CN101356286A - 心血管病症的诊断和疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明的试剂盒和方法涉及心血管病症的诊断。一方面，本发明公开了确定个体是否具有易碎斑块病症的方法和试剂盒。一方面，本发明公开了确定个体是否具有闭塞病症的方法和试剂盒。一方面，本发明公开了确定个体是否具有再狭窄病症的方法和试剂盒。本发明的其它方法涉及用于患有心血管疾病患者的治疗剂的选择。

Description

心血管病症的诊断和疗法
技术领域
本发明涉及诊断和治疗心血管病症的试剂盒和方法，更具体地，涉及与IL-1基因型模式相关病症的诊断有关的试剂盒和方法。
发明背景
动脉粥样硬化(或动脉硬化)为用于描述动脉的渐进性管腔变窄和硬化的术语，其可导致动脉瘤、局部缺血、血栓形成、栓塞形成或其它血管功能不全。所述疾病过程能在人体任意全身性动脉中发生。例如，供应脑的动脉(例如，颈动脉，大脑内的，等等)的动脉粥样硬化可导致中风。当外周动脉堵塞时可能发生坏疽，当向心肌供氧和营养物的动脉受影响时发生冠状动脉疾病。
冠状动脉疾病为多因子病，其导致供应心肌的动脉粥样斑块沉积和渐进性管腔变窄。动脉粥样硬化过程涉及动脉壁中脂质诱导的生物学变化，导致保持血液腔室的流动相与管壁分开的稳态机制被打破。由于对所有损伤的正常反应是炎症，所以粥样硬化病变显示出复杂的慢性炎性反应，包括单核白细胞的渗透、细胞增殖和迁移、细胞外基质的重构和新生血管形成。实际上，粥样斑块由炎性和免疫细胞的混合物、纤维组织、以及诸如低密度脂质(LDL)的脂肪物质及其变体和α-脂蛋白构成。管腔变窄或堵塞导致向心肌输氧和营养物能力的减弱、产生心肌梗塞、心绞痛、不稳定心绞痛、以及突发的局部缺血性死亡如心力衰竭。
尽管闭塞通常进展缓慢，但是当一部分组合而成的动脉斑脱落并沉积在动脉的某处而临时堵塞时，或者更经常地，当在动脉腔内出现血栓时，血液供应可能被突然中断。压在易损斑块上的纤维帽的破裂为冠状动脉血栓形成的最通常原因。取决于这种发作期间堵塞远端的肌肉量，一部分心肌组织可能死亡、弱化心肌并通常导致个体死亡。
很多年以来，对诸如心肌梗塞或死亡的心脏病“临床事件”的来临风险的最普通衡量是冠状动脉的物理堵塞，如通过诸如血管造影术的技术所评估的。DeWood和同事在80年代早期的研究(N.Engl.J.ofMed.(1980)303：1137-40)中揭示闭塞血栓导致了大多数的急性心肌梗塞。当时，流行的观点是心肌梗塞起因于高度狭窄位点的闭塞。1988年，Little et al.(Circulation(1988)78：1157-66)证实大多数的梗塞起因于之前已在血管造影术上显示了少于50％狭窄的冠状堵塞。因此，冠状动脉狭窄的严重性不精确地预报随后的冠状动脉堵塞的位置。由于这些研究，易损动脉粥样硬化斑块的重要性变得明显。
现在已清楚，易损动脉粥样硬化斑块位点的破裂是急性冠脉综合征的最通常原因。这种斑块不引起高度狭窄，但是可以导致急性冠脉综合征，例如不稳定型心绞痛、心肌梗塞或猝死。目前没有方法能可靠地鉴别易于破裂的斑块。实际上，开发临床上有用的成像技术来鉴别易损斑块是活跃的研究领域。一些方法被用于鉴别这类斑块，包括例如热成像(粥样硬化斑块显示热不均一性)、光谱学(用于定量存在于冠状动脉组织的小容积中的胆固醇、胆固醇酯、甘油三酯、磷脂和钙盐)、放射性同位素闪烁法(诸如炎症细胞的易损斑块的多种成分可采用放射性同位素技术成像)、以及检测炎性血清标志物如C反应性蛋白水平。
显示急性斑块破裂的动脉位点以慢性炎性组分为特征，在稳定和不太可能导致临床事件的动脉斑块中这些组分不存在或以非常低的水平存在。(Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis：a perspective forthe 1990s(动脉粥样硬化的发病机理：二十世纪九十年代观点).Nature1993；362：801-809.)(Libby P.Molecular basis of the acute coronarysyndromes(急性冠脉综合征的分子基础).Circulation 1995；91：2844-2850)。目前发表的很多来源的临床数据清楚的证实多种炎性组分为冠状动脉疾病的严重性和临床结果的强有力独立影响因素(Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis：a perspective for the 1990s.Nature1993；362：801-809.)(Libby P.Molecular basis of the acute coronarysyndromes.Circulation 1995；91：2844-2850)。此外，实验室工作已证明促炎介质为动脉粥样硬化过程中的关键元素(Ross R.The pathogenesisof atherosclerosis：a perspective for the 1990s.Nature 1993；362：801-809.)(Libby P.Molecular basis of the acute coronary syndromes.Circulation1995；91：2844-2850)。
尽管存在很多学说，但是动脉粥样化斑块构建的起因和机制不完全清楚。动脉粥样硬化发病机理的一种理论包括以下阶段：(1)内皮细胞机能障碍和/或损伤，(2)单核细胞募集和巨噬细胞形成，(3)脂质沉积和修饰，(4)血管平滑肌细胞增殖，以及(5)细胞外基质合成。根据这些理论，动脉粥样硬化的起始可能是由于损伤形成，可能源自机械应激或源自化学应激。身体对这些损伤如何反应决定该损伤是否以及如何迅速地恶化为粥样硬化病变。这又可导致动脉管腔变窄和对心脏组织的损伤，这取决于血流的氧和营养物。
很多年以来，流行病学研究已经表明个体的遗传组成为发生血管疾病的重要风险因子。例如，心脏疾病的家族史与增加的发生冠状动脉疾病的个体风险相关。历史上曾将脂质和胆固醇代谢认为是冠状动脉疾病的首要遗传影响因素。例如，诸如在家族性高胆固醇血症中低密度脂质(LDL)的细胞受体的缺陷与高水平的血浆LDL和过早出现动脉粥样硬化相关(Brown&Goldstein，Sci.，191(4223)：150-4(1976))。
现在普遍认为炎症是动脉粥样硬化病理过程中的重要组分(Munro，Lab Invest.，58：249-261(1988)；Badimon，et al.，Circulation，87：3-16(1993)；Liuzzo，et al.，N.E.J.M.，331(7)：417-24(1994)；Alexander，N.E.J.M.，331(7)：468-9(1994))。作为血管衬里的内皮细胞的损伤导致包括IL-1、TNFα在内的炎性细胞因子的积聚，以及释放前列腺素类和生长因子，如前列腺素I2(PGI2)、血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞成长因子(bFGF)、以及粒细胞-单核细胞刺激因子(GM-CSF)。这些因子导致诸如单核细胞的炎性细胞的积聚和调节，所述炎性细胞积聚在血管壁内。然后单核细胞释放其它的炎性介质，包括IL-1、TNF、前列腺素E2(PGE2)、bFGF和转化生长因子α和β(TGFα、TGFβ)。所有这些炎性介质都募集更多的炎性细胞至损伤区域，调节内皮和平滑肌细胞的行为，并导致动脉粥样化斑块的积聚。
在动脉粥样硬化病变中或者在病变的冠状动脉中已鉴定出包括IL-1β的几种炎性产物(Galea，et al.，Ath.Thromb.Vasc.Biol，16：1000-6(1996))。另外，还已发现患有冠状动脉疾病的患者中IL-1β血清浓度升高(Hasdai，et al.，Heart，76：24-8(1996))。尽管历史上认为炎性剂的存在是响应损伤或单核细胞活化，但是异常炎性反应也可能是冠状动脉疾病的病因或者产生对该疾病增加的易感性。
治疗血管疾病的关键问题是正确诊断。通常该疾病的第一体征是猝死。例如，大约半数死于冠状动脉疾病的个体是猝死。另外，对于40-60％的最终被诊断为具有冠状动脉疾病的患者，心肌梗塞是该疾病的首次表现。遗憾的是，约40％的这些初发事件未被患者注意到。现在认为，易损斑块的鉴定和稳定是治疗冠状动脉粥样硬化的重要要素。在不同个体中鉴定单倍性模式将使得处理心血管疾病成为可能，并且治疗将致力于斑块稳定而不是血管重建和其它侵入性更强的方法。这是特别重要的，因为出于各种原因，患者感受的症状并不与冠状动脉疾病的总负荷很好地相关(Anderson&Kin，Am.Heart J.，123(5)：1312-23(1992))。
经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)被用于通过压缩动脉粥样化斑块至血管壁侧来治疗梗阻性冠状动脉疾病。PTCA被广泛使用，最初成功率超过90％。但是，PTCA的长期成功被管腔内操作位点的再变窄或再狭窄所限制。这在操作后6个月内出现在经历了单支操作的约30％至40％患者中和在经历了多支血管成形术的多于50％的患者中。
支架的放置在很大程度上替代了球囊血管成形术，因为其能够更广泛地恢复管腔内尺寸，具有减少再狭窄约50％的作用。具有讽刺意味的是，支架放置实际上增加了治疗位点的新生内膜生长，但是由于通过支架放置可实现更大的内腔，该组织生长可更容易地被容纳并且维持足够的腔尺寸，这样与单独球囊血管成形术相比，通过支架放置的再狭窄速率几乎减半。
再狭窄中涉及的病理生理学机制还没有完全清楚。尽管多种临床、解剖和技术因素与出现再狭窄有关系，但是至少有50％的过程还有待阐明。然而，已知在内皮损伤后，启动了一系列的修复机制。在损伤的几分钟内，一层血小板和纤维蛋白沉积在损伤的内皮上。几小时至几天内，炎症细胞开始渗入损伤的区域。在损伤后24小时内，位于血管中膜的血管平滑肌细胞(SMC)就开始DNA合成。数天后，这些活化的、合成的SMC穿过内弹性膜朝管腔表面迁移。这些细胞通过它们的连续复制和它们产生的细胞外基质形成新生内膜。内膜厚度的增加与正在进行的细胞增殖基质沉积一起发生。当这些血管愈合的过程过度进行，则该病理学状况称为内膜增生或肌内膜增生。参与了再狭窄的血管壁愈合生物学因此包括伤口愈合的一般过程和肌内膜增生的特异过程。炎症通常被视为这两种过程中的重要组分。(Munro and Cotran(1993)Lab.Investig.58：249-261；和Badimon et al.(1993)，Supp II87：3-6)。因此，了解急性和慢性炎症在血管壁中的作用可提出诊断和治疗再狭窄和相关状况的方法。
在其初始阶段，炎症的特征是白细胞对血管壁的粘附。白细胞对损伤内皮表面的粘附是通过内皮和嗜中性粒细胞表面的几种复合糖蛋白介导的。其中两种结合分子已被很好地表征：内皮白细胞粘附分子-1(ELAM-1)和细胞间粘附分子-1(ICAM-1)。炎症状态期间，中性粒细胞对有关细胞表面的粘附大大增加，主要是由于这些结合分子的上调和增强的表达。被认为是对组织损伤的炎性反应的主要介质的物质包括白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子α(TNF)、淋巴毒素和细菌内毒素，它们都增加这些结合物质的产生。
在结合至损伤的血管壁后，白细胞向其中迁移。一旦达到血管壁内合适位置，则白细胞、尤其是活化的巨噬细胞释放其它的炎性介质，包括IL-1、TNF、前列腺素E2(PGE2)、bFGF、以及转化生长因子α和β(TGFα、TGFβ)。所有这些炎性介质都募集更多的炎症细胞至损伤区域，并调节平滑肌的进一步增殖和迁移。单核-巨噬细胞加工的公知生长因子为单核细胞和巨噬细胞衍生生长因子(MDGF)、平滑肌细胞和成纤维细胞增殖的刺激物。MDGF被认为类似于血小板衍生生长因子(PDGF)；实际上，这两种物质可能是相同的。通过刺激平滑肌细胞增殖，炎症可促进肌内膜增生的进行。
通过上述炎症化学介质吸引至血管壁的白细胞产生对血管壁有直接影响的物质，这可能恶化局部损伤和延长愈合反应。首先，通过炎症过程被活化的白细胞分泌溶酶体酶，其可消化胶原和其它的结构蛋白。这些酶在血管壁内的释放可影响其细胞外基质的完整性、允许SMC和其它迁移细胞更容易地穿过血管壁。因此，这些溶酶体蛋白酶的释放可增强导致肌内膜增生的过程。其次，活化的白细胞通过NADPH系统的作用在它们的细胞膜上产生自由基。这些自由基可直接损害细胞组分，导致局部损伤的扩展或损伤-炎症-愈合周期的延长。
希望的是确定哪些患者会对诸如血管造影术和血管内支架放置的对闭塞血管疾病的侵入性治疗反应良好。还希望的是鉴定有增加的狭窄风险的患者，这样可针对他们采用适合的疗法以防止、调节或逆转该状况。此外，还希望的是，鉴定由于再狭窄风险而对他们而言PTCA和支架放置为亚适治疗选择的那些个体。那些患者可能成为在较早阶段可能与其它药理学介入联合的血管重建操作的候选者。
IL-1基因簇的遗传学
IL-1基因簇位于染色体2的长臂上(2q13)，在430Kb的区域内含有至少IL-1α(IL-1A)、IL-1β(IL-1B)、和IL-1受体拮抗剂(IL-1RN)的基因(Nicklin，et al.(1994)Genomics，19：382-4)。激动剂分子IL-1α和IL-1β具有有效的促炎活性，处于很多炎性级联的开始。它们通常通过诱导其它细胞因子如IL-6和IL-8起作用，导致活化和募集白细胞到损伤组织、血管活性剂的局部产生、脑部的发热反应和肝急性期反应。三种IL-1分子都结合I型和II型IL-1受体，但是只有I型受体将信号转导进细胞内部。与此相反，II型受体从细胞膜脱落，用作诱骗受体。因此，该受体拮抗剂和II型受体就其作用而言是抗炎的。
IL-1的不适当产生在很多自身免疫和炎性疾病(包括类风湿性关节炎、炎性肠病、牛皮癣等)的病理学中起关键作用。此外，在IL-1的产生速率方面存在稳定的个体间差异，一些这种差异可以通过IL-1基因位点的遗传差异得到说明。因此，IL-1基因是确定对炎性疾病的遗传易感性部分的合适候选者，这些炎性疾病的大部分具有有多基因组分的多因子病因学。
某些来自IL-1基因簇的等位基因已知与特定的疾病状态相关。例如，IL-1RN(VNTR)等位基因2已经被证实与骨质疏松(美国专利5,698,399)、糖尿病中的肾病(Blakemore，et al.(1996)Hum.Genet.97(3)：369-74)、斑秃(Cork，et al.，(1995)J.Invest.Dermatol.104(5 Supp.)：15S-16S；Cork et al.(1996)Dermatol Clin 14：671-8)、格雷夫斯(Graves)病(Blakemore，et al.(1995)J.Clin.Endocrinol.80(1)：111-5)、系统性红斑狼疮(Blakemore，et al.(1994)Arthritis Rheum.37：1380-85)、硬化性苔藓(Clay，et al.(1994)Hum.Genet.94：407-10)、以及溃疡性结肠炎(Mansfield，et al.(1994)Gastoenterol.106(3)：637-42))相关。
此外，来自标志物-889的IL-1A等位基因2和来自标志物+3954的IL-1B(TaqI)等位基因2已被发现与牙周病相关(美国专利5,686,246；Kornman and diGiovine(1998)Ann Periodont 3：327-38；Hart andKornman(1997)Periodontal 2000 14：202-15；Newman(1997)CompendContin Educ Dent 18：881-4；Kornman et al.(1997)J.Clin Periodontal 24：72-77)。来自标志物-889的IL-1A等位基因2也已被发现与青少年慢性关节炎、尤其是慢性虹膜睫状体炎相关(McDowell，et al.(1995)Arthritis Rheum.38：221-28)。来自IL-1B的标志物+3594的IL-1B(TaqI)等位基因2也已被发现在DR3/4患者中与牛皮癣和胰岛素依赖的糖尿病相关(di Giovine，et al.(1995)Cytokine 7：606；Pociot，et al.(1992)EurJ.Clin.Invest.22：396-402)。此外，该IL-1RN(VNTR)等位基因1被发现与糖尿病性视网膜病相关(参见USSN 09/037472和PCT/GB97/02790)。此外，IL-IRN(VNTR)的等位基因2被发现与来自北美和欧洲的高加索人群的溃疡性结肠炎相关(Mansfield，J.et al.，(1994)Gastroenterology 106：637-42)。有趣的是，这种相关性在种族相关的Ashkenazi Jews人群中尤其明显(PCT WO97/25445)。
基因型筛选
传统的筛选可遗传疾病的方法依赖于鉴别出异常基因产物(例如镰刀形细胞贫血症)或异常表型(例如智力迟缓)。这些方法对于诸如例如血管病的晚期发作和不容易鉴定表型的遗传病的作用有限。随着简单和低价的遗传筛选方法的出现，现在可能鉴定指示出现疾病的倾向性的多态性，甚至当该疾病是多基因起源时。可通过分子生物学方法筛选的疾病数量随着对多因子病症遗传基础的增加的了解而持续增加。
遗传筛选(也称为基因分型或分子筛选)可在广义上被定义为测试以确定患者是否具有突变(或等位基因或多态性)，该突变引起疾病状态或与引起疾病状态的突变“连锁”。连锁指这样的现象，其中基因组中靠近在一起的DNA序列具有一起遗传的趋势。因为共遗传的某些选择优势，两序列可能是连锁的。但是，更典型的是，因为两多态性之间的区域内减数分裂重组事件相对低频地发生，所以两多态性序列共遗传。这些共遗传的多态性等位基因被认为彼此间连锁不平衡，因为在给定的人群中，在该人群的任何特定个体中它们趋于一起出现或者完全不出现。实际上，当给定染色体区域中的多重多态性被发现彼此连锁不平衡时，它们定义了准稳定的遗传“单倍型”。相反，出现在两多态性位点之间的重组事件使得它们被分离至不同的同源染色体中。如果两物理上连锁的多态性之间的减数分裂重组足够频繁地发生，则该两多态性看起来是独立分离的，称为连锁平衡。
尽管两标志物之间的减数分裂重组的频率通常与染色体上它们之间的物理距离成比例，但是“热点”以及染色体重组被抑制区域的出现可导致两标志物之间物理和重组距离的差异。因此，在某些染色体区域中，横跨宽染色体结构域的多重多态性位点可能彼此是连锁不平衡的，因此定义了宽跨度的遗传单倍型。此外，当致病突变被发现位于这种单倍型内或与其连锁时，单倍型的一个或多个多态性等位基因可被用作出现疾病可能性的诊断或预测指示物。如果疾病突变在不久前发生，则其它良性多态性和致病多态性之间的关联性出现，这样没有经过足够长的时间通过重组事件来实现平衡。因此，对跨越致病突变变化的或与其连锁的人单倍型的鉴定用作个体遗传了该致病突变的可能性的预测性衡量。重要的是，这种预测或诊断性操作可在不必鉴定和分离实际的致病病变下使用。这是有重要意义的，因为精确确定涉及疾病过程的分子缺陷可能是困难和费力的，特别是对于诸如炎性病症的多因子疾病而言。
实际上，炎性病症和IL-1多态性之间的统计学相关性不一定表明该多态性直接导致了该病症。而是相关的多态性可能是良性等位基因变体，其与致病突变连锁(即与其连锁不平衡)，该突变在最近人类进化中发生，这样没有经过足够长的时间通过介入染色体分离中的重组事件来实现平衡。因此，出于特定疾病的诊断和预测测定目的，可利用对与该疾病相关的多态性等位基因的检测，无需考虑该多态性是否直接参与了该疾病的病因学。而且，当给定的良性多态性位点与明显的致病多态性位点连锁不平衡时，其它的与该良性多态性位点连锁不平衡的多态性位点也可能与该致病多态性位点连锁不平衡。这样，这些其它的多态性位点也可预测或诊断具有遗传的该致病多态性位点的可能性。实际上，一旦在特定疾病或状况和对应的人单倍型之间建立了相关性，则宽跨度的人单倍型(描述一套连锁的多态性标志物的等位基因共遗传的典型模式)可为诊断目的的目标。因此，可通过表征一个或多个疾病相关多态性等位基因(或甚至一个或多个疾病相关单倍型)来确定个体出现特定疾病状况的可能性，而不必确定或表征致病性遗传变异。
发明概述
一方面，本发明提供了确定个体是否患有心血管病症的新方法和试剂盒。在一个实施方案中，本发明的试剂盒和方法涉及易碎斑块病症的诊断。易碎斑块病症存在的诊断鉴定出有出现易碎斑块疾病倾向的那些患者，该易碎斑块疾病的特征在于诸如心肌梗塞和中风的临床事件。对这些有出现易碎斑块疾病倾向的个体的诊断是尤其重要的，因为该疾病的发作可以是突然的和悲剧性的，没有预警体征和症状。因此确定哪些患者由于他们具有所述病症而具有出现所述疾病的风险使得早期诊断疾病状况并通过适当治疗剂治疗所述病症和疾病成为可能。
在另一实施方案中，本发明的试剂盒和方法涉及诊断闭塞病症。闭塞病症存在的诊断鉴定出具有出现闭塞疾病倾向的那些患者，该闭塞疾病的特征在于诸如局部缺血、绞痛、跛行、休息痛和坏疽的临床事件。因此确定哪些患者由于它们具有所述病症而具有出现所述疾病的风险使得在受影响血管供应的组织中出现不可逆组织变化之前的阶段早期诊断和治疗性介入成为可能。
在另一实施方案中，本发明的试剂盒和方法涉及诊断再狭窄病症。再狭窄病症存在的诊断鉴别出有出现再狭窄疾病倾向的那些患者，该再狭窄疾病的特征在于与正在通过支架进行治疗的初始血管狭窄的复发相关的临床事件。因此确定哪些患者由于它们具有所述病症而具有出现所述疾病的风险使得选择对于该初始血管狭窄最可能避免随后的狭窄的疗法成为可能。例如这些患者可能是手术血管重建而不是经皮腔内血管成形术的候选者，或者这些患者在影响该再狭窄病症进展的早期阶段可以受益于药理学或局部介入。
另一方面，本发明的方法提供了对具有上述类型的心血管病症的患者的治疗。治疗包括确定患者是否具有与心血管病症相关的等位基因模式并向患者给予适于治疗该心血管病症的治疗剂。在一个实施方案中，该方法可包括对该心血管病症风险因子的鉴定和减少该风险因子对患者影响的治疗方案的形成。
本发明的这些和其它实施方案至少部分地依赖于这样的新发现：IL-1基因簇中四个多态性位点的等位基因模式与心血管病症相关。这些模式在本文中被称为模式1、2和3。模式1包括这样的等位基因模式：其包括IL-1A(+4845)或IL-1B(+3954)的等位基因2和IL-1B(-511)或IL-1RN(+2018)的等位基因1，或者与上述等位基因之一连锁不平衡的等位基因。在优选的实施方案中，这种等位基因模式使得能诊断易碎斑块病症。模式2包括这样的等位基因模式：其包括IL-1B(-511)或IL-1RN(+2018)的等位基因2和IL-1A(+4845)或IL-1B(+3954)的等位基因1，或者与上述等位基因之一连锁不平衡的等位基因。在优选的实施方案中，这种等位基因模式使得能诊断易碎斑块病症。模式3包括这样的等位基因模式：其包括IL-1A(+4845)的等位基因1或IL-1B(+3954)的等位基因1、和IL-1B(-511)的等位基因1或IL-1RN(+2018)的等位基因1、或者与上述等位基因之一连锁不平衡的等位基因。在优选的实施方案中，这种等位基因模式使得能诊断再狭窄病症。
通过多种可利用技术的任一种可检测与心血管病症相关的等位基因，包括：1)在核酸样品和能够与该等位基因杂交的探针之间进行杂交反应；2)对该等位基因的至少一部分测序；或者3)确定该等位基因或其片段(例如通过内切酶消化产生的片段)的电泳移动率。该等位基因可任选地在检测步骤进行之前经扩增步骤。优选的扩增方法选自：聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链替代扩增(SDA)、克隆以及上述方法的变体(例如RT-PCR和等位基因特异的扩增)。例如可从IL-1基因座内选择扩增所需的寡核苷酸，它们或者邻接所关注的标志物(如PCR扩增所需)或直接重叠标志物(如在ASO杂交中的)。在尤其优选的实施方案中，该样品与一套引物杂交并经受PCR扩增，所述引物与血管疾病相关等位基因的有义或反义序列的5′和3′杂交。
也可以间接检测与心血管病症相关的等位基因，例如通过分析DNA编码的蛋白产物。例如，当所关心的标志物导致翻译出突变的蛋白，则可通过多种蛋白检测技术的任一种检测该蛋白。这类方法包括免疫检测和生物化学试验，例如当蛋白由于截短、延长、折叠改变或翻译后修饰改变而具有表观分子量变化时，采用大小分级。
另一方面，本发明的特征在于进行上述测定的试剂盒。该试剂盒可包括核酸样品收集手段和测定个体是否携带有心血管病症相关等位基因的手段。该试剂盒还可以含有阳性或阴性对照样品或标准品和/或评估结果的算法装置以及包括如下的其它的试剂和组分：DNA扩增试剂、DNA聚合酶、核酸扩增试剂、限制酶、缓冲剂、核酸取样装置、DNA纯化装置、脱氧核苷酸、寡核苷酸(例如探针和引物)等。
如上所述，对照样品可为阳性或阴性对照。此外，对照样品可以含有所采用的等位基因检测技术的阳性(或阴性)产物。例如，当等位基因检测技术为PCR扩增、随后是大小分级时，该对照样品可以包含合适大小的DNA片段。同样，当等位基因检测技术涉及检测突变的蛋白时，对照样品可以包括突变蛋白的样品。但是，优选对照样品包含待检测的物质。例如，对照可以为基因组DNA样品或IL-1基因簇的克隆部分。但是，当带测试的样品为基因组DNA时，优选对照样品为基因组DNA的高度纯化的样品。
存在于所述试剂盒中的寡核苷酸可以被用于扩增所关注的区域或指引等位基因特异的寡核苷酸(ASO)杂交到所研究的标志物上。因此，该寡核苷酸可以从两侧邻接所关注的标志物(如PCR扩增所需)或直接重叠标志物(如在ASO杂交中的)。
采用本文描述的测定法和试剂盒获得的信息(单独的，或者与风险因子信息联合，这些风险因子例如是促进血管病症的并发疾病、遗传缺陷或环境因子)可用于确定无症状个体是否具有心血管病症或者是否可能出现心血管疾病。此外，该信息使得能够采用更加个性化的方法，并且使得能够确定作用过程是否应该涉及使用侵入性更强的操作或者治疗是否应该针对斑块稳定性。这种信息使得临床医师能更有效地确定针对该病症的分子或遗传基础的疗法。
另一方面，本发明的特征在于治疗或防止个体中心血管病症出现的方法，其通过向该个体给予适当的本发明治疗剂来实现。另一方面，本发明提供了体外或体内测定法，用于筛选测试化合物以鉴定治疗或防止心血管病症的治疗剂。在一个实施方案中，该测定包括让经可操作地连接至适当启动子的致病突变转染的细胞与测试化合物接触并测定存在或不存在测试化合物下该细胞中蛋白的表达水平。在一个实施方案中，该致病突变影响了IL-1受体拮抗剂的系统水平并与增加的IL-1RA的血清水平相关，这样特定化合物的治疗效果可通过其存在下IL-1RA的血清水平是否下降来判断。在另一优选的实施方案中，如果该心血管病症致病突变导致IL-1α或IL-1β的产生增加，则测试化合物存在下IL-1α或IL-1β的产生减少表明该化合物为IL-1α或IL-1β活性的拮抗剂。在另一实施方案中，本发明的特征在于转基因非人动物和它们在鉴定IL-1α或IL-1β活性的拮抗剂或IL-1Ra活性的激动剂方面的用途。
本发明的其它特征和优点在以下的详细说明和权利要求中指出。
附图简要说明
图1示意性绘出了染色体2上的基因位置。
图2显示了IL-1基因簇内不平衡值表格。
图3给出了显示单倍型模式频率的条形图。
图4给出了IL-1基因型模式2内的等位基因示意图和某些其它临床相关性。
图5显示了与遗传标志物相关的临床试验的特征。
图6给出了IL-1基因型和冠状动脉狭窄之间相关性的条形图。
图7给出了显示IL-1基因型模式和再狭窄之间相关性的条形图。
图8给出了显示IL-1RN(+2018)位点的纯合和杂合等位基因模式与再狭窄和靶血管重建(TVR)之间相关性的条形图。
图9给出了胆固醇水平、IL-1模式和临床事件之间关系的示意性流程图。
图10给出了显示IL-1多态性和具有不同总胆固醇水平的易碎斑块类型临床事件风险之间关系的条形图。
图11给出了IL-1基因型模式1中等位基因的示意性图以及某些它们的临床相关性。
图12显示了关联IL-1基因型模式2与Lp(a)水平的条形图。
图13显示了关联IL-1基因型模式2与LDL水平的条形图。
图14显示了说明IL-1基因型与C反应性蛋白水平之间关系的条形图。
发明详细说明
4.1定义
为了方便起见，下面提供在本说明书、实施例、和所附权利要求中使用的某些术语和短语的含义。
术语“异常活性”，当应用于诸如IL-1的多肽的活性时，是指这样的活性：其不同于天然多肽的活性或不同于健康个体中多肽的活性。因为它强于它的天然对应物的活性，所以多肽活性可以是异常的。或者，因为它相对于它的天然对应物的活性较弱或没有活性，所以活性可以是异常的。异常活性还可以是活性的变化。例如异常多肽可与不同靶肽相互作用。由于编码IL-1位点多肽的IL-1位点基因的过表达或表达不足，细胞可具有异常的IL-1活性。
术语“等位基因”指在不同多态区域发现的不同序列变体。例如IL-1RN(VNTR)具有至少5个不同的等位基因。序列变体可以是单个或多个碱基变化，包括但不限于插入、缺失、或取代，或可以是可变数量的序列重复。
术语“等位基因模式”指一个等位基因或多个等位基因在一个或多个多态区域的同一性。例如，等位基因模式可以由在多态位点的单个等位基因组成，就IL-1RN(VNTR)等位基因1而言，其是在IL-1RN位点的VNTR处具有至少一个拷贝的IL-1RN等位基因1的等位基因模式。或者，等位基因模式可以由单个多态性位点的纯合或杂合状态组成。例如，IL1-RN(VNTR)等位基因2，2是这样的等位基因模式：其中在IL-1RN的VNTR标志物处存在两拷贝的第二等位基因，其对应于纯合IL-RN(VNTR)等位基因2状态。或者，等位基因模式可以由在多于一个多态性位点的等位基因的同一性构成。
用在本文时，术语“抗体”意图指与IL-1B多肽特异性反应的结合剂，其包括整个抗体或其结合片段。可使用常规技术将抗体片段化，以与上述对于完整抗体的相同方式筛选片段的效用。例如，通过用胃蛋白酶处理抗体可以产生F(ab)2片段。可处理得到的F(ab)2片段以还原二硫键产生Fab片段。本发明的抗体还旨在包括双特异性的、单链的、和嵌合的和人源化的分子，其具有由抗体的至少一个CDR区域赋予的对IL-1B多肽的亲和力。
出于本文的目的，当用于IL-1时，可以互换使用的“生物学活性”或“生物活性”或“活性”或“生物学功能”指通过IL-1多肽(无论是它的天然或变性构象)或通过其任何子序列(片段)直接或间接发挥的效应物或抗原功能。生物学活性可包括结合、从受体完成信号转导、调节基因表达或抗原性效应物功能。
用在本文时，术语“IL-1多肽的生物活性片段”指全长IL-1多肽的片段，其中该片段特异性地模拟或拮抗野生型IL-1多肽的活性。生物活性片段优选能够与白细胞介素受体相互作用的片段。
“细胞”、“宿主细胞”或“重组宿主细胞”在本文中是可互换使用的术语，不仅是指特定的个体细胞，而且指该细胞的后代或潜在的后代。因为由于突变或环境影响而导致在后代中可以发生某些改变，这种后代事实上可能与母细胞不相同，但仍被包括在本文所用术语的范围内。
“嵌合体”、“镶嵌型”、“嵌合哺乳动物”等指在至少一些含有其基因组的细胞中具有敲除或敲入构建体的转基因哺乳动物。
术语“对照”或“对照样品”指对于所用检测技术适合的任何样品。对照样品可以包含所用等位基因检测技术的产物或待检测的物质。另外，对照可以是阳性或阴性对照。举例而言，当等位基因检测技术是PCR扩增，接着大小分级时，则对照样品可以包含适当大小的DNA片段。同样，当等位基因检测技术涉及检测突变蛋白质时，对照样品可以包含突变蛋白质的样品。然而，优选对照样品包含待检测的物质。例如，对照可以是基因组DNA样品或IL-1基因簇的克隆部分。然而，当待检测的样品是基因组DNA时，优选对照样品是高度纯化的基因组DNA样品。
由本文定义时，“心血管疾病”是指通过包括临床症状和临床体征的临床事件表征的心血管病症。临床症状为患者报告的那些体验，提示临床医师病状的存在。临床体征是那些在身体或者实验室检测中提示临床医师存在病状的客观发现。“心血管疾病”包括“冠状动脉疾病”和“外周血管疾病”，这两个术语在下文定义。在心血管疾病的临床症状包括胸痛、气短、虚弱、晕厥发作、意识改变、四肢痛、阵发性夜间呼吸困难、短暂局部缺血发作和患者经历的其它这样的的现象。心血管疾病中的临床体征包括这样的发现：如EKG异常、改变的周围脉搏、动脉杂音、异常心音、罗音和喘鸣、颈静脉扩张、神经学改变和临床医师确定的其它这样的发现。临床症状和临床体征可以在诸如心肌梗塞(MI)或者中风(也称为“脑血管意外”或者“CVA”)的心血管疾病中联合，，其中患者将报告某些现象(症状)而且临床医师将察觉其它的现象(体征)，它们都表明了隐含的病理学。“心血管疾病”包括那些与易碎斑块病症、闭塞病症和狭窄的心血管病症相关的疾病。例如，易碎斑块病症(如下文对该术语的定义)导致的心血管疾病可被称为“易碎斑块疾病”。与易碎斑块疾病相关的临床事件包括那些体征和症状：其中具有后来的急性血栓形成或者有远端的栓塞形成的易碎斑块的破裂是其标志。易碎斑块疾病的例子包括某些中风和心肌梗塞。作为另一实例，由闭塞病症引起的心血管疾病可称为“闭塞性疾病”。与闭塞性疾病相关的临床事件包括那些体征和症状：其中动脉闭塞的进展影响了循环至靶组织的血液量。进行性动脉闭塞可能导致进行性局部缺血，如果血液循环量不足以维持该组织，可能会最终进展至组织死亡。闭塞性疾病的体征和症状包括跛脚、休息痛、绞痛、和坏疽，以及表明血管狭窄和远端灌注降低的身体和实验室发现。在另一个实例中，由再狭窄而引起的心血管疾病可称为支架内狭窄疾病。支架内狭窄疾病包括由进行性动脉支架的堵塞引起的体征和症状，动脉支架已经确定为诸如经皮腔内血管成形术的程序的一部分，其中支架的存在旨在帮助血管维持其被最新扩展的形态。与支架内狭窄疾病相伴的临床事件是那些可归于重建动脉的再狭窄。
“心血管病症”广义上指冠状动脉病症和外周动脉病症。术语“心血管病症”可以用于任何动脉异常，无论是结构上的、组织学的、生物化学的或者任何其它的异常。该术语包括那些以易碎斑块为特征的病症(本文称为“易碎斑块病症”)、那些以血管闭塞为特征的疾病(本文称为“闭塞性病症”)、以及那些以再狭窄为特征的病症。“心血管病症”可以先在动脉中发生，即，先于任何医疗或者外科手术。主要的心血管病症尤其包括动脉粥样硬化、动脉闭塞、动脉瘤形成和血栓形成等。“心血管病症”可以在动脉中继发发生，即，在医疗或者外科手术以后。继发心血管病症尤其包括创伤后动脉瘤的形成、再狭窄、以及手术后的移植闭塞。
“导致心血管病症的功能性突变”指引起或促进个体中心血管病症出现的突变。优选的突变发生在IL-1复合体内。发生在IL-1基因(例如，IL-1A、IL-1B或IL-1RN)或与其连锁的位点内的导致心血管病症的功能性突变可以改变例如基因的开放阅读框或剪接模式，由此导致了无活性或低活性基因产物的形成。例如，发生在IL-1A位点的内含子6内的突变对应于可变数量(对应于5至18重复单元)的串联重复46bp序列(Bailly，et al.(1993)Eur.J.Immunol.23：1240-45)。这些重复序列含有三个潜在的转录因子结合位点：SP1位点、病毒增强子元件和糖皮质激素反应元件；因此，携带具有大量重复单元的IL-1A内含子6 VNTR等位基因的个体可能遭受改变的IL-1A基因转录调节和随后的炎性细胞因子产生的紊乱。实际上，有证据表明，在该多态性IL-1A位点处增加的重复数量导致降低的IL-1α合成(Bailly et al.(1996)MolImmunol 33：999-1006)。或者，突变可导致高活性基因产物。例如，IL-1B(G位于+6912)多态性的等位基因2发生在IL-1B mRNA的3′UTR(非翻译区)，并且与IL-1B基因位于+6912)的等位基因1相关的IL-1BmRNA和IL-1B蛋白的稳态水平相比，与大约4倍的水平增加相关。此外，IL-1B(-511)突变在邻近负糖皮质激素反应元件的启动子结合位点处(Zhang et al.(1997)DNA Cell Biol 16：145-52)。这种元件使地塞米松四倍抑制IL-1B表达成为可能，并且这种负反应元件的缺失引起IL-1B启动子活性2.5倍的增加。因此，该IL-1B(-511)多态性可能影响到细胞因子产生和炎性反应。这些实例证明发生在IL-1A或IL-1B基因中的遗传性变型可直接导致改变的生成或对IL-1细胞因子活性的调节。
“心血管病症治疗剂”指防止或推迟个体中构成心血管病症的异常的出现或降低其程度的任何试剂或治疗方案(包括药物、营养制品和外科手段)。心血管病症治疗剂可涉及对包括易碎斑块病症、闭塞病症和再狭窄的任何心血管病症的治疗。本文提供了针对心血管病症每一类的治疗剂的实例。应理解的是，治疗剂可以用于一类以上的心血管病症的治疗。该治疗剂可为多肽、肽模拟物(peptidomimetic)、核酸或其它无机或有机分子，优选包括维生素、无机物和其它营养物的“小分子”。优选地，该治疗剂可通过模拟或加强(激动)或抑制(拮抗)天然存在多肽的作用而调节IL-1多肽的至少一种活性，例如与受体的相互作用。IL-1激动剂可为野生型蛋白或具有该野生型至少一种生物活性如受体结合活性的其衍生物。IL-1激动剂也可为上调基因表达或增强蛋白的至少一种生物活性的化合物。IL-1激动剂也可为增强多肽与另一分子如受体的相互作用的化合物。IL-1拮抗剂可为抑制或降低蛋白和另一分子如受体相互作用的化合物，或者阻断信号转导或翻译后加工的试剂(例如，IL-1转化酶(ICE)抑制剂)。因此，优选的拮抗剂为抑制或减弱与受体结合并由此阻断随后对受体活化的化合物。IL-1拮抗剂也可为下调基因表达或减少存在的蛋白量的化合物。该拮抗剂可为多肽的显性负形式(dominant negative form)，例如，能够与靶多肽如受体相互作用但是不促进受体的活化的多肽形式。该拮抗剂也可为编码显性负形式的多肽的核酸、反义核酸、或能够与RNA特异相互作用的核酶。其它的拮抗剂为与多肽结合并抑制其作用的分子。这类分子包括肽，例如不具有生物学活性并抑制与受体结合的靶肽的形式。因此，这类肽将与蛋白的活性位点结合并防止其与靶肽的相互作用。其它的拮抗剂包括与分子的表位特异相互作用的抗体，这种结合干扰了多肽的生物学功能。在另一优选的实施方案中，拮抗剂为小分子，例如能够抑制多肽与靶受体相互作用的分子。或者，该小分子可通过与不同于受体结合位点的位点相互作用而起拮抗剂的作用。优选的治疗剂包括降脂药物、抗血小板剂、抗炎剂和抗高血压剂。
用在本文时，“脑血管疾病”为一类外周血管疾病(如下文所定义的)，其中阻断的外周血管为脑循环的一部分。脑循环包括颈动脉和椎动脉系统。脑血管疾病的这种定义旨在特意包括颅内出血，其并不作为动脉堵塞的现象出现。通过诸如斑块破裂或栓塞形成的机制，堵塞可突然发生。堵塞可进行性地发生，通过肌内膜增生和斑块形成而使动脉变窄。堵塞可为完全的或部分的。某些程度和持续时间的堵塞导致脑缺血，持续几秒至数分钟的血流减小。脑缺血的时间延长可导致脑梗塞。局部贫血和梗塞可为局部的或广泛的。脑缺血或梗塞可导致称为“中风”或“脑血管意外(CVA)”的无抽搐性局部神经缺损的突然发作。脑血管疾病具有两大病理学种类：血栓形成和栓塞。血栓形成性中风的发生在80-90％的患者中没有预警症状；10-20％的血栓形成性中风由短暂脑缺血发作预报。脑血管疾病可与易碎斑块病症相关。这种类型的脑血管疾病的体征和症状为与易碎斑块有关的那些体征和症状，包括由于具有血栓或栓塞形成的突然动脉堵塞导致的中风。脑血管疾病可与闭塞病症有关。这种类型的脑血管疾病的体征和症状涉及具有整体或局部脑缺血的血流的进行性堵塞。这种情况下，可看到神经学变化，包括中风。
“临床事件”为疾病的临床上可辨认的体征或疾病的临床上可报告的症状的出现。“临床上可辨认的”表明该体征可由卫生保健提供者鉴别出。“临床上可报告的”说明该症状是可对卫生保健提供者描述的现象类型。临床事件可以包括临床上可报告的症状，即使特定的患者自己不能报告它们，只要这些类型的现象通常能够由患者向卫生保健提供者描述。
“冠状动脉疾病”(“CAD”)指涉及供应心脏的动脉的堵塞的血管病症。堵塞可通过诸如斑块破裂或栓塞形成的机制突然发生。堵塞可进行性发生，通过肌内膜增生和斑块形成使动脉变窄。供应心脏的动脉的堵塞引起的这些临床体征和症状为冠状动脉疾病的表现。冠状动脉疾病的表现包括绞痛、局部贫血、心肌梗塞、心肌病、充血性心力衰竭、心率不齐和动脉瘤形成。应理解的是，冠状循环中易碎斑块疾病与动脉血栓形成或远端栓塞有关，其自身表现为心肌梗塞。应理解的是，冠状循环中闭塞疾病与伴有绞痛症状的动脉狭窄有关，该症状为通常采用药物介入和血管成形式治疗的状况。
“疾病”为以包括临床体征和临床症状的临床事件为特征的病症。本文讨论的疾病包括心血管疾病、外周血管疾病、CAD、脑血管疾病以及那些在与易碎斑块病症有关的、与闭塞病症有关的或与再狭窄有关的任何解剖学位置中的疾病。
“病症相关等位基因”或“与病症相关的等位基因”指其在个体中的存在表明该个体具有或者易于发生特定病症的等位基因。一种类型的病症相关等位基因为“心血管病症相关等位基因”，其在个体中的存在表明该个体具有或易于出现心血管病症。这些广义上在其范围内包括与“易碎斑块病症”有关的等位基因、与“闭塞病症”有关的等位基因、以及与再狭窄有关的等位基因。与“易碎斑块病症”有关的等位基因的实例包括IL-1A+4825的等位基因2；IL-1B的+3954标志物的等位基因2；以及IL-1RN的+2018标志物的等位基因1；和IL-1B基因的(-511)标志物的等位基因1或者与上述等位基因之一连锁不平衡的等位基因。与“闭塞病症”有关的等位基因的实例包括IL-1A+4825的等位基因1；IL-1B的+3954标志物的等位基因1；以及IL-1RN的+2018标志物的等位基因2；和IL-1B基因的(-511)标志物的等位基因2或者与上述等位基因之一连锁不平衡的等位基因。与再狭窄有关的等位基因的实例包括IL-1A的+4825标志物的等位基因1或+3954标志物的等位基因1与IL-1B的-511标志物的等位基因1或IL-1RN的+2018标志物的等位基因1的组合，或者与前述等位基因之一连锁不平衡的等位基因的组合。“牙周病症相关等位基因”指其在个体中的存在表明该个体具有或易于发生牙周病症的等位基因。
短语“基因破坏”和“靶向破坏”或任何类似的短语指天然DNA序列的位点特异性破坏，以便与野生型拷贝的该基因相比防止在细胞中该基因的表达。该中断可以由基因的缺失、插入或修饰或其任何组合所导致。
用在本文时，术语“栓塞物”、“栓塞”或“栓塞形成”指动脉至动脉的栓塞或栓塞形成。
“易碎斑块病症”指这样的心血管病症：其特征在于在动脉内作为动脉粥样硬化过程的一部分的易碎斑块的形成。该易碎斑块易于断裂、血栓形成或者破裂。当斑块的完整性被改变时，其可机械性地堵塞局部血管，或者其可将片段或相关的凝块送至血管下游，以在更远端引起堵塞。如果斑块破裂，其可为局部血栓形成的病灶。易碎斑块病症与IL-1位点的等位基因模式1相关。
“易碎斑块病症治疗剂”指防止或推迟个体中构成易碎斑块病症的异常的出现或降低其程度的任何试剂或治疗方案(包括药物、营养制品和外科手段)。该术语包括某些通过稳定易碎斑块而起作用的试剂、某些具有抗凝血或抗血小板作用的试剂、以及某些具有抗氧化作用的试剂。易碎斑块病症相关治疗剂的实例包括抑制素药物、具有抗前列腺素作用的抗炎剂、诸如Tenidap的指向IL-1和TNF-α的抗炎剂和细胞因子抑制剂、包括四环素和相关试剂的基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂以及特异性MMP抑制剂、以及重组IL-1受体拮抗剂。此外，该术语包括阻断IL-1的那些营养制品，例如鱼油、ω-3脂肪酸、多不饱和脂肪酸、以及诸如丁羟基茴香醚(BHA)的那些具有抗氧化作用的营养制品。
用在本文时，术语“单倍型”意图指一组等位基因，其在统计学显著水平上(pcorr＜0.05)作为一簇(连锁不平衡)一起遗传。用在本文时，短语“IL-1单倍型”指IL-1位点中的单倍型。
用在本文时，“IL-1激动剂”指一种试剂，其模拟、上调(加强或者补充)或者以其它方式增加IL-1生物活性或IL-1生物学途径中基因的生物活性。IL-1激动剂可以在多种不同水平的任意水平上起作用，包括在启动于区域调节IL-1基因表达、调节mRNA的剪接机制、稳定mRNA、用于翻译的蛋白的磷酸化、转化IL-1前体(proIL-1)至成熟的IL-1和分泌IL-1。增加IL-1合成的激动剂包括：脂多糖、IL-1B、cAMP诱导剂、NfκB激活剂、AP-1激活剂、TNF-α、氧化型LDL、高级糖基化终产物(AGE)、剪切力、缺氧、氧过多、缺血再灌注损伤、组胺、前列腺素E2(PGE2)、IL-2、IL-3、IL-12、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、单核细胞集落刺激因子(M-CSF)、干细胞因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、补体C5A、补体C5b9、纤维蛋白降解产物、纤溶酶、凝血酶、9-羟基十八烷酸、13-羟基十八烷酸、血小板活化因子(PAF)、因子H、视黄酸、尿酸、焦磷酸钙、多聚核苷、c-反应性蛋白、α-抗胰蛋白酶、烟草抗原、胶原、β-1整合素、LFA-3、抗-HLA-DR、抗-IgM、抗-CD3、植物血球凝集素(CD2)、sCD23、紫外线B辐射、γ-辐射、P物质、异丙基肾上腺素、去氧麻黄碱和褪黑激素。稳定IL-1 mRNA的激动剂包括细菌内毒素和IL-1。其它激动剂通过增加可以利用的IL-11型受体的数目来发挥功能，其包括IL-1、PKC活化剂、地塞米松、IL-2、IL-4和PGE2。其它优选的拮抗剂干扰或者抑制通过IL-1活化的或在IL-1信号传导途径中使用的信号传导因子(如，NF□B和AP-1、PI3激酶、磷酸酶A2、蛋白激酶C、JNK-1、5-脂氧合酶、环氧化酶2、酪氨酸磷酸化、iNOS途径、Rac、Ras、TRAF)。其它的激动剂还增加被IL-1诱导表达的基因的生物活性，其包括：IL-1、IL-1Ra、TNF、IL-2、IL-3、IL-6、IL-12、GM-CSF、G-CSF、TGF-β、纤维蛋白原、尿激酶纤溶酶原抑制剂、1型和2型纤溶酶原激活剂抑制剂、p-选择蛋白(CD62)、纤维蛋白原受体、CD-11/CD18、蛋白酶连接蛋白-1、CD44、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-3、弹性蛋白酶、胶原酶、金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIM-1)、胶原、增加APoCIII的甘油三酯、载脂蛋白、ICAM-1、ELAM-1、VCAM-1、L-选择蛋白、核心蛋白多糖、干细胞因子、白血病抑制因子、IFN□、□.□.L-8、IL-2受体、IL-3受体、IL-5受体、c-kit受体、GM-CSF受体、环氧化酶-2(COX-2)、2型磷脂酶A2、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、内皮素-1，3、γ谷氨酰基转移酶、Mn超氧化物歧化酶、C-反应性蛋白、纤维蛋白原、血清淀粉样蛋白A、金属硫蛋白、血浆铜蓝蛋白、溶菌酶、黄嘌呤脱氢酶、黄嘌呤氧化酶、血小板衍生生长因子A链(PDGF)、黑色素瘤生长刺激活性(gro-□、□.□)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、活化素A、鸦片-黑色素-皮质素前体、促肾上腺皮质激素释放因子、B淀粉样蛋白前体、基底膜蛋白-40、层粘连蛋白B1和B2、组成性的热休克蛋白p70、P42分裂素、活化蛋白激酶、鸟氨酸脱羧酶、血红素氧化酶和G-蛋白□亚基)。
用在本文时，“IL-1拮抗剂”指下调或者以其它方式降低IL-1生物活性的试剂。IL-1拮抗剂可以在多种不同水平的任意水平上起作用，包括在启动于区域调节IL-1基因表达、调节mRNA的剪接机制、稳定mRNA、用于翻译的蛋白的磷酸化、转化IL-1前体至成熟的IL-1和分泌IL-1。IL-1生成的拮抗剂包括：皮质类固醇、脂氧合酶抑制剂、环氧化酶抑制剂，γ-干扰素、IL-4、IL-10、IL-13、转化生长因子β(TGF-β)、ACE抑制剂、n-3多不饱和脂肪酸类、抗氧化剂和脂还原剂。去稳定IL-1 mRNA的拮抗剂包括增强去腺苷酸化作用的试剂。抑制或者防止用于翻译的IL-1蛋白的磷酸化作用的拮抗剂包括吡啶基-咪唑化合物，例如特丁非隆和抑制微管形成的化合物(如秋水仙碱、长春碱和长春新碱)。抑制或者阻止IL-1前体转变为成熟IL-1的拮抗剂包括白细胞介素转化酶(ICE)抑制剂，例如εICE亚型，ICEα、β和γ亚型抗体，CXrm-A，转录物X，内源的四肽竞争性底物抑制剂，胰蛋白酶，弹性蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，糜蛋白酶，和其它的非特异性蛋白酶。阻止和抑制IL-1分泌的拮抗剂包括阻止阴离子转运的试剂。干扰与IL-1受体相互作用的拮抗剂包括：抑制1型IL-1受体的糖基化作用的试剂、针对IL-1RI的反义寡聚核苷酸、针对IL-1RI的抗体和针对IL-1RacP的反义寡聚核苷酸。通过减少可用的IL-11型受体的数目起作用的其它的拮抗剂包括TGF-β、COX抑制剂、增加IL-1II型受体的因子、地塞米松、PGE2、IL-1和IL-4。其它优选的拮抗剂干扰或者抑制被IL-1激活或者在IL-1信号传导途径中使用的信号传导因子(如NF□B和AP-1、PI3激酶、磷脂酶A2、蛋白激酶C、JNK-1、5-脂氧化酶、环氧化酶-2、酪氨酸磷酸化、iNOS途径、Rac、Ras、TRAF)。其它的拮抗剂还干扰被IL-1诱导表达的基因的生物活性，其包括：IL-1、IL-1Ra、TNF、IL-2、IL-3、IL-6、IL-12、GM-CSF、G-CSF、TGF-β、纤维蛋白原、尿激酶纤溶酶原抑制剂、1型和2型纤溶酶原激活剂抑制剂、p-选择素(CD62)、纤维蛋白原受体、CD-11/CD18、蛋白酶连接蛋白-1、CD44、基质金属蛋白酶-1(MMP-1)、MMP-3、弹性蛋白酶、胶原酶、金属蛋白酶-1组织抑制剂(TIMP-1)、胶原、增加APoCIII的甘油三酯、载脂蛋白、ICAM-1、ELAM-1、VCAM-1、L-选择蛋白、核心蛋白多糖、干细胞因子、白血病抑制因子、IFN□、□.□.L-8、IL-2受体、IL-3受体、IL-5受体、c-kit受体、GM-CSF受体、环氧化酶-2(COX-2)、2型磷脂酶A2、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、内皮素-1，3、γ谷氨酰基转移酶、Mn超氧化物歧化酶、C-反应性蛋白、纤维蛋白原、血清淀粉样蛋白A、金属硫蛋白、血浆铜蓝蛋白、溶菌酶、黄嘌呤脱氢酶、黄嘌呤氧化酶、血小板衍生生长因子A链(PDGF)、黑色素瘤生长刺激活性(gro-□、□.□)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、活化素A、鸦片-黑色素-皮质素前体、促肾上腺皮质激素释放因子、B淀粉样蛋白前体、基底膜蛋白-40、层粘连蛋白B1和B2、组成性的热休克蛋白p70、P42分裂素、活化蛋白激酶、鸟氨酸脱羧酶、血红素氧化酶和G-蛋白□亚基)。其它优选的拮抗剂包括：hymenialdisine、除莠霉素(如herbamycin A)、CK-103A及其衍生物(如4，6-二氢哒嗪并[4，5-c]哒嗪-5(1H)酮)、CK-119、CK-122、吲哚美辛、黄曲毒素B1、瘦素、肝素、二环咪唑(如SB203580)、PD15306 HCl、罗汉松酸衍生物、M-20、人[Gly2]胰高血糖素样肽-2、FR167653、类固醇衍生物、糖皮质激素、槲皮素、茶碱、NO-合成酶抑制剂、RWJ 68354、euclyptol(1.8-按树脑)、Magnosalin、N-乙酰半胱氨酸、α-褪黑激素-刺激激素(□-MSH)、三氯生(2，4，4’-三氯-2’-羟基二苯醚)、前列腺素E2和4-氨基吡啶依他尼酸和4，4’-二异硫氰酸均二苯乙烯-2，2’-二磺酸(DIDS)、葡萄糖、脂磷聚糖、阿司匹林、代谢阻断剂、Diacerhein、巯基调节剂、锌、吗啡、白三烯生物合成抑制剂(如MK886)、血小板活化因子受体拮抗剂(如WEB2086)、胺碘酮、曲尼司特、S-甲基-L-硫瓜氨酸、β-肾上腺受体激动剂(如，丙卡特罗、克仑特罗、非诺特罗、特布他林、透明质酸、抗-TNF-□抗体、抗-IL-1□自身抗体、IL-1受体拮抗剂、IL-1R相关激酶、可溶性TNF受体和抗炎细胞因子(如IL-4、IL-13、IL-10、IL-6、TGF-□、血管紧张素II、可溶性IL-1II型受体、可溶性IL-11型受体、组织纤溶酶原激活剂、锌指蛋白A20 IL-1肽(如(Thr-Lys-Pro-Arg)(促吞噬肽)、(Ile-Thy-Gly-Ser-Glu)IL-1-α、Val-Thr-Lys-Phe-Tyr-Phe、Val-Thr-Asp-Phe-Tyr-Phe、干扰素α2b、干扰素β、IL-1-β类似物(如IL-1-β三肽：Lys-D-Pro-Thr)、糖基化的IL-1-α和IL-1ra肽。
用在本文时，术语“IL-1基因簇”和“IL-1位点”包括所有位于或者接近2号染色体的2q13区域的核酸，包括至少IL-1A、IL-1B和IL-1RN基因以及任何其它连锁序列。(Nicklin et al.，Genomics 19：382-84，1994)。用在本文时，术语“IL-1A”、“IL-1B”和“IL-1RN”分别指编码IL-1α、IL-1β和IL-1受体拮抗剂的基因。IL-1A、IL-1B和IL-1RN的基因登录号分别为X03833、X04500、和X64532。
“IL-1功能突变”指IL-1基因簇内导致改变的表型的突变(即影响IL-1基因或蛋白质的功能)。实例包括：IL-1A(+4845)等位基因2、IL-1B(+3954)等位基因2、IL-1B(-511)等位基因1和IL-1RN(+2018)等位基因1。
“IL-1X(Z)等位基因Y”指出现在基因X内的IL-1位点多态位点处的特定等位基因型，称为Y，其中X是IL-1A、B或AN或者IL-1位点中的某个其它基因，位于或接近核苷酸Z，其中核苷酸Z是相对于主要转录起始位点被编号，该起始位点是IL-1基因X的核苷酸+1。如本文另外所用，术语“IL-1X等位基因(Z)”是指位于或接近核苷酸Z的基因X中IL-1多态位点处的所有等位基因。例如，术语“IL-1RN(+2018)等位基因”指在标志物+2018处IL-1RN基因的可选择形式。“IL-1RN(+2018)等位基因1”指在有义链的位置+2018处含有半胱氨酸(C)的IL-1RN基因型。Clay et al.，Hum.Genet.97：723-26，1996。“IL-1RN(+2018)等位基因2”是指在正链的位置+2018处含有胸腺嘧啶(T)的IL-1RN基因型。当个体具有两个相同的IL-1RN等位基因时，该个体被称为纯合的，或具有纯合状态。当个体具有两个不同的IL-1RN等位基因时，该个体被称为杂合的，或具有杂合状态。术语“IL-1RN(+2018)等位基因2，2”是指纯合的IL-1RN(+2018)等位基因2状态。相反，术语“IL-1RN(+2018)等位基因1，1”是指纯合的IL-1RN(+2018)等位基因1状态。术语“IL-1RN(+2018)等位基因1，2”指杂合的等位基因1和2状态。
用在本文时，“IL-1相关的”旨在包括与人染色体2(2q 12-14)上人IL-1位点基因有关的所有基因。这些包括位于染色体2(2q 13-14)处人IL-1基因簇的IL-1基因，包括：编码白介素-1α的IL-1A基因、编码白介素-1β的IL-1B基因，以及编码白介素-1受体拮抗剂的IL-1RN(或IL-1ra)基因。此外，这些IL-1相关基因包括位于人染色体2(2q12)上的I型和II型人IL-1受体基因以及位于小鼠染色体1上位置19.5cM处它们的小鼠同源物。白介素-1α、白介素-1β、和白介素IL-1RN在甚至它们都结合IL-1I型受体上是相关的，但是只有白介素-1α和白介素-1β为活化IL-1I型受体的激动剂配体，而白介素IL-1RN为天然存在的拮抗剂配体。当术语“IL-1”参照基因产物或多肽使用时，意味着指由人染色体2(2q 12-14)上的白介素-1位点编码的所有基因产物以及来自其它物种的它们相应的同源物或其功能变体。因此术语IL-1包括诸如IL-1α和IL-1β的促进炎性反应的分泌的多肽，以及诸如IL-1受体拮抗剂和IL-1II型(引诱物)受体的拮抗炎性反应的分泌的多肽。
“IL-1受体”或“IL-1R”指能够结合和/或转导来自IL-1位点编码的配体的信号的多种细胞膜结合蛋白受体。该术语应用至任何这样的蛋白，其能够结合白介素-1(IL-1)分子，并且以它们作为哺乳动物质膜蛋白的天然构型可能在向细胞转导IL-1提供的信号中起作用。用在本文时，该术语包括具有IL-1结合或信号转导活性的天然蛋白的类似物。实例包括美国专利4,968,607中描述的人和鼠IL-1受体。术语“IL-1核酸”指编码IL-1蛋白的核酸。
“IL-1多肽”和“IL-1蛋白”旨在包括包含由用于IL-1α、IL-1β和IL-1RN的IL-1基因组DNA序列编码的氨基酸序列的多肽、或其片段、和其同源物，并且包括激动剂和拮抗剂多肽。
“支架内狭窄”指在血管成形术期间放置的支架内的进行性闭塞。支架内狭窄为发生在动脉支架内的再狭窄形式。
“增加的风险”指与群体中疾病或病症的发生率比较，个体中该疾病或病症在统计学上有更高的发生率。所鉴定的与增加的风险相关的因子被称为“风险因子”。携带特定多态等位基因是针对特定心血管疾病的风险因子，并与特定疾病增加的风险相关。
用在本文时，术语“相互作用”旨在包括分子间可检测的关系或结合(例如生物化学相互作用)，例如本质上的蛋白-蛋白、蛋白-核酸、核酸-核酸和蛋白-小分子或核酸-小分子之间的相互作用。
用在本文中就诸如DNA或RNA的核酸而言时，术语“分离的”指分别与高分子天然来源中存在的其它DNA或RNA分离的分子。例如，编码个体IL-1多肽之一的分离的核酸优选地包括基因组DNA中天然地紧邻IL-1基因的不超过10千碱基(kb)的核酸序列，更优选不超过5kb的这种天然存在的邻接序列，并且最优选不超过1.5kb的这种天然存在的邻接序列。用在本文时，术语分离的还指基本上不含细胞物质、病毒物质或培养基(通过重组DNA技术产生时)或化学前体或其它化学试剂(通过化学合成时)的核酸或多肽。此外，“分离的核酸”意味着包括核酸片段，其不是作为片段被天然产生，并且不会在天然状态下被发现。用在本文时，术语“分离的”还指与其它细胞蛋白分离的多肽，意味着包括纯化的和重组的多肽。
“敲入(knock-in)”转基因动物指具有引入其基因组内的经修饰基因的动物，该经修饰的基因可为外源的或内源来源的。
“敲除(knock-out)”转基因动物指内源基因的表达被部分或完全抑制(例如，基于至少一部分基因的删除、以另一序列对基因的至少一部分的置换、终止密码子的引入、编码关键氨基酸的碱基的突变、或者内含子接合处的去除，等等)的动物。
“敲除构建体”指可被用于减少或抑制由细胞中内源DNA序列编码的蛋白的表达的核酸序列。在简单的实例中，敲除构建体包括在基因的关键部分具有缺失的基因，如IL-1RN基因，这样不能从其表达活性蛋白。或者，一定量的终止密码子可被添加至天然基因，导致蛋白的过早终止，或者内含子接合处可被失活。在典型的敲除构建体中，基因的一些部分被可选择标志物(例如neo基因)置换，这样该基因可表示如下：IL-1RN 5′/neo/IL-1RN 3′，其中IL-1RN5′和IL-IRN3′分别指相对于IL-1RN基因部分在其上游和下游的基因组或cDNA序列，以及其中neo指新霉素抗性基因。在另一敲除构建体中，另一可选择标志物被加入至侧翼位置，这样该基因可被表示为IL-1RN/neo/IL-1RN/TK，其中TK为胸苷激酶基因，其可被加入至前述构建体的IL-1RN5′或IL-1RN3′序列，并且可在合适的培养基中针对其进一步进行选择(即，为负选择标志物)。这种双标志物构建体使得能从非同源重组事件选出同源重组事件，其中同源重组事件除去邻接的TK标志物，而非同源重组事件通常保留该TK序列。基因删除和/或置换可从外显子、内含子、尤其是内含子接合处和/或诸如启动子的调节区进行。
“连锁不平衡”指两个等位基因以大于对给定对照群体中每个等位基因发生的分开频率所期望的频率的共遗传。独立遗传的两个等位基因发生的期望频率是第一个等位基因的频率乘以第二个等位基因的频率。以期望频率共发生(co-occur)的等位基因称为“连锁不平衡”。连锁不平衡的原因经常是不清楚的。它可以是由于对特定等位基因组合的选择或遗传异种群体的最近混合而引起。另外，在与疾病基因非常紧密连锁的标志物的情形中，如果疾病突变在近期发生以致没有经过足够的时间以通过特定染色体区域的重组事件来达到平衡，则预期等位基因(或一组连锁等位基因)与疾病基因关联。当提及由多于一个等位基因组成的等位基因模式时，如果包含第一个等位基因模式的所有等位基因与第二个等位基因模式的至少一个等位基因连锁不平衡，则第一个等位基因模式与第二个等位基因模式连锁不平衡。连锁不平衡的实例是在IL-1RN(+2018)和IL-1RN(VNTR)多态位点的等位基因之间发生的连锁不平衡。IL-1RN(+2018)处的两个等位基因与IL-1RN(VNTR)的两个最频繁的等位基因(等位基因1和等位基因2)是100％连锁不平衡。
术语“标志物”指基因组中的已知在个体间不同的序列。例如，IL-1RN基因具有由可变数量的串联重复(VNTR)构成的标志物。
“调节”指调控生物活性的物质的能力。当应用至IL-1生物活性时，激动剂或拮抗剂例如可通过激动或拮抗IL-1合成、受体相互作用或IL-1介导的信号转导机制而调节生物活性。
“突变的基因”或“突变”或“功能性突变”指基因的等位基因形式，其能够相对于不具有该突变的基因的个体改变具有该突变的基因的个体的表型。由突变导致的改变的表型可通过某些试剂矫正或补偿。如果对于该突变个体必须是纯合的以具有改变的表型，则突变称为隐性的。如果一个拷贝的突变基因足以改变个体的表型，则突变称为显性的。如果个体具有一个拷贝的突变基因并且具有介于纯合和杂合个体之间的表型(对于该基因)，则该突变称为共显性的。
本发明的“非人动物”包括哺乳动物如啮齿类、非人灵长类、绵羊、狗、牛、山羊等，两栖类如非洲爪蟾属成员，以及转基因鸟类(例如鸡、鸟等)。术语“嵌合动物”在本文中用来指其中发现重组基因、或者其中重组基因在动物的一些但不是全部细胞中表达的动物。术语“组织特异性嵌合动物”表示重组IL-1基因之一在一些组织但不在其它组织中存在和/或表达或被破坏。术语“非人类哺乳动物”是指哺乳动物纲中除了人以外的任何成员。
用在本文时，术语“核酸”指多核苷酸或寡核苷酸如脱氧核糖核酸(DNA)，并且适当时，指核糖核酸(RNA)。该术语应当也被理解为包括，作为等价物的由核苷酸类似物制成的RNA或DNA类似物(例如肽核酸)，以及如果适用于描述的实施方案时，还包括单链(有义或反义)和双链多核苷酸。
“闭塞病症”指心血管病症，其以动脉壁的进行性变厚为特征，与动脉内存在的动脉粥样硬化内膜病变有关。闭塞病症导致动脉的进行性堵塞。由于足够的进展，闭塞病症可减少动脉中的流动，直至在该动脉灌注的组织中产生临床体征和症状。这些临床事件涉及被灌注组织的局部缺血。严重时，局部缺血伴有组织死亡，称为梗塞或坏疽。闭塞病症与IL-1位点处的等位基因模式2s有关。
“闭塞病症治疗剂”指防止或推迟个体中构成闭塞病症的异常的出现或降低其程度的任何试剂或治疗方案(包括药物、营养制品和外科手段)。闭塞病症治疗剂的实例包括抗氧化剂试剂、降低血清脂质的试剂、阻断氧化的脂质的作用的试剂和影响脂代谢或者以其它方式具有脂活性作用的其它试剂。
“外周血管疾病”(“PVD”)为外周(即非冠状)动脉堵塞引起的心血管疾病。堵塞可通过诸如斑块破裂或栓塞形成的机制突然发生，如在易碎斑块疾病中发生的。堵塞可进行性发生，通过肌内膜增生和斑块形成使动脉变窄，如在闭塞疾病中发生的。堵塞可为完全的或部分的。外周动脉的堵塞引起的这些临床体征和症状为外周血管疾病的表现。外周血管疾病的表现尤其包括跛行、局部贫血、肠绞痛、基于血管的肾机能不全、短暂缺血发作、动脉瘤、外周栓塞和中风等。缺血性脑血管疾病为一类外周血管疾病。
术语“多态性”指基因或其部分(例如等位基因变体)的一种以上形式的共存。存在至少两种不同形式，即存在两种不同核苷酸序列，的基因的一部分被称为“基因的多态区”。基因多态区的特异遗传序列是等位基因。多态区域可以是单核苷酸，其在不同等位基因中不同。多态区域也可以是几个核苷酸长。
术语“疾病倾向”，以及疾病的“素因”或“易感性”或任何相似的短语，含义是某些等位基因因此被发现与个体出现特定疾病(本文中，心血管病)的发生有关或预示该发生。因此与健康个体相比，等位基因在患病个体中经常过表达。因此，这些等位基因可以用来预测疾病，甚至在症状发生前或疾病发生前的个体中预测疾病。这些等位基因被理解为涉及疾病下的病症。
术语“再狭窄”指在患病血管中重建性手术后出现的任何闭塞前病变。该术语不仅用于现存狭窄的复发，还用于诸如静脉移植物的以前正常的血管，其在血管分流后变得部分闭塞。再狭窄指在针对动脉的治疗介入后发生的任何管腔变窄。导致再狭窄的损伤因此可包括对动脉粥样硬化病变的创伤(如在血管成形术中看到的)、病变的切除(如在动脉内膜切除术中看到的)、外部创伤(例如，横形钳闭损伤)、或手术吻合。再狭窄可作为任何时间的血管重建的结果出现，无论是在冠状脉管系统还是在外周(Colburn and Moore(1998)MyointimalHyperplasia pp.690-709 in Vascular Surgery：A Comprehensive Review(Philadelphia：Saunders，1998))。例如，研究已报告在冠状动脉血管成形术后有30-50％比例的有症状再狭窄(参见Berk and Harris(1995)Adv.Intern.Med.40：455-501)。作为另一实例，在颈动脉内膜切除术后，所研究患者的20％具有大于50％的管腔变窄(Clagett et al.(1 986)J.Vasc.Surg.3：10-23)。再狭窄的另一实例在腹股沟下血管分流术中看到，其中40-60％的修复移植物和20-40％的静脉移植物在三年时闭塞(Dalmanand Taylor(1990)Ann.Vasc.Surg.3：109-312，Szilagyi et al.(1973)Ann.Surg.178：232-246)。不同程度的症状伴随不同解剖学位置的闭塞前病变，这是由于一些因子的组合，这些因子包括涉及的血管的不同管径、残留病的程度和局部血流动力学。支架内狭窄是再狭窄的一种类型。
“再狭窄病症治疗剂”指防止或推迟患者中构成再狭窄病症的异常的出现或降低其程度的任何试剂或治疗方案(包括药物、营养制品和外科手段)。再狭窄被认为包括三个阶段。第一阶段的特征是涉及募集白细胞至损伤位点的炎性反应和在第一个48小时期间血栓的形成。随着表达粘附分子ICAM-1、E-选择蛋白、P-选择蛋白和VCAM-的表达，内皮被活化。同时，巨噬细胞和成纤维细胞通过上调整合素而迁移至损伤位点。第二阶段的特征是血管壁中层中平滑肌细胞的增殖以及这些细胞迁移至内膜，移居在这里。从血小板、白细胞和平滑肌细胞释放调节平滑肌细胞增殖和迁移的生长因子和细胞因子。最后阶段包括来自平滑肌细胞的细胞外基质的分泌阶段。再狭窄病症治疗剂可以在调节再狭窄过程中影响到任意这些过程。再狭窄病症治疗剂可以包括那些影响NO合成过程的试剂，例如曲格列酮和曲尼司特。再狭窄病症疗法包括影响再狭窄或支架内再狭窄进展的物理介入，例如放射治疗。再狭窄病症疗法包括支架修饰技术，例如给支架接种遗传修饰的内皮细胞、以肝素或相关试剂包被支架、提供负载药物的聚合物支架、构建释放血小板糖蛋白受体抗体的聚合物包被的支架、或其它的支架修饰。再狭窄病症疗法包括遗传工程技术，例如，涉及治疗基因转移的技术或和涉及在水凝胶包被医疗装置中并入质粒DNA的技术。再狭窄病症疗法还包括手术操作或旨在最小化再狭窄发病率或避免再狭窄的手术治疗方案的一部分。再狭窄病症被认为是在所有的经血管内操作的天然动脉中和在用作血管移植物的自身静脉中发生。例如，近端或远端吻合或静脉移植物自身的内膜增生一直是腹股沟下血管重建最终失败的主导原因。在修复移植物重建中，这种问题及其少见。对闭塞病症倾向性的诊断可能指导外科医生选择用于血管重建的移植材料类型，或者可能影响到对用作该过程的附属物的药理学试剂的选择。
“风险因子”为被鉴定为与增加的风险相关的因子。心血管病症或心血管疾病的风险因子为任何被鉴定为与出现这些状况或与这些状况恶化增加的风险有关的因子。风险因子还可与患有心血管病症的患者中不利临床事件或不利临床结果增加的风险有关。心血管疾病的风险因子包括抽烟、不利的脂质状况、升高的脂质或胆固醇、糖尿病、高血压、易凝状态、升高的高半胱氨酸水平以及缺乏锻炼。携带特定的多态性等位基因为特定心血管病症的风险因子，并且与特定病症增加的风险相关。
用在本文时，术语“小分子”指分子量小于5kD并最优选小于4kD的化合物。小分子可为核酸、肽、肽模拟物、碳水化合物、脂质或其它有机或无机分子。
用在本文时，术语“特异杂交”或“特异检测”指核酸分子与样品核酸的至少约6个连续核苷酸杂交的能力。
如本文所理解的，“狭窄”指动脉变窄，如在闭塞病症或在再狭窄中看到的。狭窄可伴随有反映穿过变窄的动脉节段的血流减小的那些症状，这种情况下导致狭窄的病症称为疾病(即，闭塞疾病或再狭窄疾病)。狭窄可在血管中无症状地存在，仅通过诸如血管造影术的诊断介入或血管实验室研究才检测到。
“转录调节序列”为遍及本说明书使用的总称，指DNA序列，如起始信号、增强子和启动子，它们诱导或控制与它们可操作地连接的蛋白编码序列的转录。
用在本文时，术语“转基因”指被引入细胞的核酸序列(编码例如IL-1多肽之一或其反义转录本)。转基因可对其被引入其中的转基因动物或细胞来说是部分或完全异源的，即外来的，或者与其被引入其中的转基因动物或细胞的内源基因同源，但是其被设计为被插入或被插入进动物的基因组，使得改变其所插入细胞的基因组(例如，其被插入在不同于天然基因所在的位置或其插入导致基因敲除)。转基因也可以附加体的形式存在于细胞中。转基因可包括一个或多个转录调节序列和任何其它核酸，例如内含子，其可能是所选核酸的最佳表达所必需的。
“转基因动物”是指任何动物，优选非人哺乳动物、鸟或两栖动物，其中一个或多个动物细胞包含通过人干预的方式如本领域公知的转基因技术引入的异源核酸。通过经计划的遗传操作，如通过显微注射或通过用重组病毒感染，直接或间接导入细胞前体而将核酸导入细胞。术语遗传操作不包括传统的杂交育种，或体外受精，而涉及重组DNA分子的引入。该分子可以整合到基因组中，或可以是染色体外复制的DNA。在本文所述的典型转基因动物中，转基因导致细胞表达重组形式的IL-1多肽之一，例如激动剂或拮抗物形式。然而，还考虑其中重组基因是沉默的转基因动物，例如以下描述的FLP或CRE重组酶依赖性构建体。此外，“转基因动物”还包括其中一个或多个基因的基因破坏是由人干预导致的那些重组动物，所述人干预包括重组和反义技术。该术语意味着包括所有后代。因此，包括起始动物及所有的F1、F2、F3等其后代。
用在本文时，术语“治疗”旨在包括治愈以及改善疾病的至少一种症状或与病症有关的至少一种异常。通过给予心血管病症治疗剂可进行对心血管病症的治疗。还可通过改变与心血管病症有关的风险因子而进行对的心血管病症的治疗。
“治疗计划”指进行的改变风险因子对患者的影响的至少一种介入。用于心血管病症或疾病的治疗计划可处理那些与心血管病症或疾病相关的风险因子。治疗计划可包括致力于改变患者行为的介入，例如戒烟。治疗计划可包括向患者给予治疗剂的介入。作为实例，可通过适当的药物治疗而降低胆固醇水平，可通过胰岛素控制糖尿病。可通过断瘾药物治疗尼古丁成瘾。治疗计划可包括诊断介入。例如，高血压风险因子的存在可导致诊断介入，由此确定高血压的病因学。在鉴定了高血压的原因后，可以给予进一步的治疗。
术语“载体”指核酸分子，其能够输送已与其连接的另一核酸。一类优选载体是附加体，即能够在染色体外复制的核酸。优选的载体是能够自主复制和/或表达与其连接的核酸的那些。能够指导与其可操作连接的基因的表达的载体在此处被称为“表达载体”。通常，用于重组DNA技术的表达载体经常是“质粒”形式，其通常是指环状双链DNA环，为载体形式时它们不与染色体结合。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明意图包括这种其它形式的表达载体，其起相同的作用并且之后为本领域所知。
术语“野生型等位基因”是指基因的等位基因，当以两个拷贝存在个体中时其导致野生型表型。因为基因中的某些核苷酸变化可能不影响具有核苷酸变化的具有两个拷贝基因的个体的表型，所以可以存在特定基因的多个不同野生型等位基因。
4.2概述
本发明的试剂盒和方法至少部分地依赖于这样的新发现：IL-1基因簇中四个多态位点的等位基因模式与心血管病症相关。这些模式在本文中称为模式1、2和3。模式1包括这样的等位基因模式：其包括IL-1A(+4845)或IL-1B(+3954)的等位基因2和IL-1B(-511)或IL-1RN(+2018)的等位基因1，或者与前述等位基因之一连锁不平衡的等位基因。在优选的实施方案中，这种等位基因模式使得能诊断易碎斑块病症。模式2包括这样的等位基因模式：其包括IL-1B(-511)或IL-1RN(+2018)的等位基因2和IL-1A(+4845)或IL-1B(+3954)的等位基因1，或者与前述等位基因之一连锁不平衡的等位基因。在优选的实施方案中，这种等位基因模式使得能诊断易碎斑块病症。模式3包括这样的等位基因模式：其包括IL-1A(+4845)的等位基因1或IL-1B(+3954)的等位基因1以及IL-1B(-511)的等位基因1或IL-1RN(+2018)的等位基因1，或者与前述等位基因之一连锁不平衡的等位基因。在优选的实施方案中，这种等位基因模式使得能诊断再狭窄病症。一方面，本发明提供了确定个体是否患有心血管病症的新方法和试剂盒。一方面，本发明公开了确定个体是否患有易碎斑块病症的方法和试剂盒。一方面，本发明公开了确定个体是由患有闭塞病症的方法和试剂盒。一方面，本发明公开了确定个体是由患有再狭窄病症的方法和试剂盒。
用于IL-1α、IL-1β和IL-1RN的基因位于染色体2上的基因簇中，如图1所示。某些IL-1位点处的基因被认为是连锁不平衡，如图2所示。此外，如图3所示，单倍型模式可被鉴定，并且它们在群体中的频率可被确认。可以通过显示在表1中的IL-1基因簇中的四个多态位点定义这三个单倍型模式，模式1、2和3。
表1
单倍型 IL-1A(+4845) IL-1B(+3954) IL-1B(-511) IL-1RN(+2018)
模式1 等位基因2 等位基因2 等位基因1 等位基因1
模式2 等位基因1 等位基因1 等位基因2 等位基因2
模式3 等位基因1 等位基因1 等位基因1 等位基因1
单倍型模式1与易碎斑块病症相关。单倍型模式2与闭塞病症相关。单倍型模式3与再狭窄病症相关。如以上所讨论的，因为这些等位基因与其它等位基因为连锁不平衡，对这些其它连锁等位基因的检测也可表明该个体患有或易于出现心血管病症。
易于破裂的动脉粥样硬化斑块(易碎斑块，如在易碎斑块病症中看到的)具有某些结构、细胞和分子特征。压在易碎斑块上的纤维帽的破裂是冠状动脉血栓形成的最普通病因。通常，易碎斑块具有大的脂质核心和通常被炎症细胞渗入的薄纤维帽。形成核心的脂质的性质也是重要的；例如，胆固醇酯形式的脂质软化斑块而晶体胆固醇可能具有相反作用。此外，发现炎症细胞渗入为斑块易碎的标志。诸如氧化的脂蛋白、病原体或自身抗原如热休克蛋白的几种因子可能在动脉粥样硬化斑块中激起慢性炎症反应。活化的巨噬细胞和T淋巴细胞向斑块中的流入、以及随后细胞因子和基质降解蛋白的流入导致斑块的结缔组织框架弱化。基质金属蛋白酶和某些细胞因子为斑块易碎致病的重要因素。在诊断出易碎斑块病症后，可设计治疗剂来处理如上所述的易碎斑块的特征。
在一个实施方案中，本发明公开了显著的冠状动脉狭窄、增加的颈动脉壁内膜-中层厚度与IL-1基因模式2之间的相关性。可测量模式2的存在来确定出现CAD的风险因子。这种模式以及其病理生理学关联显示在图4中。进行临床试验来确定遗传标志物和有症状的冠状动脉狭窄的存在之间的相关性，该临床试验的发现概述在图5中。该临床试验的结果显示在图6中，其中对IL-1 RN位点处等位基因2纯合的患者约75％被确定具有显著的冠状动脉狭窄。
在一个实施方案中，本发明公开了再狭窄和IL-1位点处模式3基因型的相关性。如图7所示，研究显示，模式3基因型与约3-4倍的再狭窄风险增加相关，而对于模式2基因型该风险为0.5，对于模式1基因型为1.0。描述来自相同研究的数据的图8显示，对IL1RN(+2018)处等位基因1纯合的个体的约40％具有显著的再狭窄，25％已经需要靶血管的血管成形术。
应理解在某些风险因子对患有上述心血管病症之一的患者的影响和出现相关疾病之间可能具有关联性，以及风险因子和相关疾病的进展之间可能具有关联性。对潜在的单倍型模式的诊断可在给出建议或者在设计降低该风险因子对特定病症或疾病的影响方面指导临床医师。
例如，患者中的IL-1基因型模式可与总胆固醇水平对心血管病症和疾病的影响有关。在某种IL-1基因型模式存在下某个血清胆固醇水平的存在与统计学上可确定的冠状闭塞疾病和易碎斑块疾病的风险有关。这些相关性概要地显示在图9中。图10总结了一些支持该相关性的数据。这些数据表明，即使在低血清胆固醇存在下，模式1的存在也是易碎斑块类型事件风险的强烈预兆。易碎斑块类型事件也可在具有模式2的患者中观察到，尽管与血清胆固醇水平有高相关性。I1-1基因型模式2的一般关联概要地总结在图11中。
采用本发明的方法和试剂盒，可以将I1-1基因型模式与个体中的Lp(a)水平联系以确定闭塞CAD的优势比。已知胆固醇在血流中是以脂蛋白颗粒的形式输送。这些聚集体的蛋白组分具有特异的细胞靶向能力。每种脂蛋白颗粒通过密度分类，含有1)作为核心的主要种类的脂质和2)作为颗粒外壳的特异载脂蛋白。例如，LDL具有胆固醇核心以及载脂蛋白B-100外壳。脂蛋白(a)[Lp(a)]为含有LDL和模拟纤溶酶原的蛋白链的脂蛋白。Lp(a)表现为具有致动脉粥样硬化和促血栓形成作用，其干扰纤溶酶原和tPA结合纤维蛋白并刺激纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)合成。研究已显示了Lp(a)和冠状动脉疾病(CAD)之间的关系。相对于Lp(a)浓度对I1-2基因型模式的确定显示了有症状的冠状动脉狭窄和模式2患者中Lp(a)水平之间的关系，图12显示了这种关系。那些IL-1B(-511)等位基因2纯合的患者对有症状的狭窄有大大增加了的风险，尽管有低的Lp(a)水平。图13显示了升高的LDL和冠状动脉闭塞风险之间的关系，表明了模式2和升高的血清脂质水平之间的相互关系。
本发明的方法和试剂盒可以被用于将C反应性蛋白(CRP)与IL-1基因型模式联系起来。这种模式1个体(对IL-1B(+3954)处的等位基因2纯合)超过50％被发现具有高于0.20的CRP，而此时对IL-1B(+3954)处的等位基因1纯合的模式2个体CRP高于0.20仅有约28％。这些数据显示在图14中
4.3预测医学
4.3.1.与心血管病症有关的多态性
本发明至少部分地基于与个体中出现心血管病症相关的(统计学上显著的程度)等位基因的鉴定。因此，个体中的这些等位基因的单独检测，或者与另一手段联合，表明该个体患有或易于出现心血管病症。例如，如以下实施例中所显示的，与易于出现冠状动脉病症或其它血管闭塞引起的血管病症有关的IL-1多态等位基因包括IL-1B(-511)的等位基因2、IL-1RN(VNTR)的等位基因2、IL-1RN(+2018)的等位基因2、IL-1A(+4845)的等位基因1或IL-1B(+3954)的等位基因1或者与前述等位基因之一连锁不平衡的等位基因。
本发明还公开了与由于易碎斑块破裂引起的心血管疾病的倾向或更大风险有关的IL-1多态等位基因。这些等位基因包括IL-1A(+4845)的等位基因2、IL-1B(+3954)的等位基因2、IL-1B(-511)的等位基因1和IL-1RN(+2018)的等位基因1或者与前述等位基因之一连锁不平衡的等位基因。这种模式还与增加的出现严重成人牙周炎的风险相关。
例如，IL-1B(-511)的等位基因2和IL-1RN(VNTR)的等位基因2彼此连锁不平衡并且与多个其它的定义IL-1(44112332)单倍型的IL-1多态性连锁不平衡(Cox，et al.(1998)Am.J.Hum.Genet.62：1180-88)。具体地，该44112332单倍型包括以下的基因型：
    IL-1A的222/223标志物的等位基因4IL-1A的gz5/gz6标志物的等位基因4IL-1A的-889标志物的等位基因1IL-1B的+3954标志物的等位基因1IL-1B的-511标志物的等位基因2gaat.p33330标志物的等位基因3Y31标志物的等位基因3IL-1RN的VNTR标志物的等位基因2
因此，在本发明的备选实施方案中，确定了在IL-1A的222/223标志物、IL-1A的gz5/gz6标志物、IL-1A的-889标志物、IL-1B的+3954标志物、IL-1B/IL-1RN基因间区域的gaat.p33330标志物或IL-1B/IL-1RN基因间区域的Y31标志物处的基因分型分析，IL-1A的222/223标志物的等位基因4、IL-1A的gz5/gz6标志物的等位基因4、IL-1A的-889标志物的等位基因1、IL-1B的+3954标志物的等位基因1、gaat.p33330标志物的等位基因3、或Y31标志物的等位基因3的存在表明了增加的出现心血管病症的增加的可能性，尤其是通过动脉的闭塞引起的特定病症。在某些实施方案中，对闭塞疾病的倾向的诊断可导致对与闭塞临床事件增加的发生率有关的生活方式因子的改变，或者可导致引入治疗方式来减少闭塞症状或体征的风险。在其它实施方案中，诊断对闭塞疾病的倾向可提醒临床医师说明其它难以诊断的疾病，例如肠绞痛、肾血管性高血压和其它的动脉狭窄可以造成这些症状和体征的状况。
此外，IL-1RN(+2018)多态性的等位基因2(Clay et al.(1996)HumGenet 97：723-26)，也称为外显子2(8006)(GenBank：X64532，位于8006)，已知与IL-1RN(VNTR)多态性位点的等位基因2连锁不平衡，其又是44112332人单倍型的一部分。因此，IL-1RN(+2018)位点的等位基因2(即，+2018处为C)为与44112332单倍型有关的等位基因变体，并因此提供了另一靶标，用于预测性基因分型分析来确定个体发生血管病症的可能性。类似地，IL-1RN可选择的外显子中三个其它的多态性(外显子lic，其产生基因产物的细胞内形式)也与IL-1RN(VNTR)的等位基因2连锁不平衡(Clay et al.(1996)Hum Genet 97：723-26)。这些包括：IL-1RN外显子lic(1812)多态性(GenBank：X77090，位于1812)；IL-1RN外显子lic(1868)多态性(GenBank：X77090，位于1868)；以及IL-1RN外显子lic(1887)多态性(GenBank：X77090，位于1887)。此外，启动子中用于基因的可选择的剪接的细胞内形式的另一多态性Pic(1731)多态性(GenBank：X77090，位于1731)也与IL-1RN(VNTR)多态位点的等位基因2连锁不平衡(Clay et al.(1 996)Hum Genet 97：723-26)。针对每个这些IL-1RN多态性位点的相应序列变化显示如下。
等位基因# 外显子2(IL-1RN的+2018) 外显子lic-1(GB：X77090的1812) 外显子lic-2(GB：X77090的1868) 外显子lic-3(GB：X77090的1887) Pic(GB：X77090的1731)
1 T G A G G
2 C A G C A
对于这些多态性位点的每一个，等位基因2序列变体被确定为与IL-1RN(VNTR)位点的等位基因2连锁不平衡(Clay et al.(1996)HumGenet 97：723-26)。
类似地，与增加的出现易碎斑块疾病的风险有关的33221461包括以下基因型：
    IL-1A的222/223标志物的等位基因3IL-1A的gz5/gz6标志物的等位基因3IL-1A的-889标志物的等位基因2IL-1B的+3954标志物的等位基因2IL-1B的-511标志物的等位基因1gaat.p33330标志物的等位基因4Y31标志物的等位基因6
IL-1RN的+2018的等位基因1
IL-1A的+4845的等位基因2
IL-1RN的VNTR标志物的等位基因1
在本发明的另一实施方案中，在IL-1A的-889标志物、IL-1B/IL-1RN基因间区域的gaat.p33330标志物、IL-1B/IL-1RN基因间区域的Y31标志物处的基因分型分析被确定，并且IL-1A的-899标志物的等位基因1、gaat.p3330标志物的等位基因4、或Y31标志物的等位基因6的存在预示了心血管病症，尤其是增加的易碎斑块病症风险。已知这些病症通过血栓形成和栓塞形成导致临床事件。通常该临床事件没有被在先的局部缺血体征预示。用在本文时，慢性局部缺血与闭塞心血管疾病而不是与易碎斑块疾病相关。早期检测到不幸临床事件倾向会是对目前的诊断手段的重要补充。脑血管循环中的易碎斑块临床事件可通过堵塞脑血管并且引起急性局部缺血而导致中风或CVA，其可导致不可逆的脑梗塞。心肌循环中的易碎斑块临床事件可通过堵塞冠状血管和引起急性局部缺血而导致心肌梗塞，其可导致不可逆的心肌损伤。非脑外周血管中的易碎斑块临床事件可导致引起坏疽和组织缺损的局部缺血突然发作。由于这些易碎斑块临床事件可以发生而没有之前的预告，所以鉴定与增加的风险相关的基因型可导致对这些风险中个体的增加的临床检测，具有更早和更广泛的诊断或治疗性介入。在另一实施方案中，还预示增加的出现严重成人牙周炎的风险。在另一实施方案中，严重成人牙周炎的存在预示着增加的易碎斑块疾病风险。
除了上述等位基因模式之外，如本文所述，本领域技术人员可容易地鉴别其它等位基因(包括多态性和突变)，该等位基因与心血管病症相关等位基因连锁不平衡。例如，可收集来自第一组无心血管病症的个体的核酸样品，以及来自第二组的患有心血管病症的个体的DNA。然后，比较核酸样品以鉴别第二组中与第一组相比过表达的那些等位基因，其中这些等位基因可能与心血管病症相关。或者，例如可通过对大群体基因分型并进行统计学分析来确定哪些等位基因比预期的更加经常地一起出现，可鉴别与心血管病症相关等位基因连锁不平衡的等位基因。优选地，所选的组由遗传上相关的个体组成。遗传上相关的个体包括相同种族、相同民族或甚至相同家族的个体。当对照组和测试组之间的遗传关联性的程度增加时，与致病等位基因更远连锁的多态性等位基因的预测值也增加。这是由于经过更少的进化时间使得沿染色体在建立者群体中连锁的多态性通过交换事件再分布。因此，可开发种族特异的、民族特异的、以及甚至家族特异的诊断性基因分型测定以允许检测在人类进化中更近期出现的疾病等位基因，例如在主要的人种族趋异后、在人群分为不同的民族后、以及甚至在特定家系的近代史内。
两多态标志物之间或一个多态标志物和致病突变之间的连锁不平衡为相对稳定状态。缺乏选择压力或零星的连锁重现潜在突变事件，则多态性将最终通过染色体重组事件而变得不关联，并由此会通过人类进化过程而最终达到连锁平衡。因此，发现与疾病或状况连锁不平衡的多态性等位基因的可能性可以随至少两因子而增加：该多态性标志物与致病突变之间减小的物理距离、以及可用于该连锁对分离的减数分裂代减少的数量。考虑后一因素表明，两个个体的相关性越近，它们越有可能共享一个母本染色体或者含有连锁的多态性的染色体区域，而且还不大可能是：通过发生在每一代的减数分裂的交换事件，使这一连锁对成为非连锁。作为结果，两个个体的相互关系越近，越有可能很远间隔的多态性可以共遗传。这样，对于通过共同种族、民族或者家族相关的个体来说，距离更远的多态性位点可信赖为连锁的致病突变遗传的指示。
存在于本发明试剂盒的一个实施方案中的寡核苷酸可以被用于扩增所关注的区域或者指导等位基因特异寡核苷酸(ASO)杂交至所研究的标志物。因此，该寡核苷酸可以邻接所关注的标志物(如PCR扩增所需)或者直接重叠标志物(如在ASO杂交中的)。用于上述检测方法的合适引物的实例包括：
5′-CTCAGCAACACTCCTAT-3′(SEQ ID NO.1)；
5′-TCCTGGTCTGCAGGTAA-3′(SEQ ID NO.2)；
其可被用于扩增人IL-1RN(VNTR)多态性位点并对其分型；
5′-CTATCT GAGGAACAACCAACTAGTAGC-3′(SEQ ID NO.3)；
5′-TAG GAC ATT GCA CCT AGG GTT TGT-3′(SEQ ID NO.4)；
其可被用于扩增人IL-1RN(+2018)多态性位点并对其分型；
5′TGGCATTGATCTGGTTCATC 3′(SEQ ID No：5)；
5′GTTTAGGAATCTTCCCACTT 3′(SEQ ID No：6)；
其可被用于扩增人IL-1B(-5 11)多态性位点并对其分型；
5′CTC AGG TGT CCT CGA AGA AAT CAA A 3′(SEQ ID NO：7)；
5′GCT TTT TTG CTG TGA GTC CCG 3′(SEQ ID NO：8)
其可被用于扩增人IL-1B(+3954)多态性位点并对其分型；以及
5′ATG GTT TTA GAA ATC ATC AAG CCT AGG GCA 3′(SEQ IDNO：9)
3′AAT GAA AGG AGG GGA GGA TGA CAG AAA TGT 3′(SEQID NO：10)
其可被用于扩增人IL-1A(+4845)多态性位点并对其分型。
可以设计合适的探针与诸如IL-1A、IL-1B或IL-1RN的IL-1位点的特异基因或相关基因杂交。或者，这些探针可以并入相关基因组的位点的其它区域，包括基因间序列。实际上，人染色体2的IL-1区横跨大约400,000碱基对，并且估计每1,000碱基对平均1个单核苷酸多态性，则包括约400 SNP单独位点。可用于本发明的其它多态性可从各种公开资源获得。例如，人基因组数据库收集了基因内SNP，可通过序列检索，目前含有约2,700条目(http://hgbase.interactiva.de)。还可获得人多态性数据库，其由Massachusetts Institute of Technology(麻省理工学院)维护(MIT SNP数据库(http://www.genome.wi.mit.edu/SNP/human/index.html))。从这些资源可以发现SNP以及其它的人多态性。
例如，对于这些数据库任何一个中的人基因组的IL-1区的研究揭示，IL-1位点基因被127.4cM(厘摩)处的称为小随体标志物AFM220ze3的着丝粒近端多态性标志物(参见GenBank Ace.No.Z17008)和127.9cM处的称为小随体锚标志物AFM087xal的远端多态性标志物(参见GenBank Ace.No.Z16545)从两侧邻接。这些人多态性位点都为CA二核苷酸重复小随体多态性，因此，在人群中显示出高度的杂和现象。例如，采用5′引物序列TGTACCTAAGCCCACCCTTTAGAGC(SEQ ID NO.14)和3′引物序列TGGCCTCCAGAAACCTCCAA(SEQ ID NO.15)，AFM220ze3的一个等位基因产生211 bp PCR扩增产物。此外，采用5′引物序列GCTGATATTCTGGTGGGAAA(SEQ IDNo.16)和3′引物序列GGCAAGAGCAAAACTCTGTC(SEQ ID NO.17)，AFM087xal的一个等位基因产生177bp PCR扩增产物。对应于出现在这些人染色体2 CA二核苷酸重复多态性的5′和3′的独特序列的等价引物对本领域技术人员来说是显而易见的。适合的等价引物包括与指定引物的约1kb内杂交并且进一步地在任何地方的约17bp至约27bp长度的引物。用于设计扩增独特的人染色体基因组序列的引物的一般原则是它们具有至少约50□C的融解温度，其中可采用公式T融解＝[2x(A或T的#)+4x(G或C的#)]估计大概的融解温度。
多个其它的人多态性位点存在在这些两CA二核苷酸重复多态性之间，并提供了另外的靶标来确定家族或遗传上相关个体的其它组中的心血管病症预测性等位基因。例如，the National Center forBiotechnology Information web site(国家生物技术信息中心网站)(www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/)列出了IL-1位点区域内的多个多态性标志物，并为设计扩增和分析这些标志物的合适引物提供了指导。
因此，本发明的核苷酸片段由于其如下能力可以被使用：选择性地与人染色体2q 12-13的互补性节段或源于该区域的cDNA形成双链分子、或者能够提供引物来扩增该区域的DNA或cDNA。设计合适的用于此目的的探针需要考虑多种因素。例如，会发现长度在10、15、或18核苷酸至约20或至约30核苷酸的片段尤其实用。对于某些实施方案来说，甚至更优选较长的序列，例如40、50、80、90、100、甚至全长。至少约18至20核苷酸的寡核苷酸长度被本领域技术人员广泛接受，由于足以允许充分特异的杂交，由此可用作分子探针。此外，取决于预期的应用，会希望采用不同的杂交条件来实现探针对靶序列的不同程度的选择性。对于需要高选择性的应用，通常希望采用相对严紧的条件形成杂交物。例如，较低的盐和/或高温条件，例如在约50□C至约70□C的温度由0.02M-0.15M NaCl所提供的。这种选择性条件可以忍耐极少(如果有的话)的探针与模板或靶链之间的错配。
与上述等位基因的检测联合，血管病症的其它等位基因或其它标志物可在个体中被检测或监测，例如鉴定血管壁厚度(例如，通过超声测量的)、或者该个体是否吸烟、是否饮酒、是否过重、是否有压力、是否具有高胆固醇或低胆固醇、是否具有升高的Lp(a)，或者是否锻炼。
4.3.2等位基因的检测
很多方法可用于检测人多态性位点处的特异等位基因。检测特异多态性等位基因的优选方法部分地取决于多态性的分子性质。例如，多态性位点的各种等位基因形式可以通过DNA的单碱基对区分。这种单核苷酸多态性(或SNP)为遗传变异的主要贡献者，占所有已知多态性的大约80％，并且它们在人类基因组中的密度据估计为平均1,000碱基对1个。SNP是最频繁的二等位基因-仅以两种不同形式存在(尽管高达四种不同形式的SNP，对应于在DNA中出现的四种不同核苷酸碱基，在理论上是可能的)。然而，SNP在突变上比其它多态性更稳定，使它们适合于相关性研究，其中将标志物和未知变体之间的连锁不平衡用于对致病突变作图。另外，因为SNP典型地仅具有两种等位基因，它们可以通过简单的正/负测定而不是长度测量来基因分型，使它们更易于自动化。
多种方法可供检测个体中特定单核苷酸多态性等位基因的存在。该领域的进展已经提供准确、容易和便宜的大规模SNP基因分型。最近，例如已经描述了几种新技术，包括动态等位基因特异性杂交(DASH)、微量板阵列对角凝胶电泳(MADGE)、焦磷酸测序、寡核苷酸特异性连接、TaqMan系统以及诸如Affymetrix SNP芯片的各种DNA“芯片”技术。这些方法要求靶基因区域的扩增，典型地通过PCR进行。还有其它新开发的方法，其基于通过侵入裂解产生小信号分子，接着质谱分析或固定化锁定探针和滚环扩增，最终可能消除对PCR的需要。下文总结了本领域已知的用于检测特定单核苷酸多态性的几种方法。本发明的方法应当理解为包括所有可利用的方法。
几种方法已经被开发用于促进单核苷酸多态性的分析。在一个实施方案中，通过使用专门的抗外切核酸酶的核苷酸可以检测单碱基多态性，如例如在Mundy C.R.(美国专利4,656,127)中所公开的。根据该方法，与紧接多态位点3′的等位基因序列互补的引物允许与从特定动物或人获得的靶分子杂交。如果在靶分子上的多态位点包含与存在的特定抗外切核酸酶的核苷酸衍生物互补的核苷酸，那么该衍生物将被掺入到杂交引物的末端。该掺入导致引物抗外切核酸酶，由此使得其检测成为可能。因为样品的抗外切核酸酶的衍生物的身份是已知的，所以发现引物已经变得抗外切核酸酶则揭示存在于靶分子的多态位点中的核苷酸与用于反应中的核苷酸衍生物互补。该方法具有优势，即它不要求确定大量的外来序列数据。
在本发明的另一实施方案中，基于溶液的方法被用于测定多态位点核苷酸的同一性。Cohen，D.等人(法国专利2,650,840；PCT申请WO91/02087)。如在美国专利4,656,127的Mundy方法中，使用与紧接多态位点3′的等位基因序列互补的引物。采用标记的双脱氧核苷酸衍生物，该方法确定该位点的核苷酸同一性，其中所述双脱氧核苷酸衍生物如果与多态位点的核苷酸互补将被掺入到引物的末端。
Goelet，P.等人(PCT申请92/15712)描述一种备选方法，称为遗传位分析法(Genetic Bit Analysis)或GBATM。Goelet，P.等的方法使用标记的终止子和引物的混合物，其中所述引物与多态位点3′的序列互补。掺入的经标记终止子因此通过存在于被评估的靶分子的多态位点中的核苷酸而测定并与其互补。与Cohen等人的方法(法国专利2,650,840；PCT申请WO91/02087)形成对比，Goelet，P.等的方法优选非均相测定，其中引物或靶分子被固定于固相。
近来，已经描述几种用于测定DNA中多态性位点的引物引导的核苷酸掺入方法(Komher，J.S.et al.，Nucl.Acids.Res.17：7779-7784(1989)；Sokolov，B.P.，Nucl.Acids Res.18：3671(1990)；Syvanen，A.-C，et al.Genomics 8：684-692(1990)；Kuppuswamy，M.N.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)88：1143-1147(1991)；Prezant，T.R.et al.，Hum.Mutat.1：159-164(1992)；Ugozzoli，L.et al.，GATA 9：107-112(1992)；Nyren，P.et al.，Anal.Biochem.208：171-175(1993))。这些方法与GBATM的区别在于它们都依赖于标记的脱氧核苷酸的掺入以区别多态位点处的碱基。在这种形式中，因为信号与掺入的脱氧核苷酸的数量成比例，在相同核苷酸的运行中出现的多态性可以产生与运行长度成比例的信号(Syvanen，A.-C.，et al.，Amer.J.Hum.Genet.52：46-59(1993))。
对于导致蛋白质翻译的过早终止的突变，蛋白质截短试验(PTT)提供有效的诊断方法(Roest，et al.，(1993)Hum.Mol Genet.2：1719-21；van der Luijt，et al.，(1994)Genomics 20：1-4)。对于PTT，RNA最初从可利用的组织中分离并被逆转录，并通过PCR扩增所关注的片段。然后将逆转录PCR的产物用作嵌套PCR扩增的模板，引物包含RNA聚合酶启动子和用于起始真核生物翻译的序列。在扩增所关注的区域以后，掺入到引物的独特基序允许PCR产物的连续体外转录和翻译。在翻译产物的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸胺凝胶电泳以后，截短多肽的出现指示导致翻译过早终止的突变的存在。在该技术的变体中，当所关注的靶区域来源于单个外显子时，将DNA(与RNA相反)用作PCR模板。
可以利用任何细胞类型或组织以获得用于本文所述诊断的核酸样品。在优选实施方案中，DNA样品获自体液，例如通过已知技术(例如静脉穿刺)获得的血液或唾液。或者，可在干燥样品(例如头发或皮肤)上进行核酸检验。当使用RNA或蛋白质时，可以使用的细胞或组织必须表达IL-1基因。
还可以直接在获自组织活检或切除术的患者组织的组织切片(固定和/或冷冻)上原位进行诊断操作，因此不需要核酸纯化。可以将核酸试剂用作该原位操作的探针和/或引物(参见，例如，Nuovo，G.J.，1992，PCR in situ hybridization：protocols and applications(PCR原位杂交：方法和应用)，Raven Press，NY)。
除了主要集中在检测一种核酸序列的方法以外，在这类检测方案中还可以评估图谱。例如通过使用差异显示方法、Northern分析和/或RT-PCR可以产生指纹图谱。
优选的检测方法是使用探针的等位基因特异性杂交，所述探针重叠IL-1促炎单倍型的至少一个等位基因区域并具有突变或多态区域周围约5、10、20、25、或30个核苷酸。在本发明的优选实施方案中，将能够与其它涉及心血管病症的等位基因变体特异杂交的几个探针附着在固相载体，例如“芯片”(其可以容纳高达约250,000个寡核苷酸)。寡核苷酸可以通过包括平版印刷术在内的多种方法与固相载体结合。例如在Cronin et al.(1996)Human Mutation 7：244中描述使用这些包含寡核苷酸的芯片(也称为“DNA探针陈列”)的突变检测分析。在一个实施方案中，芯片包含基因的至少一个多态区域的所有等位基因变体。然后将固相载体与检验核酸接触并检测与特异性探针的杂交。因此，在简单的杂交实验中可鉴定一个或多个基因的许多等位基因变体的身份。
这些技术可以还包括在分析前扩增核酸的步骤。扩增技术对于本领域技术人员是已知的，包括但不限于克隆、聚合酶链式反应(PCR)、特异性等位基因的聚合酶链式反应(ASA)、连接酶链式反应(LCR)、嵌套聚合酶链式反应、自主序列复制(Guatelli，J.C.et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh，D.Y.et al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、以及Q-Beta复制酶(Lizardi，P.M.et al.，1988，Bio/Technology 6：1197)。
可以以多种方式测定扩增产物，包括大小分析、限制消化接以大小分析、在反应产物中检测特异标记的寡核苷酸引物、等位基因特异寡核苷酸(ASO)杂交、等位基因特异性5′外切核酸酶检测、测序、杂交等。
基于PCR的检测方法可以包括同时多重扩增多个标志物。例如，本领域中公知选择PCR引物以产生大小不重叠并且可以同时分析的PCR产物。备选地，可能使用带有不同标签的引物来扩增不同标志物，因此每个可被差异检测。当然，基于杂交的检测手段允许样品中多个PCR产物的差异检测。本领域已知其它技术允许多个标志物的多重分析。
在仅说明性的实施方案中，该方法包括以下步骤：(i)从患者收集细胞样品，(ii)从样品细胞中分离核酸(例如，基因组，mRNA或两者)，(iii)在多种条件下使核酸样品与一种或多种引物接触以便发生等位基因的杂交和扩增，其中所述引物与IL-1促炎单倍型的至少一个等位基因的5′和3′特异性杂交，以及(iv)检测扩增产物。如果这些分子以极低数量存在，则这些检测方案对于检测核酸分子特别有用。
在个体测定的优选实施方案中，通过限制酶切割模式的改变鉴定IL-1促炎单倍型的等位基因。例如，分离样品和对照DNA、扩增(任选地)、用一种或多种限制内切核酸酶消化、并通过凝胶电泳确定片段长度大小。
在另一实施方案中，本领域已知的多种测序反应中的任何一种可被用于直接对等位基因测序。示例性的测序反应包括那些基于由Maxim和Gilbert((1977)Proc.Natl Acad Sci USA 74：560)或Sanger(Sanger et al.(1977)Proc.Nat.Acad.Sci USA 74：5463)开发的技术。还考虑当进行个体测定时可以使用多种自动测序方法中的任何一种(参见例如Biotechniques(1995)19：448)，包括通过质谱测序(参见，例如PCT公开WO94/16101；Cohen et al.(1996)Adv Chromatogr 36：127-162；以及Griffin et al.(1993)Appl Biochem Biotechnol 38：147-159)。对于本领域技术人员显而易见的是，对于某些实施方案，仅仅需要在测序反应中确定一个、两个或三个核酸碱基的出现。例如，可以进行A-跟踪(A-track)等，如其中仅检测一个核酸。
在另一实施方案中，可使用切割剂(如核酸酶、羟胺或四氧化锇和哌啶)的保护来检测RNA/RNA或RNA/DNA或DNA/DNA异源双链中的错配碱基(Myers et al.(1985)Science 230：1242)。通常，“错配切割”的现有技术通过提供含有野生型等位基因的(标记的)RNA或DNA与样品杂交形成的异源双链起始。用切割双链体的单链区域的试剂处理双链体，这种单链区域例如由于对照和样品链之间的碱基对错配而导致其存在。例如，可以用RNA酶处理RNA/DNA双链体和用S1核酸酶处理DNA/DNA杂交物以酶促消化错配区域。在其它实施方案中，可以用羟胺或四氧化锇和哌啶处理DNA/DNA或RNA/DNA双链体以便消化错配区域。在消化错配区域以后，通过在变性聚丙烯酰胺凝胶上通过大小分离得到的物质以确定突变位点。参见，例如Cotton et al.(1988)Proc.Natl Acad Sci USA 85：4397；和Saleeba et al.(1992)Methods Enzymol.217：286-295。在优选实施方案中，对照DNA或RNA可被标记以用于检测。
在另一实施方案中，错配切割反应使用一种或多种识别双链DNA中的错配碱基对的蛋白质(所谓“DNA错配修复”酶)。例如大肠杆菌mutY酶在G/A错配处切割A，来自HeLa细胞的胸苷DNA糖基化酶在G/T错配处切割T(Hsu et al.(1994)Carcinogenesis 15：1657-1662)。按照示例性实施方案，基于IL-1位点单倍型的等位基因的探针与来自检验细胞的cDNA或其它DNA产物杂交。用DNA错配修复酶处理双链体，从电泳方案等可以检测到切割产物，如果有的话。参见，例如美国专利5,459,039。
在其它实施方案中，电泳迁移率的改变可以用来鉴定IL-1位点等位基因。例如，单链构象多态性(SSCP)可以被用于检测突变型和野生型核酸之间的电泳迁移率的差异(Orita et al.(1989)Proc Natl.Acad SciUSA 86：2766，还参见Cotton(1993)Mutat Res 285：125-144和Hayashi(1992)Genet Anal Tech Appl 9：73-79)。使样品和对照IL-1位点等位基因的单链DNA片段变性并让其复性。单链核酸的二级结构随序列而变化，导致的电泳迁移率的改变使得能够检测甚至单碱基变化。DNA片段可以被标记或用经标记的探针检测。通过使用RNA(而不是DNA)可以增强测定的灵敏性，在RNA中二级结构对序列变化更为敏感。在优选的实施方案中，基于电泳迁移率的变化，所述方法使用异源双链体分析来分离双链异源双链体分子(Keen et al.(1991)Trends Genet7：5)。
在另一实施方案中，使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)测定在含有梯度变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中等位基因的运动(Myers et al.(1985)Nature 313：495)。当将DGGE用作分析方法时，例如通过PCR加入约40bp高熔解的富含GC的DNA的GC夹修饰DNA，以确保它不完全变性。在另一实施方案中，使用温度梯度替代变性剂梯度来鉴定对照和样品DNA的迁移率差异(Rosenbaum and Reissner(1987 BiophysChem 265：12753)。
其它用于检测等位基因的技术的实例包括但不限于选择性寡核苷酸杂交、选择性扩增、或选择性引物延伸。例如，可以制备其中已知突变或核苷酸差异(例如在等位基因变体中)被放置在中央的寡核苷酸引物，然后在只有存在完全匹配时才杂交的条件下与靶DNA杂交(Saiki et al.(1986)Nature 324：163)；Saiki et al.(1989)Proc.Natl Acad.Sci USA 86：6230)。当寡核苷酸与PCR扩增的靶DNA杂交时该等位基因特异的寡核苷酸杂交技术可以被用于检测每个反应一个突变或多态区域，当寡核苷酸附着在杂交膜和与经标记的靶DNA杂交时该技术可以用于检测多个不同突变或多态区域。
或者，依赖于选择性PCR扩增的等位基因特异扩增技术可以与本发明结合使用。用作特异扩增引物的寡核苷酸可以在分子中央携带所关心的突变或多态区域(这样扩增取决于差异杂交)(Gibbs et al(1989)Nucleic Acids Res.17：2437-2448)，或者在一条引物的3′最末端，其中在适当条件下可以防止错配，或减少聚合酶延伸(Prossner(1993)Tibtech 11：238)。另外，可能希望在突变区域引入新的限制位点以产生基于切割的检测(Gasparini et al.(1992)Mol.Cell Probes 6：1)。预期在某些实施方案中还可以使用用于扩增的Taq连接酶来进行扩增(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci USA 88：189)。在这些情形中，只有当5′序列的3′末端存在完全匹配时才发生连接，使其可能通过检查是否存在扩增来检测在特定位点处已知突变的存在。
在另一实施方案中，如例如在美国专利4,998,617和在Landegren，U.等人((1988)Science 241：1077-1080)中所描述的，使用寡核苷酸连接测定法(OLA)进行等位基因变体的鉴定。OLA方案使用两寡核苷酸，它们被设计为能够与靶的单链的邻接序列杂交。寡核苷酸之一与分离标志物连接，例如生物素化，另一条被可检测地标记。如果在靶分子中存在精确的互补序列，则寡核苷酸将杂交，以致于它们的末端邻接，并产生连接底物。然后连接允许使用抗生物素蛋白或另外的生物素配体回收被标记的寡核苷酸。Nickerson，D.A.等人已经描述了结合PCR和OLA的特点的核酸检测法(Nickerson，D.A.et al.(1990)Proc.Natl.Acad Sci.USA 87：8923-27)。在该方法中，PCR被用于实现靶DNA的指数扩增，然后使用OLA检测。
几种基于该OLA方法的技术已被开发，可被用于检测IL-1位点单倍型的等位基因。例如，美国专利5,593,826公开了这样的OLA，其使用具有3′-氨基的寡核苷酸和5′-磷酸化寡核苷酸形成具有氨基磷酸酯连接的偶联物。在Tobe等人((1996)Nucleic Acids Res 24：3728)描述的另一种OLA变体中，与PCR结合的OLA允许在单个微量孔中将两个等位基因分型。通过用独特半抗原，即毛地黄毒苷和荧光素，标记每种等位基因特异性引物，通过使用半抗原特异性抗体可检测每种OLA反应，所述半抗原特异性抗体用不同的酶报告者(碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶)标记。该系统允许使用导致两种不同颜色产生的高通量形式检测两个等位基因。
本发明另一实施方案涉及用于检测出现心血管病症的素因的试剂盒，该心血管病症或者是由于动脉闭塞引起，或者是由于形成易碎斑块引起，或者是由于形成再狭窄引起。该试剂盒可包含一种或多种寡核苷酸，包括与IL-1位点单倍型的至少一个等位基因的5′和3′杂交的5′和3′寡核苷酸。PCR扩增寡核苷酸应当在相隔25至2500个碱基对、优选相隔约100至约500个碱基之间杂交，以便产生用于随后分析的适合大小的PCR产物。
尤其优选的用在本发明诊断方法中的引物包括SEQ ID Nos.1-10。
可获得的来自包含人IL-1位点的人染色体2q13的最新序列信息和最新的关于该位点的可获得的人多态性信息促进了用于通过本发明方法扩增和检测IL-1多态等位基因的另外的寡核苷酸的设计。使用该序列信息和本领域已知用于设计和优化引物序列的标准技术，可以容易地设计用于检测这些基因中人类多态性的适当引物。例如通过使用商业上可购得的引物选择程序如Primer 2.1、Primer 3或GeneFisher可以实现这些引物序列的最优设计(还参见Nicklin M.H.J，Weith A.DuffG.W.，“A Physical Map of the Region Encompassing the HumanInterleukin-1α，Interleukin-1β，and Interleukin-1 Receptor AntagonistGenes(包含人白介素-1α、白介素-1β和白介素-1受体拮抗剂基因的区域的物理图谱)”Genomics 19：382(1995)；Nothwang H.G.et al.“Molecular Cloning of the Interleukin-1 gene Cluster：Construction of anIntegrated YAC/PAC Contig and a partial transcriptional Map in theRegion of Chromosome 2q13(白介素-1基因簇的分子克隆：构建整合的YAC/PAC重叠群和染色体2q13区域中的部分转录图谱)”Genomics 41：370(1997)；Clark et al.(1986)Nucl.Acids.Res.，14：7897-7914[出版错误出现在Nucleic Acids Res，15：868(1987)和URL http://www.gdb.org的基因组数据库(GDB)计划中]。
关于在试剂盒中的使用，寡核苷酸可以是多种天然和/或合成组合物中的任何一种，如合成寡核苷酸、限制性片段、cDNA、合成肽核酸(PNA)等。测定试剂盒和方法还可以使用经标记的寡核苷酸以允许在测定中易于鉴定。可以使用的标记的实例包括放射标记、酶、荧光化合物、抗生蛋白链霉素、抗生物素蛋白、生物素、磁性部分、金属结合部分、抗原或抗体部分等。
试剂盒可任选地还包括DNA取样装置。DNA取样装置对于本领域技术人员是公知的并且可以包括但不限于基质，如滤纸，AmpliCardTM(University of Sheffield，Sheffield，England S10 2JF；Tarlow，JW et al.，J.of Invest.Dermatol.103：387-389(1994))等；DNA纯化试剂如NucleonTM试剂盒、裂解缓冲液、蛋白酶溶液等；PCR试剂，如10X反应缓冲液、热稳定性聚合酶、dNTP等；以及等位基因检测手段如HinfI限制酶、等位基因特异寡核苷酸、用于来自干血的嵌套PCR的简并寡核苷酸引物。
4.3.3.药物基因组学
对出现心血管病症的易感性相关的特定等位基因的单独了解、或其与关于其它促进心血管病症的遗传缺陷信息的结合使得根据个体的遗传状况的预防或治疗的个性化成为可能，这是“药物基因组学”的目标。
一种预防和治疗心血管疾病的方法涉及对特定疾病风险因子的鉴定。
例如，具有任意以下标志物的等位基因2：IL-1A+4845或IL-1B(+3954)、或以下标志物的等位基因1：IL-1B(-511)或IL-1RN(+2018)、或者与这些等位基因任一个连锁不平衡的任何核酸序列的个体可能具有或者倾向于出现以形成易碎斑块为特征的心血管疾病、可能倾向于增加的心肌梗塞、中风、急性外周血管堵塞、以及大动脉中中等大小动脉瘤形成的风险。这些患者还倾向于出现严重成人牙周炎。
另一种治疗心血管疾病的方法涉及干扰潜在病症的进展、改善疾病症状和体征、或者保护靶组织，这样影响组织循环的心血管病症的存在不导致与该靶组织相关的临床症状和体征的出现。
举例而言，某些药物对动脉粥样硬化斑块有稳定作用或者对易碎斑块疾病后遗症有其它有益作用。作为实例，β-肾上腺素受体阻断剂减少心肌梗塞的复发、血管紧张素转化酶抑制剂减少心肌梗塞的发病率、某些抗生素和抗氧化剂也被证明在稳定斑块方面有效。有降低脂质能力的药物如3-羟基-3甲戊二酰-辅酶A还原酶抑制剂(他汀类)也是重要的。基于本文公开的模式1IL-1基因型，这些患者可能对致力于斑块稳定的治疗反应更好，而不是血管重建或其它侵入性技术。
在细胞水平上，降低血清胆固醇水平导致动脉粥样硬化斑块内炎性细胞的减少。在分子水平上，脂质降低已被证实降低了这些斑块中金属蛋白酶活性。
在一个实施方案中，例如，诸如基因治疗的技术可以被用于稳定易碎斑块，这可包括基质金属蛋白酶的组织抑制剂的过表达和阻断促炎分子的反义方法。
另一方面，具有任何以下标志物的等位基因1：IL-1A+4845或IL-1B(+3954)、或以下标志物的等位基因2：IL-1B(-511)或IL-1RN(+2018)的个体可能对诸如血管重建的特定方法或者改变内膜中层动脉增厚的进展的那些方法反应更好。
另一治疗心血管病症和疾病的方法包括控制增加心血管病症风险的条件。
与动脉粥样硬化进展相关的因子包括糖尿病、高血压、高胆固醇血症、高脂蛋白-a、肥胖和吸烟。其中可受药理学介入影响的因子包括：i)糖尿病、ii)高血压、和iii)血脂异常。降低脂质药物的实例包括：阴离子交换树脂如消胆胺、考来替泊；HMG CoA还原酶抑制剂或(他汀类)如辛伐他汀、pracastatin、西立伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、洛伐他汀；贝特类如非诺贝特、苯扎贝特、吉非贝齐、氯贝丁酯、环丙贝特；烟酸和类似物：阿昔莫司、尼可呋糖；增强非受体介导的LDL清除和降低LDL氧化的普罗布考；鱼油如脉适宝、复方ω-3不饱和脂肪酸；以及胆固醇吸附抑制剂如帕马苷、替奎安。
相应地，可基于这种基因型分析开发针对个体中疾病特定分子基础的治疗剂。因此，就心血管病症将个体的IL-1谱与群体谱进行比较，使得选择或设计预期对特定患者或患者群(即，具有相同遗传改变的患者组)安全有效的药物或其它治疗方案成为可能。
另外，基于遗传谱靶向期望显示最高临床益处的群体的能力便能够：1)重新定位已经上市的防止或治疗心血管病症的药物；2)拯救由于安全性或功效限制导致中断临床开发的候选药物，其是患者亚群特异的；以及3)加速和更便宜地开发候选疗法和更佳的药物标签(例如，因为测量各种剂量的药剂对血管病症致病突变的效果对于优化有效剂量是有用的)。
通过测定蛋白质(例如IL-1α、IL-1β、或IL-1Ra)、mRNA和/或转录水平可监测特定疗法的个体治疗。根据检测水平，然后可以维持或调整(增加或减少剂量)治疗方案。在优选实施方案中，以药剂对个体的有效治疗包括以下步骤：(i)在给药药剂之前从个体中获得给药前样品；(ii)检测给药前样品中的蛋白质、mRNA或基因组DNA的水平或量；(iii)从个体中获得一个或多个给药后的样品；(iv)在给药后的样品中检测蛋白质、mRNA或基因组DNA的表达水平或活性；(v)将给药前的样品中蛋白质、mRNA或基因组DNA的表达水平或活性分别与给药后的样品中对应的蛋白质、mRNA或基因组DNA比较；以及(vi)相应地改变对个体的药剂给药。
还可以在治疗剂给药之前和之后获得个体的细胞以检测除了IL-1基因以外的基因的表达水平，以证实治疗剂未增加或减少可能有害的基因的表达。这可以例如通过使用转录谱的方法完成。因此，可以将来自体内暴露于治疗剂的细胞的mRNA和来自未暴露于治疗剂的相同类型细胞的mRNA逆转录并与含有来自多个基因的DNA的芯片杂交，由此比较在用治疗剂处理和未处理的细胞中基因的表达。
4.4心血管病症和疾病的治疗剂
IL-1(例如IL-1α、IL-1β或IL-1受体拮抗剂)的调节物或由与IL-1基因连锁不平衡的基因编码的蛋白质的调节物可以包含任何类型的化合物，包括蛋白质、肽、肽模拟物、小分子、或核酸。优选的拮抗物包括核酸(例如编码IL-1蛋白或被IL-1蛋白上调或下调的基因)、蛋白质(例如IL-1蛋白或由此上调或下调的蛋白质)或小分子(例如调节IL-1蛋白的表达或结合)。例如使用本文所述的测定法可以鉴定的优选拮抗剂包括核酸(例如单链(反义)或双链(三联体)DNA或PNA和核酶)、蛋白质(例如抗体)和用于阻止或抑制IL-1转录和/或蛋白质活性的小分子。
4.4.1.有效剂量
通过在细胞培养物或实验动物中例如用于测定LD50(50％群体致死的剂量)和Ed50(50％群体治疗有效的剂量)的标准药物方法，可以测定这些化合物的毒性和治疗功效。毒性作用和治疗作用之间的剂量比率是治疗指数，它可以表达为比率LD50/ED50。优选显示大的治疗指数的化合物。尽管可以使用显示毒性副作用的化合物，应当小心设计递送系统，其使这些化合物靶向受影响组织的部位，以便最小化对未感染细胞的潜在损伤并由此减小副作用。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于确定用于人类的剂量范围。这些化合物的剂量优选位于ED50具有很小或无毒性的循环浓度范围内。根据所用剂型和所用给药途径，剂量可以在该范围内变化。对于本发明方法中所用的任何化合物，最初从细胞培养测定中可以评估治疗有效剂量。在动物模型中可以确定剂量以获得包括如细胞培养中测定的IC50(即获得症状最大抑制一半的检测化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。该信息可以用于更准确地确定人类中的有效剂量。例如通过高效液相色谱可以测量血浆中的水平。
4.4.2制剂和用途
可以使用一种或多种生理上可接受的载体或赋形剂以常规方法配制用于本发明的组合物。因此，可以配制化合物和它们生理上可接受的盐和溶剂化物，用于通过例如注射、吸入或吹入(通过嘴或鼻)给药或口服、含服、肠胃外或直肠给药。
对于该治疗，可以将本发明化合物配制用于各种负荷的给药，包括全身的和局部的或定位给药。技术和制剂通常可以在Remmington’sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)，Meade Publishing Co.，Easton，PA.中找到。对于全身给药，优选注射，包括肌内、静脉内、腹膜内和皮下注射。对于注射，可以将本发明化合物配制在液体溶液中，优选在生理相容的缓冲液如Hank溶液或Ringer溶液中。另外，化合物可以以固体形式配制并在即将使用前再溶解或悬浮。还包括冻干形式。
对于口服给药，组合物可以采取通过常规方法用药物可接受的赋形剂制备的例如片剂或胶囊剂的形式，这些赋形剂例如为粘合剂(例如预先糊化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或湿润剂(例如十二烷基硫酸钠)。可以用本领域公知的方法包衣片剂。用于口服给药的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆或混悬剂的形式，或者它们可以作为在使用前与水或其它适当载体组构的干产品存在。通过常规方法用药用添加剂可以制备这些液体制剂，所述药用添加剂如悬浮剂(例如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性载体(例如成ationd油、油性酯、乙醇或分级的植物油)；以及防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。视情况制剂还可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。
可以将用于口服给药的制剂适当地配制以产生活性化合物的控释。对于含服给药而言，组合物可以采取以常规方法配制的片剂或锭剂的形式。对于通过吸入给药，用于本发明的化合物便利地以来自加压包装或喷雾器的气溶胶喷雾呈递的形式使用适当的推进剂输送，所述推进剂例如为二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当的气体。在加压气溶胶的情形中，可以通过提供阀门以输送计量量来确定剂量单位。可以配制用于吸入器或吹入器的例如明胶的胶囊和药筒，其包含化合物和诸如乳精或淀粉的适当粉末基质的粉末混合物。
可以被配制化合物通过注射用于肠胃外给药，例如通过单次快速静脉注射或连续输注。用于注射的制剂可以单位剂量形式存在，例如在安瓿瓶中或在多剂量容器中，并含有加入的防腐剂。组合物可以采取诸如在油性或水性载体中的混悬液、溶液或乳剂的形式，并且可以包含配制剂如混悬剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是在使用前与适当载体例如无菌不含热原的水组构的粉末形式。
化合物还可以被配制成诸如栓剂或保留灌肠剂的直肠组合物，例如包含诸如可可油或其它甘油酯的常规栓剂基质。
除了前述制剂，化合物还可以被配制成长效制剂。这些长效制剂可以通过移植(例如皮下或肌内)或通过肌内注射给药。因此，例如化合物可以用适当的聚合或疏水性物质(例如作为可接受油中的乳剂)或离子交换树脂配制、或配制成微溶衍生物，例如微溶盐。其它适当的递送系统包括微球体，其提供在延长时期的时间内局部非侵入性递送药物的可能性。该技术利用前毛细管大小的微球体，其可以经由冠状动脉导管注射到例如心脏或其它器官的任何选择部分而不导致炎症或局部缺血。给予的治疗剂从这些微球体缓慢地释放并被周围组织细胞(例如内皮细胞)吸收
还可以通过经粘膜或经皮方法全身给药。对于经粘膜或经皮给药，在制剂中使用适于被渗透的屏障的渗透剂。这些渗透剂在本领域是公知的，包括例如用于经粘膜给药胆汁盐和梭链孢酸衍生物。另外，可以使用洗涤剂以促进渗透。经粘膜给药可以通过鼻喷雾或使用栓剂。对于局部给药，本发明的寡聚体可以被配制成本领域公知的软膏、药膏、凝胶、或乳膏。可以局部使用洗液以处理损伤或炎症以加速愈合。
如果需要，组合物可以存在于包装或分配器装置之中，其可以含有一种或多种含有活性成分的单位剂量形式中。包装例如可以包括金属或塑料箔，如泡罩包装。包装或分配器装置可以附有给药说明。
4.5鉴定心血管病症和疾病的治疗剂的测定法
基于对导致或促进血管病症出现的突变的鉴定，本发明的另外特征在于例如用于鉴定血管病症治疗剂的基于细胞的或无细胞的测定法。在一个实施方案中，在测试化合物单独存在下或在测试化合物和另外的蛋白质存在下孵育在其细胞膜外表面上表达IL-1受体的细胞或由与IL-1基因连锁不平衡的基因编码的蛋白质的受体的细胞，并例如通过使用微生理仪检测测试化合物和受体之间或蛋白质(优选经标记的蛋白质)和受体之间的相互作用(McConnell et al.(1992)Science 257：1906)。通过微生理仪检测作为培养基酸化变化的受体和测试化合物或蛋白质之间的相互作用。该测定系统因此提供鉴定例如通过干扰蛋白质-受体相互作用起作用的分子拮抗剂以及例如通过激活受体起作用的分子激动剂的方法。
细胞或无细胞测定法还可以用于鉴定调节IL-1基因或与其连锁不平衡的基因的表达、调节mRNA翻译的化合物、或调节mRNA或蛋白质稳定性的化合物。因此，在一个实施方案中，将能够产生IL-1或其它蛋白质的细胞与测试化合物一起孵育，测量细胞培养基中产生的蛋白质的量，并将其与从未与测试化合物接触的细胞中产生的量比较。通过各种对照分析，例如测量一个或多个对照基因的表达，可以证实化合物相对于蛋白质的特异性。特别是，该分析可以用于测定反义核酸、核酶和三聚体化合物的功效
无细胞测定还可以用于鉴定能够与蛋白质相互作用、由此改变蛋白质活性的化合物。该化合物可以例如修饰蛋白质的结构由此影响它与受体结合的能力。在优选实施方案中，用于鉴定这些化合物的无细胞测定基本上由反应混合物组成，所述反应混合物包含在结合配体的存在或不存在条件下的蛋白质和测试化合物或测试化合物库。测试化合物可以是例如结合配体的衍生物，例如无生物活性的靶肽或小分子。
相应地，本发明的一个示例性筛选测定包括将蛋白质或其功能片段与测试化合物或测试化合物库接触并检测复合体的形成的步骤。出于检测目的，分子可以用特异的标志物来标记，测试化合物或测试化合物库用不同的标志物标记。于是在孵育步骤和洗涤步骤以后通过测定两种标记的水平可以检测测试化合物与蛋白质或其片段的相互作用。在洗涤步骤以后两种标记的存在表明了相互作用。
通过使用检测表面等离子共振(SPR)(一种光学现象)的实时BIA(生物分子相互作用分析，Pharmacia Biosensor AB)也可以鉴定分子间的相互作用。检测依赖于在生物特异性界面大分子质量浓度的变化，不需要反应物的任何标记。在一个实施方案中，测试化合物库可被固定在传感器表面，例如，其形成微流量池的一个壁。然后含有蛋白质或其功能片段的溶液连续流过传感器表面。如信号记录所示的共振角变化表明相互作用已经发生。该技术例如在Pharmacia的BIA技术手册中进一步描述
本发明另一示例性的筛选测定包括以下步骤：(a)形成反应混合物，其包括：(i)IL-1或其它蛋白质，(ii)适当的受体，以及(iii)测试化合物；和(b)检测蛋白质和受体的相互作用。与缺乏测试化合物的相互作用相比，在测试化合物存在条件下蛋白质和受体的相互作用的统计学显著变化(加强或抑制)显示可能的拮抗剂(抑制剂)。该测试的化合物可以同时接触。或者，蛋白质可以首先与测试化合物接触适当量的时间，接着将受体加入反应混合物。通过使用各种浓度的测试化合物获得的数据产生剂量反应曲线可以评估化合物的功效。此外，还可以进行对照测定以提供比较的基线。
可以通过多种技术检测蛋白质和受体之间的复合体形成。通过免疫测定，或通过色谱检测，使用例如可检测的标记蛋白质，如放射性标记、荧光标记、或酶促标记的蛋白质或受体，可以定量对复合体形成的调节
典型地，希望固定化蛋白质或受体以促进从非复合形式的一种或两种蛋白质中分离复合体以及适应测定的自动化。在任何适于包含反应物的容器中可以完成蛋白质和受体的结合。实例包括微量滴定板、试管和微型离心管。在一个实施方案中，可以提供融合蛋白质，其增加允许蛋白质与基质结合的结构域。例如，谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白质可被吸附到谷胱甘肽琼脂糖小珠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)或谷胱甘肽衍生化的微量滴定板上，其然后与受体例如35S-标记的受体和测试化合物结合，在有助于复合体形成的条件下，例如在盐和pH的生理条件下，孵育混合物，尽管稍微更严谨的条件可能更理想。孵育后，洗涤小珠以去除任何未结合的标记，将基质固定并直接测定放射性标记(例如将小珠放于闪烁体中)，或在随后将复合体解离后在上清液中测定放射性标记。备选地，复合体可以从基质上解离，通过SDS-PAGE分离，使用如在所附的实施例中所述的标准电泳技术从凝胶中定量在小珠级分中发现的蛋白质或受体的水平。其它用于固定蛋白质于基质上的技术也可以供所述测定使用。例如，利用生物素和抗生蛋白链菌素的偶联可以固定化蛋白质或受体。也可以制备转基因动物以鉴定激动剂和拮抗剂或证实候选治疗剂的安全性和功效。本发明的转基因动物可包括非人动物，其包含在适当内源启动子的控制下或在异源启动子的控制下的心血管病症致病突变。
转基因动物还可以是含有在适当启动子的控制下的转基因如报告基因或其片段的动物。这些动物可用于例如鉴定如通过调节基因表达调节IL-1蛋白质的产生的药物。获得转基因非人动物的方法在本领域是公知的。在优选实施方案中，使用例如以期望模式控制表达的顺式作用序列，将心血管病症致病突变的表达限制在特定的细胞亚群、组织或发育阶段。在本发明中，这种蛋白质的嵌合表达可能对于许多形式的谱系分析是关键性的，并且可以另外提供评估例如表达水平效果的方法，所述表达水平可能完全改变另外正常胚胎内小块组织的发育。为此，可以使用组织特异性调节序列和条件调节序列来控制在特定空间分布模式中突变的表达。此外，通过例如条件重组系统或原核转录调节序列可以提供表达的时间分布模式。遗传技术，其允许通过体内位点特异性遗传操作可以调节突变表达，对于本领域技术人员是已知的。
本发明的转基因动物在多个它们的细胞内都包括本发明的心血管病症致病突变转基因，该转基因改变“宿主细胞”的表型。在说明性的实施方案中，可以使用噬菌体P1的cre/loxP重组酶系统(Lakso etal.(1992)PNAS 89：6232-6236；Orban(1992)PNAS 89：6861-6865)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的FLP重组酶系统(O’Gorman etal.(1991)Science 251：1351-1355；PCT公开WO92/15694)来产生体内位点特异性遗传重组系统。Cre重组酶催化位于loxP序列之间的插入靶序列的位点特异性重组。loxP序列是Cre重组酶结合的34个碱基对的核苷酸重复序列并且为Cre重组酶介导的遗传重组所需。当Cre重组酶存在时，loxP序列的定向决定插入靶序列被切除或倒置(Abremski etal.(1984)J.Biol.Chem.259：1509-1514)；当loxP序列定向为正向重复时催化靶序列的切除，当loxP序列定向为反向重复时催化靶序列的倒置。
因此，靶序列的遗传重组取决于Cre重组酶的表达。重组酶的表达可以通过启动子元件调节，所述启动于受调节控制，例如组织特异性、发育阶段特异性、通过外加试剂可诱导的或可抑制的。这种调节的控制仅在重组酶表达受启动子元件介导的细胞中导致靶序列的遗传重组。因此，通过控制重组酶表达可以调节致病突变转基因的表达的激活。
将cre/loxP重组酶系统用于调节致病突变转基因的表达要求构建含有编码Cre重组酶和所述蛋白质的转基因的转基因动物。通过构建“二重”转基因动物可以提供含有Cre重组酶和心血管病症致病突变转基因的动物。提供这些动物的便利方法是使两种各自含有一种转基因的动物交配。
使用原核启动子序列可以提供类似的条件转基因，为了促进转基因的表达所述原核启动子序列要求原核蛋白质同时表达。示例启动子和相应的反式激活原核蛋白质在美国专利4,833,080中给出。
此外，通过类似基因治疗的方法可以诱导条件转基因的表达，其中将编码反式激活蛋白，例如重组酶或原核蛋白质，的基因递送到组织并使其例如以细胞类型特异性的方式表达。通过该方法，转基因可以保持沉默至成年期直至通过引入反式激活物“开启”。
在示例性实施方案中，通过将转基因导入非人动物的种系中来产生本发明的“转基因非人动物”。在不同发育阶段的胚胎靶细胞可以用来导入转基因。根据胚胎靶细胞的发育阶段使用不同方法。基于普遍良好的健康、好的胚胎产率、在胚胎中良好的原核能见度、和良好的生殖适度来选择用于实施本发明的任何动物的特定品系。另外，单倍型是重要因素。例如，当生产转基因小鼠时，经常使用诸如C57BL/6或FVB系的品系(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)。优选的品系是具有H-2b、H-2d、或H-2q单倍型的那些，如C57BL/6或DBA/1。用于实施本发明的品系本身可以是转基因的，和/或可以是敲除的(即从具有部分或完全被抑制的一个或多个基因的动物中获得)。
在一个实施方案中，将转基因构建体引入单一阶段的胚胎。合子是显微注射的最好目标。在小鼠中，雄性原核达到直径约20微米的大小，其允许1-2 p1 DNA溶液的可重复注射。将合子用作基因转移的目标具有一个主要优势，因为在大多数情形中注射的DNA将在第一次卵裂之前整合到宿主基因中(Brinster et al.(1985)PNAS 82：4438-4442)。结果，所有转基因动物细胞将携带整合的转基因。这通常也在转基因有效地输送给建立者的后代中得到反映，因为50％的生殖细胞将含有转基因。
通常，将受精的胚胎在适当培养基中孵育直至原核出现。约在此时，如下所述将包含转基因的核苷酸序列导人雌性或雄性原核。在一些物种如小鼠中，优选雄性原核。最优选在它被卵核或合子的雌性原核加工以前将外源遗传物质加至合子的雄性DNA互补体。认为卵核或雌性原核释放影响雄性DNA互补体的分子，其可能通过用组蛋白替换雄性DNA的鱼精蛋白，由此促进雌性和雄性DNA互补体的结合以形成二倍体合子。因此，优选在它受雌性原核的影响之前将外源遗传物质加入雄性DNA互补体或任何其它DNA互补体。例如，在形成雄性原核之后尽可能快地将外源遗传物质加入早期雄性原核，这时雄性原核和雌性原核很好地分离并且都位于近细胞膜。备选地，在它已经被诱导进行解凝聚以后可以将外源遗传物质加入精核。含有外源遗传物质的精子然后可以加入卵子或者可以将解凝聚的精子加入卵子，其后尽可能快地加入转基因构建体。
可以通过本领域已知的任何方法例如显微注射、电穿孔、或脂转染，实现将转基因核苷酸序列导入胚胎。在将转基因核苷酸序列引入胚胎以后，胚胎可以体外孵育不同时间，或重移植到替代宿主中，或两者都进行。体外孵育至成熟在本发明的范围内。一种常规方法是将胚胎体外孵育约1-7天(取决于物种)，然后将它们重移植到替代宿主中。
出于本发明的目的，合子基本上是二倍体细胞的形成，其能够发育成完整的生物。通常合子由含有通过融合来自一个配子或多个配子的两个单倍体核天然或人工形成的核的卵子组成。因此，配子核必须是天然相容的配子核，即产生能够进行分化和发育成功能生物体的能生存的合子的配子核。通常，优选整倍体合子。如果获得非整倍体合子，那么相对于任何一个配子起源的生物的整倍体数量，染色体的数量改变应当不超过一个。
除了类似的生物学考虑，物理考虑也决定外源遗传物质的数量(例如体积)，所述外源遗传物质可被加至合子的核或者形成合子核的一部分的遗传物质。如果未去除遗传物质，那么可以加入的外源遗传物质的量将受被吸收但无物理性破坏的量的限制。通常，插入的外源遗传物质的体积将不超过约10皮升。加入的物理影响不应该如此大以致物理上破坏合子的生存力。因为包括外源遗传物质在内的得到的合子的遗传物质必须在生物学上能够起始和保持合子的分化并发育成功能生物体，所以DNA序列的数量和种类的生物学限制将根据具体合子和外源遗传物质的功能而变化，并且对于本领域技术人员而言是显而易见的。
加入合子的转基因构建体的拷贝数目取决于加入的外源遗传物质的总量，并且将是能够使遗传转化发生的量。理论上仅需要一个拷贝；然而通常使用许多拷贝，例如1,000-20,000个拷贝的转基因构建体，以便确保一个拷贝有功能。关于本发明，通常有利的是具有多于一个功能拷贝的每个插入外源DNA序列以增强外源DNA序列的表型表达。
只要它不对细胞、核膜或其它存在的细胞或遗传结构是破坏性的，就可以使用允许加入外源遗传物质至核遗传物质中的任何技术。外源遗传物质优选通过微量注射插入核遗传物质中。细胞和细胞结构的微量注射是已知的并在本领域中被使用。
使用标准方法完成重移植。通常，将替代宿主麻醉，将胚胎插入输卵管。移植到具体宿主中的胚胎的数量将随物种变化，但是将通常类似于物种天然生产的后代数量。
可以通过任何适当方法筛选替代宿主的转基因后代的转基因的存在和/或表达。经常使用与转基因的至少一部分互补的探针，通过DNA印迹或RNA印迹分析完成筛选。可以使用利用针对由转基因编码的蛋白质的抗体的蛋白质印迹分析作为筛选转基因产物存在的备选或补充方法。典型地，从尾组织中制备DNA并通过DNA印迹分析或PCR分析转基因。或者，尽管任何组织或细胞类型可以用于该分析，但使用DNA印迹分析或PCR检验认为以最高水平表达转基因的组织或细胞的转基因的存在和表达。
用于评估转基因存在的备选或补充方法包括但不限于诸如酶和/或免疫学测定的适当的生物化学测定、针对特定标志物或酶活性的组织学染色、流式细胞仪分析等。血液的分析也可以用于检测血液中转基因产物的存在，以及评估转基因对各种类型的血细胞和其它血液成分的水平的影响。
通过将转基因动物与适当的配偶交配、或通过获自转基因动物的卵和/或精子的体外受精可以获得转基因动物的后代。当进行与配偶交配时，配偶可以是或不是转基因的和/或敲除的；当它是转基因的时，它可以包含相同或不同的转基因，或都含有。或者，配偶可以是母本品系。当使用体外受精时，可以将受精胚胎移植到替代宿主中或体外孵育，或两者都进行。使用任一方法，使用上述方法或其它适当的方法可以评估后代转基因的存在。
按照本发明产生的转基因动物将包含外源遗传物质。另外，在该实施方案中，序列将附着在转录控制元件例如启动子上，所述转录控制元件优选使得转基因产物能在特定类型的细胞中表达。
逆转录病毒感染也可以用来将转基因导入非人动物。发育的非人胚胎可以体外培养至胚泡期。在该期间，可以以卵裂球为逆转录感染的靶标(Jaenich，R.(1976)PNAS 73：1260-1264)。通过酶处理去除透明带可以获得卵裂球的有效感染(Manipulating the Mouse Embryo(小鼠胚胎操作)，Hogan eds.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，1986)。用于导入转基因的病毒载体系统典型地是携带转基因的复制缺陷的逆转录病毒(Jahner et al.(1985)PNAS 82：6927-6931；Vander Putten et al.(1985)PNAS 82：6148-6152)。通过在生产病毒的细胞单层上培养卵裂球容易或有效地获得转染(Van der Putten，上文；Stewartet al.(1987)EMBO J.6：383-388)。或者，可在后期进行感染。可将病毒或产生病毒的细胞注射到囊胚腔中(Jahner et al.(1982)Nature298：623-628)。因为整合仅在形成转基因非人动物的细胞亚群中发生，大多数建立者将是转基因的嵌合体。另外，建立者可以在基因组的不同位置包含转基因的各种逆转录病毒插入，其通常将在后代中分离。另外，还可以通过子宫内逆转录病毒感染孕中期胚胎将转基因导入种系(Jahner et al.(1982)上文)。
第三类用于转基因导入的靶细胞是胚胎干细胞(ES)。ES细胞获自体外培养并与胚胎融合的移植前的胚胎(Evans et al.(1981)Nature 292：154-156；Bradley et al.(1984)Nature 309：255-258；Gossler et al.(1986)PNAS 83：9065-9069；以及Robertson et al.(1986)Nature 322：445-448)。通过DNA转染或通过逆转录病毒介导的转导可以将转基因有效地导入ES细胞。该转化的ES细胞此后可以与来自非人类动物的胚泡结合。ES细胞此后移植居胚胎，并有助于得到的嵌合动物的种系。关于综述参见Jaenisch，R.(1988)Science 240：1468-1474。
进一步通过下列实施例来举例说明本发明，所述实施例不应当被认为是以任何方式限制性的。所有引用的参考文献的内容(包括贯穿本申请引用的文献参考、授权的专利、公开的专利申请)以此明确并入本文作为参考。除非另外说明，本发明的实施将使用本技术领域内的常规技术。这些技术在文献中被充分解释。参见，例如Molecular CloningA Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)，(第二版，Sambrook、Fritsch和Maniatis编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning(DNA克隆)卷I和II(D.N.Glover编辑，1985)；Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)(M.J.Gait编辑，1984)；美国专利4,683,195；美国专利4,683,202；以及Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)(B.D.Hames & S.J.Higgins编辑，1984)。
5.实施例
实施例1：单支冠状动脉疾病的标志物
本项研究的目的是确定患有早期形式的冠状动脉粥样硬化(即单支冠状动脉疾病)的患者是否更可能在以下基因中具有特异等位基因：IL-1A(-889标志物)、IL-1B(-511和+3954标志物)、IL-1RN(VNTR标志物)或TNFα(-308标志物)。多支疾病通常代表了该疾病的晚期阶段，其可能涉及很多因素，会使数据解释复杂化。因此，由心脏病专家评估表现出胸痛不适的患者，从分析中排除在一个以上冠状动脉中具有显著动脉粥样硬化的血管造影证据的那些患者。
患者群组：采用常规技术从股动脉或肱动脉进行血管造影。在研究的患者中，八十五(85)名通过血管造影没有明显的管腔不规则，被分类为具有血管造影术上正常的冠状动脉的对照。如果通过肉眼评估，三个心外膜冠状血管之一含有导致管腔直径50％减少的心外膜狭窄，则患者被分类为具有单支疾病。五十八(58)名患者被发现具有单支冠状动脉疾病。排除具有多支血管疾病的患者。对照和单支疾病组具有类似的平均年龄，分别是57.6±10.4岁和56.4±9.4岁。对照组中男性与女性的比例为1∶1.7，患病组中为2.6∶1。
一般方法：除非另有说明，涉及核酸技术的反应和操作按Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989)中通常描述的方法进行。聚合酶链式反应(PCR)一般按PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(PCR规程：方法和应用指南)，Academic Press，San Diego，CA(1990)中所述进行。基因分型方法一般如美国专利4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659、和5,272,057以及McDowell et al.，Arthritis &Rheumatism，38(2)：221-8(1995)中所描述。
DNA制备：采用改良的盐析方法(Nucleon IITM，Scotlab，UK)从全血提取DNA。
基因分型IL-1RN：之前已由Tarlow et al.，Human Genetics，91：403-4(1993)描述了与IL-1RN基因相关的等位基因。用于PCR的酶来自Promega(UK)，热循环仪来自MJ Research DNA Engine或Biometra。在ABI DNA合成仪中产生以下的引物：
5′CTCAGCAACACTCCTAT 3′(SEQ ID No.1)
5′TCCTGGTCTGCAGGTAA 3′(SEQ ID No.2)
在镁终浓度1.75mM的情况下进行PCR扩增，循环方案为1个循环的96℃ 1分钟；30个循环的[94℃ 1分钟、60℃ 1分钟、以及70℃1分钟]；以及1个循环的70℃ 2分钟。PCR后，不同的等位基因在溴化乙啶染色的2％琼脂糖凝胶上电泳，并在uv光下观察和鉴定。每个试验中都进行没有DNA的阴性对照。
IL-1RN基因的内含子2含有可变数量的串联重复(VNTR)区，其产生如下的五(5)个等位基因：
等位基因1含有四个重复，显示412bp的PCR产物；
等位基因2含有两个重复，显示240bp的PCR产物；
等位基因3含有三个重复，显示326bp的PCR产物；
等位基因4含有五个重复，显示498bp的PCR产物；以及
等位基因5含有六个重复，显示584bp的PCR产物。
基因分型IL-1B(-511)
diGiovine，Hum.Molec.Genet，1(6)：450(1992)描述了IL-1B的-511标志物。基于等位基因1(C)上的AvaI位点和等位基因2(T)上的Bsu36I位点鉴定IL-1B碱基-511处的单碱基变异(C/T)。以1个循环的95℃ 2分钟、35个循环的[95℃ 1分钟，53℃ 1分钟和74℃ 1分钟]和1个循环的74℃ 4分钟进行PCR。通过AvaI和Bsu36I在37℃下限制酶消化8小时以及随后的8％PAGE大小分析对PCR产物进行分析。在ABIDNA合成仪中产生以下的引物(Clark et al.，Nucl.Acids.Res.，14：7897-7914(1986)[出版错误出现在Nucleic Acids Res.，15(2)：868(1987)中]；GENBANK X04500)：
5′TGGCATTGATCTGGTTCATC 3′(-702/-682)(SEQ ID No：5)
5′GTTTAGGAATCTTCCCACTT 3′(-417/-397)(SEQ ID No：6)
结果：对于IL-1A(-889标志物)、IL-1B(+3954标志物)或TNFα(-308标志物)，在对照和患病患者之间基因中不同等位基因的频率无显著差异。但是，与对照中22％相比，IL-1RN基因中VNTR标志物的等位基因2在单支疾病患者中过度表现为41％。据估计，带有至少一个拷贝的等位基因2的个体与对等位基因2阴性的个体相比，患有单支冠状动脉疾病的可能性大2.44倍(优势比＝2.44、p＝0.003、95％置信区间＝1.35-4.43)。
此外，具有两拷贝，即IL-1RN中等位基因2纯合，的个体与对等位基因2阴性的个体相比，具有单支冠状动脉疾病的可能性高5.36倍(优势比＝5.36、p＝0.005、95％置信区间＝1.6-17.97)。
与对照中38％相比，携带一个拷贝的IL-1B基因的-511标志物的等位基因2在单支冠状动脉疾病中增加至52％。据估计具有至少一个拷贝的等位基因2的个体与对等位基因2阴性的个体相比，患有单支疾病的可能性是其1.74倍(优势比＝1.74、p＝0.1、95％置信区间＝0.86-3.52)。
这些发现表明IL-1RN基因的等位基因2为易于出现冠状动脉闭塞疾病(表现为单支狭窄)的标志。该等位基因与增加2.4至5.4倍的冠状动脉疾病风险相关，这取决于存在一个拷贝的(杂合的)还是两个拷贝的(纯合的)疾病相关等位基因。该等位基因相对于其它普通风险因子对冠状动脉疾病风险的影响显示在表1中。
此外，发现IL-1B基因的等位基因与单支冠状动脉疾病相关。该等位基因与1.74倍冠状动脉疾病增加的风险相关。
表1
风险因子     冠状动脉疾病增加的风险
    吸烟(每天1盒)     2.5
    久坐生活方式     1.9
    严重肥胖(女性)     3.3
    高血压     2.1
    高胆固醇(＞240)     2.4
    IL-1RN(VNTR)等位基因2-杂合     2.4
    IL-1RN(VNTR)等位基因2-纯合     5.4
    IL-1B(-511)等位基因2     1.74-1.92
实施例2：多支冠状动脉疾病的标志物
本项研究的目的是确定患有晚期或更弥散形式的冠状动脉粥样硬化，即多支冠状动脉疾病，的患者是否更可能在IL-1基因簇或TNFα的基因内具有特异等位基因。
患者群组：患者群组的确定如实施例1，只是通过肉眼观察，一个以上的心外膜冠状血管含有导致管腔直径＞50％减少的心外膜狭窄的患者被分类为具有多支疾病。在所研究的患者中，86名被分类为具有血管造影上正常的冠状动脉的对照，315名患者被发现具有多支冠状动脉疾病。对照和单支疾病组具有类似的年龄，分别为57.6±10.4岁和60.8±1.13岁。对照组中的男性与女性比例为1∶1∶7，患病组为3.7∶1。
一般方法：反应和方法如实施例1。
结果：对于IL-1A(-889标志物)、IL-1B(+3954标志物)、和IL-1RN(VNTR标志物)，基因中不同等位基因的频率在对照和患病患者中无显著差异。但是，与对照中的38％相比，携带IL-1B基因的-511标志物的Bsu36I等位基因(等位基因2)的一个拷贝在多支疾病患者中增加至54％。据估计具有至少一个拷贝的-511标志物的等位基因2的个体与对等位基因2阴性的个体相比，患多支冠状动脉疾病的可能性是其1.92倍(优势比+1.92、p＝0.009、95％置信区间＝1.17-3.16)。在该群体中，至少对于-511标志物而言看起来没有剂量效应。
总之，IL-1B基因的等位基因被发现与多支冠状动脉疾病相关。该等位基因与1.92倍的冠状动脉疾病增加的风险相关。
单支和多支冠状动脉疾病每种看起来都与IL-1基因簇的不同基因相联系。这可能作为真实的生物差异出现，其中IL-1RA如此调节IL-1β作用使得产生单支表型。或者，可能是这两基因实际上作为整体与冠状动脉疾病相关，并且这里所观察到的相关性是由这种特定群体表现冠状动脉疾病的方式所引起。无论哪种解释，IL-1生物学和冠状动脉疾病的强相关性都已被确认。
实施例3：白介素-1基因变体与颈动脉壁增厚的相关性
在社区动脉粥样硬化风险(ARIC)研究的参与者中研究了颈动脉内膜中层壁厚(IMT)与染色体2上白介素-1(IL-1)基因簇四个基本的双等位基因标志物(IL-1A(+4845)、IL-1B(+3954)、IL-1RN(+2018))的相关性，这些参与者为选自四个美国社区的年龄45-64岁的15,792名男性和女性群组。远侧壁厚度通过B模式超声测量，采用先验选择的用于升高的平均IMT(≥1mm)的切点分析以鉴定最高心血管疾病风险的个体。在排除了具有心血管疾病史的那些后，对252名非洲裔美国人和924名高加索人分层的随机样本进行基因分型。在非洲裔美国人中，IL-1RN(+2018)的少见等位基因(等位基因2)携带者比非携带者在调整了年龄、性别和研究中心的基本模型中更可能具有平均IMT≥1mm(16％对5％p＝0.04)。高加索人中，经调整的具有升高IMT的个体比例也高于携带IL-1RN(+2018)等位基因2的那些(9％对6％)。但是这种差异不是统计学上显著的(p＝0.10)。IL-1A(+4845)、IL-1B(+3954)或IL-1B(-511)变体与任一民族的颈动脉IMT之间没有相关性。
实施例4：IL-1基因分型与斑块形成和增加的斑块易碎性相关
IL-1受体拮抗剂基因和连锁的IL-1B(-511)基因中的多态性与冠状动脉中大(＞50％血管闭塞)斑块的存在以及颈动脉壁中早期动脉粥样硬化变化紧密相关(ARIC数据)。这些数据提示包括IL-1RN(+2018)等位基因2和/或IL-1B(-511)等位基因2的遗传多态性模式预示大的闭塞性斑块。
某些IL-1基因型与诸如血栓形成和栓塞的临床事件增加的风险相关。我们主张，位点IL-1A(+4845)和IL-1B(+3954)之一或二者中的等位基因2预期会增加炎性反应，因此增加斑块易碎性和诸如血栓形成和栓塞的临床事件的风险。这种风险在低水平胆固醇个体中最大，由于较高的水平预期会活化甚至IL-1野生型(例如，IL-1A(+4845)＝1.1，IL-1B(+3954)＝1.1)中的最大炎性反应。
我们主张与较大闭塞斑块相关的基因型即IL-1RN(+2018)等位基因2或IL-1B(-511)等位基因2会预示斑块易碎性的较低风险。
在纵向随访临床事件(ARIC)的约15,000健康个体中，记录了370血栓形成或栓塞事件。一组约900随机分层的对照被选择用于比较。
IL-1A(+4845)和IL-1B(+3954)处的等位基因2影响易碎斑块相关的临床事件：
·对于LDL＜130的病例(n＝535)
IL-1A(+4845)基因型2.2：临床事件优势比(OR+95％CI)＝3.03
(0.96-9.1)；p＝0.059
·对于总胆固醇＜200的病例(n＝425)
IL-1A(+4845)基因型2.2：OR＝6.25(1.69-20.00)；p＝0.006
IL-1B(+3954)基因型1.2或2.2：OR＝2.58(1.25-5.31)；p＝0.010
IL-1RN(+2018)处的等位基因2与易碎斑块相关临床事件反相关，因此提示对动脉粥样硬化斑块的稳定作用：
·对于所有病例(n＝1214)
IL-1RN(+2018)基因型1.2或2.2：OR＝0.65(0.43-0.96)；p＝0.031
·对于LDL＞160(n＝343)
IL-1RN(+2018)基因型1.2或2.2：OR＝0.33(0.14-0.73)；p＝0.058
·对于总胆固醇＞240(n＝307)
IL-1RN(+2018)基因型1.2或2.2：OR＝0.28(0.11-0.68)；p＝0.054
实施例5：与单倍型模式1一致的IL-1复合基因型与牙周炎相关，与 单倍型模式2一致的IL-1基因型与闭塞性心血管疾病相关
研究了牙周炎、心血管疾病和染色体2上白介素-1(IL-1)基因簇中的四个基本双等位基因标志物(IL-1A(+4845)、IL-1B(+3954)、IL-1B(-511)、和IL-1RN(+2018))的相关性。
由IL-1基因簇中四个多态性位点可以定义两种单倍型模式，如表2中所示(IL-1A(+4845)、IL-1B(+3954)、IL-1B(-511)、IL-1RN(+2018))。一种模式包括IL-1A(+4845)处和IL-1B(+3954)位点处的等位基因2。另一种模式包括IL-1B(-511)处和IL-1RN(+2018)位点处的等位基因2。
表2
单倍型 IL-1A(+4845) IL-1B(+3954) IL-1B(-511) IL-1RN(+2018)
模式1 等位基因2 等位基因2 等位基因1 等位基因1
模式2 等位基因1 等位基因1 等位基因2 等位基因2
该单倍型表明，当在一个位点发现等位基因2时，很可能在其它位点也发现它。以前的数据(Cox et al.(1998)Am.J.Hum.Genet.62：1180-1188)表明，当在IL-1A(+4845)位点发现等位基因2时，在大约80％情况下等位基因2也可存在于IL-1B(+3954)位点。单倍型模式仅与染色体的单个拷贝相关。由于有两拷贝的染色体2并且标准的基因分型方法不能鉴定在哪条染色体上发现了特定等位基因的拷贝，因此专门的统计学程序被用于从确定的基因型模式推断单倍型模式。
作为动脉粥样硬化研究(Pankow et al.(1999)The ARIC study(ARIC研究).European Atherosclerosis Society Annual Meeting(欧洲动脉粥样硬化协会年会)，摘要，#646)的一部分，在新群体中研究了这些遗传模式的分布。在该群体(N＝1,368)中，在10.2％的个体中发现了IL-1A(+4845)基因型2.2。但是，在基因型IL-1B(+3954)＝2.2(N＝95)的个体中，在71.6％的个体中发现IL-1A(+4845)基因型2.2。这表明IL-1A(+4845)处等位基因2与IL-1B(3954)处等位基因2以比考虑到这些标志物的每一个在群体中的分布时所预期的高得多的比例一起遗传。对于模式2特征性的2位点处的等位基因2而言，存在类似的数据。另外，当基因型模式1被确认时，极不可能的是，等位基因2存在于其它模式特征性的任何位点处。
这两种基因型模式还与白介素-1的功能生物学中的特定差异相关。例如，当经LPS刺激时来自在IL-1B(+3954)处具有一个或两个拷贝的等位基因2的个体的外周单核细胞产生的IL-1□的量为来自具有基因型模式IL-1B(+3954)＝1.1的个体的单核细胞的2至4倍。(DiGiovini，FS et al.(1995)Cytokine，7：606)。对于从患有严重牙周炎的个体中分离的外周血多形核白细胞，最近也报道了类似的数据(Gore，EA et al.(1998)J.Clin.Periodontal.，25：781)。此外，在IL-1□水平方面，来自具有表明模式1的复合基因型的个体的龈沟液(GCF)比来自对那些基因型阴性的个体的GCF高2至3倍(Engelbretson，SP et al.(1999)J.Periodontal.，出版中)。还有数据表明，对于模式2，IL-1RN+2018处的等位基因2与IL-1受体拮抗剂蛋白的减低的水平相关。因此，模式1基因型似乎与增加的IL-1激动剂相关，而模式2似乎与降低水平的IL-1受体拮抗剂相关。
与模式1一致的复合IL-1基因型与增加的严重成人牙周炎易感性相关(Kornman，KS et al.(1997)，上文；Gore，EA et al.(1998)，上文；McGuire，MK et al.(1999)J.Periodontal.，出版中；McDevitt，MJ et al.(1999)J.Periodontal.，出版中)。IL-1基因型对牙周炎的一方面的影响看起来是增强特异细菌复合体(包括公认的牙周病原体)的龈下水平(Socransky，SS et al.(1999)IADR年会，摘要#3600)。但是，模式1基因型不与增加的闭塞性心血管疾病风险相关。在来自Pankow和同事提供的社区动脉粥样硬化风险(ARIC)研究的数据中(参见Pankow etal.，上文)，将具有指示闭塞性心血管病症的颈动脉壁内膜中层厚度(IMT)超声测量的个体与IL-1基因多态性分层的随机对照群进行比较。IL-1A(+4845)和IL-1B(+3954)都没有显示出与高IMT风险的任何相关性。
模式2特征性的基因型最近与增加的闭塞性冠状动脉疾病易感性相关，但是不与增加的牙周炎风险相关。在关于冠状动脉疾病的报告中，具有冠状狭窄血管造影证据的患者显著地更可能是IL-1RN(+2018)位点处或IL-1B(-511)位点处等位基因2携带者(参见Francis et al.，上文)。这两个位点都是单倍型模式2特征性的。如上所述，在ARIC研究中，具有高IMT测量值的非洲裔美国人中对IL-1RN(+2018)等位基因2的携带显著高于种族上相似的对照。在具有高IMT测量值的高加索人中在IL-1RN(+2018)处携带一个拷贝等位基因显著高于对照，但是在该位点纯合的个体与对照无差异。应注意，这项研究中高加索人中对IL-1RN(+2018)处等位基因2纯合的个体的患病率显著低于在其它群体中所观察到的。
当评估患有牙周炎以及齿龈健康的个体与模式1和模式2一致的基因型模式时，患有严重成人牙周炎的个体被发现具有显著优势的与模式1一致的基因型，而具有健康牙周状况的个体具有既无模式1又无模式2主导的基因型模式。因此看起来与单倍型模式1一致的IL-1基因型与严重牙周炎和斑块易碎性病症相关，不与闭塞性心血管疾病相关，而与单倍型模式2一致的IL-1基因型与闭塞性心血管疾病相关，但不与牙周炎或斑块易碎性相关。一种可能的机制是，IL-1基因型模式1直接影响斑块易碎性；另一可能的机制是模式1直接影响牙周炎，而其可能通过作为口腔慢性炎症过程一部分而发现的牙周微生物间接影响到心血管疾病。另一种机制可能是IL-1基因型模式2直接影响心血管闭塞病症，但是对牙周炎无影响。因此可能的是，IL-1遗传多态性可影响心血管疾病和严重牙周炎，通过以相同方式直接改变两种疾病中免疫炎性反应的共同潜在机制和通过提高口腔细菌负载并随后影响心血管疾病的间接机制进行。与单倍型模式1一致的IL-1基因型可能在一部分群体中通过增大免疫炎性反应和龈下细胞负载而影响牙周炎和心血管疾病的相关性。
实施例5：Mayo诊所研究
研究设计：18至75岁的在Mayo Clinic，Rochester，Minnesota进行临床上需要的冠状动脉血管造影的患者被考虑用于这项研究。如果患者具有需要治疗的糖尿病、吸烟史＞50盒龄、在先或计划的人器官移植、怀孕、在先经皮或手术冠状动脉血管重建、活动性出血或血红蛋白低于8g/dL、在30天内接受了输血、血液动力学不稳定、人免疫缺陷病毒感染、需要透析的肾衰竭、以及胸部放射治疗史，则它们不适于包括进来。504名患者代表了＞90％的适合于这项研究的患者，它们在该期间经历了冠状动脉血管造影。
血管造影分析：采用手持测径器或视觉分析来分析冠状动脉血管造影照片，将它们分类为揭示正常冠状动脉(平滑动脉没有狭窄或狭窄≤10％)、轻微疾病(冠状动脉管腔直径减小10％至50％)、单支疾病(单个冠状动脉或其主要分支中≥50％)、双支冠状动脉疾病(两个冠状动脉中管腔直径狭窄≥50％)、以及三支疾病(三个冠状动脉中管腔直径狭窄≥50％)。分析血管造影照片时对患者风险因子和遗传分析是不知情的。
实验室分析：载脂蛋白A1、载脂蛋白B、Lp(a)和纤维蛋白原测定在COBAS MIRA系统上进行。这些测定的正常范围为载脂蛋白A1，115-190mg/dL；载脂蛋白B，70-160mg/dL；Lp(a)，2.5-7.0mg/dL；纤维蛋白原的正常范围还未被报道。测定了总血浆高半胱氨酸。
定义：如果不吸烟或不具有糖尿病的患者一级亲属在年龄≤55岁出现了冠状动脉疾病则认为存在冠状动脉疾病家族史。高血脂症定义为总胆固醇≥250mg/dL或LDL ≥150mg/dL，或者在治疗前脂值未知的患者中正接受降脂剂治疗。分别根据加拿大心脏协会和纽约州分类方案对绞痛和心力衰竭分类。
统计方法：值表达为百分比和均值+1标准差。对于优势比，将95％置信区间表示在括号中。
在确定冠状动脉疾病关联性的初步分析中，首先进行卡方检验和单因子方差分析以检验在无疾病、轻微疾病、单支疾病、双支疾病和三支疾病患者中各种常规和显现的风险因子、以及IL-1簇基因中等位基因变体的相关性。接着对冠状动脉疾病重新分类以将无疾病或轻微疾病患者与单支、双支或三支狭窄患者进行比较。具有一定程度的堵塞但是冠状狭窄＜50％的患者被认为具有轻微冠状疾病并与没有堵塞(无疾病)患者一起分组，而在单个、两个或三个冠状动脉中狭窄≥50％的患者被一起分类用于进一步的研究，因为这些患者被认为具有显著程度的冠状动脉疾狭窄。趋势精确检验被用于在具有多态性的患者群中检验趋势。
根据四分位数和三分位数以logistic回归模型拟合各种风险因子，给出报道的关于增加四分位数和三分位数水平的优势比。为了进一步分析IL-1簇基因的等位基因变体与冠状动脉疾病的相关性，以多重logistic回归模型拟合，将统计学上显著的混杂因子包括到每个模型中。所有的常规和显现的风险因子都被考虑包括进该模型中，并且该模型以分步方式拟合以获得最佳的拟合模型，其中所有的包括在该模型中的因子都是统计上显著的。此外，可能的效应修饰因素也被考虑包括进该模型中。对该多重logistic回归模型的反应是存在或不存在以上定义的显著冠状动脉狭窄。
除了分析包括在该项研究中的所有个体，还分别在≤60岁的个体和＞60岁的个体上进行了进一步的统计分析。该基于年龄的分析被认为是合理的，因为年龄已被证实是冠状动脉疾病的强风险因子，并且据信因为多因子病中的遗传影响在早期发作病例中是最明显的。另外，由于上位性可能决定遗传影响在男性和女性有不同的结果，所以基于性别的亚分析也被认为是重要的，在一些分析中男性和女性分别处理。
实施例6：Munich研究
方法
患者
本研究包括1850连续高加索患者，这些患者具有有症状的冠状动脉疾病并在Deutsches Herzzentrum München和1.Medizinische Klinikrechts der Isar der Technischen
Figure A20068005065200801
München接受了冠状支架移植。所有的患者都预订在第6月血管造影随访。所有参与这项研究的患者都给出关于介入、血管造影随访和基因型确定的书面知情同意书。本研究方案符合赫尔辛基宣言，并经伦理委员会同意。
表1.基线临床特征
                         IL-1RN 1/2或2/2    IL-1RN 1/1        P
                         (n＝896)           (n＝954)
年龄-岁                  63.4±10.0         62.6±10.0        0.11
女性-％                  22.4               19.9              0.19
动脉高血压-％            67.2               68.9              0.44
糖尿病-％                22.7               19.4              0.08
现在或以前吸烟-％        38.7               41.2              0.28
升高的总胆固醇-％        42.5               43.1              0.81
急性心肌梗塞-％          20.3               20.2              0.97
不稳定绞痛-％            27.9               27.8              0.95
之前的分流术-％          10.6               11.5              0.53
减少的左心室功能-％      31.3               27.7              0.09
患病冠状血管的数量                          0.39
-1支-％                  29.2               27.3
-2支-％                  32.9               31.9
-3支-％                  37.8               40.9
手术附近阿昔单抗治疗-％  19.8               19.6              0.93
数据为比例或均值SD
支架放置和支架后治疗的方案对本领域从业者来说是熟悉的。大多数的支架手动移植到常规的血管成形术气球上。
术后治疗由阿司匹林(100mg，每天两次，不限期地)和噻氯匹定(250mg，每天两次，持续四周)构成。支架移植后由于残留血栓或流量损害性切割导致结果不是最满意的患者接受另外的治疗，在支架插入操作中以单次快速静脉注射给予阿昔单抗并在这之后进行12小时的连续输注。给予阿昔单抗的决定由手术员判断作出。
确定IL-1RN基因型
用QIAamp Blood Kit(QIAamp血液试剂盒)(Qiagen，Hilden，Germany)和High Pure PCR Template Preparation Kit(高纯PCR模板制备试剂盒)(Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany)从200ml的外周血白细胞提取基因组DNA。
IL-1RN基因分型采用ABI Prism Sequence Detection System(ABI棱镜序列检测系统)(PE Applied Biosystems，Weiterstadt，Germany)进行。在5′核酸酶反应中使用等位基因特异的荧光探针将DNA扩增和基因型测定合并为单一测定33。外显子2中单碱基对多态性IL-1RN(+2018)为这项研究26中分型的多态性。引物和探针的核苷酸序列如下：正向引物5′GGG ATG TTA ACC AGA AGA CCT TCT ATC T 3′，反向引物5′CAA CCA CTC ACC TTC TAA ATT GAC ATT 3′，等位基因1探针5′AAC AAC CAA CTA GTT GCT GGA TAC TTG CAA 3′，等位基因2探针5′ACA ACC AAC TAG TTG CCG GAT ACT TGC 3′。等位基因1的探针被荧光染料6-羧基-荧光素(FAM)标记，等位基因2的探针被荧光染料四氯-6-羧基-荧光素(TET)在5′端标记。两探针都在它们的3′端被淬灭剂6-羧基-四甲基-若丹明(TAMRA)标记。热循环方案由40循环的95℃ 15秒变性和64℃ 1分钟的退火/延伸组成。通过采用具有新个体码的双份DNA样品重复20％患者中测定，来进行基因型确认，其中该新个体码与原始个体码无关。两种结果间为100％一致。
血管造影评估
根据改良的美国心脏病学学院/美国心脏病协会分级系统将冠状病变分类。采用7段划分基于双相血管造影定性评估左心室功能；在反差血管造影存在至少两运动功能减弱段时确立对左心室功能减弱的诊断。定量的计算机辅助血管造影分析在放置支架前不久、放置支架后立即、以及在随访时获得的血管造影照片上离线进行，采用自动的边缘检测系统CMS(Medis Medical Imaging Systems，Nuenen，TheNetherlands)。操作者未知患者的IL-1RN基因型。靶病变的相同投影被用于所有的评估的血管造影照片。最小内腔直径、内插参考直径、直径狭窄、病变长度和最大膨胀气球直径为通过这种分析系统获得的血管造影参数。即刻管腔获得(acute lumen gain)被计算为介入终止时最小管腔直径与介入前最小管腔直径的差值。晚期管腔丢失(late lumenloss)被计算为介入终止时最小管腔直径与血管造影随访时最小管腔直径的差值。丢失指数计算为晚期管腔丢失与即刻管腔获得的比例。
定义和研究终点
这项研究的主要终点是再狭窄。对再狭窄的两测量值进行评估：定义为6个月随访血管造影时50％的直径狭窄的血管造影再狭窄的发病率，和在插入一年后支架位点处存在血管造影再狭窄的情况下由于局部缺血症状或体征而需要靶血管重建(PTCA或主动脉冠状动脉分流术[CABG])。所评估的其它主要不利事件为：任何原因的死亡和心肌梗塞。所有的死亡都被认为是由于心脏原因，除非尸检证明为非心脏原因。对急性心肌梗塞的诊断是基于应用在EPISTENT试验(新病理学Q波或肌酸激酶[CK]值或其MB异构酶为上限的至少3倍)35中的标准。在支架植入操作48小时以后对CK进行系统测定。在1年随访期内一直检测临床事件。该评估基于医院再入院记录、咨询医生或电话询问患者提供的信息。对于在询问期间显示了心脏症状的那些患者，在门诊部或由咨询医生进行至少1种临床和心电图检查。
统计分析
离散变量表达为数量或百分比，并在需要时与卡方或Fisher精确检验比较。连续变量表达为均值SD，并通过未配对、双侧t检验方法或针对2组以上的方差分析进行比较。通过计算优势比和95％置信区间进行风险分析。主要分析在于比较组合的杂合和纯合IL-11RN*2等位基因携带者与纯合IL-11RN*1等位基因携带者。此外，在包括那些临床和病变相关特征的多变量logistic回归模型中评估IL-1RN基因型和再狭窄之间的相关性，对此IL-1RN*2等位基因携带者和非携带者之间的比较显示了0.30的P值。在此多变量模型中，我们检验了IL-1RN基因型与年龄之间可能的相互作用。由于遗传因素对多因子过程如再狭窄的有关贡献可能随年龄降低，因此我们对＜60岁的预先指定的患者亚组进行了另外的分析。接着，我们使用趋势检验评估了基因剂量效应，即随着0、1、或2个推定等位基因的存在逐步增加的表型反应。对P值0.05接受为统计学上显著的。
结果
患者特征
在研究群体中所观察的IL-1RN基因型在954中为1/1(51.6％)，在742中为1/2(40.1％)，在154中为2/2(8.3％)。因此，等位基因2的频率为0.28。所观察到的分布与Hardy-Weinberg平衡相符。患者的主要基线特征列在表1中，并比较了IL-1RN*2等位基因的携带者和非携带者。在IL-1RN*2等位基因携带者中存在更高频率糖尿病和减弱的左心室功能的趋势。其它的特征在2组间均匀分布。介入时血管造影和程序特征列在表2中，显示IL-1RN*2等位基因携带者和非携带者之间无显著差异。
表2.介入时血管造影和程序特征
                    IL-1RN 1/2或2/2    IL-1RN 1/1     P
                    (n＝896)           (n＝954)
靶冠状血管                             0.89
左主动脉-％         1.3                1.6
LAD-％              40.1               39.3
LCx-％              19.9               20.0
RCA-％              32.6               31.9
静脉分流移植-％     6.1                7.2
复杂病变-％         75.2               74.1           0.58
再狭窄病变-％       25.3               23.3           0.30
植入支架前
参照直径，mm        3.02±0.53         3.05±0.54     0.29
直径狭窄-％         79.1±14.9         78.7±15.7     0.57
病变长度-mm         12.1±6.9          12.1±6.6      0.98
程序数据
测量的气球直径-mm     3.2±0.5              3.2±5             0.45
最大气球压力-atm      13.9±3.3             13.8±3.2          0.20
支架植入段长度-mm     20.0±14.3            20.3±13.6         0.70
支架植入后不久
直径狭窄-％           5.2±9.1              5.4±7.6           0.47
数据为比例或均值SD
LAD表示冠状动脉左前降支；LCx，冠状动脉左旋支；RCA，右冠状动脉；根据美国心脏病学院/美国心脏病协会分级系统，将复杂病变定义为ACC/AHA病变类型B2和C。
IL-1ra多态性，植入支架后的死亡率和心肌梗塞
表3显示了IL-1RN*2等位基因的携带者和非携带者在冠状支架植入后的第一个30天内观察到的不利临床事件。IL-1RN*2等位基因的存在和死亡、心肌梗塞或靶血管重建之间没有相关性，显示在所述风险中IL-1ra基因中该多态性对冠状支架植入后早期血栓形成事件无显著影响。
表3.在最早30天期间记录的不利事件的发生率
                     IL-1RN 1/2或2/2     IL-1RN 1/1    P
                     (n＝896)            (n＝954)
死亡-          ％    0.9                 0.9           0.91
非致命心肌梗塞-％    3.3                 2.6           0.52
-Q波-          ％    1.1                 0.7           0.39
-无Q波-        ％    2.2                 1.9           0.60
靶血管重建-    ％    3.0                 2.3           0.34
1年的随访也表明IL-1RN*2等位基因的存在和介入后死亡率或心肌梗塞发病率之间没有相关性。1年的随访期间，IL-1RN 1/2和IL-1RN2/2患者的合并组中死亡率为2.8％，IL-11/1患者中为2.2％(P＝0.42)，产生1.28的优势比(95％置信区间，0.71-2.29)。IL-1RN*2等位基因携带者中非致命心肌梗塞的发病率为3.5％，在IL-1RN*1等位基因纯合携带者中为3.9％(P＝0.54)，对应的优势比为0.86(0.53-1.4)。
IL-1ra多态性和支架植入后再狭窄
在中值188天后在84％患者中进行对照血管造影(四分位数间距，171-205天)。具有对照血管造影的患者比例在通过是否存在IL-1RN*2等位基因而定义的两组中类似。表4列出了对6月血管造影照片定量评估的结果。
表4.血管造影随访结果
                   IL-1RN 1/2或2/2(n＝758)    IL-1RN 1/1(n＝798)    P
晚期管腔丢失-mm    1.160.82                   1.240.86              0.07
丢失指数           0.530.38                   0.590.45              0.009
直径狭窄-％        41.826.2                   45.228.7              0.015
再狭窄率-％        30.2                       35.6                  0.024
数据为比例或均值SD
值得注意的是，反映支架植入后增生反应的丢失指数在携带IL-1RN*2等位基因的患者中显著较低。与IL-1RN 1/1基因型患者中35.6％相比，IL-1 RN*2等位基因携带者中血管造影再狭窄的发病率也显著较低，为30.2％。因此，IL-1RN*2等位基因的存在与再狭窄率22％降低(优势比，0.78[0.63-0.97])相关。与IL-1RN*1等位基因纯合患者中22.7％(P＝0.026)相比，表现为需要靶血管重建的临床再狭窄也在IL-1RN*2等位基因携带者中显著较低，为17.7％，产生0.73的优势比(0.58-0.92)。
与IL-1RN*2等位基因的存在与否一起，年龄、性别、是否存在糖尿病、吸烟习惯、减弱的左心室功能和再狭窄病变、血管大小(所有变量在单变量分析中相差P值0.30)进入关于血管造影再狭窄的多变量模型。较高年龄(P＝0.005)、存在糖尿病(P＜0.001)、再狭窄病变(P＜0.001)和小血管大小(P＜0.001)独立地与再狭窄增加的风险相关。与此相反，IL-1RN*2等位基因的存在独立地(P＜0.001)与降低的再狭窄风险相关，调整的优势比为0.81(0.71-0.92)。另外，IL-1RN*2等位基因的存在和年龄之间存在显著相互作用(P＝0.009)，正如该等位基因在年轻患者中逐渐增加的强保护作用所反映的。
在＜60岁的预先指定的患者亚组(n＝696)中分析的结果显示在表5中。在1年的随访期间，17.1％的IL-1RN*2等位基因携带者和24.9％的纯合IL-1RN*1等位基因携带者需要靶血管重建(P＝0.013)。因此IL-1RN*2等位基因的存在与对局部缺血驱动的再介入的需要降低37％相关(优势比：0.63[0.43-0.91])。在6个月时对照研究获得的定量相关造影数据(在590或85％的＜60岁患者中进行的)显示在表5中。
表5.＜60岁患者中血管造影随访结果
                    IL-1RN 1/2或2/2(n＝273)  IL-1RN 1/1(n＝317)     P
晚期管腔丢失-mm     1.080.77                 1.270.93               0.008
丢失指数            0.490.35                 0.590.48               0.003
直径狭窄-％         39.324.1                 46.730.5               0.001
再狭窄率-％         25.6                     38.5                   ＜0.001
数据为比例或均值SD
在IL-1RN 1/2和IL-1RN 2/2的合并组中血管造影再狭窄的发病率为25.6％，而在IL-1RN 1/1患者中为38.5％(P＜0.001)，其对应于45％减少(优势比0.55[0.39-0.78])。再狭窄发病率随IL-1RN*2等位基因的杂合和纯合逐步减小。血管造影再狭窄的比例在IL-1RN 1/1患者中为38.5％，在IL-1RN 1/2患者中为26.3％，在IL-1RN 2/2患者中为22.4％(P＝0.001，趋势检验)。靶血管重建比例在IL-1RN 1/1患者中为24.9％，在IL-1RN 1/2患者中为17.9％，在IL-1RN 2/2患者中为13.2％(P＝0.01，趋势检验)。
实施例7.复合IL-1基因型与心血管疾病素因的相关性
进行了关联IL-1复合基因型与炎性介质表达以及不利心脏事件风险的研究。所鉴定的是复合基因型和它们与增加的、或者相反减小的、心血管疾病素因风险的关系。还鉴定的是种族群体中该基因型的流行率。IL-1基因簇复合基因型可用于区别在环境挑战如LDL(“坏”)胆固醇存在下个体炎性因子的表达，这样通过鉴定心脏疾病遗传风险帮助个体保持心脏健康并使得能作出个性化的健康决定(如营养和生活方式)来保持心脏健康。
从临床研究获得数据，其评估了IL-1基因簇遗传变异与生化或临床结果之间的相关性，并且数据支持了IL-1遗传变异对生物学/分子机制、疾病/临床结果相关性、以及对抗炎补加物的反应的影响，如通过生物标志物变化或疾病风险所衡量的。
表7-1提供了高加索和亚洲(这里，韩国人)群体中主要IL-1单倍型。
提供在表7-2中的数据表明具有三个不同复合基因型模式之一的个体会被分类为对炎症过度表达和CVD增加的风险的IL-1基因型“阳性”，而具有两个不同复合基因型模式之一的个体会被分类为对炎症过度表达和CVD降低的风险的IL-1基因型“阴性”。
表7-3提供了显示在表7-2中的风险模式分种族流行率。
表7-1：主要IL-1单倍型
Figure A20068005065200881
表7-2：与增加的或降低的CVD风险相关的IL-1复合基因型
Figure A20068005065200891
“*”表示对于该基因型仅需存在一个等位基因。
表7-3风险模式分种族流行率
Figure A20068005065200901
增加的炎性介质与复合基因型模式的相关性与心血管疾病增加的风险相关。
进行了DARIC(社区牙齿动脉粥样硬化风险)研究以证实在较小年龄CVD和首次心脏病发作的增加的风险与IL-1β和CRP生物标志物增加的表达之间的相关性。
复合基因型1a模式与GCF IL-1β32％的增加(p＝0.01)和血清中CRP 24％的增加(p＝0.087)相关。
复合基因型1b模式与GCF IL-1β28％的增加相关(p＝0.02)，但是与血清中CRP增加的水平不显著相关。
复合基因型1 c模式与GCF IL-1β增加的水平不显著相关，但是与血清中CRP 54％的增加相关(p＝0.01)。
另一研究产生了类似的结果，显示模式1a与血清中CRP 81％的增加相关(p＝0.0001)，模式1b与血清中增加的CRP不显著相关，模式1c与血清中CRP 32％的增加相关(p＝0.04)。
涉及IL-1基因变异和炎性介质的另外的研究描述在表7-4中。
表7-4：IL-1基因变异和炎性介质概述
介质   介质来源   疾病显露(注1)   与升高的介质水平相关的IL-1多态性 参考文献 评价
  IL-1β蛋白相关性 PBMC(注2) 无 IL-1B-511 1* Iacoviello(1)   LPS刺激的结果：1，1＝4500pg/ml1，2＝2100pg/ml2，2＝800pg/ml
无相关性 PBMC 无 IL-1B-511 2* Hall 2004(2)   由于复杂的体外设计，不清楚实际上测量的什么，所以只是注意到这篇文章，但数据没有用。
  CRP相关性 血清   冠状心脏疾病   IL-1B+3954 2*IL-1A+4845 2*   Berger2002(3)   单SNP分析，与1a和1c的复合基因型组分相反
血清 无   IL-1B-511 1*IL-1B+3954 2*   Eklund2003(4)   单SNP分析，与复合基因型相反
血清   冠状心脏疾病 IL-1B+3954 2*   Latkovskis(5)   单SNP分析，与复合基因型相反
注1.这项研究中的个体具有所列出的状况注2PMBC为外周血单核细胞
表7-4参考文献
1.Iacoviello et al.Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005；25：222-227.
2.Hall et al.Arthritis Rheum 2004；50(6)：1976-1983.
3.Berger et al.Cytokine.2002；17：171-174.
4.Eklund et al.Eur Cytokine Netw 2003 Jul-Sep；14(3)：168-171.
5.Latkovskis et al.Eur J Immunogenet 2004；31(5)：207-213.
尤其关注的是Iacoviello研究，其证实IL-1B(-511)1.1基因型与在较小年龄增加的MI风险相关(对于男性＜45岁，对于女性＜50岁(OR-2.2))。此外，IL-1B(-511)1.2基因型与在较小年龄增加的MI风险相关(对于男性＜45岁，对于女性＜50岁(OR＝1.8))。
还关注的是在Mayo诊所进行的研究，其发现患有冠状动脉疾病的个体比那些无疾病个体有更大的MI风险，患有多支疾病(MVD)的那些患者比患有单支疾病(SVD)的那些患者有更大MI风险，以及，与冠状动脉疾病的程度无关，那些在IL-1A+4845和IL-1B+3954处对CVD基因型阳性(与模式1a和1c一致)的个体与那些检验为阴性的个体相比有增加的MI风险。该Mayo研究还发现，IL-1A+4845和IL-1B+3954处CVD基因型阳性(与模式1a和1c一致)还与心导管插入术时较小年龄(小2岁)和出现典型和非典型胸痛时较小年龄(小2岁)相关。最后，这项研究发现，对CVD测试阳性(即风险模式1a，1b或1c)的患有冠状动脉疾病的个体而言，与有记录的较早心脏病发作增加的风险存在显著相关性。
也确定了CVD模式与心肌梗塞的相关性，提供在以下表7-5中。
表7-5：CVD模式1与心脏病发作的相关性
 模式1“风险”基因型   P值   优势比
 1a   0.01   4.3
 1b   0.02   4.1
 1c   0.003   7.0
实施例8.复合IL-1基因型与韩国人心血管疾病素因的相关性
进行了关联存在于韩国人中的IL-1复合基因型与炎性介质表达和不利心脏事件风险的研究。所鉴定的是新遗传标志物IL-1B(+3877)等位基因，以及包括2拷贝的IL-1B(+3877)等位基因1、1拷贝的IL-1B(-511)等位基因1和1拷贝的IL-1B(-511)等位基因2的复合基因型。表8-1显示了与CVD相关的IL-1基因型模式以及这些等位基因与其它IL-1基因簇等位基因之间的相关性
Figure A20068005065200921
(1)高加索人中的标志物包括IL-1A(+4845)等位基因2加上IL-1B(+3954)等位基因2；亚洲人(例如韩国人)中的标志物包括IL-1B(+3877)1.1。(2)IL-1B启动子中功能性单倍型标志物，包括IL-1B(-511)。
对高加索人和韩国人男性个体比较进行了研究。样本群体如下：n＝133个体，CAD+，患有MI(大部分≤55岁)；n＝169CAD+，无MI(大部分≤55岁)；以及n＝302对照。平均年龄为54岁。C反应性蛋白(CRP)测量如下。三等分分布如下：＜0.37；0.37-1.08；＞1.08mg/l。在12％群组中发现CRP＞3mg/l。
CRP水平与CVD相关基因型相关，如表8-2中所显示的。如同表8-1中所示，高加索人中的标志物包括IL-1A(+4845)等位基因2加上IL-1B(+3954)等位基因2；亚洲人(例如韩国人)中的标志物包括IL-1B(+3877)1.1。IL-1B启动子中功能性单倍型的标志物包括IL-1B(-511)。
表8-2模式 LD区1(1) LD区2(2)   高加索人表型(CVD风险)   韩国人表型(CVD风险)
 1a   +   1.1   增加的   (稀有基因型)
 1b   -   1.1
 1c   +   1.2   增加的   增加的
 1c’   -   1.2
 1d   +   1.2   (稀有基因型)   增加的
 参照   -   2.2
CVD相关基因型的相对分布提供在表8-3中。如同表8-1，高加索人中的标志物包括IL-1A(+4845)等位基因2加上IL-1B(+3954)等位基因2；亚洲人(例如韩国人)中的标志物包括IL-1B(+3877)1.1。
  表8-3模式   LD区1   LD区2   高加索人个体％   高加索人表型   韩国人个体％  韩国人表型
1a +   (-511)1.1 21   早期MI，CAD(1) 1
1b -   (-511)1.1 23.5   早期MI，CAD(1) 20 早期MI对CAD
1c +   (-511)1.2 14.5 早期MI 7  早期MI对CAD；早期MI对对照
1c’ -   (-511)1.2 30 早期MI 50 早期MI
1d +   (-511)1.2 1 10  早期MI对CAD；早期MI对对照
参照 -   (-511)2.2 10 参照组(2) 12 参照组
(1)表示在诸如oxPL的挑战存在下增加的冠状动脉疾病风险；(2)表示不存在诸如oxPL的挑战下增加的冠状动脉疾病风险。
这项研究中，将患有心肌梗塞(MI)的个体与对照个体比较。存在133 CAD+MI+和302对照；数据针对年龄、BMI和吸烟而进行调整。确定指示MI风险的基因型模式包含两拷贝的IL-1B(-511)等位基因2和两拷贝的IL-1B(+3877)等位基因1(模式1d；p＝0.01)。另一指示MI风险的基因型模式包含IL-1B(-511)等位基因1、IL-1B(-511)等位基因2和两拷贝的IL-1B(+3877)等位基因1(模式1c；p＝0.09)。
在进一步的分析中，将年龄较小(55岁或更小)的患有MI的个体与年龄较大(56岁或更高)的对照进行比较。有97个≤55岁发作的CAD+MI+个体，132对照，年龄56岁或更高。针对BMI和吸烟调整数据。确定指示MI风险的基因型模式包含两拷贝的IL-1B(-511)等位基因2和两拷贝的IL-1B(+3877)等位基因1(模式1d；p＝0.01)。另一指示MI风险的基因型模式包含IL-1B(-511)等位基因1、IL-1B(-511)等位基因2和两拷贝的IL-IB(+3877)等位基因1(模式1c；p＝0.05)。
另外，将患有MI的个体与非MI对照进行了比较。有133 MI阳性个体和169 MI阴性个体。通常，MI阴性个体年龄较大、较轻并具有更高的酒精摄入。针对年龄、BMI、吸烟和治疗血清脂质水平的药物调整了数据。确定指示MI风险的基因型模式包含两拷贝的IL-1B(-511)等位基因1和IL-1B(+3877)等位基因2(模式1b；p＝0.15)。指示MI风险的另一基因型模式包含IL-1B(-511)等位基因1、IL-1B(-511)等位基因2和两拷贝的IL-1B(+3877)等位基因1(模式1c；p＝0.02)。指示MI风险的另一基因型模式包含两拷贝的IL-1B(-511)等位基因2和两拷贝的IL-1B(+3877)等位基因1(模式1d；p＝0.02)。
在进一步的分析中，将年龄55岁或更小的患有CAD和MI的个体与患有CAD但没有MI的对照进行了比较。有77 MI+个体和79 MI-个体。MI阴性个体趋于年龄更大、更轻和具有更高的酒精摄入。针对BMI、吸烟和HDL含量调整了数据。确定指示MI风险的基因型模式含有两拷贝的IL-1B(-511)等位基因1和IL-1B(+3877)等位基因2(模式1b；p＝0.04)。指示MI风险的另一基因型模式包含IL-IB(-511)等位基因1、IL-1B(-511)等位基因2和两拷贝的IL-1B(+3877)等位基因1(模式1c；p＝0.01)。指示MI风险的另一基因型模式包括两拷贝的IL-1B(-511)等位基因2和两拷贝的IL-1B(+3877)等位基因1(模式1d；p＝0.02)。
该研究的另一方面比较了HDL水平和MI风险。有1 56名年龄55岁或更小的患有CAD的个体。确定HDL≤40mg/dl的个体中，无相关IL-1MI风险。对于HDL＞40mg/dl的个体(n＝95)，观察到以下的MI风险模式。模式1b(p＝0.05)、模式1c(p＝0.04)和模式1d(p＝0.02)。
另外，在健康对照个体中测定了CRP水平。分析了平均年龄54岁的302名个体。CRP三等分如下：＜0.37；0.37-1.08；＞1.08mg/l。发现12％的群组具有CRP水平≥3mg/l。包含两拷贝的IL-1B(+3877)等位基因1的基因型与CRP 40％的增加相关(p＝0.03)。该结果证实了IL-1B(-511)的所有基因型组合。
序列表
<110>英特利金遗传学有限公司
<120>心血管病症的诊断和疗法
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Claims (19)

1.确定个体的心血管疾病素因的方法，包括检测选自以下的模式：
a)两拷贝的IL-1B(-511)等位基因1、两拷贝的IL-1B(+3877)等位基因1、IL-1B(+3954)等位基因2、以及IL-1A(+4845)等位基因2；以及
b)两拷贝的IL-1B(-511)等位基因1、两拷贝的IL-1B(+3877)等位基因1、两拷贝的IL-1B(+3954)等位基因1、以及两拷贝的IL-1A(+4845)等位基因1，
其中所述模式的存在表明所述个体有心血管疾病倾向。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述个体具有增加的IL-1β和C反应性蛋白表达。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述个体有增加的患心肌梗塞的风险。
4.确定个体的心血管疾病素因的方法，包括检测选自以下的模式：
a)两拷贝的IL-1B(-511)等位基因1、IL-1B(+3877)等位基因2、IL-1B(+3954)等位基因2、以及两拷贝的IL-1A(+4845)等位基因1；
b)两拷贝的IL-1B(-511)等位基因1、IL-1B(+3877)等位基因2、两拷贝的IL-1B(+3954)等位基因1、以及IL-1A(+4845)等位基因2；以及
c)两拷贝的IL-1B(-511)等位基因1、IL-1B(+3877)等位基因2、两拷贝的IL-1B(+3954)等位基因1、以及两拷贝的IL-1A(+4845)等位基因1，
其中所述模式的存在表明所述个体有心血管疾病倾向。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述个体具有增强的IL-1β表达。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述个体有增加的患心肌梗塞的风险。
7.确定个体的心血管疾病素因的方法，包括检测选自以下的模式：
a)IL-1B(-511)等位基因1、IL-1B(-511)等位基因2、两拷贝的IL-1B(+3877)等位基因1、IL-1B(+3954)等位基因2、以及IL-1A(+4845)等位基因2；
b)IL-1B(-511)等位基因1、IL-1B(-511)等位基因2、两拷贝的IL-1B(+3877)等位基因1、两拷贝的IL-1B(+3954)等位基因1、以及IL-1A(+4845)等位基因2；
c)IL-1B(-511)等位基因1、IL-1B(-511)等位基因2、两拷贝的IL-1B(+3877)等位基因1、IL-1B(+3954)等位基因2、两拷贝的IL-1A(+4845)等位基因1；以及
d)IL-1B(-511)等位基因1、IL-1B(-511)等位基因2、两拷贝的IL-1B(+3877)等位基因1、两拷贝的IL-1B(+3954)等位基因1、以及两拷贝的IL-1A(+4845)等位基因1，
其中所述模式的存在表明所述个体有心血管疾病倾向。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述个体具有增强的C反应性蛋白表达。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述个体有增加的患心肌梗塞的风险。
10.确定个体的心血管疾病素因的方法，包括检测选自以下的模式：
a)IL-1B(-511)等位基因1、IL-1B(-511)等位基因2、IL-1B(+3877)等位基因2、两拷贝的IL-1B(+3954)等位基因1、以及IL-1A(+4845)等位基因2；
b)IL-1B(-511)等位基因1、IL-1B(-511)等位基因2、IL-1B(+3877)等位基因2、IL-1B(+3954)等位基因2、以及两拷贝的IL-1A(+4845)等位基因1；
c)IL-1B(-511)等位基因1、IL-1B(-511)等位基因2、IL-1B(+3877)等位基因2、两拷贝的IL-1B(+3954)等位基因1、以及两拷贝的IL-1A(+4845)等位基因1；
d)两拷贝的IL-1B(-511)等位基因2、两拷贝的IL-1B(+3877)等位基因1、IL-1B(+3954)等位基因2、以及IL-1A(+4845)等位基因2；
e)两拷贝的IL-1B(-511)等位基因2、IL-1B(+3954)等位基因2、以及两拷贝的IL-1A(+4845)等位基因1；
f)两拷贝的IL-1B(-511)等位基因2、两拷贝的IL-1B(+3954)等位基因1、以及IL-1A(+4845)等位基因2；以及
g)两拷贝的IL-1B(-511)等位基因2、两拷贝的IL-1B(+3954)等位基因1、以及两拷贝的IL-1A(+4845)等位基因1，
其中所述模式的存在表明所述个体无心血管疾病倾向。
11.确定高加索个体的心血管疾病素因的方法，包括检测IL-1A(+4845)等位基因2和IL-1B(+3954)等位基因2，其中所述等位基因的存在表明所述个体有心血管疾病倾向。
12.如权利要求11所述的方法，还包括鉴定IL-1B(+3877)等位基因1或IL-1B(-511)等位基因1。
13.确定亚洲个体心血管疾病素因的方法，包括检测两拷贝的IL-1B(+3877)等位基因1，其中所述等位基因的存在表明所述个体有心血管疾病倾向。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述个体为韩国人、中国人或日本人。
15.如权利要求13所述的方法，还包括鉴定IL-1B(-511)等位基因2。
16.确定亚洲男性个体的心血管疾病素因的方法，其中所述个体年龄为55岁或以上，包括检测IL-1B(+3877)等位基因2和两拷贝的IL-1B(-511)等位基因1，其中所述等位基因的存在表明所述个体有心血管疾病倾向。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述个体为韩国人、中国人或日本人。
18.确定韩国男性个体心血管疾病素因的方法，包括检测两拷贝的IL-1B(+3877)等位基因1和两拷贝的IL-1B(-511)等位基因2，其中所述等位基因的存在表明所述个体有心血管疾病倾向。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述个体具有增强的C反应性蛋白表达。
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