WO2000032811A2 - Verfahren zur bestimmung des apolipoprotein-e-genotyps in einer menschlichen probe - Google Patents

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WO2000032811A2
WO2000032811A2 PCT/EP1999/009344 EP9909344W WO0032811A2 WO 2000032811 A2 WO2000032811 A2 WO 2000032811A2 EP 9909344 W EP9909344 W EP 9909344W WO 0032811 A2 WO0032811 A2 WO 0032811A2
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • the invention relates to a method for determining the apohpoprotein E alleles in a human sample
  • Alzheimer's disease is a neurodegenerative disease that is particularly old
  • CONFIRMATION COPIT is important, but the entire ApoE allele status, ie the ratio of all ApoE alleles to each other
  • ApoE4 In addition to the developmentally oldest Apol ⁇ poprote ⁇ n-E4 (ApoE4), other common ApoE isoforms have been identified to date, which are referred to as ApoE2 and ApoE3 Arginine occurs (Arg / Arg), ApoE3 has Cys / Arg and ApoE2 Cys / Cys at these points
  • FIG. 1 shows an age-dependent genotype distribution, from which the percentage Risk of Alzheimer's disease depending on the genotype can be read.
  • the statistical clinical picture of 75-year-old patients shows, for example, that with a homozygous genotype ApoE4 / 4 there is only 20% protection against Alzheimer's disease, with the genotype ApoE3 / 3 there is approximately 70% protection and in patients with an ApoE2 / 2 genotype e Disease can be almost 100% excluded
  • a reliable diagnosis of Alzheimer's disease and in particular the exclusion of this disease therefore requires that the entire ApoE allele picture be determined and the respective individual values weighed against each other
  • US Pat. No. 5,508,167 describes a method for the detection of apoliprotein E4 in a human sample for use as an indicator for an increased risk of Alzheimer's disease.
  • the method comprises the duplication of the apoliprotein E4 gene from a human sample by a conventional polymerase chain reaction (henceforth Called PCR) the subsequent detection of the ApoE4 allele by a hybridization method or a residual digestion
  • a disadvantage of the method is that only a weak amplification of the ApoE4 gene is achieved with the conventional PCR used in the first step. This reduces the detection sensitivity of the amplified sequence regions in the second method step, the hybridization or the residual digestion
  • the object is achieved by the method according to the invention for determining the
  • Apolipoprotein E polymorphism in a human sample by PCR amplification of a selected base sequence and detection of the Apolipoprotein E alleles, using a multiplex PCR with 6 different specific polymers and four of the polymers ending directly at the mutation-specific sites.
  • the two Basisp ⁇ mer are not variable and are preferably in regions in which no mutations are known
  • a preferred embodiment relates to a method in which the polymers which end directly at the mutation-specific sites are specificity-enhanced by base mismatches at the third to fifth, preferably at the fourth site before the 3 'end, and in which, optionally to improve the amplification selectivity, the mismatch Places of e II and e III or of e V and e VI can be shifted relative to the 3 'end
  • the primers preferably have a length of 10 to 30 base pairs, particularly preferably 15 to 28 base pairs
  • oligonucleotides which have the sequence of an apolipoprotein allele and are 15 to 28 base pairs long and where four of the primers end directly at the mutation-specific sites of the apolipoprotein E alleles and, if appropriate, by base mismatches on the are preferably used as the polymer third to fifth, preferably in the fourth position before the 3 'end, and the two base elements are not variable and are preferably in regions which have no mutations
  • the oligonucleotides can have a non-specific part of the sequence for easier electrophoretic differentiation
  • a base mismatch can be inserted at the third to fifth position before the 3 'end and the mismatch points of ⁇ II and ⁇ III or of ⁇ V and ⁇ VI can be shifted relative to the 3' end to improve the amplification selectivity, e.g. as below
  • the polymer preferably have melting points which differ from one another by at most 5 ° C., preferably by 2 ° C.
  • the polymer can also be fluorescence-labeled, so that the detection of the alleles can be carried out using a multiple fluorescence detector
  • a DMSO-free relaxation reagent preferably Solution-D® from Qiagen GmbH, Hilden, should preferably be used in the multiplex PCR of the method according to the invention
  • Another embodiment relates to a method in which the P ⁇ mer ⁇ I and ⁇ IV are somewhat further away from the diagnostic codons.
  • This method is suitable, for example, if an electrophoresis system with a low gel concentration is used, for example for cost reasons or on the basis of technical specifications preferably on the 3 'side of codon 158
  • the PCR according to the invention also enables an effective synthesis of longer amplimers with high yield, for example amplimers with a length of 200 to 700 base pairs.
  • the length difference of the polymer can therefore be increased, for example by adding individual ones a number of bases as "tail" or "attachment egg” is added to codon-specific parameters
  • a further embodiment relates to a method in which mixed-base gonucleotides are used instead of the 5′-polymer ⁇ l and ⁇ lV.
  • This relates to cases in which mutations relevant to Alzheimer occur in the sequence region of the base polymer ⁇ l and ⁇ lV.
  • Such sequence variants which can influence the binding of the polymer can be caused by The use of mixed base ogonucleotides is neutralized.
  • Mixed base o gonucleotides correspond to an O gonucleotide mixture, which consists of equal parts of oligonucleotides, each containing one of the possible bases at the mutation-relevant position.
  • Yet another embodiment relates to a method, wherein instead of a multiplex PCR, a PCR with two ohgonucleotides is used as the polymer with the sequences
  • rE 1 5 1 CCAAggAgCTgCAggCg and SEQIDNO 15 rE 2: 5 'CCggCCTggTACACTgC, SEQIDNO 16
  • the invention also relates to oligonucleotides which have a sequence from an apohpoprotein allele, are 15 to 28 base pairs long, and either end directly at a mutation-specific site of an apohpoprotein E allele and, if appropriate, by base mismatches on the third to fifth, preferably on the fourth Position in front of the 3 'end is specific or invariable and is in a mutation-free region
  • the invention relates in particular to oligonucleotides with the native ApoE sequences and oligonucleotides which contain the mentioned mismatches and shifts
  • the above oligonucleotides are used as primers in a multiplex PCR for the detection of apohpoprotein E alleles.
  • the invention also relates to diagnostic kits for Alzheimer's disease, comprising a) oligonucleotides with the above-mentioned ApoE sequences or the mismatch sequences and b) PCR Reagents, especially polymerase, dNTPs and relaxation reagent
  • One embodiment relates to a diagnostic kit which comprises a multi-titer plate in which the reaction reagents are vitrified, that is to say they are crosslinked in sugar, so that only the sample to be examined and water have to be added for the detection.
  • Another embodiment relates to a kit which contains detection strips, on which the reaction reagents are applied.
  • a third embodiment comprises a kit which contains one or more of the specified oligonucleotides on a solid support
  • a DMSO-free additive was therefore used as the relaxation reagent, namely Solution-D® from Qiagen.
  • Other DMSO-free relaxation reagents such as Solution-W1®, a mixture of polyoxyethylene ether from Sigma, or Mixtures of Tween-20®, Tween-25®, Tween-30® and Tween-35® can be used
  • the method according to the invention relates to a multiplex PCR, which does not require a residual or a hybridization step for detection
  • a multiplex-PCR is described in which four short proteins are used, three of which end directly at the mutation-specific sites and are specificity-enhanced by base mismatches at the second site before the 3 'end. These do not provide a sufficiently specific reaction
  • the method according to the invention delivers two (in the case of a homozygous genotype) or three or four bands (in the case of a heterozygous genotype).
  • the respective genotypes can be distinguished by the combination of the bands.
  • the allele ⁇ 2 provides bands at 85 and 110 bp ( Base pairs), the allele ⁇ 3 bands at 85 and 98 bp and the allele ⁇ 4 bands at 73 and 98 bp
  • FIG. 3 shows an overview of the location of the apohpoprotein E alleles and of the polymers used in multiplex PCR ⁇ 1 to ⁇ VI on the apohpoprotein E gene
  • the method according to the invention comprises a multiplex PCR for the duplication of selected gene fragments of the apohpoprotein E gene, which are subsequently separated on an agarose gel and detected with ethidium bromide.
  • FIG. 1 shows a statistical evaluation of the risk of sporadic Alzheimer's disease in patients with different ApoE genotypes depending from age
  • FIG. 2 shows a section of the nucleic acid sequence of the ApoE protein, which encompasses the region with codons 1 12 and 158 where the mutation-specific sites are located.
  • the nucleic acid sequences CgC at positions 112 and 158 encode the amino acids arginine (Arg / Arg)
  • ApoE3 TgC and CgC encode for Cys / Arg and with ApoE2 CgC stand for Cys / Cys in both positions
  • the apolipoprotem E gene contains 2 nucleic acid codons which are different in the respective ApoE isomers and on the basis of which they can be distinguished.
  • a DNA region was selected which contains the two variable nucleic acid codons (for AS 112 and 158). Both individual nucleotide change sites are located in exon 4 of the ApoE gene.
  • the method according to the invention relates to a multiplex PCR with six short parameters, four of which each end directly at the mutation-specific sites and are specificity-enhanced by base mismatches in the fourth place before the 3 'end.
  • the two 5'-polymer ⁇ 1 and ⁇ lV are in one Placed sequence area, which is invariable with regard to Alzheimer's-relevant mutations according to current knowledge. If sequence variants are known in this area which influence the primer binding, which is easily possible, these are neutralized by using mixed base ohgonucleotides
  • the polymers according to the invention are designed in such a way that their melting points are matched to one another by 2 ° C. This applies to all polymers used in a multiplex PCR, including the oligonucleotides that have an unspecific or "random" attachment. This attachment from 12 to 20 Nucleotides enable the different alleles to be distinguished from one another after separation on an agarose gel
  • Oligonucleotides with the following sequences, which are complementary to the selected DNA region, are used as the polymer
  • oligonucleotides constructed according to the same principle, which additionally have a shift between e I I and e I I I and between e V and e VI as
  • a base mismatch is inserted at the third, fourth or fifth position from the 3 'end of the ohgonucleotide, which leads to a wobble effect when the polymer is attached and makes the polymer a so-called stumbling block.
  • the above-mentioned ohgonucleotides are ⁇ II, ⁇ III and ⁇ V, ⁇ VI stumbling block
  • the sequence dimension C is exchanged for a G
  • the exchange can also be exchanged for another base, for example T, is used.
  • the sequence G is replaced by a C.
  • the exchange can also be carried out for another base, for example T.
  • FIG. 3 shows the position of this stopper ohgo, which prevents the polymerase from being able to read significantly beyond the ⁇ l - ⁇ lll amplimer.
  • the other oligonucleotide preferably has the following sequence
  • all alleles occurring in the sample can be detected in one approach.
  • a separate band is obtained for each of the different codons.
  • the bands are separated in an agarose gel and visualized with ethidium bromide.
  • two are obtained (with a homozygous genotype ) or three to four bands (for a heterozygous genotype) that can be assigned to the different alleles
  • primers ⁇ I and ⁇ ll are used in the multiplex PCR, they produce an amphmer with a length of 73 bp, specifically for Arg 112, the primers ⁇ I and ⁇
  • genotype in the diploid genome results as follows
  • Lane 4 shows the band pattern of the amphfected and agarose-separated PCR product of a patient sample.
  • a 00 bp marker is applied in lane 1 as a reference in lane 1 and a lane 8 and 20 bp marker in lane 8.
  • Lanes 2-7 show the separated PCR product of different patient samples Over the running distance, the size of the bands can first be determined, from which the present ApoE genotype can be determined according to the above key.
  • the sample in lane 2 shows 2 bands of 73 and 98 bp, which correspond to the Correspond to genotype ⁇ 4 / 4
  • the bands in lane 3 have a size of 85 or 98 bp and stand for the genotype ⁇ 3 / 3 lane 4 shows two bands of 85 and 110 bp, corresponding to the genotype ⁇ 2 / 2 lane 5 shows 3 bands with 73 , 85 or 98 bp, which correspond to the genotype ⁇ 4 / 3.
  • the sample in lane 6 contains 4 bands, each at 73, 85, 98 and 110 bp, which corresponds to the genotype ⁇ 4 / 3.
  • the sample in lane 7 shows 3 bands at 85 , 98 and 110, which stands for the genotype ⁇ 3 / 2.
  • FIG. 5 shows the evaluation of a gel electrophoresis prepared according to the invention
  • the figure shows the running distances (in centimeters) of the ApoE amphmers of the respective samples in electrophoresis.
  • the marker A is a 100 base pair DNA marker With this electrophoresis gel, a distance of marker A of 0.9 cm corresponds to 400 base pairs, a distance of 4.5 cm corresponds to 100 base pairs.
  • the second marker B is a 20 base pair DNA marker 1.8 cm corresponds to 260 base pairs, a running distance of 2.5 cm 200, a running distance of 4.5 cm 100 and a running distance of 5.2 cm 80 base pairs.
  • the measured walking distances of the patients and the ApoE genotypes derived from them are shown in reproduced in the table below
  • the ApoE genotype in the sample can be used to diagnose the risk of Alzheimer's disease
  • e VIII 5 'CGC TCG GCG CCC TCG C SEQ ID NO 22 for obtaining a 240mers in exon 4 under the above-mentioned synthesis conditions using a substance Q ® , whereby these polymers can carry a labeling group at the 5' end for detection such as biotin or the like and the subsequent hybridization to the detection polymer localized in individually defined "array spots" with the sequences S1-S4 for the combined determination of S1-S4 in a microarray experiment, the detection polymer being computationally by different methods and preferably experimentally in their Melting point are adjusted by varying their length and shifting their sequences relative to the core sequence to be detected S1-S4 or by hybridization with the detection sequences of genomic DNA or RNA or cDNA of a sample. Furthermore, the invention comprises the use of the specially developed
  • suppression means systemic application, for example in humans in a chemically stabilized modified form such as phosphothioate coupling or polyamide nucleic acid (PNA) and in a form required for blood transfusion, such as by Boado et al (J Pharmaceutical Sei 1998, 87 (11) pp1308J 315) or Tyler et al (PNAS 1999, 96 (12) pp7053-58) and according to the requirement of the specialist's own workmanship, also in a physiologically sensible pharmaceutical dosage form with regard to the diluents or car ⁇ er (lipofectin, SA-MA 0X26 or the like), concentration (administration of 10-100 mg corresponds to 3-4 mg / kg body weight / day to achieve an effective concentration of 0.1-10 ⁇ M in CSF / on site), duration and route of application, as discussed by Hyb ⁇ don (WO 97/48795)
  • a chemically stabilized modified form such as phosphothioate coupling or polyamide nucleic acid (PNA)
  • PNA polyamide nu
  • a reaction mixture of 50 ⁇ l was put together with 1 ⁇ reaction buffer from the polymerase manufacturer, 1 mM MgCl 2 , 4 ⁇ 12.5 ⁇ M dNTPs, 0.01% BSA, 1 ⁇ relaxation reagent, 6 oligonucleotides in a concentration of 2 ⁇ M (primer el to eVI), 0.1 U Taq polymerase from Perkin-Elmer and 1 -2 ⁇ l DNA extract (100-200 ng).
  • a DMSO-like agent was used as the relaxation reagent, but it did not contain any DMSO. A more specific double strand formation of the P ⁇ mer reached and at the same time the binding strength reduced.
  • the P ⁇ mer used had the sequences
  • PCR products were separated in a 4% metaphor agarose gel (made from a modified agarose from FMC) in flat bed electrophoresis in ethidium bromide-containing 1x TBE buffer for 600 Vh. The detection was carried out under UV light at 311 nm
  • a PCR was carried out over the entire length of the selected area. Two primers were used with the sequences
  • rE 1 5 'CCAAggAgCTgCAggCg and SEQIDNO 15 rE 2: 5' CCggCCTggTACACTgC. SEQ ID NO 16
  • PCR product was cut with two residual enzyme enzymes, each with specific codon 112 and 158.
  • a multiplex PCR was carried out as described in Example 1, but using four mutation-specific primers which were of the same length and were each labeled with four different fluorescent dyes. The respective codon-specific polymer pair therefore differed only in the 3'-base and the fluorescent one Molecule at 5'-
  • End primers e I and e IV correspond to those from Example 1
  • the PCR reaction was simplified accordingly, since the polymer had practically identical melting points.
  • the fluorescent labeling of the polymer enabled the Detection of the allele fragments could be automated, for example with an HPLC system with a multiple fluorescence detector.
  • the gel electrophoresis from Example 1 was omitted

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung des Apoliprprotein-E-Polymorphismus in einer menschlichen Probe durch PCR-Amplifikation einer ausgewählten Basensequenz und Nachweis der Apolipoprotein-E-Allele, wobei eine Multiplex-PCR mit 6 bis 7 verschiedenen spezifischen Primern verwendet wird und jeweils vier der Primer direkt an den mutationsspezifischen Stellen enden. Die Primer zeichnen sich aus unter anderem durch Basenmismatche an der dritten bis fünften Stelle vor dem 3'-Ende und dass zur Verbesserung der Amplifikationsselektivität die Mismatch-Stellen von ⊂ II und ⊂ III beziehungsweise von ⊂ V und ⊂ VI relativ zum 3'-Ende verschoben sind.

Description

VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG DES APOLIPOPROTEIN-E-GENOTYPS IN EINER MENSCHLICHEN PROBE
GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Apohpoprotein-E-Allele in einer menschlichen Probe
HINTERGRUND DER ERFINDUNG Das sekretorische Glycoprotein Apohpoprotein-E (fortan Apo-E) wurde ursprünglich im
Blutplasma entdeckt, wo es als Bestandteil von Lipoproteinen vorkommt Verschiedene Untersuchungen zeigen, dass das Glycoprotein Apo-E am Cholesteπnmetabolismus und Tπglyceridtransport zwischen verschieden Zelltypen, einschließlich Nervenzellen, beteiligt ist Es ist auch beschrieben, dass Apo-E eine Auswirkung auf das Neuntenwachstum und die Cytoskelettaktivitat in Neuronen hat Es ist bspw beschrieben, dass die Variante ApoE4 durch Einwirkung auf den Lipoprotein-Metabolismus das Neuntenwachstum und die Mikrotubulusbildung hemmt
Zudem ist ein Zusammenhang zwischen dem ApoE4-Genotyp und Morbus Alzheimer bekannt Verschiedene Studien zeigen, dass das ApoE4-Allel mit einem erhöhten Risiko einer Alzheimererkrankung in Verbindung steht Insbesondere bei Patienten mit einem homozygoten ApoE4-Genotyp liegt die Wahrscheinlichkeit im Alter an Morbus Alzheimer zu erkranken sehr viel hoher als bei Patienten, bei denen zumindest ein anderes ApoE-Allel vorliegt Bei Patienten, die kein ApoE4-Allel haben, kann hingegen eine sporadische Alzheimererkrankung mit großer Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden Die Alzheimerkrankheit ist eine neurodegenerative Krankheiten, die besonders altere
Menschen betrifft und durch starken geistigen Leistungsabfall gekennzeichnet ist Mit über 70% ist sie die häufigste Form der Altersdemenz Eine der pathologischen Veränderungen im Krankheitsverlauf ist die fortschreitende Ablagerung von fibnllarem Amyloidprotein, das sich in den Nervenzellen des Gehirns und spater auch im synaptischen Spalt ablagert und Plaques bildet Wegen der Abgeschlossenheit des menschlichen Gehirns durch die Blut/Hirnschranke können diese pathogenen Veränderungen bei Morbus Alzheimer bislang mit herkömmlichen labordiagnostischen Verfahren nicht nachgewiesen werden Die Bestimmung der Plaques und neurofibπllarer Nekrosen kann daher erst post mortem erfolgen
Aus diesem Grund wird seit Langem nach Verfahren gesucht, die eine frühzeitige verlassliche Diagnose der Alzheimererkrankung ermöglichen
Bisher beschranken sich die Verfahren zur frühen Diagnose der Alzheimererkrankung auf die Bestimmung des ApoE4-Status des Patienten In jüngster Zeit wurde jedoch gefunden, dass nicht allein der Nachweis des Risikoallels ApoE4 für die Diagnose einer Alzheimererkrankung
BESTÄTIGUNGSKOPIt von Bedeutung ist, sondern der gesamte ApoE-Allelstatus, d h das Verhältnis aller ApoE-Allele zueinander
Neben dem entwicklungsgeschichtlich ältesten Apolιpoproteιn-E4 (ApoE4) sind bislang weitere häufige ApoE-lsoformen nachgewiesen worden, die als ApoE2 und ApoE3 bezeichnet werden DieseAlleleberuhenjeweilsaufemerNukleinsauremutation, dieAminosauresubstitutionen an den Positionen 112 und 158 zur Folge haben Wahrend bei ApoE4 an den Positionen 112 und 158 die Aminosäure Arginin vorkommt (Arg/Arg), hat ApoE3 an diesen Stellen Cys/Arg und ApoE2 Cys/Cys
Im Gegensatz zum ApoE4-Allel sind für die ApoE2- und ApoE3-Allele Schutzfunktionen beschrieben, die auf ein verringertes Risiko einer Alzheimererkrankung hinweisen Verschiedene Studien unterstutzen bspw die statistische Beobachtung, dass etwa 64% des Risikos einer sporadischen Alzheimererkrankung auf die Anwesenheit des Risikoalleis ApoE4 entfallen und 23% auf die Abwesenheit des ApoE2-Allels Es ist weiter beschrieben, dass das Verhältnis von ApoE4 zu ApoE2, ahnlich wie das Verhältnis von ApoE4 zu ApoE3, auf ein erhöhtes Risiko einer Erkrankung hinweist Fig 1 zeigt eine altersabhangige Genotypenverteilung, aus der das prozentuale Risiko einer Alzheimererkrankung in Abhängigkeit vom Genotyp abgelesen werden kann Das statistische Erkrankungsbild 75-jahrιger Patienten zeigt bspw , dass bei einem homozygoten Genotyp ApoE4/4 nureιn20%ιger Schutz voreiner Alzheimererkrankung gegeben ist, bei dem Genotyp ApoE3/3 ein etwa 70%ιger Schutz und bei Patienten mit einem ApoE2/2- Genotyp eine Erkrankung zu nahezu 100% ausgeschlossen werden kann
Eine verlassliche Diagnose der Alzheimerkrankheit und insbesondere der Ausschluss dieser Erkrankung erfordert daher, dass das gesamte ApoE-Allelbild ermittelt und die jeweiligen Einzelwerte gegeneinander abgewogen werden
STAND DER TECHNIK
US 5 508 167 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Apolιpoproteιn-E4 in einer menschlichen Probe zur Verwendung als Indikator für ein erhöhtes Risiko einer Alzheimererkrankung Das Verfahren umfasst das Vervielfältigen des Apolιpoproteιn-E4-Gens aus einer menschlichen Probe durch eine herkömmliche Polymerase-Kettenreaktion (fortan PCR genannt) den anschließenden Nachweis des ApoE4-Allels durch ein Hybπdisierungsverfahren oder einen Restπktionsverdau
Nachteilig an dem Verfahren ist, dass mit der verwendeten herkömmlichen PCR im ersten Schritt nur eine schwache Amplifikation des ApoE4-Gens erreicht wird Dies verringert die Nachweisempfindlichkeitderamplifizierten Sequenzregionen im zweiten Verfahrensschritt, der Hybridisierung bzw dem Restπktionsverdau
Ein weiterer Nachteil liegt dann, dass bei dem Restπktionsverdau durch ApoE- unspezifische Reaktionen des Restriktionsenzyms eine Vielzahl Banden entsteht Die Interpretation dieser Banden erweist sich folglich als schwierig, selbst wenn die Probe auf einem Gel stark aufgetrennt wird Für ein Routineuntersuchung scheidet dieses Verfahren daher aus
Zur Behebung dieses Problems werden zahlreiche verschiedene Oligonukleotide vorgeschlagen, die als Pπmer in einer PCR zur Bestimmung von ApoE geeignet sein sollen (siehe WO 97/48795 A2, WO 96/25517 A1 , WO 95/16791 A1, US 5 780 587, JP-Kokai 4-320700, Chem Abstr 130 (1999) 1632621v, Chem Abstr 130 (1999) 120090d, Mol Diagn 1997, 2(4) pp271-276, J Neurosci Methods 1998, 79(2) pp 229-231 , J Lipid Res 1991. 32(1 ) pp183-187) Zugleich werden verschiedene Nachweisstrategien beschrieben, einschließlich die Verwendung von wenigstens zwei Primern (JP-Kokai 4-320700), sogenannten base-pairmismatches am 3'-Ende (J Lipid Res 1991 , 32(1), pp 183-187), die Verwendung einer Multiplex-PCR (DE 41 29 653 A1 ) oder eine Restπktionstypisierung (US 5716828) Es sein diesem Zusammenhang angemerkt, dass die WO 96/25517 nur die Variante 113 A/Gly113Asp berücksichtigt, allerdings steht seit der Erstveröffentlichung der Untersuchung jede Verifikation durch Dritte oder die Autoren aus Die vorgenannten Druckschriften werden durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung aufgenommen
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es ist Aufgabe der Erfindung ein Verfahren bereitzustellen, das einen schnellen, hoch spezifischen, empfindlichen Nachweis der ausgewählten Allele des Apolipoproteins-E ermöglicht Die Aufgabe wird gelost durch das erfindungsgemaße Verfahren zur Bestimmung des
Apolipoprotein-E-Polymorphismus in einer menschlichen Probe durch PCR-Amplifikation einer ausgewählten Basensequenz und Nachweis der Apolipoprotein-E-Allele, wobei eine Multiplex-PCR mit 6 verschiedenen spezifischen Pπmern verwendet wird und jeweils vier der Pπmer direkt an den mutationsspezifischen Stellen enden Die zwei Basispπmer sind nicht variabel und liegen vorzugsweise in Regionen, in denen keine Mutationen bekannt sind
Eine bevorzugte Ausfuhrungsform betrifft ein Verfahren, bei dem die Pπmer, die direkt an den mutationsspezifischen Stellen enden, durch Basenmismatche an der dritten bis fünften vorzugsweise an der vierten Stelle vor dem 3'-Ende spezifitatsverstarkt sind und worin wahlfrei zur Verbesserung der Amplifikationsselektivität die Mismatch-Stellen von e II und e III beziehungsweise von e V und e VI relativ zum 3'-Ende verschoben sein können
Die Primer haben bevorzugt eine Lange von 10 bis 30 Basenpaare, besonders bevorzugt von 15 bis 28 Basenpaare
In dem erfindungsgemaßen Verfahren werden als Pπmer vorzugsweise Oligonukleotide verwendet, die die Sequenz eines Apolipoprotein-Allels aufweisen und 15 bis 28 Basenpaare lang sind, und wobei vier der Primer direkt an den mutationsspezifischen Stellen der Apolipoprotein- E-Allele enden und gegebenenfalls durch Basenmismatche an der dritten bis fünften, vorzugsweise an der vierten Stelle vor dem 3'-Ende spezifitatsverstarkt sind, und die zwei Basispπmer nicht variabel sind und vorzugsweise in Regionen hegen, die keine Mutationen aufweisen Zudem können die Oligonukleotide einen unspezifischen Sequenzteil zur leichteren elektrophoretischen Unterscheidbarkeit haben
Eine besonders bevorzugte Ausfuhrungsform betrifft ein Verfahren, bei dem als Primer Oligonukleotide verwendet werden mit den Sequenzen
εl: 5' GCT GTC CAA GGA GCT GC, SEQ 1D NO 1
G εll 5' CAC CAG GCG GCC TCG, SEQ ID NO 2
A G εlll 5' TTT CTA ATC TTA CAC CAG GCG GCC GCA, SEQ ID No 3
εlV 5' CGA GGA GCT GCG GGT G, SEQ ID NO 4
T A εV 5' -GGT ACA CTG CCA GGC G, und SEQ ID NO 5
T C εVI 5' TTC TAA TCT TAT -GGT ACA CTG CCA GGC A, SEQ ID NO 6
wobei an der dritten bis fünften Stelle vor dem 3'-Ende ein Basenmismatch eingefugt sein kann und zur Verbesserung der Amplifikationsselektivität die Mismatch-Stellen von ε II und ε lll beziehungsweise von ε V und ε VI relativ zum 3'-Ende verschoben sein können, bspw wie nachstehend
ε l 5 ' GCT GTC CAA GGA GCT GC, SEQ ID NO 1 ε ll 5 ' CAC CAG GCG GCC GCG, SEQ ID NO 7 ε lll 5 ' TTT CTA ATC TTA CAC CAG GCG GCC GCA, SEQ ID NO 8 εεllVV 5 5'' CGA GGA GCT GCG GGT G, SEQ ID NO 4 ε V 5 ' GGT ACA CTG CCA GGC G, und SEQ ID NO 9 ε VI 5 ' TTC TAA TCT TAT GGT ACA CTG CCA GGC A, SEQ ID NO 10 oder ε l 5 ' GCT GTC CAA GGA GCT GC , SEQIDNO 1 ε ll 5 ' CAC CAG GCG GCC TCG, SEQIDNO 11 ε lll 5 ' TTT CTA ATA TTA CAC CAG GCG GCG GCA, SEQIDNO 12 ε lV 5 ' CGA GGA GCT GCG GGT G, SEQIDNO 4 ε V 5 ' TGG TAC ACT GCC AGA CG, SEQIDNO 13 ε VI 5 ' TTC TAA TCT TAT TGG TAC ACT GCC ACG CA. SEQIDNO 14 Die Pπmer haben vorzugsweise Schmelzpunkte, die voneinander höchstens um 5°C, vorzugsweise um 2°C abweichen Die Pπmer können auch fluoreszenzmarkiert sein, so dass der Nachweis der Allelvaπanten mit einem Mehrfachfluoreszenzdetektor erfolgen kann
Vorzugsweise sollte in der Multiplex-PCR des erfindungsgemaßen Verfahrens ein DMSO- freies Relaxationsreagens vorzugsweise Solution-D® von Qiagen GmbH, Hilden, verwendet werden
Eine weitere Ausfuhrungsform betrifft ein Verfahren bei dem die Pπmerε I und ε IV etwas weiter entfernt von den diagnostischen Codons liegen Dieses Verfahren ist bspw geeignet, wenn man ein Elektrophoresesystem mit niedriger Gelkonzentration verwendet, bspw aus Kostengrunden oder aufgrund technischer Vorgaben Der Pπmer ε IV egt dabei bevorzugt auf der 3'-Seιte des Codons 158
Die erfindungsgemaße PCR ermöglicht auch eine wirksame Synthese längerer Amplimere mit hoher Ausbeute bspw Amplimere mit einer Lange von 200 bis 700 Basenpaaren Um die Amplimere in der Elektrophorese oder der Flussigchromatographie besser voneinander unterscheiden zu können, kann man daher die Langendifferenz der Pπmer vergrößern, bspw indem einzelnen codonspezifischen Pπmern eine Anzahl Basen als "Schwanz" oder "Anhangsei" angefugt wird
Eine weitere Ausfuhrungsform betrifft ein Verfahren, bei dem anstelle der 5'-Pπmer εl und εlV Mischbaseno gonukleotiden eingesetzt werden Dies betrifft Falle, bei denen im Sequenzbereich der Basispπmer εl und εlV alzheimerrelevante Mutationen auftreten Solche Sequenzvarianten, die die Pπmerbindung beeinflussen können, können durch die Verwendung von Mischbasenohgonukleotiden neutralisiert werden Mischbaseno gonukleotide entsprechen einem O gonukleotidgemisch, das aus gleichen Teilen Oligonukleotide besteht, die jeweils eine der möglichen Basen an der mutationsrelevanten Position enthalten So können auch bei vorliegenden Mutationen im Bereich der Basispπmer alle Sequenzvaπanten in der Multiplex-PCR erfasst werden
Noch eine weitere Ausfuhrungsform betπfftein Verfahren, wobei anstelle einer Multiplex- PCR eine PCR mit zwei Ohgonukleotiden als Pπmer verwendet wird mit den Sequenzen
rE 1: 51 CCAAggAgCTgCAggCg und SEQIDNO 15 rE 2 : 5' CCggCCTggTACACTgC, SEQIDNO 16
und zum Nachweis eine Restπktionstypisierung erfolgt
Die Erfindung betrifft zudem Oligonukleotide, die eine Sequenz aus einem Apohpoprotein- Allel aufweisen, 15 bis 28 Basenpaare lang sind, und entweder direkt an einer mutationsspezifischen Stelle eines Apohpoprotein-E-Allels enden und gegebenenfalls durch Basenmismatche an der dritten bis fünften vorzugsweise an der vierten Stelle vor dem 3'-Ende spezifitatsverstarkt sind oder invariable sind und in einer mutationsfreien Region liegen Die Erfindung betrifft insbesondere Oligonukleotide mit den nativen ApoE-Sequenzen und Oligonukleotide, worin die genannten Mismatche und Verschiebungen enthalten sind
Erfindungsgemaß werden die vorstehenden Oligonukleotide als Primer in einer Multiplex- PCR zum Nachweis von Apohpoprotein-E-Allelen eingesetzt Die Erfindung betrifft auch Diagnosekits für die Alzheimererkrankung, umfassend a) Oligonukleotide mit den oben angegebenen ApoE-Sequenzen bzw den Mismatch-Sequenzen und b) PCR-Reagenzien, insbesondere Polymerase, dNTPs und Relaxationsreagens
Eine Ausfuhrungsform betrifft ein Diagnosekit, das eine Multititerplatte umfasst, in der die Reaktionsreagenzien verglast, d h in Zucker vernetzt enthalten sind, so dass man für den Nachweis lediglich die zu untersuchende Probe und Wasser zugeben muss Eine weitere Ausfuhrungsform betrifft ein Kit, das Nachweisstreifen enthalt, auf denen die Reaktionsreagenzien aufgebracht sind Eine dritte Ausfuhrungsform umfasst einen Kit, welcher ein oder mehrere der angegebenen Oligonukleotide auf einem festen Trager enthalt
Die mit dem erfindungsgemaßen Verfahren erzielten Vorteile bestehen insbesondere dann, dass deutlich mehr gewünschtes PCR-Produkt gewonnen werden kann als mit herkömmlichen Verfahren und zum Nachweis der Allele kein Hybπdisierungsverfahren bzw Restπktionsverdau benotigt wird
Zudem wurde erkannt, dass der entsprechende DNS-Bereich der Apolipoprotein-E-Gene aufgrund eines vergleichsweise hohen GC-Gehalts von über 70% zur Bildung unspezifischer Doppelbindungen neigt und dadurch die PCR stark beeinträchtigt Eine spezifische PCR kann daher nur stattfinden, wenn die Tendenz zu unspezifischen Doppelstrangbildungen herabgesetzt wird Bei dem erfindungsgemaßen Verfahren werden daher als Pπmer kürzere Oligonukleotide als bei den herkömmlichen Verfahren eingesetzt und zudem eine geringere Magnesiumkonzentration Es wurde auch gefunden, dass die Zugabe von DMSO ins Reaktionsgemisch die PCR-
Reaktion nicht positiv beeinflusst Bei dem erfindungsgemaßen Verfahren wurde daher als Relaxationsreagens ein DMSO-freies Additiv verwendet und zwar Solution-D® der Firma Qiagen Es können auch andere DMSO-freie Relaxationsreagenzien wie Losung-W1®, ein Gemisch aus Polyoxyethylenether der Firma Sigma, oder Mischungen aus Tween-20®, Tween-25®, Tween-30® und Tween-35® verwendet werden
Desweiteren wurde gefunden, dass durch Einfuhrung einer Verschiebung zwischen den Pπmer-Sequenzen von ε II und ε III sowie ε V und ε VI die Amplifikationsselektivität in dem PCR- Verfahren überraschend erhöht wird
Das erfindungsgemaße Verfahren betrifft eine Multiplex-PCR, die zum Nachweis weder einen Restπktions- noch einen Hybπdisierungsschπtt benotigt Bei dem erfindungsgemaßen
Verfahren werden in einem Schritt sechs kurze bis sehr kurze Pπmer eingesetzt, von denen vier jeweils direkt an den mutationsspezifischen Stellen enden und durch Basenmismatche an der vierten Stelle vor dem 3'-Ende spezifitatsverstarkt sind Diese Oligonukleotide werden als Stolperpπmer bezeichnet Die zwei weiteren Pπmer, auch "Forward"- oder Basispnmer genannt, sind nicht variabel und egen vorzugsweise in konservierten Bereichen, in denen keine Mutationen vorliegen , bzw bekannt sind Durch diese Reaktion können alle in der Probe vorkommenden Allele in einem Reaktionsansatz nachgewiesen werden, und zwar direkt nach Auftrennung der Banden in einem einfachen Agarosegel mit Ethidiumbromid Die kurzen, vergleichsweise nahe beieinander hegenden Pπmer ermöglichen kurze Reaktionszyklen und einen hoch spezifische Nachweis Zudem ist die erfindungsgemaße Reaktion hoch effektiv und ermöglicht, dass geringere O gonukleotidmengen eingesetzt werden können als bei herkömmlichen Verfahren
Als Vergleichsbeispiel wird eine Multiplex-PCR beschrieben bei der vier kurze Pπmer eingesetzt werden, von denen drei jeweils direkt an den mutationsspezifischen Stellen enden und durch Basenmismatche an derzweiten Stelle vor dem 3'-Ende spezifitatsverstarkt sind Diese liefern keine ausreichend spezifische Reaktion
Das erfindungsgemaße Verfahren liefert je nach Genotyp der Patientenprobe zwei (bei einem homozygoten Genotyp) bzw drei oder vier Banden (bei einem heterozygoten Genotyp) Die jeweiligen Genotypen lassen sich dabei an der Kombination der Banden unterscheiden Das Allel ε2 liefert Banden bei 85 und 110 bp (Basenpaaren), das Allel ε3 Banden bei 85 und 98 bp und das Allel ε4 Banden bei 73 und 98 bp
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Es zeigt
Fig. 1 eine altersabhangige Genotypenverteilung, aus der das prozentuale Risiko einer Alzheimererkrankung in Abhängigkeit vom Genotyp abgelesen werden kann,
Fig. 2 den Abschnitt der Nukleinsauresequenz des ApoE-Proteins, der den Bereich mit den Codons 112 und 158 umfasst (SEQ ID NO 23),
Fig.3 eine UbersichtderLokahsation derApohpoprotein-E-Allele und derbei der Multiplex-PCR verwendeten Pπmer εl bis εVI auf dem Apohpoprotein-E-Gen,
Fig.4 das Bandenmuster der amphfizierten und im Agarosegel aufgetrennten PCR-Produkte verschiedener Patientenproben,
Fig. 5 die Laufstrecken der ApoE-Amphmere in der Elektrophorese AUSFUHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das erfindungsgemaße Verfahren umfasst eine Multiplex-PCR zur Vervielfältigung ausgewählter Genfragmente des Apohpoprotein-E-Gens, die anschließend auf einem Agarosegel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid nachgewiesen werden Fig 1 zeigt eine statistische Auswertung des Risikos einer sporadischen Alzheimererkrankung von Patienten mit verschiedenen ApoE-Genotypen in Abhängigkeit vom Alter
Fig 2 zeigt einen Ausschnitt der Nukleinsauresequenz des ApoE-Proteins, der den Bereich mit den Codons 1 12 und 158 umfasst, wo die mutationsspezifischen Stellen hegen Bei ApoE4 kodieren die Nukleinsauresequenzen CgC an den Positionen 112 und 158 für die Aminosäuren Arginin (Arg/ Arg), bei ApoE3 kodieren TgC und CgC für Cys/Arg und bei ApoE2 stehen CgC an beiden Positionen für Cys/Cys
Fig 3 zeigt eine Übersicht der Apohpoprotein-E-Allele und die Loka sation der zur Multiplex-PCR verwendeten Pπmerεl bis εVI auf dem Apohpoprotem-E-Gen DasApolipoprotem-E- Gen enthalt 2 Nukleinsaurecodons, die bei den jeweiligen ApoE-lsomeren verschieden sind und anhand derer sie sich unterscheiden lassen Für das erfindungsgemaße Verfahren wurde eine DNS-Region ausgewählt, die die beiden variablen Nukleinsaurecodons (für AS 112 und 158) enthalt Beide Einzelnukleotidwechselstellen liegen im Exon 4 des ApoE-Gens Beide Codons kommen meist in der Form CGC (für Arginin) und TAC (für Cystein) vor Die drei häufigsten Kombinationen, die für die neuronale Prognose bedeutsam sind, sind die Allele mit den Codons CGC CGC in Apoε 4 TAC CGC in Apoε3 und TAC TAC in Apoε2
Das erfindungsgemaße Verfahren betrifft eine Multiplex-PCR mit sechs kurzen Pπmern, von denen vier jeweils direkt an den mutationsspezifischen Stellen enden und durch Basenmismatche an der vierten Stelle vor dem 3'-Ende spezifitatsverstarkt sind Die beiden 5'- Pπmer εl und εlV sind in einem Sequenzbereich plaziert, der hinsichtlich alzheimerrelevanter Mutationen nach derzeitiger Kenntnis invariabel ist Werden in diesem Bereich Sequenzvarianten bekannt, die die Primerbindung beeinflussen, was leicht möglich ist so werden diese durch Verwendung von Mischbasenohgonukleotiden neutralisiert
Die erfindungsgemaßen Pπmer sind so entworfen, dass ihre Schmelzpunkte um 2°C aneinander angeglichen sind Dies betrifft alle Pπmer, die in einer Multiplex-PCR eingesetzt werden, auch die Oligonukleotide, die einen unspezifischen oder"random" Anhang haben Dieser Anhang von 12 bis 20 Nukleotiden ermöglicht, dass man die verschiedenen Allele nach der Auftrennung auf einem Agarosegel voneinander unterscheiden kann
Als Pπmer werden Oligonukleotide mit nachstehende Sequenzen verwendet, die komplementär zum ausgewählten DNS-Bereich sind
εl 5^ GCT GTC CAA GGA GCT GC SEQIDNO 1 εll 5' CAC CAG GCG GCG GCG SEQIDNO 17 εlll 5' TTT CTA ATC TTA CAC CAG GCG GCG GCA SEQIDNO 18 ε IV 5 ' CGA GGA GCT GCG GGT G SEQ ID NO 4 εV 5' GGT ACA CTG CCA CGC G SEQIDNO 19 εVI 5' TTC TAA TCT TAT GGT ACA CTG CCA CGC A SEQIDNO 20
oder nach dem gleichen Prinzip aufgebaute Oligonukleotide, die zusatzlich eine Veschiebung aufweisen zwischen e I I und e I I I sowie zwischen e V und e VI aufweisen wie
ε I 5 ' GCT GTC CAA GGA GCT GC SEQ ID NO 1 εll 5' CAC CAG GCG GCC TCG SEQIDNO 11 εlll 5' TTT CTA ATA TTA CAC CAG GCG GCG GCA SEQIDNO 12 ε IV 5 ' CGA GGA GCT GCG GGT G SEQ ID NO 4 V 5' TGG TAC ACT GCC AGA CG SEQIDNO 13 εVI 5' TTC TAA TCT TAT TGG TAC ACT GCC ACG CA. SEQIDNO 14
Bei vier dieser Pπmer ist an der dritten, vierten oder fünften Stelle vom 3'-Ende des Ohgonukleotids ein Basenmismatch eingefugt, das beim Anlagern des Pπmers zu einem Wobbeieffekt fuhrt und den Pπmer zu einem sogenannten Stolperpπmer macht Von den vorstehenden erfindungsgemaßen Ohgonukleotiden sind ε II, ε III und ε V, ε VI Stolperpπmer Bei Ihnen ist an der vierten Stelle vom 3'-Ende (siehe markierte Base) ein Basenmismatch eingefugt Bei den Pπmern ε II und ε III ist das sequenzgemaße C gegen ein G ausgetauscht Der Austausch kann auch gegen eine andere Base, bspw T erfolgen Bei den Pπmern ε V und ε VI ist das sequenzgemaße G gegen ein C ausgetauscht Der Austausch kann auch gegen eine andere Base, bspw T erfolgen
Es wurde gefunden, dass die Position des Basenmismatches für den Wobbeieffekt entscheidend ist Eine Stolperbase an der ersten oder zweiten Stelle vom 3'-Ende des Pπmers fuhrtdazu, dass das 3'-Ende beιm"Anneahngschπtt" derPCR"flattert", d h sich das Oligonukleotid nicht ausreichend an die DNS anlagert, und folglich die Polymerase nicht ansetzen kann Eine Stolperbase an der Position 6 oder an einer anderen Stelle, die weiter 5' egt, liefert hingegen keine ausreichende Selektivitatzur Unterscheidung der Allele Zur Unterscheidung zweier Allele, die nur in einer Base voneinander abweichen, benotigt man eine sehr hohe Selektivität Diese wird erfindungsgemaß erreicht durch Einfugen einer Stolperbase an der dritten bis fünften Stelle vom 3'-Ende Dadurch wird die Bedeutung der letzten Base vor der mutationsspezifischen Stelle erhöht und der Pπmer bindet nur solche Moleküle, zu denen auch die letzte Base komplementär ist
Desweiteren hat sich bewahrt, wenn bei der PCR-Amplifikation ein weiteres 15 bis 50 Nukleotide langes Oligonukleotid zugesetzt wird, dessen 3'-Ende durch eine Dideoxi-Eigenschaft oder einen vergleichbaren Polymeπsationsblock charakterisiert ist und mit einer Sequenz zwischen den Amp merpaaren hybridisiert Figur 3 zeigt die Position dieses Stopper-Ohgos, welches verhindert, dass die Polymerase erheblich über das εl - εlll-Amplimer hinauslesen kann Das weitere Oligonukleotid hat bevorzugt folgende Sequenz
e VI I 5 GTG CAG GCC ATG CTC GG SEQ ID NO 21
Durch diese Reaktion können in einem Ansatz alle in der Probe vorkommenden Allele nachgewiesen werden Dabei erhalt man furjedes der verschiedenen Codons eine eigene Bande Die Banden werden in einem Agarosegel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht Je nach Genotyp der Patientenprobe erhalt man zwei (bei einem homozygoten Genotyp) oder drei bis vier Banden (bei einem heterozygoten Genotyp), die den verschieden Allelen zugeordnet werden können
Wenn die Pπmer ε I und ε ll bei der Multiplex-PCR zum Einsatz kommen, erzeugen sie ein Amphmer mit einer Lange von 73 bp, spezifisch für Arg 112 Kommen die Primer ε I und ε
III bei der Multiplex-PCR zum Einsatz, entsteht ein Amphmer mit einer Lange von 85 bp, spezifisch furCys 112 Wenn die Pπmerε IV und εV bei der Multiplex-PCR zum Einsatz kommen, erzeugen sie ein Amphmer mit einer Lange von 98 bp, spezifisch für Arg 158 und kommen die Pπmer ε
IV und ε VII zum Einsatz, entsteht ein Amphmer mit einer Lange von 110 bp, spezifisch für Cys 158 Die drei unterschiedlichen Genmorphen ergeben folgende Amplimerkonfigurationen
Allel ε4 (Arg 112, Arg 158) bp 73 und bp 98,
Allel ε3 (Cys 112, Arg 158) bp 85 und bp 98, und Allel ε2 (Cys 112 und Cys 158) bp 85 und bp 110
Anhand der Kombination der Amplimere können dann wie oben beschrieben die jeweiligen Genotypen unterschieden werden Daraus ergibt sich im diploiden Genom der Genotyp je nach Amphmerkombination wie folgt
Genotyp Banden mit Basenpaaren ε4/4 73 und 98, ε4/3 73, 85 und 98, ε4/2 73, 85, 98 und 110, ε3/3 85 und 98, ε3/2 85, 98 und 110 und ε2/2 85 und 110
Fig 4 zeigt das Bandenmuster des amphfizierten und im Agarosegel aufgetrennten PCR- Produkts einer Patientenprobe In den Bahnen 1 und 8 sind als Referenz Großenmarker aufgetragen in Bahn 1 ein 00 bp-Markerund ιn Bahn 8 eιπ 20 bp-Marker Die Bahnen 2-7 zeigen das aufgetrennte PCR-Produkt verschiedener Patientenproben Über die Laufstrecke laßt sich zunächst die Große der Banden ermitteln, aus der man nach dem vorstehend genannten Schlüssel den vorliegenden ApoE-Genotyp bestimmen kann Die Probe in Bahn 2 zeigt 2 Banden von 73 und 98 bp, die dem Genotyp ε4/4 entsprechen Die Banden in Bahn 3 haben eine Große von 85 bzw 98 bp und stehen für den Genotyp ε3/3 Bahn 4 zeigt zwei Banden von 85 und 110 bp, entsprechend dem Genotyp ε2/2 Bahn 5 zeigt 3 Banden mit 73, 85 bzw 98 bp, die dem Genotyp ε4/3 entsprechen Die Probe in Bahn 6 enthalt 4 Banden, jeweils bei 73, 85, 98 und 110 bp, was dem Genotyp ε4/3 entspricht Die Probe in Bahn 7 zeigt 3 Banden bei 85, 98 und 110, was für dem Genotyp ε3/2 steht Fig 5 zeigt die Auswertung einer Gelelektrophorese erfindungsgemaß vorbereiteter
Patientenproben 1 bis 6 Die Fig zeigt die Laufstrecken (in Zentimetern) der ApoE-Amphmere der jeweiligen Proben in der Elektrophorese Anhand der in der Gelelektrophorese mitgefuhrten DNS-Langenmarker A und B wurden die ApoE-Amphmere den verschiedenen ApoE-Genotypen zugeordnet Der Marker A ist ein 100-Basenpaar-DNS-Marker Bei diesem Elektrophoresegel entspricht eine Laufstrecke des Markers A von 0,9 cm 400 Basenpaaren, eine Laufstrecke von 4,5 cm 100 Basenpaaren Der zweite Marker B ist ein 20-Basenpaar-DNS-Marker Eine Laufstrecke von 1 ,8 cm entspricht hierbei 260 Basenpaaren, eine Laufstrecke von 2,5 cm 200, eine Laufstrecke von 4,5 cm 100 und eine Laufstrecke von 5,2 cm 80 Basenpaaren Die gemessenen Laufstrecken der Patienten sowie die daraus abgeleiteten ApoE-Genotypen sind in nachstehender Tabelle wiedergegeben
Probe ApoE- -Genotyp Laufstrecke (cm)
A 100 bp-Marker 0,9, 1 ,45, 2,55, 4,5
1 ApoE ε4/ε4 4,5, 5,55
2 ApoE ε4/ε3 4,5, 4,9
3 ApoE ε4/ε2 4,15, 4,9
4 ApoE ε3/ε3 4,55, 4,9, 5,55
5 ApoE ε3/ε2 4,15, 4,5, 4,9, 5,55
6 ApoE ε2/ε2 4,15, 4,5, 4,9
B 20 bp-Marker 1 ,8, 2,0, 2,2, 2,5, 2,8 3,15, 3,5 4,0, 4,5, 5,2, 6,2, 7,45, 8 9
Anhand des ermittelten ApoE-Genotyps in der Probe kann eine Diagnose erfolgen hinsichtlich des Risikos einer Alzheimererkrankung
Die Erfindung umfasst zudem den Nachweis des gesamten pathogenitatsrelevanten Sequenzsets aus Apohpoprotein E von S1 = 5' TAC GGC (cd 112 e2/3),
S2= 5' CGC GGC (cd 112 e4),
S3= 5' CGC CTG (cd 158 e3/4/ und
S4= 5' TAC CTG (cd 158 e2)
durch Ampiifikation der Proben-DNS mit dem oben genannten speziellen Pπmer ε I und dem ebenfalls nativen kurzen, optimiert in einer konservierten Region bei cd 158 und vor den variablen Codons 212, 224 etc platzierten Pπmer
e VIII = 5 ' CGC TCG GCG CCC TCG C SEQ ID NO 22 zum Erhalt eines 240mers im Exon 4 bei den genannten Synthesebedingungen unter Verwendung einer Substanz Q®, wobei diese Pπmer am 5'-Ende eine Markierungsgruppe zum Nachweis tragen können wie etwa Biotin oder vergleichbares und die anschließende Hybridisierung an die je in einzelnen definierten "array spots" lokalisierten Nachweispπmer mit den Sequenzen S1-S4 fur die kombinierte Bestimmung von S1-S4 bei einem Mikroarray-Expeπment, wobei die Detektionspπmer rechnerisch durch verschiedene Verfahren und bevorzugt experimentell in ihrem Schmelzpunkt angeglichen sind durch Variation ihrer Lange und Verschiebung ihrer Sequenzen relativ zur zu detektierenden Kernsequenz S1-S4 Oder durch Hybridisierung mit den Nachweissequenzen von genomischer DNS oder RNS oder cDNS einer Probe Desweiteren umfasst die Erfindung die Verwendung der speziell entwickelten
Eigenschaften des oben genannten Ohgonukleotids ε ll, - spezifisch für den Nachweis von cd 112C (ε4-Allel) - für die partielle Suppression oder Blockade der Translation bzw Expression des Apohpoproteιn-E-ε4-Gens, speziell seiner mRNS, bei gleichzeitiger freier Expression der eventuell vorhandenen ε2- oder ε3-Allele mit cd 112T, bei Patienten mit erkennbarem krankheitserzeugenden Emfluss von deren ε4-Allel, zum Beispiel aber nicht ausschließlich bei Erkrankung von homozygoten ε4-Tragern mit spatem sporadischem morbus Alzheimer Entsprechend, falls dies sich als therapeutisch wünschenswert erweisen sollte, auch der Suppression der ε3-mRNS mittels der speziellen Pπmer ε lll (bei Patienten ε 3/3 oder ε 4/3) oder ε V (bei Patienten mit ε 2/3 oder ε 3/3), je ohne den unspezifischen Verlangerungsanhang der Pπmer Und entsprechend der ε 2-mRNS, zum Beispiel bei kongenital homozygoten Patienten zur Therapie der Hy pertπglyzeπdamie, etwa bei gleichzeitiger Gabe von substitutiven Agentien Gegebenenfalls erweiterbar durch die von Lucotte (1996, WO 96/25517) berichtete alzheim- errelevante Variante 113A in ε4 oder ihrer häufigeren Form ε3-1 13A mittels des Antisense- Ohgonukleotids ε IH"kurz" (ohne den unspezifischen Anhang) zum Zweck der teilweisen oder vollständigen Suppression des Schadalleis eventuell bei gleichzeitiger gentherapeutischer Gabe von ε2- oder ε3-Sequenz oder anderer pharmazeutischer MA-Kurativa
Verwendung zur Suppression bedeutet systemische Applikation zum Beispiel beim Menschen in einer chemisch stabilisierend modifizierten Form wie Phosphothioat-Koppelung oder Polyamid-Nukleinsaure (PNA) und in einer dem Bluthimschrankentransport forderlichen Form, wie etwa von Boado et al (J Pharmaceutical Sei 1998, 87(11 ) pp1308J 315) oderTyler etal (PNAS 1999, 96(12) pp7053-58) berichtet und entsprechend der Maßgabe derfacheigenen Kunstfertigkeit Außerdem in einer physiologisch sinnvollen pharmazeutischen Darreichungsform hinsichtlich der Verdünnungsmittel bzw Carπer (Lipofektin, SA-MA 0X26 o a ), Konzentration (Gaben von 10-100 mg entspr 3-4 mg/kg Korpergewicht/Tag zur Erreichung einer wirksamen Konzentration von 0,1 - 10 μM im Liquor/vor Ort), Dauer und Apphkationsroute, wie etwa von Hybπdon (WO 97/48795) diskutiert
BEISPIELE
Beispiel 1 Bestimmung der Sequenzvarianten der Apo-E-Allele
Für die Multiplex-PCR wurde Ausgangs-DNS hoher Reinheit eingesetzt
Es wurde ein Reaktionsansatz von 50 μl zusammengestellt mit 1 x Reaktionspuffer des Polymeraseherstellers, 1 mM MgCI2, 4 x 12,5 μM dNTPs, 0,01% BSA, 1 x Relaxationsreagens, 6 Oligonukleotide in einer Konzentration von 2 μM (Primer el bis eVI), 0,1 U Taq-Polymerase von Perkin-Elmer sowie 1 -2 μl DNS-Extrakt (100-200 ng) Es wurde als Relaxationsreagens ein DMSO-ahnhches Mittel verwendet, das jedoch kein DMSO enthielt So wurde eine spezifischere Doppelstrangbildung der Pπmer erreicht und gleichzeitig die Bindungsstarke verringert Die eingesetzten Pπmer hatten die Sequenzen
ε I 5 "" GCT GTC CAA GGA GCT GC SEQ ID NO 1 εll 5 ' CAC CAG GCG GCG GCG SEQ ID NO 7 εlll: 5' TTT CTA ATC TTA CAC CAG GCG GCG GCA SEQIDNO 18 εlV: 5' CGA GGA GCT GCG GGT G SEQIDNO 4 εV 5' GGT ACA CTG CCA CGC G SEQIDNO 19 εVI 5' TTC TAA TCT TAT GGT ACA CTG CCA CGC A. SEQIDNO 20
Für die PCR wurden folgende Zykherbedingungen eingesetzt
5 Minuten bei 95°C, und dann 40 Zyklen mit 94°C, 1 Minute, 64°C, 1 Minute,
72°C, 1 Minute, 74°C, 10 Minuten, und (4°C bis zur Entnahme) Die PCR-Produkte wurden in einem 4%ιgen Metaphoragarosegel (hergestellt aus einer modifizierten Agarose der Firma FMC) in der Flachbettelektrophorese in ethidiumbromidhaltigem 1x TBE-Puffer für 600 Vh aufgetrennt Die Detektion erfolgte unter UV-Licht bei 311 nm
Beispiel 2 Bestimmung der Sequenzvarianten der ApoE-Allele aus DNS-Ausgangsmateπal geringerer Reinheit
Es wurde eine PCR über die Gesamtlange des ausgewählten Bereichs Es wurden zwei Primer eingesetzt mit den Sequenzen
rE 1: 5' CCAAggAgCTgCAggCg und SEQIDNO 15 rE 2 : 5' CCggCCTggTACACTgC . SEQ ID NO 16
Es wurden die gleichen PCR-Bedingungen wie in der Kombireaktion aus Beispiel 1 verwendet, außer dass die Konzentration der dNTPs 4 x 17 μM und dιe von MgCI2 1 ,4 mM betrug Die Anneahngtemperatur lag bei 66°C Die Amphmerlange war 214 bp Die Sensitivitat lag bei dieser Reaktion etwa 50% hoher
Anschließend erfolgte eine Restπktionstypisierung Dazu wurde das PCR-Produkt mit zweι Restπktιonsenzymengeschnιtten,jeweιlsspezιfιschfurCodon 112und 158 Für jeden Ansatz wurden 30 μl PCR-Produkt mit 4 U BstH2 I und 5 U Afl III in 25 mM Tπs, 50 mM NaCI, 10 mM MgCI2, 1 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA, mit einen pH-Wert von 7,82 Stunden bei 37°C verdaut Die Proben wurden in 3,75% Metaphor in einer Hoπzontaielektrophorese in 1 X TBE mit Ethidiumbromid für 500 Vh aufgetrennt Es wurden folgende Fragmente nachgewiesen ε4 194 bp, ε3 145 bp und ε2 165 bp
Beispiel 3 Bestimmung der Sequenzvarianten der Apo-E- Allele einer größeren Probenzahl
Es wurde eine Multiplex-PCR durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei jedoch vier mutationsspezifische Primer verwendet wurden die gleich lang waren und jeweils mit vier verschiedenen fluoreszierenden Farbstoffen markiert waren Das jeweilige codonspezifische Pπmerpaar unterschied sich damit nur in der 3'-Base und dem fluoreszierenden Molekül am 5'-
Ende Die Primer e I und e IV entsprechen denen aus Beispiel 1
Die PCR-Reaktion wurde dementsprechend vereinfacht, da die Pπmer praktisch identische Schmelzpunkte hatten Zudem ermöglichte die Fluoreszenzmarkierung der Pπmer dass der Nachweis der Allelfragmente automatisiert werden konnte, bspw mit einer HPLC-Anlage mit Mehrfachfluoreszenzdetektor Die Gelelektrophorese aus Beispiel 1 entfiel
Vergleichsbeispiel
Bei diesem Versuch wurden als Primer 4 Oligonukleotide mit folgenden Sequenzen verwendet
ε I 5 ' GCT GTC CAA GGA GCT GC SEQ ID NO 1 εll 5' CAC CAG GCG GCG GCG SEQID O 17 εlll 5' TTT CTA ATC TTA CAC CAG GCG GCG GCA SEQIDNO 18 εlV 5' CGA GGA GCT GCG GGT G, SEQIDNO 4
von denen drei jeweils direkt an den mutationsspezifischen Stellen endeten und durch Basenmismatche an der zweiten Stelle vor dem 3'-Ende spezifitatsverstarkt waren Es wurden die gleichen Versuchsbedingungen eingesetzt wie in Beispiel 1 Das Ergebnis zeigte jedoch eine Vielzahl unspezifischer Banden, die keine verlasshche diagnostische Auswertung ermöglichten

Claims

PATENTANSPRÜCHE
Verfahren zur Bestimmung des Apohpoprotein-E-Polymorphismus in einer menschlichen Probe durch PCR-Amplifikation einer ausgewählten Basensequenz und Nachweis der
Apohpoprotein-E-Allele, dadurch gekennzeichnet, dass eine Multiplex-PCR verwendet wird, bei der die Pπmer Oligonukleotide sind mit den nativen ApoE-Sequenzen und unspezifischen Basen oder Sequenzanhangen
εl 51 GCT GTC CAA GGA GCT GC, SEQIDNO 1
G εll 5' CAC CAG GCG GCC TCG, SEQIDNO 2
A G εlll 5 ' TTT CTA ATC TTA CAC CAG GCG GCC GCA, SEQ ID NO 3
ε IV 5' CGA GGA GCT GCG GGT G, SEQIDNO 4
T A εV 5' -GGT ACA CTG CCA GGC G, und SEQIDNO 5
T c εVI 5' TTC TAA TCT TAT -GGT ACA CTG CCA GGC A, SEQIDNO 6
wobei an der dritten bis fünften Stelle vor dem 3'-Ende ein Basenmismatch eingefugt sein kann und zur Verbesserung der Amplifikationsselektivität die Mismatch-Stellen von s II und e III beziehungsweise von e V und e VI relativ zum 3'-Ende verschoben sein können
Verfahren nach Anspruch 1 , wobei als Pπmer Oligonukleotide verwendet werden mit den Sequenzen
εl 5' GCT GTC CAA GGA GCT GC, SEQIDNO 1 εll 5' CAC CAG GCG GCG GCG, SEQIDNO 7 εlll 5 ' TTT CTA ATC TTA CAC CAG GCG GCG GCA, SEQ ID NO 8 ε IV 5' CGA GGA GCT GCG GGT G, SEQIDNO 4 εV 5' GGT ACA CTG CCA CGC G, und SEQIDNO 9 ε VI 5' TTC TAA TCT TAT GGT ACA CTG CCA CGC A SEQIDNO 10 Verfahren nach Anspruch 1 , wobei als Pπmer Oligonukleotide verwendet werden mit den Sequenzen
εl 5' GCT GTC CAA GGA GCT GC , SEQIDNO 1 εll 5' CAC CAG GCG GCC TCG, SEQIDNO 11 εlll 5' TTT CTA ATA TTA CAC CAG GCG GCG GCA, SEQIDNO 12 ε IV 5' CGA GGA GCT GCG GGT G, SEQIDNO 4 εV 5' TGG TAC ACT GCC AGA CG, SEQIDNO 13 εVI 5' TTC TAA TCT TAT TGG TAC ACT GCC ACG CA. SEQIDNO 14
Verfahren nach Anspruch 1, wobei in die PCR-Amplifikation ein weiteres 15 bis 50 Nukleotide langes Oligonukleotid zugesetzt wird, dessen 3'-Ende durch eine Dideoxi- Eigenschaft oder einen vergeichbaren Polymeπsationsblock charakterisiert ist und mit einer Sequenz zwischen den Amphmerpaaren hybridisiert
Verfahren nach Anspruch 4, wobei das weitere Oligonukleotid folgende Sequenz besitzt.
εVII 5' GTG CAG GCC ATG CTC GGdd SEQ ID NO 21
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Erfassung mehrerer
Sequenzvarianten anstelle der Basispπmer ε I und ε IV Mischbasenohgonukleotide eingesetzt werden können
Verfahren nach Anspruch 1 , wobei für die Multiplex-PCR ein DMSO-freies Relaxationsrea- gens verwendet wird
Oligonukleotide als Pπmerfur eine Multiplex-PCR zum Nachweis von Apohpoprotein-E- Allelen mit den Sequenzen
ε I 5' GCT GTC CAA GGA GCT GC, SEQIDNO 1 εll 5' CAC CAG GCG GCC GCG, SEQIDNO 7 ε II' 5' CAC CAG GCG GCC TCG, SEQIDNO 11 εlll 5' TTT CTA ATC TTA CAC CAG GCG GCC GCA, SEQIDNO 8 ε Hl' 5' TTT CTA ATA TTA CAC CAG GCG GCG GCA, SEQIDNO 12 ε IV 5 ' CGA GGA GCT GCG GGT G, SEQIDNO 4 εV 5' GG TAC ACT GCC AGG CG, SEQIDNO 9 ε V 5 ' TGG TAC ACT GCC AGA CG , SEQ ID NO 13 ε VI 5 ' TTC TAA TCT TAT GGT ACA CTG CCA GGC A, SEQ ID NO 1 1 ε VI' 5 ' TTC TAA TCT TATTGGT ACA CTG CCA GGC A, SEQ ID NO 14 ε VII 5 ' GTG CAG GCC ATG CTC GGdd SEQ ID NO 21
Verwendung ein oder mehrerer Oligonukleotide aus Anspruch 8 als Pπmer oder
Polymerisationsstopp für eine Multiplex-PCR zur Bestimmung des Apohpoprotem-E-Poly- morphismus in einer menschlichen Probe
Verwendung ein oder mehrerer Oligonukleotide aus Anspruch 8 in einem Diagnosekit auf Alzheimererkrankungen, Hypertπglyzeπdamie, Atherosklerose und andere ApoE- reaktiven/responsible Erkrankungen
Diagnosekit, dadurch gekennzeichnet, ein oder mehrere Oligonukleotide aus Anspruch 8 , übliche PCR-Reagenzien und DMSO-freies Relaxationsreagens enthalt
Diagnosekit nach Anspruch 11, wobei ein oder mehrere Oligonukleotide gemäß Anspruch 8 auf einem festen Trager oder auf einem Chip oder an Beads gebunden sind
Diagnosekit nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass das Kit eine Multititerplatte umfasst, in der die Reaktionsreagenzien verglast enthalten sind
Diagnosekit nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass das Kit Nachweisstreifen umfasst, die Reaktionsreagenzien enthalten
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