KR101634855B1 - Trpc3와 trpc1 간의 이형복합체 형성을 저해하는 물질을 이용한 칼슘이온 관련 근육 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 TRPC3(canonical-type transient receptor potential cation channel 3)와 TRPC1(canonical-type transient receptor potential cation channel 1) 간의 이형복합체 형성을 저해하는 물질을 이용하여 근육 세포의 세포질 칼슘이온 과잉과 관련한 근육 질환을 치료하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

TRPC3와 TRPC1 간의 이형복합체 형성을 저해하는 물질을 이용한 칼슘이온 관련 근육 질환의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition for preventing or treating calcium ion-related muscle disease using materials inhibiting heteromerization between TRPC3 and TRPC1}

본 발명은 TRPC3(canonical-type transient receptor potential cation channel 3)와 TRPC1(canonical-type transient receptor potential cation channel 1) 간의 결합(이형복합체 형성)을 저해하는 물질을 이용하여 근육 세포의 칼슘이온 과잉과 관련된 근육 질환을 치료하기 위한 약학 조성물에 관한 것이다.

TRPC3(canonical-type transient receptor potential cation channel 3)은 TRP 수퍼-패밀리의 서브-패밀리 맴버 중의 하나이며, 세포막에 존재하는 칼슘이온-투과성 비선택적 양이온 이동 통로(channel)로서, 다양한 세포에서 세포 외부에 존재하는 칼슘이온이 세포질로 유입되는 이동 통로로써의 역할을 한다. 7개의 TRPC 아형이 알려져 있으며, 이 중, TRPC3은 6개의 막관통 도메인, 안키린 반복(AR; ankyrin repeat) 부위를 포함하는 N-말단, TRP 도메인 및 프롤린-다존재 모티프를 포함하는 C-말단을 가지고 있다.

TRPC3은 같은 또는 다른 아형의 TRP들과 동형 또는 이형복합체를 형성(heteromerization)하여 4분자 복합체(tetrameric complex)를 형성하며, 이렇게 형성된 복합체가 세포 외부로부터 세포질로 칼슘이온이 이동하는 통로로써 기능을 한다. 골격근 세포에서 TRPC3는 세포 외부로부터 칼슘이온의 유입을 가능하게 하여 세포질 칼슘이온 농도를 높은 수준으로 유지하는 역할을 하고, 이에 의하여 골격근의 흥분-수축 결합(ECC; excitation-contraction coupling)이 최대 활성(full-gain)으로 일어날 수 있도록 한다.

또한, 골격근 세포에서 TRPC3와 TRPC1 간의 결합이 보고 되었는데(M. Schaefer, Pflugers Arch 451(2005) 35-42; X. Liu, B.C. J Biol Chem 280 (2005) 21600-21606; B. Lintschinger, M. et al., J Biol Chem 275 (2000) 27799-27805; K.K. Cheung, S.S. et al., Muscle Nerve 44 (2011) 358-365), TRPC3의 어느 세부 부위가 이러한 결합, 즉, 이형복합체 형성에 관여하는지, 그리고 이러한 결합에 의해 만들어진 TRPC3/1 이형복합체가 골격근 세포에서 어떤 역할을 하는지에 대해서는 보고된 바가 없다.

본 발명은 TRPC3의 아미노산 서열 중에, TRPC3와 TRPC1 간의 결합(이형복합체 형성)을 매개하는 상세 부위와, 상기 결합을 방해하는 부위가 동시에 존재한다는 것을 확인하였다. 또한, TRPC3와 TRPC1 간의 결합으로 형성된 이형복합체가 골격근 세포의 세포질 칼슘이온 농도를 조절하는 것을 확인하였다. 따라서, TRPC3의 아미노산 서열 중, TRPC1 과의 이형복합체 형성을 매개하는 또는 방해하는 부분을 이용함으로써, 골격근 세포의 세포질 칼슘이온 농도의 과잉 또는 저하에 의해 유발되는 각종 근육 질환들을 치료할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서, TRPC3의 아미노산 서열 중, N-말단의 1부터 37번째 아미노산까지의 부위가 TRPC3와 TRPC1 간의 결합(이형복합체 형성)을 방해한다는 것을 확인하였으며, 상기 아미노산으로 이루어진 단편을 서열번호 1로 나타내었다.

또한, 본 발명에서, TRPC3의 아미노산 서열 중, N-말단의 38부터 188번째 아미노산까지의 부위를 통해서 TRPC3와 TRPC1 간의 결합(이형복합체 형성)이 일어난다는 것을 확인하였으며, 상기 아미노산으로 이루어진 단편을 서열번호 2로 나타내었다.

또한, 본 발명에서, TRPC3의 전체 아미노산 서열을 서열번호 3으로 나타내었다(인간 TRPC3의 cDNA 염기서열은 GenBank accession number: NM_003305.2 참고).

또한, 본 발명에서, TRPC1의 전체 아미노산 서열을 서열번호 4로 나타내었다(인간 TRPC1의 cDNA 염기서열은 GenBank accession number: BC113953.1 참고).

이에 따라, 본 발명의 목적은, TRPC3와 TRPC1 간의 결합(이형복합체 형성)을 저해하는 물질을 포함하는, 브로디 신드롬(Brody Syndrome), 뒤시엔느 근육위축병(Duchenne muscular dystrophy) 및 악성고열골격근병(Malignant hyperthermia)으로 이루어진 군에서 선택되는 칼슘 과잉과 관련된 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물

보다 상세하게, 본 발명의 목적은, (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산, 및 (iii) TRPC3 단백질 중 38부터 188번째 아미노산 부위(일 예로, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 중 38 부터 188번째 아미노산 부위)에 특이적으로 결합하는 항체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 브로디 신드롬, 뒤시엔느 근육위축병 및 악성고열골격근병으로 이루어진 군에서 선택되는 칼슘 과잉과 관련된 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

골격근의 주된 역할은 골근육의 수축과 이완을 일으키는 것이며, 이 때 골격근 세포의 세포질 칼슘이온이 골격근의 수축과 이완 과정을 매개하는 핵심적인 세포 내 이차전달 물질로 작용한다. TRPC3은 N-말단에 38부터 188번째 아미노산까지의 서열에 안키린 반복(AR; ankyrin repeat) 부위를 가지고 있으며, 골격근 분화세포(skeletal myotubes) 등 다양한 세포에서 같은 또는 다른 TRP 아형(subtype)들과 동종 또는 이형복합체를 형성(heteromerization)함으로써 세포 외부로부터 세포질로의 칼슘이온-유입 통로(channel)로써 역할을 한다. 그러나, 현재까지, TRPC3의 어느 부위가 이형복합체 형성에 관여하는지, N-말단의 AR 부위가 그 이형복합체 형성에 관여하는지, 및 이형복합체 형태의 TRPC3가 골격근에서 무슨 역할을 하는지에 대해서 보고된 바가 없다.

본 발명에서는 GST 풀-다운 방법(GST pull-down assay)을 통하여 TRPC3와 TRPC1의 이형복합체 형성을 분석하여, TRPC3의 아미노산 서열 중에서 TRPC1과의 결합에 관여하는 상세 부위를 밝혀냈다. 본 발명에 의하면, TRPC3의 AR 부위를 포함하는 영역(TRPC3의 N-말단의 38부터 188번째 아미노산)이 TRPC1과의 결합을 매개한다는 것과, TRPC3의 N-말단 끝부분인 1부터 37번째 아미노산 부위가 상기 결합을 저해한다는 것을 밝혀냈다. 또한, 상기 TRPC3의 N-말단 끝부위 단편을 생쥐의 일차배양 골격근 분화세포(mouse primary skeletal myotubes)에 발현시킨 결과, TRPC3와 TRPC1 간의 이형복합체 형성이 유의적으로 저해되었고, 휴지상태의 세포질의 칼슘 양이 의미 있게 감소된 것을 확인하였다.

이러한 결과는, TRPC3의 AR 부위가 TRPC3와 TRPC1 간의 이형복합체 형성을 매개하며, 이를 통해 형성된 TRPC3/1 이형복합체가 골격근 세포에서 휴지상태의 세포질 칼슘이온 농도를 조절하는 데 관여한다는 것을 나타낸다.

본 발명에 따르면, TRPC3의 N-말단 끝부분인 1부터 37번째 아미노산 부위는 TRPC3와 TRPC1 간의 이형복합체 형성을 저해함으로써 골격근 세포의 세포질 칼슘 농도를 낮출 수 있다. 따라서, TRPC3의 N-말단 끝부분인 1부터 37번째 아미노산으로 이루어진 펩타이드(본 발명에서는 서열번호 1로 나타낸다) 또는 이를 코딩하는 핵산을 약제로 투여할 경우 골격근 세포의 세포질에 높아진 칼슘 농도를 유의적으로 감소시켜서, 칼슘 과잉으로 인해 유발되는 근육 질환들, 예컨대 브로디 신드롬(Brody Syndrome), 뒤시엔느 근육위축병(Duchenne muscular dystrophy) 및 악성고열골격근병(Malignant hyperthermia) 등을 방지 또는 개선하는 데 사용될 수 있다.

또는, 본 발명에 따르면, TRPC3의 N-말단의 38부터 188번째 아미노산 부위가 TRPC3와 TRPC1 간의 이형복합체 형성을 매개하는 부위이므로, TRPC3의 N-말단의 38부터 188번째 아미노산으로 이루어진 펩타이드(본 발명에서는 서열번호 2로 나타낸다) 또는 이를 코딩하는 핵산을 약제로 투여할 경우 골격근 세포에 원래 존재하는 TRPC3가 TRPC1과의 이형복합체를 형성하는 것을 경쟁적으로 저해하여, 골격근 세포에서 TRPC3와 TRPC1 간의1 이형복합체 형성을 감소시킬 수 있다. 이러한 원리로, 서열번호 2의 펩타이드를 약제로 투여할 경우 골격근 세포의 세포질에 높아진 칼슘 농도를 유의적으로 감소시켜서, 칼슘 과잉으로 인해 유발되는 근육 질환들, 예컨대 브로디 신드롬, 뒤시엔느 근육위축병 및 악성고열골격근병 등을 방지 또는 개선하는 데 사용될 수 있다.

또는, 본 발명에 따르면, TRPC3의 N-말단의 38부터 188번째 아미노산 부위가 TRPC3와 TRPC1 간의 이형복합체 형성을 매개하는 부위이므로, 상기 부위를 억제할 경우 (예를 들어, TRPC3의 N-말단의 38부터 188번째 아미노산 부위에 결합하는 항체 투여), TRPC3와 TRPC1 간의 이형복합체 형성을 저해하여, 골격근 세포에서 TRPC3와 TRPC1 간의 이형복합체 형성을 감소시킬 수 있다. 이러한 원리로, TRPC3의 N-말단의 38부터 188번째 아미노산 부위에 결합하는 항체를 약제로 투여할 경우 골격근 세포의 세포질에 높아진 칼슘 농도를 유의적으로 감소시켜서, 칼슘 과잉으로 인해 유발되는 근육 질환들, 예컨대 브로디 신드롬, 뒤시엔느 근육위축병 및 악성고열골격근병 등을 방지 또는 개선하는 데 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

하나의 양태로서, 본 발명은, TRPC3와 TRPC1의 이형복합체 형성을 저해하는 물질을 포함하는, 브로디 신드롬, 뒤시엔느 근육위축병 및 악성고열골격근병으로 이루어진 군에서 선택되는 칼슘 과잉과 관련된 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

일 구현예로, 본 발명은, (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산, (ii) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산, 및 (iii) TRPC3 단백질 중 38부터 188번째 아미노산 부위(일예로, 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 중 38부터 188번째 아미노산 부위)에 특이적으로 결합하는 항체로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는, 브로디 신드롬, 뒤시엔느 근육위축병 및 악성고열골격근병으로 이루어진 군에서 선택되는 칼슘 과잉과 관련된 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 브로디 신드롬, 뒤시엔느 근육위축병 및 악성고열골격근병으로 이루어진 군에서 선택되는 칼슘 과잉과 관련된 근육 질환의 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 범위에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 변형된 형태도 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아세틸화(acetylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파렌실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 천연에서 추출하거나 합성 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에서 상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자는, 자연에서 분리되거나 인위적으로 합성 변형된 것일 수 있다. 즉, 천연형 DNA에 한정되는 것은 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 활성을 유지하는 범위 내에서 적절한 변형이 가해지거나 발현 조절을 위한 요소가 부가되거나, 유전공학적 방법 혹은 화학적 방법에 의해 얻어지는지 여부를 불문하고 본 발명의 목적에 적합하게 사용될 수 있는 것을 의미한다.

또한, 본 발명의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자는 벡터에 포함된 상태로 세포배양 시스템에서 적절한 진핵세포에 도입시켜 상기 펩타이드를 직접적으로 발현시키거나, 원핵세포에 형질전환시켜 상기 펩타이드를 발현시킨 후, 이들 펩타이드를 정제하여 사용할 수 있다. 이러한 본 발명의 펩타이드는, 예를 들면 정제된 펩타이드, 수용성 펩타이드, 또는 표적 세포로의 전달 또는 투여를 위한 담체에 결합된 형태의 펩타이드나 아미노산 잔기와 융합된 형태를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드를 코딩하는 유전자는 세포 내 전달을 위한 발현 벡터에 포함되어 제공될 수 있다. 이 경우, 펩타이드를 코딩하는 핵산은 발현 벡터 내에서 프로모터/인핸서 서열과 같은 발현 조절 서열 및 기타 전사, 해독 또는 프로세싱에 필요한 서열들과 함께 결합될 수 있다. 조절 서열은 뉴클레오타이드의 구성적 발현(constitutive expression)을 지시하는 것뿐만이 아니라 조직-특이적 조절 및/또는 유도성 서열을 포함할 수 있으며, 발현 벡터의 설계는 형질전환시킬 숙주 세포, 목적하는 발현 수준 등과 같은 요소에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물에서 상기 펩타이드를 환부에 지속적으로 공급하기 위해 펩타이드를 코딩하는 핵산을 삽입할 수 있는 벡터로는 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus) 벡터 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 벡터와 같은 바이러스 유래 벡터와, 동물의 체내에서 발현될 수 있는 플라스미드 및 이들의 변형 벡터 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은, TRPC3 단백질(서열번호 3)의 N-말단의 38부터 188번째 아미노산 부위의 활성을 억제하기 위하여, 상기 부위에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로 포함할 수 있다. 이러한 항체는 단일클론항체 및 이에 대한 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체를 모두 포함하는 것이고, 신규한 항체 외에 이미 당해 기술분야에서 공지된 항체들도 포함될 수 있다.

상기 항체는 TRPC3 의 N-말단의 38부터 188번째 아미노산 부위를 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄와 2개의 경쇄의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 조성물은 브로디 신드롬, 뒤시엔느 근육위축병 및 악성고열골격근병으로 이루어진 군에서 선택되는 칼슘 과잉과 관련된 근육 질환의 예방 또는 치료에 효과적이다. 본원에 있어서, "예방"이란 조성물의 투여로 질환의 형성을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하는 것이며, "치료"란 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하는 것이다.

브로디 신드롬은 골격근 조직의 파괴(rhabdomyolysis)가 유발되는 상염색체에 기인된 유전적 골격근육병증(inherited skeletal myopathy)으로, 신체의 움직임 또는 운동 과정에 근육 경직과 경련통(exercise-induced muscle stiffness and cramping)이 수반된다. 특히, 다리, 팔, 얼굴(특히 눈꺼풀)에 심하게 나타나, 이동(movement) 장애와 표정(expression) 장애를 일으킨다.

브로디 신드롬 환자는 골근육 세포의 세포질 칼슘이 정상 상태에 비해서 높게 나타나는 특징이 있다(A. Odermatt, et al., Genomics 45 (1997) 541-53; I.A. Brody, N Engl J Med 281 (1969) 187-92; Y. Zhang, et al., Genomics 30 (1995) 415-24; N.C. Voermans, et al., Neuromuscul Disord (2012), In press). 본 발명에서 제공하는 서열번호 1의 펩타이드는 골격근 세포의 세포질 칼슘 농도를 낮출 수 있으므로, 상기 펩타이드의 발현 또는 투여로, 브로디 신드롬 환자의 골격근 세포의 세포질에 높아진 칼슘 농도를 낮추어서, 브로디 신드롬 환자의 치료 및 증상을 개선할 수 있는 약제로 활용할 수 있다. 또는, 본 발명에서 제공하는 서열번호 2의 펩타이드는 골격근 세포에 원래 존재하는 TRPC3가 TRPC1과 이형복합체를 형성하는 것을 경쟁적으로 저해하여, 세포질의 칼슘 농도를 낮출 수 있으므로, 상기 펩타이드의 발현 또는 투여로 브로디 신드롬 환자의 치료 및 증상을 개선할 수 있는 약제로 활용할 수 있다. 또는, 본 발명에서 제공하는 항체는, TRPC3 의 N-말단의 38부터 188번째 아미노산 부위에 특이적으로 결합하여 TRPC3가 TRPC1과 이형복합체를 형성하는 것을 저해함으로써, 세포질의 칼슘 농도를 낮출 수 있으므로, 상기 항체의 투여로 브로디 신드롬 환자의 치료 및 증상을 개선할 수 있는 약제로 활용할 수 있다.

뒤시엔느 근육위축병는 3,600 명 어린이 중에 1 명 꼴로 발견되는 널리 알려진 빈발 근육병으로, 골격근 퇴행(degeneration)으로 결국 사망까지 이르게 하는 병이다. 직접적 원인으로는 디스트로핀(dystrophin)에 대한 유전자에 돌연변이 발생에 의한 디스트로핀의 부재이다.

뒤시엔느 근육위축병 환자의 골격근 세포는 정상보다 높은 세포질 칼슘 농도를 가지고 있다는 것이 잘 알려져 있고, 이로 인해 비정상적인(abnormal) 골격근 수축과 이완 발생이 증상의 원인으로 알려져 있다(Mallouk N. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. (2000) 25;97(9):4950-5). 따라서, 본 발명에서 제공하는 서열번호 1의 펩타이드는 골격근 세포의 세포질 칼슘 농도를 낮출 수 있으므로, 상기 펩타이드의 발현 또는 투여로, 뒤시엔느 근육위축병 환자의 골격근 세포의 세포질에 높아진 칼슘 농도를 낮추어서, 뒤시엔느 근육위축병 환자의 치료 및 증상을 개선할 수 있는 약제로 활용할 수 있다. 또는, 본 발명에서 제공하는 서열번호 2의 펩타이드는 골격근 세포에 원래 존재하는 TRPC3이 TRPC1과 이형복합체를 형성하는 것을 경쟁적으로 저해하여, 세포질의 칼슘 농도를 낮출 수 있으므로, 상기 펩타이드의 발현 또는 투여로 뒤시엔느 근육위축병 환자의 치료 및 증상을 개선할 수 있는 약제로 활용할 수 있다. 또는, 본 발명에서 제공하는 항체는, TRPC3의 N-말단의 38부터 188번째 아미노산 부위에 특이적으로 결합하여 TRPC3가 TRPC1과 이형복합체를 형성하는 것을 저해함으로써, 세포질의 칼슘 농도를 낮출 수 있으므로, 상기 항체의 투여로 뒤시엔느 근육위축병 환자의 치료 및 증상을 개선할 수 있는 약제로 활용할 수 있다.

악성고열골격근병은 마취 중에 갑자기 그리고 빠르게 고열이 발생하여 사망에 이를 확률이 극히 높은 증후군을 말한다. 골격근 세포의 근세포질세망(sarcoplasmic reticulum)의 막에 존재하는 칼슘이온 이동 통로의 감수성이 증가하여 근수축이 과하게 일어나 발열을 일으키며, 호흡이나 맥박이 빨라지고 체온이 5분에 1℃ 정도의 속도로 42℃ 정도까지 상승하고, 동시에 근육의 경직이나 과긴장이 생기고 대사성 및 호흡성 산증, 고칼륨혈증이 나타난다.

악성고열골격근병 환자는 골격근 세포의 세포질 칼슘이 정상 상태에 비해서 높게 나타나는 특징이 있다(Eltit JM et al., FASEB J. (2013) 27(3):991-1000). 본 발명에서 제공하는 서열번호 1의 펩타이드는 골격근 세포의 세포질 칼슘 농도를 낮출 수 있으므로, 상기 펩타이드의 발현 또는 투여로, 악성고열골격근병 환자의 골격근 세포의 세포질에 높아진 칼슘 농도를 낮추어서, 악성고열골격근병 환자의 치료 및 증상을 개선할 수 있는 약제로 활용할 수 있다. 또는, 본 발명에서 제공하는 서열번호 2의 펩타이드는 골격근 세포에 원래 존재하는 TRPC3이 TRPC1과 이형복합체화를 형성하는 것을 경쟁적으로 저해하여, 세포질의 칼슘 농도를 낮출 수 있으므로, 상기 펩타이드의 발현 또는 투여로 악성고열골격근병 환자의 치료 및 증상을 개선할 수 있는 약제로 활용할 수 있다. 또는, 본 발명에서 제공하는 항체는, TRPC3의 N-말단의 38 부터 188번째 아미노산 부위에 특이적으로 결합하여 TRPC3가 TRPC1과 이형복합체를 형성하는 것을 저해함으로써, 세포질의 칼슘 농도를 낮출 수 있으므로, 상기 항체의 투여로 악성고열골격근병 환자의 치료 및 증상을 개선할 수 있는 약제로 활용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함하여 제제화될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체" 란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 본 발명에서의 약학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 또는 정제로 제제화 할 수 있다.

또한 바람직하게 본 발명의 약제학적 조성물은 충진제, 부형제, 붕해제, 결합제 및 활택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약제학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화 될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용 약, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 펩타이드 또는 항체의 투여, 핵산의 바이러스성 또는 비바이러스성 기술에 의한 운반, 또는 핵산을 발현하는 세포의 이식을 포함한다.

본 발명의 조성물의 투여경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여, 강내 투여, 복강 내 투여, 경막 내 투여가 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지는 않으며, 바람직하게는 질환 병소를 나타내는 조직, 즉 근육 조직에 직접 투여할 수 있다.

본 발명의 치료방법은 상기 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 치료 방법은 칼슘 이상과 관련된 근육 질환이 발생할 수 있는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

본 발명은 근육 세포 칼슘 분배 이상에 따른 근육 질환을 치료하는 데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 TRPC3 전장(full-length) 단백질과 TRPC3의 단편들(NF1, NF2, NF3)에 대한 아미노산 서열을 나타낸다. 숫자는 아미노산 번호를 나타낸다. AR은 안키린 반복(ankyrin repeat) 부위, TM 은 막통과 부위, T는 TRP 도메인을 나타낸다.
도 2는 TRPC3의 단편들(NF4, NF5)에 대한 아미노산 서열을 나타낸다. 숫자는 아미노산 번호를 나타낸다. AR은 안키린 반복(ankyrin repeat) 부위, TM 은 막통과 부위를 나타낸다.
도 3은 GST(음성 대조군) 및 GST-TRPC3 단편들(GST-NF1, GST-NF2, GST-NF3)을 E. coli에서 발현시키고, SDS-PAGE로 분리한 후 쿠마시 블루로 염색한 결과를 나타낸다(발현된 각각의 단백질을 흰색 별표로 표시).
도 4는 GST(음성 대조군) 및 GST-TRPC3 단편들(GST-NF1, GST-NF2, GST-NF3)을 E. coli에서 발현시킨 후 GST 구슬로 정제한 결과를 나타낸다.
도 5는 GST(음성 대조군) 및 GST-TRPC3 단편들(GST-NF1, GST-NF2, GST-NF3)을 각각 TRPC1을 포함하는 트라이아드 샘플(triad sample)과 GST 풀-다운 방법을 실행하여 얻어진 단백질들, 그리고 트라이아드 샘플을 각각 SDS-PAGE 로 분리한 후 TRPC1 항체를 처리한면역탁본한 결과를 나타낸다. 트라이아드 샘플은 SDS-PAGE 젤 상에서 TRPC1의 정확한 위치를 나타내고 있다 (비특이적 단백질 밴드와의 구분을 위함). 결론적으로, NF2 만이 TRPC1과 결합함을 나타내고 있다.
도 6은 GST(음성 대조군) 및 GST-TRPC3 단편들(GST-NF4, GST- NF5)을 E. coli에서 발현시키고, SDS-PAGE로 분리한 후 쿠마시 블루로 염색한 결과를 나타낸다(발현된 각각의 단백질은 흰색 별표로 표시).
도 7은 GST(음성 대조군) 및 GST-TRPC3 단편들(GST-NF2, GST-NF4, GST-NF5)을 각각 TRPC1을 포함하는 트라이아드 샘플(triad sample)을 GST 풀-다운 방법을 실행하여 얻어진 단백질들, 그리고 트라이아드 샘플을 각각 SDS-PAGE 로 분리한 후 TRPC1 항체를 처리한 면역탁본한 결과를 나타낸다. 결론적으로, NF4의 존재 하에서는 NF2가 TRPC1와 결합하지 않으며, NF4 부위를 포함하고 있는 NF5 단편 또한 TRPC1 과 결합하지 않음을 나타내고 있다.
도 8은 생쥐의 일차배양 골격근 분화세포(mouse primary skeletal myotubes)에 GFP-NF4를 감염시킨 후, GFP에 대한 면역세포화학법(immunocytochemistry)을 통해 NF4의 발현을 확인한 결과이다.
도 9는 NF4를 발현하는 일차배양 골격근 분화세포 용해액과 TRPC3 항체를 이용한 공동면역침전을 수행하여, 전장(full-length)의 TRPC3와 TRPC1 간의 결합을 확인한 결과를 나타낸다. 벡터만이 감염된 골격근 분화세포를 표준 대조군으로 사용하였다. 결론적으로, 전장의 TRPC3와 TRPC1 간의 결합을 재확인한 결과를 나타내고 있고, NF4를 발현하는 골격근 분화세포에서 TRPC3와 TRPC1 간의 결합이 벡터 대조군에 비해서 의미 있게 낮다는 것을 나타낸다(왼쪽 그림). 오른쪽 그림은 TRPC3와 함께 공동침전된 TRPC1에 대한 밴드의 강도를 표준보정(normalized)하여 막대그래프로 나타낸 것이다(0.67±0.05 vs. 1.00±0.08).
도 10은 면역탁본법을 이용하여, NF4를 발현하는 골격근 분화세포에서 TRPC1, TRPC3, Orai1, 및 STIM1 의 발현 정도를 각각 확인한 결과를 나타낸다. 벡터만이 감염된 골격근 분화세포를 표준 대조군으로 사용하였다. 결론적으로, 벡터 대조군에 비해서 분석한 단백질들의 발현 수준에서는 의미 있는 변화가 없음을 나타내고 있다.
도 11은 단일세포 칼슘 이미징 기법을 이용하여, NF4를 발현하는 골격근 분화세포의 세포질에서 칼슘 양을 측정한 결과를 나타낸다. 결론적으로, 벡터 대조군에 비해서, NF4를 발현하는 골격근 분화세포의 세포질에서 칼슘의 양이 의미 있게 감소함을 나타내고 있다(64.6±8.2 vs. 84.0±9.9).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. GST 및 TRPC3 단편의 융합체 ( GST - TRPC3 단편) 또는 GFP 및 TRPC3 단편의 융합체( GFP-TRPC3 단편)에 대한 cDNA 제작과 단백질 발현 방법

도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이 TRPC3 단편들(NF1, NF2, NF3, NF4, NF5)을 준비하기 위하여, 인간 TRPC3 cDNA(GenBank accession number: NM_003305.2) 를 견본으로, 표 1에 제시된 PCR 프라이머들을 이용하여 PCR 을 수행하였다. PCR 수행 조건으로 샘플을 95 ℃에서 5분 동안 유지 한 후, 95℃에서 30초, 57 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분 유지하는 과정을 40번 반복하였다.

PCR 프라이머			서열번호
GST-NF1	순방향	5'-CGGAATTCATGGAGGGAAGCCCATCCCTGAG-3'	5
	역방향	5'-CGGTCGACTCAGCTTCGCAGAATTTTCCCCAGC-3'	6
GST-NF2	순방향	5'-CGGAATTCATGGCCGAGGAGGAGCGCTTCC-3'	7
	역방향	5'-CGGTCGACTCAGCTTCGCAGAATTTTCCCCAGC-3'	8
GST-NF3	순방향	5'-CGGAATTCATGCCGCACGACTATTTCTGCAAG-3'	9
	역방향	5'-CGGTCGACTCAGCTTCGCAGAATTTTCCCCAGC-3'	10
GST-NF4	순방향	5'-CGGAATTCATGGAGGGAAGCCCATCCCTGAG-3'	11
	역방향	5'-CGGTCGACTCAGGTGAGGCTGGTGCCGCGGTC-3'	12
GST-NF5	순방향	5'-CGGAATTCATGGAGGGAAGCCCATCCCTGAG-3'	13
	역방향	5'-CGGTCGACTCACCGCTCGATCCTGGCACCCTTC-3'	14
GFP-NF4	순방향	5'-GATCTCGAGCTACCATGGAGGGAAGCCCATCC-3'	15
	역방향	5'-CGGTCGACTCAGGTGAGGCTGGTGCCGCGGTC-3'	16

얻어진 PCR 합성체는 pGEX-4T-1 벡터(GE healthcare 에서 구입)에 제한효소 EcoR1과 Sal1을 이용하여 삽입하거나(이와 같이 제조된 벡터를 각각 GST-NF1, GST-NF2, GST-NF3, GST-NF4, 및 GST-NF5 로 명명함), pEGFP-C1 포유동물 발현 벡터(Clontech Laboratories,Inc.에서 구입)에 제한효소 XhoI 과 Sal1을 이용하여 삽입하였고(이와 같이 제조된 벡터를 GFP-NF4 로 명명함), 만들어진 cDNA의 염기 서열은 유전자 서열기를 통하여 재차 확인하였다. GST-TRPC3 단편들(GST-NF1, GST-NF2, GST-NF3, GST-NF4, 및 GST-NF5)은 E.coli(DH5α로 형질전환(transformation)하여 단백질로 발현시킨 후 GST 구슬(bead)를 이용하여 정제하였고, GFP-TRPC3 단편(GFP-NF4)은 골격근 분화세포(skeletal myotubes)의 감염(transfection)에 사용하였다.

실시예 2. 트라이아드 샘플( triad sample ) 준비와 GST 풀-다운( pull - down )을 통한 GST - TRPC3 단편들과 TRPC1 의 결합 반응 분석

TRPC1 단백질을 얻기 위해서, 토끼 골격근(rabbit fast-twitch skeletal muscle)에서 트라이아드 낭(triad vesicle)을 얻었고, 용해액(1% Triton X-100, 10 mM Tris-HCl, 1 mM Na₃VO₄, 10% 글리세롤, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 프로테아제 저해제 칵테일, 및 pH 7.4)과 트라이아드 낭을 섞어 4℃ 에서 4시간 동안 용해(solubilize)하여 트라이아드 샘플을 얻었다. GST 풀-다운을 위해서, GST 구슬에 붙은 GST-TRPC3 단편들에 트라이아드 샘플(150 μg)을 섞어서 4℃ 에서 8시간 동안 결합 반응을 진행하였고, 얻어진 구슬에 붙은 모든 단백질들은 SDS-PAGE 를 이용하여 분리하고, TRPC1 항체를 사용하여 면역탁본법(immunoblot assay)으로 GST-TRPC3 단편과 TRPC1 간의 결합 여부를 확인하였다.

실시예 3. 일차 골격근 세포의 배양과 분화 유도 방법

생쥐(mouse)의 골격근에서 일차 골격근 세포(primary skeletal muscle cell)를 분리하고, 세포 배양액(F10 Nutrient Mixture 조성: 20% FBS, 100 units/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민, 20 nM basic fibroblast growth factor)을 처리하여 37℃ 조건의 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. 사용한 배양 접시로는 용도에 따라서 10-cm 또는 96-well 접시를 사용하였고, 모든 접시는 마트리젤(Matrigel)로 코팅하여 사용하였다. 일차 골격근 세포가 배양 접시의 70% 가량을 차지할 정도로 증식하였을 때, 세포의 분화(differentiation)를 유도하였다(세포 분화액 조성: 세포 배양액에서 20% FBS와 F-10 Nutrient Mixture 대신 5% heat-inactivated horse serum과 low-glucose DMEM을 사용하고, bFGF는 넣지 않음, 18% CO₂ 인큐베이터를 사용). 분화가 완성된 세포는 골격근 분화세포(skeletal myotube)라 하고, 광학현미경을 사용하여 분화세포의 형태(이미지)를 얻었다.

실시예 4. 골격근 분화세포( myotube )에 NF4 발현을 위한 NF4 cDNA 감염

분화가 유도된 날로부터 3일째가 되는 미성숙 골격근 분화세포(immature myotubes)에 제작된 NF4 cDNA를 4시간 동안 처리하여 감염하고(cDNA transfection: 10-cm 배양 접시에 배양된 세포를 예로 들 경우에, 30μl FuGENE6, 20μg cDNA가 같이 처리됨), 분화 5일째가 되는 날(즉, 감염 후 36 시간 후, 분화가 완성된 골격근 분화세포)에 면역세포화학법(immunocytochemistry)을 이용하여 표지로 사용된 GFP 의 발현 여부로 NF4의 성공적 발현을 확인하였다.

실시예 5. 공동면역침전법( co - immunoprecipitation ), 면역탁본법( immunoblot assay) 및 면역세포화학법(immunocytochemistry)을 통한 분석

골격근 분화세포(myotube)는 용해 용액 [lysis buffer 조성: 1% Triton -100, 10 mM Tris-HCl(pH 7.4), 1 mM Na₃VO₄, 10% 글리세롤, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 프로테아제 저해제(1μM 펩스타틴, 1μM 류펩틴, 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 20 mg/ml 아프로티닌, 1μM 트립신 저해제)]을 처리하여 24 시간 동안 4℃에서 용해(solubilize) 시킨 후, 공동면역침전법과 면역탁본법에 사용하였다. 이때 10-cm 배양 접시에서 자란 세포를 예로 들면, 300 μl의 용해 용액을 세포에 처리하였다.

공동면역침전법을 수행하기 위해, TRPC3 항체를(10μg/ml)를 이용하여 용해된 골격근 분화세포용액(전체단백질 800μg)에서 TRPC3를 침전시키고, 얻어진 단백질들을 SDS-PAGE로 분리한 뒤에(10% 젤 사용), TRPC3 항체와 TRPC1 항체를 이용하여 면역탁본법을 수행하였다. 단순 면역탁본법을 수행하기 위해, 용해된 골격근 분화세포용액(전체단백질 50μg)을 SDS-PAGE 로 분리한 뒤에(10% 젤 사용), 해당 항체(1:1000 희석)를 사용하여 해당 단백질의 발현 수준을 확인하였다.

면역세포화학법을 수행하기 위해, 골격근 분화세포(myotube)를 차가운 메탄올(cold methanol)로 30분 동안 고정(fix)한 뒤에, GFP 항체(1:500 희석)와 FITC-장착 이차 항체(1:500 희석)를 사용하였다. 광학현미경과 형광현미경을 사용하여 골격근 분화세포의 형태(이미지)와 발현된 NF4의 정도를 확인하고, 다음 실험에 사용하였다.

실시예 6. 단일 세포 칼슘 이미징 기법을 이용하여 휴지 상태의 골격근 분화세포의 세포질 칼슘 양 측정

NF4를 발현하는 골격근 분화세포(myotubes)에 칼슘과 결합하게 되면 칼슘이 결합되기 전과는 다른 파장의 형광을 내는 칼슘 형광 염색약(Ca^{2 +} dye)인 fura-2(5 ?)을 45분 동안 37℃에서 주입(incubation) 하였다. 이 때 골격근 분화세포는 이미징 용액(125 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM KH₂PO₄, 2 mM CaCl₂, 25 mM HEPES, 6 mM 글루코스, 1.2 mM MgSO₄, 0.05% BSA(fraction V), pH 7.4.)이 처리된 상태였다. 75-watt Xenon lamp(FSM150Xe, Bentham Instruments, Ltd)와 12-bit CCD 카메라(DVC-340M-OO-CL, Digital Video Camera Company)가 장착된 형광 현미경(Nikon x40 oil-immersion objective, NA 1.30, ECLIPSE Ti, Nikon)을 사용하여, 휴지 상태에서 세포질(cytosol)의 칼슘 농도를 측정하였다. 형광현미경에서 컴퓨터로 전송된 데이터는 High-Speed InCyt Im2 image acquisition and analysis software(v5.29, Intracellular Imaging Inc)를 이용하여 분석 되었다. Ca^{2 +}-fura-2 에 대한 해리상수(dissociation constant)로 225 nM 를 사용하여, 칼슘 농도를 계산 하였다.

실시예 7. 데이터 분석

공동면역침전법과 면역탁본법을 이용한 실험 결과는 세 번의 결과를 종합한 평균값으로 나타내었고, 대표 영상을 도면에 나타내었다. 표준보정된(normalized) TRPC1 밴드의 강도는 대조군에서 얻어진 수치를 1로 하고 그에 대한 상대적 변화를 표현하는 표준화비율(normalized ratio) 방식을 사용하여 ±S.E.로 표현하였다. 휴지상태에서 세포질의 칼슘 양 측정을 위해서 52개의 벡터대조군 골격근 분화세포와 80개의 NF4를 발현하는 골격근 분화세포가 분석에 사용하였다. 유의차(significant differences)는 paired t-test(GraphPad InStat, v2.04)를 이용하여 수행하였고, P<0.05 일 경우에 별표로 표시하였음. 그래프 작성은 Origin v7 프로그램 사용하였다.

실험결과

1. TRPC3 의 N-말단에 위치한 안키린 반복( AR ; ankyrin repeat ) 부위가 TRPC3 와 TRPC1 간의 이형복합체 형성( heteromerization )을 매개한다.

각종 세포에서, TRPC3가 TRPC1과 함께 이형복합체(heteromer)를 형성하여 칼슘 이동 통로로써 역할을 한다는 보고는 많았으나, 여기에 TRPC3의 어느 부위가 정확히 관여하는지에 대해서는 보고 되지 않았다. 본 발명에서는 TRPC3와 TRPC1 간에 이형복합체 형성을 이루는 과정에서 TRPC3의 어떤 부위가 이형복합체 형성에 관여하는지를 확인하기 위하여, 도 1 및 도 2에 나타낸 것과 같은 TRPC3의 단편들(NF1, NF2, NF3, NF4, NF5)을, 각각 GST와 융합시켜 정제하였다(GST-NF1, GST-NF2, GST-NF3, GST-NF4, 및 GST-NF5 로 명명; 도 3, 도 4, 도 6). 또한, 토끼 골격근으로부터 TRPC1을 포함하는 트라이아드 샘플을 얻고, 상기 트라이아드 샘플을 각각 GST-TRPC3 단편들(GST-NF1, GST-NF2, GST-NF3)과 GST 풀-다운 한 후, 면역탁본법으로 TRPC1과 GST-TRPC3 단편들과의 결합을 확인한 결과, NF1, NF2, NF3 중에서 NF2만이 TRPC1과 결합하는 것을 확인하였다(도 5).

따라서, 본 발명에서는 TRPC3의 N-말단에 위치한 AR 부위(AR region, 38-188 번째 아미노산)가 TRPC3와 TRPC1 간의 이형복합체 형성(heteromerization)을 매개함을 발견하였다. 종래 AR 부위가 TRPC3의 기능(function)에 관여한다는 것은 보고되어 있었으나, TRPC3가 기능을 가진 이온 통로로 형성(formation)되는 과정 자체에 AR 부위가 관여한다는 것은 본 발명에서 최초로 알아낸 것이다.

2. TRPC3 의 N-말단 끝부위가 안키린반복 부위에 의해 매개되는 TRPC3 와 TRPC1 간의 이형복합체 형성을 저해한다.

다음으로, NF4의 부재(NF2) 또는 존재 하(NF2+NF4)에서, TRPC1을 포함한 트라이아드 샘플을 GST-NF2와 GST 풀-다운시켜 면역탁본법으로 TRPC1과 GST-NF2와의 결합을 확인한 결과, NF4의 존재 하에서는 NF2가 TRPC1과 결합하지 않는 것을 확인하였고, 나아가 NF4 부위를 포함하고 있는 NF5 단편 또한 TRPC1 과 결합하지 않는 것을 확인하였다(도 7).

따라서, 본 발명에서는 TRPC3의 N-말단의 끝부위(1부터 37번째 아미노산; NF4에 해당)에 의하여 AR 부위에 의해 매개되는 TRPC3 와 TRPC1 간의 이형복합체 형성이 저해된다는 것을 발견하였다. 결과적으로, TRPC3의 N-말단에는 TRPC3와 TRPC1 간의 이형복합체 형성을 매개 또는 방해하는 부위가 각각 존재한다는 것이 본 발명에서 밝혀졌다.

3. TRPC3 의 N-말단 끝부위는 안키린반복 부위에 의해 매개되는 TRPC3 와 TRPC1 간의 이형복합체 형성을 저해한다(세포에서 재확인).

본질적으로 원래(bona-fide expression system) TRPC3와 TRPC1을 발현하는 골격근 분화세포에서 TRPC3에 대한 항체를 이용한 공동면역침전을 통하여 전장(full-length)의 TRPC3와 TRPC1이 결합(이형복합체를 형성)한다는 것을 재확인하였고, 상기 골격근 분화세포에 GFP-NF4를 감염시켜 NF4를 발현시킨 후 TRPC3 항체를 이용하여 공동면역침전 시킨 경우에는 TRPC3와 TRPC1 간의 이형복합체 형성이 정상 상태에 비해서 현저히 낮아짐을 확인할 수 있었다(0.67±0.05 vs. 1.00±0.08; 도 8 및 도 9). 즉, 정상 상태에서 전장의 TRPC3와 TRPC1 간의 이형복합체 형성이 NF4에 의하여 저해된다는 것을 세포 수준에서 다시 한 번 확인되었다.

4. TRPC3 의 N-말단 끝부위가 골격근 분화세포에서 휴지상태의 세포질 칼슘 양을 감소시킨다.

골격근 세포질의 칼슘은 골격근의 주된 작용인 수축과 이완 과정을 매개하는 핵심적 세포 내 이차전달 물질(second messenger)이다. 즉, 세포질의 칼슘 농도 변화는 곧 골격근의 수축과 이완에 직접적으로 영향을 준다. 이에, 본 발명자들은 단일세포 칼슘 이미징 기법을 이용하여, NF4를 발현하는 골격근 분화세포의 휴지 상태(resting state)의 세포질(cytosol)에서 칼슘 양을 측정해 보았다. 그 결과, NF4를 발현하는 골격근 분화세포의 세포질에서 상대적으로 칼슝의 양이 낮다는 것을 확인할 수 있었다(대략 30% 이상 감소, 64.6±8.2 vs. 84.0±9.9; 도 11). 이와 같이 휴지 상태에서 세포질의 칼슘 농도에 이상이 발생하였다는 것은, 골격근의 수축과 이완을 발생시키기 위하여 칼슘 농도가 변화하는 과정에 이상이 발생하여, 비정상적인(abnormal) 수축과 이완이 일어남을 의미한다. 그리고, 이러한 세포질의 칼슘 농도 이상이, 기존에 세포질의 칼슘 농도 등에 영향을 미치는 것으로 알려진 Orai1 칼슘 채널이나 이를 조절하는 것으로 알려진 STIM1 단백질, 또는 TRPC1이나 TRPC3 의 발현 양의 변화에 기인된 단순 변화가 아님을 면역탁본법을 통하여 확인하였다 (도 10).

<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for preventing or treating calcium ion-related musle disease using materials inhibiting heteromerization between TRPC3 and TRPC1 <130> DPP20140806KR <160> 16 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRPC3 fragment (1~37th amino acid sequence) <400> 1 Met Glu Gly Ser Pro Ser Leu Arg Arg Met Thr Val Met Arg Glu Lys 1 5 10 15 Gly Arg Arg Gln Ala Val Arg Gly Pro Ala Phe Met Phe Asn Asp Arg 20 25 30 Gly Thr Ser Leu Thr 35 <210> 2 <211> 151 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TRPC3 fragment (38~188th amino acid sequence) <400> 2 Ala Glu Glu Glu Arg Phe Leu Asp Ala Ala Glu Tyr Gly Asn Ile Pro 1 5 10 15 Val Val Arg Lys Met Leu Glu Glu Ser Lys Thr Leu Asn Val Asn Cys 20 25 30 Val Asp Tyr Met Gly Gln Asn Ala Leu Gln Leu Ala Val Gly Asn Glu 35 40 45 His Leu Glu Val Thr Glu Leu Leu Leu Lys Lys Glu Asn Leu Ala Arg 50 55 60 Ile Gly Asp Ala Leu Leu Leu Ala Ile Ser Lys Gly Tyr Val Arg Ile 65 70 75 80 Val Glu Ala Ile Leu Asn His Pro Gly Phe Ala Ala Ser Lys Arg Leu 85 90 95 Thr Leu Ser Pro Cys Glu Gln Glu Leu Gln Asp Asp Asp Phe Tyr Ala 100 105 110 Tyr Asp Glu Asp Gly Thr Arg Phe Ser Pro Asp Ile Thr Pro Ile Ile 115 120 125 Leu Ala Ala His Cys Gln Lys Tyr Glu Val Val His Met Leu Leu Met 130 135 140 Lys Gly Ala Arg Ile Glu Arg 145 150 <210> 3 <211> 848 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(848) <223> full amino acid sequence of TRPC3 <400> 3 Met Glu Gly Ser Pro Ser Leu Arg Arg Met Thr Val Met Arg Glu Lys 1 5 10 15 Gly Arg Arg Gln Ala Val Arg Gly Pro Ala Phe Met Phe Asn Asp Arg 20 25 30 Gly Thr Ser Leu Thr Ala Glu Glu Glu Arg Phe Leu Asp Ala Ala Glu 35 40 45 Tyr Gly Asn Ile Pro Val Val Arg Lys Met Leu Glu Glu Ser Lys Thr 50 55 60 Leu Asn Val Asn Cys Val Asp Tyr Met Gly Gln Asn Ala Leu Gln Leu 65 70 75 80 Ala Val Gly Asn Glu His Leu Glu Val Thr Glu Leu Leu Leu Lys Lys 85 90 95 Glu Asn Leu Ala Arg Ile Gly Asp Ala Leu Leu Leu Ala Ile Ser Lys 100 105 110 Gly Tyr Val Arg Ile Val Glu Ala Ile Leu Asn His Pro Gly Phe Ala 115 120 125 Ala Ser Lys Arg Leu Thr Leu Ser Pro Cys Glu Gln Glu Leu Gln Asp 130 135 140 Asp Asp Phe Tyr Ala Tyr Asp Glu Asp Gly Thr Arg Phe Ser Pro Asp 145 150 155 160 Ile Thr Pro Ile Ile Leu Ala Ala His Cys Gln Lys Tyr Glu Val Val 165 170 175 His Met Leu Leu Met Lys Gly Ala Arg Ile Glu Arg Pro His Asp Tyr 180 185 190 Phe Cys Lys Cys Gly Asp Cys Met Glu Lys Gln Arg His Asp Ser Phe 195 200 205 Ser His Ser Arg Ser Arg Ile Asn Ala Tyr Lys Gly Leu Ala Ser Pro 210 215 220 Ala Tyr Leu Ser Leu Ser Ser Glu Asp Pro Val Leu Thr Ala Leu Glu 225 230 235 240 Leu Ser Asn Glu Leu Ala Lys Leu Ala Asn Ile Glu Lys Glu Phe Lys 245 250 255 Asn Asp Tyr Arg Lys Leu Ser Met Gln Cys Lys Asp Phe Val Val Gly 260 265 270 Val Leu Asp Leu Cys Arg Asp Ser Glu Glu Val Glu Ala Ile Leu Asn 275 280 285 Gly Asp Leu Glu Ser Ala Glu Pro Leu Glu Val His Arg His Lys Ala 290 295 300 Ser Leu Ser Arg Val Lys Leu Ala Ile Lys Tyr Glu Val Lys Lys Phe 305 310 315 320 Val Ala His Pro Asn Cys Gln Gln Gln Leu Leu Thr Ile Trp Tyr Glu 325 330 335 Asn Leu Ser Gly Leu Arg Glu Gln Thr Ile Ala Ile Lys Cys Leu Val 340 345 350 Val Leu Val Val Ala Leu Gly Leu Pro Phe Leu Ala Ile Gly Tyr Trp 355 360 365 Ile Ala Pro Cys Ser Arg Leu Gly Lys Ile Leu Arg Ser Pro Phe Met 370 375 380 Lys Phe Val Ala His Ala Ala Ser Phe Ile Ile Phe Leu Gly Leu Leu 385 390 395 400 Val Phe Asn Ala Ser Asp Arg Phe Glu Gly Ile Thr Thr Leu Pro Asn 405 410 415 Ile Thr Val Thr Asp Tyr Pro Lys Gln Ile Phe Arg Val Lys Thr Thr 420 425 430 Gln Phe Thr Trp Thr Glu Met Leu Ile Met Val Trp Val Leu Gly Met 435 440 445 Met Trp Ser Glu Cys Lys Glu Leu Trp Leu Glu Gly Pro Arg Glu Tyr 450 455 460 Ile Leu Gln Leu Trp Asn Val Leu Asp Phe Gly Met Leu Ser Ile Phe 465 470 475 480 Ile Ala Ala Phe Thr Ala Arg Phe Leu Ala Phe Leu Gln Ala Thr Lys 485 490 495 Ala Gln Gln Tyr Val Asp Ser Tyr Val Gln Glu Ser Asp Leu Ser Glu 500 505 510 Val Thr Leu Pro Pro Glu Ile Gln Tyr Phe Thr Tyr Ala Arg Asp Lys 515 520 525 Trp Leu Pro Ser Asp Pro Gln Ile Ile Ser Glu Gly Leu Tyr Ala Ile 530 535 540 Ala Val Val Leu Ser Phe Ser Arg Ile Ala Tyr Ile Leu Pro Ala Asn 545 550 555 560 Glu Ser Phe Gly Pro Leu Gln Ile Ser Leu Gly Arg Thr Val Lys Asp 565 570 575 Ile Phe Lys Phe Met Val Leu Phe Ile Met Val Phe Phe Ala Phe Met 580 585 590 Ile Gly Met Phe Ile Leu Tyr Ser Tyr Tyr Leu Gly Ala Lys Val Asn 595 600 605 Ala Ala Phe Thr Thr Val Glu Glu Ser Phe Lys Thr Leu Phe Trp Ser 610 615 620 Ile Phe Gly Leu Ser Glu Val Thr Ser Val Val Leu Lys Tyr Asp His 625 630 635 640 Lys Phe Ile Glu Asn Ile Gly Tyr Val Leu Tyr Gly Ile Tyr Asn Val 645 650 655 Thr Met Val Val Val Leu Leu Asn Met Leu Ile Ala Met Ile Asn Ser 660 665 670 Ser Tyr Gln Glu Ile Glu Asp Asp Ser Asp Val Glu Trp Lys Phe Ala 675 680 685 Arg Ser Lys Leu Trp Leu Ser Tyr Phe Asp Asp Gly Lys Thr Leu Pro 690 695 700 Pro Pro Phe Ser Leu Val Pro Ser Pro Lys Ser Phe Val Tyr Phe Ile 705 710 715 720 Met Arg Ile Val Asn Phe Pro Lys Cys Arg Arg Arg Arg Leu Gln Lys 725 730 735 Asp Ile Glu Met Gly Met Gly Asn Ser Lys Ser Arg Leu Asn Leu Phe 740 745 750 Thr Gln Ser Asn Ser Arg Val Phe Glu Ser His Ser Phe Asn Ser Ile 755 760 765 Leu Asn Gln Pro Thr Arg Tyr Gln Gln Ile Met Lys Arg Leu Ile Lys 770 775 780 Arg Tyr Val Leu Lys Ala Gln Val Asp Lys Glu Asn Asp Glu Val Asn 785 790 795 800 Glu Gly Glu Leu Lys Glu Ile Lys Gln Asp Ile Ser Ser Leu Arg Tyr 805 810 815 Glu Leu Leu Glu Asp Lys Ser Gln Ala Thr Glu Glu Leu Ala Ile Leu 820 825 830 Ile His Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asn Pro Ser Met Leu Arg Cys Glu 835 840 845 <210> 4 <211> 759 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(759) <223> full amino acid sequence of TRPC1 <400> 4 Met Met Ala Ala Leu Tyr Pro Ser Thr Asp Leu Ser Gly Ala Ser Ser 1 5 10 15 Ser Ser Leu Pro Ser Ser Pro Ser Ser Ser Ser Pro Asn Glu Val Met 20 25 30 Ala Leu Lys Asp Val Arg Glu Val Lys Glu Glu Asn Thr Leu Asn Glu 35 40 45 Lys Leu Phe Leu Leu Ala Cys Asp Lys Gly Asp Tyr Tyr Met Val Lys 50 55 60 Lys Ile Leu Glu Glu Asn Ser Ser Gly Asp Leu Asn Ile Asn Cys Val 65 70 75 80 Asp Val Leu Gly Arg Asn Ala Val Thr Ile Thr Ile Glu Asn Glu Asn 85 90 95 Leu Asp Ile Leu Gln Leu Leu Leu Asp Tyr Gly Cys Gln Lys Leu Met 100 105 110 Glu Arg Ile Gln Asn Pro Glu Tyr Ser Thr Thr Met Asp Val Ala Pro 115 120 125 Val Ile Leu Ala Ala His Arg Asn Asn Tyr Glu Ile Leu Thr Met Leu 130 135 140 Leu Lys Gln Asp Val Ser Leu Pro Lys Pro His Ala Val Gly Cys Glu 145 150 155 160 Cys Thr Leu Cys Ser Ala Lys Asn Lys Lys Asp Ser Leu Arg His Ser 165 170 175 Arg Phe Arg Leu Asp Ile Tyr Arg Cys Leu Ala Ser Pro Ala Leu Ile 180 185 190 Met Leu Thr Glu Glu Asp Pro Ile Leu Arg Ala Phe Glu Leu Ser Ala 195 200 205 Asp Leu Lys Glu Leu Ser Leu Val Glu Val Glu Phe Arg Asn Asp Tyr 210 215 220 Glu Glu Leu Ala Arg Gln Cys Lys Met Phe Ala Lys Asp Leu Leu Ala 225 230 235 240 Gln Ala Arg Asn Ser Arg Glu Leu Glu Val Ile Leu Asn His Thr Ser 245 250 255 Ser Asp Glu Pro Leu Asp Lys Arg Gly Leu Leu Glu Glu Arg Met Asn 260 265 270 Leu Ser Arg Leu Lys Leu Ala Ile Lys Tyr Asn Gln Lys Glu Phe Val 275 280 285 Ser Gln Ser Asn Cys Gln Gln Phe Leu Asn Thr Val Trp Phe Gly Gln 290 295 300 Met Ser Gly Tyr Arg Arg Lys Pro Thr Cys Lys Lys Ile Met Thr Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Gly Ile Phe Trp Pro Val Leu Ser Leu Cys Tyr Leu Ile 325 330 335 Ala Pro Lys Ser Gln Phe Gly Arg Ile Ile His Thr Pro Phe Met Lys 340 345 350 Phe Ile Ile His Gly Ala Ser Tyr Phe Thr Phe Leu Leu Leu Leu Asn 355 360 365 Leu Tyr Ser Leu Val Tyr Asn Glu Asp Lys Lys Asn Thr Met Gly Pro 370 375 380 Ala Leu Glu Arg Ile Asp Tyr Leu Leu Ile Leu Trp Ile Ile Gly Met 385 390 395 400 Ile Trp Ser Asp Ile Lys Arg Leu Trp Tyr Glu Gly Leu Glu Asp Phe 405 410 415 Leu Glu Glu Ser Arg Asn Gln Leu Ser Phe Val Met Asn Ser Leu Tyr 420 425 430 Leu Ala Thr Phe Ala Leu Lys Val Val Ala His Asn Lys Phe His Asp 435 440 445 Phe Ala Asp Arg Lys Asp Trp Asp Ala Phe His Pro Thr Leu Val Ala 450 455 460 Glu Gly Leu Phe Ala Phe Ala Asn Val Leu Ser Tyr Leu Arg Leu Phe 465 470 475 480 Phe Met Tyr Thr Thr Ser Ser Ile Leu Gly Pro Leu Gln Ile Ser Met 485 490 495 Gly Gln Met Leu Gln Asp Phe Gly Lys Phe Leu Gly Met Phe Leu Leu 500 505 510 Val Leu Phe Ser Phe Thr Ile Gly Leu Thr Gln Leu Tyr Asp Lys Gly 515 520 525 Tyr Thr Ser Lys Glu Gln Lys Asp Cys Val Gly Ile Phe Cys Glu Gln 530 535 540 Gln Ser Asn Asp Thr Phe His Ser Phe Ile Gly Thr Cys Phe Ala Leu 545 550 555 560 Phe Trp Tyr Ile Phe Ser Leu Ala His Val Ala Ile Phe Val Thr Arg 565 570 575 Phe Ser Tyr Gly Glu Glu Leu Gln Ser Phe Val Gly Ala Val Ile Val 580 585 590 Gly Thr Tyr Asn Val Val Val Val Ile Val Leu Thr Lys Leu Leu Val 595 600 605 Ala Met Leu His Lys Ser Phe Gln Leu Ile Ala Asn His Glu Asp Lys 610 615 620 Glu Trp Lys Phe Ala Arg Ala Lys Leu Trp Leu Ser Tyr Phe Asp Asp 625 630 635 640 Lys Cys Thr Leu Pro Pro Pro Phe Asn Ile Ile Pro Ser Pro Lys Thr 645 650 655 Ile Cys Tyr Met Ile Ser Ser Leu Ser Lys Trp Ile Cys Ser His Thr 660 665 670 Ser Lys Gly Lys Val Lys Arg Gln Asn Ser Leu Lys Glu Trp Arg Asn 675 680 685 Leu Lys Gln Lys Arg Asp Glu Asn Tyr Gln Lys Val Met Cys Cys Leu 690 695 700 Val His Arg Tyr Leu Thr Ser Met Arg Gln Lys Met Gln Ser Thr Asp 705 710 715 720 Gln Ala Thr Val Glu Asn Leu Asn Glu Leu Arg Gln Asp Leu Ser Lys 725 730 735 Phe Arg Asn Glu Ile Arg Asp Leu Leu Gly Phe Arg Thr Ser Lys Tyr 740 745 750 Ala Met Phe Tyr Pro Arg Asn 755 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-NF1 forward primer <400> 5 cggaattcat ggagggaagc ccatccctga g 31 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-NF1 reverse primer <400> 6 cggtcgactc agcttcgcag aattttcccc agc 33 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-NF2 forward primer <400> 7 cggaattcat ggccgaggag gagcgcttcc 30 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-NF2 reverse primer <400> 8 cggtcgactc agcttcgcag aattttcccc agc 33 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-NF3 forward primer <400> 9 cggaattcat gccgcacgac tatttctgca ag 32 <210> 10 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-NF3 reverse primer <400> 10 cggtcgactc agcttcgcag aattttcccc agc 33 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-NF4 forward primer <400> 11 cggaattcat ggagggaagc ccatccctga g 31 <210> 12 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-NF4 reverse primer <400> 12 cggtcgactc aggtgaggct ggtgccgcgg tc 32 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-NF5 forward primer <400> 13 cggaattcat ggagggaagc ccatccctga g 31 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GST-NF5 reverse primer <400> 14 cggtcgactc accgctcgat cctggcaccc ttc 33 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP-NF4 forward primer <400> 15 gatctcgagc taccatggag ggaagcccat cc 32 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GFP-NF4 reverse primer <400> 16 cggtcgactc aggtgaggct ggtgccgcgg tc 32

Claims (4)

1. TRPC3(canonical-type transient receptor potential cation channel 3)와 TRPC1(canonical-type transient receptor potential cation channel 1) 간의 이형복합체 형성을 저해하는 물질로서,
   서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산;
   서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 또는 이를 코딩하는 핵산; 또는
   서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질 중 38부터 188번째 아미노산 부위에 특이적으로 결합하는 항체;를 포함하는,
   브로디 신드롬(Brody Syndrome), 뒤시엔느 근육위축병(Duchenne muscular dystrophy) 및 악성고열골격근병(Malignant hyperthermia)으로 이루어진 군에서 선택되는 칼슘 과잉과 관련된 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   
2. 삭제
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 코딩하는 핵산은 벡터에 포함된 것인 약학 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 항체는 단일클론항체, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, 약학 조성물.

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