JP3585137B2 - 硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
在宅維持透析療法として位置づけられているＣＡＰＤ療法は、我国で開始されてから１５年が経つが、その普及率は全透析患者の５％を超えた程度である。血液透析と比べると生体適合性や残腎機能の保持、および、ＱＯＬの向上などの点では優れているが、出口部感染への対応の煩雑さや突然発症する腹膜炎、特に致死的な硬化性被嚢性腹膜炎（Ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ：ＳＥＰ）への進展が問題と考えられる。現在、腹膜カテーテルの改良やコネクトロジーの発展によって、出口部感染による腹膜炎は確実に減少している。しかしながら、さらにＣＡＰＤ療法をさらに普及させるためには、ＳＥＰの発症を防止することが必要である。ＳＥＰは腹膜機能の低下が先行している場合が多いが、その発症原因はわかっていない。また、致死的なＳＥＰへ進展した場合、有効な治療方法は存在しない。
【０００３】
現在、ＳＥＰの確認方法としては、肥厚した腹膜により一塊となった小腸が被覆されている“ｓａｃ ｌｉｋｅ ｃｏｃｏｏｎ”を確認することで診断を行えるが、開腹術そのものが腎不全患者には大きな侵襲となり、またこの方法はあくまでもＳＥＰが発生したか否かの診断方法であり発生を予測するものではない。また、ＳＥＰの発生が確認された場合には、前述した通り有効な治療方法は存在せず、ＣＡＰＤ療法の中止後、腸管の安静を保ち、経静脈的高カロリー輸液による十分な栄養補給を主体におこない、絶飲、絶食を行うことが基本原則となり、患者に対して心身共に多大な負担がかかる。このように現時点で進行した症例に対する有効な治療法はなく、早期診断あるいは遺伝学的危険因子の同定による予知を行うことが重要であると思われる。
【０００４】
最近、ヒトリポ蛋白質の構成蛋白質のひとつであるアポリポ蛋白質Ｅ（ａｐｏＥ）の遺伝子多型が種々の疾病の危険因子となることが報告されている。ａｐｏＥはＶＬＤＬ（超低比重リポタンパク質）の構成アポ蛋白質として発見されたアポ蛋白質であるが、カイロミクロン、カイロミクロンレムナントにも存在する。アポＥを合成する遺伝子には一般人口中に主にε４、ε３、ε２の３種の対立遺伝子が存在し、蛋白質型をａｐｏＥ４，ａｐｏＥ３，ａｐｏＥ２と称し、このうちε３が野生型と考えられている。ａｐｏＥ４（ε４）と，ａｐｏＥ２（ε２）はａｐｏＥ３（ε３）のそれぞれ１１２番目と１５８番目のアミノ酸残基でアルギニンとシステインの相互置換によって多型が生じる。日本人では、これらのａｐｏＥ遺伝子はε４が０．０６７〜０．０９０、ε３が０．８４〜０．８６、ε２が０．０５３〜０．０８１の頻度で認められる。
【０００５】
１９９３年 Ｒｏｓｅｓらのグループにより晩期発症型家族性アルツハイマー病において、ａｐｏＥのε４型アレルの遺伝子量効果が病因に影響を与えることを報告した。この傾向は家族性のみならず、晩期発症型の弧発性アルツハイマー病でも確認されている。ε４多型が従来の単一遺伝子病の原因遺伝子と異なる点はε４多型の存在が即アルツハイマー病の発症に直結するのではなく、あくまでも発症する可能性を増加させる遺伝学的危険因子として捉えられる。
【０００６】
また、遺伝性の高脂血症であるＩＩＩ型高脂血症においてはε２のホモ接合対から発症する。レムナントの代謝はａｐｏＥを認識するレムナントレセプターを介して行われるものと考えられている。ａｐｏＥ２蛋白質はアミノ酸変異によってレセプターに結合できず、これがＩＩＩ型高脂血症におけるレムナントの蓄積の原因と考えられている。しかしながらε２のホモ接合対のすべてが高脂血症を発症するものではなく、ＩＩＩ型高脂血症はアポＥ異常の遺伝素因を基に、肥満・糖尿病・甲状腺機能低下症といったＴＧ−ｒｉｃｈリポ蛋白質の合成亢進・異化障害をもたらす異常が加わり高脂血症を発症するものと考えられている。このようにａｐｏＥは、種々の疾病の遺伝学的危険因子として働く可能性を持つが、ＳＥＰに関与する報告はされていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ＳＥＰは数回の腹膜炎の繰り返しの結果、進展する例が多いが、個人により腹膜炎の回数とＳＥＰの発症に何らかの遺伝学的危険因子の存在が考えられる。なぜならば、何回も腹膜炎を繰り返しているにもかかわらずＳＥＰに至らない人もいれば、２，３回の腹膜炎でＳＥＰへ進展する人もいるためである。そこで、ＳＥＰの遺伝学的危険因子を同定し、診断を可能にすることにより透析療法前に適切な選択が行え、ＳＥＰの発症を防止することが可能となる。つまり、ＳＥＰの遺伝学的危険因子をもたない人は積極的にＣＡＰＤ療法を行い、危険因子を有する人は血液透析療法を行えばよい。このように遺伝学的危険因子による予測方法を確立し、これと透析療法を組み合わせることによりＳＥＰの発生を著しく低減させることができる。
【０００８】
本発明者らは上記課題を鑑みて、ａｐｏＥ遺伝子多型とＣＡＰＤ患者の硬化性被嚢性腹膜炎との関連について鋭意検討を行った結果、以下の本発明を完成させた。
（１） ヒトアポリポ蛋白質Ｅの多型を解析することを特徴とする硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
（２） 血液を検体として前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅの多型を解析する上記（１）に記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
（３） ヒトアポリポ蛋白質Ｅをコードする遺伝子を解析することにより、前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅの多型を解析する上記（１）または（２）に記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
（４） 血液よりＤＮＡを抽出し、この抽出されたＤＮＡから、前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅをコードする遺伝子を解析する上記（３）に記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
（５） 前記血液からリンパ球を分離し、この分離されたリンパ球から前記ＤＮＡを抽出する上記（４）に記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
（６） 遺伝子をＰＣＲ法により増幅した後、前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅをコードする遺伝子を解析する上記（３）ないし（５）のいずれかに記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
（７） 遺伝子を制限酵素ＨｈａＩで処理した後、前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅをコードする遺伝子を解析する上記（３）ないし（６）のいずれかに記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
（８） 遺伝子を制限酵素ＨｈａＩで処理してフラグメント化し、このフラグメントの塩基数を指標として、前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅをコードする遺伝子を解析する上記（３）ないし（７）のいずれかに記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
（９） ポリアクリルアミド電気泳動法を用いて、前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅをコードする遺伝子を解析する上記（３）ないし（８）のいずれかに記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
（１０） 前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅがε４型であるか否かを少なくとも特定する上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
まず、ＣＡＰＤ患者の血液からそれぞれリンパ球を分離し、そのリンパ球からＤＮＡを抽出する。次に抽出したＤＮＡを ＷｈｅｎｈａｍらによるＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を改良して遺伝子型のタイピングを行う。つまり多型を表わす１１２番目と１５８番目のアミノ酸を含む領域に対し図１に示す配列のプライマーを合成し、ＰＣＲにて増幅し、得られた産物を制限酵素ＨｈａＩを用いてＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｒｍｏｒｐｈｉｓｍ）を行う。すなわちε３型は９１塩基のフラグメントを生じるが、ε４型は１１２番目のアミノ酸がＣｙｓに変わることで、ＨｈａＩ認識部位が生じ１９塩基と７２塩基のフラグメントが生じる。またε２型は１５８番目のアミノ酸が（Ｃｙｓ）に変わることで、ＨｈａＩ認識部位が生じ３１塩基と４８塩基のフラグメントが生じる。
【００１０】
典型的な例を図２に示す。図２はＣＡＰＤ患者８人の血液を上記の方法で処理し最後にアクリルアミド電気泳動させたものである。Ｎｏ，７、Ｎｏ，８に７２ｂ．ｐの４型の特徴を示すバンドが検出された。この時、リンパ球の分離方法、リンパ球からＤＮＡの抽出方法、ＰＣＲ方法は特に限定されるものではない。また、等電点電気泳動法により蛋白質の多型の解析を行っても良い。
【００１１】
この結果、ＳＥＰ患者の多くがε４型を持っていることがわかった。すなわち、ε４型を持つ人はＳＥＰになる可能性が高いことが予測できる。従って本発明の予測方法によりＳＥＰの発生が予測できる。また、この予測方法の結果により個々の症例に適した透析方法を選択することができる。つまり、ε４型を持たない人にはＣＡＰＤ（腹膜透析）療法を勧めることができるが、ε４型を持つ人には血液透析を勧めることが好ましい。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
ＳＥＰを呈した例１４人、呈しないＣＡＰＤ患者８１人の血液を採取し、ａｐｏＥ遺伝子の多型を解析した。
検体血液から約１０６〜１０７個のリンパ球を分離し、５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中に懸濁した。リンパ球を含む溶液からのＤＮＡの抽出は ＧｅｎｅＲｅｌｅａｓｅｒ（Ｂｉｏｖｅｎｔｕｒｅｓ，Ｉｎｃ．）を用い、１μｌのリンパ球溶液に２０μｌの ＧｅｎｅＲｅｌｅａｓｅｒ 溶液を加え、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ 社）により、６５℃／３０秒、８℃／３０秒、６５℃／９０秒、９７℃／１８０秒、８℃／６０秒、６５℃／１８０秒、９７℃／６０秒、６５℃／６０秒のプログラムを実行しＤＮＡを抽出した。反応を８０℃で維持し、あらかじめ調製しておいたＰＣＲ反応液を加えた。
【００１３】
このＰＣＲ反応液は ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ 社）のものを使用し、滅菌水４４．５μｌ、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ １０μｌ、１．２５ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ １６μｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ３μｌ、２０μＭ オリゴヌクレオチドプライマー；５’−ＡＣＧ ＣＧＧ ＧＣＡ ＣＧＧ ＣＴＧ ＴＣＣ ＡＡＧ ＧＡＧ−３’及び５’−ＣＴＣ ＧＣＧ ＧＧＣ ＣＣＣ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＴＡ ＣＡＣ−３’をそれぞれ２．５μｌ含んでいる。
【００１４】
続いてＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ 社）を用い９４℃／２分、加熱した後、６０℃／１分、７２℃／２分、９４℃／１分のサイクルを３０回繰り返した。得られたＰＣＲ産物が目的の長さをもつことを１．３％アガロースゲル電気泳動で確認した後、２０μｌの反応溶液を別のエッペンドルフチューブに移し、制限酵素 ＨｈａＩ １μｌ（１０ｕｎｉｔ）を加え３７℃でインキュベートした。４時間後、制限酵素消化物を８％ポリアクリルアミド電気泳動をおこない切断フラグメントを確認した。
【００１５】
その結果、正常なＣＡＰＤ患者８１人中ε４型を持つ者は４人（全体の５％）であるのに対し、ＳＥＰを呈した１４人中ε４型を持つ者は７人（全体の５０％）であった。つまりε４型を持つ確率はＳＥＰを呈した患者は５０％であり、正常なＣＡＰＤ患者の５％に比べて有意に高い。統計的な日本人のε４型の確率は約１０％と言われ、それと比較した場合においてもＳＥＰ患者における５０％という数字はきわめて高く、ａｐｏＥ遺伝子のε４が危険因子であることが考えられる。
【００１６】
このようにａｐｏＥ遺伝子多型の確認をし、ＳＥＰの発生の予測を行い、ε４型を持つ者が血液透析を、ε４型を持たない者がＣＡＰＤ療法を選択することによりＳＥＰの発生を抑制することが可能となる。
【００１７】
【発明の効果】
本発明の硬化性被嚢性腹膜炎（ＳＥＰ）の予測方法は、上述した通りヒトアポリポ蛋白質Ｅ（ａｐｏＥ）またはその遺伝子の多型を解析することによりＳＥＰの発生を予測することができる。つまりＳＥＰ患者の多くがａｐｏＥ４（ε４型）を持っていることから、ε４型を持つ人はＳＥＰが発生する可能性が高いことが予測できる。
【００１８】
また、本発明の予測方法の結果により個々の症例に適した透析方法を選択することができる。つまり、ε４型を持たない人にはＣＡＰＤ療法を勧めることができるが、ε４型を持つ人には血液透析を勧めることが好ましい。その結果、ＳＥＰの発生を抑制することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトアポリポ蛋白質Ｅの部分遺伝子の塩基配列を示す。
【図２】ＤＮＡを制限酵素ＨｈａＩ切断後にアクリルアミド電気泳動させた結果を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
在宅維持透析療法として位置づけられているＣＡＰＤ療法は、我国で開始されてから１５年が経つが、その普及率は全透析患者の５％を超えた程度である。血液透析と比べると生体適合性や残腎機能の保持、および、ＱＯＬの向上などの点では優れているが、出口部感染への対応の煩雑さや突然発症する腹膜炎、特に致死的な硬化性被嚢性腹膜炎（Ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ ｐｅｒｉｔｏｎｉｔｉｓ：ＳＥＰ）への進展が問題と考えられる。現在、腹膜カテーテルの改良やコネクトロジーの発展によって、出口部感染による腹膜炎は確実に減少している。しかしながら、さらにＣＡＰＤ療法をさらに普及させるためには、ＳＥＰの発症を防止することが必要である。ＳＥＰは腹膜機能の低下が先行している場合が多いが、その発症原因はわかっていない。また、致死的なＳＥＰへ進展した場合、有効な治療方法は存在しない。
【０００３】
現在、ＳＥＰの確認方法としては、肥厚した腹膜により一塊となった小腸が被覆されている“ｓａｃ ｌｉｋｅ ｃｏｃｏｏｎ”を確認することで診断を行えるが、開腹術そのものが腎不全患者には大きな侵襲となり、またこの方法はあくまでもＳＥＰが発生したか否かの診断方法であり発生を予測するものではない。また、ＳＥＰの発生が確認された場合には、前述した通り有効な治療方法は存在せず、ＣＡＰＤ療法の中止後、腸管の安静を保ち、経静脈的高カロリー輸液による十分な栄養補給を主体におこない、絶飲、絶食を行うことが基本原則となり、患者に対して心身共に多大な負担がかかる。このように現時点で進行した症例に対する有効な治療法はなく、早期診断あるいは遺伝学的危険因子の同定による予知を行うことが重要であると思われる。
【０００４】
最近、ヒトリポ蛋白質の構成蛋白質のひとつであるアポリポ蛋白質Ｅ（ａｐｏＥ）の遺伝子多型が種々の疾病の危険因子となることが報告されている。ａｐｏＥはＶＬＤＬ（超低比重リポタンパク質）の構成アポ蛋白質として発見されたアポ蛋白質であるが、カイロミクロン、カイロミクロンレムナントにも存在する。アポＥを合成する遺伝子には一般人口中に主にε４、ε３、ε２の３種の対立遺伝子が存在し、蛋白質型をａｐｏＥ４，ａｐｏＥ３，ａｐｏＥ２と称し、このうちε３が野生型と考えられている。ａｐｏＥ４（ε４）と，ａｐｏＥ２（ε２）はａｐｏＥ３（ε３）のそれぞれ１１２番目と１５８番目のアミノ酸残基でアルギニンとシステインの相互置換によって多型が生じる。日本人では、これらのａｐｏＥ遺伝子はε４が０．０６７〜０．０９０、ε３が０．８４〜０．８６、ε２が０．０５３〜０．０８１の頻度で認められる。
【０００５】
１９９３年 Ｒｏｓｅｓらのグループにより晩期発症型家族性アルツハイマー病において、ａｐｏＥのε４型アレルの遺伝子量効果が病因に影響を与えることを報告した。この傾向は家族性のみならず、晩期発症型の弧発性アルツハイマー病でも確認されている。ε４多型が従来の単一遺伝子病の原因遺伝子と異なる点はε４多型の存在が即アルツハイマー病の発症に直結するのではなく、あくまでも発症する可能性を増加させる遺伝学的危険因子として捉えられる。
【０００６】
また、遺伝性の高脂血症であるＩＩＩ型高脂血症においてはε２のホモ接合対から発症する。レムナントの代謝はａｐｏＥを認識するレムナントレセプターを介して行われるものと考えられている。ａｐｏＥ２蛋白質はアミノ酸変異によってレセプターに結合できず、これがＩＩＩ型高脂血症におけるレムナントの蓄積の原因と考えられている。しかしながらε２のホモ接合対のすべてが高脂血症を発症するものではなく、ＩＩＩ型高脂血症はアポＥ異常の遺伝素因を基に、肥満・糖尿病・甲状腺機能低下症といったＴＧ−ｒｉｃｈリポ蛋白質の合成亢進・異化障害をもたらす異常が加わり高脂血症を発症するものと考えられている。このようにａｐｏＥは、種々の疾病の遺伝学的危険因子として働く可能性を持つが、ＳＥＰに関与する報告はされていない。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
ＳＥＰは数回の腹膜炎の繰り返しの結果、進展する例が多いが、個人により腹膜炎の回数とＳＥＰの発症に何らかの遺伝学的危険因子の存在が考えられる。なぜならば、何回も腹膜炎を繰り返しているにもかかわらずＳＥＰに至らない人もいれば、２，３回の腹膜炎でＳＥＰへ進展する人もいるためである。そこで、ＳＥＰの遺伝学的危険因子を同定し、診断を可能にすることにより透析療法前に適切な選択が行え、ＳＥＰの発症を防止することが可能となる。つまり、ＳＥＰの遺伝学的危険因子をもたない人は積極的にＣＡＰＤ療法を行い、危険因子を有する人は血液透析療法を行えばよい。このように遺伝学的危険因子による予測方法を確立し、これと透析療法を組み合わせることによりＳＥＰの発生を著しく低減させることができる。
【０００８】
本発明者らは上記課題を鑑みて、ａｐｏＥ遺伝子多型とＣＡＰＤ患者の硬化性被嚢性腹膜炎との関連について鋭意検討を行った結果、以下の本発明を完成させた。
（１） ヒトアポリポ蛋白質Ｅの多型を解析することを特徴とする硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
（２） 血液を検体として前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅの多型を解析する上記（１）に記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
（３） ヒトアポリポ蛋白質Ｅをコードする遺伝子を解析することにより、前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅの多型を解析する上記（１）または（２）に記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
（４） 血液よりＤＮＡを抽出し、この抽出されたＤＮＡから、前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅをコードする遺伝子を解析する上記（３）に記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
（５） 前記血液からリンパ球を分離し、この分離されたリンパ球から前記ＤＮＡを抽出する上記（４）に記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
（６） 遺伝子をＰＣＲ法により増幅した後、前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅをコードする遺伝子を解析する上記（３）ないし（５）のいずれかに記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
（７） 遺伝子を制限酵素ＨｈａＩで処理した後、前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅをコードする遺伝子を解析する上記（３）ないし（６）のいずれかに記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
（８） 遺伝子を制限酵素ＨｈａＩで処理してフラグメント化し、このフラグメントの塩基数を指標として、前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅをコードする遺伝子を解析する上記（３）ないし（７）のいずれかに記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
（９） ポリアクリルアミド電気泳動法を用いて、前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅをコードする遺伝子を解析する上記（３）ないし（８）のいずれかに記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
（１０） 前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅがε４型であるか否かを少なくとも特定する上記（１）ないし（９）のいずれかに記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
【０００９】
【発明の実施の形態】
まず、ＣＡＰＤ患者の血液からそれぞれリンパ球を分離し、そのリンパ球からＤＮＡを抽出する。次に抽出したＤＮＡを ＷｈｅｎｈａｍらによるＰＣＲ−ＲＦＬＰ法を改良して遺伝子型のタイピングを行う。つまり多型を表わす１１２番目と１５８番目のアミノ酸を含む領域に対し図１に示す配列のプライマーを合成し、ＰＣＲにて増幅し、得られた産物を制限酵素ＨｈａＩを用いてＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｒｍｏｒｐｈｉｓｍ）を行う。すなわちε３型は９１塩基のフラグメントを生じるが、ε４型は１１２番目のアミノ酸がＣｙｓに変わることで、ＨｈａＩ認識部位が生じ１９塩基と７２塩基のフラグメントが生じる。またε２型は１５８番目のアミノ酸が（Ｃｙｓ）に変わることで、ＨｈａＩ認識部位が生じ３１塩基と４８塩基のフラグメントが生じる。
【００１０】
典型的な例を図２に示す。図２はＣＡＰＤ患者８人の血液を上記の方法で処理し最後にアクリルアミド電気泳動させたものである。Ｎｏ，７、Ｎｏ，８に７２ｂ．ｐの４型の特徴を示すバンドが検出された。この時、リンパ球の分離方法、リンパ球からＤＮＡの抽出方法、ＰＣＲ方法は特に限定されるものではない。また、等電点電気泳動法により蛋白質の多型の解析を行っても良い。
【００１１】
この結果、ＳＥＰ患者の多くがε４型を持っていることがわかった。すなわち、ε４型を持つ人はＳＥＰになる可能性が高いことが予測できる。従って本発明の予測方法によりＳＥＰの発生が予測できる。また、この予測方法の結果により個々の症例に適した透析方法を選択することができる。つまり、ε４型を持たない人にはＣＡＰＤ（腹膜透析）療法を勧めることができるが、ε４型を持つ人には血液透析を勧めることが好ましい。
【００１２】
【実施例】
以下、実施例により本発明を詳細に説明する。
ＳＥＰを呈した例１４人、呈しないＣＡＰＤ患者８１人の血液を採取し、ａｐｏＥ遺伝子の多型を解析した。
検体血液から約１０６〜１０７個のリンパ球を分離し、５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）中に懸濁した。リンパ球を含む溶液からのＤＮＡの抽出は ＧｅｎｅＲｅｌｅａｓｅｒ（Ｂｉｏｖｅｎｔｕｒｅｓ，Ｉｎｃ．）を用い、１μｌのリンパ球溶液に２０μｌの ＧｅｎｅＲｅｌｅａｓｅｒ 溶液を加え、ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ 社）により、６５℃／３０秒、８℃／３０秒、６５℃／９０秒、９７℃／１８０秒、８℃／６０秒、６５℃／１８０秒、９７℃／６０秒、６５℃／６０秒のプログラムを実行しＤＮＡを抽出した。反応を８０℃で維持し、あらかじめ調製しておいたＰＣＲ反応液を加えた。
【００１３】
このＰＣＲ反応液は ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ 社）のものを使用し、滅菌水４４．５μｌ、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ １０μｌ、１．２５ｍＭ ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ １６μｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０．５μｌ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２ ３μｌ、２０μＭ オリゴヌクレオチドプライマー；５’−ＡＣＧ ＣＧＧ ＧＣＡ ＣＧＧ ＣＴＧ ＴＣＣ ＡＡＧ ＧＡＧ−３’及び５’−ＣＴＣ ＧＣＧ ＧＧＣ ＣＣＣ ＧＧＣ ＣＴＧ ＧＴＡ ＣＡＣ−３’をそれぞれ２．５μｌ含んでいる。
【００１４】
続いてＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ 社）を用い９４℃／２分、加熱した後、６０℃／１分、７２℃／２分、９４℃／１分のサイクルを３０回繰り返した。得られたＰＣＲ産物が目的の長さをもつことを１．３％アガロースゲル電気泳動で確認した後、２０μｌの反応溶液を別のエッペンドルフチューブに移し、制限酵素 ＨｈａＩ １μｌ（１０ｕｎｉｔ）を加え３７℃でインキュベートした。４時間後、制限酵素消化物を８％ポリアクリルアミド電気泳動をおこない切断フラグメントを確認した。
【００１５】
その結果、正常なＣＡＰＤ患者８１人中ε４型を持つ者は４人（全体の５％）であるのに対し、ＳＥＰを呈した１４人中ε４型を持つ者は７人（全体の５０％）であった。つまりε４型を持つ確率はＳＥＰを呈した患者は５０％であり、正常なＣＡＰＤ患者の５％に比べて有意に高い。統計的な日本人のε４型の確率は約１０％と言われ、それと比較した場合においてもＳＥＰ患者における５０％という数字はきわめて高く、ａｐｏＥ遺伝子のε４が危険因子であることが考えられる。
【００１６】
このようにａｐｏＥ遺伝子多型の確認をし、ＳＥＰの発生の予測を行い、ε４型を持つ者が血液透析を、ε４型を持たない者がＣＡＰＤ療法を選択することによりＳＥＰの発生を抑制することが可能となる。
【００１７】
【発明の効果】
本発明の硬化性被嚢性腹膜炎（ＳＥＰ）の予測方法は、上述した通りヒトアポリポ蛋白質Ｅ（ａｐｏＥ）またはその遺伝子の多型を解析することによりＳＥＰの発生を予測することができる。つまりＳＥＰ患者の多くがａｐｏＥ４（ε４型）を持っていることから、ε４型を持つ人はＳＥＰが発生する可能性が高いことが予測できる。
【００１８】
また、本発明の予測方法の結果により個々の症例に適した透析方法を選択することができる。つまり、ε４型を持たない人にはＣＡＰＤ療法を勧めることができるが、ε４型を持つ人には血液透析を勧めることが好ましい。その結果、ＳＥＰの発生を抑制することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトアポリポ蛋白質Ｅの部分遺伝子の塩基配列を示す。
【図２】ＤＮＡを制限酵素ＨｈａＩ切断後にアクリルアミド電気泳動させた結果を示す。
Claims (10)
- ヒトアポリポ蛋白質Ｅの多型を解析することを特徴とする硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
- 血液を検体として前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅの多型を解析する請求項１に記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
- ヒトアポリポ蛋白質Ｅをコードする遺伝子を解析することにより、前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅの多型を解析する請求項１または２に記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
- 血液よりＤＮＡを抽出し、この抽出されたＤＮＡから、前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅをコードする遺伝子を解析する請求項３に記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
- 前記血液からリンパ球を分離し、この分離されたリンパ球から前記ＤＮＡを抽出する請求項４に記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
- 遺伝子をＰＣＲ法により増幅した後、前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅをコードする遺伝子を解析する請求項３ないし５のいずれかに記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
- 遺伝子を制限酵素ＨｈａＩで処理した後、前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅをコードする遺伝子を解析する請求項３ないし６のいずれかに記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
- 遺伝子を制限酵素ＨｈａＩで処理してフラグメント化し、このフラグメントの塩基数を指標として、前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅをコードする遺伝子を解析する請求項３ないし７のいずれかに記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
- ポリアクリルアミド電気泳動法を用いて、前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅをコードする遺伝子を解析する請求項３ないし８のいずれかに記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
- 前記ヒトアポリポ蛋白質Ｅがε４型であるか否かを少なくとも特定する請求項１ないし９のいずれかに記載の硬化性被嚢性腹膜炎の予測方法。
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