JP2021517584A - 増殖分化因子15アゴニスト化合物およびその使用方法 - Google Patents

増殖分化因子15アゴニスト化合物およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明において、体重減少を誘発する、ならびに糖尿病、脂質異常症、NASHおよび/または肥満を治療する化合物が提供される。そのような化合物を含有する薬学的組成物ならびにそのような化合物および組成物の治療的使用もまた提供され、そのような化合物は、作用時間の延長および他の有利な特性を有するGDF15アゴニストとして作用する。

Description

発明の詳細な説明
本開示は、生物学および医学に関し、より具体的には、作用時間の延長および他の有利な特性を有する増殖分化因子15(GDF15)アゴニスト化合物を含む化合物および組成物、ならびに、体重減少を誘発するため、ならびに糖尿病、脂質異常症、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)および/または肥満を治療するための、それを使用する方法に関する。
GDF15(MIC−1、NAG−1としても知られている)は、トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGFβ)スーパーファミリーに属するシステイン(Cys、C)ノットタンパク質である。その循環濃度は、癌悪液質および代謝などのさまざまな生物学的機能に関与している(Emmerson et al.(2017)Nat.Med.23:1215−1219を参照)。成熟ヒトGDF15(配列番号1)は112アミノ酸のペプチドである。循環GDF15は、ホモダイマーの各鎖の配列番号1の77位にあるCys残基間の1つの鎖間ジスルフィド結合であると報告されているもの(配列番号2の316位に対応する)を介して、成熟タンパク質(25kDa)のホモダイマーを形成する。ホモダイマーの形成は、GDF15の生物学的活性に必要であると考えられている(国際特許出願公開第WO2017/147743号を参照)。
成熟GDF15ホモダイマーの多くの生物学的機能が報告されている中で、肥満と2型糖尿病(T2D)の治療の可能性により、エネルギー恒常性の調節に注目が集まっている。成熟GDF15ホモダイマー活性とエネルギー恒常性との間の関係は、血清レベルの成熟GDF15の増加が、進行した前立腺癌である個体の体重減少と相関するという観察に基づいている(Emmerson et al.(2017))。
さらに、組換えGDF15を投与することによって、または腫瘍異種移植片からのその発現および分泌を通してマウスのGDF15を増加させると、GDF15が、食物摂取を減らし、エネルギー消費を増やすその能力を介して体重減少を引き起こすことが示された。さらに、GDF15ノックアウトマウスは体重と脂肪量が増加していたのに対し、GDF15を過剰発現しているトランスジェニックマウスは、食餌で誘発される肥満に対して耐性があり、耐糖能の改善を示した。GDF15で誘発される体重減少は、炎症応答を減少させ、げっ歯動物の寿命を延ばすことがさらに示された。
グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)受容体アルファ様(GFRAL)は、GDF15のリガンド結合受容体として同定されている。GFRAL欠損マウスおよび抗GFRAL中和モノクローナル抗体を投与されたラットにおけるGDF15の食欲抑制効果の喪失は、GFRALがGDF15の代謝効果の主な原因であることを例証した(Emmerson et al.(2017))。
成熟循環ヒトGDF15ホモダイマーアゴニストの自然半減期(t1/2)は比較的短い(約2〜3時間)。しかし、国際特許出願公開第WO2015/017710号は、一般に、フラグメント結晶化可能領域(Fc)との結合を含む様々な結合を介してGDF15アゴニストのt1/2を延長することを記載している。
体重減少を誘発するための、ならびにT2D、脂質異常症、NASHおよび/または肥満を治療するための療法において使用できる、作用時間が延長された生物学的に活性なGDF15化合物の必要性が存在している。治療的に望ましい化合物は、GFRAL受容体を刺激し、有利な特性を提供する。1つの有利な特性は、体重減少を誘発することである。別の有利な特性は、所望の治療効果を達成するために週に1回の投薬で、血流中の薬物の安定したレベルを可能にする治療範囲での長期間におけるインビボでの安定性である。さらに望ましい特性には、免疫原性の低下も含まれる。また、望ましい化合物は、有利な物理的および/または化学的な安定性特性を有する。
上記を考慮して、本開示は、延長されたt1/2および他の望ましい特性を有する生物学的に活性なGDF15アゴニスト化合物を記載する。より具体的には、本発明の化合物は、リジッドリンカーを介してGDF15アナログ化合物のアミノ(N)末端に連結されたヒンジレスモノマー(GDF15あたり1つのFcユニット)ヒトIgG4 Fcを有する組換え融合タンパク質であり、それにより、これらの化合物は、各モノマーのGDF15部分間の少なくとも1つの鎖間ジスルフィド結合を介して共有結合的に連結されたホモダイマーを形成する。例示的な化合物である化合物2は、化合物1(配列番号2)の2分子のホモダイマーであり、驚くべきことに、最大約117時間の増強されたt1/2を示し、これは、延長された効能を提供することができ、週に1回の化合物の投与を可能にし得る。本発明の化合物はまた、物理的安定性も強化されている。例えば、化合物2は、プロテインA捕捉プールで低い4.1%の高分子量(HMW)可溶性凝集体を有している。化合物2はまた、pH6.0のクエン酸中40℃で4週間保存した後、1mg/mlにおける低い0.75%の低分子量(LMW)パーセントの成長など、化学的安定性の向上も示した。
一実施形態では、配列番号2を含む化合物が提供される。
別の実施形態では、それぞれが配列番号2を含む2つのモノマーを含むホモダイマーを含む化合物が提供され、これらの2つのモノマーは、第1のモノマーのCys残基と第2のモノマーのCys残基との間の少なくとも1つの鎖間ジスルフィド結合を介して連結されている。
別の実施形態では、配列番号2を有する化合物または配列番号2の2つのモノマーのホモダイマー、および1つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物が提供される。
別の実施形態では、個体において、体重減少を誘発するため、またはT2D、脂質異常症、NASHおよび/または肥満を治療するための方法が提供され、この方法は、配列番号2を有する化合物、配列番号2の2つのモノマーを含むホモダイマー、または配列番号2を有する化合物もしくは配列番号2の2つのモノマーを含むホモダイマーを含む薬学的組成物の有効量を個体に投与することを含む。
別の実施形態では、療法における使用のための、配列番号2または配列番号2の2つのモノマーを含むホモダイマーを含む化合物が提供される。あるいは、体重減少を誘発する際の使用のため、またはT2D、脂質異常症、NASHおよび/もしくは肥満を治療する際の使用するための、配列番号2または配列番号2の2つのモノマーを含むホモダイマーを含む化合物が提供される。
別の実施形態では、体重減少を誘発するための、またはT2D、脂質異常症、NASHおよび/もしくは肥満を治療するための医薬の製造における、配列番号2を含む化合物または配列番号2の2つのモノマーを含むホモダイマーの使用が提供される。
他の実施形態では、ポリペプチドが発現されるような条件下で、配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするcDNA分子を含む哺乳動物細胞を培養すること、および化合物を回収することにより産生される化合物が提供される。さらに、有効量の本発明の化合物または本発明の組成物を週1回個体に投与することを含む、個体において体重減少を誘発するため、またはT2D、脂質異常症、NASHおよび/もしくは肥満を治療するための方法が提供される。
本明細書で使用される場合、「約」は、例えば、明記された濃度、長さ、分子量、pH、配列同一性、時間枠、温度、体積などの値の統計的に意味のある範囲内を意味する。このような値または範囲は、所定の値または範囲の典型的には20%以内、より典型的には10%以内、さらにより典型的には5%以内の大きさの範囲内であり得る。「約」によって包含される許容される変動は、研究下の特定のシステムに依存し、当業者によって容易に理解され得る。
本明細書で使用する場合、「有効量」は、本発明の化合物または本発明の化合物を含む薬学的組成物の量または用量を意味し、患者または対象への単回または複数回用量の投与で、研究者、獣医、医師または他の臨床医が求めている組織、システム、動物、哺乳動物またはヒトに対して、生物学的または医学的応答または所望の治療効果を誘発する。好ましくは、必要とする患者に対する、有効量の本発明の化合物または本発明の化合物を含有する組成物は、体重の正味の減少をもたらす。用量は、より高い初期負荷用量、その後でより少ない用量を含むことができる。
本明細書で使用される場合、「個体」、「患者」および「対象」は、互換的に使用され、動物、特にヒトを意味する。ヒトの場合、個体は、本発明の化合物または組成物の投与から利益を得る疾患、障害または状態を特徴とする。
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、それらの状態の症状および合併症と闘うかまたは緩和する目的でGDF15投与が示される状態を有する個体を管理およびケアすることを意味する。治療は、症状または合併症の発症を予防するため、症状もしくは合併症を軽減するため、または疾患、状態もしくは障害を排除するために、本発明の化合物または本発明の化合物を含む組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む。特に、治療することは、本発明の化合物または本発明の化合物を含む組成物を、それを必要とする個体に投与して、正味の体重減少をもたらすことを含む。治療される個体は、動物、特にヒトであり得る。
本発明の薬学的組成物は、このような治療を必要とする個体に非経口的に投与することができる。非経口投与は、シリンジ、任意でペン様シリンジ、または機械駆動式注射器を用いた皮下、筋肉内または静脈内注射によって実施することができる。あるいは、非経口投与は、注入ポンプを用いて行うことができる。さらに、薬学的組成物は、1つ以上の薬学的に許容される賦形剤を含み得る。そのような薬学的組成物は、当該技術分野で周知である医薬品用の従来の賦形剤を使用する様々な技術のいずれかによって調製することができる(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,21st Edition,University of the Sciences in Philadelphia,Philadelphia,PA,USA(2006)を参照)。
本発明の化合物および組成物は、体重減少を誘発するため、ならびに糖尿病、T2Dに関連する状態、脂質異常症、NASHおよび/または肥満を治療するために有用な1つ以上の追加の治療剤と同時に、個別に、または逐次的に組み合わせて使用できる。特許請求される化合物と組み合わせることができる追加の治療剤の非限定的な例には、インスリンまたはインスリン類似体、ビグアナイド、スルホニル尿素、チアゾリジンジオン、ジペプチジルペプチダーゼ−4(「DPP−4」)阻害剤、ナトリウム依存性グルコース輸送体(SGLT2)阻害剤、グルカゴン様ペプチド−1(GLP−1)またはGLP−1アナログ、胃抑制性ポリペプチド(GIP)またはGIPアナログ、オキシントモジュリン(OXM)またはOXMアナログなどのインクレチン化合物、または前述の薬剤のいずれかの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。本発明の化合物および追加の治療剤(複数可)は、単一の丸剤、カプセル、錠剤、もしくは注射可能な製剤などの同じ送達経路および装置を介して一緒に投与するか、または別々の送達装置もしくは経路で同時に投与するか、または逐次的に投与するかのいずれかで投与することができる。
本発明の化合物は、当業者に公知である様々な技術によって調製することができる。例えば、これらの化合物は、組換えDNA技術を使用したタンパク質または前駆体タンパク質分子の産生を介して調製され得る。cDNAおよび合成DNAを含むDNAは、二本鎖または一本鎖であり得る。本発明のタンパク質をコードするコード配列は、遺伝子コードの重複または縮重の結果として変化し得る。DNAを宿主細胞に導入して、化合物またはその前駆体を生成することができる。宿主細胞は、大腸菌のK12株またはB株などの細菌細胞、酵母細胞などの真菌細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣(「CHO」)細胞などの哺乳動物細胞であり得る。
本発明の化合物またはその前駆体を産生するために、適切な宿主細胞を、発現ベクターなどの発現系で一過性または安定にトランスフェクトまたは形質転換する。発現ベクターは、典型的には、エピソーム、または宿主染色体DNAの一体化した部分のいずれかとして、宿主生物中で複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のDNA配列で形質転換されたこれらの細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、グルタミンシンセターゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼを含有する。
本発明の化合物は、当業者に公知である様々な技術、ならびに以下に記載されている方法によって調製することができる。本発明の化合物を調製するために、記載された各工程のための特定の生合成工程または合成工程を使用してもよいし、使用しなくてもよいし、または異なる方法で組み合わせてもよい。
本明細書のGDF15アナログ化合物は、GFRAL化合物として作用することができ、CHOK1細胞誘導体を使用して哺乳動物細胞発現系で生成される。GDF15タンパク質をコードする遺伝子は、グルタミンシンセターゼ(GS)を含む発現プラスミドバックボーン(pEE12.4ベースのプラスミド)にサブクローニングされる。例示的なFc−GDF15タンパク質である化合物1(配列番号2)をコードするcDNA配列(配列番号16)は、シグナルペプチド配列、METDTLLLWVLLLWVPGSTG(配列番号3)のコード配列とインフレームで融合されて、組織培養培地への所望の産物の分泌を増強する。
発現はウイルス性サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターによって駆動される。CHOK1SV細胞は、エレクトロポレーションおよび適切な量の組換え発現プラスミドを使用して安定してトランスフェクトされ、トランスフェクトされた細胞は適切な細胞密度で浮遊培養において維持される。トランスフェクトされた細胞の選択は、25μMメチオニンスルホキシミン(MSX)を含む無血清培地での増殖によって達成され、約35℃〜37℃および約5〜7%COでインキュベートされる。GDF15タンパク質またはFc−GDF15融合タンパク質は、CHO細胞から培地に分泌される。タンパク質のGDF15部分は互いに結合し、鎖間ジスルフィド結合を介して相互に接続された2つのGDF15タンパク質を含むホモダイマーまたはFc−GDF15融合タンパク質ホモダイマーを作成する。GDF15またはFc−GDF15ホモダイマーは、プロテインAアフィニティクロマトグラフィー、続いて陰イオン交換および疎水性クロマトグラフィーによって精製できる。
採取した培地からのGDF15タンパク質ホモダイマーは、Capto Blue樹脂(GE)に捕捉される。採取した培地からのFc−GDF15タンパク質ホモダイマーは、Mab Select Protein A樹脂(GE)に捕捉される。次に、リン酸緩衝生理食塩水(PBS;pH7.4)などのランニングバッファーまたはTrisを含むランニングバッファーで樹脂を簡単に洗浄して、非特異的に結合した物質を除去する。タンパク質は、10mMクエン酸pH3などの低pH溶液で樹脂から溶出される。GDF15タンパク質を含む画分はプールされ、潜在的なウイルスを不活化するために低pHに保持することができる。0.1M Tris pH8.0などの塩基を加えることで、pHを中性化できる。GDF15タンパク質は、Poros XQ(Life Technologies)などの樹脂を使用する陰イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製できる。GDF15タンパク質は、15カラム体積にわたる50mM Tris、pH8.0中の0〜200mM NaClグラジエントを使用してAEXカラムから溶出される。
Fc−GDF15融合タンパク質は、Capto Phenyl ImpRes疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)カラム(GE Healthcare)を使用することによって、疎水性相互作用クロマトグラフィーによってさらに精製できる。カラムは、チャージ溶液を約0.5M硫酸ナトリウムに調整することで実施され、20mM Tris pH8溶液中の0.5Mから0M硫酸ナトリウムに移行する10カラム容量(CV)勾配を使用して溶出される。HIC後、PBS pH7.4中でのアイソクラティック溶出を伴うSuperdex200(GE Healthcare)に、濃縮されたCapto Phenyl ImpResプールをローディングすることによって、タンパク質はサイズ排除クロマトグラフィーにより、さらに精製できる。
精製されたGDF15化合物は、Planova 20N(旭化成メディカル)などのウイルス保持フィルターを通過し、その後、再生セルロース膜(Millipore)の接線流限外ろ過を使用して、10mMクエン酸、150mM NaCl pH7に濃縮/透析ろ過される。
可溶性ヒトGFRAL細胞外ドメイン(ECD)は、CHOK1細胞誘導体を使用して哺乳動物細胞発現システムにおいて産生される。採取した培地からのポリヒスチジンタグ付きGFRAL ECDは、ニッケル固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー(IMAC)に捕捉される。次に、樹脂をPBS pH7.4などのランニングバッファー、またはTris(pH8.0、500mM NaCl)を含むランニングバッファーで簡単に洗浄して、非特異的に結合した物質を除去する。結合したHISタグ付きGFRAL ECD(配列番号4)は、PBSまたはTRIS(pH8.0、500mM NaCl)中の0−250mMイミダゾールを使用して、10カラム容量にわたって溶出される。HISタグ付きGFRAL ECDは、PBS(pH7.4)中でのアイソクラティック溶出を伴うSuperdex200(GE Healthcare)に濃縮IMACプールをローディングすることによって、サイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製できる。
哺乳動物の抗体発現はグリコシル化をもたらす。典型的には、グリコシル化は、高度に保存されたN−グリコシル化部位の抗体のFc領域において生じる。N−グリカンは、典型的には、アスパラギンに結合する。IgG免疫グロブリンの典型的な定常領域では、N結合型グリコシル化の部位は1つだけである。しかし、この部位は、グリコシル化を防ぐために改変され得るか、またはさらなるもしくは多様なグリコシル化構造のためにさらなる部位が加えられ得る。また、グリコシル化は、哺乳動物細胞において発現される分子の他の領域で時折発生する。
本発明の化合物は、この様式で、または当業者によって容易に決定される同様の方法で調製される。
以下の非限定的な実施例は、限定ではなく例示の目的で提供される。
実施例1:インビトロ受容体親和性
ヒトGFRAL受容体へのヒトGDF15ホモダイマーおよび例示的な化合物2のインビトロ結合パラメータは、表面プラズモン共鳴(SPR)によって決定される。GFRALのECDには、3つのCysリッチドメイン(D1、D2、およびD3)が含まれている。ヒトGDF15のホモダイマー(des−ARN配列番号1、つまり、N末端からAla、Arg、Aspを欠くGDF15)と、Fc−GDF15化合物1のホモダイマーである化合物2(配列番号2)の、HISタグ付きヒトGFRAL ECD(配列番号4)に対する親和性は、SPRによって測定できる。結合速度を表1にまとめる。
ヒトGFRAL ECDに結合するヒトGDF15(des−ARN配列番号1)または化合物2を測定するために、Biacore T200 Instrumentを使用して、ヒトGDF15ホモダイマー(des−ARN配列番号1)と化合物2の、GFRAL ECDへの結合速度を測定する。測定は25℃で実施される。試料をHBS−EP+、pH7.4(GE Healthcare;10mM HEPES pH7.4+150mM NaCl+3mM EDTA+0.05%界面活性剤P20)に溶解する。ヤギ抗ウサギGDF15抗体(R&D)は、アミンカップリングケミストリーを使用して、CM5センサーチップのフローセルに固定化されている。GDF15試料は、ランニングバッファーへの希釈により25μg/mlに調製される。
ランニングバッファー中への希釈によって、1000,500,250,125,62.5,31.3,15.6,7.8,3.9,2.0、および0(ブランク)nMの最終濃度でヒトGFRAL ECD試料を調製する。SPR実験には、次の手順が含まれる:(1)個別のフローセル(Fc2、Fc3およびFc4)上にGDF15試料を捕捉すること、(2)すべてのフローセルにわたって200μlのヒトGFRAL ECDを100μl/分で注入すること、(3)600秒間解離すること、(4)グリシン、pH1.5を20μl/分で10μl(30秒)注入してチップ表面を再生すること、および(5)HBS−EP+の20μl/分での10μl(30秒)の注入を用いてチップ表面を平衡化すること。各濃度のヒトGFRAL ECDを2連で注入する。
データは、標準の二重参照を使用して処理され、Biacore T200評価ソフトウェアを使用して1:1結合モデルに適合し、結合速度(kon、M−1−1)、解離速度(koff、s−1)および最大応答(Rmax;応答単位(RU))を決定した。K=koff/kon(M)の関係から平衡解離定数(K)を計算する。
Figure 2021517584
結果は、ヒトGDF15ホモダイマー(des−ARN配列番号1を含む2つの化合物)がヒトGFRAL ECDに対して7.2nMの親和性を有し、化合物2ホモダイマー(配列番号2を含む2つの化合物)がヒトGFRAL ECDについて8.3nMの親和性を持つことを示す。
実施例2:インビトロ機能活性
GDF15の受容体であるGFRALは、GDNF受容体ファミリーのメンバーであり、単一の膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。GFRALを含むGDNF受容体ファミリーのメンバーは、共受容体RETを利用して信号を変換する。GDNF受容体/RET複合体の刺激は、ERK、AKTおよびSTATリン酸化を含むシグナル伝達ネットワークを活性化することが知られている。
成熟ヒトGDF15バリアントの活性と相対的な効力を評価するために、HEK293細胞(ATCC)に、ヒトGFRAL(NCBI参照配列番号NP_997293.2)およびヒトRET51(NCBI参照配列番号NP_066124.1)を含むCMV駆動の哺乳動物発現ベクターをトランスフェクトし、ジェネティシンおよびピューロマイシン(Life Technologies)の存在下で3週間増殖させ、両方のタンパク質を安定して発現する細胞のプールを作製する。ERK1/2リン酸化の測定がエンドポイントとして選択され、製造業者の指示に従って、AlphaLISA Surefire Ultra Phospho−ERK1/2アッセイキット(Perkin Elmer)およびEnVisionマルチラベルマイクロプレートリーダーモデル2102(Perkin Elmer)を利用してRET活性化を評価する。
簡単に言えば、継代数10〜20の間であるHEK293−hGFRAL/hRET細胞を、ポリ−D−リジンでコーティングされた96ウェルプレートにウェルあたり20,000細胞で播種し、5%CO/95%O雰囲気下、37℃で3日間増殖させる。細胞を無血清培地で4時間インキュベートした後、指示どおりに10分間処理し、アッセイするまで溶解および凍結する。細胞溶解物を4℃で1時間インキュベートすることによって解凍し、オービタルプレートシェーカー上で混合して、白色の384ウェルプレートに移す。AlphaLISAの「2プレート/1インキュベーション」メソッドは、アッセイキットに付属のアクセプターおよびドナーミックスをライセートに追加すること、およびEnVisionプレートリーダー上でのAlphaLISA信号の測定前に、暗所にて室温で8時間インキュベートすることにより利用される。
アッセイのために使用される細胞の各プレートには、アッセイ性能の参照標準としてネイティブのヒト成熟GDF15が含まれている。複数のプレートからのERK1/2リン酸化(pERK1/2)データは、Y軸上の生のAlphaLISA信号データを、次の式を使用して、ヒトGDF15参照標準に対するMaxima%に変換することにより、単一のグラフに収集される。
Maxima%=100*(x−分)/(max−分)、
ここで、分=0でありかつ刺激なしを表し、max=100でありかつ化合物の飽和用量で観察された刺激を表し、x=任意の所定の治療を表す。各化合物のEC50は、GraphPad Prismバージョン7.00の4つのパラメータのロジスティック回帰を伴う可変勾配シグモイド用量反応曲線を使用して決定される。表2の各化合物について列挙されているEC50は、以下の式を用いて各化合物の3つの独立したアッセイについてのEC50の幾何平均を生成することによって決定される。
Figure 2021517584
ヒトGFRALとヒトRET51の両方を発現するHEK293細胞を使用して、化合物2の効力を評価する。ホモダイマーとしてのネイティブのヒト成熟GDF15(配列番号1)は、細胞の各プレート上の参照標準として使用される。テスト項目は、3つの独立した実験で4連で実行される。
Figure 2021517584
実施例3:正常ラットモデルにおけるインビボ効能
肥満は、糖尿病およびインスリン抵抗性に関連する一般的な併存疾患である。GDF15は食物摂取を抑制し、体重減少を誘発し、グルコース恒常性を改善すると報告されている。したがって、GDF15化合物は、体重減少を誘発するための療法や、T2D、脂質異常症、NASH、および/または肥満などの状態のための療法に有効である可能性がある。化合物2を15日間の期間、雄性Sprague Dawleyラットに投与し、毎日の体重および摂食量を測定する。
正常雄性Sprague−Dawleyラット(Envigo;14週齢)は、施設到着時に通常の飼料で飼育され(TD2014;Teklad,Madison,WI)、以下の研究において使用される。12時間の明/暗サイクル(0600点灯)ならびに食餌(TD2014)および水の自由アクセスを有する温度制御した(24℃)施設に、動物を個別に収容する。
施設に最低1週間順応後、動物の各実験群が同様の体重を有するように、ラットをそれらの体重に応じて無作為化する。体重は332〜369グラムの範囲であった。
すべての群には5匹のラットが含まれていた。ビヒクル(PBS)またはビヒクルに溶解した化合物2(用量範囲0.01〜0.3mg/kg)を、皮下(SC)注射(1mL/kg)により、15日間、3日ごとに自由摂食した正常ラットに投与する。
1、4、7、10、および13日目に皮下注射を行う。毎日の体重および摂食量の測定が、研究期間を通して行われる。体重パーセントは、各動物の初期体重から毎日次のように計算される。
体重%=(その日の体重/初期体重)X 100
すべてのデータは、群あたり5匹の動物の平均±SEMとして提示される。体重減少パーセントおよび累積摂食量の有効用量濃度は、非線形フィットツールを使用してGraphPad Prismで決定される。統計分析は、反復測定ANOVA、続いて多重比較のためのダネットの方法を使用して実施する。有意差は、*−p<0.05、**−p<0.01、***−p<0.001、****−p<0.0001で識別される。
Figure 2021517584
正常SD雄性ラットにおける化合物2を用いる長期治療により、用量依存的に、ビヒクルで治療した動物と比較して、食物摂取が統計的に有意に減少し、研究完了時に体重パーセントが統計的に有意に減少した。累積摂食量は、テストされた最高用量で264.48から91.22に減少し、体重減少は7%から26%の減少の範囲である。データは、化合物2が正常SDラットの体重および摂食量を用量依存的な様式で減少させるのに統計的に有意な効果を有することを示しているようである。
実施例4:食事誘発性肥満(DIO)マウスのインビボ効能
体重減少、代謝、身体組成および肝脂肪変性に対する化合物2の効果を調べるために、化合物2をC57/Bl6 DIOマウスに長期的に投与する。
24〜25週齢の雄性C57/Bl6 DIOマウス(Taconic)は、施設到着時にカロリーを豊富に含む食餌で維持し(TD95217;Teklad,Madison,WI)、以下の研究で使用される。12時間の明/暗サイクル(2200点灯)ならびに食餌(TD95217)および水の自由アクセスを有する温度制御した(24℃)施設に、マウスを個別に収容する。施設に最低2週間順応後、動物の各実験群が同様の体重を有するように、マウスをそれらの体重に応じて無作為化する。体重は、40〜50gの範囲である。
すべての群には5匹のマウスが含まれる。ビヒクルまたは化合物2(0.002、0.006、0.02、0.06、および0.2mg/kg)をビヒクル(PBS)に溶解し、3日間ごとに21日間、暗サイクルの開始の30〜90分前に、自由摂食DIOマウスに、皮下(SC)注射(10mL/kg)によって投与する。1、4、7、10、13、16、19および22日目にSC注射を行う。研究を通して、体重および摂食量を毎日測定する。
体重の絶対変化は、分子の最初の注射の前の同じ動物の体重を差し引くことによって計算される。17日目に、動物は0600で絶食し、1300で採血して空腹時血糖およびインスリンを測定する。血糖値はAccuChek(登録商標)血糖測定器(Roche Diabetes Care,Inc.;Indianapolis,IN)によって測定される。インスリンはELISA(MSD,Rockville,MD)によって測定される。インスリン抵抗性指数は次の式で計算される。
HOMA IR=空腹時血漿インスリン(mIUl/L)*(空腹時血糖(mmol/L)/22.5。
24日目に、暗周期の前に動物を屠殺し、肝臓を取り出して凍結する。屠殺時に収集される肝臓のホモジネートから決定される、肝臓トリグリセリド、および血漿分析物を、Hitachi Modular P臨床分析装置で測定する。
Figure 2021517584
Figure 2021517584
Figure 2021517584
化合物2は、用量依存的に雄性DIOマウスの体重および摂食量を減少させ、これは、体重減少の誘発および肥満の治療に使用できることを示す(表4)。化合物2は血清グルコースも低下させ、これは、糖尿病の治療に使用できることを示す(表5)。化合物2はさらにコレステロールを低下させ、これは、脂質異常症の治療に使用できることを示す(表5)。化合物2は肝臓の健康を改善し(血清ALTの低下により実証される)、肝臓のトリグリセリドを減少させ、これは、NASHの治療に使用できることを示す(表5)。17日目に行われた空腹時血糖およびインスリン検査は、インスリン感受性の増加およびインスリン抵抗性指数の低下を示し、これは、糖尿病の治療において化合物2を使用することの可能性をさらに支持する(表6)。
実施例5:様々なFc−GDF15構築物の安定性
医薬品におけるタンパク質凝集は、全体的な生産収量を低下させ、個人に投与した場合に免疫応答を引き起こす可能性があるため、望ましくない。したがって、化合物をモノマー状態、またはこの場合は共有結合したホモダイマーに維持することが好ましい。
様々なGDF15融合タンパク質が凝集および/または分解する傾向をテストするために、様々なFc−GDF15融合タンパク質を哺乳動物CHO細胞で発現させることができる。Fc−GDF15融合タンパク質は、PBS(pH7.4)ランニングバッファーを用いて、Mab Select Protein A(GE;Piscataway、NJ)に捕捉でき、手短に述べると、非特異的に結合した物質を除去するために、ランニングバッファーを用いて簡単に洗浄でき、20mM酢酸と5mMクエン酸、pH3を用いて溶出できる。Fc−GDF15タンパク質を含む画分をプールし、1/10量の1M Tris pH8.0を加えることによってpHを中性化する。
次に、プロテインA捕捉プールをサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって分析して、高分子量凝集体(HMW)%を決定し、これは、どの程度の凝集が発生したかを示す。SEC分離法は、30cm x 0.78cmのサイズのTosoh Bioscience 3000SWXL、5μmカラムで実施される。移動相は流速0.5mL/分のPBSx1、350mM NaCl(pH7.4)である。最初の低濃度試料は10mcLの注入として適用され、214nmの吸収波長でモニターされる。LMW種%は、化学的安定性、または化合物の低分子量分解生成物を示す。
Figure 2021517584
タンデムFc−GDF15融合タンパク質構築物(抗体の2つの類似したFc部分は、エンドツーエンドで互いにつながっており、ヒンジ領域を含んでおり、そしてGDF15分子につながっており、次いでGDF15部分が自己会合して、ダイマーを作製する)、化合物3(2つの分子のホモダイマー、それぞれ配列番号5を含む)は、化合物2の4.1%HMWと比較して60.8%HMWを有する。これは、タンデムFc−GDF15融合タンパク質構築物よりも化合物2の方が物理的安定性が高く、凝集が少なく、免疫原性凝集のリスクが少ないことを示唆している。
ヘテロダイマーFc−GDF15(互いに隣り合って結合され、1つのFc部分(鎖B、配列番号17)がGDF15に接続されている別のFc部分(鎖A、配列番号6)に結合されており、GDF15部分が自己会合してホモダイマーを作製する、抗体の2つの異なるFc部分)、化合物4(2分子のホモダイマー、各分子は配列番号6および配列番号17のヘテロダイマーを含む)は、わずか2.3%のLMWしか有しない化合物2と比較して、49.1%の高いLMW種を有しており、これは、化合物2がより高い化学的安定性を有し、化学的またはタンパク質分解性開裂の傾向が減少することを示唆する。化学的安定性と分解の回避は、長期間にわたって化合物の効力を維持するのに役立つ。また、分解が少ないと、分解副産物が製剤中の有効成分を妨害することによりさらなる効力の問題を引き起こすリスク、または分解副産物が凝集して免疫原性の問題を引き起こすリスクが最小限に抑えられる。
実施例6:二重Fc変異対単一Fc変異の安定性
本発明の化合物のFc部分の独特の構造は、2つの特定の変異を有し、いずれか一方の変異のみを有するFc構築物よりも、高濃度で予想外に優れた安定性と高い溶解度を示す。単一の変異を有する2つのFcsが生成され、IgG4−FcのCH3/CH3結合が破壊され、モノマーFc構築物が作成される。最初は化合物7であり、配列番号2の173位(配列番号9の175位)に対応する完全長ヒトIgG4重鎖の405位のフェニルアラニンがグルタミンに置換された。生成された第2の単一変異体は、化合物8であって、これは、完全長ヒトIgG4重鎖の407位のチロシンがグルタミン酸で置換されたFcであり、配列番号2の175位に対応する(配列番号10の177位に対応)。デュアルFc変異体である化合物5(配列番号7)もまた生成され、化合物7と8の両方のFc変異を含む。化合物5は、追加の2つのアミノ酸APが化合物5のFc領域のN末端に存在することを除いて、化合物2と同じ配列である。化合物2、5、7および8は、モノマーIgG4Fcの形成を確実にするために、ESKYGPPCPPCP(配列番号8)のヒンジ領域を欠いている。
本実施例の化合物は哺乳動物のCHO細胞で発現させ、回収した培地はPBS(pH7.4)ランニングバッファーを含むMab Select Protein A(GE)に捕捉される。非特異的に結合した物質を除去するためにランニングバッファーで簡単に洗浄し、そして20mMの酢酸および5mMのクエン酸、pH3.0で溶出した。GDF15タンパク質を含む画分をプールし、1/10量の1M Tris pH8.0を添加することによりpHを中性化する。
中性化されたプロテインA捕捉プールは、10MWCOのAmicon Ultra 0.5ml遠心濃縮機でpH5.0の10mMクエン酸中でバッファー交換される。次に、シングルおよびダブルFc−GDF15変異体を、10MWCOのAmicon Ultra 0.5ml遠心濃縮器を使用して、10mg/ml以上に濃縮することを試みる。
Figure 2021517584
結果は、化合物7と化合物8のホモダイマーである単一のFc変異体が、化合物5のホモダイマーである二重Fc変異体と比較して溶解度が低下したことを示す。化合物7のホモダイマーは、沈殿および材料損失のために10mg/mlを達成できなかった。化合物7のホモダイマーと比較すると、化合物8のホモダイマーは溶解性の改善を示したが、しかし、濃縮プロセス中に材料の喪失のため、10mg/mlを達成できなかった。化合物5のホモダイマーは、Fcに新しい二重変異を伴い、9.8mg/mlで溶解性を保持していた。モノマーIgG4 Fcのみのコントロールは、12mg/mlまで溶解性であった。
実施例7:フレキシブルリンカーまたはリジッドリンカーの化学的安定性の比較
本発明のGDF15化合物の化学的安定性をテストするために、そのような化合物を次のバッファーに4℃で一晩透析する:10mMクエン酸、pH6(C6)、10mMクエン酸、pH7(C7)、10mM Tris、pH7.0(T7)、10mM Tris、pH8.0(T8)または1xPBS、pH7.4(PBS)。Fc−GDF15融合物の長期安定性を評価するために、1.0mg/mLタンパク質溶液をそれぞれのバッファーに4℃、25℃、40℃で4週間保存し、LMW%を分析SECによって測定する。
SEC分離法は、30cm x 0.78cmのサイズのTosoh Bioscience 3000SWXL、5μmカラムで実施できる。移動相は、PBS、350mM NaCl、pH7.4、流速0.5mL/分である。最初の低濃度試料は10mcLの注入として適用され、214nmの吸収波長でモニターされる。
LMW%で測定される化学的安定性の変化は、時間0の試料と比較して評価される。本質的に上記のように実施された研究により決定されたように、GDF15化合物のLMW成長%は表9に要約されている。
テストされた化合物は、リジッドG4−AP10−G4リンカーを伴う、化合物1のホモダイマーである化合物2(配列番号2)、フレキシブルL5Qリンカー(GGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQ(配列番号12))を伴う、化合物5のホモダイマー(配列番号7)、およびリジッドG4S−AP10−G4Sリンカーを伴う、化合物6のホモダイマー(配列番号11)である。
Figure 2021517584
L5Qリンカーは、AP10リンカーのいずれかよりも25℃および40℃で保存した後のLMW%が高く、AP10(APAPAPAPAPAPAPAPAPAP;配列番号13)リジッドリンカーを含むタンパク質よりも、L5Qフレキシブルリンカーを含むGDF15融合タンパク質についての化学分解の傾向が高いことを示唆する。また、G4S(GGGGS;配列番号14)を含むリンカーを伴う化合物6のホモダイマーは、ほとんどの条件でG4(GGGG;配列番号15)を含むリンカーを伴う化合物2よりも高いLMW%を有しており、そのG4−AP10−G4リンカーを伴う化合物2のより高い化学的安定性の向上を示唆している。
リジッド(化合物2および化合物6)およびフレキシブルリンカー(化合物5)を伴うGDF15化合物の化学的および物理的安定性は、10mg/mlの高濃度で評価できる。化合物は最初に4℃で一晩以下のバッファーに透析する。(a)10mMクエン酸pH6.5、(b)10mMクエン塩pH6.5、150mM NaCl、および(c)10mMクエン塩pH6.5、0.02%ポリソルベート80。150mM NaClおよび0.02%ポリソルベートなどの賦形剤を製剤に添加して、GDF15融合の化学的および物理的安定性への影響をテストする。次に、10,000MWCO、15mlのミリポアスピンコンセントレータを使用して、化合物を10mg/mlに濃縮できる。濃縮後、HMW%およびLMW%は、濃縮タンパク質を使用してSECによって決定できる(t=0)。
SEC分離法は、30cm x 0.78cmのサイズのTosoh Bioscience 3000SWXL、5μmカラムで実施できる。移動相は、PBS、350mM NaCl、pH7.4、流速0.5mL/分であった。10mg/mlの試料をそれぞれのバッファーで1mg/mlに希釈し、10mcLの注入として適用し、214nmの吸収波長でモニターする。
10mg/ml製剤を4℃、25℃、40℃で4週間インキュベートして、ストレス条件下での長期安定性を評価することができる。LMW%およびHMW%は、SECによって4週間の時点(t=4w)で再度決定できる。化学的安定性の変化(LMW%)は、時間0の試料と比較して評価できる。
Figure 2021517584
Figure 2021517584
表10に示すように、フレキシブルリンカーを含む10mg/mlの化合物5のホモダイマーは、25℃と40℃で、リジッドリンカーを伴う化合物6のホモダイマーよりも高いレベルのLMW%を示し、これはより低い化学的安定性を示す。
表11に示すように、フレキシブルリンカーを含む10mg/mlの化合物5のホモダイマーは、リジッドリンカーを伴う化合物6のホモダイマーよりも高いレベルのHMW%を示した。化学的および/または物理的安定性が低いと、沈殿および免疫原性の問題が発生する可能性がある。
実施例8:GDF15化合物の薬物動態学的挙動
化合物2の薬物動態学的挙動はサルでテストされている。GDF15化合物の血漿中濃度は、Eli Lilly and Company(Indianapolis,IN)のELISA法によって決定される。サンドイッチELISAは、捕捉試薬として1または3μg/mLでコーティングされたポリクローナルヤギ抗ヒトGDF15(R&D Systems/AF957)またはモノクローナルマウス抗ヒト/霊長類GDF15抗体(R&D Systems/MAB957)を使用する。次に、GDF15化合物を、マウス抗ヒトIgG4 pFc−HRP抗体(Southern Biotech/9190−05)またはマウス抗ヒトIgG Fc−HRP抗体(Southern Biotech/9200−05)のいずれかで検出する。プレートは、テトラメチルベンジジン(TMB)基質システム(SeraCare/5120)を使用して発色され、酵素反応はTMB Stop Solution(KPL/50−85−04)でクエンチされる。
雄性カニクイザルに、PBS(pH7.4)中の化合物2を0.5mL/kgの単回皮下用量(0.3mg/kg)で投与する。薬物動態学的特徴付けのために、投与前および投与後6、24、48、72、96、168、240、336、408、および504時間で各動物から血液を採取する。
Figure 2021517584
表12のデータは、サルのt1/2が117時間で測定されることを示している。これは、モノマーFc分子の予想外に長いt1/2である。また、サルの薬物動態プロファイルは長期間にわたって安定しており、これは、ヒトの化合物2の薬物動態プロファイルも、治療範囲の長期間にわたって明らかに安定しており、週1回の投与を用いて血流中での定常レベルの薬物を可能にすることを示唆している。
配列
以下の核酸配列および/またはアミノ酸配列は、本開示において言及され、参照のために以下に提供される。
配列番号:1−成熟ヒトGDF15
ARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
配列番号2−融合タンパク質
EAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFQLESRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPGGGGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
配列番号3−リーダー配列
METDTLLLWVLLLWVPGSTG
配列番号4−人工配列
QTNNCTYLREQCLRDANGCKHAWRVMEDACNDSDPGDPCKMRNSSYCNLSIQYLVESNFQFKECLCTDDFYCTVNKLLGKKCINKSDNVKEDKFKWNLTTRSHHGFKGMWSCLEVAEACVGDVVCNAQLASYLKACSANGNPCDLKQCQAAIRFFYQNIPFNIAQMLAFCDCAQSDIPCQQSKEALHSKTCAVNMVPPPTCLSVIRSCQNDELCRRHYRTFQSKCWQRVTRKCHEDENCISTLSKQDLTCSGSDDCKAAYIDILGTVLQV QCTCRTITQSEESLCKIFQHMLHRKSCFNYPTLSNVKGMALYTRKHANKHHHHHH
配列番号5−人工配列
ERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGSGGGGASARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
配列番号6−人工配列
DKTHTCPPCPAPALGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNGTHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
配列番号7−人工配列
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFQLESRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
配列番号8−Fcフラグメント
ESKYGPPCPPCP
配列番号9−人工配列
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFQLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
配列番号:10−人工配列
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLESRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
配列番号:11−人工配列
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFQLESRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGGGGGSAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPGGGGSGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI
配列番号12−人工配列
GGGGQGGGGQGGGGQGGGGQGGGGQ
配列番号13−人工配列
APAPAPAPAPAPAPAPAPAP
配列番号14−人工配列
GGGGS
配列番号15−人工配列
GGGG
配列番号16−人工配列
gaggccgccgggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttcaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtcctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggaaagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttccagctcgagagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtggcggtggtggagctccagccccagctcctgctcctgcaccagcacctgcccccgctccagcacccgcacctggaggagggggcggtgaccactgtcccctggggcctggccggtgttgcagactgcatacagtccgggcctccctggaagacctgggttgggcagattgggtgctctcacctcgcgaggttcaggtgaccatgtgcattggggcttgtccctcacaatttcgcgcagctaacatgcacgcccaaatcaaaacctccctgcaccggcttaaaccggatactgttcctgctccctgctgcgtgccagcatcctacaaccccatggtgctgatccagaagacggatacaggggtgtcactgcagacctatgatgacctcctggccaaagattgccactgtatc
配列番号17−人工配列
DKTHTCPPCPAPALAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Claims (22)

  1. 配列番号2を含む化合物。
  2. 配列番号2からなる化合物。
  3. 請求項1または2に記載の2つの化合物を含むホモダイマーであって、前記化合物が、第1の化合物のシステイン残基と第2の化合物のシステイン残基との間の少なくとも1つの鎖間ジスルフィド結合を介して連結されている、ホモダイマー。
  4. 請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物と、1つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
  5. 患者の体重減少を誘発する方法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項1〜3に記載の化合物または請求項4に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  6. 患者の2型糖尿病を治療する方法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項1〜3に記載の化合物または請求項4に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  7. 患者の肥満を治療する方法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項1〜3に記載の化合物または請求項4に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  8. 患者のNASHを治療する方法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項1〜3に記載の化合物または請求項4に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  9. 患者の脂質異常症を治療する方法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項1〜3に記載の化合物または請求項4に記載の組成物を投与することを含む、方法。
  10. 療法における使用のための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
  11. 体重減少を誘発する際の使用のための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
  12. 2型糖尿病の治療における使用のための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
  13. 肥満の治療における使用のための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
  14. 脂質異常症の治療における使用のための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
  15. NASHの治療における使用のための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物。
  16. 体重減少を誘発するための医薬の製造における、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物の使用。
  17. 2型糖尿病の治療のための医薬の製造における、請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物の使用。
  18. 肥満の治療のための医薬の製造における請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物の使用。
  19. 脂質異常症の治療のための医薬の製造における請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物の使用。
  20. NASHの治療のための医薬の製造における請求項1〜3のいずれか1項に記載の化合物の使用。
  21. 配列番号2のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするcDNA分子を含む哺乳動物細胞を、ポリペプチドが発現されるような条件下で培養し、化合物を回収することによって産生される化合物。
  22. 患者の体重減少を誘発する方法、2型糖尿病、肥満、NASHおよび/または脂質異常症を治療する方法であって、それを必要とする患者に有効量の請求項1〜3の化合物または請求項4の組成物を週1回投与することを含む方法。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5977814B2 (ja) 2011-04-08 2016-08-24 アムジエン・インコーポレーテツド 増殖分化因子15(gdf−15)を使用して代謝障害を治療または改善する方法
MA38873B1 (fr) 2013-07-31 2018-11-30 Amgen Inc Constructions contenant le facteur 15 de différentiation de croissance (gdf-15)
PE20201350A1 (es) 2018-04-09 2020-11-30 Amgen Inc Proteinas de fusion del factor de diferenciacion de crecimiento 15
US20230210950A1 (en) 2019-10-04 2023-07-06 Amgen Inc. Use of gdf15 for treating cardiometabolic syndrome and other conditions
WO2021076620A1 (en) 2019-10-15 2021-04-22 Eli Lilly And Company Recombinantly engineered, lipase/esterase-deficient mammalian cell lines
CA3226178A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Jiangyu YAN Gdf15 fusion proteins and uses thereof
WO2023154953A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Gdf15 polypeptides for treating and preventing autoimmune diseases

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015506373A (ja) * 2012-01-26 2015-03-02 アムジエン・インコーポレーテツド 成長分化因子15(gdf−15)ポリペプチド
JP2016532690A (ja) * 2013-07-31 2016-10-20 アムジエン・インコーポレーテツド 増殖分化因子15(gdf−15)の構築物
WO2017196647A1 (en) * 2016-05-10 2017-11-16 Janssen Biotech, Inc. Gdf15 fusion proteins and uses thereof
JP2017538395A (ja) * 2014-10-31 2017-12-28 エヌジーエム バイオファーマシューティカルズ インコー 代謝障害を処置するための組成物及びその使用方法
JP2018538335A (ja) * 2015-12-22 2018-12-27 ノバルティス アーゲー 増殖分化因子15(gdf−15)を使用して代謝障害を処置するまたは軽快させる方法

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5288931A (en) * 1991-12-06 1994-02-22 Genentech, Inc. Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation
GB9912350D0 (en) * 1999-05-26 1999-07-28 European Molecular Biology Lab Embl Modified cytokine
FI117667B (fi) * 2001-07-05 2007-01-15 Univ Zuerich Farmaseuttinen koostumus, joka soveltuu käytettäväksi ortopediassa ja hammaslääketieteessä
US20090042780A1 (en) 2004-05-20 2009-02-12 Acceleron Pharma Inc Modified TGF-Beta Superfamily Polypeptides and Related Methods
US20060074225A1 (en) 2004-09-14 2006-04-06 Xencor, Inc. Monomeric immunoglobulin Fc domains
EP2571510B1 (en) * 2010-05-21 2018-08-08 XL-protein GmbH Biosynthetic proline/alanine random coil polypeptides and their uses
CA2826142A1 (en) * 2011-02-03 2012-08-09 Xoma Technology Ltd. Methods and materials for enhancing functional protein expression in bacteria
WO2013148117A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods of use for treating metabolic disorders
AU2013364133B2 (en) * 2012-12-21 2018-10-11 Aveo Pharmaceuticals, Inc. Anti-GDF15 antibodies
KR101993714B1 (ko) 2013-01-30 2019-06-28 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. 대사 장애를 치료하는데 이용하기 위한 조성물과 방법
SG11201600734YA (en) 2013-07-31 2016-02-26 Amgen Inc Stabilization of fc-containing polypeptides
US20170204149A1 (en) 2014-06-23 2017-07-20 Novartis Ag Hsa-gdf-15 fusion polypeptide and use thereof
EP3851445A1 (en) 2014-06-23 2021-07-21 Novartis AG Site specific protein modifications
JP6696915B2 (ja) 2014-06-24 2020-05-20 ノヴォ ノルディスク アー/エス Mic−1融合タンパク質及びその使用
MD20170020A2 (ro) 2014-07-30 2017-07-31 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compoziţii şi metode utilizate pentru tratamentul tulburărilor metabolice
CA2964808C (en) 2014-10-30 2023-06-27 Acceleron Pharma Inc. Methods and compositions using gdf15 polypeptides for increasing red blood cells
WO2016131893A1 (en) 2015-02-18 2016-08-25 Medimmune Limited Incretin fusion polypeptides
CN107921089A (zh) 2015-04-02 2018-04-17 詹森生物科技公司 原毒素‑ii变体及使用方法
US11105818B2 (en) 2016-01-15 2021-08-31 Novo Nordisk A/S MIC-1 receptor and uses thereof
EP3413620A4 (en) 2016-02-29 2019-01-16 Huawei Technologies Co., Ltd. VIDEO OPTIMIZATION PROCEDURE, USER DEVICE UNIT AND NETWORK DEVICE UNIT
JP2019510739A (ja) 2016-02-29 2019-04-18 イーライ リリー アンド カンパニー Gfral受容体療法
US20170299608A1 (en) 2016-03-04 2017-10-19 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating body weight

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015506373A (ja) * 2012-01-26 2015-03-02 アムジエン・インコーポレーテツド 成長分化因子15(gdf−15)ポリペプチド
JP2016532690A (ja) * 2013-07-31 2016-10-20 アムジエン・インコーポレーテツド 増殖分化因子15(gdf−15)の構築物
JP2017538395A (ja) * 2014-10-31 2017-12-28 エヌジーエム バイオファーマシューティカルズ インコー 代謝障害を処置するための組成物及びその使用方法
JP2018538335A (ja) * 2015-12-22 2018-12-27 ノバルティス アーゲー 増殖分化因子15(gdf−15)を使用して代謝障害を処置するまたは軽快させる方法
WO2017196647A1 (en) * 2016-05-10 2017-11-16 Janssen Biotech, Inc. Gdf15 fusion proteins and uses thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE, vol. 9, JPN6021034796, 18 October 2017 (2017-10-18), pages 8732, ISSN: 0004706556 *

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