WO2002036770A2 - Sequences polymorphes du gene humain abca1, leurs utilisations, les methodes et kits de detection - Google Patents

Sequences polymorphes du gene humain abca1, leurs utilisations, les methodes et kits de detection Download PDF

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Marie-Françoise ROSIER
Isabelle Arnould-Reguigne
Nicolas Duverger
François CAMBIEN
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to polymorphisms of the human ABCAl gene and the new polypeptide alleles encoded by the different sequences exhibiting allelic variations.
  • the invention also relates to methods and kits for the analysis of allelic variations in the human ABCAl gene, and the use of the ABCAl polymorphism for the diagnosis and treatment of cardiovascular conditions such as the risk of myocardial infarction. , atherosclerosis, and Tangier's disease.
  • ABCAl is a member of the ABC transporter protein superfamily
  • the members of this transporter family which, on the one hand, are extremely conserved during evolution, from bacteria to humans, on the other hand have a common general structure characterized by two nucleotide binding folds (Nucleotide Binding Fold or NBF) with Walker motifs A and B as well as two transmembrane domains, each of the transmembrane domains consisting of several helices.
  • NBF Nucleotide Binding Fold
  • the specificity of the ABC transporters for the different molecules transported appears to be determined by the structure of the transmembrane domains, while the energy necessary for the transport activity is provided by the degradation of ATP at the level of NBF folding.
  • LDLs Low Density Lipoprotein
  • HDLs High Density Lipoprotein
  • the LDLs supply the tissues with cholesterol whereas, on the contrary, the HDLs drive the excess cholesterol formed in the tissues to the liver.
  • cholesterol is acylated by transfer of lecithin fatty acids by the action of the enzyme phosphatidyl-sterol-acyltransferase (LCAT).
  • LCAT phosphatidyl-sterol-acyltransferase
  • LDLs and HDLs lipoprotein complexes which therefore intervene respectively in the cholesterol influx and efflux mechanisms, from the liver to the tissues or vice versa, have a spherical structure of different density, which consists essentially of a core of non-polar lipids made up of triacylglycerols and cholesterol esters, and a crown made up of apolipoproteins and amphiphilic lipids.
  • a first so-called passive pathway promotes the efflux of cholesterol from the plasma membrane to HDLs
  • the second pathway is energy-dependent, and in particular uses apolipoprotein AI (Apo-AI) from nascent HDLs, which is probably recognized and binds to membrane receptors cells in order to allow the translocation of excess cholesterol to the HDLs particles (Rothblat et al. J. Lipid. Res. (1999) 40 (5) 781-96).
  • fibroblasts and macrophages are the site of an active translocation of cholesterol using apolipoproteins poor in lipids such as ApoA-I, ApoA-IL and Apo-E (Yokoyama S., Biochim. Biophys Acta (1998) 1392 (1), 1-15; Takahashi et al., PNAS (1999) 96 (20), 11358-63).
  • HDL metabolism Family disorders linked to HDL metabolism are also characterized by a low concentration of HDL particles, and are most often detected in patients affected by coronary heart disease (Marcil et al., The Lancet (1999) 354 (9187), 1341-6). This cardio-protective effect of HDL is probably explained by its involvement in the transport of cholesterol from peripheral tissues to the liver (Bruce et al. Annu. Rev. Nutr. (1998) 18, 297-3130).
  • the ABCAl gene product is likely to play a role in regulating the cellular metabolism of cholesterol and in the reverse transport of cholesterol and phospholipids.
  • the ABCAl gene is a key gene in the active path of translocation of cholesterol from cells to HDL.
  • the transporter ABCAl is mutated in patients affected in the reverse transport of cholesterol, and in particular in patients suffering from both Tangier's disease and familial HDL deficiency (Lawn et al, J. Clin. Invest. (1999) 104 (8) 125-31; Bodzioch et al, N ⁇ t. Genêt. (1999) 22 (4), 347-51; Orso et al., Nat. Genêt. (2000) 24 (2), 192-6).
  • the human ABCAl gene was recently cloned and characterized and is described in particular in applications PCT / FROO / 01595, EP99402668, and by Santamarina-Fojo et al, PNAS (2000) 97 (14), 7987-7992). It has a total size of 149kb, and includes a promoter sequence of 1.453kb, coding and intronic sequences of 146.581 kb, and a 3 'region of lkb. It consists of 50 exons and therefore 49 introns.
  • Exon 1 code for the 5 'untranslated end (5' UTR) is followed by a large intron 24,156 kb in length, and exon 2 contains the remaining part of the 5 'UTR end, and code for the first 21 amino acids of the N-terminus of the ABCAl protein.
  • the ABCAl gene codes for the transporter protein ABCAl of 2261 amino acids.
  • TATAAAAG TATA box 33 bp upstream of the transcription initiation site
  • numerous ubiquitous transcription factor binding sites such as SP1 , NF-kB, activator proteins (AP-1, -2, and -4), and three E-box motifs (5'-CANNTG- 3 '), as well as several hepatocyte nuclear factor (HNF) binding sites -3 ⁇ .
  • the applicants have surprisingly and unexpectedly discovered a number of polymorphisms in the human gene coding for the transporter ABCAl.
  • the applicants have also discovered a statistically significant correlation between the presence of certain allelic polymorphisms of the ABCAl gene and the predisposition of a subject to develop a coronary pathology, such as in particular a risk of myocardial infarction.
  • the present invention therefore relates to isolated nucleic acids coding for polymorphic variants of the human ABCAl transporter, capable of being linked with a coronary risk, such as a risk of myocardial infarction, of cardiovascular disease or more generally any condition due to HDL deficiency.
  • the present invention also relates to the polymorphic polypeptide sequences of the human ABCAl transporter produced by the allelic forms of ABCAl.
  • the subject of the present invention is recombinant vectors comprising these nucleic acids, cells comprising the vectors, and methods for producing variant polypeptides obtained by culturing the cells under conditions allowing the expression of these polypeptides.
  • the subject of the present invention is appropriate means of detection, probes or primers, specific for some of these polymorphisms in the human gene ABCAl, capable of being associated with coronary risks, such as for example a risk of myocardial infarction, or to a particular pharmacological response to a therapeutic molecule.
  • the present invention also relates to a method and kits for detecting a sequence of polymorphisms at the level of the ABCAl transporter sequence of a human subject, and consists in (i) isolating a DNA sample from said subject, (ii) amplifying the regions containing the ABCAl gene, (iii) determining the presence or absence of one or more polymorphisms at the level of the amplified DNA region.
  • Such polymorphisms can be linked to other polymorphisms in a polymorphic profile, which is associated with a predisposition to a disease or to a metabolic disorder.
  • the present invention relates to a method for diagnosing the risk of a cardiovascular condition in a patient.
  • the method consists in comparing two polymorphic profiles.
  • the first profile is that of the patient to be tested, and the second is a reference polymorphic profile which is derived from a population of control individuals with a predetermined cardiovascular or coronary risk such as for example a risk of infarction myocardium.
  • the comparison between the test and control polymorphic sequences gives a good indication of the risk factor of the subject having an ABCAl polymorphic sequence.
  • nucleic acid refers to polymers containing purine and pyrimidine bases. These are polyribonucleotides, polydeoxyribonucleotides, or mixed polyribo-polydeoxyribomicleotide polynucleotides.
  • the nucleic acids include the single and double stranded molecules, of the DNA-DNA, DNA-RNA, and RNA type, or the “protein nucleic acids” (PNA) formed by conjugation of bases to an amino acid skeleton. Nucleic acids also include molecules comprising modified bases and analogous phosphodiester linkages, such as phosphorothioates and thioesters.
  • nucleic acid in particular DNA, RNA molecules, refers only to a primary or secondary structure of the molecule, and is not limited by a particular tertiary configuration. Therefore, the term includes double stranded DNA, which is found among others in linear or circular DNA molecules (in restriction fragments), plasmids, and chromosomes. The structure of double stranded DNA molecules are described using conventional direction, i.e. 5 '->3' of the non-transcribed strand of DNA or sense strand (having an RNA homologous sequence).
  • a recombinant DNA molecule is a DNA molecule that has been subjected to molecular biology manipulations.
  • nucleic acid or an“ isolated ”polypeptide within the meaning of the present invention means a nucleic acid or a polypeptide which has been removed from its environment of natural origin.
  • An isolated nucleic acid or polypeptide contains less than about 50%, preferably less than 75%, and even more preferably less than 90% of cellular components.
  • a nucleic acid or a derived polypeptide sequence corresponds to a region of a particular designated sequence, and includes for nucleic acids, the sequences which are identical or complementary.
  • nucleotide sequence can be used to designate either a polynucleotide or a nucleic acid, encompasses the genetic material itself, and is therefore not limited to the information containing its sequence.
  • oligonucleotide refers to a nucleic acid, generally comprising at least 10, preferably 15, and more preferably at least 20 nucleotides, which is capable of hybridizing to a DNA molecule genomics, to an mRNA molecule encoding a gene, to a cDNA, or any other molecule of interest.
  • the oligonucleotides can be labeled, for example with 32 P nucleotides, or nucleotides to which are fixed by covalent bond, a fluorescent marker, or a marker such as biotin.
  • the oligonucleotide can be a probe capable of detecting the presence of a nucleic acid.
  • Toligonucleotide can be a PCR primer, and can be used to clone the complete sequence or a fragment of a gene of interest.
  • the oligonucleotide can further form a triple helix with a double strand sequence of interest on a DNA molecule.
  • a library of oligonucleotides can be attached to a solid support in order to detect different polymorphisms of interest.
  • oligonucleotides are synthetic, and may include phosphodiester linkages or thioester linkages.
  • a probe refers to a nucleic acid or an oligonucleotide capable of hybridizing to a sequence on a target nucleic acid due to the complementarity of at least part of the probe with a sequence of the target nucleic acid. This probe is generally labeled in order to be detectable after hybridization.
  • a nucleic acid molecule hybridizes to a nucleic acid molecule, such as a cDNA, genomic DNA, or RNA, when the single-stranded form of the nucleic acid molecule can stabilize with another molecule single-stranded nucleic acid according to the appropriate temperature and ionic strength conditions of the hybridization solution (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New - York). The temperature and ionic strength conditions determine the stringency of the hybridization.
  • Low stringency conditions are used for preliminary screening of nucleic acids (temperature equal to 55 ° C., 5XSSC at 0.1% SDS, 0.25% milk, without formamide; or 30% formamide, 5XSSC at 0, 5% SDS).
  • the hybridization temperature is calculated by the equations described in Sambrook et al.
  • the position of the mismatches is important, and the length of the oligonucleotide determines its specificity. This generally has a minimum length of 10 nucleotides, preferably at least 15 nucleotides, and even more preferably 20 nucleotides.
  • hybridization conditions described above are suitable for hybridization under high stringency conditions, of a nucleic acid molecule of variable length from 20 nucleotides to several hundred nucleotides.
  • the suitable hybridization conditions can for example be adapted according to the teaching contained in the work of HAMES and HIGGINS (Eds., (1985)
  • a gene refers to a nucleic acid sequence corresponding to a sequence present in the genome which comprises (i) the coding region, which comprises exons, introns, and sequences at the junction between exons and introns, and (ii) 5 'and 3' regulatory sequences of the coding region.
  • “ABCAl transporter” is understood to mean the ABCAl transporter protein having the cDNA of nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 (FIG. 1), and the peptide sequence SEQ ID NO: 2 (FIG. 2).
  • FIG. 1 nucleotide sequence SEQ ID NO: 1
  • FIG. 2 peptide sequence SEQ ID NO: 2
  • nucleotide polymorphism or SNP is meant the substitution, insertion or deletion of a single nucleotide in the nucleotide sequence of a gene between several individuals.
  • polymorphism When the polymorphism is in the form of an insertion or a deletion, it may be an insertion or a deletion of one or more nucleotides at a position of a gene.
  • the different nucleotide sequences of the same gene due to a polymorphism are alleles.
  • a "polymorphic position” is a predetermined position in the sequence of a gene that includes an SNP.
  • genetic polymorphisms cause a variation in the amino acid sequence, and therefore from a polymorphic position can result in a polymorphism in the amino acid sequence at a predetermined position in the polypeptide sequence.
  • An individual homozygous for a particular polymorphism carries on the two copies of the same gene, the same polymorphic sequence at the same position.
  • An individual heterozygous for a particular polymorphism relates to the two copies of the gene, different sequences at the level of the polymorphic position.
  • polymorphic profile is understood to mean one or more single nucleotide polymorphisms, which may be present in the sequence of a single gene or of a plurality of genes.
  • a simple polymorphic profile includes an SNP in a single position of one or two alleles of an individual (allelic polymorphism).
  • a polymorphic test profile corresponds to the characteristic polymorphism of an individual who is the subject of a diagnosis for example of a predisposition to a disease associated with a deficiency of the ABCAl gene, such as a metabolic deficiency of the FHD type or a condition cardiovascular, or a risk of myocardial infarction.
  • the reference or control polymorphic profile was determined by statistically significant correlation of the profiles in a population of individuals who present a coronary risk.
  • the present invention is based on the discovery of 90 polymorphisms in the sequence of the human gene ABCAl as represented in the sequences SEQ ID NO: 3-22, of which 22 SNPs are found in the promoter sequence upstream of the human ABCAl gene of SEQ ID NO: 23. Certain SNPs according to the present invention lead to structural alterations in the polypeptide sequence of the human ABCAl transporter protein represented at SEQ ID NO: 2.
  • PCR polymerase chain reactions
  • Table 2 shows the allelic polymorphisms in the exons and introns of the human ABCAl gene according to the present invention.
  • H indicates in particular the polymorphic position in each of the exons with respect to the first nucleotide of the reference exon, and in each of the introns with respect to the 3 'end or upstream of the 5' end of the most exon close, the 5 'and 3' sequences on either side of the polymorphic position, the frequency of appearance of the polymorphism in the three populations tested, African, Caucasian and Japanese. In cases where these frequencies could not be determined, it is indicated "nd".
  • polymorphisms are manifested by structural alterations in the peptide sequence of the human ABCAl transporter protein, and more precisely by the substitution of one amino acid for another (MIS).
  • Other polymorphisms in the exonic sequences are said to be silent (SEL), the protein sequence ABCAl remaining unchanged.
  • SEL silent
  • NAD non-coding
  • the s-35ela mutation consists in the substitution of a cytosine (C) by a guanine (G) at position 35 of exon la, that is to say at position 2928 with respect to the sequence SEQ ID NO: 3.
  • Exon the carrying this polymorphism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 24.
  • the cDNA carrying the polymorphism in exon la of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 92.
  • a first mutation is designated s-16elb and consists of the insertion of a guanine (G) at position 16 of exon lb, ie at position 115 relative to the sequence SEQ ID NO: 4.
  • Exon lb carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 25.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon lb of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 93.
  • a second mutation designated s-76elb consists in the substitution of a guanine (G) by a cytosine (C) in position 76 of exon lb, that is to say in position 175 with respect to the sequence SEQ ID NO: 4.
  • L exon lb carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 26.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon lb of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 94.
  • the s-m39i3 mutation consists of the substitution of a cytosine (C) into an adenine (A) position -39 of the 3 'end of intron 3, i.e. at position 10646 relative to the sequence SEQ ID NO: 5.
  • the nucleotide sequence of intron 3 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ ID NO: 27. Mutation in intron 4
  • the s-25i4 mutation consists of the substitution of a cytosine (C) in a thymidine (T) position 25 at the 5 'end of the intron 4, ie at position 10828 relative to the sequence SEQ ID NO: 5.
  • the partial nucleotide sequence of intron 4 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ ID NO: 28.
  • the s-53e5 mutation consists of the substitution of a guanine (G) in an adenine (A) position 53 of exon 5, that is to say position 306 with respect to the sequence
  • Exon 5 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 29.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 5 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 95.
  • the mutation designated s-108e6 consists of the substitution of an adenine (A) in a guanine (G) in position 108 of exon 6, that is to say in position 268 with respect to the sequence SEQ ID NO: 7.
  • the exon 6 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 30.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 6 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 96.
  • the mutation s-113e6 consists in the substitution of a guanine (G) in an adenine (A) in position 113 of exon 6, that is to say in position 273 with respect to the sequence SEQ ID NO: 7.
  • the sequence of exon 6 of the ABCAl gene carrying this polymo ⁇ hism is the polynucleotide of sequence SEQ ID NO: 31.
  • the mutated cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 6 is represented in the nucleotide sequence SEQ ID NO: 97, code for an ABCAl polypeptide varying with a length of 2261 amino acids, of sequence SEQ ID NO: 127.
  • the s-ml4i7 mutation consists of the insertion of an adenine (A) at position - 14 upstream of the 3 'end of intron 7, i.e. at position 589 relative to the sequence SEQ ID NO: 8
  • the partial nucleotide sequence of intron 7 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ ID NO: 32.
  • the mutation s-123e8 consists of the substitution of a cytosine (C) by a thymine (T) in position 123 of exon 8, that is to say in position 726 with respect to the sequence SEQ ID NO: 8.
  • Exon 8 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 33.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 8 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 98.
  • the s-135e8 mutation consists of the substitution of a guanine (G) by an adenine (A) at position 135 of exon 8, that is to say at position 738 with respect to the sequence SEQ ID NO: 8.
  • Exon 8 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 34.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 8 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 99.
  • the s-m89i8 mutation consists of the substitution of an adenine (A) by a guanine (G) in position -89 upstream of the 3 'end of intron 8, i.e. at position 525 relative to the sequence SEQ ID NO: 9.
  • the partial nucleotide sequence of intron 8 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the nucleotide sequence SEQ ID NO .- 35.
  • the mutation s-ml04i9 consists of the substitution of an adenine (A) by a guanine (G) in position -104 upstream of the 3 'end of intron 9, that is to say position 981 with respect to the sequence SEQ ID NO: 9.
  • the partial nucleotide sequence of intron 9 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the nucleotide sequence SEQ ID NO: 36.
  • the mutation s-m61i9 consists of an insertion of a guanine (G) in position -61 upstream from the 3 'end of intron 9, ie at position 1023 relative to the sequence SEQ ID NO: 9.
  • the sequence partial nucleotide of intron 9 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ ID NO: 37.
  • the mutation s-m41i9 consists of a deletion of a fragment of three "CTC" nucleotides from the nucleotide in position - 1 to the nucleotide - 43 upstream of the 3 'end of intron 9, ie in position 1042-4044 relative to the sequence
  • SEQ ID NO: 9 The partial nucleotide sequence of intron 9 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the nucleotide sequence SEQ ID NO: 38.
  • the s-ml3i9 mutation consists of the substitution of a cytosine (C) by a thymine (T) in position -13 upstream of the 3 'end of intron 9, ie at position 1072 relative to the sequence SEQ ID NO: 9.
  • the partial nucleotide sequence of intron 9 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the nucleotide sequence SEQ ID NO: 9.
  • the mutation s-126el2 consists in the substitution of a cytosine (C) in a thymine (T) in position 126 of exon 12, that is to say in position 765 with respect to the sequence SEQ ID NO: 10.
  • Exon 12 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 40.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 12 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 100.
  • the s-m29il2 mutation consists of the substitution of an adenine (A) by a guanine (G) in position -29 upstream of the 3 'end of intron 12, i.e. at position 1337 relative to the sequence SEQ ID NO: 10.
  • the nucleotide sequence of intron 12 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ ID NO:
  • the s-24il3 mutation consists of the substitution of a thymine (T) by an adenine (A) at position 24 of the 5 'end of intron 13, i.e. at position 1566 relative to the sequence SEQ ID NO : 10.
  • the nucleotide sequence of intron 13 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the nucleotide sequence SEQ ID NO:
  • the s-m59il3 mutation consists of the substitution of a cytosine (C) by a thymma (T) in position -59 upstream of the 3 'end of intron 13, ie at position 3270 relative to the sequence SEQ ID NO: 10.
  • the nucleotide sequence of intron 13 carrying this polymo ⁇ hism has the sequence SEQ ID NO: 43.
  • the mutation s-148el4 consists of the substitution of a cytosine (C) by an adenine (A) in position 148 of exon 14, that is to say in position 3476 with respect to the sequence SEQ ID NO: 10.
  • Exon 14 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 44.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 14 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 101.
  • the s-81il4 mutation consists of the substitution of a guanine (G) by an adenine (A) at position 81 of the 5 'end of intron 14, i.e. at position 3632 relative to the sequence SEQ ID NO : 10.
  • the nucleotide sequence of intron 14 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ ID NO: 45.
  • the mutation s-115il4 consists of the substitution of a cytosine (C) by an adenine (A) in position 115 of the 5 'end of intron 14, that is to say in position 3666 with respect to the sequence SEQ ID NO : 10.
  • Intron 14 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 46.
  • the mutation s-196el5 consists in the substitution of a guanine (G) by an adenine (A) in position 196 of exon 15, that is to say in position 5492 with respect to the sequence SEQ ID NO: 10.
  • Exon 15 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 47.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 15 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 102, and codes for a mutated ABCAl protein SEQ ID NO : 128 in which a valine (V) is substituted by a methionine (M) at position 771.
  • the mutation s-136el6 consists in the substitution of a guanine (G) by an adenine (A) in position 136 of exon 16, that is to say in position 6714 with respect to the sequence SEQ ID NO: 10.
  • Exon 16 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 48.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 16 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 103, and codes for a mutated ABCAl protein of sequence SEQ ID NO: 129, which includes the substitution of a valine (V) for isoleucine (I) in position 825.
  • the mutation s-27el7 consists of the substitution of a thymine (T) by a cytosine (C) at position 27 of exon 17, that is to say at position 7914 relative to the sequence SEQ ID NO: 10.
  • Exon 17 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 49.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 17 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 104, and codes for a mutated ABCAl protein SEQ ID NO : 130 in which a tyrosine (Y) is substituted by a proline (P) at position 857.
  • the mutation s-107el7 consists in the substitution of an adenine (A) by a guanine (G) in position 107 of exon 17, that is to say in position 7994 with respect to the sequence SEQ ID NO: 10.
  • Exon 17 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 50.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 17 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 105, and codes for a mutated ABCAl protein SEQ ID NO : 131 in which an isoleucine (I) is substituted by a methionine (M) at position 883. Mutations in the intron 17
  • the s-60il7 mutation consists of the substitution of a thymine (T) by a cytosine (C) at position 60 of the 5 'end of intron 17, ie at position 8061 relative to the sequence SEQ ID NO : 10.
  • the partial nucleotide sequence of intron 17 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ ID NO: 51.
  • the s-m68il7 mutation consists of the substitution of a cytosine (C) by a guanine (G) in position -68 upstream of the 3 'end of intron 17, ie at position 319 relative to the sequence SEQ Tû NO: 11.
  • the partial nucleotide sequence of intron 17 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ ⁇ ) NO: 52.
  • the mutation s-4el8 consists of the substitution of a guanine (G) by a thymine (T) in position 4 of exon 18, that is to say in position 390 with respect to the sequence SEQ ID NO: 11.
  • Exon 18 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 53.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 18 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 106, and codes for a mutated ABCAl protein SEQ ID NO : 132 in which a cysteine (C) is substituted by a phenylalanine (F) at position 887.
  • the mutation s-40el9 consists of the substitution of a cytosine (C) by a thymine (T) in position 40 of exon 19, ie at position 943 relative to the sequence SEQ ID NO: 12.
  • Exon 19 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 54.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 19 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 107.
  • the s-18il9 mutation consists of the substitution of a guanine (G) by an adenine (A) at position 18 of the 5 'end of intron 19, i.e. at position 1053 relative to the sequence SEQ ED NO : 12.
  • the partial nucleotide sequence of intron 19 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ ID NO: 55.
  • the mutation s-ml0il9 consists of the substitution of a cytosine (C) by a thymine (T) in position —10 upstream of the 3 ′ end of intron 19, ie at position 274 relative to the sequence SEQ . ⁇ D NO: 13.
  • the partial nucleotide sequence of intron 19 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ ID NO: 56.
  • the mutation s-123e22 consists in the substitution of a cytosine (C) by a thymine (T) in position 123 of exon 22, that is to say in position 1592 with respect to the sequence SEQ ID NO: 13.
  • Exon 22 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 57.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 22 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 108, and codes for a mutated ABCAl protein SEQ ID NO : 133 in which a leucine (L) is substituted by a cysteine (C) in position 1122.
  • the s-m65i22 mutation consists of the substitution of a guanine (G) by an adenine (A) in position -65 upstream from the 3 'end of intron 22, i.e. at position 2884- relative to the sequence SEQ ID NO: 13.
  • the nucleotide sequence of the intron 22 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ Tu NO: 58.
  • the mutation s-54e23 consists of the substitution of a guanine (G) by a cytosine (C) in position 54 of exon 23, that is to say in position 3002 with respect to the sequence SEQ ID NO: 13.
  • Exon 23 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 59.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 23 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 109, and codes for a mutated ABCAl protein SEQ ID NO : 134 in which a glutamic acid (E) is substituted by an aspartic acid (D) in position 1172.
  • the mutation s-149i23 consists of the substitution of a cytosine (C) by a thymine (T) at position 149 of the 5 'end of intron 23, that is to say at position 3170 with respect to the sequence SEQ ID NO : 13.
  • the nucleotide sequence of intron 23 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ ID NO: 60.
  • the s-m50i23 mutation consists of the substitution of a cytosine (C) by a thymine (T) in position -50 upstream of the 3 'end of intron 23, ie at position 3958 relative to the sequence SEQ ID NO: 13.
  • the sequence of intron 23 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the nucleotide sequence SEQ ID NO: 61.
  • the mutation s-98e24 consists of the substitution of an adenine (A) by a guanine (G) at position 98 of exon 24, that is to say at position 4105 with respect to the sequence SEQ ID NO: 13.
  • Exon 24 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 62.
  • the cDNA corresponding to the mutation in exon 24 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ Tu NO: 110 .
  • the mutation s-149e24 consists in the substitution of a guanine (G) by an adenine (A) at position 149 of exon 24, that is to say at position 4156 with respect to the sequence SEQ ID NO: 13.
  • Exon 24 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 63.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 24 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 111.
  • the mutation s-44e27 consists of the substitution of a guanine (G) by an adenine (A) in position 44 of exon 27, that is to say in position 604 with respect to the sequence SEQ ID NO: 14.
  • Exon 27 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 64.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 27 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 112.
  • the s-7e30 mutation consists of the substitution of a guanine (G) by an adenine (A) at position 7 of exon 30, ie at position 6854 relative to the sequence SEQ ID NO: 14.
  • Exon 30 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 65.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 30 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 113.
  • the mutation s-166e30 consists in the substitution of a guanine (G) by a thymine (T) in position 166 of exon 30, that is to say in position 7013 with respect to the sequence SEQ ID NO: 14.
  • the cDNA corresponding to the mutation in exon 30 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 114.
  • the mutation s-30i31 consists of the substitution of a thymine (T) by a guanine (G) in position 30 of the 5 'end of intron 31, that is to say position 1307 relative to the sequence SEQ ID NO : 15.
  • the nucleotide sequence of intron 31 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ ID NO: 67.
  • the s-ml42i32 mutation consists of the substitution of a cytosine (C) by a ( thymine (T) in position -142 upstream from the 3 'end of intron 32, i.e. at position 3600 relative to the sequence SEQ ID NO: 15.
  • the nucleotide sequence of intron 32 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ ID NO:
  • the s-ml30i32 mutation consists of an insertion of two nucleotides in position -130 upstream of the 3 'end of intron 32, ie at position 3611 relative to the sequence SEQ ID NO: 15.
  • the nucleotide sequence of intron 32 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the nucleotide sequence SEQ ID NO:
  • the s-m26i32 mutation consists of the substitution of a guanine (G) by a cytosine (C) in position —26 upstream of the 3 'end of intron 32, ie at position 3716 relative to the sequence SEQ ID NO: 15.
  • the nucleotide sequence of intron 32 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the nucleotide sequence
  • the s-m74i33 mutation consists of the substitution of a thymine (T) by an adenine (A) in position —74 upstream of the 3 ′ end of intron 33, ie at position 5247 relative to the sequence SEQ TD NO: 15.
  • the nucleotide sequence of intron 33 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ ID NO:
  • the mutation s-62e34 consists of the substitution of a guanine (G) by an adenine (A) in position 62 of exon 34, that is to say in position 5382 with respect to the sequence SEQ ID NO: 15.
  • Exon 34 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 72.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 34 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 115, and codes for a mutated ABCAl protein of SEQ ID NO: 135, in which an arginine (R) has been replaced by a lysine (K) at position 1587.
  • the polymorphism s-62e34 according to the invention which results in the replacement of an arginine (R) by a lysine (K) in position 1587 of the protein ABCAl, constitutes a functional mutation which affects the levels of HDL cholesterol, d apolipoprotein AI and apolipoprotein A-II and predisposes to cardiovascular risk.
  • the mutation s-77e36 consists of the substitution of a guanine (G) into an adenine (A) at position 77 of exon 36, that is to say at position 1064 relative to the sequence SEQ ID NO: 16.
  • Exon 36 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 73.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 36 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ Tû NO: 116, and codes for a mutated ABCAl protein of SEQ ID NO 136, in which a valine (V) is substituted by an isoleucine (I) in position 1674.
  • the s-55i36 mutation consists of the substitution of a thymine (T) by a cytosine (C) at position 55 of the 5 'end of intron 36, i.e. at position 1220 with respect to the sequence SEQ ID NO : 16.
  • Intron 36 carrying this polymo ⁇ hism has the partial nucleotide sequence SEQ ID NO: 74.
  • the mutation s-64e38 consists in the substitution of a thymine (T) in a cytosine (C) in position 64 of exon 38, that is to say in position 835 with respect to the sequence SEQ ID NO: 17.
  • the cDNA carrying the polymorphism in exon 38 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 117.
  • the S-25H39 mutation consists of the substitution of a thymine (T) by a guanine (G) at position 251 of the 5 'end of intron 39, ie at position 375 relative to the sequence SEQ ID NO : 18.
  • the partial nucleotide sequence of intron 39 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ ID NO: 76.
  • the mutation s-252i39 consists in the substitution of a thymine (T) by a cytosine (C) in position 252 of the 5 'end of the intron 39, ie at position 376 relative to the sequence SEQ ID NO : 18.
  • the partial nucleotide sequence of intron 39 carrying this polyhismism is represented in the sequence SEQ ID NO: 77.
  • the s-ml 19i40 mutation consists of the substitution of a cytosine (C) for a thymine (T) in position —119 upstream of the 3 'end of intron 40, that is to say in position 710 with respect to the sequence SEQ ID NO: 19.
  • the nucleotide sequence of intron 40 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ ID NO: 78.
  • the s-m69i44 mutation consists of the substitution of a thymine (T) by a cytosine (C) in position -69 upstream from the 3 'end of intron 44, ie at position 108 relative to the sequence SEQ ID NO: 20.
  • the partial nucleotide sequence of intron 44 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the nucleotide sequence SEQ ID NO: 79. Mutation in exon 45
  • the mutation s-114e45 consists of the substitution of a cytosine (C) by a thymine (T) at position 114 of exon 45, that is to say at position 290 relative to the sequence SEQ ID NO: 20.
  • Exon 45 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 80.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 45 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 118.
  • the mutation s-m34i45 consists of the substitution of a cytosine (C) by a thymine (T) in position —34 upstream from the 3 ′ end of intron 45, ie at position 343 relative to the sequence SEQ ID NO: 21.
  • the partial nucleotide sequence of intron 45 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ ID NO: 21.
  • the s-13i47 mutation consists of the substitution of an adenine (A) by a guanine (G) at position 13 of the 5 'end of intron 47, i.e. at position 1068 relative to the sequence SEQ ID NO : 21.
  • the partial nucleotide sequence of intron 47 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ ID NO: 82.
  • the mutation s-86i47 consists of the substitution of an adenine (A) by a cytosine (C) at position 86 of the 5 'end of intron 47, ie at position 1141 relative to the sequence SEQ ID NO : 21.
  • the partial nucleotide sequence of intron 47 carrying this polymo ⁇ hism is represented in the sequence SEQ ID NO: 83. Changes in exon 49
  • the mutation s-377e49 consists of the substitution of a thymine (T) by a cytosine (C) at position 377 of exon 49, ie at position 571 with respect to the sequence SEQ ID NO: 22.
  • Exon 49 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 84.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 49 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 119.
  • the mutation s-833e49 consists in the substitution of a cytosine (C) by a thymine (T) in position 833 of exon 49, that is to say in position 1027 with respect to the sequence SEQ ID NO: 22.
  • Exon 49 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 85.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 49 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 120.
  • the mutation s-1580e49 consists in the substitution of a cytosine (C) by a thymine (T) in position 1580 of exon 49, that is to say in position 1773 with respect to the sequence SEQ ID NO: 22.
  • Exon 49 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 86.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 49 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 121.
  • the mutation s-1791e49 consists in the substitution of an adenine (A) by a thymine (T) in position 1791 of exon 49, that is to say in position 1985 relative to the sequence SEQ ID NO: 22.
  • Exon 49 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 87.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 49 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 122.
  • the mutation s-2034e49 consists in the substitution of an adenine (A) by a guanine (G) in position 2034 of exon 49, that is to say in position 2228 with respect to the sequence SEQ ID NO: 22.
  • the cDNA carrying the polymorphism in exon 49 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 123.
  • the mutation s-2049e49 consists in the substitution of a cytosine (C) by a thymine (T) in position 2049 of exon 49, ie at position 2243 relative to the sequence SEQ ID NO: 22.
  • Exon 49 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 89.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 49 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 124.
  • the mutation s-2449e49 consists in the substitution of an adenine (A) by a guanine (G) in position 2449 of exon 49, that is to say in position 2643 with respect to the sequence SEQ ID NO: 22.
  • Exon 49 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 90.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 49 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 125.
  • the mutation s-2843e49 consists in the substitution of a guanine (G) by an adenine (A) in position 2843 of exon 49, that is to say in position 3037 with respect to the sequence SEQ ID NO: 22.
  • Exon 49 carrying this polymo ⁇ hism has the nucleotide sequence SEQ ID NO: 91.
  • the cDNA carrying the polymo ⁇ hism in exon 49 of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 126.
  • polymo ⁇ hisms found within the coding regions which essentially correspond to substitutions of a single nucleotide located on the third base of the codons of the open reading frame of ABCAl, do not cause modifications as to the nature of the amino acid. coded, taking into account the rules of genetic degeneration in humans, well known to those skilled in the art. Polymohisms that do not alter the amino acid sequence may, however, have an important biological function, which may have an effect on the concentration of Circulating HDL, and therefore of apolipoprotein AI or A-IL Such polymo ⁇ hisms can for example affect the regulation of transcription or translation, for example by acting on the stability of mRNA, splicing, the rate of transcription, and the fidelity of the translation.
  • polymo ⁇ hisms have been discovered in the promoter region upstream of the human ABCAl gene.
  • the polymorphic positions are represented in FIG. 3 by nucleotides marked in bold (and underlined when it concerns the bases surrounding an insertion) on the sequence of the gene promoter
  • Table 3 also presents the allelic polymo ⁇ isms in the promoter sequence of the human ABCAl gene according to the present invention. It indicates the name, the wild and mutant alleles, the polymorphic positions, and the frequency of appearance of allelic polymorphisms in two population groups, the Caucasian population and the Japanese population.
  • Polymohism S-2389p consists of the substitution of a guanine (G) by an adenine (A) at position 505 of the first nucleotide of the sequence SEQ Tu NO:
  • nucleic acid comprising the polymorphism S-2389p in the regulatory sequence of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 137.
  • Sins-2176-2177p polymorphism consists of an insertion of the sequence
  • the nucleic acid comprising the polymorphism Sins-2176-2177p in the regulatory sequence of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 138.
  • Polymo ⁇ hisme S-1814p consists in the substitution of an adenine (A) by a guanine (G) in position 1080 of the first nucleotide of the sequence SEQ ID NO:
  • nucleic acid comprising the polymorphism S-1814p in the regulatory sequence of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 139.
  • Polymohism S-1801p consists in the substitution of a cytosine (C) by a thymine (T) in position 1093 of the first nucleotide of the sequence SEQ ID NO:
  • nucleic acid comprising the polymoism S-1801p in the regulatory sequence of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 140.
  • Polymohism S-1652p consists of the substitution of an adenine (A) by a guanine (G) at position 1242 of the first nucleotide of the sequence SEQ Tu NO: 23 or at position— 1652 with respect to the initiation site of the transcription +1.
  • the acid nucleic acid comprising the polymorphism S-1652p in the regulatory sequence of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 141.
  • Polymo ⁇ hisme S-1506p consists in the substitution of a guanine (G) by a cytosine (C) in position 1388 of the first nucleotide of the sequence SEQ ID NO: 23 or in position —1506 compared to the site of initiation of the transcription +1.
  • the nucleic acid comprising the polymohism S-1506p in the regulatory sequence of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 142.
  • Polymohism S-1395p consists in the substitution of a cytosine (C) by a thymine (T) in position 1499 of the first nucleotide of the sequence SEQ ID NO: 23 or in position —1395 relative to the initiation site of the transcription +1.
  • the nucleic acid comprising the polymo ⁇ hism S-1395p in the regulatory sequence of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 143.
  • Polymohism S-1252p consists in the substitution of a guanine (G) by an adenine (A) in position 1642 of the first nucleotide of the sequence SEQ ID NO: 23 or in position —1252 relative to the site of initiation of the transcription + 1.
  • the nucleic acid comprising the polymb ⁇ hism S-1252p in the regulatory sequence of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 144.
  • Polymohism S-1217p consists in the substitution of a cytosine (C) by a thymine (T) in position 1677 of the first nucleotide of the sequence SEQ ID NO: 23 or in position —1217 relative to the site of initiation of the transcription + 1.
  • the nucleic acid comprising the polymorphism S-1217p in the regulatory sequence of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 145.
  • Polymohism S-1099p consists in the substitution of a guanine (G) by a thymine (T) in position 1795 of the first nucleotide of the sequence SEQ JD NO: 23 or in position —1099 relative to the initiation site of the transcription +1.
  • the nucleic acid comprising the polymorphism S-1099p in the regulatory sequence of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 146.
  • the Sins-1034-1035p polymolism consists of an insertion of an adenine and a thymine (AT) at position 1859 of the first nucleotide of the sequence SEQ ID NO: 23 or at position —1034 relative to the initiation site of the transcription +1.
  • the nucleic acid comprising the polymorphism Sins-1034-1035p in the regulatory sequence of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 147.
  • Polymo ⁇ hisme S-940p consists in the substitution of a thymine (T) in a guanine (G) in position 1954 of the first nucleotide of the sequence SEQ ID NO: 23 or in position —940 compared to the site of initiation of the transcription +1.
  • the nucleic acid comprising the polymorphism S-940p in the regulatory sequence of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 148.
  • Polymohism S-803p consists in the substitution of a guanine (G) by an adenine (A) in position 2091 of the first nucleotide of the sequence SEQ ID NO: 23 or in position - 803 relative to the site of initiation of the transcription +1.
  • the nucleic acid comprising the polymorphism S-803p in the regulatory sequence of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 149.
  • the S ⁇ -777-774p polymolism consists of a deletion of a fragment of four nucleotides TTTG at position 2117 of the first nucleotide of the sequence SEQ ID NO: 23 or at position— 774 relative to the initiation site of transcription +1 .
  • the nucleic acid comprising the S ⁇ -777-774p polymolism in the sequence regulator of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ TU NO: 150.
  • Polymohism S ⁇ -773-765p consists of a deletion of a fragment of nine nucleotides TTTGTTTGT at position 2121 of the first nucleotide of the sequence SEQ ID NO: 23 or at position -765 relative to the initiation site of transcription +1 .
  • the nucleic acid comprising the polymolism S ⁇ -773-765p in the regulatory sequence of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 151.
  • Polymohism S-564p consists in the substitution of a cytosine (C) by a thymine (T) in position 2330 of the first nucleotide of the sequence SEQ ID NO:
  • nucleic acid comprising the polymorphism S-564p in the regulatory sequence of the gene
  • ABCAl is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 152.
  • Polymohism S-407p consists of the substitution of a guanine (G) by a cytosine (C) at position 2487 of the first nucleotide of the sequence SEQ ID NO:
  • nucleic acid comprising the polymorphism S-407p in the regulatory sequence of the gene
  • ABCAl is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 153.
  • Polymohism S-302p consists in the substitution of a cytosine (C) by a thymine (T) in position 2592 of the first nucleotide of the sequence SEQ ID NO:
  • nucleic acid comprising the polymorphism S-302p in the regulatory sequence of the gene
  • ABCAl is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 154.
  • Polymohism S-278p consists of the substitution of a guanine (G) by a cytosine (C) at position 2616 of the first nucleotide of the sequence SEQ ID NO:
  • nucleic acid comprising the polymorphism S-278p in the regulatory sequence of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 155.
  • the S ⁇ -223-219p polymolism consists of a deletion of a fragment of five CACCC nucleotides at position 2671 of the first nucleotide of the sequence SEQ ID NO: 23 or at position -219 relative to the initiation site of transcription +1 .
  • the nucleic acid comprising the polymolism S ⁇ -223-219p in the regulatory sequence of the ABCAl gene is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 156.
  • Polymohism S-99p consists of the substitution of a guanine (G) by a cytosine (C) at position 2795 of the first nucleotide of the sequence SEQ ID NO:
  • Nucleic acid comprising the polymorphism S-99p in the regulatory sequence of the gene
  • ABCAl is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 157.
  • Polymohism S-14p consists of the substitution of a cytosine (C) by a thymine (T) at position 2880 of the first nucleotide of the sequence SEQ ID NO:
  • nucleic acid comprising the polymorphism S-14p in the regulatory sequence of the gene
  • ABCAl is represented by the nucleotide sequence SEQ ID NO: 158.
  • the invention also relates to the nucleotide sequences of the ABCAl gene comprising at least one biallelic polymorphism as described above.
  • the subject of the invention is a nucleic acid comprising a polynucleotide chosen from the group consisting of the nucleotide sequences SEQ ID NO: 24-126 and 137-158 or a nucleic acid of complementary sequence.
  • the invention also relates to a nucleic acid hybridizing, under conditions of high stringency, with a polynucleotide chosen from the group consisting of the nucleotide sequences SEQ JD NO: 24-126 and 137-158 or a nucleic acid of complementary sequence.
  • the invention also relates to a nucleic acid having at least 9 consecutive nucleotides of a polynucleotide chosen from the group consisting of the nucleotide sequences SEQ ID NO 24-126 and 137-158, and comprising the polymorphic base or a nucleic acid of sequence complementary.
  • the invention also relates to a nucleic acid having at least 21 consecutive nucleotides of a polynucleotide chosen from the group consisting of the nucleotide sequences SEQ ID NO 24-126 and 137-158, and comprising the polymorphic base or a nucleic acid of sequence complementary.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid having at least 21 consecutive nucleotides of a polynucleotide chosen from the group consisting of the nucleotide sequences SEQ ID NO: 24-126 and 137-158, the polymorphic base being located at the center of the nucleotide fragment of 21 bases.
  • the invention further relates to a nucleic acid derived from a polynucleotide chosen from the group consisting of the nucleotide sequences SEQ ID NO: 24-126 and 137-158 comprising the polymorphic sequence, and at least two nucleotides located on either side of the polymorphic position or a nucleic acid of complementary sequence.
  • Another subject of the invention relates to a nucleic acid coding for a polypeptide chosen from the group consisting of amino acid sequences SEQ ID NO: 127-136.
  • the invention also relates to a polypeptide comprising an amino acid sequence chosen from the group consisting of sequences SEQ ID NO: 127-136.
  • the antico ⁇ s directed against an ABCAl polymo ⁇ he polypeptide comprising an amino acid sequence chosen from the group consisting of sequences SEQ ID NO: 127-136, or a peptide fragment of the latter.
  • the antico ⁇ s according to the present invention comprises a detectable compound.
  • the subject of the invention is also a nucleic acid containing a polynucleotide encoding a polypeptide or a nucleic acid of interest linked in a functional manner to a "polynucleotide chosen from the group consisting of nucleotide sequences SEQ ID NO: 137-158.
  • the subject of the present invention is a recombinant cloning and / or expression vector which carries a nucleic acid comprising a polynucleotide chosen from the group consisting of the nucleotide sequences SEQ JD NO: 24-126 and 137-158, and at least one of the polymo ⁇ hisms as previously described. It also relates to a host cell transformed with a nucleic acid comprising a polynucleotide chosen from the group consisting of the nucleotide sequences SEQ ID NO: 24-126 and 137-158, and at least one of the polymo ⁇ hisms as previously described or by the recombinant vector described above.
  • the subject of the invention is probes or nucleotide primers capable of hybridizing to nucleic acids of sequences SEQ ID NO: 24-126 and 137-158 and comprising at least one polymorphic position or to nucleic acids of complementary sequence.
  • the nucleotide probes and primers comprise a polynucleotide of nucleotide sequence chosen from the group consisting of sequences SEQ ID NO: 24-126 and 137-158, or of a complementary sequence, containing one of the polymorphic bases according to the invention.
  • a nucleotide probe according to the invention has a length of 15, 16, 19 to 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000, 1500 consecutive nucleotides of a polynucleotide of nucleotide sequence chosen from the group consisting of sequences SEQ ID NO 24-126 and 137-158, and comprising at least one polymorphic base, or of a nucleic acid of complementary sequence.
  • the nucleotide probes consist of a nucleic acid comprising at least 21 consecutive nucleotides of a polynucleotide chosen from the group consisting of nucleotide sequences
  • the polymorphic base is located in the center of the nucleotide fragment of 21 bases.
  • a nucleotide primer according to the invention has a length of 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 to 40 consecutive nucleotides of a polynucleotide of nucleotide sequence chosen from the group consisting of sequences SEQ ID NO 24-126 and 137-158, and comprising at least one polymorphic base, or of a nucleic acid of complementary sequence.
  • the base of the 3 ′ end of these primers is complementary to a nucleotide located at 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 or more nucleotides on the 3 ′ side of the position of the polymorphism according to the invention, present in one of the sequences SEQ Tû NO 24-126 and 137-158 and / or their complementary sequences .
  • a probe and of a nucleotide primer according to the invention therefore includes oligonucleotides which hybridize, under the conditions of high stringency hybridization defined above, with a nucleic acid chosen from the sequences
  • SEQ ID NO: 24-126 and 137-158 comprising at least one of the polymo ⁇ hisms defined above, or with a sequence complementary to the latter.
  • primers and primer pairs for amplifying different regions of the ABCAl gene are shown below.
  • a primer or a nucleotide probe according to the invention can be prepared by any suitable method well known to those skilled in the art, including by cloning and action of restriction enzymes or also by direct chemical synthesis according to techniques such as the method to the phosphodiester of Narang et al. (Methods Enzymol (1979) 68, 90-98) or Brown et al. (Methods Enzymol (1979) 68, 109-151), the diethylphosphoramidite method of Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. (1981) 22, 1859-1862), or the solid support technique described in US Patent No. EP 0 707 592.
  • suitable nucleotide primers are, for example, primers whose base at the 3 ′ end hybridizes with the base located immediately on the 3 ′ side of the polymorphic base of the fragment comprising the polymorphism.
  • an elongation step with a mixture of two dideoxynucleotides complementary to the polymorphic base of said polymorphism, for example labeled with two distinct fluorophores then a step of detecting the fluorescence signal obtained makes it possible to determine which of the two differently labeled fluorescent dideoxynucleotides has been inco ⁇ orated, and to deduce the nature of the polymorphic base.
  • Each of the nucleic acids according to the invention can be labeled, if desired, by incorporating a label detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or even chemical means.
  • markers can consist of radioactive isotopes (32P, 33P, 3H, 35S), fluorescent molecules (5-bromodeoxyuridine, fluorescein, acetylaminofluorene, digoxigenin) or also ligands such as biotin.
  • radioactive isotopes 32P, 33P, 3H, 35S
  • fluorescent molecules 5-bromodeoxyuridine, fluorescein, acetylaminofluorene, digoxigenin
  • ligands such as biotin.
  • the labeling of the probes is preferably carried out by inco ⁇ oration of molecules marked within the polynucleotides by extension of primers, or else by addition on the 5 ′ or 3 ′ ends.
  • amplified fragments of genomic DNA capable of containing polymo ⁇ hisms are incubated with a primer marked with fluorescein at the 5 ′ end, in the presence of fluorescent dideoxynucleotide triphosphate and of a modified Taq polymerase.
  • the labeled primer is extended by one base by inco ⁇ oration of the labeled dideoxynucleotide specific for the allele present in the complementary genomic DNA sequence.
  • the fluorescence intensities for the two marker compounds of the labeled dideoxynucleotides are analyzed directly without separation or purification.
  • the ratio for these two fluorescences makes it possible to determine the nucleotide used by the polymerase during the elongation, and to deduce the nature of the polymorphic base. All of these steps can be carried out in the same tube and the modifications of fluorescence followed in real time.
  • the extension primer can be analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry. The base located in the polymorphic position is identified by measuring the mass added to the microsequencing primer. (Haff et al., Gen Res, 7 (1997) 378-388).
  • the probes according to the invention allow an amplification of the signal, such as the probes described by Urdea et al. (Nucl. Acid. SympSer. (1991) 24, 197-200) or also in European patent n ° EP-0 225 807 (CHIRON).
  • the oligonucleotide probes according to the invention can be used in particular in hybridizations of the Southern type with genomic DNA or Northern with RNA.
  • the structural characteristics making it possible to differentiate the normal sequences from the mutated sequences of ABCAl are thus used in order to provide means for detecting the mutated sequences of ABCAl in a sample, in particular in the form probes specifically hybridizing with the mutated sequences of ABCAl or alternatively primer pairs making it possible to selectively amplify the regions of the ABCAl gene carrying the polymo ⁇ hisms described above.
  • the detection of the presence of these mutations can in particular be carried out by discriminating the length of the amplified nucleic acid fragments, by hybridization of the amplified fragments using the specific probes described above or also by direct sequencing of these amplified fragments .
  • nucleotide primers can for example be immobilized on a support.
  • immobilize on a support for example in an orderly manner, multiple specific primers as described above, each of these primers being suitable for the detection of one of the polymo ⁇ hisms of the ABCAl gene according to l 'invention.
  • the polymo ⁇ hisms of the ABCAl gene according to the invention are useful in particular as genetic markers in studies of association between the presence of a given allele in a subject and the predisposition of this subject to a pathology given and / or a response given to a therapeutic molecule within the framework of pharmacogenetic studies.
  • the present invention therefore relates to genetic markers comprising all or part of a nucleic acid chosen from the group consisting of nucleotide sequences SEQ ID NO: 24-126 and 137-158 or a nucleic acid of complementary sequence, and comprising one of the polymo ⁇ hisms according to the invention.
  • the genetic markers of the invention are advantageously used for studies of association of a given allele of polymo ⁇ hisms according to the invention, with the levels of HDL cholesterol, of apolipoprotein AI and of apolipoprotein A-DD in plasma in patients .
  • the genetic markers are used for studies of association of polymo ⁇ hisms s-35ela, s-16elb, s-76elb, s-53e5, s-108e6, s- 113e6, s-123e8, s-153e8, s- 126el2, s-148el4, s-196el5, s-136el6, s27el7, sl07el7, s-4el8, s-40el9, s-123e22, s-54e23, s-98e24, s-149e24, s-44e27, s-7e30, s-166e30, s- 62e34, s-77e36, s-64e38, s-114e45, s-377e49, s-833e49, s-1580e49, s-1791e49, s- 2034e49, s-2049e49, s-2449
  • the genetic markers are used for the association studies of polymo ⁇ hisms s-113e6, s-196el5, s-136el6, s27el7, sl07el7, s-4el8, s-123e22, s-54e23, s-62e34 , and s-77e36 with plasma HDL cholesterol, apolipoprotein AI and apolipoprotein A-Il levels in patients.
  • the present invention relates to genetic markers comprising all or part of a nucleic acid chosen from the group consisting of nucleotide sequences SEQ ID NO: 24-126 and 137-158 or a nucleic acid of complementary sequence, for studies of association of polymo ⁇ hisms such as described above with a cardiovascular risk in patients and more particularly a risk of myocardial infarction.
  • the biallelic polymo ⁇ hisms according to the invention are useful in any one of the methods described in the state of the art intended to demonstrate a statistically significant correlation between a genotype and a phenotype.
  • Biallelic polymo ⁇ hisms can be used in linkage analysis and in allele sharing processes.
  • the biallelic polymo ⁇ hisms according to the invention are used to identify genes associated with detectable characters (phenotypes) using association studies, an approach which does not require recourse to families affected by the character, and which also allows the identification of genes associated with complex and sporadic characters.
  • biallelic polymo ⁇ hisms are for example those described by Forsell et al. (Biol Psychiatry 42 (1997) 898-903) Xiong et al. (Ann J Hum Genêt 64 (1999) 629-640), Horvath et al. (Am J Hum Genêt 63 (1998) 1886-1897), Sha et al. (Ann Hum Genêt 59 (1995) 323-336) or Nickerson et al. (Genomics, 12 (1992) 377-387).
  • biallelic polymo ⁇ hisms are used to identify genes associated with a phenotype.
  • the present invention relates to a method of detecting one of the polymo ⁇ hisms described above in the nucleotide sequence of the ABCAl gene of a subject.
  • the method according to the invention consists in determining the nucleotide sequence of all or part of the ABCAl gene in said subject at one of the polymorphic positions of the invention, and identifying the presence or absence of the SNP (single nucleotide polymorphism) at the position analyzed.
  • the detection method according to the invention consists in determining the presence of a G or of an A at the polymorphic position 113 of exon 6, the presence of a G or of an A at the position polymo ⁇ he 196 of exon 15, the presence of a G or A at the position polymo ⁇ he 136 of exon 16, the presence of an A or a G at the position polymo ⁇ he 107 of exon 17 , the presence of a T or a C at the polymo ⁇ he position 27 of exon 17, the presence of a G or a T at the polymo ⁇ he position 4 of exon 18, the presence of a C or a T at the polymorphic position 123 of exon 22, the presence of a G or a C at the polymorphic position 54 of exon 23, the presence of a C or a T at the polymo ⁇ he position 62 of exon 34, the presence of a G or an A at the polymo ⁇ he position 77 of exon 36.
  • the detection method according to the present invention consists in determining the nucleotide sequence of the ABCAl gene at position 62 of exon 34 and the SNP corresponding to the presence of a C or of a T.
  • the presence of at least one of the SNPs described above is identified by sequencing all or part of the subject's ABCAl gene at the polymorphic positions.
  • Amplification and sequencing primers can be constructed in order to hybridize with a determined region of a sequence chosen from the sequence group consisting of the sequences SEQ ID NO: 24-126 and SEQ ID NO: 137-158, or of complementary sequence, and comprising at least one polymorphic position.
  • Such sequencing primers are preferably constructed so as to amplify fragments of approximately 250 to approximately 500 nucleotides, comprising at least one of the polymorphic positions according to the invention.
  • the amplified fragments are then sequenced and the sequence obtained is compared with the reference sequences SEQ JD NO: 24-91 and 137 to 158 in order to determine whether one or more deletions, additions or substitutions of nucleotides are found in the amplified sequence from the DNA contained in the biological sample from the test subject.
  • the method of the invention allows the amplification of a nucleic acid containing at least one of the polymo ⁇ hisms of the invention, and comprising the steps consisting in:
  • the invention therefore relates, according to this first embodiment, to a method for detecting one of the polymo ⁇ hisms according to the invention in the ABCAl gene in a subject, comprising the following steps:
  • the method for detecting the presence of a polymorphism of the ABCAl gene in a subject also comprises the steps consisting in: a) sequencing, from a biological material originating from the subject to be tested, all or part of the ABCAl gene, using a nucleotide primer hybridizing with the sequence chosen from SEQ ID NO: 24-91 or the sequences SEQ ID NO: 137-158; b) align the nucleotide sequence obtained in a) with a sequence chosen from the group consisting of sequences SEQ ID No. 1 and 3-23;
  • c) determine the nucleotide differences between the polynucleotide sequence originating from the biological material of the test subject and the reference sequences SEQ ID NO: 1 and 3-23.
  • it uses the ' oligonucleotide probes as described above, which are capable of specifically hybridizing with a corresponding region of one of the sequences SEQ ID NO: 24-91 or with a corresponding region of one of the sequences SEQ ID N ° 137-158, and comprising at least one of the polymo ⁇ hes bases according to the invention as described above, with a view to detecting the presence of one or more of the polymo ⁇ hisms according to the invention in a sample from a subject.
  • the nucleotide probes consist of a nucleic acid comprising at least 21 consecutive nucleotides of a polynucleotide chosen from the group consisting of the nucleotide sequences SEQ ID NO: 24-126 and
  • the polymorphic base being located in the center of the nucleotide fragment of
  • nucleotide probes according to this embodiment of the invention are immobilized on a solid support.
  • solid supports are well known to those skilled in the art and comprise the surfaces of the wells of microtiter plates covered with polystyrene beds, magnetic beds, nitrocellulose strips, or even microparticles such as latex particles.
  • the present invention also relates to a method for detecting the presence of a nucleic acid as described above in a sample, said method comprising the steps consisting in:
  • the oligonucleotide probe (s) are immobilized on a support, and even more preferably, the oligonucleotide probes comprise a detectable marker.
  • the methods of detecting polymo ⁇ hisms described above are used to diagnose in a subject a predisposition to develop a certain pathology, after an association study, or to predict the pharmacological response of a patient to a given molecule, after a pharmacogenetic study.
  • the methods make it possible to diagnose in a subject who has been detected as carrying a given allele of at least one of the polymo ⁇ hisms according to the invention, a pathological risk linked to a deficiency of the transporter ABCAl, or a zero or undesirable response to a given therapeutic molecule.
  • the methods according to the invention are particularly useful for diagnosing the predisposition of an individual to present a coronary or cardiovascular risk, such as a risk of myocardial infarction, or atherosclerosis.
  • the method according to the invention makes it possible to determine whether a subject presents a risk for the development of a pathology linked to a deficit in the metabolism of cholesterol, in particular in the reverse transport of cholesterol, a risk of development of a familial HDL deficiency such as Tangier's disease or more generally of a cardiovascular disease or a coronary disease, such as a risk of myocardial infarction or atherosclerosis.
  • a familial HDL deficiency such as Tangier's disease or more generally of a cardiovascular disease or a coronary disease, such as a risk of myocardial infarction or atherosclerosis.
  • Such methods include the detection, in cells of a biological sample originating from the test subject, of the presence or absence of a given allele of one of the polymo ⁇ hisms according to the invention as described in table 2 , in the sequence of the human ABCAl gene of sequence SEQ JD NO: 3-22.
  • the methods according to the invention also make it possible to detect in cells of a biological sample originating from the subject to be tested, the presence or absence of a given allele of one of the polymo ⁇ hisms according to the invention as described in the table 3, in the regulatory sequence SEQ ID NO: 23 upstream of the ABCAl gene characterized by an alteration in the expression of a gene whose expression is regulated by the ABCAl promoter.
  • the subject of the present invention is the method for diagnosing a pathology linked to a deficiency of the ABCAl transporter which consists in detecting in a subject, the presence of a given allele of one of the polymo ⁇ hisms of the invention according to one of the methods of detection described above.
  • the method of the invention makes it possible to diagnose the predisposition of a subject to develop a cardiovascular disease such as a myocardial infarction.
  • the present invention relates to a method and a kit for diagnosing a risk of myocardial infarction or a risk of cardiovascular disease in a subject, consisting in detecting in said subject, the presence of a nucleic acid comprising a polynucleotide of sequence SEQ ID NO: 72 or 115, and comprising a polymorphic base A in position 62 of exon 34, that is to say in position 5382 with respect to the sequence SEQ JD NO: 15.
  • the subject of the present invention is the method of diagnosing a pharmacological response linked to a variation of the ABCAl transporter or of its regulation which consists in detecting in a subject, the presence of a given allele of at least one of the polymo ⁇ hisms of l invention according to one of the detection methods described above.
  • such SNP polymorphisms can be detected in order to determine the existence of a substitution of a nucleotide in the sequence of a nucleic acid corresponding to the ABCAl gene of sequence SEQ ID NO: 3-22 and / or in the regulatory sequence upstream of the ABCAl gene of sequence SEQ ID NO: 23, of the addition of one or more nucleotides or of the deletion of one or more nucleotides in said sequences SEQ ID N ° 3-22 or SEQ ID N ° 23.
  • the present invention further relates to the use of oligonucleotide probes specifically hybridizing with a corresponding region of one of the sequences SEQ ID NO: 24-126 or with a corresponding region of one of the sequences SEQ ID N ° 137-158, comprising at least one of the polymorphic bases according to the invention as described above, with a view to diagnosing in a subject a predisposition to the development of a pathology linked to a deficiency in the reverse transport of cholesterol, such as myocardial infarction, atherosclerosis or even Tangier's disease, or more generally a cardiovascular disease, or to predict the pharmacological response of a subject to a given therapeutic molecule.
  • oligonucleotide probes specifically hybridizing with a corresponding region of one of the sequences SEQ ID NO: 24-126 or with a corresponding region of one of the sequences SEQ ID N ° 137-158, comprising at least one of the polymorphic bases according to the invention as described above, with
  • the diagnostic methods according to the present invention can advantageously be used in order to evaluate the efficacy of therapeutic products in the treatment of conditions linked to a deficiency of the ABCAl transporter.
  • the subjects carrying an allelic polymo ⁇ hism of the ABCAl gene can present for example differences in concentration of the various lipid variables which are commonly measured such as the levels of HDL cholesterol, triglycerides, apolipoproteins AI and A-Il, lipoprotein particles AI and A-JJ, or even differences in the regulation of protein biosynthesis.
  • the differences observed due to the presence of an allelic variant in a subject can be modified when a particular therapeutic agent is administered to said subject.
  • the methods according to the present invention can therefore be useful for determining the clinical effect of a therapeutic substance and determining the therapeutic doses to be administered.
  • the subject of the present invention is a kit or kit for the detection of the presence of one of the polymo ⁇ hisms as previously described, in the ABCAl gene in a subject, said kit comprising:
  • the subject of the invention is also a kit or kit for the detection of one of the polymo ⁇ hisms of the present invention in the ABCAl gene, in a subject, comprising:
  • oligonucleotide probes as defined above; b) where appropriate, the reagents necessary for carrying out a hybridization reaction.
  • nucleic acid fragments derived from any of the nucleotide sequences SEQ ID NO 24-126 comprising one of the polymo ⁇ hisms of the invention are therefore useful for the detection of the presence of at least one polymo ⁇ he allele of the ABCAl gene in a sample.
  • the probes according to the invention can also be used for the detection of PCR amplification products or even for the detection of mismatches.
  • the detection kit or kit is characterized in that the probe or probes are immobilized on a support.
  • the detection kit or kit is characterized in that the oligonucleotide probes comprise a detectable marker.
  • such a kit will comprise a plurality of oligonucleotide probes in accordance with the invention which can be used to detect target sequences of interest or alternatively to detect mutations in the coding regions or the non-coding regions of the nucleic acids according to the invention, more particularly nucleic acids of sequences SEQ ID NO 1, and 3-23 or the nucleic acids of complementary sequence.
  • the probes according to the invention immobilized on a support can be ordered in matrices such as "DNA chips".
  • matrices such as "DNA chips”.
  • nucleotide primers according to the invention can be used to amplify any of the nucleic acids according to the invention, and more particularly all or part of a nucleic acid of sequences SEQ ID NO 24-126 and 137-158.
  • the subject of the invention is also a kit or kit for the amplification of a nucleic acid according to the invention, and more particularly all or part of a nucleic acid of sequences SEQ ID NO 1, and 3-23 said kit or kit comprising a) a pair of nucleotide primers in accordance with the invention, the hybridization position of which is located respectively on the 5 ′ side and on the 3 ′ side of the target nucleic acid whose amplification is sought; b) where appropriate, the reagents necessary for the amplification reaction.
  • Such an amplification kit or kit will advantageously comprise at least one pair of nucleotide primers as described above.
  • the invention also relates to a method for detecting the presence of an ABCAl polymo ⁇ he protein in a sample, comprising the steps of a) contacting the sample with an antico ⁇ s as previously described; and b) detection of the antigen / antico ⁇ s complex formed.
  • the present invention also relates to a diagnostic kit for the detection of the presence of an ABCAl polymo ⁇ he polypeptide in a sample, said kit comprising a) an antico ⁇ s as previously described; and b) a reagent allowing the detection of the antigen / antico ⁇ s complexes formed.
  • FIG. 1 illustrates the sequence SEQ JD NO: 1 corresponding to the nucleotide sequence of the transcript of the human gene ABCAl;
  • FIG. 2 illustrates the amino acid sequence SEQ ID NO: 2 corresponding to the peptide sequence of the transporter protein ABCAl;
  • FIG. 3 illustrates the regulatory sequence SEQ ID NO: 23 upstream of the human gene ABCAl; the position of the different polymo ⁇ hisms is indicated in bold.
  • the detection of polymo ⁇ isms in the sequences of the transcripts or in the genomic sequences of the ABCAl gene can be carried out according to different protocols.
  • the method of choice is direct sequencing.
  • the technique of detection of polymo ⁇ isms by direct sequencing consists in comparing the genomic sequences of the ABCAl gene obtained from at least 32 individuals from each population tested, Caucasian, African and Japanese. Sequence divergences constitute polymo ⁇ hisms. All those modifying the amino acid sequence of the wild-type protein are mutations capable of affecting the function of said protein which it is interesting to consider more particularly in the case / control association studies described in Example 2. Des primers for the amplification of the DNA of individuals were designed from the non-repetitive sequences of the intronic DNA of the ABC1 gene, so that an amplification of the intron-exon junctions as well as essential bases for the formation of the secondary structure during the RNA splicing step is included in the amplified fragments.
  • the genomic DNA of the individuals was amplified using the primers described above using the Qiagen's Star Taq® kit (Qiagen, Nalencia, CA) or the Supertaq® kit (Ambion, Austin, TX) using the hybridization conditions and amplification cycle conditions recommended by the manufacturer.
  • the amplified PCR products were purified using a kit sold by the company Qiagen, then sequenced by the Big Dye Terminator method on an ABI 3700 sequencer (Apllied Biosystems, Foster City, CA).
  • ECTIM Myocardial Infarction Case-Control Study
  • exonic polymo ⁇ hisms such as for example s-16elb, s-113e6, s-135e8, s-148el4, s-136el6, s- ' 101el7, s-54e23, s -7e30, s-62e34, s-833e49 and s-2034e49, with plasma HDL cholesterol, ApoA.-I and ApoA- ⁇ levels in controls and patients.
  • the genomic DNA of the individuals was amplified using the primers described above making it possible to specifically amplify the exon of interest and the corresponding intron-exon junctions using for example the kit Qiagen's Star Taq® (Qiagen, Nalencia, CA) or the Supertaq® kit (Ambion, Austin, TX) under the hybridization conditions and the amplification cycle conditions recommended by the manufacturer.
  • mini-sequencing reactions were carried out for each of the polymo ⁇ hisms selected.
  • the genotype of each of the controls and of the patients could thus be determined for each of the polymo ⁇ hisms.
  • These data were analyzed with SAS software.
  • the Hardy-Weinberg equilibrium was tested by a ⁇ 2 test with 1 df. Genotypic and allelic frequencies were compared between groups by ⁇ 2 tests. The different phenotypic parameters were compared between the genotypes by analysis of variance A ⁇ ONA.

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Abstract

La présente invention a pour objet des acides nucléiques isolés codant pour la protéine transporteur ABCA1 et comportant des variations polymorphes de séquence, ainsi que des polypeptides dérivés du transporteur humain ABCA1 et contenant des acides aminés polymorphes.L'invention a également pour objet des amorces et des sondes spécifiques d'allèle qui s'hybrident à des régions flanquant ou contenant ces sites ou positions polymorphes, des procédés et des kits ou nécessaires permettant d'analyser les écarts d'allélisme affectant le gène ABCA1, et enfin l'utilisation des polymorphismes du gène humain ABCA1 pour le diagnostic, d'une maladie ou d'une prédisposition à une maladie, en particulier liée à la concentration de HDL (High Density Lipoprotein) cholestérol plasmatique, comme par exemple c'est le cas des déficiences familiales en HDL comme la maladie de Tangier, de l'infarctus du myocarde, de l'athérosclérose, et d'autres affections cardiovasculaires.

Description

SEQUENCES POLYMORPHES DU GENE HUMAIN ABCAl. LEURS UTILISATIONS. LES METHODES ET KITS DE DETECTION
La présente invention a pour objet des polymorphismes du gène ABCAl humain et les nouveaux allèles polypeptidiques codés par les différentes séquences présentant les variations alléliques. L'invention concerne également des procédés ainsi que des kits destinés à l'analyse des variations alléliques dans le gène ABCAl humain, et l'utilisation du polymorphisme ABCAl pour le diagnostic et le traitement des affections cardiovasculaires telles que les risques d'infarctus du myocarde, l'athérosclérose, et la maladie deTangier.
ABCAl est membre de la superfamille des protéines transporteurs ABC
(ATP Binding Cassette ) qui sont impliqués dans le transport des peptides, des sucres, des vitamines ou encore des hormones stéroïdes. (Dean et al. Cuir. Opin. Genêt. 5 (1995) 779-785 ; Decocottignies et al. Nat. Genêt. Dev., 15 (1997) 137-145 ; Allikmets et al., Hum. Mol. Genêt, 5 (1996) 1649-1655).
Les membres de cette famille de transporteur qui sont d'une part extrêmement conservés au cours de l'évolution, de la bactérie à l'homme, présentent d'autre part une structure générale commune caractérisée par deux repliements de liaison aux nucléotides (Nucléotide Binding Fold ou NBF) avec des motifs Walker A et B ainsi que deux domaines transmembranaires, chacun des domaines transmembranaires étant constitué de plusieurs hélices. La spécificité des transporteurs ABC pour les différentes molécules transportées apparaît être déterminée par la structure des domaines transmembranaires, alors que l'énergie nécessaire à l'activité de transport est fournie par la dégradation de l'ATP au niveau du repliement NBF. Le transport du cholestérol du foie aux tissus et inversement est assuré par les deux complexes lipoprotéiques que sont les LDLs (Low Density Lipoprotein) et les HDLs (High Density Lipoprotein). Les LDLs alimentent les tissus en cholestérol alors qu'au contraire les HDL conduisent le cholestérol en excès formé dans les tissus jusqu'au foie. Au cours du transport, le cholestérol est acylé par transfert des acides gras des lécithines par l'action de l'enzyme phosphatidyl-stérol-acyltransférase (LCAT).
Il est maintenant clairement établi chez les patients présentant de faibles taux de HDLs plasmatiques, que les taux élevés de LDL conduisent à une accumulation de cholestérol au niveau des vaisseaux et une probabilité d'apparition d'insuffisances coronariennes (Castelli et al., Jama (1986) 256(20), 2835-8). En effet, une élimination plus lente du cholestérol en excès dans les tissus favorise la formation de plaques artérielles, et à terme le risque d'attaque cardiaque, d'une angine de poitrine, ou bien d'une affection du système artériel périphérique.
Ces complexes lipoprotéiques LDLs et HDLs, qui interviennent donc respectivement dans les mécanismes d'afflux et d'efflux du cholestérol, du foie aux tissus ou inversement, présentent une structure sphérique de densité différente, qui se compose essentiellement d'un noyau de lipides apolaires constitués de triacylglycérols et d'esters de cholestérol, et d'une couronne constituée d'apolipoprotéines et de lipides amphiphiles.
H est généralement admis que l'efflux de cholestérol des tissus vers le foie, est réalisé par deux voies différentes. Une première voie dite passive favorise l'efflux de cholestérol de la membrane plasmique aux HDLs, alors que la deuxième voie est énergie-dépendante, et utilise notamment l'apolipoprotéine A-I (Apo-AI) des HDL naissants, qui est vraisemblablement reconnue et se lie à des récepteurs membranaires cellulaires afin de permettre la translocation du cholestérol en excès aux particules HDLs (Rothblat et al. J. Lipid. Res. (1999) 40(5) 781-96). Il a été récemment démontré en particulier que les fibroblastes et les macrophages sont le siège d'une translocation active de cholestérol utilisant des apolipoprotéines pauvres en lipides telles que ApoA-I, ApoA-IL et Apo-E (Yokoyama S., Biochim. Biophys. Acta (1998) 1392(1), 1-15 ; Takahashi et al., PNAS (1999) 96(20), 11358-63).
Diverses maladies liées à une déficience en HDL, et notamment de la voie active de translocation de cholestérol, ont été décrites. Il s'agit notamment de la maladie de Tangier et de la déficience familiale en HDL (FHD) (Remaley et al., Arterioscl. Thromb. Vase. Biol. (1997) 17(9) 1813-21 ; Marcil et al., Arterioscl. Thromb. Vase. Biol (1999) 19(1), 159-69 ; Francis et al. (1995) J. Clin. Invest. 96(1), 78-87).
La maladie de Tangier semble en effet liée à un déficit cellulaire dans la voie active de translocation du cholestérol cellulaire, qui conduit à une dégradation des HDLs et à une perturbation du métabolisme lipoprotéique. En effet, les particules n'incorporant pas de cholestérol à partir des cellules périphériques et ne pouvant pas être métabolisées correctement, sont éliminées rapidement de l'organisme. La concentration plasmatique en HDL circulante de ces patients est donc extrêmement réduite et les HDLs n'assurent donc plus le retour du cholestérol vers le foie. Le cholestérol en excès accumulé dans les cellules et tissus périphériques provoque des manifestations cliniques caractéristiques telles que la formation des amygdales orangées (Serfaty-Lacrosniere et al. (1994) Athérosclerosis 107(1) 85-98).
Les affections familiales liées au métabolisme du HDL se caractérisent également par une faible concentration des particules de HDL, et sont le plus souvent détectées chez les patients affectés de maladies coronariennes (Marcil et al., The Lancet (1999) 354(9187), 1341-6). Cet effet cardio-protecteur du HDL s'explique probablement par son implication dans le transport du cholestérol des tissus périphériques vers le foie (Bruce et al. Annu. Rev. Nutr. (1998) 18, 297-3130).
Le produit du gène ABCAl est susceptible de jouer un rôle dans la régulation du métabolisme cellulaire du cholestérol et dans le transport inverse de cholestérol et de phospholipides. A cet égard, il a été récemment démontré que le gène ABCAl est un gène clé dans la voie active de translocation du cholestérol des cellules aux HDL. En effet, il a été observé que le transporteur ABCAl était muté chez les patients affectés dans le transport inverse du cholestérol, et notamment chez les patients atteints à la fois de la maladie de Tangier et de la déficience familiale en HDL (Lawn et al, J. Clin. Invest. (1999) 104(8) 125-31 ; Bodzioch et al, Nαt. Genêt. (1999) 22(4), 347-51 ; Orso et al., Nat. Genêt. (2000) 24(2), 192-6).
Par conséquent, la présence de mutations ou polymorphismes dans la séquence nucléotidique de ABCAl semble constituer au même titre que la concentration plasmatique de HDL, un bon facteur de risque permettant de dépister une affection coronarienne.
La forte incidence des maladies coronariennes qui est une principale cause de mortalité dans les pays développés montre clairement la nécessité de disposer d'outils de détection d'une part des polymorphismes alléliques du gène ABCAl, ainsi que de compositions, de procédés et des kits permettant de diagnostiquer les risques coronariens ou une prédisposition à une maladie, en particulier liée à un déficit en HDL circulant, qui serait susceptible de conduire à une angine de poitrine, un infarctus du myocarde, une athérosclérose, ou une déficience familiale en HDL comme la maladie de Tangier, dont les symptômes sont décrits ci-avant. Le gène ABCAl humain a été récemment clone et caractérisé et est décrit notamment dans les demandes PCT/FROO/01595, EP99402668, et par Santamarina- Fojo et al, PNAS (2000) 97(14), 7987-7992). Il a une taille totale de 149kb, et comprend une séquence promotrice de l,453kb, des séquences codante et intronique de 146,581 kb, et une région 3' de lkb. Il est constitué de 50 exons et donc de 49 introns. L'exon 1 code pour l'extrémité 5' non traduite (5' UTR) est suivi d'un grand intron de 24,156 kb de long, et l'exon 2 contient la partie restante de l'extrémité 5 'UTR, et code pour les 21 premiers acides aminés de l'extrémité N terminale de la protéine ABCAl. Le gène ABCAl code pour la protéine transporteur ABCAl de 2261 acides aminés. L'analyse de la séquence régulatrice en amont du gène humain ABCAl a permis d'identifier une boite TATA (TCTATAAAAG) 33 pb en amont du site d'initiation de la transcription, de nombreux sites de liaison de facteurs de transcription ubiquitaires tels que SP1, NF-kB, des protéines activatrices (AP-1, -2, et -4), et trois motifs E-box (5'-CANNTG- 3'), ainsi que plusieurs sites de fixation de facteur nucléaire hépatocytaire (HNF)-3 β .
Les demandeurs ont découvert de manière surprenante et inattendue un certain nombre de polymorphismes dans le gène humain codant pour le transporteur ABCAl. Les demandeurs ont par ailleurs découvert une corrélation statistiquement significative entre la présence de certains polymorphismes alléliques du gène ABCAl et la prédisposition d'un sujet à développer une pathologie coronarienne, telle que notamment un risque d'infarctus du myocarde.
La présente invention a donc pour objet des acides nucléiques isolés codant pour des variants polymorphes du transporteur ABCAl humain, susceptibles d'être liés avec un risque coronarien, tel qu'un risque d'infarctus du myocarde, d'affection cardiovasculaire ou plus généralement toute affection due à une déficience en HDL. La présente invention a également pour objet les séquences polypeptidiques polymorphes du transporteur ABCAl humain produites par les formes alléliques de ABCAl. En outre, la présente invention a pour objet des vecteurs recombinants comprenant ces acides nucléiques, des cellules comprenant les vecteurs, et les méthodes de production de polypeptides variants obtenus par culture des cellules dans des conditions permettant l'expression de ces polypeptides.
Selon un autre aspect, la présente invention a pour objet des moyens de détection appropriés, sondes ou amorces, spécifiques de certains de ces polymorphismes dans le gène humain ABCAl, susceptibles d'être associés à des risques coronariens, tels que par exemple un risque d'infarctus du myocarde, ou à une réponse pharmacologique particulière vis-à-vis d'une molécule thérapeutique. La présente invention concerne également un procédé et des kits permettant de détecter une séquence des polymorphismes au niveau de la séquence du transporteur ABCAl d'un sujet humain, et consiste à (i) isoler un échantillon d'ADN dudit sujet, (ii) amplifier les régions contenant le gène ABCAl, (iii) déterminer la présence ou l'absence d'un ou plusieurs polymorphismes au niveau de la région d'ADN amplifiée. De tels polymorphismes peuvent être liés à d'autres polymorphismes dans un profil polymorphe, qui est associé avec une prédisposition à une maladie ou à un désordre métabolique.
Encore selon un autre aspect, la présente invention concerne une méthode permettant de diagnostiquer le risque d'une affection cardiovasculaire chez un patient. La méthode consiste à comparer deux profils polymorphes. Le premier profil est celui du patient que l'on souhaite tester, et le deuxième est un profil polymorphe de référence qui est dérivé d'une population d'individus témoins ayant un risque cardiovasculaire ou coronarien prédéterminé tel que par exemple un risque d'infarctus du myocarde. La comparaison entre les séquences polymorphes test et témoin donne une bonne indication du facteur de risque du sujet présentant une séquence polymorphe ABCAl .
DEFINITIONS GENERALES
Les termes « acide nucléique » ou « polynucléotide » font référence à des polymères contenant des bases puriques et pyrimidiques. Il s'agit de polyribonucléotides, de polydésoxyribonucléotides, ou de polynucléotides mixtes polyribo-polydésoxyribomicléotides. Les acides nucléiques comprennent les molécules simple et double brins, de type ADN-ADN, ADN-ARN, et ARN, ou les «protein nucleic acid » (PNA) formés par conjugaison de bases à un squelette amino acide. Les acides nucléiques incluent également les molécules comprenant des bases modifiées et des liaisons phosphodiester analogues synthétiques, telles que les phosphorothioates et les thioesters. Le terme acide nucléique, en particulier les molécules d'ADN, d'ARN, font référence seulement à une structure primaire ou secondaire de la molécule, et n'est pas limitée par une configuration tertiaire particulière. Par conséquent, le terme inclue l'ADN double brin, qui se trouve entre autres dans les molécules d'ADN linéaire ou circulaire (dans les fragments de restriction), les plasmides, et les chromosomes. La structure des molécules d'ADN double brin sont décrites en utilisant la direction conventionnelle, c'est à dire 5'-> 3' du brin non transcrit de l'ADN ou brin sens (ayant une séquence homologue de l'ARN ). Une molécule d'ADN recombinant est une molécule d'ADN qui a été soumise à des manipulations de biologie moléculaire. On entend par acide nucléique ou un polypeptide « isolé » au sens de la présente invention, un acide nucléique ou un polypeptide qui a été soustrait à son environnement d'origine naturel. Un acide nucléique ou polypeptide isolé contient moins d'environ 50%, de préférence moins de 75%, et encore plus préférentiellement moins de 90% de composants cellulaires.
Un acide nucléique ou une séquence polypeptidique dérivée correspond à une région d'une séquence désignée particulière, et inclut pour les acides nucléiques, les séquences qui sont identiques ou complémentaires.
Aux fins de la présente invention, l'expression « séquence nucléotidique » peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique, englobe le matériel génétique lui-même, et n'est donc pas restreinte à l'information contenant sa séquence.
Au sens de la présente invention, le terme « oligonucléotide » fait référence à un acide nucléique, comprenant généralement au moins 10, de préférence 15, et plus préférentiellement au moins 20 nucléotides, qui est capable de s'hybrider à une molécule d'ADN génomique, à une molécule d'ARNm codant pour un gène, à un cDNA, ou toute autre molécule d'intérêt. Les oligonucléotides peuvent être marqués , par exemple avec des nucléotides 32P, ou des nucléotides sur lesquels sont fixés par liaison covalente, un marqueur fluorescent, ou un marqueur tel que la biotine. L'oligonucléotide peut être une sonde capable de détecter la présence d'un acide nucléique. Alternativement, Toligonucléotide peut être une amorce PCR, et peut être utilisée pour cloner la séquence complète ou un fragment d'un gène d'intérêt. L'oligonucléotide peut former en outre une triple hélice avec une séquence double brin d'intérêt sur une molécule d'ADN. Enfin, une banque d'oligonucléotides peut être fixée sur un support solide afin de détecter différents polymorphismes d'intérêt. Généralement, les oligonucléotides sont synthétiques, et peuvent comprendre des liaisons phosphodiester ou des liaisons thioester.
Une sonde fait référence à un acide nucléique ou à un oligonucléotide capable de s'hybrider à une séquence sur un acide nucléique cible du fait de la complémentarité d'au moins une partie de la sonde avec une séquence de l'acide nucléique cible. Cette sonde est généralement marquée afin d'être détectable après hybridation.
Une molécule d'acide nucléique s'hybride à une molécule d'acide nucléique, tel qu'un cDNA, un ADN génomique, ou un ARN, lorsque la forme simple brin de la molécule d'acide nucléique peut se stabiliser avec une autre molécule d'acide nucléique simple brin selon les conditions appropriées de température et de force ionique de la solution d'hybridation (Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press : Cold Spring Harbor, New- York). Les conditions de température et de force ionique déterminent la stringence de l 'hybridation.
On utilise pour un criblage préliminaire des acides nucléiques homologues, des conditions de basse stringence (température égale à 55°C, 5XSSC à 0,1% SDS, 0,25 % lait, sans formamide ; ou 30% formamide, 5XSSC à 0,5%SDS).
Pour des conditions modérées d'hybridation, on utilise une température plus élevée, avec 50% de formamide, et 5X ou 6XSSC. Bien que la réaction d'hybridation nécessite la complémentarité des acides nucléiques, des mésappariements entre les bases sont acceptables. La stringence adaptée à l'hybridation d'un acide nucléique dépend de la longueur de l'acide nucléique et du degré de complémentarité, qui sont des variables bien connues en biologie moléculaire. Plus le degré de similarité et d'homologie entre deux séquences nucléotidique est élevé, plus une température d'hybridation élevée peut être utilisée. Pour les hybrides ayant une taille supérieure à 100 nucléotides, le calcul de la température d'hybridation se fait par les équations décrites dans Sambrook et al. Pour l'hybridation d'acides nucléiques de taille inférieure, tels que les oligonucléotides, la position des mésappariements est importante, et la longueur de l'oligonucléotide détermine sa spécificité. Celui-ci a en général une longueur minimale de 10 nucléotides, de préférence au moins 15 nucléotides, et encore plus préférentiellement 20 nucléotides.
Pour des conditions d'hybridation de forte stringence , on utilise les conditions suivantes :
1- Compétition des membranes et PRE HYBRIDATION :
- Mélanger : 40μl ADN sperme de saumon (1 Omg/ml)
+ 40 μl ADN placentaire humain (1 Omg/ml) - Dénaturer 5 mn à 96°C, puis plonger le mélange dans la glace.
- Oter le tampon 2X SSC et verser 4 ml de mix formamide dans le tube d'hybridation contenant les membranes.
- Ajouter le mélange des deux ADNs dénaturés.
- Incubation à 42°C pendant 5 à 6 heures, avec rotation.
2- Compétition de la sonde marquée :
- Ajouter à la sonde marquée et purifiée 10 à 50 μl ADN Cot L selon la quantité d'hybridations non spécifiques.
- Dénaturer 7 à 10 mn à 95°C. - Incuber à 65°C pendant 2 à 5 heures. 3- Hybridation:
- Oter le mix de pré hybridation.
- Mélanger 40 μl ADN sperme de saumon + 40 μl ADN placentaire humain ; dénaturer 5 mn à 96°C, puis plonger dans la glace. - Ajouter dans le tube d'hybridation 4 ml de mix formamide, le mélange des deux ADN et la sonde marquée/ADN Cot I dénaturée.
- Incuber 15 à 20 heures à 42°C, avec rotation.
4- Lavages : - Un lavage à température ambiante dans du 2xSSC, pour rincer.
- 2 fois 5 minutes à température ambiante 2xSSC et 0,1%» SDS
- 2 fois 15 minutes 0,lxSSC et 0,1%SDS à 65°C. Envelopper les membranes dans du Saran et exposer.
Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur variable de 20 nucléotides à plusieurs centaines de nucléotides.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (Eds., (1985)
Nucleic Acid hybridization, a practical approach, IRL Press, Oxford) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al (Current Protocols in Molecular Biology, Green
Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y).
Un gène fait référence à une séquence d'acide nucléique correspondant à une séquence présente dans le génome qui comprend (i) la région codante, qui comprend des exons, des introns, et des séquences à la jonction entre les exons et les introns, et (ii) des séquences de régulation en 5' et 3' de la région codante. On entend par « transporteur ABCAl » la protéine transporteur ABCAl ayant l'ADNc de séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 (Figure 1), et la séquence peptidique SEQ ID NO : 2 (Figure 2). En outre, plusieurs séquences nucléotidiques génomiques partielles du gène ABCAl ont été isolées et caractérisées, ces séquences génomiques comprenant à la fois des séquences exoniques et des séquences introniques. Certaines de ces séquences génomiques partielles sont représentées dans le tableau 1 ci-après.
Tableau 1 Séquences génomiques partielles du gène ABC1 humain
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Par «polymorphisme mononucléotide ou SNP », on entend la substitution, l'insertion ou la délétion d'un simple nucléotide dans la séquence nucléotidique d'un gène entre plusieurs individus. Lorsque le polymorphisme se présente sous la forme d'une insertion ou d'une délétion, il peut s'agir d'une insertion ou d'une délétion d'un ou plusieurs nucléotides à une position d'un gène. Les différentes séquences nucléotidiques d'un même gène du fait d'un polymorphisme, sont des allèles. Une «position polymorphe » est une position prédéterminée dans la séquence d'un gène qui comprend un SNP. Dans certains cas, les polymorphismes génétiques provoquent une variation dans la séquence d'acides aminés, et donc d'une position polymorphe peut résulter en un polymorphisme dans la séquence amino acide à une position prédéterminée de la séquence du polypeptide. Un individu homozygote pour un polymorphisme particulier, porte sur les deux copies du même gène, la même séquence polymorphe à la même position. Un individu hétérozygote pour un polymorphisme particulier porte sur les deux copies du gène, des séquences différentes au niveau de la position polymorphe.
On entend par «profil polymorphe », un ou plusieurs polymorphismes simple nucléotide, qui peut être présent sur la séquence d'un seul gène ou d'une pluralité de gènes. Un profil polymorphe simple comprend un SNP dans une seule position d'un ou de deux allèles d'un individu (polymorphisme allélique). Un profil polymorphe test correspond au polymorphisme caractéristique d'un individu qui fait l'objet d'un diagnostic par exemple d'une prédisposition à une maladie associée à une déficience du gène ABCAl, telle qu'une déficience métabolique du type FHD ou une affection cardiovasculaire, ou un risque d'infarctus du myocarde. Le profil polymorphe de référence ou témoin a été déterminé par corrélation statistiquement significative des profils dans une population d'individus qui présentent un risque coronarien.
POLYMORPHISMES DU GENE ABCAl
La présente invention est basée sur la découverte de 90 polymorphismes dans la séquence du gène humain ABCAl telle que représentée aux séquences SEQ ID NO: 3-22, dont 22 SNPs sont trouvés dans la séquence promotrice en amont du gène ABCAl humain de SEQ ID NO: 23. Certains SNPs selon la présente invention conduisent à des altérations structurales dans la séquence polypeptidique de la protéine transporteur ABCAl humaine représentée à la SEQ ID NO : 2.
Pour l'identification et la caractérisation d'ADN polymorphe de ABCAl, des réactions de polymérisation en chaîne (PCR) ont été réalisées pour amplifier les séquences de ABCAl à partir d'ADN génomique humain provenant de trois groupes ethniques différents, à savoir une population caucasienne, une population japonaise, et/ou une population africaine. Les produits de PCR sont séquences, et les séquences sont comparées entre elles et avec les séquences de référence SEQ ID NO : 3-23.
Le tableau 2 présente les polymorphismes alléliques dans les exons et les introns du gène ABCAl humain selon la présente invention. H indique notamment la position polymorphe dans chacun des exons par rapport au premier nucléotide de l'exon de référence, et dans chacun des introns par rapport à l'extrémité 3' ou en amont de l'extrémité 5' de l'exon le plus proche, les séquences 5' et 3' de part et d'autre de la position polymorphe, la fréquence d'apparition du polymorphisme dans les trois populations testées, africaine, caucasienne et japonaise. Dans les cas où ces fréquences n'ont pu être déterminées, il est indiqué « n.d. ». Certains polymorphismes se traduisent par des altérations structurales dans la séquence peptidique de la protéine transporteur ABCAl humaine, et plus précisément par la substitution d'un acide aminé par un autre (MIS). D'autres polymorphismes dans les séquences exoniques sont dits silencieux (SEL), la séquence protéique ABCAl restant inchangée. Enfin, lorsque le polymorphisme est localisé dans un intron ou dans un exon non codant, la séquence polymorphe est dite non codante (NCD). Les polymorphismes identifiés dans les différents exons et introns du gène ABCAl sont décrits en détails ci-après. Tableau 2
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Polymorphismes alléliques dans les exons et les introns du gène ABCA1 humain
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Mutation dans l'exon la
La mutation s-35ela consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une guanine (G) en position 35 de l'exon la, soit à la position 2928 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 3. L'exon la portant ce polymorphisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 24. L'ADNc portant le polymorphisme dans l'exon la du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 92.
Mutations dans l'exon lb
Une première mutation est désignée s-16elb et consiste en l'insertion d'une guanine (G) en position 16 de l'exon lb, soit à la position 115 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 4. L'exon lb portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 25. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon lb du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 93.
Une deuxième mutation désignée s-76elb consiste en la substitution d'une guanine (G) par une cytosine (C) en position 76 de l'exon lb, soit à la position 175 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 4. L'exon lb portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 26. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon lb du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 94.
Mutation dans l'intron 3
La mutation s-m39i3 consiste en la substitution d'une cytosine (C) en en une adénine (A) position -39 de l'extrémité 3' de l'intron 3, soit à la position 10646 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 5. La séquence nucléotidique de l'intron 3 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 27. Mutation dans l'intron 4
La mutation s-25i4 consiste en la substitution d'une cytosine (C) en une thymidine (T) position 25 de rextrémité 5' de l'intron 4, soit à la position 10828 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 5. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 4 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ ID NO :28.
Mutation dans l'exon 5
La mutation s-53e5 consiste en la substitution d'une guanine (G) en une adénine (A) position 53 de l'exon 5, soit à la position 306 par rapport à la séquence
SEQ ID NO: 6. L'exon 5 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 29. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 5 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 95.
Mutations dans l'exon 6
La mutation désignée s-108e6 consiste en la substitution d'une adénine (A) en une guanine (G) en position 108 de l'exon 6, soit à la position 268 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 7. L'exon 6 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 30. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 6 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 96.
La mutation s-113e6 consiste en la substitution d'une guanine (G) en une adénine (A) en position 113 de l'exon 6, soit à la position 273 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 7. La séquence de l'exon 6 du gène ABCAl portant ce polymoφhisme est le polynucléotide de séquence SEQ ID NO : 31. L'ADNc muté portant le polymoφhisme dans l'exon 6 est représenté dans la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 97, code pour un polypeptide ABCAl variant d'une longueur de 2261 acides aminés, de séquence SEQ ID NO : 127.
Mutation dans l'intron 7
La mutation s-ml4i7 consiste en l'insertion d'une adénine (A) en position - 14 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 7, soit à la position 589 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 8. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 7 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 32.
Mutations dans l'exon 8
La mutation s-123e8 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 123 de l'exon 8, soit à la position 726 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 8. L'exon 8 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 33. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 8 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 98.
La mutation s-135e8 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 135 de l'exon 8, soit à la position 738 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 8. L'exon 8 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 34. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 8 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 99.
Mutation dans l'intron 8
La mutation s-m89i8 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position -89 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 8, soit à la position 525 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 9. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 8 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ ID NO .- 35.
Mutations dans l'intron 9
La mutation s-ml04i9 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position -104 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 9, soit à la position 981 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 9. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 9 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 36.
La mutation s-m61i9 consiste en une insertion d'une guanine (G) en position -61 en amont de l'extrémité 3' de intron 9, soit à la position 1023 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 9. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 9 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 37.
La mutation s-m41i9 consiste en une délétion d'un fragment de trois nucléotides « CTC » du nucléotide en position - 1 au nucléotide —43 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 9, soit à la position 1042-4044 par rapport à la séquence
SEQ ID NO : 9. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 9 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 38.
La mutation s-ml3i9 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine(T) en position -13 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 9, soit à la position 1072 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 9. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 9 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ
ID NO : 39. Mutation dans l'exon 12
La mutation s-126el2 consiste en la substitution d'une cytosine (C) en une thymine (T) en position 126 de l'exon 12, soit à la position 765 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 10. L'exon 12 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 40. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 12 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 100.
Mutation dans l'intron 12
La mutation s-m29il2 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position -29 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 12, soit à la position 1337 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 10. La séquence nucléotidique de l'intron 12 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ ID NO :
41.
Mutations dans l'intron 13
La mutation s-24il3 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une adénine (A) en position 24 de l'extrémité 5' de l'intron 13, soit à la position 1566 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 10. La séquence nucléotidique de l'intron 13 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ ID NO :
42.
La mutation s-m59il3 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymme (T) en position -59 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 13, soit à la position 3270 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 10. La séquence nucléotidique de l'intron 13 portant ce polymoφhisme a la séquence SEQ ID NO : 43.
Mutation dans l'exon 14 La mutation s-148el4 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une adénine (A) en position 148 de l'exon 14, soit à la position 3476 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 10. L'exon 14 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 44. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 14 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 101.
Mutations dans l'intron 14
La mutation s-81il4 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 81 de l'extrémité 5' de l'intron 14, soit à la position 3632 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 10. La séquence nucléotidique de l'intron 14 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 45.
La mutation s-115il4 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une adénine (A) en position 115 de l'extrémité 5' de l'intron 14, soit à la position 3666 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 10. L'intron 14 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 46.
Mutation dans l'exon 15
La mutation s-196el5 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 196 de l'exon 15, soit à la position 5492 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 10. L'exon 15 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 47. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 15 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 102, et code pour une protéine ABCAl mutée SEQ ID NO : 128 dans laquelle une valine (V) est substituée par une méthionine (M) en position 771.
Mutation dans l'exon 16 La mutation s-136el6 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 136 de l'exon 16, soit à la position 6714 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 10. L'exon 16 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 48. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 16 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 103, et code pour une protéine ABCAl mutée de séquence SEQ ID NO : 129, qui comprend la substitution d'une valine (V) en isoleucine (I) en position 825.
Mutations dans l'exon 17
La mutation s-27el7 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une cytosine (C) en position 27 de l'exon 17, soit à la position 7914 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 10. L'exon 17 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 49. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 17 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 104, et code pour une protéine ABCAl mutée SEQ ID NO : 130 dans laquelle une tyrosine (Y) est substituée par une proline (P) en position 857.
La mutation s-107el7 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 107 de l'exon 17, soit à la position 7994 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 10. L'exon 17 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 50. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 17 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 105, et code pour une protéine ABCAl mutée SEQ ID NO : 131 dans laquelle une isoleucine (I) est substituée par une méthionine (M) en position 883. Mutations dans l'intron 17
La mutation s-60il7 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une cytosine (C) en position 60 de l'extrémité 5' de l'intron 17, soit à la position 8061 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 10. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 17 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 51.
La mutation s-m68il7 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une guanine (G) en position -68 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 17, soit à la position 319 par rapport à la séquence SEQ Tû NO: 11. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 17 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ ÏÏ) NO : 52.
Mutation dans l'exon 18
La mutation s-4el8 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une thymine (T) en position 4 de l'exon 18, soit à la position 390 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 11. L'exon 18 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 53. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 18 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 106, et code pour une protéine ABCAl mutée SEQ ID NO : 132 dans laquelle une cystéine (C) est substituée par une phénylalanine (F) en position 887.
La mutation s-40el9 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 40 de l'exon 19, soit à la position 943 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 12. L'exon 19 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 54. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 19 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 107. Mutations dans l'intron 19
La mutation s-18il9 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 18 de l'extrémité 5' de l'intron 19, soit à la position 1053 par rapport à la séquence SEQ ED NO: 12. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 19 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ ID NO :55.
La mutation s-ml0il9 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position —10 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 19, soit à la position 274 par rapport à la séquence SEQ .ÏÏD NO: 13. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 19 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 56.
Mutation dans l'exon 22
La mutation s-123e22 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 123 de l'exon 22, soit à la position 1592 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 13. L'exon 22 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 57. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 22 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 108, et code pour une protéine ABCAl mutée SEQ ID NO : 133 dans laquelle une leucine (L) est substituée par une cystéine (C) en position 1122.
Mutation dans l'intron 22
La mutation s-m65i22 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position -65 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 22, soit à la position 2884- par rapport à la séquence SEQ ID NO: 13. La séquence nucléotidique de l'intron 22 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ Tu NO : 58.
Mutation dans l'exon 23
La mutation s-54e23 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une cytosine (C) en position 54 de l'exon 23, soit à la position 3002 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 13. L'exon 23 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 59. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 23 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 109, et code pour une protéine ABCAl mutée SEQ ID NO : 134 dans laquelle un acide glutamique (E) est substitué par un acide aspartique (D) en position 1172.
Mutations dans l'intron 23
La mutation s-149i23 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 149 de l'extrémité 5' de l'intron 23, soit à la position 3170 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 13. La séquence nucléotidique de l'intron 23 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 60.
La mutation s-m50i23 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position -50 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 23, soit à la position 3958 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 13. La séquence de l'intron 23 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 61.
Mutations dans l'exon 24
La mutation s-98e24 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 98 de l'exon 24, soit à la position 4105 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 13. L'exon 24 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 62. L'ADNc correspondant à la mutation dans l'exon 24 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ Tu NO : 110.
La mutation s-149e24 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 149 de l'exon 24, soit à la position 4156 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 13. L'exon 24 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 63. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 24 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 111.
Mutation dans l'exon 27
La mutation s-44e27 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 44 de l'exon 27, soit à la position 604 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 14. L'exon 27 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 64. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 27 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 112.
Mutations dans l'exon 30
La mutation s-7e30 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 7 de l'exon 30, soit à la position 6854 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 14. L'exon 30 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 65. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 30 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 113.
La mutation s-166e30 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une thymine (T) en position 166 de l'exon 30, soit à la position 7013 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 14. L'exon 30 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ Tu NO : 66. L'ADNc correspondant à la mutation dans l'exon 30 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 114.
Mutation dans l'intron 31
La mutation s-30i31 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une guanine (G) en position 30 de l'extrémité 5' de l'intron 31, soit à la position 1307 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 15. La séquence nucléotidique de l'intron 31 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 67.
Mutations dans l'intron 32
La mutation s-ml42i32 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une ( thymine (T) en position -142 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 32, soit à la position 3600 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 15. La séquence nucléotidique de l'intron 32 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ ID NO :
68.
La mutation s-ml30i32 consiste en une insertion de deux nucléotides en position -130 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 32, soit à la position 3611 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 15. La séquence nucléotidique de l'intron 32 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ ID NO :
69.
La mutation s-m26i32 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une cytosine (C) en position —26 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 32, soit à la position 3716 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 15. La séquence nucléotidique de l'intron 32 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence nucléotidique
SEQ ID NO : 70. Mutation dans l'intron 33
La mutation s-m74i33 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une adénine (A) en position —74 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 33, soit à la position 5247 par rapport à la séquence SEQ TD NO: 15. La séquence nucléotidique de l'intron 33 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ ID NO :
71.
Mutation dans l'exon 34
La mutation s-62e34 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 62 de l'exon 34, soit à la position 5382 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 15. L'exon 34 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 72. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 34 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 115, et code , pour une protéine ABCAl mutée de SEQ ID NO : 135, dans laquelle une arginine (R) a été remplacée par une lysine (K) en position 1587.
L'analyse de ce polymoφhisme dans une population ECTIM (étude cas- témoin de l'infarctus du myocarde), qui comprend une étude de patients ayant survécu à un infarctus du myocarde et de sujets contrôles de type caucasien (Parra et al., Arteriosclerosis and Thrombosis, (1992) 12(6), 701-707), montre que ce polymoφhisme est associé à des taux moyens plus bas de HDL, d'apolipoprotéine A- I et A-Il, et de cholestérol. Plus précisément, ce polymoφhisme se trouve associé de façon significative à une diminution d'environ 5mg/dl du taux d'apolipoprotéine A-I (F=18,6 p<0,0001). Le polymoφhisme s-62e34 selon l'invention, qui entraîne le remplacement d'une arginine (R) par une lysine (K) en position 1587 de la protéine ABCAl, constitue une mutation fonctionnelle qui affecte les taux de cholestérol HDL, d' d'apolipoprotéine A-I et d'apolipoprotéine A-Il et prédispose à un risque cardiovasculaire.
Mutations dans l'exon 36
La mutation s-77e36 consiste en la substitution d'une guanine (G) en une adénine (A) en position 77 de l'exon 36, soit à la position 1064 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 16. L'exon 36 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 73. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 36 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ Tû NO : 116, et code pour une protéine ABCAl mutée de SEQ ID NO 136, dans laquelle une valine (V) est substituée par une isoleucine (I) en position 1674.
Mutation dans l'intron 36
La mutation s-55i36 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une cytosine (C) en position 55 de l'extrémité 5' de l'intron 36, soit à la position 1220 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 16. L'intron 36 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique partielle SEQ ID NO : 74.
Mutation dans l'exon 38
La mutation s-64e38 consiste en la substitution d'une thymine (T) en une cytosine (C) en position 64 de l'exon 38, soit à la position 835 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 17. L'exon 38 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 75. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 38 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO :117.
Mutations dans l'intron 39
La mutation S-25H39 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une guanine (G) en position 251 de l'extrémité 5' de l'intron 39, soit à la position 375 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 18. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 39 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 76.
La mutation s-252i39 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une cytosine (C) en position 252 de l'extrémité 5' de l'intron 39, soit à la position 376 par rapport à la séquence SEQ ID NO : 18. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 39 portant ce pόlymoφhisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 77.
Mutation dans l'intron 40
La mutation s-ml 19i40 consiste en la substitution d'une cytosine (C) en une thymine (T) en position —119 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 40, soit à la position 710 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 19. La séquence nucléotidique de l'intron 40 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ ID NO :78.
Mutation dans l'intron 44
La mutation s-m69i44 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une cytosine (C) en position -69 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 44, soit à la position 108 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 20. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 44 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 79. Mutation dans l'exon 45
La mutation s-114e45 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 114 de l'exon 45, soit à la position 290 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 20. L'exon 45 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 80. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 45 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO :118.
Mutation dans l'intron 45
La mutation s-m34i45 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position —34 en amont de l'extrémité 3' de l'intron 45, soit à la position 343 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 21. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 45 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ
ID NO : 81.
Mutations dans l'intron 47
La mutation s-13i47 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 13 de l' extrémité 5' de l'intron 47, soit à la position 1068 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 21. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 47 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 82.
La mutation s-86i47 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une cytosine (C) en position 86 de l'extrémité 5' de l'intron 47, soit à la position 1141 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 21. La séquence nucléotidique partielle de l'intron 47 portant ce polymoφhisme est représentée à la séquence SEQ ID NO : 83. Mutations dans l'exon 49
La mutation s-377e49 consiste en la substitution d'une thymine (T) par une cytosine (C) en position 377 de l'exon 49, soit à la position 571 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 22. L'exon 49 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 84. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 49 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 119.
La mutation s-833e49 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 833 de l'exon 49, soit à la position 1027 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 22. L'exon 49 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 85. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 49 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 120.
La mutation s-1580e49 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 1580 de l'exon 49, soit à la position 1773 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 22. L'exon 49 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 86. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 49 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 121.
La mutation s-1791e49 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une thymine (T) en position 1791 de l'exon 49, soit à la position 1985 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 22. L'exon 49 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 87. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 49 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 122.
La mutation s-2034e49 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 2034 de l'exon 49, soit à la position 2228 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 22. L'exon 49 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 88. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 49 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 123.
La mutation s-2049e49 consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 2049 de l'exon 49, soit à la position 2243 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 22. L'exon 49 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 89. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 49 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 124.
La mutation s-2449e49 consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 2449 de l'exon 49, soit à la position 2643 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 22. L'exon 49 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 90. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 49 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 125.
La mutation s-2843e49 consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 2843 de l'exon 49, soit à la position 3037 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 22. L'exon 49 portant ce polymoφhisme a la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 91. L'ADNc portant le polymoφhisme dans l'exon 49 du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 126.
Certains polymoφhismes retrouvés au sein des régions codantes, qui correspondent essentiellement à des substitutions d'un seul nucléotide localisé sur la troisième base des codons du cadre ouvert de lecture de ABCAl, n'entraînent pas de modifications quant à la nature de l'acide aminé codé, compte tenu des règles de dégénérescence génétique chez l'homme, bien connues de l'homme du métier. Les polymoφhismes qui n'altèrent pas la séquence d'acide aminé peuvent toutefois avoir une fonction biologique importante, qui peuvent avoir un effet sur la concentration de HDL circulante, et donc d'apolipoprotéine A-I ou A-IL De tels polymoφhismes peuvent par exemple affecter la régulation de la transcription ou la traduction, par exemple en agissant sur la stabilité de l'ARNm, l'épissage, le taux de transcription, de traduction et la fidélité de la traduction.
AUTRES POLYMORPHISMES
Selon l'invention, d'autres polymoφhismes ont été découverts dans la région promotrice en amont du gène ABCAl humain. Les positions polymoφhes sont représentées à la figure 3 par des nucléotides marqués en gras (et soulignés lorsqu'il s'agit des bases encadrant une insertion) sur la séquence du promoteur du gène
ABCAl humain sauvage de séquence SEQ JD NO : 23.
Le tableau 3 présente par ailleurs les polymoφhismes alléliques dans la séquence promotrice du gène ABCAl humain selon la présente invention. Il est indiqué le nom, les allèles sauvage et mutant, les positions polymoφhes, et la fréquence d'apparition des polymoφhismes alléliques dans deux groupes de population, la population caucasienne et la population japonaise.
Tableau 3
Figure imgf000041_0001
Polymorphismes alléliques dans le promoteur du gène ABCA1 humain
Figure imgf000041_0002
Figure imgf000042_0001
Figure imgf000042_0002
Le polymoφhisme S-2389p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 505 du premier nucléotide de la séquence SEQ Tu NO :
23, ou en position —2389 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme S-2389p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 137.
Le polymoφhisme Sins-2176-2177p consiste en une insertion de la séquence
GGAGGGGAGG en 717 du premier nucléotide de la séquence SEQ K) NO : 23 ou en position— 2176 par rapport au site d'initiation de la transcription. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme Sins-2176-2177p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 138.
Le polymoφhisme S-1814p consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 1080 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO :
23 ou en position —1814 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme S-1814p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 139.
Le polymoφhisme S-1801p consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 1093 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO :
23 ou en position— 1801 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme S-1801p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 140.
Le polymoφhisme S-1652p consiste en la substitution d'une adénine (A) par une guanine (G) en position 1242 du premier nucléotide de la séquence SEQ Tu NO : 23 ou en position— 1652 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme S-1652p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 141.
Le polymoφhisme S-1506p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une cytosine (C) en position 1388 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position —1506 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme S-1506p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 142.
Le polymoφhisme S-1395p consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 1499 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position —1395 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme S-1395p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 143.
Le polymoφhisme S-1252p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 1642 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position —1252 par rapport au site d'initiation de la transcription + 1. L'acide nucléique comprenant le polymbφhisme S-1252p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 144.
Le polymoφhisme S-1217p consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 1677 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position —1217 par rapport au site d'initiation de la transcription + 1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme S-1217p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 145.
Le polymoφhisme S-1099p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une thymine (T) en position 1795 du premier nucléotide de la séquence SEQ JD NO : 23 ou en position —1099 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme S-1099p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 146.
Le polymoφhisme Sins-1034-1035p consiste en une insertion d'une adénine et d'une thymine (AT) en position 1859 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position —1034 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme Sins-1034-1035p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 147.
Le polymoφhisme S-940p consiste en la substitution d'une thymine (T) en une guanine (G) en position 1954 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position —940 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme S-940p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 148.
Le polymoφhisme S-803p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une adénine (A) en position 2091 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position — 803 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme S-803p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 149.
Le polymoφhisme SΔ-777-774p consiste en une délétion d'un fragment de quatre nucléotides TTTG en position 2117 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position— 774 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme SΔ-777-774p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ TU NO : 150.
Le polymoφhisme SΔ-773-765p consiste en une délétion d'un fragment de neuf nucléotides TTTGTTTGT en position 2121 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position -765 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme SΔ-773-765p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 151.
Le polymoφhisme S-564p consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 2330 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO :
23 ou en position —564 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme S-564p dans la séquence régulatrice du gène
ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 152.
Le polymoφhisme S-407p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une cytosine (C) en position 2487 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO :
23 ou en position -407 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme S-407p dans la séquence régulatrice du gène
ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 153.
Le polymoφhisme S-302p consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 2592 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO :
23 ou en position — 302 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme S-302p dans la séquence régulatrice du gène
ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 154. Le polymoφhisme S-278p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une cytosine (C) en position 2616 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO :
23 ou en position -278 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme S-278p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 155.
Le polymoφhisme SΔ-223-219p consiste en une délétion d'un fragment de cinq nucléotides CACCC en position 2671 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO : 23 ou en position -219 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme SΔ-223-219p dans la séquence régulatrice du gène ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 156.
Le polymoφhisme S-99p consiste en la substitution d'une guanine (G) par une cytosine (C) en position 2795 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO :
23 ou en position — 99 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme S-99p dans la séquence régulatrice du gène
ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 157.
Le polymoφhisme S-14p consiste en la substitution d'une cytosine (C) par une thymine (T) en position 2880 du premier nucléotide de la séquence SEQ ID NO :
23 ou en position -14 par rapport au site d'initiation de la transcription +1. L'acide nucléique comprenant le polymoφhisme S-14p dans la séquence régulatrice du gène
ABCAl est représenté par la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 158.
Selon un premier aspect, l'invention concerne également les séquences nucléotidiques du gène ABCAl comprenant au moins un polymoφhisme biallélique tel que décrit ci-dessus. Ainsi, l'invention a pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention est également relative à un acide nucléique hybridant, dans des conditions de forte stringence, avec un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ JD NO : 24-126 et 137-158 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention est également relative à un acide nucléique ayant au moins 9 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 24-126 et 137-158, et comprenant la base polymoφhe ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention est également relative à un acide nucléique ayant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 24-126 et 137-158, et comprenant la base polymoφhe ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention a également pour objet un acide nucléique ayant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158, la base polymoφhe étant localisée au centre du fragment nucléotidique de 21 bases.
L'invention concerne en outre un acide nucléique dérivé d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158 comprenant la séquence polymoφhe, et au moins deux nucléotides situés de part et d'autre de la position polymoφhe ou un acide nucléique de séquence complémentaire. Un autre objet de l'invention concerne un acide nucléique codant pour un polypeptide choisi dans le groupe constitué de séquences d'acides aminés SEQ ID NO : 127-136.
L'invention concerne également un polypeptide comprenant une séquence d'acide aminé choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 127-136 .
Elle a également pour objet un anticoφs dirigé contre un polypeptide ABCAl polymoφhe comprenant une séquence d'acide aminé choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 127-136 , ou un fragment peptidique de ce dernier. De préférence, l'anticoφs selon la présente invention comprend un composé détectable. L'invention a également pour objet un acide nucléique contenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ou un acide nucléique d'intérêt lié de manière fonctionnelle à un" polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 137-158.
La présente invention a pour objet un vecteur de clonage et/ou d'expression recombinant qui porte un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ JD NO : 24-126 et 137-158, et au moins un des polymoφhismes tels que précédemment décrits. Elle concerne également une cellule hôte transformée par un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158, et au moins un des polymoφhismes tels que précédemment décrits ou par le vecteur recombinant décrit ci-dessus. Elle concerne en outre un mammifère transgénique non humain dont les cellules somatiques et/ou les cellules germinales ont été transformées par un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158, et au moins un des polymoφhismes tels que précédemment décrits ou par un vecteur recombinant tel que décrit ci-dessus. Selon un second aspect, l'invention a pour objet des sondes ou des amorces nucléotidiques capables de s'hybrider aux acides nucléiques de séquences SEQ ID NO : 24-126 et 137-158 et comprenant au moins une position polymoφhe ou aux acides nucléiques de séquence complémentaire.
Les sondes et amorces nucléotidiques comprennent un polynucléotide de séquence nucléotidique choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO : 24-126 et 137-158, ou d'une séquence complémentaire, contenant une des bases polymoφhes selon l'invention.
De préférence, une sonde nucléotidique selon l'invention a une longueur de 15, 16, 19 à 25, 35, 40, 50, 70, 80, 100, 200, 500, 1000, 1500 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide de séquence nucléotidique choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO 24-126 et 137-158, et comprenant au moins une base polymoφhe, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
De manière encore plus préférentielle, les sondes nucléotidiques sont constituées d'un acide nucléique comprenant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques
SEQ ID NO : 24-126 et 137-158. De préférence, la base polymoφhe est localisée au centre du fragment nucléotidique de 21 bases.
De préférence, une amorce nucléotidique selon l'invention a une longueur de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 à 40 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide de séquence nucléotidique choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID NO 24-126 et 137-158, et comprenant au moins une base polymoφhe, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire. De préférence, la base de l'extrémité 3' de ces amorces est complémentaire d'un nucléotide situé à 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 nucléotides ou plus du côté 3' de la position du polymoφhisme selon l'invention, présent dans l'une des séquences SEQ Tû NO 24-126 et 137-158 et/ou de leurs séquences complémentaires.
La définition d'une sonde et d'une amorce nucléotidique selon l'invention englobe donc des oligonucléotides qui hybrident, dans les conditions d'hybridation de forte stringence définies ci-avant, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences
SEQ ID NO : 24-126 et 137-158, comprenant au moins un des polymoφhismes définis précédemment, ou avec une séquence complémentaire de ces derniers.
Des exemples d'amorces et de couples d'amorces permettant d'amplifier différentes régions du gène ABCAl sont représentés ci-dessous.
Il s'agit par exemple du couple d'amorces représenté par l'amorce de séquence SEQ ID NO : 159 (ACCGAAGTAAGGAGTTGCTC) et l'amorce de séquence SEQ ID N°: 160 (ACTGTTTCACTAATACTTACTG).
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de Narang et al. (Methods Enzymol (1979) 68, 90-98) ou de Brown et al. (Methods Enzymol (1979) 68, 109- 151), la méthode aux diéthylphosphoramidites de Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. (1981) 22, 1859-1862), ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet EU N°EP 0 707 592. A titre illustratif, des amorces nucléotidiques appropriées selon la présente invention sont par exemple des amorces dont la base à l'extrémité 3' hybride avec la base localisée immédiatement du coté 3' de la base polymoφhe du fragment comprenant le polymoφhisme. Après une étape d'hybridation spécifique de l'amorce, une étape d'élongation avec un mélange de deux didéoxynucléotides complémentaires de la base polymoφhe dudit polymoφhisme, par exemple marqués par deux fluorophores distincts, puis une étape de détection du signal de fluorescence obtenu permet de déterminer lequel des deux didéoxynucléotides fluorescents différemment marqués a été incoφoré, et de déduire la nature de la base polymoφhe.
Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incoφorant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P, 33P, 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5-bromodeoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène, digoxigénine) ou encore des ligands tels que la biotine.
Le marquage des sondes est réalisé de préférence par incoφoration de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces, ou bien par rajout sur les extrémités 5' ou 3'.
Des exemples de marquage non radioactifs de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français n° FR 78 109 75 ou encore dans les articles de Urdea et al. (Nucl. Ac. Res. (1988) 11, 4937-4957) ou Sanchez-pescador et al. (J. Clin. Microbiol. (1988) 26 (10) 1934-1938). D'autres approches peuvent être utilisées pour le marquage et la détection des didéoxynucléotides. Une méthode en phase homogène basée sur le FRET (Fluorescence Résonance Energy Transfer) a été décrite entre autres par Chen et Kwok (Nucl Ac Res, 25 (1997) 347-353). Selon cette méthode, des fragments amplifiés d'ADN génomique susceptibles de contenir des polymoφhismes sont incubés avec une amorce marquée à la fluorescéine à l'extrémité 5', en présence de didéoxynucléotides triphosphate fluorescents et d'une polymérase Taq modifiée. L'amorce marquée est allongée d'une base par incoφoration du didéoxynucléotide marqué spécifique de l'allèle présent dans la séquence d'ADN génomique complémentaire. A la fin de cette réaction d'élongation, les intensités de fluorescence pour les deux composés marqueurs des didéoxynucléotides marqués sont analysées directement sans séparation ni purification. Le ratio pour ces deux fluorescences permet de déterminer le nucléotide utilisé par la polymérase lors de l'élongation, et de déduire la nature de la base polymoφhe L'ensemble de ces étapes peut être réalisé dans le même tube et les modifications de fluorescence suivies en temps réel. Alternativement, l'amorce d'extension peut être analysée par spectrométrie de masse MALDI-TOF. La base située en position polymoφhe est identifiée en mesurant la masse ajoutée à l'amorce de microséquençage. (Haff et al., Gen Res, 7 (1997) 378- 388).
De manière avantageuse, les sondes selon l'invention permettent une amplification du signal, telles que les sondes décrites par Urdea et al. (Nucl. Acid. SympSer. (1991) 24, 197-200) ou encore dans le brevet européen n° EP-0 225 807 (CHIRON). Les sondes oligonucléotides selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN génomique ou Northern à l'ARN.
Les caractéristiques structurales permettant de différencier les séquences normales des séquences mutées d'ABCAl (génomiques, ARNs messagers, ADNc) sont ainsi mises à profit afin de réaliser des moyens de détection des séquences mutées d'ABCAl dans un échantillon, en particulier sous la forme de sondes hybridant spécifiquement avec les séquences mutées d'ABCAl ou encore des couples d'amorces permettant d'amplifier sélectivement les régions du gène ABCAl portant les polymoφhismes décrits ci-dessus. La détection de la présence de ces mutations pouvant notamment être effectuée par discrimination de la longueur des fragments d'acide nucléique amplifiés, par hybridation des fragments amplifiés à l'aide des sondes spécifiques décrites ci-dessus ou encore par séquençage direct de ces fragments amplifiés.
De telles amorces nucléotidiques peuvent par exemple être immobilisées sur un support. De plus, il est possible d'immobiliser sur un support, par exemple de manière ordonnée, de multiples amorces spécifiques telles que décrites ci-dessus, chacune de ces amorces étant adaptée à la détection de l'un des polymoφhismes du gène ABCAl selon l'invention.
Selon un troisième aspect de la présente invention, les polymoφhismes du gène ABCAl selon l'invention sont utiles notamment comme marqueurs génétiques dans des études d'association entre la présence d'un allèle donné chez un sujet et la prédisposition de ce sujet à une pathologie donnée et/ou à une réponse donnée à une molécule thérapeutique dans le cadre d'études pharmacogénétiques. La présente invention a donc pour objet des marqueurs génétiques comprenant tout ou partie d'un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158 ou un acide nucléique de séquence complémentaire, et comprenant un des polymoφhismes selon l'invention.
Les marqueurs génétiques de l'invention sont avantageusement utilisés pour les études d'association d'un allèle donné des polymoφhismes selon l'invention, avec les taux de cholestérol HDL, d'apolipoprotéine A-I et d'apolipoprotéine A-JJ plasmatiques chez les patients.
De préférence, les marqueurs génétiques sont utilisés pour les éludes d'association des polymoφhismes s-35ela, s-16elb, s-76elb,s-53e5, s-108e6, s- 113e6, s-123e8, s-153e8, s-126el2, s-148el4, s-196el5, s-136el6, s27el7, sl07el7, s-4el8, s-40el9, s-123e22, s-54e23, s-98e24, s-149e24, s-44e27, s-7e30, s-166e30, s- 62e34, s-77e36, s-64e38, s-114e45, s-377e49, s-833e49, s-1580e49, s-1791e49, s- 2034e49, s-2049e49, s-2449e49, et s-2843e49 avec les taux d'HDL cholestérol, d'apolipoprotéine A-I et d'apolipoprotéine A-JJ plasmatiques chez les patients.
De manière encore plus préférentielle, les marqueurs génétiques sont utilisés pour les études d'association des polymoφhismes s-113e6, s-196el5, s-136el6, s27el7, sl07el7, s-4el8, s-123e22, s-54e23, s-62e34, et s-77e36 avec les taux d'HDL cholestérol, d'apolipoprotéine A-I et d'apolipoprotéine A-Il plasmatiques chez les patients.
En particulier, la présente invention concerne des marqueurs génétiques comprenant tout ou partie d'un acide nucléique choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et 137-158 ou un acide nucléique de séquence complémentaire, pour les études d'association des polymoφhismes tels que décrits précédemment avec un risque cardiovasculaire chez les patients et plus particulièrement un risque d'infarctus du myocarde.
Les méthodes pour l'analyse génétique de caractères (phénotypes) complexes sont de différents types (Lander et al, Science, 265 (1994) 2037-2048). En général, les polymoφhismes biallèliques selon l'invention sont utiles dans l'un quelconque des procédés décrits dans l'état de la technique destiné à démontrer une corrélation statistiquement significative entre un génotype et un phénotype. Les polymoφhismes biallèliques peuvent être utilisés dans des analyses de liaison ("linkage analysis") et dans des procédés de partage d'allèles ("allèle sharing"). De préférence, les polymoφhismes biallèliques selon l'invention sont utilisés pour identifier des gènes associés à des caractères (phénotypes) détectables en utilisant des études d'association, une approche qui ne nécessite pas le recours à des familles affectées par le caractère, et qui permet en outre l'identification de gènes associés à des caractères complexes et sporadiques.
D'autres méthodes statistiques mettant en œuvre des polymoφhismes biallèliques selon l'invention sont par exemple celles décrites par Forsell et al. (Biol Psychiatry 42 (1997) 898-903) Xiong et al. (Ann J Hum Genêt 64 (1999) 629-640), Horvath et al. (Am J Hum Genêt 63 (1998) 1886-1897), Sha et al. (Ann Hum Genêt 59 (1995) 323-336) ou encore Nickerson et al. (Genomics, 12 (1992) 377-387). De préférence, les polymoφhismes biallèliques sont utilisés pour identifier les gènes associés avec un phénotype.
Selon un quatrième aspect, la présente invention a pour objet un procédé de détection d'un des polymoφhismes décrits précédemment dans la séquence nucléotidique du gène ABCAl d'un sujet. Le procédé selon l'invention consiste à déterminer la séquence nucléotidique de tout ou partie du gène ABCAl chez ledit sujet à une des positions polymoφhes de l'invention, et identifier la présence ou l'absence du SNP (polymoφhisme simple nucléotide) à la position analysée.
De préférence, le procédé de détection selon l'invention consiste à déterminer la présence d'un G ou d'un A à la position polymoφhe 113 de l'exon 6, la présence d'un G ou d'un A à la position polymoφhe 196 de l'exon 15, la présence d'un G ou d'un A à la position polymoφhe 136 de l'exon 16, la présence d'un A ou d'un G à la position polymoφhe 107de l'exon 17, la présence d'un T ou d'un C à la position polymoφhe 27 de l'exon 17, la présence d'un G ou d'un T à la position polymoφhe 4 de l'exon 18, la présence d'un C ou d'un T à la position polymoφhe 123 de l'exon 22, la présence d'un G ou d'un C à la position polymoφhe 54 de l'exon 23, la présence d'un C ou d'un T à la position polymoφhe 62 de l'exon 34, la présence d'un G ou d'un A à la position polymoφhe 77 de l'exon 36.
De manière encore plus préférentielle, le procédé de détection selon la présente invention, consiste à déterminer la séquence nucléotidique du gène ABCAl au niveau de la position 62 de l'exon 34 et le SNP correspondant à la présence d'un C ou d'un T.
Selon un premier mode de réalisation du procédé de l'invention, la présence d'au moins un des SNP décrits précédemment est identifiée par séquençage de tout ou partie du gène ABCAl du sujet au niveau des positions polymoφhes.
Des amorces d'amplification et de séquençage peuvent être construites afin d'hybrider avec une région déterminée d'une séquence choisie dans le groupe de séquence constitué par les séquences SEQ ID NO : 24-126 et SEQ ID NO : 137-158, ou de séquence complémentaire, et comprenant au moins une position polymoφhe. De telles amorces de séquençage sont construites préférentiellement de manière à amplifier des fragments d'environ 250 à environ 500 nucléotides, comprenant au moins une des positions polymoφhes selon l'invention.
Les fragments amplifiés, par exemple par la méthode PCR, sont ensuite séquences et la séquence obtenue est comparée aux séquences de référence SEQ JD NO : 24-91 et 137 à 158 afin de déterminer si une ou plusieurs délétions, additions ou substitutions de nucléotides sont retrouvées dans la séquence amplifiée à partir de l'ADN contenu dans l'échant lon biologique provenant du sujet testé.
Le procédé de l'invention permet l'amplification d'un acide nucléique contenant au moins un des polymoφhismes de l'invention, et comprenant les étapes consistant à :
a) mettre en contact un échantillon, dans lequel la présence de l'acide nucléique ABCAl est suspectée, avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est locahsée respectivement du côté 5 ' sur un brin et du côté 3 ' sur le brin complémentaire de la région de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et
b) détecter les acides nucléiques amplifiés.
Pour mettre en oeuvre le procédé d'amplification tel que défini ci-dessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques définies selon les critères mentionnés ci-avant. L'invention concerne donc selon ce premier mode de réalisation un procédé de détection d'un des polymoφhismes selon l'invention dans le gène ABCAl chez un sujet, comportant les étapes suivantes :
a) séquençage, à partir d'un matériel biologique provenant du sujet à tester, d'un fragment d'acide nucléique à l'aide d'au moins une amorce nucléotidique hybridant avec la séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 24-91 ou les séquences SEQ K) NO : 137-158 selon l'invention;
b) aligner la séquence obtenue en a) avec la séquence correspondante à la séquence amplifiée choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 24-91 ou les séquences SEQ ID NO : 137-158;
c) déterminer la présence d'un polymoφhisme dans la séquence du fragment d'acide nucléique par rapport aux séquences SEQ ID NO : 24-91 ou aux séquences SEQ ID NO : 137-158 de référence.
Le procédé de détection de la présence d'un polymoφhisme du gène ABCAl chez un sujet, comprend également les étapes consistant à: a) séquencer, à partir d'un matériel biologique provenant du sujet à tester, tout ou une partie du gène ABCAl, à l'aide d'une amorce nucléotidique hybridant avec la séquence choisie parmi les SEQ ID NO :24-91 ou les séquences SEQ ID NO : 137- 158 ; b) aligner la séquence nucléotidique obtenue en a) avec une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID N° 1 et 3-23;
c) déterminer les différences nucléotidiques entre le polynucléotide séquence provenant du matériel biologique du sujet à tester et les séquences SEQ ID NO : 1 et 3-23 de référence. Selon un deuxième mode de réalisation du procédé selon la présente invention, celui-ci utilise les' sondes oligonucléotidiques telles que décrites précédemment, qui sont capables d'hybrider spécifiquement avec une région correspondante d'une des séquences SEQ ID NO : 24-91 ou avec une région correspondante d'une des séquences SEQ ID N° 137-158, et comprenant au moins une des bases polymoφhes selon l'invention telles que décrites précédemment, en vue de détecter la présence d'un ou plusieurs des polymoφhismes selon l'invention dans un échantillon provenant d'un sujet.
De manière préférentielle, les sondes nucléotidiques sont constituées d'un acide nucléique comprenant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 et
137-158, la base polymoφhe étant localisée au centre du fragment nucléotidique de
21 bases.
De préférence les sondes nucléotidiques selon ce mode de réalisation de l'invention sont immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de microtitration recouvert de lits de polystyrène, de lits magnétiques, de bandes de nitrocellulose, ou encore de microparticules telles que des particules de latex.
En conséquence, la présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique tel que décrit ci-avant dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes consistant à :
1) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ; 2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
De préférence, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support, et encore plus préférentiellement, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
Selon un cinquième aspect de la présente invention, les procédés de détection des polymoφhismes décrits précédemment sont utilisés pour diagnostiquer chez un sujet une prédisposition à développer une certaine pathologie, après une étude d'association, ou pour prédire la réponse pharmacologique d'un patient à une molécule donnée, après une étude pharmacogénétique.
Plus particulièrement, les procédés permettent de diagnostiquer chez un sujet qui a été détecté comme portant un allèle donné d'au moins un des polymoφhismes selon l'invention, un risque pathologique lié à une déficience du transporteur ABCAl, ou une réponse nulle ou indésirable à une molécule thérapeutique donnée.
Les procédés selon l'invention sont particulièrement utiles pour diagnostiquer la prédisposition d'un individu à présenter un risque coronarien ou cardiovasculaire, tel qu'un risque d'infarctus du myocarde, ou d'athérosclérose.
Le procédé selon l'invention permet de déterminer si un sujet présente un risque pour le développement d'une pathologie liée à un déficit dans le métabolisme du cholestérol, notamment dans le transport inverse de cholestérol, un risque de développement d'une déficience HDL familiale telle que la maladie de Tangier ou plus généralement d'une maladie cardiovasculaire ou une affection coronarienne, telle qu'un risque d'infarctus du myocarde ou d'athérosclérose. De telles méthodes comprennent la détection, dans des cellules d'un échantillon biologique provenant du sujet à tester, de la présence ou de l'absence d'un allèle donné d'un des polymoφhismes selon l'invention tel que décrit dans le tableau 2, dans la séquence du gène ABCAl humain de séquence SEQ JD NO: 3-22.
Les méthodes selon l'invention permettent également de détecter dans des cellules d'un échantillon biologique provenant du sujet à tester, la présence ou l'absence d'un allèle donné d'un des polymoφhismes selon l'invention tel que décrit dans le tableau 3, dans la séquence régulatrice SEQ ID NO : 23 en amont du gène ABCAl caractérisée par une altération dans l'expression d'un gène dont l'expression est régulée par le promoteur de ABCAl .
La présente invention a pour objet le procédé de diagnostic d'une pathologie liée à une déficience du transporteur ABCAl qui consiste à détecter chez un sujet, la présence d'un allèle donné d'un des polymoφhismes de l'invention selon une des méthodes de détection décrites précédemment.
De préférence, le procédé de l'invention permet de diagnostiquer la prédisposition d'un sujet à développer une maladie cardiovasculaire telle qu'un infarctus du myocarde.
De manière encore plus préférentielle, la présente invention a pour objet un procédé et un kit de diagnostic d'un risque d'infarctus du myocarde ou d'un risque d'affection cardiovasculaire chez un sujet, consistant à détecter chez ledit sujet, la présence d'un acide nucléique comprenant un polynucléotide de séquence SEQ ID NO : 72 ou 115, et comprenant une base polymoφhe A en position 62 de l'exon 34, soit à la position 5382 par rapport à la séquence SEQ JD NO: 15. La présente invention a pour objet le procédé de diagnostic d'une réponse pharmacologique liée à une variation du transporteur ABCAl ou de sa régulation qui consiste à détecter chez un sujet, la présence d'un allèle donné d'au moins un des polymoφhismes de l'invention selon une des méthodes de détection décrites précédemment.
A titre illustratif, de tels polymoφhismes SNPs peuvent être détectés afin de déterminer l'existence d'une substitution d'un nucléotide dans la séquence d'un acide nucléique correspondant au gène ABCAl de séquence SEQ ID NO : 3-22 et/ou dans la séquence régulatrice en amont du gène ABCAl de séquence SEQ ID NO : 23, de l'addition d'un ou plusieurs nucléotides ou encore de la délétion d'un ou plusieurs nucléotides dans lesdites séquences SEQ ID N° 3-22 ou SEQ ID N° 23.
La présente invention a en outre pour objet l'utilisation des sondes oligonucléotidiques hybridant spécifiquement avec une région correspondante d'une des séquences SEQ ID NO : 24-126 ou avec une région correspondante d'une des séquences SEQ ID N° 137- 158, comprenant au moins une des bases polymoφhes selon l'invention telles que décrites précédemment, en vue de diagnostiquer chez un sujet une prédisposition au développement d'une pathologie liée à une déficience dans le transport inverse du cholestérol, tel que l'infarctus du myocarde, l'athérosclérose ou encore la maladie de Tangier, ou plus généralement une affection cardiovasculaire, ou de prédire la réponse pharmacologique d'un sujet à une molécule thérapeutique donnée.
Les méthodes de diagnostic selon la présente invention peuvent avantageusement être utilisées afin d'évaluer l'efficacité de produits thérapeutiques dans le traitement des affections liées à une déficience du transporteur ABCAl . Les sujets porteurs d'un polymoφhisme allèlique du gène ABCAl peuvent présenter par exemple des différences de concentration des différentes variables lipidiques qui sont couramment mesurées telles que les taux de HDL cholestérol, de triglycérides, d'apolipoprotéines A-I et A-Il, des particules lipoprotéiques A-I et A-JJ, ou encore des différences au niveau de la régulation de la biosynthèse de la protéine. Les différences observées du fait de la présence d'une variant allèlique chez un sujet peuvent être modifiées lorsque l'on administre audit sujet un agent thérapeutique particulier. Les procédés selon la présente invention peuvent donc être utiles pour déterminer l'effet clinique d'une substance thérapeutique et déterminer les doses thérapeutiques à administrer.
Selon un dernier aspect, la présente invention a pour objet un kit ou nécessaire pour la détection de la présence d'un des polymoφhismes tels que précédemment décrits, dans le gène ABCAl chez un sujet, ledit nécessaire comprenant :
a) une ou plusieurs amorces hybridant avec une région choisie parmi les séquences SEQ JD NO : 24-126 ou ïes séquences SEQ JD NO : 137-158;
b) le cas échéant, les moyens nécessaires à la réalisation d'une réaction d'amplification d'au moins une position polymoφhe de la présente invention.
L'invention a encore pour objet un kit ou nécessaire pour la détection d'un des polymoφhismes de la présente invention dans le gène ABCAl, chez un sujet, comprenant:
a) une ou plusieurs sondes oligonucléotidiques telles que définies ci-dessus; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'hybridation.
Les fragments d'acides nucléiques dérivés de l'une quelconque des séquences nucléotidiques SEQ ID NO 24-126 comprenant un des polymoφhismes de l'invention sont donc utiles pour la détection de la présence d'au moins un allèle polymoφhe du gène ABCAl dans un échantillon.
Les sondes selon l'invention peuvent aussi être utilisées pour la détection de produits d'amplification PCR ou encore pour la détection de mésappariements.
De préférence, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
Selon un second mode de réalisation, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit ci-dessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui pourront être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes des acides nucléiques selon l'invention, plus particulièrement des acides nucléiques de séquences SEQ ID NO 1, et 3-23 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.
Ainsi, les sondes selon l'invention immobilisées sur un support peuvent être ordonnées en matrices telles que les " puces à ADN ". De telles matrices ordonnées ont été en particulier décrites dans le brevet US N° 5,143,854, dans les demandes WO 90/15070 et WO 92/10092.
Des matrices supports sur lesquelles des sondes oligonucléotidiques ont été immobilisées à une haute densité sont par exemple décrites dans les brevets US N°5,412,087 et dans la demande PCT N°WO 95/11995. Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 24-126 et 137-158.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID NO 1, et 3-23 ledit nécessaire ou kit comprenant a) un couple d'amorces nucléotidiques conformes à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification. Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telles que décrites ci-dessus.
L'invention a par ailleurs pour objet un procédé destiné à la détection de la présence d'une protéine ABCAl polymoφhe dans un échantillon, comprenant les étapes de a) mise en contact de l'échantillon avec un anticoφs tel que précédemment décrit; et b) détection du complexe antigène/anticoφs formé.
La présente invention a également pour objet un nécessaire de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide ABCAl polymoφhe dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant a) un anticoφs tel que précédemment décrit; et b) un réactif permettant la détection des complexes antigènes/anticoφs formés.
L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples ci-après. La figure 1 illustre la séquence SEQ JD NO : 1 correspondant à la séquence nucléotidique du transcrit du gène humain ABCAl;
La figure 2 illustre la séquence d'acides aminés SEQ ID NO : 2 correspondant à la séquence peptidique de la protéine transporteur ABCAl ; La figure 3 illustre la séquence régulatrice SEQ ID NO : 23 en amont du gène humain ABCAl ; la position des différents polymoφhismes est indiquée en gras.
EXEMPLE 1 : IDENTIFICATION DES POLYMORPHISMES DE ABCAl
La détection de polymoφhismes dans les séquences des transcrits ou dans les séquences génomiques du gène ABCAl peut être réalisée selon différents protocoles. La méthode de choix est le séquençage direct. Dans le cas d'un transcrit où la structure du gène correspondant est inconnue ou partiellement connue, il est nécessaire de déterminer précisément sa structure intron-exon ainsi que la séquence génomique du gène correspondant. Il s'agit donc dans un premier temps d'isoler le ou les clones de BAC d'ADN génomique correspondant au transcrit étudié, de séquencer l'insert du ou des clones correspondants et de déterminer la structure intron-exon en comparant la séquence de l'ADNc à celle de l'ADN génomique obtenu. La technique de détection de polymoφhismes par séquençage direct consiste à comparer les séquences génomiques du gène ABCAl obtenues à partir d'au moins 32 individus de chaque population testée, caucasienne, africaine et japonaise. Les divergences de séquence constituent des polymoφhismes. Tous ceux modifiant la séquence en acides aminés de la protéine sauvage sont des mutations susceptibles d'affecter la fonction de ladite protéine qu'il est intéressant de considérer plus particulièrement dans les études d'association cas/témoin décrites dans l'Exemple 2. Des amorces pour l'amplification de l'ADN des individus ont été conçues à partir des séquences non répétitives de l'ADN intronique du gène ABC1, de telle manière à ce qu'une amplification des jonctions intron-exon ainsi que des bases essentielles pour la formation de la structure secondaire durant l'étape d'épissage de l'ARN soit incluses dans les fragments amplifiés. L'ADN génomique des individus a été amplifié à l'aide des amorces décrites ci- dessus en utilisant le kit Qiagen's Star Taq® (Qiagen, Nalencia, CA) ou encore le kit Supertaq® (Ambion, Austin, TX) en utilisant les conditions d'hybridation et des conditions de cycle d'amplification préconisées par le constructeur. Les produits PCR amplifiés ont été purifiés en utilisant un kit commercialisé par la société Qiagen, puis séquences par la méthode Big Dye Terminator sur un séquenceur ABI 3700 (Apllied Biosystems, Foster City, CA).
EXEMPLE 2 : ANALYSE DES POLYMORPHISMES DU GENE ABCAl
L'étude Cas-Témoins de l'Infarctus du Myocarde (ECTIM) est une étude de patients victimes d'un infarctus du myocarde et de sujets contrôles provenant d'Irlande du Nord, d'Angleterre et de France (tous du type Caucasien).
L'étude a été réalisée afin d'identifier une éventuelle association des polymoφhismes exoniques tels que par exemple s-16elb, s-113e6, s-135e8, s-148el4, s-136el6, s- ' 101el7, s-54e23, s-7e30, s-62e34, s-833e49 et s-2034e49, avec les taux d'HDL cholestérol, ApoA.-I et ApoA-ïï plasmatiques chez les témoins et les patients. L'ADN génomique des individus a été amplifié à l'aide des amorces décrites ci- dessus permettant d'amplifier spécifiquement l'exon d'intérêt et les jonctions intron- exon correspondantes en utilisant par exemple le kit Qiagen's Star Taq ® (Qiagen, Nalencia, CA) ou encore le kit Supertaq® (Ambion, Austin, TX) dans les conditions d'hybridation et des conditions de cycle d'amplification préconisées par le constructeur. Sur ces amplifiais des réactions de mini-séquençage ont été réalisées pour chacun des polymoφhismes sélectionnés. Le génotype de chacun des témoins et des patients a ainsi pu être déterminé pour chacun des polymoφhismes. Ces données ont été analysées avec le logiciel SAS. L'équilibre Hardy- Weinberg a été testé par un test de χ2 avec 1 df. Les fréquences génotypiques et alléliques ont été comparées entre les groupes par tests de χ2. Les différents paramètres phénotypiques ont été comparé entre les génotypes par analyse de variance AΝONA.

Claims

REVENDICATIONS
1. Acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID N° 24-126 et 137-158, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
2. Acide nucléique dérivé d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID N° 24-126 et 137-158, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
3. Acide nucléique comprenant au moins 9 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID
N° 24-126, ou un acide nucléique de séquence complémentaire, et comprenant un polymoφhisme choisi dans le groupe constitué par i) un A nommés s-m39i3, s-53e5, s-113e6, s-135e8, s-24il3, s-148el4, s-81il4, s-115il4, s-196el5, s-136el6, s-18il9, s-m65i22, s-149e24, s-44e27, s-7e30, s-62e34, s-m74i34, s-77e36, s-2843e495 ii) un T nommés s-25i4, s-123e8, s-ml3i9, s-126el2, s-m59il3, s-4el8, s-40el9, s-ml0il9, s-123e22, s-149i23, s-m50i23, s-166e30, s-ml42i32, s-mll9i40, s-114e45, s-m34i45, s-833e49, s-1580e49, s-1791e49, s-2049e49, iii) un G nommés s-35ela, s-108e6, s- m89i8, s-ml04i9, s-m29il2, s-107el7, s-m68il7, s-98e24, s-30i31, s-251i39, s-13i47, s-2034e49, s-2449e49, iv) un C nommés s-76elb, s-27el7, s-60il7, s-54e23, s- m26i32, s-55i36, s-64e38, s-252i39, s-m69i44, s-86i47, s-377e49, v) une délétion nommée s-m41i9, et vi) une insertion nommées s-16elb, s-ml4i7, s-m61i9, s- ml30i32.
4. Acide nucléique comprenant au moins 9 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 137-158, ou un acide nucléique de séquence complémentaire, et comprenant, par rapport à la séquence promotrice du gène ABCAl SEQ ID NO : 23, un polymoφhisme choisi dans le groupe constitué par i) un A en positions 505, 1642, 2091, ii) un T en positions 1093, 1499, 1677, 1795, 2330, 2592, 2880, iii) un G en positions 1080, 1242, 1954, iv) un C en positions 1388, 2487, 2616, 2795, v) une insertion de GGAGGGGAGG en position 717, une insertion AT en position 1859, et vi) une délétion de TTTG en position 2117, une délétion de TTTGTTTGT en position 2121, et une délétion de CACCC en position 2671.
5. Acide nucléique comprenant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynuléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 ou un acide nucléique de séquence complémentaire, et comprenant un polymoφhisme choisi dans le groupe constitué par i) un A nommés s-m39i3, s-53e5, s-113e6, s-135e8, s-24il3, s-148el4, s-81il4, s-115il4, s-196el5, s-136el6, s-18il9, s-m65i22, s-149e24, s-44e27, s-7e30, s-62e34, s-m74i34, s-77e36, s-2843e49, ii) un T nommés s-25i4, s-123e8, s-ml3i9, s-126el2, s-m59il3, s-4el8, s-40el9, s-ml0il9, s-123e22, s-149i23, s-m50i23, s-166e30, s-ml42i32, s-ml l9i40, s-114e45, s-m34i45, s-833e49, s-1580e49, s-1791e49, s-2049e49, iii) un G nommés s-35ela, s-108e6, s- m89i8, s-ml04i9, s-m29il2, s-107el7, s-m68il7, s-98e24, s-30i31, s-251i39, s-13i47, s-2034e49, s-2449e49, iv) un C nommés s-76elb, s-27el7, s-60il7, s-54e23, s- m26i32, s-55i36, s-64e38, s-252i39, s-m69i44, s-86i47, s-377e49, v) une délétion nommée s-m41i9, et vi) une insertion nommées s-16elb, s-ml4i7, s-m61i9, s- ml30i32.
6. Acide nucléique comprenant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 137-158 ou un acide nucléique de séquence complémentaire et comprenant, par
-rapport à la séquence promotrice du gène ABCAl SEQ ID NO : 23, un polymoφhisme choisi dans le groupe constitué par i) un A en positions 505, 1642,
2091, ii) un T en positions 1093, 1499, 1677, 1795, 2330, 2592, 2880, iii) un G en positions 1080, 1242, 1954, iv) un C en positions 1388, 2487, 2616, 2795, v) une insertion de GGAGGGGAGG en position 717, une insertion AT en position 1859, et vi) une délétion de TTTG en position 2117, une délétion de TTTGTTTGT en position 2121, une délétion de CACCC en position 2671.
7. Acide nucléique comprenant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 24-126 ou un acide nucléique de séquence complémentaire, et comprenant un base polymoφhe localisée au centre du fragment de 21 nucléotides et choisie dans groupe constitué par i) un A nommés s-m39i3, s-53e5, s-113e6, s-135e8, s-24il3, s- 148el4, s-81il4, s-115il4, s-196el5, s-136el6, s-18il9, s-m65i22, s-149e24, s- 44e27, s-7e30, s-62e34, s-m74i34, s-77e36, s-2843e49, ii) un T nommés s-25i4, s- 123e8, s-ml3i9, s-126el2, s-m59il3, s-4el8, s-40el9, s-ml0il9, s-123e22, s-149i23, s-m50i23, s-166e30, s-ml42i32, s-mll9i40, s-114e45, s-m34i45, s-833e49, s- 1580e49, s-1791e49, s-2049e49, iii) un G nommés s-35ela, s-108e6, s-m89i8, s- ml04i9, s-m29il2, s-107el7, s-m68il7, s-98e24, s-10i31, S-25H39, s-13i47, s- 2034e49, s-2449e49, iv) un C nommés s-76elb, s-27el7, s-60il7, s-54e23, s-m26i32, s-55i36, s-64e38, s-252i39, s-m69i44, s-86i47, s-377e49, v) une délétion nommée s- m41i9, et vi) une insertion nommées s-16elb, s-ml4i7, s-m61i9, s-ml30i32.
8. Acide nucléique comprenant au moins 21 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 137-158 ou un acide nucléique de séquence complémentaire, et comprenant une base polymoφhe localisée au centre dudit fragment de 21 nucléotides et choisie dans groupe constitué par i) un A en positions 505, 1642, 2091, ii) un T en positions 1093, 1499, 1677, 1795, 2330, 2592, 2880, iii) un G en positions 1080, 1242, 1954, iv) un C en positions 1388, 2487, 2616, 2795, v) une insertion de GGAGGGGAGG en position 717, une insertion AT en position 1859, vi) une délétion de TTTG en position 2117, une délétion de TTTGTTTGT en position 2121, et une délétion de CACCC en position 2671, par rapport à la séquence promotrice du gène ABCAl SEQ ID NO : 23
9. Acide nucléique hybridant dans des conditions de forte stringence, avec un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID
N° 24-126 et 137-158, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
10. Acide nucléique codant pour un polypeptide choisi dans le groupe constitué des séquences peptidiques SEQ JD NO : 127-136.
11. Acide nucléique comprenant: a) un acide nucléique comprenant un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 137-158; et b) un polynucléotide codant pour un polypeptide ou un acide nucléique d'intérêt.
12. Polypeptide ABCAl polymoφhe, caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi dans le groupe des polypeptides de séquence d'acides aminés SEQ
ID NO: 127-136.
13. Sonde ou amorce nucléotidique spécifique du gène ABCAl comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 3 à 9, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
14. Sonde ou amorce selon la revendication 13, utile pour la détection d'un polymoφhisme dans le gène ABCAl, d'une longueur d'au moins 15 nucléotides.
15. Sonde ou amorce nucléotidique amorce selon la revendication 13, utile pour la détection d'un polymoφhisme dans le gène ABCAl, d'une longueur d'au moins 21 nucléotides.
16. Sonde nucléotidique selon l'une quelconque des revendications 13 à 15, caractérisée en ce qu'elle comprend un composé marqueur dont la présence est détectable. j
17. Amorce nucléotidique selon l'une des revendications 13 à 15 j la base de l'extrémité 3' de la dite amorce étant complémentaire du nucléotide localisé immédiatement du côté 3' de la base polymoφhe de l'une des séquences SEQ ID NO 24-126 et 137-158 ou de leurs séquences complémentaires.
18. Amorce nucléotidique selon la revendication 17, la base de l'extrémité 3' de la dite amorce étant complémentaire d'un nucléotide situé à 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 nucléotides ou plus du côté 3' de la position du polymoφhisme de l'une des séquences SEQ JD NO 24-126 et 137-158 ou de leurs séquences complémentaires.
19. Marqueur génétique comprenant un acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 3 à 9, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
20. Procédé pour la détection d'un acide nucléique selon la revendication 1 ou 2 dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de: a) mise en contact de l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la position polymoφhe cible à amplifier de l'acide nucléique selon la revendication 1 ou 2 en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification; et b) détection des acides nucléiques amplifiés.
21. Procédé de détection selon la revendication 20, caractérisé en ce que les amorces nucléotidiques sont choisies parmi les amorces selon l'une des revendications
13 à 18.
22. Nécessaire pour la détection d'un acide nucléique selon la revendication 1 ou 2 comprenant : a) un couple d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la position polymoφhe cible à
5 amplifier de l'acide nucléique la revendication 1 ou 2; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
23. Nécessaire pour l'amplification d'un acide nucléique selon la revendication 22, caractérisé en ce que les amorces nucléotidiques sont choisies dans le groupe constitué des amorces selon l'une des revendications 13 à 18.
10 24. Procédé de détection de la présence d'un polymoφhisme du gène ABCAl chez un sujet, ladite méthode comprenant les étapes consistant à: , a) séquencer, à partir d'un matériel biologique provenant du sujet à tester, tout ou une partie du gène ABCAl, à l'aide d'une amorce nucléotidique selon l'une des revendications 13 à 18; 15 b) aligner la séquence nucléotidique obtenue en a) avec une séquence choisie dans le groupe constitué des séquences SEQ ID N° 1 et 3-23; c) déterminer les différences nucléotidiques entre le polynucléotide séquence provenant du matériel biologique du sujet à tester et les séquences SEQ ID NO : 1 et 3-23 de référence.
20 25. Kit ou nécessaire pour la détection de la présence d'un polymoφhisme du gène ABCAl chez un sujet, comprenant les moyens nécessaires au séquençage de tout ou partie de l'acide nucléique correspondant au gène ABCAl aux positions polymoφhes de l'acide nucléique selon la revendication 1 ou 2.
26. Procédé de détection de la présence d'un polymoφhisme du gène ABCAl
25 chez un sujet, ladite méthode comprenant les étapes de : a) mettre en contact une ou plusieurs sondes nucléiques selon l'une des revendications 13 à 16 avec l'échantillon provenant du sujet à tester; b) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
27. Procédé de détection selon la revendication 26, caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
28. Nécessaire pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon la revendication 1 ou 2 dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques selon l'une quelconque des revendications 13 à 16; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation.
29. Nécessaire de détection selon la revendication 28, caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
30. Procédé de diagnostic d'un risque d'infarctus du myocarde chez un sujet, consistant à détecter par un procédé selon l'une des revendications 24, 26 ou 27, la présence chez ledit sujet d'un acide nucléique comprenant un polynucléotide de séquence SEQ ID NO : 72 ou 115, et comprenant une base polymoφhe A en position 5382 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 15.
31. Procédé de diagnostic d'un risque d'affection cardiovasculaire chez un sujet, consistant à détecter par un procédé selon l'une des revendications 24, 26 ou 27, la présence chez ledit sujet d'un acide nucléique comprenant un polynucléotide de séquence SEQ ID NO : 72 ou 115, et comprenant une base polymoφhe A en position 5382 par rapport à la séquence SEQ ID NO: 15.
32. Vecteur de clonage et/ou d'expression recombinant comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 11.
33. Cellule hôte transformée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 11 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 32.
34. Mammifère transgénique non humain dont les cellules somatiques et/ou les cellules germinales ont été transformées par un acide nucléique selon la revendication 1 à 11 ou par un vecteur recombinant selon la revendication 32.
35. Anticoφs dirigé contre un polypeptide ABCAl polymoφhe selon la revendication 12, ou un fragment peptidique de ce dernier.
36. Anticoφs selon la revendication 35, caractérisé en ce qu'il comprend un composé détectable.
37. Procédé pour détecter la présence d'un protéine ABCAl polymoφhe selon la revendication 12 dans un échantillon, comprenant les étapes de: a) mise en contact de l'échantillon avec un anticoφs selon l'une des revendications 35 ou 36; b) détection du complexe antigène/anticoφs formé .
38. Nécessaire de diagnostic pour la détection de la présence d'un polypeptide selon la revendication 12 dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant: a) un anticoφs selon l'une des revendications 35 ou 36; b) un réactif permettant la détection des complexes antigènes/anticoφs formés.
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