特性，如：增加血清半衰期或增加组织结合。
药物组合物
本发明另一方面提供包含本发明组合物和／或化合物的药物组合物。包含本发明组合物的物质可经配制并经由全身性施用。用于配制及施用的技术可在Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,1990,MackPublishing Co.,Easton,PA中找到。
在用于注射方面，本发明的组合物可配制在水溶液、乳液或悬浮液、或非水性溶液、悬浮液、乳液、分散液或适合重建成无菌注射液或分散液的无菌粉末或冻干粉末中。合适的水性和非水性稀释剂、溶剂及载剂的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如丙二醇、聚乙二醇、甘油等等)、其合适的混合物及油类。流动性可经由，例如使用涂层(诸如卵磷脂)、在分散液的情况下经由维持所需的粒度及使用表面活性剂来保持或改善。
本发明的组合物可配制在包含生理上相容的缓冲剂(诸如柠檬酸盐、醋酸盐、组氨酸或磷酸盐)的水溶液中。如有需要，这类配制剂也可包含各种张力标记剂、助溶剂和／或稳定剂(如：盐类，诸如氯化钠、糖类，诸如蔗糖、甘露醇及海藻糖、蛋白质，诸如白蛋白、氨基酸，诸如甘氨酸及组氨酸、表面活性剂，诸如聚山梨酸酯(Tween)或共溶剂，诸如乙醇、聚乙二醇及丙二醇)。本发明的组合物还可包含佐剂，诸如润湿剂、乳化剂及悬浮剂、分散剂和防腐剂。本发明的组合物还可包含悬浮剂，诸如琼脂、偏氢氧化铝、膨润土、乙氧基化异硬脂醇、微晶型纤维素、聚氧乙烯山梨醇和山梨醇酐酯，以及黄蓍胶，或其混合物。
本发明的组合物还可能包含各种抗菌及抗真菌剂，例如对苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等等。还可需要包含等张剂，例如糖、氯化钠等等。本发明的注射组合物的长期吸收可能受使用能延迟吸收的作用剂(例如：单硬脂酸铝及明胶)影响。
本发明的组合物可包含用于改变、维持或保存例如组合物的pH值、渗透压、粘度、澄清度、颜色、等张性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释出速度、吸附或渗透的配制剂质。合适用的配制剂质包括，但不限于：氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)、抗菌剂、抗氧化剂(诸如L-甲硫氨酸抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)、缓冲剂(诸如醋酸钠、乳酸盐、硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)、膨胀剂(诸如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂(诸如乙二胺四醋酸(EDTA)、DPTA)、复合剂(诸如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)、填充剂、单醣、双醣及其它碳水化合物(诸如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白质(诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、着色剂、调味及稀释剂、乳化剂、亲水性聚合物(诸如聚乙烯吡咯啶酮)、低分子量多肽、成盐抗衡离子(诸如钠)、防腐剂(诸如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己啶(chlorhexidine)、山梨酸或过氧化氢)、溶剂(诸如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(诸如甘露醇或山梨醇)、悬浮剂、表面活性剂或润湿剂(诸如普朗尼克(pluronics)；PEG；山梨醇酐酯；聚山梨酸酯，诸如聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80；triton；胺丁三醇；卵磷脂；胆固醇或泰洛沙泊(tyloxapal))、稳定性加强剂(诸如蔗糖或山梨醇)、张力加强剂(诸如碱金属卤化物-优选为氯化钠或钾-或甘露醇、山梨醇)、输送载体、稀释剂、赋形剂和／或制药佐剂。
所述配制组分以能被施用部位接受的浓度存在。可使用缓冲剂将所述组合物维持在生理pH值或略低的pH值，通常在约5至约8的pH值范围内。
在一些方面，本发明的药物组合物可能制备成其中本发明化合物经配制以控制或持续释出所述化合物。实例包括透明质酸等、高分子凝胶，小珠、颗粒，可注射的微球，脂质体，薄膜，微胶囊，持续释出的基质及植入式药物输送装置。
在一些方面，本发明药物组合物提供于单或多室预填式注射器中。
在一些方面，本发明提供包含至少一种本发明化合物或组合物与至少一种适合用于药物组合物中的额外成分的试剂盒。在一些方面，本发明提供包含至少一种本发明化合物或组合物与至少一种用于输送所述组合物给患者的试剂盒。
本发明的组合物可经由将FGF21分子与接头共价连接并将接头与多价抗体的结合位点缀合来合成。例如：可将FGF21-接头缀合物(其中所述接头包含二酮或AZD(β-内酰胺)反应部分)与0.5当量夫人醛缩酶抗体(诸如h38C2IgG1)一起培育以制造本发明的组合物。
使用方法
在人类治疗用途方面，人、人源化、或人嵌合抗体、或其抗原结合部分为本发明化合物或组合物的抗体部分的优选抗体形式。
本发明的一方面为用于治疗糖尿病或糖尿病相关病况的方法，其包含给予患有糖尿病或糖尿病相关病况对象治疗上有效量的本发明的组合物。
本发明另一方面为用于增加对象内胰岛素分泌的方法，其包含给予对象治疗上有效量的本发明组合物或其药学衍生物。
本发明另一方面为用于降低对象中血糖量的方法，其包含给予对象治疗上有效量的本发明组合物或其药学衍生物。
本发明另一方面为用于治疗对象肥胖的方法，其包含给予对象治疗上有效量的本发明组合物或其药学衍生物。
本发明另一方面为用于控制或减轻对象体重的方法，其包含给予对象治疗上有效量的本发明组合物或其药学衍生物。
本发明另一方面为用于治疗对象饿血脂异常(dyslipidemia)的方法，其包含给予对象治疗上有效量本发明组合物或其药学衍生物。
本发明另一方面为用于治疗对象高血压的方法，其包含给予对象治疗上有效量本发明组合物或其药学衍生物。
本发明另一方面为用于治疗对象肝脂肪变性(hepatosteaotosis)的方法，其包含给予对象治疗上有效量的本发明组合物或其药学衍生物。
本发明另一方面为用于治疗对象心血管疾病的方法，其包含给予对象治疗上有效量的本发明组合物或其药学衍生物。
本发明另一方面为用于降低对象胰高血糖素量的方法，其包含给予对象治疗上有效量的本发明组合物或其药学衍生物。
本发明另一方面为用于降低对象三酸甘油酯量的方法，其包含给予对象治疗上有效量的本发明组合物或其药学衍生物。
本发明另一方面为用于增加对象非酯化游离脂肪酸量的方法，其包含给予对象治疗上有效量的本发明组合物或其药学衍生物。
本发明另一方面为用于降低对象中低密度胆固醇量的方法，其包含给予对象治疗上有效量本发明组合物或其药学衍生物。
本发明另一方面为用于降低对象中C-反应蛋白量的方法，其包含给予对象治疗上有效量的本发明组合物或其药学衍生物。
本发明另一方面为用于降低对象中果糖胺量的方法，其包含给予对象治疗上有效量的本发明组合物或其药学衍生物。
本发明另一方面为用于控制对象中血糖控制的方法，其包含给予对象治疗上有效量的本发明组合物或其药学衍生物。
本发明的另一方面是用于增加对象中降脂蛋白(adipsin)量的方法，其包含给予对象治疗上有效量的本发明组合物或其药学衍生物。
本发明另一方面为用于增加对象中HDL量的方法，其包含给予对象治疗上有效量的本发明组合物或其药学衍生物。
在一些方面，本发明提供用于治疗下列疾病的方法：糖尿病相关病况、肥胖、血脂异常、高血压、肝脂肪变性或心血管疾病；或控制或减轻体重量；或控制血糖控制；或增加胰岛素分泌、或非酯化游离脂肪酸、HDL或降脂蛋白的量；或降低血糖、胰高血糖素、三酸甘油酯、果糖胺、低密度胆固醇、或C-反应蛋白的量；其包含给予对象治疗上有效量的本发明化合物或药物组合物。
在一些方面，本发明提供本发明组合物或药物组合物于制备用于治疗下列疾病的药物的用途：糖尿病相关病况、肥胖、血脂异常、高血压、肝脂肪变性、或心血管疾病；或控制或减轻体重量；或控制血糖控制；或增加胰岛素分泌、HDL、或非酯化游离脂肪酸的量或降脂蛋白；或降低血糖、胰高血糖素、三酸甘油酯、果糖胺、低密度胆固醇、或C-反应蛋白的量。
本文所使用的术语“治疗有效剂量”意指研究人员、医生或其它临床医疗人员寻求的可在组织系统、动物或人体中引发生物或药物反应(其包括减轻正在接受治疗的疾病或障碍的症状)的本发明化合物、组合物或药物组合物的量。
施用方法和剂量
本发明组合物的施用途径可能包括肠胃道外输送，包括肌肉内、SC或髓内注射，以及鞘内、直接室内、静脉内及腹腔内输送。在一些实施方案中，施用经由静脉内途径。本发明组合物可经由直接注射配制剂或经由输液基质(诸如生理盐水、D5W、乳酸林格氏液或其它常用的输液介质)输注本发明组合物的配制剂的混合物而通过任何肠胃道外途径施用。
于治疗患有糖尿病或与糖尿病相关的病况(在一些方面为一或多种下列病况：糖尿病、肥胖、血脂异常、高血压、肝脂肪变性、心血管疾病、高血糖、低胰岛素量或本文所讨论的任何病况、或与本文所讨论的症状相关的病况)的哺乳类动物(包括人类)时给予治疗上有效量的本发明的组合物或药学上可接受的衍生物。例如：本发明的组合物可以约0.1毫克/公斤体重至约15毫克/公斤体重的每日IV输液形式施用。因此，一些实施方案提供了约0.5毫克/公斤体重的剂量。其它实施方案提供约0.75毫克/公斤体重的剂量。其它实施方案提供约1.0毫克/公斤体重的剂量。其它实施方案提供约2.5毫克/公斤体重的剂量。其它实施方案提供约5毫克/公斤体重的剂量。其它实施方案提供约10.0毫克/公斤体重的剂量。其它实施方案提供约15.0毫克/公斤体重的剂量。本发明的组合物或药学上可接受的衍生物的剂量应以约每天一次至每周2次，或者约每周一次至每月一次的间隔施用。在一些实施方案中施用的剂量为使根据本发明的本发明组合物或其药学上可接受的衍生物的峰值血浆浓度达到约0.002毫克/毫升至30毫克/毫升。此可经由无菌注射在适当的配制剂中的施用成分的溶液来达成(可使用化学领域中的本领域技术人员已知的任何合适配制剂溶液)。理想的血液浓度可经由连续输注根据本发明的本发明组合物来维持(此可经由经验证的分析方法测量血浆量来确定)。
一种用于将本发明的组合物给予对象的方法包含给予对象FGF21-接头缀合物并允许其在体内与适当抗体的结合位点形成共价化合物。在体内形成的本发明组合物的抗体部分可在施用FGF21-接头缀合物之前、同时或之后给予对象。或者，或另外，抗体可在以适当的免疫原接种后存在于对象的循环中。例如，可经由以底物的反应性中间体(其与载体蛋白缀合)进行免疫接种来产生催化性抗体。尤其是，醛缩酶催化性抗体可经由施用与二酮部分连接的鲎血蓝蛋白来产生。
因此，所述组合物可随着时间的推移以单一剂量、两个或更多个剂量(其可能或可能不包含相同量的所需分子)的形式施用，或经由植入装置或导管连续输注。适当剂量的进一步修饰为本领域技术人员的常规工作且是在其定期执行的任务范围内。适当的剂量可通过使用合适的剂量-反应数据确定。
所述药物组合物的施用途径与已知的方法相同，例如：口服、通过SC、IV、腹腔内、脑内(脑实质内)、脑室内，肌肉内、眼内、动脉内、门静脉内或病灶内途径注射；经由持续释放系统；或经由植入设备。当需要时，可经由一次大量注射(bolus injection)或持续输注，或经由植入设备来施用所述组合物。
或者，或另外，可经由植入膜、海绵或其它已吸收或封装所需分子的适当材料来局部施用所述组合物。当使用植入装置时，可将所述装置植入任何合适的组织或器官，所述所需分子可经由输液、定时释出的一次大量施用或连续施用来输送。
组合疗法
在本发明的另一方面中，本发明的组合物可与其它用于治疗糖尿病或与糖尿病相关的病况、或增加胰岛素分泌、或降低血糖量、或用于治疗本文所讨论的任何病况的治疗剂组合。在一个实施方案中，可将本发明的组合物与胰岛素(诸如，例如合成的人胰岛素，包括速效、短效、中速或长效胰岛素)组合施用。在其它实施方案中，可将本发明的组合物与属于α-葡萄糖苷酶抑制剂、磺酰脲、格列萘(meglitinide)、双胍类或噻唑啶二酮(TZD)族的化合物组合施用。亦可将本发明的组合物与下列者组合施用：代谢标记蛋白质或肽类，诸如葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖激酶标记蛋白(GKRP)、解耦合蛋白2及3(UCP2及UCP3)、胰高血糖素、胰高血糖素样肽1及2(Glp1及Glp2)、唾液素(exendin)(诸如唾液素-4)、抑胃肽(GIP)、Glp2过氧化酶体增殖激活受体α(PPARα)、瘦素受体(OB-Rb)、DPP-IV抑制剂、磺酰脲或其它肠促胰岛素肽类。本领域技术人员会知道多种目前用于治疗糖尿病或与糖尿病相关的病况的作用剂。
为了评估本发明组合物或其药学上可接受的衍生物与其它用于治疗下列病况的治疗药物组合时的潜在疗效，可使用本领域已知的方法测试这些组合：糖尿病或与糖尿病相关的病况、增加胰岛素分泌、或降低血糖量。例如，可使用体外经葡萄糖刺激的胰岛素分泌分析来测量本发明组合物与另一治疗剂的组合于增加胰岛素分泌的能力。于这类分析中以不同浓度的葡萄糖治疗胰脏β细胞一段设定的时间并使用本领域已知的方法(诸如放射免疫法)测量胰岛素量。亦可在体内测量本发明组合物与其它治疗剂对胰岛素分泌的影响，这是经由直接给予对象作用剂并在不同时点测量体液样本中的胰岛素量来进行。用于给予对象已知的治疗剂以用于组合疗法中的方法为临床医疗服务提供者所周知。
欲施用的本发明组合物的有效剂量可通过本领域所周知的用于测定诸如生物半衰期、生体可用率及毒性的这类参数的程序确定。欲与本发明组合物或其药学上可接受的衍生物组合使用的治疗剂的有效量是根据本领域技术人员所知的建议剂量。在测试这些给药量与本发明组合物或其药学上可接受的衍生物组合时的有效性后，这些建议或已知的量优选为所引用的给药量再降低10％至50％。需注意，主治医生将知道如何及何时将因为毒性、骨髓、肝或肾功能障碍、或不良的药物-药物相互作用而治疗终止、中断或调整疗法以降低给药量。若临床反应不适(排除毒性)，则主治医生亦将知道调整治疗剂至较高量。
治疗有效剂量是指足以改善症状或延长患者生存的化合物量。本发明组合物在体外的有效浓度可经由测量EC50测定。这类作用剂在体内的毒性和疗效可经由在细胞培养或实验动物中的标准制药程序测定，如：用于测定LD50(使50％族群致命的剂量)及ED50(对50％族群为治疗有效剂量)。介于毒性及治疗效果之间的剂量比为治疗指数且可以LD50/ED50比表示。显示出大治疗指数的化合物为优选者。从这些细胞培养分析及动物研究取得的数据可用于配制用于人类的剂量范围。这类化合物的给药量宜在一循环浓度的范围内，包括具有很少或不具毒性的ED50。所述给药量可根据所使用的剂型及施用途径而在此范围内变化。对任何化合物而言，所述治疗有效剂量可从细胞培养分析进行初步估计。剂量可在动物模式中配制以取得包括IC50(即，在细胞培养中测得的与未经治疗的对照组相比较时，可达到半最大抑制受感染细胞制造RT的测试化合物浓度)的循环血浆浓度范围。这类资讯可用于更准确地测定人体中的有用剂量。血浆中的量可，例如经由高效液相色层分析(HPLC)测得。
在那些其中将本发明组合物与与其它治疗剂组合施用的实施方案中，可经由Chou和Talalay(T.C.Chou and P.Talalay,Adv.Enzyme Regul.22:27-55(1984))的多种药物分析法，采用下列公式计算所述作用剂的组合效果：
CI = D 1 ( Dx ) 1 + D 2 ( Dx ) 2 + α D 1 D 2 ( Dx ) 1 ( Dx ) 2
其中CI为组合指数，(Dx)1为产生x百分比效果所需单独的药物1的剂量，D1为与D2组合时产生相同的x百分比效果所需药物1的剂量。(Dx)1及(D)2的数值类似地从药物2推衍出。α值使用中位数效果公式从剂量效应曲线图测定：
fa fu = ( D Dm ) m
其中fa为受剂量D影响的分数，fu为未受影响的分数，Dm为50％效果所需的剂量且m为剂量效应曲线的斜率。对于相互排斥的药物(即，类似的作用模式)方面，两种单独的药物及其混合物在中位数效果图中为平行线。互相不排斥的药物(即，作用模式独立)在中位数效果图中将为平行线，但混合物中将产生凹面向上曲线。若所述作用剂互相排斥，则α为0，若所述作用剂互相不排斥，则α为1。所取得的假设互相不排斥的数值将总是略高于相互排斥的药物。CI值<1表示协同效应，数值>1表示拮抗效应，数值等于1表示加成效应。组合的药物效果也可使用来自Biosoft的CalcuSyn软件包(英国剑桥)计算。
根据本发明的化合物可为溶剂化的，尤其是水合的。水合作用可在制造化合物或包含所述化合物的组合物时发生，或者，水合作用可因为所述化合物的吸湿性质而随时间发生。本发明的化合物可为经冻干的。
本发明亦提供本发明化合物的立体异构物、互变异构物、溶剂化物、前药及其药学上可接受的盐。本发明亦提供根据本文所揭露的任何序列的化合物。
序列
Figure BDA00003461989900281
Figure BDA00003461989900291
SEQ ID NO：1显示出181-残基表达蛋白质，其中H1为任意的且残基146可为L或P。经测试的用于缀合的残基位置下方划线且为黑体。全部使用用于SEQ ID NO：1的编号。
还显示一种人源化38C2IgG1实施方案的轻链及重链的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO：25及26)。可变区(VC及VH)下方划线且互补决定区(CDR)为黑体。赖氨酸99(其侧链与本文所描述的接头共价结合)邻接HC CDR3。
附图简述
图1：m38c2、h38c2及人类种系的可变区的氨基酸序列比对。框架区(FR)及CDR根据Kabat等人的定义。星号标记区分m38c2与h38c2或h38c2与人类种系之间的差异。
图2A、2B和2C：以与接头-1(L-1)缀合的Ab-FGF21△H-Al29C所进行的单剂量小鼠药物动力学研究与以L-2、L-3或L-4所进行的研究的比较。经由IV或SC给予年轻成年雄性Swiss-Webster小鼠3毫克/公斤的剂量。在所有案例中，在半衰期(L-1缀合物的SC及IV半衰期～33小时，L-2、L-3或L-4缀合物的SC半衰期为13-23小时，IV半衰期为22-37小时)和／或SC生体可利用率方面(L-1缀合物为～100%，L-2、L-3或L-4缀合物为约48-53％)，具L-1的缀合物有较佳的性能。
图3A：以与L-1缀合的Ab-FGF21ΔH-Al29C所进行的单剂量大鼠药物动力学研究与以L-2所进行的研究的比较。经由IV或SC给予成年雄性Sprague Dawley大鼠3毫克/公斤的剂量。在两种施用途径中，在半衰期(L-1缀合物的SC半衰期为～39小时且IV半衰期为～60小时，L-2缀合物的SC半衰期为～33小时且IV半衰期为～52小时)及SC生体可利用率方面(L-1缀合物为～52%，L-2缀合物为36％)具L-1的缀合物相较于L2有较佳的性能。图3B：Ab-L1-FGF21ΔH-D79C、Ab-L7-FGF21△H-D79C及Ab-L8-FGF21△H-D79C的PK的比较。
图4A及4B：在给予单一SC剂量的ob/ob小鼠中进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)期间的葡萄糖曲线下面积(AUC)(平均葡萄糖AUC(％载剂对照组)在中括号中)：载剂[100]、FGF21△H(1毫克/公斤[74])、FGF21△H(0.6毫克/公斤[103])(为了清楚起见未显示于第4B图)、Ab-FGF21△H-H125C(3毫克/公斤[66]及1毫克/公斤[87])(与L1缀合)、Ab-FGF21△H-K59(3毫克/公斤[105])(与L5缀合)、Ab-FGF21△H-Knull-H1K(3毫克/公斤[100])(与L5缀合)、精瘦对照组[56]。经由单向ANOVA分析，相对于PBS，*P<0.05，**P<0.01。
图5A和5B：在给予单一SC剂量的ob/ob小鼠中进行OGTT期间的累积体重(A)及肝脏重量(B)变化(平均体重(克)在中括号中，平均肝脏重量(克)在大括号中)：载剂[2.6]{2.4}、FGF21ΔH(1毫克/公斤[2.5]{2.2})、FGF21△H(0.6毫克/公斤[3.2]{2.4})、Ab-FGF21△H-Al29C(3毫克/公斤[1.7]{2.0})(与L1缀合)、Ab-FGF21ΔH-K59(3毫克/公斤[2.7]{2.4})(与L5缀合)、Ab-FGF21△H-Knull-H1K(3毫克/公斤[2.6]{2.4})(与L5缀合)、精瘦对照组[0.6]{1.0}。经由双向ANOVA(A)及单向ANOVA(B)分析，相对于PBS，*P<0.05，**P<0.01。
图6A：在给予单一剂量的ob/ob小鼠中累积体重变化(平均体重(克)在中括号中)：载剂[1.7]、FGF21△H[1.9]、FGF21ΔH-D79C(2毫克/公斤[2.1])、Ab-FGF21△H-D79C(10毫克/公斤[1.4])、Ab-FGF21△H-H125C(10毫克/公斤[0.8])及Ab-FGF21△H-Al29C(10毫克/公斤[0.9])、精瘦载剂[0.6]。d0：第0天。所有Ab缀合物均使用L1。经由双向ANOVA分析，相对于PBS，**P<0.01。
图6B：在给予单一剂量的ob/ob小鼠中进行OGTT期间的葡萄糖AUC(平均葡萄糖AUC％在中括号中)：载剂[100]，FGF21△H[63]，Ab-FGF21△H-D79C(2毫克/公斤[86])，FGF21△H-D79C(10毫克/毫升[54])，Ab-FGF21△H-H125C(10毫克/毫升[51])及Ab-FGF21△H-Al29C(10毫克/公斤[54])，精瘦对照组[48]。所有Ab缀合物均使用L1。经由单向ANOVA分析，相对于载剂，**P<0.01。
图6C：在给予FGF21△H及Ab-FGF21△H-D79C剂量(10毫克/公斤)的ob/ob小鼠中进行OGTT期间的葡萄糖AUC。Ab-FGF21△H-D79C是与接头-1缀合。相对于载剂，**P<0.01。
图6D：在第6天施用FGF21△H及Ab-FGF21△H-D79C剂量(10毫克/公斤)的ob/ob小鼠中于进行OGTT期间的葡萄糖AUC。Ab-FGF21△H-D79C与接头-1缀合。相对于ob/ob-PBS，**P<0.01。
图6E：在第0、1、2或3天施用单一Ab-FGF21△H-Al29C剂量(3毫克/公斤)的ob/ob小鼠中于d6进行OGTT期间的葡萄糖AUC。Ab-FGF21△H-Al29C与L1缀合。经由单向ANOVA分析，相对于PBS，*P<0.05，***P<0.001。
图6F：单一剂量的Ab-FGF21△H-Al29C(10毫克/公斤)增加ob/ob小鼠的白色脂肪组织中的Ucpl表达。Ab-FGF21△H-Al29C与L1缀合。
图6G：单一剂量的Ab-FGF21△H-Al29C(10毫克/公斤)降低ob/ob小鼠中的肝脏三酸甘油酯。Ab-FGF21△H-Al29C与L1缀合。经由单向ANOVA分析，相对于载剂，*P<0.05，***P<0.001。
图6H：在第0、1、2或3天施用单一剂量的Ab-FGF21△H-Al29C(10毫克/公斤)的ob/ob小鼠中的累积体重变化。Ab-FGF21△H-Al29C与L1缀合。
图7A：重复施用Ab-FGF21△H-Al29C的剂量(第0及7天，10毫克/公斤)提高DIO小鼠中的葡萄糖耐量。OGTT在第10天进行。Ab-FGF21△H-Al29C与L1缀合。经由单向ANOVA分析，相对于载剂，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图7B：在第0及7天施用二个Ab-FGF21△H-Al29C(10毫克/公斤)剂量的DIO小鼠中的累积体重变化。Ab-FGF21△H-Al29C与L1缀合。经由双向ANOVA分析，相对于载剂，*P<0.05。
图7C：重复施用Ab-FGF21ΔH-Al29C剂量(10毫克/公斤)增加DIO小鼠的白色脂肪组织中的Ucpl表达。经由单向ANOVA分析，相对于载剂，**P<0.01。
图7D：Ab-FGF21△H-Al29C降低DIO小鼠中的血清三酸甘油酯(10毫克/公斤)。
图7E：Ab-FGF21△H-Al29C降低DIO小鼠中的血清非酯化脂肪酸(10毫克/公斤)。第7F图.Ab-FGF21△H-Al29C肝重量。Ab-FGF21△H-Al29C与L1缀合。经由单向ANOVA分析，相对于载剂(A、B)、相对于PBS(C)，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图7G、7H、7i：Ab-FGF21△H-Al29C对ob/ob小鼠中肝脏基因表达的影响。(7G)SCD1：硬脂酰-Co A脱氢酶1，(7H)MOGAT2：单酰基甘油酰基转移酶2(7i)FoxA2：叉头转录因子A2。Ab-FGF21△H-Al29C与L1缀合。经由单向ANOVA分析，相对于载剂，**P<0.01。
图7J、7K：给予ob/ob小鼠10毫克/公斤的Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C剂量(7J)及3毫克/公斤的Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C剂量(7K)后的剂量相关血清量。
图8A：在高胰岛素正常血糖钳夹全部期间的血糖量。图8B：在高胰岛素正常血糖钳夹全部期间的葡萄糖输注速率。图8C：在基础(basal)及钳夹条件下的肝葡萄糖生成(***=P<0.0001)。
图9A-E及9H-9P：数值代表Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C，1.5毫克/公斤及FGF21ΔH(对照组蛋白质)(n=5)、Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C，0.15毫克/公斤及载剂组(n=6)的平均值±SEM。在以Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C治疗的组别中，计算在各个时点相对于载剂的显著性。显著性值为a=p<0.05，b=p<0.01，c=p<0.005且d=p<0.001。Y轴显示从基期开始的变化。
图9A：Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C对体重的影响。
图9B：Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C对空腹血糖的影响。
图9C：Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C对空腹血浆胰岛素的影响。
图9D：Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C对空腹血浆果糖胺的影响。
图9E：Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C对空腹血浆胰高血糖素的影响。
图9F：Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C对静脉内葡萄糖耐量试验(IVGTT)ΔAUC葡萄糖的影响。数值代表平均ΔAUC±SEM。以Dunnetts事后检验，经由单向方差分析(ANOVA)评估以Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C0.15毫克/公斤及1.5毫克/公斤治疗的组别相对于载剂的统计显著性。以Dunnetts事后检验，经由重复测量ANOVA来评估FGF21ΔH对照蛋白质组中经过的IVGTT时点处相对于基期的统计学显著性。
图9G：Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C对IVGTTΔAUC胰岛素的影响。数值代表平均ΔAUC±SEM。以Dunnetts事后检验，经由单向方差分析(ANOVA)评估以Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C0.15毫克/公斤及1.5毫克/公斤治疗的组别相对于载剂统计显著性。以Dunnetts事后检验，经由重复测量ANOVA来评估FGF21△H对照蛋白质组中经过的IVGTT时点处相对于基期的统计学显著性。
图9H：Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C对空腹血浆总胆固醇的影响。
图9i：Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C对空腹血浆三酸甘油酯的影响。
图9J：Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C对空腹血浆游离脂肪酸的影响。
图9K：Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C对空腹血浆低密度脂蛋白胆固醇的影响。
图9L：Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C对空腹血浆总酮体的影响。
图9M：Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C对空腹血浆脂联素(adiponectin)的影响。
图9N：Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C对空腹血浆C-反应蛋白的影响。
图9o：Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C对空腹血浆瘦素的影响。
图9P：Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C对空腹血浆降脂蛋白的影响。
实施例
经由下列实施例说明本发明的多功能性，这些实施例说明本发明的典型实施方案，而非以任何方式限制所主张的专利范围或说明书内容。
实施例1鉴定FGF-21上的最佳系链部位
进行研究以鉴定经由接头将FGF21与催化性抗体结合位点缀合的最佳部位。虑及了两种缀合策略：通过表面赖氨酸侧链缀合，及通过表面半胱氨酸侧链缀合。一般而言，球蛋白在其表面上不具有未配对的半胱氨酸残基，因此，在蛋白质表面中纳入单一半胱氨酸可用于建造用于特定缀合的单一位点。然而，具半胱氨酸的表面残基的突变往往造成诸如分子间二聚体化、天然二硫键配对错误及干扰受体结合的问题。由于这些原因，蛋白质缀合最常见的是通过赖氨酸残基而受到影响。
FGF21受体及其活化机制的同源模拟
FGF21结合FGFR1c及FGFR4二者，但所述受体复合物仅能通过FGFR1c激活。虽然FGFR1b与FGFR1c具有87％同一性(FGFR1b与FGFR1c相一致，除了Ⅲb/c选择式剪接区之外)，FGF21仅特异识别FGFR1c。本文中，FGF21-FGFR1c复合结构的同源模拟是使用FGFR2-FGFR1c晶体结构作为模板来进行。使用MOE软件进行同源模拟及结构分析。受体激活需要另一细胞表面受体，β-Klotho。Β-Klotho具有两个与人类细胞质β-葡萄糖苷酶非常相似(～35％相同)的结构域。人类β-Klotho结构使用人类细胞质β-葡萄糖苷酶作为模型，且所述FGF21-FGFR1c的模拟结构中的结构比对一致。此模拟的复合物结构提供最佳赖氨酸缀合位点及纳入FGF21的最佳半胱氨酸残基(其不应干扰FGF21与FGFR1c之间及FGF21与β-Klotho之间的结合界面)的合理准则。
使用下列标准来选择缀合位点：(1)结构中的残基应尽可能接触溶剂；(2)残基应远离二硫键；(3)残基应远离受体及β-Klotho结合表面。
与溶剂的接触可根据可接触的表面积(ASA)评估。使用CCP4软件(TheCCP4Suite:Programs for Protein Crystallography".(1994)Acta Cryst.D50,760-763)及内部自用程序(in-house program)从FGF21的模拟结构计算ASA。简言之，CCP4中的程序在其日志档案中计算每一残基的平方埃值。为了计算ASA(fASA)部分(fraction of ASA)，使用内部自用程序将每一残基的ASA标准化。表1显示残基的ASA及fASA。其侧链中经预测受到遮蔽的残基的表面不包括在内。第1栏为氨基酸名称，第2栏为残基数，第3栏为ASA(为平方埃)，第4栏为暴露部分。fASA值界定溶剂对指定多肽中的氨基酸残基的可接近性。接近零的fASA值指出预测所述残基无法接近溶剂，暗示接头较无法接近而与其缀合。使用绝对最低fASA值，0.3，表面积值>1.00暗示此为特别可能的候选缀合位点。
根据ASA分析，K122(表面积为164.4)及K59(表面积为117.2)被认为是最有希望的缀合的候选位点。为了比较，也在K69(表面积为91)及K56(表面积为73)进行缀合。
Figure BDA00003461989900341
Figure BDA00003461989900351
表1FGF21的表面残基的比较
实施例2产生FGF21蛋白质及突变体
从ATCC购买FGF21cDNA。使用pcDNA3.1
Figure BDA00003461989900352
及pET21b(EMD)分别建构哺乳动物及细菌表达载体。在FGF21突变变种方面，使用
Figure BDA00003461989900353
定向诱变试剂盒
Figure BDA00003461989900354
将突变引入表达载体中。经由DNA定序验证所需的突变的存在。
在哺乳动物表达方面，使用293转染(fectin)试剂
Figure BDA00003461989900355
以FGF21的哺乳动物表达载体转染HEK293F细胞
Figure BDA00003461989900356
并使其生长在不含血清的培养基上。将经调整的无菌过滤培养基对缓冲液A(20mM Tris-HCl，pH7.5)进行透析，并装载至以缓冲液A预先平衡的HiTrap Q柱(GE
Figure BDA00003461989900357
上。以从缓冲液A至缓冲液B(20mM Tris-HCl，pH7.5及100mMNaCl)的线性梯度洗涤FGF21蛋白质。将汇集的分液浓缩，并与磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)装载至Sephadex300上。将由此产生的蛋白质溶液浓缩并储存在低于-80℃。经由SDS-PAGE及RP-HPLC确认纯度。
为了从大肠杆菌生成FGF21△H，将细菌表达载体转化入宿主株BL21-(DE3)-RIL中。使转化的细胞在37℃下生长在1升LB培养基上，经由加入1mM异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷来起始表达。4小时后，收成细胞并将其冷冻在-20℃中。将冷冻的细胞糊悬浮在裂解缓冲液(50mM Tris，10mM EDTA，pH7.5)中，并通过微射流机4次。在17,000X g，4℃下离心30分钟后，将含有沉淀小丸的包涵体(IB)再悬浮于50mM Tris，pH7.5中。将经清洗的IB浆离心(30分钟，17,000X g，4℃)。将IB沉淀小丸储存在-80℃。以7M尿素、5mM DTT及50mM双三羟基甲氨基丙烷(bis-tris propane)，pH10.5溶解冷冻的IB沉淀小丸，浓度为1至10毫克/毫升FGF21，并搅拌1小时以溶解并减少蛋白质。然后，将溶解的IB在50mM双三羟基甲氨基丙烷(pH值8.0)中稀释10倍。最终蛋白质浓度为0.1至1毫克/毫升。将溶液搅拌～2天并对4升的20mM Tris-HCl，pH7.5进行透析。将蛋白质溶液在14000X g离心30分钟。将上清液装载至HiTrap QHP
Figure BDA00003461989900361
上，以缓冲液A平衡的(见上文)。以缓冲液A清洗未结合的细菌蛋白，并以缓冲液B的线性梯度洗涤FGF21蛋白质。然后，将FGF21分液装载到预先以PBS缓冲液平衡的HiTrap螯合HP柱(GE
Figure BDA00003461989900362
上。以从PBS至PBS缓冲液加100mM咪唑(pH值调整为7.4)的线性梯度洗涤FGF21蛋白质。收集分液并浓缩的(可高达50毫克/毫升)，将蛋白质溶液施放在以PBSpH7.4)平衡的尺寸排阻柱(Hiload26/60，superdex300)上。经由0.22微米过滤器将纯化的蛋白质消毒，并保存于-80℃。来自8升培养基的FGF21ΔH的典型产量为600～700毫克。典型纯度为>95％。典型的内毒素量为～1EU/毫克。以类似于FGF21ΔH的方式制造并纯化FGF21的半胱氨酸及赖氨酸-至-精氨酸突变种。纯化蛋白质的典型产量为350～400毫克。使用Ellman试剂确认游离半胱氨酸。
实施例3接头1的合成方法
Figure BDA00003461989900364
接头1的合成方法：在氮气存在下于约35℃将一整份钯碳(例如约1.0克，约0.47毫摩尔)加入在甲醇(例如约200毫升)中的13A(例如约5克，约20.1毫摩尔)的悬浮液中，再将盐酸(例如约2.5毫升，约30.2毫摩尔)一滴滴地加入其中。将氢气缓慢地吹入约35℃的溶液中并将所述溶液在此温度下搅拌约2小时。将固体通过硅藻土垫过滤并收集。将滤液在降低的压力下浓缩并将固体在真空中干燥以产生为盐酸盐形式的13B。将化合物13B与二氯甲烷(例如约200毫升)及饱和碳酸氢钠溶液(例如约250毫升)混合，并将二氯甲烷层分开。以饱和氯化钠(例如约250毫升)清洗二氯甲烷层，并将其以硫酸钠干燥。过滤有机层，将其在降低的压力下浓缩并使用快速层析法(SiO2，约60％的在己烷中的醋酸乙酯)纯化的以产生约68％产量(例如约2.94克)的13C。将约0℃的在二氯甲烷(例如约200毫升)中的13C(例如约4.65克，约21.3毫摩耳)、13D(例如约7.00克，约21.3毫摩尔)和N-(3-二甲基胺丙基)-N'-乙基碳二酰亚胺盐酸盐(例如约3.3克，约21.3毫摩尔)，以及N,N-二异丙基乙胺(例如约2.75克，约21.3毫摩尔)的溶液在氮气下搅拌5分钟，并在室温下搅拌约4小时。以稀释的碳酸氢钠溶液及饱和氯化钠溶液清洗有机层，在真空下浓缩之，并使用快速层析法(SiO2，乙腈)纯化的以产生接头1(例如约8.25克，产量约73％)。
实施例4接头2的合成方法
Figure BDA00003461989900371
将在DMF(例如约10毫升)中的柠檬酸酐，14(例如约2.0毫克，约16.7毫摩尔)、β-丙氨酸，17(例如约1.5克，约16.7毫摩尔)的溶液在室温下搅拌约5小时。然后，将反应液冷却至约0℃并加入包含二异丙基碳二酰亚胺(例如约2.6毫升，约16.7毫摩尔)的HOBT(例如约1.9克，约16.7毫摩尔)的DMF(例如约10毫升)溶液。加入二异丙基乙胺(例如约5当量，约83.5毫摩尔)并将所述反应混合物暖至室温，再搅拌约16小时。将反应物倒入水中，以1N HCl酸化，再以醋酸乙酯(例如约3x约30毫升)萃取。以水(例如约2×约30毫升)及盐水(例如约30毫升)清洗有机层，然后以硫酸钠干燥。在真空下去除溶剂，并经由柱色层分析法纯化所述粗混合物。汇集所需的分液，并在降低的压力下浓缩的以产生17A。
在室温下，将化合物17A(例如约0.5克，约2.09毫摩尔)在二氯甲烷中的约15％三氟醋酸中搅拌约2小时，并在降低的压力下浓缩至干燥。将游离酸18加入在四氢呋喃(例如约20毫升)中的N-羟基琥珀酰亚胺(例如约0.25g，约2.09毫摩尔)，再加入二异丙基碳二酰亚胺(例如约0.33毫升，约2.09毫摩尔)，并在室温下搅拌约4小时。将二异丙基脲过滤掉。将滤液蒸发至干燥。将石油醚(例如约30毫升)加入残质中，研磨、摇动后，轻轻倒出石油醚层。再以石油醚重复一次此程序并将产物18在真空中干燥。
将胺-peg2-t-丁酯，19(例如约0.5克，2.09毫摩尔)加入活化的18的THF溶液中，再加入过量的DIPEA(例如约3当量)。将溶液在室温下搅拌至少1小时，并经由HPLC-MS纯化，收集343及399的质量。汇集包含所需产物的分液并冻干的以收集20。将残质溶解在二氯甲烷中的约15％三氟醋酸及数滴水中，并在室温下搅拌约2小时。将反应物浓缩至约1毫升并以水处理的使产物沉淀。使用HPLC-MS将所述粗物质纯化以产生21(M+343)。
将在DMF(例如约2毫升)中的酸21(例如约60毫克，约0.18毫摩尔)、HBTU(例如约137毫克，约0.36毫摩尔)及苯胺盐酸盐22(例如约45毫克，约0.18毫摩尔)、二异丙基乙胺(例如约0.14毫升，约0.90毫摩尔)的溶液在室温下搅拌约30分钟并在HPLC-MS上纯化。汇集所需的分液并浓缩的以收集L2(例如约16毫克，约0.03毫摩尔)。
实施例5接头3的合成方法
Figure BDA00003461989900391
将在DMF(例如约10毫升)中的柠檬酸酐，14(例如约0.5克，约16.4毫摩尔)、胺-peg2-t-丁酯23(例如约1.0克，约4.2毫摩尔)的溶液在室温下搅拌约2小时。加入二异丙基碳二酰亚胺(例如约0.8毫升，约5.2毫摩尔)及HOBT(例如约0.7克，约6.1毫摩尔)并将反应物在约80℃加热约2小时。令反应物冷却至室温过夜，过滤出尿素。将滤液倒入水中并以DCM萃取。以盐水清洗有机层并浓缩成油。将所述粗产物溶解在乙腈中的约50％6NHCl中以将所述酸去保护。将所述产物溶解在DMF中，过滤并使用HPLC-MS纯化的以收集24(例如约208毫克，约0.7毫摩尔)。
将过量的HBTU和DIEA(例如各约超过3当量)加入在DMF中的马来酰亚胺，24(例如约0.16克，约0.6毫摩尔)及苯胺盐酸盐22(例如约150毫克，约0.6毫摩尔)的溶液。经由约2次注射在HPLC-MS上来纯化所述粗制物质。汇集包含所述最纯物质的所需分液并冻干，以收集L3(例如约17.3毫克，约36.7毫摩尔)。
实施例6接头4的合成方法
Figure BDA00003461989900392
在氮气(N2)下，将在二甲基甲酰胺(例如约5毫升)中的柠檬酸酐(14，例如约510毫克，约4.55毫摩尔)及反式-4-氨甲基环己烷羧酸(13，例如约716毫克，约4.55毫摩尔)的溶液在室温下搅拌约6小时。将反应溶液冷却至约0℃，加入DIPEA(例如约198毫升，约11.4毫摩尔)，再加入在DMF(例如约3毫升)中的五氟苯基三氟醋酸酯(例如约1.96毫升，约11.4毫摩尔)。将反应混合物暖至室温，再在氮气下搅拌约16小时。过滤出固体，将滤液倒入约30毫升水中，以二氯甲烷(例如约2×约30毫升)萃取并将二氯甲烷层以硫酸钠干燥。在真空下除去溶剂并经由柱层析法将粗混合物纯化以产生约550毫克的五氟苯基酯中间体(15，例如约29％产量)。
将N-甲基吗啉(例如约290微升，约2.64毫摩尔)加入在四氢呋喃(THF，例如约5毫升)中的五氟苯基酯中间体(15，例如约550毫克，1.32毫摩尔)及3-[2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]丙酸t-丁酯(例如约295毫克，约1.32毫摩尔)的溶液中并在室温下搅拌约2小时。在真空下去除溶剂，将残余物质溶解于DMF中并经由制备性高效液相层析法纯化。以在二氯甲烷(例如约4毫升)中的约50％三氟醋酸处理所获得的t-丁酯中间体约30分钟。在真空下去除溶剂并经由制备性高效液相层析法纯化所述残余物质以产生约300毫克为白色固体的酸中间体16(例如约55％产量；MS：411.2(M+H+))。
将在DMF(例如约1毫升)中的上述酸中间体(16，例如约33毫克，约0.08毫摩尔)、1-[3-(4-氨基-苯基)-丙酰基]-氮杂环丁-2-酮(例如约18毫克，约0.08毫摩尔)、HOBT(例如约25毫克，约0.16毫摩尔)和HBTU(例如约61毫克，约0.16毫摩尔)，以及N-甲基吗啉(例如约44微升，约0.4毫摩尔)的溶液在室温下搅拌约2小时。经由制备性高效液相层析法纯化所述粗混合物以产生为无色油质的L4(例如约22毫克，45％产量；MS：611.4(MH+))。
实施例7接头5的合成方法
在约0℃，将二异丙基碳二酰亚胺(例如约3.11毫升，约19.86毫摩尔，约2.95当量)加入在干燥四氢呋喃(例如约500毫升)中的接头6(例如约6.63克，约20.69毫摩尔，约3.07当量)及N-羟基琥珀酰亚胺(例如约2.29克，约19.86毫摩尔，约2.95当量)的溶液中。将混合物在约0℃下搅拌约1小时，然后在室温下搅拌过夜。在真空下去除溶剂并以石油醚(例如约2×约200毫升)清洗残质，将粉末在真空下干燥约2小时，再用于接下去的步骤中。
实施例8接头6的合成方法
实施例9接头7的合成方法
将在二甲基甲酰胺(例如约25毫升)中的I(例如约438毫克，约4.47毫摩尔)和Ⅱ(例如约1.04克，约4.47毫摩尔)的溶液在氮气下搅拌约2.5小时。使用冰浴将反应物冷却至约0℃。加入1-羟基吡咯啶-2,5-二酮(例如约647毫克，约5.62毫摩尔)，及N-(3-二甲胺丙基)-N'-乙基碳二酰亚胺盐酸盐(例如约1.71克，约8.92毫摩尔)并在约室温搅拌过夜。以二氯甲烷稀释有机层，以清水洗净，在降低的压力下浓缩并使用快速层析法(SiO2，约75％的在己烷中的醋酸乙酯至约5％的在二氯甲烷中的甲醇)纯化，以产生Ⅲ(例如约767毫克)。将在二氯甲烷(例如约15毫升)及三氟醋酸(例如约1.16毫升)中的Ⅲ(例如约573毫克，约1.83毫摩尔)的溶液在约室温下搅拌约9.5小时。将所述物质在降低的压力下浓缩，在真空泵上干燥过夜以产生Ⅳ。将粗Ⅳ溶解在二氯甲烷(例如约15毫升)及二甲基甲酰胺(约2滴)中并与草酰氯(例如约465毫克，约3.66毫摩尔)一起搅拌约2小时。在减压下除去溶剂并将所述油在真空下干燥1小时。将所述油溶解在二氯甲烷(例如约15毫升)中并将其在氮气下与13B(例如约464毫克，约1.83毫摩尔)及二异丙基乙胺(例如约2.9毫升，约16.5毫摩尔)一起搅拌约30分钟。以饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液清洗有机层，在降低的压力下浓缩并使用快速层析法(SiO2，约85％的在己烷中的醋酸乙酯至约100％的醋酸乙酯)纯化以产生接头7(例如约323毫克，约39％)。
实施例10接头8的合成方法
Figure BDA00003461989900421
将在二氯甲烷中的V(例如约980毫克，1.91毫摩尔)、13C(例如约484毫克，1.91毫摩尔)、二异丙基乙胺(例如约2毫升，约11.5毫摩尔)的溶液在约室温下搅拌约6小时。另外加入约1当量的13C(例如约484毫克，约1.91毫摩尔)及约3当量的二异丙基乙胺(例如约1毫升，约5.73毫摩尔)并在约室温下搅拌过夜。以饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化钠溶液清洗反应混合物，干燥(硫酸钠)、过滤后在降低的压力下浓缩并使用快速层析法(约100％醋酸乙酯至约5％的在醋酸乙酯中的甲醇至约10％的在醋酸乙酯中的甲醇)纯化以产生接头8(例如约285毫克，约24％)。
实施例11蛋白质与接头的缀合
以1:10的摩尔比将FGF21突变蛋白与相关接头在室温下反应2小时。然后，使用PD-10柱及交换成20mM Tris-HCl，20mM NaCl，pH7.0的缓冲液将所有与接头连接的FGF21蛋白纯化。
实施例12蛋白质-接头复合物与抗体缀合
以6:1的摩尔比将所有与接头连接的FGF21蛋白与h38C2IgG1(SEQ IDNO：25及26)(20mM Tris-HCl，20mM NaCl，pH7.0)在室温下融合过夜。经由SEC纯化蛋白质-接头-抗体复合物。经由LCMS分析确认缀合效率。
实施例13蛋白质生成分析
在大肠杆菌中表达所有FGF21蛋白。在包涵体中发现经细菌表达的FGF21蛋白。将细胞裂解并移除上清液后，将沉淀小丸溶解在4℃，7M尿素、50mM双三羟基甲基甲氨基丙烷(Bis-Tris-propane)，pH10.5中。将溶解的包涵体在50mM双三羟基甲基甲氨基丙烷、10mM氧化的谷胱甘肽，pH9.0中稀释并搅拌2小时，再在4℃下对20mM Tris-HCl，pH7.5透析过夜。经由HiTrap Q柱纯化可溶部分。经由SDS-PAGE分析决定蛋白质的特点。赖氨酸突变体的表达量为10-50毫克/升。
实施例14Glutl Taqman分析
经由qPCR法使用已分化的3T3-L1脂肪细胞来测量Glutl mRNA表达。在第10-14天以化合物处理经血清饥饿过夜的分化的3T3-L1脂肪细胞6小时。从这些细胞萃取总RNA，使用Quantitect探针RT-PCR试剂盒并在Taqman探针机(Applied Biosystems
Figure BDA00003461989900431
)中运行定量即时PCR反应以测量Glutl及GAPDH mRNA表达。经由Glutl mRNA量中的倍数变化(经由来自各样本的GAPDH mRNA量正常化)测量化合物的生物活性。从分析中的剂量反应曲线取得为化合物药效测量值的EC50值。
实施例15葡萄糖摄入分析
在无血清存在时以化合物处理分化的3T3-L1脂肪细胞24小时。然后，将细胞与14C-2-脱氧葡萄糖培育1小时并在Wallac1450MicroBeta(Trilux)仪器中定量摄入细胞的葡萄糖。摄取的葡萄糖以每分钟计数(CPM)表示。从分析中的剂量反应曲线取得为化合物药效测量值的EC50值。
实施例16鼠药物动力学
经由IV或SC施用后，在小鼠中检查FGF21抗体缀合物的PK。将抗体缀合物注射入年轻的成年雄性瑞士韦伯斯特(Swiss-Webster)小鼠(20-25克)，并在给药后5分钟至120小时的时点取得血液样本。使用ELISA测定血清中的抗体缀合物浓度(所述ELISA是通过结合在96孔板上的单株抗-hFGF21抗体来捕捉抗体缀合物的FGF21部分)。通过抗-hFC单株抗体检测结合在板上的FGF21抗体缀合物，并使用在包含血清的分析缓冲液中稀释的PK剂量溶液的标准曲线测定浓度。取得SC血清浓度剖面的曲线下面积(AUC)除以IV血清浓度剖面的AUC的比例以计算SC生物可利用率。
实施例17鼠效力
在两种小鼠肥胖胰岛素抗性模型-ob/ob小鼠及由高脂肪饮食诱导的肥胖小鼠中评估FGF21抗体缀合物的效力。在这两种模型方面，将雄性小鼠(在ob/ob方面使用6-8周龄，在DIO方面使用12-14周龄，高脂肪饮食从6周龄开始)每2-4只安置在一个笼内并经由皮下注射施用FGF21抗体缀合物。每天早上测量体重。经由口服葡萄糖耐量试验评估葡萄糖耐量。简言之，在测试当天上午让小鼠禁食4-5小时。取得基线血液样本并使用可携式血糖仪测定血糖量。在基线样本之后，经由管喂施用葡萄糖，之后，在15至120分钟抽取血液样本。在基线至120分钟的时点的AUC计算糖耐量。实施例18K56Ab-L5-FGF21ΔH-K56活性
依上述产生FGF21△H-K56-K59R-K69R-K122R(SEQ ID NO：18)并纯化。在Glutl Taqman分析中发现FGF21△H-K56-K59R-K69R-K122R有效(EC50=0.9nM；n=2)。摄入的葡萄糖显示出为5.5nM。FGF21△H-K56-K59R-K69R-K122R与L5在K56结合并依描述与h38C2缀合以形成Ab-L5-FGF21ΔH-K56。在Glutl Taqman分析中Ab-L5-FGF21ΔH-K56保留效力(EC50=1.9nM；n=1)，并显示出IV半衰期为17小时，SC半衰期为13小时。生物可利用率为66％。
实施例19K59Ab-L5-FGF21ΔH-K59活性
依上述产生FGF21△H-K56R-K59-K69R-K122R(SEQ ID NO：19)并纯化。在Glutl Taqman分析中发现FGF21△H-K56R-K59-K69R-K122R有效(EC50=0.6nM；n=1)。摄入的葡萄糖为0.9nM。FGF21△H-K56R-K59-K69R-K122R与L5在K59组合并与h38C2缀合形成Ab-L5-FGF21ΔH-K59。在Glutl Taqman分析中Ab-L5-FGF21ΔH-K56保留体外效力(EC50=6.5nM；n=2)，并显示出IV半衰期为13小时。
实施例20K69Ab-L5-FGF21ΔH-K69活性
依上述产生FGF21△H-K56R-K59R-K69-K122R(SEQ ID NO：20)并纯化。在Glutl Taqman分析(EC50=1.3nM；n=1)及葡萄糖摄入分析(EC50=5.2nM)中发现FGF21△H-K56R-K59R-K69-K122R是有效的。FGF21△H-K56R-K59R-K69-K122R与L5在K69组合并与h38C2缀合以形成Ab-L5-FGF21ΔH-K69。
实施例21K122Ab-L5-FGF21ΔH-K122活性
依上述产生FGF21△H-K56-K59R-K69R-K122(SEQ ID NO：21)并纯化。在Glutl Taqman分析(EC50=2.6nM；n=2)及葡萄糖摄入分析(EC50=1.7nM)中发现FGF21△H-K56-K59R-K69R-K122是有效的。FGF21△H-K56-K59R-K69R-K122与L5在K122组合并与h38C2缀合以形成Ab-L5-FGF21ΔH-K122。Ab-L5-FGF21ΔH-K122保留体外效力(在GlutlTaqman分析中，EC50=1.6nM；n=2)，并显示出IV半衰期为16小时，SC半衰期为14小时。生物可利用率为40％。
实施例22K-null-P2Ab-L5-FGF21ΔH-Knull-P2活性
依上述产生FGF21△H-Knull-P2(SEQ ID NO：22)并纯化。在Glutl Taqman分析(EC50=1.2nM；n=2)中发现FGF21△H-Knull-P2是有效的。FGF21△H-Knull-P2与L5在P2的N'端组合并与h38C2缀合以形成Ab-L5-FGF21ΔH-Knull-P2。Ab-L5-FGF21ΔH-Knull-P2显示出体外效力降低(在Glutl Taqman分析中，EC50=16.6nM；n=1)，并显示出IV半衰期为17小时。
实施例23Knull-H1K Ab-L5-FGF21ΔH-Knull-H1K活性
依上述产生FGF21△H-Knull-H1K(SEQ ID NO：23)并纯化。在GlutlTaqman分析(EC50=6.4nM；n=2)中发现FGF21△H-Knull-H1K是有效的。FGF21△H-Knull-H1K与L5在H1K组合并与h38C2缀合以形成Ab-L5-FGF21ΔH-Knull-H1K。FGF21ΔH-Knull-H1K保留体外效力(在GlutlTaqman分析中，EC50=4.3nM；n=2)，并显示出IV半衰期为16小时，SC半衰期为11小时且SC生物可利用率为51％。
实施例24K-null-S181K Ab-L5-FGF21ΔH-Knull-S181K活性
依上述产生FGF21△H-Knull-S181K(SEQ ID NO：24)并纯化。在GlutlTaqman分析(EC50=7.5nM；n=2)中发现FGF21△H-Knull-S181K是有效的。FGF21△H-Knull-S181K与L5在S181K组合并与h38C2缀合以形成Ab-L5-FGF21ΔH-Knull-S181K。Ab-L5-FGF21ΔH-Knull-S181K显示出失去体外效力(在Glutl Taqman分析中，EC50=>500nM；n=2)。
实施例25赖氨酸突变体的活性的结果摘要
所有赖氨酸突变蛋白质在Glut1Taqman分析中均具活性。在Taqman分析中，当缀合时，大多数缀合物(K56、K59、K122、Knull-H1K)保留活性，其EC50值类似于固有FGF21蛋白。在Taqman分析中，Knull-P2缀合物显示出起始效力降低，且Knull-S181K缀合物显示出失去活性。
实施例26利用半胱氨酸马来酰亚胺缀合作用鉴定FGF21上最佳系链部位
引入半胱氨酸取代突变作为连接残基的挑战之一为所述半胱氨酸残基可能会发现自己与其它残基接触，和／或形成盐桥或氢键。虽然使用建模结构预测原子层级的距离可能很难，根据位于FGFR1c及βKlotho结合位点远端的潜力选出许多残基：His1、Thr4O、Asp79、Leu86、His125及A1a129。所有六个残基在结构组成(转弯及环)、可接近的表面积(ASA)及四周形状(凸和凹)方面均彼此不同，且全部均以与FGFR1c相互作用的蛋白质的对侧为模型(见表2)。尤其是，由于与Hisl、Asp79、Leu86及His125相关的高ASA值，这些部位被鉴定为具有潜在吸引力的缀合位点。
残基 结构 形状 %ASA ASA βKlotho部位
His1 混乱 N/A N/A
Thr40 β-股 凹 34 49.8 较不远
Asp79 β-转角 凸 71 109.8 远
Leu86 β-股 凸 60 119.4 较不远
His125 混乱 凸 85 169.4 远
Ala129 混乱 凹 68 78.8 远
表2用于半胱氨酸取代的候选残基的比较
实施例27H1C FGF21△H-H1C
制造及表达FGF21△H-H1C(SEQ ID NO：16)。然而，FGF21△H-H1C突变体缺乏N'半胱氨酸基团，因此，终止研究这种突变体。
实施例28T40C FGF21ΔH-T40C
制造FGF21△H-T40C(SEQ ID NO：15)时出现重大挑战。在位置40处的苏氨酸的半胱氨酸突变在再折叠后在RP-HPLC中造成多种FGF21△H-T40C种类。采取进一步的尝试，经由改变蛋白质的浓度及pH值，加入及不加入谷胱甘肽来改良再折叠过程。经由RP-HPLC监测再折叠过程。加入谷胱甘肽造成T40C的有效再折叠；然而，谷胱甘肽被发现连接至FGF21上(最可能通过在位置40处的引入的半胱氨酸连接)。谷胱甘肽加合物显示出与野生型FGF21ΔH相同的生物活性，表示位置40不涉及由FGF21造成的受体活化。
实施例29D79C Ab-L1-FGF21△H-D79C活性
依上述产生FGF21△H-D79C(SEQ ID NO：12)并纯化。在Glutl Taqman分析(EC50=2.1nM；n=4)中发现FGF21△H-D79C是有效的。FGF21△H-D79C与L1在D79C组合并与h38C2缀合以形成Ab-L1-FGF21ΔH-D79C。Ab-L1-FGF21ΔH-D79C保留体外效力(EC50=3.7nM，在Glutl Taqman分析中；n=3)，并显示出IV半衰期为17及19小时(n=2)，SC半衰期为20及20小时(n=2)且生物可利用率为55％及70(n=2)。
实施例30FGF21△H-D79C的稳定性分析
依上述在大肠杆菌中制造FGF21△H-D79C突变蛋白并纯化。从1升培养表达FGF21△H-D79C。取得150毫克包涵体并取得85毫克纯化的蛋白，代表60％产量。为了测试FGF21△H-D79C及FGF21△H(SEQ ID NO：2)的稳定性，将刚解冻的样本保持在4℃超过七天，并在第0、3及7天经由RP-HPLC、SEC-HPLC、埃尔曼分析及SDS-PAGE检查其完整性。结果发现FGF21△H-D79C在中性pH7.4是稳定的：即使在4℃培育7天后仅少量FGF21△H-D79C显示出被氧化及二聚体化，而超过一半的FGF21△H-D79C在较低的pH6.0下，在4℃培育3天后被氧化。PBS(pH7.4)及20mM Tris-HCl、50mM NaCl(PH7.5)对FGF21△H-D79C的稳定性的影响没有显著差异。
为何FGF21△H-D79C的游离半胱氨酸在pH7.4下较在pH6.0下更加稳定并不清楚。WT FGF21的计算出的等电点(pI)为5.43(e.e.,FGF21-H1-P146)；FGF21△H的pI为5.27；且FGF21△H-D79C的pI为5.47。FGF21△H-D79C的溶解度在pH6.0下可能降低。在数个冷冻/解冻周期下检查FGF21△H-D79C的稳定性。将蛋白重复冷冻(-80℃)及解冻(4℃)9次。在RP-HPLC、SEC及埃尔曼(Ellman)分析中，在周期1和周期9之间无一样品显示出任何差异。总之，FGF21△H-D79C显现出在4℃下比在-80℃下明显较不稳定。
实施例31L86C FGF21△H-L86C
依上述产生FGF21△H-L86C(SEQ ID NO：14)并纯化。虽然大多数疏水性残基埋藏在蛋白质核心中，一些残基暴露于可能会导致蛋白质不溶的溶剂中。Leu86为疏水性残基并在FGF21的模建结构中显现出接触溶剂。据推测，L86C突变可能提供溶解度利益。
L86C突变导致无效的再折叠及低蛋白产量。加入谷胱甘肽造成L86C有效再折叠；然而，结果发现有超过一个的谷胱甘肽连接在FGF21分子上(最有可能通过引入的C86以及天然半胱氨酸残基连接)。所述谷胱甘肽加合物显示出生物活性约降低10倍，因此终止研究FGF21△H-L86C。
实施例32H125C Ab-L1-FGF21△H-H125C活性
依上述产生FGF21△H-H125C(SEQ ID NO：7)并纯化。在Glutl Taqman分析(EC50=1.24nM；n=3)中发现FGF21△H-H125C是有效的。FGF21△H-H125C与L1组合并在H125C与h38C2缀合以形成Ab-L1-FGF21△H-H125C。当缀合时，Ab-L1-FGF21△H-H125C保留体外效力(在Glutl Taqman分析中，EC50=3.2nM；n=4)，并显示出IV半衰期为37小时，SC半衰期为32小时且SC生物可利用率为67％。
实施例33A129C Ab-L1-FGF21△H-A129C活性
依上述产生FGF21△H-A129C(SEQ ID NO：10)并纯化。在Glutl Taqman分析(EC50=1.4nM；n=6)中发现FGF21△H-A129C是有效的。FGF21△H-A129C在A129C与L1组合并与h38C2缀合以形成Ab-L1-FGF21△H-A129C。Ab-L1-FGF21△H-A129C保留体外效力(在Glutl Taqman分析中，EC50=2.7nM；n=7)，并显示出IV半衰期为33小时，SC半衰期为37小时且SC生物可利用率为69％(在小鼠中)。Ab-L1-FGF21△H-A129C在大鼠中显示出IV半衰期为60小时，SC半衰期为39小时且SC生物可利用率为52％。Ab-L1-FGF21△H-A129C在猴子中显示出IV半衰期为65小时，SC半衰期为48小时且SC生物可利用率为68％。
实施例34内毒素纯度的提升
经由大肠杆菌发酵培养来生成FGF21△H-H125C和FGF21△H-Al29C蛋白。为了降低内毒素量，在第一个Q步骤后使用额外的Q步骤，以使内毒素量从10EU/毫升降至>0.1EU/毫升。依下述修改纯化方案。自1升培养基取得约10克的IB并以40毫升的7M尿素、5mM DTT、50mM BTP(双三羟基甲基丙烷)pH10.5(1~2小时)溶解之。经由RP-HPLC监测FGF21蛋白减少。经由在400毫升的50mM BTP，pH8.0(24~36小时)中稀释将溶解的蛋白再折叠。经由RP-HPLC监测FGF21的固有二硫键的氧化反应。一旦再折叠几乎完成，将溶液对4升的20mM Tris-HCl，pH7.5透析两次。经由在20,000X g离心60分钟使未溶解的蛋白质沉淀出。将上清液装填在Hitrap Q FF上，并以0~200mM NaCl梯度(20CV，20mM Tris-HCl，0.01mM TCEP，pH7.5)洗涤FGF21蛋白。将收集的分液装填在Hitrap Ni-NTA FF上并以0~100mM咪唑梯度(10CV，0.01mM TCEP，PBS，pH7.4)有效地移除残余的DNA。将所需分液对4升的20mM Tris-HCl，0.01mM TCEP，pH7.5透析两次并装填在Hitrap Q HP柱上，以0~100mM NaCl梯度(20CV，20mM Tris-HCl，pH7.5)洗涤。收集纯化的蛋白质分液，以0.22mm过滤器消毒，并保存于-80℃。
自1升培养基取得的典型产量为约350至约400毫克。典型的纯化的蛋白质产量为约220至约280毫克。此种纯化技术产生纯度>95％的蛋白质，而典型之内毒素量为约1EU/毫克。使用发酵器取代摇瓶以改善产量约4至约5倍。
实施例35选择接头
众所周知，下列L1的马来酰亚胺环可能容易被打开，产物接着随着时间的推移而降解(Woodnutt,G;IBC Conference“BeyondAntibodies/Protein Engineering Design”,San Diego,21-23rdSeptember2009)。
如方案1所示，马来酰亚胺接头(诸如L1)可与巯基反应以形成具有马来酰亚胺部分的巯基加合物。此将巯基加至马来酰亚胺的加成反应被称为迈克尔(Michael)反应。接着，含氨基基团(诸如抗体h38C2)可依计划1中所示与AZD(β-内酰胺)反应来产生6。所产生的巯基-琥珀酰亚胺加合物是稳定的。然而，所述琥珀酰亚胺环可随着时间的推移缓慢地水解分裂，产生7和／或8。因此，具有对水解分裂作用具提高的稳定性，同时保留其发生迈克尔反应的能力的马来酰亚胺环是有吸引力的。
Figure BDA00003461989900501
实施例36马来酰亚胺修饰
因此，检查L1中的马来酰亚胺环的稳定性，预料经由修改马来酰亚胺环可产生更稳定的接头。为了减缓由水造成的马来酰亚胺环可能的水解分裂，采取三种不同的方法(L2-L4)修改所述环并提高稳定性。
Figure BDA00003461989900511
首先，设想附着于所述环的小烷基可能减缓琥珀酰亚胺环的水解分裂。制备在琥珀酰亚胺环上具有甲基的接头2。为了令环发生水解分裂，水分子加在羰基上并形成过渡态的四面体中间体。甲基的存在将会在空间上及电子上限制四面体中间体形成，并大幅减缓水解速率。
第二种修改聚焦在马来酰亚胺环的羰基附近的丙酰胺羰基上。羰基一般会吸引水。在靠近马来酰亚胺环处具有羰基有助于吸引水并促进攻击马来酰亚胺环的羰基。经由移除丙酰胺羰基可减缓水解性开环反应。此修改可在L3中见到。
第三种修改在如L4中所见到的丙酰氨基中引入环己基亚甲基。所述环己基环的大体积疏水性质会在电子及空间上干扰四面体中间体形成，所述四面体中间体经由开环水解分裂所必须的在环的羰基上加入水来形成。预料，这将减缓水解分裂。
稳定性研究
在稳定性研究方面，从接头L1-L4移除1-(3-(4-胺苯基)丙酰基)-氮杂环丁-2酮部分。制备4种测试化合物(30-33)，其中所述马来酰亚胺与谷胱甘肽(一种具三个氨基酸的肽)缀合。
实施例37化合物30的合成方法
将在二甲亚砜(5毫升)中的3-(2-(2-(3-(2,5-二合氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰氨基)-乙氧基)乙氧基)丙酸(164毫克，0.5毫摩尔)及还原的谷胱甘肽(154毫克，为0.5毫摩尔)的溶液在室温下搅拌17小时。将醋酸乙酯(25毫升)加入反应混合物中并滤出固体。以额外的25毫升醋酸乙酯清洗固体，干燥，以产生252毫克的化合物30。
Figure BDA00003461989900521
实施例38化合物31的合成方法
将在二甲亚砜(1.2毫升)中的3-(2-(2-(3-(3-甲基-2,5-二合氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)丙酰氨基)-乙氧基)乙氧基)丙酸(37毫克，0.12毫摩尔)及还原的谷胱甘肽(42毫克，0.12毫摩尔)的溶液在室温下搅拌22小时。将在乙醚中的50％醋酸乙酯(10毫升)加入反应混合物中并滤出固体。以额外的25毫升醋酸乙酯清洗固体，干燥，以产生67毫克的化合物31。
Figure BDA00003461989900522
实施例39化合物32的合成方法
将在二甲亚砜(2毫升)中的3-(2-(2-(3-甲基-2,5-二合氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)丙酸(50毫克，0.2毫摩尔)及还原的谷胱甘肽(61毫克，0.2毫摩尔)的溶液在室温下搅拌25小时。将在乙醚中的65％醋酸乙酯(30毫升)加入反应混合物中并滤出固体。以额外的25毫升醋酸乙酯清洗固体，干燥，以产生92毫克的化合物32。
实施例40化合物33的合成方法
将在二甲基亚砜(1.2毫升)中的3-(2-(2-(4–((3-甲基-2,5-二合氧基-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)甲基)环己烷羧酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸(50毫克，0.12毫摩尔)及还原的谷胱甘肽(37毫克，0.12毫摩尔)的溶液在室温下搅拌22小时。将在乙醚中的50％醋酸乙酯(10毫升)加入反应混合物中并滤出固体。以额外的25毫升醋酸乙酯清洗固体，干燥，以产生75毫克的化合物33。
Figure BDA00003461989900532
实施例41化合物30-33的稳定性研究
Figure BDA00003461989900541
在LC-MS上监测化合物30、31、32及33形成开环产物以及谷胱甘肽裂解。检查这些新类似物在40℃,pH=6.5缓冲液、40℃，pH=7.5缓冲液及4℃，pH=7.5缓冲液中于两周的期间内的稳定性(表3A-C)。
将化合物30、31、32及33溶解在室温的缓冲液中。将样本在40℃下培育并在设定的期间分析缓冲溶液。在界定的期间，将10微升的缓冲溶液注入用于分析的安捷伦(Agilent)高效液相层析和质谱仪。使用UV光谱仪在210和254nm处监测来自分析柱的洗涤液，也使用质谱仪监测。使用质谱仪监测水解副产物并根据特定质量的总离子流计算水解百分比。
从表3A-3C中的显示％水解的LC-MS数据明确得知：与L1(30)中的马来酰亚胺环相比较，经修饰的L2、L3和L4(31-33)的马来酰亚胺环在40℃，pH=6.5下的稳定性高出5-10倍，在40℃，pH=7.5缓冲液中的稳定性高出4-15倍，而在40℃，pH=7.5缓冲液中的稳定性则高达20倍。谷胱甘肽缀合的结果(包括表3A、3B及3C中的数据)的讨论见于IBC Conference“Beyond Antibodies/Protein Engineering Design”,San Diego,21-23rdSeptember2009中。
Figure BDA00003461989900551
表3A在40℃，pH值的稳定性研究（10mM His、130mMGly、130mMSuc缓冲液).
Figure BDA00003461989900552
表3B在40℃,pH值=7.5的稳定性研究(100mM His、200mMGly、200mMSuc)。
Figure BDA00003461989900553
表3C在4℃，pH值=7.5的稳定性研究（100mMHis、200mMGly、200mMSuc).
实施例42与FGF21缀合的接头L1-L4的稳定性
进行下列实验以调查所述四种接头在与FGF21缀合后于2周之内的化学稳定性：将各接头与FGF21缀合，放置在+4℃储存条件下，移出部分并在特定时点经由冷冻淬火，并经由LCMS分析监测接头的稳定性。
将所述来自冻干的贮存物质的四种接头溶解在DMSO。在以1:1的接头：蛋白质比例加入接头贮存物质前先以0.1mM TCEP将FGF21ΔH-Al29C蛋白部分还原30分钟；在缀合反应物中的FGF21ΔH-Al29C蛋白的浓度为5毫克/毫升。令L1与蛋白质反应30分钟；令L2、L3和L4反应2小时。通过尺寸排阻树脂去除过量的接头以将缀合反应淬火。将缀合的FGF21ΔH-Al29C蛋白放置在+4℃以稳定储存。在t=0(稳定储存之前)及t=第1、3、8和14天移出部分。经由LC-MS分析进行接头稳定性的分析以测定所述未缀合的蛋白质、蛋白质+接头缀合物及所述缀合的蛋白质+接头经过一次及两次水解时的相对量。
接头水解为此实验分析的关键变量。经由观察接下去在FGF21-接头复合物中加入水来监测水解。加入一个H2O，+(1)H2O，似乎表示存在于所有4种接头上的活性AZD基团的水解作用。加入第二个H2O分子，+(2)H2O，为接头中的水解作用(如化学不稳定性)的强烈指示。由于存在马来酰亚胺官能团，L1特别容易受影响。
下列表4中的实验结果证明L1的+(2)H2O增幅最大。在t=0时，L1-L4各自的+(2)H2O测量值介于6-8％的总测量蛋白质。在2周之间监测这些样本，在L1中观察到的+(2)H2O增加至18％，而其余的各接头L2-L4的数值固定在6-8％。此数据暗示与L2-L4相比较，L1相对不稳定。
Figure BDA00003461989900561
表4与FGF21缀合的L1-L4的水解分析
实施例43与L1-L4缀合的Ab-FGF21ΔH-Al29C
L2-L4先前显示出在各种条件下与谷胱甘肽(见表3A-C)及FGF21(见表4)缀合时较L1稳定。将修饰的马来酰亚胺接头L2-L4与FGF21ΔH-Al29C融合(缀合效率显示于表5中)，并在Glut1Taqman分析中显示出活性(表5)：将EC50值对FGF21ΔH的相对数值正常化。
Figure BDA00003461989900571
表5L1-L4的缀合效率
然而，不管上述内容，Ab-L2-FGF21ΔH-Al29C、Ab-L3-FGF21ΔH-Al29C、Ab-L4-FGF21ΔH-Al29C在体内各自较Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C不稳定。此可从IV给药后循环中的维持量较低，SC给药后循环中的峰值和维持量较低是显见的(图2A-C，表6)。令人惊讶的是，这些结果与那些以缓冲系统中与小肽融合的接头进行的稳定性研究的结果背道而驰。
Figure BDA00003461989900572
表6在IV及SC施用3毫克/公斤后小鼠与L1、L2、L4及L4缀合的FGF21的PK参数
在小鼠血清中的另一研究中证明这些结果。使用各个L1、L2、L3和L4将FGF21ΔH-Al29C与h38C2缀合。在冷冻前，将各个样本在小鼠血清中稀释成0.3毫克/毫升并在37℃下培育，接着再经由2DLC/MS进行分析。与参考标准相比较，5分钟后检测到149％的Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C，34小时后为66％，72小时后为81％，且在120小时后检测不到。相反地，在所有样本中均检测不到Ab-L2-FGF21ΔH-Al29C、Ab-L3-FGF21ΔH-Al29C、Ab-L4-FGF21ΔH-Al29C。
实施例44在大鼠中研究与L1&L2缀合的Ab-FGF21ΔH-Al29C
在雄性Spraque Dawley大鼠中测定两种不同变化形式的Ab-FGF21ΔH-Al29C(其差异在于所述将FGF21蛋白与抗体支架缀合的接头)的单剂量药物动力学(PK)。经由IV或SC给予大鼠Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C(马来酰亚胺接头)或Ab-L2-FGF21ΔH-Al29C(甲基马来酰亚胺接头)的剂量(3毫克/公斤)，并在给药后的5分钟至14天的期间抽取血液样本。经由ELISA法测定血清Ab-FGF21ΔH-Al29C量，其中经由特异于FGF21的单株抗体捕捉所述FGF21缀合物并经由抗人Fc检测。所得的PK数据证明与Ab-L2-FGF21ΔH-Al29C缀合物(T1/2：IV=52小时，SC=33小时；SC生物可利用率=36％)相比较，所述Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C缀合物具有较优越的PK特性(T1/2：IV=60小时，SC=38小时；SC生物可利用率=52％)(图3A及表7)。这些结果并不被预期可用于提供在缓冲系统中以这些与小肽融合的接头进行的稳定性研究的结果。
Figure BDA00003461989900581
表7在IV及SC施用的3毫克/公斤剂量后具有L和L2之FGF21结合物的大鼠PK参数（图3A)
实施例45具有L1及L2的Ab-FGF21ΔH-Al29C对Glut1RNA的影响
在第8天将3T3-L1脂肪细胞接种在24孔组织培养板
Figure BDA00003461989900583
，目录＃353047)中，并在37℃，5％CO2下，培养在DMEM完全培养基(10％FBS，2mM L-谷氨酰胺，1％P/S)中。以含有0.2％BSA，不含血清的DMEM培养基饥饿这些细胞(第12天)过夜并以在含有0.2％BSA，但不含血清的DMEM培养基中的Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C及Ab-L2-FGF21ΔH-Al29C在37℃处理6小时。吸出培养基，然后根据制造商的说明，使用RNeasy迷你试剂盒从细胞萃取RNA。使用
Figure BDA00003461989900582
Plus分光光度计在A260nm测量RNA。
化合物 Glut1RNA表达EC50(nM)
FGF21△H 3.39
FGF21△H-A129C 16.03
Ab-L1-F2H-A129C 1.72
Ab-L2FGF21△H-A129C 9.33
表8Taqman定量即時PCR
以FGF2lΔH、FGF2lΔH-A12gC、Ab-u-FGF2lΔH-A12gC及Ab-L2-FGF2lΔH-A12gC刺激3T3-u脂肪细胞而产生剂量依赖性G/UM诱导。Ab-u-FGF2lΔH-A12gC显示出较Ab-L2-FGF2lΔH-A12gC有效(表8)。
实施例46接头长度的研究
将Ab-Ll-FGF2lΔH-D7gC、Ab-L7-FGF2IΔH-D79C及Ab-L8-FGF21ΔH-D79C针对彼此进行测试以评估接头长度的容限。在以细胞为基础的实验中全部均显示出类似的PK(图3B及表9)和可相比拟的效力(数据未显示)。
表9.经IV施用3毫克/公斤后具L1、L7及L8接头的FGF21结合物的鼠PK参数(图3B)
实施例47残基位置及接头选择的摘要
采用巯基-马来酗亚胺缀合策略测试可能的缀合位点的HlC、T4OC、D7gC、L86C、H125C及A12gC。其中，HlC、T4OC及L86C显示出具有表达及再折叠的问题。由于D7gC、H125C及A12gC均显示出可接受的蛋白质生成量，对其进行进一步探索并证明未经缀合的突变蛋白仍有效力。Ab-FGF2lΔH-D7gC、Ab-FGF2lΔH-H125C及Ab-FGF2lΔH-A12gC显示出与FGF2lΔH类似的生物活性，暗示在这些位置结合抗体不会干扰受体结合。D7gC、H125C及A12gC具有与FGF2lΔH类似的稳定性及生物活性。
所有测试的赖氨酸突变抗体缀合物均显示出较H125C及A12gC抗体缀合物差的鼠PK，其IV半衰期为13-17小时(表10)。
Figure BDA00003461989900592
表10FGF21上缀合位点的概括。*给予单-3毫克/公斤之SC剂量后3天(除了D79C为10毫克/公斤，FGF21dH为1毫克/公斤Qd以外)。**蛋白质;ND:未测定
虽然Ala129并未高度暴露于溶剂中，且较D7g或H125为少，令人惊讶地，FGF2lΔH-A12gC为最稳定的突变体直一且为测试的用于抗体结合的最佳位置。这令人意想不到，因为所述突变为非保留性。虽然不欲受限于理论，在Al29C缀合的独特的适用性有几个可能的原因。首先，Ala129及His125均位于FGF21模建结构中有弹性的环区中。这些区通常为其它肝素结合FGF成员的肝素结合位点。由于FGF19、FGF21及FGF23不会与肝素相互作用，维持此区的序列保真度可能不是其生物学功能的关键。所述位置的弹性可能有益于抗体-缀合，以避免干扰受体结合。第二；A1a129被带正电的驻在者，即His125、Arg126及Arg131、及Arg135包围。由于强电荷的排斥力，此正电区可能避免FGF21△HA-l29C的SS-二聚体化。第三；这些带电的驻在者可能有利于稳定马来酰亚胺接头L1，当其不存在时可能会在马来酰亚胺开环后产生羧酸化物。因此，当采用马来酰亚胺键联策略来缀合FGF21时，在Al29的特定残基位置连接显示出特别有利。
在小鼠模型中，Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C及Ab-L1-FGF21ΔH-Hl25C均显示出至少30小时的高IV半衰期及SC半衰期以及良好的生物可利用率。此两种缀合物在Glut1Taqman分析中证明效力低于4nM。一般而言，与Ab-L1-FGF21ΔH-Hl25C相比较，Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C显示出半衰期及效力略为提升。在Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C中使用L1亦显示超越较体外试验中建议者的令人惊讶的体内优势，且与那些测试者相比较，其似乎为整体最有利的接头。
与数种替代者相比较，Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C组分(抗体、接头、连接残基位置、连接残基、蛋白质)的特定组合似乎提供最佳的半衰期、生物可利用率、效力、活性、容易生成且对水解具抗性。
实施例48化合物的效力
测试以化合物Ab-FGF21ΔH-K56及Ab-FGF21ΔH-Knull-H1K治疗的ob/ob小鼠的葡萄糖耐量。与Ab-FGF21ΔH-H125C(图4A及4B)及Ab-FGF21ΔH-Al29C(图5A及5B)相比较，两种化合物较差。相反地，Ab-FGF21ΔH-D79C及Ab-FGF21ΔH-H125C显示出改善葡萄糖耐量并减少体重增加(图4A、4B、6A、6B、6C、6D及表11)。
Figure BDA00003461989900611
表11在第6天,于ob/ob小鼠中进行OGTT其间经由SC注射10毫克/公斤的Ab-FGF21△H-D79C后,于指出的时间的葡萄糖AUC(图6C及6D)
由ob/ob小鼠中的白色脂肪组织(WAT)中的Ucpl表达增加及逆转脂肪肝证明由于能源消耗增加，Ab-FGF21ΔH-Al29C被发现可改善葡萄糖耐量并减少体重增加(图6E、6F、6G、6H及表12)。在Ucpl表达方面，将从体内效力研究中收集的冷冻内脏WAT样本均化。从组织匀浆中萃取总RNA，使用Quantitect探针RT-PCR试剂盒并在Taqman机器(Applied Biosystems)中运行定量即时PCR反应来测量Glut1和GAPDH mRNA表达。经由Glut1mRNA量(经由来自各样本的GAPDH mRNA量正常化)的倍数变化决定治疗效果。由WAT中的Ucpl表达增加暗示由于能源消耗增加，Ab-FGF21ΔH-Al29C造成体重减轻、降低DIO小鼠中的血清三酸甘油酯及脂肪酸量并减少肝脏重量(图7A、7B、7C、7D、7E及表13)。在ob/ob小鼠中亦观察到肝脏重量减轻(图7F及表14)。在ob/ob小鼠中的进一步试验证明在硬脂酰-辅酶A去饱和酶-1(SCD1)、单酰基甘油O-酰基转移酶(MOGAT2)及叉头盒(forkhead box)A2(FoxA2)中的RNA量降低(图7G、7H、7I及表15)。
Figure BDA00003461989900612
表12第6天在ob/ob小鼠中单次SC注射Ab-FGF21△H-A129C后的结果;参见图6E、6F、6G、6H。
表13第0及7天在DIO小鼠中重复SC注射10毫克/公斤的Ab-FGF21△H-A129C后第10天的结果(见图7A、7B、7C、7D、7E)
Figure BDA00003461989900622
表14在ob/ob小鼠中于指定时间单次SC注射10毫克/公斤的Ab-FGF21△H-A129C后第6天的肝脏重量(图7F)
Figure BDA00003461989900623
表15在ob/ob小鼠中于指定时间单次SC注射10毫克/公斤之Ab-FGF21△H-A129C后第6天从收集的肝脏组织样品进行的qPCR所得的mRNA表达的平均倍数变化(图7G、7H、71)。
实施例49在ob/ob模型中的Ab-Ll-FGF2lΔH-A12gC的血浆药物量
在给予10毫克/公斤及3毫克/公斤的剂量后的第3、4、5及6天检查ob/ob小鼠中的剂量相关的Ab-Ll-FGF2lΔH-A12gC血清量。观察到的Ab-Ll-FGF2l△H-A129C血清量维持良好(图7J及7K)。这些结果与健康动物中的药物动力学一致。
实施例5OAb-Ll-FGF2l△H-A129C在体内对胰岛素敏感性的影响
在有知觉、未受约束的ob/ob小鼠中进行研究，以测定在高胰岛素正常血糖钳夹技术(hyperinsulinemic euglycemic clamp)期间Ab-Ll-FGF2l△H-A129C在体内对全身胰岛素敏感性(以葡萄糖输注速率来 衡量)及肝葡萄糖生成的影响。以每周两次的频率经由SC施用10毫克/公斤剂量的Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C(在30mM醋酸盐缓冲液中，pH4.8)共一周。每次注射的给药量为2毫升/公斤。在研究的第2及5天注射Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C。在研究的第2及5天以每周两次的频率施用载剂(在30mM醋酸盐缓冲液中，pH4.8)，每次注射的给药量为2毫升/公斤。在手术前不久以2毫克/公斤SC的酮洛酚(ketprofen)及100毫克/公斤SC的氨苄青霉素治疗小鼠。根据动物第1天的空腹血糖及体重将其随机分配(n=8/组)。
在研究第1、4、7及8天记录体重。令人意外地，Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C在这项研究中并未表现出对体重的影响(数据未显示)。在第1天(4-小时空腹)及第8天(16-小时空腹)以Accu-Chek手持式血糖仪(罗氏)测定空腹血糖。Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C在这项研究中对空腹血糖的量没有影响(数据未显示)。
在研究第7天，令小鼠在第8天的钳夹程序前禁食16小时。在第8天将导管外置并为动物连接输液管。在钳夹程序开始前90分钟(-90分钟)，将6μCi的[3-3H]葡萄糖大丸药注射入颈静脉，再以0.1μCi/分钟的固定输液速度输液，直到钳夹程序结束。在-10分钟和0分钟采血以测定基础HCG。在时间0分钟时开始变量输注葡萄糖(50％葡萄糖)及固定输注胰岛素20mU/公斤/分钟。每10分钟从尾静脉测量血糖并根据每只动物的血糖量调整葡萄糖输注速率直到达到稳定的状态。在170分钟及180分钟的时点，收集血液以在钳夹条件下测定肝葡萄糖产量(HGP)。在钳夹程序期间，动物未被约束且有知觉。
采用下列公式计算肝葡萄糖产量(HGP)：
HPG=Ra-冷葡糖输注速率，其中，
Figure BDA00003461989900631
出现速率(Ra)(其如同稳定状态=消失速率(Rd))
与以载剂治疗的动物相比较，Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C不影响ob/ob小鼠的体重或空腹血糖。所有动物均成功钳夹，并在钳夹的最后30分钟达到100-110毫克/分公升的正常血糖量以及固定的葡萄糖输注速率。在以载剂及Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C治疗的组别中均达到正常血糖(100毫克/分公升-11O毫克/分公升血糖)。在整个高胰岛素正糖钳夹技术期间均测量血糖量(图8A)。在实验最后30分钟(钳夹期间)，以载剂及Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C治疗的动物之间并无统计上的差异。与载剂相比较，Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C显著增加葡萄糖输注速率(GIR)(图8B)。Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C未改变基础肝葡萄糖产量(HGP)，但在钳夹条件下(高胰岛素)显著抑制HGP(图8C)。
总之，在这项研究中，与以载剂治疗的动物相比较，Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C显著增加葡萄糖输注速率(其为全身胰岛素敏感性的测量值)并抑制肝葡萄糖产量，但不会对体重或空腹血糖量有影响。
实施例51Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C在食蟹猴中的作用
这项研究的目的评估当经由每周两次皮下注射给予肥胖胰岛素抗性(糖尿病前期)食蟹猴Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C时，其对血浆血糖及血脂指标，以及葡萄糖耐量和炎症生物标记的影响。这项研究亦经过设计以确定与每天给予FGF21ΔH剂量相比较时，Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C在猴子中的药效动力学(PD)效果的持续时间。
本研究中包含22只成年食蟹猴(Macaca fascicularis)。根据性别、体重及在给药开始前2周采集的基线血浆样本中所测得的基础血糖和血脂指数将猴子(13只雄性，11只雌性)分为四组治疗组，每组6只。将动物保持在高脂肪的饮食。先给予动物药物4周，再接着4周的洗出期。依下述给予动物剂量：每周两次经由皮下给予在25mM Tris，125mM NaCl于pH为7.0中的Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C，剂量分别为1.5毫克/公斤(A组；4只雄性(m)，1只雌性(f))及0.15毫克/公斤(B组；3m，3f)，每周两次经由皮下施用载剂(25mM Tris及125mM NaCl最终pH为7.0)(C组；3m，3f)及每日一次(QD)0.3毫克/公斤的FGF21△H(D组；3m，2f)。
在给药和冲洗期间每周采集血液样本，但在冲洗的第3周未收集样本。经过一夜饥饿(16-18小时)后，经由肌肉内注射(IM)为猴子注射氯胺酮10-15毫克/公斤使其镇静。记录体重并经由经皮股静脉穿刺将血液(5毫升)收集到经乙二胺四醋酸(EDTA)处理的真空采血管中，所述采血管以～1.8个胰蛋白酶抑制剂单位(TIU)抑肽酶(Aprotinin)(西格玛，0.6TIU/毫升全血)预先处理选。将采血管立即放在冰上。经由离心制备血浆，将所产生的血浆部分分装并冷冻在-80℃。
在给药期的第1、14及28天进行血浆药物量抽样。使用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血浆Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C量。使用鼠抗独特型h38C2捕捉Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C并以针对FGF21的N-和C-端的生物素化鼠抗FGF21单株抗体的混合物检测。所述C-端检测抗体对FGF21的最后4-5个氨基酸具特异性，而N-端检测抗体针对FGF21之前11-12个氨基酸产生。双检测试剂分析的最低需要稀释为在3％BSA的磷酸盐缓冲液中稀释20倍。校准范围为0.03-10微克/毫升，而定量范围为0.03-4微克/毫升。
以相同的方式处理每个药效终点的数据。将每一只猴子的基线值从各时点减除以产生对应于从基线开始的变化的数值。将各治疗组中每个时点从基线值开始的变化加以平均并计算所述平均值的标准差(SEM)。以从基线值开始的平均变化±标准差报告在研究时程中各治疗组的结果。在以0.15毫克/公斤及1.5毫克/公斤Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C治疗的动物方面，使用从基线值开始的变化及学生T检验(未配对样本，不相等的方差)评估在各时点时相对于载剂的统计意义。由于经FGF21△H治疗的动物没有载剂对照组，使用原始数据，而非使用从基线值开始的变化来评估统计意义。在这种情况下，相对于基线进行学生T检验(两侧，配对样本)。
实施例52Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C血浆药物量
血浆药物量显示于表16中。可衡量的药物量出现在第一个剂量后4小时及接下去的所有测试时点。
Figure BDA00003461989900651
表16Ab-L1-FGF21ΔH-A129C血浆药物量。BLQ＝低于定量限值(8毫微克/毫升)，NC＝未计算，n＜3，-＝无可用于测试的样本
实施例53体重
以AB-Ll-FGF2l△H-A129C剂量治疗2周后的二组及以FGF21对照蛋白质治疗1周后的组别中的体重均显著减轻(图9A)。在所有组别中，在洗出期间体重减轻仍受压制，虽然在AB-LlTGF2l△H-A129C二组中于4周洗出期前已不明显。以FGF2l△H治疗的动物表现出体重减轻高于以AB-LlTGF2l△H-A129C治疗的动物。在这些动物中并不直接测量食品的摄入量，但保健人员并未在任何治疗组的任何动物中观察到食欲不振。
实施例54空腹血糖
采用Ace Alera临床化学分析仪及试剂(阿尔法考德威尔，NJ)，根据制造商的指示经由酶比色法测量血糖。于任何治疗组中的空腹血糖在所经历的时间均无显著改变(图9B)，这表示以AB-L1-FGF21ΔH-Al29C长期治疗不会引起低血糖。
实施例55空腹血浆胰岛素
采用来自
Figure BDA00003461989900661
(瑞典乌普萨拉)的ELISA试剂盒，根据制造商的指示测定血浆胰岛素浓度。在任何治疗组中的空腹血浆胰岛素在所经历的时间均无显著改变(图9C)。
实施例56空腹血浆果糖胺
采用Ace Alera临床化学分析仪，利用来自Roche 
Figure BDA00003461989900664
(德国Mannheim)的试剂盒根据制造商的指示经由酶比色法测量血浆果糖胺。以0.15毫克/公斤和1.5毫克/公斤AB-L1-FGF21ΔH-Al29C治疗的组别在治疗4及3周后，以及以FGF21对照蛋白质治疗的动物在治疗3周后血浆果糖胺量显著降低(图9D)。此显著性持续至洗出期，尤其是在1.5毫克/公斤AB-L1-FGF21ΔH-Al29C治疗组中，但在以FGF21△H治疗的动物方面，所经历的各时点间则不一致。血浆果糖胺量随着时间的推移显著降低，表示血糖控制改善。
实施例57空腹血浆胰高血糖素
使用来自
Figure BDA00003461989900662
的人类(与非人类灵长类动物的交叉反应)内分泌免疫分析试剂盒在
Figure BDA00003461989900663
仪器(Luminex xMAP技术)上根据制造商的指示测量血浆胰高血糖素。在整个研究过程中，所有3个治疗组中的胰高血糖素量降低，且在一些时点处胰高血糖素量下降达到有意义，但下降的显著性在治疗组间或AB-L1-FGF21ΔH-Al29C剂量组间并不一致(图9E)。
实施例58静脉内葡萄糖耐量试验(IVGTT)
在三个时点，在每一只动物中进行静脉内葡萄糖耐量试验(IVGTTs)：基线(即，开始给药前两周)，给药4周后第二次试验，给药后冲洗期4周后最后一次试验。在那些时点，为猴子注射镇静剂并依上述采集空腹血液样本。在约30秒内将50％右旋糖(500毫克/公斤；1毫升/公斤)注入周边静脉(头静脉或隐静脉)，再冲洗生理盐水。接着，在给予右旋糖后5、10、20、30和60分钟将血液样本收集入以EDTA处理的真空采血管中(2毫升)。
在IVGTT的各时点测量葡萄糖及胰岛素。计算糖耐量试验期间(0-60分钟)的葡萄糖及胰岛素曲线下面积。以梯形法则，采用时间0(t=O分钟)数值作为基线值，从葡萄糖及胰岛素偏移曲线计算葡萄糖和胰岛素的ΔAUC。在以0.15毫克/公斤和1.5毫克/公斤AB-L1-FGF21ΔH-Al29C治疗的组别方面，以Dunnetts事后检验，经由ANOVA评估相对于载剂的统计学意义。以Dunnetts事后检验，经由重复测量ANOVA来评估
FGF21△H组中在经过的IVGTT时点处相对于基线的统计学意义。
葡萄糖及胰岛素的平均ΔAUC±SEM计算值分别显示于图9F及9G中。任何治疗组的任何计算参数中并无显著变化。
实施例59血浆总胆固醇(TPC)
在Ace Alera分析仪上使用酶法测量TPC量。在所有治疗组中，治疗1周后TPC显著减少(图9H)。以0.15毫克/公斤AB-L1-FGF21ΔH-Al29C治疗的动物中其TPC量在整个给药及洗出阶段中保持下降，然而以1.5毫克/公斤及FGF21△H治疗的组别中其TPC量在洗出阶段中朝基线反弹。
实施例60三酸甘油酯(TG)
在Ace Alera分析仪上使用酶法测量TG量。在以1.5毫克/公斤AB-L1-FGF21ΔH-Al29C治疗的组别及
FGF21△H治疗的动物中在整个给药期间TG显著减少(第9i图)。以FGF21△H治疗的组别中TG量在洗出阶段持续下降，而以1.5毫克/公斤AB-L1-FGF21ΔH-Al29C治疗的组别中TG量在洗出阶段则有朝向基线的趋势。
实施例61非酯化的游离脂肪酸(FFA)
在罗氏(Roche)
Figure BDA00003461989900671
C311临床化学分析仪上，采用来自和光(和光诊断，Richmond，维吉尼亚州)的议定计划及试剂，根据制造商的指示使用酶法测量非酯化的游离脂肪酸(FFA)。在以0.15毫克/公斤及1.5毫克/公斤AB-L1-FGF21ΔH-Al29C治疗的组别中FFA量没有显著变化(图9J)。在以FGF21ΔH治疗的动物中，FFA量在治疗前2周显著增加，然后在洗出阶段第1周前回到基线量。
实施例62高密度脂蛋白胆固醇(HDL)
在Ace Alera分析仪上使用酶法测量HDL量。在任何治疗组中HDL胆固醇在整个治疗期间并无显著的变化。
实施例63低密度脂蛋白胆固醇(LDL)
在Ace Alera分析仪上使用酶法测量LDL量。在以0.15毫克/公斤及1.5毫克/公斤AB-L1-FGF21ΔH-Al29C治疗的组别中，LDL胆固醇分别从治疗2周及治疗1周开始明显下降至洗出阶段第2周(图9K)。在以FGF21ΔH治疗的动物中，LDL胆固醇量仅在治疗1周后被观察到显著下降。此治疗组中的任何其它时点并未见到任何显著性。
实施例64总酮体(TOTK)
在罗氏(Roche)
Figure BDA00003461989900681
C311临床化学分析仪上，采用来自和光
Figure BDA00003461989900682
的议定计划及试剂，使用酶法测量TOTK。在以0.15毫克/公斤及1.5毫克/公斤AB-L1-FGF21ΔH-Al29C治疗的动物中总酮量并无显著变化(图9L)。在以FGF21△H治疗的动物中，TOTK量在治疗前3周后显著增加，而在整个洗出阶段中TOTK量有朝向基线的趋势。
实施例65脂联素
使用
Figure BDA00003461989900683
ELISA试剂盒测量脂联素量。血浆脂联素量显示于图9M中。有三只动物(载剂、1.5毫克/公斤AB-L1-FGF21ΔH-Al29C及FGF21△H治疗组中各1只)被从分析中排除，因为其脂联素量低于分析的检测下限。虽然以FGF21△H治疗的动物中脂联素量有向上的趋势，但在任何治疗组中未见到脂联素量有显著变化。
实施例66C-反应蛋白(CRP)
采用来自ALPCO
Figure BDA00003461989900684
(新罕布什尔州，Salem)的ELISA试剂盒，根据制造商的指示测量C-反应蛋白(CRP)。在以0.15毫克/公斤及1.5毫克/公斤AB-L1-FGF21ΔH-Al29C治疗的组别中，在4周的治疗期内，除了第2周之外，血浆CRP量显著下降(图9N)。在冲洗阶段所述量趋向回复至基线。在以FGF21△H治疗的动物中血浆CRP量亦下降，但仅在冲洗阶段第1周达到显著意义。
实施例67瘦素
采用
Figure BDA00003461989900685
技术目录编号HMH-34K)，根据制造商的指示使用议定计划及试剂来测量瘦素。在以FGF21△H治疗的动物中血浆瘦素量下降(图9o)，但这种下降在任何时点均未达到显著意义。在以AB-L1-FGF21ΔH-Al29C治疗的组别中瘦素量没有变化。
实施例68降脂蛋白
采用R＆D
Figure BDA00003461989900691
(明尼苏达州，明尼亚波利市)人补体因子D Quantikine试剂盒(目录编号DFD00)，根据制造商的说明来测量降脂蛋白量。在治疗之前3周，所有经治疗的动物中的血浆降脂蛋白量显著增加(图9Q)。在冲洗阶段所述量趋向回复至基线。
实施例69来自猴子研究的结论
AB-L1-FGF21ΔH-Al29C可在轻至中度胰岛素抗性食蟹猴中有效减轻体重、改善脂质指标(TPC、TG和LDL)并降低炎性生物标记(CRP)。AB-L1-FGF21ΔH-Al29C或FGF21ΔH对空腹血糖量没有明显效果且未发展出低血糖。经由IVGTT评估得知对胰岛素敏感性没有影响。虽然意外，这样的结果，加上对血糖量没有影响，可能是由于与正常健康的猴相比时，在这些猴中的葡萄糖及胰岛素的基线量仅略微升高。此暗示这些动物只显示轻度的胰岛素抗性。基线量的小变化，加上猴子与猴子之间的自然变异以及每组中少量的动物数目可能使观察到血糖指数的统计上显著变化较为困难。在以AB-L1-FGF21ΔH-Al29C治疗的动物中，治疗期结束时果糖胺量降低确实指出这些动物中的血糖控制改善。每周两次给予AB-L1-FGF21ΔH-Al29C剂量(尤其是1.5毫克/公斤剂量)时可产生与每天给予对照组FGF21蛋白剂量相当的有利影响。
实施例70AB-L1-FGF21ΔH-Al29C的首次人体研究
在患有第2型糖尿病的受试者中进行Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C(h38C2-(SEQ ID NO:10-L1)2)的随机化、安慰剂对照、平行上升单一IV剂量研究。受试者接受为IV大丸药(0.5毫克及1.5毫克)或IV滴液(5、15、50、100、200毫克)形式的安慰剂或Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C，在各活性治疗剂量组中有10位受试者接受评估，在安慰剂组中有14位接受评估。迄今为止，已有七组剂量高达200毫克剂量量的群组接受评估，由于高达200毫克的单一IV剂量被发现通常为安全且被良好耐受，因而未鉴定最大耐受剂量(MTD)。本文提出所观察到的安全性/耐受性、药物动力学及药效学数据的初步总结。
在给予单一剂量后，与安慰剂相比较，7个点的平均血浆血糖变化形廓及空腹血糖量之间并未观察到差异，虽然二者均显示出降低。在总胆固醇、LDL胆固醇、空腹胰岛素、空腹胰高血糖素或空腹β-羟基丁酸酯中未观察到剂量相关的趋势。与安慰剂相比较，在研究的顶端两个剂量量(100和200毫克IV)中观察到HDL胆固醇增加。在空腹三酸甘油酯方面观察到剂量依赖性下降。
在单次静脉内给予健康志愿者Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C后分别估计FGF21的完整C-端及完整N-端的药物动力学。与所述二者的接触似乎随剂量增加而按比例增加。对数浓度对时间曲线的终端阶段分别与C-端的7至9小时的平均终端半衰期及N-端的30-36小时的平均终端半衰期平行。
在33位受试者中无严重不良事件(SAE)的报告，共有60件不良事件(AE)的报告。在这些不良事件中，有54件报告来自28位接受Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C的受试者中。大多数的AE被认为在强度上是轻微的，除了在给予15毫克Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C剂量或安慰剂后32.5小时开始的恶心事件被评级为中度不良事件以外(所述中度不良事件历时165小时，其并不需要医疗干预且被认为与研究药物治疗有关)。亦报告一起被评级为中度的腹泻事件，其在给予50毫克Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C剂量或安慰剂后2小时开始，历时156小时，不需要医疗干预且被认为与研究药物治疗有关。腹泻为最常报告的AE(12位受试者中有14起)，其中九(9)起被认为与治疗有关。其它腹泻事件被认为与供给的自来水改变加氯治疗有关，所述自来水在参与临床研究的单位的住院禁闭期间提供给一个群组的受试者。在第7群组(200毫克剂量组或安慰剂)中报告的9起胃肠不良事件中有5起的胃肠道症状(腹胀、腹痛、腹泻、消化不良、胃肠胀气、胃酸过多、恶心及呕吐)显示出出现的频率似乎随剂量增加而增加。没有任何参与研究的受试者因为AE而撤回。
在研究的全部剂量中未观察到IGF-1值、实验室试验、生命征象或12导联心电图中具有剂量相关的趋势。在200毫克治疗组中，收缩压(SBP)的平均值在数值上有较其它治疗组(包括安慰剂)高的趋势，增加最多的为在第1天给药后0.5小时从基线增加11.2mM汞柱，并持续至第15天增加7.0mM汞柱。在200毫克治疗组中观察到的从基线间始的平均变化在所述组平均基线的一个标准偏差内。再者，在200毫克治疗组中，个别受试者中的Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C暴露与SBP增加之间没有相关性。此外，增加的SBP持续至第15天，直到研究药物冲洗后。所有这些观察暗示所观察到的平均值增加在治疗组变异之内且可能与此有关。
实施例71剂量摄生法
在给予第2型糖尿病患者单一剂量的Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C后三酸甘油酯降低的浓度-反应关系使用一个缓慢的药理学起始及终止PK/PD模型来解说。剂量的预测基于使用所述PK/PD模型测出的IC50和来自FIH(人体首次)三酸甘油酯数据的缓慢药理动力学，以及从ob/ob小鼠OGTT数据得到的模型推衍的最大药理作用。预计每周给予10毫克h38C2-(SEQ IDNO:10-L1)2的剂量或每周给予两次5毫克Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C的剂量共4周以在8％HbA1C的患者中达到降低～25％的空腹血糖。
因此，本发明提供一种剂量摄生法，其包含以约5毫克的本发明化合物(尤其是Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C)的剂量治疗患者。在一些方面，一周二次(每周两次)施用约5毫克的本发明化合物(尤其是Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C)。在一些方面，施用约5毫克的本发明化合物(尤其是Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C)至少四周。在一些方面，每二周施用一次约5毫克的本发明化合物(尤其是Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C)至少四周。
因此，本发明提供一种剂量摄生法，其包含以约10毫克的本发明化合物(尤其是Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C)剂量治疗患者。在一些方面，每周一次施用约10毫克的本发明化合物(尤其是Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C)。在一些方面，施用约10毫克的本发明化合物(尤其是Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C)至少四周。在一些方面，每周施用一次约10毫克的本发明化合物(尤其是Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C)至少四周。
在一些方面，所述患者患有第2型糖尿病。在一些方面，所述患者为具有升高的血红蛋白A1C的糖尿病患者。在一些方面，所述剂量摄生法用于降低三酸甘油酯量。在一些方面，所述剂量摄生法用于提高高密度脂蛋白。在一些方面，所述剂量摄生法用于降低血糖。在一些方面，所述剂量摄生法用于降低至少约25％的血糖。在一些方面，所述剂量摄生法用于治疗第2型糖尿病。
实施例72Ab-L1-FGF21ΔH-H125C&Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C的稳定性
经由UF-DF(采用截断30000分子量的渗滤及超滤作用)制备Ab-L1-FGF21ΔH-H125C&Ab(h38C2-(FGF21ΔH-H125C-L1)2)及Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C(h38C2-(FGF21ΔH-Al29C-L1)2)的各种配制剂，然后进行无菌过滤。将配制剂置于一范围的压力条件下(见表17)。然后，使用外观分析、UV(紫外线吸光度)、SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)、尺寸排阻层析法(SEC)及iCE(成像毛细管电泳法)分析样本。经由生物物理技术(诸如差示扫描量热法(DSC)及分析性超速离心)分析一些样本。在不同时点分析样本(表17)以评估稳定性趋势。为了测定聚山梨酸酯80的任何有益的影响，选择制备的具有或不具有聚山梨酸酯80的配制剂接受搅动压力(在300rpm回转振荡4小时)。此外，若缀合物可以高浓度溶解于水性缓冲溶剂中，一些配制剂亦使用较高的浓度来进行评价，并评估在高浓度下的稳定性。
Figure BDA00003461989900721
表17Ab-Ll-FGF2l△H-H125C(A-E)及Ab-Ll-FGF2l△H-A129C(F-I)的配置剂。PF形成粒子;C:透明;nc:未进行。
外观分析
在不同温度下储存时形成颗粒:在2OmM组氨酸，pH6配制剂中的两种候选物(配制剂A和F)显示出在5℃下储存4周，或在25℃下储存4周，或在40℃下储存2周，或在50℃下储存2周时会形成颗粒。这些数据暗示2OmM组氨酸，pH6配制剂导致Ab-Ll-FGF2lΔH-H125C及Ab-Ll-FGF2lΔH-A12gC不稳定。当承受在40℃下2周的压力时，相对于具相同蛋白质浓度的组氨酸，pH6配制剂，醋酸盐，pH4及磷酸盐，pH8的配制剂显示出未形成微粒。然而，当与具较低蛋白质浓度(7-10毫克/毫升)的相同配制剂(组氨酸，pH6)相比较时，高蛋白质浓度(40-50毫克/毫升)显示出减缓颗粒形成。在5℃下储存4周后比较Ab-Ll-FGF2l△H-H125C及Ab-Ll-FGF2lΔH-Al29C之外观数据时，在2种配制剂(醋酸盐，pH4及磷酸盐，pH8)中，Ab-Ll-FGF2lΔH-Al2gC显示出较优越的对抗颗粒配制剂的性能。
如从表17中所见，当比较具有及不具有聚山梨酸酯80的配制剂时，聚山梨酸酯80的存在有助于在两种候选物中防止诱导形成颗粒的搅动压力。搅动压力通常用于预测对抗涉及空气-水界面以及机械压力的不同操作步骤的稳定性。
随着时间的推移未观察到紫外线的显著变化指出即使表17中所列直一些配制剂中被观察到形成微粒，蛋白质的净浓度不会随着时间的推移受到显著影响。形成高分子量种类(HMWS)
使用SEC来测量表17中列出的各种配制剂形成HMWS(结果显示于表18中)。SEC能够可靠地分离HMWS且为Ab-L1-FGF21ΔH-H125C及Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C的重要稳定性指示分析。SEC分析中的HMWS被定义为在携带2个FGF21单位(即，h38C2-(FGF21ΔH-H125C-L1)2及h38C2-(FGF21ΔH-Al29C-L1)2)的缀合物前洗涤出的种类。二种候选物的在20mM组氨酸，pH6中的配制剂显示出高初始以及时间倚赖性的HMWS形成作用。有趣的是，二种候选物直一些配制剂(醋酸盐，pH4；磷酸盐，pH8及在组氨酸，pH6中的高浓度配制剂)在高温下(40℃)下趋向显示出聚集物在第一周初步分解。蛋白配制剂随着时间的推移有非线性聚集的趋势在文献中得知。与在20mM组氨酸，pH6中的配制剂相比较，在20mM醋酸钠，pH4中的配制剂显示出HMWS较少。因此，在形成HMWS方面，在20mM醋酸钠，pH4中的配制剂提供较在20mM组氨酸，pH6中的配制剂更优越的稳定性。SDS-PAGE分析与这些结果一致。最后，当比较两种候选物在5℃醋酸盐，pH4的配制剂中形成HMWS的倾向时，Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C显示出性能优于Ab-L1-FGF21ΔH-H125C(表18)。
表18经由SEC测量的Ab-Ll-FGF2l△H-H125C及Ab-Ll-FGF2l△H-A129C%HMWS(高分子量种类)的稳定性数据。SEC条件包括:Waters Biosuite UHR 2504微米,4.6×300毫米SEC柱,流动相:200mM磷酸钠100mM氯化钠缓冲液(pH7.0)，分析柱温度:周围温度，流速:0.1毫升/分钟(等强度)，检测:在214nm的紫外线吸收，运行时间:50分钟
电荷异质性
蛋白质具有由翻译后修饰(诸如脱酰胺及断裂成片断)造成的电荷异质性。影像式毛细管等电聚焦法(iCE)根据其在pH梯度中的电荷差异(pI值)分离蛋白质种类。表19中显示使用iCE监控在各种Ab-Ll-FGF2l△H-H125C及Ab-Ll-FGF2l△H-Al29C配制剂中的电荷异质性。iCE的运行条件包括:含有2M尿素及Pharmalyte3-10的约1毫克/毫升蛋白质。与在2OmM醋酸钠，pH4中的配制剂相比较，二种候选物在2OmM组氨酸，pH6以及2OmM磷酸钠，pH8中的配制剂显示出较高的形成酸性种类的趋势。因此，在20mM醋酸钠，pH4中的配制剂提供卓越的稳定性。此外，与在相同配制剂中的Ab-L1-FGF21ΔH-H125C相比较，Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C显示出在20mM醋酸钠，pH4中形成较少的酸性种类的倾向，因而在电荷异质性方面表现出较优越的稳定性。
Figure BDA00003461989900741
表19经由Ab-Ll-FGF2I△H-Hl25C及Ab-Ll-FGF2l△H-A129C时iCE电荷异质性数据所测量的%酸性种类
差示扫描量热法(DSC)
采用DSC，经由测量由温度引起的解折叠转变中点(Tm)来研究两种候选物的热稳定性。h38C2的士要解折叠转变的Tm值为73.5℃。所述缀合物显示出较高的士要解折叠转变的Tm，暗示具较高的对抗解折叠的热稳定，性(Ab-Ll-FGF2l△H-H125C(h38C2-(FGF2l△H-H125C-Ll)2)以及Ab-Ll-FGF2l△H-Al29C(h38C2-(FGF2l△H-A129C-Ll)2二者的Tm为79℃)。
亦使用内在蛋白色氨酸萤光，经由测量由温度引起的解折叠转变中点(Tm-FL)来研究两种候选物的热稳定性。此分析半定量地监控由高温引起解折叠时的三级结构变化。h38C2、Ab-Ll-FGF2l△H-A129C及Ab-Ll-FGF2l△H-Hl25C的主要解折叠转变的Tm-FL值分别为约74.1℃、77.7℃及79.7℃。与经由DSC测量的Tm值一致，所述两种候选物显示出较h38C2的Tm-FL略高的类似Tm-FL，此暗示所述缀合物的热动力学稳定性较单独的h38C2为高。
分析性超速离心分析
使用此分析正交定性测量选定的测试配制剂中的HMWS的量。HMWS在2OmM组氨酸，pH6配制剂中的量显示出与SEC中所见者类似。Ab-Ll-FGF2lΔH-Al2gC在2OmM醋酸钠，pH4中的HMWS量较低，与在SEC分析中所见的趋势为定性上相一致。分析性超速离心数据提供正交验证，指出所述20mM醋酸钠，pH4配制剂具有较20mM组氨酸，pH6配制剂优越的稳定性(表20)。
配制剂 %HMWS
Ab-L1-FGF21△H-H125C在20mM组氨酸,pH6中 25.2
Ab-L1-FGF21△H-A129C在20mM组氨酸,pH6中 24.3
Ab-L1-FGF21△A129C在20mM醋酸钠,pH4中 5.2
表20经由Ab-Ll-FGF2l△H-H125c及Ab-Ll-FGF2l△H-A129C的分析性超离心所测得的HMWS数据
比较数种此实施例中所讨论的稳定性指标的数据，Ab-Ll-FGF2l△H-Al29C的整体稳定性变化形廓似乎优于Ab-Ll-FGF2l△H-H125C。亦明显地，与较高的pH值(如pH值6-8)相比较，降低配制剂的pH值(如醋酸盐，pH4)可提供优选的稳定性。
实施例73Ab-Ll-FGF2l△H-A129C的pH缓冲液的筛选
研究Ab-Ll-FGF2l△H-Al29C(h38C2-(FGF2l△H-Al29C-Ll)2)在各种水性缓冲液中的稳定性以寻找合适的稳定介质为目标。接头-1不稳定，以及蛋白组分(即h38C2和FG2l)的任何水解分解产生低分于量的物种(LMWS)。此外，右缀合物在测试的配制剂中聚集则可形成高分于量物种。经由将缓冲液交换入所需的配制剂中，使目标蛋白的浓度在5-8毫克/毫升的范围内来制备配制剂。使用0.2微米过滤器过滤配制剂，包装在玻璃小瓶中并储存在所需的温度下。在指定的时点分析样本。经由SEC测量HMWS及LMWS
在温度压力(40℃)下观察缓冲液和pH值的显著影响2周。数据呈现在表21中。在最初的时点可见到在较高pH的配制剂中HMWS有增加的趋势。组氨酸配制剂为显现出高％HMWS的物种直一。在4.5至5的pH值范围内的醋酸钠、乳酸钠、苹果酸钠及柠檬酸钠配制剂显示出在起始点的聚集相对少。在40℃储存数周后，在pH6.5和7的配制剂中，％HMWS确实降低。乳酸钠，pH4.5配制剂显示出在％HMWS方面相当优越的性能。
LMWS的趋势与HMWS的趋势不同。除柠檬酸钠，pH5配制剂外，所有配制剂在起始时点均显示出一致的％LMWS值。在40℃储存2周后，一些低pH配制剂显示出％LMWS显著增加，据推测这是由于发酵。然而，很明显地，缓冲液物种的作用在对抗形成LMWS的稳定作用上亦发挥效果。％LMWS的pH依赖趋势暗示进一步精制配制剂可以进一步改善稳定性。
Figure BDA00003461989900761
表21Ab-LlTGF2l％H-A129C的配制剂的SEC数据
实施例74Ab-Ll-FGF2l△H-A129C对抗搅动的稳定性
经由缓冲液交换及添加赋形剂使目标蛋白质浓度在9-11毫克/毫升的范围内来制备配制剂。使用0.2微米过滤器过滤制备的配制剂并包装在玻璃小瓶中。使用速度为30Orpm的回转式振荡器施放搅动。在指出的时点分析样本。表22中的结果证实聚山梨酸酯80的存在有助于防止由搅动引起的不稳定。
Figure BDA00003461989900762
表22配制剂对抗搅动压力的稳定性数据
实施例75Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C的冻干配制物
虽然液态配制物可与本发明的化合物一起使用，冻干配制物可提供更长久的稳定性。实施例72证实本发明化合物在醋酸钠中最稳定的令人吃惊的结果。然而，醋酸钠会升华，因此很难纳入冻干的缓冲液中。因此，有需要研发用于本发明化合物的替代缓冲液以在冻干配制物中提供最佳的长期稳定性。
经由缓冲液交换及添加赋形剂使目标蛋白质浓度约为10毫克/毫升来制备配制物，但配制物J和K的目标蛋白质浓度为约20毫克/毫升。使用0.2微米过滤器过滤制备的配制物并包装在玻璃小瓶中。为了制备冻干的配制物，将小瓶冻干、塞住并加盖。在指定的时点拉出样本并经由各种分析方法测定(包括SEC及iCE)。亦评估所述液态配制物2周以评估稳定性。
评估冻干配制物储存在升高的温度下的性能。表23显示出在指定的时点的SEC和iCE数据。冻干配制物表现出众，即使在较高的温度压力下比较时。在冻干配制物中，乳酸盐及醋酸盐配制物的表现相对较好。然而，已知当冻干造成pH值移动时醋酸盐会发生升华。醋酸配制物在冻干时确实显示出增加0.3-0.5个pH单位。因此，归结出所述冻干的乳酸配制物(配制物C)适合用于取得适当的稳定性，并提供足够的保护防止形成微粒、HMWS、LMWS及酸性物种。当与实施例73中呈现的配制物比较时，显然地，配制物C(包含乳酸盐、海藻糖二水合物、PS20、EDTA、L-Met)协助预防接头的不稳定性和蛋白质剪切(此两者造成LMWS形成)，以及聚集(形成微粒及HMWS)。实施例72和73显示出仅包含乳酸盐的h38C2-(FGF21ΔH-Al29C-L1)2的配制物虽然优于其它缓冲液(诸如组氨酸)，但可能不会提供足够的稳定性以利长期使用。乳酸盐与各种类型的稳定剂(诸如作为冷冻保护剂及冻干保护剂的糖或多元醇(如海藻糖、蔗糖、甘露醇)、用于搅动稳定性的表面活性剂(如聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯20、泊洛沙姆(poloxamer))和螯合剂(如EDTA、DTPA)以及抗氧化剂(如L-甲硫氨酸)的组合可提供稳定性的协同增强作用。表23中，与仅含缓冲液的相对应的配制物相比较，乳酸盐被苹果酸盐、琥珀酸盐或醋酸盐直一取代的组合配制物可提供较优越的稳定性。因此，所述组合物明显增强Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C的稳定性。
实施例76Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C的冻干配制物
经由缓冲液交换及添加赋形剂使配制物间的目标蛋白质浓度有所不同来制备配制物。使用0.2微米过滤器过滤制备的配制物并包装在玻璃小瓶中。为了制备冻干的配制物，将小瓶冻干、塞住并加盖。在指定的时点经由各种分析方法(包括SEC及iCE)分析样本。此外，亦评估所述液态配制物2周以评估液态配制物的稳定性趋势。在冻干后测试所述冻干配制物的含水量且均低于0.5％。
将所述冻干配制物储存在不同的温度压力下，表24显示出在指定的时点的SEC、iCE及降低的CGE(毛细管凝胶电泳)数据。CGE产生蛋白质片段的半定量估计值。与其液体对应部分相较下，冻干配制物显示出优选的稳定性。乳酸(乳酸钠)冻干制剂在稳定赋形剂的存在下(在冷冻保护剂/冻干保护剂的存在下)显示出良好的稳定性。因此，可归结出所述冻干的乳酸配制物适合测试长期的储存稳定性。在乳酸配制物中，需要平衡配制物的pH值以防止因为接头的不稳定性及蛋白质剪切而过度破碎。例如：与其它配制物相比较，液体状态的配制物F，pH4.5产生大量碎片。最后，当比较配制物B及L时，稳定剂(即，EDTA和L-甲硫氨酸)被发现可提供实质的利益使破碎减至最少，尤其是提供给液体配制物此利益。其它金属螯合剂(如：EDTA、DTPA)及抗氧化剂(如：L-甲硫氨酸、纯抗坏血酸)的组合预计对取得稳定性有利。
也测试了选定的配制物的相对生物活性以探究在表24的数据中见到的物理和化学降解间是否有关联性。经由间接FGF-R/β-Klotho HEK-293细胞结合ELISA测量生物活性，并以参考物质的相对%表示。生物活性数据呈现于表25中。从数据来看，似乎物理与化学降解间有关联性，且所述经由分析方法分析出的显示明显降解的配制物(表24)亦显示出生物活性明显降低。这些数据对配制物A的组分所提供的稳定性及功能完整性提供进一步的信心。
表25表24列出的选定的Ab-Ll-FGF2l△H-△129C的冻干和液体配制剂的生物活性(相对%)数据
因此，在一些方面，本发明提供包含约0.1至约200毫克/毫升的FGF2l-缀合物及约1至15OmM的乳酸或醋酸钠，pH值为约4至约5.5;以及至少下列一者的配制物:
(i)约l0至约150毫克/毫升的冷冻保护剂;
(ii)约0.001至约1.0毫克/毫升的螯合剂;
(iii)约0.01至约10毫克/毫升的抗氧化剂;
(iV)约0.02-2.0毫克/毫升的表面活性剂。
在一些方面，本发明的配制物包含二或多项的(i)至(iv)。在一些方面，本发明的配制物包含三或多项的(i)至(iv)。在一些方面，本发明的配制物包含(i)、(ii)、(iii)及(iv)。
在一些方面，本发明提供冻干配制物，其包含：
(i)约0.1至约200毫克/毫升的FGF21-缀合物
(ii)约1至150mM的乳酸，pH值约4至约5.5；及
(iii)约10至约150毫克/毫升的冷冻保护剂；
(iv)约0.02-2.0毫克/毫升的表面活性剂。
在一些方面，所述冻干配制物可进一步包含约0.001至约1.0毫克/毫升的螯合剂。所述螯合剂可为EDTA或DTPA，且存在量可为约0.02至约0.5毫克/毫升。所述螯合剂的存在量可为约0.05毫克/毫升。
在一些方面，所述冻干配制物可进一步包含约0.01至约10毫克/毫升的抗氧化剂。在一些方面，所述抗氧化剂可为L-甲硫氨酸。所述抗氧化剂的存在量可为约0.02至约5毫克/毫升。所述抗氧化剂的存在量可为约0.05至约0.2毫克/毫升。所述抗氧化剂的存在量可为约0.1毫克/毫升。
在一些方面，所述FGF21-缀合物为一种如本文描述的本发明化合物。在一些方面，所述FGF21-缀合物为Ab-L1-FGF21ΔH-H125C或Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C。在一些方面，所述FGF21-缀合物为特殊物种h38C2-(SEQ ID NO:10-L1)2。在一些方面，所述FGF21-缀合物的存在量为约5毫克/毫升至约200毫克/毫升。在一些方面，所述FGF21-缀合物的存在量为约5毫克/毫升至约100毫克/毫升。所述FGF21-缀合物的存在量为约5毫克/毫升至约50毫克/毫升。所述FGF21-缀合物的存在量为约10毫克/毫升。
在一些方面，所述乳酸的存在量为约1至约100mM。在一些方面，所述乳酸的存在量为约10mM至约50mm。在一些方面，所述乳酸的存在量为约30mM。所述pH值可为约4.3至5.3。所述pH值可为约4.8±0.5。所述pH值可为约4.8。
在一些方面，所述冷冻保护剂选自如下：海藻糖二水合物、蔗糖及甘露醇。所述冷冻保护剂可为海藻糖二水合物。所述冷冻保护剂的存在量可为约50至约120毫克/毫升。所述冷冻保护剂的存在量可为约90毫克/毫升。
在一些方面，所述表面活性剂选自如下：聚山梨酸酯80、聚山梨酸酯20及波洛沙姆。所述表面活性剂可为聚山梨酸酯20。在一些方面，所述表面活性剂的存在量为约0.05至约1.0毫克/毫升。在一些方面，所述表面活性剂的存在量为约0.1至0.5毫克/毫升。在一些方面，所述表面活性剂的存在量为约0.2毫克/毫升。
在一些方面，本发明包含适合用于冻干的配制物，其包含下列：
(i)约10毫克/毫升的h38C2-(FGF21ΔH-Al29C-L1)2；
(ii)约30mM乳酸，pH4.8±0.5；
(iii)约90毫克/毫升的脱水海藻糖；
(iv)约0.05毫克/毫升的乙二胺四醋酸二钠二水合物；
(v)约0.1毫克/毫升的L-甲硫氨酸；及
(vi)约0.2毫克/毫升的聚山梨酸酯20。
除非另有说明，在具体实施例中当使用术语“Ab-L1-FGF21ΔH-Al29C”时，其是指h38C2抗体(SEQ ID NO：25及26)，所述抗体的各臂通过SEQ IDNO：26的K99共价连接至接头-1(L1)，且各L1分子共价结合SEQ ID NO：10中的Cys129的巯基(根据SEQ ID NO：1的编号)。所述化合物亦可被描述为Ab-(FGF21ΔH-Al29C-L1)2、h38C2(FGF21ΔH-Al29C-L1)2及h38C2(SEQ IDNO:10-L1)2。显然地，对所述抗体的序列、特殊接头及FGF21分子进行些微修改是可能的。
因此，本发明已被广泛揭露并参考上述代表性实施例说明。本领域技术人员将可察知可对本发明做各项修改，而不悖离其精神及范围。本文列举的所有出版物、专利申请案及核发的专利纳入做为参考，其程度如同各个别出版物、专利申请案及核发的专利专门且个别指明其全部内容被纳入参考。当与本揭露内容中的定义矛盾时则排除纳入参考之内容中所包含的定义。
可感知，为了清楚起见而描述在分开实施例中的本发明某些特性亦可组合提供于单一实施例中。相反地，为了简明起见而描述在单一实施例中的本发明的各种特性亦可分开提供或以任何合适的子组合提供。
此文中关于本发明直一个实施方案所讨论的任何限制经具体虑及可能适用于本发明的任何其它实施例。此外，本发明的任何组合物可用于本发明的任何方法中，且本发明的任何方法可用于制造或采用本发明的任何组合物。尤其是，可理解的是，申请专利范围中所描述的本发明的任何方面(单独或与一或多项额外的专利主张和／或描述的方面组合)可与申请专利范围和／或说明中另外提出的本发明的其它方面组合。
除非明确表示仅指所述替代项，或替代项彼此具排他性，申请专利范围中所使用的“或”一词是指“和／或”，虽然所述揭露内容支持仅指所述替代项及“和／或”的定义。
除非另外明确描示，本专利说明书中所使用的“一(a)”或“一(an)”可能意指一或多个。在本文的申请专利范围中，当与“包含”一起使用时，“一(a)”或“一(an)”等字可能意指一或超过一个。本文所使用的“另一”可能意指至少有第二项或更多项。
此文中，当参考本发明使用“包含(comprises)/包含(comprising)”等字及“具有(having)/包括(including)”等字时用于具体指明所陈述的特性、整体、步骤或组分的存在，但不排除存在或加入一或多种其它特性、整体、步骤、组分或其群组。
Figure BDA00003461989900821
Figure BDA00003461989900831
Figure IDA00003461990400011
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Figure IDA00003461990400251

Claims (38)

1.一种组合物，其包含经由接头共价附着至抗体的结合位点或其抗原结合部分的FGF21分子。
2.如权利要求1的组合物，其中所述接头通过根据SEQ ID NO：1编号的氨基酸位置79、125或129处的连接残基侧链共价附着至FGF21分子。
3.如权利要求2的组合物，其中残基129为半胱氨酸且所述接头共价附着至半胱氨酸129的巯基。
4.如任意前述权利要求的组合物，其中所述接头包含式X-Y-Z；其中X为包括选自C、H、N、O、P、S、F、Cl、Br和I的任何原子的生物相容连接链，并可能包含聚合物或嵌段共聚物，且共价连接其中接头为线性的连接残基，Y为任选存在的包含至少一个环状结构的识别基；以及Z为附着部分，其包含连接至抗体结合位点中的氨基酸侧链的共价键。
5.如权利要求4的组合物，其中Y具有任选存在的经取代的结构：
其中a、b、c、d及e各自独立地为碳或氮；f为碳、氮、氧或硫。
6.如权利要求5的组合物，其中Y为苯基。
7.如权利要求4-6任一项的组合物，其中当共价附着至抗体时Z具有下式
Figure FDA00003461989800012
且q=1或2。
8.如权利要求7的组合物，其中q=2。
9.如权利要求4-8任一项的组合物，其中X为包含三种组分的基团：Xp-Xs-Xy，其中Xp为经特异改造成可与FGF21蛋白质的连接残基的侧链组合的基团，Xs为X基团的间隔区，以及Xy为经改造成与Y基团结合的基团。
10.如权利要求9的组合物，其中Xy选自酰胺键、烯胺键或胍键。
11.如权利要求10的组合物，其中Xy具有下式：
Figure FDA00003461989800021
12.如权利要求4-11任一项的组合物，其中Xp包含下式：
Figure FDA00003461989800022
13.如权利要求4-12任一项的组合物，其中Xs选自：
Figure FDA00003461989800023
其中n=1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，且m存在或不存在。
14.如权利要求13的组合物，其中Xs包含下式：
Figure FDA00003461989800024
15.如权利要求14的组合物，其包含下式：
Figure FDA00003461989800025
其中所述抗体连接在该抗体的结合位点，S-FGF21是连接至连接残基含巯基侧链的共价键，n=1或2、3、4、5、6、7、8、9或10；且m存在或不存在。
16.如权利要求13或14的组合物，其包含下式：
Figure FDA00003461989800031
其中所述抗体连接在该抗体的结合位点，S-FGF21是连接至连接残基含巯基侧链的共价键，且n=1或2、3、4、5、6、7、8、9或10。
17.如权利要求15或16的组合物，其中n=1、2、3或4。
18.如权利要求17的组合物，其包含下式：
Figure FDA00003461989800032
其中所述抗体连接在该抗体的结合位点，且S-FGF21连接在连接残基的含巯基侧链。
19.如任意前述权利要求的组合物，其中所述接头共价缀合至根据Kabat编号的所述抗体重链的赖氨酸93的ε-氨基基团。
20.如任意前述权利要求的化合物，其中所述抗体是包含来自h38c2或m38C2的VH及VL结构域的全长抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、FV、dsFV、scFV、VH、VL、双抗体、小体，或者是包含来自h38c2或m38C2的VH及VL结构域及选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的恒定区的全长抗体，以及可以是h38C2IgG1。
21.如任意前述权利要求的组合物，其中该抗体为醛缩酶抗体。
22.如权利要求21的组合物，其中所述醛缩酶抗体包含含有SEQ IDNO：27的VL区。
23.如权利要求22的组合物，其中所述醛缩酶抗体包含含有SEQ IDNO：28的VH区。
24.如权利要求23的组合物，其中所述醛缩酶抗体包含含有SEQ IDNO：25的轻链。
25.如权利要求24的组合物，其中所述醛缩酶抗体包含含有SEQ IDNO：26的重链。
26.如任意前述权利要求的组合物，其中所述FGF21分子包含选自如下的序列：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15及SEQ ID NO：16。
27.如任意前述权利要求的组合物，其中所述FGF21分子包含序列SEQ ID NO：3。
28.如任意前述权利要求的组合物，其中所述FGF21分子包含序列SEQ ID NO：10。
29.如权利要求28的组合物，其包含下式
Figure FDA00003461989800041
其中所述抗体连接在结合位点并包含SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26，且S-FGF21是SEQ ID NO：10的Cys129的含巯基侧链。
30.如权利要求1-27任一项的组合物，其包含下式
Figure FDA00003461989800042
其中所述抗体连接在结合位点并包含SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26，且S-FGF21是SEQ ID NO：7的Cys125的含巯基侧链。
31.如权利要求1-27任一项的组合物，其包含下式
Figure FDA00003461989800051
其中所述抗体连接在结合位点并包含SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26，且S-FGF21是SEQ ID NO：12的Cys79的含巯基侧链。
32.一种包含FGF21分子的组合物，所述FGF21分子共价连接至位于根据SEQ ID NO：1编号的第79、125或129号残基的连接残基处的半衰期增加部分。
33.一种组合物，其选自：SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：13。
34.一种组合物，其包含经由接头共价附着至抗体结合位点的FGF21分子，其中所述接头共价附着至FGF21内的连接残基的侧链，形成缀合的蛋白质-抗体复合物，从而使该缀合的蛋白质-抗体复合物具有至少一种下列特征：
（a）在鼠模型中SC注射后至少约30小时的血浆T1/2，
（b）在Glut1Taqman测定中低于约4nM的效力，且特征在于该缀合的蛋白质-抗体复合物具有下式：
Figure FDA00003461989800052
其中所述抗体连接在结合位点并包含SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26，且S-FGF21是SEQ ID NO：7的Cys125或SEQ ID NO：10的Cys129的含巯基侧链。
35.一种组合物，其包含经由接头共价附着至抗体结合位点的FGF21分子，其中所述接头共价附着至FGF21内的连接残基的侧链，形成缀合的蛋白质-抗体复合物，从而使该缀合的蛋白质-抗体复合物具有至少一种下列特征：
（a）在鼠模型中SC注射后至少约33小时的血浆T1/2，
（b）在大鼠模型中SC注射后至少约35小时的血浆T1/2，
（c）在灵长类动物模型中SC注射后至少约45小时的血浆T1/2，
（d）在Glut1Taqman测定中少于约3nM的效力，且
特征在于所述缀合的蛋白质-抗体复合物具有下式：
Figure FDA00003461989800061
其中所述抗体连接在结合位点并包含SEQ ID NO：25及SEQ ID NO：26，且S-FGF21是SEQ ID NO：10的Cys129的含巯基侧链。
36.一种药物组合物，其包含治疗有效量的任意前述权利要求的化合物组合药学上可接受的载体。
37.一种方法，其用于治疗糖尿病、糖尿病相关病况、肥胖、血脂异常、高血压、肝脂肪变性、或心血管疾病；或用于控制或降低重量水平；或用于控制血糖控制；或用于增加胰岛素分泌、HDL水平、或非酯化的游离脂肪酸或降脂蛋白的水平；或用于降低血糖、胰高血糖素、三酸甘油酯、果糖胺、低密度胆固醇或C-反应蛋白的水平；所述方法包括向对象施用治疗有效量的权利要求1-35任一项的化合物或者权利要求36的药物组合物。
38.权利要求1-35任一项的化合物或者权利要求36的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于：治疗糖尿病相关病况、肥胖、血脂异常、高血压、肝脂肪变性、或心血管疾病；或控制或降低重量水平；或控制血糖控制；或增加胰岛素分泌、HDL水平、或非酯化的游离脂肪酸水平；或降低血糖、胰高血糖素、三酸甘油酯、果糖胺、低密度胆固醇或C-反应蛋白的水平。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022228498A1 (zh) * 2021-04-30 2022-11-03 信达生物制药(苏州)有限公司 一种oxm3储存剂、oxm3制剂及制备方法

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9574002B2 (en) 2011-06-06 2017-02-21 Amgen Inc. Human antigen binding proteins that bind to a complex comprising β-Klotho and an FGF receptor
JP6712230B2 (ja) 2014-03-11 2020-06-17 ノバルティス アーゲー リポジストロフィーおよびインスリン産生の欠損またはインスリンシグナル伝達の欠損と関連する代謝性障害を処置する方法
WO2015138309A1 (en) 2014-03-13 2015-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for regulating pancreatic beta cell function using adipsin
CN106536540A (zh) 2014-07-24 2017-03-22 基因泰克公司 将试剂缀合至含有至少一个三硫键的蛋白质中的巯基部分的方法
US11638745B2 (en) 2015-05-20 2023-05-02 University of Pittsburgh—Of the Commonwealth Cvctom of Hierher Education Method to improve neurologic outcomes in temperature managed patients
US11236159B2 (en) 2015-08-03 2022-02-01 Novartis Ag Methods of treating FGF21-associated disorders
CA3052911A1 (en) 2017-02-08 2018-08-16 Novartis Ag Fgf21 mimetic antibodies and uses thereof
PE20210632A1 (es) 2018-07-03 2021-03-23 Bristol Myers Squibb Co Formulaciones de fgf-21
EP3863672A4 (en) * 2018-10-11 2022-06-29 The Scripps Research Institute Antibody compounds with reactive arginine and related antibody drug conjugates
BR112022013172A2 (pt) * 2020-01-08 2022-09-13 Bristol Myers Squibb Co Formulações de conjugados de fgf-21
CN113728013B (zh) 2020-01-11 2022-06-14 北京质肽生物医药科技有限公司 Glp-1和fgf21的融合蛋白的缀合物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005091944A2 (en) * 2004-03-17 2005-10-06 Eli Lilly And Company Glycol linked fgf-21 compounds
WO2005113606A2 (en) * 2004-05-13 2005-12-01 Eli Lilly And Company Fgf-21 fusion proteins
CN101287485A (zh) * 2005-03-03 2008-10-15 爱尔兰考夫克斯科技有限公司 抗血管生成化合物

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5733757A (en) 1995-12-15 1998-03-31 The Scripps Research Institute Aldolase catalytic antibody
US6326176B1 (en) 1997-12-18 2001-12-04 The Scripps Research Institute Aldol condensations by catalytic antibodies
US7408047B1 (en) 1999-09-07 2008-08-05 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
CA2389250C (en) 1999-10-08 2010-07-20 The Scripps Research Institute Antibody catalysis of enantio- and diastereo-selective aldol reactions
US6294374B1 (en) 1999-10-08 2001-09-25 The Scripps Research Institute Use of catalytic antibodies for synthesizing epothilone
US6716626B1 (en) 1999-11-18 2004-04-06 Chiron Corporation Human FGF-21 nucleic acids
CN100560131C (zh) 2001-10-22 2009-11-18 斯克里普斯研究学院 抗体靶向化合物
AU2003201810A1 (en) 2002-01-15 2003-07-30 Eli Lilly And Company Method for reducing morbidity and mortality in critically ill patients
ES2298785T3 (es) * 2003-06-12 2008-05-16 Eli Lilly And Company Proteinas de fusion.
KR20060135648A (ko) 2003-12-10 2006-12-29 일라이 릴리 앤드 캄파니 섬유모세포 성장인자 21의 뮤테인
WO2005072769A1 (en) 2004-01-26 2005-08-11 Eli Lilly And Company Use of fgf-21 and thiazolidinedione for treating type 2 diabetes
DE602005016946D1 (de) 2004-09-02 2009-11-12 Lilly Co Eli Muteine des fibroblasten-wachstumsfaktors 21
EP1789443A1 (en) 2004-09-02 2007-05-30 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
WO2006050247A2 (en) 2004-10-29 2006-05-11 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycopegylation of fibroblast growth factor (fgf)
WO2006065582A2 (en) 2004-12-14 2006-06-22 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
US20080261875A1 (en) 2005-01-21 2008-10-23 Eli Lilly And Company Method For Treating Cardiovascular Disease
JP5167473B2 (ja) * 2005-03-03 2013-03-21 コヴェックス・テクノロジーズ・アイルランド・リミテッド 抗血管新生化合物
CN101611053B (zh) * 2006-11-10 2015-06-03 CovX科技爱尔兰有限公司 抗血管生成化合物
US20090098130A1 (en) * 2007-01-05 2009-04-16 Bradshaw Curt W Glucagon-like protein-1 receptor (glp-1r) agonist compounds
KR101476472B1 (ko) * 2007-03-30 2015-01-05 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 ｆｇｆ-21 폴리펩티드 및 그 용도
US8293714B2 (en) * 2008-05-05 2012-10-23 Covx Technology Ireland, Ltd. Anti-angiogenic compounds
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
WO2010065439A1 (en) * 2008-12-05 2010-06-10 Eli Lilly And Company Variants of fibroblast growth factor 21
US20120052069A1 (en) * 2009-05-05 2012-03-01 Amgen Inc Fgf21 mutants and uses thereof
RU2573896C2 (ru) * 2009-10-15 2016-01-27 Дженентек, Инк. Химерные факторы роста фибробластов с измененной рецепторной специфичностью
AR082205A1 (es) * 2010-07-12 2012-11-21 Covx Technologies Ireland Ltd Conjugados de anticuerpos multifuncionales

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005091944A2 (en) * 2004-03-17 2005-10-06 Eli Lilly And Company Glycol linked fgf-21 compounds
WO2005113606A2 (en) * 2004-05-13 2005-12-01 Eli Lilly And Company Fgf-21 fusion proteins
CN101287485A (zh) * 2005-03-03 2008-10-15 爱尔兰考夫克斯科技有限公司 抗血管生成化合物

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022228498A1 (zh) * 2021-04-30 2022-11-03 信达生物制药(苏州)有限公司 一种oxm3储存剂、oxm3制剂及制备方法

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