JP2003503026A - ヒト遺伝子ａｂｃ１に対応する核酸及びタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、病気、例えばアテローム性動脈硬化症、より詳しくはコレステロールの逆輸送の変調、より詳しくは例えばタンジエール病のような家族性のＨＤＬ欠乏（ＦＨＤ）を誘発する、コレステロールの代謝の機能不全に関連した病気の原因遺伝子であることが現在証明されている、遺伝子ＡＢＣ１の様々なエキソン及びイントロンに対応する核酸に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明は、遺伝子ＡＢＣ１の様々なエキソン及びイントロンに対応する核酸に
関する。これについては現在、アテローム性動脈硬化症のような病気を誘発する
コレステロールの代謝の機能不全、より詳しくはコレステロールの逆輸送の変調
、より詳しくはタンジエール病のような家族性のＨＤＬ欠乏（ＦＨＤ）に関連し
た病原遺伝子であることが証明されている。本発明はまた、遺伝子ＡＢＣ１にお
ける、又は遺伝子ＡＢＣ１のアレリック形態によって生産される対応タンパク質
における一般的な多形性、特に突然変異の検出手段にも関する。本発明はまた、
遺伝子ＡＢＣ１のコード領域を含んでいる核酸を含む製薬組成物、及びコレステ
ロールの逆輸送における欠損に関連した病気、例えばタンジエール病の治療のた
めのタンパク質ＡＢＣ１を含む製薬組成物をも提供する。本発明はまた、それ自
体がコレステロールの逆輸送に対して作用する生成物を構成することができ、か
つそのままで、治療的観点からアテローム性動脈硬化症に対して効率的に闘うこ
とを可能にしうるタンパク質ＡＢＣ１に対して作用する小分子の選別方法をも提
供する。

【０００２】 高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は、血漿中を流れるリポタンパク質の主な４
つの種類のうちの１つである。

【０００３】 これらのリポタンパク質は、様々な代謝経路、例えば脂質輸送、胆汁酸の形成
、ステロイド発生、細胞増殖に関わっており、さらには血漿プロテイナーゼ系と
も競合する。

【０００４】 ＨＤＬは、遊離コレステロールの完全なアクセプターであり、コレステロール
の転移タンパク質（ＣＥＴＰ）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、肝リパー
ゼ（ＨＬ）、及びレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡ
Ｔ）と組合わせて、コレステロールの逆輸送、すなわち胆汁酸の形態での生物か
らの除去のための、末梢細胞内の過剰コレステロールの肝臓への輸送において大
きい役割を果たす。

【０００５】 ＨＤＬは、末梢組織から肝臓へのコレステロールの輸送において中心的役割を
果たすことが証明された。

【０００６】 ＨＤＬの欠乏に関連した様々な病気が記載されている。これには、タンジエー
ル病、ＨＤＬの欠乏症、及びＬＣＡＴの欠乏症が含まれる。

【０００７】 タンジエール病に関わる欠乏は、ＨＤＬの分解を伴なう細胞コレステロールの
トランスロケーションにおける細胞欠損に関連している。それにもかかわらず、
タンジエール病の場合、この欠損の正確な性質はいまだに正確には規定されてい
ない。

【０００８】 タンジエール病において、この細胞欠損は、リポタンパク質代謝の変調を生じ
る。末梢細胞からのコレステロールを組込まず、かつ正しく代謝されえないＨＤ
Ｌ粒子は、生物から迅速に除去される。従ってこれらの患者のＨＤＬ血漿濃度は
極端に低下し、ＨＤＬはもはや、肝臓へのコレステロールの戻りを保証しない。
このコレステロールは、これらの末梢細胞中に蓄積され、例えばオレンジ扁桃の
形成のような特徴的な臨床的兆候を引起す。さらにはその他のリポタンパク質変
調、例えばトリグリセリドの過剰生産、並びにリン脂質の増加した細胞内合成及
び異化作用が観察される。

【０００９】 上記のような症状のタンジエール病は、冠動脈疾患に冒されている患者におい
て最も普通に検出される、ＨＤＬ代謝に関係した家族性疾患に分類される。

【００１０】 数多くの研究によって、ＨＤＬコレステロールの低下したレベルは、冠動脈疾
患を見つけ出すことができる優れたリスク因子であることが証明された。

【００１１】 このような状況において、ＨＤＬ欠乏に関連した症候群は、アテローム性動脈
硬化症におけるＨＤＬの役割の理解を増すことができるという事実によって、過
去十年間に関心が高まっている。

【００１２】 遺伝子アポＡ−Ｉにおけるいくつかの突然変異が特徴決定された。これらの突
然変異はまれであり、アポＡ−Ｉの生産の欠如を生じることがある。

【００１３】 リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）又はその活性化因子アポＣ−ＩＩについて
コードする遺伝子における突然変異は、重症の高トリグリセライド血症及び非常
に低下したＨＤＬ−ｃのレベルと関連している。

【００１４】 レシチン酵素：コレステロール、アシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）につ
いてコードする遺伝子における突然変異も、重症のＨＤＬ欠乏に関連している。

【００１５】 さらにはコレステロールの逆輸送における機能不全は、生理学的欠損によって
誘発されるのであろう。これは、細胞内小胞の貯蔵されたコレステロールの膜表
面への輸送工程のうちの１つ又は複数に影響を与える。この膜表面のレベルにお
いて、コレステロールはＨＤＬによって引き受けられる。

【００１６】 従ってこの技術の状態において、コレステロール及び／又はリポタンパク質の
代謝工程のうちのいずれか１つに関わっている遺伝子、及び特に末梢細胞のコレ
ステロールの肝臓への逆輸送の機能不全に関連した遺伝子を同定する必要がます
ます大きくなっている。

【００１７】 最近、ゲノムの全体上に分配され、かつ互いの間が平均して１０．３ｃＭ離れ
ている３４３マイクロサテライトマーカーの様々なアレリック形態の分離研究が
実施された。

【００１８】 連鎖（ｌｉｎｋａｇｅ）研究が、１１世代に対して十分に特徴決定された一家
族に対して実施された。この家族の多くのメンバーがタンジエール病に冒されて
おり、この家族は５血統の血縁を含んでいる。

【００１９】 この研究によって、その疾患に統計学的に関連したヒト染色体９の遺伝子座９
ｑ３１中に局在化された領域を同定することができた（Ｒｕｓｔ Ｓ．ら、Ｎａ
ｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第２０巻、１９９８年９月、９６−９８ページ）
。

【００２０】 しかしながらＲｕｓｔらの研究は、タンジエール病に関連させることができる
改変を有するゲノムの広い領域のみを規定している。これは単に、該領域９ｑ３
１−３４が、ＥＳＴを含んでいるが、既知の遺伝子はまったく含んでいないこと
を明らかにするだけである。

【００２１】 本発明によれば今や、ヒトにおける遺伝子座９ｑ３１中に位置する約１ｃＭの
領域が、一般的にはＨＤＬの家族性欠乏と関連していることが証明された。

【００２２】 より正確には、遺伝子座９ｑ３１の１ｃＭの領域に正確に局在化されている輸
送体ＡＢＣ族のタンパク質についてコードする遺伝子が、コレステロールの逆輸
送における欠損に関係した病気に関わっていることが証明された。

【００２３】 より詳しくは本発明によれば、輸送体ＡＢＣ−１についてコードする遺伝子は
、コレステロールの逆輸送に冒されている患者において、とりわけタンジエール
病に罹っている患者において、突然変異されていることが証明された。

【００２４】 輸送体タンパク質ＡＢＣ（「ＡＴＰ結合カセット」）は、ヒトにおける細菌の
進化中に極端に保存されているタンパク質の一族を構成する。

【００２５】 輸送体タンパク質ＡＢＣは、種々の基質、例えばイオン、アミノ酸、ペプチド
、糖、ビタミン、あるいはさらにはステロイドホルモンの膜輸送に関わっている
。

【００２６】 あるいくつかの輸送体ＡＢＣのアミノ酸の完全配列の特徴決定によって、これ
らのタンパク質が一般に共通の構造、特にウオーカー（Ｗａｌｋｅｒ）Ａ及びＢ
型のモチーフを伴なう２つのヌクレオチド結合折畳み（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｆｏｌｄ又はＦＢＦ）、並びに２つの貫膜ドメインを有すると
決定することができた。これらの貫膜ドメインの各々は、６つの螺旋から成って
いる。輸送された様々な分子についての輸送体ＡＢＣの特異性は、貫膜ドメイン
の構造によって決定されるようであるが、一方、輸送活性に必要なエネルギーは
、ＮＢＦ折畳みのレベルにおけるＡＴＰの分解によって供給される。

【００２７】 ヒトにおいて同定された輸送体タンパク質ＡＢＣのいくつかは、様々な病気に
関連していた。

【００２８】 例えばムコビシドーシスは、遺伝子ＣＦＴＲ（のう胞性線維症貫膜コンダクタ
ンス調節剤）における突然変異によって引起される。

【００２９】 さらには腫瘍細胞中の医薬への多耐性のいくつかの表現型は、これも同様に輸
送体ＡＢＣの構造を有する、タンパク質ＭＤＲ（多薬剤耐性）をコードする遺伝
子中の突然変異に関連していた。

【００３０】 他の輸送体ＡＢＣは、ニューロン及び腫瘍疾患に関連しており（米国特許第５
，８５８，７１９号）、あるいはまた、金属のホメオスタシスの改変、例えばタ
ンパク質ＡＢＣ−３によって引起された病気に潜在的に関わっていた。

【００３１】 同様にもう１つの輸送体ＡＢＣは、ＰＦ１Ｃ２と呼ばれているが、これは進行
性家族性肝臓内胆汁分泌停止の一形態に関わっているように見える。このタンパ
ク質は潜在的に、ヒトの場合、胆汁塩の輸出の原因である。

【００３２】 １９９４年に、マウスの新規輸送体ＡＢＣについてコードするＤＮＡｃが同定
され、ＡＢＣ１と名付けられた（Ｌｕｃｉａｎｉら、１９９４年）。このタンパ
ク質は、高度に疎水性のセグメント及び２つのＮＢＦモチーフに結合した２つの
貫膜ドメインを含む対称構造を含んでいるという点において、輸送体ＡＢＣの特
徴である。

【００３３】 ヒトにおいて、ヒト輸送体ＡＢＣ１のオープンリーディング段階の全体を含む
部分的ＤＮＡｃが同定された（Ｌａｎｇｍａｎｎら、１９９９）。

【００３４】 同様に、ヒトタンパク質ＡＢＣ１についてコードする遺伝子が、種々の組織に
おいて、より詳しくは胎盤、肝臓、肺、副腎内、並びに胎児組織内で、高いレベ
ルで発現されることも証明された。

【００３５】 これらの研究者らはまた、ヒトタンパク質ＡＢＣ１についてコードする遺伝子
の発現が、試験管内でのマクロファージへの単核細胞の分化中に誘発されること
をも発明した。さらにはタンパク質ＡＢＣ１についてコードする遺伝子の発現は
、ヒトマクロファージがアセチル化低密度リポタンパク質（ＡｃＬＤＬ）の存在
下にインキュベーションされる時に増加する。

【００３６】 しかしながら脂質の輸送系におけるヒトタンパク質ＡＢＣ１の正確な役割は、
まったく知られていない。タンパク質ＡＢＣ１が、リン脂質のトランスロカーゼ
活性を有すると仮定されるだけである。

【００３７】 本発明によれば今や、タンジエール病に罹っている患者が、突然変異された遺
伝子ＡＢＣ１を含むことが証明された。遺伝子ＡＢＣ１の様々なエキソン中に分
配されているいくつかの突然変異は、様々な患者、特に冠動脈異常に関連する病
気の重症形態に冒された患者のゲノムにおいて同定された。さらには種々の多形
性が、この病気のより軽症の形態に罹っている患者において、遺伝子ＡＢＣ１の
エキソンとイントロンとにおいて同時に発見された。このことは、これらの患者
が、１つ又は複数の「野生型」アレレとは異なるこの遺伝子の特別なアレレレを
有することを示している。一部これらの多形性を特徴とするこのようなアレレは
さらに、それぞれこの遺伝子の第一エキソンの５’側、あるいはさらには最後の
エキソンの３’側に局在化された非コード領域において、特に調節領域において
、例えばプロモーター配列において、あるいはさらには活性化配列において（英
語で“ｅｎｈａｎｃｅｒ」）において、ヌクレオチドの置換、付加、欠失を含み
やすく、これはポリペプチドＡＢＣ１の合成において欠陥増加又は減少を誘発す
る性質を有するものである。

【００３８】 従って遺伝子ＡＢＣ１において、タンジエール病に罹っている患者において、
特別な第一突然変異が同定された。これは、エキソン１３に局在化されており、
ヌクレオチドの置換から成っており、これによって、オープンリーディング段階
への早すぎる翻訳停止コドンの導入を引起し、これはタンジエール病に冒されて
いない患者において、合成ポリペプチドのアミノ酸配列の約１／４を含む一部分
が欠けたポリペプチドの合成を生じる。

【００３９】 遺伝子ＡＢＣ１における特別な第二突然変異が発見された。これは、エキソン
１２への１００ヌクレオチドの断片の挿入から成っており、これは、次の点にお
いて異常なポリペプチドの合成を生じる。すなわち、これは６残基の欠失及び３
８アミノ酸の挿入を含む、それもタンパク質配列の４６８位において含むという
点においてである。

【００４０】 さらに本発明によれば、遺伝子ＡＢＣ１がアセチル化低密度リポタンパク質（
ＡｃＬＤＬ）によって確かに調節されていることも確認された。

【００４１】 （一般的定義） 本発明の意味における「単離されている」という用語は、もとの環境（これが
自然に局在化されている環境）から取られた生物学的物質（核酸又はタンパク質
）のことについて言う。

【００４２】 例えば植物又は動物において自然状態で存在するポリヌクレオチドは、単離さ
れていない。隣接核酸（この中でポリヌクレオチドは植物又は動物のゲノム中に
自然に挿入されている）から分離された同じポリヌクレオチドは、「単離されて
いる」と考えられる。

【００４３】 このようなポリヌクレオチドは、ベクター中に含まれていてもよく、及び／又
はこのようなポリヌクレオチドは、１つの組成物中に含まれていてもよく、それ
にもかかわらず、このベクター又は組成物がその自然の環境を構成していないと
いう事実によって、単離された状態に留まりうる。

【００４４】 「精製された」という用語は、この物質が、他の化合物の存在を排除する絶対
純度の形態で存在することを必要としない。これはむしろ相対的な定義である。

【００４５】 ポリヌクレオチドは、少なくとも好ましくは２又は３程度の大きさ、好ましく
は４又は５程度の大きさの出発原料又は天然物質の精製後の「精製された」状態
にある。

【００４６】 本明細書の目的のためには、「ヌクレオチド配列」という表現は、ポリヌクレ
オチド又は核酸を無差別に示すために用いることができる。「ヌクレオチド配列
」という表現は、遺伝物質それ自体を包含しており、従ってその配列に関する情
報には制限されない。

【００４７】 「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、あるいはさらに
は「ヌクレオチド配列」という用語は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＤＮＡｃ配列、あるい
はさらには１つ以上のヌクレオチドのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を、単鎖
形態でも二重鎖形態でも無差別に包含する。

【００４８】 「ヌクレオチド」という用語は、天然ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）と同時
に、例えば（１）プリンの類似体、（２）ピリミジンの類似体、又は（３）類似
糖のような少なくとも１つの修飾を含む、修飾されたヌクレオチドを示しており
、このような修飾ヌクレオチドの例は、例えばＰＣＴ出願第ＷＯ９５／０４０６
４号に記載されている。

【００４９】 本発明の目的のためには、第一ポリヌクレオチドは、第一ヌクレオチドの各塩
基が、逆の配向を有する第二ポリヌクレオチドの相補塩基と対になっている時、
第二ポリヌクレオチドの「相補的なもの」であると考えられる。相補塩基は、Ａ
とＴ（又はＡとＵ）、又はＣとＧである。

【００５０】 本発明による核酸の「変異型」とは、対照ポリヌクレオチドと比べて１つ又は
複数の塩基が異なる核酸のことを言う。変異型核酸は、天然起源のもの、例えば
自然界に見られるアレリック変異型であってもよく、あるいはまた、例えば突然
変異誘発技術によって得られた、非天然変異型であってもよい。

【００５１】 一般に対照核酸と変異型核酸との差は、対照核酸と変異型核酸のヌクレオチド
配列が非常に近くなるように、多くの領域では同一になるように小さくされる。
変異型核酸中に存在するヌクレオチドの修飾は、サイレントであってもよく、こ
のことは、これらの修飾が前記変異型核酸によってコードされたアミノ酸配列を
改変しないことを意味する。

【００５２】 しかしながら変異型核酸中のヌクレオチドの変化もまた、対照核酸によってコ
ードされたポリペプチドと比べて、変異型核酸によってコードされたポリペプチ
ドにおける置換、付加、欠失において結果として生じうる。さらにはコード領域
中のヌクレオチドの修飾は、アミノ酸配列における同類又は非同類置換を生じる
ことがある。

【００５３】 好ましくは本発明による変異型核酸は、対照核酸のポリペプチドと実質的に同
じ生物学的機能又は活性、あるいはさらには、最初の核酸によってコードされた
ポリペプチドに対して向けられた抗体によって認識される能力を保持するポリペ
プチドについてコードする。

【００５４】 従ってあるいくつかの変異型核酸は、体系的研究によって、問題のタンパク質
の構造・活性の関係を推論することができるポリペプチドの突然変異形態につい
てコードする。研究された病気に対してこれらの変異型を知ることは基本的なこ
とであるが、それは、これによって、この病気の分子的原因を理解することがで
きるからである。

【００５５】 「断片」とは、本発明による対照核酸、対照核酸と比べて小さくなった長さを
有し、かつ共通の部分において対照核酸と同一のヌクレオチド配列を有するヌク
レオチド配列のことを言う。

【００５６】 本発明による核酸のこのような「断片」は場合によっては、これが構成してい
る、より大きいポリヌクレオチドの中に含まれていてもよい。

【００５７】 このような断片は、本発明による核酸の８、１０、１２、１５、１８、２０〜
２５、３０、４０、５０、７０、８０、１００、２００、５００、１０００、又
は１５００連続ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを含んでいるか、ある
いはまたこれらから成っている。

【００５８】 本発明によるポリペプチドの「変異型」とは主として、対照ポリペプチドのア
ミノ酸配列と比べて、少なくとも１つのアミノ酸残基の１つ又は複数の置換、付
加、又は欠失を含むアミノ酸配列のポリペプチドのことを言い、アミノ酸の置換
は、無差別に同類であっても非同類であってもよいと理解される。

【００５９】 本発明によるポリペプチドの「断片」とは、対照ポリペプチドの配列よりも短
いアミノ酸配列を有し、かつこれらの対照ポリペプチドとの共通部分全体におい
て、同一のアミノ酸配列を含んでいるポリペプチドのことを言う。

【００６０】 このような断片は場合によっては、これらが属している、より大きいポリペプ
チドの中に含まれていてもよい。

【００６１】 本発明によるポリペプチドのこのような断片は、１０、１５、２０、３０〜４
０、５０、１００、２００、又は３００アミノ酸の長さを有していてもよい。

【００６２】 ヌクレオチド又はアミノ酸の２つの配列間の「同一性の割合％」は、本発明の
意味においては、比較窓（ｆｅｎｅｔｒｅ ｄｅ ｃｏｍｐａｒａｉｓｏｎ）を
通して、最適に整合された２つの配列を比較して決定することができる。

【００６３】 従って比較窓におけるヌクレオチド又はポリペプチド配列の部分は、２つの配
列の最適な整合を得るように、対照配列（これは付加も欠失も含んでいない）に
対して、付加又は欠失（例えば「ギャップ」）を含んでいてもよい。

【００６４】 この割合％は、同一な核塩基又はアミノ酸残基が、比較された２つの配列（核
又はペプチド配列）について観察される位置数を測定し、ついで２つの塩基又は
アミノ酸残基間に同一性がある位置数を、比較窓における位置総数で割り、つい
でこの結果に１００を掛けて計算され、配列の同一性の割合％が得られる。

【００６５】 この比較のための配列の最適な整合は、ウイスコンシン州マジソン、５７５サ
イエンスドクターのウイスコンシン・ジェネティックス・ソフトウエア・パッケ
ージ、ジェテティックス・コンピュータ・グループ社（ＧＣＧ）（ＷＩＳＣＯＮ
ＳＩＮ ＧＥＮＥＴＩＣＳ ＳＯＦＴＷＡＲＥ ＰＡＣＫＡＧＥ，ＧＥＮＥＴＩ
ＣＳ ＣＯＭＰＵＴＥＲ ＧＲＯＵＰ（ＧＣＧ），５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄ
ｏｃｔｏｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩＳＣＯＮＳＩＮ）のパッケージに入っている
既知のアルゴリズムによって、情報科学的に実施することができる。

【００６６】 例えば、配列の同一性割合％は、端数を切り捨てたパラメーターを専ら用いて
、ブラスト（ＢＬＡＳＴ）ソフトウエア（１９９６年３月のブラストバージョン
１．４．９、１９９８年２月のブラスト２．０．４、及び１９９８年９月のブラ
スト２．０．６）によって実施することができる（Ｓ．Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌら
、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９０、２１５；４０３−４１０、Ｓ．Ｆ．Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９７ ２５：３３８
９−３４０２）。ブラストは、Ａｌｔｓｃｈｕｌらのアルゴリズムを用いて、対
照「リクエスト」配列と同様な／相同な配列を求めている。このリクエスト配列
及び用いられたデータのベースは、ペプチドであっても又は核であってもよく、
あらゆる組合わせが可能である。

【００６７】 本発明の意味での「強緊縮ハイブリダイゼーション条件」とは、下記条件を意
味する： １．膜競合及びプレハイブリダイゼーション： −混合する：サケの精液４０μｌ ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ） ＋ヒト胎盤４０μｌ ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）。

【００６８】 −９６℃で５分間変性し、ついでこの混合物を氷の中に浸す。

【００６９】 −ＳＳＣ２Ｘを取り除き、これらの膜が入っているハイブリダイゼーション管
の中にホルムアミドミックス４ｍｌを注ぐ。

【００７０】 −変性された２つのＤＮＡの混合物を添加する。

【００７１】 −４２℃で５〜６時間、回転を伴なうインキュベーション。

【００７２】 ２．マークされたプローブの競合： −マーク及び精製されたプローブに、繰返し体の量に応じて、１０〜５０μｌ ＤＮＡ Ｃｏｔ ｌを添加する。

【００７３】 −９５℃で７〜１０分間変性する。

【００７４】 −６５℃で２〜５時間インキュベーションする。

【００７５】 ３．ハイブリダイゼーション： −プレハイブリダイゼーションミックスを取除く。

【００７６】 −サケの精液４０μｌ ＤＮＡ＋ヒト胎盤４０μｌ ＤＮＡを混合し、９６℃
で５分間変性し、ついで氷の中に浸す。

【００７７】 −ハイブリダイゼーション管の中に、ホルムアミドミックス４ｍｌ、２つのＤ
ＮＡの混合物、マークされたプローブ／変性されたＤＮＡ Ｃｏｔ ｌを添加す
る。

【００７８】 −４２℃で１５〜２０時間、回転を伴なってインキュベーションする。

【００７９】 ４．洗浄： −濯ぎ洗いをするために、周囲温度でＳＳＣ２Ｘ中での洗浄。

【００８０】 −周囲温度でＳＳＣ２Ｘで及び６５℃でＳＤＳ０．１％で５分間２回。

【００８１】 −６５℃でＳＳＣ１Ｘで、６５℃でＳＤＳ０．１％で１５分間２回。

【００８２】 これらの膜をサランに包んで暴露する。

【００８３】 前記ハイブリダイゼーション条件を、数百のヌクレオチドを有する２０ヌクレ
オチドの可変長さの核酸分子の強緊縮条件下でのハイブリダイゼーションに適合
させる。

【００８４】 前記ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションが求められてい
る核酸の長さ、又は当業者に知られている技術に従って選ばれたマーキング型に
応じて適合させてもよいことは言うまでもない。

【００８５】 便利なハイブリダイゼーション条件は、例えばＨＡＭＥＳ及びＨＩＧＧＩＮＳ
の研究（１９８５）、あるいはまたＦ．ＡＵＳＵＢＥＬらの研究（１９９９）に
含まれている教示に従って適合させてもよい。

【００８６】 遺伝子ＡＢＣ１の核酸 ゲノム配列 ヒト遺伝子ＡＢＣ１は、特にマウスにおけるオーソロガス遺伝子ＡＢＣ１の構
造を参照するならば、４８エキソンと４７イントロンとを含むであろう。

【００８７】 遺伝子ＡＢＣ１のいくつかの部分的ゲノムヌクレオチド配列が単離され、本発
明によって特徴決定された。これらのゲノム配列は、エキソン配列と新規イント
ロン配列とを同時に備えている。これらは特に、試料中の遺伝子ＡＢＣ１又はこ
れのヌクレオチド発現産物の様々な検出手段の製造のために用いることができる
。これらの部分的ゲノム配列を、下記表１に示す。

【００８８】

【表１】

【００８９】 従って本発明の第一の目的は、ヌクレオチド配列配列番号１−１４から成る群
から選ばれるポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸の少なくとも２４５連続ヌ
クレオチドを含む核酸から成る。

【００９０】 本発明はまた、ヌクレオチド配列配列番号１−１４から成る群から選ばれるポ
リヌクレオチド、又は相補配列の核酸の少なくとも２４５連続ヌクレオチドを含
む核酸との、少なくとも８０％、有利には９０％、好ましくは９５％、非常に好
ましくは９８％のヌクレオチド同一性を有する核酸にも関する。

【００９１】 遺伝子ＡＢＣ１の３２エキソンは少なくとも一部、下記表ＩＩに示されている
ような、これらのヌクレオチド配列を特徴としていた。

【００９２】

【表２】

【００９３】 従って本発明はまた、ヌクレオチド配列配列番号１５−４７から成る群から選
ばれるポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸を含む核酸にも関する。

【００９４】 さらには、遺伝子ＡＢＣ１の３５イントロンが単離され、少なくとも一部特徴
決定された。遺伝子ＡＢＣ１のイントロンのヌクレオチド配列、並びにこれらの
断片及びこれらの変異型はまた、試料中の遺伝子ＡＢＣ１の少なくとも１つのコ
ピーの存在を検出するため、あるいはまた遺伝子ＡＢＣ１中の決定された配列を
増幅させるためのヌクレオチドプローブ又はプライマーとしても用いることがで
きる。

【００９５】 遺伝子ＡＢＣ１のイントロン配列への参照は、下記表ＩＩＩに示されている。

【００９６】

【表３】

【００９７】 本発明はまた、ヌクレオチド配列配列番号４８−８９から成る群から選ばれる
ポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸の少なくとも８連続ヌクレオチドを含む
核酸にも関する。

【００９８】 本発明はさらに、ヌクレオチド配列配列番号４８−８９から成る群から選ばれ
るポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸との少なくとも８０％のヌクレオチド
同一性を有する核酸をも目的とする。

【００９９】 本発明はまた、強緊縮条件下に、ヌクレオチド配列配列番号４８−８９から成
る群から選ばれるポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸とハイブリダイズする
核酸にも関する。

【０１００】 さらには、遺伝子ＡＢＣ１の最後のエキソンの３’末端の下流に局在化されて
いる潜在的調節ゲノムヌクレオチド配列が単離された。配列配列番号９０のポリ
ヌクレオチドである。特にコレステロールの逆輸送における欠損の軽症形態、特
にタンジエール病の軽症形態に冒されている患者の場合、この潜在的調節配列に
おける多形性の特徴決定は、遺伝子ＡＢＣ１の発現の調節における欠陥を誘発し
やすいこれらの多形性のいくつかに特異的な、適切な検出手段、プローブ、又は
プライマーをつくることができるようにする性質のものであろう。

【０１０１】 配列配列番号９０の生物学的に活性なポリヌクレオチド断片を同定するために
、当業者は有利にはＳａｍｂｒｏｏｋらの研究（１９８９）を参照することがで
きるであろう。これは、マーカー遺伝子（例えばβガラクトシダーゼ、クロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ等）を有する組換えベクターの使用に
ついて記載している。これの発現は、このマーカー遺伝子が配列配列番号９０の
ポリヌクレオチドの適合させられたプロモーター及び生物学的に活性な断片の制
御下に置かれた時に検出することができる。配列配列番号９０の生物学的に活性
なこのような断片は特に、適切な調節配列の選択ベクター、例えばクロンテック
社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から販売されているベクターｐＳＥＡＰ−ベイシック（
Ｂａｓｉｃ）、ｐＳＥＡＰ−エンハンサー（Ｅｎｈａｎｃｅｒ）、ｐβｇａｌ−
ベイシック、ｐβｇａｌ−エンハンサー、あるいはさらにはｐＥＧＦＰ−１のう
ちの１つにクローンすることができる。

【０１０２】 本発明はさらに、ヌクレオチド配列配列番号９０から成る群から選ばれるポリ
ヌクレオチド、又は相補配列の核酸との少なくとも８０％のヌクレオチド同一性
を有する核酸をも目的とする。

【０１０３】 本発明はまた、強緊縮条件下に、ヌクレオチド配列配列番号９０から成る群か
ら選ばれるポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸とハイブリダイズする核酸に
も関する。

【０１０４】 完全ＤＮＡｃ 以前に既に指摘されているように、遺伝子ＡＢＣ１の発現に対応するＤＮＡｃ
の部分配列が、Ｌａｎｇｍａｎｎら（１９９９）によって同定された。ＡＢＣ１
のＤＮＡｃのこの部分配列は、６８８０ヌクレオチドを含んでおり、コレステロ
ールの逆輸送と関連した障害に冒されていない被験者において生産されるタンパ
ク質ＡＢＣ１に対応するオープンリーディング段階の全体を含んでいる。Ｌａｎ
ｇｍａｎｎら（１９９９）によって記載されたＤＮＡｃ配列はさらに、５’−Ｕ
ＴＲ（ヌクレオチド１〜１２０）領域の一部と、３’−ＵＴＲ（ヌクレオチド６
７２７〜６８８０）領域の一部とを含んでいる。

【０１０５】 本発明によれば今や、遺伝子ＡＢＣ１に対応する完全ＤＮＡｃの全体が単離さ
れ、特徴決定された。これは、新規３’−ＵＴＲ領域を含んでおり、これは、特
に細胞中のメッセンジャーＲＮＡの安定性の観点から重要な核領域を構成する。

【０１０６】 配列配列番号９１の転写物の発現分析が、実施例１に記載されているようにＲ
Ｔ−ＰＣＲによって実施された。様々な組織のＲＮＡポリＡ＋から実施されたこ
れらの分析によって、遺伝子ＡＢＣ１は胎児の大脳、大脳、心臓、胎盤、又は子
宮において発現されることを示すことができた。

【０１０７】 従って本発明はまた、ヒト遺伝子ＡＢＣ１のＤＮＡｃの配列配列番号９１のポ
リヌクレオチド、又は相補配列の核酸を含む核酸にも関する。

【０１０８】 配列配列番号９１のヒト遺伝子ＡＢＣ１のＤＮＡｃは、１２１位のヌクレオチ
ド（翻訳ＡＴＧの開始コドンの塩基Ａ）から配列配列番号９１の６７２３位のヌ
クレオチドまでのオープンリーディング段階を含んでいる。ポリアデニル化シグ
ナル（配列ＡＴＴＡＡＡのもの）が存在しており、これは配列配列番号９１の９
４５４位におけるヌクレオチドにおいて開始される。

【０１０９】 配列配列番号９１のＤＮＡｃは、２２０１アミノ酸長さを有し、かつアミノ酸
配列配列番号１３９を有するポリペプチドＡＢＣ１についてコードする。

【０１１０】 本発明はまた、配列配列番号９２のポリヌクレオチド、これの生物学的に活性
な断片、又は相補配列の核酸の少なくとも８連続ヌクレオチドを含む核酸にも関
する。

【０１１１】 本発明はまた、配列配列番号９２のポリヌクレオチド、これの生物学的に活性
な断片、又は相補配列の核酸との少なくとも８０％のヌクレオチド同一性を有す
る核酸をも目的とする。

【０１１２】 本発明のもう１つの目的は、強緊縮条件下に、配列配列番号９２のポリヌクレ
オチド、これの生物学的に活性な断片、又は相補配列の核酸とハイブリダイズす
る核酸から成る。

【０１１３】 遺伝子ＡＢＣ１中の多形性 突然変異 本発明によれば、いくつかの突然変異が、遺伝子ＡＢＣ１の配列において同定
された。これらの突然変異は、突然変異された配列によってコードされたポリペ
プチドＡＢＣ１の大きい構造的改変を生じた。これらの突然変異は特に、重大な
冠動脈障害に関連したタンジエール病の重症形態に罹っている患者において見ら
れた。特に有害な２つの突然変異を次に記載する。

【０１１４】 １．エキソン１２における突然変異 この突然変異は、配列配列番号２の正常なゲノムＤＮＡの４７２位のヌクレオ
チドから４８５位のヌクレオチドまでの局在化１４ヌクレオチド（「ＴＧＡＧＡ
ＧＧＡＡＧＴＴＣＴ」）のセグメントの欠失と、配列番号２の正常なゲノムＤＮ
Ａの４８６位のヌクレオチドの上流において、遺伝子ＡＢＣ１のエキソン１２の
配列中への１１０ヌクレオチドのＡｌｕ型の配列の挿入とから同時に成る。

【０１１５】 欠失／挿入のこの突然変異を有するエキソン１２は、ヌクレオチド配列配列番
号９３を有する。

【０１１６】 突然変異されたこの対応ＤＮＡｃは、ヌクレオチド配列配列番号９４を有し、
配列配列番号１４０の２２３３アミノ酸長さの突然変異されたポリペプチドＡＢ
Ｃ１についてコードする。これの構造は、配列配列番号１３９の正常なポリペプ
チドＡＢＣ１に比べて強く改変されている。

【０１１７】 ヌクレオチド配列配列番号９３及び９４、並びにポリペプチド配列配列番号１
４０もまた、本発明に属する。

【０１１８】 ２．エキソン１３における突然変異 この突然変異は、エキソン１３に局在化されているゲノム配列配列番号２の１
２３２位のヌクレオチド（Ｇ）の欠失から成る（エキソン１３の配列配列番号１
７の１０６位のヌクレオチドＧ）。１つの塩基のこの点欠失は、遺伝子ＡＢＣ１
のＲＮＡｍ中の正常なリーディング段階に停止コドンを導入する。

【０１１９】 この突然変異を有する遺伝子ＡＢＣ１のエキソン１３の配列は、配列配列番号
９５のポリヌクレオチドである。

【０１２０】 遺伝子ＡＢＣ１のエキソン１３におけるこの突然変異に対応するＤＮＡｃは、
ヌクレオチド配列配列番号９６によって表わされる。

【０１２１】 突然変異された遺伝子ＡＢＣ１によってコードされる突然変異タンパク質は、
５７４アミノ酸長さを有する。すなわち正常なタンパク質のアミノ酸長さの約１
／４である。一部分が欠けたポリペプチドは、アミノ酸配列配列番号１４１を有
する。 ＡＢＣ１の突然変異された配列の正常な配列を分化させうる構造的特徴（ゲノム
、メッセンジャーＲＮＡ、ＤＮＡｃ）は、試料中のＡＢＣ１の突然変異配列の検
出手段、特にＡＢＣ１の突然変異配列と特異的にハイブリダイズするプローブ、
あるいはさらには上記突然変異を有する遺伝子ＡＢＣ１の領域を選択的に増幅さ
せうるプライマーカップルをつくるために利用することができる。これらの突然
変異の存在の検出は特に、増幅された核酸の断片の長さを見分けること、前記特
異的プローブによる増幅断片のハイブリダイゼーションによって、あるいはさら
にはこれらの増幅断片の直接配列決定によって、実施することができる。

【０１２２】 このようにして本発明はさらに、ヌクレオチド配列配列番号９３−９６から成
る群から選ばれるポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸の少なくとも８連続ヌ
クレオチドを有する核酸をも目的とする。

【０１２３】 好ましくはこのような核酸は、下記のものを含んでいる： ａ）配列配列番号９３及び９４に局在化された配列Ａｌｕの少なくとも２つの
連続ヌクレオチド、好ましくは配列配列番号９３及び９４中に局在化された配列
Ａｌｕの５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、又は１００連
続ヌクレオチド； ｂ）あるいは配列配列番号９４及び９５において欠失された塩基Ｇの両側に位
置する少なくとも２つのヌクレオチド「ＣＴ」。

【０１２４】 同様に、前記２つの突然変異のどちらかを有するＡＢＣ１の配列（ゲノム、メ
ッセンジャーＲＮＡ）の領域に局在化された１つの核配列とハイブリダイズする
プライマーも、本発明の一部である。

【０１２５】 本発明はさらに、ヌクレオチド配列配列番号９３−９６から成る群から選ばれ
るポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸との少なくとも８０％のヌクレオチド
同一性を有する核酸にも関する。

【０１２６】 本発明はまた、強緊縮条件下に、ヌクレオチド配列配列番号９３−９６から成
る群から選ばれるポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸とハイブリダイズする
核酸にも関する。

【０１２７】 その他の多形性 その他の多形性は、遺伝子ＡＢＣ１の配列の中に見られた。特にコード領域（
エキソン）及び非コード領域に同時に局在化されているヌクレオチドの置換であ
る。

【０１２８】 コード領域の中に見られる多形性に関して、本質的にはＡＢＣ１のオープンリ
ーディグフレームのコドンの第三塩基上に局在化されている唯一のヌクレオチド
の置換であり、これらの置換は、当業者によく知られている、人間における遺伝
的変質の規則を考慮すると、コードされたアミノ酸の性質に関して修飾を伴なわ
ない。

【０１２９】 これらの多形性は、本明細書において４１塩基長さのヌクレオチド配列の形態
で示されている。多形塩基は、多形断片の中心に局在化されている。探し当てら
れた多形性の各々の場合、各々のアレレは従って４１塩基の配列として表わされ
、多形性それ自体は、それぞれこれらの形態の各々に対応する２つのヌクレオチ
ド配列によって規定される。遺伝子ＡＢＣ１において同定されている多形性は、
下記表ＩＶに示されている。

【０１３０】

【表４】

【０１３１】 被験者からのＤＮＡ試料中のこれらの多形性の検出は、例えば多形塩基を含む
ＡＢＣ１のヌクレオチド領域の特異的増幅、ついで増幅された断片の配列決定に
よって実施し、前記被験者が有する１つ又は複数のアレレの性質を決定すること
ができる。

【０１３２】 被験者からのＤＮＡ試料中のこれらの多形性の検出はまた、本発明による遺伝
子ＡＢＣ１の多形性の多形塩基のうちの１つを含む、決定されたアレレと特異的
にハイブリダイズするヌクレオチドプローブ又はプライマーを用いて実施するこ
ともできる。

【０１３３】 例えば、適切なヌクレオチドプライマーは例えば、その３’末端における塩基
が、前記多形性を含むこの断片の多形塩基の５’側のすぐ近くに局在化された塩
基とバイブリダイズするプライマーである。特異的プライマーのハイブリダイゼ
ーション工程後、例えば蛍光によって差別的にマークされた前記多形性の多形塩
基の２つの相補的ジデオキシヌクレオチドの混合物を用いた延長工程、ついで得
られた蛍光シグナルの検出工程によって、異なった仕方でマークされたこれら２
つの蛍光ジデオキシヌクレオチドのうちのどちらが組込まれたかを決定すること
ができ、この多形性のレベルに存在する多形塩基の性質を直接推論することがで
きる。

【０１３４】 これらのジデオキシヌクレオチドのマーキング及び検出のために、様々な方法
を用いることができる。ＦＲＥＴ（「蛍光共鳴エネルギー転移」に基づいた均一
相方法が、Ｃｈｅｎ及びＫｗｏｋ（１９９７年）によって記載された。この方法
によれば、多形性を含むゲノムＤＮＡの増幅断片を、マークされた三リン酸ジデ
オキシヌクレオチド及び修飾ポリメラーゼＴａｑの存在下に、５’末端において
フルオレセインでマークされたプライマーと共にインキュベーションする。マー
クされたプライマーは、相補ゲノムＤＮＡの配列上に存在するアレレの特異的マ
ークジデオキシヌクレオチドの組込みによって一塩基だけ伸ばされている。この
遺伝子型決定（ｇｅｎｏｔｙｐａｇｅ）反応が終わった時、マークされたジデオ
キシヌクレオチドの２つのマーカー化合物についての蛍光強度を、分離も精製も
行なわずに直接分析する。これらの工程の全体は、同じ管で実施されてもよく、
蛍光シグナルの修飾がリアルタイムにその後に続く。もう１つの実施態様によれ
ば、伸ばされたプライマーは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ型のマススペクトロメトリー
によって分析することができる。多形を有する部位のレベルに局在化された塩基
は、ミクロ配列決定のプライマーに添加された質量の測定によって同定される（
Ｈａｆｆ及びＳｍｉｒｎｏｖ、１９９７）。

【０１３５】 このようなヌクレオチドプライマーは例えば、支持体上に固定化されてもよい
。さらには、前記のような特異的多プライマーを、例えば秩序正しく支持体上に
固定化することもできる。これらのプライマーの各々は、本発明による遺伝子Ａ
ＢＣ１の多形性の１つの検出に適している。

【０１３６】 本発明による遺伝子ＡＢＣ１の多形性は、被験者におけるある一定のアレレの
存在と、この被験者のある一定の病気への素質、特に染色体領域９ｑ３１と既に
関連付けられている病気の１つ、好ましくはコレステロールの逆輸送の機能不全
に関連した病気への素質との間の関連性の研究において、特に遺伝マーカーとし
て有用である。

【０１３７】 複合形質（表現型）の遺伝的分析方法は、様々な種類を有する（Ｌａｎｄｅｒ
及びＳｃｈｏｒｋ、１９９４）。一般に、本発明によるビアレリック多形性は、
遺伝子型と表現型との間の統計的に有意な相関関係を証明するための技術の状態
において記載されている方法のいずれか１つにおいて有用である。ビアレリック
多形性は、連鎖分析（「ｌｉｎｋａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ」）及びアレレの共
有（「ａｌｌｅｌｅ ｓｈａｒｉｎｇ」）方法において用いることができる。好
ましくは本発明によるビアレリック多形性は、関連性の研究を用いて検出可能な
形質（表現型）と関連する遺伝子を同定するために用いられる。これは、この形
質によって影響を受けている家族を利用する必要もなく、さらには複合的及び散
発性形質と関連する遺伝子の同定をも可能にする方法である。

【０１３８】 本発明によるビアレリック多形性を利用するその他の統計学的方法は例えば、
Ｆｏｒｓｅｌｌら（１９９７）、Ｘｉｏｎｇら（１９９９）、Ｈｏｒｖａｔｈら
（１９９８）、Ｓｈａｍら（１９９５）、あるいはさらにはＮｉｃｋｅｒｓｏｎ
ら（１９９２）によって記載された方法である。

【０１３９】 もう１つの側面によれば、本発明はまた、前記のような少なくとも１つのビア
レリック多形性を含む遺伝子ＡＢＣ１のヌクレオチド配列にも関する。

【０１４０】 従って本発明はまた、ヌクレオチド配列配列番号９７−１０８から成る群から
選ばれ、かつ多形塩基を含むポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸の少なくと
も８連続ヌクレオチドを有する核酸にも関する。

【０１４１】 ヌクレオチドプローブ及びプライマー ヌクレオチド配列配列番号１−１４、１５−４７、４８−８９、９０、９２、
９４−９６、及び９７−１０８のいずれか１つから誘導された核酸の断片は、試
料中の遺伝子ＡＢＣ１の１つのヌクレオチド配列、あるいはさらにはこの後者の
ものの１つの断片又は変異型（突然変異又は多形性を含むもの）の少なくとも１
つのコピーの存在の検出に有用である。

【０１４２】 本発明によるヌクレオチドプローブ又はプライマーは、配列配列番号１−１４
、１５−４７、４８−８９、９０、９２、９３−９６、及び９７−１０８から成
る群から選ばれる１つの核酸、又は相補配列の核酸の少なくとも８連続ヌクレオ
チドを含んでいる。

【０１４３】 好ましくは本発明によるヌクレオチドプローブ又はプライマーは、本発明によ
る核酸、特に配列配列番号１−１４、１５−４７、４８−８９、９０、９２、９
３−９６、及び９７−１０８から選ばれるヌクレオチド配列の核酸、又は相補配
列の核酸の１０、１２、１５、１８、又は２０〜２５、３５、４０、５０、７０
、８０、１００、２００、５００、１０００、又は１５００連続ヌクレオチドの
長さを有するであろう。

【０１４４】 あるいはまた、本発明によるヌクレオチドプローブ又はプライマーは、本発明
による核酸、より詳しくは配列配列番号１−１４、１５−４７、４８−８９、９
０、９２、９３−９６、及び９７−１０８から選ばれる１つの核酸、又は相補配
列の核酸の１２、１５、１８、２０、２５、３５、４０、５０、１００、２００
、５００、１０００、又は１５００連続ヌクレオチドの長さの断片から成るか、
及び／又はこれを含むであろう。

【０１４５】 従って本発明によるヌクレオチドプローブ又はプライマーの定義は、前記のよ
うな強緊縮バイブリダイゼイション条件下において、配列配列番号１−１４、１
５−４７、４８−８９、９０、９２、９３−９６、及び９７−１０８から選ばれ
る１つの核酸、又はこれらの後者の相補配列の核酸とハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドを包含する。

【０１４６】 遺伝子ＡＢＣ１の種々の領域を増幅することができるプライマー及びプライマ
ーカップルの例は、下記表Ｖに示されている。

【０１４７】

【表５】 本発明による好ましいプローブ及びプライマーの第一実施態様によれば、これ
らは、ヌクレオチド配列配列番号１０９−１３８から選ばれるポリヌクレオチド
、又は相補配列の核酸のすべて又は一部を含んでいる。

【０１４８】 本発明によるヌクレオチドプライマー又はプローブは、当業者によく知られた
あらゆる適合方法によって調製することができる。この方法には、制限酵素のク
ローニング及び作用、あるいはさらには例えばＮａｒａｎｇら（１９７９）又は
Ｂｒｏｗｎら（１９７９）のホスホジエステル方法、Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９
８０）のジエチルホスホルアミダイト方法のような技術、あるいはさらには欧州
特許第ＥＰ０７０７５９２号に記載されている固体支持体上の技術よる化学合成
による方法が含まれる。

【０１４９】 前記オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマーが含まれる、本発明による核
酸の各々は、所望であれば、分光、光化学、生化学、免疫化学、あるいはさらに
は化学的手段によって検出しうるマーカーを組込んで、マークされてもよい。

【０１５０】 例えばこのようなマーカーは、放射性同位元素（３２Ｐ、３３Ｐ、３Ｈ、３５
Ｓ）、蛍光分子（５−ブロモデオキシウリジン、フルオレセイン、アセチルアミ
ノフルオレン、ジゴキシゲニン）、あるいはまた例えばビオチンのようなリガン
ドから成っていてもよい。

【０１５１】 プローブのマーキングは好ましくは、プライマーの延長によって、あるいはま
た５’又は３’末端上への付加によって、ポリヌクレオチドの中にマーク分子を
組込んで実施される。

【０１５２】 核酸断片の非放射性マーキングの例は特に、フランス特許第ＦＲ７８１０９７
５号、あるいはさらにはＵｒｄｅａら（１９８８）又はＳａｎｃｈｅｚ−ｐｅｓ
ｃａｄｏｒら（１９８８）の論文に記載されている。

【０１５３】 有利には本発明によるプローブは、このシグナルの増幅を可能にする性質の構
造的特徴を有していてもよい。例えばＵｒｄｅａら（１９９１）によって、ある
いはさらには欧州特許第ＥＰ−０２２５８０７号（ＣＨＩＲＯＮ）に記載されて
いるプローブである。

【０１５４】 本発明によるオリゴヌクレオチドプローブは特に、ゲノムＤＮＡのサザン型ハ
イブリダーゼーションにおいて、あるいはさらには対応する転写物の発現が試料
中において求められている時に、対応メッセンジャーＲＮＡのハイブリダイゼー
ションにおいて用いることができる。

【０１５５】 本発明によるプローブはまた、ＰＣＲ増幅産物の検出のために、あるいはさら
にはメソペア（ｍｅｓａｐｐａｒｉｅｍｅｎｔｓ）の検出にも用いることができ
る。

【０１５６】 本発明によるヌクレオチドプローブ又はプライマーは、固体支持体上に固定化
されてもよい。このような固体支持体は、当業者によく知られており、これらに
は、ミクロ滴定プレート容器（ｐｕｉｔｓ）の表面、ポリスチレン床、磁気床、
ニトロセルロースバンド、あるいはさらには例えばラテックス粒子のようなミク
ロ粒子が含まれる。

【０１５７】 従って本発明はまた、試料中の前記のような核酸の存在の検出方法にも関する
。前記方法は下記工程を含む： １）本発明による１つ又は複数のヌクレオチドプローブと、テストされる試料
とを接触させる工程； ２）１つ又は複数のプローブと、試料中に存在する核酸との間に場合によって
は形成される複合体を検出する工程。

【０１５８】 本発明による検出方法の特別な実施態様によれば、１つ又は複数のオリゴヌク
レオチドプローブは、支持体上に固定化されている。

【０１５９】 もう１つの側面によれば、オリゴヌクレオチドプローブは、検出可能なマーカ
ーを含んでいる。

【０１６０】 本発明はさらに、試料中の本発明による核酸の存在の検出のために必要なもの
又はキットに関する。前記必要なものは、次のものを含んでいる： ａ）例えば前記のような１つ又は複数のヌクレオチドプローブ； ｂ）場合によっては、ハイブリダイゼーション反応に必要な反応体。

【０１６１】 第一側面によれば、検出に必要なもの又はキットは、１つ又は複数のプローブ
が支持体上に固定化されていることを特徴とする。

【０１６２】 第二側面によれば、検出に必要なもの又はキットは、オリゴヌクレオチドプロ
ーブが、検出可能なマーカーを含んでいることを特徴とする。

【０１６３】 前記検出キットの特別な実施態様によれば、このようなキットは、関連標的配
列を検出するため、あるいはまた本発明による核酸、より詳しくは配列配列番号
１−１４、１５−４７、４８−８９、９０、９２、９３−９６、及び９７−１０
８の核酸、又は相補配列の核酸のコード領域又は非コード領域における突然変異
を検出するために用いることができる、本発明に合致する複数のオリゴヌクレオ
チドプローブを含む。

【０１６４】 従って支持体上に固定化された本発明によるプローブは、例えば「ＤＮＡチッ
プ」のようにマトリックスにおいて秩序正しいものであってもよい。このような
秩序のあるマトリックスは特に、米国特許第５，１４３，８５４号、ＰＣＴ出願
第ＷＯ ９０／１５０７０号及び第９２／１００９２号に記載されている。

【０１６５】 オリゴヌクレオチドプローブが高密度で固定化されている支持体マトリックス
は、例えば米国特許第５，４１２，０８７号、及びＰＣＴ出願第ＷＯ ９５／１
１９９５号に記載されている。

【０１６６】 本発明によるヌクレオチドプローブは、本発明による核酸のいずれか１つ、よ
り詳しくは配列配列番号１−１４、１５−４７、４８−８９、９０、９２、９３
−９６、及び９７−１０８の核酸、あるいはさらにはこれの変異型の全部又は一
部を増幅させるために用いられてもよい。

【０１６７】 本発明のもう１つの目的は、本発明による核酸、より詳しくは配列番号１−１
４、１５−４７、４８−８９、９０、９２、９３−９６、及び９７−１０８の核
酸、又は試料の中に含まれているこれの断片又は変異型の増幅方法に関する。前
記方法は、下記工程を含んでいる： ａ）増幅反応に必要な反応体の存在下において、標的核酸の存在が疑われる試
料と、ハイブリダイゼーション位置が、増幅が求められている標的核酸の領域の
それぞれ５’側及び３’側に局在化されている一対のヌクレオチドプライマーと
を接触させる工程；及び ｂ）増幅された核酸の検出工程。

【０１６８】 前記のような増幅方法の実施のためには、有利には前記ヌクレオチドプライマ
ーのいずれか１つを利用する。

【０１６９】 本発明はさらに、本発明による核酸、より詳しくは配列配列番号１−１４、１
５−４７、４８−８９、９０、９２、９３−９６、及び９７−１０８の核酸の全
部又は一部の増幅に必要なもの又はキットをも目的とする。前記必要なもの又は
キットは、次のものを含んでいる： ａ）ハイブリダイゼーション位置が、増幅が求められている標的核酸のそれぞ
れ５’側及び３’側に局在化されている、本発明に合致するヌクレオチドプライ
マーカップル； ｂ）場合によっては、増幅反応に必要な反応体。

【０１７０】 このような増幅に必要なもの又はキットは、有利には前記のような少なくとも
一対のヌクレオチドプライマーを含む。

【０１７１】 好ましい第一実施態様によれば、本発明によるプライマーは、前記第一突然変
異（欠失／挿入）を有する遺伝子ＡＢＣ１のエキソン１２の領域を増幅しうる、
ヌクレオチド配列配列番号１０９及び１１０から選ばれるポリヌクレオチド、又
は相補配列の核酸の全部又は一部を含んでいる。

【０１７２】 好ましい第二実施態様によれば、本発明によるプライマーは、前記第ニ突然変
異（塩基Ｇの欠失）を有する遺伝子ＡＢＣ１のエキソン１３の領域を増幅しうる
、ヌクレオチド配列配列番号１１１及び１１２から選ばれるポリヌクレオチド、
又は相補配列の核酸の全部又は一部を含んでいる。

【０１７３】 好ましい第三実施態様によれば、本発明によるプライマーは一般に、ヌクレオ
チド配列配列番号１０９−１３８から選ばれるポリヌクレオチド、又は相補配列
の核酸の全部又は一部を含んでいる。

【０１７４】 好ましい第四実施態様によれば、本発明はまた、配列配列番号９７−１０８か
ら成る群から選ばれる１つの核酸、又は相補配列の核酸の少なくとも１５連続ヌ
クレオチドを含むヌクレオチドプライマーにも関する。これらのプライマーの３
’末端の塩基は、配列配列番号９７−１０８又はこれらの相補配列の１つの多形
塩基の５’側のすぐ近くに局在化されているヌクレオチドの相補的なものである
。

【０１７５】 もう１つの側面によれば、本発明はまた、配列配列番号９７−１０８から成る
群から選ばれる１つの核酸、又は相補配列の核酸の少なくとも１５連続ヌクレオ
チドを含むヌクレオチドプライマーにも関する。これらのプライマーの３’末端
の塩基は、これらの配列配列番号９７−１０８又はこれらの相補配列のうちの１
つの多形塩基の５’側の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、
１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチド又はそれ以上に
位置するヌクレオチドの相補的なものである。３’末端におけるヌクレオチドが
、配列配列番号９７−１０８の１つの多形塩基の５’側の２０以上のヌクレオチ
ドに局在化されたヌクレオチドの相補的なものであるプライマーを構成するため
に、当業者なら有利には、アレレの性質が求められている多形性を含む、配列配
列番号１−１４、あるいはさらには配列番号１５−４７、及び４８−９０のうち
の対応するゲノム配列を参照するであろう。

【０１７６】 このようなプライマーは、被験者の遺伝子型決定及び／又は集団の遺伝子型決
定方法の枠内で、特に被験者において特別なアレレ形態又は特別なアレレ群（半
数型（ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ））の形態と、これらの被験者における特別な表現
型（形質）の存在、例えばこれらの被験者が、コレステロールの逆輸送における
欠損に関連した病気を発生させる素質、あるいはさらにはこれらの被験者が、染
色体９、より正確には腕９ｑ上、さらにより正確には遺伝子座９ｑ３１の中に位
置する候補染色体領域を有する病気を発生させる素質との間の関連性の研究の枠
内で特に有用である。 ＤＥＲＫＦＷ組換えベクター 本発明は、本発明による核酸を含む組換えベクターに関する。

【０１７７】 このような組換えベクターは次の核酸の中から選択した核酸を含むのが有利で
ある。すなわち、 ａ） 配列配列番号９２の核酸またはこの核酸の生物学的に活性なフラグメン
ト、 ｂ） 配列配列番号９１、９４または９６のポリヌクレオチドを含む核酸、 ｃ） ヌクレオチド配列配列番号１５〜４７および４８〜９０からなる群から
選択されるポリヌクレオチドを含む核酸、 ｄ） ヌクレオチドとして、配列 配列番号１５〜４７および４８〜９０から
なる群から選択された核酸、またはこの核酸のフラグメントまたはこの核酸の異
性体と少なくとも８０％同一性を有する核酸、 ｄ）極めて厳密なハイブリダイゼーション条件において、配列 配列番号１５
〜４７および４８〜９０の核酸、またはこの核酸のフラグメントまたは異性体と
ハイブリッド形成する核酸。

【０１７８】 本発明の意味での『ベクター』とは、一本鎖または２本鎖の形態には拘わらず
、環状または線状 ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を言う。

【０１７９】 第１実施方法に従って、本発明による組換えベクターは、所望の細胞宿主の形
質転換または形質移入後にそこに（組換えベクター）挿入される核酸を増幅する
ために使用される。

【０１８０】 第２の実施方法に従って、本発明に準拠する核酸の他に、本発明による組換え
ベクターは、核酸の転写および／または翻訳に導くことができる制御配列含む発
現ベクターに関する。

【０１８１】 有利な実施方法に従って、本発明による組換えベクターは特に次の要素を含む
。

【０１８２】 （１） プロモーターおよび活性化配列（転写促進因子）のような、挿入すべ
き核酸の発現を制御するエレメント、 （２） このようなベクター内に挿入すべき、本発明に準拠する核酸の中に含
まれるコード配列、前記コード配列は（１）に記載した制御信号との局面で配置
される、 （３） 適切な転写開始配列および終止配列。

【０１８３】 さらに、本発明による組換えベクターは、増幅または発現が求められる細胞の
宿主内で一つまたは複数の複製開始点、マーカーまたは選択マーカーを有してい
てもよい。

【０１８４】 例として、細菌プロモーターは Ｌａｃｌ、ＬａｃＺプロモーター、バクテリ
オファージＴ３またはＴ７のＲＮＡポリメラーゼプロモーター、λファージのＰ
ＲまたはＰＬプロモーターであってもよい。

【０１８５】 真核細胞用プロモーターはＨＳＶウイルスのチミジンキナーゼのプロモーター
またはマウスのメタロチオネイン−Ｌのプロモーターを含む。

【０１８６】 一般に、採用するプロモーターの選択には、当業者は上述した Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋらの著作（１９８９年）またはＦｕｌｌｅｒらの技術文書（１９９６年）を
参考にするのが有利であろう。 ＡＢＣ１遺伝子のゲノム配列の発現が望ましい場合は、大きな挿入配列を含むこ
とが可能なベクターを用いるのが好ましい。この特別な実施方法では、Ｓｔｅｒ
ｎｂｅｒｇが記載している（１９９２、１９９４年）ベクター ｐ１５８または
さらにベクターｐ１５８／ネオ８などのバクテリオファージベクターＰ１のよう
なバクテリオファージベクターを使用するのが好ましい。

【０１８７】 本発明による好ましい細菌性ベクターは、たとえばベクターｐＢＲ３２２（Ａ
ＴＣＣ３７０１７）、またはｐＡＡ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓ
ａｌａ、スウェーデン）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、
Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）のようなベクターである。

【０１８８】 さらに、ベクターｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｓ
ｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＡ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮ
Ｈ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ＯＧ４４、ｐＸＴＩ
、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のようなその他の市販のベクターを挙げるこ
とができる。

【０１８９】 さらに、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａから派生したＳｆ９（
ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７１１）系統の細胞を形質移入するために使用されるベク
ターｐＶＬ１３９２／１３９３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）のようなバキュロウイ
ルス型のベクターでもよい。

【０１９０】 さらには２または５型のヒトアデノウイルスのようなアデノウイルスベクター
であってもよい。

【０１９１】 本発明による組換えベクターはまた、レトロウイルスまたはアデノ随伴ベクタ
ー（ＡＡＶ）であってもよい。このようなアデノ随伴ベクターはたとえば Ｆｌ
ｏｔｔｅら（１９９２年）、Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９年）またはＭｃＬａ
ｕｇｈｌｉｎ ＢＡら（１９９６年）により記載されている。

【０１９２】 本発明によるポリヌクレオチドの発現を可能にするために、これらのポリヌク
レオチドを宿主細胞内に導入する必要がある。本発明によるポリヌクレオチドの
宿主細胞内への導入は、細胞の形質転換または形質移入を行うために当業者によ
く知られた技術により、インビトロで、あるいは一次培養において、あるいは細
胞系統形態下で行ってもよい。また、コレステロールの逆輸送不全に関連する病
気の予防または治療のために、本発明によるポリヌクレオチドの導入をインビボ
またはエックスビボで行うことも可能である。

【０１９３】 ポリヌクレオチドまたはベクターを宿主細胞内へ導入するために、当業者は、
リン酸カルシウムによる沈殿技法（Ｇｒａｈａｍら、１９７３年、Ｃｈｅｎら、
１９８７年）、ＤＥＡＥデキストラン（Ｇｏｐａｌ、１９８５年）、電気穿孔法
（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ、１８９６年、Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４年）、直接微量
注入（Ｈａｒｌａｎｄら、１９８５年）、ＤＮＡ電荷リポソーム（Ｎｉｃｏｌａ
ｕら、１９８２年、Ｆｒａｌｅｙら、１９７９年）のようなさまざまな技術を参
考にするのが有利である。

【０１９４】 ひとたびポリヌクレオチドが宿主細胞内に導入されると、細胞のゲノム内に安
定した状態で取り込まれる。取り込みはゲノムの一定の場所で相同的組換えによ
り行われてもよく、または場所を特定せずに行われてもよい。実施方法によって
は、ポリヌクレオチドは、エピソームフラグメントの形態下で宿主細胞内に安定
的に維持されることも可能で、エピソームはこのエピソームを細胞サイクルから
独立して、あるいは細胞サイクルと同期して維持、複製することができる配列を
含んでいる。

【０１９５】 特別な実施方法により、本発明によるポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入す
る方法、特に哺乳類に由来する宿主細胞内にインビボで導入する方法には、医薬
的に適合性のあるベクターと、適切な制御配列のコントロール下に置かれた本発
明による『裸の』ポリヌクレオチドとを含むプレパラートを、選択した組織、た
とえば平滑筋組織に局所注入により導入する工程が含まれ、『裸の』ヌクレオチ
ドは、この組織の細胞に吸収される。

【０１９６】 『裸の』ポリヌクレオチドを含む、インビトロおよびインビボで利用する組成
物はたとえば、ＰＣＴ出願番号 ＷＯ９５／１１３０７（パスツール研究所、国
立衛生医学研究所、オタワ大学）、ならびにＴａｃｓｏｎら（１９９６年）およ
びＨｕｙｇｅｎら（１９９６年）の論文に掲載されている。

【０１９７】 本発明の特殊実施方法により、ＡＢＣ１蛋白のインビボ生成のための組成物が
提供されている。この組成物は、物理理論学上受容可能なベクター内に溶液状で
、適切な調節配列のコントロール下に置かれたＡＢＣ１ポリペプチドのためのコ
ードポリヌクレオチドを含む。

【０１９８】 選択された宿主生物に注入されるベクターの量は注入部位により異なる。参考
までに、動物の、好ましくはコレステロールの逆輸送不全に関連する病気が進行
する可能性のある患者、またはすでにこの病気が進行している患者の体内にＡＢ
Ｃ１蛋白質をコードするポリヌクレオチドを約０．１〜１００μｇ注入してもよ
い。

【０１９９】 したがって、本発明はまた、物理理論学上適合性のある一つまたは複数の賦形
剤と組み合わせたＡＢＣ１蛋白質をコードする核酸を含む、コレステロールの逆
輸送機能不全の罹っている患者の予防または治療のための医薬組成物にも関する
。

【０２００】 有利には、このような組成物は、適切な制御エレメントのコントロール下に置
かれた、配列配列番号９１のポリヌクレオチドを含む。

【０２０１】 本発明はさらに、物理理論学上適合性のある一つまたは複数の賦形剤と組み合
わせた本発明による組換えベクターを含む、コレステロールの逆輸送機能不全に
罹患した患者の予防または治療のための医薬組成物を対象とする。

【０２０２】 本発明はまた、さまざまな形態のアテローム性動脈硬化症の予防のための、ま
たはより詳細にはコレステロールの逆輸送機能不全の患者の治療のための医薬品
製造のために、ＡＢＣ１蛋白質をコードする、本発明による核酸の使用に関する
。

【０２０３】 本発明はまた、さまざまな形態のアテローム性動脈硬化症の予防のための、ま
たはより詳細にはコレステロールの逆輸送機能不全の患者の治療のための医薬品
製造のために、ＡＢＣ１蛋白質をコードする核酸を含む、本発明による組換えベ
クターの使用に関連する。

【０２０４】 体細胞遺伝子治療方法に使用されるベクターおよびこのようなベクターを含む
組成物 本発明はまた、コレステロール輸送に関連する病理を処置するための新規の治
療方法にも関する。本発明は、コレステロールの輸送および代謝に関与するＡＢ
Ｃ１蛋白質をコードする遺伝子のインビボでの伝達および発現により、遺伝子治
療によるコレステロール輸送に関する病気を治療できることを証明することで、
従来技術の不都合面を対して優れた解決策を提供する。このように本発明は、た
とえばアテローム性動脈硬化症のような関連する病理の特殊なかつ効果的な治療
を可能にする簡単な方法を提供する。

【０２０５】 遺伝子治療は、欠陥または異常（異常な突然変異や発現、等）を修正する、ま
たは害を受けた細胞または器官内に遺伝情報を導入することで、治療効果のある
蛋白質を発現させるものである。この遺伝情報は、器官から抽出した細胞内に
エックスビボで導入され、修正された細胞が生体内に戻されてもよく、あるいは
直接適切な組織内に導入されてもよい。第２の場合さまざまな技術が存在し、中
でもＤＮＡとＤＥＡＥ−デキストランとの複合体（Ｐａｇａｎｏら、Ｊ． Ｖｉ
ｒｏｌ． １（１９６７年） ８９１）、ＤＮＡと核蛋白質との複合体（Ｋａｎ
ｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３（１９８９年）３７５）、ＤＮＡと脂質との複
合体（Ｆｅｌｇｎｅｒら、ＰＮＡＳ８４（１９８７年）７４１３）、リポソーム
の使用（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２５（１９８０年）１０
４３１）、等を必要とするさまざまな形質移入技術ある。近年、これら形質移入
の物理的技術にとって有望な代替技術として遺伝子伝達のためのベクターとして
ウイルスを使用する方法が発表された。このためにさまざまなウイルスが、一定
の細胞群を感染させる能力についてテストが行われた。特にこれらはレトロウイ
ルス（ＲＳＶ、ＨＭＳ、ＭＭＳ、等）、ＨＳＶウイルス、アデノ随伴ウイルス、
およびアデノウイルスである。

【０２０６】 したがって本発明は、ＡＢＣ１をコードする遺伝子をインビボで伝達および発
現させる、コレステロールの輸送に関連する病気の処置ための新規の治療方法に
も関する。特に有利に、本出願人は今回、コレステロールの代謝に関与するＡＢ
Ｃ１蛋白質に対してコードする ＤＮＡ配列を含む組換えウイルスを構成し、こ
れら組換えウイルスをインビボで投与することが可能であること、またこの投与
により、インビボで生物学的に活性なＡＢＣ１蛋白質の安定したかつ有効な発現
が可能であり、しかも細胞病理学的な副作用がないことを証明した。

【０２０７】 本発明はまた、アデノウイルスがＡＢＣ１遺伝子の伝達と発現に対して特に有
効なベクターであることが明らかになったことに由来している。特に本発明は、
ベクターとして組換えアデノウイルスの使用することで、この遺伝子の十分に高
い発現レベルが得られ、求められている治療効果を生み出すことができることを
証明するものである。遺伝子の安定した発現を可能にするレトロウイルスまたは
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のようなその他ベクターも本請求の対象である。

【０２０８】 このように本発明は、コレステロールの輸送異常に関連する心血管病態および
神経性病態の治療および予防の新しい方法を提供する。

【０２０９】 したがって本発明はまた、コレステロールの代謝に関与するＡＢＣ１蛋白質に
対してコードする核配列を含む欠損組換えウイルスも対象とする。

【０２１０】 本発明はまた、心血管病の治療および／または予防のための医薬組成物調製の
ためのこのような欠陥組換えウイルスの使用にも関する。

【０２１１】 本発明はまた、生物学的に活性なＡＢＣ１蛋白質のインビボでの長期にわたる
かつ有効な発現を可能にする、上述したようなウイルスによりエックスビボで遺
伝子的に修正された細胞、またはこのようなウイルスを生成する、生体内に移植
された細胞の使用にも関する。

【０２１２】 本発明は、ウイルスベクター内にＡＢＣ１をコードするＤＮＡ配列を取り込ま
せることが可能であること、かつこれらのベクターが生物学的に活性な成熟形態
を有効に発現させることが可能であることを証明する。より詳細には、本発明は
、アデノウイルスを直接投与することにより、または生成細胞、またはそのよう
なＤＮＡを取り込んだアデノウイルスまたはレトロウイルスによって遺伝子的に
修正された細胞を移植することによりＡＢＣ１がインビボで発現される可能性が
あることを証明する。

【０２１３】 本発明は、コントロールされた発現を引き起こすことが可能であり、しかも通
常この蛋白質の発現には関係しない器官にＡＢＣ１の有害な影響を与えないので
特に有益である。特に本発明のベクターを生成する細胞、または本発明のベクタ
ーにエックスビボで感染させた細胞を移植することにより、ＡＢＣ１蛋白質が有
意に単離される。

【０２１４】 本発明の範囲内でもたらされるコレステロールの輸送体活性はヒトＡＢＣ１型
または動物ＡＢＣ１型であってもよい。本発明の範囲内で使用する核配列は、ｃ
ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＲＮＡ（レトロウイルスの場合）、または
一つまたは複数のイントロンが挿入されたたとえばｃＤＮＡからなるハイブリッ
ド構成であってもよい。さらに合成配列または半合成配列であってもよい。特に
有利な方法としては、ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡを用いる。特にｇＤＮＡはヒト細
胞においてより優れた発現を可能にする。本発明によるウイルスベクター内これ
らを取り込めるようにするには、特に、適切な制限部位を挿入するためには、こ
れらの配列をたとえば方向付けされた変異誘発により修正するのが有利である。
従来技術に記載されている配列は本発明による使用のために構成されておらず、
大量の発現を得るには予め調整を行うことが必要な場合がある。本発明の範囲内
においては、ヒトＡＢＣ１蛋白質に対してコードする核配列を使用するのが好ま
しい。さらにこれらＡＢＣ１蛋白質の誘導体に対してコードする構成を用いるこ
とも可能である。これらＡＢＣ１蛋白質の誘導体はたとえば、未変性配列に対し
て行われる変異、遺伝子欠失および／または付加により得られるもので、コレス
テロール輸送体活性を保持した生成物をコードするあらゆる配列を含む。これら
の修正は当業者に既知の技術で行うことができる（下記の細胞生物学の一般技術
を参照）。このようにして得られた誘導体の生物学的活性は、特に実施例で示し
たように、細胞からのコレステロールの流出測定により、容易に決定することが
できる。本発明の意味での誘導体はまた、プローブとして未変性配列またはその
フラグメントを用いて、核酸バンクからハイブリダイゼーションにより得ること
も可能である。

【０２１５】 これらの誘導体は特に、その固定部位に対してより大きな親和力を有する分子
、プロテアーゼに対して耐性を増した分子、より優れた治療効果を有するまたは
副作用が少なく、または場合によっては新規の生物学的特性を持つ分子である。
誘導体はまたインビボにおけるより優れた発現を可能にする修正されたＤＮＡ配
列を含む。

【０２１６】 第１の実施方法においては、本発明は、コレステロールの輸送および代謝に関
与するＡＢＣ１蛋白質をコードするｃＤＮＡ配列を含む欠損組換えウイルスに関
する。本発明の好ましい別の実施方法においては、ＤＮＡ配列はｇＤＮＡ配列で
ある。

【０２１７】 本発明のベクターはさまざまな型のウイルスから調製してもよい。好ましくは
、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ
）またはレトロウイルスから誘導したベクターを使用する。特に、移植目的の細
胞の直接投与またはエックスビボでの修正のためにはアデノウイルス、生成細胞
の移植のためにレトロウイルスを用いるのが有利である。

【０２１８】 本発明によるウイルスは欠損したウイルス、すなわち標的細胞内において自力
で複製することができないウイルスである。したがって一般に、本発明の範囲内
で使用する欠損ウイルスのゲノムは少なくとも、感染させた細胞内において前記
ウイルスの複製に必要な配列を欠失している。これらの領域は（すべてまたは一
部を）除去する、あるいは機能不可にする、あるいは他の配列、特にＡＢＣ１蛋
白質をコードする核配列によって置換してもよい。しかしながら好ましくは欠損
ウイルスは、ウイルス粒子のキャプシド形成に必要なそのゲノム配列は保持して
いる。

【０２１９】 より詳細にはアデノウイルスに関しては、構造および特性が多少異なったさま
ざまな血清型が分類されている。これらの血清型の中で、本発明の範囲では、２
または５型のヒトアデノウイルス（Ａｄ２またはＡｄ５）または動物起源アデノ
ウイルス（請求 ＷＯ９４／２６９１４を参照）を用いるのが好ましい。本発明
の範囲で使用可能な動物起源アデノウイルスの中では、イヌ、ウシ、マウス（例
：Ｍａｖ１， Ｂｅａｒｄら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５（１９９０年）８１）、ヒ
ツジ、ブタ、トリまたはサル（例：ＳＡＶ）からのアデノウイルスがある。好ま
しくは動物起源アデノウイルスはイヌアデノウイルスであり、より詳細にはＣＡ
Ｖ２アデノウイルス［たとえばマンハッタンまたはＡ２６／６１（ＡＴＣＣ Ｖ
Ｒ−８００）株］である。本発明の範囲内では、好ましくはヒトまたはイヌまた
はその混合のアデノウイルスを使用する。好ましくは、本発明の欠損アデノウイ
ルスは、ＩＴＲ、キャプシド形成を可能にする配列およびＡＢＣ１蛋白質をコー
ドする配列を含む。本発明のアデノウイルスゲノムにおいては、少なくとも領域
Ｅ１が機能不可になっているのが有利である。さらに、本発明のアデノウイル
スゲノムにおいて、遺伝子Ｅ１、および遺伝子 Ｅ２、Ｅ４、Ｌ１〜Ｌ５のうち
の少なくとも一つが機能不可であることがより好ましい。考慮するウイルス遺伝
子を当業者に既知のあらゆる技術により機能不可にしてもよく、特に考慮する一
つまたは複数の遺伝子において全面的抑制、置換、部分的除去、または一つまた
は複数の塩基の付加により機能不可にする。このような修正は、たとえば遺伝子
工学を用いて、または変異誘発因子よる処理を行ってインビトロで（単離したＤ
ＮＡ上で）またはｉｎ ｓｉｔｕで得ることが可能である。他の領域、特に領域
Ｅ３（ＷＯ９５／０２６９７）、Ｅ２（ＷＯ９４／２８９３８）、Ｅ４（ＷＯ９
４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／１２６９７）およびＬ５（
ＷＯ９５／０２６９７）を修正することもできる。好ましい実施方法により、本
発明によるアデノウイルスは領域 Ｅ１およびＥ４おいて欠失があり、ＡＢＣ１
をコードする配列が不活性化された領域Ｅ１を挿入する。別の好ましい実施方法
に従って、本発明によるアデノウイルスは領域 Ｅ１において欠失があり、そこ
に領域 Ｅ４およびＡＢＣ１をコードする配列を挿入する（仏特許請求 ＦＲ９
４１３３５５）。

【０２２０】 本発明による欠損組換えウイルスは当業者に既知のあらゆる技術により調製さ
れてもよい（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ１０１（１９９１年）１９５、ＥＰ１
８５５７３、Ｇｒａｈａｍ、ＥＭＢＯ Ｊ．３（１９８４年）２９１７）。特に
これらは、アデノウイルスと、なかでもＡＢＣ１蛋白質をコードするＤＮＡ配列
を有するプラスミドとの相同組換えにより調製されてもよい。相同組換えは適切
な細胞系統における前記アデノウイルスとプラスミドとの同時形質移入後に行わ
れる。使用する細胞系統は好ましくは、（i）前記エレメントにより形質転換が
可能であること、（ii）欠損アデノウイルスのゲノムの一部を、好ましくは組換
えの危険を避けるために完全な形態で補うことができる配列を有していること。
系統の例としては、そのゲノムに組み入れられた、特にアデノウイルスＡｄ５の
ゲノム左部分（１２％）を含むヒト胚性腎臓系統２９３（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．
Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３６（１９７７年）５９）、または特に請求番号ＷＯ
９４／２６９１４およびＷＯ９５／０２６９７に記述されているようなＥ１およ
びＥ４機能を補うことができる系統を挙げることができる。

【０２２１】 次に、繁殖させたアデノウイルスを回収し、実施例に例証されているように分
子生物学の従来の技術により純度を高める。

【０２２２】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）については、このウイルスが感染させた細胞の
ゲノム内に安定的にかつ特定部位に組み込まれた、比較的短いＤＮＡを有するウ
イルスである。これらは細胞の大部分を感染させることができ、細胞の成長、形
態または分化に影響を与えない。さらにヒトの病理には関与しないと考えられる
。ＡＡＶのゲノムはクローン化され、配列が決定されて分類が行われてい。約４
７００個の塩基を有し、各末端には、ウイルスの複製の源となる約１４５個の塩
基による逆方向反復領域（ＩＴＲ）を持つ。ゲノムの残りの部分はキャプシド形
成機能を備える ２つの主要領域に分けられ、ゲノム左部分はウイルス複製およ
びウイルス遺伝子の発現に関与する ｒｅｐ遺伝子を含み、ゲノムの右部分はウ
イルスのキャプシド蛋白質をコードするｃａｐ遺伝子を含む。

【０２２３】 インビトロおよびインビボでの遺伝子伝達のためのＡＡＶから派生したベクタ
ーの使用については文献に記載されている（特にＷＯ９１／１８０８８、ＷＯ９
３／０９２３９、ＵＳ４７９７３６８、ＵＳ５１３９９４１、ＥＰ４８８５２８
を参照）。これらの請求は ＡＡＶから誘導されたしたさまざまな構成を記載し
ており、この中で ｒｅｐ遺伝子および／またはｃａｐ遺伝子は除去されて価値
のある別の遺伝子に置き換えられており、前記価値のある遺伝子をインビトロで
（培養細胞に対して）またはインビボで（生体内に直接に）伝達するために使用
されている。しかしながら、これらの文献のいずれもＡＢＣ１蛋白質のインビボ
またはエックスビボでの伝達および発現対する組換えＡＡＶの使用については説
明も提案もしておらず、このような伝達の利点についても触れていない。本発明
による欠損組換えＡＡＶは、ヒト補助ウイルスにより感染させた細胞系統内で、
ＡＡＶの二つの逆方向反復領域（ＩＴＲ）に縁取られたＡＢＣ１蛋白質をコード
する配列を含むプラスミドと、ＡＡＶのキャプシド形成遺伝子（ｒｅｐおよびｃ
ａｐ遺伝子）を備えるプラスミドとの同時形質移入により調製することができる
。次に、生成された組換えＡＡＶを従来の方法により精製する。

【０２２４】 ヘルペスウイルスおよびレトロウイルスに関しては、組換えベクターの構成に
ついて文献に幅広く説明されている。特にＢｒｅａｋｆｉｅｌｄら、Ｎｅｗ Ｂ
ｉｏｌｏｇｉｓｔ ３（１９９１年） ２０３、ＥＰ４５３２４２、ＥＰ１７８
２２０、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅｔ． Ｅｎｇ． ７（１９８５年）３
２５、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ， Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３（１９８５年
）６８９、等を参照。

【０２２５】 特にレトロウイルスは、分裂細胞を感染させる組み込みウイルスである。レト
ロウイルスのゲノムは主に二つのＬＴＲ、キャプシド形成配列、３つのコード領
域（ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）を含む。レトロウイルスから派生した組換えベク
ターにおいては、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子は一般に全てまたは一部が
除去されており、価値のある異種核酸配列に置き換えられている。これらのベク
ターは、特に ＭｏＭｕＬＶ（「マウスモロニー白血病ウイルス」、ＭｏＭＬＶ
とも表示される）、ＭＳＶ（「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「
ハーベイ肉腫ウイルス」）、ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）、ＲＳＶ（「ラウ
ス肉腫ウイルス」）またはＦｒｉｅｎｄウイルスのようなさまざまなレトロウイ
ルス型から作られてもよい。

【０２２６】 本発明によるＡＢＣ１蛋白質をコードする配列を含む組換えレトロウイルスを
構成するためには、一般に、ＬＴＲを特に含むプラスミド、キャプシド形成配列
および前記コード配列を含むプラスミドを構成し、ラスミド内に欠損レトロウイ
ルス機能をトランス状態で運ぶことができる、いわゆるキャプシド形成細胞系統
を形質移入するために使用する。したがって一般にキャプシド形成系列は、ｇａ
ｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ遺伝子を発現させることができる。このようなキャプシド形
成系列は従来技術に記載されており、特にＰＡ３１７系列（ＵＳ４８６１７１９
）、ＰｓｉＣＲＩＰ系列（ＷＯ９０／０２８０６）およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１
２系列（ＷＯ８９／０７１５０）がある。さらに、組換えレトロウイルスは、転
写活性を抑制するためにＬＴＲのレベルで修正部分を含む場合、またｇａｇ遺伝
子の一部（Ｂｅｎｄｅｒら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６１（１９８７年）１６３９
）を含む延長されたキャプシド形成配列を含む場合もある。生成した組換えレト
ロウイルスをさらに従来の技術により精製を行う。

【０２２７】 本発明を実施するために、欠損組換えアデノウイルスを使用するのが特に有利
である。下記に示す結果で、実際に、コレステロール輸送活性を有する蛋白質の
インビボでの発現に対するアデノウイルスの特に興味深い特性が示されている。
本発明によるアデノウイルスベクターは、精製した懸濁液のインビボでの直接投
与に対して、または特に自家移植のための細胞のエックスビボでの形質転換に対
して特に有利である。さらに本発明によるアデノウイルスベクターは、とりわけ
少量のウイルス懸濁液からの感染も可能にする極めて高い感染能力のような重要
な利点を有する。

【０２２８】 本発明の別の特に有利な実施方法に従って、インビボでの移植のために、ＡＢ
Ｃ１蛋白質をコードする配列を含むレトロウイルスベクター生成系統を使用する
。この目的のために使用できる系統は特に細胞 ＰＡ３１７（ＵＳ４８６１７１
９）、ＰｓｉＣＲＩＰ（ＷＯ９０／０２８０６）およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２
（ＵＳ５２７８０５６）であり、本発明によるＡＢＣ１蛋白質をコードする核配
列を含むレトロウイルスを生成できるように修正されている。たとえば血液細胞
の前駆体である全能性の細胞株が被験者から採取され、単離される。培養状態に
おいたこれらの細胞を、ウイルス性プロモーター、非ウイルス性プロモーター、
マクロファージの特殊プロモーターのコントロール下の、またはそれ独自のプロ
モーターのコントロール下の、ＡＢＣ１蛋白質をコードする配列を含むレトロウ
イルスベクターにより形質移入が行われてもよい。次にこれらの細胞を被験者に
再導入する。これらの細胞の分化は、ＡＢＣ１蛋白質を発現させる血液細胞の元
になり、特にマクロファージに転換されて動脈壁のコレステロールの除去に関わ
る単球の元になる。ＡＢＣ１蛋白質を発現させるこれらのマクロファージは過剰
コレステロールを代謝する能力が高く、コレステロールを細胞表面に配置して、
膜様コレステロールの一次受容体によりこれを除去する。

【０２２９】 有利には、本発明のベクターにおいて、ＡＢＣ１蛋白質をコードする配列は、
感染させた細胞内でその発現を可能にするシグナルによるコントロール下に置か
れる。これは相同または異種発現シグナル、すなわちＡＢＣ１蛋白質の発現に本
来関係するシグナルとは異なるシグナルである。これは特に、他の蛋白質の発現
に関係する配列、または合成配列に関する。とりわけ、特殊な方法でまたは非特
殊方法で、かつ誘導可能にまたは非誘導的に転写を促すまたは抑制する真核生物
遺伝子またはウイルス遺伝子の配列、または派生配列に関する。たとえば、感染
させたい細胞のゲノムに由来する、またはウイルスのゲノムに由来するプロモー
ター配列、特にアデノウイルスのＥ１Ａ、ＭＬＰ遺伝子のプロモーター、ＣＭＶ
、ＬＴＲ−ＲＳＶプロモーター、等に関するものである。真核生物プロモーター
の中で、偏在性プロモーター（ＨＰＲＴ、ビメンチン、ａ−アクチン、チューブ
リン、等）、中間フィラメント（デスミン、ニューロフィラメント、ケラチン、
ＧＦＡＰ、等）のプロモーター、治療遺伝子（ＭＤＲ、ＣＦＴＲ型、因子VIII、
等）プロモーター、組織特殊プロモーター（ピルビン酸キナーゼ、ビリン、脂肪
酸結合腸蛋白質プロモーター、平滑筋細胞のアクチンａプロモーター、肝臓特有
プロモーター、Ａｐｏ Ａｌ、Ａｐｏ Ａ１１、ヒトアルブミン、等）、または
刺激反応プロモーター（ステロイドホルモン受容体、レチノイン酸受容体、等）
も挙げることができる。さらに、これらの発現配列は、活性化配列、制御配列、
等の付加により修正してもよい。さらに挿入された遺伝子が発現配列を含まない
場合、欠損ウイルスのゲノム内のこのような配列の下流に遺伝子を挿入してもよ
い。

【０２３０】 独自の実施方法において、本発明は、ＬＴＲ−ＲＳＶまたはＣＭＶの早熟性プ
ロモーターの中から選択されるプロモーターのコントロール下にコレステロール
の代謝に関与するＡＢＣ１蛋白質コード核配列を含む欠損組換えウイルスに関す
る。

【０２３１】 上記したように、本発明はまた、コレステロール輸送に関連する病理の治療お
よび／または予防のための医薬組成物を調製するための上記のようなウイルスの
あらゆる使用にも関する。

【０２３２】 本発明はまた、上述のような一つまたは複数の欠損組換えウイルスを含む医薬
組成物にも関する。これらの医薬組成物は局所、経口、非経口、鼻孔内、静脈内
、筋肉内、皮下、眼内、経皮、等の投与のために処方してもよい。好ましくは、
本発明の医薬組成物は、特に、たとえば患者の門静脈内のような静脈内注入のた
めの、注射剤処方に受け入れ可能な医薬媒体を含んでいる。これは特に、無菌液
、等張液、または、場合によって無菌水または血清を添加することで注射薬を作
ることができる特に親液性の乾燥組成物に関する。患者の門静脈内への直接の注
入は、肝臓への感染を標的とすることができ、したがってこの器官の治療効果に
集中させることができるので有効である。

【０２３３】 注入に使用される欠損組換えウイルスの投与量はさまざまなパラメータに応じ
て調整されてよく、特にウイルスベクターに応じて、用いられる投与方法に応じ
て、関連する病態に応じて、また求められる治療期間に応じて調整することが可
能である。一般に、本発明による組換えアデノウイルスは、１０^４〜１０^１４
ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０^６〜１０^１０ ｐｆｕ／ｍｌの投与量形態で処方
、投与される。用語ｐｆｕ（「ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ プラ
ーク形成単位」）はウイルス液の感染能力に対応しており、適切な細胞培地の感
染、および感染させた細胞のプラーク数の一般に４８時間後の大きさにより決定
する。ウイルス液のｐｆｕ力価の測定技術は文献に詳しく述べられている。

【０２３４】 レトロウイルスに関して、本発明による組成物は、その移植のために生成細胞
を直接含んでいてもよい。

【０２３５】 このために、本発明は、上記したような一つまたは複数の欠損組換えウイルス
により感染させたあらゆる哺乳類細胞が本発明のもう一つの対象である。より詳
細には、本発明はこれらのウイルスにより感染させたあらゆるヒト細胞群に関す
る。特に血液源細胞（全能性細胞株または前駆体）、繊維芽細胞、筋芽細胞、肝
細胞、ケラチン生成細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、グリア細胞、等に関する場合
もある。

【０２３６】 本発明による細胞は一次培養に由来してもよい。これらは当業者に既知のあら
ゆる技術により採取してもよく、次いで、増殖が可能な条件において培養する。
繊維芽細胞についてより詳しく述べると、これらはたとえばＨａｍにより記載さ
れた技術［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ２１ａ（１９８０年）２５
５］により生検から容易にえられる。これらの細胞はウイルスによって感染させ
るために直接利用してもよく、あるいは後に使用するために、自家バンク設定の
ためにたとえば冷蔵保存してもよい。本発明による細胞はまた、予め設定された
バンクから得た、二次培養に由来するものであってもよい（たとえばＥＰ２２８
４５８、ＥＰ２８９０３４、ＥＰ４０００４７、ＥＰ４５６６４０を参照）。

【０２３７】 次に培養細胞は、これに生物学的に活性なＡＢＣ１蛋白質を生成する能力を付
与するために、組換えウイルスによって感染させる。感染は、当業者に既知の技
術によりインビボで行う。特に、使用する細胞の型および所望する細胞によるウ
イルスの複製数により、当業者は感染の多様性を図り、場合によっては実施する
感染サイクルの回数を調整してもよい。これらの工程は、細胞がインビボ投与向
けである場合適切な無菌条件で行う必要があることは当然である。細胞の感染に
使用する組換えウイルスの量は、使用目的に応じて当業者が調整してもよい。イ
ンビボでの投与のための上記の条件をインビトロでの感染に応用してもよい。レ
トロウイルスによる感染に対して、感染させたい細胞を、本発明による組換えレ
トロウイルス生成細胞と共に同時培養することも可能である。この方法ではレト
ロウイルスの純度を高める必要はない。

【０２３８】 本発明のもう一つの目的は、上記したような一つまたは複数の欠損組換えウイ
ルスにより感染させた哺乳類細胞、または組換えウイルスを生成する細胞、およ
び細胞外基質を含むインプラント（移植組織）に関する。好ましくは、本発明に
よるインプラントは１０^５〜１０^１０個の細胞を含んでいる。より好ましくは１
０^６〜１０^８個の細胞を含む。

【０２３９】 より詳細には、本発明のインプラントにおいて、細胞外基質には、ゲル化化合
物および場合によっては細胞の定着を可能にする支持体が含まれる。 本発明によるインプラントを調製するために、各種のゲル化剤が用いられても
よい。ゲル化剤は、ゲルの成分を有する基質内に細胞を封入するために、また必
要な場合、支持体上に細胞を定着させるために用いられる。したがって特にコラ
ーゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、レクチンのよう
なさまざまな細胞接着剤が、ゲル化剤として使用されてもよい。好ましくは本発
明の範囲においてはコラーゲンを使用する。これはヒト、ウシ、マウス起源コラ
ーゲンであってもよい。１型コラーゲンを使用するのがより好ましい。

【０２４０】 上記したように、本発明による組成物には、細胞の定着を可能にする支持体が
含まれるのが有利である。定着という言葉は、支持体上に細胞を接着するおよび
／または固定する、生物学的および／または化学的および／または物理学的なあ
らゆる相互作用形態を意味する。さらに細胞は使用する支持体を覆う、あるいは
この支持体の内部に侵入してもよくあるいはその両方の場合がある。本発明の範
囲では毒性の無いおよび／または生物学的に適合性のある固体支持体を使用する
のが好ましい。特にポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）繊維または生物起
源支持体を使用してもよい。

【０２４１】 本発明はまた、コレステロールの輸送に関連する病理、特に肥満、高トリグリ
セリド血症、または心血管疾患分野における心筋梗塞、狭心症、突然死、心不全
、および脳血管不調を治療または予防するために極めて有効な方法も提供する。

【０２４２】 さらにこの治療はヒトならびに、ヒツジ、ウシ、家畜（イヌ、ネコ、等）、ウ
マ、魚などのようなあらゆる動物を対象にすることもできる。 組換え宿主細胞 本発明はまた、本発明の核酸のいずれか一つ、より詳しくは配列 配列番号９
１、９４または９６の核酸を含む組換え宿主細胞にも関する。

【０２４３】 別の見地から、本発明はまた、上記のような組換えベクターを含む組換え宿主
細胞にも関する。

【０２４４】 本発明による好ましい宿主細胞はたとえば次のものである。

【０２４５】 ａ） 原核動物宿主細胞 ：大腸菌株（ＤＨ５−ａ株）、枯草菌株、ネズミチ
フス菌株、またはシュードモナス、ストレプトマイセス、ブドウ球菌のような種
の株、 ｂ） 真核生物宿主細胞 ：ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ番号 ＣＣＬ２）、Ｃｖ １
細胞（ＡＴＣＣ番号 ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ番号 ＣＲＬ １６
５０）、Ｓｆ−９細胞（ＡＴＣＣ番号 ＣＲＬ １７１１）、ＣＨＯ細胞（ＡＴ
ＣＣ番号 ＣＣＬ−６１）または３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ番号 ＣＲＬ−６３６１
）。

【０２４６】 変異ＡＢＣ１ポリペプチド 別の見地から、本発明は変異ＡＢＣ１遺伝子、より詳しくはコレステロールの
逆輸送における不全に罹患した患者、特にＴａｎｇｉｅｒ病の患者の体内で変異
したＡＢＣ１遺伝子によりコード化されたポリペプチドに関する。

【０２４７】 すでに上述したように、Ｔａｎｇｉｅｒ病の患者で二つの有害な突然変異が特
定された。

【０２４８】 第１の突然変異は、ＡＢＣ１遺伝子のエクソン１２のコード配列の中に約百対
の塩基フラグメントが挿入され、配列配列番号１４０の２２３３アミノ酸の生物
学的に不活性なポリペプチドが生成されることである。配列 配列番号１４０の
変異ＡＢＣ１ポリペプチドは、配列配列番号１３９の正常ポリペプチドと比べて
次のような違いがある。 ａ） 配列「ＤＥＲＫＦＷ」ペプチドフラグメントの欠失、およびこのペプチド
フラグメントが、挿入 Ａｌｕ型のヌクレオチドフラグメントによりコード化さ
れた配列「ＥＹＳＧＶＴＳＡＨＣＮＬＣＬＬＳＳＳＤＳＲＡＳＡＳＱＶＡＧＩＴ
ＡＰＡＴＴＰＡ」により置き換えられている。

【０２４９】 第２の突然変異は、ＡＢＣ１遺伝子のエクソン１３のコード配列の最初の４分
の１に早発性終止コドンが導入され、配列配列番号１４１の５７４アミノ酸を有
する一部が欠けたポリペプチドが生成されることである。さらに塩基Ｇの欠失が
読み取り範囲の変化を引き起こし、正常ＡＢＣ１ポリペプチドのアミノ酸配列に
は存在しないＣＯＯＨ−末端を有する蛋白質を生成する。これは配列配列番号１
４１の変異したＡＢＣ１ポリペプチドのＣＯＯＨ−末端「ＲＡＰＲＲＫＬＶＳＩ
ＣＮＲＣＰＩＰＶＴＬＭＴＳＦＣＧ」に関する。

【０２５０】 これら二つのポリペプチドは、特に、特定的にこれらを組み換える抗体の調製
に役立つ。このような抗体は、被験者、好ましくはコレステロールの逆輸送不全
の特徴的症状を示す患者、特に好ましくはＴａｎｇｉｅｒ病の特徴的症状を示す
患者に由来する標本中の変異したこれらＡＢＣ１ポリペプチド生成の欠失手段と
なる。

【０２５１】 別の見地から、したがって本発明は配列番号１４０アミノ酸配列を含むポリペ
プチドに関する。

【０２５２】 さらに別の見地から、本発明は配列番号１４１アミノ酸配列を含むポリペプチ
ドに関する。

【０２５３】 本発明はまた、配列番号１４０および１４１配列のペプチド、またはこのペプ
チドのペプチドフラグメントからなる群から選ばれるアミノ酸配列と、少なくと
も８０％同一のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する
。

【０２５４】 好ましい第１ペプチドフラグメントは、配列配列番号１４０の変異したＡＢＣ
１ポリペプチド内に含まれる配列「ＥＹＳＧＶＴＳＡＨＣＮＬＣＬＬＳＳＳＤＳ
ＲＡＳＡＳＱＶＡＧＩＴＡＰＡＴＴＰＧ」のペプチドフラグメントの少なくとも
５つの連続アミノ酸を含む。

【０２５５】 好ましい第２ペプチドフラグメントは、配列配列番号１４１の変異したＡＢＣ
１ポリペプチド内に含まれる配列「ＲＡＰＲＲＫＬＶＳＩＣＮＲＣＰＩＰＶＴＬ
ＭＴＳＦＣＧ」のペプチドフラグメントの少なくとも５つの連続アミノ酸を含む
。

【０２５６】 有利には、配列配列番号１４０および１４１のペプチド、またはこのペプチド
のペプチドフラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８
５％、９０％、９５％または９９％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが
本発明の一部を成す。

【０２５７】 好ましくは、本発明によるポリペプチドは、本発明による核酸の１５、１８ま
たは２０〜２５、３５、４０、５０、７０、８０、１００または２００の連続ア
ミノ酸の長さ、特に配列配列番号１４０および１４１から選ばれるアミノ酸配列
のポリペプチドを有する。

【０２５８】 または、本発明によるポリペプチドは、本発明によるポリペプチドの、より詳
しくは配列配列番号１４０および１４１から選ばれるポリペプチドの１５、１８
、２０、２５、３５、４０、５０、１００または２００の連続アミノ酸の長さの
フラグメントから成るおよび／または含むことになる。

【０２５９】 一般に、本発明によるポリペプチドは単離したまたは純度を高めた形態下に存
在する。

【０２６０】 本発明はまた、配列配列番号１４０および１４１のポリペプチド、またはペプ
チドフラグメントまたはこのペプチドフラグメントの変異体のいずれか一つの生
産方法に関し、前記方法には次の各工程が含まれる。

【０２６１】 ａ） 前記ポリペプチドをコードする核酸を適切なベクター内に挿入する、 ｂ） 工程ａ）の組換えベクターによりあらかじめ形質転換または形質移入し
た宿主細胞を適切な培養培地内で培養する、 ｃ）条件付けした培養媒質を回収する、またはたとえば超音波処理または浸透
圧ショックにより宿主細胞を溶解する、 ｄ） 前記培養培地からまたは工程ｃ）で得られた細胞溶解物から前記ポリペ
プチドを分離し、純度を高める、 ｅ） 必要があれば生成された組換えポリペプチドの特徴付け（分類）を行う
。

【０２６２】 本発明によるペプチドは、このポリペプチドに対して、またはこのポリペプチ
ドのフラグメントまたは変異体に対して導かれた抗体があらかじめ固定されてい
る免疫親和性クロマトグラフィーカラム上に固定して分類を行ってもよい。

【０２６３】 別の見地から、本発明による組換えポリペプチドは、当業者に既知であり、た
とえばＦ． Ａｕｓｕｂｅｌらにより記述された（１９８９年）方法に従って、
適切な本数組み合わせたクロマトグラフィーカラム上を通過させることで純度を
高めるすることができる。

【０２６４】 本発明によるポリペプチドは、従来の、均質溶液または固相の無差別化学合成
技術により調製することも可能である。

【０２６５】 例証として、本発明によるポリペプチドは、Ｈｏｕｂｅｎ Ｗｅｙｌが記載し
た（１９７４年）技術または均質溶液により、またはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄが記
載した（１９６５年ａ、１９６５年ｂ）固相合成技術により調製してもよい。

【０２６６】 配列番号１４０および１４１アミノ酸、またはそれらのフラグメントまたは
変異体配列のポリペプチドのいずれかといわゆる『相同』なポリペプチドも本発
明の一部である。

【０２６７】 このような相同ポリペプチドは、基準ポリペプチドに対して、同等のアミノ酸
による一つまたは複数のアミノ酸置換を持つアミノ酸配列を有する。

【０２６８】 本発明による同等のアミノ酸とは、たとえば当業者によく知られた技術による
、Ｌ形態下の残基のＤ形態下の残基による置き換え物、またはグルタミン酸（Ｅ
）のピログルタミン酸による置き換え物を意味する。例証として、少なくとも一
つのＤ形態残基を含むペプチド合成はＫｏｃｈにより記載されている（１９７７
年）。

【０２６９】 もう一つの見地から、同じ分類に属する二つのアミノ酸、すなわち非極性また
は非電荷極性の酸性、塩基性の二つのアミノ酸も同等アミノ酸として見なされる
。

【０２７０】 レトロ逆結合（ＮＨＣＯ）、カルバ結合（ＣＨ_２ＣＨ_２）またはケトメチレン
結合（ＣＯ−ＣＨ_２）のような非ペプチド結合を少なくとも一つ有するポリペプ
チドも本発明の対象となる。

【０２７１】 好ましくは、少なくとも一つのアミノ酸の一つまたは複数の付加、欠失、置換
を含む本発明によるポリペプチドは、非修正ポリペプチドに対して導かれた抗体
により認識される能力を保持している。

【０２７２】 抗体 本発明による変異されたＡＢＣ１ポリペプチド、特に配列番号１４０および１
４１アミノ酸による配列のポリペプチドまたはそれらのフラグメントならびに相
同ペプチドは、特に患者体内のＡＢＣ１ポリペプチドの変質形態の生成を検出す
ることを目的とした抗体を調製するために用いられてもよい。

【０２７３】 本発明による好ましい第１抗体は、配列配列番号１４０の変異ＡＢＣ１ポリペ
プチドに含まれる配列「ＥＹＳＧＶＴＳＡＨＣＮＬＣＬＬＳＳＳＤＳＲＡＳＡＳ
ＱＶＡＧＩＴＡＰＡＴＴＰＧ」のペプチドフラグメントの少なくとも５つの連続
アミノ酸を含むペプチドフラグメントに対して導かれた。

【０２７４】 本発明による好ましい第２抗体は、配列配列番号１４１の変異ＡＢＣ１ポリペ
プチドに含まれる配列「ＲＡＰＲＲＫＬＶＩＣＮＲＣＰＩＩＰＶＴＬＭＴＳＦＣ
Ｇ」のペプチドフラグメントの少なくとも５つの連続アミノ酸を含むペプチドフ
ラグメントに対して導かれた。

【０２７５】 本発明の意味での『抗体』とは、特に、多クローン性または単クローン性抗体
またはフラグメント（たとえば、フラグメントＦ（ａｂ）’_２、Ｆａｂ）、また
は本発明の標的であるポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを認識する
初期抗体分域を含むあらゆるポリペプチドを意味する。

【０２７６】 単クローン性抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎが記載した（１９
７５年）技術によりハイブリドーマから調製することができる。

【０２７７】 本発明はまた、上記したようなポリペプチド、またはＫｏｚｂｏｒらが記載し
た（１９８３年）ｔｒｉｏｍａ技術またはハイブリドーマ技術における生成物の
ようなこのポリペプチドのフラグメントまたは変異体に対して導かれた抗体にも
関する。

【０２７８】 本発明はまた、米国特許第４９４６７７８号にまたはＭａｒｔｉｎｅａｕらに
より記載された（１９９８年）ような一本鎖抗体フラグメント Ｆｖ（ＳｃＦｖ
）にも関する。

【０２７９】 本発明による抗体はまた、Ｒｉｄｄｒら（１９９５年）ファージバンクにより
得られる抗体フラグメントまたはＲｅｉｎｍａｎｎら（１９９７年）、Ｌｅｇｅ
ｒら（１９９７年）のヒトに適合させた抗体を含む。

【０２８０】 本発明による抗体の調製物は、標本中の抗体の有無および／または量を確認す
るための免疫性検出テストにおいて有効である。

【０２８１】 本発明による抗体はさらに、たとえば蛍光性の、または当業者によく知られた
技術により、ビオチンなどの分子に結合された同位体または非同位体検出マーカ
ーを含んでいてもよい。

【０２８２】 このように本記載さらには、標本中の本発明に準拠するポリペプチドの有無を
検出するための方法を対象とし、前記方法には次の各工程が含まれる。

【０２８３】 ａ） テストすべき標本を上記のような抗体と接触させる、 ｂ） 形成された抗原／抗体の複合体を検出する。

【０２８４】 本発明はまた、標本中の本発明に準拠するポリペプチドの有無を検出するため
の必需品または診断キットにも関し、前記必需品には次のものが含まれる。

【０２８５】 ａ） 上記で定義されたような抗体、 ｂ） 形成された抗原／抗体複合体を検出できる反応体。

【０２８６】 医薬組成物および治療措置方法 本発明はまた、アテローム性動脈硬化症のようなコレステロールの代謝におけ
る不全、特にコレステロールの輸送における不全、より詳しくはコレステロール
の逆輸送における不全の予防または治療のための医薬組成物であり、正常ＡＢＣ
１ポリペプチド、特に配列 配列番号１３９のポリペプチドの有効量を生成する
ことができるポリヌクレオチドを治療的に有効な量含むことを特徴とする医薬組
成物に関する。

【０２８７】 本発明はさらに、アテローム性動脈硬化症のようなコレステロールの代謝にお
ける不全、特にコレステロールの輸送における不全、より詳しくはコレステロー
ルの逆輸送における不全の予防または治療のため医薬組成物であり、正常ＡＢＣ
１ポリペプチド、特に配列配列番号１３９のポリペプチドを治療的に有効な量含
むことを特徴とする医薬組成物も対象とする。

【０２８８】 このような医薬組成物は、たとえば、ＡＢＣ１ポリペプチドの量が１ｍｇ／ｋ
ｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは少なくとも０．０１ｍｇ／ｋｇ／日、
もっとも好ましくは０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日の非経口投与に適合されるのが
有利である。

【０２８９】 本発明による医薬組成物は、経口、経腸、非経口、静脈内、皮下または真皮内
のいずれの方法によっても投与してもよい。

【０２９０】 本発明はまた、さまざまな形態のアテローム性動脈硬化症の予防、より詳しく
はコレステロールの逆輸送機能不全の患者を治療するための医薬品製造のための
、配列配列番号１３９のＡＢＣ１ポリペプチドの使用に関する。

【０２９１】 最後に本発明は、コレステロールの逆輸送機能不全の患者の予防または治療の
ための、配列配列番号１３９のポリペプチドを治療的に有効な量含む医薬組成物
に関する。

【０２９２】 別の見地から、本発明はまた、コレステロールの代謝における、より詳しくは
コレステロールの輸送、さらに詳しくはコレステロールの逆輸送における欠陥に
より引き起こされる病気の予防的または治療的措置方法をも対象とし、このよう
な方法には、前記患者の体内にＡＢＣ１ポリペプチドを発現させることができる
ポリヌクレオチドを患者に投与する工程が含まれ、前記ポリヌクレオチドは、必
要があれば、生物学的に適合性のある一つまたは複数の媒体および／または賦形
剤と組み合わせられる。

【０２９３】 好ましくは、上記で定義したような、ポリヌクレオチドを含む医薬組成物を患
者に投与する。

【０２９４】 さらに別の見地から、本発明はまた、コレステロールの代謝における、より詳
しくはコレステロールの輸送における、さらにより詳しくはコレステロールの逆
輸送における欠陥により引き起こされる病気の予防的または治療的処置方法も対
象とし、このような方法には、前記患者の体内においてＡＢＣ１ポリペプチドの
治療上有効な量を患者に投与する工程が含まれ、前記ポリペプチドは、必要があ
れば、生物学的に適合性のある一つまたは複数の媒体および／または賦形剤と組
み合わせられる。

【０２９５】 好ましくは、上記で定義したような、ポリペプチドを含む医薬組成物を患者に
投与する。

【０２９６】 ＡＢＣ１ポリペプチドの作用薬化合物または拮抗薬化合物のスクリーニング方
法 別の見地から、本発明はまた、Ｔａｎｇｉｒ病、またはより一般にはＦＨＤ型
疾患のような、コレステロールの代謝における、特にコレステロールの輸送にお
ける、よく詳しくはコレステロールの逆輸送における不全による病気の治療に有
効な治療目的を持った化合物のスクリーニング方法にも関する。

【０２９７】 したがって、本発明はまた、コレステロールの逆輸送機能不全による病気の予
防的または治療のための活性成分をスクリーニングするための、ＡＢＣ１ポリペ
プチドの使用、またはＡＢＣ１ポリペプチドを発現させる細胞の使用にも関する
。 ＡＢＣ１ポリペプチドの触媒部位およびオリゴペプチドフラグメントまたは免疫
原性フラグメントは多数のあらゆる既存技術により生成物バンクをスクリーニン
グするために役立つ。この型のスクリーニングにおいて使用するフラグメントは
、細胞表面上でまたは細胞内で固体支持体上に固定されて、溶液状に遊離してい
てもよい。次に、ＡＢＣ１フラグメントとテストされる作用薬との間の結合複合
体の形成が測定されてもよい。

【０２９８】 価値のある蛋白質に対して親和性を有する生成物への到達を可能にする高流速
スクリーニングにおいて用いることができるもう一つの生成物スクリーニング技
術は、出願ＷＯ８４／０３５６４に記載されている。ＡＢＣ１蛋白質が適用され
ているこの方法においては、さまざまな生成物が固体表面上で合成される。これ
らの生成物は、ＡＢＣ１蛋白質とまたはＡＢＣ１蛋白質のフラグメントと反応し
、複合体は洗浄される。次にＡＢＣ１蛋白質と結合した生成物は、当業者に既知
の方法論により検出される。非中和抗体もまたペプチドを捕獲し、支持体上にこ
れを固定するために使用してもよい。

【０２９９】 もう一つの可能性は、ＡＢＣ１を中和する抗体、ＡＢＣ１蛋白質およびＡＢＣ
１蛋白質と潜在的に結合している生成物の競合を利用した生成物スクリーニング
を使用することである。このように、抗体はＡＢＣ１と共通の抗原性モチーフを
有するペプチドの有無を検出するために使用されてもよい。

【０３００】 評価すべき、かつＡＢＣ１活性を増大させる生成物の中で、特に、分子の活性
化に関与するキナーゼの特殊ＡＴＰ相同体、ならびにこれらいわゆるキナーゼに
由来する脱リン酸化を回避することができるホスファターゼを挙げる。特にホス
ホジエステラーゼ（ＰＤＥ）テオフィリンおよび３−イソブチル−１−メチルキ
サンチン型の阻害薬またはアデニルシクラーゼ フォルスコリン活性剤を挙げる
。

【０３０１】 したがって、我々は本特許において、メンブランまたは小胞間のコレステロー
ルの転位置方法（実施例１７を参照）に基づく生成物のあらゆるスクリーニング
方法の使用を請求するものであり、これはあらゆる合成または細胞の型、すなわ
ち連続的にヒトＡＢＣ１配列を発現する、またはヒトＡＢＣ１配列を取り込んで
いる哺乳類、昆虫、細菌または酵母において使用される。このため、標識された
された脂質類似物を使用してもよい。

【０３０２】 同じく、ＡＢＣ１蛋白質がアニオン輸送を可能にすることが記載されており（
Ｂｅｃｑら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ｖｏｌ ２７２， 番号 ５ ｐａｇｅｓ ２６９５−２６９９，１９９７
年およびＹａｍｏｎら、Ｂｌｏｏｄ ｖｏｌ ９０， 番号 ８ ｐａｇｅｓ
２９１１−２９１５， １９９７年）、かつこの輸送はオカダ酸およびオルトバ
ナジン酸塩のようなホスファターゼ阻害剤ならび、フォルスコリンのような作用
薬によるｃＡＭＰの上昇により活性化される。我々はＡＢＣ１蛋白質の活性を調
整する分子をスクリーニングするためにこのシステムの使用を請求する（実施例
１８を参照）。

【０３０３】 Ｙａｍｏｎら（Ｂｌｏｏｄ ｖｏｌ ９０， 番号 ８ ｐａｇｅｓ ２９１
１−２９１５， １９９７年）は、マウスのＡＢＣ１蛋白質がマウスの腹腔マク
ロファージ内の炎症誘発性サイトカインＩＬ−ベータの分泌に関与することを証
明した。したがって、二つの蛋白質を発現させるあらゆるタイプの細胞からのＩ
Ｌ−ベータの塩析測定により、ＡＢＣ１蛋白質活性を調節する生成物のスクリー
ニング方法も提案してもよい（実施例１９を参照）。

【０３０４】 さらに数多くの輸送体の分裂が記載されているので（ｖａｎ， ｄｅｎ Ｈａ
ｚｅｌ． Ｈ．， Ｈ． Ｐｉｃｈｌｅｒ， Ｖ．Ｍ．Ｍ． ｄｏ， Ｅ． Ｌ
ｅｉｔｎｅｒ， Ａ． Ｇｏｆｆｅａｕ， ａｎｄ Ｇ． Ｄａｕｍ． １９９
９． ＰＤＲ１６ ａｎｄ ＰＤＲ１７， ｔｗｏ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｇ
ｅｎｅｓ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ， ａｆ
ｆｅｃｔ ｌｉｐｉｄ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｒｅｓｉｓｔａｎ
ｃｅ ｔｏ ｍｕｔｉｐｌｅ ｄｒｕｇｓ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７
４（４）：１９３４−４１）、特徴的な表現型を有する細胞変異体を使用し、Ａ
ＢＣ１により変異体の機能を補い、全体をスクリーニング目的に使用することを
考慮してもよい。

【０３０５】 本発明はまた、コレステロールの代謝に対して活性な、ＡＢＣ１ポリペプチド
の作用薬または拮抗薬化合物のスクリーニング方法にも関し、前記方法には次の
各工程が含まれる。

【０３０６】 ａ）ＡＢＣ１蛋白質と、検出可能マーカーを有する脂肪基質とを含む膜性小胞
を調製する、 ｂ）工程ａ）で得られた小胞を作用または拮抗薬候補化合物と共にインキュベ
ートする、 ｃ）検出可能マーカーを含む脂質基質の遊離を質的および量的に測定する、 ｄ）工程ｂ）で得た測定値を、あらかじめ作用薬または拮抗薬候補化合物と共
にインキュベートされていない小胞により標識されたされた脂質基質の遊離測定
値と比較する。

【０３０７】 上記のスクリーニング方法の第１見地から、膜性小胞は、当業者によく知られ
た技術により調製することができる合成脂質小胞である。この独自な見地から、
ＡＢＣ１蛋白質は組換えＡＢＣ１蛋白質であってもよい。

【０３０８】 第２の見地から、膜性小胞は、ＡＢＣ１ポリペプチドを発現させる細胞から誘
導された細胞質膜小胞である。これはＡＢＣ１ポリペプチドを自然に発現させる
細胞、またはＡＢＣ１ポリペプチドをコードする組換えベクターと共に形質移入
させた細胞である。

【０３０９】 上記スクリーニング方法の第３の見地から、脂質基質はコレステロールまたは
ホスファチジルコリンの中から選ばれる。

【０３１０】 第４の見地から、脂質基質は、たとえば、^３Ｈまたは^１２５Ｉの中から選択さ
れた同位元素による放射性標識が行われる。

【０３１１】 第５の見地から、脂質基質は、ＮＢＤまたはピレンのような蛍光性化合物によ
り標識する。

【０３１２】 第６の見地から、標識された膜性小胞およびＡＢＣ１ポリペプチドを含む脂質
基質は、工程ｂ）であらかじめ固体支持体の表面に固定されている。 第７の見地から、小胞により遊離された蛍光または放射能の測定値は、ＡＢＣ１
ポリペプチドによる脂質基質の輸送活性を直接反映している。

【０３１３】 本発明はまた、コレステロールの代謝に対する、ＡＢＣ１ポリペプチドの作用
薬または拮抗薬化合物のスクリーニング方法に関し、前記方法には次の各工程が
含まれる。

【０３１４】 ａ）自然にまたは形質移入後にＡＢＣ１ポリペプチドを発現させる細胞、たと
えば細胞系統を得る、 ｂ）検出可能マーカーにより標識したアニオンの存在下に、工程ａ）の細胞を
インキュベートする、 ｃ）工程ｂ）の細胞を洗浄し、これらの細胞内に侵入しなかった標識された過
剰アニオンを除去する、 ｄ）工程ｃ）で得られた細胞を、ＡＢＣ１ポリペプチドの作用薬または拮抗薬
候補化合物と共にインキュベートする、 ｅ）標識したアニオンの流出を測定する、 ｆ）工程ｅ）で測定した、標識したアニオンの流出値を、ＡＢＣ１ポリペプチ
ドの作用薬または拮抗薬候補化合物の存在下にあらかじめインキュベートしなか
った細胞で測定した標識アニオンの流出値と比較する。

【０３１５】 上記スクリーニング方法の第１の見地から、使用する細胞はＡＢＣ１ポリペプ
チドを自然に発現する細胞である。これは、ヒト血液の単核細胞群から精製した
、一次培養のヒト単球であってもよい。また単核球性白血病系統ＴＨＰ１のよう
な、ヒト単核細胞系統であってもよい。

【０３１６】 第２の見地から、上記に記載されたスクリーニング方法で使用する細胞は、自
然にＡＢＣ１ポリペプチドを発現しない、またはわずかしか発現しない細胞であ
ってもよく、前記細胞はＡＢＣ１ポリペプチドの発現を導くことができる、本発
明による組換えベクターと共に形質移入される。

【０３１７】 第３の見地から、細胞はアニオン輸送における生得不全を有する細胞、または
バラパミルＴＭまたはテトラエチルアンモニウムのようなアニオンチャネルの一
つまたは複数の阻害剤により予備処理した細胞であってもよい。 前記スクリーニング方法の第４の見地により、アニオンは塩Ｋ^１２５ＩまたはＮ
ａ^１２５Ｉのような放射能で標識したヨウ化物である。

【０３１８】 第５の見地から、標識したアニオンの流出量は実験中に定期的に測定され、こ
のようにしてこの流出の動力学的基準も確立できる。

【０３１９】 第６の見地から、標識したアニオンの流出値を細胞培養残存物中にある時間存
在する標識したアニオンの量の測定により決定する。

【０３２０】 第７の見地から、標識したアニオンの流出量値を、細胞溶解物中の放射能と細
胞培養残存物中の放射能との総和に一致する全放射能に対する、細胞培養残存物
中に見いだされる放射能の割合として決定する。

【０３２１】 本発明はまた、コレステロールの代謝に対する、ＡＢＣ１ポリペプチドの作用
薬または拮抗薬活性化合物のスクリーニング方法を対象とし、前記方法には次の
各工程が含まれる。

【０３２２】 ａ）ヒト単球系統の細胞を、純度を高めたヒトアルブミンの存在下に、適切な
培養培地でインキュベートする、 ｂ）工程ａ）の細胞を、ＩＬ−１ベータの生成を促す化合物および作用薬また
は拮抗薬候補化合物の存在下に同時にインキュベートする、 ｃ）工程ｂ）で得られた細胞を適切な濃度の ＡＴＰの存在下にインキュベー
トする、 ｄ）細胞培養残存物中で単離した ＩＬ−１ベータを測定する、 ｅ）工程ｄ）で得られたＩＬ−１ベータの単離値を、作用薬または拮抗薬候補
化合物の存在下にあらかじめインキュベートしていない細胞培養残存物中で単離
したＩＬ−１ベータの値と比較する。

【０３２３】 上記のスクリーニング方法の第１の見地から、使用する細胞はヒト白血病単球
系統ＴＨＰ１に属する。

【０３２４】 スクリーニング方法の第２の見地から、ＩＬ−１ベータの生成を促す化合物は
リポ多糖類である。

【０３２５】 前記方法の第３の見地から、さらにこれらの細胞によりＩＬ−１アルファ、Ｉ
Ｌ−６およびＴＮＦアルファを質的および／または量的に測定する。

【０３２６】 第４の見地から、ＩＬ−１をコードするメッセンジャーＲＮＡの発現レベルも
同様に測定する。

【０３２７】 本発明は、制限されることなく、次の図および実施例により例証される。

【０３２８】 図１はＡＢＣ１遺伝子のエクソン１２におけるＡｌｕ配列の挿入による変異の
分離を例証している。ＡＢＣ１遺伝子のエクソン １２における挿入−欠失は、
図１Ａに示すような１４のヌクレオチドの欠失および１１０のヌクレオチドの挿
入からなる。図１Ｂは、エクソン１２のＰＣＲによる増幅後にそれぞれの患者か
ら得た系統 ＮｕおよびＤＮＡフラグメントの大きさを示している。コースＭは
移動マーカーに対応する（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）。コースＣは指標ＤＮＡに対応
する。

【０３２９】 図２はＡＢＣ１遺伝子のエクソン１３における一つのヌクレオチドの欠失によ
る変異を例証している。補足片の配列が得られ、これを３’から５’の方向へ示
している。ＡＢＣ１ポリペプチドのアミノ酸５４６〜５５２をコードする配列を
調査を行った系統群のさまざまな患者について示しており、それぞれ同型接合個
体（図２−ａ）、異種接合個体（図２−ｂ）および非罹患個体（図２−ｃ）に対
している。図２−ａの配列は ３人の同型接合個体で見いだされ、図２−ｂの配
列は５人の異種接合個体で、図２−ｃの配列は４人の非罹患個体で見いだされた
。

【０３３０】 実施例 実施例１：本発明によるＡＢＣ１遺伝子の転写物の組織分布 本発明によるポリヌクレオチドの発現プロフィールは、特にＳａｍｂｒｏｏｋ
らが記載したＰＣＲにつながるノーザンブロットおよび逆転写の分析手順により
決定される（ｒｅｆ． ＣＳＨ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ
， Ｅ． Ｆ．， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．（１９８９）．“Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
，”２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ．） たとえば、逆転写による分析の場合、配列配列番号９１のＡＢＣ１ヒト遺伝子
の完全ＤＮＡから合成した端緒（プライマー）対を対応する ｃＤＮＡを検出す
るために用いる。

【０３３１】 連鎖的なポリメラーゼ反応（ＰＣＲ）は、ｍＡＲＮ ｐｏｌｙＡ＋（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ）レトロ転写物に対応するｃＤＮＡ基質上で行う。ｃＤＮＡにおける逆
転写は、製造者が記載した条件に従って酵素 ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ II（Ｇ
ｉｂｃｏＢＲＬ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に行う。連鎖的
なポリメラーゼ反応はｃＤＮＡ調製物２５ｎｇとの反応混合物２０ｍｌの中で、
標準条件に従って行う。反応混合物は、各ｄＮＴＰを４００ ｍＭ、Ｔｈｅｒｍ
ｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ
Ｇｏｌｄ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を ２単位、各プライマー ０．５
ｍＭ、ＭｇＣｌ_２を ２．５ ｍＭ、およびＰＣＲタンポンから構成される。テ
ルモサイクラー Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９７００内で９４℃で１０分間の
第一変性工程後に、ＰＣＲを３４サイクル行う。ＰＣＲ反応は電気泳動によるア
ガロースゲル上で視覚化される。得られたｃＤＮＡフラグメントはノーザンブロ
ットによる分析のためのプローブとして使用してもよく、またポリヌクレオチド
配列の正確な決定に使用してもよい。

【０３３２】 ノーザンブロットによる分析の場合、上記したように生成されたｃＤＮＡプロ
ーブを、ＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）標識システム
により、製造者の説明書に従って^３２Ｐにより標識する。標識後、製造者の説明
書に従って、プローブをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の微
小カラム上で純度を高める。標識して、純度を高めたプローブをさまざまな組織
内におけるｍＲＮＡの発現検出のために使用する。

【０３３３】 さまざまなヒト組織のＲＮＡ試料を含むノーザンブロット（（Ｍｕｌｔｉｐｌ
ｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ， ＭＴＮ， Ｃｌｏｎｔｅｃｈ） Ｂｌ
ｏｔ２，参照７７７５９−１）を標識したプローブと共にハイブリッド形成する
。

【０３３４】 ハイブリダイゼーションおよび洗浄の手順は、直接製造者が記載した手順であ
ってもよく、あるいは当業者に既知の技術、たとえば Ｆ． Ａｕｓｕｂｅｌら
が記載した技術（１９９９年）を使って、この手順に適合させ他ものでもよい。
このようにすることで、たとえば、プレハイブリダイゼーションおよびホルムア
ミドの存在下におけるハイブリダイゼーションの温度を変化させることができる
。

【０３３５】 たとえば次の手順を用いてもよい。 １．− メンブランの競合およびプレハイブリダイゼーション −混合する：サケの精子ＤＮＡ４０ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌ） ＋ヒトの胎盤ＤＮＡ ４０ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌ） −９６℃で５分間変性させ、混合物を氷の中に浸す。

【０３３６】 −ＳＳＣ ２Ｘを取り除き、メンブランを含むハイブリダイゼーションチュー
ブ内に混合ホルムアミド４ｍｌを流し込む。

【０３３７】 −変性させた二つのＤＮＡの混合物を加える。

【０３３８】 −回転させながら、４２℃で５〜６時間インキュベートする。

【０３３９】 ２．−標識したプローブの競合 −標識を行い純度を高めたプローブに、反復配列の量に従って、ＤＮＡ Ｃｏｔ
Iを１０〜５０ｍｌ加える。

【０３４０】 −９５℃で７〜１０分変性させる。

【０３４１】 −６５℃で２〜５時間インキュベートする。

【０３４２】 ３．−ハイブリダイゼーション −予備ハイブリダイゼーション混合物を取り除く。 −サケ精子ＤＮＡ４０ｍｌ＋ヒト胎盤ＤＮＡ ４０ｍｌを混合する、 ９６℃で５分間変性させ、氷に浸す。

【０３４３】 −ハイブリダイゼーションチューブ内に、ホルムアミド混合物を４ｍｌ、二つ
のＤＮＡの混合物および標識したプローブ／変性させたＤＮＡ Ｃｏｔ １を加
える。

【０３４４】 −回転させながら、４２℃で１５〜２０時間インキュベートする。

【０３４５】 ４．−洗浄： −２×ＳＳＣ内で室温で洗浄を行い、リンスする、 −２×ＳＳＣおよび６５℃の０．１％ＳＤＳを室温で５分間２回、 −１×ＳＳＣおよび６５℃の０．１％ ＳＤＳを６５℃で１５分間２回。

【０３４６】 ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、ブロットを、Ｓｔｏｒｍ（Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）により顕した
蛍光体スクリーンに接触させて一晩露光した後分析する。

【０３４７】 実施例２：ＡＢＣ１遺伝子の完全ｃＤＮＡの獲得 ヒトＡＢＣ１遺伝子のｃＤＮＡの３’−ＵＴＲ領域の配列をデータベース内を調
査して特定した。 配列 ＥＳＴのデータベース（「Ｇｅｎｂａｎｋ ｍｏｕｓｅ ｈｕｍａｎ ｓ
ｕｂｄｉｖｉｓｉｏｎ ＥＳＴ， ｖ． １１１」）の反復スクリーニングをソ
フトＢＬＡＳＴにより行った。

【０３４８】 配列ＥＳＴから誘導された部分的共通配列からオリゴヌクレオチドプライマー
を合成し、ＲＴ−ＰＣＲ反応により、ヒトＡＢＣ１遺伝子のｃＤＮＡ３’末端を
増幅してその配列を決定した。

【０３４９】 使用したオリゴヌクレオチドプライマーは次の通りである。

【化１】

【０３５０】 脳組織、胎児脳、心臓、子宮および胎盤（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から市販されて
いるバンク）からのｍＲＮＡ ｐｏｌｙ（Ａ）＋の逆転写を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒ
ｉｐｔＴＭキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．社より市販
）を使用して、製造者の説明書に従い、ｏｌｉｇｏｄＴプライマーによるエロン
ゲーション（延長術）により行った。

【０３５１】 各実験において、逆転写酵素を含まない標本中のＰＣＲにより増幅されるポリ
ヌクレオチドの欠如により汚染された ＤＮＡの存在を排除することができた。

【０３５２】 ＰＣＲ反応を、次の条件における第１逆転写工程を受けたまたは受けない生成
物対して行った。

【０３５３】 −ＮＴＰ ４００ ｍＭ、ＤＮＡポリメラーゼ Ｔａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａ
ｑｕａｔｉｃｕｓ、Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ
社より市販） ２単位、各プライマーを ０．５ ｍＭずつ、ＭｇＣｌ_２を ２
．５ ｍＭ、全体は、同じく ＤＮＡを ５０ｎｇまたはｃＤＮＡを約２５ｎｇ
含む ＰＣＲ用タンポンに入れる。

【０３５４】 −ＰＣＲ反応を、９６穴のマイクロプレート内、ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ装
置（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９７００ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ）内
で３０サイクル行った。

【０３５５】 −９４℃、１０分間の初期変性の後、各サイクルを次のように行った。

【０３５６】 −９４℃、３０秒間の変性工程、３０秒間のハイブリダイゼーション工程（６
４℃で２サイクル、６１℃で、２サイクル、５８℃で２サイクル、５５℃で２８
サイクル）。

【０３５７】 −延長術工程をキロベース当たり１分間に相当する時間行う。

【０３５８】 −７分間の拡大最終工程でＰＣＲ反応を終える。

【０３５９】 ＡＢＣ１の完全ｃＤＮＡに対応するｃＤＮＡを単離するためには他のさまざま
な方法を用いてもよい。

【０３６０】 たとえば、完全クローンはｃＤＮＡバンクを価値のある遺伝子の配列を持つ特
殊ポリヌクレオチドプローブを使ってスクリーニングすることで、ハイブリダイ
ゼーションにより直接単離してもよい。

【０３６１】 特に３０〜４０のヌクレオチドの特殊プローブは、選択した配列により、Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍマーク合成機／Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒを使
って合成する。

【０３６２】 得られたオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ ポリヌクレオチドキナーゼを用いてた
とえば^３２Ｐ−γ−ＡＴＰにより放射能標識し、通常の方法（たとえば Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ
， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ， ＮＹ １９８２年またはＦ． Ａｕｓｕｂｅｌ
ら ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｅｄｓ， １９８９年
）により純度を高める。

【０３６３】 スクリーニングを望むｃＤＮＡを含むクローンバンクは、上記で挙げた通常の
方法（Ｆ． Ａｕｓｕｂｅｌら）による適切な抗生物質を含むペトリボックス内
の培養培地（寒天１．５％）上に陳列されている。インキュベーション後このよ
うに生成されたコロニーはニトロセルロースフィルター上に移されて、通常の方
法で、放射能標識されたヌクレオチドプローブによりスクリーニングされる。プ
ローブとハイブリッド形成したコロニーを単離し、下位クローン化する。

【０３６４】 このようにして探知するクローンのＤＮＡを調製し、配列毎に分析する。完全
ｃＤＮＡに対応するフラグメントを含むクローンの純度を高め、当業者に既知で
あり、たとえばＦ．Ａｕｓｕｂｅｌらが紹介している（１９８９年）の手順によ
りｐｃＤＮＡ３ベクター内で再クローン化する。

【０３６５】 本出願に記載する遺伝子に対応するｃＤＮＡの５’および３’末端を識別する
ためにはさまざまな方法が知られている。これらの方法には、ハイブリダイゼー
ションによるクローン化、当業者によく知られている ３’または５’ＲＡＣＥ
−ＰＣＲ（Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄ
−ＰＣＲ）に類似したまたは同一の手順を用いるクローン化があるが、これらに
限定されるものではない。

【０３６６】 たとえば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から市販されているキット（Ｍａｒａｔｈｏｎ
ＲｅａｄｙＴＭ ｃＤＮＡ ｋｉｔ， 参照手順 ＰＴ１１５６−１）を使用
してもよい。または５’ＲＡＣＥに類似の方法は ｃＤＮＡの ５’末端欠如を
分析するために使用できる（Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２１（７） ： １６８３−１６８４（１
９９３））。要するに、ＲＮＡのオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡ群の５’末端に
結合する。ｃＤＮＡでのレトロ転写、価値のある遺伝子の ５’で結合したアダ
プターと３’に位置する配列とのそれそれの特殊プライマーセットを、求めるｃ
ＤＮＡの５’部分を増幅するためにＰＣＲで用いる。増幅されたフラグメントは
次に完全ｃＤＮＡを再構成するために使われる。

【０３６７】 実施例３：Ｔａｎｇｉｅｒ病についての遺伝子発現プロフィール分析 Ｔａｎｇｉｅｒ細胞表現型を導くＡＢＣ１遺伝子の発現レベルの変化は、この
病気に罹患したまたは非罹患者の繊維芽細胞に由来する ｍＲＮＡに対応するプ
ローブとこれら配列とのハイブリダイゼーションを下記の方法に従って行うこと
で確認できる。

【０３６８】 １．全 ＲＮＡ、ｍＲＮＡ ｐｏｌｙ（Ａ）＋およびｃＤＮＡプローブの調製
全ＲＮＡを健康被験者またはＴａｎｇｉｅｒ病患者の繊維芽細胞の細胞培養から
、イソチオシアン酸塩グアニジン方法により得る（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ＆
Ｓａｃｃｈｉ， １９８７）。ｍＲＮＡ ｐｏｌｙ（Ａ）＋は、オリゴ（ｄＴ
）−セルロースカラム（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）上での親和性クロマト
グラフィーにより獲得し、プローブとして使用するｃＤＮＡは、蛍光物質（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ； ＣｙＤｙｅ）により標
識したオリゴヌクレオチドとのＲＴ−ＰＣＲ（ＤｅＲｉｓｉら、１９９７） に
より得る。

【０３６９】 ２．ハイブリダイゼーションおよび発現レベルの検出 Ｔａｎｇｉｅｒ遺伝子に対応する、本特許請求中に示されている配列を含むガラ
スメンブレンを繊維芽細胞から得た、ｃＤＮＡプローブと共にハイブリッド形成
する（ｌｙｅｒら、１９９９）。Ａｍｅｒｓｈａｍ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒＣｙｎ
ａｍｉｃｓシステム（Ａｖａｌａｎｃｈｅ ＭｉｃｒｏｓｃａｎｎｅｒＴＭ）を
使用することで、健康または罹患した細胞タイプに対する配列生成物の発現を量
子化できる。

【０３７０】 実施例４：哺乳類細胞におけるＡＢＣ１完全ｃＤＮＡを含む発現ベクターの構
成 ＡＢＣ１遺伝子は哺乳類細胞中で発現させることが可能である。典型的な真核
生物の発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を可能にするプロモーター、蛋白
質をコードする配列、転写の終結および転写物のポリアデニル化に必要なシグナ
ルを含んでいる。また転写促進因子のような補足シグナル、Ｋｏｚａｋ配列、ｍ
ＲＮＡのスプライシングに必要な配列も含んでいる。有効な転写はウイルスＳＶ
４０のプロモーターの初期および遅発エレメント、ＬＴＲレトロウイルスまたは
ＣＭＶウイルスの初期プロモーターにより得られる。しかしながら、アクチンプ
ロモーターのような細胞エレメントもまた用いることができる。本発明を実施す
るために数多くの発現ベクターを、ｐｃＤＮＡ３ベクターのように使用すること
ができる。

【０３７１】 実施例５：正常または変異ＡＢＣ１ポリペプチドの生成 実施例２にその単離を記載した（完全ｃＤＮＡのクローン化）ＡＢＣ１の完全
ｃＤＮＡによりコードされる正常ＡＢＣ１ポリペプチド、またはその完全ｃＤＮ
Ａもまた実施例２に記載した技術に従って得ることができる変異ＡＢＣ１ポリペ
プチドは、バキュロウイルスを用いることで、細菌、昆虫細胞発現システムにお
いて、またはワクチンのウイルスベクターと共に、またはこれを用いずに、哺乳
類細胞中で容易に生成することができる。これら全ての方法は今日幅広く公表さ
れており、当業者に既知の方法である。たとえば、Ｆ． Ａｕｓｕｂｅｌらによ
り詳細に説明されている。

【０３７２】 実施例６：突然変異したポリペプチドＡＢＣ１の一つに対して誘導される抗体
の生成 本発明における抗体は、種々の方法によって調製することができる（Ｆｒｅｄ
ｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔ、Ｒｏｂｅｒｔ Ｅ
．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｄａｖｉｄ Ｄ．Ｍｏｏｒｅ、Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ、
Ｊｏｈｎ Ａ．Ｓｍｉｔｈ、Ｋｅｖｉｎ Ｓｔｒｕｈｌ−マサチューセッツ総合
病院ハーバード医学学校、第１１章によって編集されたＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍｅ１−
分子生物学における一般的プロトコル、第一巻）。たとえば、本発明のプロペプ
チドを表わす細胞は、抗体を含む血清の生成を誘導するために、動物に投与され
る。上述した方法の一つにおいては、プロテインは、汚染を防ぐために調製され
、浄化される。こうして、このような調製は、活性がより大きなポリクローン抗
血清剤を生成する目的で動物において行なわれた。

【０３７３】 好ましい方法においては、本発明の抗体は、モノクローン抗体である。このよ
うなモノクローン抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ等、Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５（１９７５年）；Ｋｏｈｌｅｒ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ． ６：５１１（１９７６）；Ｋｏｈｌｅｒ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．６：２９２（１９７６）；Ｈａｍｍｅｌｉｎｇ等、：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ＆ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ−モノクロー
ン抗体＆Ｔ細胞ハイブリドーマ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ．５６
３−６８１ ５１９８１）を使用することによって調製することができる。一般
に、このような方法は、ポリペプチドによって、さらに好ましくはポリペプチド
を表わす細胞によって、動物（好ましくはマウス）に対して免疫を与えることを
前提としている。これらの細胞は、適切な組織培養基の中で培養され得る。しか
しながら、牛の胎盤の血清（５６℃で不活化）１０％を補われ、非必須アミノ酸
およそ１０ｇ／ｌと、ペニシリン１０００Ｕ／ｍｌと、ストレプトマイシン１０
０μｇ／ｍｌを追加したイーグル法の媒質（イールを修正したもの）内で細胞を
培養することが好ましい。

【０３７４】 これらのマウスのスプレノサイトは、適切なミエローマの細胞系統とともに抽
出及び融合される。しかしながら、ＡＴＣＣで入手可能な両親のミエローマの細
胞系統（ＳＰ２０）を使用することが好ましい。融合後、その結果生じるハイブ
リドーマ細胞は、選別的にＨＡＴ媒質において保持され、さらに、Ｗａｎｄｓ等
（Ｇａｓｔｒｏｅｍｔｅｒｏｌｏｇｙ−胃腸病学８０：２２５−２３２（１９８
１））によって紹介されているような限定希釈によってクローン化される。この
ような選別後に得られたハイブリドーマ細胞は、ポリペプチドに固定することが
できる抗体を分泌するクローンを識別するためにテストされる。

【０３７５】 その一方で、ポリペプチドに固定することができる他の抗体は、抗イディオタ
イプ抗体を使用する２段階の手順にしたがって生成することができ、このような
方法は、抗体それ自体で抗原であり、したがって、他の抗体を特定する抗体を得
ることが可能であるという事実に基づいている。この方法によれば、動物、好ま
しくはマウスにに免疫を与えるために、プロテインの特定の抗体が使用される。
次に、ハイブリドーマ細胞を生成するためにこの動物のスプレノサイトが使用さ
れ、これらの細胞は、抗体を生成するクローンを識別するために選別され、プロ
テインと特定の抗体との錯体に固定されるべきその抗体の体積は、ポリプロペプ
チドによってブロックされる。これらの抗体は、より大きな量のプロテインの特
定の抗体の形成を誘導するために動物に免疫を与えるように使用することができ
る。

【０３７６】 本発明の抗体のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２及び他のフラグメントは、通常、こ
こに説明した方法によって使用することができると考えられるだろう。このよう
なフラグメントは、通常、パペイン（Ｆａｂフラグメントを生成するため）また
はペプシン（フラグメントＦ（ａｂ’）２を生成するため）のような酵素を用い
てタンパク質加水分解型分裂によって生成される。そうでなければ、プロテイン
を特定する分泌されたフラグメントは、ＤＮＡ組換え技術または化学合成技術を
適用して生成することができる。

【０３７７】 人間における抗体の生体内使用のためには、「人間に適用された」架空のモノ
クローン抗体を使用することが望ましい。このような抗体は、上述のモノクロー
ン抗体を生成するハイブリドーマ細胞から派生する遺伝子構造を使用することに
よって生成されうる。架空の抗体を生成するための方法は、当業者によって知ら
れている（定期刊行物としては、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：
１２０２（１９８５）；Ｏｉ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ４：２１４（１９
８６）；Ｃａｂｉｌｌｙ等、ＥＰ１７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等、ＷＯ
８６０１５３３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等、ＷＯ ８７０２６７１； Ｂｏｕｌｉａ
ｎｎｅ等；Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ等
、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５）） 例７：Ｔａｎｇｉｅｒ病の細胞表現型の補正 Ｔａｎｇｉｅｒ病は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）粒子によって加速され
る異化作用と、組織内コレステロールの蓄積によって特徴づけられる。特に、Ｔ
ａｎｇｉｅｒ病にかかった患者の皮膚の線維芽細胞は、ＨＤＬの重要なプロテイ
ンであるアポリポプロテインＡ−１（アポＡ−１）によって保証されるコレステ
ロールの流れのプロセスによって、その内容のコレステロールを除去するべき小
さい体積を有する（Ｆｒａｎｃｉｓ等、１９９５年）。官能基の喪失に対応する
この特徴はまた、家族性ＨＤＬ不全にかかっている患者の他の線維芽細胞内にも
見られる（Ｍａｒｃｉｌ等、１９９９年）。

【０３７８】 Ｔａｎｇｉｅｒの線維芽細胞の表現型の補正は、前記の細胞において、本発明
によるＡＢＣ１の完全なＤＡＮｃのトランスフェクションによって行なうことが
できる。ＤＡＮｃは、次に以下に説明する方法によってトランスフェクションさ
れる表現ベクトル内に挿入される。

【０３７９】 １．Ｔａｎｇｉｅｒ病にかかっている患者及び正常な被験者の線維芽細胞培養
の調製 人間の皮膚の一次的線維芽細胞は、前腕から生じる肌のバイオプシ培養化によ
って得られる。それらのバイオプシは、「ホモ接合体」の臨床学的及び生化学的
特殊性、すなわちオレンジ色の扁桃、百分の五未満のアポＡ−I及びコレステロ
ール−ＨＤＬのプラズマ濃度を有する、Ｔａｎｇｉｅｒ病にかかった患者におい
て実施される。正常の線維芽組織系統は、アメリカンタイプ培養コレクション（
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で得られる。線維芽組織は、牛の胎児の血清１０％
、グルタミン２ｍＭ，ペニシリン１００Ｕｌ／ｍｌ、ステプトマイシン１００μ
ｍ／ｍｌ（ＥＭＭＥＭ１０によって指定される媒質）によって補足されＥＭＭＥ
Ｍ（イーグル−変更済み最小必須媒質；ＧＩＢＣＯ）媒質において培養される。
コレステロールの流れの研究を実施するために、これらの細胞は、子牛の血清は
持たないが、２ｍｇ／ｍｌの牛のアルブミンを含む（ＢＳＡ、フラクションV）
上述の媒質の中で５０μｇ／ｍｌのコレステロールとともに２４時間インキュベ
ーションすることによってコレステロールが予備装入される。

【０３８０】 ２．コレステロールの流れの研究 ２４ウェルにおけるプレート上で融合することによってコレステロールを予備
装入された線維芽組織は、４８時間、ＥＭＭＥＭ１０及び１．２−^３Ｈ−コレス
テロール媒質（５０ Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ｄｕｐｏｎｔ；Ｗｉｌｉｍｉｎｇｔｏｎ
、ＤＥ）においてインキュベーションされる。ウェルごとに、毎分およそ１００
，０００回が、または細胞プロテイン１μｇごとにおよそ毎分１，０００回得ら
れる。細胞は、ＥＭＭＥＭ／ＢＳＡ媒質によって３回洗浄され、優性遺伝子をト
ランスフェクションし、ＥＭＭＥＭ／ＢＳＡ媒質にアポＡ−Ｉを含むプロテオロ
ポゾーム１０μｇ／ｍｌを付加することによって流れを開始させる前に、２４時
間、この媒質によってインキュベーションされる。これらのプロテオリポゾーム
は、ホスファチジルコリン及び浄化された人間のａｐｏＡ−Ｉのソニケーション
によって調製される（Ｊｏｎａｓ、１９８６年）。細胞のトランスフェクション
は、リン酸カルシウムの沈殿技術によって行なわれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１
９８９年）。流れの時間、一般に２０時間を経た後に、媒質は集められ、遠心分
離され（１０００ｇ、５分間）、液体のシンチレーションでカウントすることに
よって放射能が決定される。細胞内に残された放射能はまた、イソプロパノール
の脂質から抽出された後に夜間に決定される。流れのパーセンテージは、細胞の
表面に残存するものと細胞エキスにおいて、表面に残存されたものの中で測定さ
れた放射能力を測定された放射能力の和で割ることによって計算される。証拠遺
伝子によってトランスフェクションされた、正常の線維芽細胞からの細胞コレス
テロールの流れは、６±２％に対応し、それに対して、Ｔｒａｎｇｉｅｒ病にか
かり、その証拠遺伝子によってトランスフェクションされた線維芽細胞から得ら
れる流れは、１％未満である。反対に、本発明による、完全なＤＮＡｃまたはさ
らにＡＢＣ１のゲノムのＤＡＮを含むプラスミドによる、Ｔａｎｆｉｅｒ病にか
かった線維芽細胞のトランスフェクションは、正常線維芽組織のに対応するレベ
ルで、コレステロールの過剰分を除去するそれらの細胞の能力を回復させること
ができるだろう。

【０３８１】 実施例８：人間の遺伝子ＡＢＣ１のゲノムフラグメントの隔離と特徴付け 人間ＡＢＣ１のＤＡＮｃのおよそ３ｋｂのフラグメントは、ＡＢＣ１のＡＴＰ
の第一の固定領域を含む「ｐｆ１０」と称されたＤＡＮｃのクローンから得られ
た。このＤＡＮｃクローンは、Ｌｕｃｉａｎｔ等の論文（１９９４年）の中で紹
介されている。

【０３８２】 制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩを用いてクローンｐｆ１０の温浸によって
得られたＤＡＮｃフラグメントは、電気泳動の後にアガロースのゲル上で隔離さ
れ、さらに、メーカの指示にしたがって、ジゴキシゲニンによってマークされた
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍによって市販されたキット、商品番
号１ ５８５ ６１４）。

【０３８３】 マークされたＤＡＮｃのフラグメントは、ナイロンフィルタ^ＴＭ上に固定され
た染色体９のコスミドＬＬＮＬ（ｌａｗｒｅｎｃｅ Ｌｉｖｅｍｏｒｅ Ｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｌａｂｓ）のバンクを選別するために使用された。

【０３８４】 陽性の６つのクローンが識別された。それら６つのコスミドについては、ゾン
デが単一のコロニーとともに混成された。

【０３８５】 代表的なクローンは、これらのコロニーの各々から隔離された。

【０３８６】 クローンＬＬＮＬＣ １３１Ｊ０８７ Ｑ２（ここではｃｏｓ３ａと称される
）とＬＬＮＬｃ １３Ｏ１１６５ Ｑ２（ここではｃｏｓ６ｆ）がより詳細に分
析された。

【０３８７】 クローンｃｏｓ３ａは、ベクトルＧｅｎ３ｚｆ（−）内でフラグメントＥｘｏ
ＲＩの形状でサブクローン化され、タイプＡＢＩ３７７のシーケンサにおいてビ
ッグ・ダイ・ターミネータ技術を使用しながら２つの先端でシーケンス化された
（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−応用バイオシステム、Ｐｅｒｋｉｎ
Ｅｌｍｅｒ）。

【０３８８】 ベクトルのシーケンスと混成させる前駆体を用いて、完全にシーケンス化され
るためにあまりに長い長さを有する別々のインサート（種々のインサートとの先
端、あるいはまたそれらのサイズの決定によって決定される）を含むクローンは
、トランスポソンの装入技術、次に、トランスポソンの特殊な前駆体を用いたシ
ーケンス化技術によってさらに分析が進められた（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉａｌａｂｓ社によって市販された「ＧＰＳ」システム）。

【０３８９】 この方法で、人間の遺伝子ＡＢＣ１に対応するゲノムシーケンスは、隔離され
、特徴付けられた。これらシーケンスは、イントロン−エキソン接合を決定する
ことができるデータベースの中で参照される人間及びマウスのシーケンスと比較
された。

【０３９０】 実施例９：遺伝子ＡＢＣ１の中の多形性／突然変異の決定 遺伝子ＡＢＣ１の転写シーケンスの中またはゲノムシーケンスの中の多形性ま
たは突然変異の検知は、種々の手順に沿って行なわれた。選択方法は、直接シー
ケンス化である。ＡＲＮｍの調製を得ることができる患者については、選択方法
はＤＮＡｓを調製し、それらを直接的にシーケンス化することである。ＤＮＡし
か入手できない患者については、対応する遺伝子の構造が知られていない、また
は部分的にしか知られていない転写の場合には、イントロン−エキソン構造と、
対応する遺伝子のゲノムシーケンスを厳密に決定することが必要である。したが
って、まず最初に、例８で説明された方法にしたがって検討された転写に対応す
るゲノムＤＡＮのＢＡＣまたは一つまたは複数のコスミドクローンを隔離し、対
応する１つまたは複数のクローンのインサートをシーケンス化して、ＤＡＮｃの
シーケンスと得られたゲノムＤＡＮのシーケンスとを比較することによって、イ
ントロン−エキソン構造を決定することが問題となる。

【０３９１】 直接シーケンス化による突然変異の検知技術は、疾患のためのホモ接合体また
は少なくとも８人の個人（研究対象の病理に感染した４人及び感染していない４
人）から得られた遺伝子ＡＢＣ１のゲノムシーケンスを比較することからなる。
シーケンスの相違が多形性を構成する。自然のプロテインのアミノ酸のシーケン
スを変更させるあらゆるシーケンスは、前記プロテインの官能基に影響を与える
恐れがある突然変異とすることもできる。とりわけ、血統の中、あるいはまた、
散発性の症例の分析のために症例と証拠の接合の研究において、突然変異と病気
の共−分離研究（遺伝子型と表現型との相関）のために考察することが興味深い
と思われる。

【０３９２】 実施例１０：原因となる突然変異または転写の相違によるコレステロールの逆
輸送不全に関連した病気の原因となる遺伝子の識別 実施例９に紹介されている方法によって識別された突然変異については、病気
の表現型に結びついたものはすべて原因となる恐れがある。それらの結果の有効
化は、あらゆる患者と（ＤＮＡが入手可能な）その親戚における遺伝子をシーケ
ンス化しながら行なわれる。

【０３９３】 他方、例１に紹介された方法によって、病気にかかっている個人またはかかっ
ていない個人の特定のＡＲＮからのＮｏｔｈｅｒｎブロットまたはＲＴ−ＰＣＲ
の実施は、研究対象の遺伝子の表現レベルの著しい変化、とりわけ遺伝子の転写
が不在を検知することができる。

【０３９４】 実施例１１：Ｔａｎｇｉｅｒ病にかかった患者における遺伝子ＡＢＣ１のエキ
ソン１３におけるヌクレオチドの欠失の識別 遺伝子ＡＢＣ１における突然変異の分析は、複数のメンバーが、早発性冠動脈
変調をともなうＴａｎｇｉｅｒ病にかかっている血統に属する何人かのＤＮＡ遺
伝子について行なわれた。

【０３９５】 ヌクレオチドの欠失は、エキソン１３において識別された（ＤＧ１７６４：Ｌ
ｅｕ５４８Ｌｅｕ；５７５Ｅｎｄ）。この欠失は、突然変異した遺伝子ＡＢＣ１
によってコード化されたプロテインＡＢＣ１の欠如を予測することができるポジ
ション５７５にストップコドンを引き入れる。この欠如は、アミノ酸の正常のシ
ーケンスの大部分、とりわけＡＴＰにおける２つの固定用カセットの欠失された
ポリペプチドの合成を導く。

【０３９６】 ヌクレオチドのこの欠失の存在と患者の症状の所見との間の完璧な相関が、血
族の全体の中に存在した（図１）。

【０３９７】 実施例１２：遺伝子ＡＢＣ１のエキソン１２におけるヌクレオチドのセグメン
トの装入の識別 複数のメンバーがＴａｎｇｉｅｒ病にかかっている他の血族において、エキソ
ン１２にお１４の基礎対の欠失をともなう、Ａｌｕ−Ｓｑタイプの反復ヌクレオ
チドシーケンス構造を有する１１０の基礎対の装入が見られた（図２）。装入／
欠失によるこの突然変異は、６５のアミノ酸（ＤＥＲＫＦＷ）の欠失と、さらに
３８のアミノ酸（ＥＹＳＧＶＴＹＳＡＨＣＮＬＣＬＬＳＳＳＤＲＡＳＡＳＱＶＡ
ＧＩＴＡＰＡＴＴＰＧ）の位相への装入を予測することを可能にする。

【０３９８】 こうした突然変異は、正常の輸送用ポリペプチドの合成を可能にしない。した
がって、この系統の個人においては、Ｔａｎｇｉｅｒ病は、遺伝子ＡＢＣ１にお
ける欠陥によって引き起こされる。

【０３９９】 実施例１３：遺伝子ＡＢＣ１における双対立遺伝子の多形性の識別 患者のＤＮＡの拡大のための前駆体は、遺伝子ＡＢＣ１のイントロンＤＡＮの
非反復性シーケンスから考えられ、その結果イントロン−エキソン接合の拡大と
、ＡＲＮの組み継ぎ段階中の二次構造の形成のための重要なベースが、拡大され
たフラグメント内に含まれる。

【０４００】 特別に調製された前駆体の種々の対は、表５に示されている。

【０４０１】 冠動脈の合併症をもたないＴａｎｇｉｅｒ病の症例を含む血統のＤＮＡにおい
て認められた結果は、表６に示されている。

【０４０２】 患者の遺伝子ＤＮＡは、メーカによって推薦された拡大サイクルの条件と混成
条件を使用しながら、Ｑｉａｇｅｎ’ｓ Ｓｔａｒ ＴａｇキットまたはＳｕｐ
ｅｒｔａｑキットを用いて、上述の前駆体によって拡大された。

【０４０３】 拡大された生成物ＰＣＲは、Ｑｉａｇｅｎ社から市販されているキットを用い
て浄化され、さらに、シーケンサＡＢＩ３７７においてＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒ
ｍｍｉｎａｔｏｒ法によってシーケンス化された（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｉ
ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）。

【０４０４】 実施例１４：タンジエール病に関連した遺伝子座９ｑ３１上の１ｃＭ領域の同
定 第一連鎖（「ｌｉｎｋａｇｅ」）分析が、Ｒｕｓｔらの論文（１９９８年）に
記載された。

【０４０５】 この論文は、タンジエール病に罹っている患者の３家族に対する連鎖分析を紹
介しており、９ｑ３１における８ｃＭの候補区間を規定した。

【０４０６】 本出願人は、４つの補足家族、並びに公開データベースにおいて参照されてい
る追加のマーカーを含めて連鎖研究を実施し、ジェネトン社（Ｇｅｎｅｔｈｏｎ
）によって公開された遺伝カード（ｃａｒｔｅ ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ）（Ｄｉｂ
ら、１９９６年）を参照して、候補領域を約１ｃＭにきめ細かく決定した。

【０４０７】 下記に示されている連鎖分析結果によって、本出願人は、候補領域から、それ
ぞれマーカーＤ９Ｓ２７１及びＤ９Ｓ１８６６に近位（セントロメア）及び遠位
（テロメア）のゲノムセグメントを除外することができた。

【０４０８】 従って候補領域は、これら２つの除外マーカー間に局在化されている。

【０４０９】 候補領域をきめ細かくするのを可能にした重要な情報は、Ｒｕｓｔらの論文（
１９９８年）に記載された血統のＥ１部分から得られた。実際、この論文の図２
に既に記載されている乗換え事象（ｃｒｏｓｓｉｎｇ−ｏｖｅｒ）（マーカーＤ
９Ｓ２７７とＤ９Ｓ５３間）が、実際にマーカーＤ９Ｓ２７１に対してテロメア
的に局在化されているであろうということが、Ｅ１２１ｍ部分を起源とする母性
染色体上において証明された。候補区間のセントロメア境界は、Ｄ９Ｓ２７１と
Ｄ９Ｓ２７７間に位置する。

【０４１０】 新規家族のうちの２つ、すなわちそれぞれ家族「Ｓ１」と家族「ＮＵ」におい
て、補足乗換え事象が観察された。これらの乗換え事象によって、候補区分のテ
ロメア境界を、マーカーＤ９Ｓ１６７７（Ｒｕｓｔらの論文（１９９８年）に記
載されているもの）からマーカーＤ９Ｓ１８６６に移動させることができた。

【０４１１】 第一血統「Ｓ１」が伸長された。罹患している個人は、８ｃＭ領域のすべての
マーカー、並びにこの領域の両側に局在化されているさらに遠いマーカーについ
て、ホモ接合体遺伝子型を示している。２人の両親（二重近親交配）によってＳ
１に類似している個人Ｓ１のいとこのうちの一人は、４人の子供を持っている。
これらの子供のうちの２人は、父性起源の染色体上に、病気のハプロ型（ｈａｐ
ｌｏｔｙｐｅ）の大部分の保持を示す（８ｃＭの規定領域内）。これらの２人の
子供はまた、タンジエール病に罹っている家族のヘテロ接合体両親の典型的な特
徴、すなわちこの病気に冒されていない患者において見られるレベルの半分のＨ
ＤＬレベルを示す。

【０４１２】 しかしながらこれらのマーカーについてのホモ接合体形質は、マーカーＤ９Ｓ
１８６６（これはこれらの個人においてヘテロ接合体である）からの染色体領域
においてはもはや見られない。これによって、Ｄ９Ｓ１８６６を、候補領域のテ
ロメア境界と規定することができた。

【０４１３】 同じテロメア境界は、家族「Ｎｕ」においても見られた。この家族において、
明白ないとこ同士の両親からの４人の子供のうちの一人は、ホモ接合体タンジエ
ール病に冒された患者であった。

【０４１４】 候補領域の全体上のマーカーについてのホモ接合性が、この患者において見ら
れた。

【０４１５】 ヘテロ接合体（表現型レベルにおいて）のこの患者の兄弟のうちの一人は、２
つの染色体のうちの１つ上で乗換え事象（ｃｒｏｓｓｉｎｇ−ｏｖｅｒ）を示し
ており、従ってこの兄弟は、マーカーＤ９Ｓ１８６６を含むあらゆるテロメアマ
ーカーについてホモ接合体（遺伝レベルにおいて）であるが、セントロメアの方
への領域において局在化されているマーカーの場合、ヘテロ接合体（遺伝レベル
において）である。

【０４１６】 この患者は、ホモ接合体患者の表現型を示さないので、マーカーＤ９Ｓ１８６
６を含むテロメア領域は除外することができた。

【０４１７】 実施例１５：ヒト遺伝子ＡＢＣ１の単離及び特徴決定 ヒトＡＢＣ１のＤＮＡｃの約３ｋｂの断片は、ＡＢＣ１のＡＴＰの第一固定ド
メインを含む「ｐｆ１０」と名付けられたＤＮＡｃのクローンから得られた。こ
のＤＮＡｃのクローンは、Ｌｕｃｉａｎｉらの論文（１９９４年）に記載されて
いる。

【０４１８】 制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲｌによるクローンｐｆ１０の消化によって得
られたこのＤＮＡｃ断片は、電気泳動後アガロースゲル上で単離され、ついで構
成者の指示に従って（ベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ）によって販売されているキット）ジゴキシゲニンでマークされ
た。

【０４１９】 マークされたこのＤＮＡｃ断片は、ナイロン（Ｎｙｌｏｎ）（登録商標）のフ
ィルター上に固定化された染色体９のコスミドバンクＬＬＮＬを選別するために
用いられた。

【０４２０】 ６つのポジティブクローンが同定された。これら６つのコスミドについて、プ
ローブはユニークコロニーとハイブリダイズした。

【０４２１】 代表的クローンが、これらのコロニーの各々から単離された。

【０４２２】 これらのクローンＬＬＮＬＣ １３１Ｊ０８７ Ｑ２（ここではｃｏｓ３ａと
名付けられている）及びＬＬＮＬｃ １３１０１１６５ Ｑ２（ここではｃｏｓ
６ｆと名付けられている）が、より詳細に分析された。

【０４２３】 クローンｃｏｓ３ａは、ベクターＧｅｎ３ｚｆ（−）内の断片ＥｃｏＲｌの形
態でサブクローニングされ、ＡＢ１３７７型のシークエンサー上のビッグダイ・
ターミネーター（Ｂｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）技術を用いて、２つ
の末端に配列決定された。

【０４２４】 ベクターの配列とハイブリダイズするプライマーによって完全に配列決定され
るには大きすぎる長さを有する別々の挿入断片（異なる挿入断片の末端の配列決
定後、あるいはさらにはこれらのサイズの決定によって決定されたもの）を含む
クローンは、トランスポゾンの挿入技術によって、ついでトランスポゾンの特異
的プライマーによる配列決定技術（ニューイングランド・バイオラブス社（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって販売されている系「ＧＰＳ」）
によってさらに詳しく分析された。

【０４２５】 このようにして、ヒト遺伝子ＡＢＣ１に対応するゲノム配列が単離され、特徴
決定された。これらの配列は、ヒトの配列及びデータベースにおいて参照されて
いるマウスの配列と比較された。

【０４２６】 イントロン−エキソン結合の配列を決定した。

【０４２７】 これらの患者のＤＮＡの増幅用のプライマーは、イントロン−エキソン結合の
増幅並びにスプライス工程中の投げ縄型構造の形成に対して不可欠の塩基が、増
幅された断片の中に含まれるように、遺伝子ＡＢＣ１のイントロンＤＮＡの非反
復的配列から考え出された。

【０４２８】 これらの患者のゲノムＤＮＡは、キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）のスター・タッ
ク（Ｓｔａｒ Ｔａｑ）キット、あるいはさらにはスーパータック（Ｓｕｐｅｒ
ｔａｑ）キットを用い、ハイブリダイゼーション条件及び構成者によって推奨さ
れている増幅サイクル条件を用いて、上記プライマーによって増幅された。

【０４２９】 増幅ＰＣＲ産物は、キアゲン社によって販売されているキットを用いて精製さ
れ、ついでシークエンサーＡＢ１３７７上のビッグダイ・ターミネーター方法に
よって配列決定された。

【０４３０】 実施例１６：タンパク質ＡＢＣ１についてコードするポリヌクレオチドを含む
組換えベクターの構成 １．ヒト遺伝子ＡＢＣ１の合成 ヒト胎盤組織（米国カリフォルニア州パロアルトのクロンテック社（Ｃｌｏｎ
ｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ））から単離された全ＲＮＡ（５
００ｎｇ）が、下記のものを利用して、ヒト遺伝子ＡＢＣ１のＤＮＡｃの合成源
として用いられた。すなわち「スーパースクリプト・ワン・ステップ（Ｓｕｐｅ
ｒｓｃｒｉｐｔ ｏｎｅ ｓｔｅｐ）ＲＴ−ＰＣＲ（米国メリーランド州ゲイタ
ーズバーグのライフ・テクノロジー社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ））及び下記ＡＢＣ１の特異的オリゴ
ヌクレオチドプライマー（０．２５μＭ）を利用した： − 行きのプライマー：５’−ＣＴＡＣＣＣＡＣＣＣＴＡＴＧＡＡＣＡＡＣ−
３’（ＡＢＣ１ ＤＮＡｃのｎｔ ７５−９４） −帰りのプライマー：５’−１ＧＣＣＡＣＣＣＣＧＴＡＴＧＡＡＣＡＧＧＧ−
３’（ＡＢＣ１ ＤＮＡｃのｎｔ ６７３１−６７５１）。

【０４３１】 これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、ＡＢ１ ３９４型のＤＮＡの合成
装置（米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ
社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ，
ＵＳＡ））でのホスホルアミダイト方法によって合成された。

【０４３２】 制限酵素Ｎｏｔｌによって認識された部位は、新規増幅工程によって、６６７
６ｐｂの増幅ＤＮＡｃ中に組み込まれた。この時、前記ジデオキシヌクレオチド
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、及びｄＧＴＰの各々２００μＭ、並びにＰｙｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（米国カリフォルニア州ラジョラのストラタ
ジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）
）のＤＮＡポリメラーゼの存在下、マトリックスとしてのヒトＡＢＣ１のＤＮＡ
ｃ ５０ｎｇ、及び５’末端に制限酵素Ｎｏｔｌによって認識された部位を含む
前記オリゴヌクレオチドプライマー０．２５μＭを用いた。

【０４３３】 ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ用の熱サイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｕｒ）装置
（米国コネチカット州ノーウオークのシータス・パーキン・エルマー社（Ｃｅｔ
ｕｓ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，ＵＳＡ））において
、各々９５℃で１分間の変性工程、５０℃で１分間の復元工程、及び７２℃で２
分間の延長工程を含む３０サイクルの間に施した。

【０４３４】 ＩＩ．発現ベクターにおけるヒト遺伝子ＡＢＣ１のＤＮＡｃのクローニング ヒトＡＢＣ１のＤＮＡｃの６６７６ｐｂの挿入断片が、サイトメガロウイルス
の早発性（ｐｒｅｃｏｃｅ）プロモーター及び活性化配列（「Ｅｎｈａｎｃｅｒ
」）、並びにＳＶ４０のポリアデニル化シグナルを含む発現ベクターｐＣＭＶの
制限部位Ｎｏｔｌにクローンされ（Ｂｅｇら、１９９０年；Ａｐｐｌｅｂａｕｍ
−Ｂｏｄｅｎ、１９９６年）、ｐＡＢＣ１と名付けられた発現ベクターがつくら
れた。

【０４３５】 クローンされたＤＮＡｃの配列は、ＡＢｌ ３１０型の毛管シークエンサー（
米国カリフォルニア州フォスターシティ、アプライド・バイオシステムズ社）に
おいて、反応セット「ＡＢｌ プリズム・ビッグダイ・ターミネーター・サイク
ル・シークエンシング・レディ」（米国カリフォルニア州フォスターシティ、ア
プライド・バイオシステムズ社によって販売されているもの）を用いて、２つの
ストランド（ｂｒｉｎ）上の配列決定によって確認された。

【０４３６】 ＩＩＩ．ヒト遺伝子ＡＢＣ１のＤＮＡｃを含む組換えアデノウイルスベクター
の構成 Ａ．発現ベクターｐＣＭＶ−βの修飾 発現ベクターｐＣＭＶ−β（米国カリフォルニア州パロアルトのクロンテック
社、遺伝子バンク受入れ番号第Ｕ０２４５１号）のβ−ガラクトシダーゼのＤＮ
Ａｃは、制限エンドヌクレアーゼＮｏｔｌでの消化によって欠失させられ、５’
末端から３’末端の方へ、下記部位を含むクローニング多部位（ｐｏｌｙｓｉｔ
ｅ）と置換えられた： Ｎｏｔｌ、Ａｓｃｌ、Ｒｓｒｌｌ、Ａｖｒｌｌ、Ｓｗａｌ、及びＮｏｔｌ（ク
ローニング多部位の配列）：

【０４３７】

【化２】 クローニングのこの多部位は、部位Ｎｏｔｌのレベルでクローンされた。

【０４３８】 修飾された発現ベクターｐＣＭＶの部位ＥｃｏＲｌとＳａｎｌとの間に含まれ
るＤＮＡ断片が単離され、シャトルベクターｐＸＣＸｌｌの修飾部位Ｘｂａｌ中
にクローンされた（ＭｃＫｉｎｎｏｎら、１９８２年；ＭｃＧｒｏｒｙら、１９
８８年）。

【０４３９】 Ｂ．シャトルベクターｐＸＣＸｌｌの修飾 ５’末端から３’末端の方へ、制限部位Ｘｂａｌ、ＥｃｏＲｌ、Ｓｆｉｌ、Ｐ
ｍｅｌ、Ｎｈｅｌ、Ｓｒｆｌ、Ｐａｃｌ、Ｓａｌｌ、及びＸｂａｌ（配列：

【０４４０】

【化３】 のもの）を含むクローニング多部位は、ベクターｐＸＣＸｌｌのＸｂａｌ部位（
３３２９位のヌクレオチド）のレベルに挿入された（ＭｃＫｉｎｎｏｎら、１９
８２年；ＭｃＧｒｏｒｙら、１９８８年）。

【０４４１】 ＣＭＶのプロモーター／エンハンサー、ＦＶ４０のスプライシングドナー及び
アクセプター部位、及びＦＶ４０のポリアデニル化シグナルを含む、修飾ベクタ
ーｐＣＭＶ−βから単離されたＤＮＡ ＥｃｏＲｌ−Ｓａｌｌの断片はついで、
ｐＣＭＶ−１１と名付けられた修飾シャトルベクターｐＸＣＸの部位ＥｃｏＲｉ
−Ｓａｌｌ中にクローンされた。

【０４４２】 Ｃ．シャトルベクターｐＡＤ１２−ＡＢＣ１の調製 ヒトＡＢＣ１ ＤＮＡｃは、前記のようにＲＴ−ＰＣＲ反応によって得られ、
ベクターｐＣＭＶ−１２中の部位Ｎｏｔｌのレベルにクローンされ、その結果ベ
クターｐＣＭＶ−ＡＢＣ１が結果として得られる。

【０４４３】 ベクターｐＣＭＶ−ＡＢＣ１中に含まれているＡＢＣ１ ＤＮＡｃは、ヒトＡ
ＢＣ１ ＤＮＡｃの７５位のヌクレオチドから、６７５１位のヌクレオチドまで
の配列を含む、６６７６ｐｂのＤＮＡ断片から構成されている。

【０４４４】 Ｄ．ＡＢＣ１組換えアデノウイルスの構成 ヒトＡＢＣ１ ＤＮＡｃを含む組換えアデノウイルスＡＢＣ１−ｒｌｄＶは、
ＭｃＧｒｏｒｙら（１９８８年）によって記載された技術に従って構成された。

【０４４５】 簡潔に言えば、ベクターｐＡＤ１２−ＡＢＣ１は、ＣＨＥＮ及びＯＫＡＹＡＭ
Ａの技術（１９８７年）に従って、ベクターｔＧＭ１７と共にコトランスフェク
ションされた。

【０４４６】 同様にベクターｐＡＤ１２−ルシフェラーゼが構成され、ベクターｐＪＭ１７
と共にコトランスフェクションされた。

【０４４７】 組換えアデノウイルスは、ＰＣＲ増幅によって同定され、ヒトの腎臓の胚細胞
系統ＨＥＫ２９３（米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ））中での大規模増幅前に
２サイクルの精製に付された。

【０４４８】 感染された細胞は、アデノウイルスベクターによる感染の４８〜７２時間後に
収集され、凍結及び解凍による５サイクルの溶解に付された。

【０４４９】 これらの粗ライゼートは、フレオン（ハロカーボン１１３、米国ニュージャー
ジー州スコーカスのマセソン・プロダクト社（Ｍａｔｈｅｓｏｎ Ｐｒｏｄｕｃ
ｔ，Ｓｃａｕｃｕｓ，Ｎ．Ｊ．ＵＳＡ））によって抽出され、０．２％マウスア
ルブミンが補足された塩化セシウム（米国ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケ
ミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ、
ＭＯ，ＵＳＡ））中に２回沈降され、１５０ｎＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｈｅｐ
ｅｓ（ｐＨ７，４）、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、及び１ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ_２から成る緩衝液に対して示量的に（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｍｅｎｔ）透析さ
れた。

【０４５０】 組換えアデノウイルスは、−７０℃に保存され、動物へのこれらの投与、又は
培養中細胞とのこれらのインキュベーション前に滴定された。

【０４５１】 野生型の汚染アデノウイルスの不在は、欠失領域の構造部分上に局在化された
オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲ増幅による選別によって確認さ
れた。

【０４５２】 ＩＶ．ヒトＡＢＣ１ ＤＮＡｃの発現の有効化 ヒトポリペプチドＡＢＣ１の特異的ポリクローナル抗体は、タンパク質ＡＢＣ
１から誘導された合成ペプチド「ＬＨＫＮＱＴＶＶＤＶＡＶＬＴＳＦＬＱＤＥＫ
ＶＫＥＳＹＶ」の注入によって、ウサギ及びひよこにおいて調製された。これら
のポリクローナル抗体は、免疫インプリンティング（ｉｍｍｕｎｏｅｍｐｒｅｉ
ｎｔｅ）及び／又は免疫検出による細胞及び動物モデルにおけるヒト遺伝子ＡＢ
Ｃ１の発現を検出及び／又は定量化するために用いられる。

【０４５３】 ＡＢＣ１の生物活性は、コレステロールが挿入されたベクターｐＣＭＶ−ＡＢ
Ｃ１によってトランスフェクションされた細胞から、アポＡ−ｌによって誘発さ
れたコレステロールフラックスを定量化して追跡することができる（Ｒｅｍａｌ
ｅｙら、１９９７年）。

【０４５４】 Ｖ．細胞中のヒトＡＢＣｌ ＤＮＡｃの試験管内発現 系統ＨＥＫ２９３及び系統ＣＯＳ−７の細胞（米国メリーランド州ベテスダの
アメリカン・ティシュー・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉ
ｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｂｅｔｅｓｄａ，ＭＤ，Ｕ
ＳＡ））、並びにタンジエール病患者又は低アルファリポタンパク質血症に罹っ
ている患者に由来する初代培養の繊維芽細胞が、リポフェクタミン（米国メリー
ランド州ゲイターズバーズのＢＲＬ社）を用いて、あるいは塩化カルシウムによ
る共沈殿によって（Ｃｈｅｎら、１９８７年）、発現ベクターｐＣＭＶ−ＡＢＣ
１（５〜２５μｇ）でトランスフェクションされる。

【０４５５】 これらの細胞はまた、ベクターｐＡＢＣ１−ＡｄＶで感染させられてもよい（
感染指数、ＭＯｌ＝１０）。

【０４５６】 ヒトＡＢＣ１発現後に、免疫インプリンティング、並びにトランスフェクショ
ン及び／又は感染された細胞からのアポＡ−１によって誘発されたコレステロー
ルの流出の定量化を行なってもよい。

【０４５７】 タンジエール病患者及び低アルファリポタンパク質血症患者が、これらの患者
の繊維芽細胞から罹っている遺伝的欠陥の相補性は、正常遺伝子ＡＢＣ１の発現
の検出によって確認することができる。これによって、この受容体の機能的重要
性を確立することができる。

【０４５８】 ＶＩ．：各動物モデルにおけるＡＢＣ１遺伝子のインビボでの発現 溶菌斑（ＰＦＵｓ）を形成する１０８〜１０９単位を含む純度を高めた組換え
アデノウイルス（ｐＡＢＣ１−ＡｄＶまたはｐＬｕｃｉｆ−ＡｄＶ）を含む媒質
の適切量（１００〜３００ｍｌ）を、実験０日に、マウスの伏在静脈内に注入す
る（Ｃ５７ＢＬ／６、一度に基準マウスおよび遺伝子組換えマウスまたはノック
アウトマウス）。

【０４５９】 リポ蛋白質の代謝におけるＡＢＣ１蛋白質の生理的な役割の評価は、コレステ
ロール、トリグリセリド、リン脂質および遊離コレステロール（Ｓｉｇｍａ ｅ
ｔ Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＶＡ， ＵＳＡ）
、ＨＤＬコレステロール（ＣＩＢＡ−Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｏｂｅｒｌｉｎ， Ｏ
Ｈ， ＵＳＡ）およびマウスのアポリポ蛋白質Ａ−I、Ａ−II、ＥおよびＢ（Ｆ
ｏｇｅｒら、１９９７年）の総量を、アデノウイルスの投与前（０日）および後
（２、４、７、１０、１４日）に測定することで行う。

【０４６０】 アポＡ−I−ＨＤＬ、ＣＥ−ＨＤＬならびにアポＢ−ＬＤＬおよびＣＥ−ＬＤ
Ｌのような放射能で標識した生成物による動力学的な調査をベクターｒＬｕｃｆ
−ＡｄＶおよびｒＡＢＣ１−ＡｄＶの投与５日後に行って、ＨＤＬｓおよびＬＤ
Ｌｓならびにコレステロールの肝臓への放出に対するＡＢＣ１の発現効果を評価
する。

【０４６１】 アテローム性動脈硬化症の進行に対するＡＢＣ１発現の効果は、ベクターｒＡ
ＢＣ１−Ａｄｖの投与後、マウスアポＥにおける大動脈損傷の平均面積を計量化
して評価してもよい。

【０４６２】 さらに、遺伝子組換えマウスおよびＡＢＣ１遺伝子を過剰発現するウサギを、
Ｗａｉｓｍａｎ（１９９５年）およびＨｏｅｇ（１９９６年）の情報に従って、
ＡＢＣ１、ＣＭＶまたはアポＥのような内在性プロモーターのコントロール下に
ヒトＡＢＣ１のｃＤＮＡを含む構成を用いて生成してもよい。

【０４６３】 脂質、リポ蛋白質、血漿アポリポ蛋白質の動力学およびアテローム性動脈硬化
症に対するＡＢＣ１発現の長期にわたる効果の評価は上述のように行ってもよい 実施例１７：ＡＢＣ１遺伝子の作用分子および拮抗分子のスクリーニングに対
する小胞の利用 この試験の基本は、ＡＢＣ１遺伝子を取り込み、コレステロールまたはリン脂
質のような基質を含むメンブランの再構成である。ＡＢＣ１蛋白質はそこで活性
化されてもよく、またはその機能を価値ある分子を付加することで抑制してもよ
い。ＡＢＣ１蛋白質により形成された導管による基質の排出を検出する。

【０４６４】 ａ） ＡＢＣ１蛋白質および標識した基質を含むメンブランの再構成 有機溶媒や、超音波処理『フレンチプレス』のような機械的手段を用いた方法、
または凝結・解凍サイクルによる方法、さらには界面活性剤を用いた方法（コー
ル酸塩類， Ｃｈａｐｓ， Ｃｈａｐｓｏ） （参照 ： Ｒｉｇａｕｄら Ｂ
ｉｏｃｈｉｍｉｃａ およびＢｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １２３１ （１
９９５年）２２３−２４６）など、これらのメンブランを製造するためには数多
くの方法を用いることができる。

【０４６５】 より詳細には、リン脂質のような脂質基質、３Ｈ−コレステロール、１２５−
I−コレステロール、３Ｈ−ホスファチジリコリン型の放射性またはＮＢＤまた
はピレン（分子プローブ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ）およ
び卵のホスファチジリコリンを伴った蛍光性コレステロールまたはコレステロー
ルエステルをガラスフラスコの底部で乾燥させる。このフラスコ内で、コール酸
ナトリウムおよび０．３モルのモル比率のＡＢＣ１蛋白質を一度に混合する。全
体をボルテックスにより５分間混合し、次いで２５℃で３０分間インキュベート
を行い、続いて食塩緩衝液に対して透析を行う。この手順により作られた蛋白リ
ポソームを混濁度計測器で検査して、良好に製造されているかを確認する。

【０４６６】 ｂ）固体表面上での蛋白リポソーム捕獲 この段階はインテグリンタイプの固定蛋白質を取り込んで行ってもよい。この
手順では、あらかじめ９６または３８４穴のプレート上に吸収させたＡＢＣ１蛋
白質に対して導かれた抗体による捕獲を用いる。

【０４６７】 濃度１００ｍｇ／ｌのこれら抗体を含む溶液を、４℃の装置上でインキュベー
ションを行ってこれら多穴プレート上に吸収させる。洗浄後、３７℃で２時間イ
ンキュベートした１ｍｇ／ｍｌのウシアルブミンによりプレートを飽和する。全
体をさらに洗浄し、ＡＢＣ１を含む蛋白リポソームと共に３７℃で２時間インキ
ュベートする。

【０４６８】 ｃ）価値ある分子への結合 この工程は生成物を３７℃で１時間インキュベーションすることで行われる。

【０４６９】 ｄ）ＡＢＣ１の活性化または抑制の測定 基質が蛍光性である場合、残存物の蛍光により、蛋白リポソームの外側への脂
質の輸送を引き起こす生成物の活性が明らかにされる。または、共焦点システム
を用いることで蛋白リポソームの内外での基質の量についての情報が得られる。
基質が放射性である場合は、シンチレーション液との保存液を有するＣｙｔｏＳ
ｔａｒタイプのプレートを使用することで、蛋白リポソーム内にまだ残存してい
る基質が明らかになる。

【０４７０】 実施例１８：ＡＢＣ１蛋白質の作用および拮抗分子のスクリーニングのための
アニオン輸送の利用 この試験の原理は、アニオンをその活性時に輸送するＡＢＣ１蛋白質の特性に
基づくものである。。

【０４７１】 ａ）ＴＨＰ−１系統のマクロファージ細胞、単球白血病ヒト細胞は異なったマ
クロファージモデルである。これら細胞を、１穴毎に２１０５細胞密度である４
８穴プレート内の胎生子牛血清を１０％追加した媒質ＲＰＭＩ１６４０内で培養
する。Ｔａｎｇｉｅｒ病患者の繊維芽細胞は、これらのＡＢＣ１蛋白質が機能し
ないので、マイナス指標として用いることができる。もう一つのマイナス指標は
抗ＡＢＣ１抗体を付加することで得てもよい。

【０４７２】 ｂ）アニオン輸送不全細胞またはアニオン導管阻害剤で処理した細胞（バラパ
ミル型、Ｐ−グリコプロテイン阻害剤またはテトラエチルアンモニウム、カリウ
ム導管阻害剤）を使用してもよい。

【０４７３】 ｃ）厳密な意味での試験のために、細胞を、Ｋｌを１ｍｌ〜１ｍｍｏｌ／Ｌ（
Ｎａ１２５が０．１ｍＣｉ／ｍｌ）であらかじめ電荷した塩水で修飾したＥａｒ
ｌｅｓ媒質により、このＥＳＳ媒質内で、３７℃、３０分間洗浄する。生成物を
細胞外媒質内に加える。次に細胞をＥＳＳ媒質により洗浄する。

【０４７４】 ｄ）媒質内のヨウ化物の量を１１分間の間１分ごとに検出する。二つの第１点
が基本的な流出量に一致する。インキュベーション終了時に媒質を取り出し、細
胞内に残ったヨウ化物の量を、ＮａＯＨ１モル内の細胞溶解物に基づき計測する
。

【０４７５】 ｅ）ゼロ時間における総放射量は細胞の残存物および残渣中に見いだされる放
射能の総計に等しい。時間毎の媒質中に放出された放射能のパーセンテージを記
入して流出グラフ作成する。

【０４７６】 実施例１９：ＡＢＣ１蛋白質の作用および拮抗分子のスクリーニングのための
ＩＬ−１ベータを発現するＴＨＰ−１マクロファージの使用 このテストの原理は、ＡＢＣ１蛋白質の活性を調製するあらゆる物質がＩＬ−
１の合成に影響を与えることにある。

【０４７７】 ａ）ＴＨＰ−１系統のマクロファージ細胞、単球白血病ヒト細胞は異なったマ
クロファージモデルである。各細胞を、穴毎に２１０５細胞密度である多穴プレ
ート内の胎生子牛血清を１０％追加した媒質ＲＰＭＩ１６４０内で培養する。

【０４７８】 ｂ）本来の意味での試験のために、細胞を洗浄して、純度を高めたヒトアルブ
ミン（フラクショIV）１ｍｇ／ｍｌを含むＲＰＭI１６４０媒質内に配置する。

【０４７９】 ｃ）生成物を細胞外媒質に加える。同時に細胞を１ｍｇ／ｍｌのリポ多糖類（
ＬＰＳ）を３時間かけて加えて活性化し、５ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰの存在下に３
０分間インキュベートする。

【０４８０】 ｄ）ＩＬ−１ベータの濃度、コントロール状態のＩＬ−１アルファ腫瘍壊死因
子（ＴＮＦアルファ）およびＩＬ−６の濃度を、ＥＬＩＳＡキットにより、製造
者（（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｔｅｍ；ヒト ＩＬ−１ベータ化学蛍光ＥＬＩＳＡ 参
照 ＱＬＢ００）の説明に従って測定する。影響を受けないとされるＩＬ−１ベ
ータのｍＲＮＡでの変化を対応するプローブを使ってノーザンブロット法で評価
する。

【０４８１】

【表６】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１はＡＢＣ１遺伝子のエクソン１２におけるＡｌｕ配列の挿入による変異の
分離を例証している。ＡＢＣ１遺伝子のエクソン １２における挿入−欠失は、
図１Ａに示すような１４のヌクレオチドの欠失および１１０のヌクレオチドの挿
入からなる。図１Ｂは、エクソン１２のＰＣＲによる増幅後にそれぞれの患者か
ら得た系統 ＮｕおよびＤＮＡフラグメントの大きさを示している。コースＭは
移動マーカーに対応する（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）。コースＣは指標ＤＮＡに対応
する。

【図２】 図２はＡＢＣ１遺伝子のエクソン１３における一つのヌクレオチドの欠失によ
る変異を例証している。補足片の配列が得られ、これを３’から５’の方向へ示
している。ＡＢＣ１ポリペプチドのアミノ酸５４６〜５５２をコードする配列を
調査を行った系統群のさまざまな患者について示しており、それぞれ同型接合個
体（図２−ａ）、異種接合個体（図２−ｂ）および非罹患個体（図２−ｃ）に対
している。図２−ａの配列は ３人の同型接合個体で見いだされ、図２−ｂの配
列は５人の異種接合個体で、図２−ｃの配列は４人の非罹患個体で見いだされた
。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 3/04 Ａ６１Ｐ 9/04 ４Ｃ０８６ 3/06 9/10 ４Ｃ０８７ 9/04 Ｃ０７Ｋ 14/47 ４Ｈ０４５ 9/10 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/21 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 アルヌウ−ルギーニユ，イザベル フランス国、エフ−94430・シユネビエー ル・シユール・マルヌ、リユ・ドウ・ブ リ、112 (72)発明者 プラドウ，カトリーヌ フランス国、エフ−94320・チエ、アブニ ユ・ドユ・ジエネラル・ドウ・ゴール、30 (72)発明者 ノダン，ローラン フランス国、エフ−91150・エタンプ、リ ユ・ドウ・ラ・ロシユ・プラツト、11・ビ ス (72)発明者 ルモアンヌ，サンドリンヌ フランス国、エフ−91300・マシー、アブ ニユ・マルセル・ラモルフオ・ガルニエ、 ５ (72)発明者 ドユベルジエ，ニコラ フランス国、エフ−75005・パリ、リユ・ ロラン、４ (72)発明者 アースマーン，ゲルト ドイツ国、デー−48161・ミユンスター、 ニユニンクベーク・49 (72)発明者 ルスト，シユテフアン ドイツ国、デー−48147・ミユンスター、 タンネンベルクシユトラーセ・６−８ (72)発明者 フンケ，ハラルト ドイツ国、デー−48145・ミユンスター、 ゲーアハルトシユトラーセ・13 (72)発明者 ブルアー，エイチ・ブライアン アメリカ合衆国、メリーランド・20854、 ポトマツク、ペブル・ブルツク・レイン・ 10805 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 FB07 4B024 AA01 AA11 CA04 CA09 EA02 HA14 HA17 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ02 QQ43 QQ79 QR48 QR55 QS32 4B065 AB01 BA02 CA22 CA44 CA46 4C084 AA02 AA13 CA01 CA53 NA14 ZA36 ZA40 ZA45 ZA70 ZC33 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 NA14 ZA36 ZA40 ZA45 ZA70 ZC33 4C087 AA01 AA02 BC83 NA14 ZA36 ZA40 ZA45 ZA70 ZC33 4H045 AA10 AA11 AA30 CA40 DA75 EA23 EA27 EA50

Claims (51)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヌクレオチド配列配列番号１−１４から成る群から選ばれる
   ポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸の少なくとも２４５連続ヌクレオチドを
   含む核酸。
2. 【請求項２】 ヌクレオチド配列配列番号１５−４７から成る群から選ばれ
   るポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸を含む核酸。
3. 【請求項３】 ヌクレオチド配列配列番号４８−９０から成る群から選ばれ
   るポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸の少なくとも８連続ヌクレオチドを含
   む核酸。
4. 【請求項４】 ヌクレオチド配列配列番号４８−９０から成る群から選ばれ
   るポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸との少なくとも８０％のヌクレオチド
   同一性を有する核酸。
5. 【請求項５】 強緊縮条件下に、ヌクレオチド配列配列番号４８−９０から
   成る群から選ばれるポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸とハイブリダイズす
   る核酸。
6. 【請求項６】 配列配列番号９１のポリヌクレオチド又は相補配列の核酸を
   含む核酸。
7. 【請求項７】 ヌクレオチド配列配列番号９２から成る群から選ばれるポリ
   ヌクレオチド、これの生物学的に活性な断片、又は相補配列の核酸の少なくとも
   ８連続ヌクレオチドを含む核酸。
8. 【請求項８】 ヌクレオチド配列配列番号９２から成る群から選ばれるポリ
   ヌクレオチド、これの生物学的に活性な断片、又は相補配列の核酸との少なくと
   も８０％のヌクレオチド同一性を有する核酸。
9. 【請求項９】 強緊縮条件下に、ヌクレオチド配列配列番号９２から成る群
   から選ばれるポリヌクレオチド、これの生物学的に活性な断片、又は相補配列の
   核酸とハイブリダイズする核酸。
10. 【請求項１０】 ヌクレオチド配列配列番号９３−９６から成る群から選ば
    れるポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸の少なくとも８連続ヌクレオチドを
    含む核酸。
11. 【請求項１１】 ヌクレオチド配列配列番号９３−９６から成る群から選ば
    れるポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸との少なくとも８０％のヌクレオチ
    ド同一性を有する核酸。
12. 【請求項１２】 強緊縮条件下に、ヌクレオチド配列配列番号９３−９６か
    ら成る群から選ばれるポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸とハイブリダイズ
    する核酸。
13. 【請求項１３】 ヌクレオチド配列配列番号９７−１０８から成る群から選
    ばれ、かつ多形塩基を含むポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸の少なくとも
    ８連続ヌクレオチドを含む核酸。
14. 【請求項１４】 請求項１〜９のうちのいずれか１つに記載の核酸から選ば
    れる少なくとも１５ヌクレオチドの長さの、遺伝子ＡＢＣ１の特異的ヌクレオチ
    ドプローブ又はプライマー。
15. 【請求項１５】 ヌクレオチド配列配列番号１０９−１３８から成る群から
    選ばれるポリヌクレオチド、又は相補配列の核酸を含む、請求項１４に記載のプ
    ローブ又はプライマー。
16. 【請求項１６】 請求項１１又は１２に記載の核酸から選ばれる、少なくと
    も１５ヌクレオチドの長さの、遺伝子ＡＢＣ１中の突然変異の検出に有用なヌク
    レオチドプローブ又はプライマー。
17. 【請求項１７】 ヌクレオチド配列配列番号１０９−１１２から選ばれるポ
    リヌクレオチド、又は相補配列の核酸を含む、請求項１６に記載のヌクレオチド
    プローブ又はプライマー。
18. 【請求項１８】 請求項１３に記載の核酸から選ばれる、少なくとも１５ヌ
    クレオチドの長さの、遺伝子ＡＢＣ１中の多形性の検出に有用なヌクレオチドプ
    ローブ又はプライマー。
19. 【請求項１９】 ヌクレオチド配列配列番号１４２−１４９から選ばれるポ
    リヌクレオチド、又は相補配列の核酸を含む、請求項１８に記載のプローブ又は
    プライマー。
20. 【請求項２０】 ヌクレオチド配列配列番号９７−１０８又はこれらの相補
    配列から成る群から選ばれるポリヌクレオチドの少なくとも１５連続ヌクレオチ
    ドを含むヌクレオチドプライマーであって、これらのプライマーの３’末端の塩
    基は、配列配列番号９７−１０８又はこれらの相補配列のうちの１つの多形塩基
    の５’側のすぐ近くに局在化されているヌクレオチドの相補的なものであるプラ
    イマー。
21. 【請求項２１】 ヌクレオチド配列配列番号９７−１０８又はこれらの相補
    配列から成る群から選ばれるポリヌクレオチドの少なくとも１５連続ヌクレオチ
    ドを含むヌクレオチドプライマーであって、これらのプライマーの３’末端の塩
    基は、配列配列番号９７−１０８又はこれらの相補配列のうちの１つの多形塩基
    の５’側の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、
    １５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチド又はそれ以上に位置するヌク
    レオチドの相補的なものであるプライマー。
22. 【請求項２２】 試料中に含まれている、請求項１〜１３のうちのいずれか
    １つに記載の核酸の増幅方法であって、前記方法は、下記工程： ａ）増幅反応に必要な反応体の存在下において、標的核酸の存在が疑われる試
    料と、ハイブリダイゼーション位置がそれぞれ、増幅が求められている標的核酸
    の領域の５’側及び３’側に局在化されている一対のヌクレオチドプライマーと
    を接触させる工程；及び ｂ）増幅された核酸の検出工程、 を含んでいる方法。
23. 【請求項２３】 ヌクレオチドプライマーが、請求項１４〜１９のうちのい
    ずれか１つに記載のプライマーから選ばれることを特徴とする、請求項２２に記
    載の増幅方法。
24. 【請求項２４】 下記のもの： ａ）ハイブリダイゼーション位置がそれぞれ、増幅が求められている標的核酸
    の５’側及び３’側に局在化されているヌクレオチドプライマーカップル； ｂ）場合によっては、増幅反応に必要な反応体、 を含む、請求項１〜１３のうちのいずれか１つに記載の核酸の増幅に必要なもの
    。
25. 【請求項２５】 ヌクレオチドプライマーが、請求項１４〜１９のうちのい
    ずれか１つに記載のプライマーから成る群から選ばれることを特徴とする、請求
    項２２に記載の核酸の増幅に必要なもの。
26. 【請求項２６】 存在を検出しうるマーカー化合物を含むことを特徴とする
    、請求項１４〜１９のうちのいずれか１つに記載のヌクレオチドプローブ。
27. 【請求項２７】 試料中における、請求項１〜１３のうちのいずれか１つに
    記載の核酸の存在の検出方法であって、前記方法が、下記工程： ａ）請求項１４〜１９のうちの１つに記載の１つ又は複数の核プローブと、テ
    ストされる試料とを接触させる工程；及び ｂ）１つ又は複数のプローブと、試料中に存在する核酸との間に場合によって
    は形成される複合体の検出工程、 を含んでいる方法。
28. 【請求項２８】 １つ又は複数のプローブが、支持体上に固定化されている
    ことを特徴とする、請求項２７に記載の検出方法。
29. 【請求項２９】 試料中における、請求項１〜１３のうちのいずれか１つに
    記載の核酸の存在の検出に必要なものであって、前記の必要なものが、 ａ）請求項１４〜１９のうちのいずれか１つに記載の１つ又は複数のヌクレオ
    チドプローブ； ｂ）場合によっては、ハイブリダイゼーションに必要な反応体、 を含むもの。
30. 【請求項３０】 １つ又は複数のプローブが、支持体上に固定化されている
    ことを特徴とする、請求項２９に記載の検出に必要なもの。
31. 【請求項３１】 請求項１〜１３のうちのいずれか１つに記載の核酸を含ん
    でいる組換えベクター。
32. 【請求項３２】 アデノウイルスであることを特徴とする、請求項３１に記
    載のベクター。
33. 【請求項３３】ＡＢＣ１−ｒｌｄＶであることを特徴とする、請求項３２又
    は３３に記載のベクター。
34. 【請求項３４】 請求項１〜１３のうちのいずれか１つに記載の核酸又は請
    求項３１〜３３のうちのいずれか１つに記載の組換えベクターを含む組換えホス
    ト細胞。
35. 【請求項３５】 アミノ酸配列配列番号１４０のポリペプチドを含むことを
    特徴とする、突然変異されたポリペプチドＡＢＣ１。
36. 【請求項３６】 アミノ酸配列配列番号１４１のポリペプチドを含むことを
    特徴とする、突然変異されたポリペプチドＡＢＣ１。
37. 【請求項３７】 請求項３５又は３６に記載の突然変異されたポリペプチド
    ＡＢＣ１又はこの後者のペプチド断片に対して向けられた抗体。
38. 【請求項３８】 検出可能な化合物を含むことを特徴とする、請求項３７に
    記載の抗体。
39. 【請求項３９】 下記工程： ａ）この試料と、請求項３７又は３８に記載の抗体とを接触させる工程； ｂ）形成された抗原／抗体複合体の検出工程、 を含んでいる、試料中の請求項３５又は３６に記載のポリペプチドの存在を検出
    する方法。
40. 【請求項４０】 試料中の請求項３５又は３６に記載のポリペプチドの存在
    を検出するための診断に必要なものであって、前記の必要なものが、 ａ）請求項３７又は３８に記載の抗体； ｂ）形成された抗原／抗体複合体の検出を可能にする反応体、 を含んでいるもの。
41. 【請求項４１】 コレステロールの逆輸送の機能不全に冒されている被験者
    の予防又は治療のための製薬組成物であって、生理学的に適合する１つ又は複数
    の賦形剤と組合わせて、請求項１〜６のうちのいずれか１つに記載の核酸を含ん
    でいる組成物。
42. 【請求項４２】 コレステロールの逆輸送の機能不全に冒されている被験者
    の予防又は治療のための製薬組成物であって、生理学的に適合する１つ又は複数
    の賦形剤と組合わせて、請求項３１に記載の組換えベクターを含んでいる組成物
    。
43. 【請求項４３】 様々な形態のアテローム性動脈硬化症の予防、又はより詳
    しくはコレステロールの逆輸送の機能不全に冒されている被験者の治療のための
    薬剤の製造のための、請求項１〜６のうちのいずれか１つに記載の核酸の使用。
44. 【請求項４４】 様々な形態のアテローム性動脈硬化症の予防、又はより詳
    しくはコレステロールの逆輸送の機能不全に冒されている被験者の治療用薬剤の
    製造のための、請求項３１に記載の組換えベクターの使用。
45. 【請求項４５】 このベクターが、ＡＢＣ１−ｒｌｄＶであることを特徴と
    する、請求項４４に記載の使用。
46. 【請求項４６】 様々な形態のアテローム性動脈硬化症の予防、又はより詳
    しくはコレステロールの逆輸送の機能不全に冒されている被験者の治療のための
    薬剤の製造のための、配列配列番号１３９のポリペプチドＡＢＣ１の使用。
47. 【請求項４７】 コレステロールの逆輸送の機能不全に冒されている被験者
    の予防又は治療のための製薬組成物であって、配列配列番号１３９のポリペプチ
    ドの治療的有効量を含む組成物。
48. 【請求項４８】 コレステロールの逆輸送の機能不全の結果生じる病気の予
    防又は治療のための活性成分を標的するための、ポリペプチドＡＢＣ１、又はポ
    リペプチドＡＢＣ１を発現する細胞の使用。
49. 【請求項４９】 ポリペプチドＡＢＣ１のアゴニスト又はアンタゴニストの
    コレステロールの代謝に対して活性な化合物の標的方法であって、前記方法が下
    記工程： ａ）ポリペプチドＡＢＣ１と、検出可能なマーカーを含む脂質基質とを含む膜
    小胞を調製する工程； ｂ）アゴニスト又はアンタゴニスト候補化合物と共に、工程ａ）で得られた小
    胞をインキュベーションする工程； ｃ）検出可能なマーカーを含む脂質基質の放出を、定性的及び／又は定量的に
    測定する工程； ｄ）工程ｂ）で得られた測定値と、アゴニスト又はアンタゴニスト候補化合物
    と共に予めインキュベーションされなかった小胞によってマークされた脂質基質
    の放出の測定値とを比較する工程、 を含んでいる方法。
50. 【請求項５０】 ポリペプチドＡＢＣ１のアゴニスト又はアンタゴニストの
    コレステロールの代謝に対して活性な化合物の標的方法であって、前記方法が下
    記工程： ａ）自然に又はポリペプチドＡＢＣ１のトランスフェクション後に発現する細
    胞、例えば細胞系統を得る工程； ｂ）検出可能なマーカーによってマークされたアニオンの存在下に、工程ａ）
    の細胞をインキュベーションする工程； ｃ）これらの細胞の中に浸透しなかった過剰のマークアニオンを除去するため
    に、工程ｂ）の細胞を洗浄する工程； ｄ）ポリペプチドＡＢＣ１のアゴニスト又はアンタゴニスト候補化合物と共に
    、工程ｃ）で得られた細胞をインキュベーションする工程； ｅ）マークアニオンの流出を測定する工程； ｆ）工程ｅ）で決定されたマークアニオンの流出の値と、ポリペプチドＡＢＣ
    １のアゴニスト又はアンタゴニスト候補化合物の存在下に予めインキュベーショ
    ンされなかった細胞で測定されたマークアニオンの流出の値とを比較する工程、 を含んでいる方法。
51. 【請求項５１】 ポリペプチドＡＢＣ１のアゴニスト又はアンタゴニストの
    コレステロールの代謝に対して活性な化合物の標的方法であって、前記方法が下
    記工程： ａ）精製されたヒトアルブミンの存在下に、適切な培養培地中で、ヒト単核細胞
    系統の細胞を培養する工程； ｂ）ＩＬ−１ベータ生産を刺激する化合物とアゴニスト又はアンタゴニスト候補
    化合物との同時の存在下に、工程ａ）の細胞をインキュベーションする工程； ｃ）ＡＴＰの適切な濃度の存在下に、工程ｂ）で得られた細胞をインキュベー
    ションする工程； ｄ）細胞培養の上澄み液中に放出されたＩＬ−１ベータを測定する工程； ｅ）工程ｄ）で得られたＩＬ−１ベータの放出の値と、アゴニスト又はアンタ
    ゴニスト候補化合物の存在下に予めインキュベーションされなかった細胞の培養
    上澄み液中に放出されたＩＬ−１ベータの値とを比較する工程、 を含んでいる方法。