WO1996025517A1 - Procede de detection d'une mutation intervenant dans la maladie d'alzheimer et sequences nucleotidiques pour sa mise en ×uvre - Google Patents

Procede de detection d'une mutation intervenant dans la maladie d'alzheimer et sequences nucleotidiques pour sa mise en ×uvre Download PDF

Info

Publication number
WO1996025517A1
WO1996025517A1 PCT/FR1996/000263 FR9600263W WO9625517A1 WO 1996025517 A1 WO1996025517 A1 WO 1996025517A1 FR 9600263 W FR9600263 W FR 9600263W WO 9625517 A1 WO9625517 A1 WO 9625517A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
alzheimer
cgc
gene
mutation
Prior art date
Application number
PCT/FR1996/000263
Other languages
English (en)
Other versions
WO1996025517A9 (fr
Inventor
Gérard Lucotte
Stéphane Reveilleau
Original Assignee
Laboratoires Eurobio
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Laboratoires Eurobio filed Critical Laboratoires Eurobio
Publication of WO1996025517A1 publication Critical patent/WO1996025517A1/fr
Publication of WO1996025517A9 publication Critical patent/WO1996025517A9/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a new mutation occurring in Alzheimer's disease.
  • Apolipoprotein E is a plasma glycoprotein of 299 amino acids, synthesized mainly by the liver and the intestine, but also in most other tissues, in particular by the astrocyte of nervous tissue.
  • the normal concentration of apo E in the plasma is around 40 mg / 1. It is present there in the lipoproteins chylomicrons, VLDL, ILDL (as well as in the cerebrospinal fluid).
  • the fourth exon of the gene codes for the domain of the apo E protein, which participates in the binding with the LDL receptor.
  • E2 and E4 differ from E3 by basic substitutions: in E4, C is in place of T at position 3932, and in E2 is T in place of C in position 4070. This results in changes in amino acids following: Cys (112) instead of Arg for 1 "E4 isoform, and Arg (158) instead of Cys for E2 isoform.
  • apo E isoforms of apo E are conventionally distinguished by isofocusing of serum proteins. It is currently easier to genotype them by polymerase chain reaction (PCR) on the basis of their variation in DNA sequence (Hixson and Vernier, 1990, J. Lipid Res., 31: 545-548), by cleavage , after amplification, with the restriction enzyme Hha I.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the Applicant has found a new mutation in the apolipoprotein E gene and has shown that this mutation was associated with a high probability of Alzheimer's disease.
  • the Applicant has therefore resolved the problem set out above by providing the means to distinguish patients carrying an additional mutation of Apo E which, jointly with or independently of ⁇ 4, determines Alzheimer's.
  • the subject of the present invention is a method for the detection, in a DNA preparation, of a mutation intervening in Alzheimer's disease, characterized in that the presence, in the apolipoprotein E gene, is determined.
  • '' one of the following nucleotide sequences SEQ ID N * 1, SEQ ID N * 3 OR SEQ ID N * 5: SEQ ID NJ: TGC GGC CGC
  • SEQ ID N'2 Cys Gly Arg
  • SEQ ID N'4 Cys Asp Arg
  • SEQ ID N * 6 Arg Asp Arg
  • the present invention also relates to a method for detecting such a mutation in an RNA preparation, in which case the presence in the RNA corresponding to the apolipoprotein E gene is sought, either of the sequence SEQ ID N * 5, or of the sequences SEQ ID N * 7 and SEQ ID N * 8 corresponding respectively to the sequences SEQ ID N * 1 and SEQ ID N * 3 in which T has been replaced by U.
  • the determination of the presence of one of the nucleotide sequences is carried out by specific amplification of the DNA, in which these sequences are sought, that is to say that of the apolipoprotein E gene or a part of this gene.
  • the present invention further relates to nucleotide sequences comprising from approximately 20 to approximately 30 nucleotides, or base pairs, and comprising one of the sequences SEQ ID N * 3 or SEQ ID N * 5 described above.
  • sequences as well as the sequence SEQ ID N * 1 can be advantageously used as oligoprobes for the specific amplification of the part of the apolipoprotein E gene in which the presence of a mutation is sought.
  • the amplification of such a sequence can be carried out using primers which do not contain one of the sequences SEQ ID N * 1, SEQ ID N * 3 or SEQ ID N * 5.
  • the aim of the method according to the invention is to amplify a fragment of approximately 100 to 400 base pairs, capable of containing the mutation sought. Primers can therefore be chosen on either side of the region to be amplified.
  • the specific amplification of the sequence likely to contain a mutation is preferably carried out by the polymerase chain reaction (PCR) method, and in particular its ARMS variant (Allele Refractory Mutation System).
  • PCR polymerase chain reaction
  • ARMS variant Allele Refractory Mutation System
  • the amplification reaction products are identified by any method known to a person skilled in the art making it possible to differentiate two DNA fragments, and in particular by staining with ethidium bromide or by hybridization with oligoprobes.
  • ARMS of the PCR method comprises the following steps: use of a common primer (C) and two differential primers; one corresponding to the normal allele (B), and the other to the mutated allele (A); the reaction is carried out simultaneously on the one hand between common primer and normal primer (AC), and on the other hand between common primer and mutated primer (BC).
  • the mutation can also be demonstrated simply by digestion of the amplification product with an appropriate restriction enzyme, the mutation of which (when it is present) alters the cleavage site: thus, the restriction enzyme Not I (GCGGCCGG ) normally cut the sequence once into two restriction fragments of 72 and 172 base pairs; when the mutation is present, a single fragment at 244 base pairs is then obtained.
  • an appropriate restriction enzyme the restriction enzyme Not I (GCGGCCGG ) normally cut the sequence once into two restriction fragments of 72 and 172 base pairs; when the mutation is present, a single fragment at 244 base pairs is then obtained.
  • FIG. 1 is a representation of the DNA sequence of the amplified apo E region, ranging from nucleotide sequence n " 3869 to n" 3958 (rising arrows) (SEQ ID N * 9).
  • the corresponding protein sequences range from 90 to 121 (descending arrows) (SEQ ID N * 10).
  • the first two Hhal sites (GCGC) are underlined and the third, polymorphic ⁇ 2, ⁇ 3, ⁇ 4, boxed.
  • the four polymorphic sites of the third letter of the codons are indicated.
  • the sites corresponding to the new mutation are framed (GGC - ⁇ Gly / GAC - ⁇ Asp).
  • FIGS. 2A to 2C represent agarose gels derived from the ARMS PCR genotyping process for the mutation.
  • the common primer C is used jointly, on the one hand with the mutant primer A, and on the other hand with the normal primer B.
  • the three kinds of genotypes are thus easily identifiable.
  • the G by A mutation (3936) is present in eight control individuals, not suffering from Alzheimer's disease at an advanced age: two homozygotes 3-3 (Nos 1559 and 145), two heterozygotes 2- 3 (Nos 1542 and 1597), a heterozygote 2-4 (N'1149), two heterozygotes 3-4 (Nos 1573 and 1542), and even a homozygote 4-4 (N * 125).
  • the association observed can be explained in terms of linkage imbalance between two mutated sites corresponding to contiguous codons.
  • One embodiment of the invention uses the DNA sequencing technique, according to which direct sequencing is carried out by using the enzyme sequenase (industrial kit), on an automatic sequencing apparatus Applied Biosystems.
  • the non-coding strand was sequenced twice for each reaction, by using the primer 5'-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3 'Another embodiment of the invention, easier to implement than the previous one, consists to use the PCR technique for the detection of the mutation.
  • mutant primer B 3'-CGGCGGACCACGTCATGGCG-5 '(normal primer) are used in PCR ARMS (allele refractory mutation System) technique with a common primer C located at approximately 300 bp in the adjacent intron.
  • PCR ARMS allele refractory mutation System
  • AC and BC under the following conditions: 1 ⁇ g of genomic DNA 1 pmol / ⁇ l of each primer, 10 ⁇ mol / ⁇ l of dNTPs 10% DMSO
  • the hybridization temperature is discriminating between the AC and BC reactions.
  • the band of amplifiers observable in agarose gel makes it possible to produce the genotype as illustrated in FIG. 2.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Procédé de détection, dans une préparation d'ADN, d'une mutation intervenant dans la maladie d'Alzheimer caractérisé en ce que l'on détermine la présence, dans le gène de l'apolipoprotéine E, d'une des séquences nucléotidiques SEQ ID N°1, SEQ ID N°3 ou SEQ ID N°5 suivantes: SEQ ID N°1: TGC GGC CGC; SEQ ID N°3: TGC GAC CGC; SEQ ID N° 5: CGC GAC CGC. Cette détermination peut être effectuée par amplification en chaîne par polymérase (PCR) ou par séquençage.

Description

Procédé de détection d'une mutation intervenant dans la maladie d'Alzheimer et séquences nucléotidiques pour sa mise en oeuvre
La présente invention a pour objet un procédé de détection d'une nouvelle mutation intervenant dans la maladie d'Alzheimer.
Elle est en outre relative à des séquences nucléotidiques pour la mise en oeuvre de ce procédé.
L'apolipoprotéine E (apo E) est une glycoprotéine plasmatique de 299 acides aminés, synthétisée principalement par le foie et l'intestin, mais aussi dans la plupart des autres tissus, notamment par l'astrocyte du tissu nerveux. La concentration normale en apo E du plasma est de l'ordre de 40 mg/1. Elle y est présente dans les lipoprotéines chylomicrons, VLDL, ILDL (ainsi que dans le liquide céphalo-rachidien) . On connaît la séquence de la protéine (RALL et al, 1982 J. Biol. Chem. , 257: 4171-4178), celle de l'ADN complémentaire, ainsi que la structure et la séquence du gène APO E (DAS et al, 1985, J. Biol. Chem., 260: 6240-6247; PAIK et al, 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. , 82:3445-3449 ). Le quatrième exon du gène code pour le domaine de la protéine apo E, qui participe à la liaison avec le récepteur LDL.
Des différences dans la séquence d'ADN de cette région déterminent les trois isoformes communes de l'apo E (E2, E3 et E4) . E2 et E4 diffèrent de E3 par des substitutions de bases: dans E4, C se trouve à la place de T en position 3932, et dans E2 se trouve T à la place de C en position 4070. Il en résulte les changements en acides aminés suivants: Cys (112) au lieu de Arg pour 1"isoforme E4, et Arg (158) au lieu de Cys pour l'isoforme E2.
Ces trois isoformes de l'apo E sont classiquement distinguées par isofocalisation des protéines du sérum. Il est actuellement plus aisé de les génotyper par amplification en chaîne par polymerase (PCR) sur la base de leur variation de séquence d'ADN (Hixson et Vernier, 1990, J. Lipid Res. , 31:545-548), par coupure, après amplification, avec l'enzyme de restriction Hha I.
En 1993, Strittmatter et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1977-1981) ont montré que la fréquence allelique de APOE-ε4 était de 0,50 + 0,06 dans trente familles de patients atteints par la forme tardive de la maladie d'Alzheimer, alors qu'elle n'était que de 0,16 + 0,03 chez les témoins. Les mêmes chercheurs ont retrouvé par la suite (Saunders et al., 1993, Neurology, 43:1467-1472) la nature élevée de l'association entre APO E-ε4 et la maladie d'Alzheimer pour 176 cas certains établis par autopsie.
La même année, Lucotte et al. (Lancet, 342:1309) ont étendu cette association aux patients atteints par la forme sporadique, qui représente l'essentiel (plus de 95%) des cas d'Alzheimer. Ces résultats ont été confirmés ultérieurement par plus d'une cinquantaine de laboratoires indépendants de par le monde. II ressort donc de l'état de la technique que l'on connaissait déjà des procédés d'analyse génétique permettant de détecter, au niveau de l'ADN de patients, s'ils étaient porteurs d'une mutation du gène Apo E liée à la maladie d'Alzheimer. Cependant, tous les cas d'Alzheimer ne sont pas liés au variant ε4 de l'Apo E, et à l'inverse d'autres Alzheimer peuvent se manifester chez des patients apparemment aussi bien ε3 que ε2.
La demanderesse a trouvé une nouvelle mutation dans le gène de 1 'apolipoprotéine E et a montré que cette mutation était associée avec une forte probabilité à la maladie d'Alzheimer.
La demanderesse a donc résolu le problème exposé ci-dessus en fournissant le moyen de distinguer les patients porteurs d'une mutation supplémentaire de l'Apo E qui, conjointement à ε4 ou indépendamment d'elle, détermine l'Alzheimer.
La présente invention a pour objet un procédé de détection, dans une préparation d'ADN, d'une mutation intervenant dans la maladie d'Alzheimer caractérisé en ce que l'on détermine la présence, dans le gène de l'apolipoproteine E, d'une des séquences nucléotidiques SEQ ID N* 1, SEQ ID N*3 OU SEQ ID N*5 suivantes: SEQ ID NJ : TGC GGC CGC
SEQ ID N"3 : TGC GAC CGC SEQ ID N*5: CGC GAC CGC Ces trois séquences correspondent respectivement aux séquences d'acides aminés SEQ ID N*2, SEQ ID N'4 et SEQ ID N*6 suivantes:
SEQ ID N'2 : Cys Gly Arg SEQ ID N'4 : Cys Asp Arg SEQ ID N* 6 : Arg Asp Arg La présente invention a aussi pour objet un procédé de détection d'une telle mutation dans une préparation d'ARN, auquel cas on recherche la présence dans l'ARN correspondant au gène de l'apolipoproteine E, soit de la séquence SEQ ID N*5, soit des séquences SEQ ID N*7 et SEQ ID N* 8 correspondant respectivement aux séquences SEQ ID N* 1 et SEQ ID N*3 dans lesquelles T a été remplacé par U.
SEQ ID N'7 : UGC GGC CGC SEQ ID N' 8: UGC GAC CGC Selon un premier mode de mise en oeuvre de l'invention, la présence de la séquence nucléotidique est mise en évidence par séquençage de l'ADN, ou d'ARN, dans lequel on recherche ces séquences.
Des méthodes de séquençage sont bien connues de l'homme du métier et sont en particulier décrites dans MAILLET-BARON "Séquençage des acides nucléiques"
Editions Lavoisier, 1992, Paris auquel on peut se référer pour la mise en oeuvre de telles méthodes.
Selon un second mode de mise en oeuvre de l'invention, la détermination de la présence d'une des séquences nucléotidiques est effectuée par amplification spécifique de l'ADN, dans lequel on recherche ces séquences, c'est-à-dire celui du gène de l'apolipoproteine E ou d'une partie de ce gène.
Des exemples illustratifs de ces modes de mise en oeuvre sont décrits ci-après.
La présente invention est en outre relative à des séquences nucléotidiques comprenant d'environ 20 à environ 30 nucléotides, ou paires de bases, et comprenant l'une des séquences SEQ ID N*3 ou SEQ ID N*5 décrites ci-dessus. De telles séquences ainsi que la séquence SEQ ID N*l peuvent être avantageusement utilisées comme oligosondes pour l'amplification spécifique de la partie du gène de l'apolipoproteine E dans laquelle on recherche la présence d'une mutation. On notera néanmoins que l'amplification d'une telle séquence peut être effectuée à l'aide d'amorces ne contenant pas l'une des séquences SEQ ID N* 1, SEQ ID N*3 ou SEQ ID N*5. En effet, le but du procédé selon l'invention est d'amplifier un fragment d'environ 100 à 400 paires de bases, susceptible de contenir la mutation recherchée. Des amorces peuvent donc être choisies de part et d'autre de la région à amplifier.
L'amplification spécifique de la séquence susceptible de contenir une mutation est préférentiellement effectuée par la méthode de réaction de polymérisation en chaîne (PCR) , et en particulier sa variante ARMS ( Allele Refractory Mutation System) . Les produits de la réaction d'amplification sont identifiés par toute méthode connue de l'homme du métier permettant de différencier deux fragments d'ADN, et en particulier par coloration à l'aide du bromure d'éthidium ou par hybridation avec des oligosondes.
Pour la mise en oeuvre de la méthode PCR, l'homme du métier peut consulter de manière avantageuse: LARZUL, " Un procédé de réplication in vitro", Editions Lavoisier, 1993, Paris. On rappelera néanmoins que la variante dite
ARMS de la méthode PCR comprend les étapes suivantes: utilisation d'une amorce commune (C) et de deux amorces différentielles; l'une correspondant à l'allele normal (B), et l'autre à l'allele muté (A); la réaction est effectuée simultanément d'une part entre amorce commune et amorce normale (AC) , et d'autre part entre amorce commune et amorce mutée (BC).
La mutation peut aussi être mise simplement en évidence par digestion du produit d'amplification par une enzyme de restriction appropriée, dont la mutation (lorsqu'elle est présente) altère le site de coupure: ainsi, l'enzyme de restriction Not I (GCGGCCGG) coupe normalement la séquence une fois en deux fragments de restriction de 72 et 172 paires de bases; lorsque la mutation est présente, un seul fragment à 244 paires de bases est alors obtenu.
La présente invention est illustrée sans être aucunement limitée, par les exemples qui suivent : La figure 1 est une représentation de la séquence ADN de la région apo E amplifiée, allant de la séquence nucléotidique n" 3869 à la n" 3958 (flèches montantes) (SEQ ID N*9). Les séquences protéiques correspondantes vont de 90 à 121 (flèches descendantes) (SEQ ID N*10). Les deux premiers sites Hhal (GCGC) sont soulignés et le troisième, polymorphe ε2, ε3,ε4, encadré. Les quatres sites polymorphes de la troisième lettre des codons sont indiqués. Les sites correspondants à la nouvelle mutation sont encadrés (GGC —^Gly/GAC —^ Asp)..
Les figures 2A à 2C représentent des gels d'agarose issus du procédé de génotypage par PCR ARMS de la mutation. L'amorce commune C est utilisée conjointement, d'une part avec l'amorce mutante A, et d'autre part avec l'amorce normale B. Dans les conditions de température d'hybridation décrites dans le texte, les trois sortes de génotypes: +/+ (une bande BC) , +/m (deux bandes d'égale intensité deux fois moindre) , et m/m (une bande AC) , correspondant respectivement aux figures 2A, 2B et 2C, sont ainsi facilement identifiables. EXEMPLE 1-
Mise en évidence de la mutation en position 3936 du gène codant pour l'apolipoproteine E. Par séquençage direct du produit PCR obtenu selon Hixson et Vernier (précédemment cités) de la séquence d'ADN du gène de 1 'apolipoproteine E, correspondant aux positions 3869 à 3955 chez 29 individus différents, sains ou atteints de la maladie d'Alzheimer et génotypes par APOE, trois types de variation ont été mis en évidence (figure 1).
Chez les ε4 on retrouve le remplacement de T par C (3932), aboutissant au niveau protéique à la substitution de Cys par Arg (112). Quatre polymorphis es, correspondant à des remplacements portant sur la troisième base des codons, et neutres du point de vue protéique: G par T (3877), G par A (3886), G par T (3889), et G par T (3946) sont mis en évidence. Enfin et surtout, il a été montré, chez la plupart des malades Alzheimer ε4 une substitution G par A en position 3936, devant déterminer au niveau protéique la substitution Gly par Asp en position 113. Cette dernière substitution, déduite de celle détectée au niveau de l'ADN, est susceptible d'avoir d'importantes conséquences sur la structure de l'APOE.
Parmi les 29 individus séquences, la mutation G par A (3936) est présente chez huit individus témoins, non atteints de la maladie d'Alzheimer à un âge avancé: deux homozygotes 3-3 (Nos 1559 et 145), deux hétérozygotes 2-3 (Nos 1542 et 1597), un hétérozygote 2-4 (N'1149), deux hétérozygotes 3-4 (Nos 1573 et 1542), et même un homozygote 4-4 (N* 125).
Elle est par contre présente à l'état homozygote chez cinq malades Alzheimer probables 4-4 (Nos 65, 100, 203, 214 et 265) et un malade Alzheimer certain 3-3 (n"81). Elle est aussi présente à l'état homozygote chez un individu à risque primaire 3-3 (n'207), et à l'état hétérozygote chez quatre autres individus à risque primaire 3-3 (Nos 159, 160 , 206 et 209). Elle est également présente à l'état hétérozygote chez deux autres malades Alzheimer probables 3-4 (Nos 233 et 236) et un autre malade Alzheimer probable 3-3 (n* 235). Elle est cependant absente chez sept autres malades Alzheimer probables: quatre 3-3 (Nos 215, 226, 231 et 232), un 2-3 (n' 229), et deux 3-4 (Nos 213 et 227).
Au total, chez vingt et un malades Alzheimer probables, certains, ou à risque primaire (42 allèles), la mutation est présente 21 fois, soit dans 50% des cas.
Dix huit fois sur vingt et une ( 86% des cas), elle est associée à au moins un allele ε4.
L'association observée est explicable en termes de déséquilibre de liaison entre deux sites mutés correspondant à des codons contigus.
Le microséquençage après digestion peptidique de l'apo E chez un malade Alzheimer probable homozygote 4-4 et présentant à l'état homozygote la mutation G par A (3936) montre que le résidu Asp (113) est effectivement présent.
Un mode de mise en oeuvre de l'invention utilise la technique de séquençage d'ADN, selon laquelle on réalise un séquençage direct par utilisation de l'enzyme séquenase (kit industriel), sur un appareil séquenceur automatique Applied Biosystems. Le brin non-codant a été séquence deux fois pour chaque réaction, par utilisation de l'amorce 5'-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3' Un autre mode de mise en oeuvre de l'invention, plus facile à mettre en oeuvre que le précédent, consiste à utiliser la technique PCR pour la détection de la mutation.
Deux amorces différentielles: A: 3'-TGGCGGACCACGTCATGGCG-5'
(amorce mutante) B: 3'-CGGCGGACCACGTCATGGCG-5' (amorce normale) sont utilisées en technique PCR ARMS (allele refractory mutation System) avec une amorce commune C située à environ 300 pb dans l'intron adjacent. Pour chaque échantillon sont réalisées deux PCR simultanées: AC et BC dans les conditions suivantes: 1 μg d'ADN génomique 1 pmol/μl de chaque amorce, lOμmol/μl des dNTP 10% DMSO
0,025 U/μl de Taq polymerase
dans un volume de 50 μl de tampon (Tris-HCl, 10 mM, pH=8,3; 50 mM KC1; 1,5 mM MgCl2) la réaction est de 30 cycles 95*C 1 minute
(dénaturâtion)
64"C 1 minute (hybridation)
70*C 2 minutes
(élongation) .
La température d'hybridation est discriminante entre les réactions AC et BC. La bande d'amplifiât observable en gel d'agarose permet de réaliser le génotype comme illustré à la figure 2.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: LABORATOIRES EUROBIO
(B) RUE: 7, Avenue de Scandinavie
(C) VILLE: LES ULIS
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 91953
(G) TELEPHONE: 69 07 94 77 (H) TELECOPIE: 69 07 95 34 (I) TELEX: 681 425 F
(ii) TITRE DE L' INVENTION: PROCEDE DE DETECTION D'UNE MUTATI INTERVENANT DANS LA MALADIE D'ALZHEIMER ET SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES POUR SA MISE EN OEUVRE
(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 10
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible
(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB
(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 95 01 884
(B) DATE DE DEPOT: 17-FEB-1995
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 9 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
( ii ) TYPE DE MOLECULE : ADN ( génomique )
( iii ) HYPOTHETIQUE : NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1: TGCGGCCGC (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 3 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2
Cys Gly Arg
1
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 9 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (genomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: TGCGACCGC (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 3 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (genomique) (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4
Cys Asp Arg
1
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 9 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: double
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (genomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5 CGCGACCGC (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 3 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS:
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6
Arg Asp Arg 1
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 9 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNm
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7 UGCGGCCGC (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 9 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ARNm
(ii ) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8: UGCGACCGC (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 90 paires de bases
(B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN (genomique)
(iii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: allele
(B) EMPLACEMENT:replace(9, "t")
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: allele
(B) EMPLACEMENT:replace(18, "a")
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: allele
(B) EMPLACEMENT:replace(21, "t")
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: allele
(B) EMPLACEMENT:replace(64, "c")
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: allele
(B) EMPLACEMENT:replace(68, "a")
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: allele
(B) EMPLACEMENT:replace(78, "t")
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9: GCACGGCTGT CCAAGGAGCT GCAGGCGGCG CAGGCCCGGC TGGGCGCGGA CATGGAGGA GTGTGCGGCC GCCTGGTGCA GTACCGCGGC (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 30 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linéaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: Modified-site
(B) EMPLACEMENT:22
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product≈ "arg"
(ix) CARACTERISTIQUE:
(A) NOM/CLE: Modified-site
(B) EMPLACEMENT:23
(D) AUTRES INFORMATIONS:/product≈ "asp"
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:
Ala Arg Leu Ser Lys Glu Leu Gin Ala Ala Gin Ala Arg Leu Gly Ala 1 5 10 15
Asp Met Glu Asp Val Cys Gly Arg Leu Val Gin Tyr Arg Gly 20 25 30

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection, dans une préparation d'ADN, d'une mutation intervenant dans la maladie d'Alzheimer caractérisé en ce que l'on détermine la présence, dans le gène de l 'apolipoproteine E, d'une des séquences nucléotidiques SEQ ID N*l, SEQ ID N*3 ou SEQ ID N"5 suivantes:
SEQ ID N"l: TGC GGC CGC SEQ ID N*3: TGC GAC CGC
SEQ ID N*5: CGC GAC CGC
2. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la présence de la séquence nucléotidique est déterminée par séquençage de l'ADN.
3. Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce que la présence de la séquence nucléotidique est déterminée par amplification spécifique de l'ADN du gène de l 'apolipoproteine E ou d'une partie de ce gène.
4. Procédé selon la revendication 3 caractérisé en ce que l'amplification est effectuée par la méthode d'amplification en chaîne par polymerase (PCR).
5. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend l'une des séquences SEQ ID N'3, ou SEQ ID N*5.
6. Oligosondes pour réaction d'amplification en chaîne par polymerase ( PCR) présentant la séquence selon la revendication 5.
7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que la réaction est mise en oeuvre à l'aide d'amorces oligonucléotidiques dans le gène choisies de part et d'autre de la région à amplifier.
8. Procédé selon la revendication 7 caractérisé en ce que l'une des amorces est celle selon la revendication 6.
9. Produit issu de l'amplification par un procédé selon l'une des revendications 3, 4, 7 et 8 caractérisé en ce qu'il présente une taille comprise entre environ 100 et 400 paires de bases.
10. Procédé de détection dans une préparation d'ARN d'une mutation intervenant dans la maladie d'Alzheimer caractérisé en ce que l'on détermine la présence, dans l'ARN correspondant au gène de 1 'apolipoproteine E, d'une des séquences SEQ ID N*5, SEQ ID N"7 OU SEQ ID N-8 suivantes: SEQ ID N* 7 UGC GGC CGC
SEQ ID N' 8 UGC GAC CGC
SEQ ID N' 5 CGC GAC CGC
11. Séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend l'une des séquences SEQ ID N*7 ou SEQ ID N'8.
PCT/FR1996/000263 1995-02-17 1996-02-19 Procede de detection d'une mutation intervenant dans la maladie d'alzheimer et sequences nucleotidiques pour sa mise en ×uvre WO1996025517A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR95/01884 1995-02-17
FR9501884A FR2730745B1 (fr) 1995-02-17 1995-02-17 Procede de detection d'une mutation intervenant dans la maladie d'alzheimer et sequences nucleotidiques pour sa mise en oeuvre

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO1996025517A1 true WO1996025517A1 (fr) 1996-08-22
WO1996025517A9 WO1996025517A9 (fr) 1996-11-28

Family

ID=9476285

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR1996/000263 WO1996025517A1 (fr) 1995-02-17 1996-02-19 Procede de detection d'une mutation intervenant dans la maladie d'alzheimer et sequences nucleotidiques pour sa mise en ×uvre

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR2730745B1 (fr)
WO (1) WO1996025517A1 (fr)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998039477A2 (fr) * 1997-03-03 1998-09-11 Brigham And Women's Hospital DIAGNOSTIC DES ASTHMATIQUES PREDISPOSES A UNE INTOLERANCE AUX β-AGONISTES
WO2000032811A2 (fr) * 1998-12-01 2000-06-08 Michael Essrich Procede d'analyse du genotype de l'apolipoproteine e dans un prelevement humain

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108588207A (zh) * 2018-04-02 2018-09-28 南昌艾迪康医学检验实验室有限公司 检测apoe基因型别的引物和方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994009155A1 (fr) * 1992-10-13 1994-04-28 Duke University Procedes de detection de la maladie d'alzheimer

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994009155A1 (fr) * 1992-10-13 1994-04-28 Duke University Procedes de detection de la maladie d'alzheimer

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BERR, C.: "apolipoprotéine E et maladie d' Alzheimer", REVUE NEUROLOGIQUE, vol. 151, no. 1, January 1995 (1995-01-01), pages 3 - 5, XP002005037 *
HANLON, C. ET AL: "Arginine residues at codons 112 and 158 in the apolipoprotein E gene correspond to the ancestral state in humans", ATHEROSCLEROSIS, vol. 112, January 1995 (1995-01-01), pages 85 - 90, XP002005036 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998039477A2 (fr) * 1997-03-03 1998-09-11 Brigham And Women's Hospital DIAGNOSTIC DES ASTHMATIQUES PREDISPOSES A UNE INTOLERANCE AUX β-AGONISTES
WO1998039477A3 (fr) * 1997-03-03 1998-12-17 Brigham & Womens Hospital DIAGNOSTIC DES ASTHMATIQUES PREDISPOSES A UNE INTOLERANCE AUX β-AGONISTES
US6156503A (en) * 1997-03-03 2000-12-05 The Regents Of The University Of California Diagnosing asthma patients predisposed to adverse β-agonist reactions
WO2000032811A2 (fr) * 1998-12-01 2000-06-08 Michael Essrich Procede d'analyse du genotype de l'apolipoproteine e dans un prelevement humain
DE19855469A1 (de) * 1998-12-01 2000-06-15 Michael Esrich Verfahren zur Bestimmung des Apolipoprotein-E-Genotyps in einer menschlichen Probe
WO2000032811A3 (fr) * 1998-12-01 2000-09-08 Michael Essrich Procede d'analyse du genotype de l'apolipoproteine e dans un prelevement humain
DE19855469C2 (de) * 1998-12-01 2001-01-11 Michael Esrich Verfahren zur Bestimmung des Apolipoprotein-E-Genotyps in einer menschlichen Probe

Also Published As

Publication number Publication date
FR2730745B1 (fr) 1997-06-13
FR2730745A1 (fr) 1996-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Whittock et al. Striate palmoplantar keratoderma resulting from desmoplakin haploinsufficiency
Moriya et al. Effects of polymorphisms of MDR1, MRP1, and MRP2 genes on their mRNA expression levels in duodenal enterocytes of healthy Japanese subjects
Bürger et al. Hereditary spastic paraplegia caused by mutations in the SPG4 gene
Pras et al. Mutations in the SLC3A1 transporter gene in cystinuria
van den Maagdenberg et al. Apolipoprotein E* 3-Leiden allele results from a partial gene duplication in exon 4
US6297014B1 (en) Genetic test to determine non-responsiveness to statin drug treatment
Heim et al. [17] Genetic polymorphism of debrisoquine oxidation: restriction fragment analysis and allele-specific amplification of mutant alleles of CYP2D6
EP0749498A1 (fr) Marqueurs genetiques utilises conjointement pour le diagnostic de la maladie d'alzheimer, methode et kit de diagnostic
EP1186672A2 (fr) Polymorphismes dans le gène humain du transporteur d'anion organique (OATP-C)
Yoon et al. Endothelial nitric oxide synthase gene is associated with vessel stenosis in Korean population
Jo et al. Interaction between− 786TC polymorphism in the endothelial nitric oxide synthase gene and smoking for myocardial infarction in Korean population
WO1996025517A1 (fr) Procede de detection d'une mutation intervenant dans la maladie d'alzheimer et sequences nucleotidiques pour sa mise en ×uvre
Suzuki et al. A novel genetic marker for coronary spasm in women from a genome-wide single nucleotide polymorphism analysis
AU2006307640B2 (en) Genetic variants of human inositol polyphosphate-4-phosphatase, type I (INPP4A) useful for prediction and therapy of immunological disorders
WO1996025517A9 (fr) Procede de detection d'une mutation intervenant dans la maladie d'alzheimer et sequences nucleotidiques pour sa mise en ×uvre
Bjerre et al. Porcine parkin: molecular cloning of PARK2 cDNA, expression analysis, and identification of a splicing variant
Bespalova et al. G to C transversion at a splice acceptor site causes exon skipping in the cystatin B gene
FR2737732A1 (fr) Test co-dominant de diagnostic genetique
Pisciotta et al. A “de novo” mutation of the LDL-receptor gene as the cause of familial hypercholesterolemia
CA2416533A1 (fr) Methode de detection d'erreurs du metabolisme lipidique
FR2914316A1 (fr) Methodes et outils pour determiner l'origine d'un sujet.
US9909182B1 (en) Methods for identifying subjects susceptible to charcot-marie-tooth neuropathy type 1C
Hirata et al. A method to detect the G894T polymorphism of the NOS3 gene. Clinical validation in familial hypercholesterolemia
Alonso-Montes et al. Mitochondrial transcription factors TFA, TFB1 and TFB2: a search for DNA variants/haplotypes and the risk of cardiac hypertrophy
JP3682688B2 (ja) 骨粗鬆症薬剤感受性予測方法およびそのための試薬キット

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CA JP US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
COP Corrected version of pamphlet

Free format text: PAGES 10-15,DESCRIPTION,AND PAGES 1/2-2/2,DRAWINGS,REPLACED BY NEW PAGES BEARING THE SAME NUMBER;DUE TO LATE TRANSMITTAL BY THE RECEIVING OFFICE

122 Ep: pct application non-entry in european phase