CA2427436A1 - Sequences polymorphes du gene humain abca1, leurs utilisations, les methodes et kits de detection. - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet des acides nucléiques isolés codant pour la protéine transporteur ABCA1 et comportant des variations polymorphes de séquence, ainsi que des polypeptides dérivés du transporteur humain ABCA1 et contenant des acides aminés polymorphes.L'invention a également pour objet d es amorces et des sondes spécifiques d'allèle qui s'hybrident à des régions flanquant ou contenant ces sites ou positions polymorphes, des procédés et d es kits ou nécessaires permettant d'analyser les écarts d'allélisme affectant l e gène ABCA1, et enfin l'utilisation des polymorphismes du gène humain ABCA1 pour le diagnostic, d'une maladie ou d'une prédisposition à une maladie, en particulier liée à la concentration de HDL (High Density Lipoprotein) cholestérol plasmatique, comme par exemple c'est le cas des déficiences familiales en HDL comme la maladie de Tangier, de l'infarctus du myocarde, d e l'athérosclérose, et d'autres affections cardiovasculaires.

Description

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SE~UENCES POLYMORPHES DU GENS HUMAIN ABCA1, LEURS
UTILISATIONS, LES METHODES ET KITS DE DETECTION
La présente invention a pour objet des polymorphismes du gène ABCA1 humain et les nouveaux allëles polypeptidiques codés par les différentes séquences présentant les variations alléliques. L'invention concerne également des procédés ainsi que des kits destinés à l'analyse des variations alléliques dans le gène ABCAI
humain, et l'utilisation du polymorphisme ABCAI pour Ie diagnostic et Ie traitement des affections cardiovasculaires telles que les risques d'infarctus du myocarde, l'athérosclérose, et la maladie deTangïer.
ABCAl est membre de la superfamille des protéines transporteurs ABC
(ATP Binding Cassette ) qui sont impliqués dans le transport des peptides, des sucres, des vitamines ou encore des hormones stéroïdes. (Dean et al. Cuf°f-.
Opin. Genet. 5 (1995) 779-785 ; Decocottignies et al. Nat. Genet. Deu, 15 (I997) 137-145 ;
A llikmets et al., Hum. Mol. Genet., 5 (1996) 1649-1655).
Les membres de cette famille de transporteur qui sont d'une part extrêmement conservés au cours de l'évolution, de la bactérie à l'homme, présentent d'autre part une structure générale commune caractérisée par deux repliements de liaison aux nucléotides (Nucléotide Binding Fold ou NBF) avec des motifs Walker A
et B ainsi que deux domaines transmembranaires, chacun des domaines transmembranaires étant constitué de plusieurs hélices. La spécificité des transporteurs ABC pour les différentes molécules transportées apparaît être déterminée par la structure des domaines transmembranaires, alors que l'énergie nécessaire à l'activité de transport est fournie par la dégradation de l'ATP
au niveau du repliement NBF.

2 Le transport du cholestérol du foie aux tissus et inversement est assuré par les deux complexes lipoprotéiques que sont les LDLs (Low Density Lipoprotein) et les HDLs (High Density Lipoprotein). Les LDLs alimentent les tissus en cholestérol alors qu'au contraire les HDL conduisent le cholestérol en excès formé dans les tissus jusqu'au foie. Au cours du transport, le cholestérol est acylé par transfert des acides gras des lécithines par l'action de l'enzyme phosphatidyl-stérol-acyltransférase (LCAT).
Il est maintenant clairement établi chez les patients présentant de faibles taux de HDLs plasmatiques, que les taux élevés de LDL conduisent à une accumulation de cholestérol au niveau des vaisseaux et une probabilité d'apparition d'insuffisances coronariennes (Castelli et al., Jama (1986) 256(20), 2835-8). En effet, une élimination ., plus lente du cholestérol en excès dans les tissus favorise la formation de plaques artérielles, et à terme le risque d'attaque cardiaque, d'une angine de poitrine, ou bien d'une affection du système artériel périphérique.
Ces complexes lipoprotéiques LDLs et HDLs, qui interviennent donc respectivement dans les mécanismes d'afflux et d'efflux du cholestérol, du foie aux tissus ou inversement, présentent une structure sphérique de densité
différente, qui se compose essentiellement d'un noyau de lipides apolaires constitués de triacylglycérols et d'esters de cholestérol, et d'une couronne constituée d'apolipoprotéines et de lipides amphiphiles.
II est généralement admis que l'efflux de cholestérol des tissus vers le foie, est réalisé par deux voies différentes. Une première voie dite passive favorise I'efflux de cholestërol de la membrane plasmique aux HDLs, alors que Ia deuxième voie est énergie-dépendante, et utilise notamment l'apolipoprotéine A-I (Apo-AI) des HDL
naissants, qui est vraisemblablement reconnue et se Iie à des récepteurs membranaires

3 cellulaires afin de permettre la translocation du cholestérol en excës aux particules HDLs (Rothblat et al. J. Lipid. Res. (1999) 40(5) 781-96). Il a été récemment démontré en particulier que les fibroblastes et les macrophages sont le siège d'une translocation active de cholestérol utilisant des apolipoprotéines pauvres en lipides telles que ApoA-I, ApoA-lI, et Apo-E (Yokoyama S., Biochim. Biophys. Acta (1998) 1392(1), 1-15 ; Takahashi et al., PNAS (1999) 96(20), 11358-63).
Diverses maladies liées à une déficience en HDL, et notamment de la voie active de translocation de cholestérol, ont été décrites. II s'agit notamment de la maladie de Tangier et de la déficience familiale en HDL (FHD) (Remaley et al., Arterioscl. Thromb. Irasc. Biol. (1997) 17(9) 1813-21 ; Marcil et al., Arterioscl.
Thromb. T~asc. Biol (1999) 19(1), 159-69 ; Francis et al. (1995) J. Clin.
Invest. 96(1), 78-87). , La maladie de Tangier semble en effet liée à un déficit cellulaire dans la voie active de translocation du cholestérol cellulaire, qui conduit à une dégradation des HDLs et à ùne perturbation du métabolisme lipoprotéique. En effet, les particules n'incorporant pas de cholestérol à partir des cellules périphériques et ne pouvant pas être métabolisées correctement, sont éliminées rapidement de l'organisme. La concentration plasmatique en HDL circulante de ces patients est donc extrêmement rëduite et les HDLs n'assurent donc plus le retour du cholestérol vers Ie foie. Le cholestérol en excès accumulé dans les cellules et tissus périphériques provoque des manifestations cliniques caractéristiques telles que la formation des amygdales orangées (Serfaty-Lacrosniere et al. (1994) Athérosclerosis 107(1) 85-98).
Les affections familiales liées au métabolisme du HDL se caractérisent également par une faible concentration des particules de HDL, et sont Ie plus souvent détectées chez les patients affectés de maladies coronariennes (Marcil et al., The

4 Lancet (1999) 354(9187), 1341-6). Cet effet cardioprotecteur du HDL s'explique probablement par son implication dans Ie transport du cholestérol des tissus périphériques vers le foie (Brute et al. Anr~u. Rev. Nutr. (1998) 18, 297-3130).
Le produit du gène ABCA1 est susceptible de jouer un rôle dans la régulation du métabolisme cellulaire du cholestérol et dans le transport inverse de cholestérol et de phospholipides. A cet égard, il a été récemment démontré que le gëne ABCAl est un gène clé dans la voie active de translocation du cholestérol des cellules aux HDL. En effet, il a été observé que le transporteur ABCAl était muté
chez les patients affectés dans le transport inverse du cholestérol, et notamment chez les patients atteints à la fois de la maladie de Tangier et de la déficience familiale en HDL (Lawn et al., J. Clin. Invest. (1999) 104(8) 125-31 ; Bodzioch et al., Nat. Genet.
w (1999) 22(4), 347-51 ; Orso et al., Nat. Ge~zet. (2000) 24(2), 192-6).
Par conséquent, la présence de mutations ou polymorphismes dans la séquencë nucléotidique de ABCA1 semble constituer au même titre que la concentration plasmatique de HDL, un bon facteur de risque permettant de dépister une affection coronarienne.
La forte incidence des maladies coronariennes qui est une principale cause de mortalité dans les pays développés montre clairement la nécessité de disposer d'outils de détection d'une part des polymorphismes alléliques du gène ABCAl, ainsi que de compositions, de procédés et des kits permettant de diagnostiquer les risques coronariens ou une prédisposition à une maladie, en particulier liée à un déficit en HDL circulant, qui serait susceptible de conduire à une angine de poitrine, un infarctus du myocarde, une athérosclérose, ou une déficience familiale en HDL
comme la maladie de Tangier, dont les symptômes sont décrits ci-avant.

S
Le gène ABCAl humain a été récemment cloné et caractérisé et est décrit notamment dans les demandes PCT/FR00/O1S9S, EP99402668, et par Santamarina-Fojo et al., PNAS (2000) 97(14), 7987-7992). ll a une taille totale de 149kb, et comprend une séquence promotrice de 1,4S3kb, des séquences codante et intronique S de 146,581 kb, et une région 3' de lkb. Il est constitué de SO exons et donc de 49 introns. L'exon 1 code pour l'extrémité S' non traduite (S' UTR) est suivi d'un grand iniron de 24,156 kb de Long, et l'exon 2 contient Ia partie restante de l'extrémité
S'UTR, et code pour les 2I premiers acides aminés de l'extrémité N terminale de la protéine ABCA1. Le gène ABCAl code pour la protéine transporteur ABCA1 de 2261 acides aminés. L'analyse de la séquence régulatrice en amont du gène humain ABCAl a permis d'identifier une boite TATA (TCTATAAA.AG) 33 pb en amont du site d'initiation de la transcription, de nombreux sites de liaison de facteurs de transcription ubiquitaires tels que SPI, NF-kB, des protéines activatrices (AP-l, -2, et -4), et trois motifs E-box (S'-CANNTG- 3'), ainsi que plusieurs sites de fixation de I S facteur nucléaire hépatocytaire (HNF)-3 (3.
Les demandeurs ont découvert de manière surprenante et inattendue un certain nombre de polymorphismes dans le gène humain codant pour le transporteur ABCA1. Les demandeurs ont pax ailleurs découvert une corrélation statistiquement significative entre la présence de certains polymorphismes alléliques du gène ABCAl et la prédisposition d'un sujet à développer une pathologie coronarienne, telle que notamment un risque d'infarctus du myocarde.
La présente invention a donc pour objet des acides nucléiques isolés codant pour des variants polymorphes du transporteur ABCAl humain, susceptibles d'être liés avec un risque coronarien, tel qu'un risque d'infarctus du rnyocaxde, d'affection 2S cardiovasculaire ou plus généralement toute affection due à une déficience en HDL.

La présente invention a également pour objet les séquences polypeptidiques polymorphes du transporteur ABCAl humain produites par les formes alléliques de ABCAl. En outre, la présente invention a pour objet des vecteurs recombinants comprenant ces acides nucléiques, des cellules comprenant les vecteurs, et les méthodes de production de polypeptides variants obtenus par culture des cellules dans des conditions permettant l'expression de ces polypeptides.
Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet des moyens de détection appropriés, sondes ou amorces, spécifiques de certains de ces polyrnorphismes dans le gène humain ABCAl, susceptibles d'être associés à des risques coronariens, tels que par exemple un risque d'infarctus du myocarde, ou à une réponse pharmacologique particulière vis-à-vis d'une molécule thérapeutique.
La présente invention concerne également un procédé et des kits permettant de détecter une séquence des polymorphismes au niveau de la séquence du transporteur ABCAl d'un sujet humain, et consiste à (i) isoler un échantillon d'ADN dudit sujet, (ü) amplifier les régions contenant le gène ABCA1, (iii) déterminer la présence ou l'absence d'un ou plusieurs polymorphismes au niveau de la région d'ADN
amplifiée.
De tels polyrnorphismes peuvent être liés à d'autres polymorphismes dans un profil polymorphe, qui est associé avec une prédisposition à une maladie ou à un désordre métabolique.
Encore selon un autre aspect, la présente invention concerne une méthode permettant de diagnostiquer le risque d'une affection cardiovasculaire chez un patient.
La mëthode consiste à comparer deux profils polymorphes. Le premier profil est celui du patient que l'on souhaite tèster, et le deuxième est un profil polymorphe de rëférence qui est dérivé d'une population d'individus témoins ayant un risque cardiovasculaire ou coronarien prédéterminé tel que par exemple un risque d'infarctus du myocarde. La comparaison entre les séquences polymorphes test et témoin donne une bonne indication du facteur de risque du sujet présentant une séquence polymorphe ABCAl.
DEFINITIONS GENERALES
Les termes « acide nucléique » ou « polynucléotide » font référence à des polymères contenant des bases puriques et pyrimidiques. Il s'agit de polyribonucléotides, de polydësoxyribonucléotides, ou de polynucléotides mixtes polyribo-polydésoxyribonucléotides. Les acides nucléiques comprennent Ies molécules simple et double brins, dé type ADN-ADN, ADN-ARN, et ARN, ou les « protein nucleic acid » (PNA) formés par conjugaison de bases à un squelette amino acide. Les acides nuclëiques incluent également les molécules comprenant des bases modifiées et des liaisons phosphodiester analogues synthétiques, telles que les phosphorothioates et Ies thioesters. Le terme acide nucléique, en particulier les molécules d'ADN, d'ARN, font référence seulement à une structure primaire ou secondaire de la molécule, et n'est pas limitée par une configuration tertiaire particuliére. Par conséquent, le terme inclue l'ADN double brin, qui se trouve entre autres dans les molécules d'ADN linéaire ou circulaire (dans les fragments de restriction), les plasmides, et les chromosomes. La structure des molécules d'ADN
double brin sont décrites en utilisant la direction conventionnelle, c'est à
dire 5'-> 3' du brin non transcrit de l'ADN ou brin sens (ayant une séquence homologue de l'ARNm). Une molécule d'ADN recombinant est une molécule d'ADN qui a été
soumise à des manipulations de biologie moléculaire.

ô
On entend par acide nucléique ou un polypeptide « isolé » au sens de la présente invention, un acide nucléique ou un polypeptide qui a été soustrait à
son environnement d'origine naturel. Un açide nucléique ou polypeptide isolé
contient moins d'environ 50%, de préférence moins de 75%, et encore plus préférentiellement moins de 90% de composants cellulaires.
Un acide nucléique ou une séquence polypeptidique dérivée correspond à
une région d'une séquence désignée particulière, et inclut pour les acides nucléiques, les séquences qui sont identiques ou complémentaires.
Aux fins de la présente invention, l'expression « séquence nucléotidique »
peut être employée pour désigner , indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique, englobe le matériel génétique lui-même, et n'est donc pas restreinte à
l'information contenant sa séquence.
Au sens de la présente invention, le terme « oligonucléotide » fait référence à
un acide nucléique, comprenant généralement au moins 10, de préférence 15, et plus préférentiellement au moins 20 nucléotides, qui est capable de s'hybrider à
une molécule d'ADN génomique, à une molécule d'ARNm codant pour un gène, à un cDNA, ou toute autre molécule d'intérêt. Les oligonucléotides peuvent être marqués , par exemple avec des nucléotides 32P, ou des nucléotides sur lesquels sont fixés par liaison covalente, un marqueur fluorescent, ou un marqueur teI que la biotine.
L'oligonucléotide peut être une sonde capable de détecter la présence d'un acide nucléique. Alternativement, l'oligonucléotide peut étre une amôrce PCR, et peut être utilisée pour cloner la séquence complète ou un fragment d'un gène d'intérêt.
L'oligonucléotide peut former en outre une triple hélice avec une séquence double brin d'intérêt sur une molécule d'ADN. Enfin, une banque d'oligonucléotides peut être fixée sur un support solide afm de détecter différents polymorphismes d'intérêt.

Généralement, les oligonucléotides sont synthétiques, et peuvent comprendre des liaisons phosphodiester ou des liaisons thioester.
Une sonde fait référence à un acide nucléique ou à un oligonucléotide capable de s'hybrider à une séquence sur un acide nucléique cible du fait de la complémentarité d'au moins une partie de la sonde avec une séquence de l'acide nucléique cible. Cette sonde est gënéralement marquée afm d'être détectable après hybridation.
Une molécule d'acide nucléique s'hybride à une molécule d'acide nucléique, tel qu'un cDNA, un ADN gënomique, ou un ARN, lorsque la forme simple brin de la molécule d'acide nucléique peut se stabiliser avec une autre molécule d'acide nucléique simple brin selon les conditions appropriées de température et de force ionique de la solution d'hybridation (Sambrook et al. 1989, Molecular Gloning : ~i Laboratory Manual, Second Édition, Cold Spring Harbor Laboratory Press : Cold Spring Harbor, New-York). Les conditions de température et de force ionique déterminent Ia stringence de l'hybridation.
On utilise pour un criblage préliminaire des acides nucléiques homologùes, des conditions de basse stringence (température égale à 55°C, SXSSC à
0,1% SDS, 0,25 % Lait, sans formamide ; ou 30% formamide, SXSSC à 0,5%SDS).
Pour des conditions modérées d'hybridation, on utilise une température plus élevée, avec 50% de formamide, et SX ou 6XSSC. Bien que la réaction d'hybridation nécessite la complémentarité des acides nucléiques, des mésappariements entre les bases sont acceptables. La stringence adaptée à l'hybridation d'un acide nucléique dépend de Ia longueur de l'acide nucléique et du degré de complémentarité, qui sont des variables bien connues en biologie moléculaire. Plus le degré de similarité et d'homologie entre deux séquences nucléotidique est élevé, plus une température d'hybridation élevée peut être utilisée. Pour les hybrides ayant une taille supérieure à
100 nucléotides, le calcul de la température d'hybridation se fait par les équations décrites dans Sambrook et al. Pour l'hybridation d'acides nucléiques de taille

5 inférieure, tels que les oligonucléotides, la position des mésappariements est importante, et Ia longueur de I'oligonucléotide détermine sa spécificité.
Celui-ci a en général une longueur minimale de 10 nucléotides, de préférence au moins 15 nucléotides, et encore plus préférentiellement 20 nucléotides.
Pour des conditions d'hybridation de forte stringence , on utilise les conditions 10 suivantes 1- Compétition des membranes et PRE HYBRIDATION
- Mélanger : 401 ADN sperme de saumon (1 Omg/ml) + 40 ~,I ADN placentaire humain (1 Omg/ml) - Dénaturer 5 mn à 96°C, puis plonger Ie mélange dans Ia glace.
- Oter le tampon ZX SSC et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes.
- Ajouter le mélange des deux ADNs dénaturés.
- Incubation à 42°C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.
2- Compétition de la sonde maranée - Ajouter à Ia sonde marquée et purifiée 10 à 50 gI ADN Cot I, selon la quantité
d'hybridations non spécifiques.
- Dénaturer 7 à IO mn à 95°C.
- Incuber à 65°C pendant 2 à 5 heures.

3- Hybridation:
- Oter le mix de pré hybridation.
- Mélanger 40 ~.1 ADN sperme de saumon + 40 ~,l ADN placentaire humain ;
_ dénaturer 5 mn à 96°C, puis plonger dans la glace.
- Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mix formamide, le mélange des deux ADN et la sonde marquée/ADN Cot I dénaturée.
- Incuber 15 à 20 heures à 42°C, avec rotation.
4- Lava es - Un lavage à température ambiante dans du 2xSSC, pour rincer.
- 2 fois 5 minutes à température ambiante 2xSSC et 0,1% SDS
- 2 fois 15 minutes O,IxSSC et 0,1%SDS à 65°C.
Envelopper les membranes dans du Saran et exposer.
Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptëes à l'hybridation dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur variable de 20 nucléotides à plusieurs centaines de nucléotides.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de RAMES et HIGGINS (Eds., (195) Nucleic Acid hybridizatioh, a practical approach, IRL Press, Oxfoy~d) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al (Cur~refzt Pr°otocols irc Molecular Biology, Greer~
PublishihgAssociates a~cd Wileylhterscience, N. Y).
Un gène fait référence à une séquence d'acide nucléique correspondant à une séquence présente dans le génome qui comprend (i) la région codante, qui comprend des exons, des introns, et des séquences à la jonction entre les exons et les introns, et (ü) des séquences de régulation en 5' et 3' de la région codante.

On entend par « transporteur ABCAl » la protéine transporteur ABCAl ayant l'ADNc de séquence nucléotidique SEQ JD NO: 1 (Figure 1), et la séquence peptidique SEQ m NO : 2 (Figure 2). En outre, plusieurs séquences nucléotidiques génomiques parüelles du gène ABCA1 ont été isolées et caractérisées, ces séquences génomiques comprenant à la fois des séquences exoniques et des séquences introniques. Certaines de ces séquences génomiques partielles sont représentées dans le tableau 1 ci-après.
Tableau 1 Séquences génomiques partielles du géne ABC1 humain SEQ TD NO ~ Dsignation 3 Promoteur (p), exon 1 a, intron 1 a(p) 4 Tntron la(p), exon lb, intron lb(p) 5 Intron lb(p), exon 2, intron3, 2, exon intron 3, exon 4, intron 4(p)

6 Intron 4(p), exon 5, intron 5(p)

7 Intron 5(p), exon 6, intron 6(p)

8 Intron 7(p), exon 8, intron 8(p)

9 Intron 8(p), exon 9, intron10, 9, exon intron 10(p)

10 Intron 11 (p), exon 12, intron 12, exon 13, intron 13, exon 14, intron 14, exon 15, intron 15, exon 16, intron 16, exon 17, intron 17(p)

11 Intron 17(p), exon 18, intron 18(p)

12 Intron 18(p), exon 19, intron 19(p)

13 13 Intron 19(p), exon 20, intron 20, exon 21, intron 21, exon 22, iniron 22, exon 23, intron 23, exon 24, intron 24, exon 25, intron 25, exon 26, intron 26(p)

14 Intron 26(p), exon 27, intron 27, exon 28, intron 28, exon 29, intron 29, exon 30, intron 30(p)

15 Intron 30(p), exon 31, intron 3I, exon 32, intron 32, exon 33, intron 33, exon 34, intron 34(p)

16 Intron 35(p), exon 36, intron 36(p)

17 Tntron 36(p), exon 37, intron 37, exon 38, intron 3 8 (p)

18 Intron 38(p), exon 39, Tniron 39(p)

19 . Intron 39(p), exon 40, intron 40, exon 41, intron 41 (p)

20 Intron 44(p), exon 45, intron 45(p) 2I Intron 45(p), exon 46, intron 46, exon 47, intron 47(p) 22 . Intron 48(p), exon 49, squence en 3' du dernier exon Par « polymorphisme mononucléotide ou SNP », on entend la substitution, l'insertion ou la délétion d'un simple nucléotide dans la séquence nucléotidique d'un géne entre plusieurs individus. Lorsque le polymorphisme se présente sous la forme d'une inserüon ou d'une délétion, il peut s'agir d'une insertion ou d'une délétion d'un ou plusieurs nucléotides à une position d'un gène. Les différentes séquences nucléotidiques d'un même gène du fait d'un polymorphisme, sont des alléles.

Une « position polymorphe » est une position prédéterminée dans la séquence d'un gène qui comprend un SNP. Dans certains cas, Ies polymorphismes génétiques provoquent une variation dans la séquence d'acides aminés, et donc d'une position polymorphe peut résulter en un polymorphisme dans la séquence amino acide à une position prédéterminée de la séquence du polypeptide. Un individu homozygote pour un polymorphisme particulier, porte sur Ies deux copies du même gène, la méme séquence polymorphe à la même position. Un individu hétérozygote pour un polymorphisme particulier porte sur Ies deux copies du gëne, des séquences différentes au niveau de la position polymorphe.
On entend par « profil polymorphe », un ou plusieurs polymorphismes simple nucléotide, qui peut être présent sur la séquence d'un seul gène ou d'une pluralité de gènes. Un profil polymorphe simple comprend un SNP dans une seule position d'un ou de deux allèles d'un individu (polymorphisme allélique). Un profil polymorphe test correspond au polymorphisme caractéristique d'un individu qui fait l'objet d'un diagnostic par exemple d'une prédisposition à une maladie associée à une dëficience du gène ABCAl, telle qu'une déficience métabolique du type FHD ou une affection cardiovasculaire, ou un risque d'infarctus du myocarde. Le profil polymorphe de référence ou témoin a été déterminé par corrélation statistiquement significative des profils dans une population d'individus qui présentent uri risque coronarien.
POLYMORPHISMES DU GENS ABCAl La présente invention est basée sur la découverte de 90 polymorphismes dans la séquence du gène humain ABGAl telle qua représentée aux séquences SEQ m NO: 3-22, dont 22 SNPs sont trouvés dans Ia sëquence promotrice en amont du gène ABCAl humain de SEQ ID NO: 1 23. Certains SNPs selon la présente invention conduisent à des altérations structurales dans la séquence polypeptidique de Ia protéine iransporteur ABCAI humaine représentée à la SEQ ID NO : 2.
5 Pour l'identification et la caractérisation d'ADN polymorphe de ABCA1, des réactions de polymérisation en chaîne (PCR) ont été rëalisées pour amplifier les séquences de ABCAl à partir d'ADN génomique humain provenant de trois groupes ethniques différents, à savoir une population caucasienne, une population japonaise, et/ou une population africaine. Les produits de PCR sont séquencés, et les séquences 10 sont comparées entre elles et avec les séquences de référence SEQ ID NO : 3-23.
Le tableau 2 présente Ies polymorphismes alléliques dans les exons et les introns du gène ABCAl humain. selon la présente invention. Il indique notamment la position polymorphe dans chacun des exons par rapport au premier nucléotide de l' exon de référence, et dans chacun des introns par rapport à l' extrémité 3' ou en IS amont de l'extrémité 5' de I'exon le plus proche, les séquences 5' et 3' de part et d'autre de la position polymorphe, la fréquence d'apparition du polymorphisme dans les trois populations testées, africaine, caucasienne et japonaise. Dans les cas où ces fréquences n'ont pu être déterminées, il est indiqué « n.d. ». Certains polymorphismes se traduisent par des altérations structurales dans la séquence peptidique de la protéine transporteur ABCA1 humaine, et plus précisément par la substitution d'un acide aminé par un autre (MIS). D'autres polymorphismes dans les séquences exoniques sont dits silencieux (SIL), la séquence protéique ABCAI restant inchangée.
Enfin, lorsque Ie polymorphisme est localisé dans un iniron ou dans un exon non codant, la séquence polymorphe est dite non codante (NCD). Les polymorphismes identifiés dans les différents exons et introns du gène ABCAl sont décrits en détails ci-après.

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21 Mutation dans l'exoh Ia La mutation s-3Sela consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une guanine (G) en position 3S de l'exon 1a, soit à la position 2928 par rapport à
la séquence SEQ m NO: 3. L'exon la portant ce polymorphisme a la séquence S nucléotidique SEQ m NO : 24. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon la du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ m NO : 92.
Mutatio~zs dans l'exon 1 b Une première mutation est désignée s-l6elb et consiste en l'insertion d'une guanine (G) en position 16 de l'exon lb, soit à la position 11S par rapport à
la séquence SEQ m NO: 4. L'exon lb portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ m NO : 2S. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon lb du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ B7 NO : 93.
Une deuxième mutation désignée s-76e1b consiste en la substitution d'une guanine (G) par une cytosine (C) en position 76 de l'exon lb, soit à la position 17S
1S par rapport à la séquence SEQ m NO: 4. L'exon lb portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ m NO : 26. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon lb du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ m NO
94.
Mutation dans l'ihtYOn 3 La mutation s-m39i3 consiste en la substitution d'une cytosine (C) en en une adénine (A) position 39 de l'extrémité 3' de l'intron 3, soit à la position 10646 par rapport à la séquence SEQ 1D NO: S. La séquence nucléotidique de l'intron 3 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 27.

22 Mutation dans l'ihtron 4 La mutation s-25i4 consiste en la substitution d'une cytosine (C) en une thymidine (T) position 25 de l'extrémité 5' de l'intron 4, soit à la position 10828 par rapport à la séquence SEQ >D NO: 5. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 4 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO :28.
Mutation datZS l'exon 5 La mutation s-S3e5 consiste en la substitution d'une guanine (G) en une adénine (A) position 53 de l'exon 5, soit à la position 306 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 6. L'exôn 5 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ
ID NO : 29. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 5 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ Q7 NO : 95.
Mutations dans l'exo~Z 6 La mutation désignée s-108e6 consiste en la substitution d'une adénine (A) en une guanine (G) en position 108 de l'exon 6, soit à la position 268 par rapport à la I S séquence SEQ ID NO: 7. L'exon 6 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 30. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 6 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 96.
La mutation s-113e6 consiste en la substitution d'une guanine (G) en une adénine (A) en position 113 de l'exon 6, soit à la position 273 par rapport à
la séquence SEQ ID NO: 7. La séquence de l'exon 6 du gène ABCAl portant ce polymorphisme est le polynucléotide de séquence SEQ ID NO : 3I. L'ADNc muté
portant le polymorphisme dans l'exon 6 est représenté dans la séquence nucléotidique

23 SEQ ID NO : 97, code pour un polypeptide ABCAl variant d'une longueur de 2261 acides aminés, de séquence SEQ ID NO : 127.
Mutation dans l'intron 7 La mutation s-m14i7 consiste en l'insertion d'une adénine (A) en position -14 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 7, soit à la position 589 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 8. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 7 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 32.
Mutations dans l'exon 8 La mutation s-123e8 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 123 de l'exon 8, soit à la position 726 par rapport à
la séquence SEQ m NO: 8. L'exon 8 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 33. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 8 du géne ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ m NO : 98.
La mutation s-135e8 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 135 de l'exon 8, soit à la position 738 par rapport à
la séquence SEQ ID NO: 8. L'exon 8 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ll7 NO : 34. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 8 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 99.
Mutation dans l'intron 8 La mutation s-m89i8 consiste en Ia substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position -89 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 8, soit à
la position 525 par rapport à Ia séquence SEQ m NO: 9. La séquence nucléotidique partielle de

24 l'intron 8 portant ce polymozphisme est représentée ~à la séquence nucléotidique SEQ
m NO : 35.
Mutations dans l'intron 9 La mutation s-m104i9 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position -104 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 9, soit à
la position 981 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 9. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 9 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ m NO : 36.
La mutation s-m61i9 consiste en une insertion d'une guanine (G) en position -61 en amont de l'extrémité 3' de intron 9, soit à la position 1023 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 9. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 9 portant ce polymorphisme est représentée à.la séquence SEQ ID NO : 37.
La mutation s-m41i9 consiste en une délétion d'un fragment de trois nucléotides « CTC » du nucléotide en position -41 au nucléotide --43 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 9, soit à la position 1042-4044 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 9. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 9 portant ce polymorphisme est représentée à Ia séquence nucléotidique SEQ ID NO : 38.
La mutation s-m13i9 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine(T) en position -13 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 9, soit à la position 1072 par rapport à la séquence SEQ B7 NO: 9. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 9 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ
ID NO : 39.

Mutation dans l'exon 12 La mutation s-I26e12 consiste en Ia substitution d'une cytosine (C) en une thymine (T) en position 126 de l'exon 12, soit à la position 765 par rapport à
la séquence SEQ ID NO: 10. L'exon 12 portant ce polymorphisme a la séquence 5 nucléotidique SEQ ID NO : 40. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 12 du gène ABCAI est représenté par la séquence nucléotidique SEQ m NO : 100.
Mutation dans l'intron 12 La mutation s-m29i12 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position -29 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 12, soit à
la 10 position 1337 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 10. La séquence nucléotidique de l'intron 12 portant cé polymorphisme est représentée à la séquence SEQ JI7 NO
41.
Mutations dans l'intron 13 La mutation s-24113 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une 15 adénine (A) en position 24 de l'extrémité 5' de l'intron 13, soit à la position 1566 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 10. La séquence nucléotidique de l'intron 13 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ m NO
42.
La mutation s-m59i13 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une 20 thymine (T) en position -59 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 13, soit à la position 3270 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 10. La séquence nucléotidique de I'intron 13 portant ce polymorphisme a la séquence SEQ m NO : 43.
Mutation dans l'exon 14 La mutation s-148e14 consiste en Ia substitution d'une cytosine (C) par une adénine (A) en position 148 de l'exon 14, soit à la position 3476 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 10. L'exon 14 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ )D NO : 44. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 14 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ m NO : 101.
Mutations dates l'ïht~oh 14 La mutation s-81 i 14 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 81 de l'extrémité 5' de l'intron 14, soit à la position 3632 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 10. La séquence nucléotidique de l'intron 14 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ m NO : 45.
La mutation s-115114 consiste en la substitution d'une cytôsine (C) par une adénine (A) en position 115 de l'extrémité 5' de l'intron 14, soit à la position 3666 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 10. L'intron 14 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ J17 NO : 46.
Mutation dans l'exon 1 S
La mutation s-196e15 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 196 de l'exon 15, soit à la position 5492 par rapport à la séquence SEQ 117 NO: 10. L'exon 15 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ D~ NO : 47. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 15 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 102, et code pour une protéine ABCA1 mutée SEQ ID NO : 128 dans laquelle une valine (~ est substituée par une méthionine (M) en position 771.
Mutation dans l'exon 16 La mutation s-136e16 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 136 de l'exon 16, soit à la position 6714 par rapport à la séquence SEQ )D NO: 10. L'exon 16 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ )D NO : 48. L'ADNc portant le polymorphisme dans I'exon 16 du gëne ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ >D NO : 103, et code pour une protéine ABCA1 mutée de séquence SEQ JD NO : 129, qui comprend la substitution d'une valine (V) en isoleucine ()] en position 825.
Mutations dans l'exon 17 La mutation s-27e17 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une IO cytosine (C) en position 27 de I'exon 17, soit à la position 7914 par rapport à la séquence SEQ >I7 NO: 10. L'exon 17 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 49. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 17 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ )D NO : 104, et codé
pour une protéine ABCA1 mutée SEQ ll~ NO : 130 dans laquelle une tyrosine ('S~
est substituée par une proline (P) en position 857.
La mutation s-107e17 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 107 de l'exon 17, soit à la position 7994 par rapport à la sëquence SEQ m NO: 10. L'exon 17 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 50. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 17 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 105, et code pour une protéine ABCAl mutée SEQ )D NO : 131 dans laquelle une isoleucine (n est substituée par une méthionine (M) en position 883.

Mutations datas l'itatrou 17 La mutation s-60i 17 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une cytosine (C) en position 60 de l'extrémité 5' de l'intron 17, soit à la position 8061 par rapport à la séquence SEQ m NO: 10. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 17 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ m NO : 51.
La mutation s-m68i17 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une guanine (G) en position -68 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 17, soit à
la position 319 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 11. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 17 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ
I O m NO : 52.
Mutatio~z dans l'exon 18 La mutation s-4e18 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une thymine (T) en position 4 de l'exon 18, soit à la position 390 par rapport à
la séquence SEQ ll~ NO: 11. L'exon 18 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ m NO : 53. L'ADNc portant le polymorphisme dans I'exon I8 du géne ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ m NO : 106, et code pour une protéine ABCA1 mutée SEQ m NO: 132 dans laquelle une cystéine (C) est substituée par une phénylalanine _(F) en position 887.
La mutation s-40e19 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 40 de l'exon 19, soit à la position 943 par rapport à
la séquence SEQ ID NO: 12. L'exon 19 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ m NO : 54. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 19 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 107.

Mutations dans l'intron 19 La mutation s-18119 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 18 de l'extrémité 5' de l'intron 19, soit à la position 1053 par rapport à la séquence SEQ )D NO: 12. La séquence nucléotidique partielle de l'intron S 19 portant ce polymorphisme est représentëe à la séquence SEQ m NO :55.
La mutation s-m10i19 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position -10 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 19, soit à
la position 274 par rapport à Ia séquence SEQ .a7 NO: 13. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 19 portant ce polymorphisme est représentée à Ia séquence SEQ
m NO : 56.
Mutation dans l'exon 22 La mutation s-123e22 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 123 de l'exon 22, soit à la position 1592 par rapport à la séquence SEQ TI7 NO: 13. L'exon 22 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ )D NO : 57. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 22 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ m NO : 108, et code pour une protéine ABCA1 mutée SEQ >D NO : 133 dans laquelle une leucine (L) est substituée par une cystéine (C) en position 1122.
Mutation dans l'intron 22 La mutation s-m65i22 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position -65 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 22, soit à
la position 2884 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 13. La séquence nucléotidique de l'intron 22 portant ce polymorphisme est repxésentëe à la séquence SEQ ID
NO
58.
Mutation dans l'~xon 23 La mutation s-54e23 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une 5 cytosine (C) en position 54 de l'exon 23, soit à la position 3002 par rapport à la séquence SEQ 117 NO: 13. L'exon 23 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ 117 NO : 59. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 23 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ 117 NO : 109, et code pour une protéine ABCAl mutée SEQ ID NO : 134 dans laquelle un acide glutamique 10 (E) est substitué par un acide aspartique (D) en position 1172.
Mutations dans l'introh 23 La mutation s-149123 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 149 de l'extrémité 5' de l'intron 23, soit à la position 3170 par rapport à la séquence SEQ 1T7 NO: 13. La séquence nucléotidique de l'intron 23 15 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ m NO : 60.
La mutation s-m50i23 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position -50 en amont de l'extrëmité 3' de l'intron 23, soit à
la position 3958 par rapport à la séquence SEQ m NO: 13. La séquence de l'intron portant ce polymorphisme est représentée à Ia séquence nucléotidique SEQ ID NO
20 61.
Mutations dans l'exon 24 La mutation s-98e24 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 98 de l'exon 24, soit à la position 4105 par rapport à
la séquence SEQ 117 NO: 13. L'exon 24 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 62. L'ADNc correspondant à la mutation dans l'exon du gène ABCA1 est représenté par Ia sëquence nucléotidique SEQ >D NO : I I0.
La mutation s-149e24 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 149 de l'exon 24, soit à la position 4156 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 13. L'exon 24 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ 117 NO : 63. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 24 du gène ABCAI est représenté par la séquence nucléotidique SEQ m NO : 111.
Mutation dans l'exon 27 La mutation s-44e27 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 44 de ~1'exon 27, soit à la position 604 par rapport à
la séquence SEQ a7 NO: 14. L'exon 27 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ II7 NO : 64. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 27 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 112.
Mutations dates l'exoh 30 La mutation s-7e30 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 7 de l'exon 30, soit à la position 6854 par rapport à
la séquence SEQ ID NO: 14. L'exon 30 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ 1I7 NO : 65. L'ADNc portant le polymorphisme dans I'exon 30 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ >D NO : 113.
La mutation s-166e30 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une thymine (T) en position I66 de l'exon 30, soit à la position 7013 par rapport à la séquence SEQ >D NO: 14. L'èxon 30 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ a7 NO : 66. L'ADNc correspondant à la mutation dans l'exon du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ m NO : 114.
Mutation dates l'intron 31 La mutation s-30131 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une guanine (G) en position 30 de l'extrémité 5' de l'intron 31, soit à la position 1307 par rapport à la séquence SEQ m NO: 15. La séquence nucléotidique de l'intron 31 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ m NO : 67.
Mutations dans l'intron 32 La mutation s-mI42i32 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position -142 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 32, soit à
la position 3600 par rapport à la séquence SEQ m NO: I5. La séquence nucléotidique de l'intron 32 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID
NO
68.
La mutation s-m130i32 consiste en une insertion de deux nucléotides en IS position -130 en amont de l'extrëmité 3' de I'intron 32, soit à la position 3611 par rapport à la séquence SEQ m NO: 15. La séquence nucléotidique de I'intron 32 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ m NO
69.
La mutation s-m26i32 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une cytosine (C) en position 26 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 32, soit à
la position 3716 par rapport à la séquence SEQ m NO: 15. La séquence nucléotidique de l'intron 32 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ 117 NO : 70.

Mutation dafZS l'ihtron 33 La mutation s-m74i33 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une adénine (A) en position 74 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 33, soit à
la position 5247 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 15. La séquence nucléotidique de I'intrôn 33 portant ce polymorphisme est représentée à Ia séquence SEQ ID
NO
71.
Mutation dates l'exon 34 La mutation s-62e34 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 62 de I'exon 34, soit à la position 5382 par rapport à
la séquence SEQ ID NO: 15. L'exon 34 portant ce polymorphisme a Ia séquence nucléotidique SEQ ID NO : 72. L'ADN~ portant le polymorphisme dans l'exon 34 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ 1D NO : 115, et code pour une protéine ABCAl mutée de SEQ ID NO : 135, dans laquelle une arginine (R) a été remplacée par une lysine (K) en position 1587.
L'analyse de ce polymorphisme dans une population ECTIM (étude cas-témoin de l'infarctus du myocarde), qui comprend une élude de patients ayant survécu à un infarctus du myocarde et de sujets contrôles de type caucasien (Pana et al., ~Irterioscle:°osis arad Thrornbosis, (1992) 12(6), 701-707), montre que ce polymorphisme est associé à des-taux moyens plus bas de HDL, d'apolipoprotéine A-I et A-II, et de cholestérol. Plus précisément, ce polymorphisme se trouve associé de façon significative à une diminution d'environ 5mg/dl du taux d'apolipoprotéine A-I
(F=18,6 p<0,0001).

Le polymorphisme s-62e34 selon l'invention, qui entraîne le remplacement d'une arginine (R) par une lysine (K) en position 1587 de la protéine ABCAl, constitue une mutation fonctionnelle qui affecte les taux de cholestérol HDL, d' d'apolipoprotéine A-I et d'apolipoprotéine A-II et prédispose à un risque cardiovasculaire.
Mutations dates l'exoh 3b La mutation s-77e36 consiste en Ia substitution d'une guanine (G) en une adénine (A) en position 77 de l'exon 36, soit à la position 1064 par rapport à
la sëquence SEQ ID NO: I6. L'exon 36 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 73. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 36 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 116, et code pour une protéine ABCA1 mutée de SEQ lD NO 136, dans laquelle une valine (~
est substituée par une isoleucine (I) en position 1674.
Mutation dans l'intron 36 La mutation s-SSi36 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une cytosine (C) en position 55 de l'extrémité 5' de l'intron 36, soit à la position 1220 par rapport à la séquence SEQ 117 NO: 16. L'intron 36 portant ce polymorphisme a Ia séquence nucléotidique partielle SEQ ID NO : 74.
Mutation dans l'exon 38 La mutation s-64e38 consiste en la substitution d'une thymine (T) en une cytosine (C) en position 64 de l'exon 38, soit à la position 835 par rapport à
la séquence SEQ II7 NO: 17. L'exon 38 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ 1D NO : 75. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 38 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ m NO :117.
Mutations dans l'intron 39 La mutation s-251139 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une 5 guanine (G) en position 25I de l'extrémité 5' de l'intron 39, soit à la position 375 par rapport à Ia séquence SEQ B7 NO: I8. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 39 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ a7 NO : 76.
La mutation s-252139 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une cytosine (C) en position 252 de l'extrémité 5' de l'intron 39, soit à la position 376 par 10 rapport à Ia séquence SEQ m NO : 18. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 39 portant ce pôlymorphisme est représentée à la séquence SEQ a7 NO : 77.
Mutation dans l'int~on 40 La mutation s-m119i40 consiste en la substitution d'une cytosine (C) en une thymine (T) en position -119 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 40, soit à
la 15 position 710 par rapport à la séquence SEQ m NO: 19. La séquence nucléotidique de I'intron 40 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ ID NO
:78.
Mutation dans l'intron 44 La mutation s-m69i44 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une cytosine (C) en position -69 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 44, soit à
la 20 position 108 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 20. La séquence nucléotidique partielle de I'intron 44 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ m NO : 79.

Mutation dans l'exon 45 La mutation s-114e45 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une Thymine (T) en position 114 de l'exon 45, soit à la position 290 par rapport à
la séquence SEQ ID NO: 20. L'exon 45 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ m NO : 80. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 45 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ m NO :l 18.
Mutation dates l'd3tti0it 45 La mutation s-m34i45 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 34 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 45, soit à
la position 343 par rapport à la séquence SEQ m NO: 21. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 45 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ
a7N0:81.
Mutations dates l'ihtrou 47 La mutation s-13147 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 13 de l'extrémité 5' de I'intron 47, soit à Ia position 1068 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 21. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 47 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ m NO : 82.
La mutation s-86147 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une cytosine (C) en position 86 de l'extrémité 5' de l'intron 47, soit â la position 1141 par rapport à la séquence SEQ m NO: 21. La séquence nucléotidique partielle de I'intron 47 portant ce polymorphisme est représentée à la séquence SEQ m NO : 83.

Mutations dates l'exoh 49 La mutation s-377e49 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une cytosine (C) en position 377 de l'exon 49, soit à la position 571 par rapport à la séquence SEQ m NO: 22. L'exon 49 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ 1T7 NO : 84. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 49 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 119.
La mutation s-833e49 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 833 de l'exon 49, soit à la position 1027 par rapport à la séquence SEQ )D NO: 22. L'exon 49 portant ce polymorphisme a la sëquence nucléotidique SEQ D7 NO : 85. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 49 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 120.
La mutation s-1580e49 consiste en la substitution d'unë cytosine (C) pax une thymine (T) en position 1580 de l'exon 49, soit à la position 1773 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 22. L'exon 49 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ >D NO : 86. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 49 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ 117 NO : 121.
La mutation s-1791e49 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une thymine (T) en position 1791 de l'exon 49, soit à la position 1985 par rapport à la séquence SEQ m NO: 22. L'exon 49 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 87. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 49 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 122.
La mutation s-2034e49 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 2034 de l'exon 49, soit à la position 2228 par rapport à la séquence SEQ m NO: 22. L'exon 49 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 88. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 49 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 123.
La mutation s-2049e49 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 2049 de l'exon 49, soit à la position 2243 par rapport à la séquence SEQ B7 NO: 22. L'exon 49 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 89. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 49 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ m NO : 124.
La mutation s-2449e49 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 2449 de l'exon 49, soit à la position 2643 par rapport à la séquence SEQ m NO: 22. L'exon 49 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ m NO : 90. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 49 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ 1D NO : 125.
La mutation s-2843e49 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 2843 de l'exon 49, soit à la position 3037 par rapport à la séquence SEQ m NO: 22. L'exon 49 portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ m NO : 91. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon 49 du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 126.
Certains polymorphismes retrouvés au sein des régions codantes, qui correspondent essentiellement à des substitutions d'un seul nucléotide localisé sur la troisième base des codons du cadre ouvert de lecture de ABCAl, n'entraînent pas de modifications quant à la nature de l'acide aminé codé, compte tenu des règles de dégénérescence génétique.chez l'homme, bien connues de l'homme du métier. Les polymorphismes qui n'altèrent pas la séquence d'acide aminé peuvent toutefois avoir une fonction biologique importante, qui peuvent avoir un effet sur la concentration de HDL circulante, et donc d'apolipoprotéine A-I ou A-II. De tels polymorphismes peuvent par exemple afFecter la régulation de la transcription ou la traduction, par exemple en agissant sur la stabilité de l'ARNm, l'épissage, le taux de transcription, de traduction et la fidélité de la traduction.
AUTRES POLYMORPHISMES
Selon l'invention, d'autres polymorphismes ont été découverts dans la région promotrice en amont du gène ABCAl humain. Les positions polymorphes sont représentées à la figure 3 par des nucléotides marqués en gras (et soulignés lorsqu'il s'agit des bases encadrant une insertion) sur la séquence du promoteur du gène ABCA1 humain sauvage de séquence SEQ ID NO : 23. ' Le tableau 3 présente par ailleurs les polymorphismes alléliques dans la séquence promotrice du géne ABCAI humain selon la présente invention. il est indiqué le nom, les allèles sauvage et mutant, les positions polymorphes, et la fréquence d'apparition des polymorphismes alléliques dans deux groupes de population, la population caucasienne et la population japonaise.

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23, ou en position 2389 par rapport au site d'initiation de la transcription +l . L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-2389p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représentë par la séquence nucléotidique SEQ m NO : 137.
Le polymorphisme Sins-2176-2177p consiste en une insertion de la séquence GGAGGGGAGG en 717 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position 2176 par rapport au site d'initiation de la transcription. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme Sins-2176-2177p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ 117 NO : 138.
Le polymorphisme S-1814p consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 1080 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID
NO
23 ou en position -1814 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-1814p dans la séquence régulatrice du gène ABCAI est représenté par la séquence nucléotidique SEQ B7 NO : 139.
Le polymorphisme S-1801p consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 1093 du premier nucléotide de la séquence SEQ m NO
23 ou en position-1801 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-1801p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 140.
Le polymorphisme S-1652p consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 1242 du premier nucléotide de la séquence SEQ 117 NO
23 ou en position-1652 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-1652p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ D~ NO : 141.
Le polymorphisme S-1506p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une cytosine (C) en position 1388 du premier nucléotide de la séquence SEQ m NO
23 ou en position-1506 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-1506p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ m NO : 142.
Le polymorphisme S-1395p consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 1499 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID
NO
23 ou en position-1395 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-1395p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par là séquence nucléotidique SEQ ID NO : 143.
Le polymorphisme S-1252p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 1642 du premier nucléotide de Ia séquence SEQ ID
NO
23 ou en position-1252 par rapport au site d'initiation de Ia transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymôrphisme S-1252p dans Ia séquence régulatrice du gène ABCAI est représenté pàr la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 144.
Le polymorphisme S-1217p consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 1677 du premier nucléotide de la séquence SEQ 1D
NO
23 ou en position-1217 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-1217p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ll~ NO : 145.
Le polymorphisme S-1099p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une thymine (T) en position 1795 du premier nucléotide de la séquence SEQ 1D
NO

23 ou en position -1099 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant Ie polymorphisme S-1099p dans la séquence régulatrice du gène ABCAI est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 146.
Le polymorphisme Sins-1034-1035p consiste en une insertion d'une adénine et d'une thymine (AT) en position 1859 du premier nucléotide de la séquence NO : 23 ou en position -1034 par rapport au site d'initiation de la transcription +l .
L'acide nucléique comprenant le polymorphisme Sins-1034-1035p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ 1D
NO : 147.
Le polymorphisme S-940p consiste en la substitution d'une thymine (T) en une guanine (G) en position 1954 du premier nucléotide de la séquence SEQ m NO
23 ou en position -940 par rapport au site d'initiation de la transcription +l. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-940p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ m NO : 148.
Le polymorphisme S-803p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 2091 du premier nucléotide de la séquence SEQ D7 NO
23 ou en position -803 par rapport au site d'initiation de la transcription +l. L'acide nucléique comprenant Ie polymorphisme S-803p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ll~ NO : 149.
Le polymorphisme SO-777-774p consiste en une délétion d'un fragment de quatre nucléotides TTTG en position 2117 du premier nucléotide de la séquence SEQ
m NO : 23 ou en position -774 par rapport au site d'initiation de la transcription +l .
L'acide nucléique comprenant le polymorphisme SO-777-774p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID
NO : 150.
Le polymorphisme SO-773-765p consiste en une délétion d'un fragment de neuf nucléotides TTTGTTTGT en position 2121 du premier nucléotide de la 5 séquence SEQ ID NO : 23 ou en position -765 par rapport au site d'initiation de la transcription +l. L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S~-773-765p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ m NO : 1 S 1.
Le polymorphisme S-564p consiste en la substitution d'une cytosine (C) par 10 une thymine (T) en position 2330 du premier nucléotide de la séquence SEQ m NO
23 ou en position 564 par rappbrt au site d'initiation de la transcription +1.
L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-564p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 152.
Le polymorphisme S-407p consiste en la substitution d'une guanine (G) par 15 une cytosine (C) en position 2487 du premier nucléotide de la séquence SEQ
m NO
23 ou en position -407 par rapport au site d'initiation de la transcription +l . L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-407p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 153.
Le polymorphisme S-302p consiste en la substitution d'une cytosine (C) par 20 une thymine (T) en position 2592 du premier nucléotide de la séquence SEQ

23 ou en position 302 par rapport au site d'initiation de la transcription +I.
L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-302p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ m NO : 154.

Le polymorphisme S-278p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une cytosine (C) en position 2616 du premier nucléotide de la séquence SEQ m NO
23 ou en position 278 par rapport au site d'initiation de la transcription +l.
L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-278p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ m NO : 155.
Le polymorphisme SD-223-219p consiste en une délétion d'un fragment de cinq nucléotides CACCC en position 2671 du premier nucléotide de la séquence SEQ
m NO : 23 ou en position 219 par rapport au site d'initiation de la transcription +1.
L'acide nucléique comprenant le polymorphisme Sd-223-219p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID
NO : 156.
Le polymorphisme S-99p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une cytosine (C) en position 2795 du premier nucléotide de la séquence SEQ 1D
NO
23 ou en position 99 par rapport au site d'initiation de la transcription +1.
L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-99p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ a7 NO : 157.
Le polymorphisme S-14p consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 2880 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID
NO
23 ou en position -14 par rapport au site d'initiation de la transcription +l, L'acide nucléique comprenant le polymorphisme S-14p dans la séquence régulatrice du gène ABCA1 est représenté par la séquence nucléotidique SEQ D7 NO : 158.
Selon un premier aspect, l'invention concerne également les séquences nucléotidiques du gène ABCAl comprenant au moins un polymorphisme biallélique tel que décrit ci-dessus.

Ainsi, l'invention a pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ m NO : 24-126 et 137-158 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention est également relative à un acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec un polynucléotide choisi dans le groupe constitué
des séquences nucléotidiques SEQ m NO : 24-126 et 137-158 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention est également relative à un acide nucléique ayant au moins 9 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué
des séquences nucléotidiques SEQ m NO 24-126 et 137-158, et comprenant la base polymorphe ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention est également relative à un acide nucléique ayant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué
des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 24-126 et 137-158, et comprenant la base polymorphe ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention a également pour objet un acide nucléique ayant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué
des séquences nucléotidiques SEQ I17 NO : 24-126 et 137-158, la base polymorphe étant localisée au cenire du fragment nucléotidique de 21 bases.
L'invention concerne en outre un acide nucléique dérivé d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ m NO : 24-I26 et 137-158 comprenant la séquence polymorphe, et au moins deux nucléotides situés de part et d'autre de la position polymorphe ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

Un autre objet de l'invention concerne un acide nucléique codant pour un polypeptide choisi dans le groupe constitué de séquences d'acides aminés SEQ m NO : 127-136.
L'invention concerne également un polypeptide comprenant une séquence d'acide aminé choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ m NO : 127-136 .
Elle a également pour objet un anticorps dirigé contre un polypeptide ABCA1 polymorphe comprenant une sëquence d'acide aminé choisie dans le groupe constitué
des séquences SEQ m NO : 127-136 , ou un fragment peptidique de ce dernier. De préférence, (anticorps selon la présente invention comprend un composé
détectable.
L'invention a également pour objet un acide nucléique contenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ou un acide nucléique d'intérêt lié
de manière fonctionnelle à un" polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 137-158.
La présente invention a pour objet un vecteur de clonage et/ou d'expression recombinant qui porte un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ 1D NO : 24-126 et 137-158, et au moins un des polyrnorphismes tels que précédemment décrits. Elle concerne également une cellule hôte transformée par un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID
NO : 24-126 et 137-158, et au moins un des polymorphismes tels que précédemment décrits ou par le vecteur recombinant décrit ci-dessus. Elle concerne en outre un mammifère transgénique non humain dont les cellules somatiques et/ou les cellules germinales ont été transformées par un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158, et au moins un des polymorphismes tels que précédemment décrits ou par un vecteur recombinant tel que décrit ci-dessus.

Selon un second aspect, (invention a pour objet des sondes ou des amorces nucléotidiques capables de s'hybrider aux acides nucléiques de séquences SEQ m NO : 24-126 et 137-158 et comprenant au moins une position polymorphe ou aux acides nucléiques de séquence complémentaire.
Les sondes et amorces nucléotidiques comprennent un polynucléotide de séquence nucléotidique choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID
NO
24-126 et 137-158, ou d'une séquence complémentaire, contenant une des bases polymorphes selon (invention.
De préférence, une sonde nucléotidique selon l'invention a une longueur de 15, 16, 19 à 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000, 1500 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide de séquence nucléotidique choisie dans le groupe constitué
des séquences SEQ m NO 24-126 et 137-158, et comprenant au moins une base polymorphe, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
De manière encore plus prëférentielle, les sondes nucléotidiques sont constituées d'un acide nucléique comprenant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ m NO : 24-126 et 137-158. De préférence, la base polymorphe est localisée au centre du fragment nucléotidique de 21 bases.
De préférence, une amorce nucléotidique selon l'invention a une longueur de 2U 8, 9, 10, 1 l, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 à 40 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide de séquence nucléotidique choisie dans le groupé
constitué des séquences SEQ m NO 24-126 et 137-158, et comprenant au moins une base polymorphe, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.

De préférence, la base de l'extrémité 3' de ces amorces est complémentaire d'un nucléotide situé à 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 nucléotides ou plus du côté 3' de la position du polymorphisme selon l'invention, présent dans l'une des séquences SEQ m NO 24-126 et 137-158 et/ou de leurs 5 séquences complémentaires.
La définition d'une sonde et d'une amorce nucléotidique selon l'invention englobe donc des oligonucléotides qui hybrident, dans les conditions d'hybridation de forte stringence définies ci-avant, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ a7 NO : 24-126 et 137-158, comprenant au moins un des polymorphismes 10 définis précédemment, ou avec une séquence complémentaire de ces derniers.
Des exemples d'amorces et de couples d'amorces permettant d'amplifier différentes régions du gène ABCA1 sont représentés ci-dessous.
Il s'agit par exemple du couple d'amorces représenté par l'amorce de séquence SEQ )D NO : 159 (ACCGAAGTAAGGAGTTGCTC) et l'amorce de 15 séquence SEQ II7 N°: 160 (ACTGTTTCACTA.ATACTTACTG).
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de Narang et al. (Methods 20 Enzyrnol (1979) 68, 90-98) ou de Brown et al. (Methods Enzymol (1979) 68, 151), la méthode aux diéthylphosphoramidites de Beaucage et al. (Tetrahedron Lett.
(1981) 22, 1859-1862), ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet EU N°EP 0 707 592.

A titre illustratif, ~ des amorces nucléotidiques appropriées selon la présente invention sont par exemple des àmorces dont la base à l'extrémité 3' hybride avec la base localisée immédiatement du coté 3' de la base polymorphe du fragment comprenant le polymorphisme. Après une étape d'hybridation spécifique de l'amorce, une étape d'élongation avec un mélange de deux didéoxynucléotides complémentaires de la base polymorphe dudit polymorphisme, par exemple marqués par deux fluorophores distincts, puis une étape de détection du signal de fluorescence obtenu permet de déterminer lequel des deux didéoxynucléotides fluorescents différemment marqués a été incorporé, et de déduire la nature de la base polymorphe.
Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P, 33P, 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5-bromodeoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène, digoxigénine) ou encore des ligands tels que la biotine.
Le marquage des sondes est réalisé de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3'.
Des exemples de marquage non radioactifs de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n° FR 78 109 75 ou encore dans les articles de Urdea et al. (Nucl. Ac. Res. (1988) 11, 4937-4957) ou Sanchez-pescador et al. (J. Clin. Microbiol. (1988) 26 (10) 1934-1938).

D'autres approches peuvent être utilisées pour le marquage et la détection des didéoxynucléotides. Une méthode en phase homogène basée sur le FRET
(Fluorescence Resonance Energy Transfer) a été décrite entre autres par Chen et Kwok (Nucl Ac Res, 25 (1997) 347-353). Selon cette méthode, des fragments amplifiés d'ADN génomique susceptibles de contenir des polymorphismes sont incubés avec une amorce marquée à la fluorescéine à l'extrémité 5', en présence de didéoxynucléotides triphosphate fluorescents et d'une polymérise Taq modifiée.
L'amorce marquée est allongée d'une base par incorporation du didéoxynucléotide marqué spécifique de l'allèle présent dans la séquence d'ADN génomique complémentaire. A la fin de cette réaction d'élongation, les intensités de fluorescence pour les deux composés marqueurs des didéoxynucléotides marqués sont analysées directement sans séparation ni purification. Le ratio pour ces deux fluorescentes permet de déterminer le nucléotide utilisé par la polymérise lors de l'élongation, et de déduire la nature de la base polymorphe L'ensemble de ces étapes peut être réalisé
dans le même tube et les modifications de fluorescence suivies en temps réel.
Alternativement, l'amorce d'extension peut être analysée par spectrométrie de masse MALDI-TOF. La base située en position polymorphe est identifiée en mesurant la masse ajoutée à l'amorce de microséquençage. (Haff et al., Ge~c Res, 7 (1997) 388).
De manière avantageuse, les sondes selon l'invention permettent une amplification du signal, telles que les sondes décrites par Urdea et al.
(Nucl. Acid.
SympSer. (1991) 24, 197-200) ou encore dans le brevet européen n° EP-0 (CHIRON).

Les sondes oligonucléotides selon l'ïnventïon peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique ou Northern à l'ARN.
Les caractéristiques structurales permettant de différencier les séquences normales des séquences mutées d'ABCAl (génomiques, ARNs messagers, ADNc) sont ainsi mises à profit afm de réaliser des moyens de détection des séquences mutées d'ABCAI dans un échantillon, en particulier sous la forme de sondes hybridant spécifiquement avec les séquences mutées d'ABCAI ou encore des couples d'amorces permettant d'amplifier sélectivement les régions du gëne ABCAI
portant les polymorphismes décrits ci-dessus. La détection de la présence de ces mutations pouvant notamment être effectuée par discrimination de la longueur des fragments d'acide nucléique amplifiés, par hybridation des fragments amplifiés à l'aide des sondes spécifiques décrites ci-dessus ou encore par séquençage direct de ces fragments amplifiés.
De telles amorces nucléotidiques peuvent par exemple être immobilisées sur un support. De plus, il est possible d'immobiliser sur un support, par exemple de manière ordonnée, de multiples amorces spécifiques telles que décrites ci-dessus, chacune de ces amorces étant adaptée à la détection de l'un des polyrnorphismes du gëne ABCA1 selon l'invention.
Selon un troisième aspect de la présente invention, les polyrnorphismes du gène ABCA1 selon l'invention sont utiles notamment comme marqueurs génétiques dans des études d'association entre la présence d'un a11é1c donné chez un sujet et la prédisposition de ce sujet à une pathologie donnée et/ou à une réponse donnée à une molécule thérapeutique dans le cadre d'études pharmacogénétiques.

La présente invention. a donc pour objet des marqueurs génétiques comprenant tout ou partie d'un acide nucléique choisi dans le groupe constitué
des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158 ou un acide nucléique de séquence complémentaire, et comprenant un des polymorphismes selon l'invention.
Les marqueurs génétiques de l'invention sont avantageusement utilisés pour les études d'association d'un allèle donné des polymorphismes selon l'invention, avec les taux de cholestérol HDL, d'apolipoprotéine A-I et d'apolipoprotéine A-II
plasmatiques chez les patients.
De préférence, les marqueurs génétiques sont utilisés pour les études d'association des polymorphismes s-35e1a, s-l6elb, s-76elb,s-53e5, s-108e6, s-113e6, s-123e8, s-153e8, s-126e12, s-148e14, s-196e15, s-136e16, s27e17, s107e17, s-4e18, s-40e19, s-123e22, s-54e23, s-98e24, s-149e24, s-44e27, s-7e30, s-166e30, s-62e34, s-77e36, s-64e38, s-114e45, s-377e49, s-833e49, s-1580e49, s-1791e49, s-2034e49, s-2049e49, s-2449e49, et s-2843e49 avec les taux d'HDL cholestérol, d'apolipoprotéine A-I et d'apolipoprotéine A-II plasmatiques chez les patiènts.
De manière encore plus préférentielle, les marqueurs génétiques sont utilisës pour les études d'association des polymorphismes s-113e6, s-196e15, s-136e16, s27e17, s107e17, s-4e18, s-123e22, s-54e23, s-62e34, et s-77e36 avec les taux d'HDL
cholestérol, d'apolipoprotéine A-I et d'apolipoprotéine A-II plasmatiques chez Ies patients.
- En particulier, la présente invention concerne des marqueurs génétiques comprenant tout ou partie d'un acide nucléique choisi dans le groupe constitué
des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158 ou un acide nucléique de sëquence complémentaire, pour les études d'association des polyrnorphismes tels que décrits précédemment avec un risque cardiovasculaire chez les patients et plus particulièrement un risque d'infarctus du myocarde.
Les méthodes pour l'analyse génétique de caractères (phénotypes) complexes sont de différents types (Lander et al., Science, 265 (1994) 2037-2048). En général, 5 les polymorphismes bialléliques selon l'invention sont utiles dans l'un quelconque des procédés décrits dans l'état de la technique destiné à démontrer une corrélation statistiquement significative entre un génotype et un phénotype. Les polymorphismes bialléliques peuvent être utilisés dans des analyses de liaison ("linkage analysis") et dans des procédés de partage d'allèles ("allele sharing"). De préférence, les 10 polymorphismes bialléliques selon l'invention sont utilisés pour identifier des gënes associés à des caractères (phénotypes) détectables en utilisant des études d'association, une approche qui ne nécessite pas le recours à des familles affectées par le caractère, et qui permet en outre l'identification de gènes associés à des caractères complexes et sporadiques.
15 D'autres méthodes statistiques mettant en oeuvre des polymorphismes bialléliques selon l'invention sont par exemple celles décrites par Forsell et al. (Biol Psychiat~y 42 (1997) 898-903) Xiong et al. (Ann JHum Genet 64 (1999) 629-640), Horvath et al. (Am JHurn Genet 63 (1998) 1886-1897), Sham et al. (Ann Hum Genet 59 (1995) 323-336) ou encore Nickerson et al. (Genomics, 12 (1992) 377-387).
De 20 préférence, les polymorphismes' biallèliques sont utilisés pour identifier les gènes associés avec un phénotype.
Selon un qûatrième aspect, la présenté invention a pour objet un procédé de détection d'un des polymorphismes décrits précédemment dans la séquence nucléotidique du gène ABCA1 d'un sujet.

Le procédé selon l'invention consiste à déterminer la séquence nucléotidique de tout ou partie du gène ABCA1 chez ledit sujet à une des positions polymorphes de l'invention, et identifier la présence ou l'absence du SNP (polymorphisme simple nucleotide) à la position analysée.
De préférence, le procédé de détection selon l'invention consiste à
déterminer la présence d'un G ou d'un A à la position polymorphe 113 de l'exon 6, la présence d'un G ou d'un A à la position polymorphe 196 de l'exon 15, la présence d'un G ou d'un A à la position polymorphe 136 de I'exon 16, la présence d'un A
ou d'un G à la position polymorphe 107de l'exon 17, la présence d'un T ou d'un C
à la position polymorphe 27 de l'exon 17, la présence d'un G ou d'un T à la position polymorphe 4 de l'exon 18, la présence d'un C ou d'un T à Ia position polymorphe 123 de l'exon 22, la présence d'un G ou d'ûn C à la position polymorphe 54 de l'exon 23, la présence d'un C ou d'un T à Ia position polymorphe 62 de l'exon 34, la présence d'un G ou d'un A à Ia position polymorphe 77 de l'exon 36.
De manière encore plus préférentielle, Ie procédë de détection selon la présente invention, consiste à déterminer la séquence nucléotidique du gène ABCAl au niveau de la position 62 de l'exon 34 et le SNP correspondant à la présence d'un C
ou d'un T.
Selon un premier mode de réalisation du procédé de l'invention, la présence d'au moins un des SNP décrits précédemment est identifiée par séquençage de tout ou partie du gène ABCA1 du sujet au niveau des positions polymorphes.
Des amorces d'amplification et de séquençage peuvent être construites afm d'hybrider avec une région déterminée d'une séquence choisie dans le groupe de séquence constitué par les séquences SEQ m NO : 24-126 et SEQ TD NO : 137-158, ou de séquence complémentaire, et comprenant au moins une position polymorphe.
De telles amorces de séquençage sont construites préférentiellement de manière à
amplifier des fragments d'environ 250 à environ 500 nucléotides, comprenant au moins une des positions polymorphes selon l'invention.
Les fragments amplifiés, par exemple par la méthode PCR, sont ensûite séquencés et la séquence obtenue est comparée aux séquences de référence SEQ

NO : 24-91 et 137 à 158 afin de déterminer si une ou plusieurs délétions, additions ou substitutions de nucléotides sont retrouvées dans la séquence amplifiée à
partir de l'ADN contenu dans l'échant~lon biologique provenant du sujet testé.
Le procédë de l'invention permet l'amplification d'un acide nucléique contenant au moins ün des polymorphismes de l'invention, et comprenant les étapes consistant à
a) mettre en contact un échantillon, dans lequel la présence de l'acide nucléique ABCA1 est suspectée, avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' sur un brin et du côté 3' sur le brin complémentaire de la région de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détecter les acides nucléiques amplifiés.
Pour mettre en oeuvre le procédé d'amplification tel que défini ci-dessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques définies selon les critères mentionnés ci-avant.

L'invention concerne donc selon ce premier mode de réalisation un procédé
de détection d'un des polymorphismes selon l'invention dans le gène ABCAI chez un sujet, comportant les étapes suivantes a) séquençage, à partir d'un matériel biologique provenant du sujet à tester, d'un fragment d'acide nucléique à l'aide d'au moins une amorce nucléotidique hybridant avec la séquence choisie parmi les séquences SEQ m NO : 24-91 ou les séquences SEQ ID NO : 137-158 selon l'invention;
b) aligner la séquence obtenue en a) avec la séquence correspondante à la sëquence amplifiée choisie parmi les séquences SEQ m NO : 24-91 ou les séquences SEQ TD NO : 137-158;
c) déterminer la présence d'un polymorphisme dans la séquence du fragment d'acide nucléique par rapport aux séquences SEQ ID NO : 24-9I ou aux séquences SEQ B7 NO : 137-I58 de référence.
Le procédé de détection de la présence d'un polymorphisme du gène ABCAl chez un sujet, comprend également les étapes consistant à:
a) séquencer, à partir d'un matériel biologique provenant du sujet à tester, tout ou une partie du gène ABCAl, à l'aide d'une amorce nucléotidique hybridant avec la séquence choisie parmi les SEQ m NO :24-9I ou les séquences SEQ lD NO : 137-158 ;
b) aligner la séquence nucléotidique obtenue en a) avec une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ m N° 1 et 3-23;
c) déterminer les différences nucléotidiques entre le polynucléotide séquencé
provenant du matériel biologique du sujet à tester et les séquences SEQ m NO :
1 et 3-23 de référence.

Selon un deuxième mode de réalisation du procédé selon la présente invention, celui-ci utilise les- sondes oligonucIéotidiques telles que décrites précédemment, qui sont capables d'hybrider spécifiquement avec une région correspondante d'une des séquences SEQ ll~ NO : 24-91 ou avec une région correspondante d'une des séquences SEQ >D N° 137-158, et comprenant au moins une des bases polymorphes selon l'invention telles que décrites précédemment, en vue de détecter la présence d'un ou plusieurs des polymorphismes selon l'invention dans un échantillon provenant d'un suj et.
De manière préférentielle, les sondes nucléotidiques sont constituées d'un IO acide nucléique comprenant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158, la base polymorphe étant localisée au centre du fragment nucléotidique de 2I bases.
De préférence les sondes nucléotidiques selon ce mode de rëalisation de l'invention sont immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de microtitration recouvert de lits de polystyrène, de lits magnétiques, de bandes de nitrocellulose, ou encore de microparticules telles que des particules de latex.
En conséquence, la présente invention concerne également un procédé de détection de Ia présence d'un acide nucléique tel que décrit ci-avant dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes consistant à
I) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'invention avec I' échantillon à tester ;

2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
De préférence, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support, et encore plus préférentiellement, les sondes oligonuclëotidiques 5 comprennent un marqueur détectable.
Selon un cinquième aspect de la présente invention, les procédés de détection des polymorphismes décrits précédemment sont utilisés poux diagnostiquer chez un sujet une prédisposition à développer uné certaine pathologie, après une étude d'association, ou pour prédire la réponse pharmacologique d'un patient à une 10 molécule donnée, après une étude pharmacogénétique.
' Plus particulièrement, les procédés permettent de diagnostiquer chez un sujet qui a été détecté comme portant un allèle donné d'au moins un des polymorphismes selon L'invention, un risque pathologique lié à une déficience du transporteur ABGA1, ou une réponse nulle ou indésirable à une molécule thérapeutique donnée.
15 Les procédés selon l'invention sont particulièrement utiles pour diagnostiquer la prédisposition d'un individu à présenter un risque coronarien ou cardiovasculaire, tel qu'un risque d'infarctus du myocarde, ou d'athérosclérose.
Le procédë selon l'invention permet de déterminer si un sujet présente un risque pour le développement d'une pathologie liée à un déficit dans Ie métabolisme 20 du cholestérol, notamment dans le transport inverse de cholestérol, un risque de développement d'une déficience HDL familiale telle qua la maladie de Tangier ou plus généralement d'une maladie carâiovasculaire ou une affection coronarienne, telle qu'un risque d'infarctus du myocarde ou d'athérosclérose.

De telles méthodes comprennent la détection, dans des cellules d'un échantillon biologique provenant du sujet à tester, de la présence ou de l'absence d'un allèle donné d'un des polymorphismes selon l'invention tel que décrit dans Ie tableau 2, dans la séquence du gène ABCA1 humain de séquence SEQ m NO: 3-22.
Les méthodes selon l'invention permettent également de détecter dans des cellules d'un échantillon biologique provenant du sujet à tester, Ia présence ou l'absence d'un allële donné d'un des polymorphismes selon l'invention tel que décrit dans le tableau 3, dans la séquence régulatrice SEQ >D NO : 23 en amont du gène ABCAl caractérisée par une altération dans l'expression d'un gène dont l'expression est régulée par le promoteur de ABCA1.
La présente invention a pour objet le procédé de diagnostic d'une pathologie liëe à une déficience du transporteur ABCA1 qui consiste à détecter chez un sujet, la présence d'un allèle donné d'un des polymorphismes de l'invention selon une des méthodes de détection décrites précédemment.
De préférence, le procédé de l'invention permet de diagnostiquer la prédisposition d'un sujet à développer une maladie cardiovasculaire telle qu'un infarctus du myocarde.
De maniëre encore plus préférentielle, la présente invention a pour objet un procédé et un kit de diagnostic d'un risque d'infarctus du myocarde ou d'un risque d'affection cardiovasculaire chez un sujet, consistant à détecter chez ledit sujet, la présence d'un acide nucléique comprenant un polynucléotide de séquence SEQ m NO : 72 ou 115, et comprenant une base polymorphe A en position 62 de l'exon 34, soit à la position 53 ~2 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 15.

La présente invention a pour objet le procédé de diagnostic d'une réponse pharmacologique liée à une variation du transporteur ABCAl ou de sa régulation qui consiste à détecter chez un sujet, la présence d'un allèle donné d'au moins un des polymorphismes de l'invention selon une des méthodes de détection décrites précédemment.
A türe illustratif, de tels polymorphismes SNPs peuvent être détectés afin de déterminer l'existence d'une substitution d'un nucléotide dans la séquence d'un acide nucléique correspondant au gène ABCA1 de séquence SEQ m NO : 3-22 et/ou dans la séquence régulatrice en amont du gène ABCAl de séquence SEQ m NO : 23, de l'addition d'un ou plusieurs nucléotides ou encore de la délétion d'un ou plusieurs nucléotides dans lesdites séquences SEQ ID N° 3-22 ou SEQ m N°
23.
La présente invention a en outre pour objet l'utilisation des sondes oligonucléotïdiques hybridant spécifiquement avec une région correspondante d'une des séquences SEQ m NO : 24-126 ou avec une région correspondante d'une des séquences SEQ m N°137-158, ~ comprenant au moins une des bases polymorphes selon l'invention telles que décrites précédemment, en vue de diagnostiquer chez un sujet une prédisposition au développement d'une pathologie liée à une déficience dans le transport inverse du cholestérol, tel que l'infarctus du myocarde, l'athérosclérose ou encore la maladie de Tangier, ou plus généralement une affection cardiovasculaire, ou de prédire la réponse pharmacologique d'un sujet à une molécule thérapeutique donnée.
Les méthodes de diagnostic selon la présente invention peuvent avantageusement être utilisées afm d'évaluer l'effïcacité de produits thérapeutiques dans le traitement des affections liées à une déficience du transporteur ABCAl . ' Les sujets porteurs d'un polymorphisme allèlique du gène ABCAl peuvent présenter par exemple des différences de concentration des différentes variables lipidiques qui sont couramment mesurées telles que les taux de HDL
cholestérol, de triglycérides, d'apolipoprotéines A-I et A-II, des particules lipoprotéiques A-I et A-TI, ou encore des différences au niveau de Ia régulation de la biosynthèse de la protéine.
Les différences observées du fait de la présence d'une variant allélique chez un sujet peuvent être modifiées lorsque l'on adminïstre audit sujet un agent thérapeutique particulier. Les procédés selon la présente invention peuvent donc être utiles pour déterminer l'effet clinique d'une substance thérapeutique et déterminer les doses thérapeutiques à administrer.
Selon un dernier aspect, la prësente invention a pour objet un kit ou nécessaire pôur la détection de la présence d'un des polymorphismes tels que précédemment décrits, dans Ie gène ABCA1 chez un sujet, Ledit nécessaire comprenant a) une ou plusieurs amorces hybridant avec une région choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 24-126 ou les séquences SEQ ID NO : 137-158;
b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la réalisation d'une réaction d'amplification d'au moins une position polymorphe de la présenté invention.
L'invention a encore pour objet un kit ou nécessaire pour la détection d'un des polymorphismes de la présente invention dans Ie gène ABCAI, chez un sujet, comprenant:
a) une ou plusieurs sondes oligonucléotidiques telles que définies ci-dessus;

b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'hybridation.
Les fragments d'acides nucléiques dérivés de l'une quelconque des séquences nucléotidiques SEQ ll~ NO 24-126 comprenant un des polyrnorphismes de l'invention sont donc utiles pour Ia détection de la présence d'au moins un allèle polymorphe du gène ABCA1 dans un échantillon.
Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.
De préférence, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que Ia ou les sondes sont immobilisées sur un support.
Selon un second mode de réalisation, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit ci-dessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à
l'invention qui pourront être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes des acides nucléiques selon l'invention, plus particulièrement des acides nucléiques de sëquences SEQ )D NO 1, et 3-23 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.
Ainsi, les sondes selon l'invention immobilisées sur un support peuvent être ordonnées en matrices telles que les " puces à ADN ": De telles matrices ordonnées ont été en particulier décrites dans le brevet US N° 5,143,854, dans les demandes WO 90/15070 et WO 92/10092.
Des matrices supports sur lesquelles des sondes oligonucléotidiques ont été
immobilisées à une haute densité sont par exemple décrites dans les brevets US
5 N°5,412,087 et dans la demande PCT N°WO 95/11995. Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention, et plus particuliërement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ m NO 24-126 et 137-158.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification 10 d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 1, et 3-23 ledit nécessaire ou kit comprenant a) un couple d'amorces nucléotïdiques conformes à l'invention, dont Ia position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée; b) le cas échéant, les réactifs 15 nécessaires à la réaction d'amplification. Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telles que décrites ci-dessus.
L'invention a par ailleurs pour objet un procédé destinë à la détection de la présence d'une protéine ABCAI polymorphe dans un échantillon, comprenant les 20 étapes de a) mise en contact de l'échantillon avec un anticorps tel que précédemment décrit; et b) détection du complexe antigène/anticorps formé.
La présente invention a également pour objet un nécessaire de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide ABCA1 polymorphe dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant a) un anticorps tel que précédemment décrit; et b) un

25 réactif permettant la détection des complexes antigènes/anticorps formés.
L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples ci-après.

La figure 1 illustre la séquence SEQ ID NO : 1 correspondant à la séquence nucléotidique du transcrit du gëne humain ABCA1;
La figure 2 illusïre la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2 correspondant à la séquence peptidique de la protéine transporteur ABCA1 ;
La figure 3 illustre la séquence régulatrice SEQ ID NO : 23 en amont du gène humain ABCAI ; la position des différents polymorphismes est indiquée en gras.
EXEMPLE 1 : IDENTIFICATION DES POLYMORPHISMES DE ABCA1 La détection de polymozphismes dans les séquences des transcrits ou dans les séquences génomiques du gène ABCA1 peut être réalisée selon différents protocoles.
La méthode de choix est le séquençage direct. Dans le càs d'un transcrit où la structure du gène correspondant est inconnue ou partiellement connue, il est nécessaire de déterminer précisément sa structure intron-exon ainsi que la séquence génomique du gëne correspondant. Il s'àgit donc dans un premier temps d'isoler le ou les clones de BAC d'ADN génomique correspondant au transcrit étudié, de séquencer 1_'insert du ou des clones correspondants et de déterminer la structure intron-exon en comparant la séquence de l'ADNc à celle de l'ADN génomique obtenu.
La technique de détection de polymorphismes par séquençage direct consiste à
comparer les séquences génomiques du gène ABCAl obtenues à partir d'au moins individus de chaque population testée, caucasienne, africaine et japonaise.
Les divergences de séquence constituent des polymorphismes. Tous ceux modifiant la séquence en acides aminés de la protéine sauvage sont des mutations susceptibles d'affecter la fonction de ladite protéine qu'il est intéressant de considérer plus particulièrement dans les études d'association cas/témoin décrites dans l'Exemple 2.
Des amorces pour l'amplification de l'ADN des individus ont été conçues à
partir des séquences non répétitives de l'ADN intronique du gène ABC1, de telle manière à
ce qu'une amplification des jonctions intron-exon ainsi que des bases essentielles pour la formation de Ia structure secondaire durant l'étape d'épissage de l'ARN soit incluses dans les fragments amplifiés.

L'ADN génomique des individus a été amplifié à l'aide des amorces décrites ci-dessus en utilisant le kit Qiagen's Star Taq~ (Qiagen, Valencia, CA) ou encore le kit Supertaq~ (Ambion, Austin, TX) en utilisant Ies conditions d'hybridation et des conditions de cycle d'amplification préconisées par le constructeur.
Les produits PCR amplifiés ont été purifiés. en utilisant un kit commercialisé
par la société Qiagen, puis séquencés par la méthode Big Dye Terminator sur un séquenceur ABI 3700 (Apllied Biosystems, Foster City, CA).
EXEMPLE 2 : ANALYSE DES POLYMORPHISMES DU GENE ABCAI
L'étude Cas-Témoins de l'Infarctus du Myocarde (ECTIM) est une étude de patients victimes d'un infarctus du myocarde et de sujets contrôles provenant d'Irlande du Nord, d'Angleterre et de France (tous du type Caucasien).
L'étude a été réalisée afm d'identifier une éventuelle association des polymorphismes exoniques tels que par exemple s-l6elb, s-113e6, s-135e8, s-148e14, s-136e16, s-' lOlel7, s-54e23, s-7e30, s-62e34, s-833e49 et s-2034e49, avec les taux d'HDL
cholestérol, ApoA-I et ApoA-II plasmatiques chez les témoins et les patients.
L'ADN génomique des individus a été amplifié à I'aide des amorces décrites ci-dessus permettant d'amplifier spécifiquement l'exon d'intérêt et les jonctions intron-exon correspondantes en utilisant par exemple le kit Qiagen's Star Taq ~
(Qiagen, Valencia, CA) ou encore le kit Supertaq~ (Ambion, Austin, TX) dans les conditions d'hybridation et des conditions de cycle d'amplification préconisées par le constructeur. Sur ces amplifiats, des réactions de mini-séquençage ont été
réalisées pour chacun des polymorphismes sélectionnés. Le génotype de chacun des témoins et des patients a ainsi pu être déterminé pour chacun des polymorphismes.
Ces données ont été analysées avec le logiciel SAS. L'équilibre Hardy-Weinberg a été
testé par un test de x2 avec 1 df. Les fréquences génotypiques et alléliques ont été
comparées entre les groupes par tests de x2. Les différents paramètres phénotypiques ont été comparé entre les génotypes par analyse de variance ANOVA.

LISTE DE SEQUENCES
<110> AVENTIS PHARMA SA et INSERM
S <120> SEQUENCES POLYMORPHES DU GENE HUMAIN ABCA1, LEURS
UTILISATIONS, LES METHODES ET KITS DE DETECTION
<130> POLYMORPHISMES ABCA1 l~ <140> ST00031 <141> 2000-10-31 <160> 160 IS <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 9741 <212> ADN

20 <213> Homosapiens <400> 1 cttgttttttccccggttctgttttctcccct.tctccggaaggcttgtcaaggggtagga60 gaaagagacgcaaacacaaaagtggaaaacagttaatgaccagccacggcgtccctgctg120 ~S tgagctctggccgctgccttccagggctcccgagccacacgctgggggtgctggctgagg180 gaacatggcttgttggcctcagctgaggttgctgctgtggaagaacctcactttcagaag240 aagacaaacatgtcagctgctgctggaagtggcctggcctctatttatcttcctgatcct300 gatctctgttcggctgagctacccaccctatgaacaacatgaatgccattttccaaataa360 agccatgccctctgcaggaacacttccttgggttcaggggattatctgtaatgccaacaa420 cccctgtttccgttacccgactcctggggaggctcccggagttgttggaaactttaacaa480 atccattgtggctcgcctgttctcagatgctcggaggcttcttttatacagccagaaaga540 caccagcatgaaggacatgcgcaaagttctgagaacattacagcagatcaagaaatccag600 ctcaaacttgaagcttcaagatttcctggtggacaatgaaaccttctctgggttcctgta660 tcacaacctctctctcccaaagtctactgtggacaagatgctgagggctgatgtcattct720 3S ccacaaggtatttttgcaaggctaccagttacatttgacaagtctgtgcaatggatcaaa780 atcagaagagatgattcaacttggtgaccaagaagtttctgagctttgtggcctaccaag840 ggagaaactggctgcagcagagcgagtacttcgttccaacatggacatcctgaagccaat900 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<213> Homosapiens <400> 23 acagggcatggtggcaggtgcctgtaatctcagttactcgggaggtggaggttgcaatga60 gcccagatcgcaccattgcactccagcctgggcaacaaaaggtgaaactccatctcaatt120 aaaaaaaaaagaatgattttggtggtcgacttcaaataggtaggagaagaaggagagagg180 agatggagggtcagggagatctaattactctctaaaatcatgctaggaaagataacacct240 tttaataacactctctgcttttataacatcattctgccaaggagctcaaaggtttcaaca300 aagttcactttcagaaaacccctttgaggaagacagaatatacatcttctctccatttta360 aagatgaagaaacaggccgggcacaatggctaatgcctgtaatcccagcactttgggagg420 ctgaggccagaggatcgcttgagctccagagtttgagaccagcctggataacatggcaaa480 accctgtctctacaaaaaaaatacaaaaattagatgggtgtggtggcatgcacctgtggt540 cccagctacttgggaggctaaggtgggaggatcgcttgagcccagggagtcaagtctaca600 ctgagccatgattggatcactgcactccagcctgggtagacagagcaagaccctgtctca660 2$ aaaaaaagaaatgaaagagaaagaaagaaagaggagaggagaggagatgaggggaggagg720 gagggggggaggaaggaaggaaggaaggaaggaaaaaaagatgaaaaaagaaaaaaacaa780 gatgaaacagaggcagaaagactttacgtaaattgctcatcatgtggttgtcaagtttga840 ccccaaaacccaatttattgaccaaggttattctttgactgaggcaagggggtccgctct900 cctgggccttgggctttagaaagctcatctctggcctttctgagatccatccctttcttt960 ttatttttcttgacacggagtcttgctctgtcactcaggctggagtgcagtggcatgatc1020 tcgactcactgtaacctctgcctcccgggttcaagcgattctcctgcctcagcctcctga1080 gataacaggcgcccgccaccacatctggctaatttttgtatttttagtaaagactgggtt1140 tcatcatgttggccaggttggtttcgaactcctgacctgaggtgagctgcccaccttggc1200 ctcccaaagtgctgggattacaggcatgagccactgcgcccagctcagatccatcccttt1260 35 ctaagggcaaacag.tccatggtgcaaaggggccatgccacccagagttatgagtacctgg1320 gactccagaattccttgcctggtggcctccacatgcacttccagggcctgcttgggcctc1380 ttctatgcgtctgtcctgagtgttgatagaaccactgatgtgagtacctgggcttgagcc1440 gtggcctggagatcctgttgactgtagcatggagggggcttgtgcagctgaatgtctgca1500 tgcaggtggtgggagttctggaatatgatggagctggaggtgggaagagaagtaggcttg1560 4o gggcagctctctcatgccacctcattctggccaaaactcaggtcaaactgtgaagagtct1620 aaatgtgaatctgcccttcaaggtggctacaaaggtatctttgtcaaggtaggagacctt1680 gtggcctccacgtgcacttccagggcctgcttgggcctcttctacgggtctgtcctgagt1740 cttctatgaatccttcagggcagattcatatttagactcttcacagtttgacctgagttt1800 tggccagaataaggtgacatttagtttgttggcttgatggatgacttaaatatttagaca1860 45 tggtgtgtaggcctgcattcctactcttgctttttttttgcccctccagtgttttgggt1920 agttttgctcccctacagccaaaggcaaacagagaagttggaggtctggagtggctacat1980 aattttacacgactgcaattctctggctgcacttcacaaatgtatacaaactaaatacaa2040 gtcctgtgtttttatcacagggaggctgatcaatataatgaaattaaaagggggctggtc2100 catattgttctgtgtttttgtttgtttgttttgtttgtttctttttttgtttttgtggcc2160 5o tccttcctctcaatttatgaagagaagcagtaagatgttcctctcgggtcctctgaggga2220 cctggggagctcaggctgggaatctccaaggcagtaggtcgcctatcaaaaatcaaagtc2280 caggtttgtggggggaaaacaaaagcagcccattacccagaggactgtccgccttcccct2340 caccccagcctaggcctttgaaaggaaacaaaagacaagacaaaatgattggcgtcctga2400 gggagattcagcctagagctctctatccccaatccctccctccggctgaggaaactaac2460 $$ aaaggaaaaaaaaattgcggaaagcaggatttagaggaagcaaattccactggtgccctt2520 ggctgccgggaacgtggactagagagtctgcggcgcagccccgagcccagcgcttcccgc2580 gcgtcttaggccggcgggcccgggcgggggaaggggacgcagaccgcggaccctaagaca2640 CCtgCtgtaCCCtCCaCCCCCaCCCC3CCCCdCCCdCCtCCCCCCaaCtCCCtagatgtg2700 tcgtgggcggctgaacgtcgcccgtttaaggggcgggccccggctccacgtgctttctgc2760 tgagtgactgaactacataaacagaggccgggaagggggcggggaggagggagagcacag2820 gctttgaccgatagtaacctctgcgctcggtgcagccgaatctataaaaggaactagtcc2880 cggcaaaaacccc 2893 6S <210> 24 <211> 221 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 24

27 gtaattgcga gcgagagtga gtggggccgg gaccggcaga gCCgagCCga CCCttCtCtC 60 ccgggctgcg gcagggcagg gcggggagct ccgcgcacca acagagccgg ttctcagggc 120 gctttgctcc ttgttttttC CCCggttCtg ttttCtCCCC ttctccggaa ggcttgtcaa 180 ggggtaggag aaagagacgc aaacacaaaa gtggaaaaca g 221 <210> 25 <211> 158 <212> ADN
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<213> Homo sapiens <400> 26 ttaatgacca gccacgggcg tccctgctgt cagctctggc cgctgccttc cagggctccc 60 gagccacacg ctgggggtgc tggctgaggg aacatggcat gttggcctca gctgaggttg 120 ctgctgtgga agaacctcac tttcagaaga agacaaaca 159 <210> 27 <211> 1269 <212> ADN
<213> Homo sapiens <400> 27 3$ gtaagtatcagatcaggttttctttccaaacttgtcagttaatccttttccttcctttct60 tgtcctctggagaattttgaatggctggatttaagtgaagttgtttttgtaaatgcttgt120 gtgatagagtctgcagaatgagggaagggagaattttggagaatttggggtatttggggt180 atccatcacctcgagtatttatcatttctgtatgttgtgaacatttcaagtcctgtctgc240 _ tagctattttggaatatactatatgttgttaatgatatcatgcagcagacgtgcatctga300 atgggctggctctaggagctagagggtaggggctggcacaaagatgcatgctggaagggt360 ccttgcccataagaagctgacagccaaggctaggggagttCtgtcttctctgcatcaggt420 CaCCtCtCtCaCCtCtgtCaCtgCCCCatCagaCtaCaatgtCtgCaggtCtttCtCCCC480 tgagtgtgagctccctgagcaaagcaggatgctgccccttCCCtttgtattCCtggCtCC540 tggcttcagtgcctggacataagtatgggcataataagtgtcccccaaatgagacattga600 45 ggattcttcaaatgcacaggaccgtgatgtgagttaggacggagtaaggacgatgggatg660 tggctcaggacaatcctgaggaagctgcagctgcggcacgcagggccacactgtcatgtt720 catggaccctagactggctttgtagcctccatgggccccttccatacacaaatattaaaa780 attatatttcatgactgcattggtataaagatgaatataatccagaccagattcatgatt840 attcatacatttttagtgtattaacttttaattctgcttttaaaataaattaaaacattc900 taatatgcccttaagagtatcccaggcccaggccactgagcctactgtggttcatggata960 agttggccctgggggcatgtgtgtgcatgcatgtgtgtgcacatgcatgatgagccgggc1020 cttgaagggtggtaagatttgggtgtgtagaccaatggagaaaggcatttggggcagtga1080 tgatgggtgggggagggaacatggtgatgaatggagctgggtgtggggagccatgggagt1140 gggttagggccagcctgtggaggacctgggagccaggctgagttctatgcacttggcagt1200 $$ cacttctgtaaagcagcagaggcagttggcatagctaaagcctttcgccttttcttgcac1260 cctttacag 1269 <210> 28 <211> 951 <212> ADN .

<213> Homosapiens <400> 28 C)5 gtaagtaaaa accttctctg catctgttta taattggaaa ttgacctgca ccagggaaag 60 agagtagccc aggtgtctgg ggcttgttcc cattagatct tccccaaggg gtttttctcc 120 ttggtggctg gcctgtgggg CCCCtCtCCa ggaggcattg gtgaagaaac taggggagct 180 ggttgccaca gacagtgatg tactaatctt ctctgggaag acagaagaaa agtccccagg 240 gaagaatact acagacttgg ccttagggac agctaggggt gcagattgct gccaactgca 300 ttttttctga agttggccat atggttgcag tgaatggatt tatagacaga gtatttctgt 360

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<213> Homo sapiens <400> 33

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<213> Homosapiens <400> 108 gtaattgcgagcgagagtgagtggggccgggacccgcagagCCgagCCgaCCCttCtC'tC60 CCgggctgcggcagggcagggcggggagctccgcgcaccaacagagccggttctcagggc120 $5 gctttgctccttgttttttCCCCggttCtgttttCtCCCCttctccggaaggcttgtcaa180 ggggtaggagaaagagacgcaaacacaaaagtggaaaacagttaatgaccagccacggcg240 tccctgctgtgagctctggccgctgccttccagggctcccgagccacacgctgggggtgc300 tggctgagggaacatggcttgttggcctcagctgaggttgctgctgtggaagaacctcac360 tttcagaagaagacaaacatgtcagctgctgctggaagtggcctggcctctatttatctt420 cctgatcctgatctctgttcggctgagctacccaccctatgaacaacatgaatgccattt480 tccaaataaagccatgccctctgcaggaacacttccttgggttcaggggattatctgtaa540 tgccaacaacccctgtttccgttacccgactcctggggaggctcccggagttgttggaaa600 ctttaacaaatccattgtggctcgcctgttctcagatgctcggaggcttcttttatacag660 ccagaaagacaccagcatgaaggacatgcgcaaagttctgagaacattacagcagatcaa720 6S gaaatccagctcaaacttgaagcttcaagatttcctggtggacaatgaaaccttctctgg780 gttcctgtatcacaacctctctctcccaaagtctactgtggacaagatgctgagggctga840 tgtcattctccacaaggtatttttgcaaggctaccagttacatttgacaagtctgtgcaa900 tggatcaaaatcagaagagatgattcaacttggtgaccaagaagtttctgagctttgtgg960 cctaccaagggagaaactggctgcagcagagcgagtacttcgttccaacatggacatcct1020 gaagccaatcctgagaacactaaactctacatctcccttcccgagcaaggagctggccga1080 agccacaaaaacattgctgcatagtcttgggactctggcccaggagctgttcagcatgag1140 aagctggagtgacatgcgacaggaggtgatgtttctgaccaatgtgaacagctccagctc1200 ctccacccaaatctaccaggctgtgtctcgtattgtctgcgggcatcccgagggaggggg1260 gctgaagatcaagtctctcaactggtatgaggacaacaactacaaagccctctttggagg1320 S caatggcactgaggaagatgctgaaaccttctatgacaactctacaactccttactgcaa1380 tgatttgatgaagaatttggagtctagtcctctttcccgcattatctggaaagctctgaa1440 gccgctgctcgttgggaagatcctgtatacacctgacactccagccacaaggcaggtcat1500 ggctgaggtgaacaagaccttccaggaactggctgtgttccatgatctggaaggcatgtg1560 ggaggaactcagccccaagatctggaccttcatggagaacagccaagaaatggaccttgt1620 ccggatgctgttggacagcagggacaatgaccacttttgggaacagcagttggatggctt1680 agattggacagcccaagacatcgtggcgtttttggccaagcacccagaggatgtccagtc1740 cagtaatggttctgtgtacacctggagagaagctttcaacgagactaaccaggcaatccg1800 gaccatatctcgcttcatggagtgtgtcaacctgaacaagctagaacccatagcaacaga1860 agtctggctcatcaacaagtccatggagctgctggatgagaggaagttctgggctggtat1920 1$ tgtgttcactggaattactccaggcagcattgagctgccccatcatgtcaagtacaagat1980 ccgaatggacattgacaatgtggagaggacaaataaaatcaaggatgggtactgggaccc2040 tggtcctcgagctgacccctttgaggacatgcggtacgtctgggggggcttcgcctactt2100 gcaggatgtggtggagcaggcaatcatcagggtgctgacgggcaccgagaagaaaactgg2160 tgtctatatgcaacagatgccctatccctgttacgttgatgacatctttctgcgggtgat2220 gagccggtcaatgcccctcttcatgacgctggcctggatttactcagtggctgtgatcat2280 caagggcatcgtgtatgagaaggaggcacggctgaaagagaccatgcggatcatgggcct2340 ggacaacagcatcctctggtttagctggttcattagtagcctcattcctcttcttgtgag2400 cgctggcctgctagtggtcatcctgaagttaggaaacctgctgccctacagtgatcccag2460 cgtggtgtttgtcttcctgtccgtgtttgetgtggtgacaatcctgcagtgcttcctgat2520 2$ tagcacactcttctccagagccaacctggcagcagcctgtgggggcatcatctacttcac2580 gctgtacctgccctacgtcctgtgtgtggcatggcaggactacgtgggcttcacactcaa2640 gatcttcgctagcctgctgtctcctgtggcttttgggtttggctgtgagtactttgccct2700 ttttgaggagcagggcattggagtgcagtgggacaacctgtttgagagtcctgtggagga2760 agatggcttcaatctcaccacttcggtctccatgatgctgtttgacaccttcctctatgg2820 ggtgatgacctggtacattgaggctgtctttccaggccagtacggaattcccaggccctg2880 gtattttccttgcaccaagtcctactggtttggcgaggaaagtgatgagaagagccaccc2940 tggttccaaccagaagagaatatcagaaatctgcatggaggaggaacccacccacttgaa3000 gctgggcgtgtccattcagaacctggtaaaagtctaccgagatgggatgaaggtggctgt3060 cgatggcctggcactgaatttttatgagggccagatcacctccttcctgggccacaatgg3120 3$ agcggggaagacgaccaccatgtcaatcctgaccgggttgttccccccgacctcgggcac3180 cgcctacatcctgggaaaagacattcgctctgagatgagcaccatccggcagaacctggg3240 ggtctgtccccagcataacgtgctgtttgacatgctgactgtcgaagaacacatctggtt3300 ctatgcccgcttgaaagggctctctgagaagcacgtgaaggcggagatggagcagatggc3360 cctggatgttggtttgccatcaagcaagctgaaaagcaaaacaagccagctgtcaggtgg3420 aatgcagagaaagctatctgtggccttggcctttgtcgggggatctaaggttgtcattct3480 ggatgaacccacagctggtgtggacccttactcccgcaggggaatatgggagctgctgct3540 gaaataccgacaaggccgcaccattattctctctacacaccacatggatgaagcggacgt3600 cctgggggacaggattgccatcatctcccatgggaagctgtgctgtgtgggctcctccct3660 gtttctgaagaaccagttgggaacaggctactacctgaccttggtcaagaaagatgtgga3720 4$ atcctccctcagttcctgcagaaacagtagtagcactgtgtcatacctgaaaaaggagga3780 cagtgtttctcagagcagttctgatgctggcctgggcagcgaccatgagagtgacacgct3840 gaccatcgatgtctctgctatctccaacctcatcaggaagcatgtgtctgaagcccggct3900 ggtggaagacatagggcatgagctgacctatgtgctgccatatgaagctgctaaggaggg3960 agcctttgtggaactctttcatgagattgatgaccggctctcagacctgggcatttctag4020 50 ttatggcatctcagagacgaccctggaagaaatattcctcaaggtggccgaagagagtgg4080 ggtggatgctgagacctcagatggtaccttgccagcaagacgaaacaggcgggccttcgg4140 ggacaagcagagctgtcttcgcccgttcactgaagatgatgctgctgatccaaatgattc4200 tgacatagacccagaatccagagagacagacttgctcagtgggatggatggcaaagggtc4260 ctaccaggtgaaaggctggaaacttacacagcaacagtttgtggccettttgtggaagag4320 ~

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<213> Homo sapiens <400> 117 gtaattgcga gcgagagtga gtggggccgg gacccgcaga gCCgagCCga CCCttCtCtC 60 DEMANDE OU BREVET VOLUMINEUX
LA PRÉSENTE PARTIE DE CETTE DEMANDE OU CE BREVET COMPREND
PLUS D'UN TOME.

CONTENANT LES PAGES 1 Ä 177 NOTE : Pour les tomes additionels, veuillez contacter le Bureau canadien des brevets JUMBO APPLICATIONS/PATENTS

VOLUME

NOTE: For additional volumes, please contact the Canadian Patent Office NOM DU FICHIER / FILE NAME
NOTE POUR LE TOME / VOLUME NOTE:

Claims (38)

REVENDICATIONS

1. Acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID N° 24-126 et 137-158, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

2. Acide nucléique dérivé d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID N° 24-126 et 137-158, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

3. Acide nucléique comprenant au moins 9 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID
N° 24-126, ou un acide nucléique de séquence complémentaire, et comprenant un polymorphisme choisi dans le groupe constitué par i) un A nommés s-m39i3, s-53e5, s-113e6, s-135e8, s-24i13, s-148e14, s-81i14, s-115i14, s-196e15, s-136e16, s-18i19, s-m65i22, s-149e24, s-44e27, s-7e30, s-62e34, s-m74i34, s-77e36, s-2843e49, ii) un T nommés s-25i4, s-123e8, s-m13i9, s-126e12, s-m59i13, s-4e18, s-40e19, s-m10i19, s-123e22, s-149i23, s-m50i23, s-166e30, s-m142i32, s-m119i40, s-114e45, s-m34i45, s-833e49, s-1580e49, s-1791e49, s-2049e49, iii) un G nommés s-35e1a, s-108e6, s-m89i8, s-m104i9, s-m29i12, s-107e17, s-m68i17, s-98e24, s-30i31, s-251i39, s-13i47, s-2034e49, s-2449e49, iv) un C nommés s-76e1b, s-27e17, s-60i17, s-54e23, s-m26i32, s-55i36, s-64e38, s-252i39, s-m69i44, s-86i47, s-377e49, v) une délétion nommée s-m41i9, et vi) une insertion nommées s-16e1b, s-m14i7, s-m61i9, s-m130i32.

4. Acide nucléique comprenant au moins 9 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID
NO : 137-158, ou un acide nucléique de séquence complémentaire, et comprenant, par rapport à la séquence promotrice du gène ABCA1 SEQ ID NO : 23, un polymorphisme choisi dans le groupe constitué par i) un A en positions 505, 1642, 2091, ii) un T en positions 1093, 1499, 1677, 1795, 2330, 2592, 2880, iii) un G en positions 1080, 1242, 1954, iv) un C en positions 1388, 2487, 2616, 2795, v) une insertion de GGAGGGGAGG en position 717, une insertion AT en position 1859, et vi) une délétion de TTTG en position 2117, une délétion de TTTGTTTGT en position 2121, et une délétion de CACCC en position 2671.

5. Acide nucléique comprenant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynuléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ
ID
NO : 24-126 ou un acide nucléique de séquence complémentaire, et comprenant un polymorphisme choisi dans le groupe constitué par i) un A nommés s-m39i3, s-53e5, s-113e6, s-135e8, s-24i13, s-148e14, s-81i14, s-115i14, s-196e15, s-136e16, s-18i19, s-m65i22, s-149e24, s-44e27, s-7e30, s-62e34, s-m74i34, s-77e36, s-2843e49, ii) un T nommés s-25i4, s-123e8, s-m13i9, s-126e12, s-m59i13, s-4e18, s-40e19, s-m10i19, s-123e22, s-149i23, s-m50i23, s-166e30, s-m142i32, s-m119i40, s-114e45, s-m34i45, s-833e49, s-1580e49, s-1791e49, s-2049e49, iii) un G nommés s-35e1a, s-108e6, s-m89i8, s-m104i9, s-m29i12, s-107e17, s-m68i17, s-98e24, s-30i31, s-251i39, s-13i47, s-2034e49, s-2449e49, iv) un C nommés s-76e1b, s-27e17, s-60i17, s-54e23, s-m26i32, s-55i36, s-64e38, s-252i39, s-m69i44, s-86i47, s-377e49, v) une délétion nommée s-m41i9, et vi) une insertion nommées s-16e1b, s-m14i7, s-m61i9, s-m130i32.

6. Acide nucléique comprenant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID
NO : 137-158 ou un acide nucléique de séquence complémentaire et comprenant, par rapport à la séquence promotrice du gène ABCA1 SEQ ID NO: 23, un polymorphisme choisi dans le groupe constitué par i) un A en positions 505, 1642, 2091, ii) un T en positions 1093, 1499, 1677, 1795, 2330, 2592, 2880, iii) un G en positions 1080, 1242, 1954, iv) un C en positions 1388, 2487, 2616, 2795, v) une insertion de GGAGGGGAGG en position 717, une insertion AT en position 1859, et v1) une délétion de TTTG en position 2117, une délétion de TTTGTTTGT en position 2121, une délétion de CACCC en position 2671.

7. Acide nucléique comprenant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID
NO : 24-126 ou un acide nucléique de séquence complémentaire, et comprenant un base polymorphe localisée au centre du fragment de 21 nucleotides et choisie dans groupe constitué par i) un A nommés s-m39i3, s-53e5, s-113e6, s-135e8, s-24i13, s-148e14, s-81i14, s-115i14, s-196e15, s-136e16, s-18i19, s-m65i22, s-149e24, s-44e27, s-7e30, s-62e34, s-m74i34, s-77e36, s-2843e49, ii) un T nommés s-25i4, s-123e8, s-m13i9, s-126e12, s-m59i13, s-4e18, s-40e19, s-m10i19, s-123e22, s-149i23, s-m50i23, s-166e30, s-m142i32, s-m119i40, s-114e45, s-m34i45, s-833e49, s-1580e49, s-1791e49, s-2049e49, iii) un G nommés s-35e1a, s-108e6, s-m89i8, s-m104i9, s-m29i12, s-107e17, s-m68i17, s-98e24, s-10i31, s-251i39, s-13i47, s-2034e49, s-2449e49, iv) un C nommés s-76e1b, s-27e17, s-60i17, s-54e23, s-m26i32, s-55i36, s-64e38, s-252i39, s-m69i44, s-86i47, s-377e49, v) une délétion nommée s-m41i9, et vi) une insertion nommées s-16e1b, s-m14i7, s-m61i9, s-m130i32.

8. Acide nucléique comprenant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID
NO : 137-158 ou un acide nucléique de séquence complémentaire, et comprenant une base polymorphe localisée au centre dudit fragment de 21 nucleotides et choisie dans groupe constitué par i) un A en positions 505, 1642, 2091, ii) un T en positions 1093, 1499, 1677, 1795, 2330, 2592, 2880, iii) un G en positions 1080, 1242, 1954, iv) un C
en positions 1388, 2487, 2616, 2795, v) une insertion de GGAGGGGAGG en position 717, une insertion AT en position 1859, vi) une délétion de TTTG en position 2117, une délétion de TTTGTTTGT en position 2121, et une délétion de CACCC en position 2671, par rapport à la séquence promotrice du gène ABCA1 SEQ ID NO : 23

9. Acide nucléique hybridant dans des conditions de forte stringence, avec un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID
No 24-126 et 137-158, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

10. Acide nucléique codant poux un polypeptide choisi dans le groupe constitué des séquences peptidiques SEQ ID NO : 127-136.

11. Acide nucléique comprenant:
a) un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 137-158; et b) un polynucléotide codant pour un polypeptide ou un acide nucléique d'intérêt.

12. Polypeptide ABCA1 polymorphe, caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi dans le groupe des polypeptides de séquence d'acides aminés SEQ
ID NO: 127-136.

13. Sonde ou amorce nucléotidique spécifique du gène ABCA1 comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 3 à 9, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

14. Sonde ou amorce selon la revendication 13, utile pour la détection d'un polymorphisme dans le gène ABCA1, d'une longueur d'au moins 15 nucléotides.

15. Sonde ou amorce nucléotidique amorce selon la revendication 13, utile pour la détection d'un polymorphisme dans le gène ABCA1, d'une longueur d'au moins 21 nucléotides.

16. Sonde nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé marqueur dont la présence est détectable.

17. Amorce nucléotidique selon l'une des revendications 13 à 15 la base de l'extrémité 3' de la dite amorce étant complémentaire du nucléotide localisé
immédiatement du côté 3' de la base polymorphe de l'une des séquences SEQ ID
NO
24-126 et 137-158 ou de leurs séquences complémentaires.

18. Amorce nucléotidique selon la revendication 17, la base de l'extrémité 3' de la dite amorce étant complémentaire d'un nucléotide situé à 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 nucléotides ou plus du côté 3' de la position du polymorphisme de l'une des séquences SEQ 117 NO 24-126 et 137-158 ou de leurs séquences complémentaires.

19. Marqueur génétique comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 3 à 9, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.

20. Procédé pour la détection d'un acide nucléique selon la revendication 1 ou 2 dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de:
a) mise en contact de l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la position polymorphe cible à amplifier de l'acide nucléique selon la revendication 1 ou 2 en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification; et b) détection des acides nucléiques amplifiés.

21. Procédé de détection selon la revendication 20, caractérisé en ce que les amorces nucléotidiques sont choisies parmi les amorces selon l'une des revendications 13 à 18.

22. Nécessaire pour la détection d'un acide nucléique selon la revendication 1 ou 2 comprenant:
a) un couple d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la position polymorphe cible à
amplifier de l'acide nucléique la revendication 1 ou 2;
b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.

23. Nécessaire pour l'amplification d'un acide nucléique selon la revendication 22, caractérisé en ce que les amorces nucléotidiques sont choisies dans le groupe constitué des amorces selon l'une des revendications 13 à 18.

24. Procédé de détection de la présence d'un polymorphisme du gène ABCA1 chez un sujet, ladite méthode comprenant les étapes consistant à:
a) séquencer, à partir d'un matériel biologique provenant du sujet à tester, tout ou une partie du gène ABCA1, à l'aide d'une amorce nucléotidique selon l'une des revendications 13 à 18;
b) aligner la séquence nucléotidique obtenue en a) avec une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID N o 1 et 3-23;
c) déterminer les différences nucléotidiques entre le polynucléotide séquencé
provenant du matériel biologique du sujet à tester et les séquences SEQ ID NO
: 1 et 3-23 de référence.

25. Kit ou nécessaire pour la détection de la présence d'un polymorphisme du gène ABCA1 chez un sujet, comprenant les moyens nécessaires au séquençage de tout ou partie de l'acide nucléique correspondant au gène ABCA1 aux positions polymorphes de l'acide nucléique selon la revendication 1 ou 2.

26. Procédé de détection de la présence d'un polymorphisme du gène ABCA1 chez un sujet, ladite méthode comprenant les étapes de:

a) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléiques selon l'une des revendications 13 à 16 avec l'échantillon provenant du sujet à tester;

b) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.

27. Procédé de détection selon la revendication 26, caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.

28. Nécessaire pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon la revendication 1 ou 2 dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant:

a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'une quelconque des revendications 13 à 16;

b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.

29. Nécessaire de détection selon la revendication 28, caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.

30. Procédé de diagnostic d'un risque d'infarctus du myocarde chez un sujet, consistant à détecter par un procédé selon l'une des revendications 24, 26 ou 27, la présence chez ledit sujet d'un acide nucléique comprenant un polynucléotide de séquence SEQ ID NO : 72 ou 115, et comprenant une base polymorphe A en position 5382 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 15.

31. Procédé de diagnostic d'un risque d'affection cardiovasculaire chez un sujet, consistant à détecter par un procédé selon l'une des revendications 24, 26 ou 27, la présence chez ledit sujet d'un acide nucléique comprenant un polynucléotide de séquence SEQ ID NO : 72 ou 115, et comprenant une base polymorphe A en position 5382 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 15.

32. Vecteur de clonage et/ou d'expression recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 11.

33. Cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 11 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 32.

34. Mammifère transgénique non humain dont les cellules somatiques et/ou les cellules germinales ont été transformées par un acide nucléique selon la revendication 1 à 11 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 32.

35. Anticorps dirigé contre un polypeptide ABCA1 polymorphe selon la revendication 12, ou un fragment peptidique de ce dernier.

36. Anticorps selon la revendication 35, caractérisé en ce qu'il comprend un composé détectable.

37. Procédé pour détecter la présence d'un protéine ABCA1 polymorphe selon la revendication 12 dans un échantillon, comprenant les étapes de:
a) mise en contact de l'échantillon avec un anticorps selon l'une des revendications 35 ou 36;
b) détection du complexe antigène/anticorps formé .

38. Nécessaire de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide selon la revendication 12 dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant:
a) un anticorps selon l'une des revendications 35 ou 36;
b) un réactif permettant la détection des complexes antigènes/anticorps formés.