DE19855469A1

DE19855469A1 - Verfahren zur Bestimmung des Apolipoprotein-E-Genotyps in einer menschlichen Probe

Info

Publication number: DE19855469A1
Application number: DE19855469A
Authority: DE
Inventors: Michael Esrich
Original assignee: Michael Esrich
Current assignee: Immundiagnostik AG
Priority date: 1998-12-01
Filing date: 1998-12-01
Publication date: 2000-06-15
Anticipated expiration: 2018-12-02
Also published as: WO2000032811A3; WO2000032811A2; AU1969000A; DE19855469C2

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Apolipoprotein-E-Polymorphismus in einer menschlichen Probe durch PCR-Amplifikation einer ausgewählten Basensequenz und Nachweis der Apolipoprotein-E-Allele, wobei eine Multiplex-PCR mit 6 verschiedenen spezifischen Primern verwendet wird und jeweils vier der Primer direkt an den mutationsspezifischen Stellen enden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Apo lipoprotein-E-Allele in einer menschlichen Probe.

Das sekretorische Glycoprotein Apolipoprotein-E (ApoE) wurde ursprünglich im Blutplasma entdeckt, wo es als Be standteil von Lipoproteinen vorkommt. Verschiedene Unter suchungen zeigen, dass das Glycoprotein Apo-E am Choles terinmetabolismus und Triglyceridtransport zwischen ver schieden Zelltypen, einschließlich Nervenzellen, beteiligt ist. Es ist auch beschrieben, dass Apolipoprotein E eine Auswirkung auf das Neuritenwachstum und die Cytoskelett aktivität in Neuronen hat. Es ist bspw. beschrieben, dass ApoE4 durch Einwirkung auf den Lipoprotein-Metabolismus das Neuritenwachstum und die Mikrotubulusbildung hemmt.

Zudem ist ein Zusammenhang zwischen dem ApoE4-Genotyp und der Alzheimerkrankheit bekannt. Verschiedene Studien zei gen, dass das ApoE4-Allel mit einem erhöhten Risiko einer Alzheimererkrankung in Verbindung steht. Insbesondere bei Patienten mit einem homozygoten ApoE4-Genotyp liegt die Wahrscheinlichkeit im Alter an Alzheimer zu erkranken sehr viel höher als bei Patienten, bei denen zumindest ein anderes ApoE-Allel vorliegt. Bei Patienten, die kein ApoE4- Allel haben, kann hingegen eine sporadische Alzheimerer krankung mit großer Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden.

Die Alzheimerkrankheit ist eine neurodegenerative Krank heiten, die besonders ältere Menschen betrifft und durch starken geistigen Leistungsabfall gekennzeichnet ist. Mit über 70% ist sie die häufigste Form der Altersdemenz. Eine der pathologischen Veränderungen im Krankheitsverlauf ist die fortschreitende Ablagerung von fibrillärem Amyloidpro tein, das sich in den Nervenzellen des Gehirns und später auch im synaptischen Spalt ablagert und Plaques bildet.

Wegen der Abgeschlossenheit des menschlichen Gehirns durch die Blut/Hirnschranke können diese pathogenen Veränderungen bei Morbus Alzheimer bislang mit herkömmlichen labordiag nostischen Verfahren nicht nachgewiesen werden. Die Bestim mung der Plaques und neurofibrillärer Nekrosen kann daher erst post mortem erfolgen.

Aus diesem Grund wird seit Langem nach Verfahren gesucht, die eine frühzeitige verlässliche Diagnose der Alzheimer erkrankung ermöglichen.

Bisher beschränken sich die Verfahren zur frühen Diagnose der Alzheimererkrankung auf die Bestimmung des ApoE4-Status des Patienten. In jüngster Zeit wurde jedoch gefunden, dass nicht allein der Nachweis des Risikoallels ApoE4 für die Diagnose einer Alzheimererkrankung von Bedeutung ist, son dern der gesamte ApoE-Allelstatus, d. h. das Verhältnis aller ApoE-Allele zueinander.

Neben dem entwicklungsgeschichtlich ältesten Apolipopro tein-E-4 (ApoE4) sind bislang weitere häufige ApoE-Iso formen nachgewiesen worden, die als ApoE2 und ApoE3 be zeichnet werden. Diese Allele beruhen jeweils auf einer Nukleinsäuremutation, die Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 112 und 158 zur Folge haben. Während bei ApoE4 an den Positionen 112 und 158 die Aminosäure Arginin vor kommt (Arg/Arg), hat ApoE3 an diesen Stellen Cys/Arg und ApoE2 Cys/Cys.

Im Gegensatz zum ApoE4-Allel sind für die ApoE2- und ApoE3- Allele Schutzfunktionen beschrieben, die auf ein verringer tes Risiko einer Alzheimererkrankung hinweisen. Verschie dene Studien unterstützen bspw. die statistische Beobach tung, dass etwa 64% des Risikos einer sporadischen Alzhei mererkrankung auf die Anwesenheit des Risikoallels ApoE4 entfallen und 23% auf die Abwesenheit des ApoE2-Allels. Es ist weiter beschrieben, dass das Verhältnis von ApoE4 zu ApoE2, ähnlich wie das Verhältnis von ApoE4 zu ApoE3, auf ein erhöhtes Risiko einer Erkrankung hinweist. Abb. 1 zeigt eine altersabhängige Genotypenverteilung, aus der das prozentuale Risiko einer Alzheimererkrankung in Abhängig keit vom Genotyp abgelesen werden kann. Das statistische Erkrankungsbild 75-jähriger Patienten zeigt bspw., dass bei einem homozygoten Genotyp ApoE4/4 nur ein 20%iger Schutz vor einer Alzheimererkrankung gegeben ist, bei dem Genotyp ApoE3/3 ein etwa 70%iger Schutz und bei Patienten mit einem ApoE2/2-Genotyp eine Erkrankung zu nahezu 100% ausgeschlos sen werden kann.

Eine verlässliche Diagnose der Alzheimerkrankheit und ins besondere der Ausschluß dieser Erkrankung erfordert daher, dass das gesamte ApoE-Allelbild ermittelt und die jewei ligen Einzelwerte gegeneinander abgewogen werden.

Das US-Patent 5 508 167 beschreibt ein Verfahren zum Nach weis von Apolipoprotein-E-4 in einer menschlichen Probe zur Verwendung als Indikator für ein erhöhtes Risiko einer Alz heimererkrankung. Das Verfahren umfasst das Vervielfältigen des Apolipoprotein-E-4-Gens aus einer menschlichen Probe durch eine herkömmliche PCR und den anschließenden Nachweis des ApoE-4-Allels durch ein Hybridisierungsverfahren oder einen Restriktionsverdau.

Nachteilig an dem Verfahren ist, dass mit der verwendeten herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktion (PCR) im ersten Schritt nur eine schwache Amplifikation des Apo-E4-Gens erreicht wird. Dies verringert die Nachweisempfindlichkeit der amplifizierten Sequenzregionen im zweiten Verfahrens schritt, der Hybridisierung bzw. dem Restriktionsverdau.

Ein weiterer Nachteil liegt darin, dass bei dem Restrik tionsverdau durch ApoE-unspezifische Reaktionen des Res triktionsenzyms eine Vielzahl Banden entsteht. Die Inter pretation dieser Banden erweist sich folglich als schwie rig, selbst wenn die Probe auf einem Gel stark aufgetrennt wird. Für ein Routineuntersuchung scheidet dieses Verfahren daher aus.

Es ist Aufgabe der Erfindung ein Verfahren bereitzustellen, das einen schnellen, hoch spezifischen, empfindlichen Nach weis der ausgewählten Allele des Apolipoproteins-E ermög licht.

Die Aufgabe wird gelöst durch das erfindungsgemäße Verfah ren zur Bestimmung des Apolipoprotein-E-Polymorphismus in einer menschlichen Probe durch PCR-Amplifikation einer aus gewählten Basensequenz und Nachweis der Apolipoprotein-E- Allele, wobei eine Multiplex-PCR mit 6 verschiedenen spezi fischen Primern verwendet wird und jeweils vier der Primer direkt an den mutationsspezifischen Stellen enden. Die zwei Basisprimer sind nicht variabel und liegen vorzugsweise in Regionen, in denen keine Mutationen bekannt sind.

Eine bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Verfahren, bei dem die Primer, die direkt an den mutationsspezifischen Stellen enden, durch Basenmismatche an der dritten bis fün ften, vorzugsweise an der vierten Stelle vor dem 3'-Ende spezifitätsverstärkt sind.

Die Primer haben bevorzugt eine Länge von 10 bis 30 Basen paare, besonders bevorzugt von 15 bis 28 Basenpaare.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden als Primer vor zugsweise Oligonukleotide verwendet, die die Sequenz eines Apolipoprotein-Allels aufweisen und 15 bis 28 Basenpaare lang sind, und wobei vier der Primer direkt an den muta tionsspezifischen Stellen der Apolipoprotein-E-Allele enden und gegebenenfalls durch Basenmismatche an der dritten bis fünften, vorzugsweise an der vierten Stelle vor dem 3'-Ende spezifitätsverstärkt sind, und die zwei Basisprimer nicht variabel sind und vorzugsweise in Regionen liegen, die keine Mutationen aufweisen.

Zudem können die Oligonukleotide einen unspezifischen Se quenzteil zur leichteren elektrophoretischen Unterscheid barkeit haben.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Ver fahren, bei dem als Primer Oligonukleotide verwendet werden mit den Sequenzen:

wobei die Sequenzen einem Teil der nativen ApoE-Sequenzen entsprechen und zudem so verändert sein können, dass an der dritten bis fünften, vorzugsweise an der vierten Stelle vor dem 3'-Ende ein Basenmismatch eingefügt ist.

Weiter bevorzugt ist dann z. B. ein Verfahren, bei dem als Primer Oligonukleotide verwendet werden mit den Sequenzen:

Die Primer haben vorzugsweise Schmelzpunkte, die vonein ander höchstens um 5°C, vorzugsweise um 2°C abweichen. Die Primer können auch fluoreszenzmarkiert sein, so dass der Nachweis der Allelvarianten mit einem Mehrfachfluoreszenz detektor erfolgen kann.

Vorzugsweise sollte in der Multiplex-PCR des erfindungsge mäßen Verfahrens ein DMSO-freies Relaxationsreagens, vor zugsweise Solution-D® von Qiagen GmbH, Hilden, verwendet werden.

Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Verfahren, bei dem die Primer ∈I und ∈IV etwas weiter entfernt von den diagnostischen Codons liegen. Dieses Verfahren ist bspw. geeignet, wenn man ein Elektrophoresesystem mit niedriger Gelkonzentration verwendet, bspw. aus Kostengründen oder aufgrund technischer Vorgaben. Der Primer ∈IV liegt dabei bevorzugt auf der 3'-Seite des Codons 158.

Die erfindungsgemäße PCR ermöglicht auch eine wirksame Syn these längerer Amplimere mit hoher Ausbeute, bspw. Ampli mere mit einer Länge von 200 bis 700 Basenpaaren. Um die Amplimere in der Elektrophorese oder der Flüssigchromato graphie besser voneinander unterscheiden zu können, kann man daher die Längendifferenz der Primer vergrößern, bspw. indem einzelnen codonspezifischen Primern eine Anzahl Basen als "Schwanz" oder "Anhängsel" angefügt wird.

Eine weitere Ausführungsform betrifft ein Verfahren, bei dem anstelle der 5'-Primer ∈I und ∈IV Mischbasenoligonu kleotiden eingesetzt werden. Dies betrifft Fälle, bei denen im Sequenzbereich der Basisprimer ∈I und ∈IV alzheimerrele vante Mutationen auftreten. Solche Sequenzvarianten, die die Primerbindung beeinflussen können, können durch die Verwendung von Mischbasenoligonukleotiden neutralisiert werden. Mischbasenoligonukleotide entsprechen einem Oligo nukleotidgemisch, das aus gleichen Teilen Oligonukleotide besteht, die jeweils eine der möglichen Basen an der muta tionsrelevanten Position enthalten. So können auch bei vor liegenden Mutationen im Bereich der Basisprimer alle Se quenzvarianten in der Multiplex-PCR erfasst werden.

Noch eine weitere Ausführungsform betrifft ein Verfahren, wobei anstelle einer Multiplex-PCR eine PCR mit zwei Oligo nukleotiden als Primer verwendet wird mit den Sequenzen:

und zum Nachweis eine Restriktionstypisierung erfolgt.

Die Erfindung betrifft zudem Oligonukleotide, die eine Se quenz aus einem Apolipoprotein-Allel aufweisen, 15 bis 28 Basenpaare lang sind, und entweder direkt an einer muta tionsspezifischen Stelle eines Apolipoprotein-E-Allels en den und gegebenenfalls durch Basenmismatche an der dritten bis fünften, vorzugsweise an der vierten Stelle vor dem 3'- Ende spezifitätsverstärkt sind, oder invariable sind und in einer mutationsfreien Region liegen.

Die Erfindung betrifft insbesondere Oligonukleotide mit den nativen ApoE-Sequenzen:

wobei an der dritten bis fünften, vorzugsweise an der vier ten Stelle vor dem 3'-Ende eine Basenveränderung eingefügt sein kann.

Besonders bevorzugt sind Oligonukleotide mit den Sequenzen:

Erfindungsgemäß werden die vorstehenden Oligonukleotide als Primer in einer Multiplex-PCR zum Nachweis von Apolipopro tein-E-Allelen eingesetzt.

Die Erfindung betrifft auch Diagnosekits für die Alzheimer erkrankung, umfassend

a) Oligonukleotide mit den nativen ApoE-Sequenzen:
wobei zudem an der dritten bis fünften, vorzugsweise an der vierten Stelle vor dem 3'-Ende eine Basenveränderung ein gefügt sein kann, und
b) PCR-Reagenzien, insbesondere Polymerase, dNTPs und Relaxationsreagens.

Eine Ausführungsform betrifft ein Diagnosekit, das eine Mul tititerplatte umfasst, in der die Reaktionsreagenzien verglast, d. h. in Zucker vernetzt enthalten sind, so dass man für den Nachweis lediglich die zu untersuchende Probe und Wasser zugeben muss. Eine weitere Ausführungsform be trifft ein Kit, das Nachweisstreifen enthält, auf denen die Reaktionsreagenzien aufgebracht sind.

Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, dass deutlich mehr gewünschtes PCR-Produkt gewonnen werden kann als mit herkömmlichen Ver fahren und zum Nachweis der Allele kein Hybridisierungsver fahren bzw. Restriktionsverdau benötigt wird.

Zudem wurde erkannt, dass der entsprechende DNS-Bereich der Apolipoprotein-E-Gene aufgrund eines vergleichsweise hohen GC-Gehalts von über 70% zur Bildung unspezifischer Doppel bindungen neigt und dadurch die PCR stark beeinträchtigt. Eine spezifische PCR kann daher nur stattfinden, wenn die Tendenz zu unspezifischen Doppelstrangbildungen herabge setzt wird. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden da her als Primer kürzere Oligonukleotide als bei den herkömm lichen Verfahren eingesetzt und zudem eine geringere Magne siumkonzentration.

Es wurde auch gefunden, dass die Zugabe von DMSO ins Reak tionsgemisch die PCR-Reaktion nicht positiv beeinflusst. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde daher als Relax ationsreagens ein DMSO-freies Additiv verwendet, und zwar Solution-D® der Firma Qiagen. Es können auch andere DMSO freie Relaxationsreagenzien wie Lösung-W1®, ein Gemisch aus Polyoxyethylenether der Firma Sigma, oder Mischungen aus Tween-20®, Tween-25®, Tween-30® und Tween-35® verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft eine Multiplex-PCR, die zum Nachweis weder einen Restriktions- noch einen Hybri disierungsschritt benötigt. Bei dem erfindungsgemäßen Ver fahren werden in einem Schritt sechs kurze bis sehr kurze Primer eingesetzt, von denen vier jeweils direkt an den mutationsspezifischen Stellen enden und durch Basenmismat che an der vierten Stelle vor dem 3'-Ende spezifitätsver stärkt sind. Diese Oligonukleotide werden als Stolperprimer bezeichnet. Die zwei weiteren Primer, auch "Forward"- oder Basisprimer genannt, sind nicht variabel und liegen vorzugs weise in konservierten Bereichen, in denen keine Mutationen vorliegen, bzw. bekannt sind. Durch diese Reaktion können alle in der Probe vorkommenden Allele in einem Reaktionsan satz nachgewiesen werden, und zwar direkt nach Auftrennung der Banden in einem einfachen Agarosegel mit Ethidiumbro mid. Die kurzen, vergleichsweise nahe beieinander liegenden Primer ermöglichen kurze Reaktionszyklen und einen hoch spe zifische Nachweis. Zudem ist die erfindungsgemäße Reaktion hoch effektiv und ermöglicht, dass geringere Oligonukleo tidmengen eingesetzt werden können als bei herkömmlichen Verfahren.

Als Vergleichsbeispiel wird eine Multiplex-PCR beschrieben bei der vier kurze Primer eingesetzt werden, von denen drei jeweils direkt an den mutationsspezifischen Stellen enden und durch Basenmismatche an der zweiten Stelle vor dem 3'- Ende spezifitätsverstärkt sind. Diese liefern keine ausrei chend spezifische Reaktion.

Das erfindungsgemäße Verfahren liefert je nach Genotyp der Patientenprobe zwei (bei einem homozygoten Genotyp) bzw. drei oder vier Banden (bei einem heterozygoten Genotyp). Die jeweiligen Genotypen lassen sich dabei an der Kombi nation der Banden unterscheiden. Das Allel ∈2 liefert Ban den bei 85 und 110 bp (Basenpaaren), das Allel ∈3 Banden bei 85 und 98 bp und das Allel ∈4 Banden bei 73 und 98 bp.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Es zeigt:

Abb. 1 eine altersabhängige Genotypenverteilung, aus der das prozentuale Risiko einer Alzheimererkrankung in Abhängigkeit vom Genotyp abgelesen werden kann;

Abb. 2 den Abschnitt der Nukleinsäuresequenz des ApoE-Proteins, der den Bereich mit den Codons 112 und 158 umfasst.

Abb. 3 eine Übersicht der Lokalisation der Apo lipoprotein-E-Allele und der bei der Multiplex-PCR verwen deten Primer ∈I bis ∈VI auf dem Apolipoprotein-E-Gen;

Abb. 4 das Bandenmuster der amplifizierten und im Agarosegel aufgetrennten PCR-Produkte verschiedener Patien tenproben;

Abb. 5 die Laufstrecken der ApoE-Amplimere in der Elektrophorese.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst eine Multiplex-PCR zur Vervielfältigung ausgewählter Genfragmente des Apolipo protein-E-Gens, die anschließend auf einem Agarosegel auf getrennt und mit Ethidiumbromid nachgewiesen werden.

Abb. 1 zeigt eine statistische Auswertung des Risikos einer sporadischen Alzheimererkrankung von Patienten mit verschiedenen ApoE-Genotypen in Abhängigkeit vom Alter.

Abb. 2 zeigt einen Ausschnitt der Nukleinsäuresequenz des ApoE-Proteins, der den Bereich mit den Codons 112 und 158 umfasst, wo die mutationsspezifischen Stellen liegen. Bei ApoE4 kodieren die Nukleinsäuresequenzen CgC an den Positionen 112 und 158 für die Aminosäuren Argenin (Arg/Arg), bei ApoE3 kodieren TgC und CgC für Cys/Arg und bei ApoE2 stehen CgC an beiden Positionen für Cys/Cys.

Abb. 3 zeigt eine Übersicht der Apolipoprotein-E-Alle le und die Lokalisation der zur Multiplex-PCR verwendeten Primer ∈I bis ∈VI auf dem Apolipoprotein-E-Gen. Das Apo lipoprotein-E-Gen enthält 2 Nukleinsäurecodons, die bei den jeweiligen ApoE-Isomeren verschieden sind und anhand derer sie sich unterscheiden lassen. Für das erfindungsgemäße Verfahren wurde eine DNS-Region ausgewählt, die die beiden variablen Nukleinsäurecodons (für AS 112 und 158) enthält. Beide Einzelnukleotidwechselstellen liegen im Exon 4 des ApoE-Gens. Beide Codons kommen meist in der Form CGC (für Arginin) und TGC (für Cystein) vor. Die drei häufigsten Kombinationen, die für die neuronale Prognose bedeutsam sind, sind die Allele mit den Codons . . . CGC . . . CGC . . . in Apo∈4, . . . TGC . . . CGC . . . in Apo∈3 und . . TGC . . . TGC . . . in Apo∈2.

Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft eine Multiplex-PCR mit sechs kurzen Primern, von denen vier jeweils direkt an den mutationsspezifischen Stellen enden und durch Basenmis matche an der vierten Stelle vor dem 3'-Ende spezifitäts verstärkt sind. Die beiden 5'-Primer ∈I und ∈IV sind in einem Sequenzbereich plaziert, der hinsichtlich alzheimer relevanter Mutationen nach derzeitiger Kenntnis invariabel ist. Werden in diesem Bereich Sequenzvarianten bekannt, die die Primerbindung beeinflussen, was leicht möglich ist, so werden diese durch Verwendung von Mischbasenoligonukleoti den neutralisiert.

Die erfindungsgemäßen Primer sind so entworfen, dass ihre Schmelzpunkte um 2°C aneinander angeglichen sind. Dies be trifft alle Primer, die in einer Multiplex-PCR eingesetzt werden, auch die Oligonukleotide, die einen unspezifischen oder "random" Anhang haben. Dieser Anhang von 12 bis 20 Nukleotiden ermöglicht, dass man die verschiedenen Allele nach der Auftrennung auf einem Agarosegel voneinander unter scheiden kann.

Als Primer werden Oligonukleotide mit nachstehende Sequen zen verwendet, die komplementär zum ausgewählten DNS-Be reich sind:

Bei vier dieser Primer ist an der dritten, vierten oder fünften Stelle vom 3'-Ende des Oligonukleotids ein Basen mismatch eingefügt, das beim Anlagern des Primers zu einem Wobbeleffekt führt und den Primer zu einem sogenannten Stol perprimer macht. Von den vorstehenden erfindungsgemäßen Oligonukleotiden sind ∈II, ∈III und ∈V, ∈VI Stolper primer. Bei Ihnen ist an der vierten Stelle vom 3'-Ende (siehe markierte Base) ein Basenmismatch eingefügt. Bei den Primern ∈II und ∈III ist das sequenzgemäße C gegen ein G ausgetauscht. Der Austausch kann auch gegen eine andere Base, bspw. T erfolgen. Bei den Primern ∈V und ∈VI ist das sequenzgemäße G gegen ein C ausgetauscht. Der Austausch kann auch gegen eine andere Base, bspw. T erfolgen.

Es wurde gefunden, dass die Position des Basenmismatches für den Wobbeleffekt entscheidend ist. Eine Stolperbase an der ersten oder zweiten Stelle vom 3'-Ende des Primers führt dazu, dass das 3'-Ende beim "Annealingschritt" der PCR "flattert", d. h. sich das Oligonukleotid nicht aus reichend an die DNS anlagert, und folglich die Polymerase nicht ansetzen kann. Eine Stolperbase an der Position 6 oder an einer anderen Stelle, die weiter 5' liegt, liefert hingegen keine ausreichende Selektivität zur Unterscheidung der Allele. Zur Unterscheidung zweier Allele, die nur in einer Base voneinander abweichen, benötigt man eine sehr hohe Selektivität. Diese wird erfindungsgemäß erreicht durch Einfügen einer Stolperbase an der dritten bis fünften Stelle vom 3'-Ende. Dadurch wird die Bedeutung der letzten Base vor der mutationsspezifischen Stelle erhöht und der Primer bindet nur solche Moleküle, zu denen auch die letzte Base komplementär ist.

Durch diese Reaktion können in einem Ansatz alle in der Probe vorkommenden Allele nachgewiesen werden. Dabei erhält man für jedes der verschiedenen Codons eine eigene Bande. Die Banden werden in einem Agarosegel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Je nach Genotyp der Pa tientenprobe erhält man zwei (bei einem homozygoten Geno typ) oder drei bis vier Banden (bei einem heterozygoten Genotyp), die den verschieden Allelen zugeordnet werden können.

Wenn die Primer ∈I und ∈II bei der Multiplex-PCR zum Ein satz kommen, erzeugen sie ein Amplimer mit einer Länge von 73 bp; spezifisch für Arg 112. Kommen die Primer ∈I und ∈III bei der Multiplex-PCR zum Einsatz, entsteht ein Ampli mer mit einer Länge von 85 bp, spezifisch für Cys 112. Wenn die Primer ∈IV und ∈V bei der Multiplex-PCR zum Einsatz kommen, erzeugen sie ein Amplimer mit einer Länge von 98 bp; spezifisch für Arg 158 und kommen die Primer ∈IV und ∈VII zum Einsatz, entsteht ein Amplimer mit einer Länge von 110 bp, spezifisch für Cys 158.

Die drei unterschiedlichen Genmorphen ergeben folgende Amplimerkonfigurationen:

Allel ∈4 (Arg 112, Arg 158): bp 73 und bp 98,
Allel ∈3 (Cys 112, Arg 158): bp 85 und bp 98, und
Allel ∈2 (Cys 112 und Cys 158): bp 85 und bp 110.

Anhand der Kombination der Amplimere können dann wie oben beschrieben die jeweiligen Genotypen unterschieden werden. Daraus ergibt sich im diploiden Genom der Genotyp je nach Amplimerkombination wie folgt:

Genotyp
Banden mit Basenpaaren
∈4/4	73 und 98
∈4/3	73, 85 und 98
∈4/2	73, 85, 98 und 110
∈3/3	85 und 98
∈3/2	85, 98 und 110 und
∈2/2	85 und 110

Abb. 4 zeigt das Bandenmuster des amplifizierten und im Agarosegel aufgetrennten PCR-Produkts einer Patienten probe. In den Bahnen 1 und 8 sind als Referenz Größenmarker aufgetragen, in Bahn 1 ein 100 bp-Marker und in Bahn 8 ein 20 bp-Marker. Die Bahnen 2-7 zeigen das aufgetrennte PCR- Produkt verschiedener Patientenproben. Über die Laufstrecke läßt sich zunächst die Größe der Banden ermitteln, aus der man nach dem vorstehend genannten Schlüssel den vorliegen den ApoE-Genotyp bestimmen kann. Die Probe in Bahn 2 zeigt 2 Banden von 73 und 98 bp, die dem Genotyp ∈4/4 entspre chen. Die Banden in Bahn 3 haben eine Größe von 85 bzw. 98 bp und stehen für den Genotyp ∈3/3. Bahn 4 zeigt zwei Ban den von 85 und 110 bp, entsprechend dem Genotyp ∈2/2. Bahn 5 zeigt 3 Banden mit 73, 85 bzw. 98 bp, die dem Genotyp ∈4/3 entsprechen. Die Probe in Bahn 6 enthält 4 Banden, je weils bei 73, 85, 98 und 110 bp, was dem Genotyp ∈4/3 ent spricht. Die Probe in Bahn 7 zeigt 3 Banden bei 85, 98 und 110, was für dem Genotyp ∈3/2 steht.

Abb. 5 zeigt die Auswertung einer Gelelektrophorese erfindungsgemäß vorbereiteter Patientenproben 1 bis 6. Die Abbildung zeigt die Laufstrecken (in Centimetern) der ApoE- Amplimere der jeweiligen Proben in der Elektrophorese. An hand der in der Gelelektrophorese mitgeführten DNS-Längen marker A und B wurden die ApoE-Amplimere den verschiedenen ApoE-Genotypen zugeordnet. Der Marker A ist ein 100-Basen paar-DNS-Marker. Bei diesem Elektrophoresegel entspricht eine Laufstrecke des Markers A von 0,9 cm 400 Basenpaaren, eine Laufstrecke von 4,5 cm 100 Basenpaaren. Der zweite Marker B ist ein 20-Basenpaar-DNS-Marker. Eine Laufstrecke von 1,8 cm entspricht hierbei 260 Basenpaaren, eine Lauf strecke von 2,5 cm 200, eine Laufstrecke von 4,5 cm 100 und eine Laufstrecke von 5,2 cm 80 Basenpaaren. Die gemessenen Laufstrecken der Patienten sowie die daraus abgeleiteten ApoE-Genotypen sind in nachstehender Tabelle wiedergegeben:

Anhand des ermittelten ApoE-Genotyps in der Probe kann eine Diagnose erfolgen hinsichtlich des Risikos einer Alzheimer erkrankung.

BEISPIELE Beispiel 1 Bestimmung der Sequenzvarianten der Apo-E- Allele

Für die Multiplex-PCR wurde Ausgangs-DNS hoher Reinheit eingesetzt.

Es wurde ein Reaktionsansatz von 50 µl zusammengestellt mit 1 × Reaktionspuffer des Polymeraseherstellers, 1 mM MgCl₂, 4 × 12,5 µM dNTPs, 0,01% BSA, 1 × Relaxationsreagens, 6 Oligonukleotide in einer Konzentration von 2 µM (Primer eI bis eVI), 0,1 U Taq-Polymerase von Perkin-Elmer sowie 1-2 µl DNS-Extrakt (100-200 ng). Es wurde als Relaxationsrea gens ein DMSO-ähnliches Mittel verwendet, das jedoch kein DMSO enthielt. So wurde eine spezifischere Doppelstrangbil dung der Primer erreicht und gleichzeitig die Bindungsstär ke verringert. Die eingesetzten Primer hatten die Sequen zen:

Für die PCR wurden folgende Zyklierbedingungen eingesetzt:
5 Minuten bei 95°C, und dann
40 Zyklen mit:
94°C, 1 Minute,
64°C, 1 Minute,
72°C, 1 Minute,
74°C, 10 Minuten, und (4°C bis zur Entnahme).

Die PCR-Produkte wurden in einem 4%igen Metaphoragarosegel (hergestellt aus einer modifizierten Agarose der Firma FMC) in der Flachbettelektrophorese in ethidiumbromidhaltigem 1 × TBE-Puffer für 600 Vh aufgetrennt. Die Detektion erfolgte unter UV-Licht bei 311 nm.

Beispiel 2 Bestimmung der Sequenzvarianten der ApoE- Allele aus DNS-Ausgangsmaterial geringerer Reinheit

Es wurde eine PCR über die Gesamtlänge des ausgewählten Be reichs. Es wurden zwei Primer eingesetzt mit den Sequenzen:

Es wurden die gleichen PCR-Bedingungen wie in der Kombireak tion aus Beispiel 1 verwendet, außer dass die Konzentration der dNTPs 4 × 17 µM und die von MgCl₂ 1,4 mM betrug. Die Annealingtemperatur lag bei 66°C. Die Amplimerlänge war 214 bp. Die Sensitivität lag bei dieser Reaktion etwa 50% höher.

Anschließend erfolgte eine Restriktionstypisierung. Dazu wurde das PCR-Produkt mit zwei Restriktionsenzymen ge schnitten, jeweils spezifisch für Codon 112 und 158. Für jeden Ansatz wurden 30 µl PCR-Produkt mit 4 U BstH2 I und 5 U Afl III in 25 mM Tris, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA, mit einen pH-Wert von 7,8 2 Stunden bei 37°C verdaut. Die Proben wurden in 3,75% Metaphor in einer Horizontalelektrophorese in 1 × TBE mit Ethidiumbromid für 500 Vh aufgetrennt. Es wurden folgende Fragmente nachge wiesen:

∈4 194 bp,
∈3 145 bp und
∈2 165 bp.

Beispiel 3 Bestimmung der Sequenzvarianten der Apo-E- Allele einer größeren Probenzahl

Es wurde eine Multiplex-PCR durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei jedoch vier mutationsspezifische Primer verwendet wurden, die gleich lang waren und jeweils mit vier verschiedenen fluoreszierenden Farbstoffen markiert waren. Das jeweilige codonspezifische Primerpaar unter schied sich damit nur in der 3'-Base und dem fluoreszier enden Molekül am 5'-Ende. Die Primer eI und eIV entspre chen denen aus Beispiel 1.

Die PCR-Reaktion wurde dementsprechend vereinfacht, da die Primer praktisch identische Schmelzpunkte hatten. Zudem er möglichte die Fluoreszenzmarkierung der Primer, dass der Nachweis der Allelfragmente automatisiert werden konnte, bspw. mit einer HPLC-Anlage mit Mehrfachfluoreszenzdetek tor. Die Gelelektrophorese aus Beispiel 1 entfiel.

Vergleichsbeispiel

Bei diesem Versuch wurden als Primer 4 Oligonukleotide mit folgenden Sequenzen verwendet:

von denen drei jeweils direkt an den mutationsspezifischen Stellen endeten und durch Basenmismatche an der zweiten Stelle vor dem 3'-Ende spezifitätsverstärkt waren.

Es wurden die gleichen Versuchsbedingungen eingesetzt wie in Beispiel 1. Das Ergebnis zeigte jedoch eine Vielzahl un spezifischer Banden, die keine verlässliche diagnostische Auswertung ermöglichten.

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung des Apolipoprotein-E-Poly morphismus in einer menschlichen Probe durch PCR-Ampli fikation einer ausgewählten Basensequenz und Nachweis der Apolipoprotein-E-Allele, dadurch gekennzeichnet, dass eine Multiplex-PCR mit 6 verschiedenen spezifi schen Primern verwendet wird und jeweils vier der Primer direkt an den mutationsspezifischen Stellen enden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Primer, die direkt an den mutationsspezi fischen Stellen enden, durch Basenmismatche an der dritten bis fünften, vorzugsweise an der vierten Stelle vor dem 3'-Ende spezifitätsverstärkt sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, wobei die Primer eine Länge von 10 bis 30 Basenpaare haben, vorzugsweise von 15 bis 28 Basenpaare.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 und 3, dadurch gekenn zeichnet, dass als Primer Oligonukleotide verwendet werden, die die Sequenz eines Apolipoprotein-Allels aufweisen und 15 bis 28 Basenpaare lang sind, und vier der Primer direkt an den mutationsspezifischen Stellen der Apolipoprotein-E-Allele enden und gegebenenfalls durch Basenmismatche an der dritten bis fünften, vor zugsweise an der vierten Stelle vor dem 3'-Ende spezi fitätsverstärkt sind, und die zwei Basisprimer nicht variabel sind und vorzugsweise in Regionen liegen, die keine Mutationen aufweisen.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Primer Oligonukleotide verwendet werden mit den nativen ApoE-Sequenzen:
wobei an der dritten bis fünften, vorzugsweise an der vierten Stelle vor dem 3'-Ende ein Basenmismatch ein gefügt sein kann.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Primer Oligonukleotide verwendet werden mit den Sequenzen:

7. Verfahren nach Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeich net, dass zur Erfassung mehrerer Sequenzvarianten an stelle der Basisprimer ∈I und ∈IV Mischbasenoligo nukleotide eingesetzt werden können.

8. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Primer Schmelzpunkte haben, die voneinander höch stens um 5°C, vorzugsweise um 2°C abweichen.

9. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei für die Multiplex-PCR ein DMSO-freies Relaxationsrea gens, vorzugsweise Solution-D® verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Primer fluoreszenzmarkiert sind und der Nachweis der Allelvarianten mit einem Mehrfachfluoreszenz detektor erfolgt.

11. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, wobei anstelle einer Multiplex-PCR eine PCR mit zwei Oligonukleotiden als Primer verwendet wird mit den Sequenzen:
und zum Nachweis eine Restriktionstypisierung erfolgt.

12. Oligonukleotide, die eine Sequenz aus einem Apolipo protein-Allel aufweisen und 15 bis 28 Basenpaare lang sind, und entweder direkt an einer mutationsspezi fischen Stelle eines Apolipoprotein-E-Allels enden und gegebenenfalls durch Basenmismatche an der dritten bis fünften, vorzugsweise an der vierten Stelle vor dem 3'-Ende spezifitätsverstärkt sind, oder invariabel sind und in einer mutationsfreien Region liegen.

13. Oligonukleotide nach Anspruch 12, dadurch gekenn zeichnet, dass sie die Sequenzen haben:
wobei an der dritten bis fünften, vorzugsweise an der vierten Stelle vor dem 3'-Ende eine Basenveränderung eingefügt sein kann.

14. Oligonukleotide nach Anspruch 12 und 13 mit den Sequenzen:

15. Verwendung der Oligonukleotide aus Anspruch 12, 13 und 14 als Primer in einer Multiplex-PCR zum Nachweis von Apolipoprotein-E-Allelen.

16. Diagnosekit für die Alzheimererkrankung, umfassend

a) Oligonukleotide mit den Sequenzen:
wobei an der dritten bis fünften, vorzugsweise an der vierten Stelle vor dem 3'-Ende eine Basenveränderung eingefügt sein kann, und
b) PCR-Reagenzien, insbesondere Polymerase, dNTPs und Relaxationsreagens.

17. Diagnosekit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Kit eine Multititerplatte umfasst, in der die Reaktionsreagenzien verglast enthalten sind.

18. Diagnosekit nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Kit Nachweisstreifen umfasst, die Reaktions reagenzien enthalten.