DE60036487T2 - Polymorphismus im humanen mdr-1 gen und dessen verwendung - Google Patents

Polymorphismus im humanen mdr-1 gen und dessen verwendung Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verwendungen und Verfahren zur Diagnose des phänotypischen Spektrums sowie der überlappenden klinischen Kennzeichen bei verschiedenen Formen einer vererbten abnormalen Expression und/oder Funktion des Multidrug-Resistenz-1(MDR-1)-Gens. Im Besonderen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Diagnose einer erworbenen Multidrug-Resistenz oder -Sensitivität, die mit dem Vorhandensein einer molekularen Variante des MDR-1-Gens in Beziehung steht, oder die Verwendung eines Oligo- oder Polynucleotids für eine solche Diagnose. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Diagnose einer erworbenen Multidrug-Resistenz oder -Sensitivität bereit, die mit dem Vorhandensein einer molekularen Variante des MDR-1-Gens in Beziehung steht, umfassend die Bestimmung des Vorhandenseins eines Polynucleotids in einer Probe aus einer Testperson, wobei das Polynucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) einem Polynucleotid mit der Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 122;
    • (b) einem Polynucleotid, das eine molekulare Variante des Multidrug-Resistenz(MDR)-1-Polypeptids codiert, wobei das Polynucleotid einen Nucleotidaustausch an einer Position aufweist, die der Position 176 des MDR-1-Gens (Zugangs-Nr. M29445 oder J05168) entspricht;
    • (c) einem Polynucleotid, das eine molekulare Variante des MDR-1-Polypeptids codiert, wobei das Polynucleotid an einer Position ein T aufweist, die der Position 176 des MDR-1-Gens (Zugangs-Nr. M29445 oder J05168) entspricht; und
    • (d) einem Nucleinsäuremolekül, das zu dem Polynucleotid nach (a) bis (c) komplementär ist;
    wobei das Vorhandensein des Polynucleotids als Hinweis auf die erworbene Multidrug-Resistenz oder -Sensitivität in diesem Verfahren angesehen wird.
  • Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Diagnose einer Erkrankung bereit, die mit dem Vorhandensein einer molekularen Variante des MDR-1-Gens oder der Anfälligkeit für eine solche Erkrankung in Beziehung steht, umfassend die Bestimmung des Vorhandenseins eines Polynucleotids, wie es hierin definiert wird, in einer Probe aus einem Individuum. Des Weiteren stellt die Erfindung die Verwendung eines Antikörpers bereit, der an das Genprodukt eines MDR-1-Gens spezifisch bindet, und zwar zum Nachweis der Expression einer molekularen Variante des MDR-1-Gens, welche ein Polynucleotid umfasst, wie es hierin definiert wird, und/oder für die Unterscheidung von MDR-1-Allelen, die ein Polynucleotid umfassen, wie es hierin definiert wird. Weiterhin stellt die Erfindung die Verwendung des Einzel-Nucleotid-Polymorphismus C3435T im Exon 26 des MDR-1-Gens, wie er in Anspruch 1 definiert wurde, als pharmakogenetischen Faktor bereit, und zwar für die Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung für die Vorhersage der Blutspiegel eines MDR-1-Substrats und/oder -Induktors für die Verbesserung der Wirkstoff-Sicherheit und -Wirksamkeit, um Nebenwirkungen und Wirkstoff-Wechselwirkungen vorherzusagen und zu verhindern, und/oder um die Compliance des Patienten zu steigern. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Identifizierung und zum Gewinnen von Wirkstoff-Kandidaten und -Inhibitoren für die Therapie von Erkrankungen, die mit einer Störung des MDR-1-Gens in Beziehung stehen, sowie Verfahren für die Diagnose des Zustands einer solchen Erkrankung. Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin eine diagnostische Zusammensetzung bereit, umfassend die molekulare Variante des MDR-1-Gens, wie sie hierin beschrieben wird, oder den Primer oder die Sonde, wie sie hierin beschrieben werden. Diese diagnostische Zusammensetzung ist besonders für die Diagnose verschiedener Erkrankungen mit Wirkstoffen nützlich, die Substrate, Inhibitoren oder Modulatoren des MDR-1-Gens oder seines Produkts sind.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Das menschliche MDR-1-Gen codiert ein integrales Membranprotein, dessen Funktion im energieabhängigen Transport unterschiedlicher Stoffe aus dem Zellinneren und den Zellmembranen zum Zelläußeren besteht. Während die normale physiologische Funktion von MDR-1 am wahrscheinlichsten im Schutz der Zelle vor toxischen Stoffen besteht, ist jedoch auch bekannt, dass es sich bei vielen Substraten des MDR-1-Transporters um Wirkstoffe handelt, die für die Behandlung menschlicher Krankheiten entwickelt wurden. Daher können der Grad der Expression und die Funktionsfähigkeit des MDR-1-Genprodukts die Wirksamkeit jedes Wirkstoffes, der als Substrat von MDR-1 dient, direkt beeinflussen. So ist zum Beispiel wohlbekannt, dass der Expressionsspiegel und somit der Grad der Funktion von MDR-1 die Wirksamkeit von Anti-Tumor-Wirkstoffen bei der Krebstherapie direkt beeinflussen. Daher steht der Genname „MDR" tatsächlich für Multi-Drug-Resistenz, was die Beobachtung widerspiegelt, dass das Protein, welches durch dieses Gen codiert wird, bei Krebszellen bewirkt, dass sie gegenüber der Behandlung mit vielen Wirkstoffen, die alle Substrate des MDR-1-Transporters sind, unempfindlich werden.
  • Das MDR-1-Gen wird nicht nur auf bestimmten Krebszellen exprimiert, wo es direkt die therapeutische Wirksamkeit von Wirkstoffen beeinflussen kann, indem es eine schützende Barriere gegen den Eintritt von Wirkstoffen bildet, sondern auch auf verschiedenen nicht-bösartigen Zellen in verschiedenen Organen wie z. B. im Colon und an der Blut-Hirn-Schranke. Darüber hinaus kann MDR-1 in diesen Zellen die Aktivität und die Verfügbarkeit von Wirkstoffen beeinflussen. Zum Beispiel kann MDR-1 im Colon den Grad der Wirkstoff-Aufnahme aus dem Colon nach einer oralen Einnahme des Wirkstoffs steuern oder modulieren. MDR-1 an der Blut-Hirn-Schranke kann ebenfalls den Grad beeinflussen oder steuern, zu dem Substrate von MDR-1 in das Hirn aufgenommen werden können. Hierbei kann eine gesteigerte MDR-1-Aktivität die Aufnahme von ausreichenden Mengen der gewünschten Hirn-Wirkstoffe in das Hirn verhindern, oder umgekehrt können Varianten von MDR-1 mit verminderter Aktivität gegenüber bestimmten Wirkstoffen zu einer abnorm gesteigerten Akkumulation im Hirn führen, was zu unerwünschten oder sogar zu gefährlichen Nebenwirkungen der Wirkstoffe führen kann.
  • Der gemeinsame Faktor, welcher den von MDR-1 abhängigen Transport in bösartigen sowie in normalen Zellen und Geweben steuert, ist die Aktivität von MDR-1. Die MDR-1-Aktivität wiederum ist abhängig von: (i) dem Expressionsspiegel des MDR-1-Gens, welcher die Menge des MDR-1-Proteins bestimmt, die in den Zellen synthetisiert wird, und (ii) der Funktionsfähigkeit des synthetisierten MDR-1-Proteins, d. h. davon, welche Substrate mit welcher Wirksamkeit erkannt und aus der Zelle transportiert werden.
  • Der erste dieser Parameter, der Grad der Expression von MDR-1, wurde intensiv untersucht, insbesondere deshalb, weil die Sensitivität von Tumorzellen gegenüber einer Krebs-Chemotherapie oft mit der Hochregulierung der MDR-Expression invers korreliert ist: eine hohe MDR-1-Expression korreliert oft mit einer nicht ausreichenden Effizienz der Krebs-Chemotherapie. Obwohl die beobachtete MDR-1-Überexpression teilweise einer Amplifikation des MDR-1-Gens zugeschrieben werden kann, ist es bekannt, dass auch andere, bislang unbekannte Ursachen ebenfalls existieren müssen, wie unter anderem allelische Unterschiede. Kleine Unterschiede in den MDR-1-Gensequenzen von Individuen könnten die Ursache für die unterschiedlichen Spiegel der MDR-1-Genexpression sein. Die Zielregionen im menschlichen Genom, in denen Sequenzunterschiede existieren könnten, die die MDR-1-Genexpression direkt beeinflussen, könnten z. B. in den Kontrollregionen der Genexpression liegen: der Promotor und der Enhancer-Region des MDR-1-Gens sowie Regionen, die den Mechanismus oder die Wirksamkeit des Spleißens der MDR-1-prä-mRNAs beeinflussen. Darüber hinaus können die Expressionsspiegel durch strukturelle Veränderungen im Genom beeinflusst werden, wie z. B. durch Methylierung und durch allgemeine Chromatin-Veränderungen sowie andere Faktoren, die mit dem MDR-1-Gen verknüpft sind, und zwar in den Regionen, die direkt neben dem MDR-1-Gen liegen oder es umgeben. Es ist sehr schwierig, solche verknüpften Faktoren oder Sequenzen direkt aufzufinden und ihre Mechanismen bei der Gen-Aktivierung oder -Repression zu beweisen. Die lineare Struktur des menschlichen Genoms in den definierten Chromosomen eröffnet jedoch die Möglichkeit, bereits identifizierte Polymorphismen, die aus sich selbst heraus den Expressionsspiegel eines Gens nicht direkt beeinflussen, als Marker für bislang nicht identifizierte Veränderungen im und um das MDR-1-Gen herum zu verwenden, welche die Expressionsspiegel beeinflussen. Dieser Effekt ist als Verknüpfung definiert: definierte Allele und Basenvariationen können als Marker für einen wichtigen Phänotyp dienen, sogar dann, wenn diese Veränderungen selbst nicht die Ursache für diesen Phänotyp darstellen.
  • Der zweite Parameter, die Funktionsfähigkeit des synthetisierten MDR-1-Proteins, d. h. welche Substrate mit welcher Wirksamkeit erkannt und aus der Zelle transportiert werden, wird vorwiegend durch die Aminosäuresequenz des Proteins bestimmt, das durch das MDR-1-Allel codiert wird. Es ist wohlbekannt, dass Aminosäureveränderungen die Funktionsfähigkeit von Proteinen verändern können. Beispiele für natürlich vorkommende Variationen, d. h. unterschiedliche Allele, die eine direkte Auswirkung auf die Wirkung verschiedener Wirkstoffe haben, sind z. B. Cytochrom-P450-Polymorphismen oder Polymorphismen in TPMT, APOE und einer Reihe anderer Gene. Es ist auch bekannt, dass mit Tumoren in Beziehung stehende Variationen wie z. B. im p53-Gen solche Phänotypen vermitteln können. Bisher wurden nur einige Polymorphismen im MDR-1-Gen beschrieben und mit klinischen Auswirkungen korreliert (Mickley, Blood 91 (1998) 1749-1756). Eine Hauptfrage, die in diesem Gebiet bestehen bleibt, ist, ob weitere solche Polymorphismen existieren und, wenn ja, ob diese mit der Aktivität von Wirkstoffen und/oder Wirkstoff-Nebenwirkungen korreliert werden können. Experimente mit künstlich eingeführten Mutationen im MDR-1-Gen zeigen eindeutig, dass das MDR-1-Protein sehr empfindlich auf Aminosäureaustausche reagiert. Es wurde gezeigt, dass künstliche Mutationen im MDR-1-Gen, die bei der Translation in Veränderungen im Protein übersetzt werden, das Substratspektrum, die Wirksamkeit des Substrattransports, die Kontrolle des Transports und auch die Sensitivität von MDR-1 gegenüber der Hemmung mit spezifischen hemmenden Stoffen verändern können. Es ist klar, dass natürlich vorkommende Mutationen, sofern sie vorliegen, ähnliche Auswirkungen haben können. Es ist jedoch unbekannt, wie viele solcher Variationen existieren und mit welcher Häufigkeit und an welcher Position sie im menschlichen MDR-1-Gen vorkommen.
  • Dementsprechend sind Mittel und Verfahren für die Diagnose und die Behandlung einer Reihe von Formen der Multidrug-Resistenz, die von Polymorphismen im MDR-1-Gen herrühren, sowie eine Beeinträchtigung der Sensitivität z. B. bei der chemotherapeutischen Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Krebs, bisher nicht verfügbar, jedoch von großem Interesse.
  • Daher liegt das technische Problem der vorliegenden Erfindung darin, den vorstehend beschriebenen Bedarf zu befriedigen.
  • Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der Ausführungsformen erreicht, die in den Ansprüchen charakterisiert werden.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Auffinden einer neuen, bislang unbekannten Variation in den Nucleotidsequenzen des menschlichen MDR-1(Multidrug-Resistenz)-Gens und der Populations-Verteilung dieser Allele. Auf der Grundlage der Kenntnis dieser neuen Sequenz und den abweichenden Basen im MDR-1-Gen wurden diagnostische Tests und Reagenzien für solche Tests für den spezifischen Nachweis und die Genotypisierung der MDR-1-Allele im Menschen entworfen, einschließlich homozygoter und heterozygoter und häufiger sowie seltener Allele des MDR-1-Gens. Die Bestimmung des Allel-Status des MDR-1-Gens beim Menschen durch solche Tests ist für die Therapie verschiedener Erkrankungen mit Wirkstoffen nützlich, die Substrate, Inhibitoren oder Modulatoren des MDR-1-Genprodukts sind.
  • In einer ersten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Diagnose einer erworbenen Multidrug-Resistenz oder -Sensitivität bereit, die mit dem Vorhandensein einer molekularen Variante des MDR-1-Gens in Beziehung steht, umfassend die Bestimmung des Vorhandenseins eines Polynucleotids in einer Probe aus einer Testperson, wobei das Polynucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) einem Polynucleotid mit der Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 122;
    • (b) einem Polynucleotid, das eine molekulare Variante des Multidrug-Resistenz(MDR)-1-Polypeptids codiert, wobei das Polynucleotid einen Nucleotidaustausch an einer Position aufweist, die der Position 176 des MDR-1-Gens (Zugangs-Nr. M29445 oder J05168) entspricht;
    • (c) einem Polynucleotid, das eine molekulare Variante des MDR-1-Polypeptids codiert, wobei das Polynucleotid an einer Position ein T aufweist, die der Position 176 des MDR-1-Gens (Zugangs-Nr. M29445 oder J05168) entspricht; und
    • (d) einem Nucleinsäuremolekül, das zu dem Polynucleotid nach (a) bis (c) komplementär ist;
    wobei das Vorhandensein des Polynucleotids als Hinweis auf die erworbene Multidrug-Resistenz oder -Sensitivität bei diesem Verfahren angesehen wird.
  • In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren für die Diagnose einer Erkrankung bereit, die mit dem Vorhandensein einer molekularen Variante des MDR-1-Gens oder der Empfänglichkeit für eine solche Erkrankung in Beziehung steht, umfassend die Bestimmung des Vorhandenseins eines Polynucleotids, wie es hierin definiert wird, in einer Probe aus einer Testperson.
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung die Verwendung eines Oligo- oder Polynucleotids für die Diagnose einer erworbenen Multidrug-Resistenz oder -Sensitivität bereit, die mit dem Vorhandensein einer molekularen Variante des MDR-1-Gens in Beziehung steht, umfassend die Bestimmung des Vorhandenseins eines Polynucleotids in einer Probe aus einer Testperson, wobei das Polynucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) einem Polynucleotid mit der Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 122;
    • (b) einem Polynucleotid, das eine molekulare Variante des Multidrug-Resistenz(MDR)-1-Polypeptids codiert, wobei das Polynucleotid einen Nucleotidaustausch an einer Position aufweist, die der Position 176 des MDR-1-Gens (Zugangs-Nr. M29445 oder J05168) entspricht;
    • (c) einem Polynucleotid, das eine molekulare Variante des MDR-1-Polypeptids codiert, wobei das Polynucleotid an einer Position ein T aufweist, die der Position 176 des MDR-1-Gens (Zugangs-Nr. M29445 oder J05168) entspricht; und
    • (d) einem Nucleinsäuremolekül, das zu dem Polynucleotid nach (a) bis (c) komplementär ist;
  • In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung einen Primer oder eine Sonde für die vorstehend erwähnte diagnostische Verwendung sowie eine diagnostische Zusammensetzung bereit, umfassend die molekulare Variante des MDR-1-Gens, die hierin beschrieben wird, sowie den Primer oder die Sonde oder den Antikörper, der/die hierin beschrieben wird. Weiterhin stellt die Erfindung die Verwendung des Einzel-Nucleotid-Polymorphismus C3435T im Exon 26 des MDR-1-Gens, wie er in Anspruch 1 definiert wurde, als pharmakogenetischen Faktor bereit, und zwar für die Herstellung einer diagnostischen Zusammensetzung für die Vorhersage der Blutspiegel eines MDR-1-Substrats und/oder -Induktors für die Verbesserung der Wirkstoffsicherheit und -Wirksamkeit, um Nebenwirkungen und Wirkstoff-Wechselwirkungen vorhersagen zu können und/oder um die Compliance des Patienten zu verbessern.
  • Die pharmazeutischen und diagnostischen Zusammensetzungen, Verfahren und Anwendungen der Erfindung sind nützlich für die Diagnose und die Behandlung einer vererbten Wirkstoff-Resistenz in Tumoren und anderen Erkrankungen, deren Therapie von einer Behandlung mit Wirkstoffen abhängig ist. Die neuen varianten Formen der MDR-1-Gene entsprechend der Erfindung stellen das Potenzial für die Entwicklung eines pharmakodynamischen Profils von Wirkstoffen und Prodrugs für einen bestimmten Patienten bereit.
  • BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Das Auffinden und die Charakterisierung einer Variation im MDR-1-Gen und diagnostische Test für die Unterscheidung der verschiedenen MDR-1-Allele in menschlichen Individuen stellen ein hoch wirksames Hilfsmittel für die Verbesserung der Therapie von Erkrankungen mit Wirkstoffen bereit, die Ziele des MDR-1-Genprodukts darstellen und deren Aufnahme in die Zelle daher von MDR-1 abhängig ist. Die Diagnose des individuellen MDR-1-Allel-Status erlaubt eine stärker zielgerichtete Therapie, z. B. eröffnet sie die Möglichkeit, individuelle Dosierungsprotokolle für Wirkstoffe anzuwenden. Sie kann auch als Hilfsmittel für die Prognose eines Ergebnisses einer Therapie nützlich sein, was sicherlich einen verbesserten Ansatz gegenüber der Verwendung der allgemeinen MDR-Expression als prognostischen Marker darstellt. Darüber hinaus werden die diagnostischen Tests für die Bestimmung des Genotyps des MDR-1-Gens und der neuen MDR-1-Varianten nicht nur die Therapie mit etablierten Wirkstoffen verbessern und helfen, die Genotypen mit der Aktivität oder den Nebenwirkungen von Wirkstoffen zu korrelieren. Diese Tests und die Sequenzen stellen darüber hinaus Reagenzien für die Entwicklung neuer Inhibitoren bereit, die die Aktivität der individuellen MDR-1-Typen spezifisch modulieren. Die Möglichkeit, spezifische Inhibitoren individueller (künstlich hergestellter) MDR-Varianten zu verwenden, sowie ihre potenzielle therapeutische Anwendung wurde zum Beispiel vor kurzem in einem Modellsystem aufgezeigt (Moscow J.A. et al., Blood 94 (1999) 52-61; Dey, S. et al., Biochemistry 38 (1999) 6630-6639).
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung einen neuen Weg für die Anwendung der Molekularbiologie und der pharmazeutischen Forschung für die Wirkstoff-Therapie bereit, wobei ihre möglichen nachteiligen Auswirkungen aufgrund der Expression von MDR-1-Gen-Varianten umgangen werden.
  • Dementsprechend betrifft die Erfindung ein Verfahren für die Diagnose einer erworbenen Multidrug-Resistenz oder -Sensitivität, die mit dem Vorhandensein einer molekularen Variante des MDR-1-Gens in Beziehung steht, umfassend die Bestimmung des Vorhandenseins eines Polynucleotids in einer Probe aus einer Testperson, wobei das Polynucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) einem Polynucleotid mit der Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 122;
    • (b) einem Polynucleotid, das eine molekulare Variante des Multidrug-Resistenz(MDR)-1-Polypeptids codiert, wobei das Polynucleotid einen Nucleotidaustausch an einer Position aufweist, die der Position 176 des MDR-1-Gens (Zugangs-Nr. M29445 oder J05168) entspricht;
    • (c) einem Polynucleotid, das eine molekulare Variante des MDR-1-Polypeptids codiert, wobei das Polynucleotid an einer Position ein T aufweist, die der Position 176 des MDR-1-Gens (Zugangs-Nr. M29445 oder J05168) entspricht; und
    • (d) einem Nucleinsäuremolekül, das zu dem Polynucleotid nach (a) bis (c) komplementär ist;
    wobei das Vorhandensein des Polynucleotids als Hinweis auf die erworbene Multidrug-Resistenz oder -Sensitivität bei diesem Verfahren angesehen wird.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck „molekular variantes/molekulare Variante" des MDR-1-Gen(s) oder -Protein(s), wie er hierin verwendet wird, dass dieses MDR-1-Gen oder -Protein sich von dem Wildtyp-MDR-1-Gen oder -Protein, wie es hierin beschrieben wird, unterscheidet (genomische Sequenzen des MDR-1-Gens werden zum Beispiel beschrieben für die Exons 1-7: Zugangs-Nummer AC002457; für Exon 8: Zugangs-Nummer M29429, J05168, AC005068; für Exon 9: Zugangs-Nummer M29430, J05168, AC005068; für Exon 10: Zugangs-Nummer M29431, J05168, AC005068; für Exons 11 bis 13: Zugangs-Nummer M29432, J05168 und AC005068; für Exon 14: Zugangs-Nummer M29433, J05168, AC005068; für Exon 15: Zugangs-Nummer M29434, J05168, AC005068; für Exon 16: Zugangs-Nummer M29435, J05168, AC005068; für Exon 17: Zugangs-Nummer M29436, J05168, AC005068; für Exon 18: Zugangs-Nummer M29437, J05168, AC005068; für Exon 19: Zugangs-Nummer M29438, J05168, AC005068; für Exon 20: Zugangs-Nummer M29439, J05168, AC005068; für Exon 21: Zugangs-Nummer M29440, J05168, AC005068; für Exon 22: Zugangs-Nummer M29441, J05168, AC005068; für Exon 23: Zugangs-Nummer M29442, J05168, AC005068; für Exon 24: Zugangs-Nummer M29443, J05168, AC005068; für Exon 25: Zugangs-Nummer M29444, J05168, AC005068; für Exon 26: Zugangs-Nummer M29445, J05168, AF016535, AC005068; für Exon 27: Zugangs-Nummer M29446, J05168, AC005068; für Exon 28: Zugangs-Nummer M29447, J05168, AC005068); und zwar durch Nucleotidaustausch(e), Addition(en) und/oder Deletion(en). Diese(r) Nucleotidaustausch(e) führten bevorzugt zu (einer) entsprechenden Veränderung(en) in der Aminosäuresequenz des MDR-1-Proteins.
  • Der Begriff „entsprechend", wie er hierin verwendet wird, bedeutet, dass eine Position nicht nur durch die Zahl der davor stehenden Nucleotide beziehungsweise Aminosäuren bestimmt wird. Die Position eines bestimmten Nucleotids oder einer bestimmten Aminosäure entsprechend der vorliegenden Erfindung, die deletiert oder ausgetauscht sein kann oder die eines oder mehrere zusätzliche Nucleotide umfassen kann, kann aufgrund der Deletionen oder der zusätzlichen Nucleotide oder Aminosäuren an anderen Stellen des Gens oder des Polypeptids variieren. Daher wird gemäß der vorliegenden Erfindung unter einer „entsprechenden Position" so verstanden, dass Nucleotide oder Aminosäuren sich in der angegebenen Positions-Nummer unterscheiden können, aber immer noch ähnliche benachbarte Nucleotide oder Aminosäuren haben. Diese Nucleotide oder Aminosäuren, die ausgetauscht oder deletiert sein können oder zusätzliche Nucleotide oder Aminosäuren umfassen können, sind in dem Ausdruck „entsprechende Position" ebenfalls enthalten. Diese Nucleotide oder Aminosäuren können zum Beispiel zusammen mit ihren Nachbarn aus Sequenzen stammen, die an der Regulation der Genexpression, der Stabilität der entsprechenden RNA oder der RNA-Editierung beteiligt sind sowie funktionelle Domänen oder Motive des Proteins der Erfindung codieren.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde die Art und die Populationsverteilung von neuen und bislang nicht identifizierten genetischen Variationen im MDR-1-Gen analysiert; dies erfolgte durch Sequenzanalyse der relevanten Regionen des menschlichen MDR-1-Gens aus vielen unterschiedlichen Individuen. Es ist eine wohlbekannte Tatsache, dass die genomische DNA von Individuen, die die individuelle genetische Ausstattung aller Gene einschließlich des MDR-1-Gens tragen, leicht aus individuellen Blutproben gereinigt werden kann. Diese individuellen DNA-Proben werden dann für die Analyse der Sequenzzusammensetzung der Allele des MDR-1-Gens verwendet, die in dem Individuum vorliegen, aus dem die Blutprobe stammte. Die Sequenzanalyse wurde durchgeführt durch PCR-Amplifikation relevanter Regionen des MDR-1-Gens und anschließender Reinigung der PCR-Produkte, gefolgt von einer automatischen DNA-Sequenzierung mit etablierten Verfahren (ABI-Farbstoff-Terminator-Zyklus-Sequenzierung „ABIDyeTerminatorCycleSequencing").
  • Ein wichtiger Parameter, der bei dem Versuch, den individuellen MDR-1-Genotyp zu bestimmen und neue MDR-1-Varianten durch direkte DNA-Sequenzierung von PCR-Produkten aus menschlicher genomischer DNA aus Blut zu identifizieren, berücksichtigt werden musste, ist die Tatsache, dass jeder Mensch (in der Regel mit sehr wenigen abnormen Ausnahmen) zwei Genkopien jedes autosomalen Gens trägt (Diploidie). Aus diesem Grund musste die Auswertung der Sequenzen sehr sorgfältig erfolgen, um in der Lage zu sein, nicht nur homozygote Sequenzvarianten, sondern auch heterozygote Varianten zu identifizieren. Die Einzelheiten der verschiedenen Schritte bei der Identifizierung und Charakterisierung der neuen MDR-1-Gen-Polymorphismen (homozygot und heterozygot) werden in den nachstehenden Beispielen 1 und 2 beschrieben.
  • Die Mutationen im MDR-1-Gen, die gemäß der vorliegenden Erfindung nachgewiesen wurden, sind in der 2 dargestellt (und durch einen Pfeil markiert). Die Verfahren der Mutationsanalyse folgten Standardprotokollen und werden im Detail in den Beispielen beschrieben. Im Allgemeinen umfassen solche Verfahren, die gemäß der vorliegenden Erfindung für die Bewertung des phänotypischen Spektrums und der überlappenden klinischen Kennzeichen mit anderen Formen der Multidrug-Resistenz sowie einer veränderten Toleranz gegenüber Arzneistoffen in Patienten mit Mutationen im MDR-1-Gen verwendet werden, zum Beispiel die Haplotyp-Analyse, die Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse (SSCA), die PCR und die direkte Sequenzierung; vergleiche auch mit Mickley (1998) und den darin zitierten Referenzen. Auf der Grundlage einer gründlichen klinischen Charakterisierung vieler Patienten können die Phänotypen dann mit diesen Mutationen sowie mit Mutationen, die bereits früher beschrieben wurden, korreliert werden.
  • Wie den Fachleuten ersichtlich ist, können diese neuen molekulargenetischen Erkenntnisse nun verwendet werden, um den Genotyp des indizierten Patienten, in dem ein verabreichter Wirkstoff eine ungewöhnliche Wirkung zeigt, sowie den Genotyp der übrigen Familienmitglieder genau zu charakterisieren.
  • In den letzten 20 Jahren wurde die genetische Heterogenität mehr und mehr als eine signifikante Ursache der Variation bei Antwortreaktionen auf Wirkstoffe erkannt. In vielen wissenschaftlichen Berichten (Meyer, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37 (1997) 269-296 und West, J. Clin. Pharmacol. 37 (1997) 635-648) wurde deutlich aufgezeigt, dass einige Wirkstoffe bei bestimmten Patienten besser wirken als bei anderen oder sogar hoch toxisch sein können und dass diese Unterschiede in den Antwortreaktionen der Patienten auf Wirkstoffe mit einer molekularen Grundlage in Beziehung gesetzt werden können. Dieses „pharmakogenomische" Konzept zeigt Korrelationen zwischen den Antwortreaktionen auf Wirkstoffe und den genetischen Profilen von Patienten auf (Marshall, Nature Biotechnology 15 (1997) 954-957; Marshall, Nature Biotechnology 15 (1997) 1249-1252).
  • Im Zusammenhang mit der Variabilität einer Population im Hinblick auf die Wirkstofftherapie wurde die Pharmakogenomik als Hilfsmittel vorgeschlagen, das für die Identifizierung und die Auswahl von Patienten nützlich ist, die auf einen bestimmten Wirkstoff ohne Nebenwirkungen reagieren können. Diese Identifizierung/Auswahl kann auf Grundlage einer molekularen Diagnose der genetischen Polymorphismen zum Beispiel durch die Genotypisierung der DNA aus Leukocyten aus dem Blut eines Patienten und der Charakterisierung der Erkrankung erfolgen (Bertz, Clin. Pharmacokinet. 32 (1997) 210-256; Engel, J. Chromatogra. B. Biomed. Appl. 678 (1996) 93-103). Für die Gründer der Gesundheitsvorsorge wie z. B. Organisationen für die Erhaltung der Gesundheit in den U.S. und öffentliche Gesundheitsdienste der Regierung in vielen europäischen Ländern kann dieser pharmakogenomische Ansatz einen Weg darstellen, auf dem sowohl die Gesundheitsvorsorge verbessert als auch Unkosten vermindert werden können, da für nicht notwendige Wirkstoffe, unwirksame Wirkstoffe und Wirkstoffe mit Nebenwirkungen hohe Kosten anfallen.
  • Die Mutationen in den varianten MDR-1-Genen können manchmal entweder alleine oder in Kombination zu Aminosäure-Deletion(en) oder -Insertion(en) und insbesondere zu -Austausch(en) führen. Natürlich ist es auch möglich, solche Mutationen in Wildtyp-Genen oder in anderen mutierten Formen gentechnisch herzustellen. Verfahren für die Einbringung solcher Modifikationen in die DNA-Sequenz des MDR-1-Gens sind den Fachleuten wohlbekannt; vergleiche z. B. mit Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.
  • Für die Untersuchung der Natur der Veränderungen in der Aminosäuresequenz des MDR-1-Proteins können Computer-Programme wie z. B. BRASMOL verwendet werden, die aus dem Internet bezogen werden können. Darüber hinaus können Faltungs-Simulationen und durch Computer generierte Neuentwürfe von strukturellen Motiven unter Verwendung anderer geeigneter Computer-Programme durchgeführt werden (Olszewski, Proteins 25 (1996) 286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995) 675-679). Computer können für die Konformations- und die energetische Analyse von detaillierten Protein-Modellen verwendet werden (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995) 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995) 37-45). Eine solche Analyse kann für die Identifizierung der Auswirkungen einer bestimmten Mutation auf die Bindung und/oder den Transport von Wirkstoffen verwendet werden.
  • In der Regel erfolgen solche Deletionen, Additonen oder Austausche von Aminosäuren in der Aminosäuresequenz des Proteins, das durch das Polynucleotid der Erfindung codiert wird, aufgrund eines oder mehrerer Nucleotid-Austausche, -Insertionen oder -Deletionen oder einer beliebigen Kombination davon.
  • Das Polynucleotid der Erfindung, das bei den Verfahren oder den Anwendungen der vorliegenden Erfindung, wie hierin beschrieben, verwendet wird, kann weiterhin mindestens eine(n) andere(n) Nucleotid- und wahlweise Aminosäure-Deletion, -Addition und/oder -Austausch enthalten als diejenigen, die hierin vorstehend spezifiziert wurden, wie zum Beispiel solche, die im Fachgebiet bereits beschrieben wurden; z. B. in Mickley (1998). Dies ermöglicht die Untersuchung von synergistischen Auswirkungen der Mutationen im MDR-1-Gen auf das pharmakologische Profil von Wirkstoffen bei Patienten, die solche mutierte Formen des Gens oder ähnliche mutierte Formen tragen, und die durch die vorstehend beschriebenen Proteine nachgebildet werden. Es wird erwartet, dass die Analyse dieser synergistischen Auswirkungen ein tieferes Verständnis für das Ausbrechen von Multidrug-resistenten Phänotypen bei bestimmten Krebsarten liefert. Aus diesem größeren Verständnis wird die Entwicklung diagnostischer und pharmazeutischer Zusammensetzungen, die mit Krebs in Beziehung stehen, stark profitieren.
  • Somit führt in einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahren zur Diagnose einer erworbenen Multidrug-Resistenz oder -Sensitivität, die mit dem Vorhandensein einer molekularen Variante des MDR-1-Gens in Beziehung steht, wie sie hierin beschrieben wird, der Nucleotidaustausch zu einer veränderten Expression des varianten MDR-1-Gens im Vergleich zu dem entsprechenden Wildtyp-Gen.
  • Bei dem Polynucleotid der Erfindung, das bei den Verfahren oder den Anwendungen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann es sich z. B. um DNA, cDNA, genomische DNA, RNA oder um synthetisch hergestellte DNA oder RNA oder um ein rekombinant hergestelltes chimäres Nucleinsäuremolekül handeln, das ein beliebiges dieser Polynucleotide entweder alleine oder in Kombination umfasst.
  • Mit den Verfahren und den Anwendungen der Erfindung ist es nun möglich, die Wirksamkeit von Wirkstoffen in Beziehung zu bestimmten Mutationen im MDR-1-Gen eines Patienten und dem betroffenen Phänotyp in vivo und in vitro zu untersuchen. Darüber hinaus können die Verfahren und die Anwendungen der Erfindung dazu verwendet werden, das pharmakologische Profil von Wirkstoffen zu bestimmen, sowie zur Identifizierung und Herstellung weiterer Wirkstoffe verwendet werden, die für die Behandlung von z. B. Krebs wirksamer sind, und insbesondere für die Verbesserung von bestimmten Phänotypen, die durch die entsprechenden Mutationen verursacht wurden, wie z. B. denjenigen, die vorstehend beschrieben wurden.
  • Somit beschreibt die vorliegende Anmeldung die Auswahl von Wirkstoffen/Prodrugs und die Formulierung von Arzneimitteln für die Behandlung von Erkrankungen, die einer Chemotherapie zugänglich sind, wobei der Polymorphismus der varianten Form des MDR-1-Gens berücksichtigt wird, der mit dem betroffenen Phänotyp des zu behandelnden Patienten gemeinsam segregiert. Dies ermöglicht die sichere und ökonomische Anwendung von Wirkstoffen, die zum Beispiel bisher für eine Therapie von z. B. Krebs aufgrund ihrer Nebenwirkungen bei einigen Patienten und/oder ihres unzuverlässigen pharmakologischen Profils hinsichtlich des gleichen oder eines anderen Phänotyps der Erkrankung als nicht geeignet angesehen wurden. Die Mittel und Verfahren und die Anwendungen, die hierin beschrieben werden, können zum Beispiel verwendet werden, um Empfehlungen für Dosierungen zu verbessern, und sie ermöglichen dem Verschreibenden notwendige Dosisanpassungen in Abhängigkeit von der in Betracht stehenden Patientengruppe vorzunehmen.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Identifizierung und die Gewinnung eines MDR-1-Inhibitors, der in der Lage ist, die Aktivität einer molekularen Variante des MDR-1-Gens oder seines Genprodukts zu modulieren, umfassend die Schritte:
    • (a) des Inkontaktbringens einer Zelle, die eine molekulare Variante des MDR-1-Gens exprimiert, welche das Polynucleotid der Erfindung umfasst, in Anwesenheit von Stoffen, die ein nachweisbares Signal als Antwortreaktion auf den Wirkstoff-Transport liefern können, mit einer zu durchmusternden Verbindung unter Bedingungen, die einen durch MDR-1 vermittelten Wirkstoff-Transport erlauben, und
    • (b) des Nachweises der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Signals oder der Zunahme eines Signals, das durch den Transport des Wirkstoffes erzeugt wurde, wobei die Anwesenheit oder die Zunahme des Signals auf einen möglichen Inhibitor hinweist.
  • Der Begriff „Verbindung" bei einem Verfahren der Erfindung umfasst einen einzigen Stoff oder eine Vielzahl von Stoffen, die identisch sein können oder auch nicht.
  • Diese Verbindung(en) kann (können) chemisch synthetisiert oder durch mikrobielle Fermentation hergestellt werden, aber sie kann (können) zum Beispiel auch in Proben enthalten sein, wie z. B. in Zellextrakten z. B. aus Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen. Weiterhin können diese Stoffe im Fachgebiet bekannt sein, aber es kann bislang nicht bekannt sein, dass sie als Inhibitor nützlich sind. Diese Vielzahl an Verbindungen kann zum Beispiel einem Kulturmedium hinzugegeben werden oder in eine Zelle oder in ein nicht-menschliches Tier der Erfindung injiziert werden.
  • Wenn eine Probe, die (eine) Verbindung(en) enthält, durch das Verfahren der Erfindung identifiziert wird, ist es entweder möglich, die Verbindung aus der Original-Probe zu isolieren, die identifiziert wurde, dass sie die in Frage stehende Verbindung enthält, oder man kann die Original-Probe weiter unterteilen, wenn sie zum Beispiel aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Verbindungen besteht, damit die Zahl an unterschiedlichen Stoffen in der Probe vermindert wird, und dann kann man das Verfahren mit den unterteilten Fraktionen der Original-Probe wiederholen. Anschließend kann bestimmt werden, ob die Probe oder die Verbindung die gewünschten Eigenschaften aufweist, dies kann zum Beispiel durch die hierin oder in der Literatur beschriebenen Verfahren erfolgen (Spector et al., Cells Manual; vergleiche vorstehend). In Abhängigkeit von der Komplexität der Proben können die vorstehend beschriebenen Schritte mehrere Male durchgeführt werden; dies erfolgt vorzugsweise, bis die gemäß dem Verfahren der Erfindung identifizierte Probe nur noch eine begrenzte Zahl an Stoffen oder nur noch einen Stoff umfasst. Die Probe umfasst bevorzugt Stoffe mit ähnlichen chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften, und am stärksten wird bevorzugt, dass diese Stoffe identisch sind. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können durch Fachleute leicht durchgeführt und geplant werden, zum Beispiel entsprechend anderen auf Zellen basierenden Testansätzen, die im Fachgebiet beschrieben werden, oder durch die Verwendung und die Modifizierung der hierin beschriebenen Verfahren. Des weiteren werden Fachleute rasch erkennen, welche weiteren Verbindungen und/oder Enzyme verwendet werden können, um die Verfahren der Erfindung durchzuführen, wie zum Beispiel gegebenenfalls Enzyme, die eine bestimmte Verbindung in die Vorläuferform umwandeln, die wiederum ein Substrat für das MDR-1-Protein darstellt. Eine solche Anpassung des Verfahrens der Erfindung ist für die Fachleute gut möglich und sie kann ohne übermäßiges weiteres Experimentieren vorgenommen werden.
  • Verbindungen, die entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Peptide, Proteine, Nucleinsäuren, Antikörper, kleine organische Verbindungen, Liganden, Peptidmimetika, PNAs und ähnliche. Diese Verbindungen können auch funktionelle Derivate oder Analoga bekannter Wirkstoffe wie z. B. Verapamil oder Cyclosporin sein. Verfahren für die Herstellung chemischer Derivate und Analoga sind den Fachleuten wohlbekannt und werden zum Beispiel in: Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer-Verlag, New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 USA und in: Organic Synthesis, Wiley, New York, USA beschrieben. Darüber hinaus können diese Derivate und Analoga auf ihre Wirkungen gemäß der im Fachgebiet bekannten Verfahren oder wie beschrieben ausgetestet werden. Des Weiteren können Peptidmimetika und/oder das Computergestützte Entwerfen von geeigneten Wirkstoffderivaten und Wirkstoffanaloga verwendet werden, zum Beispiel entsprechend den nachstehend beschriebenen Verfahren. Solche Analoga umfassen Moleküle, die als Grundgerüst die Struktur bekannter MDR-Substrate und/oder -Inhibitoren und/oder -Modulatoren aufweisen; vergleiche mit dem Nachstehenden.
  • Es können geeignete Computerprogramme für die Identifizierung der miteinander in Wechselwirkung tretenden Bereichen eines potenziellen Inhibitors und des MDR-1-Proteins der Erfindung durch Computer-gestützte Suche nach komplementären Strukturmotiven verwendet werden (Fassina, Immunomethods 5 (1994) 114-120). Weitere geeignete Computersysteme für das Computer-gestützte Entwerfen von Proteinen und Peptiden werden im Fachgebiet beschrieben, wie zum Beispiel in: Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994) 1033-1036; Wodak, Ann. N.Y. Acad. Sci. 501 (1987) 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986) 5987-5991. Die durch die vorstehend beschriebene Computeranalyse erhaltenen Ergebnisse können in Verbindung mit dem Verfahren der Erfindung verwendet werden, z. B. um bekannte Inhibitoren zu optimieren. Geeignete Peptidmimetika und andere Inhibitoren können auch durch die Synthese von kombinatorischen Peptidmimetikabanken durch sukzessive chemische Modifizierung und Untersuchung der so erhaltenen Verbindungen identifiziert werden, z. B. gemäß den hierin beschriebenen Verfahren. Verfahren für die Erzeugung und die Verwendung von kombinatorischen Peptidmimetikabanken sind im Fachgebiet beschrieben worden, wie zum Beispiel in: Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996) 220-234 und in: Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996) 709-715. Darüber hinaus kann die dreidimensionale und/oder die kristallographische Struktur von Inhibitoren und des MDR-1-Proteins der Erfindung für das Entwerfen von peptidmimetischen Wirkstoffen verwendet werden (Rose, Biochemistry 35 (1996) 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996) 1545-1558).
  • Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass die vorstehend erwähnten Verfahren für die Identifizierung und die Gewinnung von Verbindungen, Verbindungen bereitstellen können, die in spezifischen Dosen für die Behandlung von spezifischen Formen von Erkrankungen verwendet werden können, wie z. B. von Krebs, wobei die Chemotherapie davon der durch Störungen des MDR-1-Gens, was oft zu einem Wirkstoff-resistenen oder -sensitiven Phänotyp führen kann, verkompliziert wird.
  • In einer noch weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Diagnose einer Krankheit, die mit dem Vorhandensein einer molekularen Variante des MDR-1-Gens oder mit der Empfänglichkeit für eine solche Erkrankung in Beziehung steht, umfassend:
    • (a) die Bestimmung des Vorhandenseins eines Polynucleotids der Erfindung in einer Probe aus einem Individuum; und/oder
    • (b) die Bestimmung des Vorhandenseins einer varianten Form des MDR-1-Proteins zum Beispiel mit dem Antikörper der Erfindung.
  • Gemäß dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Verfahren zur Untersuchung des Zustands einer Erkrankung oder der Anfälligkeit für eine solche Erkrankung unter Verwendung eines Polynucleotids oder eines Nucleinsäuremoleküls der Erfindung erfolgen, z. B. in Form eines Southern- oder eines Northern-Blots oder durch in situ-Analyse. Eine solche Nucleinsäuresequenz kann mit der codierenden Region eines der Gene oder mit einer nicht-codierenden Region hybridisieren, wie z. B. einem Intron. Wenn eine komplementäre Sequenz bei dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, kann das Nucleinsäuremolekül erneut bei einem Northern-Blot verwendet werden. Zusätzlich kann diese Untersuchung in Verbindung mit einer tatsächlichen Blockierung z. B. der Transkription des Gens durchgeführt werden, und somit kann man erwarten, dass sie therapeutisch von Bedeutung ist. Darüber hinaus kann ein Primer oder ein Oligonucleotid auch für die Hybridisierung mit einem der vorstehend erwähnten MDR-1-Gene oder den entsprechenden mRNAs verwendet werden. Die für die Hybridisierung verwendeten Nucleinsäuren können natürlich auch in geeigneter Weise markiert werden; dies erfolgt durch den Einbau oder die Anheftung z. B. eines radioaktiven oder eines anderen Markers. Solche Marker sind im Fachgebiet wohlbekannt. Die Markierung der Nucleinsäuremoleküle kann durch die üblichen Verfahren erfolgen. Darüber hinaus kann die Anwesenheit oder die Expression varianter MDR-1-Gene durch die Verwendung eines Primer-Paars, das mit jeder der entsprechenden Nucleinsäuresequenzen spezifisch hybridisiert, und durch die Durchführung einer PCR-Reaktion entsprechend Standardverfahren aufgezeigt werden. Die spezifische Hybridisierung der vorstehend erwähnten Sonden oder Primer erfolgt bevorzugt bei stringenten Hybridisierungsbedingungen. Der Begriff „stringente Hybridisierungsbedingungen" ist im Fachgebiet wohlbekannt; vergleiche zum Beispiel mit: Sambrook et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Zweite Aufl., CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989; „Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach", Hames und Higgins, Hrsg., IRL Press, Oxford, 1985. Darüber hinaus kann die mRNA, cRNA, cDNA oder die genomische DNA, die aus dem Individuum erhalten wurde, sequenziert werden, um Mutationen zu identifizieren, die charakteristische Fingerabdrücke von Mutationen im MDR-1-Gen darstellen. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin Verfahren, bei denen ein solcher Fingerabdruck durch RFLPs der DNA oder der RNA, die aus dem Individuum erhalten wurde, erzeugt wurde, wobei die DNA oder die RNA vor der Analyse wahlweise amplifiziert werden kann und wobei die Verfahren im Fachgebiet wohlbekannt sind. RNA-Fingerabdrücke können zum Beispiel durch den Verdau einer RNA-Probe, die aus dem Individuum erhalten wurde, mit einem geeigneten RNA-Enzym wie zum Beispiel RNase T1, RNase T2 oder ähnlichen oder einem Ribozym durchgeführt werden, und die RNA kann dann zum Beispiel mittels Elektrophorese aufgetrennt werden und die RNA-Fragmente können nachgewiesen werden, wie vorstehend beschrieben.
  • Weitere Modifikationen der vorstehend erwähnten Ausführungsform der Erfindung können nach dieser Offenlegung durch Fachleute leicht und ohne übermäßiges Experimentieren geplant werden; vergleiche z. B. mit den Beispielen. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren, in dem die Bestimmung durch die Anwendung eines Antikörpers der Erfindung oder eines Fragments davon durchgeführt werden kann. Der bei dem Verfahren der Erfindung verwendete Antikörper kann mit einer nachweisbaren Markierung wie z. B. einer Histidin-Markierung oder einem Biotin-Molekül markiert werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die vorstehend beschriebenen Verfahren die PCR, die Ligase-Kettenreaktion, einen Restriktionsverdau, die direkte Sequenzierung, Nucleinsäure-Amplifikations-Verfahren, Hybridisierungs-Verfahren oder Immun-Testansätze (Sambrook et al., CSH, Clonierung, loc. cit.; Harlow und Lane, CSH, Antikörper, loc. cit.).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der Krankheit um Krebs.
  • In diesem Zusammenhang und, wie durchgehend in dieser Beschreibung verwendet, bedeutet ein „funktionelles" MDR-1-Gen ein Gen, bei dem das codierte Protein einen Teil der oder die vollständige Primärstruktur-Konformation des Wildtyp-MDR-1-Proteins aufweist, d. h. die biologische Eigenschaft besitzt, den Wirkstoff-Transport durch die Membran zu vermitteln. Der Nachweis der Expression einer MDR-1-Gen-Variante erlaubt die Schlussfolgerung, dass diese Expression mit der Erzeugung oder der Aufrechterhaltung eines entsprechenden Phänotyps der Krankheit in Beziehung steht. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Oligo- oder eines Polynucleotids für die Diagnose einer erworbenen Multidrug-Resistenz oder -Sensitivität, die mit dem Vorhandensein einer molekularen Variante des MDR-1-Gens in Beziehung steht, umfassend die Bestimmung des Vorhandenseins eines Polynucleotids in einer Probe aus einer Testperson, wobei das Polynucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
    • (a) einem Polynucleotid mit der Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 122;
    • (b) einem Polynucleotid, das eine molekulare Variante des Multidrug-Resistenz(MDR)-1-Polypeptids codiert, wobei das Polynucleotid einen Nucleotidaustausch an einer Position aufweist, die der Position 176 des MDR-1-Gens (Zugangs-Nr. M29445 oder J05168) entspricht;
    • (c) einem Polynucleotid, das eine molekulare Variante des MDR-1-Polypeptids codiert, wobei das Polynucleotid an einer Position ein T aufweist, die der Position 176 des MDR-1-Gens (Zugangs-Nr. M29445 oder J05168) entspricht; und
    • (d) einem Nucleinsäuremolekül, das zu dem Polynucleotid nach (a) bis (c) komplementär ist.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist das bei der diagnostischen Anwendung verwendete Oligonucleotid eine Länge von etwa 10 bis 100, bevorzugter von 15 bis 50 Nucleotiden auf und umfasst die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 122 oder eine Wildtyp („WT")- oder eine mutierte („MUT")-Sequenz des Promotors oder eines Exons des MDR-1-Gens, die in Tabelle 8 abgebildet sind, oder eine komplementäre Sequenz einer beliebigen dieser Sequenzen.
  • Daher betrifft die vorliegende Erfindung in einer noch weiteren Ausführungsform einen Primer oder eine Sonde, die aus einem Oligonucleotid besteht, wie es vorstehend definiert wurde, das bei der diagnostischen Anwendung zu verwenden ist. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff „bestehend aus", dass die Nucleotidsequenz, die vorstehend beschrieben wurde und die für den Primer oder die Sonde der Erfindung verwendet wird, keine weiteren Nucleotidsequenzen des MDR-1-Gens enthält, die seinem 5'- und/oder 3'-Ende direkt benachbart liegen. Es können jedoch andere Einheiten wie Markierungen wie z. B. Biotin-Moleküle, eine Histidin-Markierungssequenz, Antikörper-Fragmente, kolloidales Gold usw. sowie Nucleotidsequenzen, die nicht dem MDR-1-Gen entsprechen, in dem Primer und den Sonden der vorliegenden Erfindung vorhanden sein. Des weiteren ist es auch möglich, die vorstehend beschriebenen, besonderen Nucleotidsequenzen zu verwenden und sie mit anderen aus dem MDR-1-Gen stammenden Nucleotidsequenzen zu kombinieren, wobei in diese zusätzlichen Nucleotidsequenzen andere Einheiten als Nucleinsäuren eingestreut sein können oder wobei die Nucleinsäure den Nucleotidsequenzen des MDR-1-Gens nicht entspricht.
  • Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Antikörpers, der an das Genprodukt eines MDR-1-Gens spezifisch bindet, für den Nachweis der Expression einer molekularen Variante des MDR-1-Gens, die ein Polynucleotid der Erfindung umfasst, und/oder für die Unterscheidung von MDR-1-Allelen, die ein Polynucleotid der Erfindung umfassen.
  • Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine diagnostische Zusammensetzung, welche das Polynucleotid, den Primer oder die Sonde oder den Antikörper umfasst, wie hierin beschrieben.
  • Antikörper gegen das variante MDR-1-Protein der Erfindung können durch wohlbekannte Verfahren unter Verwendung eines gereinigten Proteins gemäß der Erfindung oder eines (synthetischen) Fragments, das aus dem Protein abgeleitet wurde, als Antigen hergestellt werden. Monoclonale Antikörper können zum Beispiel durch die Verfahren, die ursprünglich in: Köhler und Milstein, Nature 256 (1975) 495 und in: Galfré, Meth. Enzymol. 73 (1981) 3 beschrieben wurden, hergestellt werden; diese umfassen die Fusion von Maus-Myelomzellen mit Milzzellen, die aus immunisierten Säugern stammen. Bei den Antikörpern kann es sich um monoclonale Antikörper, polyclonale Antikörper oder um synthetische Antikörper handeln, sowie um Fragmente von Antikörpern wie z. B. um Fab-, Fv- oder um scFv-Fragmente usw. Weiterhin können die Antikörper oder Fragmente davon gegen die vorstehend erwähnten Polypeptide unter Verwendung von Verfahren erhalten werden, die z. B. in: Harlow und Lane, „Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988 beschrieben werden. Diese Antikörper können zum Beispiel für die Immunpräzipitation und die Immunlokalisierung der varianten MDR-1-Proteine der Erfindung verwendet werden, sowie für die Überwachung der Anwesenheit solcher MDR-1-Protein-Varianten zum Beispiel in rekombinanten Organismen, und auch für die Identifizierung von Verbindungen, die mit den Proteinen gemäß der Erfindung in Wechselwirkung treten. So kann zum Beispiel die Oberflächen-Plasmon-Resonanz, die in dem BlAcore-System verwendet wird, angewendet werden, um die Effizienz von Phagen-Antikörpern zu steigern, die an ein Epitop des Proteins der Erfindung binden (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996) 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995) 7-13).
  • Wie in den Beispielen 6 und 8 gezeigt, sind die Polymorphismen, die gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden, insbesondere der Einzel-Nucleotid-Polymorphismus (SNP) C3435T im Exon 26 des MDR-1-Gens, als pharmakogenetischer Faktor nützlich, der die Vorhersage der Blutspiegel verschiedener MDR-1-Substrate und Induktoren für die Verbesserung der Wirkstoff-Sicherheit und -Wirksamkeit ermöglicht, d. h. um Nebenwirkungen und Wirkstoff-Wechselwirkungen vorherzusagen und zu verhindern und um die Compliance des Patienten zu steigern. Solche Substrate und Induktoren sind zum Beispiel krampflösende/anti-epileptische Wirkstoffe wie Phenytoin; Herzglycoside wie Digoxin; immununterdrückende Wirkstoffe wie Cyclosporin A und FK506; Macrolid-Antibiotika wie Clarithromycin und Erythromycin und makrocyclische Antibiotika wie z. B. Rifampin. In Übereinstimmung mit dem Vorstehenden betrifft daher die vorliegende Erfindung auch die Verwendung der vorstehend beschriebenen SNPs als pharmakogenetische Faktoren. Bevorzugt handelt es sich bei dem Polymorphismus um den SNP C3435T in Exon 26 des MDR-1-Gens, entweder alleine oder in Verbindung mit anderen SNPs, wie sie vorstehend beschrieben wurden.
  • Weitere Anwendungen der Polymorphismen, die gemäß der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden, und Mittel und Verfahren, die gemäß den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen verwendet werden können, können im Fachgebiet gefunden werden, wie zum Beispiel in US-A-5,856,104 , wobei die dort beschriebenen Mittel und Verfahren für die Forensik, Vaterschafts-Untersuchungen, Korrelation von Polymorphismen mit phänotypischen Eigenschaften, genetische Kartierung von phänotypischen Eigenschaften usw. gleichfalls gemäß der vorliegenden Erfindung angewendet werden können.
  • Diese und andere Ausführungsformen werden offenbart oder sind aus der Beschreibung und den Beispielen der vorliegenden Erfindung ersichtlich und darin enthalten. Weitere Literatur, die irgendeines der Verfahren, Anwendungen und Verbindungen betrifft, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können aus öffentlichen Bibliotheken zum Beispiel unter Verwendung elektronischer Geräte bezogen werden. So kann zum Beispiel die öffentliche Datenbank „Medline" verwendet werden, die im Internet zur Verfügung steht, z. B. unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Weitere Datenbanken und Adressen wie z. B. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html/, http://www.tigr.org/ sind den Fachleuten bekannt und können ebenfalls erhalten werden, z. B unter Verwendung von http://www.lycos.com. Eine Übersicht über die Patent-Information in der Biotechnologie und eine Übersicht über relevante Quellen von Patent-Information, die für eine retrospektive Suche und für den aktuellen Stand der Forschung nützlich ist, wird in Berks, TIBTECH 12 (1994) 352-364 beschrieben.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1: Ein Gel mit ausgewählten PCR-Fragmenten vor und nach der Reinigung. Agarose(Appli Chem, Darmstadt)Gelelektrophorese (1,5% Agarosegel) von MDR-1-PCR-Fragmenten vor (A) und nach (B) dem Reinigungsschritt. M: Molekulargewichtsmarker, 1-28: PCR-Fragmente, die die Sequenzen der Exons 1-28 des menschlichen MDR-1-Gens enthalten, einschließlich relevanter Sequenzen, die diese Exons flankieren.
  • 2: Beispiele für homozygote und heterozygote MDR-1-Allele. Die Sequenzen der PCR-Fragmente, die die Sequenzen der Exons 1-28 des menschlichen MDR-1-Gens enthalten, einschließlich relevanter Sequenzen, die diese Exons flankieren, wurden durch automatische Sequenzierung unter Verwendung des ABI-Dyeterminator-Verfahrens bestimmt. Heterozygote und homozygote Abweichungen von der veröffentlichten MDR-1-Sequenz können in den DNA-Sequenzprofilen direkt nachgewiesen werden.
  • 3: Beispiele für die Diagnose homozygoter und heterozygoter MDR-1-Allele. Agarose(Appli Chem, Darmstadt)Gelelektrophorese (1,5% Agarosegel) von Allelspezifischen PCR-Fragmenten des Exons 2 (261 Bp) und des Exons 5 (180 Bp).
  • Die Erfindung wird nun durch Bezugnahme auf die folgenden biologischen Beispiele beschrieben, die nur der Erläuterung dienen und nicht als Einschränkung des Rahmens der vorliegenden Erfindung angesehen werden sollten.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Isolierung genomischer DNA aus menschlichem Blut, Erzeugung und Reinigung von MDR-1-Genfragmenten
  • Die genomische DNA wurde durch Ionenaustausch-Chromatographie-Standardverfahren erhalten (Qiagen-Kits für die Isolierung genomischer DNA aus Blut). Das Blut aller Individuen, die untersucht wurden (Freiwillige aus dem Department of Pharmacology der Charité Berlin) wurde unter Berücksichtigung aller rechtlichen, ethischen und medizinischen sowie bürokratischen Vorschriften des Charité-Klinikums in Berlin, Deutschland, gewonnen.
  • Es wurden spezifische Oligonucleotid-Primer verwendet, 2 für jedes Fragment, um durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) definierte DNA-Fragmente zu erhalten, die spezifische Teile des menschlichen MDR-1-Gens enthielten. Diese spezifischen Oligonucleotid-Primer wurden so konstruiert, dass sie an Sequenzen stromaufwärts und stromabwärts der verschiedenen Exons des MDR-1-Gens banden. Die so erhaltenen DNA-Fragmente codierten nicht nur die Exonsequenzen, sondern auch Teile der Intronsequenzen an den Exon-Intron-Grenzen. Von solchen Intronsequenzen, die sich nahe den Exons befinden, ist bekannt, dass sie für die korrekte Prozessierung und die anschließende Expression der das Protein codierenden mRNA wichtig sind, ein Prozess, der als „Spleißen" bekannt ist. Die Oligonucleotid-Primerpaare, die für jedes der 28 Exons des menschlichen MDR-1-Gens optimiert wurden, wurden synthetisiert und durch Affinitäts-Chromatographie (OPC-Kartuschen) gereinigt. Die Sequenz jedes Primers ist in der Tabelle 1 aufgelistet.
  • Die Polymerase-Kettenreaktionen wurden unter Bedingungen durchgeführt, die für jedes der Fragmente, die die 28 Exons des menschlichen MDR-1-Gens sowie die Promotor- und die Enhancer-Kernregion abdeckten, optimiert wurden. Die PCRs wurden für alle Exons in einem Reaktionsvolumen von 25 μl durchgeführt. Es wurden 50 ng DNA-Matrize einem Standard-PCR-Puffer (Qiagen, Hilden) zugegeben, der 1,5 mM MgCl2 (Qiagen, Hilden), 50 μM dNTPs (Qiagen, Hilden), 25 pMol jedes Primers (Metabion, München) und 0,625 E Taq-Polymerase (Qiagen, Hilden) enthielt. Alle PCRs wurden auf einem Perkin Elmer-Thermozyklusgerät (Modell 9700) durchgeführt und zwar mit einem anfänglichen Denaturierungsschritt von 2 Min. bei 94°C und 36 Amplifikationszyklen mit 45 Sek. Denaturierung bei 94°C, 45 Sek. Primer-Anlagerung, wobei die Temperatur von der Schmelztemperatur des Primers abhing (PCR-Bedingungen: A-H), und 45 Sek. bei 72°C, gefolgt von einer abschließenden Verlängerung bei 72°C über 5 Min. Für die individuellen PCR-Bedingungen A-H wurden die folgenden Anlagerungs-Temperaturen verwendet: A: 53°C; B: 56°C; C: 55°C, D: 57,5°C; E: 58°C; F: 59°C; G: 54°C und H: 60°C.
  • Für alle Fragmente (Promotor und Enhancer) wurden die PCRs in einem Reaktionsvolumen von 50 µl durchgeführt. Es wurden 50 ng DNA-Matrize (Ausnahme: 100 ng für die Promotor-Fragmente 1-3) einem Standard-PCR-Puffer (Qiagen, Hilden) zugegeben, der 1,5 mM MgCl2 (Qiagen, Hilden), 200 µM dNTPs (Qiagen, Hilden), 30 pMol jedes Primers (Metabion, München; Ausnahme: 20 pMol für das Enhancer-Fragment 1) und 1 E Taq-Polymerase (Qiagen, Hilden) enthielt. Alle PCRs wurden auf einem Perkin Elmer-Thermozyklusgerät (Modell 9700) durchgeführt und zwar mit einem anfänglichen Denaturierungsschritt von 3 Min. bei 94°C und verschiedenen Amplifikationszyklen (30 für die Promotor-Fragmente 2 + 4 und das Enhancer-Fragment 1; 31 für das Promotor-Fragment 3; 32 für das Promotor-Fragment 1 und das Enhancer-Fragment 2) mit 30 Sek. Denaturierung bei 94°C, 30 Sek. Primer-Anlagerung, wobei die Temperatur von der Schmelztemperatur des Primers abhing (PCR-Bedingungen: A und B), und 30 Sek. bei 72°C gefolgt von einer abschließenden Verlängerung bei 72°C über 2 Min. Für die individuellen PCR-Bedingungen A und B wurden die folgenden Anlagerungs-Temperaturen verwendet: A: 58°C; B: 56°C.
  • Die optimierten PCR-Bedingungen und die resultierende Größe der gewünschten und auf diese Weise erhaltenen Fragmente sind in Tabelle 1 aufgelistet. Beispiele für die so erhaltenen MDR-1-Genfragmente, die für die weitere Analyse des individuellen Genotyps verwendet wurden, werden in 1 gezeigt.
  • Die definierten DNA-Fragmente, die spezifische Teile des menschlichen MDR-1-Gens enthielten, d. h. Exonsequenzen sowie Teile der Intronsequenzen an den Exon-Intron-Grenzen, wurden weiter bearbeitet, um nicht eingebaute Nucleotide und Pufferbestandteile zu entfernen, die andernfalls die anschließende Bestimmung des individuellen MDR-1-Genotyps durch direkte DNA-Sequenzierung beeinträchtigen könnten. Für diese Reinigung wurden Ionenaustausch-Chromatographie-Standard-Verfahren verwendet (Qiagen-Kits für die Reinigung von PCR-Fragmenten). Bei allen Fragmenten wurden ausreichende Mengen an gereinigten Fragmenten erhalten, die für die direkte DNA-Sequenzanalyse geeignet waren. Beispiele für gereinigte MDR-1-Genfragmente, die für die direkte Sequenzanalyse des individuellen MDR-1-Genotyps verwendet wurden, werden in 1 gezeigt.
  • Beispiel 2: Identifizierung unterschiedlicher Allele des MDR-1-Gens durch die Bestimmung der Sequenzen von verschiedenen Individuen
  • Für die Sequenzanalyse der relevanten Regionen des menschlichen MDR-1-Gens aus vielen unterschiedlichen Individuen wurde eine PCR-Amplifikation der relevanten Regionen des MDR-1-Gens durchgeführt (vergleiche mit Tab. 1), und die gereinigten PCR-Produkte wurden anschließend mittels etablierter Verfahren sequenziert (ABI-Dyeterminator-Zyklus-Sequenzierung). Ein sehr wichtiger Parameter, der bei der Verwendung dieses Ansatzes berücksichtigt werden musste, war, dass jedes normale menschliche Individuum zwei MDR-1-Genkopien trägt. Aufgrund dieser Diploidie (der autosomalen Gene, und MDR-1 wird autosomal codiert) musste die Auswertung der Sequenzen sehr sorgfältig erfolgen, damit es möglich war, nicht nur homozygote Sequenzvarianten, sondern auch heterozygote Sequenzvarianten eindeutig zu identifizieren. Aus diesem Grund verließen wir uns niemals auf nur eine identifizierte Sequenz, sondern bestimmten immer mindestens zwei Sequenzen für jedes definierte MDR-1-Genfragment aus jedem Individuum; dies erfolgte durch die Sequenzierung der beiden gegenläufigen DNA-Stränge.
  • Bei der anfänglichen Auswertung der MDR-1-Genvarianten in der menschlichen Population wurde die Sequenzanalyse der relevanten Regionen, die alle Exons des menschlichen MDR-1-Gens umfassten, mit der genomischen DNA aus 24 verschiedenen Individuen durchgeführt. Diese Zahl an individuellen Proben wurde dann für ausgewählte MDR-1-Genfragmente erweitert, von denen einige aus 127 Individuen analysiert wurden. Die Sequenzen wurden manuell auf das Auftreten von DNA-Sequenzen hin inspiziert, die von den veröffentlichten MDR-1-Sequenzen abwichen, welche in dieser gesamten Arbeit als „Wildtyp"-Sequenzen angesehen werden. Da die Populationsgenetik eine Berechnung der erwarteten Häufigkeit von homozygoten gegenüber heterozygoten Allelen eines definierten Gens ermöglicht (Hardy-Weinberg-Gleichung: p2 + 2pq + q2 = 1), war es auch möglich, die (nach dieser Gleichung) vorhergesagte Verteilung von homozygoten gegenüber heterozygoten Allelen und Abweichungen durch die experimentellen Befunde zu bestätigen. Dies diente als interne Kontrolle und Bestätigung, dass eine nachgewiesene Sequenzabweichung tatsächlich ein neues Allel darstellt.
  • Unter Anwendung dieses Ansatzes wurden mehrere neue Sequenzvarianten des MDR-1-Gens entdeckt und experimentell bestätigt; diese werden in 2 gezeigt. 8 Polymorphismen traten in den Intronsequenzen auf, die die Exons 5, 6, 12 und 17 nahe flankieren (SEQ ID NO: 91, 154 und 160 für Exon 5), (SEQ ID NO: 101 und 166 für Exon 6), (SEQ ID NO: 116 für Exon 12) und (SEQ ID NO: 119 und 172 für Exon 17). 7 Polymorphismen wurden in der codierenden Region gefunden, 2 in den Exons 2 und 26 und jeweils einer in den Exons 5, 11 und 12 und einer in dem nicht codierenden Exon 1 (SEQ ID NO: 79 und 85 (für Exon 2), 122 und 178 (für Exon 26), 97 (für Exon 5), 106 (für Exon 11), 112 (für Exon 12) und 73 (für Exon 1). 3 Variationen führten zu Veränderungen der Aminosäuresequenz des MDR-1-Proteins (SEQ ID NO: 85 (N21D) beziehungsweise 97 (F103S) und 106 (S400N). Diese Veränderungen führen zu einer Veränderung des MDR-Proteins. Eine Veränderung, die das Protein nicht verändert, ist direkt vor dem ATG-Translations-Start-Codon lokalisiert (SEQ ID NO: 79). Es ist bekannt, dass diese Position für den Grad der Expression eines Proteins sehr wichtig ist, indem sie die Effizienz der Translation kontrolliert. Weitere Polymorphismen verändern die Aminosäure-Zusammensetzung des MDR-1-Proteins nicht, aber sie sind dennoch nützliche Hilfsmittel für die Bestimmung des MDR-1-Genotyps, weil jede dieser Varianten ein neues MDR-1-Allel definiert. Es ist bekannt, dass die Expression des MDR-1-Gens zwischen den verschiedenen Individuen stark variiert, und eine sehr wahrscheinliche Erklärung für diese Variabilität in den Expressionsspiegeln sind die allelischen Unterschiede im MDR-1-Gen direkt sowie in den Regionen, die es umgeben. Daher können alle neuen und definierten MDR-1-Allele als Marker für die Bestimmung des MDR-1-Genstatus von Patienten dienen. Die Bedeutung dieser Bestimmung des MDR-1-Genotyps für die Diagnose und die Therapie von Erkrankungen ist den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt, und sie wurde in dem einführenden Abschnitt in Einzelheiten erklärt.
  • Die exakten Positionen und weitere Details der neuen MDR-1-Allele, einschließlich der genauen neuen Sequenzen und Sequenz-Abweichungen sowie der homozygoten vs. heterozygoten Verteilung der Allele in der Population sind in Tabelle 2 aufgelistet. Die erwartete Häufigkeit für homozygote Individuen des varianten Allels wurde auf Grundlage der Hardy-Weinberg-Verteilung berechnet. Die abweichende Base in der Sequenz ist fett gedruckt und unterstrichen. 2 zeigt Beispiele für die Entdeckung und das Auftreten neuer Varianten in den DNA-Proben von homozygoten und heterozygoten Individuen.
  • Beispiel 3: Verfahren für den spezifischen Nachweis und die Diagnose der MDR-1-Allele
  • Verfahren für den Nachweis der verschiedenen MDR-1-Allele, die identifiziert wurden, verwenden das Prinzip, dass spezifische Sequenzunterschiede in Reagenzien für die Unterscheidung von Allelen translatiert werden können. Diese Reagenzien liefern das nötige Grundgerüst für die Entwicklung von diagnostischen Tests. Beispiele für solche Reagenzien umfassen Oligonucleotide, die von der Wildtyp-MDR-1-Sequenz in dem neu identifizierten Basenaustausch abweichen, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Die Prinzipien der diagnostischen Tests für die Bestimmung des individuellen MDR-1-Genstatus umfassen oft Unterschiede in der Hybridisierungseffizienz solcher Reagenzien mit den verschiedenen MDR-1-Allelen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Denn darüber hinaus können Unterschiede in der Effizienz solcher Reagenzien, oder als unterschiedliche Substrate, bei enzymatischen Reaktionen angewendet werden, wie z. B. Ligasen oder Polymerasen oder Restriktionsenzyme. Die Prinzipien dieser Tests sind den Fachleuten wohlbekannt. Beispiele sind PCR- und LCR-Verfahren, Chip-Hybridisierungen oder MALDI-TOF-Analysen. Solche Verfahren werden im Fachgebiet beschrieben, wie z. B. PCR-Verfahren: Newton (1984), PCR, BIOS Scientific Publishers, Oxford; LCR-Verfahren: Shimer, Ligase chain reaction, Meth. Mol. Biol. 46 (1995) 269-278; Chip-Hybridisierung: Ramsay, DNA chips, State-of-the art, Nature Biotechnology 16 (1998) 40-44 und MALDI-TOF-Analyse: Ross, High level multiplex genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry, Nature Biotechnology 16 (1998) 1347-1251. Andere Testprinzipien basieren auf der Verwendung von Reagenzien, die die MDR-1-Variante in Form des translatierten und exprimierten Proteins spezifisch erkennen. Beispiele dafür sind Allel-spezifische Antikörper, Peptide, Substrat-Analoga, Inhibitoren oder andere Stoffe, die an die verschiedenen Formen des MDR-1-Proteins binden (und in einigen Fällen auch ihre Wirkung modifizieren), die durch die neuen MDR-1-Allele codiert werden. Die hier vorgestellten Beispiele, die die Prinzipien von diagnostischen Tests mit Reagenzien demonstrieren sollen, welche aus den neuen, in dieser Anwendung definierten Nucleotidaustauschen abgeleitet wurden, basieren auf PCR-Verfahren. Es ist offensichtlich, dass unter Verwendung der beschriebenen spezifischen Reagenzien jedes beliebige der anderen Verfahren ebenfalls für die Unterscheidung von MDR-1-Allelen eingesetzt werden kann.
  • Beispiel 4: Diagnose von MDR-1-Allelen durch spezifische PCR
  • Die Allel-spezifische PCR ist ein Verfahren, das den Fachleuten wohlbekannt ist und das die Unterscheidung der verschiedenen Allele eines Gens durch die Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion mit Reagenzien (Primer-Kombinationen) erlaubt, die für den Nachweis von Einzelallel-Sequenzen entworfen wurde. Der Hauptbestandteil eines solchen Tests und das einzige Reagenz, das die Spezifität eines solchen Tests bereitstellt, sind die Oligonucleotide, die so entworfen werden, dass sie Sequenzen enthalten, die zwischen den unterschiedlichen Allelen eines Gens spezifisch unterscheiden.
  • In diesem Beispiel wurden spezifische Oligonucleotide konstruiert, die zwischen den unterschiedlichen MDR-1-Allelen aufgrund ihrer unterschiedlichen Hybridisierungseffizienz mit den verschiedenen Allelen, sowie aufgrund ihrer unterschiedlichen Fähigkeit, als Substrate für enzymatische Reaktionen zu dienen (wobei das Enzym in diesem Beispiel eine hitzestabile Polymerase ist), unterscheiden können. Die Reagenzien, die spezifisch konstruiert wurden und in der Lage sind, die Anwesenheit und/oder die Abwesenheit eines neu definierten MDR-1-Allels in einem menschlichen Individuum nachzuweisen, werden als spezifische Primer-Kombinationen für jedes neue Allel in Tabelle 3 aufgelistet. Die Konstruktion dieser Reagenzien basiert auf den neu entdeckten Nucleotidsequenzen und Basenaustauschen im menschlichen MDR-1-Gen, die im Beispiel 2 dargestellt und in Tabelle 2 und in 2 aufgelistet sind. Neben der Konstruktion der spezifischen Reagenzien bedürfen die diagnostischen Tests, die auf dem Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion basieren, der Optimierung der Testbedingungen, d. h. optimierte PCR-Bedingungen. Das Ergebnis eines Tests wird in einem solchen Fall als Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen DNA-Fragments aufgezeigt, das unter Verwendung genomischer DNA aus einem menschlichen Individuum als zu untersuchender Bestandteil (Matrize) erhalten wurde. Die Herstellung der genomischen DNA aus dem Blut von Individuen wird in Beispiel 1 beschrieben.
  • Die PCRs wurden für alle Fragmente in einem Reaktionsvolumen von 20 µl durchgeführt. Es wurden 50 ng DNA-Matrize einem Standard-PCR-Puffer (Qiagen, Hilden) zugegeben, der 1,5 mM MgCl2, 250 µM dNTPs (Qiagen, Hilden), 1 × Q-Lösung (Qiagen, Hilden), 20 pMol jedes Primers (Metabion, München, spezifischer WT-Primer + gemeinsamer Primer und spezifischer MUT-Primer + gemeinsamer Primer) und 1 E Taq-Polymerase (Qiagen, Hilden) enthielt. Alle PCRs wurden auf einem Perkin Elmer-Thermozyklusgerät (Modell 9700) durchgeführt und zwar mit einem anfänglichen Denaturierungsschritt von 3 Min. bei 95°C und 30 Amplifikationszyklen mit 30 Sek. Denaturierung bei 94°C, 30 Sek. Primer-Anlagerung, wobei die Temperatur von der Schmelztemperatur des Primers abhängig war (PCR-Bedingungen: A-E), und 30 Sek. bei 72°C gefolgt von einer abschließenden Verlängerung bei 72°C über 8 Min. Für die individuellen PCR-Bedingungen A-E wurden die folgenden Anlagerungs-Temperaturen verwendet: A: 54°C; B: 58°C; C: 50°C, D: 61°C; E: 53°C.
  • Die abweichenden Basen in der entsprechenden spezifischen Primersequenz sind unterstrichen und fett gedruckt. Die Anwesenheit oder die Abwesenheit eines spezifischen DNA-Fragments bei diesem Testansatz resultiert in der An- oder der Abwesenheit des untersuchten Allels.
  • Beispiele für solche Auswertungen als Ergebnis einer MDR-1-Allele nachweisenden Diagnose werden in 3 gezeigt. Aus diesen Beispielen (Tab. 3, 3) ist offensichtlich, dass diese Tests für die Unterscheidung der Anwesenheit der analysierten MDR-1-Allele bei Menschen geeignet sind. Es können homozygote sowie heterozygote, häufige sowie seltene Allele des MDR-1-Gens nachgewiesen werden. Die Spezifität dieser Tests beruht ausschließlich auf und ist vollständig abhängig von den spezifischen Oligonucleotid-Reagenzien, die verwendet wurden. Die Konstruktion dieser Reagenzien war andererseits von der Sequenzinformation der entdeckten MDR-1-Genvarianten und der neuen Allele abhängig, die im Beispiel 2 und in der Tabelle 2 gezeigt werden.
  • Beispiel 5: Diagnose und Korrelation verschiedener MDR-1-Polymorphismen mit den Expressionsspiegeln und der in vivo-Aktivität von MDR-1 in Patienten
  • Um mögliche direkte Korrelationen der MDR-1-Polymorphismen mit klinisch relevanten Phänotypen in Menschen zu identifizieren, wurden Probanden aus einer Studie am Dr. Margarete Fischer-Bosch-Institut für Klinische Pharmakologie in Stuttgart der Bestimmung der MDR-1-Polymorphismen, wie in den Beispielen 2-4 beschrieben, unterzogen. Die Expressionsspiegel des MDR-1-Gens im Colon und in der Leber dieser Patienten wurden auch durch einen etablierten immunhistochemischen Nachweis des MDR-1-Proteins ermittelt. Neben den Messungen der Expressionsspiegel von MDR-1 im Colon wurden in der Probanden-Population auch Messungen von MDR-1 nach der Induktion des Gens durch Rifampicin durchgeführt. Ebenso wurde die in vivo-Aktivität von MDR-1 unter nicht-induziert und unter Rifampicin-induzierten Bedingungen bestimmt, dies erfolgte durch die Messung der Blutkonzentrationen von oral verabreichtem Digoxin (1 mg), das ein bekanntes MDR-1-Substrat darstellt und dessen Konzentration im Blut auch von der MDR-1-Aktivität im Colon abhängt.
  • Die Ergebnisse der MDR-1-Messungen, der Rifampicin-Induktions-Experimente und der Digoxin-Experimente sowie die Ergebnisse der MDR-1-Polymorphismus-Nachweisanalyse in der Probanden-Population zeigt Korrelationen zwischen der MDR-1-Genexpression und der in vivo MDR-1-Aktivität bei bestimmten Polymorphismen.
  • MDR-1-Proteinspiegel:
  • Wie in Tabelle 4 gezeigt, korreliert der T/C-Polymorphismus an Position 176 im Exon 26 in (Zugangs-Nrn. M29445/J05168) mit dem Expressionsspiegel von MDR-1. Die Anwesenheit des T-Allels an dieser Position weist auf einen niedrigeren MDR-1-Expressionsspiegel im Vergleich zu Proben hin, die nur das entsprechende C-Allel homozygot aufweisen. Der Mittelwert der durch Rifampicin induzierten MDR-1-Spiegel in der Population mit dem C-Allel ist viel höher als derjenige in der T-Population (924 gegenüber 587 relative Einheiten). Damit in völliger Übereinstimmung steht, dass ein Proband, der für das T-Allel homozygot war, den niedrigsten nachweisbaren MDR-1-Spiegel im nicht-induzierten sowie im induzierten Zustand aufwies, während ein für das C-Allel homozygoter Proband den höchsten Spiegel aller untersuchten Probanden besaß. Der Unterschied in den induzieren MDR-1-Expressionsspiegeln zwischen diesen Individuen war 9-fach.
  • In vivo-MDR-1-Aktivität:
  • Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse der Messungen der in vivo-Aktivität von MDR-1 unter nicht-induzierten und unter Rifampicin-induzierten Bedingungen. Dies wurde durch die Messung der Blutkonzentrationen von oral verabreichtem Digoxin ermittelt, das ein bekanntes MDR-1-Substrat darstellt und dessen Konzentration im Blut auch von der MDR-1-Aktivität im Colon abhängig ist. In Übereinstimmung mit der Beobachtung, dass der T/C-Polymorphismus an Position 176 in der Sequenz mit den Zugangs-Nrn. M29445/J05168 im Exon 26 mit dem Expressionsspiegel von MDR-1 korreliert, wurde eine Korrelation dieses Polymorphismus mit den Spiegeln an Digoxin im Blut beobachtet, die wiederum die Aktivität des MDR-1-Proteins in vivo widerspiegeln. Probanden, die das T-Allel besaßen (korreliert mit schwächerer MDR-1-Expression, vergleiche mit Tabelle 4), enthielten höhere Spiegel an Digoxin im Blut im Vergleich zu Probanden, die nur das C-Allel homozygot aufwiesen. Der Grund dafür ist, dass die Aufnahme von MDR-1-Substraten wie z. B. Digoxin aus dem Colon in das Blut in Menschen mit niedrigerer MDR-1-Expression effektiver zu sein scheint. Dies stimmt mit der Funktion von MDR-1-Transporters im Colon vollkommen überein, d. h. Re-Transport und Eliminierung von Substraten aus den aufnehmenden Zellen in das Lumen des Colon. Der Mittelwert der nicht-induzierten sowie der durch Rifampicin induzierten Digoxin-Konzentrationen im Blut (die invers mit der MDR-1-Aktivität korreliert ist) der C-Allel-Population ist ständig niedriger als derjenige in der T-Population (63,9 gegenüber 44,9 beziehungsweise 45 gegenüber 28,6 Dig, AUC, induziert). Damit in völliger Übereinstimmung steht, dass ein Proband, der für das T-Allel homozygot war, die höchste nachweisbare Digoxin-Konzentration im Blut nach der Induktion durch Rifampicin aufwies (57,3 Dig, AUC) und ein für das C-Allel homozygoter Proband den niedrigsten Spiegel aller Probanden besaß (12,3 Dig, AUC). Der Unterschied der Digoxin-Blutspiegel zwischen diesen Individuen betrug über 4-fach.
  • MDR-1-Expression in einer Patienten-Population:
  • Die Ergebnisse unserer Analyse der Korrelation zwischen den MDR-1-Expressionsspiegeln, der MDR-1-Protein-Aktivität und der Nachweisanalyse des MDR-1-Polymorphismus werden durch die Analyse der MDR-1-Expression und die MDR-1-Genotypisierung verschiedener Patienten aus dem Dr. Margarete Fischer-Bosch-Institut für Klinische Pharmakologie in Stuttgart weiter bestätigt. Mit den verschiedenen Gewebeproben der Patienten, insbesondere aus Colon und Leber, wurden immunhistologische Unersuchungen durchgeführt, und dann wurden sie miteinander verglichen, um einen relativen Vergleich des MDR-1-Proteins zwischen diesen Proben zu ermöglichen. Bei jeder Experimentenreihe wurden die Patientenproben entsprechend ihrer MDR-1-Färbungsintensität eingeteilt, d. h. die Einstufung als 1. Rang entspricht der höchsten MDR-1-Intensität und die als letzter Rang der niedrigsten MDR-1-Intensität.
  • Die Korrelation dieser Klassifikationsanalyse mit dem MDR-1-Genotyp zeigt, dass das T-Allel des Polymorphismus an Position 176 in der Sequenz mit den Zugangs-Nrn. M29445/J05168 im Exon 26 mit einer niedrigeren Expression des MDR-1-Gens, im Vergleich mit Patienten korreliert, die an dieser Position das C-Allel homozygot aufweisen. Bei dieser Analyse zeigten auch zwei andere Polymorphismen eine gewisse Korrelation mit der MDR-1-Expression: ein homozygoter T-Genotyp an Position 171466 in AC002457 (Intron 4) kann mit einer hohen Expression korrelieren, und ein Polymorphismus (G/A) an Position 101 im Exon 11 (M29432/J05168) kann mit einer niedrigen Expression korrelieren.
  • Beispiel 6: Validierung der Genotyp/Phänotyp-Korrelation des (C3435T)-Polymorphismus im Exon 26 mit einer erweiterten Probenzahl
  • Um die Korrelation des Einzel-Nucleotid-Polymorphismus (SNP) T/C an Position 176 in der Sequenz mit den Zugangs-Nrn. M29445/J051680, der in den vorstehenden Beispielen beschrieben wurde und nun als MDR-1-Exon 26-SNP-C3435T bezeichnet wird (die Position entspricht der MDR-1-cDNA mit der Genbank-Zugangs-Nr. AF016535, Codon TTC im Exon 10, d. h. F335 fehlt in dieser Sequenz, die erste Base des ATG-Start-Codons wird als 1 gesetzt), mit den Spiegeln der MDR-1-Expression im Darm weiter zu bestätigen (erste Ergebnisse wurden in Beispiel 5 gezeigt), wurden zusätzliche Freiwillige in einer weiteren experimentellen Studie am Dr. Margarete Fischer-Bosch-Institut für Klinische Pharmakologie in Stuttgart analysiert. Die Expressionsspiegel von MDR-1 im Darm dieser Freiwilligen und Patienten waren bereits durch quantitative Immunhistochemie und Western-Blot-Analysen von Biopsien und Darmzellen-Präparaten des Zwölffingerdarms bestimmt worden. Um abzusichern, dass diese Analyse die spezifische PGP-Expression in den Darmzellen widerspiegelt, wurde ein zusätzliches Markerprotein, das in Darmzellen exprimiert wird, d. h. Villin, gleichzeitig analysiert. Die Ergebnisse dieser Analyse werden in 4 gezeigt. Der T/T-Genotyp ist mit signifikant niedrigeren MDR-1- Expressionsspiegeln im Vergleich zu dem C/C-Genotyp assoziiert. Individuen mit dem C/T-Genotyp zeigen einen intermediären Phänotyp.
  • Für eine weitere Validierung der Korrelation des MDR-1-Genotyps mit der Digoxin-Aufnahme im Darm wurden zusätzliche Freiwillige einer anderen klinischen Studie an dem Universitären Medizinischen Zentrum der Charité in Berlin, bei der die Blutspiegel von Digoxin nach oraler Einnahme (ohne Rifampicin-Induktion und Bestimmung des PGP-Proteins, Johne et al. (1999) Clin. Pharmacol. Thr. 66, 338-345) untersucht wurden, auf ihren MDR-1-Genotyp im Exon 26 hin getestet. Bei dieser Studie wurden die maximalen Plasmakonzentrationen (Cmax) während Fließgleichgewichtsbedingungen von Digoxin untersucht. Dieser pharmakokinetische Parameter offenbart besonders Unterschiede in der Absorption von Digoxin zwischen den verschiedenen Gruppen. 5 zeigt einen Vergleich der Cmax-Werte für Digoxin von 7 Freiwilligen, die das T/T-Allel homozygot aufwiesen, und 7 Freiwilligen mit dem homozygoten C/C-Genotyp im Exon 26. Freiwillige, die für das T-Allel homozygot waren, zeigten signifikant höhere Spiegel an Digoxin im Vergleich zu Freiwilligen mit dem C/C-Genotyp. Der mittlere Unterschied von 38% in Cmax von Digoxin zwischen den Gruppen ist statistisch signifikant (p = 0,006, Mann Whitney U-2 Proben-Test) und spiegelt den Einfluss dieses Polymorphismus auf die Pharmakokinetik von Digoxin wider.
  • 4: Korrelation des SNPs im Exon 26 mit der MDR-1-Expression unter nicht-induzierenden Bedingungen. Der MDR-Phänotyp (Expression und Aktivität) von 21 Freiwilligen und Patienten wurde durch Western-Blot-Analyse bestimmt. Die Abbildung zeigt die Verteilung der MDR-1-Expression, die entsprechend des MDR-1-Genotyps des relevanten SNP im Exon 26 verteilt ist. Die Genotyp-Phänotyp-Korrelation besitzt eine Signifikanz von p = 0,056 (N = 21).
  • Figure 00370001
  • 5: Korrelation des MDR-1-Genotyps und der Digoxin-Aufnahme in vivo. Der MDR-1-Genotyp im Exon 26 wurde in 14 gesunden Freiwilligen analysiert, die an einer klinischen Studie teilnahmen, bei der die Blutspiegel von Digoxin während Fließgleichgewichtsbedingungen untersucht wurden (Johne et al. (1999) Clin. Pharmacol. Thr. 66, 338-345). Es wurde ein statistisch signifikanter Unterschied (p = 0,006; Mann-Whitney U 2-Probentest) bei dem Vergleich der maximalen Konzentrationen (Cmax) von Digoxin zwischen den beiden Gruppen von je 7 gesunden Freiwilligen gefunden, die entweder den T/T- oder den C/C-Genotyp aufwiesen. Der mittlere Unterschied von 38% in Cmax könnte die Bedeutung des Genotyps auf die Absorption von Digoxin nach der oralen Anwendung widerspiegeln. Es wurde eine Dosis von 0,25 mg beim Fließgleichgewicht von Digoxin verwendet.
  • Figure 00380001
  • Beispiel 7: Identifizierung neuer MDR-1-Polymorphismen durch Sequenzanalyse einer großen Gruppe verschiedener Individuen
  • Eine erweitere Suche nach SNPs im menschlichen MDR-1-Gen offenbarte neben den verschiedenen neuen MDR-1-Polymorphismen zahlreiche weitere neue Polymorphismen im MDR-1-Gen, die in Tabelle 8 aufgelistet sind. Bei dieser neuen Suche wurde die Zahl an individuellen Proben auf alle MDR-1-Exons sowie auf die MDR-1-Promotorfragmente ausgeweitet, von denen einige bei 236 Individuen untersucht wurden.
  • Es ist möglich, dass neben dem SNP (C3435T) im Exon 26 des MDR-1-Gens, der verwendet werden kann, um die PGP-Expression vorherzusagen, andere seltenere Polymorphismen in Regionen des MDR-1-Gens ebenfalls einen Einfluss auf die Expression ausüben. So ist es z. B. sehr wahrscheinlich, dass Polymorphismen im Promotor und SNPs, die das Protein verändern, eine zusätzliche Wirkung auf die MDR-1-Expression und Aktivität haben. Darüber hinaus können diese neuen Polymorphismen genutzt werden, um den genauen individuellen MDR-1-Genotyp zu bestimmen – d. h. die Allel-Zusammensetzung – die für jedes Individuum einzigartig sein kann und die daher sehr nützlich ist, um die individuelle, von MDR-1 abhängige Antwortreaktion auf Wirkstoffe vorherzusagen.
  • Je mehr Polymorphismen im menschlichen MDR-1-Gen bekannt werden, desto vollständiger und somit auch nützlicher wird eine Beschreibung des individuellen MDR-1-Genotyps sein. Die Identifizierung dieser 32 neuen MDR-1-Polymorphismen ist ein weiterer wichtiger Schritt in Richtung auf das Ziel einer Etablierung der vielen unterschiedlichen MDR-1-Genotypen, durch die das Ergebnis und die Nebenwirkungen einer Wirkstofftherapie vorhergesagt werden können.
  • Beispiel 8: Bestimmung des Polymorphismus (C3435T) im Exon 26 des MDR-1-Gens als pharmakogenetischer Faktor, der die Wirkstoff-Spiegel in Kombination mit anderen pharmakogenetischen Faktoren beeinflusst.
  • Der krampflösende Wirkstoff Phenytoin wird üblicherweise bei der Therapie der Epilepsie, der akuten und chronischen Unterdrückung von ventrikulären Arrhythmien und bei Digitalis-Vergiftung verwendet. Der enge therapeutische Bereich und eine Reihe an schweren Nebenwirkungen in Kombination mit einer nicht-linearen Pharmakokinetik (d. h. überproportionale Steigerung der Plasmaspiegel als Antwort auf eine Erhöhung der Dosis) stellen eine Herausforderung bei den Behandlung mit Phenytoin dar, und geeignete Parameter, um die Plasmaspiegel aus einer bestimmten Dosis vorhersagen zu können, sind sehr wünschenswert, um das therapeutische Ergebnis zu verbessern und um Nebenwirkungen zu verhindern.
  • Es ist bekannt, dass die polymorphen Enzyme 2C9 und 2C19 eine Wirkung auf den Stoffwechsel von Phenytoin haben (Mamiya et al., 1998, Epilepsia, Dez. 39(12):1317-23), und es wurde auch gezeigt, dass Defekte in 2C9 zu abnormen Blutspiegeln führen können, die Nebenwirkungen oder eine Unwirksamkeit des Wirkstoffes verursachen können (Aynacioglu et al., 1999, Br. J. Clin. Pharmacol. Sep. 48(3):409-415). Es ist jedoch auch klar, dass die Bestimmung des Genotyps von 2C9 es nicht erlaubt, aus einer bestimmten Dosis eine genaue Vorhersage des Blutspiegels herzuleiten. Sogar bei Individuen, für die der 2C9-Genotyp bestimmt wurde und bei denen der entsprechenden Enzym-Genotyp kompensiert wurde, können die Blutspiegel signifikant variieren.
  • Tabelle 6 zeigt, dass der SNP (C3435T) im Exon 26 des MDR-1-Gens – neben 2C9 – eine deutliche Rolle bei den Phenytoin-Blutspiegeln spielt, und die Bestimmung des MDR-1-Genotyps für diesen SNP eine genauere Korrelation zwischen der Phenytoin-Dosis, dem Genotyp und den Blutspiegeln erlaubt.
  • Innerhalb der mit dem 2C9/19-Enzym genotypisierten Gruppen kann die Variation der Spiegel durch den MDR-1-Genotyp erklärt werden, insbesondere bei den Gruppen von 2C9/C19, die schlechte Metabolisierer darstellen und die bereits einen erhöhten Blutspiegel aufweisen. In diesen Fällen ist die Bestimmung des MDR-1-Genotyps in der Lage, eine Untergruppe von Patienten zu identifizieren, die ein erhöhtes Risiko aufweist, ungewöhnlich hohe Phenytoin-Blutspiegel zu zeigen: schlechte Metabolisierer besitzen den MDR-1-Gentyp T/T. Diese Patienten besitzen ein erhöhtes Risiko für nachteilige Wirkungen des Wirkstoffs bei einer Überdosierung. So zeigte zum Beispiel in einer Gruppe von 100 Patienten, die Phenytoin erhielten, ein 2C9-defizienter Patient mit dem Genotyp für einen niedrigen PGP-Spiegel (T/T) die höchste Konzentration im Blut, was im Vergleich zu der „normalen" Population einer etwa zweifachen Steigerung entspricht. Die Korrelation zwischen dem Cyp-2C9-Gentoyp und den Phenytoin-Spiegeln im Plasma ist statistisch signifikant, aber die Signifikanz erhöht sich, wenn man den MDR-1-T/T-Genotyp als Kovariante berücksichtigt (p < 0,001, ANCOVA) Tabelle 6: Abhängigkeit der Phenytoin-Spiegel von pharmakogenetischen Faktoren
    MDR-1-Genotyp CC und CT TT
    PGP-Konzentration im Darm hoch/mittel niedrig
    Phenytoin-Blutspiegel:
    2C9-Metabolisierer normal normal
    2C9-schwache und/oder defiziente Metabolisierer hoch SEHR HOCH
    Tabelle 1 Teil 1
    Figure 00410001
    Tabelle 1 Teil 2
    Figure 00420001
    Tabelle 1 Teil 3
    Figure 00430001
    Tabelle 2 Teil 1
    Figure 00440001
    Tabelle 2 Teil 2
    Figure 00450001
    Tabelle 2 Teil 3
    Figure 00460001
    Tabelle 2 Teil 4
    Figure 00470001
    Tabelle 3 Teil 1
    Figure 00480001
    Tabelle 3 Teil 2
    Figure 00490001
    Tabelle 4
    Proben PGP-Konzentrationen MDR-1-Genotyp
    Nicht induzierte Probanden Nicht induzierte Probanden, Mittelwert 55 39 276 376 212 T-Allel vorhanden (T/T und T/C) an Position 176 in Zug.-Nr. M29445/J05168 im Exon 26
    Rifampicin-induzierte Probanden Rifampicin-induzierte Probanden, Mittelwert 142 1085 520 601
    Nicht induzierte Probanden Nicht induzierte Probanden, Mittelwert 587 96 302 291 T-Allel nicht vorhanden (nur C/C) an Position 176 in Zug.-Nr. M29445/J05168 im Exon 26
    Rifampicin-induzierte Probanden Rifampicin-induzierte Probanden, Mittelwert 230 423 1264 1086 924
    Niedrigste durch Rifampicin induzierte Aktivität 142,1 Homozygot T/T an Position 176 in Zug.-Nr. M29445/J05168
    Höchste durch Rifampicin induzierte Aktivität 1264,9 Homozygot C/C an Position 176 in Zug.-Nr. M29445/J05168
    Tabelle 5
    Proben Digoxin-Konzentration im Blut MDR-1-Genotyp
    Nicht induzierte Probanden Nicht induzierte Probanden, Mittelwert 63,6 64,1 73,2 54,7 63,9 T-Allel vorhanden (T/T und T/C) an Position 176 in Zug.-Nr. M29445/J05168
    Rifampicin-induzierte Probanden Rifampicin-induzierte Probanden, Mittelwert 57,3 39 45,8 37,7 45
    Nicht induzierte Probanden Nicht induzierte Probanden, Mittelwert 55,6 30,8 48,3 44,9 T-Allel nicht vorhanden (nur C/C) an Position 176 in Zug.-Nr. M29445/J05168
    Rifampicin-induzierte Probanden Rifampicin-induzierte Probanden, Mittelwert 39,6 12,3 33,9 28,6
    Höchster durch Rifampicin induzierter Digoxin-Blutspiegel 57,3 Homozygot T/T an Position 176 in Zug.-Nr. M29445/J05168
    Niedrigster durch Rifampicin induzierter Digoxin-Blutspiegel 12,3 Homozygot C/C an Position 176 in Zug.-Nr. M29445/J05168
  • Tabelle 8 Teil 1
    Figure 00520001
  • Tabelle 8 Teil 2
    Figure 00530001
  • Tabelle 8 Teil 3
    Figure 00540001
  • Tabelle 8 Teil 4
    Figure 00550001
  • Tabelle 8 Teil 5
    Figure 00560001
  • Tabelle 8 Teil 6
    Figure 00570001
  • Tabelle 8 Teil 7
    Figure 00580001
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00590001
  • Figure 00600001
  • Figure 00610001
  • Figure 00620001
  • Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • Figure 00690001
  • Figure 00700001
  • Figure 00710001
  • Figure 00720001
  • Figure 00730001
  • Figure 00740001
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  • Figure 01030001
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  • Figure 01050001
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  • Figure 01070001
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  • Figure 01090001
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  • Figure 01110001
  • Figure 01120001
  • Figure 01130001
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  • Figure 01290001
  • Figure 01300001

Claims (11)

  1. Verfahren zur Diagnose einer erworbenen Multidrug-Resistenz oder -Sensitivität, die in Beziehung steht zu dem Vorhandensein einer molekularen Variante des MDR-1-Gens, umfassend die Bestimmung des Vorhandenseins eines Polynucleotids in einer Probe einer Testperson, wobei das Polynucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) einem Polynucleotid mit der Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 122; (b) einem Polynucleotid, das eine molekulare Variante des Multidrug-Resistenz(MDR)-1-Polypeptids codiert, wobei das Polynucleotid einen Nucleotidaustausch an einer Position aufweist, die der Position 176 des MDR-1-Gens (Zugangsnr. M29445 oder J05168) entspricht; (C) einem Polynucleotid, das eine molekulare Variante des MDR-1-Polypeptids codiert, wobei das Polynucleotid an einer Position ein T aufweist, die der Position 176 des MDR-1-Gens (Zugangsnr. M29445 oder J05168) entspricht; und (d) einem Nucleinsäuremolekül, das komplementär zu dem Polynucleotid nach (a) bis (c) ist; wobei das Vorhandensein des Polynucleotids als Hinweis auf die erworbene Multidrug-Resistenz oder -Sensitivität in diesem Verfahren angesehen wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nucleotidsubstitution zu einer geänderten Expression des varianten MDR-1-Gens im Vergleich zum entsprechenden Wildtyp-Gen führt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die erworbene Multidrug-Resistenz in Tumoren und anderen Krankheiten vorhanden ist, deren Therapie von einer Wirkstoffbehandlung abhängig ist.
  4. Verfahren zur Diagnose einer Krankheit im Zusammenhang mit dem Vorhandensein einer molekularen Variante des MDR-1-Gens oder einer Anfälligkeit für eine solche Krankheit, umfassend die Bestimmung des Vorhandenseins eines wie in Anspruch 1 definierten Polynucleotids in einer Probe einer Testperson.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Krankheit Krebs ist.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend PCR, Ligase-Kettenreaktion, Restriktionsverdau, direktes Sequenzieren, Nucleinsäureamplifikationstechniken, Hybridisierungstechniken oder Immunoassays.
  7. In vitro-Verwendung eines Oligo- oder Polynucleotids zur Diagnose erworbener Multidrug-Resistenz oder -Sensitivität, die im Bezug steht mit dem Vorhandensein einer molekularen Variante des MDR-1-Gens, umfassend die Bestimmung des Vorhandenseins eines Polynucleotids in einer Probe einer Testperson, wobei das Polynucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus. (a) einem Polynucleotid mit der Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 122; (b) einem Polynucleotid, das eine molekulare Variante des Multidrug(MDR)-1-Polypeptids codiert, wobei das Polynucleotid einen Nucleotidaustausch an einer Position aufweist, die der Position 176 des MDR-1-Gens (Zugangsnr. M29445 oder J05168) entspricht; (c) einem Polynucleotid das eine molekulare Variante des MDR-1-Polypeptids codiert, wobei das Polynucleotid an einer Position ein T aufweist, die der Position 176 des MDR-1-Gens (Zugangsnr. M29445 oder J05168) entspricht; und (d) einem Nucleinsäuremolekül, das komplementär zu dem Polynucleotid nach (a) bis (c) ist; wobei das Oligo- oder Polynucleotid für die Bestimmung geeignet ist, und wobei das Vorhandensein des Polynucleotids als Hinweis auf die erworbene Multidrug-Resistenz oder -Sensitivität in diesem Verfahren angesehen wird.
  8. Diagnostisches Mittel, umfassend das wie in Anspruch 1 definierte Polynucleotid oder das Oligo- oder Polynucleotid nach Anspruch 7.
  9. Verwendung des MDR-1-Gen-Einzelnucleotid-Polymorphismus C3435T in Exon 26, der wie in Anspruch 1(a) oder (c) definiert ist, als pharmakogenetischen Faktor zur Herstellung eines diagnostischen Mittels für die Vorhersage von Blutspiegeln eines MDR-1-Substrats und/oder -Induktors zur Verbessung von Wirkstoffsicherheit und -Effizienz, um Nebenwirkungen und Wirkstoffinteraktionen vorherzusagen und abzuwenden und/oder um Patienten-compliance zu erhöhen.
  10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Substrat und/oder der Induktor ausgewählt ist/sind aus krampflösenden/antiepileptischen Mitteln, Herzglykosiden, immunsuppressiven Wirkstoffen, Macrolidantibiotika oder macrocyclischen Antibiotika.
  11. Verfahren zum Auffinden und Erhalten eines MDR-1-Inhibitors, der die Aktivität einer molekularen Variante des MDR-1-Gens modulieren kann, umfassend die Schritte: (a) des Inkontaktbringens einer Zelle, die eine molekulare Variante des MDR-1-Gens exprimiert, das ein wie in Anspruch 1 definiertes Polynucleotid umfasst, in der Anwesenheit von Stoffen, die ein nachweisbares Signal als Antwort auf Wirkstofftransport liefern können, mit einer zu durchmusternden Verbindung unter Bedingungen, die MDR-1-vermittelten Wirkstofftransport erlauben, und (b) des Nachweisens der Anwesenheit oder Abwesenheit eines Signals oder einer Zunahme eines Signals, das von dem Wirkstofftransport erzeugt wurde, wobei die Anwesenheit oder Zunahme des Signals auf einen möglichen Inhibitor hinweist.
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