JP2019513224A - 体重を調節するための組成物及び方法 - Google Patents

体重を調節するための組成物及び方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、体重の調節における役割を果たす、タンパク質複合体の3次元構造を含むタンパク質複合体を提供する。さらに、その3次元構造を含めた該タンパク質複合体及びその構成成分は、体重を制御するために使用することができる薬剤を特定するのに使用される。【選択図】図１

Description

(関連出願の相互参照)
本願は、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる、2016年3月4日に出願された米国特許仮出願第62/304,141号の優先権の利益を主張する。
(序論)
体重減少は、いくつかの疾患及び状態に関連する。例えば、意図しない体重減少は、悪液質などのある種の消耗性疾患に関連する、及び/又は全身性炎症又は急性炎症反応に関連する可能性がある。悪液質は、典型的には、体重の減少、筋萎縮、疲労、脱力感、及び著しい食欲の喪失を特徴とし、いくつかの慢性疾患(例えば、癌、慢性腎疾患、慢性閉塞性肺疾患、AIDS、結核、慢性炎症性疾患、敗血症、及び他の形態の全身性炎症、筋ジストロフィーなどの筋消耗、並びに神経性食欲不振症として公知である摂食障害)を患う患者の病的状態に大きく寄与し得る。例えば、末期癌では、悪液質は、よく見られ(大抵の病状末期の癌患者に生じ)、すべての癌関連死の約4分の1を占める。代謝過程(例えば、筋肉に直接的に作用し、その質量及び/又は形成を低下させる)、及び食物摂取低下(例えば、脂肪及び/又は筋肉の喪失をもたらす)は、悪液質の発生及び/又は進行を駆動する可能性がある。悪液質は、前悪液質、悪液質、及び不応性悪液質と呼ばれている段階を経て進行する可能性がある。
体重の調節は、複雑な多因子性プロセスであり、体重を調節する及び意図しない体重減少を制御することができる薬剤(例えば、体重を調節する及び意図しない体重減少を制御することができる薬剤が含まれる)、並びにこうした薬剤を特定するための方法は、大きな関心事項である。
(概要)
本開示は、体重の調節における役割を果たすタンパク質複合体を提供する。本開示のタンパク質複合体の成分は、体重を調節するために使用することができる。さらに、このタンパク質複合体及びその成分は、体重を制御するために使用することができる薬剤を特定するのに使用される。本明細書で提供するのはまた、意図しない体重減少を治療及び/又は予防するための方法である。さらに、GDF15レベルが上昇した又はGDF15レベルの上昇を起こすリスクがある対象におけるGDF15活性を低下させるための方法も開示する。
ある種の実施態様では、GDNFファミリー受容体α様(GFRAL)タンパク質と、GDF15タンパク質とを含む、単離された複合体が提供される。GFRALタンパク質は、GFRALを発現するように遺伝子改変された細胞の表面上に存在することができる。ある種の実施態様では、GFRALタンパク質は、GFRALを発現するように遺伝子改変された細胞から精製される。GFRALタンパク質は、支持体上に固定することができる。ある種の実施態様では、単離された複合体はまた、RETタンパク質を含むことができる。
ある種の実施態様では、GDF15、GFRAL、及びRETタンパク質のうちの少なくとも1つは、異種タンパク質と融合させることができる。GDF15、GFRAL、及びRETタンパク質と融合される異種タンパク質は、Ig Fc、アルブミン、及びマルトース結合タンパク質からなる群から独立に選択することができる。ある種の実施態様では、GDF15、GFRAL、及びRETタンパク質のうちの少なくとも1つと融合されるアルブミンは、ヒト血清アルブミンであり得る。
ある種の実施態様では、GDF15タンパク質及びGFRALタンパク質のうちの少なくとも1つは、検出可能なように標識することができる。
ある種の実施態様では、該複合体は、結晶である。この結晶は、いくつかの態様では、本明細書に記載した原子座標を有する。この結晶は、a=75.4Å、b=88.8Å、c=121.3Åの胞単位寸法を有する、及び/又は約2.20Åの分解能を有することができる。
本明細書で提供するのはまた、単離されたGDF15タンパク質と、GFRALタンパク質を発現するように遺伝子改変された組換え細胞とを含む組成物である。ある種の実施態様では、この組換え細胞は、RETを発現するように遺伝子改変することができる。
ある種の実施態様では、該組換え細胞は、レポーター構築物を含むことができる。このレポーター構築物は、レポーターをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含むことができ、ここでは、該プロモーターは、GFRALに対するGDF15タンパク質の結合によるRETの活性化時に、該レポーターの発現を誘導する。
GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する薬剤を特定するための方法も開示する。この方法は、GFRALの細胞外ドメインに対する候補薬剤の結合について検定することを含むことができ、ここでは、GFRALタンパク質と結合する候補薬剤が、GFRALタンパク質と結合する薬剤であると特定され、ここでは、候補薬剤の結合は、GFRALタンパク質の細胞外ドメインに対するGDF15タンパク質の結合と比較される。ある種の実施態様では、候補薬剤は、GDF15タンパク質と類似の親和性で、GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する。別の実施態様では、該方法は、本明細書に記載した原子座標によって定義されるGDF15タンパク質との複合体の3次元構造を構築することと;該3次元構造及びモデリング方法を用いて、GFRALタンパク質と結合する候補薬剤を特定することと;該候補薬剤を、GFRALタンパク質の細胞外ドメインとの結合について検定することと;該候補薬剤の結合を、GFRALタンパク質の細胞外ドメインに対するGDF15タンパク質の結合と比較する(ここでは、該候補薬剤が、GDF15タンパク質と類似の親和性で結合する場合に、該候補薬剤は、GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する薬剤であると特定される)こととを含むことができる。ある種の場合では、GDF15は、検出可能なように標識することができる。
例示的方法では、GFRALは、支持体上に固定することもできるし、GFRALを発現するように遺伝子改変された組換え細胞によって発現させることもできる。ある種の場合では、この組換え細胞は、RETを発現するように遺伝子改変することができる。
追加的実施態様では、組換え細胞は、レポーターをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含むレポーター構築物を含むことができ、ここでは、該プロモーターは、RETの活性化時に、該レポーターの発現を誘導し、また、この方法は、レポーターの発現について検定することを含むことができ、ここでは、陰性対照と比較した場合のレポーターの発現増大が、前記薬剤を、GFRALタンパク質と結合してRETを活性化する薬剤であると特定する。
さらなる追加的実施態様では、前記GFRALタンパク質の細胞外ドメインは、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含む。この実施態様では、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基は、配列番号:9のGLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、及びGLN200からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当し得る。あるいは又はさらに、前記GFRALタンパク質の細胞外ドメインは、GFRALタンパク質とRETタンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含む。この実施態様では、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基は、配列番号:9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298 SER299からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当し得る。
GFRALタンパク質とRETタンパク質を発現するように遺伝子改変された組換え細胞を開示する。ある種の例では、GFRALタンパク質又はRETタンパク質のうちの少なくとも1つを、異種タンパク質と融合させることができる。いくつかの例では、GFRALを、異種タンパク質と融合させることができる。他の場合では、RETを、異種タンパク質と融合させることができる。いくつかの場合では、GFRALとRETとの両方を、Ig Fc、アルブミン、及びマルトース結合タンパク質からなる群から独立に選択することができる異種タンパク質と融合させることができる。いくつかの実施態様では、GFRALタンパク質又はRETタンパク質のうちの少なくとも1つを、検出可能なように標識することができる。
GDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合を調節する薬剤を特定するための方法も提供する。この方法は、候補薬剤を、GFRALを発現するように遺伝子改変された組換え細胞と接触させることと(ここでは、接触は、GDF15の存在下である);GDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合のレベルを分析することと(ここでは、候補薬剤の存在下でのGDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合のレベルの、候補薬剤の非存在下でのGDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合のレベルと比較した場合の変化によって、該候補薬剤は、GDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合を調節する薬剤であると特定される)を含むことができる。別の実施態様では、この方法は、本明細書に記載した原子座標によって定義されるGDF15タンパク質との複合体の3次元構造を構築することと;該3次元構造及びモデリング方法を用いて、GDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合を調節する候補薬剤を特定することと;該候補薬剤を、GFRALタンパク質を発現するように遺伝子改変された組換え細胞と接触させる(ここでは、該接触は、GDF15タンパク質の存在下である)ことと;GDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合のレベルを分析することとを含み、ここでは、該候補薬剤の存在下でのGDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合のレベルの、該候補薬剤の非存在下でのGDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合のレベルと比較した場合の変化によって、該候補薬剤は、GDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合を調節する薬剤であると特定される。ある種の場合では、組換え細胞は、RETを発現するように遺伝子改変することができる。
ある種の実施態様では、組換え細胞は、レポーターをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含むレポーター構築物を含むことができ、ここでは、プロモーターは、RETの活性化時に、該レポーターの発現を誘導し、前記検定は、レポーターの発現について検定することを含み、ここでは、該薬剤の非存在下での発現と比較した場合のレポーターの発現の変化によって、該薬剤は、GDF15のGFRALに対する結合を調節する薬剤であると特定される。
ある種の実施態様では、薬剤は、GDF15のGFRALに対する結合を阻害することができ、該薬剤は、GDF15-GFRAL結合のアンタゴニストであると特定される。他の実施態様では、薬剤が、GDF15のGFRALに対する結合を増大させる場合に、該薬剤が、GDF15-GFRAL結合のアゴニストであると特定される。
さらなる追加的実施態様では、組換え細胞によって発現されるGFRALタンパク質は、該GFRALタンパク質の細胞外ドメインを含む。したがって、いくつかの実施態様では、該GFRALタンパク質の細胞外ドメインは、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含む。この実施態様では、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基は、配列番号:9のGLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、及びGLN200からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当し得る。あるいは又はさらに、該GFRALタンパク質の細胞外ドメインは、GFRALタンパク質とRETタンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含む。この実施態様では、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基は、配列番号:9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298 SER299からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当し得る。
GFRALタンパク質のRETタンパク質に対する結合を調節する薬剤を特定するための方法も提供する。この方法は、候補薬剤を、GFRALとRETを発現するように遺伝子改変された組換え細胞と接触させることと;GFRALのRETに対する結合のレベルを分析することと;を含むことができ;ここでは、該候補薬剤の存在下でのGFRALタンパク質とRETタンパク質との結合のレベルの、該候補薬剤の非存在下でのGFRALタンパク質とRETタンパク質との結合のレベルと比較した場合の変化によって、該候補薬剤は、GFRALタンパク質のRETタンパク質に対する結合を調節する薬剤であると特定される。別の実施態様では、この方法は、本明細書に記載した原子座標によって定義されるGDF15タンパク質との複合体の3次元構造を構築することと;該3次元構造及びモデリング方法を用いて、GFRALタンパク質のRETタンパク質に対する結合を調節する候補薬剤を特定することと;該候補薬剤を、GFRALタンパク質とRETタンパク質を発現するように遺伝子改変された組換え細胞と接触させることと;GFRALタンパク質とRETタンパク質との結合のレベルを分析することと;を含み、ここでは、該候補薬剤の存在下でのGFRALタンパク質とRETタンパク質との結合のレベルの、該候補薬剤の非存在下でのGFRALタンパク質とRETタンパク質との結合のレベルと比較した場合の変化によって、該候補薬剤が、GFRALタンパク質のRETタンパク質に対する結合を調節する薬剤であると特定される。
さらに、いくつかの実施態様では、組換え細胞によって発現されるGFRALタンパク質は、該GFRALタンパク質の細胞外ドメインを含む。いくつかの態様では、該GFRALタンパク質の細胞外ドメインは、GFRALタンパク質とRETタンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含む。この実施態様では、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基が、配列番号:9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当し得る。
ある種の実施態様では、対象における意図しない体重減少を治療する、又は意図しない体重減少を起こすリスクがある対象における意図しない体重減少を予防する方法が開示される。この方法は、i)GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する薬剤;及びii)GFRALの細胞外ドメイン(GFRAL-ECD)のうちの少なくとも1つを対象に投与することを含むことができ、ここでは、該薬剤又はGFRAL-ECDは、対象における意図しない体重減少を治療する、又は発生を予防するのに有効な量で投与される。
本明細書で提供するのはまた、GDF15タンパク質活性の増大を有する、又はGDF15タンパク質活性の増大を起こすリスクがある対象におけるGDF15タンパク質活性を低下させる方法である。この方法は、i)GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する薬剤;及びii)GFRALの細胞外ドメイン(GFRAL-ECD)のうちの少なくとも1つを対象に投与することを含むことができ、ここでは、該薬剤又はGFRAL-ECDは、対象におけるGDF15タンパク質活性を低下させるのに有効な量で投与される。
対象における悪液質を治療する、又は悪液質のリスクがある対象における悪液質を予防する方法も提供する。この方法は、i)GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する薬剤;及びii)GFRALの可溶性細胞外ドメイン(GFRAL-ECD)のうちの少なくとも1つを対象に投与することを含むことができ、ここでは、該薬剤又はGFRAL-ECDは、対象における悪液質を治療する、又は発生を予防するのに有効な量で投与される。
ある種の実施態様では、GFRAL-ECDが投与される場合、GFRAL-ECDは、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含む。この実施態様では、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基は、配列番号:9のGLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、及びGLN200からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当し得る。あるいは又はさらに、GFRAL-ECDは、GFRALタンパク質とRETタンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含み、ここでは、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基は、配列番号:9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当し得る。
ある種の実施態様では、前記薬剤は、可溶性GFRAL-ECDを含むことができる。ある種の実施態様では、GFRAL-ECDは、異種タンパク質と融合させることができる。異種タンパク質は、Ig Fc、アルブミン、及びマルトース結合タンパク質からなる群から選択することができる。例えば、アルブミンは、ヒト血清アルブミンであり得る。
他の実施態様では、前記薬剤が投与される場合、該薬剤は、GFRALの細胞外ドメインと結合する抗体であり得る。該抗体が結合するGFRALタンパク質の細胞外ドメインは、いくつかの実施態様では、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含む。この実施態様では、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基は、配列番号:9のGLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、及びGLN200からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当し得る。あるいは又はさらに、該抗体が結合するGFRALタンパク質の細胞外ドメインは、GFRALタンパク質とRETタンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含む。この実施態様では、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基は、配列番号:9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当し得る。
本明細書で提供するのはまた、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質とを含む結晶である。いくつかの実施態様では、該結晶は、X線放射を回折して、おおよそ次のセル定数:a=75.4Å、b=88.8Å、c=121.3Å、及び空間群P21を有する複合体の3次元構造を表す回折パターンをもたらす。いくつかの実施態様では、該結晶は、約2.20Åの分解能でX線放射を回折する。該結晶はまた、配列番号:23のアミノ酸配列を有するGFRALタンパク質、及び/又はホモ二量体の形態のGDF15タンパク質を含むことができる。該結晶はまた、本明細書に記載した原子座標を有することができる。本明細書で提供される結晶は、GDF15タンパク質のアンタゴニストの特定のためのスクリーニングアッセイにおいて使用することができる。
提供されるのはまた、本明細書で提供される結晶を含む組成物である。
さらに提供されるのは、GDF15タンパク質と結合する能力をもつバリアントGFRALタンパク質を特定するための方法である。この方法は、本明細書で提供される原子座標によって定義される、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質とを含む複合体の3次元構造を構築することと;該3次元構造及びモデリング方法を用いて、GFRALタンパク質を変異させるための部位を特定し、該部位を変異させてバリアントGFRALタンパク質を産生することと;該バリアントGFRALタンパク質を生成することと;該バリアントGFRALタンパク質を分析して、GDF15タンパク質と結合するその能力を決定することとを含むことができる。
いくつかの実施態様では、前記GFRALタンパク質を変異させるための部位は、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインに位置する。この実施態様では、該ドメインは、配列番号:9のGLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、及びGLN200からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基を含むことができる。
いくつかの実施態様では、前記GFRALタンパク質を変異させるための部位は、配列番号9のGLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、及びGLN200からなる群から選択される位置に相当するアミノ酸である。
さらに提供されるのは、RETタンパク質と結合する能力をもつバリアントGFRALタンパク質を特定するための方法である。この方法は、本明細書に記載した原子座標によって定義される、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質とを含む複合体の3次元構造を構築することと;該3次元構造及びモデリング方法を用いて、GFRALタンパク質を変異させるための部位を特定し、該部位を変異させてバリアントGFRALタンパク質を産生することと;該バリアントGFRALタンパク質を生成することと;該バリアントGFRALタンパク質を分析して、RETタンパク質と結合するその能力を決定することとを含むことができる。
いくつかの実施態様では、前記GFRALタンパク質を変異させるための部位は、GFRALタンパク質とRETタンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインに位置する。この実施態様では、該ドメインは、配列番号:9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基を含むことができる。
いくつかの実施態様では、前記GFRALを変異させるための部位は、配列番号9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298からなる群から選択される位置に相当するアミノ酸である。
さらに提供されるのは、GFRALタンパク質と結合する能力をもつバリアントGDF15タンパク質を特定するための方法である。この方法は、本明細書に記載した原子座標によって定義される、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質とを含む複合体の3次元構造を構築することと;該3次元構造及びモデリング方法を用いて、GDF15タンパク質を変異させるための部位を特定し、該部位を変異させてバリアントGDF15タンパク質を産生することと;該バリアントGDF15タンパク質を生成することと;該バリアントGDF15タンパク質を分析して、GFRALタンパク質と結合するその能力を決定することとを含むことができる。
いくつかの実施態様では、前記GDF15タンパク質を変異させるための部位は、GDF15タンパク質とGFRALタンパク質との間の界面を伴うGDF15ドメインに位置する。この実施態様では、該ドメインは、配列番号:6のSER35、LEU34、THR94、GLY95、GLN40、VAL96、LEU98、PRO36、VAL87、LEU88、ILE89、ASP102、THR100、PRO85、及びMET86からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基を含むことができる。
いくつかの実施態様では、前記GDF15タンパク質を変異させるための部位は、配列番号:6のSER35、LEU34、THR94、GLY95、GLN40、VAL96、LEU98、PRO36、VAL87、LEU88、ILE89、ASP102、THR100、PRO85、及びMET86からなる群から選択される位置に相当するアミノ酸である。
本明細書で提供するのはまた、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質とを含む複合体(GFRAL/GDF15複合体)又はGFRALタンパク質とRETタンパク質とを含む複合体(GFRAL/RET複合体)の形成を阻害する薬剤を生成するための方法である。この方法は、GFRALタンパク質と、2種以上の薬剤のうちの1種とを含む複合体(GFRAL/薬剤複合体)の2つ以上の3次元構造を得ることと;3次元GFRAL/薬剤複合体構造のそれぞれを、GFRAL/GDF15複合体の3次元構造と、又はGFRAL/RET複合体の3次元構造と比較することと;GFRAL/薬剤複合体と、GFRAL/GDF15複合体の3次元構造との、又はGFRAL/RET複合体の3次元構造との、構造的類似性に基づいて、該2種以上の薬剤のうちの少なくとも1種を選択することと;少なくとも1gの該薬剤を生成することとを含むことができる。
いくつかの実施態様では、前記少なくとも1種の薬剤は、GDF15タンパク質又はRETタンパク質と結合するのと同じ又はそれよりも高い親和性でGFRALタンパク質と結合する場合に選択される。
さらに、先の方法は、2種以上のGFRAL/薬剤複合体中のGFRALタンパク質のアミノ酸を、配列番号:9のGLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、及びGLN200からなる群から選択されるGFRAL/GDF15複合体中のGFRALタンパク質のアミノ酸と比較することを含む比較ステップを含む。あるいは又はさらに、前記比較は、2種以上のGFRAL/薬剤複合体中のGFRALタンパク質のアミノ酸を、配列番号:6のSER35、LEU34、THR94、GLY95、GLN40、VAL96、LEU98、PRO36、VAL87、LEU88、ILE89、ASP102、THR100、PRO85、及びMET86からなる群から選択されるGFRAL/GDF15複合体中のGDF15タンパク質のアミノ酸と比較することを含むことができる。さらに、あるいは又はさらに、前記比較ステップは、2種以上のGFRAL/薬剤複合体中のGFRALタンパク質のアミノ酸を、配列番号9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298からなる群から選択されるGFRAL/RET複合体中のGFRALタンパク質のアミノ酸と比較することを含むことができる。
いくつかの実施態様では、GFRAL/GDF15複合体の3次元構造は、本明細書で提供される原子座標によって定義される。
いくつかの実施態様では、比較することは、モデリングプログラムを用いることを含む。
いくつかの実施態様では、該方法によって特定された薬剤は、組換え細胞内で生成される。この実施態様では、生成される薬剤の量は、少なくとも10g、少なくとも100g、又は少なくとも1,000gである。
(図面の簡単な説明)
図1A、1B、及び1Cは、ヒトGDF15タンパク質(図1A;配列番号:6)、Fc-hGDF15(図1B;配列番号:7及び8)、及びHSA-hGDF15(図1C;配列番号:24)のアミノ酸配列を表す。 図2A〜2Dは、ヒトGFRALタンパク質(図2A;配列番号:9)、マウスGFRALタンパク質(図2B;配列番号:10)、ラットGFRALタンパク質(図2C;配列番号:11)、及びサルGFRALタンパク質(図2D;配列番号:12)の、タンパク質配列を表す。図2Eは、由来ヒト、マウス、ラット、及びサルのGFRALタンパク質(配列番号:9〜12)のアラインメントを表す。 図3A〜3Hは、種々のRET9及びRET51タンパク質配列(配列番号:13〜20)を表す。 図4は、GFRAL-Fcタンパク質配列(配列番号:21)を図示する。 図5は、Fc-GDF15タンパク質と、マウスGFRALタンパク質との特異的な結合を表す。 図6A及び6Bは、マウス組織におけるGFRAL mRNAの発現の分析からの結果を図示する。 図7A及び7Bは、125I-GDF15と、ヒトGFRALタンパク質を発現している細胞との結合を表す。 図8は、GFRAL-RET受容体複合体を介してGDF15によって媒介される細胞応答を図示する。 図9A〜9Dは、4つの種(図9A:ヒト、図9B:カニクイザル、図9C:ラット、図9D:マウス)由来のGFRAL-RET受容体複合体を介してヒトGDF15によって媒介される細胞応答を図示する。 図10は、GDF15タンパク質、GFRAL-Fcタンパク質、及び抗体1M03が、GFRAL発現細胞に対する結合について125I-GDF15と競合することを示す。 図11は、GDF15に対する細胞応答に対する、GFRAL-GDF15結合の阻害剤(GFRAL-Fc及び1M03抗体)の効果を表す。 図12は、GFRAL ECDタンパク質に対する結合についてGDF15タンパク質と競合する抗GFRAL ECD抗体を図示する。 図13は、抗GFRAL ECD抗体が、GDF15介在性のGFRAL-RET受容体複合体活性化を阻害することを図示する。 図14は、GFRALが、GDF15とは独立してRETと相互作用することを示す。 図15は、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質とを有する複合体の例示的な結晶を示す。 図16は、例示的なGFRAL電子密度マップを図示する。 図17は、非対称性GFRAL/GDF15結晶単位で形成された、GFRAL/GDF15二量体の例示的なリボン図を示す。GFRALタンパク質ドメインD2及びD3は、GFRAL D2及びGFRAL D3として示される。 図18は、非対称性GFRAL/GDF15結晶単位で形成された、GFRAL/GDF15ヘテロ-二量体の二量体の例示的なリボン図を示す。GFRALタンパク質ドメインD2及びD3は、GFRAL D2及びGFRAL D3として示される。 図19A〜19Bは、GFRAL/GDF15ヘテロ-二量体の二量体の異なる表面表現を示す。 図20は、GDF15と相互作用するGFRAL残基を示す。 図21A〜21Dは、GFRAL/GDF15界面を図示する。GFRALタンパク質ドメインD2及びD3は、GFRAL D2及びGFRAL D3として示される。 図22A〜22Bは、GFRALタンパク質とGFRα1の、リボン図として表した重ね合わせの異なる態様を示す。 図23A〜23Dは、RET/GFRAL/GDF15モデルにおけるGFRALタンパク質とRETタンパク質との相互作用の異なる態様を図示する。 図24A〜24Bは、GFRALタンパク質のRET界面上のアミノ酸を図示する。 図25は、種々のGFRALタンパク質間の配列アラインメントを示す。配列番号:9及び31から40を表す。 図26は、種々のGDF15タンパク質間の配列アラインメントを示す。配列番号:25及び41から51を表す。
本発明をさらに記載する前に、本発明が、記載する特定の実施態様に限定されない、したがって、当然、変わり得ることを理解するべきである。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書に使用される専門用語が、単に特定の実施態様を説明する目的であるに過ぎず、限定の意図はないことも理解するべきである。
値の範囲が提供される場合、その範囲の、及びその規定された範囲内の任意の他の規定された又は間にある値の、上限と下限の間の、文脈によってそうではないと明確に指示されない限り下限の単位の10分の1までの、間にあるそれぞれの値は、本発明に包含されることが理解されよう。これらの、より小さい範囲の上限と下限は、独立に、より小さい範囲内に含めることができ、また、本発明の範囲内に包含され、規定された範囲内のいかなる具体的に除外される制限も受ける。規定された範囲が、制限のうちの片方又は両方を含む場合、これらの含まれる制限のうちの一方又は両方を除く範囲も、本発明に含まれる。
別段の定義がない限り、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載した方法及び材料に類似する又は同等の方法及び材料を、本発明の実践又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を、これから記載する。本明細書で言及したすべての刊行物を、刊行物が引用されたものと関連する方法及び/又は材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に組み込む。
本明細書で及び添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形(ある〜(「a」、「an」)及び該〜「the」)には、文脈によってそうではないと明確に指示されない限り、複数の指示物が含まれることに留意しなければならない。したがって、例えば、「該タンパク質」に対する言及には、1以上のタンパク質、及びその他への言及が含まれる。特許請求の範囲を、何らかの任意要素を除外するために起草できることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、請求項要素の記述又は「消極的」限定の使用に関連して、「唯一」、「〜のみ」などのような排他的な用語法の使用のための先行詞としての役割を果たすものとする。
本明細書に取り上げた刊行物は、もっぱら、本出願の出願日より前のその開示のために提供される。本明細書では何も、先行発明という理由で、本発明がこうした刊行物に先行する権利を与えられない了解と解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なる可能性があり、これは、独自に確認する必要がある可能性がある。
(詳細な説明)
本開示は、体重の調節における役割を果たすタンパク質複合体を提供する。本開示のタンパク質複合体の成分は、体重を調節するために使用することができる。さらに、このタンパク質複合体及びその成分は、体重を制御するために使用することができる薬剤を特定するのに使用される。本明細書で提供するのはまた、意図しない体重減少を治療及び/又は予防するための方法である。さらに、GDF15活性の上昇を有する又はGDF15活性の上昇を起こすリスクがある対象におけるGDF15活性を低下させるための方法も開示する。
本開示はまた、GDF15タンパク質と、以前は公知ではなく新規にGDF15に対する受容体であると特定されたGFRALタンパク質とを結晶化させるための方法を提供する。本開示は、初めて、GDF15タンパク質とGFRALタンパク質との結晶を提供する。本明細書で提供される結晶は、十分に高い分解能でＸ線を回折して、原子座標を含めた、GDF15リガンド-GFRAL受容体複合体の3次元構造の決定を可能にする。この3次元構造(例えば、コンピュータ可読媒体上に提供されるようなものが含まれる)は、GDF15-関連模倣体又はGFRAL関連リガンド、並びにGDF15タンパク質とその受容体、すなわちGFRALタンパク質との相互作用を妨げる、及び/又はGFRALタンパク質とRETタンパク質との相互作用を妨げる薬剤の合理的薬物設計に有用である。こうした薬剤には、GFRALドメイン内のGFRALタンパク質と結合する、かつ、GDF15タンパク質の結合についてGFRALタンパク質と競合し、それによってGDF15-GFRAL複合体形成の全体又は一部をブロックする抗体が含まれる。こうした薬剤にはまた、GFRALドメイン内のGFRALタンパク質と結合する、かつ、RETタンパク質とGFRALタンパク質との結合を妨げ、それによってRETタンパク質のGDF15介在性の活性化(例えば、細胞シグナル伝達)の全体又は一部をブロックする抗体も含まれる。
したがって、本開示は、GDF15に対する新たに特定された受容体を含む組成物、及びその使用を含む方法を含めた、体重を調節するための組成物及び方法を提供する。本明細書で初めて提供されるのは、結晶化されたGDF15受容体(例えばGFRALタンパク質)、及びGDF15受容体(例えばGFRALタンパク質)とGDF15タンパク質との複合体の結晶構造(2.2Åで分解される)である。こうした結晶からの新規の原子座標は、3次元構造を構築するのに有用である(これは、ひいては、分子モデリングのために、また、GFRALタンパク質及び/又はGDF15タンパク質と結合する薬剤を特定するために有用である)。こうした薬剤は、体重を調節するのに、及び/又はGDF15介在性の疾患、障害、もしくは状態の治療及び/又は予防のために、有用である。
(定義)
治療法の文脈で本明細書で互換的に使用される用語「患者」又は「対象」とは、治療法又は予防ケアのレシピエントとしてのヒト又は非ヒト動物をいう。
用語「治療する」、「治療すること」、「治療」などは、対象を悩ませている疾患、障害、又は状態の根本的原因の少なくとも1つ、又は対象を悩ませている疾患、障害、状態に伴う症状の少なくとも1つを、一時的に又は永久的に消失、軽減、抑制、緩和、又は改善するように、疾患、障害、若しくは状態、又はこれらの症状が診断された、観察された、などの後に開始される、一連の行為(薬剤、例えばポリペプチド、又はポリペプチドを含む医薬組成物を投与することなど)をいう。したがって、治療には、活動性疾患を阻害すること(すなわち、疾患、障害、若しくは状態、又はこれらと関連する臨床症状の発生又はさらなる発生を抑えること)が含まれる。
本明細書で使用される用語「治療の必要がある」とは、医師又は他の治療奉仕者(caregiver)によってなされる、対象が、治療を必要とする、又は治療から恩恵を受けるであろうという判断をいう。この判断は、医師又は治療奉仕者の専門技術の範囲内である様々な因子に基づいてなされる。
用語「予防する」、「予防すること」、「予防」などは、一般に、ある特定の疾患、障害、又は状態にかかりやすい対象という状況において、対象が疾患、障害、状態などを発症するリスクを、(例えば臨床症状の非存在によって決定される通りに)一時的に又は永久的に予防、抑制、阻害、若しくは軽減する、又は、その発生を遅延させるように、ある方式で(例えば、疾患、障害、状態、又はこれらの症状の発生の前に)開始される、一連の行為(薬剤、例えばポリペプチド又はポリペプチドを含む医薬組成物を投与することなど)をいう。ある種の場合には、この用語はまた、疾患、障害、又は状態の進行を遅らせること、又は、有害な又は他の望ましくない状態へのこれらの進行を阻害することをいう。
本明細書で使用される用語「予防の必要がある」とは、医師又は他の治療奉仕者によってなされる、対象が、予防的ケアを必要とする、又は予防的ケアから恩恵を受けるであろうという判断をいう。この判断は、医師又は治療奉仕者の専門技術の範囲内である様々な因子に基づいてなされる。
語句「治療有効量」とは、患者に投与された場合に疾患、障害、又は状態のあらゆる症状、様相、又は特性に対するあらゆる検出可能な陽性の効果を有することが可能な量での、単独での又は医薬組成物の一部としての、また、単一用量での若しくは一連の用量の一部としての、対象への薬剤の投与をいう。治療有効量は、妥当な生理学的効果を測定することによって確定することができる。治療有効量は、投与レジメン、及び対象の状態の診断分析などと関連付けて調節することができる。
語句「変化をもたらすのに十分な量で」は、ある特定の治療法の施与の前(例えば、基準レベル)と後とに測定される指標のレベルに、検出可能な差が存在することを意味する。指標としては、あらゆる客観的パラメータ(例えば、体重若しくは食物摂取)、又は主観的パラメータ(例えば、対象の幸福の感情又は食欲)が挙げられる。
用語「意図しない体重減少」とは、悪液質、肝硬変、甲状腺機能亢進症、慢性腎疾患、パーキンソン病、癌、摂食障害、及びサルコペニアなどの多くの状態において認められる、意図されたものではない体重の減少をいう。
用語「悪液質」とは、積極的に体重を減らすことを試みていない人における、体重の減少(例えば、意図しない体重の減少)、筋萎縮、疲労、脱力感、体脂肪量の減少、除脂肪体重の減少、筋肉タンパク質分解の増大、インスリン抵抗性、及び/又は著しい食欲の喪失で特徴付けられる消耗性症候群をいう。悪液質は、例えば、いくつかの慢性疾患(例えば、癌、慢性腎疾患、慢性閉塞性肺疾患、AIDS、結核、慢性炎症性疾患、敗血症、及び他の形態の全身性炎症、筋ジストロフィーなどの筋消耗、並びに神経性食欲不振症として公知である摂食障害)を患う患者の病的状態に大きく寄与し得る。例えば、末期癌では、悪液質は、よく見られ(大抵の病状末期の癌患者に生じ)、すべての癌関連死の約4分の1を占める。代謝過程(例えば、筋肉に直接的に作用し、その質量及び/又は形成を低下させる)、及び食物摂取低下(例えば、脂肪及び/又は筋肉の喪失をもたらす)は、悪液質の発生及び/又は進行を駆動する可能性がある。悪液質は、前悪液質、悪液質、及び不応性悪液質と呼ばれている段階を経て進行する可能性がある。
用語「活性化因子」とは、例えば、1以上の薬剤、例えば代謝障害を治療又は予防するために使用されるポリペプチドの機能又は活性を、刺激する、上昇させる、活性化する、促進する、活性化増強する、増感する、又は上方調節する薬剤をいう。さらに、活性化因子には、本発明のポリペプチドと同じ作用機序を通して機能し(すなわち、該ポリペプチドと類似の方式で、該ポリペプチドと同じシグナル伝達経路を調節する薬剤)、かつ、該ポリペプチドに匹敵する(又は超える生物学的反応を誘発することが可能である薬剤が含まれる。活性化因子の例としては、小分子化合物などのアゴニストが挙げられる。
GDF15に関する用語「天然の」又は「野生型」とは、生物学的に活性な天然に存在するGDF15をいう。この用語には、112アミノ酸ヒトGDF15成熟配列が含まれる(図1A)。
本明細書で使用する場合、「同族体」又は「バリアント」とは、それぞれ、アミノ酸又は核酸配列に基づくと類似である、タンパク質又はDNA配列をいう。同族体又はバリアントは、天然に存在するDNA配列、及びそれによってコードされるタンパク質及びそのアイソフォームを包含する。同族体には、タンパク質/遺伝子の公知の対立遺伝子バリアント又はスプライスバリアントも含まれる。同族体及びバリアントは、天然に存在するDNA配列と1以上の塩基が異なるが、それでも、遺伝暗号の縮重のおかげで、天然に存在するタンパク質に相当するアミノ酸配列に翻訳される、核酸配列も包含する。同族体及びバリアントはまた、1以上の保存的置換及び/又はタグ及び/又は複合体によって天然に存在する配列と異なるものをいうこともできる。
本明細書で使用される用語「結晶」及び「結晶化した」とは、結晶の形態で存在する、1以上のタンパク質又はその断片をいう。結晶は、非晶質固体状態又は液体結晶状態などの他の形態とは異なる、物質の固体状態の一形態である。結晶は、原子、イオン、分子(例えば、抗体などのタンパク質)、又は分子集合体(例えば、リガンド/受容体又は抗原/抗体複合体)の、規則的な、繰り返しの、3次元配列から構成される。これらの3次元配列は、当分野で十分に理解されている特定の数学的関係に従って配置されている。結晶中で繰り返される基本単位又は構成要素を、非対称単位と称する。ある特定の、明確に定義される結晶学的対称性に従う配置における非対称単位の繰り返しは、結晶の「単位胞」を提供する。3次元すべてにおける規則的な平行移動による単位胞の繰り返しは、結晶を提供する。Giege, R.and Ducruix, A.Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp.20 1-16, Oxford University Press, New York, N.Y.,(1999年)を参照のこと。
本明細書で互換的に使用される、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」とは、重合形状のアミノ酸をいい、これは、遺伝子によってコードされた、及び遺伝子によってコードされていないアミノ酸、化学的に又は生化学的に改変又は誘導体化されたアミノ酸、及び、改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。この用語には、限定はされないが、N-終端メチオニン残基を伴う又は伴わない、異種アミノ酸配列をもつ融合タンパク質、異種及び相同リーダー配列をもつ融合体;免疫学的にタグ付けされたタンパク質;などを含めた、融合タンパク質が含まれる。
本開示全体を通して、1文字又は3文字コードによって、アミノ酸について言及するということを理解されたい。読者の便宜のために、1文字及び3文字のアミノ酸コードを、以下に提供する:
Figure 2019513224
用語「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、任意の長さの重合形状のヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドのいずれか、又はこれらの類似体をいう。ポリヌクレオチドの非限定的な例としては、線状及び環状の核酸、メッセンジャーRNA(mRNA)、cDNA、組換えポリヌクレオチド、ベクター、プローブ、及びプライマーが挙げられる。
用語「異種」とは、異なる供給源に由来する構造によって定義される2種の成分をいう。例えば、「異種」が、ポリペプチドの文脈で使用される場合、ポリペプチドは、異なるポリペプチド(例えば、タグペプチド又はタンパク質からなる第1の成分と、GFRALポリペプチドに由来する第2の成分)に由来する可能性がある作動可能に連結されたアミノ酸配列を含むことができる。同様に、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの文脈では、「異種」は、異なる遺伝子(例えば、本明細書で開示する一実施態様によるペプチドをコードする核酸由来の第1の成分と、担体ポリペプチドをコードする核酸由来の第2の成分)に由来する可能性がある作動可能に連結された核酸配列を含む。他の例示的な「異種」核酸としては、コード配列を含む核酸が、コード配列の遺伝的起原とは異なる遺伝的起原由来の調節エレメント(例えば、プロモーター)と作動可能に連結された、(例えば、プロモーター、コード配列、又はこれらの両方とは異なる遺伝的起原であり得る、対象宿主細胞における発現を提供するための)発現構築物が挙げられる。例えば、GFRAL又はRETポリペプチド又はそのドメインをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたT7プロモーターは、異種核酸であると言える。組換え細胞の文脈では、「異種」とは、それが存在する宿主細胞とは異なる遺伝的起原のものである核酸(又は、ポリペプチドなどの遺伝子産物の存在をいうことができる。
用語「作動可能に連結された」とは、所望の機能を提供する、分子間の機能性の結合をいう。例えば、「作動可能に連結された」は、核酸の文脈では、転写、翻訳などの所望の機能を提供する、核酸間の機能性の結合、例えば、核酸発現制御配列(プロモーター、又は一連の転写因子結合部位など)と、第2のポリヌクレオチドとの間の機能性の結合をいう。ここでは、該発現制御配列は、第2のポリヌクレオチドの転写及び/又は翻訳に影響を与える。ポリペプチドの文脈では、「作動可能に連結された」とは、ポリペプチドの記載された活性を提供するための、アミノ酸配列(例えば、異なるドメイン)間の機能性の結合をいう。
本明細書で使用する場合、ポリペプチドの構造の文脈では、「N-終端」及び「C-終端」とは、それぞれ、ポリペプチドの最も遠いアミノ及びカルボキシル端をいい、一方で、用語「N-末端」及び「C-末端」とは、それぞれ、N-終端及びC-終端に対するポリペプチドのアミノ酸配列における相対的位置をいい、それぞれ、N-終端及びC-終端の残基を含むことができる。
「から得られる」は、アミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列の文脈(例えば、GFRAL、RET、又はGDF15ポリペプチド「から得られる」アミノ酸配列)では、ポリペプチド又は核酸が、参照ポリペプチド又は核酸(例えば、天然に存在するGFRAL、RET、又はGDF15ポリペプチド又はGFRAL、RET、又はGDF15をコードしている核酸)の配列に基づく配列を有することを示すことが意図されるが、タンパク質又は核酸が作製される供給源又は方法に関して制限することは意図されない。
「単離された」とは、天然に存在する場合に、それが天然に存在し得る環境とは異なる環境にある、対象タンパク質をいう。「単離された」は、対象タンパク質について実質的に濃縮された、及び/又は対象タンパク質が、部分的に又は実質的に精製された試料内であるタンパク質を含むことが意図される。タンパク質が天然に存在しない場合、「単離された」は、タンパク質が、合成手段又は組換え手段のいずれかによって作製された環境から分離されていることを示す。
「濃縮された」は、対象タンパク質が、生体試料(例えば、タンパク質が天然に存在する、又は投与後に存在する試料)などの出発試料中のタンパク質の濃度、又はタンパク質が作製される(例えば、細菌タンパク質など)タンパク質の濃度よりも高い(例えば、少なくとも3倍高い、少なくとも4倍高い、少なくとも8倍高い、少なくとも64倍高い、又はそれ以上の)濃度で存在するように、試料が(例えば、科学者又は臨床医によって)天然にではなく操作されたことを意味する。
「実質的に純粋な」は、存在物(例えば、ポリペプチド)が、組成物の全量(例えば、組成物の総タンパク質)の約50%超、典型的には、タンパク質全量の約60%超を構成することを示す。より一般的には、「実質的に純粋な」とは、全組成物の少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、又はそれ以上(例えば、総タンパク質の95%)が、対象存在物である組成物をいう。好ましくは、タンパク質は、組成物中の総タンパク質の約90%超、より好ましくは約95%超を構成することとなる。
検出可能なように標識されるタンパク質という文脈では、「検出可能なように標識される」とは、検出可能な部分の結合によって修飾されているタンパク質をいう。検出可能な部分は、直接的又は間接的にシグナルを生じることができる。直接的にシグナルを生じる検出可能な部分の例としては、蛍光分子、化学発光分子、及び放射性分子が挙げられる。間接的にシグナルを生じる検出可能な部分の例としては、基質、酵素、又は抗体などの検出試薬への曝露時にシグナルを生じる部分が挙げられる。直接的にシグナルを生じる検出可能な部分は、間接的手段によって、例えば、その部分と結合する標識された抗体を使用することによって、任意に検出することができる。このシグナルは、放射線測定装置、例えば、シンチレーションカウンター;光検出器、例えば、光学顕微鏡、分光光度計、蛍光顕微鏡、蛍光サンプルリーダー、又は蛍光活性化セルソーターなどによって検出可能であり得る。
遺伝子に関する用語「内在性」は、遺伝子が、細胞に固有である、すなわち、遺伝子が、非改変細胞のゲノム内の特定の遺伝子座に存在することを示す。内在性遺伝子は、(自然界に見られる)野生型細胞内の遺伝子座に存在する野生型遺伝子であり得る。内在性タンパク質は、内在性遺伝子によって発現されるタンパク質である。
用語「構築物」とは、特定のヌクレオチド配列(1又は複数)の発現の目的で産生されている、又は他の組換えヌクレオチド配列の構築において使用される、組換え核酸、一般に組換えDNAをいう。構築物は、ベクター内、又はゲノム内に存在する可能性がある。
用語「組換え」とは、宿主細胞中には天然に存在しないポリヌクレオチド又はポリペプチドをいう。組換え分子は、天然に存在しない様式で共に連結される2つ以上の天然に存在する配列を含有することができる。組換え細胞は、組換えポリヌクレオチド又はポリペプチドを含有する。
用語「コード配列」とは、適切な調節エレメントの制御下に配置された場合に、一旦転写及び翻訳されると、例えばインビボでタンパク質を生成する、核酸配列をいう。本明細書で使用する場合のコード配列は、連続的なORFを有することもできるし、イントロン又は非コード配列の存在によって割り込まれたORFを有する可能性もある。この実施態様では、非コード配列は、pre-mRNAから切り出されて、成熟mRNAが生成される。
(単離されたタンパク質複合体)
GDF15タンパク質とGFRALタンパク質を含む、単離された複合体が提供される。GDF15(MIC-1(マクロファージ抑制性サイトカイン-1)、PDF、PLAB、NAG-1、TGF-PL、及びPTGFBとしても公知である)は、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)スーパーファミリーのメンバーである。本発明者らは、GDF15がGFRALと結合し、GFRAL-Ret受容体複合体の活性化を媒介することを発見している。この単離された複合体のタンパク質は、体重を調節すること、並びに体重を調節する薬剤の特定に使用される。
「GDNFファミリー受容体α様」(GFRAL)は、GRALとしても公知である。本明細書で使用する場合、「GFRAL」とは、配列番号:1のアミノ酸配列と少なくとも65%同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。配列番号:1は、シグナルペプチドを欠く成熟ヒトGFRALの配列:
Figure 2019513224
 である。
シグナルペプチド配列(下線付きの小文字の残基)を含む、全長前駆ヒトGFRALタンパク質のアミノ酸配列を、以下に提供する:
Figure 2019513224
したがって、本明細書で使用される「GFRAL」は、ヒトGFRAL及びそのバリアント(限定はされないが、そのオルソログ、例えばマウスGFRAL、ラットGFRAL、カニクイザルGFRALなどが含まれる)を包含する。GFRALのこうした配列を、図2に表す。GFRALは、TGFβ RII(受入番号:NM_001024847.2;NM_003242.5)又はそのオルソログではない。GFRALは、TGFβ RI(受入番号:NP_001124388.1;NP_004603.1)又はそのオルソログとは異なる。ある種の実施態様では、GFRALは、配列番号:1と、少なくとも55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又はそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。こうした例示的なGFRALタンパク質としては、図25に示した通り、チンパンジー(99%)、カニクイザル(92%)、ジャイアントパンダ(82%)、イヌ(81%)、ネコ(80%)、ブタ(77%)、ウシ(75%)、マウス(70%)、ラット(70%)、チャイニーズハムスター(65%)、及びカモノハシ(59%)が挙げられる。
GFRALタンパク質又はGFRALはまた、保存ドメインを保持し、かつ天然に存在するGFRALと同様の生物活性を有しながら、アミノ酸残基内に(例えば、バリアント及び/又は種を越えて保存されない位置に)1以上の変更を有するタンパク質をいう。GFRALは、天然に存在するDNA配列と1以上の塩基が異なるが、遺伝暗号の縮重のおかげで、それでも、天然に存在するタンパク質に相当するアミノ酸配列に翻訳される、核酸配列によってコードされ得る。GFRALはまた、1以上の保存的置換及び/又はタグ及び/又は複合体によってGFRALの天然に存在する配列と異なるタンパク質をいうことができる。
本開示のタンパク質は、GFRALから得られる、あらゆる長さの連続的アミノ酸残基を含有する。連続的アミノ酸残基の十分な長さは、そのタンパク質が得られる特定の天然に存在するアミノ酸配列に応じて変動し得る。例えば、該タンパク質は、少なくとも100アミノ酸から150アミノ酸残基の長さ、少なくとも150アミノ酸から200アミノ酸残基の長さ、又は少なくとも220アミノ酸から最大で全長タンパク質まで(例えば、250アミノ酸、300アミノ酸、319アミノ酸、333アミノ酸、376アミノ酸)であり得る。
GFRALポリペプチドのアミノ酸配列と実質的に類似であるアミノ酸配列を含有するタンパク質には、天然に存在するGFRALポリペプチドの、約100アミノ酸(aa)から約150aa、約150aaから約200aa、約200aaから約250aa、約250aaから約300、又は約300aaから最大で全長までの連続的配列との、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれる。例えば、対象組成物及び方法のGFRALポリペプチドは、図2A〜2Dに表したGFRALポリペプチドアミノ酸配列の、約100アミノ酸(aa)から約150aa、約150aaから約200aa、約200aaから約250aa、約250aaから約300、又は約300aaから最大約350aa、約350aaからおよそ全長の連続的配列との、少なくとも約71%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
前記タンパク質は、天然に存在する全長GFRALポリペプチドと比較して、少なくとも5、少なくとも10、最大で少なくとも50、又はそれ以上のaaを欠く可能性がある。例えば、該タンパク質は、天然に存在するGFRALポリペプチドのアミノ酸配列に基づくシグナル配列を含有しない可能性がある。該タンパク質はまた、天然に存在するGFRALポリペプチドと同一又は類似の翻訳後修飾を含有する可能性もあるし、翻訳後修飾を含有しない可能性もある。例えば、該タンパク質は、天然に存在するGFRALポリペプチドの糖鎖付加パターンと同一又は類似の糖鎖付加パターンを有する可能性もあるし、糖鎖付加を含有しない可能性もある。他の実施態様では、GFRLタンパク質は、天然に存在するGFRALタンパク質内に存在しない位置に糖鎖付加部位を導入する、天然に存在するGFRALタンパク質の配列と比較した場合の変異を含むことができる。
GFRALの、多くのDNA及びタンパク質配列が、当技術分野で公知であり、ある種の配列を、後に以下で論じる。ある種のGFRALタンパク質配列を、図2A〜2Eに表す。図2Eは、図2A〜2Dに示したGFRAL配列のアラインメントを示す。
ある種の実施態様では、GFRALは、その細胞表面上にGFRALタンパク質を発現するように遺伝子改変された組換え細胞によって発現させることができる。該細胞は、単離されたGDF15タンパク質を含む組成物中に存在することができる。ある種の場合では、該細胞は、RETをさらに発現させることができる-例えば、該細胞は、RETをコードする外因性配列を含むように遺伝子改変せずに、RETを内因的に発現することができる。他の実施態様では、該細胞は、検出可能なレベルのRETを発現しない可能性があり、かつ外因性配列由来のRETを発現するように遺伝子改変することができる。
本明細書で開示されるのはまた、天然のGFRALに存在する細胞内ドメイン、又は天然のGFRAL(図2A〜2Dに示す天然のGFRALなど)に存在する細胞内ドメインと膜貫通ドメインを欠くGFRAL断片などの、GFRALの断片である。先に記述した通り、GFRALの断片はまた、天然のGFRALに存在するシグナル配列を欠く可能性があるが、異種シグナル配列を含むこともできるし含んでいなくてもよい。この断片は、天然のGFRALに存在する細胞内ドメインを欠くが、膜貫通ドメインを含む可能性がある。
ある種の実施態様では、単離されたGFRAL-細胞外ドメイン(GFRAL-ECD)ポリペプチドが提供される。GFRAL-ECDは、本開示の単離されたタンパク質複合体中に存在する場合、GDF15などのリガンドに結合することができる。用語「GFRAL-細胞外ドメイン」(「GFRAL-ECD」)には、全長GFRAL ECD、GFRAL ECD断片、及びGFRAL ECDバリアントが含まれる。本明細書で使用する場合、用語「GFRAL ECD」とは、細胞内及び膜貫通ドメインを欠く、シグナルペプチドを伴う又は伴わないGFRALポリペプチドをいう。いくつかの実施態様では、GFRAL ECDとは、アミノ酸配列:
Figure 2019513224
 を有するヒト全長GFRAL ECDのアミノ酸配列と、少なくとも70%同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。
用語「全長GFRAL ECD」とは、本明細書で使用する場合、細胞外ドメインの最後のアミノ酸まで及び、かつN-末端シグナルペプチドを含むこともできるし含んでいなくてもよい、GFRAL ECDをいう。しかし、「全長GFRAL ECD」はまた、該ポリペプチドが可溶性であるという条件で、膜貫通ドメインのアミノ酸残基を含むようにC-終端上を1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10アミノ酸だけ延長されたGFRAL-ECDも包含することに留意されたい。言い換えれば、GFRAL ECDには、十分な長さの膜貫通ドメインが欠如しており、その結果、細胞膜に固着されない。語句「全長GFRAL ECD」はまた、シグナルペプチドのアミノ酸残基を含むようにN-終端上を1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10アミノ酸だけ延長されたGFRAL-ECDも包含する。ある種の実施態様では、GFRAL ECD断片は、図2A〜2Dに表した連続的アミノ酸配列と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上同一であり、かつ図2A〜2Dに表したGFRAL配列のC-終端の少なくとも30、33、35、40、45、50、又は55アミノ酸又はそれ以上を欠く、連続的アミノ酸配列をいう。
GFRAL ECDは、TGFβ RII(受入番号:NM_001024847.2;NM_003242.5)又はそのオルソログのECDではない。GFRAL ECDは、TGFβ RI(受入番号:NP_001124388.1;NP_004603.1)又はそのオルソログのECDとは異なる。ある種の実施態様では、GFRAL ECDは、配列番号:2と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。
本明細書で使用する場合、用語「GFRAL ECD断片」とは、全長ECDのN及び/又はC-終端から1以上の残基が欠失し、かつGDF15と結合する能力を保持するGFRAL ECDをいう。場合により、GFRAL ECD断片は、N-末端シグナルペプチドを含むこともできるし含んでいなくてもよい。場合により、GFRAL ECD断片は、配列:
Figure 2019513224
 のN-終端に存在する1、5、10、15、16、17、18、又は19残基を欠く、ヒトGFRAL ECD断片である。
別の例示的なGFRAL ECD断片は、全長ヒト前駆体GFRALタンパク質のQ20からC316に相当する、次のアミノ酸配列:
Figure 2019513224
 を含む。
別の例示的なGFRAL ECD断片は、全長ヒト前駆体GFRALタンパク質のW115からE351に相当する、次のアミノ酸配列:
Figure 2019513224
 を含む。
先の例示的なGFRAL ECD断片を、実施例に記載した方法において使用して、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質とを含む複合体の結晶を生じた。
GFRAL ECD内には、3つの別のドメイン-ドメイン1(D1)、ドメイン2(D2)、及びドメイン3(D3)が存在する。いくつかの実施態様では、GFRAL ECDのD1の範囲となるアミノ酸配列は、配列番号:9の残基Q20からS130である。いくつかの実施態様では、GFRAL ECDのD2の範囲となるアミノ酸配列は、配列番号:9の残基C131からC210である。いくつかの実施態様では、GFRAL ECDのD3の範囲となるアミノ酸配列は、残基C220からC316である。GFRALの、ある種の特性は、ECD内のこれらのドメインの活性及び/又は結合に起因し得る。例えば、本明細書に記載した通り、GFRAL ECDのD2内のアミノ酸残基は、GDF15に対するGFRAL結合に関する、コア相互作用界面アミノ酸及び/又は境界相互作用界面アミノ酸であると特定される。同様に、本明細書に記載した通り、GFRAL ECDのD3内のアミノ酸残基は、RETに対するGFRAL結合に関する、コア相互作用界面アミノ酸及び/又は境界相互作用界面アミノ酸であると特定される。
用語「コア相互作用界面アミノ酸」又はその文法的等価物とは、相互作用するタンパク質から4.5Å以下の範囲内に少なくとも1つの原子を有する所与のタンパク質のアミノ酸残基(例えば、GDF15又はRETと相互作用するGFRAL上のアミノ酸)をいう。4.5Åという距離は、相互作用するタンパク質との結合を形成するための、ファンデルワールス半径＋想定される水介在性の水素結合の範囲内の原子を考慮する。
用語「境界相互作用界面アミノ酸」又はその文法的等価物とは、所与のタンパク質上のコア界面アミノ酸から5Å以下の範囲内に少なくとも1つの原子を有する所与のタンパク質のアミノ酸残基(例えば、GDF15又はRETと相互作用するGFRAL上のコア相互作用界面アミノ酸の5Å以内にある、GFRAL上のアミノ酸)をいう。5Å以下の距離は、相互作用するタンパク質のファンデルワールス半径の範囲内である、所与のタンパク質上のコア相互作用界面アミノ酸から5Å未満の距離の残基に対するタンパク質結合を可能にする。
本明細書で使用する場合、用語「GFRAL ECDバリアント」とは、アミノ酸付加、欠失、又は置換を含有し、かつGDF15に結合することが可能なままである、GFRAL ECDをいう。こうしたバリアントは、親GFRAL ECDと、少なくとも80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%、又は99%同一であり得る。2つのポリペプチドの同一性(%)は、類似性を決定するための初期設定を用いるBestfitプログラムなどのアルゴリズムを使用してこれらの2つのポリペプチドのアミノ酸配列を比較することによって決定される類似性スコアによって測定することができる。Bestfitは、Smith及びWatermanの文献、Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981年)の局地的相同性アルゴリズムを使用して、2つの配列間の最適な類似性のセグメントを見つける。
ある種の実施態様では、GFRAL-ECDは、ヒト可溶性 GFRAL-ECD:
Figure 2019513224
 と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一である、長さ約100〜340残基(例えば、100、150、200、250、300、310、320、330、333、又は335残基長)の連続的アミノ酸配列を含む可溶性ポリペプチドを含むことができる。
ある種の実施態様では、可溶性GFRAL-ECDは、約325、329、330、331、332、335、340アミノ酸長であり得、かつ、ヒト可溶性GFRAL-ECD、マウス可溶性GFRAL-ECD、又はラット可溶性GFRAL-ECDと、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、又は99%同一であり得る。
ある種の場合では、GFRAL-細胞外ドメインは、膜貫通ドメインを有するGFRAL-ECDを発現するように遺伝子改変された細胞の細胞表面上で発現させることができる。ある種の場合では、可溶性GFRAL-ECDは、支持体上に固定することができる。本明細書に記述した通り、本開示のポリペプチドは、異種タンパク質配列に複合体化されたポリペプチドを含む融合タンパク質であり得る。
適切な支持体は、様々な形態及び組成を有することができ、天然に存在する材料、人工的に改変されている天然に存在する材料、又は合成の材料から得ることができる。適切な材料の例としては、限定はされないが、ニトロセルロース、ガラス、シリカ、テフロン、及び金属(例えば、金、白金など)が挙げられる。適切な材料としてはまた、プラスチック(例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、及びこれらのブレンドなど)を含めた、高分子材料、アガロース(例えば、Pharmacia社からSepharose(登録商標)として市販品として入手可能なもの)及びデキストラン(例えば、同じくPharmacia社から商品名Sephadex(登録商標)及びSephacyl(登録商標)で市販品として入手可能なもの)などの多糖、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、メタクリル酸ヒドロキシエチルとメタクリル酸メチルのコポリマーなどが挙げられる。
本明細書で意図されるのはまた、RETタンパク質とGDF15タンパク質を含む組成物である。ある種の場合では、こうした組成物は、GFRALをさらに含むことができる。ある種の場合では、RETを、支持体に付着させる、又はRETを発現するように遺伝子改変された組換え細胞の細胞表面上で発現させることができる。ある種の場合では、該組成物は、RETを発現するように遺伝子改変された組換え細胞;GDF15;及び担体、例えば医薬として許容し得る担体を含むことができる。
ある種の実施態様では、組成物は、GFRAL及びRETを含むことができる。ある種の場合では、組成物は、RET及びGFRALを発現するように遺伝子改変された組換え細胞;及び担体、例えば医薬として許容し得る担体を含むことができる。
ある種の場合では、組成物は、RET及びGFRALを発現するように遺伝子改変された組換え細胞;GDF15;担体、例えば医薬として許容し得る担体を含むことができる。
本明細書で使用する場合、「Ret」又は「RET」とは、配列番号:3のアミノ酸配列と、少なくとも75%同一、例えば、77%、79%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又はそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。RETは、TGFβ RI及びTGFβ RIIとは異なる。配列番号:3は、シグナルペプチドを欠く成熟ヒトRET9の配列である:
Figure 2019513224
シグナルペプチド配列(下線付きの小文字の残基)を含む、全長前駆ヒトRETタンパク質のアミノ酸配列を、以下に提供する:
Figure 2019513224
したがって、本明細書で使用される「RET」は、ヒトRET及びそのバリアント(限定はされないが、そのオルソログ、例えばマウスRET、カニクイザルRETなどが含まれる)を包含する。RETのこうした配列を、図3に表す。ある種の実施態様では、RETは、配列番号:3と、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又はそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質であり得る。
ある種の実施態様では、単離されたRET-細胞外ドメイン(RET-ECD)ポリペプチドが提供される。RET-ECDは、本開示の単離されたタンパク質複合体中に存在する場合、GFRALなどのリガンドに結合することができる。用語「RET-細胞外ドメイン」(「RET-ECD」)には、全長RET ECD、RET ECD断片、及びRET ECDバリアントが含まれる。本明細書で使用する場合、用語「RET ECD」とは、細胞内及び膜貫通ドメインを欠く、シグナルペプチドを伴う又は伴わないRETポリペプチドをいう。いくつかの実施態様では、RET ECDとは、アミノ酸配列:
Figure 2019513224
 を有するヒト全長RET ECDのアミノ酸配列と、少なくとも75%同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。
別の例示的な実施態様では、RET ECDとは、アミノ酸配列:
Figure 2019513224
 を有するヒト全長RET ECDのアミノ酸配列と、少なくとも75%同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質をいう。
用語「全長RET ECD」とは、本明細書で使用する場合、細胞外ドメインの最後のアミノ酸まで及び、かつN-末端シグナルペプチドを含むこともできるし含んでいなくてもよい、RET ECDをいう。しかし、「全長RET ECD」はまた、該ポリペプチドが可溶性であるという条件で、膜貫通ドメインのアミノ酸残基を含むようにC-終端上を1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10アミノ酸だけ延長されたRET-ECDも包含することに留意されたい。言い換えれば、RET ECDには、十分な長さの膜貫通ドメインが欠如しており、その結果、細胞膜に固着されない。語句「全長RET ECD」はまた、シグナルペプチドのアミノ酸残基を含むようにN-終端上を1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10アミノ酸だけ延長されたRET-ECDも包含する。ある種の実施態様では、RET ECD断片は、図3A〜3Hに表した連続的アミノ酸配列と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上同一であり、かつ図3A〜3Hに表したRET配列のC-終端の少なくとも30、33、35、40、45、50、又は55アミノ酸又はそれ以上を欠く、連続的アミノ酸配列をいう。
本明細書で使用する場合、用語「RET ECD断片」とは、全長ECDのN及び/又はC-終端から1以上の残基が欠失し、かつGFRALと結合する能力を保持するRET ECDをいう。場合により、RET ECD断片は、N-末端シグナルペプチドを含むこともできるし含んでいなくてもよい。場合により、RET ECD断片は、配列:
Figure 2019513224
 のN-終端に存在する1、5、10、15、16、17、18、又は19残基を欠く、ヒトRET ECD断片である。
先の例示的なRET ECD断片を、実施例に記載した方法において使用して、RETタンパク質、GFRALタンパク質、及びGDF15タンパク質を含む複合体のモデルを生じた。
RET ECDの代替実施態様では、RET-ECDは、配列番号27のRET ECD配列におけるC64R、N75Q、N166Q、又はC183S変異を含む。
本開示の方法に記載したタンパク質には、いずれかの天然に存在するGFRALの連続的アミノ酸配列を含有するもの、並びに1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個、又はそれ以上の、一般に、多くとも40、30、20、10、又は5個のアミノ酸置換を有するものが含まれ、ここでは、置換は、一般に、保存的アミノ酸置換である。語句「保存的アミノ酸置換」とは、一般に、次の群内のアミノ酸残基:
1)L、I、M、V、F;
2)R、K;
3)F、Y、H、W、R;
4)G、A、T、S;
5)Q、N;及び
6)D、E
の置換をいう。
本明細書で開示するペプチド又はタンパク質の文脈での保存的アミノ酸置換は、タンパク質の推定活性を維持するように選択される。こうしたプレゼンテーション(presentation)は、置き換えられるアミノ酸の側鎖と類似の酸性度、塩基性度、電荷、極性、又は大きさの側鎖を有するアミノ酸と置換することによって維持することができる。置換、挿入、又は欠失のための手引きは、異なるバリアントタンパク質又は異なる種からのタンパク質の、アミノ酸配列のアラインメントに基づく可能性がある。半保存される残基(.又は:)は、電荷、極性、又は及び/大きさを維持する変化に耐えることができる。例えば図2Eを参照のこと。
本開示は、先に記載したポリペプチドのいずれかを提供する。該タンパク質は、天然供給源(例えば、その天然に存在する環境ではない環境)から単離することができる。該対象タンパク質はまた、例えば、遺伝子改変された宿主細胞(例えば、細菌;酵母;昆虫;哺乳類-マウス、ヒト細胞;など)において組換えによって作ることもできる(ここでは、遺伝子改変された宿主細胞は、該対象タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を用いて遺伝子改変される))。該対象タンパク質は、合成のポリペプチドを包含する、例えば、対象合成ポリペプチドは、実験室で化学的に(例えば、無細胞インビトロ合成又は化学合成によって)合成される。生成の方法は、以下に、より詳細に記載する。
(核酸及びタンパク質配列)
対象ポリペプチドは、異なるGFRAL、RET、又はGDF15タンパク質の核酸を操作して対象タンパク質をコードする構築物を提供するための、組換え技術を使用して産生することができる。アミノ酸配列が提供される場合、当業者は、遺伝暗号の知識から見て、こうしたアミノ酸配列をコードする様々な異なる核酸分子を直ちに認識するであろうということを理解されたい。
天然に存在するポリペプチドから得られる対象タンパク質の産生については、様々な異なるポリペプチドをコードする核酸が、当技術分野で公知でありかつ利用可能であることに留意されたい。種々のGFRAL、RET、及びGDF15ポリペプチドに対する核酸(及びアミノ酸配列)も、受入番号GFRAL:i)ヒト(Homo sapiens):アミノ酸配列 NP_997293.2;ヌクレオチド配列:NM_207410.2;ii)ハツカネズミ(Mus musculus):アミノ酸配列 NP_995316.2;ヌクレオチド配列 NM_205844;iii)ドブネズミ(Rattus norvegicus):アミノ酸配列:NP_001178927.1;ヌクレオチド配列:NM_001191998.1;iv)カニクイザル(Macaca fascicularis):アミノ酸配列: G7P2W4;v)ニワトリ(Gallus gallus):アミノ酸配列 XP_419904.4;ヌクレオチド配列 XM_419904.4.RET:i)ヒトRET51:アミノ酸配列:NP_066124.1;ヌクレオチド配列:NM_020975.4;ii)ヒトRET9:アミノ酸配列:NP_065681.1;ヌクレオチド配列:NM_020630.4;iii)ハツカネズミRET51:アミノ酸配列:P35546;ヌクレオチド配列:NM_001080780.1;iv)ハツカネズミRET9:アミノ酸配列:P35546-2;ヌクレオチド配列:NM_001080780.1;v)ドブネズミRET51:アミノ酸配列:;NP_036775.2 ヌクレオチド配列:NM_012643.2;vi)ドブネズミRET9:アミノ酸配列:NP_001103569.1;ヌクレオチド配列:NM_001110099.1;vii)カニクイザルRET51:アミノ酸配列:XP_005565094.1;ヌクレオチド配列:XM_005565037.1;viii)カニクイザルRET9:アミノ酸配列:XP_005565095.1;ヌクレオチド配列:XM_005565038.1として提供される。例示的なGFRAL及びRETアミノ酸配列は、それぞれ、図2及び3に表す。
当技術分野で、MIC-1(マクロファージ抑制性サイトカイン-1)、PDF(前立腺分化因子(prostate differentiation factor))、PLAB(胎盤骨形成タンパク質(placental bone morphogenetic protein))、NAG-1(非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)活性化遺伝子)、TGF-PL、及びPTGFBとしても公知である「増殖分化因子15」又は「GDF15」は、トランスフォーミング増殖因子β(TGF-β)スーパーファミリーのメンバーである。GDF15は、62kDa細胞内前駆体タンパク質として合成され、続いて、フューリン様プロテアーゼによって切断され、25kDaジスルフィド結合タンパク質として分泌される(例えば、Fairlieらの文献、J.Leukoc.Biol 65:2-5(1999年)を参照のこと)。GDF15 mRNAは、肝臓、腎臓、膵臓、結腸、及び胎盤を含めたいくつかの組織において見られ、肝臓におけるGDF15発現は、肝臓、腎臓、心臓、及び肺などの器官の損傷中に、著しく上方調節される可能性がある。
GDF15前駆体は、29アミノ酸シグナルペプチド、167アミノ酸プロドメイン、及び112アミノ酸の成熟ドメイン(これは、フューリン様プロテアーゼによって、プロドメインから切除される)を含有する、308アミノ酸ポリペプチド(NCBI Ref.Seq.NP_004855.2;GI:153792495)である。
前駆体ヒトGDF15ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下に提供される:
Figure 2019513224
308アミノ酸GDF15ポリペプチドは、「全長」GDF15ポリペプチドと呼ばれ;112アミノ酸GDF15ポリペプチド(「全長」GDF15のアミノ酸197〜308)は、「成熟」GDF15ポリペプチドである。
本明細書で使用される「GDF15」には、配列番号:6のアミノ酸配列と少なくとも65%同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質が含まれる。成熟ヒトGDF15ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下に提供される:
Figure 2019513224
先の例示的な成熟ヒトGDF15を、実施例に記載した方法において使用して、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質とを含む複合体の結晶を生成した。
そうではないと示されない限り、用語「GDF15」とは、112アミノ酸成熟ヒト配列をいう。さらに、特定のGDF15残基に対する参照番号は、112アミノ酸成熟配列を指す(すなわち、残基1は、Ala(A)であり、残基112は、Ile(I)である;配列番号:6参照)。注目すべきことには、GDF15前駆体アミノ酸配列から、「成熟」ヒトGDF15の3つの推定形をもたらす3つの切除部位(すなわち、110、112、及び115アミノ酸)が予測されるが、112アミノ酸成熟配列が、正しいことが認められる。
いくつかの実施態様では、GDF15タンパク質は、ホモ二量体である(例えば、それぞれ配列番号:6の2つのポリペプチド鎖を含む)。
GDF15前駆体は、29アミノ酸シグナルペプチド、167アミノ酸プロドメイン、及び112アミノ酸の成熟ドメイン(これは、フューリン様プロテアーゼによって、プロドメインから切除される)を含有する、308アミノ酸ポリペプチド(NCBI Ref.Seq.NP_004855.2)である。308アミノ酸GDF15ポリペプチドは、「全長」GDF15ポリペプチドと呼ばれ;112アミノ酸GDF15ポリペプチド(図1A参照)は、「成熟」GDF15ポリペプチドである。そうではないと示されない限り、用語「GDF15」とは、112アミノ酸成熟配列をいう。さらに、特定のGDF15残基に対する参照番号は、112アミノ酸成熟配列を指す(すなわち、残基1は、Ala(A)であり、残基112は、Ile(I)である;図1A参照)。
本開示の範囲には、マウス(NP_035949)、チンパンジー(XP_524157)、オランウータン(XP_002828972)、アカゲザル(EHH29815)、ジャイアントパンダ(XP_002912774)、テナガザル(XP_003275874)、モルモット(XP_003465238)、フェレット(AER98997)、ウシ(NP_001193227)、ブタ(NP_001167527)、及びイヌ(XP_541938)を含めた、他の哺乳類の種由来のGDF15オルソログ、及びその改変形、並びにその使用が含まれる。こうした例示的なGDF15タンパク質を、図26に示す。図26は、種々の例示的なGDF15タンパク質のアラインメントを含む。成熟形態のヒトGDF15は、マウスオルソログとのおよそ67%アミノ酸同一性を有する。
前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、コドン使用を最適化して、対象宿主細胞(例えば、大腸菌(Escherichia coli)など)における発現を促進するように改変することができることを理解されたい。コドン最適化配列の生成のための方法は、当技術分野で公知である。
(タンパク質改変)
本開示において使用されるタンパク質は、天然に存在するタンパク質に対して改変されたタンパク質として提供することができる。改変の目的は、治療法のために製剤化されるタンパク質における望ましい性質(例えば、血清半減期)を高めること、検出アッセイにおける使用のための抗体を産生すること、及び/又はタンパク質精製のためのものなどであり得る。
対象タンパク質を改変するための1つの方法は、該タンパク質のN-及び/又はC-終端に、1以上の追加のエレメント、例えば、(例えば、対象タンパク質に対して異種のアミノ酸配列を有する)別のタンパク質及び/又は担体分子を複合体化(例えば連結)させることである。したがって、例示的なタンパク質は、免疫グロブリンFcポリペプチドから得られるポリペプチド(1又は複数)との融合タンパク質として提供することができる。
タンパク質に対する複合体化改変は、(例えば、治療的使用にとって望ましい)ある種の性質を与える及び/又は増強するための、その複合体の第2の分子の性質を利用しながら、所望の活性を保持するタンパク質をもたらすことができる。例えば、ポリペプチドは、例えば、溶解度、保管、半減期、免疫原性の低下、組織又は他の身体部位(例えば、血液又は他の特定の器官など)における制御放出を促進するために、ある分子と複合体化させることができる。
複合体化タンパク質の他の特徴には、その複合体が、非複合体化タンパク質と比較して毒性を低下させるというものが含まれ得る。別の特徴は、複合体が、ある種類の細胞又は器官を、非複合体化材料よりも効率的に標的にできることである。該タンパク質は、代謝の障害に関連する原因又は結果にさらに対抗するための薬物(例えば、筋萎縮のための薬物)を任意に結合させることができる、及び/又は(例えば、PEG化、過剰糖鎖付加などによって)向上された薬物動態プロファイルを提供するように任意に改変することができる。
対象タンパク質が、GFRAL又はGDF15又はRETポリペプチドと、異種融合パートナーポリペプチドとを含む融合タンパク質である場合、対象融合タンパク質は、GFRAL又はGDF15又はRETポリペプチドと、異種融合パートナーポリペプチドと、存在する場合、リンカーの合計と等しい全長を有することができる。例示的なGDF15融合タンパク質を、図1B(Fc融合)及び図1C(ヒト血清アルブミン融合)に示す。
本開示のポリペプチド配列を改変するために使用される前述の成分及び分子のいずれかは、リンカーを介して任意に複合体化することができる。適切なリンカーとしては、一般に、改変されるポリペプチド配列と、連結される成分及び分子との間のいくらかの動きを許容されるのに十分な長さのものである「可動性リンカー」が挙げられる。このリンカー分子は、約6〜50原子長であり得る。これらのリンカー分子は、例えば、アリールアセチレン、エチレングリコールオリゴマー(2〜10個のモノマー単位を含有する)、ジアミン、二酸、アミノ酸、又はその組み合わせとすることもできる。適切なリンカーを容易に選択することができ、また、これは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10〜20、20〜30、30〜50アミノ酸などの任意の適切な長さのものであり得る。
例示的な可動性リンカーとしては、グリシンポリマー(G)n、グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、グリシン-セリンポリマー(例えば、
Figure 2019513224
 並びにこれらの組み合わせ(ここでは、m、n、及びoは、少なくとも1から20、例えば、1〜18、2〜16、3〜14、4〜12、5〜10、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10の整数からそれぞれ独立に選択される)、及び他の可動性リンカーが挙げられる。グリシン及びグリシン-セリンポリマーは、比較的に不定形であるので、成分間の中立的なつなぎ綱としての役割を果たす。例示的な可動性リンカーとしては、限定はされないが
Figure 2019513224
 が挙げられる。
追加の可動性リンカーとしては、グリシンポリマー(G)n又はグリシン-セリンポリマー(例えば、
Figure 2019513224
 が挙げられ、ここでは、n=1から50、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10〜20、20〜30、30〜50である。例示的な可動性リンカーとしては、限定はされないが、
Figure 2019513224
 が挙げられる。これらのリンカー配列の多量体(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、10〜20、20〜30、又は30〜50)を共に連結させて、異種アミノ酸配列を本明細書で開示するポリペプチドに複合体化させるために使用することができる可動性リンカーを提供することができる。本明細書に記載した通り、異種アミノ酸配列は、シグナル配列及び/又は融合パートナー、例えば、アルブミン、Fc配列などであり得る。
(生成の方法)
本開示のタンパク質は、組換え及び非組換え方法(例えば化学合成)を含めた、任意の適切な方法によって生成することができる。ポリペプチドが化学的に合成される場合、合成は、液相又は固相を介して進めることができる。固相合成(SPPS)は、非天然のアミノ酸及び/又はペプチド/タンパク質骨格修飾の組み込みを可能にする。本開示のペプチドを合成するために、Fmoc及びBocなどの、様々な形態のSPPSが利用可能である。化学合成の詳細は、当技術分野で公知である(例えば、Ganesan A.の文献、2006年 Mini Rev.Med.Chem.6:3〜10;及びCamarero JAらの文献、2005年 Protein Pept Lett.12:723〜8)。簡単に言うと、小さい不溶性の多孔質ビーズを、その上にペプチド鎖が構築される機能単位で処理する。カップリング/脱保護のサイクルを繰り返した後、結合した固相の遊離N-末端アミンを、単一のN保護アミノ酸単位にカップリングさせる。次いで、この単位を脱保護すると、さらなるアミノ酸が結合された可能性がある新しいN-末端アミンが現れる。ペプチドは、固相上に固定されたままであり、濾過処理を受けた後に切断される。
組換え技術を使用してタンパク質を生成する場合、タンパク質は、任意の適切な構築物及び任意の適切な宿主細胞(原核又は真核細胞、例えば、それぞれ細菌(例えば大腸菌)又は酵母宿主細胞であり得る)を使用して、細胞内タンパク質として又は分泌タンパク質として生成することができる。
宿主細胞として使用することができる真核細胞の他の例としては、昆虫細胞、哺乳類細胞、及び/又は植物細胞が挙げられる。哺乳類宿主細胞が使用される場合、該細胞としては、以下の1種以上:ヒト細胞(例えば、HeLa、293、H9、及びJurkat細胞);マウス細胞(例えば、NIH3T3、L細胞、及びC127細胞);霊長類細胞(例えば、Cos 1、Cos 7、及びCV1)、及びハムスター細胞(例えば、チャイニーズハムスター卵巣(Chinese hamster ovary)(CHO)細胞)が含まれ得る。
対象タンパク質の発現に適した様々な宿主-ベクターシステムを、当技術分野で公知の標準の手順に従って用いることができる。例えば、Sambrookらの文献、1989年、「分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」、Cold Spring Harbor Press社、New York;及びAusubelらの文献、1995年、「分子生物学の最新プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」(Wiley and Sons社編)を参照のこと。
宿主細胞への遺伝子材料の導入のための方法としては、例えば、形質転換、電気穿孔、接合、リン酸カルシウム方法などが挙げられる。導入のための方法は、導入されたGFRAL及び/又はRETをコードしている核酸の安定な発現を提供するように選択することができる。ポリペプチドをコードしている核酸は、遺伝性のエピソーム要素(例えば、プラスミド)として提供することもできるし、ゲノムに組み込むこともできる。対象ポリペプチドの生成における使用のための様々な適切なベクターは、市販品として入手できる。
ベクターは、宿主細胞における染色体外維持を提供することもできるし、宿主細胞ゲノムへの組み込みを提供することもできる。発現ベクターは、転写及び翻訳調節配列を提供する、また、誘導性の又は構成的な発現を提供することができる。ここでは、コード領域は、転写開始領域並びに転写及び翻訳停止領域の転写制御下で、作動可能に連結されている。一般に、転写及び翻訳調節配列としては、限定はされないが、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終止配列、翻訳開始及び終止配列、及びエンハンサー又は活性化因子配列が含まれ得る。プロモーターは、構成的又は誘導性のいずれかであり得、また、強力な構成的プロモーター(例えば、T7、CMVなど)であり得る。ある種の実施態様では、本開示のタンパク質は、異種プロモーターが、該タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結された、核酸構築物から発現させることができる。
発現構築物は一般に、対象タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するための、プロモーター配列の近くに位置する好都合な制限部位を有する。ベクターを含有する細胞の選択を容易にするために、発現宿主において作動する選択可能マーカーが存在することができる。さらに、発現構築物は、追加のエレメントを含むことができる。例えば、発現ベクターは、1つ又は2つの複製システムを有することができ、したがって、発現のための生物において、例えば哺乳類又は昆虫細胞において、また、クローニング及び増幅のための原核生物宿主において維持されることが可能になる。さらに、発現構築物は、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするための、選択可能マーカー遺伝子を含有することができる。選択可能遺伝子は、当技術分野で周知であり、使用される宿主細胞によって異なることとなる。
タンパク質の単離及び精製は、当技術分野で公知の方法に従って実現することができる。例えば、タンパク質は、タンパク質を構成的に及び/又は誘発時に発現するように遺伝子改変された細胞の溶解物から、又は合成の反応混合物から、免疫アフィニティ精製によって単離することができる。これは一般に、試料を抗タンパク質抗体と接触させることと、洗浄して非特異的に結合した材料を除去することと、特異的に結合したタンパク質を溶出することを含む。単離されたタンパク質は、透析及びタンパク質精製方法において通常用いられる他の方法によって、さらに精製することができる。一実施態様では、タンパク質は、金属キレートクロマトグラフィー方法を使用して単離することができる。本開示のタンパク質は、先に論じた通りの、単離を容易にするための改変を含有することができる。
対象タンパク質は、実質的に純粋な又は単離された(例えば、他のポリペプチドを含まない)形態で調製することができる。該タンパク質は、存在し得る他の成分(例えば、他のポリペプチド又は他の宿主細胞成分)に対して、該ポリペプチドについて濃縮された組成物中に存在することができる。精製されたタンパク質は、該タンパク質が、他の発現されたタンパク質を実質的に含まない組成物中に存在する、例えば、組成物の90%未満、一般に60%未満、より一般には50%未満が他の発現されたタンパク質で構成されるように提供することができる。
(組換え細胞)
先に記述した通り、GFRALタンパク質を発現するように遺伝子改変された組換え細胞を開示する。先に説明した通り、この細胞によって発現されるGFRALタンパク質は、図1C〜1Eに表した通りの全長GFRALタンパク質、又はそのバリアント若しくは断片であり得る。例えば、GFRALタンパク質は、天然のGFRALに存在する細胞内ドメインを欠くことができる、及び/又は異種シグナル配列を含むことができる。該組換え細胞は、RETを内因的に発現することができる、及び/又はRETを発現するように遺伝子改変することができる。
ある種の場合では、該組換え細胞は、レポーターをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含むレポーター構築物を含むことができ、ここでは、プロモーターは、GDF15タンパク質のGFRALに対する結合によるRETの活性化時に、レポーターの発現を誘導する。
ある種の実施態様では、該組換え細胞は、活性化されたRETによってリン酸化され得るElkタンパク質又は機能的に活性なその断片などの転写活性化因子を含むことができる。リン酸化されたElkは、レポーターをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターと結合した場合に、レポーターの転写を誘発することができるが、リン酸化されていないElkは、転写を誘発することができない。Elkタンパク質は、異種タンパク質のDNA結合ドメイン(DBD)、例えば、GAL4上流活性化配列(GAL4-UAS)と特異的に結合するGAL4DBDと融合することができる。ある種の実施態様では、該レポーター構築物のプロモーター配列は、GAL4-UASを含むことができる。ある種の実施態様では、GFRALのGDF15に対する結合によるRETの活性化は、活性化されたRETによるリン酸化を介して、Elkの活性化をもたらすことができる。ある種の実施態様では、リン酸化されたElkは、GAL4DBDを介してGAL4-UASと結合した場合に、レポーターの転写を媒介することができる。
RET活性化を検出するために、いくつかのレポーター構築物を使用することができる。例えば、レポーター配列は、直接的又は間接的に検出可能であるレポータータンパク質をコードすることができる。例えば、レポーターは、抗体を使用して検出することができる、蛍光タンパク質、酵素、又はタンパク質であり得る。
前記組換え細胞は、Elk-GAL4タンパク質の発現を誘導するプロモーター配列を含む、プラスミド又は安定に組み込まれた核酸を含むことができる。プロモーターは、構成的又は誘導性プロモーターであり得る。ある種の実施態様では、RET活性化の非存在下で、Elk-GAL4タンパク質は、有意にはリン酸化されない可能性があり、また、GAL4-UASプロモーター配列と作動可能に接続されたレポーターの転写を活性化しない可能性がある。
GFRALの細胞外ドメインと結合する薬剤を特定するために、本明細書で開示する組換え細胞を使用することができる。追加的実施態様では、GFRALと結合してRETの活性化をもたらす薬剤を特定するために、GFRALとRETとを発現する組換え細胞を使用することができる。さらに、GFRALとRETとの間の結合を調節する薬剤を特定するために、GFRALとRETとを発現するように遺伝子改変された組換え細胞を使用することができる。こうした薬剤を特定するための方法は、後に以下で論じる。
本明細書で開示するのはまた、本明細書に記載した通りの組換え細胞と、単離されたGDF15タンパク質とを含む組成物である。さらに以下で説明する通り、こうした組成物は、GFRAL-GDF15受容体-リガンド複合体のモジュレーターを特定するためのスクリーニング方法において使用することができる。
(スクリーニングの方法)
GFRALの細胞外ドメインと結合する薬剤を特定するために、本明細書に記載した単離されたタンパク質複合体及び/又は本明細書に記載した組換え細胞を使用する方法を開示する。
スクリーニングのための対象候補薬剤としては、多数の化学的分類の生物学的に活性な薬剤、(場合により、無機分子、有機金属分子、免疫グロブリン、遺伝子配列などが含まれるが)主として有機分子が挙げられる。興味深いものはまた、タンパク質との構造的な相互作用、特に水素結合のために必要な官能基を含み、かつ典型的には少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル、又はカルボキシル基、しばしば少なくとも2つの化学官能基を含む有機小分子である。候補薬剤は、多くの場合、1種以上の先述の官能基で置換された、環状炭素若しくは複素環構造及び/又は芳香族若しくは多環芳香族構造を含む。候補薬剤はまた、ペプチド、ポリヌクレオチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造類似体、又はこれらの組み合わせを含めた生体分子の中から発見される。
化合物は、合成又は天然の化合物のライブラリを含めた、非常に様々な供給源から得ることができる。例えば、生体分子を含めた非常に様々な有機化合物のランダムな及び指向性の合成のために、ランダム化オリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含めた、多数の手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、及び動物抽出物の形態の天然の化合物のライブラリが利用可能である、又は容易に生成することができる。さらに、天然の又は合成によって生成されたライブラリ及び化合物は、従来の化学的、物理的、及び生化学的手段を通じて容易に改変され、また、コンビナトリアルライブラリを生じるために使用することができる。薬理作用のある公知の物質を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化(amidification)などの指向性の又はランダムな化学的改変にかけて、構造類似体を生成することができる。
複数のアッセイを、様々な濃度に対する異なる反応を得るために、異なる濃度を用いて並行して実行することができる。当技術分野で公知の通り、薬剤の有効濃度を決定することは、典型的には、1:10、又は他の対数スケールの希釈によって生じる濃度の範囲を使用する。この濃度は、必要であれば、第2の希釈系列を用いてさらに精密にすることができる。典型的には、これらの濃度の1つは、陰性対照として(すなわち、ゼロ濃度で、又は薬剤の検出のレベル未満で)働く。
ある種の実施態様では、GFRALの細胞外ドメインと結合する薬剤を特定するための方法が開示される。この方法は、GFRALの細胞外ドメインに対する候補薬剤の結合について検定することを含むことができ、ここでは、GFRALと結合する候補薬剤が、GFRALと結合する薬剤であると特定され、ここでは、候補薬剤の結合は、GFRALの細胞外ドメインに対するGDF15の結合と比較される。
ある種の場合では、GFRAL又はそのECD含有断片は、細胞の表面上で発現させることができる。他の場合では、GFRAL又はそのECD含有断片は、支持体上に固定することができる。他の場合では、細胞表面上で発現されるGFRAL又はそのECD含有断片を発現する細胞は、支持体上に固定することができる。このアッセイは、細胞及び/又は支持体を、候補薬剤と接触させることと、候補薬剤が、GFRALの細胞外ドメインと結合するかどうかを決定することを含むことができる。結合を決定するための、任意の標準の技術を利用することができる。例えば、候補薬剤は、標識することができ、非特異的結合剤を除去するための洗浄後の、細胞又は固形状支持体への標識の残留は、候補薬剤が、GFRALの細胞外ドメインと結合することを示すことができる。先に記述した通り、この結合を、同様の条件下でのGDF15の結合と比較することができ、ここでは、GDF15と同様の親和性でGFRALの細胞外ドメインと結合する候補薬剤を、候補薬剤と特定することができる。
ある種の場合では、アッセイは、細胞表面上でGFRALを発現する組換え細胞を、候補薬剤と接触させることを含むことができ、ここでは、組換え細胞は、RETを発現するように遺伝子改変することができる。組換え細胞は、レポーターをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含有するレポーター構築物を含むこともでき、ここでは、該プロモーターは、RETの活性化時に、該レポーターの発現を誘導し、また、この方法は、レポーターの発現について検定することを含み、ここでは、陰性対照と比較した場合のレポーターの発現増大が、前記薬剤を、GFRALと結合してRETを活性化する薬剤であると特定する。
ある種の場合では、組換え細胞を候補薬剤と接触させた際のレポーターの発現を、スクリーニング方法と並行して行うことができる別のアッセイにおける、組換え細胞をGDF15と接触させた際のレポーターの発現と比較することができる。ある種の場合では、GDF15によって誘発されるのと類似のレベルでレポーター発現を誘発する候補薬剤が、GFRALと結合してRETを活性化する薬剤であると特定される。
本明細書で提供するのはまた、GDF15のGFRALに対する結合を調節する薬剤を特定するための方法である。ある種の実施態様では、この方法は、候補薬剤を、GFRALを発現するように遺伝子改変された組換え細胞と接触させることと(ここでは、接触は、GDF15の存在下である);GDF15のGFRALに対する結合のレベルを分析することとを含むことができ;ここでは、該薬剤の存在下でのGDF15のGFRALに対する結合のレベルの、該薬剤の非存在下でのGDF15のGFRALに対する結合のレベルと比較した場合の変化によって、該薬剤は、GFRALに対するGDF15結合のモジュレーターとしての薬剤であると特定される。
ある種の実施態様では、GDF15は、検出可能なように標識することができ、候補薬剤の存在下での組換え細胞と結合した標識の量の低下によって、該薬剤は、GFRALに対する結合についてGDF15と競合する薬剤であると特定することができる。代替実施態様では、候補薬剤は、検出可能なように標識することができ、アッセイは、非標識であり得るGDF15の存在下での候補薬剤のGFRALに対する結合を決定することを含むことができる。
ある種の場合では、GDF15の存在下でのスクリーニングにおいて使用される組換え細胞は、先に記述した通りにRETを発現するように遺伝子改変することができ、かつ、レポーターをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含有するレポーター構築物を含み、ここでは、該プロモーターは、RETの活性化時に、該レポーターの発現を誘導し、前記検定は、レポーターの発現について検定することを含み、ここでは、該薬剤の非存在下での発現と比較した場合のレポーターの発現の変化によって、該薬剤は、GDF15のGFRALに対する結合を調節する薬剤であると特定される。
ある種の場合では、薬剤は、GDF15のGFRALに対する結合を阻害することができ、GDF15-GFRAL結合のアンタゴニストと特定することができる。他の場合では、薬剤は、GDF15のGFRALに対する結合を増大させることができ、GDF15-GFRAL結合のアゴニストと特定することができる。
ある種の実施態様では、薬剤は、GFRALに対する結合について、GDF15と競合することができる。ある種の場合では、薬剤は、GFRALと結合する場合に、RETの活性化及びレポーター発現をもたらすことができる。
本明細書で提供されるのは、GFRALとRETとの間の結合を調節する薬剤を特定するためのアッセイである。このアッセイは、細胞表面上にGFRAL及びRETを発現するように遺伝子操作された組換え細胞を、候補薬剤と接触させることと、GFRALとRETとの間の結合を評価することとを含むことができる。ある種の場合では、GFRALとRETとの間の結合は、陰性対照と比較して、薬剤の存在下で増大又は低下する可能性があり、これによって、該薬剤が、GFRALとRETとの結合のモジュレーターと特定される。GFRAとRETとの間の結合は、タンパク質-タンパク質結合を評価するための標準の方法を使用して評価することができる。
タンパク質-タンパク質結合を評価するための例示的な方法としては、免疫沈降、免疫染色、生物発光共鳴エネルギー転移(BRET)、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、TR-FRET(時間分解FRET)、又はHTRF(均一性時間分解蛍光)によるものが挙げられる。
本明細書に記述した通り、タンパク質、例えば、GFRAL、RET、及びGDF15の1つ又は複数は、タグ(例えば、ポリヒスチジンタグ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)タグ、FLAGタグ、HAタグ、Fcタグ、HSAタグなど);蛍光タンパク質(GFP、YFP、RFPなど)、生物発光タンパク質(例えば、ルシフェラーゼ)などの異種配列と複合体化させることができる。
ある種の実施態様では、結合対(例えば、タンパク質の対)のメンバー間の結合、又は薬剤(非タンパク質薬剤)のタンパク質に対する結合を、FRET又はBRETを使用して評価することができる。例えば、結合対の一方のメンバーを、第1のフルオロフォア(例えばCFP)又は生物発光タンパク質(例えばルシフェラーゼ)と複合体化させることができ、他方のメンバーを、第2のフルオロフォア(例えばYFP)と複合体化させることができる。
(組成物)
本開示は、意図しない体重減少の治療又は予防の必要がある、又はGDF15活性の低下の必要がある対象に投与することができる、対象タンパク質を含む組成物を提供する。ある種の場合では、該組成物は、本明細書に記載した通りのGFRAL ECD、GFRAL ECD断片、GFRAL ECDバリアントなどのポリペプチド、又はその組み合わせを含むことができる。
本開示のポリペプチドは、対象への投与に適した組成物の形態であり得る。一般に、こうした組成物は、1以上のポリペプチドと、1以上の医薬として許容し得る又は生理的に許容し得る希釈剤、担体、又は賦形剤を含む「医薬組成物」である。ある種の実施態様では、該ポリペプチドは、治療有効量で存在する。該医薬組成物は、本開示の方法において使用することができる;したがって、例えば、該医薬組成物は、本明細書に記載した治療的及び予防的方法並びに使用を実施するために、対象にエクスビボ又はインビボで投与することができる。
本開示の医薬組成物は、意図される投与方法又は投与経路と適合するように製剤化することができ;投与経路の例は、本明細書に説明している。さらに、本医薬組成物は、本開示によって意図される通りの疾患、障害、及び状態を治療又は予防するために、他の治療的に活性な薬剤又は化合物(例えば、食欲増進剤)と組み合わせて使用することができる。
該医薬組成物は、典型的には、本開示によって意図される治療有効量のポリペプチドの少なくとも1種と、医薬としてかつ生理的に許容し得る1種以上の製剤物質とを含む。医薬として許容し得る又は生理的に許容し得る適切な希釈剤、担体、又は賦形剤としては、限定はされないが、抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸及び硫酸水素ナトリウム)、保存剤(例えば、ベンジルアルコール、メチルパラベン、エチル又はn-プロピル、p-ヒドロキシ安息香酸エステル)、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、溶媒、充填剤、増量剤、界面活性剤、緩衝液、ビヒクル、希釈剤、及び/又は補助剤が挙げられる。例えば、適切なビヒクルは、非経口投与のための医薬組成物に一般的な他の材料がおそらく添加された、生理食塩水溶液又はクエン酸緩衝生理食塩水であり得る。中性の緩衝生理食塩水又は血清アルブミンと混合した生理食塩水は、さらなるビヒクル例である。当業者は、医薬組成物及び剤形において使用することができる様々な緩衝液を容易に認識するであろう。典型的な緩衝液としては、限定はされないが、医薬として許容し得る弱酸、弱塩基、又はそれらの混合物が挙げられる。例としては、緩衝成分は、リン酸、酒石酸、乳酸、コハク酸、クエン酸、酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びこれらの塩などの、水溶性材料であり得る。許容し得る緩衝薬としては、例えば、トリス緩衝液、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N’-(2-エタンスルホン酸)(HEPES)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸ナトリウム塩(MES)、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、及びN-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)が挙げられる。
医薬組成物は、製剤化した後、液剤、懸濁剤、ゲル剤、乳剤、固形剤、又は脱水若しくは凍結乾燥された散剤として、滅菌バイアル中で保管することができる。こうした製剤は、すぐに使える形態、使用前に再構成を必要とする凍結乾燥形態、使用前に希釈を必要とする液体形態、又は他の許容し得る形態のいずれかで保管することができる。いくつかの実施態様では、医薬組成物は、単回使用容器(例えば、単回使用のバイアル、アンプル、注射器、又は自己注射器(例えばEpiPen(登録商標)に類似したもの))中で提供されるのに対し、他の実施態様では、反復使用容器(例えば、反復使用バイアル)が提供される。埋め込み体(例えば埋め込み型ポンプ)及びカテーテルシステム(これらはどちらも当業者に周知である)を含めた、任意の薬物送達器具を使用して、ポリペプチドを送達することができる。一般に皮下又は筋肉内に投与されるデポー注射剤も、本明細書に開示するポリペプチドを規定された期間にわたって放出するために利用することができる。デポー注射剤は通常、固体-基剤又は油-基剤のいずれかであり、一般に、本明細書に説明した製剤成分の少なくとも1つを含む。当業者は、デポー注射剤の可能な製剤及び使用について熟知している。
医薬組成物は、無菌の水性又は油性の注射用懸濁剤の形態であり得る。この懸濁剤は、本明細書に言及した適切な分散若しくは湿潤剤及び懸濁化剤を使用して、公知の技術に従って製剤化することができる。無菌の注射用調製物はまた、無毒の非経口的に許容し得る希釈剤又は溶媒中の、例えば1,3-ブタンジオールの溶液としての、無菌の注射用液剤又は懸濁剤であり得る。用いることができる許容し得る希釈剤、溶媒、及び分散媒としては、水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液、クレモフォールEL(商標)(BASF社,Parsippany,NJ)又はリン酸緩衝食塩水(PBS)、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール)、並びにこれらの適切な混合物が挙げられる。さらに、溶媒又は懸濁媒として、従来、無菌の不揮発性油が用いられている。この目的のために、合成のモノ-又はジグリセリドを含めた、いかなる無刺激性の不揮発性油も用いることができる。さらに、注射剤の調製においては、オレイン酸などの脂肪酸の使用が認められる。特定の注射用製剤の吸収の延長は、吸収を遅延させる作用物質(例えば、モノステアリン酸アルミニウム又はゼラチン)を含めることによって実現することができる。
活性成分(例えば、本開示のポリペプチド)を含有する医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセル、トローチ、舐剤、水性若しくは油性懸濁剤、分散可能な散剤若しくは顆粒剤、乳剤、硬若しくは軟カプセル、又はシロップ、液剤、マイクロビーズ、又はエリキシルとしての、経口使用に適した形態であり得る。経口使用が意図される医薬組成物は、医薬組成物の製造に関して当技術分野で公知の任意の方法に従って調製することができ、こうした組成物は、医薬として洗練されかつ口当たりの良い調製物を提供するために、例えば甘味剤、着香料、着色剤、及び保存剤などの1種以上の作用物質を含有することができる。錠剤、カプセルなどは、錠剤の製造に適した無毒の医薬として許容し得る賦形剤と混合した活性成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば、希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、又はリン酸ナトリウムなど;造粒剤及び崩壊剤、例えばトウモロコシデンプン、又はアルギン酸;結合剤、例えばデンプン、ゼラチン、又はアカシアゴム;並びに滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、又はタルクであり得る。
経口投与に適した錠剤、カプセルなどは、コーティングされなくてもよいし、消化管内での崩壊及び吸収を遅延させ、それによって持続作用を提供するために、公知の技術によってコーティングすることもできる。例えば、モノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を用いることができる。これらはまた、制御放出のための浸透圧性治療用錠剤を形成するために、当技術分野で公知の技術によってコーティングすることができる。追加の薬剤は、投与される組成物の送達を制御するために、生分解性又は生体適合性の粒子又は高分子物質、例えばポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、ポリ無水物、ポリグリコール酸、エチレン-酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、又はラクチド/グリコリドコポリマー、ポリラクチド/グリコリドコポリマー、又はエチレン酢酸ビニルコポリマーなどを含む。例えば、経口用薬剤は、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル又はポリ(メチルメタクロレート(methylmethacrolate))マイクロカプセルそれぞれの使用により、コアセルベーション技術によって又は界面重合によって調製したマイクロカプセル中に、或いはコロイド薬物送達システム中に、封入することができる。コロイド分散システムには、巨大分子複合体、ナノ-カプセル、ミクロスフェア、マイクロビーズ、並びに水中油型エマルジョン、ミセル、混合型ミセル、及びリポソームを含めた脂質-ベースのシステムが含まれる。リポソームを調製する方法は、例えば、米国特許第4,235,871号、第4,501,728号、及び第4,837,028号に記載されている。先に言及した製剤の調製のための方法は、当業者に明らかであろう。
経口使用のための製剤はまた、活性成分が例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、カオリン、又は微結晶セルロースなどの不活性な固形希釈剤と混合されている硬ゼラチンカプセルとして、或いは活性成分が水又は油性媒体、例えばピーナッツ油、流動パラフィン、若しくはオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセルとして、提供することができる。
水性懸濁剤は、その製造に適した賦形剤との混合物中に活性な材料を含有する。こうした賦形剤は、懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシ-プロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル-ピロリドン、トラガカントゴム、及びアカシアゴム;分散剤又は湿潤剤、例えば、天然に存在するホスファチド(例えばレシチン)、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物(例えばステアリン酸ポリオキシ-エチレン)、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物(例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール)、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール由来の部分エステルとの縮合生成物(例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール)、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合生成物(例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビタン)であり得る。水性懸濁剤は、1種以上の保存剤を含有することもできる。
油性懸濁剤は、活性成分を、植物油、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、若しくはココナツ油に、又は流動パラフィンなどの鉱油に懸濁することによって、製剤化することができる。油性懸濁剤は、増粘剤、例えばミツロウ、固形パラフィン、又はセチルアルコールを含有することができる。先に示したものなどの甘味剤、及び着香料を添加して、口当たりの良い経口調製品を提供することができる。
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散可能な散剤及び顆粒剤は、分散剤又は湿潤剤、懸濁化剤、及び1種以上の保存剤との混合物中の活性成分を提供する。適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤は、本明細書に例示されている。
本開示の医薬組成物はまた、水中油型エマルジョンの形態であり得る。油相は、植物油、例えばオリーブ油若しくはラッカセイ油、又は鉱油、例えば流動パラフィン、又はこれらの混合物であり得る。適切な乳化剤は、天然に存在するゴム、例えばアカシアゴム又はトラガカントゴム;天然に存在するホスファチド、例えば、ダイズ、レシチン、及び脂肪酸由来のエステル若しくは部分エステル;ヘキシトール無水物、例えば、モノオレイン酸ソルビタン;並びに、部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えば、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタンであり得る。
製剤はまた、インプラント、リポソーム、ヒドロゲル、プロドラッグ、及びマイクロカプセル化送達システムを含めた制御放出製剤などの、迅速な分解又は体からの排出から組成物を保護するための担体も含むことができる。例えば、単独の、又はワックスと組み合わせたモノステアリン酸グリセリル若しくはステアリン酸グリセリルなどの時間遅延材料を用いることができる。
本開示は、薬物の直腸内投与のための座剤の形態のポリペプチドの投与を意図する。座剤は、薬物を、常温では固体であるが、直腸温度では液体であり、従って直腸内で融解して薬物を放出することとなる、適切な非刺激性の賦形剤と混合することによって調製することができる。こうした材料としては、限定はされないが、カカオ脂及びポリエチレングリコールが挙げられる。
本開示によって意図されるポリペプチドは、現在公知である又は将来開発される、任意の他の適切な医薬組成物(例えば、経鼻又は吸入使用のためのスプレー剤)の形態であり得る。
製剤中のポリペプチド又はその断片の濃度は、(例えば、重量で、約0.1%未満から、通常約2%若しくは少なくとも約2%で、20%から50%と同程度若しくはそれ以上まで)広く変動する可能性があり、通常、主として流体体積、粘度、及び対象に基づく要因(例えば、選択された投与の特定の様式に従うもの)に基づいて選択されることとなる。
本明細書で意図されるのは、Nano Precision Medical社のデポ送達技術(Nano Precision Medical社;Emeryville,CA)の使用である。この技術は、0次放出速度の巨大分子(タンパク質及びペプチド治療剤など)を生成するチタニアナノチューブ膜を利用する。この生体適合性の膜は、治療用巨大分子の長期の(例えば最大1年の)一定速度の送達を提供する、小さい皮下埋め込み体内に収められる。この技術は、II型糖尿病の治療のためのGLP-1アゴニストの送達について、現在、評価中である。ある種の実施態様では、本明細書で開示するポリペプチド(1又は複数)は、膜を伴う製剤であり得る。例えば、ポリペプチドを、膜に含浸させる、又は膜によって囲むことができる。膜は、ディスク、チューブ、又は球の形態であり得る。ある種の実施態様では、チューブはナノチューブであり得る、又は球はナノ球体であり得る。
対象の医薬組成物は、GFRAL、GFRAL細胞外ドメイン、又は可溶性GFRAL-ECDポリペプチドと、医薬として許容し得る賦形剤とを含むことができる。
(患者集団)
本開示は、意図しない体重減少を患う患者を治療するための方法を提供する。適切な患者の例は、消耗性疾患又は悪液質と診断された患者であり得る。適切な患者としては、肝硬変、甲状腺機能亢進症、慢性腎疾患、パーキンソン病、癌、摂食障害(例えば、神経性食欲不振症)、慢性炎症性疾患(例えば、関節リウマチ)、敗血症又は他の形態の全身性炎症、慢性閉塞性肺疾患、AIDS、結核、及び筋消耗(筋ジストロフィー又は多発性硬化症など)、又はサルコペニアを患う患者が挙げられる。
本開示はまた、慢性疾患、例えば、肝硬変、甲状腺機能亢進症、慢性腎疾患、パーキンソン病、癌、摂食障害(例えば、神経性食欲不振症)、慢性炎症性疾患(例えば、関節リウマチ)、敗血症又は他の形態の全身性炎症、慢性閉塞性肺疾患、AIDS、結核、及び筋消耗(筋ジストロフィー又は多発性硬化症など)、又はサルコペニアが原因の、意図しない体重減少のリスクがある可能性がある患者における意図しない体重減少を予防するための方法を提供する。こうした患者には、GDF15のレベルが上昇した、癌などのための治療を受けている患者が含まれ得る。
本開示は、悪液質を患う患者を治療する方法を提供する。適切な患者の例は、悪液質と診断された患者であり得る。本開示はまた、悪液質の発生が原因の意図しない体重減少のリスクがある可能性がある患者における、意図しない体重減少を予防するための方法を提供する。こうした患者としては、GDF15のレベルが上昇した、癌を有する、癌について治療を受けている、摂食障害を有するなどの患者が挙げられる。
開示されるのはまた、GDF15活性上昇を有する患者におけるGDF15活性を低下させるための方法である。本明細書で使用する場合、「GDF15活性上昇」は、正常な対象と比較した、対象の体液内のGDF15の活性又は量の増大を指す。いくつかの状態が、GDF15血清濃度の増大と関連しており、ここでは、GDF15の増大は、食欲喪失、体重減少などのいくつかの症状をもたらす。GDF15血清濃度の増大に関連する状態の例としては、癌、例えば、メラノーマ、胃癌、膵癌、前立腺癌;関節炎及び炎症などの自己免疫疾患;アテローム性動脈硬化症、心不全、高血圧、心筋梗塞、胸痛、及び心血管イベントのような循環器疾患;貧血、悪液質、食欲不振、腎疾患、及びサラセミアのような代謝疾患などが挙げられる。
先述の障害のいずれかを有する患者は、GFRALタンパク質の細胞外ドメイン、又はGFRAL細胞外ドメインを含むGFRALの断片、例えば可溶性GFRAL ECDと結合する薬剤、又は薬剤とGFRAL断片との組み合わせを受ける候補に適している可能性がある。
こうした個人において、GFRAL ECD、GFRAL ECD断片、及び/又はGFRAL ECDバリアントなどの対象GFRALタンパク質断片を投与することは、障害に関連する1以上の症状を軽減又は予防することができる。例えば、本開示のタンパク質を投与することは、対象における体重及び/又は食欲を増大させることができる。
(方法)
対象方法は、意図しない体重減少を有する又は意図しない体重減少を起こすリスクがある患者に、対象タンパク質を投与することを含む。対象方法は、GDF15の血清濃度の上昇を有する対象に、本明細書で開示するタンパク質を投与することを含む。本開示の方法は、GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する薬剤;及びGFRAL細胞外ドメイン(例えば、可溶性GFRAL-ECD)を含むGFRALの断片、のうちの少なくとも1つを投与することを含む。
ある種の場合では、薬剤は、GFRALの細胞外ドメインに対する結合についてGDF15と競合する、抗GFRAL抗体であり得る。ある種の場合では、薬剤は、GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合するがRETを活性化しない薬剤であり得る。例えば、薬剤は、GFRALの細胞外ドメインに対する結合についてGDF15と競合するが、GFRALに対する結合時にRETを活性化しない、抗GFRAL抗体であり得る。こうした抗体は、実験動物をGFRAL ECDで免疫化することと、産生された抗体を、本明細書に記載した通りのGFRAL結合アッセイ及び/又はGFRALシグナル伝達アッセイにおいてスクリーニングすることによって産生することができる。こうした抗GFRAL抗体は、標準の方法を使用することによって、キメラ又はヒト化抗体を産生するように改変することができる。
ある種の場合では、悪液質を有する又は悪液質を発症するリスクがある患者に投与されるGFRALの断片は、本明細書に記載した通りのGFRAL ECD、GFRAL ECD断片、及び/又はGFRAL ECDバリアントであり得る。
悪液質を有する、有する疑いがある、又は発症するリスクがある対象が、本明細書に記載した治療法について意図される。
本開示の方法では、例えば、目標体重を達成する及び/又は体重を維持する;目標ボディマス指数(BMI)を達成する及び/又はBMIを維持する;食欲を増大させる;などのために、本明細書に記載したタンパク質組成物を、対象(例えば、ヒト患者)に投与することができる。正常なヒト成人は、18.5〜24.9Kg/m2の範囲内のBMIを有する。
対象治療方法は、患者における体重、BMI、筋重量、及び/又は食物摂取を、少なくとも約5%、例えば、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、又はそれ以上、増大させることができる。
ある種の場合では、薬剤は、本明細書で開示するスクリーニング方法などの、GFRAL結合薬剤についてのスクリーニング方法を介して特定された薬剤であり得る。
本明細書で意図される悪液質の治療又は予防に関する方法としては、例えば、単独の又は他の種類の治療法と組み合わせた治療法/予防法のための、先に記載したタンパク質の使用が挙げられる。
該方法は、対象タンパク質を対象に(例えば、皮下、皮内、又は静脈内)投与することを含む。
いくつかの実施態様では、該薬剤は、筋肉量の低下、例えば、基礎疾患に関連する筋肉量の低下を経験している患者に投与される。悪液質に関連する基礎疾患としては、限定はされないが、癌、慢性腎疾患、慢性閉塞性肺疾患、AIDS、結核、慢性炎症性疾患、敗血症、及び他の形態の全身性炎症、筋ジストロフィーなどの筋消耗、及び神経性食欲不振症として公知である摂食障害が挙げられる。いくつかの実施態様では、該薬剤は、除脂肪体重(例えば、筋肉量)及び又は体脂肪量の減少を、少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、又は100%抑制する。
いくつかの実施態様では、除脂肪体重(例えば、筋肉量)の減少は、体脂肪量の減少を伴う。いくつかの実施態様では、薬剤は、体脂肪量の減少を、少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、又は100%抑制することができる。
いくつかの実施態様では、薬剤は、体重減少(例えば、意図しない体重減少)と診断された患者に投与される。いくつかの実施態様では、薬剤は、体重減少(例えば、意図しない体重減少)を、少なくとも2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、又は35%戻すことができる。
いくつかの実施態様では、薬剤は、器官質量の減少(loss of organ mass)、例えば、基礎疾患に関連する器官質量の減少と診断された患者に投与される。悪液質に関連する基礎疾患としては、限定はされないが、癌、慢性腎疾患、慢性閉塞性肺疾患、AIDS、結核、慢性炎症性疾患、敗血症及び他の形態の全身性炎症、筋ジストロフィーなどの筋消耗、及び神経性食欲不振症として公知である摂食障害が挙げられる。いくつかの実施態様では、薬剤は、器官質量の減少を、少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、又は100%抑制することができる。いくつかの実施態様では、器官質量の減少は、心臓、肝臓、腎臓、及び/又は脾臓において観察される。いくつかの実施態様では、器官質量の減少は、筋肉量の低下、体脂肪量の減少、及び/又は意図しない体重減少を伴う。
サルコペニア、筋消耗性障害、及び著しい筋重量低下は、悪液質、食欲減退、又は体重減少の非存在下で起こり得る。いくつかの実施態様では、薬剤は、対象が、悪液質又は食欲減退を有する、又は診断されているかどうかに関わりなく、サルコペニア、筋消耗性障害、及び/又は著しい筋重量低下と診断された対象を治療するために使用することができる。こうした方法は、その必要がある対象に、治療有効量の1以上の薬剤を投与することを含む。
いくつかの実施態様では、薬剤は、肥満と診断された患者に投与される。いくつかの実施態様では、薬剤は、少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、又は50%、体重増加を抑制する又は体重を減少させることができる。患者における肥満を治療するための薬剤の使用は、治療有効量の薬剤を患者に投与することを含む。
(投与経路)
本開示は、任意の適切な方式での、開示されたポリペプチド、及びその組成物の投与を意図する。適切な投与経路としては、非経口(例えば、筋肉内、静脈内、皮下(例えば、注射又は埋め込み))、腹腔内、大槽内、関節内、腹腔内、脳内(実質内)、及び脳室内)、経口、経鼻、膣内、舌下、眼内、直腸内、局所(例えば、経皮)、舌下、及び吸入が挙げられる。
本明細書で開示されたポリペプチドを、規定の期間にわたって放出するために、一般に皮下又は筋肉内に投与されるデポー注射も利用することができる。デポー注射は、通常、固体又はオイル基剤であり、一般に、本明細書に説明した製剤成分の少なくとも1種を含む。当業者は、可能な製剤及びデポー注射の使用について熟知している。
抗体に関しては、例示的な実施態様において、本開示の抗体又は抗体断片を、注射用の無菌の等張性の生理食塩水溶液中で10mg/mlで4℃で保管し、対象への投与の前に、注射用の100ml又は200ml 0.9%塩化ナトリウムに希釈する。抗体は、静脈内注入によって、0.2から10mg/kgの用量で、1時間かけて投与される。他の実施態様では、抗体は、静脈内注入によって、15分から2時間かけて投与される。さらに他の実施態様では、投与手順は、皮下の急速静注を介する。
本開示は、本開示のポリペプチド又は抗体若しくは抗体断片が、少なくとも1日2回、少なくとも1日1回、少なくとも48時間ごとに、少なくとも72時間ごとに、少なくとも週1回、少なくとも2週間ごとに、少なくとも1か月に1回、少なくとも2か月ごとに、又は少なくとも3か月ごとに、又はそれより低い頻度で対象に投与される方法を意図する。
(組み合わせ療法)
悪液質を治療又は予防することに指向される非常に様々な治療法のいずれかを、対象タンパク質を伴う組成物又は治療方法において組み合わせることができる。
「組み合わせ」は、本明細書で使用する場合、別々に投与することができる、例えば、別々の投与のために別々に製剤化される(例えば、1つのキット内に提供することができる)治療法、並びに、単一の製剤(すなわち「共製剤(co-formulated)」)での投与のための治療法を含むことが意図される。組み合わせ療法において提供することができる薬剤の例としては、GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合し、かつGFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する薬剤、例えば、GFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する抗体が挙げられる。例示的な組み合わせ療法は、抗GFRAL ECD抗体、及びGFRAL細胞外ドメイン、例えば可溶性GFRAL-ECDを含むGFRALの断片を投与することを含むことができる。
GFRAL-ECDタンパク質が、1以上の他の治療法と組み合わせて投与される場合、この組み合わせは、概して、対象タンパク質の投与と同時から、5時間又はそれ以上、例えば、10時間、15時間、20時間、又はそれ以上前又は後に投与することができる。ある種の実施態様では、例えば、対象タンパク質が、別の治療的処置の前又は後に投与される場合、対象タンパク質と他の治療介入は、連続的に投与又は適用される。さらに他の実施態様では、例えば、対象タンパク質と第2の治療法が、同じ時点で投与される場合、例えば、第2の治療法が、対象に投与される、2つの別の製剤として、又は単一の組成物にまとめて、対象タンパク質と共に投与することができる薬物である時、対象タンパク質と他の治療法は、同時に施される。先に説明した通りに連続的に投与されるか同時に投与されるかにかかわらず、これらの治療は、本開示の目的では、共に又は組み合わせで施されるとみなされる。
悪液質に関与するサイトカインとしては、アクチビンA及びIL-6が挙げられる。アクチビンレベルの増大は、癌関連の悪液質及び性腺腫瘍に関連している。例えば、Marinoらの文献(2013年) CYTOKINE & GROWTH FACTOR REV.24:477-484を参照のこと。アクチビンAは、TGF-βファミリーのメンバーであり、アクチビン2型受容体、ActRIIBのリガンドである。例えば、Zhouらの文献(2010年) CELL 142:531-543を参照のこと。IL-6の循環濃度は、癌患者における体重減少と、また生存率低下と相関することが示されている。例えば、Fearonらの文献(2012年) CELL METABOLISM 16:153-166を参照のこと。
したがって、いくつかの実施態様では、アクチビン-A又はアクチビン-A受容体、ActRIIB、IL-6又はIL-6受容体(IL-6R)の1種以上の阻害剤を、GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する及び/又はGFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する薬剤(例えば、GFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する抗体)と組み合わせて投与する(例えば、同じ時点で投与する、前に投与する、又は後に投与する)ことができる。アクチビンA又はActRIIBの例示的な阻害剤としては、例えば、抗アクチビン-A抗体又はその抗原結合断片、抗ActRIIB抗体又はその抗原結合断片、アクチビン-Aの小分子阻害剤、ActRIIBの小分子阻害剤、並びにActRIIBの「デコイ」受容体、例えば、可溶性ActRIIB受容体、及び可溶性ActRIIB受容体とFc分子との融合体(ActRIIB-Fc)が挙げられる。例えば、Zhouらの文献(2010年)、上記を参照のこと。IL-6又はIL-6Rの適切な阻害剤としては、抗IL-6抗体又はその抗原結合断片、抗IL-6R抗体又はその抗原結合断片、IL-6の小分子阻害剤、IL-6Rの小分子阻害剤、及びIL-6Rの「デコイ」受容体、例えば、可溶性IL-6受容体、及び可溶性IL-6受容体とFc分子との融合体(IL6R-Fc)が挙げられる。例えば、Enomotoらの文献(2004年) BlOCHEM.AND BIOPHYS.RES.COMM.323:1096-1 102;Argilesらの文献(2011年) EUR.J.PHARMACOL.668:S81-S86;Tucaらの文献(2013年) ONCOLOGY/HEMATOLOGY 88:625-636を参照のこと。IL-6又はIL-6Rの適切な阻害剤としては、例えば、関節リウマチの治療のために認可されたトシリズマブ(Actemra(登録商標)、Hoffmann-LaRoche社)、すなわちヒト化抗IL-6Rモノクローナル抗体、及び関節リウマチの治療のための臨床開発におけるサリルマブ/REGN88(Regeneron社)、すなわちヒト化抗IL6R抗体;並びにIL-6産生を阻害することが示されているセルメチニブ/AZD6244(AstraZeneca社)、すなわちMEKのアロステリック阻害剤を挙げることができる。Pradoらの文献(2012年) BRITISH J.CANCER 106:1583-1586。
TNFα及びIL-1は、炎症誘発性応答の媒介に関与することが公知であるサイトカインであり、これは、また、筋消耗(muscle depletion)、食欲不振、及び悪液質に関与する。TNFαの循環濃度上昇は、筋形成を阻害すると思われる。TNFαは、「カケクチン」としても知られており、インターロイキン-1分泌を刺激し、悪液質の誘発に関与する。IL-1は、急性期炎症反応の強力な誘因であり、IL-1の注入が、著しい体重減少及び食欲喪失をもたらすことができることが示されている。IL-1は、マウス結腸-26腺癌を抱えるマウスにおける癌悪液質の開始に寄与することが示されている(Strassmannらの文献(1993年) J.IMMUNOL.150:2341)。Mathys及びBilliauの文献(1997年) NUTRITION 13 :763-770;Fongらの文献(1989年) AM.J.PHYSIOL.-REGULATORY,INTEGRATIVE AND COMPARATIVE PHYSIOL.,256:R659-R665も参照のこと。したがって、関節リウマチの治療において使用されるTNFα阻害剤及びIL-1阻害剤は、悪液質の治療においても有用であり得る。
したがって、いくつかの実施態様では、TNFα又はIL-1の1種以上の阻害剤を、GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する及び/又はGFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する薬剤(例えば、GFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する抗体)と組み合わせて投与する(例えば、同じ時点で投与する、前に投与する、又は後に投与する)ことができる。TNFα又はIL-1の適切な阻害剤としては、抗TNFα抗体又はその抗原結合断片、抗IL-1抗体又はその抗原結合断片、TNFα又はIL-1の小分子阻害剤、並びにTNFα又はIL-1の「デコイ」受容体、例えば、可溶性TNFα又はIL-1受容体、及び可溶性形態のTNFα又はIL-1とFc分子との融合体が挙げられる。TNFαの適切な阻害剤としては、例えば、エタネルセプト(Enbrel(登録商標)、Pfizer社/Amgen社)、インフリキシマブ(Remicade(登録商標)、Janssen Biotech社)、アダリムマブ(Humira(登録商標)、Abbvie社)、ゴリムマブ(Simponi(登録商標)、Johnson and Johnson社/Merck社)、及びセルトリズマブペゴル(Cimzia(登録商標)、UCB社)が挙げられる。適切なIL-1阻害剤としては、例えば、IL-1aを標的にするXilonix(登録商標)抗体(XBiotech社)、アニキンラ(anikinra)(Kinaret(登録商標)、Amgen社)、カナキヌマブ(Ilaris(登録商標)、Novartis社)、及びリロナセプト(Arcalyst(登録商標)、Regeneron社)が挙げられる。ある種の実施態様では、典型的には関節リウマチの治療のために全身的に投与されるTNFa阻害剤又はIL-1阻害剤を、局所的に、及び腫瘍部位に直接的に投与することができる。
GDF-8としても公知であるミオスタチンは、ミオスタチン欠損哺乳類における筋肉量の増大によって示される通り、筋肉量の負の調節因子であるペプチドのTGF-βファミリーののメンバーである。ミオスタチンは、アクチビン2型受容体、ActRllBのリガンドである。
したがって、いくつかの実施態様では、ミオスタチン又はその受容体の1種以上の阻害剤を、GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する及び/又はGFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する薬剤(例えば、GFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する抗体)と組み合わせて投与する(例えば、同じ時点で投与する、前に投与する、又は後に投与する)ことができる。ミオスタチン又はActRllBの適切な阻害剤としては、抗ミオスタチン抗体又はその抗原結合断片、抗ActRIIB抗体又はその抗原結合断片、ミオスタチンの小分子阻害剤、ActRllBの小分子阻害剤、及びGDF-8の「デコイ」受容体、例えば、可溶性ActRllB、及び可溶性形態のActRllBとFc分子との融合体が挙げられる。例えば、Lokireddyらの文献(2012年) BlOCHEM.J.446(l):23-26を参照のこと。本発明の方法に適している可能性があるミオスタチン阻害剤としては、REGN1033(Regeneron社);Bauerleinらの文献(2013年) J.CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE:第7回悪液質カンファレンスの抄録(Abstracts of the 7th Cachexia Conference)(2013年12月9〜11日、日本、神戸/大阪)、抄録(Abstract)4-06を参照のこと;LY2495655(Lilly社)、Eli Lilly社による、臨床開発におけるヒト化抗ミオスタチン抗体;clinicaltrials.gov/ct2/NCT01505530でワールドワイドウェブ上で利用可能な「膵癌を有する参加者におけるLY2495655の第2相試験(A PHASE 2 STUDY OF LY2495655 IN PARTICIPANTS WITH PANCREATIC CANCER)」も参照のこと;NML識別子:NCT01505530;ACE-031(Acceleron Pharma社);及びスタムルマブ(stamulumab)(Pfizer社)が挙げられる。
グレリン若しくはグレリン模倣体、又はグレリン受容体としても公知であるGHS受容体(GHS-Rla)を活性化することができる他の成長ホルモン分泌促進因子(GHS)などの薬剤は、ヒトにおける食物摂取及び体重を増加させるのに有用であり得る。Guilloryらの文献(2013年) VITAMINS AND HORMONES vol.92,chap.3内;及びSteinman及びDeBoerの文献(2013年) VITAMINS AND HORMONES vol.92,chap.8を参照のこと。したがって、いくつかの実施態様では、1種以上のグレリン若しくはグレリン模倣体、又は他の成長ホルモン分泌促進因子(GHS)を、GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する及び/又はGFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する薬剤(例えば、GFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する抗体)と組み合わせて投与する(例えば、同じ時点で投与する、前に投与する、又は後に投与する)ことができる。適切なグレリン模倣体としては、アナモレリン(Helsinn,Lugano,CH);(Temelらの文献(2013年) J.CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE:第7回悪液質カンファレンスの抄録(Abstracts of the 7th Cachexia Conference)(2013年12月9〜11日、日本、神戸/大阪)、抄録(Abstract)5-01を参照のこと)が挙げられる。他の適切なGHS分子は、例えば、PCT公報WO2011/117254及びWO2012/113103に記載されている成長ホルモン分泌促進因子受容体グレリン競合アッセイを使用して同定することができる。
小分子及び他の選択的アンドロゲン受容体モジュレーター(SARM)を含めた、アンドロゲン受容体のアゴニストは、悪液質及び/又はサルコペニアを治療するのに有用であり得る。例えば、Mohlerらの文献(2009年) J.MED.CHEM.52:3597-3617;Nagataらの文献(2011) BlOORGANIC AND MED.CHEM.LETTERS 21:1744-1747;及びChenらの文献(2005年) MOL.INTERV.5:173-188を参照のこと。理想的には、SARMは、筋肉及び骨などのアナボリック標的組織において、テストステロンのような完全アゴニストとして作用するべきであるが、前立腺組織に対する唯一の部分的又は純粋なアンドロゲン受容体アンタゴニスト活性を示すはずである。例えば、Boveeらの文献(2010年) J.STEROID BlOCHEM.& MOL.BIOL.118:85-92を参照のこと。適切なSARMは、例えば、Zhangらの文献(2006年) BlOORG.MED.CHEM.LETT.16:5763-5766;及びZhangらの文献(2007年) BlOORG.MED.CHEM.LETT.17:439-443に記載されている方法及びアッセイの使用によって、同定することができる。
したがって、いくつかの実施態様では、1種以上のアンドロゲン受容体アゴニストを、GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する及び/又はGFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する薬剤(例えば、GFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する抗体)と組み合わせて投与する(例えば、同じ時点で投与する、前に投与する、又は後に投与する)ことができる。適切なSARMとしては、例えば、GTx-024(エノボサーム、Ostarine(登録商標)、GTx社)、すなわちGTx社によって第II相臨床開発中のSARMが挙げられる。Daltonらの文献(2011年) J.CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE 2:153-161も参照のこと。他の適切なSARMとしては、2-(2,2,2)-トリフルオロエチル-ベンズイミダゾール(Ngらの文献(2007年) BlOORG.MED.CHEM.LETT.17:1784-1787)及びJNJ-26146900(Allanらの文献(2007年) J.STEROID BlOCHEM.& MOL.BIOL.103:76-83)が挙げられる。
β-アドレナリン受容体遮断薬、すなわちβ-遮断薬は、悪液質対象における体重に対するその効果について研究されており、また、うっ血性心不全を有する患者における悪液質の部分的回復と関連している。例えば、Hryniewiczらの文献(2003年) J.CARDIAC FAILURE 9:464-468を参照のこと。β-遮断薬MT-102(PsiOxus Therapeutics社)は、癌悪液質を有する対象に対して、第2相臨床試験において評価されている。Coatsらの文献(2011年) J.CACHEXIA SARCOPENIA MUSCLE 2:201-207を参照のこと。したがって、いくつかの実施態様では、1種以上のβ-アドレナリン受容体遮断薬、すなわちβ-遮断薬を、GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する及び/又はGFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する薬剤(例えば、GFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する抗体)と組み合わせて投与する(例えば、同じ時点で投与する、前に投与する、又は後に投与する)ことができる。
メラノコルチンシグナル伝達における遺伝子異常を有するメラノコルチン受容体ノックアウトマウスは、悪液質と逆の表現型:食欲増大、除脂肪体重増加、及び代謝低下を呈する。したがって、慢性疾患に関連する悪液質に対する有望な治療として、メラノコルチン拮抗作用が浮上している(DeBoer及びMarksの文献(2006) TRENDS IN ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM 17:199-204)。
したがって、いくつかの実施態様では、1種以上のメラノコルチンペプチド又はメラノコルチン受容体の阻害剤を、GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する及び/又はGFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する薬剤(例えば、GFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する抗体)と組み合わせて投与する(例えば、同じ時点で投与する、前に投与する、又は後に投与する)ことができる。メラノコルチン又はメラノコルチン受容体の適切な阻害剤としては、抗メラノコルチンペプチド抗体又はその抗原結合断片、抗メラノコルチン受容体抗体又はその抗原結合断片、メラノコルチンペプチドの小分子阻害剤、メラノコルチン受容体の小分子阻害剤、メラノコルチン受容体の「デコイ」受容体、例えば、可溶性メラノコルチン受容体、及び可溶性メラノコルチン受容体とFc分子との融合体が挙げられる。適切なメラコルチン(melacortin)受容体阻害剤としては、例えば、メラノコルチン受容体アンタゴニスト・アグーチ関連ペプチド(AgRP(83-132))が挙げられ、これは、癌関連悪液質のマウスモデルにおける悪液質関連症状を予防することが実証されている(Joppaらの文献(2007年) PEPTIDES 28:636-642)。
抗癌剤、特に、悪液質を引き起こし、かつGDF-15レベルを上昇させることができるもの、例えばシスプラチンを、GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する及び/又はGFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する薬剤(例えば、GFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する抗体)と組み合わせて、本開示の方法において使用する(例えば、同じ時点で投与する、前に投与する、又は後に投与する)ことができる。多くの癌患者は、放射線及び/又は化学療法(これらは、患者がこうした治療法に耐える能力を制限し、したがって投薬レジメンを制限する可能性がある)の過酷な過程によって衰弱している。フルオロウラシル、アドリアマイシン、メトトレキサート、及びシスプラチンなどの、ある種の癌薬剤(cancer agent)は、それ自体で、例えば、重篤な胃腸管合併症を誘発することによって、悪液質に寄与する可能性がある。例えば、Inuiの文献(2002年) CANCER J.FOR CLINICIANS 52:72-91を参照のこと。抗癌剤が、本開示の抗GDF-15抗体と組み合わせて投与される、本開示の方法によって、悪液質の発生率及び/又は重症度を低下させ、最終的にこうした抗癌剤の最大耐量を増大させることが可能である。したがって、悪液質を引き起こす可能性がある抗癌剤での治療の有効性は、用量を制限する有害作用としての悪液質の発生率を低下させることによって、また、より高い用量の所与の抗癌剤の投与を可能にすることによって、向上させることができる。
したがって、本明細書で提供されるのは、GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する及び/又はGFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する薬剤(例えば、GFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する抗体)を、アクチビン-Aの阻害剤、ActRIIBの阻害剤、IL-6の阻害剤、又はIL-6Rの阻害剤、グレリン、グレリン模倣体、又はGHS-Rlaアゴニスト、SARM、TNFα阻害剤、IL-la阻害剤、ミオスタチン阻害剤、β-遮断薬、メラノコルチンペプチド阻害剤、メラノコルチン受容体阻害剤、及び抗癌剤からなる群から選択される薬剤と組み合わせて含む医薬組成物である。本開示はまた、哺乳類における悪液質及び/又はサルコペニアを治療、予防、又は最小化する方法であって、本開示の有効量の抗GDF-15抗体を含む医薬組成物又は組成物を、有効量の、アクチビン-Aの阻害剤、ActRIIBの阻害剤、IL-6の阻害剤、又はIL-6Rの阻害剤、グレリン、グレリン模倣体、又はGHS-Rlaアゴニスト、SARM、TNFα阻害剤、及びIL-la 阻害剤、ミオスタチン阻害剤、β-遮断薬、メラノコルチンペプチド阻害剤、又はメラノコルチン受容体阻害剤と組み合わせて、その必要がある哺乳類に投与することを含む前記方法を含む。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、基礎疾患に関連する筋肉量の低下を抑制する方法であって、GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する及び/又はGFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する有効量の薬剤(例えば、GFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する抗体)を含む医薬組成物又は組成物を、筋肉量の低下を防ぎ、減少させるための、有効量のアクチビン-Aの阻害剤、ActRIIBの阻害剤、IL-6の阻害剤、又はIL-6Rの阻害剤、グレリン、グレリン模倣体、又はGHS-Rlaアゴニスト、SARM、TNFα阻害剤、及びIL-lα阻害剤、ミオスタチン阻害剤、β-遮断薬、メラノコルチンペプチド阻害剤、又はメラノコルチン受容体阻害剤と組み合わせて、その必要がある哺乳類に投与することを含む前記方法である。基礎疾患は、癌、慢性心不全、慢性腎疾患、慢性閉塞性肺疾患、AIDS、多発性硬化症、関節リウマチ、敗血症、及び結核からなる群から選択することができる。さらに、いくつかの実施態様では、筋肉量の低下は、体脂肪量の減少を伴う。
別の態様では、本明細書で提供されるのは、哺乳類における意図しない体重減少を抑制又は軽減する方法であって、本開示の有効量の抗GDF-15抗体を含む医薬組成物(1種又は複数)を、有効量の、アクチビン-Aの阻害剤、ActRIIBの阻害剤、IL-6の阻害剤、又はIL-6Rの阻害剤、グレリン、グレリン模倣体、又はGHS-Rla アゴニスト、SARM、TNFα阻害剤、IL-lα阻害剤、ミオスタチン阻害剤、β-遮断薬、メラノコルチンペプチド阻害剤、又はメラノコルチン受容体阻害剤と組み合わせて、その必要がある哺乳類に投与することを含む前記方法である。
シスプラチンなどの、ある種の抗癌剤は、悪液質、サルコペニア、筋消耗、骨消耗(bone wasting)、又は意図しない体重減少などの1以上の症候群を引き起こす又は増大させることを含む、1以上の望ましくない有害作用を有する。したがって、別の態様では、本明細書で提供されるのは、哺乳類における、悪液質、サルコペニア、又は筋消耗、骨消耗、又は意図しない体重の減少の発生、頻度、又は重症度を予防、最小化、又は軽減しながら、癌を治療する方法であって、GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する及び/又はGFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する有効量の薬剤(例えば、GFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する抗体)を含む医薬組成物を、1以上の抗癌剤と組み合わせて、その必要がある哺乳類に投与することを含む前記方法である。いくつかの実施態様では、哺乳類における、悪液質、サルコペニア、又は筋消耗、骨消耗、又は意図しない体重の減少の発生、頻度、又は重症度を予防、最小化、又は軽減しながら、癌を治療する方法は、GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する及び/又はGFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する有効量の薬剤(例えば、GFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する抗体)を含む医薬組成物を、哺乳類における、悪液質、サルコペニア、又は筋消耗、骨消耗、又は意図しない体重の減少の発生、頻度、又は重症度を引き起こす又は増大させることが公知である1以上の抗癌剤と組み合わせて、その必要がある哺乳類に投与することを含む。
(投薬量)
該方法では、治療有効量の対象タンパク質が、その必要がある対象に投与される。例えば、対象タンパク質は、治療される前、以前には健康な個人と比較して正常な体重ではなかった患者に、有効量で血流に送達された場合に、体重を健康な個人と比較して正常なレベルに戻す。投与される量は、投与の目標、治療される個人の健康及び身体状態、年齢、所望される回復の程度、対象タンパク質の製剤、用いられる対象タンパク質の活性、治療する臨床医の医学的状況の評価、対象の状態、対象の体重、並びに悪液質の重症度、及び他の関連因子に依存して変動する。用量の大きさはまた、特定のタンパク質の投与に伴って起こる可能性がある何らかの有害な副作用の存在、性質、及び程度によって決定されることとなる。
前記の量は、慣例の試験を通して決定することができる、比較的に広い範囲内にあることとなることが予想される。例えば、体重及び/又は食欲を回復させるために用いられる対象タンパク質の量は、そうしないと対象にとって不可逆的に毒性である可能性があるおよその量(すなわち、最大耐量)を超えない。他の場合では、その量は、毒性閾値ぐらい又は毒性閾値を大きく下回るが、それでも有効濃度の範囲内である、又はさらに閾値用量ほど低い。
個々の用量は、典型的には、対象に対する測定可能な効果をもたらすのに必要とされる量以上であり、対象タンパク質又はその副産物の吸収、分布、代謝、及び排泄(「ADME」)に関する薬物動態及び薬理学に基づいて、また、したがって、対象内での組成物の動態に基づいて決定することができる。これには、投与経路並びに投薬量の考慮が含まれ、これは、経腸(全身的若しくは(消化管の一部に保持される場合)局所的効果のために、消化管を介して適用される)、又は非経口(全身的若しくは局所的効果のために、消化管以外の経路によって適用される)適用のために調整することができる。例えば、対象タンパク質の投与は、典型的には、注射を介し、多くの場合、静脈内、筋肉内、又はその組み合わせである。
有効な用量(ED)は、それを摂取する対象のうちのある割合において治療応答又は所望される効果をもたらす、薬剤の用量又は量である。薬剤の「半有効量」又はED50は、それが投与される集団の50%において治療応答又は所望される効果をもたらす、薬剤の用量又は量である。ED50は通常、薬剤の効果の合理的な予測の尺度として使用されるが、これは、必ずしも、臨床医がすべての関連する要因を考慮に入れて、適切であると考える可能性がある用量であるとは限らない。
いくつかの実施態様では、有効量は、算出されたED50と同じであり、ある種の実施態様では、有効量は、算出されたED50よりも多い量である。ある種の実施態様では、有効量は、算出されたED50よりも少ない量である。
有効量のタンパク質はまた、個人の体重を、治療前の個人の体重と比較して、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、又は80%超増加させるために、1以上の用量で投与される場合に、有効である量であり得る。
投与あたりの用量のさらなる例は、10μg未満、2μg未満、又は1μg未満であり得る。投与あたりの用量はまた、50μg超、100μg超、300μg超、最大600μgまで、又はそれ以上であり得る。体重あたりの投薬量の範囲の例は、約0.1μg/kgから約1μg/kg、最大約1mg/kgまで、又はそれ以上である。有効な量及び投薬レジメンは、アッセイから経験的に、安全性及び漸増用量範囲試験、それぞれの臨床医-患者の関係、並びに当技術分野で公知のインビトロ及びインビボアッセイから、容易に決定することができる。
用語「単位剤形」とは、本明細書で使用する場合、各単位が、所望の効果をもたらすのに十分な量で算出された、あらかじめ決定された量の本開示のタンパク質を、医薬として許容し得る希釈剤、担体、又はビヒクルと共に含有する、ヒト及び動物対象に対する単位投薬量として適した物理的に不連続の単位をいう。新規の単位剤形についての明細は、用いられる特定のタンパク質及び達成されるべき効果、並びに宿主における各タンパク質に関連する薬力学に依存する。
いくつかの実施態様では、対象タンパク質(例えば、GFRALのECDに対する結合についてGDF15と競合する抗体)の治療有効量は、0.1mg/kgから100mg/kg、1mg/kgから100mg/kg、1mg/kgから10mg/kg、又は2.0mg/kgから10mg/kgの範囲内である。投与される量は、治療される疾患又は適応症の種類及び程度、患者の健康全般、抗体又は融合タンパク質のインビボ効力、医薬製剤、抗体又は融合タンパク質の血清半減期、及び投与経路などの変数に依存し得る。初期投薬量は、所望の血中濃度又は組織レベルを迅速に達成するために、最高レベルを超えて増大させることができる。あるいは、初期投薬量は、最適よりも少ない可能性があり、投薬量は、治療の過程中に漸進的に増大させることができる。ヒト投薬量は、例えば、0.5mg/kgから20mg/kgまで実行するように設計された従来の第I相用量漸増試験において、最適化することができる。投薬頻度は、抗体又は融合タンパク質の投与経路、投薬量、血清半減期、及び治療されている疾患などの因子に応じて変動し得る。例示的な投薬頻度は、1日1回、週1回、及び2週ごとに1回である。いくつかの実施態様では、投薬は、2週ごとに1回である。好ましい投与経路は、非経口、例えば静脈内注入である。モノクローナル抗体ベースの薬物及び融合タンパク質ベースの薬物の製剤は、当技術分野の通常の技術の範囲内である。いくつかの実施態様では、抗体又は融合タンパク質は、凍結乾燥され、その後、投与時に、緩衝生理食塩水で再構成される。有効量の第2の活性な薬剤、例えば本明細書に記載した抗癌剤又は別の薬剤も、先に論じた原則に従うこととなり、また、患者において必要とされる治療効果を誘発するように選択されることとなる。
(キット)
本開示によって提供されるのはまた、本明細書で開示する組成物を使用するための、また、先に記載した通りの方法を実施するためのキットである。キットは、悪液質の治療又は予防の必要がある対象における対象タンパク質の投与のために提供することができる。キットは、本明細書で開示する1種以上のタンパク質を含むことができ、これは、滅菌した容器に入れて提供することができ、また、対象に対する投与のための、医薬として許容し得る適切な賦形剤を伴う製剤で提供することができる。該タンパク質は、そのまま使用される準備ができている、又は、所望の濃度を有するように再構成することができる製剤で提供することができる。使用者によって再構成されることとなるタンパク質が提供される場合、キットはまた、対象タンパク質とは別に包装された、緩衝液、医薬として許容し得る賦形剤などを提供することもできる。本発明のキットのタンパク質は、他の薬物と別に、又は組み合わせて製剤化することができる。
キットは、先に言及した構成成分に加えて、キットの構成成分を使用して対象方法を実施するための説明書をさらに含むことができる。対象方法を実施するための説明は、一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、説明は、紙又はプラスチックなどの基材に印刷することができる。このようなものとして、説明書は、添付文書としてキット内に、またキットの容器のラベル又はその構成成分(すなわち、包装材又は副包装材に添付して)などで、存在することができる。他の実施態様では、説明書は、適切なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、CD-ROM、ディスケットなどの上に存在する電子記憶装置データファイルとして存在する。さらに他の実施態様では、実在の説明書は、キット内には存在しないが、例えばインターネットを介して離れた供給源から説明書を得るための手段が提供される。この実施態様の一例は、説明書を見ることができる、及び/又は説明書をそこからダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得るための手段も、適切な基材に記録される。
(実施例)
完全な開示、及び本発明の実施及び使用の方法の説明を当業者に提供するために、次の実施例を提示するが、これらの実施例は、本発明者らがその発明とみなすものの範囲を制限するものではなく、下の実験が、実施される実験のすべて又は唯一の実施される実験であることを示すものでもない。使用される数(例えば、量、温度など)に関する正確性を確実にするために努力が注がれているが、いくらかの実験誤差及び偏差について考慮されるべきである。そうではないと示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセルシウス度(℃)であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。一般的な略語が使用される:例えば、bp、塩基対(1又は複数);kb、キロベース(1又は複数);pl、ピコリットル(1又は複数);s又はsec、秒(1又は複数);min、分(1又は複数);h又はhr、時間(1又は複数);aa、アミノ酸(1又は複数);kb、キロベース(1又は複数);bp、塩基対(1又は複数);nt、ヌクレオチド(1又は複数);i.m.、筋肉内(に);i.p.、腹腔内(に);s.c.、皮下(に);など。
(材料及び方法)
下の実施例では、次の方法及び材料を使用した。
HEK239-GFRAL細胞株の産生。ヒトGFRALを含有するプラスミドを、Lipofectamine 2000(Life Technology社)を使用して、HEK293細胞に形質移入した。形質移入の2日後、細胞を、DMEM(10% FBS及びハイグロマイシン(0.2mg/mL)を含有)と共に、コロニーが視認可能になるまでインキュベートした。クローンを選び、間接的免疫蛍光染色を使用して、Fc-GDF15結合について評価した。
RT-PCR。C57/BL6マウスからの組織を採取し、トリゾール(Life Technology社)によって全RNAを抽出した。250μgの全RNAを、Quantitect Multiplex RT-PCRキット(Qiagen社)を使用するRT-qPCR分析にかけた。マウスGFRALのためのPCRプライマーは、Life Technology社(カタログ番号Mm 02344885-m1)から購入した。鋳型としてマウスGFRAL cDNAを使用して作成された標準曲線に基づいて、転写物のコピー数を算出した。
インサイチュハイブリダイゼーション。マウスGFRALのRNAインサイチュハイブリダイゼーションを、Advanced Cell Diagnostics社(Hayward,CA)によって、そのRNASCOPE(登録商標)アッセイ技術を使用して実施した。C57BL/6マウスから全脳を切り出し、オプティマル・カッティング・テンパラチャー(optimal cutting temperature)(OCT)化合物(VWR International社)中で新鮮凍結(fresh frozen)させた。20ミクロンの凍結切片を調製し、スライド上でおよそ1hr乾燥させ、Advanced Cell Diagnostics社での処理まで、-20℃で保管した。
マウス脳切片の免疫蛍光染色。C57BL/6マウスからの全脳を、4%パラホルムアルデヒド:PBSで4℃で一晩固定した。組織をPBSで洗浄し、ビブラトーム(Vibratome)で切断した。50μm切片を、ブロッキング、抗体インキュベーション、及び洗浄ステップの全てを通して、2% BSA+0.2% Triton X-100:PBS溶液中に浮遊法処理した。切片を、一次抗体:ニワトリ抗チロシンヒドロキシラーゼ(Aves Labs社)、ウサギ抗カルシトニン受容体(Thermo Scientific社)、及びヒツジ抗GFRAL抗体(R&D Systems社)と共に、4℃で一晩インキュベートした。洗浄後、切片を、Alexa標識二次抗体(Invitrogen社)と共に、4℃で一晩インキュベートした。組織切片を、ブラシで移動させ、Fluoromount-G(Southern Biotech社)を用いてスライド上にマウントした。Leica DFC 500カメラを備え付けたLeica DM 4000 Bを使用して、落射蛍光画像を得た。Image Jソフトウェアを使用して、オーバーレイ及び追加の画像処理を行った。
ヒトGFRALに対する125I-GDF15結合。HEK293又はHEK293-ヒトGFRAL細胞を、氷冷の結合緩衝液(2mg/ml BSA及び25mM HEPES(pH 7.4)を含有するダルベッコ変法イーグル培地)に懸濁し、あらかじめ湿らせたマルチスクリーンフィルタープレート(96-ウェル Dura PVDF 0.65um Opaque;Millipore社)に移し、これを氷上に置いておいた。典型的には、ウェルあたり25μl中に1×105個の細胞を使用した。細胞を、非標識GDF15(500 nM最終反応濃度)を含む又は含まない、125I-GDF15の段階希釈物(1000pMから0.1pM最終反応濃度までの2倍段階希釈)を含有する25μlの結合緩衝液と共に、4℃で2hrインキュベートした。次いで、プレートを真空濾過マニホールド(Pall社)に移し、上清を濾過した。各ウェルを、100μlの氷冷の結合緩衝液で4回洗浄した。結合125I-GDF15を、MicroBeta2プレートカウンター(Perkin Elmer社)を使用するシンチレーション測定(150μl/ウェルのEcoLite、MP Biomedicals社、Santa Anna,CA)によって測定した。結合(分子/細胞)を、125I-GDF15のCPM及びモル濃度と相関する標準曲線に従って算出した。
GFRAL-Fcの発現及び精製。成熟GFRAL-Fcタンパク質は、GFRAL-Fcを含有するプラスミドで一過性形質移入させたHEK293細胞の培養培地に分泌された。組換えGFRAL-Fcを、プロテインA捕獲、それに続くフェニル疎水性相互作用クロマトグラフィーを使用して精製した。
GDF15介在性の細胞応答。PathDetect Trans-reporting System(Agilent Technology社)を適合させた。簡単に言うと、HEK293T細胞を、Fugene 6(Promega社)を使用して、以下のプラスミド対:pFA-Elk/pFR-Luc(トランス活性化因子/トランスレポーター;Agilent Technology社)、及びGFRAL/RET9発現構築物(ヒト、カニクイザル、ラット、又はマウス由来)で共形質移入した。形質移入した細胞を、10% FBSを含むDMEM中で37℃で一晩培養した。細胞を、GFRAL-Fc又は抗GDF15抗体(1M03)などの阻害剤の存在下又は非存在下で、GDF15又はGDNF(Peprotech社)などのリガンドで、37℃で6hr処理した。抗GFRAL抗体が含められた実験(図12及び13)では、細胞を、GDF15とのインキュベーション前に、1時間、抗体で前処理した。レポータールシフェラーゼ活性は、基質としてBright Glo(Promega社)を使用して決定し、EnSpireマルチモードプレートリーダー(Perkin Elmer社)によって検出した。非線形回帰曲線適合(GraphPad Prism)を行うと、ヒト、カニクイザル、ラット、及びマウス受容体に対するGDF15活性についてのEC50は、それぞれ、2.1pM、5.2pM、6.2pM、及び1.5pMであった。
GFRAL-Fc又は抗GDF15抗体(1M03)は、以下の濃度(nM):100、33.33、11.11、3.7、1.23、0.41、0.14、0.05、0.02、及び0.01で添加した。抗GFRAL抗体(12B10、16J20、24G2、29G7、44I10)は、以下の濃度(nM):500、166.67、55.56、18.52、6.17、2.06、0.69、0.23、0.08、及び0.03で添加した。1nM GDF15介在性の受容体活性化を阻害するためのGFRAL-Fc及び1M03についてのIC50は、それぞれ9.5nM及び11.7nMであった。10pM GDF15介在性の受容体活性化を阻害するための16J20、24G2、29G7及び44I10についてのIC50は、GraphPad Prizmを使用する非線形回帰曲線適合によれば、61.1nM、55.9nM、25.7nM、及び31.4nMであった。抗体1M03は、抗原として成熟hGDF15タンパク質を使用して産生された、マウスモノクローナル抗体である。
放射性リガンド競合結合。HEK293-GFRAL細胞を、氷冷の結合緩衝液(2mg/ml BSA及び25mM HEPES(pH 7.4)を含有するダルベッコ変法イーグル培地)に懸濁し、あらかじめ湿らせたマルチスクリーンフィルタープレート(96-ウェル Dura PVDF 0.65um Opaque;Millipore社)に移し、これを氷上に置いておいた。典型的には、ウェルあたり25μl中に1×105個の細胞を使用した。0.6nM 125I-GDF15を含有する12.5μl/ウェルの結合緩衝液を添加した。次いで、様々な濃度の12.5μl/ウェルの非標識阻害剤を添加し、4℃で2hrインキュベートした。次いで、プレートを真空濾過マニホールド(Pall社)に移し、上清を濾過した。各ウェルを、100μlの氷冷の結合緩衝液で4回洗浄した。結合125I-GDF15(CPM)を、MicroBeta2プレートカウンター(Perkin Elmer社)を使用するシンチレーション測定(150μl/ウェルのEcoLite、MP Biomedicals社、Santa Anna,CA)によって測定した。この実験で使用した非標識阻害剤の濃度(nM)は、次の通りである。GDF15及びGFRAL-Fc:100、25、6.25、1.56、0.39、0.098、0.024、0.006;1M03:1000、250、62.5、15.63、3.91、0.98、0.24、0.06。HEK-293-GFRAL細胞に対する0.15nMの125I-GDF15結合を阻害するためのIC50は、GraphPad Prismを使用する非線形回帰曲線適合によれば、GDF15、GFRAL-Fc、及び1MO3について、それぞれ0.4nM、0.56nM、及び0.66nMである。
ELISAに基づく競合結合アッセイ。ヒトFcに対する抗体(Jackson ImmunoResearch社)を、96-ウェルNunc Maxisorpプレート(Fisher Scientific社)上に、1μg/ml(PBS中)で、4℃で一晩コーティングした。ウェルを、PBS-TWEEN錠(EMD Chemicals社)から調製された洗浄緩衝液で、3回洗浄した。1% BSA(PBS中)と共に、RTで1hrインキュベートすることによって、ウェルをブロックした。洗浄後、1μg/mlのGFRAL-Fcを添加し、RTで2hrインキュベートした。ウェルを3回洗浄し、用量漸増の精製された抗GFRAL抗体を添加し、RTで1hrインキュベートした。次いで、ビオチン化GDF15を、100ng/mlまで添加し、RTで1hrインキュベートした。ウェルを3回洗浄し、HRP標識ストレプトアビジン(1:5000希釈、Life Technology社)と共に、RTで1hrインキュベートした。ウェルを洗浄し、RTで15min、TMB(Life Technology社)で処理した。SpectroMaxプレートリーダー(Molecular Devices社)を使用して、OD450を測定した。抗体は、以下の濃度(nM):62.5、20.8、6.9、2.3、0.8、0.3、0.09、0.03で添加した。固定化されたGFRAL-Fcに対する4 nMのビオチン化GDF15結合を阻害するためのIC50は、抗体12B10、16J20、24G2、29G7、及び44I10について、それぞれ、(nMで)4.9、0.6、0.9、0.8、及び0.4であった。
GFRAL-RET複合体。HEK293細胞を、製造業者の説明書に従ってLipofectamine(登録商標)2000(Life Technology社)を使用して、RET51(対照)をコードするcDNAで、又はGFRALとRET51をコードするcDNAで形質移入させた。形質移入の2日後、細胞を無血清DMEM中で1時間、飢餓状態にし、次いで、100ng/mlのGDF15で15分間処理した。培養培地を吸引し、細胞を、氷冷のRIPA緩衝液(Sigma社)(プロテインホスファターゼ阻害剤カクテルI及びII(Sigma社)、プロテアーゼ阻害剤混合物(Roche社)、NaF(1mM)、及びNaVO4(1mM)を含有する)に溶解した。1mg同等量の細胞溶解物を、20μgの抗RET51抗体(Santa Cruz Biotechnology社)と共に、4℃で45minインキュベートした。100μlのプロテインG Dynabeads(登録商標)(Life Technology社)を添加し、4℃で1.5hrインキュベートした。ビーズをPBSで3回洗浄し、結合タンパク質を、60μlのSDS-PAGE緩衝液で溶出した。15μlの溶出された溶解物を、SDS-PAGE、それに続いて、抗Ret51抗体(Santa Cruz Biotechnology社)又は抗GFRAL抗体(R&D Systems社)を使用するウエスタンブロッティングにかけた。
抗GFRAL抗体産生。GFRAL ECDを含有する組換えタンパク質を、免疫原として使用して、B6/129マウスを免疫化した。ハイブリドーマ上清を、ハイコンテンツイメージングシステム、Cell InSight(Thermo Scientific社)を使用して、GFRAL発現CHO細胞に対する結合について、又は、ELISAを使用して、GFRAL-Fcに対する結合によってスクリーニングした。
(実施例1:GDF15受容体の特定)
成熟ヒトGDF15に対する結合パートナーを特定するために、いくつかのアッセイを実施した。GDF15と結合するタンパク質を発現する組織を特定するために、125I-GDF15を使用して、脳組織切片を含めたマウス及びラットからの組織切片を染色した。さらに、尿、腹水、及び羊水を含めたヒト体液を、GDF15結合パートナーの存在について分析した。FLAGでタグ付けしたGDF15(FLAG-GDF15)を、ヒト尿、腹水、及び羊水と共にインキュベートし、FLAG-GDF15と結合したタンパク質を、質量分析によって分析した。ヒト尿、腹水、及び羊水中に存在するタンパク質を、クロマトグラフィーによって分別し、それに続いて、125I-GDF15に対する結合による検出を行った。
GDF15に対する結合についての、マウス視床下部及びヒト胎盤由来のcDNAライブラリ並びに膜タンパク質のcDNAクローンのスクリーニングも実施した。膜タンパク質の約4000のcDNAクローンのサブセット(37)を、HEK293T細胞において発現させ、Fc-GDF15に対する結合についてスクリーニングした(図1B;PCT/US2013/023465に開示されているDhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+)の二量体)。膜タンパク質cDNA発現構築物(0.08μg/ウェル)を、製造業者の説明書に従ってLipofectamine 2000(Invitrogen社、Carlsbad,CA)を使用して、384ウェルのポリ-D-リジンコーティングプレート(Greiner社)で、HEK-293T細胞(ATCC)において逆形質移入した。形質移入した細胞を、3日間培養した。細胞を、DMEM(フェノールレッド不含;Corning Cellgro社)で3回洗浄し、同じ培地でFc-GDF15(5μg/ml)と共に室温で1.5時間インキュベートした。この細胞に、Alexa647結合ヤギ抗ヒトFc抗体(Jackson Immunologicals社)を添加して0.33ng/mLにし、Hoescht33342(6.7ng/ml)(Sigma社)を添加し、40分間インキュベートした。プレートを冷HBSS/M2+(Cellgro社)で3回洗浄し、3.7%ホルマリン(PBS中)で5分間固定した。Cell InSight(Thermo Scientific社)を使用して蛍光強度を測定した。
マウスGFRALが、Fc-GDF15と結合する膜タンパク質と特定された。スクリーニングしたcDNAクローンのサブセットは、TGFβファミリー受容体及びGDNFファミリー受容体(GFRA)も含んでおり、これらはGDF15と結合しなかった(図5)。
(実施例2: GFRALは脳幹において発現される)
マウス由来の組織を、定量RT-PCRによって分析して、GFRALを発現する器官を特定した。GFRAL RNAは、ほぼ脳幹においてのみ発現していた(図6A)。中枢神経系の様々な領域並びに眼から採取した組織を、RT-PCRによって分析し、脳幹におけるGFRALの発現を確認した(図6B)。
RNAインサイチュハイブリダイゼーションを使用して、マウス脳矢状切片におけるGFRAL mRNAの発現を調べた。注意深く観察すると、脳幹の最後野領域におけるGFRALの明らかに陽性の染色のみが認められた。したがって、マウスGFRALは、脳幹の最後野において独占的に発現されるように見える。
間接的免疫蛍光染色を使用して、マウス脳矢状切片におけるGFRALタンパク質の発現を調べた。注意深く観察すると、脳幹の最後野領域におけるGFRALタンパク質の明らかに陽性の染色のみが認められた。チロシンヒドロキシラーゼ(TH)、カルシトニン受容体(CT)、及びGLP-1受容体を含めた神経細胞マーカーを用いて、GFRALに対する共染色を実施した。GFRAL発現は、TH-又はGLP-1受容体-発現ニューロンと部分的に重なるが、CT陽性ニューロンからは外れている。これらのデータは、GFRALが、最後野内のニューロンの特有のサブセットにおいて発現されることを示す。
(実施例3:GDF15はナノモル以下の親和性でGFRALと結合する)
GDF15の、GFRALに対する結合親和性を決定するために、放射標識した125I-GDF15を使用して、平衡条件下でヒトGFRAL(図2A)を発現するHEK293細胞と結合させた。図7Aに示した通り、125I-GDF15のHEK293-GFRAL細胞に対する結合は、典型的なリガンド-受容体結合双曲線に従っていた;対照的に、対照のHEK293T細胞に対する125I-GDF15結合は、線形であり、非特異的相互作用を表す。過剰量の非標識GDF15(500nM)は、125I-GDF15-GFRAL結合を、「非特異的」バックグラウンドレベルに低下させた。これは、125I-GDF15とGFRALの相互作用の特異性をさらに裏付けた。125I-GDF15-GFRALの結合親和性は、およそ200pM(図7B)であり、これはまた、高親和性のリガンド-受容体相互作用に典型的である。
(実施例4:GDF15はGFRAL及びRETを介してERKシグナル伝達経路を刺激する)
GFRALの細胞外ドメインは、GDNFファミリー受容体α(GFRA)ファミリー受容体との配列相同性を共有する。GFRA受容体は、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)によって、細胞表面に固着される。GFRA受容体は、そのリガンドに結合すると、受容体チロシンキナーゼRETを伴って、RETの活性化を媒介する。活性化されたRETは、リン酸化されたチロシンとなり、これは、転写因子ELK1のリン酸化を含めた細胞内シグナル伝達カスケードを誘発する。
GDF15が、GFRAL-RET受容体複合体を介して、ELK1リン酸化などの細胞応答を媒介するという仮説を検証するために、hGFRALとヒトRET9(図3B)との両方を発現する細胞を、GDF15に対する反応について分析した。HEK293T細胞を、GAL4DBD-ELK1融合プラスミドとGAL4-UAS-ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むレポーター系(PathDetect Trans-Reporting Systems、Agilent Technology社)を伴うhGFRAL及びhRET9のための発現プラスミドで共形質移入した。
図8に示した通り、GDF15は、ルシフェラーゼの発現を、用量依存的に媒介する。対照的に、GFRA1に対する結合によってRET活性化を媒介するGDNFは、GFRAL-RETを活性化しない。GFRALとRETは両方とも、これらの受容体のどちらか一方を省くことがルシフェラーゼ発現を抑制するので、GDF15介在性の細胞応答に必要とされる。この結果は、GDF15が、GFRAL-RET受容体系を介してその生物学的機能を発揮するという仮説を裏付ける。
(実施例5:ヒトGDF15は、ヒト、カニクイザル、ラット、及びマウス由来のGFRAL-RET受容体系を活性化する)
GDF15処理に応答するGFRAL-RET受容体系の保存を、実施例4に記載したレポーターアッセイを使用して調べた。ヒト、カニクイザル、ラット、及びマウス由来のGFRAL及びRET9受容体を、HEK293T細胞に形質移入し、ヒトGDF15に応答するレポーター遺伝子活性化を測定した。
図9A〜9Dに示した通り、GDF15は、試験された4つすべての種由来のGFRAL-RET受容体複合体を介して、細胞応答を用量依存的に媒介した。これらのデータは、GDF15/GFRAL-RETリガンド/受容体系が保存されることを実証する。
(実施例6:GFRAL-FC及び抗GDF15抗体、1M03は、GDF15のGFRALに対する結合を阻害する)
GDF15のGFRALに対する結合を阻害する分子を、競合結合実験を使用して特定した。125I-GDF15(0.15nM)と結合させたHEK293-GFRAL細胞を、非標識GDF15、GFRAL-Fc、又は抗体1M03と共にインキュベートした。
GFRAL-Fcは、hGFRALの細胞外ドメインを含む。図4に示した通り、GFRAL-Fcは、内在性シグナルペプチド(図2A参照)の代わりとなる異種シグナルペプチド:IgKシグナルペプチドを含む。GFRAL-Fcは、細胞からの分泌時に切断されるシグナルペプチドで発現される。GFRAL-Fcは、GFRALの細胞外ドメインを含むが、GFRALの膜貫通ドメインも細胞内ドメインも含まない。
非標識GDF15、GFRAL-Fc、又は抗体1M03は、HEK293-GFRAL細胞に対する125I-GDF15(0.15nM)結合を、用量依存的に阻害した(図10)。GDF15、GFRAL-Fc、及び1M03についてのIC50は、それぞれ、0.4nM、0.56nM、及び0.66nMであった。
(実施例7:GFRAL-FC及び抗GDF15抗体は、GDF15介在性の受容体活性化を阻害する)
GFRAL-Fc又は抗GDF15抗体(1M03)の、GDF15に対する結合は、GFRAL-RET受容体複合体のGDF15介在性の活性化を阻害する。GFRAL-Fc及び1M03の、GFRAL-RET受容体複合体のGDF15介在性の活性化に対する効果を、実施例4に記載したレポーターアッセイを使用して調べた。GFRAL-Fc及び1M03は、GFRALとRETとを発現するHEK293T細胞におけるGDF15(1nM)介在性のレポーター活性化を用量依存的に阻害した(図11)。GFRAL-Fc及び1M03についてのIC50は、それぞれ、9.5nM及び11.7nMであった。
(実施例8:抗GFRAL抗体は、GDF15のGFRALに対する結合を阻害する)
抗GFRAL抗体は、材料及び方法に記載した通りにGFRAL ECDを使用して産生した。いくつかのモノクローナル抗GFRAL抗体を、GFRALに対するGDF15の結合を妨げるその能力について調べた。材料及び方法に記載した通りにELISAベースの結合アッセイを実施するために、GFRAL-Fc(図4)を、プレート上に固定した。図12に示した通り、プレート上に固定されたGFRAL-Fcに対するビオチン化GDF15(4nM)の結合は、これらの抗GFRAL抗体と、用量依存的に競合した。抗GFRAL ECD抗体:12B10、16J20、24G2、29G7、及び44I10についてのIC50は、それぞれ、4.9nM、0.6nM、0.9nM、0.8nM、及び0.4nMであった。
(実施例9:抗GFRAL抗体は、GDF15介在性の受容体活性化を阻害する)
抗GFRAL抗体の、GDF15介在性のGFRAL-RET受容体複合体の活性化に対する効果を、実施例4に記載したレポーターアッセイを使用して調べた。4種の抗GFRAL ECD抗体、16J20、24G2、29G7、及び44I10は、GFRALとRETとを発現するHEK293T細胞におけるGDF15(10pM)介在性のレポーター活性化を用量依存的に阻害した(図13)。図12によって図示した通り、GFRAL-Fcに対するビオチン化GDF15の結合を、他の抗GFRAL ECD抗体と比較してそれほど効率的に阻害しない12B10抗体は、GDF15介在性の受容体活性化を阻害できなかった。
(実施例10:GFRALは、GDF15とは独立してRETと相互作用する)
GFRALとRETとの間の相互作用を調べるために、RETの免疫沈降を実施した。RETをコードするプラスミド単独で形質移入した、又はRETとGFRALとをコードするプラスミドで共形質移入したHEK293細胞を、PBSのみ又は100ng/mlのGDF15で、15分間処理した。処理された細胞からの全細胞溶解物を、抗Ret51抗体、続いてウエスタンブロット分析を使用する免疫沈降にかけた。
図14に示した通り、GFRALは、HEK293細胞上でRETと共発現された場合、抗Ret抗体によってプルダウンされた。この相互作用は、GDF15には依存しない。なぜなら、等しいGFRALが、GDF15で、又はPBSで処理されたGFRAL/RET発現細胞からプルダウンされたからである。この結果は、GFRAL-Ret複合体が、GDF15とは独立して、細胞表面上に形成されることを示した。
(実施例11:複合体形成及びGFRAL/GDF15複合体の結晶化)
GFRALタンパク質とGDF15タンパク質との複合体を、1.2モル過剰のGFRAL(W115-E351)タンパク質と、1モルのGDF15タンパク質サブユニット(一対のジスルフィド結合によって連結された2つのGDF15サブユニットのホモ二量体である、0.5モルのGDF15)とを混合することによって作製した。この複合体を、サイズ排除クロマトグラフィーによって精製して、過剰なGFRALを除去した。GFRAL/GDF15複合体を、5mg/mlの1μLタンパク質(0.5μLリザーバー溶液を伴う)と、結晶化ドロップ中の0.5μL種晶(1.0mLの0.1M Bis-Tris pH 6.0、1.5M(NH4)2SO4、及び10%エチレングリコールを含有するリザーバー溶液を伴う)とを混合することによって結晶化させた。種結晶は、0.1M Bis-Tris pH 6.0、及び1.5M(NH4)2SO4のリザーバー溶液を含む結晶化条件から得られた。結晶化設定は、Rigaku社製24ウェルクローバーリーフプレートにおいて、室温に維持した。結晶化ドロップは、インキュベーションの3日後に、小さい針状結晶を示した。
GFRALタンパク質とGDF15タンパク質の複合体の例示的な小さい針状結晶を、図15に示す。
GFRALに対しては分子モデルが利用可能ではなかったので、NaBr浸漬を使用して、結晶位相を決定した。先に記載した通りに得たGFRAL/GDF15結晶を、0.5M NaBr及び0.75M NaBr含有リザーバー溶液に浸漬した。30分後、0.5 M NaBrに浸漬した結晶が、良好な状態であったのに対して、0.75M NaBr浸漬は、クラックのある結晶をもたらした。両方の浸漬からの結晶及び非浸漬結晶を、凍結保護物質としての30% EGと共にマウントした。
本明細書に記載したモデルは、GFRALタンパク質、及びGFRALタンパク質のGDF15タンパク質に対する結合についての、第1の構造情報を提供する。
(実施例12:データ収集及び構造決定)
GFRAL/GDF15複合体結晶を、0.5M及び0.7M NaBr浸漬からの浸漬及び非浸漬結晶として、0.1M Bis-Tris pH 6.0、1.5M(NH4)2SO4、及び10%エチレングリコールリザーバー条件から、入手及び収集した。これらの結晶を、凍結保護物質としての20%エチレングリコールを添加された母液で処理し、液体窒素中で瞬間凍結した。次いで、これらの結晶を、シンクロトロンビームラインIMCA-CAT(先端放射光施設(Advanced Photon Source)、アルゴンヌ国立研究所(Argonne National Lab.))でのＸ線回折について調べた。この結晶は、2.28〜2.20Å分解能まで回折した。
例示的なGFRAL/GDF15複合体結晶についてのＸ線回折統計値を、表1に示す。
Figure 2019513224
3.2Å分解能であらかじめ解析されたGFRAL/GDF15複合体を出発モデルとして用いる、スケーリングされたデータセットを使用することによって、GFRAL/GDF15の分子置換法を実施し、剛体精密化(rigid body refinement)(Vagin,A.A.らの文献、(2004年)「REFMAC5ディクショナリー:化学的予備知識の組織化及びその使用のためのガイドライン(REFMAC5 dictionary: Organization of prior chemical knowledge and guidelines for its use)」Acta Crystallogr.D 60:2284-2295を参照のこと)及び初期位置精密化を、CCP4で実行されるREFMAC5において完了した。数ラウンドのモデル再構築によって、GFRAL/GDF15複合体の構造がもたらされた。
GFRALタンパク質とGDF15タンパク質の複合体の例示的な構造は、例えば、図17〜24Bに示す。
初期電子密度マップの観察によって、GFRAL及びGDF15についての明確な密度が示された。剛体精密化後、COOT(Emsley,P.及びCowtan,K.の文献(2004年)「COOT:分子グラフィックスのためのモデル構築ツール(COOT:model-building tools for molecular graphics.)」Acta Crystallogr.D 60:2126-2132を参照のこと)を使用して、数ラウンドのモデル構築及び制限精密化を実施した。溶媒分子の配置後に、最終精密化を完了させた。
Ｘ線回折パターンからの原子座標は、表6で参照できる。
例示的な結晶についての精密化統計値を、表2に示す。
Figure 2019513224
例示的なGFRAL/GDF15複合体結晶内のGFRALについての明確な電子密度を、図16に図示する。図16は、2.20Å分解能データを用いて算出された、かつ1σレベルで描かれたGFRAL分子についての電子密度マップ(2fo-fc)を示す。GFRAL残基は、明確に視認できる。
(実施例13:GFRAL/GDF15複合体の結晶構造)
GFRALタンパク質とGDF15タンパク質の複合体の結晶構造を決定した。
コア相互作用界面アミノ酸は、相互作用するタンパク質(GDF15など)から4.5Å以下の少なくとも1つの原子をもつ(GFRALなどのタンパク質上の)アミノ酸残基であると決定された。4.5Åは、ファンデルワールス半径＋想定される水介在性の水素結合の範囲内の原子を考慮するためのコア領域カットオフ距離として選択された。
境界相互作用界面アミノ酸は、GFRALと相互作用するタンパク質(GDF15など)と相互作用するGFRAL上のコア相互作用界面アミノ酸の5Å以下の少なくとも1つの原子をもつ、(GFRALなどのタンパク質上の)アミノ酸残基と決定された。GFRAL上のコア相互作用界面アミノ酸から5Å未満の距離の残基に対するタンパク質結合が、GFRALと相互作用するタンパク質のファンデルワールス半径の範囲内となるであろうことから、5Å以下が、境界領域カットオフ距離として選択された。
これらの距離基準を満たすアミノ酸を、CCG(Chemical Computing Group社)からのMolecular Operating Environment(MOE)プログラムを用いて算出した。
図17は、GFRAL/GDF15タンパク質結晶の非対称単位で見られる、ヘテロ二量体GFRAL/GDF15複合体の例示的な実例を示す。二量体分子GDF15は、1つの分子間ジスルフィド結合(これは、放射線障害が原因で、弱いことが判明した)を有する。GDF15分子の片側は、非対称単位における二量体を形成することができる。図18は、GFRAL/GDF15結晶における、GFRAL/GDF15ヘテロ二量体の例示的な二量体配置を示す。
図19A〜19Bは、GFRAL-GDF15界面上のタンパク質-タンパク質接触の程度を示す。GFRAL上の接触領域は、薄灰色の矢印によって示され;GDF15上の接触領域は、黒色の矢印によって示される。
図20は、GFRALの3つのα-ヘリックスが、GFRAL/GDF15界面に含まれることを示す。複数のジスルフィド架橋が、3つのGFRALα-ヘリックスの構造配置を安定化するように見える。
図21A〜21Dは、GFRAL/GDF15界面、及びGFRAL/GDF15界面を形成するのに関与するGFRALタンパク質及びGDF15タンパク質のコア及び境界アミノ酸残基の、別の態様を図示する。GFRALタンパク質及びGDF15タンパク質は、空間充填表面表現で示されたGFRAL/GDF15界面内の残基を伴うリボン図として表す。図21A〜21Cは、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質のコア相互作用界面アミノ酸を示す。図21Dは、境界相互作用界面アミノ酸を示す。
全長前駆体ヒトGFRALタンパク質のアミノ酸配列を、以下に示す:
Figure 2019513224
 配列番号:9
GFRAL/GDF15複合体の界面のGFRALアミノ酸を、表3に示す。
Figure 2019513224
Figure 2019513224
成熟ヒトGDF15のアミノ酸配列を、以下に示す:
Figure 2019513224
GFRAL/GDF15複合体の界面のGDF15残基を、表4に示す。
Figure 2019513224
(実施例14:GFRAL/RET/GDF15複合体のモデル)
Goodmanらの文献(2014年) CELL REPORTS 8,1894-1904(PDB 4UX8)によって記載されているRET/GFRα1/GDNF三元複合体を、鋳型として使用して、GFRAL/GDF15/RETの複合体のモデルを構築した(GFRAL/GDF15構造から。例えば、実施例11〜13を参照のこと)。RET/GFRα1/GDNF鋳型は、再構成された哺乳類RET(ECD)-GDNF-GFRα1三元複合体の電子顕微鏡再構成から得た(Goodmanらの文献、上記)。
実施例13からのGFRAL/GDF15結晶構造と、RET/GFRα1/GDNF鋳型内のGFRα1/GDNFの構造の、構造的類似性を比較するために、CCG社からのMOEを使用して、GFRAL/GDF15結晶内のGFRAL構造を、GFRα1/GDNF/RETモデル(PDB 4UX8)内のGFRα1と重ね合わせた。GFRAL/GFRα1とGFRAL/GDF15複合体の、質の高い重ね合わせ、したがって構造的類似性は、2.21ÅのGFRAL/GFRα1骨格残基のRMSDによって示された。GFRAL/GDF15構造とRET構造を含む、この三元複合体モデルを使用して、GFRALとRETとの間の相互作用をマッピングした。
図22A〜Bは、4XU8における、GFRALとGFRα1との重ね合わせの例示的な態様を図示する。骨格残基のRMSDは、2.21Åであった。
図23A〜Dは、RET/GFRAL/GDF15モデルにおける、GFRALタンパク質とRETタンパク質との相互作用の例示的な態様を図示する。図23Aでは、モデル化されたGFRAL/GDF15界面での、相互作用するGFRAL及びGDF15残基は、棒モデルによって表される。図23Bでは、GFRAL上のRET相互作用残基は、空間充填表面モデルで表される。図23Cでは、コア相互作用残基の空間充填表面モデルは、GFRAL及びRET上で強調される。図23Dでは、境界相互作用残基の空間充填表面モデルは、GFRAL及びRET上で強調される。
図24A〜Bは、モデル化されたRET界面での、空間充填表面モデルにおいて特定された、GFRALタンパク質上のコア及び境界アミノ酸残基を図示する。図24Aでは、モデル化されたGFRAL上のコア残基は、空間充填表面モデルにおいて、より濃い灰色で示される。図24Bでは、モデル化されたGFRAL上の境界残基は、空間充填表面モデルにおいて、より薄い灰色で示される。
このモデリングに基づいて、表5Aに示した通り、いくつかのGFRAL残基が、RET残基との相互作用について特定された。さらに、表5Bに示した通り、いくつかのRET残基が、GFRAL残基との相互作用について特定された。
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第1列-記録名;第2列-原子シリアル番号;第3列-原子名;第4列-アミノ酸残基名;第5列-鎖識別子;第6列-アミノ酸残基配列番号;第7列-Xについての直交座標(オングストローム);第8列-Yについての直交座標(オングストローム);第9列-Zについての直交座標(オングストローム);第10列-占有;第11列-温度因子;第12列-セグメント識別子;第13列-元素記号。
本発明を、その具体的実施態様に関して記載してきたが、本発明の真の趣旨及び範囲を逸脱せずに、様々な変更を行うことができ、また、等価物を置換することができることが、当業者に理解されるべきである。さらに、ある特定の状況、材料、物質組成、工程、工程段階(1又は複数)を、本発明の目的、趣旨、及び範囲に適合させるために、多くの改変を行うことができる。こうしたすべての改変を、本明細書に添付する特許請求の範囲の範囲内であるものとする。

Claims (68)

  1. GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する薬剤を特定するための方法であって、
    a)表6の原子座標によって定義されるGDF15タンパク質との複合体の3次元構造を構築することと;
    b)該3次元構造及びモデリング方法を用いて、該GFRALタンパク質と結合する候補薬剤を特定することと;
    c)該候補薬剤を、該GFRALタンパク質の細胞外ドメインとの結合について検定することと;
    d)該候補薬剤の結合を、該GFRALタンパク質の細胞外ドメインに対する該GDF15タンパク質の結合と比較する(ここでは、該候補薬剤が、該GDF15タンパク質と類似の親和性で結合する場合に、該候補薬剤は、該GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する薬剤であると特定される)ことと
    を含む前記方法。
  2. 前記GDF15タンパク質が、検出可能なように標識される、請求項1記載の方法。
  3. 前記GFRALタンパク質が、支持体上に固定される、請求項1又は2記載の方法。
  4. 前記GFRALタンパク質が、前記GFRALタンパク質を発現するように遺伝子改変された組換え細胞によって発現される、請求項1から3のいずれか1項記載の方法。
  5. 前記組換え細胞が、RETタンパク質を発現するように遺伝子改変される、請求項4記載の方法。
  6. 前記組換え細胞が、レポーターをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含むレポーター構築物を含み、ここでは、前記プロモーターが、RETタンパク質の活性化時に、該レポーターの発現を誘導し、かつ
    前記方法が、レポーターの発現について検定することを含み、
    ここでは、陰性対照と比較した場合のレポーターの発現増大が、前記薬剤を、GFRALタンパク質と結合してRETタンパク質を活性化する薬剤であると特定する、
    請求項4又は5記載の方法。
  7. 前記GFRALタンパク質の細胞外ドメインが、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含み、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基が、配列番号:9のGLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、及びGLN200からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当する、請求項1〜6のいずれか1項記載の方法。
  8. 前記GFRALタンパク質の細胞外ドメインが、GFRALタンパク質とRETタンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含み、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基が、配列番号:9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298 SER299からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当する、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。
  9. GDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合を調節する薬剤を特定するための方法であって、
    a)候補薬剤を、GFRALタンパク質を発現するように遺伝子改変された組換え細胞と接触させることと
    (ここでは、該GFRALタンパク質の細胞外ドメインは、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含み、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基が、配列番号:9のGLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、及びGLN200からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当し、かつ該接触させることがGDF15タンパク質の存在下である);
    b)GDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合のレベルを分析することと;
    を含み、
    ここでは、該候補薬剤の存在下でのGDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合のレベルの、該候補薬剤の非存在下でのGDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合のレベルと比較した場合の変化によって、該候補薬剤が、GDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合を調節する薬剤であると特定される、前記方法。
  10. 前記組換え細胞が、RETタンパク質を発現するように遺伝子改変された、請求項9記載の方法。
  11. 前記GFRALタンパク質の細胞外ドメインが、GFRALタンパク質とRETタンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含み、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基が、配列番号:9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当する、請求項9又は10記載の方法。
  12. 前記組換え細胞が、レポーターをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含むレポーター構築物を含み、ここでは、前記プロモーターが、RETタンパク質の活性化時に、該レポーターの発現を誘導し、
    前記検定が、レポーターの発現について検定することを含み、ここでは、該候補薬剤の非存在下での発現と比較した場合のレポーターの発現の変化によって、該候補薬剤が、GDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合を調節する薬剤であると特定される、
    請求項9〜11のいずれか1項記載の方法。
  13. 前記薬剤が、GDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合を阻害する場合に、該薬剤が、GDF15タンパク質-GFRALタンパク質結合のアンタゴニストと特定される、請求項9〜12のいずれか1項記載の方法。
  14. 前記薬剤が、GDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合を増大させる場合に、該薬剤が、GDF15タンパク質-GFRALタンパク質結合のアゴニストと特定される、請求項9〜12のいずれか1項記載の方法。
  15. GDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合を調節する薬剤を特定するための方法であって、
    a)表6の原子座標によって定義されるGDF15タンパク質との複合体の3次元構造を構築することと;
    b)該3次元構造及びモデリング方法を用いて、GDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合を調節する候補薬剤を特定することと;
    c)該候補薬剤を、GFRALタンパク質を発現するように遺伝子改変された組換え細胞と接触させる(ここでは、該接触は、GDF15タンパク質の存在下である)ことと;
    d)GDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合のレベルを分析することと;
    を含み、
    ここでは、該候補薬剤の存在下でのGDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合のレベルの、該候補薬剤の非存在下でのGDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合のレベルと比較した場合の変化によって、該候補薬剤が、GDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合を調節する薬剤であると特定される、前記方法。
  16. 前記組換え細胞が、RETタンパク質を発現するように遺伝子改変される、請求項15記載の方法。
  17. 前記組換え細胞が、レポーターをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター配列を含むレポーター構築物を含み、ここでは、前記プロモーターが、RETタンパク質の活性化時に、該レポーターの発現を誘導し、
    前記検定が、レポーターの発現について検定することを含み、ここでは、該候補薬剤の非存在下での発現と比較した場合のレポーターの発現の変化によって、該候補薬剤が、GDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合を調節する薬剤であると特定される、
    請求項15又は16記載の方法。
  18. 前記薬剤が、GDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合を阻害する場合に、該薬剤が、GDF15-GFRAL結合のアンタゴニストであると特定される、請求項15〜17のいずれか1項記載の方法。
  19. 前記薬剤が、GDF15タンパク質のGFRALタンパク質に対する結合を増大させる場合に、該薬剤が、GDF15タンパク質-GFRALタンパク質結合のアゴニストであると特定される、請求項15〜17のいずれか1項記載の方法。
  20. 前記組換え細胞によって発現されるGFRALタンパク質が、該GFRALタンパク質の細胞外ドメインを含む、請求項15〜19のいずれか1項記載の方法。
  21. 前記GFRALタンパク質の細胞外ドメインが、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含み、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基が、配列番号:9のGLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、及びGLN200からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当する、請求項20記載の方法。
  22. 前記GFRALタンパク質の細胞外ドメインが、GFRALタンパク質とRETタンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含み、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基が、配列番号:9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当する、請求項20又は21記載の方法。
  23. 細胞外ドメインを含むGFRALタンパク質のRETタンパク質に対する結合を調節する薬剤を特定するための方法であって、
    a)候補薬剤を、GFRALタンパク質とRETタンパク質を発現するように遺伝子改変された組換え細胞と接触させることと(ここでは、該GFRALタンパク質の細胞外ドメインは、GFRALタンパク質とRETタンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含み、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基が、配列番号:9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当する);
    b)GFRALタンパク質とRETタンパク質との結合のレベルを分析することと;
    を含み、
    ここでは、該候補薬剤の存在下でのGFRALタンパク質とRETタンパク質との結合のレベルの、該候補薬剤の非存在下でのGFRALタンパク質とRETタンパク質との結合のレベルと比較した場合の変化によって、該候補薬剤が、GFRALタンパク質とRETタンパク質との結合を調節する薬剤であると特定される、前記方法。
  24. GFRALタンパク質のRETタンパク質に対する結合を調節する薬剤を特定するための方法であって、
    a)表6の原子座標によって定義されるGDF15タンパク質との複合体の3次元構造を構築することと;
    b)該3次元構造及びモデリング方法を用いて、GFRALタンパク質のRETタンパク質に対する結合を調節する候補薬剤を特定することと;
    c)該候補薬剤を、GFRALタンパク質とRETタンパク質を発現するように遺伝子改変された組換え細胞と接触させることと;
    d)GFRALタンパク質とRETタンパク質との結合のレベルを分析することと;
    を含み、
    ここでは、該候補薬剤の存在下でのGFRALタンパク質とRETタンパク質との結合のレベルの、該候補薬剤の非存在下でのGFRALタンパク質とRETタンパク質との結合のレベルと比較した場合の変化によって、該候補薬剤が、GFRALタンパク質とRETタンパク質との結合を調節する薬剤であると特定される、前記方法。
  25. 前記組換え細胞によって発現されるGFRALタンパク質が、該GFRALタンパク質の細胞外ドメインを含む、請求項24記載の方法。
  26. 前記GFRALタンパク質の細胞外ドメインが、GFRALタンパク質とRETタンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含み、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基が、配列番号:9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当する、請求項25記載の方法。
  27. 対象における意図しない体重減少を治療する、又は意図しない体重減少のリスクがある対象における意図しない体重減少を予防する方法であって、
    a)GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する薬剤(ここでは、該GFRAL-ECDは、(i)GFRALタンパク質とGDF15タンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基(ここでは、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基は、配列番号:9のGLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、及びGLN200からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当する)、及び/又は(ii)GFRALタンパク質とRETタンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基(ここでは、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基が、配列番号:9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当する)を含む);及び
    b)GFRALタンパク質の細胞外ドメイン(GFRAL-ECD)
    のうちの少なくとも1つを対象に投与することを含み、
    ここでは、該薬剤又はGFRAL-ECDは、対象における意図しない体重減少を治療する、又は発生を予防するのに有効な量で投与される、
    前記方法。
  28. 前記GFRAL-ECDが投与される、請求項27記載の方法。
  29. 前記GFRAL-ECDが、異種タンパク質と融合される、請求項28記載の方法。
  30. 前記異種タンパク質が、Ig Fc、アルブミン、及びマルトース結合タンパク質からなる群から独立に選択される、請求項29記載の方法。
  31. 前記アルブミンが、ヒト血清アルブミンである、請求項30記載の方法。
  32. 前記薬剤が、GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する抗体を含む、請求項27記載の方法。
  33. 前記抗体が結合する前記GFRALタンパク質の細胞外ドメインが、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含み、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基が、配列番号:9のGLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、及びGLN200からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当する、請求項32記載の方法。
  34. 前記抗体が結合する前記GFRALタンパク質の細胞外ドメインが、GFRALタンパク質とRETタンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含み、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基が、配列番号:9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当する、請求項32又は33記載の方法。
  35. GDF15タンパク質活性の増大を有する、又はGDF15タンパク質活性の増大を起こすリスクがある対象におけるGDF15タンパク質活性を低下させる方法であって、
    a)GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する薬剤(ここでは、該GFRAL-ECDは、(i)GFRALタンパク質とGDF15タンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基(ここでは、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基は、配列番号:9のGLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、及びGLN200からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当する);及び/又は(ii)GFRALタンパク質とRETタンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基(ここでは、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基が、配列番号:9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当する)を含む);及び
    b)GFRALタンパク質の細胞外ドメイン(GFRAL-ECD)
    のうちの少なくとも1つを対象に投与することを含み、
    ここでは、該薬剤又はGFRAL-ECDは、対象におけるGDF15タンパク質活性を低下させるのに有効な量で投与される、
    前記方法。
  36. 前記GFRAL-ECDが投与される、請求項35記載の方法。
  37. 前記GFRAL-ECDが、異種タンパク質と融合される、請求項36記載の方法。
  38. 前記異種タンパク質が、Ig Fc、アルブミン、及びマルトース結合タンパク質からなる群から独立に選択される、請求項37記載の方法。
  39. 前記アルブミンが、ヒト血清アルブミンである、請求項38記載の方法。
  40. 前記薬剤が、GFRALタンパク質の細胞外ドメインと結合する、かつ/又はGFRALタンパク質に対する結合についてGDF15タンパク質と競合する抗体を含む、請求項35記載の方法。
  41. 前記抗体が結合する前記GFRALタンパク質の細胞外ドメインが、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含み、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基が、配列番号:9のGLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、及びGLN200からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当する、請求項40記載の方法。
  42. 前記抗体が結合する前記GFRALタンパク質の細胞外ドメインが、GFRALタンパク質とRETタンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基を含み、該GFRALドメインの1つ以上のアミノ酸残基が、配列番号:9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298からなる群から選択される位置のアミノ酸残基に相当する、請求項40又は41記載の方法。
  43. GFRALタンパク質とGDF15タンパク質とを含む結晶。
  44. X線放射を回折して、おおよそ次のセル定数:a=75.4Å、b=88.8Å、c=121.3Å、及び空間群P21を有する複合体の3次元構造を表す回折パターンをもたらす、請求項43記載の結晶。
  45. 約2.20Åの分解能でX線放射を回折する、請求項43記載の結晶。
  46. 前記GFRALタンパク質が、配列番号:23のアミノ酸配列を含む、請求項43記載の結晶。
  47. 前記GDF15タンパク質が、ホモ二量体である、請求項43記載の結晶。
  48. 前記表6の原子座標を有する、請求項43記載の結晶。
  49. GDF15タンパク質のアンタゴニストの特定のためのスクリーニングアッセイにおける使用のための、請求項43記載の結晶。
  50. 請求項43から48のいずれか1項記載の結晶を含む組成物。
  51. GDF15タンパク質と結合する能力をもつバリアントGFRALタンパク質を特定するための方法であって、
    a)表6の原子座標によって定義される、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質とを含む複合体の3次元構造を構築することと;
    b)該3次元構造及びモデリング方法を用いて、GFRALタンパク質を変異させるための部位を特定し、該部位を変異させてバリアントGFRALタンパク質を産生することと;
    c)該バリアントGFRALタンパク質を生成することと;
    d)該バリアントGFRALタンパク質を分析して、GDF15タンパク質と結合するその能力を決定することと
    を含む前記方法。
  52. 前記変異のための部位が、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインに位置し、該ドメインが、配列番号:9のGLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、及びGLN200からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基を含む、請求項51記載の方法。
  53. 前記変異のための部位が、配列番号9のGLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、及びGLN200からなる群から選択される位置に相当するアミノ酸である、請求項51記載の方法。
  54. RETタンパク質と結合する能力をもつバリアントGFRALタンパク質を特定するための方法であって、
    a)表6の原子座標によって定義される、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質とを含む複合体の3次元構造を構築することと;
    b)該3次元構造及びモデリング方法を用いて、GFRALタンパク質を変異させるための部位を特定し、該部位を変異させてバリアントGFRALタンパク質を産生することと;
    c)該バリアントGFRALタンパク質を生成することと;
    d)該バリアントGFRALタンパク質を分析して、RETタンパク質と結合するその能力を決定することと
    を含む前記方法。
  55. 前記変異のための部位が、GFRALタンパク質とRETタンパク質との間の界面を伴うGFRALドメインに位置し、該ドメインが、配列番号:9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基を含む、請求項54記載の方法。
  56. 前記変異のための部位が、配列番号9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298からなる群から選択される位置に相当するアミノ酸である、請求項54記載の方法。
  57. GFRALタンパク質と結合する能力をもつバリアントGDF15タンパク質を特定するための方法であって、
    a)表6の原子座標によって定義される、GFRALタンパク質とGDF15タンパク質とを含む複合体の3次元構造を構築することと;
    b)該3次元構造及びモデリング方法を用いて、GDF15タンパク質を変異させるための部位を特定し、該部位を変異させてバリアントGDF15タンパク質を産生することと;
    c)該バリアントGDF15タンパク質を生成することと;
    d)該バリアントGDF15タンパク質を分析して、GFRALタンパク質と結合するその能力を決定することと
    を含む前記方法。
  58. 前記変異のための部位が、GDF15タンパク質とGFRALタンパク質との間の界面を伴うGDF15ドメインに位置し、該ドメインが、配列番号:6のSER35、LEU34、THR94、GLY95、GLN40、VAL96、LEU98、PRO36、VAL87、LEU88、ILE89、ASP102、THR100、PRO85、及びMET86からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基を含む、請求項57記載の方法。
  59. 前記変異のための部位が、配列番号:6のSER35、LEU34、THR94、GLY95、GLN40、VAL96、LEU98、PRO36、VAL87、LEU88、ILE89、ASP102、THR100、PRO85、及びMET86からなる群から選択される位置に相当するアミノ酸である、請求項57記載の方法。
  60. GFRALタンパク質とGDF15タンパク質とを含む複合体(GFRAL/GDF15複合体)又はGFRALタンパク質とRETタンパク質とを含む複合体(GFRAL/RET複合体)の形成を阻害する薬剤を生成するための方法であって、
    a)GFRALタンパク質と、2種以上の薬剤のうちの1種とを含む複合体(GFRAL/薬剤 複合体)の2つ以上の3次元構造を得ることと;
    b)3次元GFRAL/薬剤複合体構造のそれぞれを、該GFRAL/GDF15複合体の3次元構造と、又はGFRAL/RET複合体の3次元構造と比較することと;
    c)GFRAL/薬剤複合体と、GFRAL/GDF15複合体の3次元構造との、又はGFRAL/RET複合体の3次元構造との、構造的類似性に基づいて、該2種以上の薬剤のうちの少なくとも1種を選択することと;
    d)該薬剤を生成することと
    を含む前記方法。
  61. 前記少なくとも1種の薬剤が、前記GDF15タンパク質又は前記RETタンパク質と結合するのと同じ又はそれよりも高い親和性で前記GFRALタンパク質と結合する場合に選択される、請求項60記載の方法。
  62. 前記ステップb)の比較が、2種以上のGFRAL/薬剤複合体中のGFRALタンパク質のアミノ酸を、配列番号:9のGLY140、LEU148、ALA149、ALA146、VAL142、ASN145、VAL139、ALA135、GLU136、LEU152、LEU132、SER201、ALA204、LEU205、LYS153、ILE196、PRO197、及びGLN200からなる群から選択されるGFRAL/GDF15複合体中のGFRALタンパク質のアミノ酸と比較することを含む、請求項60記載の方法。
  63. 前記ステップb)の比較が、2種以上のGFRAL/薬剤複合体中のGFRALタンパク質のアミノ酸を、配列番号:6のSER35、LEU34、THR94、GLY95、GLN40、VAL96、LEU98、PRO36、VAL87、LEU88、ILE89、ASP102、THR100、PRO85、及びMET86からなる群から選択されるGFRAL/GDF15複合体中のGDF15タンパク質のアミノ酸と比較することを含む、請求項60記載の方法。
  64. 前記ステップb)の比較が、2種以上のGFRAL/薬剤複合体中のGFRALタンパク質のアミノ酸を、配列番号9のGLN246、ARG247、ARG250、LYS251、CYS252、ASP255、GLU256、ASN257、CYS258、ILE259、SER260、THR261、LEU262、THR297、及びGLN298からなる群から選択されるGFRAL/RET複合体中のGFRALタンパク質のアミノ酸と比較することを含む、請求項60記載の方法。
  65. 前記GFRAL/GDF15複合体の3次元構造が、表6の原子座標によって定義される、請求項60記載の方法。
  66. 比較することが、モデリングプログラムを用いることを含む、請求項60記載の方法。
  67. 前記薬剤が、組換え細胞内で生成される、請求項60記載の方法。
  68. 少なくとも1g、少なくとも10g、少なくとも100g、又は少なくとも1,000gの前記薬剤が生成される、請求項60記載の方法。
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