DE602004009083T2

DE602004009083T2 - Verwendung von humanen oatp-c polymorphismen, die einen effekt auf die pharmakokinetik von statin haben, bei der statin-therapie

Info

Publication number: DE602004009083T2
Application number: DE602004009083T
Authority: DE
Inventors: Helen Jean Macclesfield AMBROSE; Ruth Macclesfield MARCH
Original assignee: AstraZeneca AB
Current assignee: AstraZeneca AB
Priority date: 2003-07-26
Filing date: 2004-07-26
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2024-07-27
Also published as: ES2291899T3; DE602004009083D1; GB0317592D0; EP1651774B1; WO2005012566A2; PL1651774T3; JP4166257B2; JP2007500005A; CY1107801T1; ATE373730T1; WO2005012566A3; PT1651774E; US20070031838A1; EP1651774A2; DK1651774T3; US7700277B2

Description

Hierin wird die Verwendung von Polymorphismen bei humanem OATP-C in einer Statin-Therapie beschrieben, da sie mit einem Effekt auf die Pharmakokinetik (PK) von Statin, insbesondere die Pharmakokinetik von Rosuvastatin bei Menschen in Verbindung gebracht werden. Ebenfalls wird hierin die Verwendung von OATP-C-Polymorphismen bei der Vorhersage der Wirksamkeit und Sicherheit von Statinen, deren Aufnahme in die Leber durch OATP-C vermittelt wird, insbesondere Rosuvastatin, beschrieben.
Das OATP-C-Gen (manchmal LST1, OAPT2, SLCO1B1, SLC21A6 oder OATP1B1 genannt) wurde durch vier verschiedene Gruppen kloniert, annotiert und als die EMBL-Zugangs-Nummern AB026257 (OATP-C, 2452 bp), AF205071 (OATP2, 2830, SEQ ID hierin), AJ132573 (OATP2, 2778) und AF060500 (LST-1) veröffentlicht. Konig (2000) J. Biol. Chem. 275, 23161–23168 beschreibt die genomische Organisation von OATP 1, 2 und 8. Die internationale Patentanmeldung WO 00/08157 beschreibt humane Anionentransportergene und einige Polymorphismen.
Das von Na+ unabhängige, organische Anionen transportierende Polypeptid (OATP)-C-Gen ist ein Mitglied der OATP-Supergen-Familie, die an dem multifunktionalen Transport von organischen Anionen beteiligt ist. OATP-C transportiert eine vielfältige Bandbreite an Molekülen, z. B. das organische Anion Taurocholat, konjugierte Steroide: DHEAS, Estradiol-17β-D-glucoronid und Estron-3-sulfat, Eicosanoide: PGE₂, Thromboxan B₂, Leukotrien C₄ und E₄ und die Schilddrüsenhormone T4 und T3. Es wurde auch gezeigt, dass OATP-C in den Transport von Xenobiotika und Arzneimitteln, die bei der Lipidsenkung mit einbezogen sind, z. B. Statine, involviert ist. Statine sind eine Klasse von Arzneimitteln, die das 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A (HMG-CoA) hemmen. Sie sind eine wichtige Therapie für Patienten mit atherosklerotischen Gefäßerkrankungen und werden im Allgemeinen gut vertragen, obwohl einige seltene unerwünschte Ereignisse bei allen auf dem Markt befindlichen Statinen bemerkt worden sind. Die pharmakokinetischen Unterschiede zwischen den Statinen wurden mit Unterschieden bezüglich des Nutzen-Risiko-Verhältnisses in Verbindung gebracht (Igel (2002) J. Clin. Pharmacol. 42: 835–45).
Es wird allgemein empfohlen, dass, um ein maximales Nutzen-Risiko-Verhältnis aus einer Statin-Therapie zu erlangen, die verschriebene Dosis entsprechend dem Ziel der Therapie und der Antwort individualisiert werden sollte. Zum Beispiel beträgt die empfohlene übliche Anfangsdosis von Rosuvastatin 10 mg einmal täglich bei Patienten mit Hypercholesterolämie und gemischter Dyslipidämie, obwohl eine Dosis von 5 mg ebenfalls zur Verfügung steht. Für Patienten mit einer merklichen Hypercholesterolämie (LDL-C > 190 mg/dl) und aggressiven Lipidzielen kann eine Anfangsdosis von 20 mg in Betracht gezogen werden. Die Dosis von 40 mg sollte jenen Patienten vorbehalten sein, die das LDL-C-Ziel bei 20 mg nicht erreicht haben. Nach dem Beginn und/oder nach einer Titration von Rosuvastatin, sollten die Lipidspiegel innerhalb von 2 bis 4 Wochen analysiert und die Dosierung dementsprechend angepasst werden.
Pravastatin wird aktiv aus dem Blutkreislauf zur Leber über den OATP-C-Transporter transportiert (Hsiang, B., Journal of Biological Chemistry. 274 (52), 37161–37168. 1999). Es wurde gezeigt, dass Rosuvastatin in vitro ein Substrat für OATP-C ist (Brown (2001) Atherosclerosis Supplements 2, S. 90, Poster-Abstract P174). Zahlreiche Polymorphismen bei OATP-C sind in der Literatur und den SNP-Datenbanken berichtet worden. Eine Identifizierung von SNPs bei OATP-C wurde in der EP1186672 berichtet. Ein Polymorphismus bei OATP-C wurde von Tamai et al. (2000), BBRC, 273, 251–60, berichtet und durch Tirona (2002) Adv. Drug Deliery Reviews 54: 1343–52 rezensiert. Tirona zeigte, dass einige OATP-C-Polymorphismen, was die V174A-Variante einschließt, mit einem verringerten Transport von endogenen Substraten in vitro in Zusammenhang standen. Bei der Verwendung eines anderen Zellsystems, haben Nozawa et al. (2001) J. Pharmacol. Exp. Ther., 302, 804–13, herausgefunden, dass die Variante V174A (OATPC*5) den Substrat-Transport nicht beeinflusste. Tirona stellte fest, dass die Bedeutung der OATP-C-Polymorphismen in vivo zu bestimmen blieb.
Niemi et al. (Juli 2004) Pharmacogenetics 14 (7), 429–440, beschreibt SNPs bei OATPC, einschließlich Promotor-SNPs. Die Autoren berichten von einer signifikanten Korrelation zwischen der Pravastatin-PK (Pharmakokinetik) und einem Haplotyp, der einen Promotor-SNP bei einer Gruppe von gesunden Freiwilligen enthält.
Nishizato (2003) Clin. Pharmacol. Ther. 73: 554–65 veröffentlichte in vivo-Daten, die zeigen, dass das Allel OATPC*15, das sowohl die N130D- als auch die V174A-Polymorphismen enthielt, einen Effekt auf die Pharmakokinetik von Pravastatin bei japanischen gesunden Freiwilligen hatte. Nishizato berichtete nicht über den Effekt des Allels OATP-C*5, das in der japanischen Bevölkerung bis heute nicht nachgewiesen wurde, und legte dar, dass große klinische Studien erforderlich sind, um diesen Effekt zu erforschen. Es hat keine pharmakokinetischen Studien bei Patienten gegeben, die Pravastatin einnehmen. Es hat keine pharmakogenetischen Studien an gesunden Freiwilligen oder Patienten, die Rosuvastatin nehmen, gegeben. Deshalb sind die Beobachtungen von Nishizato et al., die bei japanischen gesunden Freiwilligen durchgeführt wurden, für die PK-Profile von Patienten oder von anderen Bevölkerungen oder für die PK-Profile anderer Statine, welche sich in der Affinität zu unterschiedlichen Transportern unterscheiden können, nicht prädiktiv.
Populations-PK-Modellierungsanalysen, unter Verwendung von Daten, die von AstraZeneca bei dem klinischen Entwicklungsprogramm von Rosuvastatin gesammelt wurden, bestätigen, dass sich gesunde Freiwillige und Patienten in Bezug auf ihre Verteilung von Rosuvastatin unterscheiden. Patienten, die Statine für eine Lipidsenkung erhalten, können andere Arzneimittel nehmen, die durch OATP-C transportiert werden, und Arzneimittel-Arzneimittel-Wechselwirkungen können das PK-Profil der Statine beeinflussen (Int. J. Clin. Pharmacol. Ther. (2002), 40, 439–50). Patienten, denen Statine verschrieben wurden, können auch andere Leber- und Nierenkomplikationen haben, welche die Verteilung und die Ausscheidung der Statine beeinflussen. Es gibt ein ganzes Kapitel im Lehrbuch Clinical Pharmacokinetics (Kapitel 16, Seiten 248–266 in der 3. Ausgabe 1995, Rowland & Tozer, veröffentlicht von Williams & Wilkins), das so beginnt:
„Eine Erkrankung ist eine Hauptquelle für die Variabilität bei der Arzneimittelantwort. Für zahlreiche Erkrankungen beruht dies hauptsächlich auf Unterschieden in der Pharmakokinetik..."
Somit besteht eine Notwendigkeit zur Identifizierung, welche Polymorphismen bei OATP-C einen Effekt auf die in vivo-Pharmakokinetik von Rosuvastatin und anderen Statinen bei Patienten mit einer Gefäßerkrankung oder einer Prädisposition dazu haben. Unsere Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass der Polymorphismus V 174A und/oder ein Polymorphismus im Kopplungsungleichgewicht damit einen statistisch signifikanten Effekt auf die Statin-Pharmakokinetik bei Patienten hat. Der Polymorphismus V 174A kann die Antwort auf Statine, insbesondere Rosuvastatin, beeinflussen.
Gemäß eines Aspektes der Erfindung wird dabei ein Verfahren der Diagnose gemäß des anhängigen Anspruchs 1 bereit gestellt.
Ebenfalls wird hierin ein derartiges Verfahren offenbart, bei dem alternativ die Nukleinsäure auf die Anwesenheit eines Allels eines Polymorphismus im Kopplungsungleichgewicht mit dem Alanin codierenden Codon an der Position, die der Position 174 der SEQ ID Nr.: 1, vorzugsweise -26A>G, -118A>C, -309T>C, -878A>G, -903C>T, -1054G>T, -1215T>A oder -1558T>C, alle von der SEQ ID Nr.: 2; oder T2122G, C2158T, A2525C oder G2651A, alle von der SEQ ID Nr.: 3 entspricht, getestet wird.
Stärker bevorzugt ist der Polymorphismus -118A>C oder -1558T>C der SEQ ID Nr.: 2. Allele der Polymorphismen bei -118 und -1558 sind in einem signifikanten Kopplungsungleichgewicht mit dem Alanin-Allel bei der Position 174 der SEQ ID Nr.: 1 (p = 0,009 bzw. 0,025, analysiert durch das ASSOCIATE-Programm, siehe Ott J. (1999) Analysis of human genetic linkage, 3. Ausgabe. Johns Hopkins University Press, Baltimore).
Am stärksten bevorzugt ist der Polymorphismus von (b)(ii) -118A>C der SEQ ID Nr.: 2; Beispiel 2 beschreibt nachstehend den funktionalen Effekt dieses Polymorphismus.
Für eine beliebige Varianten-Position, zum Beispiel -26A>G, gibt dies an, dass bei der Position 26 A durch G ersetzt ist. Dies kann getestet werden, indem entweder G an dieser Position nachgewiesen wird, oder indem nachgewiesen wird, dass sich kein A an dieser Position befindet. Ähnliche Betrachtungen treffen auf eine beliebige Varianten-Position zu.
Vorzugsweise ist das therapeutische Mittel ein Statin, wird der Mensch mit einer Dosismenge an Statin behandelt und umfasst Schritt (c) ferner das Diagnostizieren des Menschen als geeignet zur Titration zu einer anderen höheren Statin-Dosismenge, was das Überwachen bezüglich einer Abnahme des Nutzen-Risiko-Verhältnisses umfasst, welches von dem reduzierten Vermögen herrührt, das Statin in Zellen hinein zu transportieren.
Stärker bevorzugt ist das therapeutische Mittel Rosuvastatin.
Wie ferner hierin offenbart, ist das therapeutische Mittel eines von Atorvastatin, Cerivastatin, Fluvastatin, Pravastatin oder Simvastatin.
Vorzugsweise wird der Mensch mit mindestens 5 mg von einem Rosuvastatin täglich behandelt. Stärker bevorzugt wird der Mensch mit mindestens 10 mg von einem Rosuvastatin täglich behandelt. Stärker bevorzugt wird der Mensch mit mindestens 20 mg von einem Rosuvastatin täglich behandelt. Stärker bevorzugt wird der Mensch mit mindestens 40 mg von einem Rosuvastatin täglich behandelt.
Gemäß eines weiteren Aspektes der Erfindung wird ein Verfahren der Diagnose gemäß des anhängigen Anspruchs 7 bereit gestellt.
Wie hierin offenbart, ist das therapeutische Mittel vorzugsweise ein Statin, wird der Mensch mit einer Dosismenge an Statin behandelt und umfasst Schritt (c) ferner das Diagnostizieren des Menschen als geeignet zur Titration zu einer anderen höheren Statin-Dosismenge, was das Überwachen bezüglich einer Abnahme des Nutzen-Risiko-Verhältnisses umfasst, welches von dem reduzierten Vermögen herrührt, das Statin in Zellen hinein zu transportieren.
Wie hierin offenbart, umfasst das Verfahren ferner vorzugsweise eine Messung des Spiegels an OATPC-Polypeptid mit Valin und/oder Alanin an der Position 174, um dadurch die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Polymorphismus -118A>C in der OATP-C-Nukleinsäure zu bestimmen.
Vorzugsweise, wie hierin offenbart, ist das Verfahren eines, das ferner das Messen des Spiegels an OATP-C-Polypeptid auf die Anwesenheit oder Abwesenheit eines OATP-C*15-Allels umfasst, um dadurch die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Polymorphismus -118A>C in der OATP-C-Nukleinsäure zu bestimmen.
Ohne durch theoretische Betrachtungen gebunden sein zu wollen, kann der Grad an Proteinexpression von jeder der verschiedenen allelischen Formen von OATPC bestimmt werden, wo der Grad der Expression der Ala174-Variante auf Grund einer verstärkten Promotoraktivität in der Gegenwart der gekoppelten -118C-Promotorvariante erhöht ist. Zum Beispiel durch das Bestimmen des Verhältnisses der Protein-Isoformen Val174 Ala174, wobei das Ala 174-Protein mit reduzierter Funktion im Überschuss bezogen auf den Val 174-Transporter mit normaler Funktion bei Personen, die an der Position 174 in der Aminosäuresequenz heterozygot sind, vorhanden ist. In einem anderen Beispiel durch das Bestimmen des absoluten Grades der OATPC-Expression bei Ala174-homozygoten Personen und das Vergleichen des absoluten Expressionsgrades mit dem des Populationsmittelwerts für Personen, die für die Val174-Variante homozygot sind, wobei die relative Expression des Ala 174-Allels in der Gegenwart des gekoppelten -1180-Promotor-Allels erhöht ist, verglichen mit Ala 174-Allelen, die an die -118A-Promotorvariante gekoppelt sind. In einem weiteren Beispiel kann durch das Bestimmen des absoluten Grades der OATPC-Expression bei Ala174-homozygoten Personen und das Vergleichen des absoluten Expressionsgrades mit dem des Populationsmittelwerts, bei Ala174-homozygoten Personen, mit den höchsten Graden an OATPC-Expression, vorausgesagt werden, dass sie eine oder mehrere Kopien der -118C-Promotorvariante aufweisen, und zwar durch die erhöhte Transkriptionsaktivität der minoren allelischen Form des OATPC-Promotors.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird bestimmt, dass die Aminosäure an Position 174 Alanin ist, und das therapeutische Mittel ist Rosuvastatin.
Gemäß der weiteren hierin bereit gestellten Offenbarung ist das therapeutische Mittel eines von Atorvastatin, Cerivastatin, Fluvastatin, Pravastatin oder Simvastatin.
Vorzugsweise wird der Mensch mit mindestens 5 mg von einem Rosuvastatin täglich behandelt. Stärker bevorzugt wird der Mensch mit mindestens 10 mg von einem Rosuvastatin täglich behandelt. Stärker bevorzugt wird der Mensch mit mindestens 20 mg von einem Rosuvastatin täglich behandelt. Stärker bevorzugt wird der Mensch mit mindestens 40 mg von einem Rosuvastatin täglich behandelt.
Ferner wird hierin ein in vitro-diagnostisches Verfahren offenbart, um einen Patienten zu identifizieren, der potenziell eine Statin-Dosismenge über der minimalen empfohlenen Dosismenge benötigt, oder um einen Patienten zu identifizieren, bei dem eine Titration zu einer Statin-Dosismenge über der minimalen empfohlenen Dosismenge überwacht werden sollte, wobei das Verfahren das Testen einer biologischen Probe von dem Patienten auf die Anwesenheit von Alanin an der Position 174 des OATP-C-Polypeptids und/oder eines Polymorphismus im Kopplungsungleichgewicht damit umfasst.
Die biologische Probe ist in geeigneter Weise eine Probe von Blut, bronchoalveolarer Spülflüssigkeit, Sputum, Leber oder einer anderen Körperflüssigkeit oder Gewebe, das von einer Person erhalten wurde. Man wird einsehen, dass die Testprobe ebenso eine Nukleinsäuresequenz, die der Sequenz in der Testprobe entspricht, sein kann, das heißt, dass die ganze oder ein Teil der Region in der Proben-Nukleinsäure zunächst durch die Verwendung einer beliebigen zweckmäßigen Technik, z. B. PCR, vor der Analyse der allelischen Variation amplifiziert werden kann. Vorzugsweise wird der Patient auf die Anwesenheit von Alanin an der Position 174 entweder durch eine Analyse des Polypeptids direkt oder durch die Analyse des genetischen Materials, das das Polypeptid codiert, getestet. Da Patienten 2 Kopien des OATPC-Gens tragen, können sie ein homozygoter oder ein heterozygter Genotyp sein. Polymorphismen im Kopplungsungleichgewicht mit Alanin bei 174 können als eine Alternative zu der direkten Bestimmung der Anwesenheit von Alanin bei 174 getestet werden.

Einem Fachmann im Fachbereich wird es ersichtlich sein, dass es eine große Anzahl an analytischen Verfahren gibt, die verwendet werden können, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von varianten Nukleotiden an einer oder mehreren polymorphen Positionen der Erfindung zu ermitteln. Im Allgemeinen erfordert der Nachweis einer allelischen Variation eine Methode zur Mutationsdiskriminierung, wahlweise eine Amplifikationsreaktion und wahlweise ein Signalerzeugungssystem. Tabelle 1 listet eine Anzahl von Techniken zur Mutationsdetektion auf, wovon einige auf der PCR basieren. Diese können in Verbindung mit einer Anzahl von Signalerzeugungssystemen verwendet werden, von denen eine Auswahl in der Tabelle 2 aufgelistet ist. Ferner sind Amplifikationsmethoden in der Tabelle 3 aufgezählt. Viele derzeitige Verfahren für den Nachweis einer allelischen Variation werden von Nollau et al., Clin. Chem. 43, 1114–1120, 1997; und in Standardlehrbüchern, zum Beispiel "Laboratory Protocols for Mutation Detection", herausgegeben von U. Landegren, Oxford University Press, 1996 und "PCR", 2. Auflage von Newton & Graham, BIOS Scientific Publishers Limited, 1997, besprochen. Abkürzungen:

ALEX^TM	Amplifikationsrefraktorisches Mutationssystem mit linearer Verlängerung (Amplification refractory mutation system linear extension)
APEX	Array-basierte Primerverlängerung (Arrayed Primer Extension)
ARMS^TM	Amplifikationsrefraktorisches Mutationssystem (Amplification refractory mutation system)
b-DNA	Verzweigte DNA
bp	Basenpaar
CMC	Chemische Mismatch-Spaltung
COPS	Kompetitives Oligonukleotid primendes System (Competitive oligonucleotide priming system)
DGGE	Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese
FREI	Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer
LCR	Ligase-Kettenreaktion (Ligase chain reaction)
MASDA	Multiples Allel-spezifisches diagnostisches Assay (Multiple allele specific diagnostic assay)
NASBA	Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation
OLA	Oligonukleotid-Ligationsassay
PCR	Polymerasekettenreaktion
PTT	Protein-Trunkierungs-Test (Protein truncation test)
RFLP	Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus
SDA	Strangverdrängungsamplifikation (Strand displacement amplifikation)
SNP	Einzel-Nukleotid-Polymorphismus
SSCP	Einzelstrang-Konformationspolymorphismus-Analyse (Single-strand conformation polymorphism analysis)
SSR	Selbst fortsetzende Replikation (Self sustained replication)
TGGE	Temperaturgradienten-Gelelektrohorese

Tabelle 1 – Mutations-Detektions-Techniken

Allgemein: DNA-Sequenzierung, Sequenzierung durch Hybridisierung
Scannen: PTT*, SSCP, DGGE, TGGE, Cleavase, Heteroduplex-Analyse, CMC, enzymatische Mismatch-Spaltung
* Anmerkung: nicht anwendbar für den Nachweis von Promotor-Polymorphismen

Hybridisierungs-basiert

Festphasen-Hybridisierung: Dot-Blots, MASDA, Reverse Dot-Blots, Oligonukleotid-Arrays (DNA-Chips)
Lösungsphasen-Hybridisierung: Taqman^TM – US-5210015 & US-5487972 (Hoffmann-La Roche), Molecular Beacons – Tyagi et al. (1996), Nature Biotechnology, 14, 303; WO 95/13399 (Public Health Inst., New York)
Verlängerungs-basiert: ARMS^TM, ALEX^TM – Europäisches Patent Nr. EP 332435 B1 (Zeneca Limited), COPS – Gibbs et al. (1989), Nucleic Acid Research, 17, 2347.
Inkorporierungs-basiert: Mini-Sequenzierung, APEX
Restriktionsenzym-basiert: RFLP, eine
Restriktionsstelle erzeugende PCR
Ligations-basiert: OLA
Andere: Invader-Assay

Tabelle 2 – Signalerzeugungs- oder Detektions-Systeme

Fluoreszenz: FREI, Fluoreszenz-Löschung, Fluoreszenz-Polarisation – UK-Patent Nr. 2228998 (Zeneca Limited)
Andere: Chemilumineszenz, Elektrochemilumineszenz, Raman, Radioaktivität, kolorimetrische Messung, Hybridisierungs-Schutz-Assay (Hybridisation protection assay), Massenspektrometrie

Tabelle 3 – weitere Amplifikationsverfahren

SSR, NASBA, LCR, SDA, b-DNA

Tabelle 4 – Nachweisverfahren der Proteinvariation

Immunoassay
Immunohistologie
Peptidsequenzierung

Bevorzugte Mutations-Nachweismethoden schließen ARMS^TM, ALEX^TM, COPS, Taqman, Molecular Beacons, RFLP und restriktionsstellen-basierte PCR- und FRET-Techniken ein. Immunoassay-Methoden sind im Fachbereich bekannt, z. B. A Practical Guide to ELISA von D. M. Kemeny, Pergamon Press 1991; Principles and Practice of Immunoassay, 2. Ausgabe, C. P. Price und D. J. Newman, 1997, erschienen bei Stockton Press in USA und Kanada und bei Macmillan Reference in Großbritannien. Histologische Methoden werden in Theory and Practice of Histological Techniques von J. D. Bancroft und A. Stevens, 4. Ausgabe, Churchill Livingstone, 1996, beschrieben. Proteinsequenzierung wird in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 9, Sequencing of Proteins and Peptides, G. Allen, 2. überarbeitete Ausgabe, Elsevier, 1989, beschrieben.
Besonders bevorzugte Verfahren schließen auf ARMS^TM und RFLP basierte Verfahren ein. ARMS^TM ist ein besonders bevorzugtes Verfahren
Antikörper können unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Verfahrens hergestellt werden. Zum Beispiel können gereinigte Polypeptide dazu verwendet werden, spezifische Antikörper herzustellen. Der Begriff „Antikörper" soll polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper und die verschiedenen Typen von Antikörperkonstrukten wie zum Beispiel F(ab')₂, Fab und Einzelketten-Fv einschließen. Antikörper werden als spezifisch bindend definiert, wenn sie die allelische Variante von OATP-C mit einem K_a von größer als oder gleich etwa 10⁷ M^-1 binden. Die Affinität der Bindung kann durch die Anwendung von herkömmlichen Methoden bestimmt werden, zum Beispiel jene, die von Scatchard et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 51: 660 (1949) beschrieben werden.
Polyklonale Antikörper können aus einer Vielzahl von Quellen leicht erzeugt werden, zum Beispiel Pferde, Kühe, Ziegen, Schafe, Hunde, Hühner, Kaninchen, Mäuse oder Ratten durch die Verwendung von Verfahren, die im Fachbereich gut bekannt sind. Im Allgemeinen wird das Antigen an das Wirtstier üblicherweise durch eine parenterale Injektion verabreicht. Die Immunogenität des Antigens kann durch die Anwendung eines Adjuvans, z.B., Freund's vollständiges oder unvollständiges Adjuvans erhöht werden. Nach Booster-Immunisierungen werden kleine Proben an Serum gewonnen und auf Reaktivität gegen das Antigen getestet. Beispiele für unterschiedliche Assays, die für eine solche Bestimmung geeignet sind, schließen jene ein, die in: Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow und Lane (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988, beschrieben sind; sowie Verfahren wie Gegenstrom-Immunoelektrophorese (CIEP), Radioimmunoassay, Radioimmunopräzipitation, Enzym-gekoppelte Immunsorptions-Assays (ELISA), Dot-Blot-Assays und Sandwich-Assays, siehe die US-Patente Nr. 4 376 110 und 4 486 530 .
Monoklonale Antikörper können leicht unter Verwendung von gut bekannten Verfahren hergestellt werden, siehe zum Beispiel die Verfahren, die in den US-Patenten Nr. RE 32 011 , 4 902 614 , 4 543 439 und 4 411 993 ; Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn und Bechtol (Hrsg.), (1980) beschrieben sind.
Monoklonale Antikörper können unter Verwendung von alternativen Verfahren hergestellt werden, so wie jene, die von Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3: 1–9 (1990), beschrieben sind, was hierin durch Bezugnahme miteinbezogen ist. In ähnlicher Weise können Bindungspartner unter Anwendung von rekombinanten DNA- Methoden konstruiert werden, um die variablen Regionen eines Gens, das einen spezifischen bindenden Antikörper codiert, einzubauen. Eine derartige Methode ist bei Larrick et al., Biotechnology, 7: 394 (1989) beschrieben.
Sobald sie isoliert und gereinigt wurden, können die Antikörper dazu verwendet werden, die Anwesenheit von bestimmten Polypeptid-Varianten in einer Probe unter Verwendung von etablierten Assay-Protokollen nachzuweisen, siehe zum Beispiel "A Practical Guide to ELISA" von D. M. Kemeny, Pergamon Press, Oxford, England.
Statine, die bereits für die Anwendung bei Menschen zugelassen sind, schließen Atorvastatin, Cerivastatin, Fluvastatin, Pravastatin und Simvastatin ein. Der Leser wird für eine weitergehende Information auf die folgenden Literaturhinweise verwiesen: Drugs and Therapy Perspectives (12. May 1997), 9: 1–6; Chong (1997) Pharmacotherapy 17: 1157–1177; Kellick (1997) Formulary 32: 352; Kathawala (1991) Medicinal Research Reviews, 11: 121–146; Jahng (1995) Drugs of the Future 20: 387–404, und Current Opinion in Lipidology, (1997), 8, 362–368. Ein bevorzugtes Statin-Arzneimittel ist Verbindung 3a (S-4522) in Watanabe (1997) Bioorganic and Medicinal Chemistry 5: 437–444; jetzt als Rosuvastatin bezeichnet, siehe Olsson (2001) American Journal of Cardiology, 87, Anhang 1, 33–36.
Vorzugsweise ist das Statin Rosuvastatin. Vorzugsweise wird dem Patient mindestens 40 mg Rosuvastatin täglich verschrieben, stärker bevorzugt wird dem Patient mindestens 60 mg Rosuvastatin täglich verschrieben und insbesondere wird dem Patient mindestens 80 mg Rosuvastatin täglich verschrieben.
Vorzugsweise wird der Patient darüber hinaus auf die Anwesenheit von Valin an der Position 174 des OATP- C-Polypeptids getestet, wobei die Anwesenheit von sowohl Valin als auch Alanin an der Position 174 auf eine Heterozygosität an diesem Locus hinweist.
Vorzugsweise wird der Polymorphismus im Kopplungsungleichgewicht mit Alanin174-OATP-C gewählt aus wenigstens einem von:

a) Asp130-OATP-C; oder
b) Konsensus-NF1-Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen an den Positionen -26A>G oder -118A>C bezogen auf die Transkriptions-Initiationsstelle (SEQ ID Nr. 2); oder
c) -309T>C, -878A>G, -903C>T, -1054G>T, -1215T>A oder -1558T>C, wobei die Nukleotidpositionen auf die Transkriptions-Initiationsstelle (SEQ ID Nr. 2) bezogen sind; oder
d) Polymorphismen in der 3'-UTR-Region des OATP-C-Gens, die aus T2122G, C2158T, A2525C und G26S1A gewählt sind, wobei die Nukleotidposition auf das ATG bezogen ist, und das A des ATG das Nukleotid +1 ist (Sequenz-Zugangsnummer AF205071 und SEQ ID Nr. 3).

Die Transkriptions-Initiationsstelle ist bei Jung, D., 2001, Journal of Biological Chemistry. 276 (40), 37206–37214 definiert.
In einer Ausführungsform wird die biologische Probe auf die Anwesenheit einer Aminosäure an einer Position des OATP-C-Polypeptids durch eine Analyse von genetischem Material, das das Polypeptid codiert, getestet.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein in vitro-Verfahren für das Beobachten eines Patienten auf ein unerwünschtes Ereignis, das mit der Statin-Therapie im Zusammenhang steht, wobei das Verfahren das Testen einer biologischen Probe aus dem Patienten hinsichtlich eines für ein unerwünschtes Ereignis kennzeichnenden Parameters umfasst und wobei der Patient für eine solche Beobachtung durch ein hierin beschriebenes Verfahren ausgewählt wird, zur Verfügung.
Vorzugsweise ist der Patient vom Genotyp OATPC*5 oder *15. Da Patienten 2 Kopien des OATPC-Gens tragen, können sie ein homozygoter oder heterozygoter Genotyp sein.
Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren für den Nachweis eines Polymorphismus bei OATPC in einem Menschen bereit gestellt, wobei das Verfahren das Bestimmen der Sequenz des Menschen an mindestens einer der folgenden polymorphen Positionen umfasst:

a) Konsensus-NF1-Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen an den Positionen -26A>G oder -118A>C bezogen auf die Transkriptions-Initiationsstelle; oder
b) -309T>C, -878A>G, -903C>T, -1054G>T, -1215T>A oder -1558T>C, wobei die Nukleotidpositionen auf die Transkriptions-Initiationsstelle bezogen sind; oder
c) Polymorphismen in der 3'-UTR-Region des OATP-C-Gens, die aus T2122G, C2158T, A2525C und G2651A gewählt sind, wobei die Nukleotidposition auf das ATG bezogen ist, und das A des ATG das Nukleotid +1 ist (Sequenz-Zugangsnummer AF205071 und SEQ ID Nr. 3).

Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein menschliches OATPC-Gen oder sein komplementärer Strang bereit gestellt, umfassend einen abweichenden allelischen Polymorphismus an einer oder mehreren der Positionen, die hierin definiert sind, oder ein Fragment davon von mindestens 20 Basen, das mindestens einen neuen Polymorphismus umfasst.
Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein allelspezifischer Primer bereit gestellt, der in der Lage ist, einen OATPC-Gen-Polymorphismus, vorzugsweise an einer oder mehreren Positionen, wie hierin definiert, nachzuweisen.
Ein allelspezifischer Primer wird verwendet, im Allgemeinen zusammen mit einem konstanten Primer in einer Amplifikationsreaktion wie einer PCR-Reaktion, die die Unterscheidung zwischen Allelen durch eine selektive Amplifikation von einem Allel an einer bestimmten Sequenzposition vorsieht, z. B. wie es für ARMS^TM-Assays verwendet wird. Der allelspezifische Primer ist vorzugsweise 17–50 Nukleotide, stärker bevorzugt etwa 17–35 Nukleotide, stärker bevorzugt etwa 17–30 Nukleotide groß.
Ein allelspezifischer Primer stimmt vorzugsweise exakt mit dem zu detektierenden Allel überein, aber Derivate davon werden ebenfalls in Betracht gezogen, wobei etwa 6–8 der Nukleotide am 3'-Ende mit dem zu detektierenden Allel übereinstimmen und wobei bis zu 10, wie bis zu 8, 6, 4, 2 oder 1 der verbleibenden Nukleotide variiert werden können, ohne die Eigenschaften des Primers signifikant zu beeinflussen.
Die Primer können unter Verwendung eines beliebigen zweckdienlichen Verfahrens der Synthese hergestellt werden. Beispiele für derartige Verfahren kann man in Standardlehrbüchern finden, zum Beispiel „Protocols for Oligonucleotides and Analogues; Synthesis and Properties," Methods in Molecular Biology Series; Band 20; Hrsg.: Sudhir Agrawal, Humana ISBN: 0-89603-247-7; 1993; 1. Ausgabe. Wenn es erforderlich ist, kann/können der/die Primer markiert werden, um eine Detektion zu erleichtern.
Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird eine allelspezifische Oligonukleotid-Sonde bereitgestellt, die in der Lage ist, einen OATPC-Gen-Polymorphismus, vorzugsweise an einer oder mehreren der hierin definierten Positionen zu detektieren.
Die allelspezifische Oligonukleotid-Sonde ist vorzugsweise 17–50 Nukleotide, stärker bevorzugt etwa 17–35 Nukleotide, stärker bevorzugt etwa 17–30 Nukleotide groß.
Der Entwurf solcher Sonden wird dem Molekularbiologen mit dem üblichen Fachwissen ersichtlich sein. Solche Sonden sind von einer beliebigen geeigneten Länge, wie bis zu 50 Basen, bis zu 40 Basen, stärker geeignet bis zu 30 Basen lang, wie zum Beispiel 8–25 oder 8–15 Basen lang. Im Allgemeinen werden solche Sonden Basensequenzen umfassen, die zu dem entsprechenden Wildtyp- oder Varianten-Locus im Gen völlig komplementär sind. Jedoch können, wenn es erforderlich ist, ein oder mehrere Fehlpaarungen bzw. Mismatches eingebaut werden mit der Maßgabe, dass das Diskriminierungsvermögen der Oligonukleotid-Sonde nicht über Gebühr beeinflusst wird. Die Sonden der Erfindung können eine oder mehrere Markierungen tragen, um eine Detektion zu erleichtern.
Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein allelspezifischer Primer oder eine allelspezifische Oligonukleotid-Sonde bereitgestellt, die in der Lage ist, einen OATPC-Gen-Polymorphismus an einer der hierin definierten Positionen zu detektieren.
Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein diagnostischer Kit zur Verfügung gestellt, der eine allelspezifische Oligonukleotid-Sonde der Erfindung und/oder einen allelspezifischen Primer der Erfindung umfasst.
Die diagnostischen Kits können eine geeignete Verpackung und Anweisungen zum Gebrauch bei den Verfahren der Erfindung umfassen. Solche Kits können ferner geeignete(n) Puffer und Polymerase(n), wie hitzebeständige Polymerasen, zum Beispiel Tag-Polymerase umfassen.
Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten zur Verfügung gestellt, der einer Behandlung mit einem Statin bedarf, wobei das Verfahren folgendes umfasst:

i) die Anwendung eines in vitro-diagnostischen Verfahrens, um einen Patienten zu identifizieren, der potenziell eine Statin-Dosismenge benötigt, die über der minimalen empfohlenen Dosismenge liegt, oder um einen Patienten zu identifizieren, bei dem eine Titration zu einer Statin-Dosismenge über der minimalen empfohlenen Dosismenge überwacht werden sollte, und wobei das Verfahren das Testen einer biologischen Probe von dem Patienten auf die Anwesenheit von Alanin an der Position 174 des OATP-C-Polypeptids und/oder eines Polymorphismus im Kopplungsungleichgewicht damit umfasst; und
ii) die Verabreichung einer wirksamen Menge des Arzneimittels.

Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung wird die Verwendung eines Statins in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines Patienten mit einer Gefäßerkrankung oder einer Prädisposition dazu bereit gestellt, wobei der Patient durch eine in vitro-Diagnose zur Identifizierung eines Patienten, der potenziell eine Statin-Dosismenge benötigt, die über der minimalen empfohlenen Dosismenge liegt, oder zur Identifizierung eines Patienten, bei dem eine Titration zu einer Statin-Dosismenge über der minimalen empfohlenen Dosismenge überwacht werden sollte und wobei das Verfahren das Testen einer biologischen Probe von dem Patienten auf die Anwesenheit von Alanin an der Position 174 des OATP-C-Polypeptids und/oder eines Polymorphismus im Kopplungsungleichgewicht damit umfasst, identifiziert wird.
Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung wird ein Verfahren zur Klassifizierung eines Patienten, der einer Statin-Therapie bedarf, zur Verfügung gestellt, das das Testen einer biologischen Probe von dem Patienten auf die Anwesenheit von Alanin an der Position 174 des OATP-C-Polypeptids und/oder eines Polymorphismus im Kopplungsungleichgewicht damit umfasst.
Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung eines Patienten bei einer Statin-Therapie zur Verfügung gestellt, die das Überwachen eines unerwünschten Ereignisses erfordert, was das Testen einer biologischen Probe von dem Patienten auf die Anwesenheit von Alanin an der Position 174 des OATP-C-Polypeptids und/oder eines Polymorphismus im Kopplungsungleichgewicht damit umfasst.
„Unerwünschtes Ereignis" bedeutet die Entwicklung eines unerwünschten medizinischen Zustands oder die Verschlechterung eines vorher vorhandenen medizinischen Zustands, nach oder während eines Aussetzens an ein pharmazeutisches Produkt, ob es als ursächlich mit dem Produkt im Zusammenhang stehend betrachtet wird oder nicht. Ein unerwünschter medizinischer Zustand können Symptome (z. B. Übelkeit, Schmerz in der Brust), Anzeichen (z. B. Herzrasen, vergrößerte Leber) oder die abormalen Resultate einer Untersuchung (z. B. Laborergebnisse, Elektrokardiogramm) sein.
„Kopplungsungleichgewicht” bedeutet das Vorhandensein von Allelen an genetischen Loci zugleich, häufiger als es durch Zufall erwartet werden würde.
„Patient" bedeutet eine Person, die eine medizinische Behandlung erhält.
„Dosis" bedeutet die zu einem Zeitpunkt zu verabreichende Menge, wie eine spezifizierte Menge der Medikation. Für Rosuvastatin beträgt die anfängliche Dosis für Erwachsene normalerweise 10 mg täglich. Höhere Dosen können erforderlich sein, um gewünschte Lipidprofile bei einigen Patienten zu erzeugen.
„Nutzen-Risiko-Verhältnis" bedeutet das Verhältnis zwischen den Risiken und Vorteilen einer gegebenen Behandlung oder Vorgehensweise.
Ein akzeptables Risiko bezieht sich auf die Möglichkeit, eine Erkrankung oder Verletzung zu erleiden, die durch eine Person im Austausch gegen die Vorteile der Verwendung einer Substanz oder eines Verfahrens, das eine solche Erkrankung oder Verletzung verursachen wird, toleriert werden wird. Die Annehmbarkeit des Risikos hängt von wissenschaftlichen Daten, sozialen, ökonomischen und politischen Faktoren ab und von den wahrgenommenen Vorteilen, die von einer Chemikalie oder einem Verfahren herrühren, welche(s) das (die) in Frage kommende(n) Risiko (Risiken) erzeugt.
Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung wird ein Verfahren zum Testen auf ein unerwünschtes Ereignis bei einem Patienten zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren umfasst

(a) das Identifizieren eines Patienten, der (i) einer Behandlung mit einem therapeutischen Mittel, das durch OATP-C transportiert wird, bedarf, und (ii) (A) ein Alanin an der Aminosäureposition von OATP-C, die der Position 174 der SEQ ID Nr.: 1 entspricht, oder (B) einen Polymorphismus im Kopplungsungleichgewicht mit (A) aufweist;
(b) das Bereitstellen einer biologischen Probe von dem Patienten, nachdem der Patient sich einer Behandlung mit dem therapeutischen Mittel unterzieht; und
(c) das Testen der Probe auf einen Parameter, der auf ein unerwünschtes Ereignis in Bezug auf die Behandlung mit dem therapeutischen Mittel hinweist

Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung wird ein Verfahren der Behandlung zur Verfügung gestellt, umfassend:

(a) das Identifizieren eines Patienten, der einer Behandlung mit einem therapeutischen Mittel, das durch OATP-C transportiert wird, bedarf;
(b) das Bestimmen, ob der Patient eines von beiden oder beides von (i) einem Alanin an der Aminosäure-Position von OATP-C, die der Position 174 der SEQ ID Nr.: 1 entspricht, oder (ii) einem Polymorphismus im Kopplungsungleichgewicht mit (i) aufweist; und
(c) das Verschreiben einer geeigneten Dosierung des therapeutischen Mittels.

Vorzugsweise umfasst das Verfahren ferner:

(d) das Überwachen des Patienten bezüglich eines unerwünschten Ereignisses im Zusammenhang mit einem reduzierten Transport des therapeutischen Mittels.

Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung wird ein Verfahren zur Charakterisierung des Genotyps eines Menschen bereitgestellt, der dahingehend identifiziert wurde, einer Behandlung mit einem durch OATP-C transportierbaren Arzneimittel zu bedürfen, wobei das Verfahren umfasst:

(a) das Bereitstellen einer Nukleinsäureprobe von dem Menschen, wobei die Probe ein erstes Nukleotid an einer Position umfasst, die der Position 620 der SEQ ID Nr.: 1 entspricht;
(b) das Testen der Probe, um die Identität des ersten Nukleotids zu bestimmen;
(c) das Aufzeichnen der Identität des ersten Nukleotids im Druck oder in einem maschinenlesbaren Medium; und
(d) das Mitteilen der Identität des ersten Nukleotids an den Menschen oder den Pfleger des Menschen.

Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung wird ein Verfahren für das Bewerten eines OATP-C-Gens bei einem Menschen bereitgestellt, wobei das Verfahren umfasst:

(a) das Erhalten einer Anfrage für die Durchführung einer Analyse des Haplotyps eines Menschen von einem Kunden, wobei der Mensch einer Behandlung mit einem durch OATP-C transportierbaren therapeutischen Mittel bedarf;
(b) das Empfangen einer Nukleinsäureprobe des Menschen;
(c) das Testen der Probe, um die Anwesenheit einer hierin beschriebenen Variante zu bestimmen; und
(d) das Abliefern der Ergebnisse des Testens an eine Partei,

wodurch das OATP-C-Gen bewertet wird.
Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um die Pharmakokinetik eines Arzneimittels zu bestimmen, wobei das Verfahren umfasst:

(a) das Bereitstellen einer Nukleinsäureprobe von einem Menschen;
(b) das Bestimmen der Anwesenheit einer hierin beschriebenen OATP-C-Variante; und
(c) das Korrelieren (i) der Identität des Nukleotids mit (ii) der Antwort des Menschen nach einer Verabreichung eines Arzneimittels, wobei die Pharmakokinetik des Arzneimittels bestimmt wird.

Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung wird ein mit einem Computer zugängliches Medium zur Verfügung gestellt, das eine Datenbank umfasst, die eine Vielzahl von Einträgen beinhaltet, wobei jeder Eintrag (a) eine Information, die eine Person identifiziert, mit (b) einer Information in Verbindung bringt, die anzeigt, ob die Person eine hierin beschriebene Variante aufweist, und worin jeder Eintrag ferner (a) in Verbindung bringt mit einer Information (c), die das Vorhandensein oder Fehlen eines unerwünschten Ereignisses bei der Person identifiziert, welches aus der Verabreichung eines durch OATP-C transportierbaren Arzneimittels an die Person resultiert.
Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung wird ein mit einem Computer lesbarer Medium-Artikel zur Verfügung gestellt, der darauf codierte Anweisungen aufweist, wobei die Anweisungen bewirken, dass ein Prozessor ein Verfahren ausführt, umfassend:

(a) das Erhalten einer Information, die anzeigt, ob eine Person eine hierin beschriebene Variante aufweist; und
(b) das Empfehlen einer geeigneten Dosierung eines mit OATP-C transportierbaren Mittels, wobei der Vorschlag auf der Information von (a) basiert.

Vorzugsweise ist der Artikel einer, worin die empfohlene Dosierung im Druck oder in einem elektronischen Format angezeigt wird.
Die Erfindung wird jetzt durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht werden, in denen
1 den Effekt des V174A-Polymorphismus auf Plasmaspiegel von Rosuvastatin zeigt. Die Korrelation zwischen Genotyp, für 3 nicht-synonyme SNPs in OATP-C, und hinsichtlich Dosis normierten Plasmawerten von Rosuvastatin (ng/ml/mg) veranschaulicht, dass die 174Ala-Variante mit höheren Plasmakonzentrationen in Zusammenhang steht. (WT = Wildtyp homozygot, HET = heterozygot, VAR = homozygot variant). Keine der 52 analysierten Personen war homozygot variant, weder für die Val174Ala- noch die Pro155Thr-Varianten. Von den 52 analysierten Personen wurden 42 dahingehend eingetragen, dass sie kaukasischer Herkunft waren. Die anderen 10 Personen waren entweder hispanisch, schwarz oder asiatisch.
2 den Effekt des OATP-C*15-Haplotyps auf Plasmaspiegel von Rosuvastatin zeigt. Die Korrelation zwischen OATP-C-Haplotypen und hinsichtlich Dosis normierten Plasmawerten von Rosuvastatin (ng/ml/mg) veranschaulicht, dass der OATP-C*15-Haplotyp mit höheren Plasmakonzentrationen in Zusammenhang steht. Siehe Tabelle 1 unten für eine Beschreibung der Aminosäure-Varianten für jeden Haplotyp. Die Ergebnisse für Personen mit Haplotyp-Paaren mit n = 3 oder weniger (*15/*14, *1b/*14, *1b/*15) sind nicht gezeigt.
In den 1 und 2 stellen die untere und obere Linie des „Kastens" den 25. und 75. Perzentil der Probe dar. Der Zwischenraum zwischen dem oberen und dem unteren Teil des Kastens ist die Interquartil-Spannweite. Die Linie in der Mitte des Kastens ist der Proben-Median. Die „Balken", die sich oberhalb und unterhalb des Kastens erstrecken, zeigen den Wertebereich für den Rest der Probe (wenn es keine Ausreißer gibt). Wenn man annimmt, dass es keine Ausreißer gibt, ist der höchste Wert der Probe das obere Ende des oberen Balkens. Der kleinste Wert der Probe ist das untere Ende des unteren Balkens. Standardmäßig ist ein Ausreißer ein Wert, der mehr als 1,5-mal der Interquartil-Spannweite vom oberen oder unteren Teil des Kastens entfernt ist. Einzelne Datenpunkte sind Ausreißer.
3 den Effekt der Val174Ala-Variante auf Plasmaspiegel von Rosuvastatin bei Patienten zeigt, die 6 Wochen lang mit unterschiedlichen Dosen von Rosuvastatin behandelt wurden. Die Plasmaspiegel von Rosuvastatin bei 6 Wochen wurden für die Analyse hinsichtlich der Dosis normiert. Mittlere Plasmaspiegel von Rosuvastatin waren bei Personen, die für den Val174Ala-Polymorphismus heterozygot waren im Vergleich zu homozygoten Wildtyp-Personen (Val/Val) höher. Die Verbindung zwischen dem Allel der V174A-Variante und den Plasma-PK-Spiegeln von Rosuvastatin war bei den höheren Dosen von Rosuvastatin am offensichtlichsten.
4 zeigt, dass es eine Tendenz zu einer Zunahme bei den mittleren Plasmakonzentrationen von Rosuvastatin bei jenen Personen gibt, die für den SNP az0005537 heterozygot sind. Dieser SNP befindet sich innerhalb einer putativen Bindungsstelle des NF1-Transkriptionsfaktors bei -118 bp stromaufwärts von dem Start der Transkription. Die gezeigten Daten sind für zwei unabhängige Studien der Phase III, in denen PK-Daten gesammelt wurden. Der Genotyp 11 ist der homozygote Wildtyp-Genotyp (az0005537 A/A) und der Genotyp 1 2 ist der heterozygote Genotyp (az0005537 A/C).
5 zeigt, dass Personen, die die gekoppelte 174A-Variante und das minore bzw. nebenrangige C-Allel bei dem az0005537-SNP besitzen, eine Tendenz zu höheren mittleren Plasmakonzentrationen an Rosuvastatin im Vergleich zu Personen mit der V174-Variante und dem verbreiteten Haupt-az0005537-Allel (A) aufweisen. Somit scheint das variante az0005537-Allel (C) einen additiven Effekt auf die Plasmaspiegel von Rosuvastatin aufzuweisen.
Da sich die Allele des SNP az0005537 im Kopplungsungleichgewicht mit jenen des OATPC-V174A befinden, kann das variante Allel beim SNP in der Promotorregion die Expression des OATPC-Allels mit reduzierter Funktion erhöhen, was erhöhte Plasmaspiegel von Rosuvastatin bei Personen zur Folge hat, die beide von diesen polymorphen Varianten besitzen. Die gezeigten Daten sind aus 2 klinischen Studien der Phase III zusammengesetzt, in denen PK-Daten gesammelt wurden. Personen, die für die V174A-Variante heterozygot sind, wurden in zwei Gruppen auf der Grundlage des Genotyps für den Promotorpolymorphismus az0005537 geschichtet. NF1 WT = Personen mit einem A/A Wildtyp-Genotyp beim az0005537-SNP. NF1 het = Personen mit dem A/C heterozygoten Genotyp beim AZ0005537-SNP.
Beispiel 1
Polymorphismen in OATP-C beeinflussen die in vivo-Disposition von Statinen bei Patienten
Kurz gesagt wurde das OATP-C-Gen bei 79 menschlichen Probanden einer klinischen Studie sequenziert. 52 dieser Patienten hatten Rosuvastatin mindestens 6 Wochen lang gegen eine dyslipidämische Erkrankung erhalten, und bei ihnen wurden Plasma-PK-Messungen nach 6 Wochen der Behandlung vorgenommen. Die Daten dieser 52 Patienten wurden dazu verwendet, um zu zeigen, dass einige polymorphe Varianten in OATP-C einen funktional signifikanten Effekt auf die Plasmaspiegel von Statinen aufweisen.
Methodik
Der Promotor, die Exons und die 3'-untranslatierten Regionen von OATP-C wurden durch eine DNA-Terminator-Sequenzierung bei DNA, die von 79 Probanden in klinischen Studien gewonnen wurde, vollständig sequenziert. Die Sequenzierungs-Spuren wurden dazu verwendet, die Genotypen nach bekannten (d. h. in der Literatur oder SNP-Datenbanken verfügbaren) SNPs in OATP-C zu erfassen. Einige neue SNPs wurden in der Promotor- und der 3'-UTR-Region von OATP-C gefunden.
Es wurden mittlere, auf die Dosis normierte Plasmakonzentrationen an Rosuvastatin für die Genotypen für jede polymorphe Variante im OATP-C-Gen bestimmt. Daten des OATP-C-Genotyps für 3 SNPs, nämlich Aminosäureposition 130 Asparagin → Asparaginsäure (Asn130Asp), 155 Prolin → Threonin (Pro155Thr) und 174 Valin → Alanin (Val174Ala) wurde dazu verwendet, das Haplotyp-Paar für jeden Probanden zu bestimmen. Es wurden mittlere, auf die Dosis normierte Plasmakonzentrationen an Rosuvastatin für die durch das Haplotyp-Paar gruppierten Personen bestimmt.
Alle einwilligenden Personen, die mit Rosuvastatin behandelt wurden (n = 271) aus den 2 klinischen Studien, was die ursprünglichen 52 Patienten einschließt, wurden anschließend unter Verwendung von TaqMan^TM auf OATP-C-Varianten genotypisiert. Die Daten für die SNPs, die die Ursache für die Varianten N130D, P155T und V174A waren, wurden dazu verwendet, die OATPC-Haplotyp-Paare jeder Person zuzuordnen, wie es vorher beschrieben wurde.
Ergebnisse
Die Sequenzierungsdaten ließen eine Anzahl von bisher nicht berichteten SNPs erkennen, 8 in der Promotor-Region (Jung, D., 2001 Journal of Biological Chemistry. 276 (40), 37206–37214) and 4 in der 3'UTR-Region von OATP-C. Diese SNPs stellen einen weiteren Aspekt der Erfindung dar. Diese 12 neuen SNPs wurden über eine Sequenzierung des OATP-C-Gens bei 79 Probanden identifiziert. Von diesen neuen SNPs wurden 8 SNPs im OATP-C-Promotor gefunden. 2 von diesen SNPs wurden in den Konsensus-Bindungsstellen des NF1-Transkriptionsfaktors an den Positionen -26A>G und -118A>C bezogen auf die Transkriptions-Initiationsstelle (siehe SEQ ID Nr. 2) gefunden. Andere neue stromaufwärts gelegene SNPs schlossen -309T>C, -878A>G, -903C>T, -1054G>T, -1215T>A und -1558T>C ein, wobei die Nukleotidpositionen auf die Transkriptions-Initiationsstelle, wie durch Jung et al. beschrieben (SEQ ID Nr. 2), bezogen sind. Weitere 4 neue SNPs wurden in der 3'UTR-Region des OATP-C-Gens gefunden, und zwar T2122G, C2158T, A2525C und G2651A, wobei die Nukleotidposition auf das ATG (siehe SEQ ID Nr. 3) bezogen ist.

Die OATP-C-Genotypdaten für die 3 SNPs Asn130Asp, Pro155Thr und Val174Ala wurden dazu verwendet, die Haplotypen zu bestimmen. Das Paket SNPHAP (Clayton, David, SNPHAPv0.2 2002, http://www-gene.cimr.cam.ac.uk/clayton/software/snphap.txt) wurde für diese Analyse verwendet. Die Haplotypen wurden auch unter Verwendung des PHASE-Pakets (Stephens, M., 2001 American Journal of Human Genetics 68, 978–989) prognostiziert und es wurde gefunden, dass sie die gleichen prognostizierten Haplotypen ergaben. Es wurde auch herausgefunden, dass die Haplotypen mit jenen, die zuvor berichtet wurden (Tirona 2001) übereinstimmten. Der Promotor-SNP -118A>C, bei der NF1-Bindungsstelle, war in einem starken Kopplungsungleichgewicht mit der Val174Ala codierenden Variante (Delta = 0,3). Tabelle 1 Übliche Haplotypen im OATP-C-Gen

*Nomenklatur	Amino-hinzugefügte Variante(n) auf dem Allel	Haplotyp-Häufigkeit (n = 79)
*1a	Asp130, Pro155, Val174	57 %
*1b	Asn130, Pro155, Val174	22 %

(Fortsetzung)

*Nomenklatur	Amino-hinzugefügte Variante(n) auf dem Allel	Haplotyp-Häufigkeit (n = 79)
*5	Asp130, Pro155, Ala174	2 %
*14	Asn130, Thr155, Val174	7,5 %
*15	Asn130, Pro155, Ala174	11,5 %

Tabelle 2 Häufigkeit der üblicheren nicht-synonymen OATP-C-SNPs (n = 79)

Aminosäure	Haupt-Allel	Minores Allel	SNP	Häufigkeit
130	Asn130	Asp130	A388G	0,41
155	Pro155	Thr155	C463A	0,08
174	Val174	Ala174	T521C	0,13

Tabelle 3: Haplotypen von Einzelpersonen für OATP-C

Haplotyp-Paar	AZ Haplotyp-ID	Nr. der Pers. (Gesamt = 79)	Häufigkeit
1a/1a	A	28	35 %
1b/1b	B	7	9 %
1a/1b	C	14	18 %
1a/15	D	13	16 %
1a/14	E	6	7 %
1b/15	F	3	4 %
1b/14	G	3	4 %
1a/5	H	2	3 %
15/14	I	3	4 %

Tabelle 4

PK-GRUPPE	Val/Nal	Val/Ala	Gesamt
HOCH	17	10	27
NIEDRIG	22	3	25
Gesamt	39	13	52

Tabelle 4 zeigt die Verteilung der Genotypen für die V174A-Variante zwischen Probanden, die auf der Grundlage der Verteilung der Plasma-PK-Spiegel von Rosuvastatin in 2 klinischen Studien der Phase III in die PK-Gruppen „hoch" und „niedrig" eingeteilt wurden. Die Untergruppen hoch und niedrig repräsentieren jene Personen mit PK-Werten im 10. und im 90. Perzentil, verglichen mit der Verteilung der Plasma-PK-Werte, die für die gesamte Untersuchungsgruppe beobachtet wurde. Der Val/Ala-heterozygote Genotyp ist bei jenen Probanden mit „hohen" Plasma-PK-Spiegeln üblicher, und häufiger als es durch Zufall auf der Grundlage der Populationshäufigkeit des Allels der V174A-Variante erwartet werden würde [Chi-Quadrat p = 0,037, wenn n = 52 (alle Personen) und p = 0,019, wenn n = 42 (nur kaukasische Personen)] und [exakter Test p = 0,055, wenn n = 52 (alle Personen) und p = 0,043, wenn n = 42 (nur kaukasische Personen)].
Die Sequenz- und Genotyp-Daten von 79 Personen wurden dazu verwendet, die Häufigkeiten des Allels und des Haplotyps zu bestimmen. Die Plasmakonzentrationen von Rosuvastatin standen nur für 52 dieser 79 Personen zur Verfügung, und somit gab es eine nur kleine Anzahl an Personen für einige der Haplotyp-Paar-Gruppen.
Die V174A-Variante tritt gewöhnlich als das OATPC*15-Allel auf. Die V174A-Variante wurde auch bei dem OATPC*5-Allel bei kaukasischen Populationen, nicht aber bei japanischen Populationen beobachtet. Jedoch wurden zwischen Populationen keine statistisch signifikanten Unterschiede in den Häufigkeiten dieser Allele beobachtet.
Tabelle 5 – Sequenzen
A) Protein-Sequenzen
Protein-Sequenzen, die durch die Translation von cDNA mit der Zugangsnummer AF205071 bestimmt wurden. 1) Sequenz des OATPC-Proteins OATPC*1a (N130 und V174) – SEQ ID Nr. 1
2) Sequenz des OATPC-Proteins OATPC*15 (D130 und A174) – SEQ ID Nr.: 4

3) Sequenz des OATPC-Proteins OATPC*5 (N130 und A174) – SEQ ID Nr.: 5
B) Sequenz der OATPC-cDNA (AF205071) für 3'-UTR-SNPs
Die codierende Region sind die Nukleotide 135 bis 2210. Die Position der Polymorphismen stromabwärts von dem ATG (oberer Fall) werden beschrieben, wobei das A des ATG +1 ist.
Die Polymorphismen T2122G, C2158T, A2525C, G2651A sind unterstrichen.
C) Sequenz der OATPC-Promotor-Region von AC022335
-26A>G oder -118A>C und -309T>C, -878A>G, -903C>T, -1054G>T, -1215T>A oder -1558 T>C, wobei die Nukleotidpositionen auf die Transkriptions-Initiationsstelle (wie definiert durch Jung et al.) bezogen und wie gemäß der folgenden Promotor- und 5'-flankierenden Sequenz (von AC022335) sind.
Der Start der Transkription wird mit einem Pfeil vermerkt. SNPs sind in Großbuchstaben markiert. SEQ ID Nr.: 2
Schlussfolgerungen
Ein Beweis für eine in vivo Genotyp-Phänotyp-Beziehung wurde zwischen OATP-C-Varianten und dem pharmakokinetischen Profil von Statinen, einer verbreiteten Klasse von Arzneimitteln, die bei der Behandlung von Hypercholesterinämie/Dyslipidämie zum Einsatz kommen, festgestellt. Die Beobachtung von höheren Plasmakonzentrationen an Rosuvastatin bei Patienten mit der Ala174-OATP-C-Variante weist darauf hin, dass der Transport von Rosuvastatin durch die Ala174-Variante geringer ist als derjenige der Val174-OATP-C-Variante. Die Ala174-Variante hat somit eine reduzierte Aufnahme von Statinen in die Leber hinein und daraus folgend erhöhte Plasmaspiegel zur Folge. Die Plasmakonzentration an Arzneimittel ist ein Faktor bei der Veränderung des Nutzen-Risiko-Verhältnisses der Statin-Therapie. Die OATP-C-Varianten N130D und P155T scheinen die pharmakokinetische Disposition von Rosuvastatin nicht zu beeinflussen.
Die Genotyp-Phänotyp-Korrelation zwischen OATP-C-Varianten und in vivo Plasmaspiegeln von Statinen kann dazu verwendet werden, die Statindosis, passend für jedes Individuum, über ein diagnostisches Assay für den SNP oder die Protein-Variante zu optimieren. Die Optimierung des Plasmaspiegels wird bei den Personen wichtig sein, die höhere Dosen an Statinen für eine adäquate Verringerung der Cholesterinspiegel auf den gewünschten Grenzwert benötigen.
Ein Beweis, dass Polymorphismen bei OATP-C die in vivo-Disposition von Statinen beeinflussen, deutet darauf hin, dass sich OATP-C-Varianten auf die klinische Antwort gegenüber Statinen und anderen klinisch relevanten Arzneimitteln, die durch OATP-C transportiert werden, auswirken können. Durch Korrelation von Polymorphismen bei OATP-C mit auf die Dosis normierten Plasmakonzentrationen an Rosuvastatin am Ende der Behandlung, die bei Personen festgestellt wurde, welche 6 Wochen lang mit unterschiedlichen Dosen von Rosuvastatin behandelt wurden, wurde gezeigt, dass OATP-C-Varianten einen funktionalen Effekt auf die pharmakokinetische in vivo-Disposition von Rosuvastatin aufweisen. Personen, die für die Val174Ala-Variante heterozygot sind, weisen erhöhte mittlere Plasmakonzentrationen an Rosuvastatin auf, verglichen mit Personen, die für die Wildtyp-Variante Val174 an der Aminosäure-Position 174 homozygot sind. Es wurde gefunden, dass Personen mit einer einzelnen Kopie des OATP-C*15-Allels (heterozygot für die Val174Ala- und die Asn130Asp-Varianten) höhere mittlere Plasmakonzentrationen als Personen mit den Haplotypen OATP-C*1a, OATP-C*1b und OATP-C*14 aufweisen. Die Beobachtung von höheren Konzentrationen an Rosuvastatin bei Personen mit der Ala174-OATP-C-Variante deutet darauf hin, dass der Transport durch die Ala174-Variante geringer als derjenige der Val174-OATP-C-Variante ist. Die Ala174-Variante hat eine reduzierte Aufnahme von Statinen in die Leber zur Folge und hat einen Einfluss auf die klinische Antwort gegenüber Statinen. OATP-C-Varianten, die einen Einfluss auf die pharmakokinetischen Profile von Statinen haben, können mit einem verringerten Nutzen-Risiko-Verhältnis der Stativ-Therapie als eine Folge der hohen Konzentrationen an Statinen im Blutkreislauf in Verbindung gebracht werden. Die Genotyp-Phänotyp-Korrelation zwischen OATP-C-Varianten und in vivo-Plasmaspiegeln von Statinen kann dazu verwendet werden, die Statindosis, passend für jedes Individuum, über ein diagnostisches Assay für den SNP oder die Proteinvariante zu optimieren. Die Optimierung des Plasmaspiegels wird bei den Personen wichtig sein, die hohe Dosen an Statinen für eine adäquate Verringerung der Cholesterinspiegel auf den gewünschten Grenzwert benötigen.
Beispiel 2
Beweis für die funktionale Signifikanz des NF1-SNPs (az0005537)
4 zeigt, dass es eine Tendenz für eine Zunahme bei den mittleren Plasmakonzentrationen an Rosuvastatin bei jenen Personen gibt, die für den SNP az0005537 heterozygot sind. Dieser SNP befindet sich innerhalb einer putativen Bindungsstelle des NF1-Transkriptionsfaktors bei -118 bp stromaufwärts von dem Start der Transkription.
5 zeigt, dass Personen, die die gekoppelte 174A-Variante und ein minores C-Allel bei dem SNP az0005537 besitzen, eine Tendenz zu höheren mittleren Plasmakonzentrationen an Rosuvastatin im Vergleich mit Personen mit der V174-Variante aber dem verbreiteten Hauptallel (A) von az0005537 aufweisen. Somit scheint das variante az0005537-Allel (C) einen additiven Effekt auf die Plasmaspiegel von Rosuvastatin zu besitzen.
Da sich Allele von SNP az0005537 im Kopplungs-Ungleichgewicht mit jenen von OATPC-V174A befinden, kann das variante Allel bei dem SNP in der Promotor-Region die Expression des OATPC-Allels mit reduzierter Funktion erhöhen, was zu erhöhten Plasmaspiegeln an Rosuvastatin bei den Personen führt, die beide dieser polymorphen Varianten besitzen.
Wenn man V174A allein bei der ganzen Kohorte von Proben (n = 267) betrachtet, weist der V174A-WT im Vergleich zum V174A-Heterozygoten einen t-Test-Wert von p = 0,055 auf. Jedoch, wenn der V174V-WT verglichen mit dem Compound-Heterozygoten V174A&NF1 (az0005537) betrachtet wird, dann beträgt der t-Test-Wert p = 0,032, was statistisch signifikant ist. Dies deutet darauf hin, dass der OATPC-NF1-SNP auch eine Determinante der pharmakokinetischen Disposition von Rosuvastatin sein kann. Vorläufige in vitro-funktionale Daten unterstützen die Hypothese, dass das variante C-Allel von az0005537 mit einer erhöhten Expression assoziiert ist. Der Promotor-Polymorphismus kann eine differenzielle allelische Expression mit einer größeren Expression des OATPC-Allels von reduzierter Funktion steuern.
Beispiel 3
Kopplungsungleichgewicht
Der Polymorphismus -118A>C oder -1558T>C der SEQ ID Nr.: 2 wurde wie unten dargelegt analysiert.
Allele der Polymorphismen bei -118 und -1558 sind in einem signifikanten Kopplungsungleichgewicht mit dem Alanin-Allel bei Position 174 der SEQ ID Nr.: 1 (p = 0,009 bzw. 0,025, analysiert durch das ASSOCIATE-Programm, siehe Ott J. (1999) Analysis of human genetic linkage, 3. Ausgabe. Johns Hopkins University Press, Baltimore).
SEQUENZ-AUFLISTUNG

Claims

Verfahren der Diagnose, umfassend: (a) das Verwenden einer biologischen Probe von einem Menschen, der dahingehend identifiziert wurde, einer Behandlung mit Rosuvastatin zu bedürfen, wobei die Probe eine OATP-C codierende Nukleinsäure umfasst; (b) das Testen der Nukleinsäure auf die Anwesenheit, auf mindestens einem Allel, von einem Alanin codierenden Codon an der Position, die der Position 174 der SEQ ID Nr.: 1 entspricht; und (c) wenn (b) in mindestens einem Allel gefunden wird, Diagnostizieren, dass der Mensch wahrscheinlich ein verringertes Vermögen besitzt, Rosuvastatin-Mittel in Zellen hinein zu transportieren.
Verfahren gemäß einem vorhergehenden Anspruch, wobei das therapeutische Mittel ein Statin ist, der Mensch mit einer Dosismenge an Statin behandelt wird und der Schritt (c) ferner das Diagnostizieren des Menschen als geeignet zur Titration gegenüber einer anderen höheren Statin-Dosismenge umfasst, umfassend das Überwachen bezüglich einer Abnahme des Nutzen-Risiko-Verhältnisses, welches von dem reduzierten Vermögen herrührt, das Statin in Zellen hinein zu transportieren.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Mensch mit mindestens 5 mg von einem Rosuvastatin täglich behandelt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Mensch mit mindestens 10 mg von einem Rosuvastatin täglich behandelt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Mensch mit mindestens 20 mg von einem Rosuvastatin täglich behandelt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Mensch mit mindestens 40 mg von einem Rosuvastatin täglich behandelt wird.
Verfahren der Diagnose, umfassend: (a) das Verwenden einer biologischen Probe von einem Menschen, der dahingehend identifiziert wurde, einer Behandlung mit Rosuvastatin zu bedürfen, wobei die Probe ein OATP-C-Polypeptid umfasst; (b) das Bestimmen, ob die Aminosäure von OATP-C, die der Position 174 der SEQ ID Nr.: 1 entspricht, ein Valin ist; und (c) wenn die Aminosäure kein Valin ist, Diagnostizieren, dass der Mensch wahrscheinlich ein verringertes Vermögen besitzt, Rosuvastatin in Zellen hinein zu transportieren.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das therapeutische Mittel ein Statin ist, der Mensch mit einer Dosismenge an Statin behandelt wird und der Schritt (c) ferner das Diagnostizieren des Menschen als geeignet zur Titration gegenüber einer anderen höheren Statin-Dosismenge umfasst, umfassend das Überwachen bezüglich einer Abnahme des Nutzen- Risiko-Verhältnisses, welches von dem reduzierten Vermögen herrührt, das Statin in Zellen hinein zu transportieren.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7–8, wobei die Aminosäure an der Position 174 dahingehend bestimmt wird, Alanin zu sein.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7–9, wobei der Mensch mit mindestens 5 mg von einem Rosuvastatin täglich behandelt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7–9, wobei der Mensch mit mindestens 10 mg von einem Rosuvastatin täglich behandelt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7–9, wobei der Mensch mit mindestens 20 mg von einem Rosuvastatin täglich behandelt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7–9, wobei der Mensch mit mindestens 40 mg von einem Rosuvastatin täglich behandelt wird.