DE60129043T2 - Identifizierung von genetischen determinanten der polymorphen cyp3a5 expression - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein polymorphes CYP3A5-Polynucleotid. Des weiteren betrifft die Erfindung Vektoren, die die Polynucleotide der Erfindung umfassen, und eine Wirtszelle, die genetisch mit dem Polynucleotid der Erfindung verändert wird. Des weiteren betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung einer molekularen Variante eines Polypeptids, Verfahren zur Herstellung von Zellen, die eine molekulare Variante des Polypeptids exprimieren können, und ein Polypeptid, das durch das Polynucleotid der Erfindung codiert wird oder das durch das Verfahren oder von den Zellen, die durch das Verfahren der Erfindung hergestellt werden, erhältlich ist. Des weiteren betrifft die Erfindung einen Antikörper, der spezifisch das Polypeptid der Erfindung bindet. Des weiteren betrifft die Erfindung ein transgenes nicht-menschliches Tier, welches das Polynucleotid oder den Vektor der vorliegenden Erfindung umfasst. Die Erfindung betrifft ebenfalls einen festen Träger, der eines/einen/eine oder eine Vielzahl der vorstehend erwähnten Polynucleotide, Vektoren, Polypeptide, Antikörper oder Wirtszellen umfasst. Des weiteren sind Verfahren zum Identifizieren eines Polymorphismus, zum Identifizieren und zum Erhalten einer Arzneistoffvorstufe oder eines Arzneistoffs ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Zusätzlich betrifft die Erfindung Verfahren zum Diagnostizieren einer Erkrankung. Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweisen des Polynucleotids der Erfindung. Des weiteren umfasst die vorliegende Erfindung eine diagnostische und eine pharmazeutische Zusammensetzung. Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendungen der Polynucleotide, Vektoren, Polypeptide oder Antikörper der Erfindung. Schließlich betrifft die Erfindung ein diagnostisches Kit.
  • Die CYP3A-Enzyme spielen ein besonders wichtige Rolle im Metabolismus von Arzneistoffen. Dies ist in ihrer reichlichen Expression in der Leber zusammen mit einem weiten Substratspektrum begründet. Tatsächlich wird geschätzt, dass CYP3A-Isozyme gemeinsam den größten Teil des CYP-Proteins der Leber umfassen (Thummel, Annu Rev Pharmacol Toxicol 38 (1998), 389-430) und dass sie an dem Metabolismus von 45%-60% aller zur Zeit verwendeten Arzneistoffe beteiligt sind (Li, Toxicology 104 (1995), 1-8, Evans, Science 286 (1999), 487-91). Zusätzlich zu den Arzneistoffen metabolisieren CYP3A-Isozyme eine Vielfalt von anderen Verbindungen einschließlich Steroidhormone, Toxine und Karzinogene. Zum Beispiel metabolisieren CYP3A-Isozyme Aflatoxin B1 (Wang, Biochemistry 37 (1998), 12536-45; Gillam, Arch Biochem Biophys 317 (1995), 374-84; Li, Cancer Res 57 (1997), 641-5), ein Mycotoxin, das in einem starken Zusammenhang mit der Ätiologie von Leberkrebs gebracht wird, welches eine Hauptursache von vorzeitigen Todesfällen in vielen Gebieten von Afrika und Asien ist (Henry, Science 286 (1999), 2453-4).
  • Die hepatische Expression und Aktivität der CYP3A-Isozyme ist zwischen Individuen variabel und diese Variabliltät ist der Grund für schädliche Interaktionen, auf die häufig bei der Entwicklung und der Anwendung von Arzneistoffen, die CYP3A-Substrate sind, gestoßen wird. Es wurde ebenfalls postuliert, dass eine variable CYP3A-Expression die Prädisposition eines Individuums gegen Krebsarten beeinflussen kann, die durch umgebungsbedingte Karzinogene, die durch CYP3A metabolisiert werden, hervorgerufen werden. Die Aufklärung von Faktoren, welche die Aktivität von CYP3A eines Individuums kontrollieren, könnte personalisierte Anpassungen der Dosis in Therapien mit seinen Substraten erlauben und ebenfalls zu der Identifizierung von Sub-Populationen mit einem erhöhten Risiko für mehrere häufige Krebserkrankungen führen. Trotz beträchtlicher Bemühungen ist jedoch unser Verständnis der Faktoren, welche die Aktivität und die Expression von CYP3A bestimmen, begrenzt. Es bestehen mehrere Gründe für dieses: Eine durchschnittliche menschliche Leber kann Produkte von bis zu vier CYP3A-Genen exprimieren (Gellner, Pharmacogenetics 11 (2001), 111-121), aber ihre jeweiligen Beiträge zum hepatischen CYP3A-Pool werden noch immer diskutiert. Es zeigte sich, dass die Unterscheidung zwischen den individuellen CYP3A-Proteinen durch enzymatischen Verfahren aufgrund der überschneidenden Substratspezifitäten und aufgrund der deutlichen Wirkung der Bedingungen der Rekonstitution auf ihre katalytischen Aktivitäten schwierig ist. Eine RNA- und Protein-Analyse zeigt, dass CYP3A4 den Hauptteil des hepatischen CYP3A-Proteins bildet und dass seine Expression hoch variabel ist (Thummel, Annu Rev Pharmacol Toxicol 38 (1998), 389-430). Ein weniger gutes Verständnis besteht bei den Beiträgen der anderen CYP3A-Gene. CYP3A5 wird weitgehend für das zweitwichtigste CYP3A-Protein in der Leber gehalten, aber die zur Verfügung stehenden Daten sind widersprüchlich, da berichtet wurde, dass seine Expression in 10% bis 97% von menschlichen Lebern vorhanden ist (Aoyama, J Biol Chem 264 (1989), 10388-95; Wrighton, Mol Pharmacol 38 (1990), 207-13; Schuetz, Pharmacogenetics 4 (1994), 11-20; Jounaidi; Biochem Biophys Res Commun 221 (1996), 466-70; Boobis, Br J Clin Pharmacol 42 (1996), 81-9). Die möglichen Gründe für diese Abweichungen schließen kleine Probengrößen, zwischenethnische Unterschiede und eine schlechte Spezifität der Proben, die verwendet wurden, um die CYP3A5-Expression zu messen, ein. Das dritte CYP3A, das CYP3A7, wurde ursprünglich in der fötalen menschlichen Leber beschrieben, wo es etwa 50% des gesamten CYP-Proteins ausmacht (Wrighton, Biochem Pharmacol 37 (1988), 3053-5). Neuere Studien deuten auf eine konstitutive oder induzierte Expression von CYP3A7 in erwachsenen menschlichen Lebern hin, aber seine Quantifizierung wurde durch das Fehlen von spezifischen Antikörpern erschwert. Gleichermaßen sind keine Daten zur Proteinexpression für das kürzlich identifizierte vierte Mitglied der Familie, das CYP3A3, erhältlich (Gellner, Pharmacogenetics 11 (2001), 111-121).
  • Klinische Studien deuten darauf hin, dass ein großer Anteil der Variabilität von CYP3A zwischen Individuen durch genetische Faktoren hervorgerufen wird (Ozdemir, Pharmacogenetics 10 (2000), 373-88), aber die Identitäten der Faktoren bleiben unbekannt. Mit Bezug auf CYP3A5 wurde eine Proteinvariante (Thr398Asn) in 2 von 5 Individuen gefunden, die mangelhaft in der CYP3A5-Expression waren (Jounaidi, Biochem Biophys Res Commun 221 (1996), 466-70), aber seine Signifikanz wurde noch nicht durch eine größere Anzahl von Leberproben und in funktionellen Studien bestätigt. Zusätzlich wurde ein Haplotyp bestehend aus zwei verbundenen Polymorphismen in der 5'-flankierenden Region des CYP3A5-Gens beschrieben, der mit einer erhöhten Expression und Aktivität des Gens assoziiert ist (Paulussen, Pharmacogenetics 10 (2000), 415-24). Es wurde jedoch nur eine kleine Probengruppe (n = 29) auf den Genotyp und den Phänotyp analysiert. Des weiteren sind die einzelnen Nucleotid-Polymorphismen (SNPs), die in dem Dokument offenbart wurden, für eine verlässliche Vorhersage einer Fehlfunktion und/oder Fehlregulierung von CYP3A5 und von den Problemen, die dadurch hervorgerufen werden, geeignet. Dieses Dokument deutet nicht auf die Existenz von weiteren Haplotypen.
  • Daher waren verbesserte Mittel und Verfahren für die Diagnose und für die Behandlung von einer Vielzahl von Erkrankungen und Störungen, die auf die Fehlfunktion oder die Fehlregulierung des Metabolismus von Arzneistoffen basieren, nicht erhältlich, sind aber dennoch sehr wünschenswert.
  • Die Lösung dieses technischen Problems wird durch das Bereitstellen der Ausführungsformen, die in den Ansprüchen gekennzeichnet werden, erreicht.
  • Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung ein Polynucleotid, das ein Polynucleotid umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt wird bestehend aus:
    • (a) einem Polynucleotid, das unter stringenten Bedingungen mit einem CYP3A5-Gen hybridisiert und die Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 112 hat;
    • (b) einem Polynucleotid, das unter stringenten Bedingungen mit einem CYP3A5-Gen hybridisiert und ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 141 hat; und
    • (c) einem Polynucleotid, das unter stringenten Bedingungen mit einem Teil eines CYP3A5-Gens hybridisiert, das die SEQ ID NO: 111 umfasst, wobei das Polynucleotid ein zusätzliches Nucleotid an einer Position hat, die der Position 27131/27132 des CYP3A5-Gens entspricht, das definiert ist durch die verknüpften Sequenzen von Zugangsnr. AF280107.1, wobei Position 166220 als + 1 nummeriert worden ist und Position 174832 als + 8613 nummeriert worden ist, und Zugangsnr. AC005020.2, wobei Position 27341 als + 8614 nummeriert worden ist.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck "Polynucleotide" oder der Ausdruck "Polypeptide" verschiedene Varianten eines Polynucleotids oder eines Polypeptids. Die Varianten umfassen eine Referenz- oder Wildtypsequenz der Polynucleotide oder der Polypeptide der Erfindung sowie der Varianten, die sich davon in der Struktur oder in der Zusammensetzung unterscheiden. Die Referenz- oder Wildtypsequenzen für die Polynucleotide sind die Zugangsnr. AF280107.1 und AC005020.2. Die Referenz- oder Wildtypsequenz für die Polypeptide der Erfindung ist die Zugangsnr. NP_000768.1. Die Unterschiede in der Struktur und der Zusammensetzung erfolgen üblicherweise durch Substitution(en), Addition(en) und/oder Deletion(en) von Nucleotiden oder Aminosäuren. Die Substitution(en), Addition(en) oder Deletion(en) von Nucleotiden führt/führen zu einer oder zu mehreren Veränderungen der entsprechenden Aminosäure(n) des Polypeptids der Erfindung. Die Polynucleotide und Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einer Fehlfunktion oder einer Fehlregulierung von CYP3A5 assoziiert sind. Dementsprechend rufen die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Fehlfunktionen oder Fehlregulierungen eine Erkrankung oder eine Störung oder eine Prävalenz für die Erkrankung oder die Störung hervor.
  • Die Polynucleotide der Erfindung schließen Polynucleotide ein, die mindestens 70%, vorzugsweise mindestens 75%, mindestens 80%, mindestens 85%, mindestens 90% oder mindestens 95% Sequenzidentität zu einem CYP3A5-Gen besitzen, wobei das Polynucleotid mindestens ein zusätzliches Nucleotid an einer Position besitzt, die der Position 27131/27132 des CYP3A5-Gens entspricht, das definiert ist durch die verknüpften Sequenzen der Zugangsnr. AF280107.1, wobei Position 166220 als + 1 nummeriert worden ist und Position 174832 als + 8613 nummeriert worden ist, und Zugangsnr. AC005020.2, wobei Position 27341 als + 8614 nummeriert worden ist.
  • Der Ausdruck "Hybridisieren", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet Polynucleotide, die an Polynucleotide der Erfindung oder an Teile davon hybridisieren können, die mit einer Fehlfunktion oder einer Fehlregulierung von CYP3A5 assoziiert sind. Daher sind die hybridisierenden Polynucleotide mit der Fehlfunktion und der Fehlregulierung ebenfalls assoziiert. Darum können die Polynucleotide als Sonden bei der Northern- oder der Southern-Blot-Analyse von RNA- oder beziehungsweise von DNA-Präparaten nützlich sein oder sie können in Abhängigkeit ihrer jeweiligen Größe als Oligonucleotid-Primer in der PCR-Analyse verwendet werden. Die Erfindung umfasst ebenfalls hybridisierende Polynucleotide, die für die Analyse von DNA-Protein-Interaktionen z.B. durch EMSA (electrophoretic mobility shift analysis) nützlich sind. Vorzugsweise umfassen die hybridisierenden Polynucleotide mindestens 10, stärker bevorzugt mindestens 15 Nucleotide in der Länge, während ein hybridisierendes Polynucleotid der vorliegenden Erfindung, das als eine Sonde verwendet werden soll, vorzugsweise mindestens 100, stärker bevorzugt mindestens 200 oder am stärksten bevorzugt mindestens 500 Nucleotide in der Länge besitzt.
  • Es ist auf dem Fachgebiet gut bekannt, wie Hybridisierungsexperimente mit Nucleinsäuremolekülen durchgeführt werden, das heißt der Fachmann weiß, welche Hybridisierungsbedingungen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden müssen. Auf solche Hybridisierungsbedingungen wird in Standardfachbüchern wie z.B. Molecular Cloning A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory (1989) NY, hingewiesen. Gemäß den vorliegenden Erfindungen werden Polynucleotide bevorzugt, die an Polynucleotide der Erfindung oder an Teile davon unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren können, die mit einer Fehlfunktion oder Fehlregulierung von CYP3A5 assoziiert sind, das heißt, die nicht mit unverwandten Polynucleotiden wie z.B. Polynucleotide, die ein Polypeptid codieren, das sich von den CYP3A5-Polypeptiden der Erfindung unterscheidet, kreuzhybridisieren.
  • Die Nucleinsäurehybridisierung wird von solchen Bedingungen wie die Salzkonzentration, Temperatur oder organische Lösungsmittel zusätzlich zu der Basenzusammensetzung, der Länge der komplementären Stränge und der Anzahl der Basenfehlpaarungen der Nucleotide zwischen den hybridisierenden Nucleinsäuren beeinflusst, wie durch den Fachmann leicht eingeschätzt werden kann. Stringente Temperaturbedingungen werden im Allgemeinen Temperaturen von mehr als 30°C, typischerweise 37°C, und vorzugsweise mehr als 45°C einschließen. Stringente Salzkonzentrationen werden gewöhnlich weniger als 1000 mM, typischerweise weniger als 500 mM und vorzugsweise weniger als 200 mM betragen. Die Kombination der Parameter ist jedoch deutlich wichtiger als das Maß eines einzelnen Parameters. Vergleiche z.B. Wetmur und Davidson, 1968. Die Sondensequenzen können ebenfalls spezifisch an eine Duplex-DNA unter bestimmten Bedingungen hybridisieren, um eine Triplex-DNA oder einen DNA-Komplex einer höheren Ordnung zu bilden. Die Herstellung von solchen Sonden und die geeigneten Hybridisierungsbedingungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
  • Der Ausdruck "prozentuale Sequenzidentität" oder "identisch" im Zusammenhang mit Nucleinsäuresequenzen bezeichnet die Reste in den zwei Sequenzen, die gleich sind, wenn sie für die maximale Übereinstimmung angeordnet werden. Die Länge des Vergleichs der Sequenzidentität kann eine Ausdehnung von mindestens neun Nucleotiden, üblicherweise von mindestens 20 Nucleotiden, noch häufiger von mindestens 24 Nucleotiden, typischerweise von mindestens 28 Nucleotiden, noch typischer von mindestens 32 Nucleotiden und vorzugsweise von mindestens 36 Nucleotiden oder mehr Nucleotiden haben. Es gibt eine Anzahl von unterschiedlichen, auf dem Fachgebiet bekannten Algorithmen, die verwendet werden können, um die Sequenzidentität der Nucleotide zu messen. Zum Beispiel können Polynucleotidsequenzen unter Verwendung von Fasta, einem Programm in GCG-Version 6.6, verglichen werden. Fasta stellt Anordnungen und die prozentuale Sequenzidentität der Regionen der besten Überschneidung zwischen der Suchanfrage und der Suchsequenz zur Verfügung (Pearson, 1980). Die prozentuale Sequenzidentität kann zum Beispiel zwischen Nucleinsäuresequenzen unter Verwendung von Fasta mit seinen Standardparametern (eine Wortgröße von 6 und den NOPAMfactor für die Auswertungsmatrix), wie sie in der GCG-Version 6.6 zur Verfügung gestellt wird, bestimmt werden.
  • Der Ausdruck "entsprechend", wie er hierin verwendet wird, bedeutet, das eine Position nicht nur durch die Anzahl der vorangegangenen Nucleotide oder beziehungsweise Aminosäuren bestimmt wird. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Position eines bestimmten Nucleotids oder einer bestimmten Aminosäure, das/die deletiert, substituiert sein kann oder ein oder mehrere zusätzliche Nucleotide umfassen kann, aufgrund von Deletionen oder von zusätzlichen Nucleotiden oder Aminosäuren woanders in dem Gen oder in dem Polypeptid liegen. Unter einer "entsprechenden Position" gemäß der vorliegenden Erfindung sollte daher verstanden werden, dass Nucleotide oder Aminosäuren sich in der angezeigten Nummer unterscheiden können, sie aber immer noch ähnliche benachbarte Nucleotide oder Aminosäuren besitzen. Die Nucleotide oder die Aminosäuren, die ausgetauscht, deletiert werden können oder die zusätzlichen Nucleotide oder Aminosäure umfassen, sind ebenfalls in dem Ausdruck "entsprechende Position" umfasst. Die Nucleotide oder Aminosäuren können zum Beispiel zusammen mit ihren Nachbarn Sequenzen bilden, die in der Regulation der Genexpression, der Stabilität der entsprechenden RNA oder der Aufbereitung der RNA beteiligt sind, sowie funktionelle Domänen oder Motive des Proteins der Erfindung codieren.
  • Mit der "Position 3709/3710" ist z.B. gemeint, dass das Polynucleotid ein oder mehrere zusätzliche Nucleotide umfasst, die zwischen der Position 3709 und der Position 3710 der entsprechenden Wildtypversion des Polynucleotids eingebracht sind. Das gleiche gilt entsprechend für alle Positionsnummer, auf die sich in der vorstehenden Ausführungsform bezogen wird, die in dem gleichen Format entworfen wurden, das heißt zwei aufeinanderfolgende Positionsnummern, die durch einen umgekehrten Schrägstrich (/) getrennt sind. Mit "Position 7424 bis 7427" ist z.B. gemeint, dass das Polynucleotid ein oder mehrere deletierte Nucleotide umfasst, die zwischen der Position 7424 und der Position 7427 der entsprechenden Wildtypversion des Polynucleotids deletiert sind und/oder ein oder mehrere zusätzliche Nucleotide, die zwischen der Position 7424 und der Position 7427 der entsprechenden Wildtypversion des Polynucleotids eingebracht sind. Das gleiche gilt entsprechend für alle anderen Positionsnummern, auf die sich in der vorstehenden Ausführungsform bezogen wird, die in dem gleichen Format entworfen wurden.
  • Die Nummerierung der Polymorphismen bezieht sich auf die angeordneten und verknüpften genomischen Sequenzen AF280107.1 und AC005020.2, wobei sich das T in Position 174832 (das als + 8613 nummeriert worden ist) der Sequenz AF280107.1 auf die Position 27340 der Sequenz AC005020.2 bezieht. Das Nucleotid A in der Position 27341 der Sequenz AC005020.2 wurden als + 8614 nummeriert. Die Nummerierung der Polymorphismen auf eine Position, die einer Position bis zu + 8613 entspricht, betrifft die genomische. Sequenz AF280207.1, die Nummerierung der Polymorphismen auf eine Position, die einer Position + 8614 und größer entspricht, betrifft die genomische Sequenz AC005020.2.
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde die Art und die Populationsverteilung von genetischen Varianten in dem CYP3A5-Gen durch Sequenzanalyse von relevanten Regionen des menschlichen Gens von vielen unterschiedlichen Individuen analysiert. Es ist eine gut bekannte Tatsche, dass die genomische DNA von Individuen, die den individuellen genetischen Aufbau von allen Genen einschließlich des CYP3A5-Gens beherbergt, leicht aus individuellen Blutproben gereinigt werden kann. Diese individuellen DNA-Proben werden anschließend für die Analyse der Sequenzzusammensetzung der Allele des CYP3A5-Gens verwendet, die in den Individuen vorhanden sind, welche die Blutprobe zur Verfügung gestellt haben. Die Sequenzanalyse wurde durch eine PCR-Amplifikation von relevanten Regionen der Gene, einer nachfolgenden Reinigung der PCR-Produkte, gefolgt von einer automatisierten DNA-Sequenzierung mit etablierten Verfahren (z.B. ABI Dyeterminator-Cycle-Sequenzierung) durchgeführt.
  • Ein wichtiger Parameter, der bei dem Versuch beachtet werden muss, die individuellen Genotypen zu bestimmen und neue Varianten des CYP3A5-Gens durch die direkte DNA-Sequenzierung von PCR-Produkten von genomischer DNA aus menschlichem Blut zu identifizieren, ist die Tatsache, das jeder Mensch (im Allgemeinen, mit sehr wenigen abnormalen Ausnahmen) zwei Genkopien von jedem autosomalen Gen (Diploidie) beherbergt. Aufgrund dessen ist eine große Vorsicht bei der Evaluierung der Sequenzen geboten, um nicht nur homozygote Sequenzvarianten sondern auch heterozygote Varianten eindeutig identifizieren zu können. Die Details der verschiedenen Schritte bei der Identifizierung und der Charakterisierung von neuen Polymorphismen in dem CYP3A5-Gen (homozygote und heterozygote) werden in den nachfolgenden Beispielen beschrieben.
  • Über die letzten 20 Jahre wurde im zunehmenden Maß erkannt, dass eine genetische Heterogenität ein wichtiger Ursprung für die Variation bei der Antwort auf Arzneistoffe ist. Viele wissenschaftliche Mitteilungen (Meyer, Ann Rev Pharmacol Toxicol 37 (1997), 269-296 und West, J Clin Pharmacol 37 (1997), 635-648) zeigten deutlich, dass einige Arzneistoffe besser wirken oder sogar eine höhere Toxizität in einigen Patienten als in anderen besitzen und dass sich diese Variationen bei den Antworten der Patienten auf die Arzneistoffe auf eine molekulare Grundlage beziehen. Dieses Konzept der "Pharmakogenomik" beleuchtet die Beziehungen zwischen Antworten auf Arzneistoffe und den genetischen Profilen von Patienten (Marshall, Nature Biotechnology 15 (1997), 954-957; Marshall, Nature Biotechnology 15 (1997), 1249-1252). In diesem Zusammenhang der Variabilität einer Population mit Bezug auf eine Arzneistofftherapie wurde die Pharmakogenomik als ein Werkzeug vorgeschlagen, dass nützlich bei der Identifizierung und der Auswahl von Patienten ist, die auf einen bestimmten Arzneistoff ohne Nebenwirkungen ansprechen. Diese Identifizierung/Auswahl kann auf eine molekulare Diagnose von genetischen Polymorphismen durch das Genotypisieren von DNA aus Leukocyten in dem Blut von Patienten und zum Beispiel durch die Charakterisierung der Erkrankung basieren (Bertz, Clin Pharmacokinet 32 (1997), 210-256; Engel, J Chromatogra B Biomed Appl 678 (1996), 93-103). Für die Gründer der Gesundheitsvorsorge wie z.B. Organisationen des Gesundheitswesens in den US und die öffentlichen Gesundheitswesen in vielen europäischen Ländern kann der Ansatz der Pharmakogenomik, eine Möglichkeit sein, sowohl die Gesundheitsvorsorge zu verbessern als auch die allgemeinen Kosten zu vermindern, weil hohe Kosten aufgrund unnötiger Arzneistoffe, unwirksamer Arzneistoffe und Arzneistoffe mit Nebenwirkungen existieren.
  • Die Mutationen in den Varianten des Gens der Erfindung können manchmal zu Deletion(en), Insertion(en) und insbesondere zu Substitution(en) von Aminosäuren entweder einzeln oder in Kombination führen. Es ist natürlich ebenfalls möglich, solche Mutationen gentechnisch in Wildtypgenen oder in anderen mutierten Formen herzustellen. Verfahren für das Einführen solcher Modifikationen in die DNA-Sequenz der Gene sind dem Fachmann gut bekannt; vergl. z.B. Sambrook, Molecular Cloning A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory (1989), NY.
  • Für die Untersuchung der Art der Veränderungen in der Aminosäuresequenz des Polypeptids der Erfindung können Software-Programme wie z.B. RASMOL verwendet werden, die aus dem Internet erhältlich sind. Des weiteren können Simulationen der Faltung und eine Computerneugestaltung der strukturellen Motive durchgeführt werden, wobei andere geeignete Computerprogramme verwendet werden (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput Appl Biosci 11 (1995), 675-679). Computer können für die konformative und energetische Analyse von detaillierten Proteinmodellen verwendet werden (Monge, J Mol Biol 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv Exp Med Biol 376 (1995), 37-45). Diese Analysen können für die Identifizierung des Einflusses einer bestimmten Mutation auf die Bindung und/oder auf die Prozessierung von Arzneistoffen verwendet werden.
  • Im Allgemeinen ist die Deletion, Addition oder Substitution einer Aminosäure in der Aminosäuresequenz des Proteins, das durch das Polynucleotid der Erfindung codiert wird, auf die Substitution, Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Nucleotide oder auf jede Kombination davon zurückzuführen. Vorzugsweise kann eine Insertion zu Aminosäuresubstitutionen von TYD zu YL. (wobei der Punkt eine Termination bedeutet) an einer Position, die der Position 346 bis 348 des CYP3A5-Polypeptids entspricht (Zugangsnr. NP_000768.1), führen.
  • Die Mutationen in dem CYP3A5-Gen, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung nachgewiesen wurden, sind in Tabelle 2 A-E aufgelistet. Die Verfahren der Mutationsanalyse folgten den Standardprotokollen und werden im Detail in den Beispielen beschrieben. Im Allgemeinen werden solche Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung für die Evaluierung des phänotypischen Spektrums sowie für die überschneidenden klinischen Kennzeichen von Erkrankungen oder Gegebenheiten verwendet, die Fehlfunktionen und Erkrankungen betreffen, die den Metabolismus von Arzneistoffen betreffen. Es ist vorteilhaft, dass die Charakterisierung der Mutanten die Grundlage der Entwicklung von verbesserten Arzneistoffen bilden kann. Die Verfahren umfassen zum Beispiel die Analyse des Haplotyps, die Analyse des Einzelstrang-Konformationspolymorphismus (SSCA), die PCR und das direkte Sequenzieren oder die TaqMan®-Analyse. Auf der Grundlage der gründlichen klinischen Charakterisierung von vielen Patienten können die Phänotypen anschließend mit diesen Mutationen korreliert werden sowie mit Mutationen, die zuvor beschrieben wurden, zum Beispiel in Jounaidi, Biochem Biophys Res Commun 221 (1996), S. 466-470.
  • Ebenfalls eingeschlossen durch die Polynucleotide, auf die in Tabelle 2 A-E hingewiesen werden, sind Polynucleotide, die mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei der Polynucleotide umfassen, die hierin vorstehend beschrieben werden, das heißt Polynucleotide, die eine Nucleotidsequenz haben, die mindestens zwei, vorzugsweise drei der in den nachfolgenden Tabellen aufgelisteten Mutationen enthalten. Der Haplotyp kann daher durch mindestens zwei, vorzugsweise drei der Mutationen in dem CYP3A5-Locus charakterisiert werden. Des weitere kann das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung weiterhin mindestens eine Deletion, Addition und/oder Substitution eines Nucleotids abgesehen von solchen, die hierin vorstehend beschrieben werden, umfassen, zum Beispiel solche, die auf dem Fachgebiet z.B. in Jounaidi, Biochem Biophys Res Commun 221, S. 466-470, 1996; in Paulussen, Pharmacogenetics 10, S. 415-434, 2000; in Kuehl, Nature Genetics 27, 383-391, 2001 oder in Chou, Drug Metab Dispos 29, 1205-1209, 2001 beschrieben werden. Dies ermöglicht die Studie von synergistischen Wirkungen der Mutationen in dem CYP3A5-Gen und/oder in einem Polypeptid, das durch das Polynucleotid codiert wird, auf das pharmakologische Profil von Arzneistoffen in Patienten, die solche mutierten Formen des Gens oder ähnliche mutierte Formen tragen, die durch die vorstehend beschriebenen Proteine nachgeahmt werden. Es wird erwartet, das die Analyse der synergistischen Wirkungen tiefere Einsichten in den Beginn der Fehlfunktionen oder Erkrankungen zur Verfügung stellt, die den Metabolismus von Arzneistoffen betreffen, wie vorstehend beschrieben wurde. Von der tieferen Einsicht wird die Entwicklung von diagnostischen und pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche die Fehlfunktionen und Erkrankungen betreffen, welche den Metabolismus von Arzneistoffen betreffen, stark profitieren.
  • Des weiteren wurde überraschenderweise entdeckt, dass die so genannte positive vorhersagenden Kraft für die Fehlfunktionen und Fehlregulierungen von CYP3A5 basierend auf den Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung deutlich gesteigert werden kann und dass dieses eine verlässliche Vorhersage im Gegensatz zu der positiven vorhersagenden Kraft, die auf dem Stand der Technik basiert, ermöglicht. Die erhöhte Proteinexpression von CYP3A5, die in allen Leberproben mit Ausnahme von einer (17/18) in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung identifiziert wurde und die im Detail in den nachfolgenden Beispielen beschrieben wird, wird zusammen mit einem Haplotyp getrennt, der aus mindestens drei Varianten (ch-v-021, ch-v-026, ch-v-015) mit bestimmten Orten innerhalb oder stromaufwärts des Genlocus besteht. Die Genotypisierung dieser drei Varianten führte in keinem Fall zu der Erzeugung von falsch-positiven Vorhersagen, was zu einer geschätzten positiven vorhersagenden Kraft für den 3-Varianten-Genotyp von etwa 99,95% führt. Dies liegt im deutlichen Gegensatz zu der positiven vorhersagenden Kraft, die für den Haplotyp bestimmt wurde, die von Paulussen, Pharmacogenetics 10, S. 415-424, 2000, beschrieben wurde, die etwa 65% beträgt. Des weiteren wurde basierend auf den Polynucleotiden der Erfindung gezeigt und wie es in den nachfolgenden Beispielen beschrieben wird, dass die von Paulussen, Pharmacogenetics 10, S. 415-424, 2000, beschriebenen SNPs im Gegensatz zu dem, was in dem Dokument berichtet wird, etwa 20 kb stromaufwärts der Startstelle den CYP3A5-Gens in einer Sequenz 5' zu einem CYP3A5-Pseudogenlocus liegen.
  • Darum erfüllen die Haplotypen, die auf der Grundlage der Polynucleotide der vorliegenden Erfindung charakterisiert wurden, die Kriterien, die von einem verlässlichen Marker der CYP3A5-Expression erwartet werden. Wie es für den Fachmann offensichtlich ist, kann das genetische Wissen, das von der vorliegenden Erfindung abgeleitet wird, nun verwendet werden, um genau und zuverlässig den Genotyp eines Patienten zu charakterisieren. Es ist vorteilhaft, dass Erkrankungen oder eine Prävalenz für eine Erkrankung, die mit einer Fehlfunktion oder einer Fehlregulierung von CYP3A5 assoziiert ist, wie z.B. Krebs, vorhergesagt werden können und dass dementsprechend präventive oder therapeutische Maßnahmen getroffen werden können. Des weiteren kann in Übereinstimmung mit dem vorstehend beschriebenen in Fällen, in denen ein bestimmter Arzneistoff eine ungewöhnliche Wirkung zeigt, eine geeignete individuelle Therapie auf der Grundlage des individuellen genetischen Aufbaus eines Individuums mit Bezug auf die Polynucleotide der Erfindung entwickelt werden und verbesserte Therapeutika können entwickelt werden, wie nachfolgend weiter diskutiert werden wird.
  • Schließlich sind die Polynucleotide und Polypeptide, auf die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung Bezug genommen wird, ebenfalls als forensische Marker nützlich, welches die Identifizierung von Individuen ermöglicht, die ermordet oder zum Beispiel durch ein Gewaltverbrechen oder eine andere Gewalttat getötet wurden und die nicht durch die gut bekannten konventionellen forensischen Verfahren identifiziert werden können. Die Anwendung von forensischen Verfahren, die auf den Nachweis der Polymorphismen basieren, die durch die Polynucleotide dieser Erfindung in dem Genom eines Individuums umfasst werden, sind besonders in Fällen gut geeignet, in denen ein (toter) Körper schwerwiegend entstellt ist, so dass eine Identifizierung durch andere körperliche Kennzeichen wie z.B. Charakterzüge des Gesichts nicht möglich ist. Dies ist der Fall, wenn zum Beispiel der Leichnam im Wasser gefunden wurde, der im Allgemeinen vollständig entstellt ist. Es ist vorteilhaft, dass die Verfahren, die auf das Bereitstellen der Polynucleotide der Erfindung basieren, nur eine minimale Menge der Gewebe oder Zellen benötigen, um durchgeführt zu werden. Die Gewebe oder Zellen können Bluttropfen, Haarwurzeln, Hautschuppen, Speicheltropfen, Sperma, etc. sein. Da nur eine minimale Menge von Geweben oder Zellen für die Identifizierung eines Individuums benötigt werden, können die Polymorphismen, die durch die Polynucleotide dieser Erfindung umfasst werden, ebenfalls als forensische Marker verwendet werden, um jemanden eines Verbrechens wie z.B. einer Verletzung (eines Missbrauchs) oder einer Entführung zu überführen. Des weiteren können die Polymorphismen, die durch die Polynucleotide dieser Erfindung umfasst werden, verwendet werden, um eine Vaterschaft zu bestätigen. In Übereinstimmung mit den forensischen Verfahren, auf die hierin Bezug genommen wird, wird die Anwesenheit oder das Fehlen der Polynucleotide der Erfindung bestimmt und mit einer Referenzprobe verglichen, die eindeutig von dem Individuum, das identifiziert werden sollt, abgeleitet wurde. Die forensischen Verfahren, die den Nachweis der Anwesenheit oder des Fehlens der Polynucleotide der Erfindung in einer Probe eines Individuums benötigen, wobei die Polymorphismen durch die Polynucleotide dieser Erfindung umfasst werden, können zum Beispiel auf PCR basierende Techniken sein, die besonders gut in Fällen geeignet sind, in denen nur eine minimale Menge von Geweben oder Zellen als forensische Proben erhältlich sind. Auf der anderen Seite, wenn genügend Gewebe oder Zellen erhältlich sind, können auf Hybridisierung basierende Techniken durchgeführt werden, um die Anwesenheit oder das Fehlen eines Polynucleotids dieser Erfindung nachzuweisen. Diese Techniken sind dem Fachmann gut bekannt und können für individuelle Zwecke angepasst werden, auf die hierin ohne weitere Umstände Bezug genommen wird. Zusammenfassend sind dank der vorliegenden Erfindung forensische Mittel, die verbesserte und verlässliche Vorhersagen mit Bezug auf die vorstehend erwähnten Aspekte ermöglichen, nun erhältlich.
  • Der Ausdruck "Krebs", wie er hierin verwendet wird, ist auf dem Fachgebiet sehr gut charakterisiert. Es existieren verschiedenen Varianten von Krebs und sie sind durch den Ausdruck umfasst, wie gemäß der Erfindung gemeint ist. Für eine detaillierte Liste von Symptomen, die für Krebserkrankungen indikativ sind, wird auf Fachbuchwissen wie z.B. Pschyrembel Bezug genommen.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynucleotid, das eine DNA oder eine RNA ist.
  • Das Polynucleotid der Erfindung kann z.B. DNA, cDNA, genomische DNA, RNA oder synthetisch hergestellte DNA oder RNA oder ein rekombinant hergestelltes chimäres Nucleinsäuremolekül sein, das jedes von solchen Polynucleotiden entweder einzeln oder in Kombination umfasst. Vorzugsweise ist das Polynucleotid ein Teil eines Vektors, insbesondere von Plasmiden, Cosmiden, Viren und Bakteriophagen, die herkömmlich in der Gentechnik verwendet werden und die ein Polynucleotid der Erfindung umfassen. Solche Vektoren können weitere Gene wie z.B. Markergene umfassen, welche die Selektion des Vektors in einer geeigneten Wirtszelle und unter geeigneten Bedingungen ermöglichen.
  • Es wird hierin ebenfalls ein Gen offenbart, welches das Polynucleotid der Erfindung umfasst.
  • Es ist auf dem Fachgebiet gut bekannt, dass Gene strukturelle Elemente umfassen, die eine Aminosäuresequenz codieren, sowie regulatorische Elemente, die bei der Regulierung der Expression der Gene beteiligt sind. Die strukturellen Elemente werden durch Exons repräsentiert, die entweder eine Aminosäuresequenz codieren oder die eine RNA codieren, die keine Aminosäuresequenz codiert, die aber trotzdem in einer RNA-Funktion involviert ist, wie z.B. bei der Regulierung der Stabilität der RNA oder dem nucleären Export der RNA.
  • Regulatorische Elemente eines Gens können Promotor-Elemente oder Enhancer-Elemente umfassen, von denen beide bei der transkriptionellen Kontrolle der Genexpression beteiligt sein können. Es ist auf dem Fachgebiet sehr gut bekannt, dass ein Promotor stromaufwärts der strukturellen Elemente eines Gens gefunden wird. Regulatorische Elemente wie z.B. Enhancer-Elemente können jedoch verteilt über den gesamten Locus des Gens gefunden werden. Die Elemente können sich z.B. in Introns, Regionen der genomischen DNA, welche die Exons eines Gens trennen, befinden. Die Introns können weitere regulatorische Elemente umfassen, die für eine einwandfreie Genexpression benötigt werden. Introns werden im Allgemeinen zusammen mit den Exons eines Gens transkribiert, welches zu einem im Entstehen begriffenen RNA-Transkript führt, das beides, sowohl Exon- als auch Intronsequenzen, enthält. Die Intron codierten RNA-Sequenzen werden im Allgemeinen durch ein Verfahren entfernt, das als RNA-Spleißen bekannt ist. Dieses Verfahren benötigt jedoch regulatorische Sequenzen auf einem RNA-Transkript, wobei die regulatorischen Sequenzen durch die Introns codiert werden können.
  • Neben ihrer Funktion bei der transkriptionellen Kontrolle und der Kontrolle der einwandfreien RNA-Prozessierung und/oder Stabilität können regulatorische Elemente eines Gens ebenfalls zusätzlich bei der Kontrolle der genetischen Stabilität eines Genlocus beteiligt sein. Die Elemente kontrollieren z.B. Ereignisse der Rekombination oder sie dienen dazu, eine bestimmte Struktur der DNA oder die Anordnung der DNA in einem Chromosom zu erhalten.
  • Daher können Polymorphismen in den Exons eines Gens auftreten, die eine Aminosäuresequenz codieren, wie vorstehend diskutiert wurde, sowie in regulatorischen Regionen, die bei den vorstehend diskutierten Verfahren beteiligt sind. Die Analyse der Nucleotidsequenz eines Genlocus in seiner Gesamtheit, einschließlich z.B. der Introns, ist angesichts der vorstehend beschriebenen Sachlage wünschenswert. Man hat basierend auf den Polymorphismen, welche die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, herausgefunden, dass bei dem Mechanismus der erhöhten Expression des CYP3A5-Proteins in den Lebern der meisten Kaukasier, die in den nachfolgenden Beispielen beschrieben wird, eine erhöhte Transkription und Stabilisierung der Gentranskripte beteiligt sein kann.
  • Daher kann in einem Gen eine Deletion, Addition und/oder Substitution eines Nucleotids zu einer veränderten Expression der Variante des Gens im Vergleich zu dem entsprechenden Wildtyp-Gen führen.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen Vektor, der das Polynucleotid der Erfindung umfasst.
  • Der Vektor kann zum Beispiel ein Phage, ein Plasmid, ein viraler oder ein retroviraler Vektor sein. Retrovirale Vektoren können kompetent oder defekt in Bezug auf die Replikation sein. Im zweiten Fall wird die Vermehrung der Viren nur in komplementierenden Wirtszellen erfolgen.
  • Das Polynucleotid der Erfindung kann mit einem Vektor verknüpft sein, der selektierbare Marker für die Vermehrung in einem Wirt enthält. Im Allgemeinen wird ein Plasmidvektor in einem Präzipitat wie z.B. einem Calciumphosphat-Präzipitat oder in einem Komplex mit einem geladenen Lipid oder in auf Kohlenstoff basierenden Clustern eingebracht. Wenn der Vektor ein Virus ist, kann er in vitro verpackt werden, wobei eine geeignete Verpackungszelllinie vor der Anwendung auf die Wirtszellen verwendet wird.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform des Vektors der Erfindung ist das Polynucleotid funktionell mit den Sequenzen der Expressionskontrolle verbunden, welches die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder in isolierten Fraktionen davon ermöglicht.
  • Die Expression des Polynucleotids umfasst die Transkription des Polynucleotids, vorzugsweise in eine translatierbare mRNA. Die regulatorischen Elemente, welche die Expression in eukaryontischen Zellen, vorzugsweise in Säugerzellen, sichern, sind dem Fachmann gut bekannt. Sie umfassen im Allgemeinen regulatorische Sequenzen, welche die Initiation der Transkription sichern, und gegebenenfalls Poly-A-Signale, welche die Terminierung der Transkription und die Stabilisierung des Transkripts sichern. Zusätzliche regulatorische Elemente können transkriptionale sowie translatorische Enhancer einschließen. Mögliche regulatorische Elemente, welche die Expression in prokaryontischen Wirtszellen ermöglichen, umfassen z.B. den lac-, trp oder tac-Promotor in E. coli und Beispiele für regulatorische Elemente, welche die Expression in eukaryontischen Wirtszellen ermöglichen, sind der AOX1- oder Gal1-Promotor in Hefe oder der CMV-, SV40-, RSV-Promotor (Rous-Sarkom-Virus), der CMV-Enhancer, SV40-Enhancer oder ein Globin-Intron in Säugerzellen und in anderen Tierzellen. Neben den Elementen, die für die Initiation der Transkription verantwortlich sind, können solche regulatorischen Elemente ebenfalls Signale für de Terminierung der Transkription, wie z.B. die SV40-Poly-A-Stelle oder die tk-Poly-A-Stelle stromabwärts des Polynucleotids umfassen. In diesem Zusammenhang sind geeignete Expressionsvektoren wie z.B. der Okayama-Berg-cDNA-Expressionsvektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen), pSPORT1 (GIBCO BRL) auf dem Fachgebiet bekannt. Vorzugsweise ist der Vektor ein Expressionsvektor und/oder ein Gentransfer- oder ein Ziel-Vektor. Expressionsvektoren, die von Viren wie z.B. Retroviren, Vaccinia-Virus, Adeno-assoziiertes Virus, Herpesviren oder Rinder-Papilloma-Virus abgeleitet sind, können für die Überbringung der Polynucleotide oder des Vektors der Erfindung in die Zielzellenpopulation verwendet werden. Es können Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, verwendet werden, um rekombinante Virus-Vektoren aufzubauen; vergl. zum Beispiel die Techniken, die in Sambrook, Molecular Cloning A Laborstory Manual, Cold Spring Harbor Laborstory (1989), NY und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publisching Associates und Wiley Interscience, NY, (1994) beschrieben werden. In einer anderen Ausführungsform können die Polynucleotide und Vektoren der Erfindung in Liposomen zur Überbringung in die Zielzellen wieder hergestellt werden.
  • Der Ausdruck "isolierte Fraktionen davon" bezieht sich auf Fraktionen von eukaryontischen oder prokaryontischen Zellen oder Geweben, welche die Zellen umfassen, die in der Lage sind, die RNA aus dem Vektor der Erfindung zu transkribieren oder zu transkribieren und translatieren. Die Fraktionen umfassen Proteine, die für die Transkription der RNA oder für die Transkription der RNA und die Translation der RNA in ein Polypeptid benötigt werden. Die isolierten Fraktionen können z.B. nukleäre und cytoplasmatische Fraktionen von eukaryontischen Zellen wie z.B. von Reticulocyten sein.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren eine Wirtszelle, die genetisch mit dem Polynucleotid oder dem Vektor der Erfindung verändert wurde.
  • Die Wirtszelle kann eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein, vergl. vorstehend. Das Polynucleotid oder der Vektor der Erfindung, das/der in der Wirtszelle anwesend ist, kann entweder in das Genom der Wirtszelle integriert sein oder es/er kann extrachromosomal erhalten sein. In diesem Zusammenhang sollte es ebenfalls selbstverständlich sein, dass das rekombinante DNA-Molekül der Erfindung für "Gentargeting" und/oder für einen "Gen-Austausch", für das Ersetzen eines mutierten Gens oder für das Herstellen eines mutierten Gens über eine homologe Rekombination verwendet werden kann, vergl. zum Beispiel Mouellic, Proc Natl Acad Sci USA 87 (1990), 4712-4716; Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Press.
  • Die Wirtszelle kann jede prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein, wie z.B. eine Bakterien-, Insekten-, Pilz-, Pflanzen-, Tier- oder Menschenzelle. Bevorzugte Pilzzellen sind zum Beispiel solche der Gattung Saccharomyces, insbesondere solche der Art S. cerevisiae. Der Ausdruck "prokaryontisch" bedeutet, dass alle Bakterien, die mit einem Polynucleotid für die Expression einer Variante eines Polypeptids der Erfindung transformiert oder transfiziert werden können, eingeschlossen sind. Prokaryontische Wirte können sowohl gram-negative als auch gram-positive Bakterien wie z.B. E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens und Bacillus subtilis einschließen. Ein Polynucleotid, das eine mutierte Form einer Variante eines Polypeptids der Erfindung codiert, kann verwendet werden, um den Wirt zu transformieren oder transfizieren, wobei jede der Techniken verwendet werden kann, die im Allgemeinen dem Fachmann gut bekannt sind.
  • Verfahren zur Herstellung von verknüpften, funktionell verbundenen Genen und für ihre Expression in Bakterien- oder Tierzellen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt (Sambrook, vorstehend). Die genetischen Konstrukte und Verfahren, die darin beschrieben werden, können für die Expression einer Variante der Polynucleotide der Erfindung in z.B. prokaryontischen Wirten verwendet werden. Im Allgemeinen werden die Expressionsvektoren, welche die Promotorsequenzen enthalten, welche die effiziente Transkription des eingebrachten Polynucleotids erleichtern, in Verbindung mit dem Wirt verwendet. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen Anfangspunkt der Replikation, einen Promotor und einen Terminator sowie spezifische Gene, die eine phänotypische Auswahl der transformierten Zellen zur Verfügung stellen können. Die transformierten prokaryontischen Wirte können in Fermentoren vermehrt werden und werden gemäß der Techniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, gezüchtet, um ein optimales Zellwachstum zu erreichen. Die Proteine der Erfindung können anschließend aus dem Wachstumsmedium, den zellulären Lysaten oder Zellmembranfraktionen isoliert werden. Die Isolation und Reinigung der mikrobiellen oder anders exprimierten Polypeptide der Erfindung können durch jedes konventionelle Mittel wie zum Beispiel präparative chromatographische Trennungen und immunologische Trennungen wie z.B. solche, welche die Verwendung von monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern beinhalten, erfolgen.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung daher ein Verfahren zur Herstellung einer molekularen Variante des Polypeptids, das die Züchtung der vorstehend beschriebenen Wirtszelle und das Erhalten des Proteins aus der Kultur umfasst.
  • In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Herstellung von Zellen, die eine molekulare Variante des Polypeptids exprimieren können, das die genetische Veränderung von Zellen mit dem Polynucleotid der Erfindung oder dem Vektor der Erfindung umfasst.
  • Die Zellen, die durch das Verfahren der Erfindung erhältlich sind, können verwendet werden, um zum Beispiel Arzneistoffe gemäß der Verfahren zu testen, die in DL Spector, RD Goldman, LA Leinwand, Cells, a Lab manual, CSH Press 1998, beschrieben werden. Des weiteren können die Zellen verwendet werden, um bekannte Arzneistoffe und unbekannte Derivate davon auf ihre Fähigkeit zu testen, den Ausfall, der durch die Mutationen in dem CYP3A5-Gen hervorgerufen wurde, zu kompensieren. Für diese Ausführungsformen fehlen den Wirtszellen vorzugsweise ein Wildtyp-Allel, vorzugsweise beide Allele des CYP3A5-Gens, und/oder sie besitzen mindestes eine mutierte Form davon. Idealerweise kann das Gen, das ein Allel umfasst, wie durch das Polynucleotid der Erfindung umfasst ist, in den Wildtyp-Locus durch einen homologen Austausch eingebracht werden. In einer anderen Ausführungsform kann eine starke Überexpression eines mutierten Allels über dem normalen Allel und ein Vergleich mit einer rekombinanten Zelllinie, die das normale Allel in einer ähnlichen Menge überexprimiert, als ein Durchmusterungs- und Analysesystem verwendet werden. Die Zellen, die durch das vorstehend erwähnte Verfahren erhältlich sind, können ebenfalls für Durchmusterungsverfahren verwendet werden, auf die sich hierin nachfolgend bezogen wird.
  • Des weiteren betrifft die Erfindung ein Polypeptid, das durch das Polynucleotid der Erfindung codiert wird oder das durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhalten wird oder das von Zellen durch das vorstehend beschriebene Verfahren hergestellt wird.
  • In diesem Zusammenhang sollte es ebenfalls selbstverständlich sein, dass die Variante des Polypeptids der Erfindung weiter durch konventionelle Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, modifiziert werden kann. Durch das Bereitstellen der Varianten der Proteine der vorliegenden Erfindung ist es ebenfalls möglich, die Anteile zu bestimmen, die für ihre biologische Aktivität oder der Inhibition der gleichen relevant sind. Die Ausdrücke "Polypeptid" und "Protein", wie sie hierin verwendet werden, sind austauschbar. Des weiteren handelt es sich um Wissen aus Standardfachbüchern, was durch diese Ausdrücke umfasst wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren einen Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid der Erfindung bindet.
  • Es ist vorteilhaft, dass der Antikörper ein Epitop, das eine oder mehrere Aminosäuresubstitution(en) enthält, wie vorstehend definiert wurde, spezifisch erkennt oder bindet. Antikörper gegen die Varianten der Polypeptide der Erfindung können durch gut bekannte Verfahren hergestellt werden, wobei ein gereinigtes Protein gemäß der Erfindung oder ein (synthetisches) Fragment, das davon abgeleitet wurde, als ein Antigen verwendet wird. Monoclonale Antikörper können zum Beispiel durch Techniken hergestellt werden, wie sie ursprünglich in Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), 495 und Galfré, Meth Enzymol 73 (1981), 3 beschrieben wurden, welche die Fusion von Maus-Myelomzellen und Milzzellen, die von immunisierten Säugern abgeleitet wurden, umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Antikörper ein monoclonaler Antikörper, ein polyclonaler Antikörper, ein Einzelketten-Antikörper, ein menschlicher oder humanisierter Antikörper, ein primatisierter Antikörper, eine Chimäre oder ein Fragment davon, der/die/das spezifisch an das Peptid oder das Polypeptid bindet, wobei ein bispezifischer Antikörper, ein synthetischer Antikörper, ein Antikörperfragment wie z.B. Fab-, Fv- oder scFv-Fragmente, etc., oder ein chemisch modifiziertes Derivat von einem dieser Antikörper ebenfalls eingeschlossen ist. Des weiteren können Antikörper oder Fragmente davon von dem vorstehend erwähnten Polypeptiden durch die Verwendung von Verfahren erhalten werden, die z.B. in Harlow und Lane, "Antibodies, A Laborstory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988 beschrieben werden. Diese Antikörper können zum Beispiel für die Immunpräzipitation und Immunlokalisierung der Varianten der Polypeptide der Erfindung sowie für das Beobachten der Anwesenheit der Varianten der Polypeptide zum Beispiel in rekombinanten Organismen und für die Identifizierung von Verbindungen, die mit den Proteinen gemäß der Erfindung interagieren, verwendet werden. Zum Beispiel kann die Oberflächen-Plasmonresonanz, wie sie im BIAcore-System verwendet wird, verwendet werden, um die Effizienz von Phagen-Antikörpern zu erhöhen, die an ein Epitop der Proteins der Erfindung binden (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J Immunol Methods 183 (1995), 7-13).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform erkennt der Antikörper der vorliegenden Erfindung spezifisch ein Epitop, das eine oder mehrere Aminosäuresubstitution(en) enthält, die durch einen Austausch eines Nucleotids hervorgerufen wird/werden, wie vorstehend definiert wird.
  • Antikörper, die spezifisch modifizierte Aminosäuren wie z.B. Phospho-Tyrosin-Reste erkennen, sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Gemäß der vorliegenden Erfindung können Antikörper, die sogar einen Austausch einer einzelnen Aminosäure in einem Epitop spezifisch erkennen, durch gut bekannte Verfahren hergestellt werden, wie vorstehend beschrieben wurde.
  • Angesichts des vorstehend beschriebenen ist der Antikörper der vorliegenden Erfindung in einer stärker bevorzugten Ausführungsform monoclonal oder polyclonal.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls ein transgenes nicht-menschliches Tier, welches das Polynucleotid der Erfindung oder den Vektor der Erfindung umfasst, wie vorstehend beschrieben wurde.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung eines transgenen nicht-menschlichen Tiers, welches die Einbringung eines Polynucleotids oder eines Vektors der Erfindung in eine Keimzelle, eine embryonale Zelle, eine Stammzelle oder ein Ei oder eine Zelle, die davon abgeleitet ist, umfasst. Das nicht-menschliche Tier kann gemäß der Verfahren der Erfindung, die nachfolgend beschrieben werden, verwendet werden und es kann ein nicht-transgenes gesundes Tier sein oder es kann eine Erkrankung oder eine Störung besitzen, die vorzugsweise eine Erkrankung ist, die durch mindestens eine Mutation in dem Gen der Erfindung hervorgerufen wird. Solche transgenen Tiere sind z.B. für pharmakologische Studien der Arzneistoffe in Verbindung mit abweichenden Formen der vorstehend beschriebenen Varianten der Polypeptide gut geeignet, da diese Polypeptide oder mindestens ihre funktionellen Domänen zwischen den Arten in höheren Eukaryonten, insbesondere bei Säugern, konserviert sind. Die Herstellung von transgenen Embryos und das Durchmustern von diesen kann durchgeführt werden, wie z.B. in AL Joyner, Hrsg., Gene Targeting, A Practical Approach (1993), Oxford University Press beschrieben wird. Die DNA der Embryos kann analysiert werden, wobei z.B. Southern-Blot-Verfahren mit einer geeigneten Sonde oder Techniken basierend auf PCR verwendet werden.
  • Ein transgenes nicht-menschliches Tier gemäß der Erfindung kann eine transgene Maus, Ratte, Hamster, Hund, Affe, Kaninchen, Schwein, Frosch, Nematode wie z.B. Caenorhabditis elegans, Fruchtfliege wie z.B. Drosophila melanogaster oder Fisch wie z.B. der Torpedofisch oder Zebrafisch sein, die das Polynucleotid oder den Vektor der Erfindung umfassen oder die durch die Verfahren erhalten wurden, die vorstehend beschrieben wurden, wobei das Polynucleotid oder der Vektor vorzugsweise in das Genom des nicht-menschlichen Tiers stabil integriert ist, vorzugsweise so, dass die Anwesenheit des Polynucleotids oder des Vektors zu der Expression der Variante des Polypeptids der Erfindung führt. Es kann eine oder mehrere Kopien des gleichen oder von verschiedenen Polynucleotiden oder Genen der Erfindung umfassen. Dieses Tier hat zahlreiche Anwendungen, einschließlich als ein Forschungsmodell für Krebs oder jede andere Erkrankung, die durch eine Fehlfunktion oder Fehlregulierung der Polynucleotide oder Polypeptide der Erfindung hervorgerufen wird, und stellt daher ein neues und wertvolles Tier bei der Entwicklung von Therapien, Behandlungen, etc. für Krebserkrankungen oder jede andere Erkrankung, die durch die Fehlfunktion oder Fehlregulierung der Polynucleotide oder der Polypeptide der Erfindung hervorgerufen wird. Dementsprechend ist der Säuger in erster Linie vorzugsweise ein Labortier wie z.B. eine Maus oder eine Ratte.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist das transgene nicht-menschliche Tier der Erfindung daher eine Maus, eine Ratte oder ein Zebrafisch.
  • Viele Berichte machen deutlich, dass die Tiere besonders gut als Modellorganismen für die Untersuchung des Metabolismus von Arzneistoffen und seiner Mangelfunktion oder für Krebserkrankungen geeignet sind. Es ist vorteilhaft, dass die transgenen Tiere leicht hergestellt werden können, wobei die Modellorganismen aufgrund der Verfügbarkeit von verschiedenen geeigneten Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, verwendet werden.
  • Die Erfindung betrifft ebenfalls einen festen Träger, der ein/einen/eine oder eine Vielzahl der Polynucleotide, der Vektoren, der Polypeptide, der Antikörper oder der Wirtszellen in immobilisierter Form umfasst.
  • Der Ausdruck "fester Träger", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet einen elastischen oder nicht elastischen Träger, der für das Tragen der immobilisierten Ziele geeignet ist. Der feste Träger kann homogen oder inhomogen sein. Der feste Träger kann zum Beispiel aus verschiedenen Materialien bestehen, welche die gleichen oder unterschiedliche Eigenschaften zum Beispiel in Bezug auf die Elastizität und Immobilisierung haben, oder die festen Träger können aus einem Material bestehen, das eine Vielfalt der Eigenschaften zeigt, wobei die Eigenschaften der Elastizität und der Immobilisierung ebenfalls umfasst werden. Der feste Träger kann Glas-, Polypropylen- oder Silikonchips, Membrane, Oligonucleotid-konjugierte Kügelchen oder Kügelchenarrays umfassen.
  • Der Ausdruck "immobilisiert" bedeutet, dass die Molekülspezies von Interesse an einen festen Träger fixiert ist, vorzugsweise daran kovalent gebunden ist. Diese kovalente Bindung kann durch verschiedene Mittel in Abhängigkeit von der molekularen Natur der molekularen Art erreicht werden. Des weiteren kann die Molekülspezies an den festen Träger auch durch elektrostatische Kräfte, hydrophobe oder hydrophile Interaktionen oder Van-der-Waals-Kräfte fixiert werden. Die vorstehend beschriebenen physikalisch-chemischen Interaktionen erfolgen typischerweise bei Interaktionen zwischen den Molekülen. Biotinylierte Polypeptide können zum Beispiel auf einen mit Avidin beschichteten festen Träger aufgrund von Interaktionen der vorstehend beschriebenen Arten fixiert werden. Des weiteren können Polypeptide wie z.B. Antikörper auf einem mit Antikörper beschichteten festen Träger fixiert werden. Des weiteren ist die Immobilisierung abhängig von den chemischen Eigenschaften des festen Trägers. Die Nucleinsäuremoleküle können zum Beispiel auf einer Membran durch Standardtechniken wie z.B. UV-Vernetzung oder Hitze immobilisiert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der feste Träger eine Membran, ein Glas- oder Polypropylen- oder Silikonchip, Oligonucleotid-konjugierte Kügelchen oder ein Kügelchenarray, der auf einem optischen Filtersubstrat angeordnet ist.
  • Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein in-Vitro-Verfahren für die Identifizierung eines Polymorphismus, wobei das Verfahren den Schritt der Identifizierung eines Polymorphismus durch Vergleichen der Nucleinsäuresequenz des Polynucleotids der Erfindung, erhalten von einer Untergruppe von Individuen, wobei die Untergruppe keine Prävalenz für Krebs hat, mit der Nucleinsäuresequenz des Polynucleotids der Erfindung, erhalten von einer Vielzahl von Untergruppen von Individuen, wobei zumindest eine oder mehrere weitere Untergruppe(n) eine Prävalenz für Krebs hat/haben, umfasst.
  • Der Ausdruck "Prävalenz", wie er hierin verwendet wird, bedeutet, dass Individuen anfällig für eine Erkrankung oder mehrere Erkrankungen sind, die mit einer Fehlfunktion oder Fehlregulierung von CAP3A5 assoziiert sind, oder dass sie schon eine oder mehrere der Erkrankung(en) haben. Eine CYP3A5-assoziierte Erkrankung kann daher verwendet werden, um die Anfälligkeit für eine andere CYP3A5-assoziierte Erkrankung zu bestimmen, wie z.B. ein beeinträchtigter Metabolismus von Arzneistoffen indikativ für eine Prävalenz von z.B. Krebs sein kann. Des weiteren sind die Symptome, die indikativ für eine Prävalenz für die Entwicklung der Erkrankungen sind, auf dem Fachgebiet sehr gut bekannt und sie wurden ausreichend in Standardfachbüchern wie z.B. Pschyrembel beschrieben.
  • Es ist vorteilhaft, dass die Polymorphismen gemäß der vorliegenden Erfindung, die mit einer Fehlfunktion oder Fehlregulierung von CYP3A5 oder einer oder mehreren darauf basierenden Erkrankung(en) assoziiert sind, in Untergruppen von Individuen, die eine Prävalenz für die Erkrankungen haben, gegenüber Untergruppen, die keine Prävalenz für die Erkrankungen haben, angereichert sein sollten. Das vorstehend beschriebene Verfahren ermöglicht daher den schnellen und verlässlichen Nachweis von Polymorphismen, die indikativ für eine oder für mehrere CYP3A5-assoziierte Erkrankung(en) oder für eine Anfälligkeit dafür sind. Es ist vorteilhaft, dass aufgrund der phänotypischen Vorselektion eine große Anzahl von Individuen, die keine Prävalenz haben, nach Polymorphismen in Allgemeinen durchsucht werden können. Referenzsequenzen, welche die Polymorphismen umfassen, die nicht mit einer oder mit mehreren CYP3A5-assoziierten Erkrankung(en) korrelieren, können daher erhalten werden. Auf der Grundlage der Referenzsequenzen ist es möglich, effizient und verlässlich die relevanten Polymorphismen zu bestimmen.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung und zum Erhalten einer Arzneistoffvorstufe oder eines Arzneistoffs, die/der die Aktivität einer molekularen Variante eines CYP3A5-Polypeptids modulieren kann, umfassend die Schritte:
    • (a) das Inkontaktbringen des Polypeptids, des festen Trägers der Erfindung, einer Zelle, die eine molekulare Variante eines Gens exprimiert, das ein Polynucleotid der Erfindung umfasst, oder des Vektors der Erfindung in der Anwesenheit von Stoffen, die ein nachweisbares Signal als Antwort auf die Arzneistoffaktivität liefern können, mit einer Verbindung, die auf Arzneistoffvorstufen- oder Arzneistoffaktivität zu durchmustern ist; und
    • (b) das Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Signals oder der Zunahme oder Abnahme eines Signals das von der Arzneistoffvorstufen- oder der Arzneistoffaktivität erzeugt wurde, wobei die Abwesenheit, Anwesenheit, Zunahme oder Abnahme des Signals auf eine mögliche Arzneistoffvorstufe oder einen Arzneistoff hinweist.
  • Der Ausdruck "Verbindung" in einem Verfahren der Erfindung schließt eine einzelne Substanz oder eine Vielfalt von Substanzen ein, die identisch sein können oder nicht.
  • Die Verbindung(en) kann/können chemisch synthetisiert oder durch eine mikrobielle Fermentation hergestellt werden, aber sie können ebenfalls zum Beispiel in Proben wie z.B. Zellextrakten von z.B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen umfasst sein. Des weiteren können die Verbindungen auf dem Fachgebiet bekannt sein, aber es kann bisher noch nicht bekannt sein, dass sie als ein Inhibitor nützlich sind. Die Vielzahl der Verbindungen kann z.B. zu dem Kulturmedium zugegeben werden oder in eine Zelle oder ein nicht-menschliches Tier der Erfindung injiziert werden.
  • Wenn eine Probe, die (eine) Verbindung(en) enthält, in dem Verfahren der Erfindung identifiziert wird, dann ist es entweder möglich, die Verbindung aus der Originalprobe, die identifiziert wurde, die in Frage kommende Verbindung zu enthalten, zu isolieren oder man kann die Originalprobe weiter unterteilen, zum Beispiel, wenn sie aus einer Vielzahl von verschiedenen Verbindungen besteht, um die Anzahl der verschiedenen Substanzen pro Probe zu vermindern, und man wiederholt das Verfahren der Unterteilung der Originalprobe. Es kann anschließend bestimmt werden, ob die Probe oder die Verbindung die gewünschten Eigenschaften zeigt, zum Beispiel durch die Verfahren, die hierin oder in der Literatur beschrieben werden (Spector et al., Cells manual; vergl. vorstehend). In Abhängigkeit der Komplexität der Proben können die Schritte, die vorstehend beschrieben werden, mehrmals durchgeführt werden, vorzugsweise bis die Probe, die gemäß des Verfahrens der Erfindung identifiziert wird, nur eine begrenzte Anzahl von Substanzen oder nur eine Substanz umfasst. Vorzugsweise umfasst die Probe Substanzen mit ähnlichen chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften und es wird am stärksten bevorzugt, dass die Substanzen identisch sind. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können leicht von einem Fachmann durchgeführt und entwickelt werden, zum Beispiel in Übereinstimmung mit anderen auf Zellen basierenden Assays, die gemäß dem Stand der Technik beschrieben sind, oder durch die Verwendung und Modifizierung der Verfahren, die hierin beschrieben werden. Des weiteren wird der Fachmann leicht erkennen, welche weiteren Verbindungen verwendet werden können, um die Verfahren der Erfindung durchzuführen, zum Beispiel Enzyme, die, falls notwendig, eine bestimmte Verbindung in einen Vorläufer umwandeln. Eine solche Anpassung des Verfahrens der Erfindung liegt im Fachwissen eines Fachmanns und kann ohne unzumutbare Versuche durchgeführt werden.
  • Verbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Peptide, Proteine, Nucleinsäuren, Antikörper, kleine organische Verbindungen, Liganden, Peptidomimetika, PNAs und dergleichen ein. Die Verbindungen können als Agonisten oder Antagonisten der Erfindung wirken. Die Verbindungen können ebenfalls funktionelle Derivate oder Analoge von bekannten Arzneistoffen sein. Die Verfahren zur Herstellung von chemischen Derivaten und Analogen sind dem Fachmann gut bekannt und werden zum Beispiel in Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer Verlag, New York Inc., New York, NY, 10010 USA und Organic Synthesis, Wiley, New York, USA beschrieben. Des weiteren können die Derivate und Analoga auf ihre Wirkung gemäß der Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind oder wie sie beschrieben wurden, getestet werden. Des weiteren können Peptid-Mimetika und/oder eine Computer gestützte Entwicklung von Derivaten und Analoga von Arzneistoffen zum Beispiel gemäß der nachfolgend beschriebenen Verfahren verwendet werden. Solche Analoga umfassen Moleküle, die als eine Basis die Struktur von bekannten CYP3A5-Substraten und/oder Inhibitoren und/oder Modulatoren haben; vergl. vorstehend.
  • Geeignete Computerprogramme können für die Identifizierung der interaktiven Stellen eines möglichen Inhibitors und für die Polypeptide der Erfindung durch computergestützte Suchen nach komplementären strukturellen Motiven verwendet werden (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120). Weitere geeignete Computersysteme für die computergestützte Entwicklung von Protein und Peptiden werden gemäß der Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel in Berry, Biochem Soc Trans 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann NY Acad Sci 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemestry 25 (1986), 5987-5991. Die Ergebnisse, die von der vorstehend beschriebenen Computeranalyse erhalten werden, können in Kombination mit dem Verfahren der Erfindung z.B. für die Optimierung von bekannten Inhibitoren, Analoga, Antagonisten oder Agonisten verwendet werden. Geeignete Peptidomimetika und andere Inhibitoren können ebenfalls durch die Synthese von kombinatorischen Peptidomimetikum-Bibliotheken durch die aufeinanderfolgende chemische Modifikation und das Testen der so erhaltenen Verbindungen, z.B. gemäß der Verfahren, die hierin beschrieben werden, identifiziert werden. Verfahren für die Herstellung und die Verwendung von kombinatorischen Peptidomimetikum-Bibliotheken werden im Stand der Technik zum Beispiel in Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 und Dorner, Bioorg Med Chem 4 (1996), 709-715 beschrieben. Des weiteren kann die dreidimensionale Struktur und/oder die kristallographische Struktur der Verbindungen und der Polypeptide der Erfindung für die Entwicklung von Peptidomimetikum-Arzneistoffen verwendet werden (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg, Med Chem 4 (1996), 1545-1558). Es ist sehr gut bekannt, wie die Verbindungen erhalten werden, z.B. durch chemische oder biochemische Standardtechniken. Daher sind die Mittel des Aufbaus und der Herstellung der Verbindungen ebenfalls durch die Verfahren der Erfindung umfasst. Kurz zusammengefasst stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Identifizierung und zum Erhalten von Verbindungen zur Verfügung, die in spezifischen Dosen zur Behandlung von spezifischen Formen von CYP3A5- assoziierten Erkrankungen wie z.B. Fehlfunktionen des Metabolismus von Arzneistoffen oder Krebs verwendet werden können.
  • Die vorangehenden Definitionen treffen entsprechend auf alle die Verfahren zu, die in dem nachfolgenden Text beschrieben werden.
  • Es wird hierin ebenfalls ein Verfahren für die Identifizierung und dem Erhalten eines Inhibitors der Aktivität einer molekularen Variante eines CYP3A5-Polypeptids offenbart, das die Schritte umfasst:
    • (a) das Inkontaktbringen des Proteins, des festen Trägers der Erfindung oder einer Zelle, die eine molekulare Variante eines Gens exprimiert, das ein Polynucleotid oder das Gen der Erfindung umfasst, in der Anwesenheit von Stoffen, die ein nachweisbares Signal als Antwort auf die Arzneistoffaktivität liefern können, mit einer Verbindung, die auf eine hemmende Aktivität zu durchmustern ist; und
    • (b) das Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Signals oder der Zunahme oder Abnahme eines Signals, das von der hemmenden Aktivität hergestellt wurde, wobei die Abwesenheit oder die Abnahme des Signals auf einen möglichen Inhibitor hinweist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist die Zelle eine Zelle, die durch das Verfahren der Erfindung erhalten wird oder die von einem transgenen nicht-menschlichen Tier, wie vorstehend beschrieben wurde, erhalten wird.
  • In einer noch weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung und zum Erhalten einer Arzneistoffvorstufe oder eines Arzneistoffs, die/der die Aktivität einer molekularen Variante eines CYP3A5-Polypeptids modulieren kann, das die Schritte umfasst:
    • (a) das Inkontaktbringen der Wirtszelle, der Zelle erhalten durch das Verfahren der Erfindung, des Polypeptids oder des festen Trägers der Erfindung mit einem ersten Molekül, von dem bekannt ist, dass es von einem CYP3A5- Polypeptid gebunden wird, um einen ersten Komplex zwischen dem Polypeptid und dem ersten Molekül zu bilden;
    • (b) das Inkontaktbringen des ersten Komplexes mit einer zu durchmusternden Verbindung; und
    • (c) das Messen, ob die Verbindung das erste Molekül aus dem ersten Komplex verdrängt.
  • Es ist vorteilhaft, dass in dem Verfahren der Schritt der Messung das Messen der Erzeugung eines zweiten Komplexes des Proteins und des zur Auswahl stehenden Inhibitors umfasst. Vorzugsweise umfasst der Schritt der Messung das Messen der Menge des ersten Moleküls, das nicht an dem Protein gebunden ist.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens ist das erste Molekül ein Agonist oder ein Antagonist oder ein Substrat und/oder ein Inhibitor und/oder ein Modulator des Polypeptids der Erfindung, z.B. mit einer radioaktiven oder fluoreszierenden Markierung.
  • Des weiteren wird hierin ein Verfahren zur Identifizierung und zum Erhalten eines Inhibitors offenbart, der die Aktivität einer molekularen Variante eines CYP3A5-Polypeptids modulieren kann, das die Schritte umfasst:
    • (a) das Inkontaktbringen der Wirtszelle oder der Zelle erhalten durch das Verfahren der Erfindung, des Proteins oder des festen Trägers der Erfindung mit einem ersten Molekül, von dem bekannt ist, dass es von einem CYP3A5-Polypeptid gebunden wird, um einen ersten Komplex zwischen dem Protein und dem ersten Molekül zu bilden;
    • (b) das Inkontaktbringen des ersten Komplexes mit einer zu durchmusternden Verbindung; und
    • (c) das Messen, ob die Verbindung das erste Molekül aus dem ersten Komplex verdrängt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung umfasst der Messschritt das Messen der Erzeugung eines zweiten Komplexes des Proteins und der Verbindung.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung umfasst der Messschritt das Messen der Menge des ersten Moleküls, das nicht an dem Protein gebunden ist.
  • In einer stärker bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung ist das erste Molekül markiert.
  • Zusätzlich wird hierin ein Verfahren für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung offenbart, das die Schritte des Verfahrens umfasst, wie vorstehend beschrieben wurde; und den weiteren Schritt der Formulierung der identifizierten und erhaltenen Verbindung oder eines Derivats davon in einer pharmazeutisch verträglichen Form.
  • Die therapeutisch nützlichen Verbindungen, die gemäß den Verfahren der Erfindung identifiziert wurden, können formuliert und einem Patienten verabreicht werden, wie vorstehend diskutiert wurde. Für Verwendungen und therapeutische Dosen, von denen durch den Fachmann bestimmt wird, dass sie geeignet sind, und für Definitionen des Ausdrucks "pharmazeutische Zusammensetzungen", vergl. nachstehend.
  • Des weiteren wird hierin ein Verfahren für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung offenbart, welche die Schritte der vorstehend beschriebenen Verfahren umfasst; und die Formulierung eines Arzneistoffs oder einer Arzneistoffvorstufe in einer geeigneten Form für die therapeutische Anwendung und das Verhindern oder das Verbessern der Erkrankung des Individuums, die durch das Verfahren der Erfindung diagnostiziert wurde.
  • Die Arzneistoffe oder die Arzneistoffvorstufen werden nach ihren Verabreichung in vivo metabolisiert, um entweder durch Ausscheidung oder durch den Metabolismus zu einem oder zu mehreren aktiven oder inaktiven Metaboliten eliminiert zu werden (Meyer, J Pharmacokinet Biopharm 24 (1996), 449-459). Daher kann statt der Verwendung der eigentlichen Verbindung oder des Inhibitors, die/der gemäß den Verfahren der Verbindung identifiziert und erhalten wird, eine entsprechende Formulierung als eine Arzneistoffvorstufe verwendet werden, die in ihre aktive Form im Patienten umgewandelt wird. Vorsorgliche Maßnahmen, die für die Anwendung von Arzneistoffvorstufen oder von Arzneistoffen getroffen werden können, werden in der Literatur beschrieben, vergl. als Übersichtsartikel Ozama, J Toxicol Sci 21 (1996), 323-329).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist der Arzneistoff oder die Arzneistoffvorstufe ein Derivat eines Medikaments, das hierin nachfolgend definiert wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein In-Vitro-Verfahren zur Diagnose von Leberkrebs oder einer Anfälligkeit für Leberkrebs im Zusammenhang mit der Anwesenheit einer molekularen Variante eines CYP3A5-Gens, umfassend das Bestimmen der Anwesenheit
    • (a) eines Polynucleotids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
    • (i) einem Polynucleotid, wie es hierin beschrieben wird; und
    • (ii) einem Polynucleotid, das ein zusätzliches Nucleotid an einer Position hat, die der Position 27131/27132 des CYP3A5-Gens entspricht, das durch die verknüpften Sequenzen von Zugangsnr. AF280107.1 definiert ist, wobei Position 166220 als + 1 nummeriert worden ist und Position 174832 als + 8613 nummeriert worden ist, und Zugangsnr. AC005020.2, wobei Position 27341 als + 8614 nummeriert worden ist; oder
    • (b) des Polypeptids, wie es hierin beschrieben wird in einer Probe eines Individuums.
  • Gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren des Testens des Status einer Erkrankung oder einer Anfälligkeit für eine solche Erkrankung durch die Verwendung eines Polynucleotids oder einer Nucleinsäure der Erfindung, z.B. in Form eines Southern- oder Northern-Blot-Verfahrens oder einer in-situ-Analyse erfolgen. Die Nucleinsäuresequenz kann entweder an eine codierende Region der Gene oder an eine nicht-codierende Region, z.B. ein Intron, hybridisieren. In dem Fall, dass eine komplementäre Sequenz in dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann das Nucleinsäuremolekül erneut in Northern-Blot-Verfahren verwendet werden. Zusätzlich kann das Testen in Verbindung mit einer tatsächlichen Blockierung, z.B. der Transkription des Gens, durchgeführt werden und es wird daher erwartet, dass es eine therapeutische Relevanz hat. Des weiteren kann ein Primer oder ein Oligonucleotid ebenfalls für die Hybridisierung von einem der vorstehend erwähnten CYP3A5-Gene oder der entsprechenden RNAs verwendet werden. Die Nucleinsäuren, die für die Hybridisierung verwendet werden, können selbstverständlich in einer geeigneten Weise durch das Einbringen oder Anheften z.B. eines radioaktiven oder eines anderen Markers markiert werden. Solche Marker sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Die Markierung der Nucleinsäuremoleküle kann durch konventionelle Verfahren erfolgen.
  • Zusätzlich kann die Anwesenheit oder die Expression einer Variante des CYP3A5-Gens durch die Verwendung eines Primer-Paars überwacht werden, das an eine der entsprechenden Nucleinsäuresequenzen spezifisch hybridisiert, und durch die Durchführung einer PCR-Reaktion gemäß Standardverfahren. Die spezifische Hybridisierung der vorstehend erwähnten Sonden oder Primer erfolgt vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen. Der Ausdruck "stringente Hybridisierungsbedingungen" ist auf dem Fachgebiet gut bekannt, vergl. z.B. Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", zweite Ausg., CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989; "Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach", Harnes und Higgins, Hrsg., IRL Press, Oxford, 1985. Des weiteren kann die mRNA, cRNA, cDNA oder die genomische DNA, die von dem Individuum erhalten wurde, sequenziert werden, um Mutationen zu identifizieren, die charakteristische Fingerabdrücke von Mutationen in dem Polynucleotid oder dem Gen der Erfindung sein können. Die vorliegenden Erfindung umfasst des weiteren Verfahren, in denen ein solcher Fingerabdruck durch RFLPs der DNA oder RNA, die von dem Individuum erhalten wurde, hergestellt werden kann, gegebenenfalls kann die DNA oder RNA vor der Analyse amplifiziert werden, wobei die Verfahren dafür auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. RNA-Fingerabdrücke können zum Beispiel durch die Spaltung einer RNA-Probe, die von einem Individuum erhalten wurde, mit einem geeigneten RNA-Enzym, zum Beispiel RNase T1, RNase T2 oder dergleichen, oder mit einem Ribozym und zum Beispiel durch die elektrophoretische Trennung und dem Nachweis der RNA-Fragmente durchgeführt werden, wie vorstehend beschrieben wurde.
  • Weitere Modifikationen der vorstehend erwähnten Ausführungsform der Erfindung können durch den Fachmann ohne übermäßige Versuche durch diese Beschreibung entwickelt werden, vergl. z.B. die Beispiele. Eine zusätzliche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren, in dem die Bestimmung durch die Verwendung eines Antikörpers der Erfindung oder eines Fragments davon erfolgt. Der Antikörper, der in dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann mit nachweisbaren Markern wie z.B. eine Histidin-Markierung oder einem Biotin-Molekül markiert werden.
  • Hierin wird ebenfalls ein Verfahren für die Diagnose einer Erkrankung, welche die Anwesenheit einer molekularen Variante eines CYP3A5-Gens betrifft, oder einer Anfälligkeit für eine solche Erkrankung offenbart, das die Bestimmung der Anwesenheit eines Polypeptids oder des Antikörpers der Erfindung in einer Probe von einem Individuum umfasst.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das vorstehend beschriebene Verfahren eine PCR, Ligase-Ketten-Reaktion, Restriktionsspaltung, direkte Sequenzierung, Techniken zur Nucleinsäureamplifikation, Hybridisierungstechniken oder Immunassays.
  • Die Techniken sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
  • Des weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren für den Nachweis des Polynucleotids oder des Gens der Erfindung in einer Probe, das die Schritte umfasst:
    • (a) das Inkontaktbringen des festen Trägers, der vorstehend beschrieben wird, mit der Probe unter Bedingungen, die eine Interaktion des Polypeptids der Erfindung mit den immobilisierten Zielen auf einem festen Träger erlauben; und
    • (b) das Bestimmen der Bindung des Polynucleotids oder des Gens an die immobilisierten Ziele auf dem festen Träger.
  • Die Erfindung betrifft des weiteren ein in-vitro-Verfahren für die Diagnose einer Erkrankung, das die Schritte des vorstehend beschriebenen Verfahrens umfasst, in dem die Bindung des Polynucleotids oder des Gens an die immobilisierten Ziele auf dem festen Träger die Anwesenheit oder die Abwesenheit der Erkrankung oder einer Prävalenz für die Erkrankung anzeigt.
  • Die Erfindung betrifft des weiteren eine diagnostische Zusammensetzung, die das Polynucleotid, den Vektor, das Polypeptid oder den Antikörper der Erfindung umfasst.
  • Zusätzlich betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das Polynucleotid, den Vektor, das Polypeptid oder den Antikörper der Erfindung umfasst.
  • Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen, die z.B. den Antikörper umfassen, können in geeigneter Weise auf jedem der Wege, die üblicherweise für die Verabreichung von Arzneistoffen verwendet werden, zum Beispiel oral, topisch, parenteral oder durch Inhalation verabreicht werden. Verträgliche Salze umfassen Acetat, Methylester, HCl, Sulfat, Chlorid und dergleichen. Die Verbindungen können in herkömmlichen Dosierungsformen verabreicht werden, die durch das Kombinieren der Arzneistoffe mit pharmazeutischen Standardträgern gemäß herkömmlicher Verfahren hergestellt werden. Diese Verfahren können das Mischen, Granulieren und Komprimieren oder das Lösen der Inhaltsstoffe beinhalten, wie es für die gewünschte Herstellung geeignet ist. Man wird es zu schätzen wissen, dass die Form und die Art des pharmazeutisch verträglichen Trägers oder Verdünnungsmittels durch die Menge der aktiven Inhaltsstoffe, mit denen es kombiniert wird, den Weg der Verabreichung und durch andere gut bekannte Variablen vorgeschrieben wird. Der/die Träger muss/müssen "verträglich" in der Bedeutung sein, dass er/sie mit den anderen Inhaltsstoffen der Formulierung kompatibel und für den Empfänger nicht schädlich ist/sind. Der verwendete pharmazeutische Träger kann zum Beispiel entweder ein Feststoff oder eine Flüssigkeit sein. Beispiele von festen Trägern sind Lactose, Terra alba, Succharose, Talk, Gelatine, Agar, Pektin, Akazie, Magnesiumstearat, Stearinsäure und dergleichen. Beispiele von flüssigen Trägern sind phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Sirup, Öl wie z.B. Erdnussöl und Olivenöl, Wasser, Emulsionen, verschiedene Arten von Befeuchtungsmittel, sterile Lösungen und dergleichen. Auf ähnliche Weise kann der Träger oder das Verdünnungsmittel ein Verzögerungsmittel, das auf dem Fachgebiet gut bekannt ist, wie z.B. Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat einzeln oder zusammen mit Wachs einschließen.
  • Der Dosierungsplan wird durch den behandelnden Arzt und durch andere klinische Faktoren bestimmt, vorzugsweise gemäß einem der vorstehend beschriebenen Verfahren. Wie auf dem medizinischen Fachgebiet gut bekannt ist, hängt die Dosierung für jeden Patienten von vielen Faktoren ab, einschließlich der Größe des Patienten, des Oberflächengebiets des Körpers, des Alters, der bestimmten Verbindung, die verabreicht werden soll, des Geschlechts, der Zeit und des Wegs der Verabreichung, des allgemeinen Gesundheitszustands und anderer Arzneistoffe, die gleichzeitig verabreicht werden sollen. Der Fortschritt kann durch regelmäßige Bewertungen kontrolliert werden.
  • Des weiteren ist die Verwendung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die Antisense-Oligonucleotide umfassen, die spezifisch an die RNA hybridisieren, welche die mutierten Versionen des Polynucleotids oder des Gens gemäß der Erfindung codieren, oder die Antikörper umfassen, die ein mutiertes Polypeptid der Erfindung, aber nicht oder nicht wesentlich die funktionelle Wildtypform erkennen, in Fällen vorstellbar, in denen die Konzentration der mutierten Form in den Zellen vermindert sein sollte.
  • Dank der vorliegenden Erfindung kann die Auswahl des bestimmten Arzneistoffs, des Dosierungsplans und der entsprechenden Patienten, die behandelt werden sollen, gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt werden. Die Dosierungsempfehlungen werden in der Produktbeschreibung, angezeigt werden, wobei der medikamentenkundigen Fachkraft ermöglicht wird, Anpassungen in der Dosis in Abhängigkeit von der betroffenen Patientengruppe vorherzusagen, mit Informationen, die das Verschreiben des falschen Arzneistoffs an die falschen Patienten in einer falschen Dosis vermeiden.
  • Ein Gen, das ein funktionelles und exprimierbares Polypeptid der Erfindung codiert, kann in die Zellen eingebracht werden, die ihrerseits das Protein von Interesse herstellen. Die Gentherapie, die auf das Einbringen therapeutischer Gene in Zellen durch ex-vivo- oder in-vivo-Techniken basiert, ist eine der wichtigsten Anwendungen des Gentransfers. Geeignete Vektoren und Verfahren für die in-vitro- oder in-vivo-Gentherapie werden in der Literatur beschrieben und sind dem Fachmann bekannt; vergl. z.B. Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ Res 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ Res 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO 94/29469 ; WO 97/00957 oder Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640 und Referenzen, die darin zitiert werden. Das Gen kann für die direkte Einbringung oder für die Einbringung durch Liposomen oder durch virale Vektoren (z.B. Adenovirus, Retrovirus) in die Zelle entwickelt werden. Vorzugsweise ist die Zelle eine Keimzelle, eine Embryonenzelle oder eine Eizelle oder ist davon abgeleitet, am stärksten bevorzugt ist die Zelle eine Stammzelle. Wie es von dem vorstehend beschriebenen offensichtlich ist, wird es bevorzugt, dass bei der Verwendung der Erfindung die Nucleinsäuresequenz mit den regulatorischen Elementen funktionell verbunden ist, was die Expression und/oder das Zielen der Polypeptide der Erfindung auf spezifische Zellen ermöglicht. Geeignete Systeme zur Verabreichung des Gens, die gemäß der Erfindung verwendet werden können, können Liposome, Rezeptor-vermittelte Verabreichungssysteme, nackte DNA und virale Vektoren wie z.B. Herpesviren, Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren unter anderen einschließen. Die Verabreichung von Nucleinsäuren an eine spezifische Stelle des Körpers für die Gentherapie kann ebenfalls unter Verwendung eines biolistischen Verabreichungssystems erreicht werden, wie z.B. das, das von Williams (Proc Natl Acad Sci USA 88 (1991), 2726-2729) beschrieben wurde. Standardverfahren für die Transfektion von Zellen mit rekombinanter DNA sind dem Fachmann im Bereich der Molekularbiologie gut bekannt, vergl. z.B. WO 94/29469 ; vergl. ebenfalls vorstehend. Die Gentherapie kann durch das direkte Verabreichen des rekombinanten DNA-Moleküls oder des Vektors der Erfindung an einem Patienten oder durch das Transfizieren von Zellen mit dem Polynucleotid oder dem Vektor der Erfindung ex vivo und der Infusion der transfizierten Zellen in den Patienten durchgeführt werden.
  • Ein Polynucleotid, das SEQ ID Nr.: 104 umfasst, und ein Polypeptid, dass SEQ ID Nr.: 145 umfasst, wurden schon in Jounaidi et al. (Jounaidi, Biochem Biophys Res Commun 221 (1996), 466-70) beschrieben. Jounaidi et al. haben jedoch nur die entsprechenden Aminosäure- und Nucleotidsequenzen offenbart, ohne eine Andeutung des pharmazeutischen und diagnostischen Wert des Polynucleotids oder Polpeptids, insbesondere für solche Störungen und Erkrankungen, auf die nachfolgend hingewiesen wird, zu machen.
  • In einer anderen Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Polynucleotids, wie hierin für die Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung für die Diagnose einer Erkrankung in einem Individuum definiert wird, das ein Genom besitzt, welches eine Variante des Allels des CYP3A5-Gens umfasst, wobei das Allel ein A an der Position besitzt, die der Position 6986 des CYP3A5-Gens entspricht, wie durch die verknüpften Sequenzen der Zugangsnr. AF280107.1, wobei Position 166220 als + 1 nummeriert wurde und Position 174832 als Position + 8613 nummeriert wurde, und der Zugangsnr. AC005020.2, wobei die Position 27341 als + 8614 nummeriert wurde, definiert wird.
  • Die Definitionen der Ausdrücke, auf die in dieser Beschreibung hingewiesen werden, gelten ebenfalls für die vorstehend erwähnte Verwendung.
  • Der Ausdruck "Individuum" betrifft unter anderem Tiere. Vorzugsweise gehören die Tiere zu den Tierarten, auf die vorstehend hingewiesen wurde. Des weiteren umfasst der Ausdruck "Individuum" Menschen. Die Menschen werden gemäß der Verwendung der vorliegenden Erfindung von allen existierenden ethnischen Gruppen und Untergruppen wie z.B. Kaukasier, Afroamerikaner oder Asiaten ausgewählt. Besonders gut für die Verwendung der Erfindung sind jedoch Afroamerikaner geeignet, für die gezeigt werden konnte, dass die Diagnose einer Erkrankung oder einer Prävalenz für eine Erkrankung auf der Grundlage des Überwachens der Anwesenheit oder Abwesenheit eines CYP3A5-Allels, das an der Position, die der Position 6986 des CYP3A5-Gens (Zugangsnr.: AF280107.1, wobei die Position 166220 als + 1 nummeriert wurde und Position 174832 als Position + 8613 nummeriert wurde, und Zugangsnr.: AC005020.2, wobei Position 27341 als + 8614 nummeriert wurde) ein A besitzt, zu einer falsch positiven Vorhersage für die Expression von CYP3A5 in einer deutlichen Anzahl von Individuen führt. Dieses Allel von CYP3A5 wurde detailliert in Kuehl, 2001, Nature Genetics 27: 383-391 als das CYP3A5*1-Alle) beschrieben. Das CYP3A5*1-Alle) ist durch die Anwesenheit eines A in der Position 22893 der Nucleinsäuresequenz von CYP3A5 gekennzeichnet, auf die in Kuehl Bezug genommen wird, wie vorstehend zitiert wurde. Die allele Frequenz des Allels ist in Afroamerikanern besonders hoch, obwohl es auch in anderen ethnischen Gruppen oder Untergruppen vorkommt. Es wurde jedoch gemäß der vorliegenden Erfindung gefunden, dass die Expression von CYP3A5 für Individuen, für die ein falsch positives Ergebnis in diagnostischen Studien, die auf dem CYP3A5*1-Alle) basieren, erhalten wurde, durch die weitere Diagnose der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Polynucleotids, wie es unter (a) bis (d) gemäß der Verwendung der vorliegenden Erfindung definiert wird, korrekt vorhergesagt werden konnten. Man konnte zeigen, dass ein Polynucleotid, das ein zusätzliches Nucleotid in einer Position besitzt, die der Position 27131/27132 des CYP3A5-Gens entspricht, wie es vorstehend definiert wurde, gemäß dieser Erfindung in etwa 10% der Afroamerikaner anwesend ist, welches zu einer Rasterverschiebungsmutation in Exon 11 führt. Die vorliegende Erfindung stellt die Mittel und Verfahren zur Verfügung, um zwischen dem Haplotyp, der zu einer verbesserten Expression von CYP3A5 führt, welches den/die Polymorphismus/Polymorphismen des CYP3A5*1-Allels umfasst, und dem Haplotyp, der zu einer verminderten Expression führt, wobei in dem Haplotyp, der vorstehend dargelegt wird, zusammen mit dem/den Polymorphismus/Polymorphismen des CYP3A5*1-Allels zusätzlich Polymorphismen isoliert werden, die durch ein Polynucleotid umfasst werden, auf das vorstehend unter (a) bis (d) Bezug genommen wird. Auf der Grundlage der vorstehend erwähnten Verwendung der vorliegenden Erfindung wird daher eine verlässliche Diagnose der CYP3A5-Aktivität eines Individuums erzielt.
  • Die Definitionen der Ausdrücke, auf die in dieser Beschreibung hingewiesen werden, gelten entsprechend für die vorstehend erwähnte Verwendung.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung konnte ebenfalls gezeigt werden, dass der/die Polymorphismus/Polymorphismen, die das CYP3A5*1- und das CYP3A5*6-Allel ausmachen, wie in Kuehl beschrieben wird, vorstehend zitiert, in einer erheblichen Anzahl von Individuen cosegregieren, und daher einen anderen Haplotypen ausmachen, welches zu einer verminderten Expression von CYP3A5 führt. Es wurde gezeigt, dass das CYP3A5*6-Allel zu einem fehlerhaften Spleißen des Exons 7 von CYP3A5, einer Verschiebung des Leserasters und einer vorzeitigen Terminierung an der Position 184 des CYP3A5-Proteins führt. Dementsprechend kann ein falsch positives Ergebnis, das die Expressionsmenge von CYP3A5 in einem Individuum betrifft, in diagnostischen Studien erhalten werden, die auf dem CYP3A5*1-Alle) basieren. Die falsch positiven Ergebnisse können aber jedoch gemäß der Verwendung dieser Erfindung durch die weitere Diagnose der Anwesenheit oder Abwesenheit des/der Polymorphismus/Polymorphismen des CYP3A5*6-Allels vermieden werden. Auf der Grundlage der vorstehend erwähnten Verwendung der vorliegenden Erfindung wird daher eine verlässliche Diagnose der CYP3A5-Aktivität eines Individuums erzielt.
  • Angesichts des vorstehend beschriebenen ist in einer bevorzugten Ausführungsform der vorstehend erwähnten Verwendung das Individuum ein Afroamerikaner.
  • Wie vorstehend diskutiert wurde, ist die Anzahl der Individuen, die falsch positiv diagnostiziert wurden, auf der hohen allelen Frequenz von CYP3A5-Allelen, wie von solchen, die ein Polynucleotid umfassen, das unter (a) bis (d) definiert wurde, das zu einer Rasterverschiebungsmutation führt, oder die durch das CYP3A5*6-Allel umfasst sind, zurückzuführen. Die allele Frequenz ist innerhalb der Gruppe der Afroamerikaner besonders hoch. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass das CYP3A5*6-Allel in etwa 13,3% der Afroamerikaner vorhanden ist. Daher sind die Probleme, die durch eine falsche Vorhersage der CYP3A5-Expression entstehen, in dieser ethnischen Gruppe schwerwiegender als für andere ethnische Gruppen.
  • Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein diagnostisches Kit für den Nachweis eines Polymorphismus, der das Polynucleotid, den Vektor, das Polypeptid, den Antikörper, die Wirtszelle, das transgene nichtmenschliche Tier oder den festen Träger der Erfindung umfasst.
  • Der Kit der Erfindung kann weitere Inhaltsstoffe wie z.B. Selektionsmarkierungen und Komponenten für Selektivmedien, die für die Herstellung von transgenen Zellen oder Tieren geeignet sind, enthalten. Der Kit der Erfindung kann für die Ausführung eines Verfahrens der Erfindung verwendet werden und kann unter anderem in einer Vielfalt von Anwendungen, z.B. in dem diagnostischen Feld oder als Mittel zur Forschung, verwendet werden. Die Teile des Kits der Erfindung können individuell in Ampullen oder als Kombination in geeigneten Behältern oder in Einheiten von Mehrfachbehältern verpackt sein. Die Herstellung des Kits folgt vorzugsweise Standardverfahren, die dem Fachmann bekannt sind. Der Kit kann für Verfahren für den Nachweis der Expression einer mutierten Form der Polypeptide, Gene oder Polynucleotide gemäß einer der vorstehend beschriebenen Verfahren der Erfindung verwendet werden, wobei zum Beispiel Immunoassay-Techniken wie z.B. ein Radioimmunassay oder ein Enzymimmunassay oder vorzugsweise eine Nucleinsäurehybridisierung und/oder Amplifizierungstechniken verwendet werden, wie z.B. solche, die hierin vorstehend und in den Beispielen sowie in pharmakokinetischen Studien beschrieben werden, wenn die transgenen nichtmenschlichen Tiere der Erfindung verwendet werden.
  • Die Figuren stellen die Erfindung dar.
  • 1: A. Western-Blot-Analyse der Expression des CYP3A5-Proteins in Mikrosomen, die aus 6 LE (low expressing, niedrige Expression)-Lebern und von 6 HE (high expressing, hohe Expression)-Lebern von Kaukasiern hergestellt wurden. B. Der relative Beitrag von CYP3A5 und CYP3A4 im kombinierten CYP3A5/CYP3A4-Proteinpool in 17 HE-Lebern, wie durch Western-Blot-Analyse bestimmt wurde.
  • 2: Expressionsmenge und der allele Ursprung der CYP3A5-Transkripte in LE- und HE-Lebern von Kaukasiern. A. TaqMan-Analyse der CYP3A5-mRNA in 8 LE- (niedrige Expression, weiße Balken) und 8 HE- (hohe Expression, graue Balken) Leberproben. B: Sequenzen eines Teils des 3'-UTR von CYP3A5 in Proben, die heterozygot für die Variante ch-v-015 (Tabelle 2A) sind. Matrizen, die für die PCR verwendet wurden, waren genomische DNA (linkes Bild), cDNA von einer LE-Leber (mittleres Bild) und cDNA von einer HE-Leber (rechtes Bild).
  • 3: Allele Frequenzen der genetischen Varianten von CYP3A5 in Kaukasiern. A. In DNA-Proben, die von 8-168 LE-Individuen abgeleitet wurden. B. In DNA-Proben, die von 7-18 HE-Individuen abgeleitet wurden. Die Balken an der Unterkante der Figur deuten schematisch die Lokalisation der Pseudoexons PS2-Exon 1 und 2 und der Exons 1-13 des CYP3A5-Gens an. Die Pfeilspitze markiert die Verdopplungsgrenze (Gellner, Pharmacogenetics 11 (2001), 111-121).
  • 4: Genomische Sequenzen und Peptidsequenzen: die genomischen DNA-Sequenzen, welche die vervielfältigten Regionen enthalten, in denen die Polymorphismen nachgewiesen wurden, und die Polypeptidsequenzen mit den Aminosäuresubstitutionen. Die Nucleotidsequenzen sind in 5'-3'-Orientierung aufgelistet. Die Buchstaben in Kleinschrift zeigen nichtcodierende Sequenzen an, Buchstaben in Großschrift zeigen codierende Sequenzen an. Primerregionen sind unterstrichen. Stellen von Varianten werden eingerahmt gezeigt. Peptidsequenzen werden in dem Ein-Buchstaben-Code gezeigt. || markiert eine Stelle, an der eine Deletion stattgefunden hat. In SEQ ID 198 wird die Hybridisierungsstelle der TaqMan®-Sonde in Fettschrift gezeigt.
  • 5: Die Insertionsregion der CYP3A5-cDNA des Plasmids, das als Startmaterial für die in-vitro-Mutagenese verwendet wurde. Die Clonierungsstellen werden unterstrichen dargestellt. Modifizierte 5'- und 3'-Regionen der CYP3A5-cDNA werden durch Buchstaben in Kleinschrift gezeigt. Die 5'-Modifikation, eine MALLLAVF-Aminosäuresequenz auf Proteinebene, wurde eingebracht, um die Expression in E. coli zu erhöhen (Gilliam, Arch Biochem Biophys 317 (1995), 374-84). Die 3'-Modifikation, ein Hiss-Anhang auf Proteinebene, wurde eingeführt, um die nachfolgende Reinigung zu verbessern. Von dem nicht modifizierten Teil der CYP3A5-Insertion wurde durch Sequenzierung bestätigt, dass es identisch zu der CYP3A5-cDNA ist, die der Zugangsnr.: NM_000777.1 entspricht, welches die zugrundeliegende Nucleotidsequenz für NP_000768.1 ist. Die Stellen, die ch-v-009 und ch-v-001 entsprechen, werden eingerahmt gezeigt.
  • Die Erfindung wird nun durch Bezugnahme auf die nachfolgenden biologischen Beispiele beschrieben, die nur veranschaulichend sind und nicht als eine Begrenzung des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung erstellt sind.
  • Beispiel 1:
  • Isolierung der genomischen DNA aus menschlichem Blut, Herstellung und Reinigung der CYP3A5-Genfragmente
  • Die genomische DNA wurde aus Blut oder aus Leberproben isoliert, wobei Qiagen-Kits zur Isolation von DNA aus Blut und Gewebe verwendet wurden. Die Oligonucleotide, die für die Durchmusterung verwendet wurden, wurden auf der Grundlage der vor kurzem bestimmten Sequenz und Organisation des menschlichen CYP3A-Locus (Gellner, Pharmacogenetics 11 (2001), 111-121) entwickelt. Die Primersequenzen und PCR-Fragmentlängen werden in Tabelle 1A dargestellt. Die amplifizierten Fragmente wurden durch PCR-Reinigungssäulen (Qiagen) prozessiert und in PE ABI 3700 DNA-Analysatoren unter Verwendung der gleichen Primer wie in der PCR sequenziert. Die Sequenzen wurden auf die Anwesenheit von Polymorphismen unter Verwendung der PHRED/PHRAP/POLYPHRED/CONSED-Software-Einheit (University of Washington, Seattle, WA, USA) analysiert.
  • Die Gesamt-RNA wurde von Leberproben unter Verwendung des RNeasy Kits (Qiagen) gemäß der Herstelleranleitungen isoliert, mit der Ausnahme, dass eine zusätzliche DNase I-Spaltung direkt auf der Säule durchgeführt wurde. Die cDNA-Pools wurden von 1 μg Gesamt-RNA hergestellt, wobei Zufalls-Hexamer-Primer und die Superscript Reverse Transcriptase (Life Technologies) verwendet wurden. Die cDNA, die für einen TaqMan-Assay verwendet wurde, wurde von 40 ng Gesamt-RNA abgeleitet. Die Expressionsspiegel der CYP3A5-mRNA wurden durch eine quantitative Real-Time-PCR quantifiziert, wobei das ABI 7700 Sequenz Detection System (PE Biosystems) verwendet wurde. Die Oligonucleotide und Sonden wurden mit dem Primer Express Programm (PE Biosystems) entwickelt. Die Oligonucleotide, die für die quantitative PCR verwendet wurden, waren: vorwärts 5'-TTG TTG GGA AAT GTT TTG TCC TAT C-3' (SEQ ID: 237) und revers 5'-ACA GGG AGT TGA CCT TCA TAC GTT-3' (SEQ ID: 238). Die TaqMan-Sonde (5'-TCA GGG TCT CTG GAA ATT TGA CAC AGA GTG CTA-3'; SEQ ID: 239) wurde mit dem 5'-Reporterfarbstoff 6-Carboxy-fluorescein (FAM) und dem 3'-Quencher 6-Carboxy-tetramethylrhodamin (TAMRA) markiert. Die Experimente wurden gemäß einem Standardprotokoll, das von PE Biosystems entwickelt wurde, durchgeführt. Die Spezifität des Assays für CYP3A5 wurde bestimmt, wobei gleiche Mengen der cDNA-Arten von CYP3A4, CYP3A5, CYP3A7 und CYP3A43, die in vitro exprimiert wurden, verwendet wurden. Die Spezifität der Sonde war 104 mal höher für CYP3A5 als für die CYP3A7-cDNA, wohingegen die CYP3A4- und CYP3A43-cDNAs überhaupt nicht nachweisbar waren. Es wurde bestimmt, dass der lineare Bereich des CYP3A5-Assays zwischen 10 und 106 Zielmolekülen liegt. Die Expressionsspiegel von CYP3A5 wurden normalisiert, wobei die Expression der 18S-mRNA-Arten mit zuvor entwickelten TaqMan-Assays (PE Biosystems) bestimmt wurden.
  • Beispiel 2:
  • Bestimmung von genetischen Variationen innerhalb des CYP3A5-Locus
  • Die Sequenzvielfalt innerhalb des CYP3A5-Locus wurde durch PCR-Amplifikation der genomischen DNA (Fragmentgröße 264-997 bp) und der Sequenzierung jedes PCR-Produkts von 19-217 Proben mit einem kaukasischen Ursprung, 36-45 Proben mit einem afroamerikanischen Ursprung, 34-47 mit einem chinesischen Ursprung, 41-50 Proben mit einem japanischen Ursprung und 31-47 Proben mit einem koreanischen Ursprung bestimmt. Die PCR-Fragmente umfassen die gesamte proteincodierende Region von CYP3A5, einen Teil der 3'-UTR, die gesamte 5'-UTR sowie eine 6203 bp große Sequenz zwischen der Transkriptionsstartstelle von CYP3A5 und einem L1_5'UTR_ORF-Repeat, das stromaufwärts des Gens gelegen ist (3). Zusätzlich haben wir zwei verknüpfte Einzelnucleotid-Polymorphismen (SNPs, ch-v-020, ch-v-021, Tabelle 2 A-E) genotypisiert, die in einer Sequenz lokalisiert sind, die ursprünglich als ein CYP3A5-Promotor beschrieben wurde, von der vor kurzem berichtet wurde, dass sie zusammen mit einer erhöhten Proteinexpression von CYP3A5 cosegregiert (Paulussen, Pharmacogenetics 10 (2000), 415-24). Die Ergebnisse deuten ebenfalls auf eine gemeinsame Cosegregation von beiden Varianten. Unter Verwendung der vor kurzem bestimmten Sequenz des gesamten CYP3A-Locus (Gellner, Pharmacogenetics 11 (2001), 111-121) platzierten wir diese Varianten etwa 20 kb stromaufwärts des ersten Exons von CYP3A5 in einer Sequenz, die 5' zu einem CYP3A Pseudogen gelegen ist (PS2 in 3). Des weiteren haben wir zusätzlich einen Einzelnucleotidpolymorphimus in Intron 3 des CYP3A5-Gens (ch-v-048, Kuehl, 2001, Nature Genetics 27: 383-391) durch einen TaqMan-Assay unter Verwendung der Primer und Sonden, die in Tabelle 1B aufgelistet sind, lokalisiert. Die Analyse wurde in einem Sequence Detection System (PE Biosystems) durchgeführt.
  • Eine Gesamtzahl von 29 Varianten, einschließlich der zwei verknüpften SNPs, die von Paulussen et al. (Paulusen, Pharmacogenetics 10 (2000), 415-24) beschrieben wurden, wurden bei der Durchmusterung der kaukasischen Proben entdeckt und ihre allelen Häufigkeiten wurden auf zwischen 0,3% und 11,9% bestimmt (Tabelle 2A). 6 Varianten sind innerhalb der 6 kb großen Sequenz lokalisiert, die stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle von CYP3A5 gelegen ist. 14 Varianten sind in den Introns lokalisiert oder in der 5'-UTR oder 3'-UTR, wohingegen 4 in der proteincodierenden Sequenz gefunden wurden. Von den letzten führen 3 Varianten in Aminosäuresubstitutionen und eine in eine vorzeitige Terminierung des CYP3A5-Proteins (Tabelle 2A). Die g.7303C>A-Variante (ch-v-009, Tabelle 2A) führt zu einem S100Y-Aminosäureaustausch in Exon 4. Die g.3705C>T-Variante (ch-v-005) führt zu einem H30Y-Aminosäureaustausch in Exon 2. Die Clonierung und Sequenzierung zeigte eine physikalische Verbindung dieser Variante zu der g.3709-3710insG-Variante (ch-v-006). Die letzte Variante führt zu einer Verschiebung des offenen Leserahmens, welches zu einer Verkürzung der Proteinsequenz an Position 34 (K34) führt. Die T398N-Variante (ch-v-001, Tabelle 2A), die ursprünglich von Jounaidi (Jounaidi, Biochem Biophys Res Commun 221 (1996), 466-70) beschrieben wurde, wurde in 3 von 80 getesteten Individuen gefunden.
  • Keine der vier proteinverändernden Varianten, die in Proben von Kaukasiern gefunden wurden, wurden in den Proben von Afroamerikanern, Chinesen, Japanern oder Koreanern gefunden (Tabelle 2 A-E). Unter anderen haben wir jedoch 4 neue Varianten in diesen Proben gefunden, die zu einer veränderten Aminosäuresequenz von CYP3A5 führten (ch-v-017, ch-v-043, ch-v-045, ch-v-068, Tabelle 2 B-E). Die g.27131-27132insT-Variante (ch-v-017) in Exon 11 (ch-v-017, Tabelle 2B, 2D) wurde in 9 von 45 afroamerikanischen Proben und in einer von 50 japanischen Proben gefunden. Die Variante führt zu einer Verschiebung des offenen Leserahmens, welches zu einer Verkürzung des Proteinsequenz bei Position 348 (D348) führt. Die Varianten ch-v-043, ch-v045 und ch-v-068 führen zu Aminosäureaustauschen.
  • Beispiel 3:
  • Identifizierung der genetischen Determinanten der CYP3A5-Proteinexpression
  • Im Folgendem wurden die Frequenzen der kaukasischen CYP3A5-Genvarianten als eine Funktion der CYP3A5-Proteinexpression analysiert. Zu diesem Zweck wurden die allelen Häufigkeiten der Varianten, die in Tabelle 2A gezeigt werden, getrennt für HE- und LE-Leber berechnet (3). Die Frequenzen der 9 Varianten (ch-v-020, ch-v-021, ch-v-026, ch-v-034, ch-v-007, ch-v-008, ch-v-011, ch-v-014 und ch-v-015) waren in HE-Lebern deutlich erhöht (alle X2 > 13,3, df = 1, p < 0,01, nach Bonferroni korrigiert). Außer einer waren alle getesteten HE-Lebern (17/18, 94%) heterozygot für drei Varianten (ch-v-021, ch-v-026 und ch-v-015). 16 von diesen Proben waren ebenfalls heterozygot für ch-v-020. Eine HE-Probe konnte für diese Variante nicht genotypisiert werden. Im Gegensatz hierzu waren die LE-Lebern entweder Wildtyp (155/168, 92,3%), heterozygot für die Varianten ch-v-021 und ch-v-026 (9/168, 5,4%) oder nur heterozygot für die Variante ch-v-015 (4/168, 2,4%). In den LE-Lebern kamen jedoch niemals alle drei Varianten gleichzeitig vor (Tabelle 3). Diese Ergebnisse definierten jeden dieser drei Varianten als einen nützlichen aber unvollkommenden Marker der erhöhten CYP3A5-Expression. Die Varianten ch-v-034, ch-v-008, ch-v-011 und ch-v-014 traten nur in einer Untergruppe der Proben heterozygot für die vorstehenden drei Varianten (ch-v-021, ch-v-026 und ch-v-015) auf.
  • Die Verteilung der Varianten ch-v-021, ch-v-026 und ch-v-015 in den durchmusterten Proben, weisen deutlich darauf hin, dass sie einen Haplotypen begründen. Im Folgendem wurde die Hypothese getestet, ob diese drei Varianten unabhängig rekombinieren oder nicht. Unter der Annahme ihrer unabhängigen Vererbung wurden die erwarteten Häufigkeiten des 3-Loci-Genotyps für alle Kombinationen der Varianten berechnet und mit den beobachteten Häufigkeiten verglichen. Der Unterschied ist hoch signifikant (x2 = 93,6; Klassen 'nur Wildtyp', 'einzelne Variante, hetero- oder homozygot', 'zwei oder drei Varianten, hetero- oder homozygot', df = 1; p >> 0,001). Es gab mehr Individuen mit zwei oder drei der Varianten als erwartet und weniger Individuen mit nur einer dieser Varianten. Dieses Ergebnis deutet darauf, dass eine Verknüpfung zwischen den drei Varianten besteht. Der Grad der Verknüpfung mit der Verknüpfung des Ungleichgewichtsparameters D für die drei Paare der Varianten wurde bestimmt. Unter Verwendung der maximalen Wahrscheinlichkeit für Haplotyphäufigkeiten wurde D auf 0,041 für die Variantenpaare ch-v-021/ch-v-015 und ch-v-026/ch-v-015 berechnet, welches 80% des theoretischen Maximums ist, und 0,065 für die Varianten ch-v-021 und ch-v-026, welches dem 100% theoretischem Maximum entspricht.
  • Die Wahrscheinlichkeit, dass Individuen, welche die jeweilige Variante des Genotyps zeigen, HE sind (positiver vorhersagender Wert), wird auf 65% für die Variante ch-v-021 beziehungsweise ch-v-026 und auf 81% für die Variante ch-v-015 bestimmt. Für die Kombination von allen drei Varianten beträgt der positive vorhersagende Wert 100% in unserer Probengruppe. Unter der Annahme, dass diese Varianten für eine erhöhte Proteinexpression in cis lokalisiert sein müssen, ist es jedoch eindeutig, dass es eine geringfügige Wahrscheinlichkeit für Individuen, die alle drei Varianten zeigen, gibt, dass sie LE sind. Die Ergebnisse zeigen, dass mindestens das Allel ch-v-021/ch-v-026 und das Allel ch-v-015 tatsächlich existieren (vergl. Genotyp 2 und 3, Tabelle 3) und daher muss die Existenz eines Genotyps mit einer Kombination dieser beiden Allele postuliert werden. Die Abschätzung der maximalen Wahrscheinlichkeit für die Frequenz dieser 3fachen Heterozygoten, die nicht alle drei Varianten in cis haben, beträgt 0,05% für alle durchmusterten Proben oder 0,61% der Proben, die heterozygot oder homozygot für alle drei Varianten sind. Mit anderen Worten, von 100 durchmusterten Kaukasiern werden statistisch etwa 9 von ihnen hetero- oder homozygot für alle drei Varianten sein und etwa 0,05 von diesen werden nicht alle drei Varianten in cis besitzen. Daher kann man erwarten, dass die positive vorhersagende Kraft des 3-Varianten-Genotyps etwa 99,5% beträgt. Die gleichen Werte würden natürlich für eine Kombination von nur zwei Varianten, entweder ch-v-021/ch-v-015 oder ch-v-026/ch-v-015, erzielt werden.
  • In einer einzelnen HE-Leber konnte keine der vorstehenden 9 Varianten nachgewiesen werden, die in den anderen 17 HE-Lebern gefunden wurden. Eine nähere Untersuchung der Varianten, die in dieser Probe gefunden wurden, zeigte eine Variante innerhalb des Introns 4 (ch-v-018) beziehungsweise eine innerhalb des Introns 5 (ch-v-019). Diese Varianten waren einzigartig in dieser Probe, da sie nicht in eine der anderen durchmusterten Proben gefunden wurden. Sie wurden auch nicht in eine der anderen ethnischen Gruppen, die durchmustert wurden, gefunden. Es muss sich noch zeigen, ob diese Varianten selber ursächlich für die Aktivierung der Transkription sind oder ob sie mit einer anderen, noch nicht nachgewiesenen Variante verknüpft sind.
  • Beispiel 4:
  • Bestimmung der Proteinexpression von CYP3A5
  • Die Proteinexpression von CYP3A4 und CYP3A5 in Leberproben von Kaukasiern wurde durch Western-Blot-Analysen unter Verwendung von CYP3A4- und CYP4A5-spezifischen Antikörpern (Gentest) bestimmt. Lebermikrosome wurden hergestellt, wie zuvor beschrieben wurde (langer, Biochemistry 27 (1988), 5447-54). Um ein Homogenat des Gesamtproteins zu erhalten, wurde gepulvertes Lebergewebe in 0,1 M Tris-Cl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM Pefa Bloc SC, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Pepstatin mit einem Potter-Elvehjem-Homogenisator (Glas/Teflon) für 2 min bei 1000 UpM homogenisiert. Die Homogenate wurden anschließend mit Ultraschall mit einem Bandelin Sonoplus HD 200 behandelt und bei –80°C gelagert. Für die Western-Blot-Analysen wurden 12,5 μg mikrosomales Proteinhomogenat oder 40 μg Gesamt-Proteinhomogenat in einem 10% SDS-Polyacrylamidgel getrennt. Der elektrophoretische Transfer auf die PVDF-Membranen wurde in einer TankBlot-Zelle (BioRad) für 1,5 Stunden bei einer konstanten Spannung (100 V) bei 10°C durchgeführt. Nach dem Transfer wurden die Membranen für 60 min in 5% Milch, TBS, 0,1% Tween 20 inkubiert, um die unspezifische Antiköroperbindung zu vermindern. Die Inkubationen mit dem jeweiligen primären Antikörper (Gentest, Verdünnung 1:500) wurden in 1% Milch, TBS, 0,1% Tween 20 für 60 min durchgeführt, solche mit dem sekundären Antikörper (Anti-Kaninchen-IgG-POD-Fab-Fragmente, Dianova, Verdünnung 1:10000) in der gleichen Lösung für 30 min. Die Proteinbanden von CYP3A4 und CYP3A5 wurden mit Supersignal Dura (Pierce) und einer digitalen CCD-Kamera (LAS-1000, Fuji) nachgewiesen. Die Quantifizierung des Signals wurde mit AIDA (Ragtest) durchgeführt. Die Proteinexpressionsspiegel wurden auf der Grundlage von Kalibrierungskurven, die mit Mikrosomen erhalten wurden, die rekombinantes CYP3A4- und CYP3A5-Protein exprimieren (Gentest), berechnet.
  • Die Homogenate oder mikrosomalen Fraktionen wurden von 186 menschlichen Lebern hergestellt und durch Western-Blot-Analysen unter Verwendung eines CYP3A5-spezifischen Antikörpers untersucht. Das CYP3A5-Protein wurde in allen untersuchten Proben nachgewiesen und seine Expression zeigte eine deutliche Bimodalität (1A). 168 Lebern (~ 90%), des weiteren als LE (low-expressing, niedrige Expression) bezeichnet, zeigten eine Expression, die nahe an oder unter der unteren Grenze der Quantifizierung (LLOQ) des Assays lagen (0,3 pmol/mg Homogenatprotein und 1,0 pmol/mg mikrosomales Protein). 18 Proben (~ 10%), des weiteren als HE (high-expressing, hohe Expression) bezeichnet, zeigten sehr viel höhere Spiegel der CYP3A5-Expression. Die Expression lag in einem Bereich zwischen 1,6 und 2,9 pmol/mg Homogenatprotein (2,3 ± 0,5; n = 6) und zwischen 3,9 und 15,5 pmol/mg mikrosomales Protein (9,7 ± 4,1; n = 12). Wenn man den LLOQ des Assays als den Expressionsspiegel von CYP3A5 in LE-Lebern in Betracht zieht, exprimieren HE-Lebern im Durchschnitt 8 bis 10 mal mehr CYP3A5-Protein als LE-Lebern.
  • Im Folgendem wurde der Beitrag von CYP3A5 bei der kombinierten Proteinexpression von CYP3A5 und CYP3A4 in HE-Lebern untersucht. Die CYP3A4-Expression in diesen Lebern lag zwischen 0,9 und 82,6 pmol/mg Homogenatprotein (n = 6) und zwischen 4,5 und 295 pmol/mg mikrosomales Protein (n = 11). Die Mengen und der Bereich der CYP3A4-Varabilität in HE-Lebern war ähnlich zu solchen in LE-Lebern (nicht gezeigt). 1B zeigt den CYP3A5-Anteil in dem kombinierten Proteinpool von CYP3A5 und CYP3A4 in 17 HE-Lebern. Der Beitrag von CYP3A5 variiert zwischen 3% und 74%. In einer durchschnittlichen HE-Leber beträgt der Anteil von CYP3A5 in dem kombinierten Pool von beiden Proteinen 24%. Wenn man den LLOQ des CYP3A5-Assays als die tatsächliche Expressionsmenge des Proteins in LE-Lebern in Betracht zieht, beträgt der entsprechende Wert in diesen Lebern etwa 1,6%.
  • Beispiel 5:
  • Bestimmung der mRNA-Expression von CYP3A5
  • Die Expression von CYP3A5-mRNA in 8 kaukasischen HE- und 8 LE-Lebern wurde unter Verwendung einer CYP3A5 spezifischen TaqMan-Sonde untersucht. Wie in 2A dargestellt wird, zeigte die Verteilung der mRNA-Spiegel von CYP3A5 eine Bimodalität, die in vollständiger Übereinstimmung mit der beobachteten Expression des CYP3A5-Proteins war (Fisher's exact Test, p = << 0,001). Die Anzahl der 3A5-Transkripte pro ng der Gesamt-RNA in HE-Lebern (n = 8) war im Durchschnitt 8,5 mal höher als solche in LE-Lebern (n = 8).
  • Im Folgendem wurde der allele Ursprung der CYP3A5-Transkripte in HE- und LE-Lebern untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein Teil der 3'-UTR (untranslatierten Region) des Gens durch PCR amplifiziert und unter Verwendung genomischer oder cDNA-Proben als Matrizen, die heterozygot für eine T>C-Variante waren, die in dieser Region lokalisiert ist (Variante ch-v-015 in Tabelle 2A), sequenziert. Wie erwartet werden beide Allele in der Sequenz repräsentiert, wobei die genomischen DNAs als Matrize verwendet wurden (2B). Beide Allele waren ebenfalls in einer Sequenz einer PCR amplifizierten cDNA von einer LE-Leber gleichmäßig repräsentiert (homozygote Wildtyp für ch-v-021 und ch-v-026, heterozygot für ch-v-015). Im Gegensatz dazu wurde nur das C-Allel in dem gleichen Anteil der cDNA der 3'-UTR von CYP3A5 aus einer HE-Leber gefunden. Dieses deutet auf eine Überrepräsentation der Transkripte, die von dem Chromosom abgeleitet sind, welches das C-Allel trägt, in dem gesamten Pool der CYP3A5-Transkripte in HE-Lebern hin.
  • Beispiel 6:
  • In-vitro-Mutagenese und Expression des rekombinanten CYP3A5-Proteins
  • Fünf Polymorphismen in Kaukasiern wurde nachgewiesen, die zu Veränderungen in der Proteinsequenz führten. Zwei von diesen, ch-v-006 und ch-v-017, führen zu einer Verkürzung des Proteins und es ist daher unwahrscheinlich, dass sie ein funktionelles Protein codieren. Da man zeigen konnte, dass ch-v-005 nur physikalisch an ch-v-006 verknüpft ist, ist es ebenfalls nicht wahrscheinlich, dass die so erhaltene Proteinvariante funktionell ist. Um die Wirkung der Proteinvarianten ch-v-009 und ch-v-001 zu bestimmen, wurden diese Varianten in einem heterologen bakteriellen Expressionssystem untersucht.
  • Es wurde eine modifizierte CYP3A5-cDNA in dem prokaryontischen Expressionsvektor pKK233-2 (Pharmacia) als Ausgangsmaterial für die in-vitro-Mutagenese verwendet (5). Die Varianten ch-v-009 oder beziehungsweise ch-v-001 wurden in das Plasmid durch die in-vitro-Mutagenese eingeführt, wobei das QuickChange Mutagenesis Kit (Stratagene) verwendet wurde. Die erfolgreiche Einführung der Mutationen und das Fehlen von anderen, unerwünschten Mutationen wurde durch Sequenzierung bestätigt. Das ursprüngliche Plasmid sowie die zwei mutagenisierten Plasmide wurden verwendet, um E. coli TOPP3-Zellen zu transformieren, einen Stamm, in dem zuvor eine optimale Expression der CYP3A-Proteine erhalten wurde. Eine Gesamtzahl von 8 einzelnen Kolonien von jedem mutierten Plasmid wurde für Expressionsstudien ausgewählt. Man ließ die Bakterien wachsen und induzierte sie, wie in Eiselt et al. (Eiselt, Pharmacogenetics 11 (2001), 447-58) beschrieben wurde. Die Expression wurde 48 h und 72 h nach der Induktion mit IPTG/δ-ALA analysiert. Die Zellen wurden geerntet, wie in Domanski et al. (Domanski, Arch Biochem Biophys 350 (1998), 223-32) beschrieben wurde. Der endgültige P450-Gehalt wurde durch verminderte Differenzspektren von Kohlenmonoxid (CO) bestimmt (Omura, J Biol Chem 239 (1964), 2370-2378).
  • Während 30 bis 50 nmol solubilisiertes CYP3A5 pro Liter Kultur des nicht mutagenisierten CYP3A5 gewonnen werden konnte, wurde die Expression in den zwei CYP3A5-Varianten S100Y und T398N auf niedriger als 3 nmol P450 Protein pro Liter Kultur bestimmt. Häufig war der "P450"-Höchstwert von einem erwarteten typischen 448-450 nm-Höchstwert eher auf 454-458 nm verschoben. Der niedrige Spiegel der Expression in den mutagenisierten Kolonien machte jeden Versuch der Proteinreinigung aussichtslos. Frühere Experimente deuteten darauf, dass die Expressionsspiegel, die so niedrig wie solche sind, die durch diese CYP3A5-Varianten gezeigt wurden, nicht deutlich durch die Verwendung anderer bakterieller Stämme oder dem Einstellen der Wachstumstemperatur verbessert werden konnten. Daher deuten die Ergebnisse deutlich darauf, dass die CYP3A5-Proteinvarianten, welche die S100Y- oder die T398N-Substitutionen umfassen, in einem Expressionssystem von E. coli unstabil sind, und dass die Varianten, die ch-v-009 oder ch-v-001 umfassen, nicht für funktionelle Proteine codieren. Das Ergebnis der negativen Expression für die Variante ch-v-001 (T398N) ist in Übereinstimmung mit der Studie, in der dieser Polymorphismus ursprünglich in zwei von fünf Individuen mit CYP3A5-Mangel nachgewiesen wurden (Jounaidi, Biochem Biophys Res Commun 221 (1996), 466-70).
  • Beispiel 7:
  • Vorhersage des erwarteten Metabolismus von Arzneistoffen durch CYP3A5-Genotypen
  • Das CYP3A5-Protein baut viele Arzneistoffe durch Oxidation ab, so dass sie nicht länger therapeutisch aktiv sind. Daher können Arzneistoffe, die CYP3A5-Substrate sind, therapeutische aktive Plasmakonzentrationen nicht für eine adäquate Zeitspanne in Patienten mit einer verstärkten CYP3A5-Aktivität erreichen. In diesen Patienten müssen diese Arzneistoffe höher dosiert werden. Andererseits müssen diese Arzneistoffe in Patienten mit einer verminderten CYP3A5-Aktivität in niedrigeren Dosen verabreicht werden, um toxische Arzneistoffspiegel zu vermeiden. Tabelle 4 zeigt eine Zuordnung für CYP3A5-Genotypen und empfohlenen Dosierungen.
  • In den Fällen, in denen der CYP3A5-Metabolismus zu der Erzeugung von pharmazeutisch aktiven Substanzen führt, muss der verstärkten enzymatischen Aktivität durch eine verminderte Dosierung entgegengewirkt werden, wohingegen eine verminderte Aktivität von CYP3A5 durch eine erhöhte Dosierung ausgeglichen werden muss. Tabelle 1A: Verwendete Primer für die Durchmusterung nach Polymorphismen innerhalb der stromaufwärts gelegenen Regionen von CYP3A5 und des CYP3A5-Gens
    Figure 00550001
    • Ref: Referenzsequenz. Die Positionen der Primer betreffen die GenBank-Sequenzen mit den Zugangsnummern (1) AF280107.1 und (2) AC005020.2.
    Tabelle 1B: Verwendete Primer (SEQ ID 202 und 203) und Sonden (SEQ ID 204 und 205) bestimmen den Nucleotidstatus an der polymorphen Stelle ch-v-048 (g.6986G>A) durch einen TaqMan-Assay.
    Figure 00560001
    • Ref: Referenzsequenz. Die Positionen der Primer betreffen die GenBank-Sequenz mit den Zugangsnummern AF280107.1. Die Sonden sind mit einem fluoreszierenden Farbstoff an dem 5'-Ende markiert und sind mit einem dunklen Quencher (DQ) und unter Verwendung eines Minor-Groove-Binder (MGB) markiert.
    Figure 00570001
    Figure 00580001
    Figure 00590001
    Figure 00600001
    Figure 00610001
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    Figure 00630001
    Tabelle 3: CYP3A5-Genotypen und -Phänotypen
    ch-v-021 ch-v-026 ch-v-015 Phänotyp Leber
    Genotyp 1 A/A A/A T/T LE 155
    Genotyp 2 A/G A/G T/T LE 9
    Genotyp 3 A/A A/A T/C LE 4
    Genotyp 4 A/G A/G T/C HE 17
    Genotyp 5 A/A A/A T/T HE 1
  • Alle drei Varianten wurden nur in dem heterozygoten Status beobachtet. HE = Leber mit starker Expression, LE = Leber mit schwacher Expression. Zahlen verweisen auf LE- und HE-Lebern mit dem bestimmten Genotyp. Die erhöhte Expression von CYP3A5 cosegregiert zusammen mit einem bestimmten Genotyp. Tabelle 4: Erwarteter Metabolismus von Arzneistoffen durch CYP3A5
    Genotyp Nr. Allele Kombination Enzymaktivität Einstellung der Dosis
    Abbau der Arzneistoffe Aktivierung der Arzneistoffe
    I Allel für hoch exprimierend / Allel für hoch exprimierend 190% 1.90 0.53
    II, III Allel für schwach exprimierend / Allel für hoch exprimierend 100% 1.00 1.00
    IV-VII Null-Allel / Allel für hoch exprimierend 95% 0.95 1.05
    VIII, IX, X Allel für schwach exprimierend / Allel für schwach exprimierend 10% 0.10 10
    XI-XVIII Null-Allel / Allel für schwach exprimierend 5% 0.05 20
    XIX-XXV Null-Allel / Null-Allel 0% < 0.05 > 20
    Genotyp Nr. Genotyp/Seq ID) bei Locus 1 - 2 - 3 - 4 - 5 - 6 - 7 - 8 Enzymaktivität Einstellung der Dosis
    Abbau der Arzneistoffe Aktivierung der Arzneistoffe
    I 060-062-079-081-087-111-103-108 / 060-062-079-081-087-111-103-108 190% 1.90 0.53
    II 0xx-06x-079-081-087-111-103-107 / 060-062-079-081-087-111-103-108 100% 1.00 1.00
    III 059-061-079-081-087-111-103-10x / 060-062-079-081-087-111-103-108 100% 1.00 1.00
    IV 0xx-06x-080-082-08x-11x-10x-10x / 060-062-079-081-087-111-103-108 95% 0.95 1.05
    V 0xx-06x-0xx-08x-088-11x-10x-10x / 060-062-079-081-087-111-103-108 95% 0.95 1.05
    VI 0xx-06x-0xx-08x-08x-112-10x-10x / 060-062-079-081-087-111-103-108 95% 0.95 1.05
    VII 0xx-06x-0xx-08x-08x-11x-104-10x / 060-062-079-081-087-111-103-108 95% 0.95 1.05
    VIII 060-062-079-081-087-111-103-107 / 059-061-079-081-087-111-103-108 10% 0.10 10
    IX 0xx-06x-079-081-087-111-103-107 / 0xx-06x-079-081-087-111-103-107 10% 0.10 10
    X 059-061-079-081-087-111-103-10x / 059-061-079-081-087-111-103-10x 10% 0.10 10
    XI 059-061-079-081-087-111-103-10x / 0xx-06x-080-082-08x-11x-10x-10x 5% 0.05 20
    XII 0xx-06x-079-081-087-111-103-107 / 0xx-06x-080-082-08x-11x-10x-10x 5% 0.05 20
    XIII 059-061-079-081-087-111-103-10x / 0xx-06x-0xx-08x-088-11x-10x-10x 5% 0.05 20
    XIV 0xx-06x-079-081-087-111-103-107 / 0xx-06x-0xx-08x-088-11x-10x-10x 5% 0.05 20
    XV 059-061-079-081-087-111-103-10x / 0xx-06x-0xx-08x-08x-112-10x-10x 5% 0.05 20
    XVI 0xx-06x-079-081-087-111-103-107 / 0xx-06x-0xx-08x-08x-112-10x-10x 5% 0.05 20
    XVII 059-061-079-081-087-111-103-10x / 0xx-06x-0xx-08x-08x-11x-104-10x 5% 0.05 20
    XVIII 0xx-06x-079-081-087-111-103-107 / 0xx-06x-0xx-08x-08x-11x-104-10x 5% 0.05 20
    XIX 0xx-06x-080-082-08x-11x-10x-10x / 0xx-06x-0xx-08x-088-11x-10x-10x 0% < 0.05 > 20
    XX 0xx-06x-080-082-08x-11x-10x-10x / 0xx-06x-0xx-08x-08x-112-10x-10x 0% < 0.05 > 20
    XXI 0xx-06x-080-082-08x-11x-10x-10x / 0xx-06x-0xx-08x-08x-11x-104-10x 0% < 0.05 > 20
    XXII 0xx-06x-080-082-08x-11x-10x-10x / 0xx-06x-080-082-08x-11x-10x-10x 0% < 0.05 > 20
    XXIII 0xx-06x-0xx-08x-088-11x-10x-10x / 0xx-06x-0xx-08x-088-11x-10x-10x 0% < 0.05 > 20
    XXIV 0xx-06x-0xx-08x-08x-112-10x-10x / 0xx-06x-0xx-08x-08x-112-10x-10x 0% < 0.05 > 20
    XXV 0xx-06x-0xx-08x-08x-11x-104-10x / 0xx-06x-0xx-08x-08x-11x-104-10x 0% < 0.05 > 20
    • Nr.: laufende Genotypnummer.
    • Genotyp: Mögliche CYP3A5-Genotypen, die von Kombinationen von Allelen stammen. Die obere Tabelle enthält die Allelnamen, die verwendet wurden, um das Prinzip anzuzeigen. Die untere Tabelle listet die Allele detaillierter auf, wobei alle Kombinationen der Varianten an den 8 Loci in den zwei homologen Chromosomen angegeben werden (Loci 1-8 beziehen sich auf die Positionen, welche den Positionen -20291, -6177, 3705, 3709/3710, 7303, 27131/27132, 27289 beziehungsweise 31611 des CYP3A5-Gens (Zugangsnr.: AF280107.1, wobei Position 166220 als + 1 nummeriert worden ist und Position 174832 als + 8613 nummeriert worden ist)). Jede Variante wird durch eine 3-stellige SEQ ID definiert, wie in Tabelle 2 A-E aufgelistet wird. Ein Platzhalter (x) in den SEQ IDs weist darauf hin, dass der Phänotyp unabhängig von der Variante an diesem Locus in diesem Chromosom ist. Die möglichen Varianten für jeden Locus, der für ein X substituiert werden kann, können von Tabelle 2 A-E erhalten werden. Zum Beispiel steht 08x in Locus 4 für die SEQ IDs 081 oder 082, wohingegen 08x in Locus 5 entweder auf SEQ ID 087 oder 088 hinweist.
    • Enzymaktivität: Die Enzymaktivität, wie sie von der Proteinkonzentration berechnet wurde, wobei die durchschnittliche Proteinkonzentration von Genotyp 059-061-079-081-111-107/060-062-079-081-111-108 als 100% definiert wurde. Einstellung der Dosis: Die Faktoren der Einstellung der Dosis für Arzneistoffe, die durch CYP3A5 abgebaut/aktiviert werden, relativ zu der Dosis, die für den Genotyp 059-061-079-081-111-107/060-062-079-081-111-108 benötigt wird. Die Faktoren müssen möglicherweise gemäß des Anteils der Aktivität des CYP3A5-Enyzms für Arzneistoffe gewichtet werden, die nicht ausschließlich durch CYP3A5 metabolisiert werden.
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00670001
  • Figure 00680001
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Claims (28)

  1. Polynucleotid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polynucleotid, das unter stringenten Bedingungen mit einem CYP3A5-Gen hybridisiert und die Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 112 hat; (b) einem Polynucleotid, das unter stringenten Bedingungen mit einem CYP3A5-Gen hybridisiert und ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 141 hat; und (c) einem Polynucleotid, das unter stringenten Bedingungen mit einem Teil eines CYP3A5-Gens hybridisiert, das die SEQ ID NO: 111 umfasst, wobei das Polynucleotid ein zusätzliches Nucleotid an einer Position hat, die der Position 27131/27132 des CYP3A5-Gens entspricht, das definiert ist durch die verknüpften Sequenzen von Zugangsnr. AF280107.1, wobei Position 166220 als + 1 nummeriert worden ist und Position 174832 als + 8613 nummeriert worden ist, und Zugangsnr. AC005020.2, wobei Position 27341 als + 8614 nummeriert worden ist.
  2. Polynucleotid nach Anspruch 1, das DNA oder RNA ist.
  3. Vektor, der ein Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2 umfasst.
  4. Vektor nach Anspruch 3, wobei das Polynucleotid funktionell mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden ist, die Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder isolierten Fraktionen davon erlaubt.
  5. Wirtszelle, die mit dem Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2 oder dem Vektor nach Anspruch 3 oder 4 genetisch verändert ist.
  6. Verfahren zur Herstellung einer molekularen Variante des CYP3A5-Polypeptids, umfassend (a) das Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 5; und (b) das Ernten des Proteins aus der Kultur.
  7. Verfahren zur Herstellung von Zellen, die eine molekulare Variante des CYP3A5-Polypeptids exprimieren können, umfassend das genetische Verändern der Zellen mit dem Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2 oder dem Vektor nach Anspruch 3 oder 4.
  8. Polypeptid, das von dem Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2 codiert wird, oder erhältlich ist durch das Verfahren nach Anspruch 6 von den Zellen, die gemäß dem Verfahren nach Anspruch 7 hergestellt wurden.
  9. Antikörper, der spezifisch an das Polypeptid nach Anspruch 8 bindet.
  10. Antikörper nach Anspruch 9, der monoclonal oder polyclonal ist.
  11. Transgenes nicht-menschliches Tier, umfassend zumindest ein Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2 oder den Vektor nach Anspruch 3 oder 4.
  12. Transgenes nicht-menschliches Tier nach Anspruch 11, das eine Maus, Ratte oder ein Zebrafisch ist.
  13. Fester Träger, umfassend ein/einen/eine oder eine Vielzahl der Polynucleotide nach Anspruch 1 oder 2, der Vektoren nach Anspruch 3 oder 4, der Polypeptide nach Anspruch 8, der Antikörper nach Anspruch 9 oder der Wirtszellen nach Anspruch 5, in immobilisierter Form.
  14. Fester Träger nach Anspruch 13, wobei der feste Träger eine Membran, ein Glas-, Polypropylen- oder ein Silikonchip ist, Oligonucleotid-konjugierte Kügelchen sind oder ein Kügelchenarray, der auf einem optischen Filtersubstrat angeordnet ist.
  15. In vitro-Verfahren zum Auffinden eines Polymorphismus, umfassend das Auffinden eines Polymorphismus durch Vergleichen der Nucleinsäuresequenz eines Polynucleotids nach Anspruch 1 oder 2, erhalten von einer Untergruppe von Individuen, wobei die Untergruppe keine Prävalenz für Krebs hat, mit der Nucleinsäuresequenz eines Polynucleotids nach Anspruch 1 oder 2 erhalten von einer Vielzahl von Untergruppen von Individuen, wobei zumindest eine oder mehrere weitere Untergruppe(n) eine Prävalenz für Krebs hat/haben.
  16. Verfahren zum Auffinden und Erhalten einer Arzneistoffvorstufe oder eines Arzneistoffs, die/der die Aktivität einer molekularen Variante eines CYP3A5-Polypeptids modulieren kann, umfassend (a) das Inkontaktbringen des Polypeptids nach Anspruch 8, des festen Trägers nach Anspruch 13 oder 14, einer Zelle, die eine molekulare Variante eines Gens exprimiert, das ein Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2 umfasst, oder des Vektors nach Anspruch 3 oder 4 in der Anwesenheit von Stoffen, die ein nachweisbares Signal als Antwort auf die Arzneistoffaktivität liefern können, mit einer Verbindung, die auf Arzneistoffvorstufen- oder Arzneistoffaktivität zu durchmustern ist; und (b) das Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Signals oder der Zunahme oder Abnahme eines Signals, das von der Arzneistoffvorstufen- oder der Arzneistoffaktivität erzeugt wurde, wobei die Abwesenheit, Anwesenheit, Zunahme oder Abnahme des Signals auf eine mögliche Arzneistoffvorstufe oder einen Arzneistoff hinweist.
  17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Zelle eine Zelle nach Anspruch 6 ist, erhalten durch das Verfahren nach Anspruch 7, oder von dem transgenen nicht-menschlichen Tier nach Anspruch 11 oder 12 erhalten werden kann.
  18. Verfahren zum Auffinden und Erhalten einer Arzneistoffvorstufe oder eines Arzneistoffs, die/der die Aktivität einer molekularen Variante eines CYP3A5-Polypeptids modulieren kann, umfassend die Schritte (a) des Inkontaktbringens der Wirtszelle nach Anspruch 5, der Zelle erhalten durch das Verfahren nach Anspruch 7, des Polypeptids nach Anspruch 8 oder des festen Trägers nach Anspruch 13 oder 14 mit einem ersten Molekül, von dem bekannt ist, dass es von einem CYP3A5-Polypeptid gebunden wird, um einen ersten Komplex zwischen dem Polypeptid und dem ersten Molekül zu bilden; (b) des Inkontaktbringens mit einer zu durchmusternden Verbindung; und (c) des Messens, ob die Verbindung das erste Molekül aus dem ersten Komplex verdrängt.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Messschritt das Messen der Bildung eines zweiten Komplexes zwischen dem Protein und der Verbindung umfasst.
  20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei der Messschritt das Messen der Menge des ersten Moleküls, das nicht an das Protein gebunden ist, umfasst.
  21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei das erste Molekül markiert ist.
  22. In vitro-Verfahren zur Diagnose von Leberkrebs oder einer Anfälligkeit für Leberkrebs im Zusammenhang mit der Anwesenheit einer molekularen Variante eines CYP3A5-Gens, umfassend das Bestimmen der Anwesenheit (a) eines Polynucleotids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) einem Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2; und (ii) einem Polynucleotid, das ein zusätzliches Nucleotid an einer Position hat, die der Position 27131/27132 des CYP3A5-Gens entspricht, das durch die verknüpften Sequenzen von Zugangsnr. AF280107.1 definiert ist, wobei Position 166220 als + 1 nummeriert worden ist und Position 174832 als + 8613 nummeriert worden ist, und Zugangsnr. AC005020.2, wobei Position 27341 als + 8614 nummeriert worden ist; oder (b) des Polypeptids nach Anspruch 8 in einer Probe eines Individuums.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, umfassend PCR, Ligase-Kettenreaktion, Restriktionsverdau, direktes Sequenzieren, Nucleinsäure-Amplifikationstechniken, Hybridisierungstechniken, Massenspektroskopie oder Immun-Assays.
  24. Verfahren zum Nachweis des Polynucleotids nach Anspruch 1 oder 2 in einer Probe, umfassend (a) das Inkontaktbringen des festen Trägers nach Anspruch 13 oder 14 mit der Probe unter Bedingungen, die eine Interaktion des Polynucleotids nach Anspruch 1 oder 2 mit den immobilisierten Zielen auf einem festen Träger erlauben; und (b) das Bestimmen der Bindung des Polynucleotids oder des Gens an die immobilisierten Ziele auf dem festen Träger.
  25. Diagnostische Zusammensetzung, umfassend das Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2, den Vektor nach Anspruch 3 oder 4, das Polypeptid nach Anspruch 8 oder den Antikörper nach Anspruch 9.
  26. Arzneimittel, umfassend das Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2, den Vektor nach Anspruch 3 oder 4, das Polypeptid nach Anspruch 8 oder den Antikörper nach Anspruch 9.
  27. Verwendung des Polynucleotids nach Anspruch 1 oder 2, des Polypeptids nach Anspruch 8 oder des Antikörpers nach Anspruch 9 für die Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung zum Diagnostizieren von Leberkrebs in einem Individuum.
  28. Diagnostischer Kit zum Nachweis eines Einzelnucleotid-Polymorphismus, umfassend das Polynucleotid nach Anspruch 1 oder 2, den Vektor nach Anspruch 3 oder 4, das Polypeptid nach Anspruch 8, den Antikörper nach Anspruch 9, die Wirtszelle nach Anspruch 5, das transgene nicht-menschliche Tier nach Anspruch 11 oder 12 oder den festen Träger nach Anspruch 13 oder 14.
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