JPH10165189A - ヒトｍａｄ蛋白質およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ＴＧＦ−βシグナル伝達蛋白質、それらのア
ンタゴニストおよびアゴニスト、ならびにそれらの使用
のための組成および方法の提供。 【解決手段】 配列番号：２に示すポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド；配列番号：２のアミノ酸を含
むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対し
て、少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチ
ド；遺伝コードの重複性によって配列番号：２の同じア
ミノ酸をコードするポリヌクレオチド；図１〜４のアミ
ノ酸１〜４２５を含むポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド；前記のポリヌクレオチドに相補的であるポ
リヌクレオチド；および前記のポリヌクレオチドの少な
くとも１５の隣接する塩基を含むポリヌクレオチド、よ
りなる群から選択されたポリヌクレオチドを含む単離ポ
リヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新たに同定された
ポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドによりコー
ドされるポリペプチド、かかるポリヌクレオチドおよび
ポリペプチドの使用、ならびにかかるポリヌクレオチド
およびポリペプチドの生産に関する。本発明のポリペプ
チドは、推定でヒトＭＡＤ相同物と同定されている。さ
らに詳しくは、本発明の一のポリペプチドが、推定で新
規なヒトＭＡＤ蛋白質と同定され、時々、以後「ＭＡＤ
ｒ３」と称する。本発明は、また、かかるポリペプチド
の働きの阻害または促進に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】細胞
成長および分化は、非常に様々な阻害、抑制および相互
依存因子およびホルモンによって、開始、増進、維持お
よび調節されるようである。細胞恒常性メカニズムの変
化および／または崩壊は、疾患に関する成長の根本的な
原因であるようである。成長係数因子は、シグナル変
換、細胞コミュニケーション、成長および発達、胚発
生、免疫反応、造血細胞生存および分化、炎症、組織修
復および改造、アテローム性動脈硬化症および癌を包含
する様々な病理学および生理学的プロセスに関係してい
る。サイトカイン／成長因子の形質転換成長因子β（Ｔ
ＧＦ−β）ファミリーは、細胞増殖、分化、認識および
死を調節し、発達の調節、組織再循環および修復に関係
する。該ファミリーに包含されるものは、ドロソフィラ
属（Drosophila）のデカペンタプレジック（ＤＰＰ）
［Sekelskyら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA,139：134
7-1358(1995)］、ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２、ＴＧＦ
β−３；および骨形態形成蛋白質、ＢＭＰ２／ＢＭＰ４
［Hoodlessら、Cell, 85：489-500(1996)；Graffら、Ce
ll, 85：479-487(1996)；Liuら、Nature, 381：620-623
(1996)；およびVhangら、Nature, 383：168-1782(199
6)］である。

【０００３】ＴＧＦ−βファミリーメンバーは、Ｉ型お
よびＩＩ型レセプターとして知られる２つの膜輸送型セ
リン／スレオニンキナーゼを同時に接触させることによ
って、シグナル伝達する。ある蛋白質は、ＴＧＦ−βフ
ァミリーのシグナルカスケード複合体を媒介する。それ
は、異なるＴＧＦ−βファミリーメンバーが別のＭＡＤ
イソ型を通してシグナル伝達し得ることを示唆した。Ｍ
ＡＤ（Mother againstDPP）蛋白質は、ドロソフィラ属
において、ＤＰＰのシグナル変換に必要であることが発
見された。他の種、例えば、ツメガエル属、マウス、お
よびヒトにおける他のＭＡＤ蛋白質は、ＢＭＰ２／ＢＭ
Ｐ４のシグナルを変換することが明らかとなった。幾つ
かの報告は、続いて起こるリガンド活性化、ＴＧＦ−β
Ｉ型レセプターがＭＡＤをリン酸化することを示唆す
る。［前記のHoodlessら、および前記のLiuら］。次
に、リン酸化されたＭＡＤは、核へトランスポーレーシ
ョンし、ＭＡＤイソ型サブタイプに特異的に選択された
初期中間遺伝子の遺伝子発現に影響する［J. Massague,
Cell, 85：947-950(June 28, 1993)］。

【０００４】従って、ＭＡＤイソ型の選択的アンタゴニ
ストは、ＴＧＦ−βまたはＢＭＰシグナル伝達の選択的
阻害が示唆されるところの多くの疾患において有益であ
ることが予想される。［例えば、Eppertら、Cell, 86：
843-552(Aug. 23, 1996)］。かかる疾患は、慢性腎不
全、瘢痕、結腸直腸癌、および心血管疾患を包含する
が、それらに限定するものではない。従って、当該分野
において、様々なＴＧＦ−βシグナル伝達蛋白質、それ
らのアンタゴニストおよびアゴニスト、ならびにそれら
の使用のための組成および方法が必要である。

【０００５】

【課題を解決するための手段】一の態様において、本発
明はポリペプチド、とりわけ、ヒト由来の新規なＭＡＤ
ポリペプチドとして同定されたポリペプチド、ならびに
生物学的活性があり、診断的または治療的に有用なそれ
らのフラグメント、変種、類似体および誘導体、該フラ
グメントの変種および誘導体、および前記の類似体を提
供する。一の具体例において、ポリペプチドはヒトＭＡ
Ｄｒ３である。別の具体例において、ポリペプチドはヒ
トＭＡＤｒ４である。これらのポリペプチドは、ＭＡＤ
ポリペプチド、例えば、既知のＭＡＤポリペプチドのア
ミノ酸配列またはヌクレオチド配列との相同性によって
同定された。なかでも本発明のこの態様の特に好ましい
具体例は、ＭＡＤｒ３およびＭＡＤｒ４のヒト遺伝子の
天然の対立遺伝子によってコードされるヒトＭＡＤｒ３
およびＭＡＤｒ４の変種である。本発明の別の態様にお
いて、非天然の合成、単離および／または組み換えＭＡ
Ｄｒ３またはＭＡＤｒ４ポリペプチド、フラグメント、
本発明のＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４の保存性アミノ酸
置換を有する共通フラグメントおよび／または配列を提
供する。これらのポリペプチドは、ＭＡＤｒ３およびＭ
ＡＤｒ４リガンドに結合することができ、または定量的
もしくは質的に、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４リガンド
結合を調節することもできる。別の態様において、本発
明は、様々なＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４またはそれら
のフラグメントを阻害する、または模造するために設計
した合成、単離または組み換えポリペプチドを提供す
る。

【０００６】本発明の別の態様において、ＭＡＤポリペ
プチド、特にヒトＭＡＤｒ３およびＭＡＤｒ４をコード
する単離核酸分子を提供する。かかる分子は、ポリヌク
レオチド、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ
およびそれらのフラグメント、ならびに類似体、および
生物学的活性があり診断的または治療的に有用なそれら
の変種、類似体および誘導体を包含する。本発明のこの
態様の特に好ましい具体例において、ポリヌクレオチド
は、図１〜４［配列番号：１および２］に示す配列にお
けるヒトＭＡＤｒ３をコードする領域を含む。本発明の
この態様の別の特に好ましい具体例において、ポリヌク
レオチドは、図５および図６［配列番号：３および４］
に示す配列におけるヒトＭＡＤｒ４の領域を含む。なか
でも本発明のこの態様の特に好ましい具体例は、ヒトＭ
ＡＤｒ３およびＭＡＤｒ４の天然の対立遺伝子変種であ
る。また本発明の別の態様において、プラスミドｐＨＳ
ＢＨＩ９１において含有されるヒトｃＤＮＡから発現で
きる成熟ポリペプチドをコードする単離核酸分子を提供
する。

【０００７】さらに別の態様において、本発明は、とり
わけ本発明の核酸配列、例えばヒトＭＡＤｒ３またはＭ
ＡＤｒ４配列とハイブリダイズするのに充分な長さの核
酸分子を含む核酸プローブを提供する。別の態様におい
て、本発明は、前記したポリペプチド、ポリペプチドフ
ラグメント、変種および誘導体、該変種および誘導体の
フラグメント、および前記の類似体を製造する方法を提
供する。好ましい具体例において、本発明は、前記のＭ
ＡＤｒ３およびＭＡＤｒ４ポリペプチドを、宿主におい
てヒトＭＡＤポリペプチドの発現条件下で本発明のポリ
ヌクレオチドをコードする核酸配列ゐ含有する（すなわ
ち、発現可能にその中に取り込まれた）組み換え原核お
よび／または真核宿主細胞の培養、次いで、発現したポ
リペプチドの回収を含む組み換え技術によって製造する
方法を提供する。さらに別の態様において、本発明は、
生産物、組成、前記のポリペプチドおよびポリヌクレオ
チドを、とりわけ研究、生物学的、臨床的および治療学
的目的に利用するプロセスおよび方法を提供する。ＭＡ
Ｄポリペプチド、特にヒトＭＡＤｒ３およびＭＡＤｒ４
ポリペプチドは、創傷治癒を促進する、外傷またあＡＩ
ＤＳ精神異常の後に正常な神経学的機能を回復させる、
ある細胞を標的とする、腎臓および肝臓障害を治療す
る、瘢痕を防ぐ；潰瘍および角膜切断治療、および胃癌
を治療するための処理を包含するが、それに限定されな
い治療学的目的に利用することができる。

【０００８】また、リガンドに結合するかまたはリガン
ド結合を調節することによって、ＭＡＤｒ３またはＭＡ
Ｄｒ４機能のモジュレーター（調節者）として有用であ
り得る組成および方法を提供し、それらの予想される生
物学的特性ゆえに、診断学的、治療学的および／または
研究的目的に利用できる。別の態様において、本発明
は、ＭＡＤポリペプチドのリン酸化を阻害または促進す
る、他の蛋白質との該ペプチドの相互作用を阻害または
促進する、該ポリペプチドの核への輸送を阻害または促
進する、および該ポリペプチドの核酸配列との相互作用
を阻害または促進する化学的または天然の化合物あるい
はそれらのリガンドをスクリーニングするための、これ
らのポリペプチドおよび蛋白質の利用方法を提供する。
本発明のこの態様のある好ましい具体例に従って、生産
物、組成および方法、とりわけ、なかでもＭＡＤｒ３ま
たはＭＡＤｒ４ポリペプチドあるいはＭＡＤｒ３または
ＭＡＤｒ４コーディングｍＲＮＡを決定することによっ
て細胞におけるＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４発現を評価
するための方法；本明細書中で開示されるようなＭＡＤ
ｒ３あるいはＭＡＤｒ４ポリペプチドまたはポリヌクレ
オチドに対して細胞を暴露することによって、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、前
記のものを包含するが限定はしない機能不全または疾患
を治療するための方法；ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４遺
伝子における遺伝学的変異および異常、例えば欠損をア
ッセイするための方法；およびＭＡＤｒ３あるいはＭＡ
Ｄｒ４ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを生物に投
与して、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４機能を増大させ
る、あるいはＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４機能不全を治
療する方法を提供する。

【０００９】また、本発明の別の態様において、ＭＡＤ
ｒ３またはＭＡＤｒ４の低発現に関連する条件の処理の
ための本発明のポリペプチドを促進するために、かかる
活性化化合物を使用するプロセスを提供する。さらに本
発明のさらなる態様において、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤ
ｒ４の超発現に関連する条件を処理するためのかかる阻
害化合物を使用するプロセスを提供する。本発明の別の
態様において、ヒト化抗体、抗−抗体、モノクローナル
抗体およびポリクローナル抗体を包含するＭＡＤポリペ
プチドに対する抗体を提供する。この点における特に好
ましい具体例において、抗体は、ヒトＭＡＤｒ３または
ＭＡＤｒ４に対して高選択的である。

【００１０】また、さらなる態様において、本発明は、
本発明のポリペプチドに対するアゴニストを提供する。
本発明のポリペプチドに対するアゴニストは、癌、良性
の前立腺肥大症の治療および創傷治癒に利用できる。な
かでも好ましいアゴニストは、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤ
ｒ４結合分子あるいはレセプター分子に結合する模造の
ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４分子、およびＭＡＤｒ３ま
たはＭＡＤｒ４誘導追う等を顕在化あるいは増加させる
分子である。また、なかでも好ましいアゴニストは、Ｍ
ＡＤｒ３若しくはＭＡＤｒ４またはＭＡＤｒ３もしくは
ＭＡＤｒ４ポリペプチドと、あるいはＭＡＤｒ３または
ＭＡＤｒ４活性の他のモジュレーターと相互反応し、そ
れによって、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４の効果、ある
いはＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４の１以上の効果を強化
または増大させる分子である。本発明の別の態様におい
て、ＭＡＤのリン酸化、輸送、他の下流蛋白質の修飾、
およびシス要素との相互作用に対する標的となり得るＭ
ＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４アンタゴニストを提供する。
ＭＡＤｒ３活性のア亜、慢性腎不全、急性腎不全、創傷
治癒および瘢痕形成の防止、関節炎、骨粗鬆症、アテロ
ーム性動脈硬化症、多発性嚢胞腎疾患およびうっ血性心
不全の治療に利用できる。なかでも好ましいアンタゴニ
ストは、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４レセプターあるい
は結合分子と結合するが、１つのＭＡＤｒ３またはＭＡ
Ｄｒ４誘導応答あるいは１以上のＭＡＤｒ３またはＭＡ
Ｄｒ４誘導応答を顕在化しないために、ＭＡＤｒ３また
はＭＡＤｒ４を模倣するものである。また、なかでも好
ましいアンタゴニストは、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４
の１つの効果あるいはＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４の１
以上の効果を阻害するために、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤ
ｒ４と結合するかあるいは相互反応する分子、あるいは
ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４の発現を妨害する分子であ
る。また、なかでも好ましいアンタゴニストは、ＭＡＤ
ｒ３またはＭＡＤｒ４をリン酸化するキナーゼと結合
し、それによってＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４のリン酸
化を妨害する分子である。

【００１１】本発明のさらなる態様において、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏでの細胞、ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞およびｉｎ
ｖｉｖｏでの細胞に、または多細胞生物に投与するた
めの、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４ポリヌクレオチドあ
るいはＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４ポリペプチドを含む
組成を提供する。本発明のこの態様のある特に好ましい
具体例において、組成には、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ
４ポリペプチドを疾患の治療のための宿主生物において
発現するためのＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４ポリヌクレ
オチドが含まれる。この点において、特に好ましくは、
ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４の異常な内因性活性に関連
した機能不全の治療の為の、ヒト患者における発現であ
る。さらに別の態様において、本発明は、本発明のポリ
ペプチドの超発現およびかかるポリペプチドをコードす
る核酸配列における取る全変異に関連する疾患を検出す
るための診断学的アッセイを提供する。例えば、ＭＡＤ
ｒ３の配列は、骨疾患、腎不全、心血管疾患および結
腸、胸部、脳、腎臓および肝臓の癌の検出に有益であろ
う超発現の検出のための診断に使用することができる。
本発明の別の態様は、癌の指標として、これらのＭＡＤ
ポリペプチドの突然変異の検出において、これらの配列
を利用するプロセスを提供する。本発明のさらなる態様
は、化学的研究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの
製造に関連する目的で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、かかるポ
リペプチド、またはかかるポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドを利用するプロセスを提供する。

【００１２】本発明の他の目的、特徴、利益および態様
は、以下の説明から、当業者に明らかになるであろう。
しかしながら、本発明の好ましい具体例を示すが、以下
の説明および実施例が説明方法のみによって得られるこ
とを理解すべきである。開示した発明の制振および範囲
内での様々な変更および修飾は、以下の説明を読み、本
開示の他の部分を読むことから、当業者にとって、容易
に明らかになるであろう。

【００１３】

【発明の実施の形態】

定義 本明細書中、特に実施例で頻繁に使用される特定の用語
の理解を容易にするために、以下の実施となる説明を供
給する。説明は便利なものとして供給されるものであ
り、本発明を制限するものではない。「遺伝子」なる語
は、ポリペプチド鎖の産生に関連するＤＮＡセグメント
を意味し、それは、個々のコーディングセグメント（エ
キソン）間の挿入配列（イントロン）と同様に前記およ
び下記のコーディング領域（リーダーおよびトレーラ
ー）を包含する。ＤＮＡの「消化」は、酵素、例えば、
限定はしないが、ＤＮＡにおけるある特定のはいれ得の
みに作用する制限酵素でのＤＮＡの触媒的開裂を言及す
る。本明細書中で引用する様々な制限酵素は、商業的に
入手でき、使用にあたって反応条件、補因子およびその
他の要求は、当業者にとって既知で、慣例である。

【００１４】分析目的のために、典型的には、プラスミ
ドまたはＤＮＡフラグメントの１マイクログラムを約２
０マイクロリットルの反応緩衝液中、約２ユニットの酵
素で消化する。プラスミドこうちくのためのＤＮＡフラ
グメントを単離する目的の場合、典型的には、５〜５０
マイクログラムのＤＮＡを比較的大量中、２０〜２５０
ユニットの酵素で消化する。特に制限酵素の場合、適当
な緩衝液および基質の量は、下記に示すような標準的な
研究室マニュアルに記載されており、それらは商業者に
よって明記されている。通常、３７℃にて約１時間イン
キュベーションするが、標準的手順、商業者の説明書お
よび反応の性質に従って、条件を変更してもよい。消化
後、反応を分析し、フラグメントをアガロースまたはポ
リアクリルアミドゲル電気泳動によって精製し、当業者
にとって慣例の既知方法を用いて、所望のフラグメント
を単離することができる。「遺伝学的要素」は、一般
に、ポリペプチドをコードする領域、または複製、転写
もしくは翻訳もしくは宿主細胞におけるポリペプチドの
発現に重要な他のプロセスを調節する領域からなるポリ
ヌクレオチド、あるいはポリペプチドをコードする領域
とそれに結合できる発現を調節する領域の両方からなる
ポリヌクレオチドを意味する。

【００１５】遺伝学的要素は、生理学的に宿主細胞ゲノ
ムに依存しない分子のようなエピソームの要素として複
製するベクター内に含まれ得る。それらは、挿入された
ＤＮＡの増幅中に真核細胞におけるメトトレキセート選
択によって生じるようなミニ染色体内に含まれ得る。ま
た、遺伝学的要素は、天然ではなくむしろ、以下の操
作、なかでも例えば単離、クローニングおよび精製ＤＮ
Ａの形で、またはベクターにおける宿主細胞への導入な
どにおいて、宿主細胞ゲノム内に含まれ得る。「単離」
とは、「人工的」に天然の状態から変化された、すなわ
ち、もし自然界で起こるならば、その元の環境から変化
または除去されること、あるいはその両方が行われたこ
とを意味する。例えば、天然のポリヌクレオチドまたは
天然の状態で生存動物に存在するポリペプチドは、「単
離」されていないが、同様なポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドが天然の状態でその共存物質から分離された
場合、本明細書で用いる用語「単離」がなされている。
ポリヌクレオチドについては、用語「単離」は、天然の
染色体および細胞から分離することを意味する。

【００１６】単離の一部または以下の単離として、かか
るポリヌクレオチドは、例えば、突然変異精製の場合、
融合蛋白質を形成するために、および宿主における増殖
または発現のために、ＤＮＡのようなたのポリヌクレオ
チドと結合することができる。単離ポリヌクレオチド
を、単一またはベクターのような他のポリヌクレオチド
と結合させて、培養体または全生物体において、宿主細
胞へ導入することができる。培養体または全生物体にお
いて宿主細胞へ導入されたかかるＤＮＡは、それらの天
然型または自然環境に存在しないので、まだ単離される
であろう。同様に、該ポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチド
の、化学的または酵素的反応のための細胞、組成または
溶液への導入のための培養液、調合、溶液のような、例
えば天然の組成ではない組成において起こり、そこで
は、本明細書中で使用されるような該用語の意味内で、
単離ポリヌクレオチドおよびポリペプチドが残存する。
「連結反応」は、そのほとんどがしばしば二本鎖ＤＮＡ
である２またそれ以上のポリヌクレオチド間にホスホジ
エステル結合を形成するプロセスを示す。連結反応技術
は、当該分野でよく知られており、連結反応のためのプ
ロトコールは、標準的な研究室マニュアルおよび参考文
献、例えば本明細書中に「Sambrookら」として下記する
Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manua
l, 第２版；Cold Spring Harbor Laboratory Press, Co
ld Spring Harbor, New York, 1989において記述されて
いる。

【００１７】「オリゴヌクレオチド」は、比較的短いポ
リヌクレオチドを示す。しばしば、この用語は、一本鎖
デオキシリボ核酸を示すが、さらに、特に一本鎖または
二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド
および二本鎖ＤＮＡを示すことができる。一本鎖ＤＮＡ
プローブオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチ
ドは、しばしば、自動オリゴヌクレオチドシンセサイザ
ー装置のような化学的方法によって合成される。しかし
ながら、オリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組み
換えＤＮＡ仲介技術を包含する様々な他の方法によっ
て、および細胞および生物におけるＤＮＡの発現によっ
て作製することができる。始めに、化学的合成ＤＮＡ
は、典型的に、５’リン酸なしで得られる。そのような
オリゴヌクレオチドの５’末端は、伝統的に組み換えＤ
ＮＡ分子形成に使用されるＤＮＡリガーゼを使用する連
結反応によるホスホジエステル結合形成のための基質で
はない。かかるオリゴヌクレオチドの連結反応が所望さ
れる場所で、リン酸を標準技術、例えばキナーゼおよび
ＡＴＰを使うような技術によって加えることができる。
化学的合成オリゴヌクレオチドの３’末端は、一般に、
遊離ヒドロキシル基を有し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのよう
なリガーゼ存在下で、容易に、たのポリヌクレオチド、
例えば別のオリゴヌクレオチドの５’リン酸とホスホジ
エステル結合を形成するであろう。周知のように、この
反応は、連結反応の前に、他のポリヌクレオオチドの
５’リン酸を除去することによって、所望の場所で選択
的に阻害することができる。

【００１８】「プラスミド」は、安定して受け継ぐ遺伝
的要素であり、宿主細胞の染色体の一部ではない。それ
らは、ＤＮＡまたはＲＮＡからなり、直鎖状または環状
えだり得る。プラスミドは、細胞複製の間のそれらの複
製および安定な遺伝を確保する分子をコードしており、
多数の医学的、農業的および環境的に重要な産物をコー
ドするかもしれない。例えば、それらは、病原性最近の
毒性をおおいに増加させる毒素をコードする。また、そ
れらは、抗生物質に対する耐性を与える遺伝子をコード
することができる。プラスミドは、分子生物学におい
て、組み換え遺伝子をクローン化および発現するために
使用されるベクターとして広範囲に使用される。プラス
ミドは、本明細書において、一般的に、当業者にとって
よく知られている標準的に挙げられる慣例に従って、小
文字のｐを前におき、および／または次に頭文字および
／または数字をおいて表す。本明細書中で開示される出
発プラスミドは、商業的に入手可能な、公的に入手可能
であるか、または入手可能なプラスミドから、よく知ら
れた慣例の追うよう、発表された手順によって構築する
ことができる。本発明に従って使用できる多くのプラス
ミドならびに他のクローニングおよび発現ベクターは、
よく知られており、当業者にとって容易に入手できる。
さらに、当業者は、容易に、本発明における使用に適当
な、かなり多くの他のプラスミドを構築することができ
る。本発明において、他のベクターと同様に、かかるプ
ラスミドの特徴、構築および使用は、本発明の開示から
当業者に容易に明らかとなるであろう。

【００１９】「ポリヌクレオチド」は、一般に、修飾さ
れていないＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修飾されたＲＮ
ＡまたはＤＮＡであり得る任意のポリヌクレオチドまた
はポリデオキシリボヌクレオチドを示す。従って、例え
ば、本明細書中で使用されるようなポリヌクレオチド
は、なかでも、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖およ
び二本鎖量息の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本
鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物で
あるＲＮＡ、一本鎖またはより典型的には二本鎖、ある
いは一本鎖および二本鎖量息の混合物であり得るＤＮＡ
およにＲＮＡを含むハイブリッド分子を示す。さらに本
明細書中で使用されるようなポリヌクレオチドは、ＲＮ
ＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含
む三本鎖領域を示す。かかる領域における鎖は、同じ分
子または異なる分子由来のものでよい。この領域は、１
またはそれ以上の分子の全てを包含し得るが、より典型
的にはいくつかの分子の一領域のみを含むことができ
る。三重らせん領域の分子の１つは、しばしばオリゴヌ
クレオチドである。

【００２０】本明細書中で使用されるように、ポリヌク
レオチドなる語は、１またはそれ以上の修飾塩基を含有
する前記のようなＤＮＡまたはＲＮＡを包含する。従っ
て、安定性または他の理由で修飾された骨格を有するＤ
ＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中で意味されるようなと
ころのポリヌクレオチドである。さらに、たった２つの
例を挙げるならば、通常の塩基、例えば、イノシン、ま
たは修飾された塩基、例えばトリチル化塩基を含むＤＮ
ＡまたはＲＮＡ、本明細書中で意味されるところのポリ
ヌクレオチドである。当業者によく知られた普通の目的
のための、非常に多くの修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに対
してなされることが、正しく認識されるであろう。ポリ
ヌクレオチドなる語は、本明細書中で使用されるよう
に、とりわけ単および複合細胞を包含するウイルスおよ
び細胞のＤＮＡおよびＲＮＡの特徴の化学的型と同様
に、ポリヌクレオチドのそのような化学的、酵素的また
は代謝的修飾型を包含する。

【００２１】「ポリペプチド」は、本明細書中で使用さ
れるように、下記のような全てのポリペプチドを包含す
る。ポリペプチドの基礎構造はよく知られており、当該
分野における無数のテキストブックおよび他の発行物に
おいて記載された。この用語は、ペプチド結合によって
直鎖中で相互に結合した二個またはそれ以上のアミノ酸
を含む任意のペプチドまたは蛋白質を示すために、本明
細書中で使用される。本明細書中で使用されるように、
この用語は、例えば、一般的に当該分野においてペプチ
ド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとして示される短
鎖、および一般的に当該分野において蛋白質として示さ
れる、多くの型が存在する長鎖の両方を示す。

【００２２】ポリペプチドがしばしば、一般に２０の天
然アミノ酸と称する２０アミノ酸以上のアミノ酸を包含
すること、および末端アミノ酸を包含する多くのアミノ
酸が、プロセッシングおよび他の翻訳後修飾のような天
然のプロセスによってか、または当該分野でよく知られ
た化学的修飾技術によって、得られるポリペプチドにお
いて修飾され得ることが、認識されるであろう。ポリペ
プチドにおいて天然の非常に多くの一般的修飾は、基礎
テキストおよびよち詳細な研究論文、ならびに分厚い研
究文献においてよく記載されており、当業者によく知ら
れている。本発明のポリペプチドに存在し得る既知の修
飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、ア
ミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌ
クレオチド誘導体の共有結合、脂質、あたは脂質誘導体
の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架
橋、結晶化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有
結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの
形成、ホルムル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシ
ル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素
化、メチル化、ミリストイル化、酸化、蛋白質加水分解
プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレ
ノイル化、硫酸化、アルギニル化のような蛋白質へのト
ランスファーＲＮＡ媒介アミノ酸付加、およびユビキチ
ン化を包含するが、それらに限定するものではない。

【００２３】かかる修飾は、当業者によく知られてお
り、化学文献にとても詳しく記載されている。特にいく
つかの一般的な修飾、例えば、グリコシル化、脂質結
合、硫酸化、グルタミン酸残基のガンマ−カルボキシル
化、ヒドロキシル化およびＡＤＰ−リボシル化は、最も
基礎的なテキスト、例えば、PROTEINS-STRUCTURE AND M
OLECULAR PROPERTIES, 第２版、T. E. Creighton, W.
H. Freeman and Company, NewYork, 1993に記載されて
いる。多くの詳細な論評がこの主題、例えばWold, F.に
よる”Posttranslation Protein MOdifications：Persp
ectives and Prospects”, Pgs. 1-12 in POSTTRANSLAT
IONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS,B. C. John
son, Ed., Academic Press, NewYork, 1983：Seifter e
t al., Meth.Enzymol., 182：626-646(1990), and Ratt
an et al., Ann. N. Y. Acad. Sci.,663：48-62(1992)
で入手可能である。

【００２４】よく知られ、前記のように、ポリペプチド
がいつも完全な直鎖状であるわけでないことが、認めら
れよう。例えば、ポリペプチドは、ユビキチン化の結果
として、分岐してもよく、それらは分岐してまたは分岐
しないで、一般には、天然のプロセシングおよび天然で
は起こらない人工的な修飾を包含する翻訳後修飾の結果
として、環状であってもよい。環状、分岐および分岐環
状ポリペプチドは、非翻訳天然プロセシングによって、
および完全な合成方法によって合成してもよい。修飾
は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカ
ルボキシ末端を包含するペプチドのどこでも起こり得
る。実際、共有結合によるポリペプチドにおけるアミノ
またはカルボキシ基の、あるいは両方のブロックは、天
然に起こるものとして一般的であり、合成ポリペプチド
およびかかる修飾は、本発明のポリペプチドに存在し得
る。例えば、プロセシングの前に、イー・コリにおいて
作られるポリペプチドのアミノ末端残基は、ほとんど不
変的に、Ｎ−ホルミルメチオニンであるであろう。

【００２５】ポリペプチドにおいて起こり得る修飾は、
しばしば、それを作る機能であろう。例えば、ポリペプ
チドが宿主内でクローン化遺伝子を発現することによっ
て作られる場合、大部分において、天然および修飾の範
囲は、宿主細胞の翻訳後修飾能力およびポリペプチドア
ミノ酸配列に存在する修飾シグナルによって決定される
であろう。例えば、よく知られているように、グリコシ
ル化は、しばしば、イー・コリのような細菌宿主におい
て起こらない。従って、グリコシル化が所望されると
き、ポリペプチドはグリコシル化している宿主、一般に
真核細胞において発現されるべきである。昆虫細胞は、
しばしば、哺乳類細胞と同じ翻訳後修飾グリコシル化を
行うので、昆虫細胞発現系は、とりわけ、グリコシル化
の天然パターンを有する哺乳動物蛋白質に発現するよう
に開発された。同様な考えを他の修飾に適用する。同じ
タイプの修飾が、得られるペプチドにおけるいくつかの
部位で同じまたは異なる程度で存在し得ることが認めら
れよう。また、得られるペプチドは、多くのタイプの修
飾を含み得る。

【００２６】一般に、本明細書中で使用するように、ポ
リペプチドなる語は、全てのかかる修飾、特に宿主細胞
においてポリヌクレオチドを発現することによって合成
されたポリペプチドに存在する修飾を含む。本明細書中
で使用する用語、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド
の「変種」は、対照ポリヌクレオチドまたはポリペプチ
ドと各々異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドで
ある。この意味における変種は、以下および本開示のど
こにおいても、とても詳細に記載されている。

【００２７】（１）ヌクレオチド配列が対照ポリヌクレ
オチドと異なるポリヌクレオチド。一般に、対照および
変種のヌクレオチド配列は、全体にわたって非常に類似
しており、多くの領域において同一であるので、差異は
限定される。下記のように、変種のヌクレオチド配列に
おける変化は、隠れたものであってもよい。それは、そ
れらが該ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ
酸を変化させなくてもよいということである。このタイ
プの隠れた変化に限定する変化では、変種は、対照と同
じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするであ
ろう。また下記のように、変種のヌクレオチド配列にお
ける変化は、対照ポリヌクレオチドによってコードされ
るポリペプチドのアミノ酸配列を変化させてもよい。か
かるヌクレオチド変化の結果、以下に論じるように、対
照配列によってコードされたポリペプチドにおけるアミ
ノ酸置換、付加、欠失融合及び先端切除を生じ得る。 （２）アミノ酸配列が対照ポリペプチドと異なるポリペ
プチド。一般に、対照および変種は、全体にわたって非
常に類似しており、多くの領域において同一であるの
で、差異は限定される。 変種および対照ポリペプチドは、アミノ酸配列が、いず
れの組み合わせでも存在し得る１またはそれ以上の置
換、付加、欠失、融合および先端切除によって異なって
もよい。

【００２８】本明細書中で使用される用語「融合蛋白
質」は、２個の、しばしば関連のない、融合遺伝子また
はそのフラグメントによってコードされる蛋白質であ
る。ヨーロッパ特許出願第ＥＰ−Ａ−０ ４６４ ５３
３号［カナダ類似特許出願第２０４５８６９号］は、免
疫グロブリン分子の不変領域の様々な蛋白質との別のヒ
ト蛋白質またはその部分からなる融合蛋白質を開示す
る。多くの場合、免疫グロブリンＦｃ領域の融合蛋白質
の一部として使用することは、治療および診断における
使用にとって有益であり、その結果、例えば、薬物動力
学特性を改善する［例えば、ヨーロッパ特許出願第ＥＰ
−Ａ ０２３２ ２６２号参照］。いくつかの使用の場
合、それは、融合蛋白質を発現、検出および精製した
後、Ｆｃ部分の欠失を削除するために望ましい。従っ
て、融合蛋白質の２成分と化学的または酵素的な開裂結
合領域を結合するのに望ましい。これはＦｃ蛋白質が治
療および診断におけつ使用にとって妨害となることを証
明する場合、例えば融合蛋白質が免疫化のための抗原と
して使用される場合である。薬剤発見において、例え
ば、ｈＩＬ−５のようなヒト蛋白質は、高処理量のスク
リーニングアッセイにおける使用のためにＦｃ蛋白質と
結合し、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定した。D. B
ennettら、J. Mol. Recog., 8：52-58(1995)；およびK.
Johnsonら、J. Biol. Chem., 270(16)：9459-9471(199
5)参照。

【００２９】従って、本発明はまた、ＭＡＤｒ３またＨ
ＡＭＡＤｒ４、あるいはその一部、および様々なサブク
ラス（ＩｇＧ、ＩｇＭ、 ＩｇＡ、 ＩｇＦ）の免疫グ
ロブリンの重鎖または軽鎖の不変領域の様々な部分から
なる、遺伝学的に操作された可溶性融合蛋白質に関す
る。好ましくは、免疫グロブリンは、ヒトＩｇＧ、特に
ＩｇＧ１の重鎖の不変部分であり、そこでは、中心領域
で融合が行われる。免疫グロブリンとして好ましいもの
は、ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧの不変部分であり、そこで
は、融合がヒンジ領域にて行われる。特別な具体例にお
いて、Ｆｃ部分は、血液凝固因子Ｘａと結合し得る開裂
配列の取り込みによって簡単に除去できる。さらに、本
発明は、遺伝子技法によるこれらの融合蛋白質の調製方
法、および診断ならびに治療のためのそれらの使用に関
する。本発明のさらなる態様はまた、かかる融合蛋白質
をコードするポリヌクレオチドに関する。

【００３０】膜結合レセプターは、特に融合蛋白質の形
成に有益である。かかるレセプターは、一般に、３つの
異なる構造領域：細胞ドメイン、膜貫通ドメインおよび
細胞質ドメインを有するとして特徴付けられる。本発明
は、１またはそれ以上のこれらの領域の、融合蛋白質の
成分としての使用が考えられる。かかる融合蛋白質技術
の例は、国際特許出願第ＷＯ９４／２９４５８号および
ＷＯ９４／２２９１４号において見ることができる。
「結合分子」（あるいは、他の呼称で「相互作用分子」
または「レセプター成分因子」）は、特に本発明のポリ
ペプチドに結合する、もしくは本発明ポリペプチドと相
互作用するリガンドを包含する分子を示す。かかる結合
分子は、本発明の一部である。結合分子はまた、非天然
であってもよく、例えば特に本発明のポリペプチドと結
合する抗体および抗体誘導試薬であり得る。

【００３１】当該分野で周知であるように、２ペプチド
間の「類似性」は、１ポリペプチドのアミノ酸配列およ
びその維持されたアミノ酸置換を２つめのポリペプチド
の配列と比較することによって決定する。さらに、ま
た、当該分野に市市であるように、「同一性」は、かか
る配列の２つの長さの合致の同一性によって決定される
ような、２ポリペプチドまたは２ポリヌクレオチド配列
間の配列関連性の程度を意味する。同一性および類似性
はどちらも、容易に算出できる［COMPUTATIONALMOLECUK
AR BIOLOGY, Lesk, A. M. , ed., Oxford University P
ress, New York,(1988)；BIOCOMPUTONG；INFORMATICS A
ND GENOME PROJECTS, Smith, D. W. ed., Academic Pre
ss, New York, (1993)；COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENC
E DATA,PART I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G.,
ed., Humana Press, New Jersey, (1994)；SEQUENCE A
NALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, Von Heinje, G., Acad
emic Press, (1987)；and SEQUENCE ANALYSIS PRIMER,
Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Pr
ess, New York, (1991)］。２ポリペプチドまたはポリ
ヌクレオチド配列間の同一性および類似性を測定する多
くの方法が存在するが、「同一性」および「類似性」な
る語は、当業者に周知である［H. Carillo and D. Lipt
on, SIAM J. Applied Math., 48：1073(1993)］。一般
に、２配列間の同一性または類似性を決定するために使
用される方法は、Guide to Huge Computers, Martin J.
Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, お
よびH.CarilloおよびLipton, SIAM J. Applied MAth.,
48：1073(1988)において開示されたものを包含するが、
これらに限定するものではない。同一性を決定するため
の好ましい方法は、試験する２配列間にもっとも大きな
合致を与えるために設計される。同一性および類似性を
決定する方法は、コンピュータープログラムに集成され
ている。２配列間の同一性および類似性を決定するため
の好ましいコンピュータープログラム法は、ＧＣＳプロ
グラムパッケージ［J. Devereuxら、Nucl.Acids Res.,
12(1)：387(1984)］、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ［S. F.
Atschulら、J. Mol. Biol., 215：403(1990)］を包含す
るが、これらに限定するものではない。

【００３２】発明の詳細な説明 本発明は、推定でヒトＭＡＤポリペプチドと同定される
新規ポリペプチド、および該ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドに関する。特に、本発明は、新規ヒト
ＭＡＤｒ３および／またはＭＡＤｒ４のポリペプチドお
よびポリヌクレオチドに関する。該同定は、他のＭＡＤ
蛋白質、例えばゼナパス（Ｘｅｎｏｐｕｓアフリカツメ
ガエル）ＭＡＤ１／２またはヒトＭＡＤｒ１に対するア
ミノ酸配列相同性の結果としてなされた。本発明のクロ
ーンは、いくつかはＴＧＦ−βの効果を形質導入するこ
とができる新規ＭＡＤ蛋白質、をコードする。本発明
は、特に、ゼナパスＭＡＤ１／２またはヒトＭＡＤｒ１
に対して約８０％のアミノ酸配列相同性に基づくＭＡＤ
ｒ３、ＭＡＤポリペプチドの推定コード領域を含む全長
クローンに関する。ＭＡＤｒ３は、図１〜４に示すヌク
レオチドおよびアミノ酸配列［各々、配列番号：１およ
び２］を有する。それによってコードされるヒトＭＡＤ
ｒ３のｃＤＮＡおよびアミノ酸配列は、また、ＡＴＣＣ
寄託番号９８２２３、プラスミドｐＨＳＢＨＩ９１にお
いて提供され、本明細書中において、「寄託クローン」
または「寄託クローンのｃＤＮＡ」と称する。図１〜４
に示すヌクレオチドおよびアミノ酸配列が寄託クローン
のｃＤＮＡを配列決定することによって得られること
は、評価されるであろう。したがって、寄託クローンの
配列は、２配列間のいずれの矛盾に関して調節してお
り、図１〜４の配列に対するいずれの対照は、寄託クロ
ーンのヒトｃＤＮＡの配列に対する対照を包含する。２
ヌクレオチド配列を同定するための別の部分的クローン
は、ＭＡＤｒ４を設計する［配列番号３および４］。図
５および６のＭＡＤｒ４フラグメントは、各々、ゼナパ
スＭＡＤｒ２と８０％のヌクレオチド相同性、およびゼ
ナパスＭＡＤｒ２に対して９０％のヌクレオチド相同性
を示す。図５は、ＭＡＤｒ４の部分アミノ酸配列をコー
ドすることが確信される。

【００３３】ポリヌクレオチド 本発明は、図１〜４［配列番号：１および２］の推定ア
ミノ酸配列を有する成熟ＭＡＤｒ３ポリペプチドまたは
寄託クローンのｃＤＮＡによってコードされるポリペプ
チドをコードする単離核酸（ポリヌクレオチド）を提供
する。本明細書中に提供される情報、例えば図１〜４
［配列番号：１］に示すポリヌクレオチド配列または図
５および図６［配列番号：３および４］のポリヌクレオ
チド配列を用いて、ヒトＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４を
コードする本発明のポリヌクレオチドを標準クローニン
グおよびスクリーニング法、例えば出発物質としてヒト
平滑筋細胞由来の細胞から得たｍＲＮＡを用いるｃＤＮ
Ａクローンニングのための方法を用いて得る。本発明の
実例となる、図１〜４［配列番号：１］に示すポリヌク
レオチドは、インターロイキン−１Ｂで誘発されるヒト
平滑筋細胞由来の商業的に入手可能なｃＤＮＡライブラ
リーにおいて、表示された配列タグ（ＥＳＴ）分析［M.
D. Adams et al., Science, 252:1651-1656(1991); M.
D.Adams et al., Nature, 355:632-634; M. D. Adams
et al., Nature, 377 Supp:3-174］を用いて発見され
た。

【００３４】本発明のヒトＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４
は、構造的に他のＭＡＤ蛋白質に関連する。例えば、Ｍ
ＡＤｒ３のｃＤＮＡ配列［図１〜４および配列番号：
１］は、４２５アミノ酸をコードするオープンリーディ
ングフレームを含み、ゼナパスＭＡＤ１／２およびヒト
ＭＡＤｒ１を包含するＭＡＤ遺伝子ファミリーの多くの
メンバーに対して有意な相同性（〜８０％）を示す。該
配列は、約４８０ｋＤａの推定分子量を有する蛋白質を
コードする。本発明のポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡの
ようなＲＮＡであり、または、例えばクローニングＤＮ
Ａまたは化学的合成技術によって作製された合成ＤＮＡ
によってか、あるいはその組合せによって得られるｃＤ
ＮＡおよびゲノムＤＮＡを包含するＤＮＡであってもよ
い。ＤＮＡは、２本鎖または１本鎖であり得る。１本鎖
ＤＮＡは、センス鎖としても知られるコーディング鎖で
あってもよく、または、アンチセンス鎖とも称される非
コーディング鎖であってもよい。

【００３５】成熟ＭＡＤｒ３ポリペプチドをコードする
配列は、図１〜４［配列番号：１］に示すポリヌクレオ
チドのコーディング配列または寄託クローンの配列と一
致し得る。また、それは、遺伝コードの重複（縮重）の
結果として図１〜４［配列番号：２］の同じ成熟ポリペ
プチドまたは寄託ｃＤＮＡをコードする、異なるコーデ
ィング配列を有するポリヌクレオチドであってもよ
く、。ＭＡＤｒ４ポリペプチドをコードするコーディン
グ配列部分は、図５および６（配列番号：３および４）
に示す２部分配列内で、そのどちらかもしくは両方で、
見られる。別法で、コーディング配列は、２部分配列の
１だけ、すなわち図５のみを包含してもよく、または、
コーディング配列は、遺伝コードの重複性または縮重の
結果として同じＭＡＤｒ４ポリペプチドをコードする異
なるコーディング配列であってもよい。

【００３６】図１〜４のポリペプチドまたは寄託ｃＤＮ
Ａによってコードされるポリペプチドをコードする本発
明のポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのコーディ
ング配列のみ；成熟ポリペプチドのコーディング配列お
よび付加コーディング配列、例えば、リーダーまは分泌
配列、例えばプレ−、またはプロ−もしくはプレプロ−
蛋白質配列をコードする配列、および、付加配列、限定
しないがイントロンおよび非コーディング５’および
３’配列、例えば転写において役割を果たす転写、非転
写配列を包含する非コーディング配列、および例えばリ
ボソーム結合およびｍＲＮＡの安定のためのスプライシ
ングおよびポリアデニル化シグナルを包含するｍＲＮＡ
プロセシングを伴う前記の付加コーディング配列を有す
るまたは有さない成熟ポリペプチドのコーディング配列
を包含するが、それに限定するものではない。付加的な
機能性を提供するコーディング配列は、また、ポリペプ
チドに取り込まれ得る。

【００３７】また、本発明は、成熟ポリペプチドのコー
ディング配列が同じリーディングフレーム内で、宿主細
胞からのポリペプチドの発現および分泌における助けと
なるポリヌクレオチド配列、例えば細胞からのポリペプ
チドの輸送を調節する分泌配列としての機能があるリー
ダー配列と融合し得るポリヌクレオチドも包含する。リ
ーダー配列を有するポリペプチドは、プレ蛋白質であ
り、ポリペプチドの成熟型を形成するために、宿主細胞
によって切断されるリーダー配列を有し得る。ポリヌク
レオチドは、また、成熟蛋白質および付加５’アミノ酸
残基であるプロ蛋白質をコードし得る。プロ配列を有す
る成熟蛋白質はプロ蛋白質であり、蛋白質の不活性型で
ある。一旦プロ配列が切断されると、活性型蛋白質が残
る。従って、例えば、ポリペプチドはフレーム内で、融
合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドのよ
うなマーカー配列と融合してもよい。本発明のこの態様
のある好ましい実施例において、マーカー配列は、ヘキ
サ−ヒスチジンペプチド、例えばｐＱＥ−９ベクター
（Qiagen, Inc.）において提供されるタグであり、細菌
宿主の場合、マーカーと結合した成熟ポリペプチドの精
製のために提供する。また例えば、Gentzら、Proc. Nat
l. Acad. Sci., USA, 1989, 86:821-824に記載されるよ
うに、ゲキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な
精製を提供する。他の具体例において、マーカー配列
は、特に哺乳類宿主、例えばＣＯＳ−７細胞のときに使
用されるヘマグルチニン（ＨＡ）タグである。ＨＡタグ
は、インフルエンザヘマグルチニン蛋白質から誘導され
るエピトープに対応し、例えばWilsonらによって、Cel
l, 1984, 37:767に記載されている。多くの他のそのよ
うなタグが商業的に入手可能である。

【００３８】図５および６（配列番号：３および４）の
部分ポリヌクレオチド配列によってコードされ得るＭＡ
Ｄｒ４の部分ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドは、すぐ先に論じた配列と同じタイプの配列を包含す
るが、それに限定するものではない。前記に従って、本
明細書中で使用する「ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド」なる語は、遺伝コードの過剰のせいで、本
発明のポリペプチド、特に図１〜４［配列番号：２］に
示すアミノ酸配列を有するヒトＭＡＤｒ３をコードする
いずれかの配列を包含するポリヌクレオチドを含む。該
用語は、付加コーディングおよび／または非コーディン
グ配列を包含するポリヌクレオチドと同様に、ポリペプ
チドのコーディング配列のみを包含する。また、該用語
は、１本鎖連続領域またはコーディングおよび／または
非コーディング配列を含有し得る付加領域を伴うポリペ
プチドをコードする（例えば、イントロンによって断続
される）不連続領域を含む。

【００３９】さらに本発明は、図１〜４（配列番号：
２）の推定アミノ酸配列を有するポリペプチドまたは寄
託クローンのｃＤＮＡによってコードされたポリペプチ
ドのフラグメント、類似体および誘導体をコードする、
本明細書中に前記したポリヌクレオチドの変種に関す
る。ポリヌクレオチドの変種は、配列番号：１および
２、または寄託クローンの天然変種、例えば、天然の対
立遺伝子変種であり得、あるいは天然ではない変種であ
ってもよい。当該分野において周知のように、対立遺伝
子変種は、１またはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠
失または付加を有してもよいポリヌクレオチド配列の変
化型であり、それは、実質上、コードするポリペプチド
の機能を変化させない。ポリヌクレオチドの非天然変種
は、ポリヌクレオチド、細胞または生物への応用を包含
する突然変異技術によって作製され得る。

【００４０】中でもこの点において変種は、ヌクレオチ
ド置換、欠失または付加によって、前記のポリヌクレオ
チドとは異なる変種である。置換、欠失または付加は、
１またはそれ以上のヌクレオチドを伴う。変種は、コー
ディングまたは非コーディング領域あるいはその両方に
おいて変化してもよい。コーディング領域における変化
は、保存または非保存アミノ酸置換、欠失あるいは付加
を伴ってもよい。中でもこの点において本発明の特に好
ましい具体例は、図１〜４［配列番号：２］に示すよう
なＭＡＤｒ３のアミノ酸配列；ＭＡＤｒ４配列［配列番
号：３および４］によってコードされるアミノ酸配列、
その変種、類似体、誘導体およびフラグメント、ならび
に該変種、類似体および誘導体のフラグメントを有する
ポリペプチド、または寄託クローンのｃＤＮＡによって
コードされる同成熟ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドである。

【００４１】この点においてさらに特に好ましくは、Ｍ
ＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４変種、類似体、誘導体および
フラグメント、ならびに該フラグメントの変種、類似体
および誘導体をコードするポリヌクレオチドであり、そ
れは、図１〜４のＭＡＤｒ３ポリペプチド、または図５
および６（配列番号：３および４）のポリヌクレオチド
によってコードされるいずれかのポリペプチドもしくは
寄託クローンｃＤＮＡによってコードされるポリペプチ
ドのアミノ酸配列を有する。そのようなポリペプチドに
おける数個、少しの、５〜１０、１〜５、１〜３、２、
または１アミノ酸残基は、いずれかの組合せにおいて、
置換、欠失または付加されてもよく、あるいは、そのい
ずれも起こらなくてもよい。中でも特に好ましくは、サ
イレント置換、付加、挿入および欠失変種があり、それ
は、ＭＡＤｒ３およびＭＡＤｒ４の特質および活性を変
化させない。また、この点において特に好ましくは、保
存置換である。最も大いに好ましくは、置換無しで図１
〜４のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドである。

【００４２】本発明のさらに好ましい具体例は、図１〜
４に示すアミノ酸配列を有するＭＡＤｒ３ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも約
８０％同一であるポリヌクレオチド、およびそのような
ポリヌクレオチドに対して相補的なである。最も大いに
好ましくは、寄託クローンのヒトｃＤＮＡのＭＡＤｒ３
ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して、
少なくとも８５％同一である領域を含むポリヌクレオチ
ド、およびそれに相補的なポリヌクレオチドである。こ
の点において、該ヌクレオチドに対して少なくとも９０
％同一なポリヌクレオチドが特に好ましく、少なくとも
９５％同一であるものが、とりわけ好ましい。さらに、
少なくとも９７％同一であるものが大いに好ましく、少
なくとも９８〜９９％同一であるものが、最も大いに好
ましく、少なくとも９９％では、最も好ましい。この点
において、さらに特に好ましい具体例は、図１〜４、寄
託クローンのｃＤＮＡまたは図５および６のＤＮＡによ
ってコードされる成熟ポリペプチドと実質上同じ生物学
的機能または活性を保持するポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドである。

【００４３】本発明はさらに、特にもし、前記の配列間
に少なくとも８０％の同一性があるならば、本明細書中
で前記した配列に対してハイブリダイズするポリヌクレ
オチドに関する。この点において、本発明は特に、本明
細書中で前記したポリヌクレオチドと厳しい条件下でハ
イブリダイズするポリヌクレオチドに関する。本明細書
中で使用するように、「厳しい条件」なる語は、配列間
に少なくとも９５％および好ましくは９７％の同一性が
存在する時のみ起こるであろうハイブリダイゼーション
を意味する。本発明のポリヌクレオチドアッセイに関し
て本明細書中で付加的に論じるように、ＭＡＤｒ３およ
びＭＡＤｒ４フラグメントを包含する本発明のポリヌク
レオチドは、ＭＡＤＲ３およびＭＡＤｒ４をコードする
全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離するために、
ならびにヒトＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４遺伝子に対し
て高い配列類似性および／あるいは類似した生物学的活
性を有する他の遺伝子のｃＤＮＡおよびゲノムクローン
を単離するために、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡのため
のハイブリダイゼーションプローブとして使用してもよ
い。そのようなプローブは、一般に、少なくとも１５ヌ
クレオチドを含むであろう。好ましくは、そのようなプ
ローブは、少なくとも３０ヌクレオチドを有し、少なく
とも５０ヌクレオチドを有してもよい。特に好ましいプ
ローブは、３０〜５０ヌクレオチド範囲であろう。ま
た、プローブは、全長転写産物に対するｃＤＮＡクロー
ンおよびゲノムクローンまたは調節およびプロモーター
領域、エキソン、ならびにイントロンを包含する完全な
ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４遺伝子を含有するクローン
の同定に使用し得る。

【００４４】スクリーニングの例は、既知ＤＮＡ配列を
用いてオリゴヌクレオチドプローブを合成し、それを用
いて遺伝子のコーディング領域を単離することを含む。
本発明の遺伝子配列に対して相補的な配列を有するラベ
ルしたオリゴヌクレオチドは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤ
ＮＡまたはｍＲＮＡライブラリーのスクリーニングに使
用し、プローブをハイブリダイズするライブラリーのメ
ンバーを決定する。好ましい具体例において、前記のポ
リヌクレオチドに対してハイブリダイズするポリヌクレ
オチドは、図１〜４（配列番号：１）のｃＤＮＡによっ
てまたは寄託ｃＤＮＡんによって、あるいは図５および
６（配列番号：３および４）の部分ｃＤＮＡによってコ
ードされる成熟ポリペプチドと実質上同じ生物学的機能
または活性を保持するポリペプチドをコードする。例え
ば、そのようなポリヌクレオチドは、配列番号：１のポ
リヌクレオチド、配列番号２および３のポリヌクレオチ
ドのためのプローブとして使用でき、例えば、ポリヌク
レオチドの回収のために、または診断プローブとしても
しくはＰＣＲプライマーとして使用できる。例えば、Ｍ
ＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４遺伝子のコーディング領域
は、既知ＤＮＡ配列を用いてオリゴヌクレオチドプロー
ブを合成し、それを用いるスクリーニングによって、単
離できる。本発明の遺伝子配列に相補的な配列を有する
ラベルしたオリゴヌクレオチドは、次いで、ヒトｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡライブラリーのスクー
ニングに使用し、該プローブがハイブリダイズするライ
ブラリーのメンバーを決定する。

【００４５】本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプ
チドは、ヒト疾患に対する治療および診断の発見のため
の研究試薬および研究材料として使用してもよく、さら
に本明細書中で論じるように、ポリヌクレオチドアッセ
イに関する。ポリヌクレオチドは、成熟蛋白質および付
加アミノ酸またはカルボキシル末端アミノ酸、あるいは
成熟ポリペプチド内のアミノ酸（例えば、成熟型が１ポ
リペプチド鎖よりも大きいとき）であるポリペプチドを
コードする。そのような配列は、数ある中でも、前駆体
から成熟型への蛋白質のプロセッシングにおいて役割を
果し、蛋白質輸送を容易にし、蛋白質の半減期を長くま
たは短くし、あるいはアッセイまたは生産のための蛋白
質の取り扱いを容易にし得る。一般的にｉｎｓｉｔｕの
場合、付加アミノ酸は、成熟蛋白質から細胞性酵素によ
って除去され得る。１またはそれ以上のプロ配列と融合
したポリペプチドの成熟型を有する前駆体蛋白質は、ポ
リペプチドの不活性型である。プロ配列が除去される
と、そのような不活性前駆体は、一般に活性化する。い
くつかのまたは全てのプロ配列は、活性化前に除去され
得る。一般に、そのような前駆体をプロ蛋白質と称す
る。

【００４６】要するに、本発明のポリヌクレオチドは、
成熟蛋白質、リーダー配列を加えた成熟蛋白質（プレ蛋
白質と称してもよい）、プレ蛋白質のリーダー配列では
ない１またはそれ以上のプロ配列を有する成熟蛋白質の
前駆体、または、プロ蛋白質に対する前駆体であり、一
般にポリペプチドの活性型および成熟型を生じるプロセ
ッシング段階で除去されるリーダー配列および１または
それ以上のプロ配列を有するプレプロ蛋白質をコードで
きる。

【００４７】寄託材料 ヒトｐＨＳＢＨＩ９１ ｃＤＮＡを含有する寄託物は、
アメリカ合衆国２０８５２メリーランド、ロックビル、
パーク・ラウン・ドライブ１２３０１番のアメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクションに、１９９６年８月
１０日に寄託し、ＡＴＣＣ受託番号９８２２３が付与さ
れた。ヒトｃＤＮＡ寄託物は、本明細書中で「寄託クロ
ーン」または「寄託クローンのｃＤＮＡ」と称する。寄
託材料ｐＨＳＢＨＩ９１は、ファージミドのマルチクロ
ーニング部位におけるＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ部位間に挿
入した全長ＭＡＤｒ３ＤＮＡを含有するｐＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔ ＳＫ（＋／−）ファージミド（Stragagene,
Inc.）である。寄託は、特許手続き上の微生物寄託の国
際承認に関するブダペスト条約の条件下でなされてい
る。特許が発行されると何ら制限または条件もなく、最
終的に株は分譲される。寄託は当業者の便宜のためのみ
に提供され、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１２条のもとに要求さ
れるような、寄託が実施可能要件であることを承認する
ものではない。寄託材料に含有されるポリヌクレオチド
の配列、ならびにそれによってコードされるポリペプチ
ドのアミノ酸配列は、リファレンスによって本明細書中
に組み込まれ、本明細書中でいずれかの配列の表示との
いずれかの矛盾において、調節している。寄託物を製
造、使用または販売するためにはライセンスが必要であ
るが、そのようなライセンスはここでは付与されていな
い。

【００４８】ポリペプチド 本発明は、図１〜４［配列番号：２］の推定アミノ酸を
有する、または寄託ｃＤＮＡによってコードされるアミ
ノ酸配列を有すヒトＭＡＤｒ３ポリペプチドに関する。
本発明はまた、これらのポリペプチドの変種、類似体、
誘導体およびフラグメント、ならびにフラグメントの変
種、類似体および誘導体に関する。「フラグメント」、
「誘導体」および「類似体」なる語は、図１〜４のポリ
ペプチドに対して用いるとき、特に、そのようなポリペ
プチドと同じ生物学的機能または活性、すなわちＭＡＤ
ｒ３またはＭＡＤｒ４としての機能を保持する、あるい
はそのリガンドまたは結合分子と結合する能力を保持す
るポリペプチドを意味する。従って、類似体は、例え
ば、プロ蛋白質部分の切断によって活性化して活性成熟
ポリペプチドを生じることができるプロ蛋白質を包含す
る。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天
然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであり得る。あ
る好ましい具体例において、それは組換えポリペプチド
である。

【００４９】図１〜４のポリペプチドの、または寄託ｃ
ＤＮＡによってコードされるフラグメント、誘導体また
は類似体は、（i）１またはそれ以上のアミノ酸残基が
保存または非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミ
ノ酸残基）と置換しており、そのような置換アミノ酸残
基は、遺伝子コードによってコードされているか、また
はされていないものであり；（ii）１またそれ以上のア
ミノ酸残基が置換基を包含するもの；（iii）成熟蛋白
質が別の化合物、例えばポリペプチドの半減期を増加さ
せる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合
しているもの；または（iv）付加アミノ酸が成熟ポリペ
プチド、例えばリーダーまたは分泌配列あるいは成熟ポ
リペプチドの精製のために使用する配列、あるいはプロ
蛋白質配列と融合しているものである。そのようなフラ
グメント、誘導体および類似体は、本明細書中の技術か
ら当業者の範囲内であると考えられる。本発明のポリペ
プチドおよびポリヌクレオチドは、好ましくは単離型で
提供され、好ましくは均一に精製される。さらに、この
点における本発明の特に好ましい具体例は、ＭＡＤｒ４
のアミノ酸配列、その変種、類似体、誘導体およびフラ
グメント、ＭＡＤｒ４の活性／機能を保持するフラグメ
ントの変種、類似体および誘導体を有するポリペプチド
である。

【００５０】中でも好ましい変種は、保存アミノ酸置換
による対照から変化するものである。そのような置換
は、ポリペプチドに与えられたアミノ酸を似た特徴の別
のアミノ酸によって置換するものである。典型的に、保
存置換が置換（replacement）、別の、中でも脂肪族ア
ミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ；ヒドロキ
シル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基Ａｓｐお
よびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎとＧｌｎの間の置
換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換ならびに芳香
族残基ＰｈｅおよびＴｙｒの間の置換である。さらに、
この点において特に好ましくは、アミノ酸残基のいくつ
か、少し、５〜１０、１〜５、１〜３、２、１個が、い
ずれかの組み合わせにおいて、置換、欠失もしくは付加
しているか、または１つも置換、欠失もしくは付加して
いない図１〜４のＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４ポリペプ
チドのアミノ酸配列を有する変種、類似体、誘導体およ
びフラグメント、ならびにフラグメントの変種、類似体
および誘導体である。これらの中でも特に好ましくは、
ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４の性質および活性を変化さ
せないサイレント置換、付加および欠失である。また、
個の点において特に好ましくは、保存置換である。最も
大いに好ましくは、図１〜４［配列番号：２］のアミノ
酸配列を置換無しで有するポリペプチドである。

【００５１】本発明のポリペプチドは、配列番号：２の
ポリペプチド（特に、成熟ポリペプチド）ならびに、配
列番号：２のポリペプチドに対して少なくとも８０％の
同一性、さらに好ましくは配列番号：２のポリペプチド
に対して少なくとも９０％の類似性（さらに好ましく
は、少なくとも９５％の同一性）および、まださら好ま
しくは配列番号：２のポリペプチドに対して少なくとも
９５％の類似性（まださらに好ましくは、少なくとも９
５％の同一性）を有するポリペプチドを包含し、また、
一般に少なくとも３０アミノ酸含有し、さらに好ましく
は少なくとも５０アミノ酸含有するポリペプチドのかか
る部分を伴うかかるポリペプチド部分を包含する。

【００５２】本発明のポリペプチドのフラグメントまた
は部分は、ペプチド合成による対応する全長ポリペプチ
ドの生産に使用でき、全長ポリペプチドの生産の中間物
質として使用できる。本発明のポリヌクレオチドのフラ
グメントまたは部分は、本発明の全長ポリヌクレオチド
の合成に使用できる。フラグメントは、「フリースタン
ディング（free-standing）」、すなわち他のアミノ酸
またはポリペプチドの一部あるいは他のアミノ酸または
ポリペプチドと融合しない状態であり、またはそれら
は、一部もしくは領域を形成するポリペプチドのより大
きいポリペプチド内に含まれ得る。より大きいポリペプ
チド内に含まれるとき、本明細書中で論じるフラグメン
トは、最も好ましく、一本鎖連続領域を形成する。しか
しながら、いくつかのフラグメントは、一本鎖のより大
きいポリペプチド内に含まれ得る。例えば、ある好まし
い具体例は、宿主において発現するように設計された前
駆体ポリペプチド内に含まれ、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤ
ｒ４フラグメントのアミノ末端に融合した非相同プレ−
およびプロ−ポリペプチド領域およびフラグメントのカ
ルボキシル末端に融合した付加領域を有する本発明のＭ
ＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４ポリペプチドに関する。さら
に、本明細書中で意図される意味の一の態様におけるフ
ラグメントは、融合蛋白質またはＭＡＤｒ３もしくはＭ
ＡＤｒ４から誘導した融合蛋白質の一部あるいは複数の
部分に言及する。

【００５３】本発明のポリペプチドフラグメントの代表
例のように、約５〜１５、１０〜２０、１５〜４０、３
０〜５５、４１〜７５、４１〜８０、４１〜９０、５０
〜４００、７５〜１００、９０〜１１５、１００〜１２
５および１１０〜１１３アミノ酸長を有する前記のポリ
ペプチドであってもよい。この文脈において、「約」
は、特に列挙した範囲および、どちらかの末端または両
端にて、数個の、少しの、５、４、３、２または１アミ
ノ酸残基によるより大きいあるいはより小さい範囲を包
含する。例えば、この文脈における約４０〜９０アミノ
酸は、４０プラスまたはマイナスいくつかの、少しの、
５、４、３、２または１アミノ酸残基ないし、９０プラ
スまたはマイナス数個の、少しの、５、４、３、２また
は１アミノ酸残基、すなわち、４０マイナス数個のアミ
ノ酸ないし９０プラス数個のアミノ酸と同様の広さない
し、４０プラス数個のアミノ酸ないし９０マイナス数個
のアミノ酸と同様の狭さの範囲のポリペプチドフラグメ
ントを意味する。この点において大いに好ましくは、ど
ちらかの末端または両端にて、列挙した範囲プラスまた
はマイナス５アミノ酸である。特に大いに好ましくは、
どちらかまたは両方の列挙した末端にて、列挙した範囲
プラスまたはマイナス３アミノ酸である。特別に特に大
いに好ましくは、どちらかの末端または両端での範囲プ
ラスまたはマイナス１アミノ酸、あるいは付加または欠
失を伴わない列挙した範囲である。この点において全て
のなかで最も大いに好ましくは、約５〜１５、１０〜２
０、１５〜４０、３０〜５５、４１〜７５、４１〜８
０、４１〜９０、５０〜１００、７５〜１００、９０〜
１１５、１００〜１２５、および１１０〜１１３アミノ
酸長のフラグメントである。

【００５４】中でも特に好ましい本発明のフラグメント
は、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４の先端を切り取った突
然変異体である。先端を切り取った突然変異体は、アミ
ノ末端を包含する残基の連続系（連続の領域、一部また
は部分）、またはカルボキシ末端を包含する残基の連続
系の欠失、あるいは二重に先端を切り取った突然変異体
の場合、１つはアミノ末端を包含し、１つはカルボキシ
末端を包含する残基の２連続系の欠失を除いて、図１〜
４の、またはその変種もしくは誘導体のアミノ酸配列を
有するＭＡＤｒ３ポリペプチドを包含する。前記のサイ
ズ範囲を有するフラグメントは、また、先端を切り取っ
たフラグメントの好ましい具体例であり、一般にフラグ
メントの中でも特に好ましい。また、本発明のこの態様
において好ましくは、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４の構
造的あるいは機能的属性によって特徴付けられたフラグ
メントである。この点における本発明の好ましい具体例
は、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４のアルファヘリックス
およびアルファヘリックス形成領域（「アルファ領
域」）、ベータシートおよびベータシート形成領域
（「ベータ領域」）、ターンおよびターン形成領域
（「ターン領域」）、コイルおよびコイル形成領域
（「コイル形成領域」）、親水性領域、疎水性領域、ア
ルファ両親媒性領域、ベータ両親媒性領域、可変領域、
表面形成領域、および高抗原性指標領域からなるフラグ
メントを包含する。

【００５５】中でもこの点における大いに好ましいフラ
グメントは、いくつかの構造的特徴、例えば前記の特徴
のいくつかを伴うＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４の領域か
らなるフラグメントである。この点において、全てが、
ターン領域、親水性領域、可変領域、表面形成領域、お
よび高抗原性指標領域に特有なアミノ酸組成によって特
徴付けられる図１〜４の約１０〜約２０、約４０〜約５
０、約７０〜約９０および約１００〜約１１３残基によ
って定義付けた領域は、特に大いに好ましい領域であ
る。そのような領域は、先に論じたように、より大きい
ポリペプチド内に含まれてもよく、または、それら自体
が本発明の好ましいフラグメントであり得る。この段落
で使用したような「約」なる語が、一般にフラグメント
について前記した意味を有することは、認められよう。
さらに好ましい領域は、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４の
活性を媒介する領域である。この点において最も大いに
好ましくは、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４の化学的、生
物学的もしくは他の活性を有するフラグメントであり、
類似の活性または改善した活性を有する、あるいは望ま
しくない活性を減じたフラグメントを包含する。この点
において大いに好ましくは、配列において、または場所
において、あるいは両方の配列において相同である領域
を含有するフラグメントであり、ヒトＭＡＤｒ１ポリペ
プチドのような関連するポリペプチドの領域を活性化す
る。中でもこれらの点において特に好ましいフラグメン
トは、先に論じたように、先端を切り取った突然変異
体、またはポリペプチドの様々なドメインを含むフラグ
メントである。

【００５６】また、本発明が、数ある中でも前記のフラ
グメントをコードするポリヌクレオチド、フラグメント
をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポ
リヌクレオチド、特に厳しい条件下でハイブリダイズす
るもの、およびフラグメントをコードするポリヌクレオ
チドの増幅のためのポリヌクレオチド、例えばＰＣＲプ
ライマーに関することが認められよう。これらの点にお
いて、好ましいポリヌクレオチドは、先に論じたよう
に、好ましいフラグメントに対応するものである。

【００５７】ベクター、宿主細胞、発現 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを包含するベ
クター、本発明のベクターで遺伝子操作される宿主細胞
および組み換え技法による本発明のポリペプチドの生産
に関する。宿主細胞を遺伝子操作して、ポリヌクレオチ
ドを組み込み、本発明のポリペプチドを発現させること
ができる。例えば、ポリヌクレオチドは、周知の感染、
トランスダクション、トランスフェクション、トランス
ベクションおよびトランスフォーメーション技法を用い
て、宿主細胞へ導入できる。別に提示しないかぎり、ト
ランスフォーメーションは、Graham, F. およびVan der
Bb, A., VIrology, 52：456-457（1973）の方法に記載
されるとおりに行った。ポリヌクレオチドは、単独で、
または他のポリヌクレオチドといっしょに導入してもよ
い。そのような他のポリヌクレオチドは、独立して導
入、同時導入または本発明のポリヌクレオチドに結合し
て導入してもよい。従って、例えば、本発明のポリヌク
レオチドは、同時トランスフェクションおよび選抜のた
めの標準技法を用いて、例えば哺乳類細胞において、別
の、選択マーカーをコードする分離ポリヌクレオチドと
いっしょに宿主へトランスフェクトしてもよい。この場
合、ポリヌクレオチドは、一般に、宿主細胞ゲノムに安
定に取り込まれるであろう。

【００５８】別法で、ポリヌクレオチドは、宿主におけ
る伝播のための選択マーカーを含有するベクターと結合
してもよい。ベクター構築物は、前記の技法によって宿
主細胞に導入され得る。一般に、プラスミドベクター
は、沈殿中のＤＮＡ、例えばリン酸カルシウム沈殿、ま
たは荷電脂質との複合体中のＤＮＡとして導入する。エ
レクトロポーレーションもまた、ポリヌクレオチドを宿
主に導入するのに使用してもよい。もしベクターがウイ
ルスならば、それは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージす
るか、またはパッケージング細胞へ導入してもよく、パ
ッケージしたウイルスは、細胞へ形質導入してもよい。
本発明のこの態様に従って、ポリヌクレオチドの作製の
ための、およびポリヌクレオチドの細胞への導入に適当
な幅広く様々な技法は、周知であり、当業者にとって慣
例である。そのような技法は、これらの技法を詳細に説
明する多くの研究室マニュアルの実例として、Sambrook
らによって詳しく概説されている。

【００５９】本発明のこの態様に従って、ベクターは、
例えば、プラスミドベクター、一本鎖または二本鎖ファ
ージベクター、あるいは一本鎖または二本鎖ＲＮＡもし
くはＤＮＡウイルス性ベクターであり得る。そのような
ベクターは、ポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡとし
て、細胞へＤＮＡおよびＲＮＡを導入するための周知の
技法によって、細胞へ導入され得る。ファージおよびウ
イルス性ベクターの場合、ベクターはまた、パッケージ
されたまたはカプシドに包まれたウイルスとして、感染
およびトランスダクションのための周知の技法によっ
て、細胞へ導入されてもよく、好ましくは導入される。
ウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損
であってもよい。後者の場合、ウイルス伝播は、一般に
補足している宿主細胞でのみ起こるであろう。ある点に
関して、ベクターの中でも好ましくは、本発明のポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドの発現のためのベクター
である。一般に、そのようなベクターは、発現するポリ
ヌクレオチドに機能的に関連する宿主における発現に効
果のあるシスアクティング（cis-acting）対照領域を含
む。適当なトランスアクティング因子は、宿主への導入
上、宿主によって供給されるか、補足しているベクター
によって供給されるか、またはベクター自身によって供
給されるかのいずれかである。

【００６０】この点におけるある好ましい具体例におい
て、ベクターは特異的な発現を供給する。そのような特
異的発現は、誘導できる発現またはあるタイプの細胞で
のみの発現、あるいは誘導できる発現および細胞特異的
発現の両方であり得る。誘導できるベクターの中でも特
に好ましくは、操作が容易な環境因子、例えば温度およ
び栄養付加によって発現を誘導できるベクターである。
本発明のこの態様に対して適当な様々なベクターは、原
核生物および真核生物宿主において使用するための保存
ならびに誘導できる発現ベクターを包含し、周知であ
り、当業者によってごく普通に使用される。

【００６１】操作した宿主細胞は、それは、とりわけ、
プロモーターを活性化する、形質転換細胞を選択するま
たは遺伝子を増幅するために適当に修飾してもよい簡便
な栄養培地中で培養できる。発現のために選択した宿主
細胞といっしょに予め使用される培養条件、例えば温
度、ｐＨなどは、当業者にとって明白であるように、一
般に、本発明のポリペプチドの発現に適当であろう。大
いに様々な発現ベクターは、本発明のポリペプチドを発
現するために使用することができる。そのようなベクタ
ーは、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクタ
ー、例えば細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母
エピソーム、酵母染色体エレメント、および、例えばバ
キュロウイルス、パポバウイルス、ＳＶ４０、ワクシニ
アウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬
病ウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス由来の
ベクター、ならびにそれらを組み合わせたものに由来す
るベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファー
ジ遺伝学的エレメント、コスミドおよびファージミド由
来のベクターを包含する。一般に、宿主においてポリペ
プチドを製造するためのポリヌクレオチドを維持、伝
播、または発現するのに適当ないずれかのベクターが、
この点に関しての発現に使用され得る。

【００６２】適当なＤＮＡ配列は、様々な周知および慣
例の技法のいずれかによって、ベクターへ挿入され得
る。一般に、発現のためのＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列、
および１またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼを伴
う発現ベクターの切断、次いでＴ４ ＤＮＡリガーゼを
用いる制限フラグメントの結合によって発現ベクターに
結合する。該末端に対して使用できる制限および連結方
法は、当業者にとって周知であり、慣例である。当業者
にとって周知であり慣例であるこの点における適当な方
法および別の技法を用いての発現ベクターの構築に適当
な方法は、Sambrookらによって非常に詳細に示されてい
る。発現ベクターにおけるＤＮＡ配列は、例えばｍＲＮ
Ａ転写に指示するプロモーターを包含する適当な発現対
照配列に機能的に関連する。そのようなプロモーターの
代表例は、少しのよく知られたプロモーターを挙げる
と、ファージラムダＰＬプロモーター、イー・コリｌａ
ｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期お
よび後期プロモーター、ならびにレトロウイルスのプロ
モーターである。本発明のこの態様において有効な多く
の他のプロモーターがよく知られており、本明細書中の
論議および実施例によって説明された方法において、当
業者によってごく普通に使用されるということが理解さ
れよう。

【００６３】一般に、発現構築物は、転写開始および終
了部位、ならびに転写領域において翻訳のためのリボソ
ーム結合部位を含有するであろう。構築物によって発現
される成熟転写産物のコーディング部分は、翻訳される
ポリペプチドの始まりに翻訳開始ＡＵＧおよび終わりに
適当に位置した終了コドンを包含するであろう。さら
に、構築物は、発現を生じると同様に調節する対照領域
を含有し得る。一般に、多くの一般的に実行される方法
に従って、そのような領域は、対照となる転写によって
生じるであろう。例は、数ある中でも、レプレッサー結
合部位およびエンハンサーを包含する。伝播および発現
のためのベクターは、一般に、選択マーカーを包含す
る。選択マーカー遺伝子は、形質転換した宿主細胞の選
択のための表現型特徴を供給する。好ましいマーカー
は、真核細胞培養株のジヒドロホーレートレダクターゼ
またはネオマイシン耐性、およびイー・コリ培養株およ
び他の細菌のテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性
遺伝子を包含するが、それに限定するものではない。そ
のようなマーカーは、また、増幅にも適当であり得る。
別法で、ベクターは、この目的のための付加マーカーを
含有してもよい。

【００６４】本明細書中に記載した適当なＤＮＡ配列を
含有するベクターは、適当なプロモーターおよび他の適
当な対照配列と同様に、所望のポリペプチドの発現に適
当な様々な周知の技法を用いて、適当な宿主に導入して
もよい。適当な宿主の代表例は、細菌細胞、例えばイー
・コリ、ストレプトミセス（Streptomyces）およびサル
モネラ・チピムリウム（Salmonella typhimuriumu）細
胞；真菌細胞、例えば酵母細胞；昆虫細胞、例えばドロ
ソフィラＳ２およびスポドプテラＳｆ９細胞；動物細
胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳおよびボウズ（Bows）黒色腫
細胞；ならびに植物細胞を包含する。非常に様々な発現
構築物の宿主は周知であり、当業者は本開示によって手
段を与えられ、本発明のこの態様に従うポリペプチドの
発現のための宿主を容易に選択するであろう。

【００６５】さらに特に、本発明はまた、１またはそれ
以上の前記の配列からなる組換え構築物、例えば発現構
築物をも包含する。構築物は、その中に本発明の配列を
挿入したベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベ
クターを含む。配列は、正方向または逆方向に挿入され
得る。この点におけるある好ましい具体例において、構
築物はさらに、規則的に、例えば操作しやすく配列に結
合したプロモーターを包含する配列を含む。多くの適当
なベクターおよびプロモーターが当業者に知られてお
り、多くの商業的に入手可能な、本発明での使用に適当
なベクターが存在する。商業的に入手可能な以下のベク
ターを実施例の方法によって供給する。ベクターの中で
も、細菌での使用に好ましいものは、Ｑｉａｇｅｎから
入手できるｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；
Ｓｔｒａｒａｇｅｎｅから入手できるｐＢＳベクター、
ファージスクリプトベクター、ブルースクリプトベクタ
ー、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ
４６Ａ；およびＰｈａｒｍａｃｉａから入手できるｐｔ
ｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐ
ＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５である。

【００６６】商業的に入手可能な以下のベクターを実施
例の方法によって供給する。ベクターの中でも、細菌で
の使用に好ましいものは、Ｑｉａｇｅｎから入手できる
ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅから入手できるｐＢＳベクター、ファージス
クリプトベクター、ブルースクリプトベクター、ｐＮＨ
８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；お
よびＰｈａｒｍａｃｉａから入手できるｐｔｒｃ９９
ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４
０、ｐＲＩＴ５である。中でも好ましい真核生物ベクタ
ーは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手できるｐＷＬＮＥ
Ｏ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳ
Ｇ；およびＰｈａｒｍａｃｉａから入手できるｐＳＶＫ
３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬである。これら
のベクターは、本発明のこの態様に従って使用するため
に、当業者が入手可能な多くの商業的に入手可能で周知
のベクターの説明書の方法によって、単に列挙されてい
る。例えば、宿主において、本発明のポリヌクレオチド
またはポリペプチドの導入、維持、伝播または発現に適
当な、いずれかの他のプラスミドまたはベクターが本発
明のこの態様において使用され得ることが認められよ
う。

【００６７】プロモーター領域は、例えばクロラムフェ
ニコールアセチル転写酵素（”ＣＡＴ”）転写ユニット
のようなプロモーター領域を欠くレセプター転写ユニッ
ト、転写部位の下流またはプロモーターフラグメント候
補を導入するための部位；すなわち、プロモーターを含
有し得るフラグメントを含むベクターを用いて、いずれ
かの所望の遺伝子から選択できる。周知のように、ＣＡ
Ｔ遺伝子の転写部位上流でのプロモーター含有フラグメ
ントのベクターへの導入は、標準ＣＡＴアッセイによっ
て検出できるＣＡＴ活性の発生を生じる。この目的に適
当なベクターは、よく知れており、容易に入手できる。
そのようなベクターの２つの例は、ｐＫＫ２３２−８お
よびｐＣＭ７である。従って、本発明のポリヌクレオチ
ドの発現のためのベクターは、よく知られており、容易
に入手できるだけでなく、レポーター遺伝子を用いる先
行技術によって容易に得られるプロモーターをも包含す
る。

【００６８】中でも、本発明に従うポリヌクレオチドお
よびポリペプチドの発現に適当な既知の細菌性プロモー
ターは、イー・コリｌａｃＩおよびｌａｃＺプロモータ
ー、Ｔ３およびＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモータ
ー、ラムダＰＲ、ＰＬプロモーターおよびｔｒｐプロモ
ーターである。中でも、この点において適当な既知の真
核生物プロモーターは、ＣＭＷ媒介初期プロモーター、
ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期および後期
ＳＶ４０プロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモ
ーター、例えばルイス・サルコマ・ウイルス（Rous Sar
coma Virusu”ＲＳＶ”）、およびメタトチオネインプ
ロモーター、例えばマウスメタロチオネイン−Ｉプロモ
ーターである。宿主細胞における発現に適当なベクター
およびプロモーターの選択は、周知の方法であり、発現
ベクターの構築、宿主へのベクターの導入および宿主で
の発現に必要な技法は、当該分野において容易な技法で
ある。

【００６９】本発明はまた、前記の構築物を含有する宿
主細胞にも関する。宿主細胞は、哺乳類細胞のようなよ
り高等な真核細胞、酵母才能のようなより下等な真核細
胞、または細菌細胞のような原核細胞であり得る。構築
物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフ
ェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェ
クション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、
エレクトロポレーション、トランスダクション、感染ま
たは他の方法によって成し遂げることができる。そのよ
うな方法は、多くの標準的研究室マニュアル、例えばDa
visら、BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY、（１９
８６）に記載されている。宿主細胞中の構築物は、伝統
的な方法において、組換え配列によってコードされる遺
伝子産物を生産するために使用できる。別法で、本発明
のポリペプチドを伝統的なペプチドシンセサイザーによ
って合成的に生産できる。

【００７０】成熟蛋白質は、適当なプロモーターの調節
下で、哺乳類細胞、酵母、細菌または他の細胞中で発現
できる。無細胞翻訳系もまた、本発明のＤＮＡ構築物由
来のＲＮＡを用いて、そのような蛋白質を生産するため
に使用することができる。原核生物および真核生物宿主
での使用のための適当なクローニングおよび発現ベクタ
ーは、Sambrookらによって記載されている。一般に、組
換え発現ベクターは、複製起点、下流の構造配列の転写
を指示するための高発現遺伝子由来のプロモーター、お
よびベクターに暴露後の細胞を含むベクターの単離を可
能にするための選択マーカーを包含するであろう。中で
も適当なプロモーターは、糖分解酵素、例えば、数ある
中でも３−ホスホグリセレートキナーゼ（”ＰＧ
Ｋ”）、α−因子、酸ホスファターゼ、および熱ショッ
ク蛋白質をコードする遺伝子由来のプロモーターであ
る。選択マーカーは、イー・コリのアンピシリン耐性遺
伝子およびエス・セレビシエ（S. cerevisiae）のｔｒ
ｐ１遺伝子を包含する。高等真核生物による本発明のポ
リペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー
配列のベクターへの挿入によって増加されうる。エンハ
ンサーは、与えられた宿主細胞型におけるプロモーター
の転写活性を増加させるように活動するＤＮＡのシス−
アクティングエレメント、通常約１０〜３００ｂｐであ
る。エンハンサーの例は、複製起点の後期側に１００〜
２７０ｂｐで位置するＳＶ４０エンハンサー、シトメガ
ロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の
後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイル
スエンハンサーを包含する。

【００７１】本発明のポリペプチドの悲相同性構造配列
をコードする本発明のポリヌクレオチドは、一般に、標
準技法を用いてベクターへ挿入され、それゆえ実施可能
に発現プロモーターと結合するであろう。ポリヌクレオ
チドは、転写開始部位が適当な５’〜リボソーム結合部
位に位置するように、位置付されるであろう。リボソー
ム結合部位は、発現のためにポリペプチドの転写を開始
する５’〜ＡＵＧであろう。一般に、開始コドン、通常
ＡＵＧ、およびリボソーム結合部位と開始コドンの間の
ｌｉｅといっしょに始まる他のオープンリーディングフ
レームは無いであろう。股、一般に、ポリペプチドの終
末に転写終止コドンおよび、転写起源の３’末端にて適
当に配列されたポリアデニル化シグナルならびに転写終
止シグナルが存在するであろう。翻訳蛋白質を小胞体内
腔、周辺腔または細胞外環境へ分泌するために、適当な
分泌シグナルを発現するポリペプチドへ組込むことがで
きる。シグナルは、ポリペプチドに対して内在性であっ
てもよく、または異種性のシグナルであってもよい。

【００７２】ポリペプチドは、融合蛋白質のような修飾
型で発現してもよく、分泌シグナルだけでなく付加異種
性機能領域も包含し得る。従って、精製またはその後の
処理および保存の間の宿主細胞中での安定性および持続
性を改善するために、例えば付加アミノ酸、特に電荷ア
ミノ酸領域をポリペプチドのＮ末端へ付加してもよい。
また精製を容易にするために、領域をポリペプチドに付
加してもよい。そのような領域は、ポリペプチドの最終
的な精製の前に除去できる。数あるなかで、分泌または
排出を生じるために、安定性を改善するために、および
精製を容易にするために、ペプチド部のポリペプチドへ
の付加は、当該分野においてよく知られていて、慣例の
技法である。本発明に従うポリヌクレオチドおよびポリ
ペプチドの伝播、維持または発現に適当な真核生物宿主
は、エスシェリシア・コリ（Escherichia coli）、バチ
ルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）およびサルモ
ネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）を包
含する。様々な種のシュードモナス（Pseudomonas）、
ストレプトミセス（Streptomyces）、およびスタフィロ
コッカス（Staphylococcus）もまた、この点における適
当な宿主である。さらに、当業者に周知の多くの他の宿
主もまた、この点において使用してもよい。

【００７３】代表例として、細菌に使用するための有効
な発現ベクターは、選択マーカーおよび、よく知られた
クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１
７）の遺伝学的エレメントからなる商業的に入手可能な
プラスミド由来の細菌の複製起点を含んでもよいが、そ
れに限定するものではない。そのような商業的なベクタ
ーは、例えばｐＫＫ２２３−３（Pharmacia Fina Chemi
cals, Uppsala, Sweden）およびＧＥＭ１（Promega Bio
tec, Madison, WI, USA）を包含する。これらのベクタ
ー、ｐＢＲ３２２「骨格」セクションは、発現するため
に、適当なプロモーターおよび構造配列と結合する。適
当な宿主株のトランスフォーメーションに従って、宿主
株は適当な細胞密度に生育する。選択したプロモーター
が誘導できる場所で、それは適当な方法（例えば、温度
シフトまたは化学的インデューサーへの暴露）によって
誘導し、細胞を、追加期間培養する。次いで、細胞は典
型的に、遠心分離、物理的または化学的方法による崩壊
によって回収し、得られる粗抽出物は、さらなる精製の
ために保持する。

【００７４】蛋白質の発現において使用される微生物細
胞は、凍結−解凍循環、音波処理、機械的崩壊、または
細胞溶菌試薬を包含するいずれかの簡便な方法によって
崩壊できる。そのような方法は、当業者に周知である。
同様に、様々な細胞培養系を発現に使用できる。哺乳類
発現系の例は、Gluzmanら、Cell、1984、23：175に記載
されたＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ヒト肝臓
２９３およびＢＨＫ細胞株、ならびにサル肝臓繊維芽細
胞のＣＯＳ−７株を包含するがそれに限定するものでは
ない。哺乳類発現ベクターは、複製起点、適当なプロモ
ーターおよびエンハンサー、ならびにいずれかの必要な
リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス
ドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列、および
発現に必要な５’フランキング非転写配列を含むであろ
う。ある好ましい具体例において、ＳＶ４０スプライス
部位およびＳＶ４０ポリアデニル化部位由来のＤＮＡ配
列は、必要な非転写遺伝学的エレメントに使用する。

【００７５】ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４ポリペプチド
は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈澱、酸抽出、
陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホス
ホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチ
ンクロマトグラフィーを包含する周知の方法によって、
組換え細胞から回収および精製できる。高速液体クロマ
トグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いるのが最も
好ましい。ポリペプチドが単離または精製中に変性した
場合、再び活性な立体配座にするために、蛋白質再生の
ための周知の技法を用いることができる。

【００７６】本発明のポリペプチドは当然、精製ポリペ
プチド、化学合成法によって製造されたポリペプチド、
および組換え技法によって、例えば細菌、酵母、高等植
物、昆虫および哺乳類細胞を包含する真核生物または原
核生物から製造されたポリペプチドを包含する。組み換
え製造法において使用される宿主に依存して、本発明の
ポリペプチドは、グリコシル化または非グリコシル化し
てもよい。さらに、本発明のポリペプチドは、開始修飾
メチオニン残基を、いくつかの場合、宿主媒介過程とし
て包含してもよい。ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４ポリヌ
クレオチドおよびポリペプチドは、本発明に従って、様
々な応用、特にＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４の化学的お
よび生物学的特質を利用するものに使用してもよい。付
加応用は、診断および細胞、組織ならびに器官の治療に
関する。本発明のこれらの態様は、以下の論議によって
さらに説明する。

【００７７】ポリヌクレオチドアッセイ 本発明はまた、使用のための相補的なポリヌクレオチド
を検出するために、例えば診断試薬おとしてのＭＡＤｒ
３またはＭＡＤｒ４ポリヌクレオチドの使用に関する。
機能不全に関連するＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４をコー
ドする遺伝子の突然変異型の検出は、ＭＡＤｒ３または
ＭＡＤｒ４の低発現、過剰発現もしくは変化した発現の
結果として起こる疾患の診断あるいは疾患に対する罹病
性を定義付ける助けとなる、または定義付けることがで
きる診断的手段を提供するであろう。そのような疾患
は、例えば、不適当な創傷、不適当な神経学的機能、視
覚障害、腎臓および肝臓障害、ならびに癌を包含する。

【００７８】ヒトＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４における
個々の突然変異は、様々な技法によってＤＮＡレベルで
検出できる。診断用核酸は、患者の細胞から、例えば血
液、尿、唾液、組織生検または解剖材料から得ることが
できる。ゲノムＤＮＡは直接、検出に使用してもよく、
または分析前にポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）［Saiki
ら、Nature, 324：163-166（1986）］を用いることによ
って酵素的に増幅してもよい。同一方法をまた、ＲＮＡ
またはｃＤＮＡに使用してもよい。例として、ＭＡＤｒ
３またはＭＡＤｒ４をコードする核酸に対して相補的な
ＰＣＲプライマーを使用して、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤ
ｒ４発現および突然変異を同定ならびに分析することが
できる。例えば、欠失および挿入は、正常な表現型と比
較した増幅産物の大きさの変化によって検出できる。点
突然変異は、増幅ＤＮＡを放射能ラベルＭＡＤｒ３また
あＭＡＤｒ４ＲＮＡあるいは、放射能ラベルＭＡＤｒ３
またはＭＡＤｒ４アンチセンスＤＮＡ配列とハイブリダ
イズすることによって同定できる。完全に対合した配列
は、ＲＮアーゼ消化により、または融解温度差により、
誤対合二重らせんから区別できる。

【００７９】対照遺伝子と突然変異を有する遺伝子間の
配列差もまた、直接ＤＮＡ配列決定することによって明
らかにできる。さらに、クローン化ＤＮＡ断片をプロー
ブとして使用し、特異的なＤＮＡ断片を検出してもよ
い。そのような方法の感受性は、ＰＣＲまたは他の増幅
法の適当な使用によって大いに増幅できる。例えば、配
列決定プライマーは、修飾ＰＣＲによって生じた二本鎖
ＰＣＲ産物または一本鎖鋳型分子と共に使用する。配列
決定は、放射能ラベルヌクレオチドを用いる常法によっ
て、または蛍光タグを用いる自動配列決定法によって行
う。ＤＮＡ配列差に基づく遺伝学的試験は、変性剤と共
にまたはなしで、ゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳
動の移動度の変化を検出することにより成し遂げ得る。
小配列欠失および挿入は、高分離ゲル電気泳動により視
覚化できる。異なる配列のＤＮＡフラグメントは、異な
るＤＮＡフラグメントの移動度が特異的融解または特異
的融解温度に従って、ゲル中の異なる場所で遅れる変性
ホルムアミド勾配ゲルで特徴付けることができる［例え
ば、Myersら、Sience, 230：1242（1985）参照］。特異
的部位での配列変化は、また、ヌクレアーゼ保護アッセ
イ、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的切断
法［例えば、Cottonら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
85：4397-4401（1985）］によって示され得る。

【００８０】従って、特異的ＤＮＡ配列の検出は、ハイ
ブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学的切断、直
接ＤＮＡ配列決定または制限酵素の使用（例えば、制限
フラグメント長多形（「ＲＦＬＰ」））およびゲノムＤ
ＮＡのサザンブロッティングのような方法によって成し
遂げ得る。本発明は、機能不全もしくは疾患に関連する
ＭＡＤ蛋白質に対する診断または罹病性の決定法を提供
し、機能不全は、特に前記のものを包含するがそれに限
定するものではない。ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４遺伝
子における突然変異は、そのような機能不全または、結
腸、胸部、肝臓、前立腺、腎臓および骨の癌を包含する
がそれに限定するものではない疾患に対する罹病性を示
し、前記の核酸配列は、そのような罹病性を確かめるた
めのアッセイにおいて使用してもよい。従って、例え
ば、アッセイは、前記の機能不全または疾患のいずれか
に対する罹病性を示す突然変異と共に、本明細書中の記
載のようなヒトＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４遺伝子にお
ける突然変異、例えば置換、欠失、先端切断、挿入、フ
レームシフトなどのような突然変異を決定するために行
われ得る。

【００８１】本発明は、そのような前記の疾患に関連す
るＭＡＤポリペプチドを診断するプロセスであって、図
１〜４［配列番号：１］、寄託ｃＤＮＡ、または図５お
よび６［配列番号：３および４］の配列を有するポリヌ
クレオチドの発現レベルを異常に減少または増加させた
患者由来の試料からの決定からなるプロセスを提供す
る。ポリヌクレオチドの発現を減少または増加は、ポリ
ヌクレオチドの定量法として当該分野において周知のい
ずれかの方法、例えばＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡアー
ゼ保護、ノーザンンブロッティングおよびその他のハイ
ブリダイゼーション法を用いて測定できる。より従来の
ゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、突然変異
もまたｉｎｓｉｔｕ分析によって検出できる。

【００８２】染色体アッセイ 本発明の配列はまた、染色体同定にも価値がある。配列
が特に標的とされ、個々のヒト染色体上の特別な場所で
ハイブリダイズできる。さらに、染色体上の特別な部位
を同定するために必要である。本当の配列データ（多形
の繰り返し）に基づく２〜３の染色体マーキング試薬
は、現在、染色体部位のマーキングに利用できる。本発
明に従う染色体に対するＤＮＡマッピングは、疾患に関
連する遺伝子を伴う配列に対応する重要な第一段階であ
る。要約すると、ｃＤＮＡからＰＣＲプライマー（好ま
しくは１５〜３０ｂｐ）を調製することによって、配列
を染色体に対してマッピングできる。３’非翻訳領域の
コンピューター分析は、１エキソン以上の範囲は増幅プ
ロセスを複雑にするプライマーなので、ゲノムＤＮＡ中
に１エキソン以上の範囲ではないプライマーを迅速に選
択うるために使用する。次いで、これらのプライマー
は、個々のヒト染色体を含有する体細胞ハイブリッドの
ＰＣＲスクリーニングに使用する。プライマーに対応す
るヒト遺伝子を含有するそれらのハイブリッドだけが、
増幅フラグメントを得るであろう。

【００８３】体細胞ハイブリッドのＰＣＲマッピング
は、特別なＤＮＡに特別な染色体を割り当てる迅速な方
法である。同じオリゴヌクレオチドプライマーと共に本
発明お用いて、類似法において、サブローカライゼーシ
ョンを特異的染色体パネルまたは巨大ゲノムクローンの
プールと共に成し遂げることができる。染色体に対する
マッピングと同様に使用できるその他のマッピング方法
は、染色体特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するため
の、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ラベルし
たフロー−分類（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体での
プレスクリーニングおよびハイブリダイゼーションによ
るプレ選抜を包含する。中期染色体拡散に対するｃＤＮ
Ａクローンの蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハブリダイゼーション
（ＦＩＳＨ）は、一段階の正確な染色体部位を提供する
ために使用できる。該技法は、５０〜６０塩基の短さの
ｃＤＮＡと共に使用できる。該技法の概説は、Verma
ら、HUMAN CHROMOSOMES：A MANUAL OF BASIC TECHNIQUE
S, PERGAMONPRESS, NEW YORK, 1988を参照とする。

【００８４】該技法をどのように行うかの例として、Ｍ
ＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４ＤＮＡを、ＱＩＡＥＸ ＩＩ
ＤＮＡ精製キット（QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA）
で消化および精製し、ならびにSuper Cos1コスミドベク
ター（STRATAGENE, La Jolla, CA）に対して接合する。
ＤＮＡは、Qiagenプラスミド精製キット（QIAGEN, In
c., Chatswoeth, CA）を用いて精製し、１ｍｇをBioNic
kラベリングキット（GibcoBRL, Life Technologies In
c., Gaithersburg, MD）を用いるビオチン−ｄＡＴＰ存
在下のニック翻訳によってラベルする。ビオチン化は、
GENE-TECT検出システム（CLONTECH Laboratories, Inc.
Palo Alto, CA）を用いて検出する。ｉｎ ｓｉｔｕハ
イブリダイゼーションは、ONCOR Light ハイブリダイゼ
ーションキット（ONCOR, Gaithersberg, MD）を用いて
スライド上で行い、中期染色体上の単一コピーを検出す
る。正常ドナーの周辺血液を３日間、２０％ＦＣＳ、３
％ＰＨＡおよびペニシリン／ストレプトマイシンで補わ
れたＲＰＭＩ１６４０中で培養し、１０〜７Ｍメトトレ
キサートで１７時間同時に処理し、補足なしのＲＰＭＩ
で二度洗浄する。次いで細胞を１０〜３Ｍチミジンで７
時間培養する。細胞は、コルセミド（０．５ｍｇ／ｍ
ｌ）で２０分培養後、中期で停止し、次いで３７℃で１
５分間７５ｍＭＫＣｌ中で低浸透性溶菌を行う。次いで
細胞ペレットを保持し、Carnoy固定液（３：１メタノー
ル／酢酸）中で固定する。

【００８５】中期スプレッド（spread）は、上清をスラ
イド上に滴下し、上清を空気乾燥することによって調製
される。ハイブリダイゼーションは、ブロッキングヒト
胎盤ＤＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ）と共に１０ｍｌのハイブリ
ダイゼーション反応液（５０％ホルムアミド、２ｘＳＳ
Ｃ、１％硫酸デキストラン）中に懸濁した１００ｎｇの
プローブを加えることによって行う。プローブ混合液を
７０℃のウォーターバス中で１０分間変性させ、３７℃
で１時間インキュベートし、７０℃にて７０％ホルムア
ミド／２ｘＳＣＣ中で予め変性させ、一連のエタノール
処理で脱水し、４℃に冷却し予め温めた（３７℃）スラ
イド上に置く。スライドは、加湿器中で３７℃にて１６
時間インキュベートする。スライドを４１℃で１０分
間、５０％ホルムアミド／２ｘＳＣＣおよび、３７℃で
７分間２ｘＳＣＣ中で洗浄する。ハイブリダイゼーショ
ンプローブは、製造者のプロトコールに従ってＦＩＴＣ
−アビジン（ONCOR, Gaithersberg, MD）でスライドを
インキュベートすることによって検出する。染色体は、
備え付けの培地で懸濁したプロプリジウムヨウ素で対比
染色する。スライドは、Leitz ORTHOPLAN ２−エピ蛍光
顕微鏡を用いて視覚化し、５個のコンピューター画像を
Imagenetics Computerおよびマッキントッシュプリンタ
ーを用いて得る。

【００８６】配列を正確な染色体部位に位置付けるとす
ぐに、染色体上での配列の物理的位置と遺伝子地図デー
タとの相互関係を明らかにできる。そのようなデータ
は、例えばV. McKusick、Mendelian Inheritance in Ma
n（Johns Hopkins UniversityWelch Medical Libraryを
通じてオンラインで利用できる)において見られる。遺
伝子と同じ染色体領域へ位置付けられた疾患の関係は、
次いで、結合分析（物理的に近接した遺伝子の共同遺
伝）を通じて同定する。次に、罹患した個体と罹患して
いない個体間のｃＤＮＡまたはゲノム配列における差異
を決定することが必要である。もし突然変異が罹患した
個体のいくつかまたは全てにおいて観察されるが、正常
な個体のいずれにおいても観察されないならば、そのと
き突然変異は疾患の作用因であるようである。物理学的
マッピングの現行の結果および遺伝子マッピング技法を
用いて、疾患と関連する染色体領域へ正確に位置付られ
たｃＤＮＡは、１メガ塩基マッピング結果および２０ｋ
ｂあたり１遺伝子と想定する５０〜５００の潜在的作用
因遺伝子の１つであるとされた。

【００８７】ポリペプチドアッセイ 本発明はまた、細胞および組織におけるＭＡＤｒ３また
はＭＡＤｒ４蛋白質の変化レベルを検出するための診断
アッセイにも関する。そのようなアッセイは、量的また
は質的であり得、従って、例えば、正常な対照組織試料
と比較したＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４蛋白質の過剰発
現を検出するための本発明に従う診断的アッセイは、癌
のようなある特定の疾患、およびその他の疾患状態の存
在を検出するために使用してもよい。宿主由来の試料中
での蛋白質、例えば本発明のＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ
４蛋白質レベルの決定に使用できるアッセイ技法は、当
業者に周知である。そのようなアッセイ法は、ラジオイ
ムノアッセイ、競合的結合アッセイ、ウェスタンブロッ
ト分析およびＥＬＩＳＡアッセイを包含する。これらの
なかでも、ＥＬＩＳＡが頻繁に好ましい。ＥＬＩＳＡア
ッセイは、初めに、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４に特異
的な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を調製するこ
とからなる。さらにレポーター抗体は、一般に、モノク
ローナル抗体と結合するものを準備する。レポーター抗
体は、検出可能な試薬、例えば、放射性、蛍光性または
酵素試薬、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素と結
合する。

【００８８】ＥＬＩＳＡを行うために、試料を宿主から
採取し、試料中の蛋白質が結合する個体支持体、例えば
ポリスチレン皿上でインキュベートする。次いで、皿上
のいずれの遊離蛋白質結合部位をも、非特異的蛋白質、
例えばウシ血清アルブミンでインキュベートすることに
よって覆う。次いで、モノクローナル抗体をモノクロー
ナル抗体がポリスチレン皿に結合したＭＡＤｒ３または
ＭＡＤｒ４蛋白質との結合に要する時間、皿中でインキ
ュベートする。非結合モノクローナル抗体を緩衝液で洗
い去る。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したレポー
ター抗体を皿に置き、その結果、レポーター抗体がＭＡ
Ｄｒ３またはＭＡＤｒ４と結合したいずれのモノクロー
ナル抗体にも結合する。次いで、非結合レポーター抗体
を洗い去る。次に、比色基質を包含するペルオキシダー
ゼ活性のための試薬を皿に加える。一次および二次抗体
によってＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４に結合した固定化
ペルオキシダーゼは、比色反応産物を生産する。与えら
れた時間中に生じた色量は、試料中のＭＡＤｒ３または
ＭＡＤｒ４蛋白質の存在量を示す。定量結果は、典型的
に、標準曲線に対する対照によって得られる。

【００８９】競合アッセイは、また、宿主由来の試料中
における本発明のポリペプチドレベルを決定するために
も使用できる。そのようなアッセイは、本発明のポリペ
プチドを含有するまたは過剰発現する細胞質蛋白質の単
離からなる。次いで、ラベルした本発明のポリペプチド
を含有する試験試料を、精製細胞質蛋白質に加え、次に
定めた時間インキュベートする。また、本発明のポリペ
プチドを含有すると思われる宿主由来の試料を反応混合
液に加える。次いで、迅速に洗浄する反応混合液をフィ
ルターに通し、次に、放射能を測定して、ポリペプチド
に対する競合量、従って、試料中の本発明のポリペプチ
ド量を決定する。別の競合アッセイは、保持体に結合し
ているＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４に特異的な抗体を伴
い、ラベルしたＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４および宿主
由来の試料は、保持体を通過する。検出した保持体に結
合したラベル量は、試料中のＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ
４の量に関係し得る。

【００９０】抗体 ポリペプチド、それらのフラグメントまたは他の誘導
体、あるいはその類似体、あるいはそれらを発現する細
胞もまた、それらの抗体を製造するために、免疫源とし
て使用できる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナ
ルまたはモノクローナル抗体であり得る。本発明はま
た、キメラ、一本鎖、およびヒト化抗体、ならびにＦａ
ｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの作製
をも包含する。当該分野に周知の様々な方法をそのよう
な抗体およびフラグメントの製造に使用してもよい。本
発明の配列に対応するポリペプチドに対して生じた抗体
は、ポリペプチドを動物に直接注射することによって、
またはポリペプチドを動物、好ましくはヒト以外に投与
することによって得ることができる。次いで、そのよう
にして得られた抗体は、ポリペプチド自体を結合するで
あろう。この方法において、ポリペプチドのフラグメン
トのみをコードする配列を、全ての天然ポリペプチドを
結合する抗体の生産に使用できる。次いで、そのような
抗体は、ポリペプチドを発現する組織からのポリペプチ
ドの単離に使用できる。

【００９１】モノクローナル抗体の場合、連続細胞株培
養によって製造される抗体を提供するいずれの技法も使
用できる。例は、ハイブリドーマ技術［G. Kohler and
C. Milstein, Nature, 256：495-497（1975）］、トリ
オーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術［Kozbor
ら、Immunology Today, 4：72（1983）］、およびＥＢ
Ｖ−ハイブリドーマ技術［Coleら、MONOCLONAL ANTIBOD
IES AND CANCER THERAPY, pg. 77-96, Alan R. Liss, I
nc.,（1985）］を包含する。一本鎖抗体の製造のために
記載された技術［米国特許第４９４６７７８号］を用い
て、本発明の免疫原ポリペプチド産物に対する一本鎖抗
体を産生することができる。また、トランスジェニック
マウス、または他の哺乳類を包含する他の生物を用い
て、本発明の免疫原ポリペプチド産物に対するヒト化抗
体を発現させることができる。

【００９２】前記の抗体を用いて、本発明のポリペプチ
ドを発現するクローンを単離または同定することがで
き、あるいは、アフィニティークロマトグラフィーによ
り単離および／または精製のための保持体への該抗体の
結合により該ポリペプチドを精製することができる。Ｍ
ＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４に対する抗体はまた、なかで
も本明細書中に前記した疾患のような機能不全または疾
患を抑制するために使用し得る。多くのタイプの癌細胞
が、腫瘍形成または過形成のプロセスの間、ＴＧＦ−β
ファミリーの様々なメンバーをアップレギュレートする
ので、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４に特異的な抗体は、
癌の診断および治療に利用できる。これらの抗体は、Ｔ
ＧＦ−βの活性にシグナルを送るＭＡＤ蛋白質と結合
し、ＭＡＤ蛋白質を不活性化する。本発明のＭＡＤポリ
ペプチドに対するモノクローナル抗体は、過形成および
腫瘍形成成長異常を包含する（しかし、限定するもので
はない）ある特定の障害の診断および治療の両方に使用
することができる。腫瘍形成組織による成長因子発現の
アップレギュレーションは、影響をうけた患者の血液中
の成長因子の増加を検出する様々な血清アッセイの基礎
を形成する。これらのアッセイは、典型的に診断的設定
に適用するでけでなく、同様に予知的設定（外科、化学
療法等に従って、隠れた腫瘍細胞の存在を検出するため
に）にも適用する。

【００９３】ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４結合分子およ
びアッセイ ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４は、それと相互作用する蛋
白質の単離に使用でき；該相互作用は干渉のための標的
でありえる。ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４と他の因子間
の蛋白質−蛋白質相互作用の阻害剤は、ＭＡＤｒ３また
はＭＡＤｒ４活性の調節のための医薬的試薬の発展を導
くことができる。従って、本発明はまた、ＭＡＤｒ３ま
たはＭＡＤｒ４と結合する分子の同定方法も提供する。
ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４と結合する分子のための蛋
白質をコードする遺伝子は、当業者にたって周知の多く
の方法、例えば、リガンドパンニング（Ligand-pannin
g）およびＦＡＣＳソーティング（FACS sorting）によ
って同定できる。そのような方法は、多くの研究室マニ
ュアル、例えばColiganら、CURRENT PROTOCOLS IN IMMU
NOLOGY 1，Chapter 5（1991）において記載されてい
る。

【００９４】例えば、酵母２ハイブリッド系は、転写活
性化剤の活性の再構成を用いて、第一試験蛋白質と第二
試験蛋白質間のイン・ビボでの相互作用を検出する方法
を提供する。該方法は、米国特許第５２８３１７３号に
おいて記載されており、試薬はClontechおよびStratage
neから入手可能である。要約すると、ＭＡＤｒ３または
ＭＡＤｒ４ｃＤＮＡは、Ｇａｌ４転写因子ＤＮＡ結合ド
メインと融合し、酵母細胞内で発現する。関連細胞から
得たＤＮＡライブラリーメンバーは、Ｇａｌ４のトラン
ス活性化ドメインと融合する。ＭＡＤｒ３またはＭＡＤ
ｒ４と相互作用することができる蛋白質を発現するｃＤ
ＮＡクローンは、Ｇａｌ４活性の再構成およびＧａｌ１
−ｌａｃＺのようなリポーター遺伝子の発現のトランス
活性化を導くであろう。

【００９５】別法では、ラムダｇｔ１１またはラムダＺ
ＡＰ（Stratagene）のスクリーニングあるいは組換えＭ
ＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４と等価のｃＤＮＡ発現ライブ
ラリーを含む。組換えＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４蛋白
質あるいはそのフラグメントは、ＦＬＡＧ、ＨＳＶまた
はＧＳＴのような小ペプチドタグと融合する。ペプチド
タグは、心筋クレアチンキナーゼのようなキナーゼに都
合のよいリン酸化部位を有し得、またはそれらはビオチ
ン化し得る。組換えＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４は、³²
［Ｐ］でリン酸化でき、あるいはストレプトアビジンま
たはタグに対する抗体で標識せずに、検出に使用でき
る。ラムダｇｔ１１ｃＤＮＡ発現ライブラリーは、関連
細胞から作製し、組換えＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４で
インキュベトし、洗浄して、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ
４と相互作用するｃＤＮＡクローンを単離する。そのよ
うな方法は、当業者によって普通に行われる。例えば、
Sambrookら参照。

【００９６】別の方法は、哺乳類発現ライブラリーのス
クリーニングである。この方法において、ｃＤＮＡは、
哺乳類プロモターとポリアデニル化部位間のベクター中
でクローン化し、ＣＯＳまたは２９３細胞中で一時的に
トランスフェクトされる。４８時間後、結合蛋白質は、
ラベルしたＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４で固定および洗
浄した細胞のインキュベーションによって検出する。好
ましい具体例において、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４を
ヨウ素化し、いずれかの結合したＭＡＤｒ３またはＭＡ
Ｄｒ４をオートラジオグラフィーによって検出する。Si
msら、Science,1988，241：585-589およびMcMahanら、E
MBO J., 1991, 10：2821-2832を参照。該方法におい
て、関係する結合蛋白質ゐコードするｃＤＮＡを含むｃ
ＤＮＡのプールを選択でき、関係するｃＤＮＡを各プー
ルのさらなる細分によって、次いで一過性トランスフェ
クション、結合およびオートラジオグラフィーの循環に
よって単離することができる。別法では、関係するｃＤ
ＮＡを全ｃＤＮＡライブラリーの哺乳類細胞へのトラン
スフェクションおよび、プレートに結合したＭＡＤｒ３
またはＭＡＤｒ４を含む皿上における細胞のパンニング
によって単離することができる。洗浄後に付着する細胞
を溶菌し、プラスミドＤＮＡを単離し、細菌中で増幅
し、およびトランスフェクションならびにパンニング
は、単一ｃＤＮＡクローンが得られるまで繰り返す。Se
edら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987,84：3365お
よびAruffoら、EMBO J., 1987, 6：3313を参照。もし
も、結合タンパク質が分泌するならば、一度、結合また
は中和アッセイが一過性トランスフェクト細胞由来の上
清をアッセイするために確立すると、そのｃＤＮＡを同
様なプーリング策法によって得ることができる。上清を
スクリーニングするための一般的な方法は、Wongら、Sc
ience, 1985, 228：810-815に開示されている。

【００９７】別の方法は、直接的に細胞由来のＭＡＤｒ
３またはＭＡＤｒ４と相互作用する蛋白質の単離を含
む。ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４とＧＳＴまたは小さい
ペプチドタグとの融合蛋白質は、ビーズ上で作られ、固
定される。関係細胞由来の生合成的にラベルしたまたは
ラベルしない蛋白質抽出物を調製し、ビーズといっしょ
にインキュベートし、緩衝液で洗浄する。ＭＡＤｒ３ま
たはＭＡＤｒ４と相互作用する蛋白質を特別にビーズか
ら溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。結合パ
ートナー一次アミノ酸配列データを、微量配列決定によ
って得る。任意に、細胞を細胞蛋白質のチロシンリン酸
化のような機能応答を誘発する試薬で処理することがで
きる。そのような試薬の例は、成長因子またはインター
ロイキン−２のようなサイトカインであろう。別の方法
は、免疫アフィニティー精製である。組み換えＭＡＤｒ
３またはＭＡＤｒ４をラベルしたまたはラベルしない細
胞抽出物といっしょにインキュベートし、抗−ＭＡＤｒ
３またはＭＡＤｒ４抗体で免疫沈殿させる。免疫沈殿物
を蛋白質Ａ−Sepharoseで回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よって分析する。ラベルしない蛋白質をビオチン化によ
ってラベルし、ストレプトアビジンを含むＳＤＳゲル上
で検出する。結合パートナー蛋白質を微量配列決定によ
って分析する。さらに、当業者に周知の標準生化学的精
製段階を微量配列決定の前に行ってもよい。

【００９８】また別の別法は、結合パートナーのペプチ
ドライブラリーのスクリーニングを含む。組み換えタグ
したまたはラベル化ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４を使用
して、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４と相互作用するペプ
チドまたはリン酸ペプチドライブラリーからペプチドを
選択する。ペプチドの配列決定は、相互作用する蛋白質
において発見し得る共通ペプチド配列の同定を導く。当
業者に周知のこれらの方法または他の方法のいずれかに
よって同定されたＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４結合パー
トナーならびに、前記で論じたそれらの推定結合パート
ナーを本発明のアッセイ法に使用することができる。Ｍ
ＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４／結合パートナー複合体の存
在のアッセイは、例えば、酵母２ハイブリッド系、ＥＬ
ＩＳＡまたは該複合体に特異的な抗体を使用する免疫ア
ッセイによって成し遂げることができる。ＭＡＤｒ３ま
たはＭＡＤｒ４／結合パートナー相互作用形成を妨害す
るまたは阻害する試験物質の存在下で、複合体量の減少
は、試験物質非存在下での対照と比較して決定されよ
う。

【００９９】遊離のＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４あるい
は結合パートナーのアッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡま
たは特異的抗体を用いる免疫アッセイによって、または
放射能ラベルしたＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４の細胞ま
たは細胞膜とのインキュベーション、次いで遠心分離も
しくはフィルター分離工程によって成し遂げることがで
きる。ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４／結合パートナー相
互作用形成を妨害するまたは阻害する試験物質の存在下
で、遊離のＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４あるいは遊離の
結合パートナー量の増加は、試験物質非存在下での対照
と比較して決定されるであろう。本発明のポリペプチド
はまた、細胞または細胞−遊離試料におけるＭＡＤｒ３
またはＭＡＤｒ４結合分子のＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ
４結合能力を評価するために使用することができる。例
えば、本発明のＭＡＤ蛋白質がシグナル試薬であるため
のレセプターを発現する悪性細胞は、ラベルしたＭＡＤ
ｒ３またはＭＡＤｒ４をレセプター結合アッセイに使用
することによって、またはレセプター自体に対する抗体
の使用によって検出し得る。細胞は、ＭＡＤポリペプチ
ドのレセプターの存在および密度に従って、特徴付けら
れ得、それにより、本発明のＭＡＤポリペプチドの生物
学的活性に対するかかる細胞の感受性を予測する方法を
提供する。

【０１００】アゴニストおよびアンタゴニスト−アッセ
イおよび分子本発明のＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４は、
本発明のＭＡＤポリペプチドの活性化（アゴニスト）ま
たは活性阻害する（アンタゴニスト）化合物のためのス
クリーニングプロセスに使用してもよい。一の方法は、
ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４−仲介ｃＡＭＰおよび／ま
たはアデニレートシクラーゼ蓄積の阻害または刺激を決
定することによるＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４阻害剤の
スクリーニングを含む。そのような方法は、真核細胞を
ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４でトランスフェクトして、
ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４を発現することを含む。次
いで、細胞をＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４の存在下で潜
在的アンタゴニストに暴露する。次いで、ｃＡＭＰ蓄積
量を測定する。もしも、潜在的アンタゴニストがＭＡＤ
ｒ３またはＭＡＤｒ４に結合するならば、従ってＭＡＤ
ｒ３またはＭＡＤｒ４結合を阻害するならば、ＭＡＤｒ
３またはＭＡＤｒ４−仲介ｃＡＭＰ、またはアデニレー
トシクラーゼ活性レベルは、減少または増加するであろ
う。

【０１０１】ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４の阻害剤を検
出するためのまた別の方法は、実施例５のFLASHPLATE酵
素アッセイフォーマットであり、それは、ＭＡＤ蛋白質
およびそのＴＧＦ−βレセプター間のリン酸化反応を測
定する。本発明のＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４のアゴニ
ストまたはアンタゴニストを検出するための他の方法
は、米国特許第５４８２８３５号に記載の技術に基いた
酵母を包含する。潜在的ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４ア
ンタゴニストの例は、抗体またはいくつかの場合、ＭＡ
Ｄｒ３またはＭＡＤｒ４に結合するがセカンドメッセン
ジャー応答を顕在化せず、その結果ＭＡＤｒ３またはＭ
ＡＤｒ４の活性を阻害するオリゴヌクレオチドを包含す
る。潜在的アンタゴニストはまた、ＭＡＤｒ３またはＭ
ＡＤｒ４のリガンド、すなわち、リガンドのフラグメン
トに密接に関係する蛋白質を包含し、該蛋白質は、生物
学的機能を失っており、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４に
結合するとき、何の応答も顕在化しない。

【０１０２】潜在的アンタゴニストはまた、アンチセン
ス技法の使用によって調製したアンチセンス構築物を包
含する。アンチセンス技法は、３重ヘリックス形成また
はアンチセンスＤＮＡもしくはＲＮＡを通して、遺伝子
発現の調節に使用でき、どちらの方法も、ポリヌクレオ
チドのＤＮＡまたはＲＮＡへの結合に基づいている。例
えば、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌク
レオチド配列の’５コーディング部位は、長さ約１０〜
４０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの
設計に使用する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に
伴われる遺伝子領域（３重ヘリックス）に相補的である
ように設計され［Leeら、Nucl. acids Res., 6：3073(1
979)；Cooneyら、Science, 241：456(1988)；およびDer
vanら、Science, 251：1360(1991)］、それにより、Ｍ
ＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４の転写および産生を阻害す
る。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮ
Ａに対してｉｎ ｖｉｖｏでハイブリダイズし、ｍＲＮ
Ａ分子のＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４（アンチセンス）
への翻訳をブロックする［Okano, J. Neurochem., 56：
560(1991)；およびOLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENS
E INHIBITORS OF GENEEXPRESSION, CRC Press, Boca Ra
ton, FL(1988)］。前記のオリゴヌクレオチドはまた、
細胞へ運搬され、その結果アンチセンスＲＮＡまたはＤ
ＮＡがｉｎ ｖｉｖｏで発現し、ＭＡＤｒ３またはＭＡ
Ｄｒ４の産生を阻害し得る。

【０１０３】別の潜在的アンタゴニストは、ＭＡＤｒ３
またはＭＡＤｒ４に結合して、リガンドに近付きがたく
して、その結果生物学的活性を阻害する小型分子であ
り。小型分子の例は、小型ペプチドまたはペプチド様分
子を包含するが、それに限定するものではない。小型分
子はまた、レセプターまたは相互作用蛋白質をＭＡＤポ
リペプチドに結合して、結合を阻害し得る。小型分子の
例は、小型ペプチドまたはペプチド様分子を包含する
が、それに限定するものではない。潜在的アンタゴニス
トはまた、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４のフラグメント
を包含し、それは、リガンドに結合し、リガンドが細胞
質ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４と相互作用しないように
する。ＭＡＤ蛋白質は、哺乳類宿主中のいたるところに
偏在し、多くの病状を包含する多くの生物学的機能の仲
介の原因である。従って、一方ではＭＡＤｒ３またはＭ
ＡＤｒ４を刺激し、他方ではＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ
４の機能を阻害することができる化合物および薬剤を見
付けることが望ましい。一般に、ＭＡＤｒ３またはＭＡ
Ｄｒ４のためのアゴニストまたはアンタゴニストは、数
ある中でも前記したような疾患または障害の治療および
予防目的に使用する。

【０１０４】本発明は、さらに、過剰なＭＡＤｒ３また
はＭＡＤｒ４活性に関する異常な状態の治療方法であっ
て、患者に前記の阻害化合物（アンタゴニスト）を医薬
上許容される担体といっしょに、ＭＡＤｒ３またはＭＡ
Ｄｒ４に対するリガンドの結合をブロックすることによ
って、または第二シグナルを阻害することによって活性
化を阻害するのに充分な量を投与し、それにより以上な
状態を緩和することからなる方法を提供する。本発明は
また、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４の低発現およびその
活性に関連する異常な状態を治療する方法であって、患
者に前記の本発明のＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４ポリペ
プチドを活性化する充分量の化合物を医薬上許容される
担体と組み合わせて投与して、異常な状態を緩和するこ
とからなる方法を提供する。本発明のポリペプチドは、
レセプターの特徴付に使用し得る。ＴＧＦ−βレセプタ
ーは、現在、ＢＭＰ２／ＢＭＰ４、およびＴＧＦ−１か
ら−３レセプターを包含する。これらの分子は、様々な
診断および治療の指標に有用である。ＭＡＤｒ３／ＭＡ
Ｄｒ４ポリペプチドは、１またはそれ以上のこれらのレ
セプターならびに、さらに同定された新たなＴＧＦ−型
レセプターのシグナリング経路成分のようである。ＭＡ
Ｄｒ３／ＭＡＤｒ４ポリペプチドの使用は、かかるレセ
プターの同定、特徴付けおよびクローニングを助ける。

【０１０５】本発明のポリペプチドはまた、創傷または
他の損傷を与える病状（例えば、ＡＩＤＳ痴呆、老人性
痴呆など）の結果として減じられた神経学的機能の回復
または亢進にも使用し得る。従って、神経学的機能が減
じられる例において、本発明のペプチドあるいは、ＭＡ
Ｄｒ３またはＭＡＤｒ４発現を刺激もしくは阻害する化
合物の投与は、脳を刺激し、適当な整理学的機能を亢進
し得る。ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４はまた、視覚障
害、例えば、角膜炎症の治療に使用し得る。さらに、Ｔ
ＧＦ−β成長因子の標的細胞に対する特異性は、標的細
胞を崩壊するメカニズムとして利用することができる。
例えば、ＭＡＤｒ３／ＭＡＤｒ４ポリペプチドを毒性分
子：例えば、標的細胞を不活性化する放射性医薬品に結
合することができる（たいへん多くの方法によって）。
これらの成長因子−毒素融合は、標的細胞（およびある
特定の場合、様々な「側に位置するもの（bystande
r）］効果によって隣接する細胞）を殺す。そのような
毒素−融合遺伝子の最近の例は、Mesriら、J. Biol. Ch
em. 268：4853-62(1993)によって出版されている。ＭＡ
Ｄｒ３／ＭＡＤｒ４ポリペプチドおよび関連する分子は
また、リポソームにおいてカプセルに包まれ、腫瘍また
は細胞特異的抗原に対して認められ、結合する抗体と共
役し、それにより細胞を「標的とする」方法を提供す
る。

【０１０６】この同じ方法において、ＴＧＦ−βファミ
リーのメンバーは、抗−増殖効果を形質転換細胞上で示
すので、ＭＡＤｒ３／ＭＡＤｒ４ポリペプチドは、抗悪
性腫瘍化合物として使用できる。ＭＡＤｒ３／ＭＡＤｒ
４ポリペプチドまたは同じもののアゴニスト／アンタゴ
ニストはまた、ある特定の腎臓障害または癌を治療する
ために使用し得る。従って、これらの因子は、該臓器の
適当な生理学的維持を必要とし得る。ＭＡＤｒ３／ＭＡ
Ｄｒ４ポリペプチドまたはペプチド、あるいはそのアゴ
ニストもしくはアンタゴニストである化合物を包含する
有意な治療は、創傷治癒に関する。本発明のこれらの組
成は、実質上全ての皮膚創傷、角膜創傷、および体の上
皮線中空器官に対する傷を包含する非常に多くの創傷の
治療に使用し得る。治療に適する創傷は、外傷、例え
ば、やけど、擦傷および切傷由来の創傷、ならびに外科
方法、例えば外科切開および皮膚移植由来の創傷を包含
する。本発明のポリペプチドでの治療に適する他の状態
は、慢性状態、例えば慢性潰瘍、および他の非治癒（栄
養を必要とする）状態を包含する。

【０１０７】ＭＡＤｒ３／ＭＡＤｒ４ポリペプチドはま
た、終末分化に関する応用にも使用し得る。該特性は、
ポリペプチド／アゴニスト／アンタゴニストを投与し、
標的細胞死を誘発することによって、ｉｎ ｖｉｖｏで
利用することができる。該摂生は、障害と考えられる状
態下で、医学的に望ましくない細胞型、例えば癌の過度
な増殖および他の増殖障害（例えば、炎症、乾癬など）
に関する。

【０１０８】組成物およびキット これらのＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４ポリペプチド、お
よびかかるＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４を活性化または
阻害する化合物は、適当な医薬上、生理学上許容される
担体と組み合わせて使用してもよい。かかる組成物は、
治療的に効果量のポリペプチドまたは化合物、および医
薬上許容される担体または賦形剤を含む。かかる担体
は、セーライン、リン酸塩、緩衝化セーライン、デキス
トロース、滅菌水、グリセロール、エタノール、および
それらの組み合わせを包含するが、これらに限定するも
のではない。処方は、投与法に適したものにすべきであ
る。投与法に従う適当な担体の選択は、当業者によって
ごく普通に行われている。本発明は、さらに、本発明の
前記の組成物成分を１またはそれ以上を充填した１また
はそれ以上の容器を含む医薬用パックおよびキットに関
する。

【０１０９】投与 ある特定の疾患病状は、本発明のＭＡＤｒ３／ＭＡＤｒ
４ポリペプチドの全身臨床投与によって、部分的にまた
は完全に改善し得る。該投与は、遺伝子治療（下記参
照）の形であり得；あるいは、ＭＡＤｒ３／ＭＡＤｒ４
ＤＮＡの組み換え構築物から合成した、またはペプチド
化学的合成（Wooら、Protein Engineering3：29-37(198
9)）由来のＭＡＤポリペプチドアゴニストまたはアンタ
ゴニストの投与であり得る。ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ
４を活性化もしくは阻害する本発明のポリペプチドおよ
び他の化合物は、単独で、または他の化合物、例えば治
療用化合物と組み合わせて用いてもよい。

【０１１０】医薬組成物は、いずれかの有効な、都合の
よい方法、例えば、なかでも局所、経口、経肛門、経
膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮
膚内の経路で投与できる。医薬組成物は、一般に、特異
的な兆候または兆候の治療あるいは予防に効果的な量を
投与する。主題のポリペプチドまたは化合物の使用量
は、投与法、他の活性化合物の使用などで変化し、一般
に、１μｇ〜１００μｇであろう。使用した化合物量
は、主題のポリペプチドを含有する主題のポリペプチド
または処方に対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞応答およ
び実験動物の応答に基づいて、経験的に決定されるであ
ろう。一般に、組成物を少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体
重の量で投与する。最も多い場合では、それらを１日あ
たり約８ｍｇ／ｋｇ体重の量で投与する。好ましくは、
ほとんどの場合、投与量は、１日に約１０μｇ／ｋｇ〜
１ｍｇ／ｋｇ体重である。最適な投与量を各治療様相お
よび兆候のための標準法によって、兆候、その激烈、投
与経路、悪化している状態などを考慮に入れて決定する
ことが適当であろう。

【０１１１】遺伝子治療 ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４ポリヌクレオチド、ポリペ
プチド、ポリペプチドであるアゴニストおよびアンタゴ
ニストは、本発明に従って、しばしば「遺伝子治療」と
称される治療様相におけるかかるポリペプチドの発現に
よって使用し得る。従って、例えば、患者由来の細胞を
ポリヌクレオチド、例えばＤＮＡまたはＲＮＡで操作し
て、ｅｘ ｖｉｖｏでポリペプチドをコードすることが
できる。操作した細胞は、次いで、患者に該ポリペプチ
ドでの治療を提供することができる。該具体例におい
て、細胞をｅｘ ｖｉｖｏで、例えば、本発明のポリペ
プチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプ
ラスミドベクターの使用によって操作することができ
る。かかる方法は、当該分野においてよく知られてお
り、本発明におけるそれらの使用は、本明細書中の技法
から明らかである。

【０１１２】同様に、細胞をｉｎ ｖｉｖｏでのポリペ
プチドの発現のために、当該分野において公知の方法に
よってｉｎ ｖｉｖｏで操作してもよい。例えば、本発
明のポリペプチドを前記のように、複製欠損レトロウイ
ルスベクターにおける発現のために操作してもよい。レ
トロウイルス発現構築物を次いで、単離する。パッケー
ジング細胞を本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡ
を含有するレトロウイルスプラスミドベクターで形質導
入し、その結果、パッケージング細胞は、関係遺伝子を
含有する感染性ウイルス粒子を産生する。これらのプロ
デューサー細胞をｉｎ ｖｉｖｏでの細胞操作およびｉ
ｎ ｖｉｖｏでのポリペプチド発現の目的で、患者に投
与してもよい。本発明のポリペプチドを投与するこれら
のおよび他の方法は、本発明の教示から当業者に明らか
にされるべきである。

【０１１３】本明細書中に前記したレトロウイルスプラ
スミドベクターを誘導し得るレトロウイルスは、モロニ
ーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、ラウス肉腫
ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、ニワトリ白血病ウイ
ルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイル
ス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および
乳癌ウイルスを包含するが、それらに限定するものでは
ない。好ましい具体例において、レトロウイルスプラス
ミドベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスから誘
導される。かかるベクターは、ポリペプチドを発現する
ための１またはそれ以上のプロモーターを包含するであ
ろう。使用に適当なプロモーターは、Millerら、Biotec
hniques, 1989, 7：980-990に記載のレトロウイルスＬ
ＴＲ；ＳＶ４０プロモーター；およびヒトシトメガルウ
イルス（ＣＭＶ）プロモーターを包含するが、それらに
限定するものではない。ヒストン、ＲＮＡポリメラーゼ
ＩＩＩ、およびβ−アクチンプロモーターを包含するが
それらに限定するものではない真核細胞プロモーターの
ような細胞プロモーターもまた、使用できる。使用して
もよいさらなるウイルスプロモーターは、アデノウイル
スプロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモータ
ー、およびＢ１９パルボウイルスプロモーター、および
Ｂ１９パルボウイルスプロモーターを包含するが、それ
らに限定するものではない。適当なプロモーターの選択
は、本明細書に含まれる技術から当業者に明らかであろ
う。

【０１１４】本発明のポリペプチドをコードする核酸配
列は、適当なプロモーターの調節下におかれるであろ
う。使用してもよい適当なプロモーターは、アデノウイ
ルスプロモーター、例えばアデノウイルス主要後期プロ
モーター（adenoviral major late promoter）；または
非相同プロモーター、例えばシトメガロウイルス（ＣＭ
Ｖ）プロモーター；呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）プ
ロモーター；誘導プロモーター、例えばメタロチオネイ
ンプロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミン
プロモーター；アポＡＩプロモーター；ヒトグロビンプ
ロモーター；ウイルス性チミジンキナーゼプロモータ
ー、例えば単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ
ー；レトロウイルスＬＴＲ（修飾した前記のＬＴＲを包
含する）；β−アクチンプロモーター；およびヒト成長
ホルモンプロモーターを包含するが、それらに限定する
ものではない。プロモーターはまた、ポリペプチドをコ
ードする遺伝子を調節する天然プロモーターであっても
よい。

【０１１５】レトロウイルスプラスミドベクターは、パ
ッケージング細胞を形質導入して、プロデューサー細胞
株を形成するために使用する。トランスフェクトされる
パッケージング細胞の例は、Miller, A.、Human Gene T
herapy, 1990, 1：5-14に記載のような、ＰＥ５０１、
ＰＡ３１７、Ψ−２、Ψ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１
４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ΨＣＲＥ、ΨＣＲＩ
Ｐ、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＮＡ細胞株を包含
するが、それらに限定するものではない。ベクターは、
当該分野で公知のいずれかの方法によって、パッケージ
ング細胞へ導入することができる。かかる方法は、エレ
クトロポーレーション、リポソームの使用、およびＣａ
ＰＯ₄沈殿を包含するが、それらに限定するものではな
い。一の別法で、レトロウイルスプラスミドベクターを
リポソーム中に入れる、または脂質に結合して、次いで
宿主へ投与してもよい。

【０１１６】プロデューサー細胞株は、ポリペプチドを
コードする核酸配列を包含する感染性レトロウイルスベ
クター粒子を生じるであろう。かかるレトロウイルスベ
クター粒子を次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏかまたはｉｎ
ｖｉｖｏのいずれかで、真核細胞を導入するために使用
することができる。導入した真核細胞は、ポリペプチド
をコードする核酸配列を発現するであろう。導入されて
もよい真核細胞は、胚性幹細胞、胚性癌腫細胞、ならび
に造血幹細胞、肝細胞、繊維芽細胞、筋芽細胞、角化細
胞、内皮細胞、および気管支上皮細胞を包含するが、そ
れらに限定するものではない。

【０１１７】

【実施例】本発明はさらに、特別な具体例を言及するこ
とによって本発明を説明するためにだけ提供される以下
の実施例によって記載される。これらの実施例は、開示
した発明の範囲を限定せず、または制限しない。本明細
書中で使用されるある特定の用語は、前記の用語集で説
明している。全ての実施例は、別に詳細に記載した場合
をの除いて、当業者に周知のありきたりの標準法を用い
て行う。以下の実施例のごく普通の分子生物学技術は、
標準研究室マニュアル、例えば、Sambrookらの記載に従
って行うことができる。以下の実施例に示す全てまたは
量は、特記しないかぎり、重量である。別に述べないか
ぎり、下記実施例におけるフラグメントのサイズ分離
は、Sambrookらおよび他の多くのリファレンス、例えば
D. Goeddelら、Nucleic Acids Res., 1980, 8：4057に
記載のように、アガロースおよびポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（「ＰＡＧＥ」）の標準法（すなわち、８％
ポリアクリルアミドゲルを用いて）を用いて行われる。
別に記載しないかぎり、連結反応は、標準緩衝液、イン
キュベーション温度および時間、例えば、連結されるた
めに約同モル量のＤＮＡフラグメント０．５μｇあたり
約１０ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）
を用いて成し遂げられる。

【０１１８】実施例１−哺乳類細胞におけるＭＡＤｒ３
またはＭＡＤｒ４の発現 発現プラスミド、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４ＨＡを、
ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４をコードするｃＤＮＡの発
現ベクターｐＣＤＮへのクローニングによって作製し得
る［N. Aiyarら、Mol. Cell. Biochem., 131：75-86(19
94)、本明細書中にリファレンスによって示される］。
クローニングに適当な制限酵素および技法の選択は、当
業者に周知である。

【０１１９】発現ベクターｐＣＤＮは： （１）配置されたヒトシトメガロウイルス（ＣＭＶ）プ
ロモーター、ウシ成長ホルモン３’フランキング配列、
ポリリンカー、ＳＶ４０イントロン、およびポリアデニ
ル化シグナルを含有し、その結果、ｃＤＮＡをＣＭＶプ
ロモーターの調節下で都合よく位置し、ポリリンカーに
おける制限部位の方法によって、実施可能にＳＶ４０イ
ントロンおよびポリアデニル化シグナルに結合すること
ができる。 （２）イー・コリおよび他の原核細胞における伝播のた
めに有効なイー・コリ複製起点； （３）ジェネティシン（Ｇ４１８）選択のための細菌性
ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ＮＥ
Ｏ）発現カセット； （４）メトトレキセート（ＭＴＸ）増幅のためのマウス
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）発現カセット； （５）プラスミドを含有する原核細胞の選択のためのア
ンピシリン耐性遺伝子；および （６）真核細胞における伝播のためのＳＶ４０複製起点
を含む。

【０１２０】全ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４前駆体をコ
ードするＤＮＡフラグメントをベクターのポリリンカー
領域へクローン化し、その結果、組み換え蛋白質発現を
ＣＭＶプロモーターによって指示する。プラスミド構築
策法は、以下のようである。プラスミドｐＭＡＤｒ３ま
たはＭＡＤｒ４のＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４ｃＤＮＡ
を独特の制限部位を含むプライマーを用いて増幅する。
ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４発現を最大化するために、
ベクターｐＣＤＮへ挿入する前に、５’および３’非翻
訳領域（ＵＴＲ）をＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４ｃＤＮ
Ａから、独特の制限酵素を用いて除去する。ＰＣＲをｃ
ＤＮＡを平滑断端するために使用するので、ＤＮＡ配列
は、発現前に確定される。

【０１２１】適当なプライマーを該実施例で使用する。
５’プライマーは、長さ約３０ｂｐであり、独特の制限
部位およびＡＧＵ開始コドンを含有する。３’プライマ
ーは、長さ約３０ｂｐであり、適当な終止コドンを含有
する。ＰＣＲ増幅ＤＮＡフラグメントおよびベクター、
ｐＣＤＮを該配列に独特の制限酵素で消化し、次いで連
結する。連結反応混合物をイー・コリ株ＳＵＲＥ（Stra
tagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037から入手
可能）へ形質転換する。形質転換株を、次にアンピシリ
ン耐性クローンを成長させるアンピシリン培地プレート
上におく。プラスミドＤＮＡを耐性クローンから単離
し、制限分析およびゲルサイズ決定によって、ＭＡＤｒ
３またはＭＡＤｒをコードするフラグメントの存在を試
験する。ヒト胚肝臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞をＭＡ
Ｄｒ３またはＭＡＤｒ４を発現するために選択する。組
み換えＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４の発現のために、２
ｘ１０⁵細胞を培地におき、３７℃にて５％増湿インキ
ュベーター中で一晩インキュベートする。次の日、前記
の２０μｇ／プレートの発現ベクターＤＮＡを製造者の
説明書に従って哺乳類トランスフェクションキットを用
いる、または、例えばSambrookらの記載のようにＤＥＡ
Ｅ−ＤＥＸＴＲＡＮを用いるリン酸カルシウム方法によ
って、細胞に導入する。

【０１２２】トランスフェクション後、細胞を３７℃に
て３％ＣＯ₂中２４時間インキュベートし、温かいDulbe
ccoのリン酸セーライン緩衝液（ＤＰＢＳ）で洗浄し、
新しい培地を与えて、３７℃にて５％ＣＯ₂中で維持し
た。一晩インキュベーション後、培地を除去し、発現ベ
クターで安定に形質転換した細胞を選択するために、４
００μｇ／ｍｌＧ４１８を含有する新しい選択培地に替
える。独立細胞コロニーが皿上に現れるまで、選択培地
を週に２回、２〜４週間替える。細胞コロニーを個々に
取り上げ、限定希釈によって精製し、さらなる分析のた
めに発展させる。クローンは、６ウェルプレート中で成
長させ、ヒトＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４を発現するク
ローン細胞株を同定する。発現は、ノーザンブロット分
析によって検出する。予想されたサイズの発現産物が細
胞ライゼート中に見られ、それは、陰性の対照（ｐＣＤ
ＮベクターのみでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細
胞が、陰性の対照として働く）中には見られない。

【０１２３】実施例２−細菌発現およびＭＡＤｒ３ポリ
ペプチドの精製 ＭＡＤｒ３をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ＃９８２
２３をブルースクリプト（Bluescript）プラスミドpHSB
HI91から、EcoRIおよびXhoIを用いて、すなわち、細菌発現
ベクターpBluescript SK (+/-)ファージミド（Stratage
ne, Inc.）上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を
切断する。pBluescript SK (+/-)ファージミドは、抗生
物質耐性（Ampr）、細菌の複製起点（ori）、β−ガラ
クトシダーゼプロモーターオペレーター、および調節配
列［GENBANK 52325］をコードする。プラスミドGEX-t1
［Pharmacia, Uppsala, Sweden］を次いで、EcoRIおよ
びXhoIで消化し、ＭＡＤｒ３配列を、消化したプラスミ
ド中へ連結する。該商業的に入手可能なプラスミドにお
いて、ＭＡＤｒ３をグルタチオンＳトランスフェラーゼ
遺伝子をコードする配列を有するフレーム内で挿入す
る。該プラスミドを消化して、該ＭＡＤｒ３の場合にお
いて、挿入遺伝子とＧＳＴの融合を生じる。連結反応混
合物を次いで、イー・コリ株ＳＯＬＲ（Stratagene）を
前記の実施例２に記載の従来の技術によって形質転換す
るために使用する。融合蛋白質ＭＡＤｒ３−ＧＳＴは、
ＧＳＴ Sephadex（Pharmacia）を用いて、製造者の説明
書に従って精製する。

【０１２４】実施例３−リガンドまたはアンタゴニスト
の同定 前記の実施例１〜２に記載の発現したＭＡＤｒ３または
ＭＡＤｒ４を次いで、以下のように、リガンドまたはア
ンタゴニストに対してスクリーンする。

【０１２５】Ａ． リガンド／組織バンク 発現したＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４を化合物バンク、
複合生物学的流体、結合有機物およびペプチドライブラ
リーなどをスクリーンし、活性化しているリガンドまた
はアンタゴニストを同定するために利用する。例えば、
発現したＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４を、（ａ）ＭＡＤ
ｒ３またはＭＡＤｒ４などの推定結合蛋白質であり得る
天然の化合物；（ｂ）哺乳類ではよく似たものがまだ発
見されていない非哺乳類、生物学的に活性なペプチド、
（ｃ）天然では見付かっていないが、天然で知られてい
ないリガンドなどを有するＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４
を活性化するまたは相互作用することが明らかな化合物
を含む、１５０を越える推定の放っておかれるＭＡＤｒ
３またはＭＡＤｒ４リガンドのバンクをスクリーンする
のに使用する。同様に、ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４を
ヒトの組織抽出物、および他の哺乳類種、例えばブタ組
織に対してスクリーンする。特に、かかる組織抽出物
は、肺、肝臓、腸、心臓、腎臓、副腎、虚血脳、血漿、
尿および胎盤を包含する。最初の抽出手順は、酸または
エタノール沈殿を経て、大きい蛋白質の除去に集中し、
分離を、高いパーセントのＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４
既知天然リガンドの原因であるペプチドおよび小型分子
へ偏らせる。続いて、より穏やかな抽出方法を用いて蛋
白質を同定する。これらの組織バンクの形成に使用した
抽出技術は、当該分野において公知である。

【０１２６】Ｂ． 機能アッセイ １． ゼナパス卵母細胞アッセイ ゼナパス卵母細胞は、正確にｍＲＮＡを翻訳し、シグナ
ルペプチド開裂、グリコシル化、リン酸化およびサブユ
ニットアセンブリーを包含する多数の翻訳後修飾を行う
ことができるので、これらの細胞系をＭＡＤｒ３または
ＭＡＤｒ４の特徴付けに使用する。機能アッセイは：ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏでキャップしたＲＮＡ転写産物を、ＭＡ
Ｄｒ３またはＭＡＤｒ４ｃＤＮＡをコードする線状プラ
スミド鋳型から、ＲＮＡポリメラーゼといっしょに、標
準プロトコールを用いて調製する。ｉｎ ｖｉｖｏでの
転写産物は、最終濃度０．２μｇ／ｍｌにて、水中に懸
濁する。卵巣葉を成熟雌ヒキガエルから除去し；ステー
ジＶ脱卵胞した卵母細胞を得、ＲＮＡ転写産物（１０ｎ
ｇ／卵母細胞）お５０ｎｌ巨丸において、Drummondマイ
クロインジェクション装置を用いて注射する。２電極電
圧クランプ（Warner Instruments）を用いて、個々のゼ
ナパス卵母細胞から電流を測定する。記録は、Ｃａ²⁺遊
離Barth培地において、室温にて行われる。

【０１２７】２． ミクロフィジオメーター（Microphy
siometer）アッセイ これらのバンクのスクリーニングは、ミクロフィジオメ
ーター（例えば、Molecular Davices, Ltd.から商業的
に入手可能）を用いて行う。例えば、第２メッセンジャ
ーの活性化系は、細胞内シグナル伝達プロセスを活性化
するために必要な増加した代謝活性の結果として大きく
形成された細胞からの少量の酸の噴出を生じる。細胞周
囲の培地におけるｐＨ変化は、小さく、ミクロフィジオ
メーターによって検出できる。従って、細胞内シグナル
伝達経路を利用するエネルギーに結合するいずれのＭＡ
Ｄｒ３またはＭＡＤｒ４の活性化は、検出できる。

【０１２８】３． カルシウムアッセイ ＨＥＫ２９３細胞において発現した安定なＭＡＤｒ３ま
たはＭＡＤｒ４は、適当なランクオーダーおよび潜在力
を有するアゴニストに対してしっかりとしたカルイシウ
ム応答を実証する。ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４トラン
スフェクトされたＨＥＫ２９３細胞またはベクター調節
細胞における基礎的なカルシウムレベルは、通常１００
ｎＭ〜２００ｎＭ範囲である。組み換えＭＡＤｒ３また
はＭＡＤｒ４を発現するＨＥＫ細胞は、ｆｕｒａ２でロ
ドードされ、１日に＞１５０の選択されたリガンドが、
アゴニスト誘導カルシウム流動のために評価される。一
時的カルシウム流動を与えるアゴニストをベクター調節
細胞において試験して、カルシウム応答がトランスフェ
クトしたＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４細胞に独特であっ
たかどうかを決定する。独特なアゴニスト誘導応答が同
定されるとき、該応答は、細胞の分離群において再現さ
れ、次いで、効果および関連したリガンドに対する濃度
応答曲線で薬理学的に特徴付けられる。

【０１２９】実施例４−遺伝子治療のためのヒトＭＡＤ
ｒ３またはＭＡＤｒ４の発現繊維芽細胞を主題の皮膚生
検から得る。得られる組織を組織培養培地におき、小片
に分離する。組織の小部分を組織培養フラスコの湿った
表面におき；約１０片を各フラスコにおく。フラスコを
転倒して、きつく閉め、室温で一晩放置する。室温で２
４時間後、フラスコを反転させ；組織部分をフラスコの
底に固定させたままで；新しい培地（例えば、１０％FB
S、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むHam's F
12培地）を加える。組織を次いで、３７℃で約１週間イ
ンキュベートする。該時間で、新しい培地を加え、続い
て、数日ごとに替える。さらに２週培養後、繊維芽細胞
の単層が出現する。単層をトリプシン処理し、より大き
なフラスコへ移す。遺伝子治療のためのベクター（例え
ば、モロニーマウス肉腫ウイルスの長い末端繰り返しに
よって隣接されたpMV-7［Kirschmeier, P. T. ら、DNA,
7：219-25(1988)］）は、発現のためにフラグメントを
クローニングするために、EcoRIおよびHindIIIを用いて
消化する。消化したベクターをウシ腸内ホスファターゼ
で処理して、自己連結反応を防ぐ。脱リン酸化、線状ベ
クターをアガロースゲル上で分画して、例えばガラスビ
ーズを用いて精製する。

【０１３０】活性なＭＡＤｒ３を発現することができる
ＭＡＤｒ３ｃＤＮＡを単離し、５’および３’末端配列
にそれぞれ対応するＰＣＲプライマーを用いて増幅す
る。もし必要なら、フラグメントの末端をベクターへの
クローニングのために修飾する。例えば、５’突出末端
をＤＮＡポリメラーゼで処理して、平滑末端を作っても
よい。３’突出末端は、Ｓ１ヌクレアーゼを用いて除去
してもよい。リンカーをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて平
滑末端に連結してもよい。モロニーマウス白血病ウイル
ス骨格およびＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４フラグメント
の等量をいっしょに混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い
て結合する。連結反応混合物を使用して、イー・コリを
形質転換し、次いで細菌をカナマイシンを含有する寒天
上におく。カナマイシン表現型および制限分析は、ベク
ターが適当に挿入された遺伝子を有することを確定す
る。

【０１３１】パッケージング細胞（amphotropic pA317
またはGP-am12パッケージング細胞）は、組織培養にお
いて成長し、１０％ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよ
びストレプトマイシンを含むDulbeccoの修飾イーグル培
地(ＤＭＥＭ）中で集密的密度になる。ＭＡＤｒ３遺伝
子を含有するベクターを標準技術を用いて、パッケージ
ング細胞へ導入する。ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４遺伝
子を含む感染性ウイルス粒子をプロデューサー細胞と称
するパッケージング細胞から集める。新しい培地をプロ
デューサー細胞に加え、適当なインキュベーション期間
後、培地を集密的プロデューサー細胞のプレートから回
収する。感染性ウイルス粒子を含有する培地をMILLIPOR
Eフィルター（Bedford, MA）によって濾過して、分離し
たプロデューサー細胞を除去する。濾過した培地を次い
で、繊維芽細胞を感染するのに使用する。培地を繊維芽
細胞のやや集密的プレートから除去し、速やかに濾過し
た培地と取り替える。POLYBRENE（Aldrich Chemical C
o., Milwaukee,WI）を培地中でインキュベートして、形
質導入を容易にしてもよい。適当なインキュベーション
後、培地を除去して、新しい培地と取り替える。もしウ
イルスのタイターが高いならば、次いで、実質的に全て
の繊維芽細胞を感染し、選択は必要でない。もしタイタ
ーが低いならば、次いで、膨張のために形質導入した細
胞を選択するための選択マーカー、例えばｎｅｏまたは
ｈｉｓを有するレトロウイルスベクターを使用する必要
がある。操作した繊維芽細胞を次いで、単独かまたはCY
TODEX 3のようなミクロキャリアービーズ上に集密する
まで成長させた後ラットに注射する。注射した繊維芽細
胞は、ＭＡＤｒ３産物を生じ、蛋白質の生物学的作用
は、宿主に伝達される。

【０１３２】実施例５−アッセイ方法 ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４のアゴニストおよびアンタ
ゴニストの同定のための酵素アッセイ方法は、以下のよ
うにフラッシュプレート（FLASHPLATE）システム（DuPo
nt）を使用するアッセイを包含する。２つのアプローチ
がＴＧＦ−βレセプター活性の測定に取り上げられ：１
つは、プレート上を直接被覆した基質、ＭＡＤｒ３蛋白
質を使用し；２つ目は、基質、ＭＡＤ蛋白質に対する抗
体のフラッシュプレートシステム上への被覆を利用する
ものである。

【０１３３】Ａ． 直接フラッシュプレート上を被覆し
たＭＡＤｒ３ 最初に、ＴＧＦ−βレセプターによるＭＡＤのリン酸化
が、フラッシュプレート上に被覆されたＭＡＤ濃度を変
化させることによって、最適化した。ＭＡＤｒ３を０．
１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中に溶解
し、１００〜１０００ｎｇタンパク質を含む１００μｌ
アリコートでフラッシュプレートウェルに加えた。室温
で一晩インキュベーション後、各ウェルを２ｘ２００μ
ｌの含有緩衝液で洗浄した。プレートを空気乾燥させ、
すぐに使用するか、または４℃で保存した。４℃で保存
したとき、プレートは２〜３週間使用可能である。リン
酸化反応の場合、各ウェルは、３３ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．４）、１７ｍＭＭｇＣｌ₂、３３μＭＡＴ
Ｐ、０．７ｍＭＤＴＴ、０．２５μＣｉの［ｇ³³Ｐ］−
ＡＴＰ（DuPont NEG-302H）、および０．３ユニットの
ＴＧＦ−βレセプターを含む全容量９０μｌを入れた。
バックグラウンドカウントは、いずれのレセプターも加
えないで測定した。プレートを３０℃で３時間インキュ
ベートした。溶液を吸引し、ウェルを１ｘ２５０μｌの
１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液／ＰＢＳで洗浄して、
反応を終了させた。プレートをPackard TopCountでカウ
ントした。さらに、ＴＧＦ−βレセプターを滴定して
（０．００〜０．０８ユニット）、少量のＭＡＤｒ３
（７５０ｎｇ／ウェル）で被覆したフラッシュプレート
上で検出可能なリン酸化反応を得るために必要な酵素レ
ベルを決定した。反応条件は、プレートを３０℃で一晩
インキュベートする以外は前記のとおりであった。

【０１３４】Ｂ． フラッシュプレート上へ被覆したＭ
ＡＤｒ３に対する抗体 フラッシュプレートを１００μｌ／ウェルのＭＡＤｒ３
に対する抗体、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ濃度で被覆した。
室温で一晩インキュベーション後、プレートを２回ＰＢ
Ｓで洗浄し、室温にて１％ＢＳＡ／ＰＢＳで少なくとも
２時間ブロックした。プレートを空気乾燥させ、使用時
まで４℃で保存した。４℃で保存したとき、プレートは
２〜３週間使用可能である。リン酸化反応をプレート中
で、３３ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１７ｍ
ＭＭｇＣｌ₂、３３μＭＡＴＰ、０．７ｍＭＤＴＴ、
０．２５μＣｉの［γ^{3 3}Ｐ］−ＡＴＰ（DuPont NEG-302
H）、20μgＭＡＤｒ３および組み換えＴＧＦ−βレセプ
ターの量を変化させたものを含む全容量６０μｌ／ウェ
ルを用いて行った。非特異的結合（ＮＳＢ）を決定する
ために、ＭＡＤｒ３を反応から削除した。プレートを３
０℃で一晩インキュベートした。溶液の吸引後、ウェル
を１ｘ２５０μｌ／ウェルの非特異的結合を減少させる
１０ｍＭリン酸ナトリウム／ＰＢＳでリンスした。プレ
ートをPackard TopCountでカウントした。

【０１３５】直接フラッシュプレート上に固定されたＭ
ＡＤ蛋白質は、ＴＧＦ−βレセオウターに対する機能的
基質としてはたらく。反応は、単に一回のリン酸リンス
を必要とし、無反応［γ³³Ｐ］−ＡＴＰおよびレセプタ
ーをウェルから除去した。レセプターを含まないウェル
中のバックグラウンドカウントは、１０＞の単一対ノイ
ズ比を生じるリンス後、約１００ｃｐｍであった。該比
率は、プレート上に被覆されたＭＡＤｒ３の量が増加す
るにつれて増加する。７５０ｎｇ／ウェルにて固定され
たＭＡＤｒ３基質を投与量依存方法においてリン酸化で
き、従って、ＴＧＦ−βレセプター活性の定量を可能に
する。ＴＧＦ−βレセプター０．０１ユニットでの単一
対ノイズ比は、５０：１であり、検出限界が本明細書中
で試験したレベルよりも低いことを示した。ＭＡＤｒ３
基質に対する抗体で被覆しているプレートはまた、結合
した基質をＴＧＦ−βレセプターによってリン酸化でき
るようにするのに有効である。反応は、加えたレセプタ
ー量に関して、投与量依存である。抗血清は、リン酸化
ならびに非リン酸化基質のどちらの型にも特異的ではな
いので、形成されると、被覆プレートは、リン酸化なら
びに非リン酸化基質の両方を捕獲した。

【０１３６】様々なオプションが、酵素アッセイを行う
ために利用できる。かかるアッセイは、人が、リン酸化
反応をＭＡＤポリペプチドとのまたはレセプターとの相
互反応によって阻害できる未知化合物を系へ挿入するこ
とを可能にする。形式の選択は、必要な感度およびアッ
セイの目的：酵素レベルを定量する、または動力学的研
究における阻害を測定することを目指すかどうかに依存
する。形式にかかわらず、かかる酵素アッセイは、自動
化および高処理量スクリーニングの両方に有益である。
本発明は、特に前記の説明および実施例に記載以外の方
法で実施してもよい。本発明の多くの修飾および変更
が、前記の技術の知識において可能であり、従って、本
明細書中の特許請求の範囲の範囲内である。

【０１３７】

【配列表】

（１）一般的情報 （i）出願人：ニコラス・ジェイ・ラッピング （ii）発明の名称：ヒトＭＡＤ蛋白質およびその使用 （iii）配列の数：４ （iv）連絡先： （Ａ）宛て先：スミスクライン・ビーチャム・コーポレ
イション （Ｂ）通り名：スウェードランド・ロード７０９番 （Ｃ）都市名：キング・オブ・プルシア （Ｄ）州名：ペンシルベニア （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：１９４０６−２７９９ （v）コンピューター・リーダブル・フォーム （Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンリューター：ＩＢＭ ＰＣコンパチブル （Ｃ）作動システム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウェア：PatenIn Release ＃1.0バージョ
ン1.30 （vi）本願のデータ： （Ａ）出願番号：ＵＳ （Ｂ）出願日 （Ｃ）分類： （viii）代理人等の情報： （Ａ）氏名：パトリシア・エー・シュレック （Ｂ）登録番号：３３，７７７ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＳＢＣ ＡＴＧ５０
０３０ （ix）テレコミュニケーションの情報 （Ａ）電話番号：６１０−２７０−５０１５ （Ｂ）テレファックス番号：６１０−２７０−５０９０

【０１３８】（２）配列番号：１の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２３３３塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii））配列の種類：ｃＤＮＡ （iii）推定：否 （iv）アンチセンス：否 （xi）配列の記載：配列番号：１： GGCACGAGGT CGAGCCCAGC CCCGCCGGGG GCGCTCCTCG CCGCCCGCGC GCCCTCCCCA 60 GCCATGTCGT CCATCCTGCC TTTCACTCCC CCGATCGTGA AGCGCCTGCT GGGCTGGAAG 120 AAGGGCGAGC AGAACGGGCA GGAGGAGAAA TGGTGCGAGA AGGCGGTCAA GAGCCTGGTC 180 AAGAAACTCA AGAAGACGGG GCAGCTGGAC GAGCTGGAGA AGGCCATCAC CACGCAGAAC 240 GCCAACACCA AGTGCATCAC CATCCCCAGG TCCCTGGATG GCCGGTTGCA GGTGTCCCAT 300 CGGAAGGGGC TCCCTCATGT CATCTACTGC CGCCTGTGGC GATGGCCAGA CCTGCACAGC 360 CACCACGAGC TGCGGGCCAT GGAGCTGTGT GAGTTCGCCT TCAATATGAA GAAGGACGAG 420 GTCTGCGTGA ATCCCTACCA CTACCAGAGA GTAGAGACAC CAGTTCTACC TCCTGTGTTG 480 GTGCCACGCC ACACAGAGAT CCCGGCCGAG TTCCCCCCAC TGGACGACTA CAGCCATTCC 540 ATCCCCGAAA ACACTAACTT CCCCGCAGGC ATCGAGCCCC AGAGCAATAT TCCAGAGACC 600 CCACCCCCTG GCTACCTGAG TGAAGATGGA GAAACCAGTG ACCACCAGAT GAACCACAGC 660 ATGGACGCAG GTTCTCCAAA CCTATCCCCG AATCCGATGT CCCCAGCACA TAATAACTTG 720 GACCTGCAGC CAGTTACCTA CTGCGAGCCG GCCTTCTGGT GCTCCATCTC CTACTACGAG 780 CTGAACCAGC GCGTCGGGGA GACATTCCAC GCCTCGCAGC CATCCATGAC TGTGGATGGC 840 TTCACCGACC CCTCCAATTC GGAGCGCTTC TGCCTAGGGC TGCTCTCCAA TGTCAACAGG 900 AATGCAGCAG TGGAGCTGAC ACGGAGACAC ATCGGAAGAG GCGTGCGGCT CTACTACATC 960 GGAGGGGAGG TCTTCGCAGA GTGCCTCAGT GACAGCGCTA TTTTTGTCCA GTCTCCCAAC 1020 TGTAACCAGC GCTATGGCTG GCACCCGGCC ACCGTCTGCA AGATCCCACC AGGATGCAAC 1080 CTGAAGATCT TCAACAACCA GGAGTTCGCT GCCCTCCTGG CCCAGTCGGT CAACCAGGGC 1140 TTTGAGGCTG TCTACCAGTT GACCCGAATG TGCACCATCC GCATGAGCTT CGTCAAAGGC 1200 TGGGGAGCGG AGTACAGGAG ACAGACTGTG ACCAGTACCC CCTGCTGGAT TGAGCTGCAC 1260 CTGAATGGGC CTTTGCAGTG GCTTGACAAG GTCCTCACCC AGATGGGCTC CCCAAGCATC 1320 CGCTGTTCCA GTGTGTCTTA GAGACATCAA GTATGGTAGG GGAGGGCAGG CTTGGGGAAA 1380 ATGGCCATGC AGGAGGTGGA GAAAATTGGA ACTCTACTCA ACCCATTGTT GTCAAGGAAG 1440 AAGAAATCTT TCTCCCTCAA CTGAAGGGGT GCACCCACCT GTTTTCTGAA ACACACGAGC 1500 AAACCCAGAG GTGGATGTTA TGAACAGCTG TGTCTGCCAA ACACATTTAC CCTTTGGCCC 1560 CACTTTGAAG GGCAAGAAAT GGCGTCTGCT CTGGTGGCTT AAGTGAGCAG AACAGGTAGT 1620 ATTACACCAC CGGCCCCCTC CCCCCAGATC TTTTTTTGAG TGACAGCTTT CTGGGATGTC 1680 ACAGTCCAAC CAGAAACACC CCTCTGTCTA GGACTGCAGT GTGGAGTTCA CCTTGGAAGG 1740 GCGTTCTAGG TAGGAAGAGC CCGCAGGGCC ATGCAGACCT CATGCCCAGC TCTCTGACGC 1800 TTGTGACAGT GCCTCTTCCA GTGAACATTC CCAGCCCAGC CCCGCCCCGC CCCGCCCCAC 1860 CACTCCAGCA GACCTTGCCC CTTGTGAGCT GGATAGACTT GGGATGGGGA GGGAGGGAGT 1920 TTTGTCTGTC TCCCTCCCCT CTCAGAACAT ACTGATTGGG AGGTGCGTGT TCAGCAGAAC 1980 CTGCACACAG GACAGCGGGA AAAATCGATG AGCGCCACCT CTTTAAAAAC TCACTTACGT 2040 TTGTCCTTTT TCACTTTGAA AAGTTGGAAG GATCTGCTGA GGCCCAGTGC ATATGCAATG 2100 TATAGTGTCT ATTATCACAT TAATCTCAAA GAGATTCGAA TGACGGTAAG TGTTCTCATG 2160 AAGCAGGAGG CCCTTGTCGT GGGATGGCAT TTGGTCTCAG GCAGCACCAC ACTGGGTGCG 2220 TCTCCAGTCA TCTGTAAGAG CTTGCTCCAG ATTCTGATGC ATACGGCTAT ATTGGTTTAT 2280 GTAGTCAGTT GCATTCATTA AATCAACTTT ATCATAAAAA AAAAAAAAAA AAA 2333

【０１３９】（２）配列番号：２の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：４２５アミノ酸 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ペプチド （iii）推定：否 （iv）アンチセンス：否 （v）フラグメントの型：Ｎ−末端 （xi）配列の記載：配列番号：２： Met Ser Ser Ile Leu Pro Phe Thr Pro Pro Ile Val Lys Arg Leu Leu 1 5 10 15 Gly Trp Lys Lys Gly Glu Gln Asn Gly Gln Glu Glu Lys Trp Cys Glu 20 25 30 Lys Ala Val Lys Ser Leu Val Lys Lys Leu Lys Lys Thr Gly Gln Leu 35 40 45 Asp Glu Leu Glu Lys Ala Ile Thr Thr Gln Asn Ala Asn Thr Lys Cys 50 55 60 Ile Thr Ile Pro Arg Ser Leu Asp Gly Arg Leu Gln Val Ser His Arg 65 70 75 80 Lys Gly Leu Pro His Val Ile Tyr Cys Arg Leu Trp Arg Trp Pro Asp 85 90 95 Leu His Ser His His Glu Leu Arg Ala Met Glu Leu Cys Glu Phe Ala 100 105 110 Phe Asn Met Lys Lys Asp Glu Val Cys Val Asn Pro Tyr His Tyr Gln 115 120 125 Arg Val Glu Thr Pro Val Leu Pro Pro Val Leu Val Pro Arg His Thr 130 135 140 Glu Ile Pro Ala Glu Phe Pro Pro Leu Asp Asp Tyr Ser His Ser Ile 145 150 155 160 Pro Glu Asn Thr Asn Phe Pro Ala Gly Ile Glu Pro Gln Ser Asn Ile 165 170 175 Pro Glu Thr Pro Pro Pro Gly Tyr Leu Ser Glu Asp Gly Glu Thr Ser 180 185 190 Asp His Gln Met Asn His Ser Met Asp Ala Gly Ser Pro Asn Leu Ser 195 200 205 Pro Asn Pro Met Ser Pro Ala His Asn Asn Leu Asp Leu Gln Pro Val 210 215 220 Thr Tyr Cys Glu Pro Ala Phe Trp Cys Ser Ile Ser Tyr Tyr Glu Leu 225 230 235 240 Asn Gln Arg Val Gly Glu Thr Phe His Ala Ser Gln Pro Ser Met Thr 245 250 255 Val Asp Gly Phe Thr Asp Pro Ser Asn Ser Glu Arg Phe Cys Leu Gly 260 265 270 Leu Leu Ser Asn Val Asn Arg Asn Ala Ala Val Glu Leu Thr Arg Arg 275 280 285 His Ile Gly Arg Gly Val Arg Leu Tyr Tyr Ile Gly Gly Glu Val Phe 290 295 300 Ala Glu Cys Leu Ser Asp Ser Ala Ile Phe Val Gln Ser Pro Asn Cys 305 310 315 320 Asn Gln Arg Tyr Gly Trp His Pro Ala Thr Val Cys Lys Ile Pro Pro 325 330 335 Gly Cys Asn Leu Lys Ile Phe Asn Asn Gln Glu Phe Ala Ala Leu Leu 340 345 350 Ala Gln Ser Val Asn Gln Gly Phe Glu Ala Val Tyr Gln Leu Thr Arg 355 360 365 Met Cys Thr Ile Arg Met Ser Phe Val Lys Gly Trp Gly Ala Glu Tyr 370 375 380 Arg Arg Gln Thr Val Thr Ser Thr Pro Cys Trp Ile Glu Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Gly Pro Leu Gln Trp Leu Asp Lys Val Leu Thr Gln Met Gly Ser 405 410 415 Pro Ser Ile Arg Cys Ser Ser Val Ser 420 425

【０１４０】（２）配列番号：３の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２７７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （iii）推定：否 （iv）アンチセンス：否 （xi）配列の記載：配列番号：３： CTGGCTCAGT CTNTTAATCA GGGTNTTGAA GCAGTCTATC ANCTAACTAG AATGGGGGGG 60 ATAAGTTTTT TGTTTNGTGA AAGGGTGNGG AGCAGTATAC CGAAGTCAGT ACGNTAACAN 120 NAGACTNCTA ACTGGATTGA ACTTCATNTG AATGGACCTC TACANTGGNT GGACAAAGTA 180 TTAACTCAGA TNGGATACCC TNCAGTGCGT TGCTCAAGNA TGTCATAAAG CTTCACCAAT 240 CAAGTCCCAT GAAAAAGACT TAAANGTAAC AACTCTN 277

【０１４１】（２）配列番号：４の情報： （i）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１８９塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：１本 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）配列の種類：ｃＤＮＡ （iii）推定：否 （iv）アンチセンス：否 （xi）配列の記載：配列番号：４： TGACATACTG CATGCCTGAG TGAGAGACGA TCCGAACTCT GTGCTAGTCA TCTGCAGCAC 60 ACTAACTATT ATGCTGATGT GACTCATTGC AGTTTAAACA TTTCTTCTGT TTGCATCTCT 120 AGTAGAAATG GAAAATAACC ACTCCCTGGC GCTCTTTTCA TTAAATTTTC ATATTTTTGA 180 AAAAAAAAA 189

【図面の簡単な説明】

以下の図は、本発明のある具体例を描写する。それら
は、別の方法で本明細書中に開示した発明を説明するの
みで制限するものではない。

【図１】 ＭＡＤｒ３の共通ｃＤＮＡ配列［配列番号：
１］および相当する推定アミノ酸配列［配列番号：２］
である。アミノ酸の標準一文字略語を用いる。

【図２】 ＭＡＤｒ３の共通ｃＤＮＡ配列［配列番号：
１］および相当する推定アミノ酸配列［配列番号：２］
である。アミノ酸の標準一文字略語を用いる。

【図３】 ＭＡＤｒ３の共通ｃＤＮＡ配列［配列番号：
１］および相当する推定アミノ酸配列［配列番号：２］
である。アミノ酸の標準一文字略語を用いる。

【図４】 ＭＡＤｒ３の共通ｃＤＮＡ配列［配列番号：
１］および相当する推定アミノ酸配列［配列番号：２］
である。アミノ酸の標準一文字略語を用いる。

【図５】 ＭＡＤｒ４と称する部分的クローンのフラグ
メント［配列番号：３］のｃＤＮＡ配列である。

【図６】 部分的クローン、ＭＡＤｒ４のフラグメント
［配列番号：４］のｃＤＮＡ配列である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/577 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＡＢ Ｃ１２Ｐ 21/08 ＡＢＬ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＢ ＡＣＳ ＡＢＬ ＡＤＡ ＡＣＳ ＡＤＴ ＡＤＡ ＡＤＵ ＡＤＴ Ｃ１２Ｐ 21/08 ＡＤＵ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:42） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:125）

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号：２に示すポリペプチド
   をコードするポリヌクレオチド； （ｂ）配列番号：２のアミノ酸を含むポリペプチドをコ
   ードするポリヌクレオチドに対して、少なくとも７０％
   の同一性を有するポリヌクレオチド； （ｃ）遺伝コードの重複性によって配列番号：２の同じ
   アミノ酸をコードするポリヌクレオチド； （ｄ）図１〜４のアミノ酸１〜４２５を含むポリペプチ
   ドをコードするポリヌクレオチド； （ｅ）（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドに相補的であ
   るポリヌクレオチドおよび （ｆ）（ａ）〜（ｅ）のポリヌクレオチドの少なくとも
   １５の隣接する塩基を含むポリヌクレオチド よりなる群から選択されたポリヌクレオチドを含む単離
   ポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡ
   である請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 配列番号：１に示すヌクレオチドを含む
   請求項２に記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 配列番号：１に示すヌクレオチド１〜２
   ３３３を含む請求項２に記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 配列番号：２のアミノ酸を含むポリペプ
   チドをコードする請求項２に記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 （ａ）配列番号：３に示すポリヌクレオ
   チド； （ｂ）配列番号：４に示すポリヌクレオチド； （ｃ）（ａ）または（ｂ）のポリヌクレオチドに対して
   少なくとも７０％同一性を有するポリヌクレオチド； （ｄ）遺伝コードの重複性によって、配列番号：３また
   は４によりコードされ得るような同じアミノ酸をコード
   するポリヌクレオチド； （ｅ）（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドに相補的であ
   るポリヌクレオチド、および （ｆ）（ａ）〜（ｅ）のポリヌクレオチドの少なくとも
   １５の隣接した塩基を含むポリヌクレオチド よりなる群から選択されたポリヌクレオチドを含む単離
   ポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡ
   である請求項７に記載のポリヌクレオチド。
8. 【請求項８】 配列番号：３に示すヌクレオチドを含む
   請求項７に記載のポリヌクレオチド。
9. 【請求項９】 配列番号：４に示すヌクレオチドを含む
   請求項７に記載のポリヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 （ａ）ＡＴＣＣ寄託番号９８２２３に
    含まれるＤＮＡにより発現されるアミノ酸配列を有する
    成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｂ）（ａ）の同じ成熟ポリペプチドをコードするポリ
    ヌクレオチドに対して、少なくとも７０％同一性を有す
    るポリヌクレオチド； （ｃ）遺伝コードの重複性によって、ＡＴＣＣ寄託番号
    ９８２２３に含まれるヒトｃＤＮＡにより発現される同
    じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドに相補的なポ
    リヌクレオチド；および （ｅ）（ａ）〜（ｄ）のポリヌクレオチドの少なくとも
    １５の隣接した塩基を含むポリヌクレオチド よりなる群から選択したポリヌクレオチドを含む単離ポ
    リヌクレオチド。
11. 【請求項１１】 請求項２に記載のＤＮＡを含むベクタ
    ー。
12. 【請求項１２】 請求項７に記載のＤＮＡを含むベクタ
    ー。
13. 【請求項１３】 請求項１１に記載のベクターを含む宿
    主細胞。
14. 【請求項１４】 請求項１２に記載のベクターを含む宿
    主細胞。
15. 【請求項１５】 請求項１３に記載の宿主細胞からの、
    該ＤＮＡによりコードされるポリペプチドの発現を特徴
    とするポリペプチドの製造方法。
16. 【請求項１６】 ポリペプチドを発現する細胞の製造方
    法であって、細胞が請求項１１に記載のベクターに含ま
    れるヒトｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドを発
    現するように、該細胞を該ベクターで形質転換またはト
    ランスフェクトすることを特徴とする方法。
17. 【請求項１７】 配列番号：２のアミノ酸配列に対して
    少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペ
    プチド。
18. 【請求項１８】 配列番号：２に示すアミノ酸配列を含
    むポリペプチド。
19. 【請求項１９】 請求項１７に記載のポリペプチドの活
    性化を阻害する化合物。
20. 【請求項２０】 請求項１７に記載のポリペプチドに対
    する抗体。
21. 【請求項２１】 請求項１７に記載のポリペプチドを活
    性化する化合物。
22. 【請求項２２】 ＭＡＤｒ３の必要性を有する個体の治
    療法であって、治療上有効量の請求項１７に記載のポリ
    ペプチドを個体に投与することを特徴とする方法。
23. 【請求項２３】 ポリペプチドをコードするＤＮＡを個
    体に提供し、該ポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで発現さ
    せることにより、治療上有効量のポリペプチドを投与す
    る、請求項２２に記載の方法。
24. 【請求項２４】 ＭＡＤｒ３またはＭＡＤｒ４ポリペプ
    チドを阻害する必要性を有する個体の治療法であって、
    治療上有効量の請求項１９に記載の化合物を個体に投与
    することを特徴とする方法。
25. 【請求項２５】 請求項１７に記載のポリペプチドの発
    現に関与する疾患または疾患に対する罹病性の診断方法
    であって、該ポリペプチドをコードする核酸配列におけ
    る突然変異を決定することからなる方法。
26. 【請求項２６】 宿主由来の試料中の請求項１７に記載
    のポリペプチドの存在を分析することからなる診断方
    法。
27. 【請求項２７】 請求項１２に記載のポリペプチドのリ
    ガンドに結合し、活性化するまたは阻害する化合物の同
    定方法であって；リガンドとの結合を可能にする条件下
    で、ポリペプチドに対するリガンドを（ここに、該リガ
    ンドは、化合物の該リガンドへの結合に反応して、検出
    可能なシグナルを提供する能力のある第２の成分に結合
    している）その表面に発現する細胞を、スクリーニング
    される化合物とを接触させること；および該化合物と該
    リガンドの相互作用から生じるシグナルの有無を検出す
    ることにより、該化合物が該リガンドに結合して、活性
    化するかまたは阻害するかを決定すること；を特徴とす
    る方法。
28. 【請求項２８】 請求項１７に記載のポリペプチドに対
    するアゴニストとして活性な化合物の同定方法であっ
    て；ＭＡＤｒ３リガンドを発現する細胞型を含む反応混
    合物とスクリーニングされる化合物とを接触させるこ
    と、および、該化合物が有効なアゴニストであるかどう
    かを同定するために、該化合物が該ＭＡＤｒ３またはＭ
    ＡＤｒ４からシグナルを生じるかどうかを決定すること
    を特徴とする方法。
29. 【請求項２９】 請求項１７に記載のポリペプチドのリ
    ン酸化を阻害し、他の蛋白質との相互作用を阻害し、Ｍ
    ＡＤｒ３の核へのトランスロケーションを阻害し、およ
    びＭＡＤｒ３と核酸配列との相互反応を阻害するアンタ
    ゴニストとして活性な化合物の同定方法であって；ＭＡ
    Ｄｒ３リガンドを発現する細胞型を含む反応混合物とス
    クリーニングされる化合物とを接触させること、および
    該化合物が有効なアンタゴニストであるかどうかを同定
    するために、該化合物の結合後に該リガンドから生じた
    シグナルの非存在を検出することを特徴とする方法。