KR20040026665A

KR20040026665A - 노화 관련 증상의 조기 개시를 검출 및 치료하는 방법

Info

Publication number: KR20040026665A
Application number: KR10-2003-7016391A
Authority: KR
Inventors: 바넷캐서린; 크로스먼데빗씨; 더프고든더블유; 프란시스쉴라이; 콘만케니스에스
Original assignee: 인터레우킨 제네틱스, 인코포레이티드
Priority date: 2001-06-15
Filing date: 2002-06-17
Publication date: 2004-03-31
Also published as: US20080199865A1; CA2450809A1; US20030152947A1; CN1630730A; EP1409737A2; WO2002103031A3; AU2002320100A1; CN100424182C; JP2005500032A; EP1409737A4; WO2002103031A2

Abstract

본 발명의 일부 측면은 노화 관련 증상의 조기 개시 또는 진행에 대한 피험체의 감수성을 결정하는 방법에 관한 것이다. 일부 측면에서 본 발명은 IL-1 패턴 1, 패턴 2 및/또는 패턴 3의 대립유전자에 대해 피험체의 유전자형을 평가하는 것에 관한 것이다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 치료법을 선택하는 방법, 연령 관련 바이오마커를 확인하는 방법, 연령 관련 증상의 진행을 모니터링하는 방법 및 노화 관련 증상의 개시를 지연 또는 감소시키는 치료법을 확인하는 방법에 관한 것이다.

Description

노화 관련 증상의 조기 개시를 검출 및 치료하는 방법{METHODS FOR DETECTING AND TREATING THE EARLY ONSET OF AGING-RELATED CONDITIONS}

배경 기술

노화의 세포 및 유전 원인

노화(aging, senescence)는 체내 각종 기관 및 조직의 기능이 시간에 따라 저하되는 것이다. 모든 사람은 결국 노화의 영향을 받게되며, 노화 속도는 개체별로 많은 차이가 있다. 노화 속도가 다양한 이유는 환경적 원인과 유전 원인이 복합되기 때문이다. 인간과 동물의 생존 및 수명에 관한 연구 결과 노화 과정에 대한 강력한 유전성 성분이 입증되었다. 또한, 몇가지 공지된 유전 질환은 개체의 조기 노화를 유발한다. 예를 들어, 워너 증후군 개체는 10대에 각종 노화 증상을 나타내어, 일반적으로 30세 이전에 사망한다(Yu et al. 1996 Science 272:258; Ye et al. 1997 Am. J. Med. Genet. 68:4940).

노화는 전 유기체에서 노화 기전의 일부를 형성할 것 같은 세포와 관계가 있다. 특정 세포형에서의 기능 감소 또는 기능 이상의 결과로서 노화 관련 현상을 검토할 수 있다. 예를 들어, 노화는 아폽토시스의 가능성 증가, 추가의 세포 분열 불가, 세포 수복계의 돌연변이 및 변경된 유전자 발현(이는 각종 원인, 예컨대 성장 호르몬 또는 성 호르몬 중단 또는 반응성 산소 최종 산물과 당화 최종산물의 축적으로부터 기인함) 등의 세포 레벨에서의 임의의 변화로 인해 생길 수 있다. 따라서, 노화는 전체 유기체에 영향을 주는 과정이지만, 단세포 또는 세포 배양물 내에서 발생하는 사건은 노화 과정의 중요한 원인 인자 또는 마커일 수 있다는 증거가 늘어나고 있다.

노화 과정의 예로서 주름진 피부는 세포 사건과 관련되어 있다. 주름진 피부는 노화 개체에서 일반적인 증상이다. 주름진 피부는 피부에 대한 손상을 수복하는, 특히 피부에 대한 구조 지지체의 많은 부분을 제공하는 콜라겐 섬유에 대한 손상을 수복하는 섬유모세포와 같은 세포의 능력 감소로부터 주로 생긴다. 최근에 노화 섬유모세포의 전체 게놈을 분석한 결과, 이들 세포가 콜라겐 섬유 및 세포외 매트릭스를 생성 및 모델링하는 데 필요한 다수의 유전자 발현을 교란한다는 것이 입증되었다(Ly et al. (2000) Science 287: 2486). 유사한 세포 기전이 면역계로부터 신경학적 기능에 이르기까지 인간 생물학에 대한 노화 영향의 기초가 될 수 있다.

정상 인간 세포는 세포가 진행할 수 있는 복제의 수에 의해 정해지는 유한한 수명을 갖는다. 세포가 비분열 상태에 들어가면, 전체 유기체의 노화 관련 병리에 영향을 주는 것으로 보이는 변화를 나타낸다. 예를 들어, 피부, 뼈 및 결합 조직을 비롯한 신체의 구조 성분과 같은 조직의 항상성 리모델링에는 섬유모세포 및 골모세포와 같은 특정 세포의 복제가 필요하다. 특정 시간에 조직 중 임의의 분절에서는 일정 비율의 세포가 복제 중에 있다. 이러한 비율은 조직 내의 자극 및 생화학적 조절 과정에 따라 증가 또는 감소한다. 복제 신호에 응답할 수 있는 세포가 거의 없다면, 조직 분절에서는 재생 및 리모델링할 수 있는 능력이 손상될 것이다.예를 들어, 뼈는 처음 40∼50년간 구조 유지의 명백한 손실없이 끊임없이 리모델링되고 있다. 이것은, 뼈를 파괴하는 골파괴 활성과 뼈를 만드는 골형성 활성 간의 긴밀한 연결에 의해 발생한다. 이러한 2가지 과정이 대등하게 일어나지 못하면, 예컨대 반응하는 골형성 활성 능력이 약간 감소되면 뼈 유지 손실을 초래할 수 있다.

리모델링과 일부 방식에서 유사한 과정이 정상 상처 치유와 함께 일어난다. 조직에서 일부 손상 또는 상해가 생기면, 신체는 상처 부위에서 계획된 일련의 세포 이동, 복제 및 특정 유전자 발현을 진행하여, 그 결과 손상된 조직이 수복 및 재생된다. 이러한 과정의 주 성분은 상처 부위에서의 세포 복제이다. 복제할 수 있는 세포군이 줄어들면, 치유 부분에서의 최종 유지가 일부 손상된다.

세포가 복제할 수 없을 때에도, 세포는 조직의 조절 및 반응에 참여하는 화학물질을 발현하여 조직 기능에 관여한다. 이것은 세포의 "표현형 발현"이며, 선택적인 오케스트라 유전자 발현의 결과이다. 노화 세포는 변형된 유전자 발현 패턴을 나타내고, 따라서 조직 기능이 변경되어, 결국 신체의 기능을 변경할 가능성이 있다는 것은 이미 확립되어 있다. 정상 세포 기능의 변형은, 노화 세포가 독성 폐기물을 제거할 수 없게 되어, 종종 노화 질환의 특징이 되는 아밀로이드 및 석회화된 생성물의 축적을 초래하게 되는 이유를 설명해 준다.

적절한 성장 인자 및 세포외 매트릭스와 함께 배양물 중에서 성장되는 비형질전환된 세포는 어느 시점까지는 계속 분열하지만, 결국 배양물에서의 성장은 중단된다(Hayflick L. (1975) Fed. Proc. 34: 9-13). 이러한 현상은 이제 세포 생물학의 본질적인 부분인 것으로 보이며, 필수 미량 원소 또는 영양소의 고갈 또는 외부 손상의 축적(연대 또는 대사 시간) 보다는 반복된 세포 분열로부터 생긴다(유사 분열 시간)(Dell'Orco et al. (1973) 77: 356-60; Harley et al. (1978) J. Cell Physiol. 97: 509-16). 유사 분열 시계는 텔로머(telomere) 길이일 것이라는 가설이 있다(Harley CB (1991) Mutat. Res. 256: 271-82). 이 기전에 의해 세포가 그 분열수를 셀 수 있으므로, 이러한 기전은 계수 기전으로, 그리고 세포 노화 프로그램에 대한 신호의 일부로 볼 수 있다. 효소 텔로머라제가 결여되어 있는 형질전환되지 않은 체세포에서는, 연속적인 세포 분열 결과 텔로머 길이가 계속 짧아진다. 이러한 염색체 단축은 결국 추가의 DNA 합성을 손상시켜, 배양시 생존 말기에는 G1/S 기 정지가 일어나는 것이 특징이다. 텔로머라제의 촉매 서브유닛을 비형질전환된 세포 내로 형질감염시키면 배양물 중에서의 수명이 연장되는 것으로 확인되었다(Bodnar et al. (1998) Science 279: 349-52). 텔로머 단축은 노화 과정 중에 발생한다. 그러나, 연령에 의해 유도되는 텔로머라제 단축에 비하여 상당한 개인 편차가 존재한다. 이것이 시사하는 바는, 환경적 요인 및 유전 요인이 그 과정에서 중요한 역할을 할 가능성이 크다는 것이다.

텔로머 단축과 후속되는 복제 노화는 세포에 대한 산화성 손상의 축적을 반영할 수 있다. 연령에 따른 텔로머 단축은 산화 내성 형태의 아스코르빈산을 첨가하면 시험관 내에서 약화된다. 이 과정은 면역계의 노화에 중요한 역할을 할 수 있다. 또한, 텔로머 불안정성 증가 및 성장 가능성 감소는 유방암 또는 난소암의 가족력을 갖는 여성으로부터 얻은 난소 표면 상피세포에서의 난소암 발생과 관련이 있다. 세포 노화의 가속화로 인한 유전 이상의 축적은 악성 형질전환 및 전이에 대한 감수성 증가에 기여할 수 있다. 마지막으로, 텔로머 단축은 혈관 내피 세포의 노화와 죽상경화증 질병의 진행에 중요한 역할을 할 수 있다. 배양된 내피 세포에서, 노화 표현형의 발생 전에 텔로머라제 활성은 감소하고, 흥미롭게도 중요한 죽상보호성(atheroprotective) 인자인 질소 산화물은 내피 세포 노화와 텔로머라제 활성의 연령 의존적 억제를 유의적으로 감소시킨다(Vasa et al. (2000) Circulation Res. 87: 540-542).

세포 배양물에서 세포의 유사분열 연령은 누적 개체군 배가수(CPD)로 측정한다. 배양물에서 수명 말기에 CPD 수는 어느 정도는 세포 유형 특이적이다. 이러한 편차는 세포 배양 이전에 발생하는 분열의 수를 반영하거나, 또는 다른 세포 특이적 기전의 작용을 나타내는 것일 수 있다. 세포 노화 프로그램과 전체 유기체의 노화 간의 관계는 아직 잘 알려져 있지 않다. 노령의 개체로부터 배양된 섬유모세포에서는 CPD가 더 적지만, 그 관계는 정확하지 않다. 또한, 인간 혈관 내피 세포의 평균 텔로머 길이는 공여자의 연령이 증가할 수록 짧아지며, 동맥 판(plaque)으로부터 배양된 세포는 대표 수명이 감소된다(Chang et al. (1995) PNAS 92: 11190-11194). 일반적으로, 배양물 중에서 수명이 거의 다한 세포는 전체로서 노화 과정에 연관된 것 같은 표현형 변화를 나타내는 것으로 보인다.

IL-1 유전자 클러스터의 유전적 특징

IL-1 유전자 클러스터는 염색체 2의 긴 아암(arm) (2q13)에 있고, 430 Kb 영역 내에서 IL-1α(IL-1A), IL-1β(IL-1B), 및 IL-1 수용체 길항제 (IL-1RN)에 대한 유전자를 적어도 포함한다(Nicklim et al. (1994) Genomics, 19: 382-4). 작용제분자인 IL-1α 및 IL-1β는 여러 염증성 캐스케이드를 개시하는 유효 전구염증성(pro-inflammatory) 활성을 갖는다. 종종 IL-6 및 IL-8과 같은 다른 시토킨의 유도를 통해 일어나는 이들의 작용은 백혈구를 활성화시켜 손상된 조직으로 모으고, 혈관작용제의 국소 생성, 뇌에서의 발열 반응 및 간의 급성기 반응을 초래한다. 모두 3개의 IL-1 분자가 I형 및 II형 IL-1 수용체에 다양한 친화도로 결합하지만, I형 수용체만이 신호를 세포 내부로 도입한다. 대조적으로 II형 수용체는 세포 막으로부터 나와서 유인 수용체로서 작용한다. 따라서, 수용체 길항제 및 II형 수용체는 모두 그 작용에 있어서 항염증성이다.

IL-1 유전자 클러스터에서 유래한 일부 대립유전자는 특정 질병 상태와 관련된 것으로 이미 알려져 있다. 예를 들어, IL-1RN 대립유전자 2는 관상 동맥 질환(PCT/US/98/04725 및 USSN 08/813456), 골다공증(미국 특허 5,698,399호), 진성 당뇨병에서의 신장병증(Blakemore, et al. (1996) Hum. Genet. 97 (3): 369-74), 원형 탈모증(Cork, et al., (1995) J. Invest. Dermatol. 104 (5 Supp.): 15S-16S; Cork et al. (1996) Dermatol Clin 14: 671-8), 그레이브스병(Blakemore, et al. (1995) J. Clin. Endocrinol. 80 (1): 111-5), 전신 홍반성 루푸스(Blakemore, et al. (1994) Arthritis Rheum. 37: 1380-85), 경화 태선(Clay, et al. (1994) Hum. Genet 94: 407-10), 및 궤양성 결장염(Mansfield, et al. (1994) Gastoenterol. 106 (3): 637-42)과 관련이 있는 것으로 확인되었다.

또한, 마커 -889에서 유래한 IL-1A 대립유전자 2와 마커 +3954에서 유래한 IL-1B (TaqI) 대립유전자 2는 치주 질환과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다(미국 특허5,686,246호; Kornman and diGiovine (1998) Ann Periodont 3: 327-38; Hart and Kornman (1997) Periodontol 2000 14: 202-15; Newman (1997) Compend Contin Educ Dent 18: 881-4; Kornman et al. (1997) J. Clin Periodontol 24: 72-77). 마커 -889에서 유래한 IL-1A 대립유전자 2는 소아 만성 관절염, 특히 만성 홍채섬모체염과 연관되어 있는 것으로 밝혀졌다(McDowell, et al. (1995) Arthritis Rheum. 38: 221-28). IL-1B의 마커 +3954로부터 유래한 IL-1B (TaqI) 대립유전자 2는 DR3/4 환자의 인슐린 의존성 당뇨병 및 건선과 관련된 것으로 확인되었다(di Giovine, et al. (1995) Cytokine 7: 606; Pociot, et al. (1992) Eur J. Clin. Invest. 22: 396-402). 또한, IL-1RN (VNTR) 대립유전자 1은 당뇨 망막병증과 연관된 것으로 확인되었다(USSN 09/037472 및 PCT/GB97/02790 참조). 또한, IL-1RN (VNTR)의 대립유전자 2는 북아메리카 및 유럽의 백인종의 궤양성 결장염과 관계된 것으로 알려져 있다(Mansfield, J. et al., (1994) Gastroenterology 106: 637-42). 이러한 연관성은 인종적으로 관련된 아시케나지 유대인 군에서 특히 강하다는 것은 흥미로운 일이다(PCT W097/25445).

유전자형 스크리닝

유전 질환을 스크리닝하는 전통적인 방법은 비정상 유전자 산물(예, 겸상 적혈구 빈혈) 또는 비정상 표현형(예, 정신 지체)의 확인에 의존한다. 이들 방법은, 예컨대 조기 노화에 대한 소인과 같이 개시가 늦고 확인이 쉽지 않은 표현형을 갖는 유전 질환에 대해서는 그 유용성이 제한된다. 비용이 적게 들고 단순한 유전자 스크리닝 방법이 개발되면서, 질병이 다유전자 기원의 질병이더라도 질병을 발생하는 경향을 나타내는 다형태를 확인할 수 있다. 분자 생물학 방법으로 스크리닝할 수 있는 질병의 수는 다인성 질병의 유전 기초에 대한 이해 증가와 더불어 계속 증가되고 있다.

유전자 스크리닝(유전자 분석(genotyping) 또는 분자 스크리닝이라고도 함)이란, 환자가 질병 상태를 유발하거나 변형시키는 돌연변이(또는 대립유전자 또는 다형태)를 포함하거나, 또는 질병 상태를 유발하거나 변형시키는 돌연변이에 "연관"되어 있는 지를 결정하는 시험으로서 광범위하게 정의할 수 있다. 연관(linkage)이란 게놈 내에서 함께 근접하여 있는 DNA 서열이 같이 유전되는 경향을 갖는 현상을 말한다. 2개의 서열은 동시 유전의 일부 선택적인 장점 때문에 연관될 수 있다. 그러나, 더욱 일반적으로는 2개의 다형성 서열은, 감수 분열 재조합 사건들이 이들 2개의 다형태 사이의 영역 내에서 발생하는 일이 상대적으로 드물기 때문에 동시 유전된다. 동시 유전된 다형성 대립유전자들은 서로 연관 비평형(linkage disequilibrium)에 있다고 하는데, 그 이유는 주어진 인간 개체군에서 이들 대립유전자들은 개체군 내의 어떤 특정 구성원에서 함께 일어나거나 또는 그렇지 않으면 전혀 일어나지 않는 경향이 있기 때문이다. 실제로, 제공된 염색제 영역 중에서 복수의 다형태가 서로 연관 비평형 상태에 있는 것으로 확인된 경우, 이들을 의사-안정한 유전자 "해플로타입(haplotype)"이라고 정의한다. 대조적으로, 2개의 다형성 좌 사이에 발생하는 재조합 사건은 이들을 별도의 상동성 염색체로 분리시킬 수 있다. 2개의 물리적으로 연관된 다형태 간의 감수분열 재조합이 빈번히 일어나는 경우, 2개의 다형태는 독립적으로 격리되는 것으로 보이며, 이를연관 평형이라고 한다.

2개의 마커 사이의 감수 분열 재조합의 빈도는 일반적으로 염색체 상에서의 이들 마커의 물리적 거리에 비례하지만, 억제된 염색제 재조합 영역과 "핫 스폿(hot spots)"의 발생은 2개의 마커 사이의 물리적 거리와 재조합 거리 간에 불일치를 초래할 수 있다. 따라서, 일부 염색체 영역에서, 광범위한 염색체 도메인에 걸쳐있는 복수의 다형성 좌는 서로 연관 비평형 상태에 있을 수 있으며, 따라서, 광범위하게 걸쳐있는 유전자 해플로타입이라고 한다. 또한, 질병을 유발하는 돌연변이가 이 해플로타입 내에서 또는 이와 연관되어 발견되는 경우, 해플로타입의 하나 이상의 다형성 대립유전자는 이 병의 발병 가능성의 진단 또는 예후 지표로서 사용할 수 있다. 다른 양성 다형태와 질병을 유발하는 다형태 간의 관련은, 질병 돌연변이가 최근에 발생하여 재조합 사건을 통해 평형이 되기 위한 충분한 시간이 경과되지 않은 경우에 일어난다. 따라서, 질병 유발 돌연변이 변화에 걸쳐 있거나 또는 연관되어 있는 인간 해플로타입의 확인은, 개체가 그 질병을 유발하는 돌연변이를 유전할 가능성의 예측 척도로서 작용한다. 이러한 예후 또는 진단 절차는, 질병을 유발하는 실제 병변의 확인 및 분리 없이 이용할 수 있다는 것이 중요하다. 이것은, 특히 염증성 질환과 같은 다인성 질병의 경우에 질병 과정에 관련된 분자 결함을 정확히 결정하는 것은 어렵고 힘든 과정이므로 중요하다.

실제로, 질병과 IL-1 다형태 간의 통계적 관계가, 다형태가 직접 질병을 유발함을 나타낼 필요는 없다. 그 보다는 관련된 다형태는, 최근 인간 진화에서 발생하였던 질병 유발 돌연변이에 연관되어 있어서(즉, 연관 비평형 상태에 있는) 중재염색체 분절 내의 재조합 사건을 통해 평형을 이룰 충분한 시간이 없었던 양성 대립유전자 대립유전자일 수 있다. 따라서, 특정 질병에 대한 진단 및 예후 분석을 위해서, 다형태가 질병의 원인과 직접 관련되는 지를 고려하지 않고 그 질병과 관련된 다형태 대립유전자의 검출을 이용할 수 있다. 또한, 제공된 양성 다형태 좌가 외관상 질병 유발 다형태 좌와 연관 비평형 상태에 있는 경우, 양성 다형태 좌와 연관 비평형 상태에 있는 다른 다형태 좌는 질병 유발 다형태 좌와 연관 비평형 상태에 있을 가능성이 있다. 따라서, 이들 다른 다형태 좌는 유전된 질병 유발 다형태 좌를 갖을 가능성의 진단 또는 예후 지표가 될 것이다. 실제로, 일단 특정 질병 또는 증상과 상응하는 인간 해플로타입 간에 관계가 도출되면 광범위하게 걸쳐있는 인간 해플로타입(한 세트의 연관 다형태 마커의 대립유전자가 동시 유전되는 전형적인 패턴을 나타냄)을 진단 목적으로 표적화할 수 있다. 따라서, 원인이 되는 유전자 변형을 결정하거나 특성규명할 필요없이 하나 이상의 질병 관련 다형태 대립유전자 (또는 하나 이상의 질병 관련 해플로타입)를 특성화하여 개체가 특정 질병 증상을 발생할 가능성을 결정할 수 있다.

노화 관련 증상의 개시는 부분적으로는 유전 인자에 의해 결정되므로, 이들 유전 인자를 확인하고, 개체에서 이러한 인자를 확인하는 방법을 개발하는 것이 요망되고 있다.

개요

일반적으로, 본 발명은 일부 IL-1 유전자형이 세포 노화의 기계론적 관련 과정과 노화에 대한 유전 영향의 지표라는 관찰 결과에 관한 것이다. 일부 측면에서,본 발명은 노화 관련 증상(EOA)의 조기 개시 또는 진행에 대한 피험체의 감수성을 결정하는 방법에 관한 것이다. 일 측면에서, 본 발명의 방법은 핵산 샘플을 피험체로부터 얻는 단계, 및 패턴 1, 패턴 2 및/또는 패턴 3과 같은 IL-1 해플로타입의 하나 이상의 EOA 관련 대립유전자의 존재에 대해 시험하는 단계를 포함한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 노화 관련 증상은 손상된 결합 조직 기능, 심혈관 질환, 연령 관련 암, 비정상 면역계 기능 및 손상된 신경학적 기능을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 노화 관련 증상은 적어도 부분적으로 석회화된 산물 및 아밀로이드의 축적, 산화성 손상 또는 반응성 산소종의 생성 증가를 초래하는 증상이다. 바람직한 구체예에서, 노화 관련 증상은 부분적으로는 아폽토시스 증가, 세포 분열을 진행하는 능력 감소, 세포 수복계의 돌연변이, 목적하지 않은 부산물, 예컨대 산화성 손상 또는 당화의 부산물의 생성에 의해 유발되는 세포 양식의 변화를 비롯한 세포 노화의 결과이다. 또한, 전술한 증상 중 다수는 치명적이며, 따라서 본 발명의 방법은 더 짧아진 평균 수명을 검출하는 데 사용할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 연령 관련 증상은 골다공증, 골관절염, 연골세포 프로테오글리칸 합성 감소, 상처 치유 감소, 피부 주름, 류마티스성 관절염, 아밀로이드증, 알츠하이머병, 2형 진성 당뇨병, T 세포 증식 감소, IL-1 생성 증가, IL-1에 대한 반응성 감소, 감염에 대한 내성 감소, 해마 뉴런에서의 장기간 유효성 손상, 시냅스 유연성 감소, 기억 상실, 청력 상실, 안구 변화, 비제한적인 예로서 망막 퇴행, 우울증, 불면증, 학습력 손상, 자궁내막암, 전립선암, 난소암, 유방암, 관상 동맥 질환, 뇌혈관 질환(예, 중풍 등), 말초 동맥 질환, 죽상경화증,울혈성 심부전 및 고혈압 등이 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 내피 세포의 개체군 배가에 관련된 증상에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 패턴 1 또는 패턴 2의 IL-1 대립유전자의 존재는 내피 세포에서의 세포 분열 가능성 감소를 나타내는 지표이다. 이러한 가능성의 감소는 광범위한 증상 및 질병과 연관되어 있다. 예를 들어, 혈관형성 과정에서는 내피 세포가 세포 분열되어 새로운 혈관이 되는 관을 형성해야 한다. 혈관형성은 일정 범위의 질병 상태, 종양 전이 및 내피 세포에 의한 비정상 성장시 발생한다. 혈관형성 과정의 결과로 형성된 혈관구조는 이들 증상에서 확인되는 병리학적 손상을 뒷받침한다. 조절되지 않은 혈관형성에 의해 생긴 다양한 병리 상태를 혈관형성 의존성 질병 또는 혈관형성 관련 질병으로서 함께 분류한다.

추가의 구체예에서, 패턴 1 해플로타입의 바람직한 대립유전자로는 IL-1A (222/223) 대립유전자 3, IL-1A (gz5/gz6) 대립유전자 3, IL-1A (-889) 대립유전자 2, IL-1B/IL-1RN 유전자간 영역의 gaat.p33330 마커의 대립유전자 4, IL-1B/IL-1RN 유전자간 영역의 Y31 마커의 대립유전자 6, IL-1RN (+2018) 대립유전자 1, IL-1A (+4845) 대립유전자 2, IL-1B (-3737) 대립유전자 1, IL-1B (+3954) 대립유전자 2 및 IL-1RN (VNTR) 대립유전자 1 등이 있다.

또 다른 구체예에서, 패턴 2 해플로타입의 바람직한 대립유전자로는 IL-1A (222/223) 대립유전자 4, IL-1A (gz5/gz6) 대립유전자 4, IL-1A (-889) 대립유전자 1, IL-1B/IL-1RN 유전자간 영역의 gaat.p33330 마커의 대립유전자 3, IL-1B/IL-1RN 유전자간 영역의 Y31 마커의 대립유전자 3, IL-1RN (+2018) 대립유전자 2, IL-1A(+4845) 대립유전자 1, IL-1B (-3737) 대립유전자 1, IL-1B (+3954) 대립유전자 1 및 IL-1RN (VNTR) 대립유전자 2 등이 있다.

또 다른 구체예에서, 패턴 3 해플로타입의 바람직한 대립유전자로는 IL-1A (-889) 대립유전자 1, IL-1A (+4845) 대립유전자 1, IL-1B (-3737) 대립유전자 2, IL-1B (+3954) 대립유전자 1, IL-1RN (+2018) 대립유전자 1 및 IL-1RN (VNTR) 대립유전자 1 등이 있다.

특히 바람직한 구체예에서, 검출하고자 하는 하나 이상의 대립유전자는 IL-1RN (VNTR) 대립유전자 2, IL-1RN (+2018) 대립유전자 2, IL-1A (+4845) 대립유전자 2 및 IL-1B (+3954) 대립유전자 2로 구성된 군에서 선택된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 EOA-관련 대립유전자를 갖는 하나 이상의 피험체에서 바이오마커를 측정하는 단계, 및 EOA-관련 대립유전자를 갖지 않는 하나 이상의 피험체에서 상기 바이오마커를 측정하는 단계를 포함하는, 노화 관련 표현형을 결정하는 데 유용한 바이오마커를 확인하는 방법을 제공한다. EOA-관련 대립유전자를 함유하는 피험체와 함유하지 않는 피험체 간의 실질적인 차이를 나타내는 바이오마커는 EOA-관련 사건을 모니터링 및 예측하는 데 유용한 바이오마커이다. 또 다른 구체예에서, EOA-관련 대립유전자를 갖거나 갖지 않는 세포 배양물 중에서 바이오마커를 측정하여 바이오마커를 확인할 수 있다.

추가의 측면에서, 본 발명은 노화 관련 증상의 조기 개시를 예방하거나 줄일 것 같은 시험 물질을 확인하기 위한 시험 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 패턴 1 또는 패턴 2 해플로타입의 하나 이상의 대립유전자로 구성된DNA를 포함하는 세포를 시험 물질과 접촉시키는 단계; 및 상기 피험체 중에서 하나 이상의 바이오마커를 관찰하는 단계를 포함하며, 노화 관련 표현형에서 비노화 관련 표현형으로의 바이오마커 변화로 노화 관련 질병 및 증상의 조기 개시를 예방하거나 줄일 것 같은 시험 물질을 확인한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 피험체의 노화 관련 증상의 조기 개시를 예방하거나 또는 줄일 것 같은 유전자를 확인하기 위해서 유전자를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이 방법은 시험 유전자가 세포 중 하나 이상으로 도입되는 조건 하에서 패턴 1 또는 패턴 2 해플로타입의 하나 이상의 대립유전자로 구성된 DNA를 함유하는 세포를 시험 유전자와 접촉시키는 단계; 및 상기 피험체 중에서 하나 이상의 바이오마커를 관찰하는 단계를 포함하며, 노화 관련 표현형에서 비노화 관련 표현형으로의 바이오마커 변화로 노화 관련 질병 및 증상의 조기 개시를 예방하거나 줄일 것 같은 시험 유전자를 확인한다.

추가의 측면에서, 본 발명은 노화 관련 증상의 조기 개시를 예방하거나 또는 줄이는 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 피험체를 상기 개시된 방법에 따라 확인된 물질 또는 유전자와 접촉시킨다. 추가의 측면에서, 본 발명은 배양된 세포의 노화를 예방하거나 줄이는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 피험체의 노화 관련 증상의 시기를 결정하는 방법을 제공한다. 이 방법은 상기 개시된 방법에 따라 확인된 하나 이상의 바이오마커를 관찰하는 단계와 바이오마커가 노화 관련 표현형을 나타내는 정도를 결정하는 단계를 포함한다. 바이오마커가 노화 관련 표현형을 나타내는 정도가 클 수록,노화 관련 증상의 시기가 더 진행된 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 연령에 의해 분류되는, 특정 IL-1 대립유전자를 보유하는 피험체의 비율을 도시한다.

도 2는 IL-1ra 유전자형(VNTR 다형태)의 함수로서 인간 제대 혈관 내피 세포(HUVEC) 개체군 배가를 도시하는 그래프이다.

도 3은 IL-1ra (VNTR) 1.1 유전자형을 갖는 세포 대 1.2 또는 2.2 유전자형을 갖는 세포에서의 HUVEC 개체군 배가를 도시하는 그래프이다. 누적 개체군 배가 감소는 p=0.047에서 유의적이다.

도 4는 IL-1A에 대한 핵산 서열을 도시한다(GEN X03833; 서열 번호 1).

도 5는 IL-1B에 대한 핵산 서열을 도시한다(GEN X04500; 서열 번호 2).

도 6은 분비된 IL-1RN에 대한 핵산 서열을 도시한다(GEN X64532; 서열 번호 3).

도 7은 세포내 IL-1RN에 대한 핵산 서열을 도시한다(GEN X77090; 서열 번호 4).

도 8은 연령 및 십분위수 연령에 의한 IL-1 유전자형의 분포를 도시한다.

상세한 설명

인터루킨-1 및 노화

본 발명은 개체의 IL-1 유전자형이 유전 측면 및 세포 측면의 개체 노화에 영향을 준다는 발견을 부분적으로 토대로 한 것이다. 예를 들어, IL-1 대립유전자는 노화 관련 증상의 조기 개시와 관련이 있다. 또한, IL-1 대립유전자는 배양된 세포의 조기 노화와 관련이 있다.

인터루킨-1 발현 및 활성이 전체 유기체에서 그리고 분리된 세포 배양물 중에서 노화와 관련되어 있다는 것이 입증되었다. 그러나, 노화와 IL-1 간의 관계는 복잡하며, 세포 유형과 조직이 다르면 그 효과도 다양하다. 일반적으로 노화 조직에서 IL-1 생성이 증가하는 것으로 생각된다. 예를 들어, IL-1β의 뇨중 농도는 연령이 많은 개체에서 유의적으로 증가하는 데, 이는 혈류 중 IL-1β농도가 더 높다는 것을 나타낸다(Liao et al. (1993) Gerontology 39: 19-27). 그러나, 일부 조직에서 IL-1 생성 저하는 노화와 관련이 있으며, 다른 노화 관련 증상을 초래할 수 있다. IL-1은 여러 노화 관련 증상, 비제한적인 예로서 손상된 결합 조직 기능, 심혈관 질환, 연령 관련 암, 비정상 면역계 기능 및 손상된 신경학적 기능에 영향을 미치는 것으로 생각된다. IL-1은 적어도 부분적으로 석회화된 생성물 및 아밀로이드의 축적, 산화성 손상 또는 반응성 산소 종의 생성 증가로부터 생기는 증상에 영향을 주는 것으로 생각된다. 일부 측면에서, 본 발명의 방법은 임의의 이들 증상을 조기에 개시할 가능성을 에측하는 데 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명은 일부 IL-1 유전자형을 갖는 피험체군이 평균적으로 다수의 연령 관련 질환의 조기 개시를 경험하며, 일부 경우에는 연령 관련 질환의 더욱 급속한 진행을 경험할 것이라는 관찰 결과에 관한 것이다. 다른 측면에서, 피험체의 IL-1 유전자형은 예방적 치료 또는 적극적 또는 조기 치료를 위한 후보 피험체를 확인하는 데 사용될 수 있다.

심혈관 질환

심혈관 질환은 여러 증상을 포함하며, 이중 다수의 증상은 죽상경화증의 진행으로부터 생긴다. 노화는 심혈관 질환, 특히 허혈성 심장 질환에 대한 중요한 위험 인자이다. 40∼80세에서는 허혈성 심장 질환으로 사망할 위험성이 100배 높아진다(1996. Mortality Statistic for England and Wales. The Stationary Office, Series DH2 number 23, ISBN 0 11 621025 7). 일반적으로, 죽상경화증의 증가된 병변으로 덮여진 주요 혈관 면적이 연령에 따라 증가한다(White et al. (1950) Circulation 1: 645; Strong et al. (1976) Atherosclerosis 23: 451-76). 또한, 조기 노화 증후군은 죽상경화증과 관련이 있다.

세포 노화는 노화 과정과 심혈관 질환 간의 중추적 연결점일 수 있다. 광범위하게 받아들여지고 있는 한 가설에 따르면, 죽상경화증은 혈관 내피에 대한 손상으로부터 생기는 것으로 생각된다. 이러한 손상에 대한 치유 반응에서 혈관 내피 세포는 세포 분열을 진행한다. 그 결과 세포 교체(turnover)가 일어나고, 이는 내피 세포의 유한 유사분열 수명을 혹사시킬 수 있으며, 따라서 비정상적으로 기능하는 노화 내피 세포가 형성되어 혈관형성이 일어나기 쉽게 된다. 시험관 내에서 내피 세포는 섬유모세포보다 짧은 유한 수명을 갖는다. 이 과정에서, 노화 마커가 누적된다(Maciag et al. (1981). J. Cell Biol. 91: 420-6; Thornton et al. (1983) Science 223: 623-5). 대부분의 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)는 성장 휴지기 상태로 들어가기 보다는 아폽토시스로 죽는다. 생체내에서, 내피는 느린 속도로 교체되지만(Schwartz et al. (1973) Lab. Invest. 28: 699-707), 혈관 분지점과 같이가장 죽종이 발생할 것 같은 부위에서는 교체 속도가 더 높다(Payling et al. (1968) Nature 220: 78-9). 내피 세포 교체는 심혈관 질환에 대한 공지된 최대 위험 인자 중 여러 가지 인자와 연관 또는 관련되어 있다. 죽상경화증의 고 지방 식이 동물 모델에서의 제1 검출가능한 사건은 내피 세포 교체 증가이다(Walker et al. (1986) Am. J. Pathol. 125: 450-9). 내피 세포 교체 증가는 고혈압 동물 모델에서의 조기 사건이며, 흡연과 관련되어 있다(Owens et al. (1985) Circ. Res. 57: 695-705; Pittilo et al. (1982) Thromb. Haemost. 48: 173-176). 또한, 이들 위험 인자는 부가적인데, 이는 위험 인자들이 세포 교체와 같은 공통 기전을 공유할 수 있다는 것을 시사한다.

텔로머 길이를 세포 유사분열 연령의 마커로서 받아들이는 것이 보편화되고 있다. 텔로머 길이 측정은 세포 노화가 심혈관 질환의 중요한 과정이라는 가설을 뒷받침한다. 텔로머 제한 단편(TLF) 길이는 배양된 내피 세포에서 세포 분열에 따라 감소하며, TLF 길이는 죽상경화증 발생을 특징으로 하는 혈관에서 더 빨리 짧아진다(Chang et al. (1995) PNAS USA 92: 11190-94). 혈관 내피 세포를 텔로머라제로 형질감염시켜 이러한 과정을 역전시킬 수 있다(Bodnar et al. (1998) Science 279: 349-52).

또한, 염증은 일반적으로 죽상경화증의 발병 과정의 중요한 성분으로서 간주된다(Munro, Lab Invest., 58: 249-261 (1988); Badimon, et al., Circulation, 87: 3-16 (1993); Liuzzo, et al., N. E. J. M., 331 (7): 417-24 (1994); Alexander, N. E. J. M., 331 (7): 468-9 (1994)). 혈관에 채워져 있는 내피 세포에 대한 손상은 염증성 시토킨, 예컨대 IL-1, TNFα의 축적과, 프로스타글란딘 I2(PGI2), 혈소판 유래의 성장 인자(PDGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF) 및 과립구 단핵구 세포 자극 인자(GM-CSF)와 같은 성장 인자 및 프로스타노이드의 방출을 초래한다. 이들 인자는 혈관 벽에 축적되는 단핵구와 같은 염증성 세포의 축적 및 조절을 유도한다. 그 다음 단핵구는 추가의 염증성 매개인자, 예컨대 IL-1, TNFα, 프로스타글란딘 E2(PGE2), bFGF 및 트랜스포밍 성장 인자 α 및 β(TFG α, TGF β)를 방출한다. 이들 염증성 매개인자 전부는 더 많은 염증성 세포를 손상된 부위로 불러들여, 내피 및 평활 근 세포의 거동을 조절하고, 죽상판의 축적을 초래한다. IL-1 유전자형 패턴 1, 2 및 3은 모두 혈관 성형술 후에 재협착을 비롯한 상이한 측면의 심혈관 질환에 대한 소인과 관련되어 있다(미국 특허 6,210,877호; 1999년 5월 26일에 출원된 미국 특허 출원 09/320395호 및 1999년 11월 11일에 출원한 미국 특허 출원 09/431352호).

IL-1β를 비롯한 몇가지 염증성 생성물이 죽상경화증 병변 또는 병에 걸린 관상 동맥의 내피에서 확인된 바 있다(Galea, et al., Ath. Thromb. Vasc. Biol., 16: 1000-6 (1996)). IL-1β의 혈청 농도는 관상 동맥 질환 환자에서 상승되는 것으로 밝혀졌다(Hasdai, et al., Heart, 76: 24-8 (1996)). 과거로부터 염증성 제제의 존재는 손상 또는 단핵구 활성화에 대한 반응인 것으로 믿어왔지만, 비정상 염증 반응은 관상 동맥 질환의 원인이거나 또는 질병에 대한 감수성 증가를 형성할 가능성도 있다.

또한, IL-1은 세포 노화에 대한 영향을 통해 심혈관 질환에 영향을 줄 수 있다. 배양물 중에 노화된 내피는 IL-1α mRNA를 축적하는 것으로 입증되었으며, IL-1α에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 배양물 중 내피 세포 수명을 연장시킬 수 있는 것으로 확인되었다(Maier et al. (1990) Science 249: 1570-4). 이러한 효과는 배양물마다 다르지만, 여전히 IL-1과의 효과를 강력하게 제시하는 것이다(Garfinkel et al. (1994) PNAS 91: 1559-63). 또한, IL-1α가 내피 세포에 대한 성장을 억제하며, G1기에서의 성장을 차단하는 것은 잘 알려진 사실이다(Cozzolino et al. (1990) PNAS 87: 6487-91). 본 발명자들 자체의 그룹에서 입수한 미공개된 연구 결과 배양물 중에서 HUVEC의 연령이 높아짐에 따라 IL-1β와 다소 적은 범위로 IL-1α 합성이 증가되는 것으로 밝혀졌다.

신경학 기능

IL-1β의 뉴런 발현 증가는 연령 관련 신경변성의 특징이다(Campbell et al. (1998) Neurobiol. Aging 19: 575-9 ; Murray et al. (1999) Gerontology 45: 136-42). 알츠하미어병 환자의 CNS에서는 IL-1 발현이 상당히 증가된다(Griffin et al. (1989) PNAS 86 : 7611-15). 또한, IL-1은 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 발현을 증가시켜, 알츠하미어병의 특징을 나타내고, 아마도 이 병을 유발하는 것으로 생각되는 플라크를 형성한다. Kolsch 등[(2001) Ann Neurol 25: 29-41]은 IL-1A (-889) 대립유전자 2에 대해 동종접합성인 피험체가 하나 이상의 IL-1A (-889) 대립유전자 1(본 명세서에 개시된 패턴 1 관련과 일치함)을 갖는 개체군과 비교하여, 개체군 레벨에서 알츠하이머병을 더욱 급속하게 발생한다는 것을 발견함으로써 이를 입증하였다. 재조합 IL-1β는 마우스 해마의 이끼 섬유 CA3 경로에서의 장기간유효화를 억제한다(Katsuki et al. (1990) Eur. J. Pharmacol. 181: 323-6). 기억 형성은 해마의 뉴런에서 LTP에 의해 매개되는 것으로 생각된다. 따라서, IL-1β레벨이 상승하면 기억력이 손상될 수 있다(Lynch MA (1998) Prog. Neurobiol. 56: 571-89). 또한, 일반적으로 뉴런 기능은 세포막을 통한 플럭스의 정확한 제어에 따라 좌우된다. IL-1은 지질을 산화시키고 막 유동성을 감소시킬 수 있는 활성 산소종의 생성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 방식으로, IL-1은 광범위한 뉴런 활성을 손상 또는 불균형화할 수 있다(Lynch MA (1998) Prog. Neurobiol. 56: 571-89; Murray et al. (1997) Gerontology 45: 136-42). 또한 IL-1은 시상하부-뇌하수체 축에 의해 여러가지 스트레스 호르몬의 생성을 자극하는 작용을 한다. 이들 스트레스 호르몬은 ACTH 및 코르티코스테론을 포함한다. 노화 래트에서 IL-1에 의해 이들 호르몬 조절이 둔해지지만, 장기간 동안 스트레스 호르몬이 생성된다. 이러한 변경된 스트레스 호르몬 생성은 노화 관련 우울증, 기억 상실 및 기타 질병에서 중요한 역할을 할 수 있다(Scapagnini U (1992) Psychoneuroendocrinology 17: 411-420).

결합 조직 기능

결합 조직은 뼈, 피부, 연골, 힘줄, 근육 및 인대를 포함한다. 이들 조직 중 다수는 구성 및 파괴의 균형도에 따라서 동적 상태로 존재한다. 뼈에서, 파괴는 파골세포가 매개한다. 파골세포 증식은 IL-1에 의해 자극된다(Mundy et al. (1974) N. Engl. J. Med. 290: 867-70). 또한, 일부 IL-1 유전자형은 골다공증의 가능성 증가와 연관되어 있다(미국 특허 5,698,399호). 근육 조직이 스트레스 하에 놓이면, 염증 활성 병소를 형성하여, IL-1β가 생성된다. 운동이 유도하는 스트레스 후의 근육에서는 IL-1β가 축적되어, 근육 단백질의 분해를 초래할 수 있다(Cannon et al. (1991) Am. J. Physiol. 260: R1214-19 ; Fielding et al. (1993) Am. J. Physiol. 265: R166-72). 운동이 젊은 사람보다 나이든 사람에서 더 많은 근육 단백질 교체를 유발하는 것은 분명하다(Fielding et al. (1997) Int. J. Sports Med. 18: S22-27).

골관절염 및 류마티스성 관절염은 중간 연령 또는 노령의 개체에서 주로 발생한다. 이들 질병은 관절의 만성 염증과 연골의 파괴로부터 생긴다. 연골은 프로테오글리칸으로 구성되어 있다. IL-1은 프로테오글리칸 분해를 자극하고 프로테오글리칸 합성을 억제한다(van Beuningen et al. (1991) Arthritis and Rheumatism 34: 606-615). 따라서, 노령 개체의 IL-1 레벨 증가는 연골 파괴를 더욱 증가시킬 수 있다.

노령 개체 및 젊은 개체로부터 얻은 섬유모세포의 마이크로어레이 분석은, 콜라겐과 결합 조직 형성에 관여하는 유전자 발현이 변경되었다는 것을 밝혀내었다. 또한, (부분적으로는 IL-1에 의해 매개되는) 염증 반응에 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자가 증가되었다(Marx (2000) Science 5462: 2390; Ly et al. (2000) Science 287: 2486-92).

IL-6은 노령의 개체에서 증가된다. IL-6은 뼈 흡수를 촉진하고 골다공증과 관련된 것으로 알려져 있다. IL-6 생성은 NF-κB 전사 인자를 통해 작용하는 IL-1에 의해 자극될 수 있다. IL-1은 또한 아직은 알려지지 않은 다른 경로를 통해서IL-6 생성을 촉진할 수 있다(Ershler et al. (2000) Annu. Rev. Med. 51: 245-70). IL-6 증가는 부분적으로 허약, 빈혈, 혈소판증가증 및 치매의 원인일 수 있다.

연령 관련 암

다수의 암들이 연령과 강하게 관련되어 있다(Newell et al. (1989) Semin. Oncol. 16: 3-9; Miller (1991) Cancer 68: 2496-2501). 실제로, 대부분의 중요한 암의 발병은 연령에 따라, 대략 연령의 4제곱으로서 급격하게 증가한다(Miller (1991) Cancer 11: 2496-2501). 이러한 연령 관계는 부분적으로는, 과도한 증식을 막는 정상 세포 상호작용의 변동 및 면역 기능을 감소시킴으로써 유발될 수 있다. IL-1α 생성은 연령 관련 자궁내막암에서 역할을 할 수 있다. 자궁내막 간질 섬유모세포(ESF)는 자궁내막암의 고착 독립성 증식을 정상적으로 억제하지만, 노령 개체로부터 얻은 ESF는 실제로 암세포 증식을 촉진한다. 노령의 ESF는 IL-1α의 레벨을 증가시키고, IL-1 경로를 길항하면 젊은이와 관련이 있는 항암 표현형이 회복된다. 유방암 및 전립선암은 연령과 강한 관련이 있으며, 간질 세포와 유사한 상호작용에 의해 영향을 받는다(Rinehart et al. (1999) Exp. Cell Res. 248: 599-607). 연령과 일치하여 현저하게 증가되는 다른 암으로는 결장, 식도, 위, 직장, 췌장의 암 및 비-흑색종 피부암 등이 있다.

면역계 기능

노화된 인간 및 동물이 각종 면역 기능, 특히 T 세포 매개 기능의 손상을 나타내는 것은 잘 알려져 있다. 표피에서의 면역 기능은 대부분 랑게르한스 세포(표피의 주요 항원 제시 세포) 및 각질세포(IL-1을 비롯한 시토킨 생산자)에 의해 매개된다. 이들 세포 중에서 IL-1 생성은 마우스의 연령에 따라 감소하는 데, 이것이 시사하는 바는 표피의 면역 기능이 손상될 수 있다는 것이다(Sauder et al. (1989) Immunol. Lett. 20: 111-4). 노화된 마우스는 헬퍼 T 세포에 의한 IL-2의 생성 감소를 나타낸다. 이것은 노령 마우스에서 헬퍼 T 세포 매개 면역 기능의 손상에 기인하는 것으로 생각된다. 이러한 감소는 부분적으로 노령 마우스로부터 얻은 대식세포가 자극시 충분량의 IL-1을 생성하는 능력이 없기 때문에 생기는 것일 수 있다(Bruley-Rosset et al. (1984) Mech. Aging and Develop. 24: 247-64; Inamizu et al. (1985) Immunology 55: 447-55).

아밀로이드 및 석회화

노화 개체의 여러가지 질병은 아밀로이드판 또는 석회화 조직의 축적으로부터 생긴다. IL-1은 이들 증상에 영향을 미치는 것으로 생각된다. 알츠하이머병은 부분적으로 아밀로이드판의 축적에 의해 유발되는 것으로 생각된다. 이들 판은 아밀로이드 단백질을 포함하여, 그 자체가 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 단백분해 부산물이다. IL-1은 APP의 생성을 촉진한다(Blume et al. (1989) Neurobiol. Aging 10: 406-8). 알츠하이머병에 관한 다른 정보에 대해서는 Neurological Disorders 참조.

활성 산소종

산화적 손상은 여러가지 노화 관련 증상의 원인으로서 연루되어 있다. 반응성 산소종(ROS)은 단백질, 지질 및 핵산을 손상시켜 돌연변이의 축적 뿐 아니라 손상된 세포 성분을 유도할 수 있으며, 이들 중 임의의 것은 노화 과정에 기여할 수있다. IL-1은 반응성 산소종의 생성을 초래하는 염증 과정을 촉진하는 것으로 알려져있다. 대식세포 및 호중구와 같은 면역 세포는 전문화된 효소계, 예컨대 슈퍼옥시드를 형성하는 NADPH 옥시다제 형태를 생산한다. 따라서, IL-1 활성은 부분적으로 반응성 산소종의 생성 증가를 유발하여 노화를 촉진할 수 있다.

세포 레벨에서, ROS는 각종 외인성 및 내인성 계에 의해 생산 및 소비된다. 1차 내인성 공급원으로는 미토콘드리아, 퍼옥시좀, 리폭시게나제, NADPH 옥시다제 및 시토크롬 P450 등이 있다. 1차 외인성 공급원은 자외선, 이온화 방사선, 화학요법, 환경 독소 및 면역계 활성 등이 있다. 항산화성 방지제로는 카탈라제, 슈퍼옥시드 디스뮤타제, 글루타티온 퍼옥시다제, 글루타티온, 비타민(예, A, C 및 E) 등이 있다. ERK, JNK, p38 MAPK, PI(3)K/AKT, NF-kB, p53 및 열 충격 반응을 비롯하여, ROS에 의해 각종 시그널 경로가 영향을 받는다. 일반적으로, ERK, PI (3) K/AKT, NF-kB 및 열 충격 반응은 산화성 스트레스 하에서의 생존에 기여하는 반면, JNK, p38 MAPK, 및 p53은 일반적으로 아폽토시스와 연관되어 있다.

세포 효과

상기 개시된 노화에 대한 생체내 IL-1 영향 외에, IL-1은 배양물 중의 세포 노화에 영향을 미친다. 배양된 세포의 노화에 대한 IL-1의 영향은 생체내 세포에 대한 IL-1의 효과를 반영하며, 생체내 노화 과정에 대한 IL-1 매개된 효과 대부분 또는 전부의 기초가 될 수 있다. IL-1α 및 IL-1 α-유도성 유전자의 발현은 연령에 따라 증가한다. 노화 인간 내피 세포는 IL-1α를 증가된 레벨로 발현하며, IL-1α의 핵 정위는 손상된 세포 성장과 관계가 있다. IL-1은, 칼슘 불감성 단백질 키나제 C 이소타입을 억제하는 것으로 밝혀진 에테르 결합된 디글리세라이드 종(알킬, 아실 및 알케닐과 아실글리세롤)의 생성을 자극한다. 이들 PKC 이소타입은 유사분열 활성에 연관되어 있으므로, IL-1 자극된 디글리세라이드 생성을 통해 이들 이소타입을 억제하면 세포 성장 정지에 역할을 할 수 있다.

또한, 세포 노화는 조기 아폽토시스로부터 기인한 것일 수 있다. 아폽토시스는 계획된 세포 사멸로서, 일부 경우에 NF-kB 전사 인자에 의해 촉진된다. NF-kB는 IL-1 활성에 의해 자극되므로, IL-1 활성은 일부 환경에서 아폽토시스를 촉진할 수 있다. 이것은 IL-1 활성이 세포 노화에 영향을 미치는 또 다른 기전을 나타낼 수 있다.

또한, 전술한 바와 같이, IL-1은 텔로머 유지 및 세포 수명에 영향을 미친다. IL-1 시그널링은 모르탈린(mortalin)에 대한 효과를 통해 텔로머 유지에 영향을 미칠 수 있다. IL-1 1형 수용체(IL-1RI)는, 세포 사망(mortal) 표현형과 연관되어 있는 HSP70과의 구성원인 모르탈린과 세포내 연관되어 있다. 시토졸 모르탈린은 세포 텔로머 유지 기전의 억제와 연관되어 있다. 이러한 관계의 기능적 연루는 명백하지 않지만, IL-1RI와 모르탈린 간의 관계는 IL-1이 복제 노화에 역할을 할 수 있는 경로 중 하나일 수 있다.

이들 연구 및 기타 연구 결과는, IL-1 좌의 유전자가 노화 유기체에서 복합 발현 패턴 및 영향을 나타냄을 시사한다. 이들 인자는 몇가지 별도의 기전을 통해 상이한 조직에서의 노화 과정에 영향을 미치는 것 같다.

혈관형성

IL-1은 혈관형성에서 역할을 할 것으로 예상된다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 일부 IL-1 대립유전자의 존재는 내피 세포의 세포 분열 가능성의 감소를 나타내는 지표이다. 이러한 가능성 감소는 광범위한 증상 및 질환에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 혈관형성 과정에서는 내피 세포가 세포 분열하여 새로운 혈관이 될 관을 형성해야 한다. 혈관형성은 일정 범위의 질병 상태, 종양 전이 및 내피 세포에 의한 비정상 성장시 발생한다. 혈관형성 과정의 결과로 형성된 혈관구조는 이들 증상에서 확인되는 병리학적 손상을 뒷받침한다. 조절되지 않은 혈관형성에 의해 생긴 다양한 병리학적 상태를 혈관형성 의존성 질병 또는 혈관형성 관련 질병으로서 함께 분류한다. 또한, 혈관형성은 상처 치유 및 재생과 같은 정상적인 과정의 일부이다.

정의

편의를 위해서, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위 중에 사용된 일부 용어를 여기에 기재한다. 다른 언급이 없으면, 본 명세서 중에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자들이 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.

용어 "부정관사(a, an)"는 문법 목적어 중 하나 또는 하나 이상(즉, 1 이상)을 의미하기 위해 사용된다. 예를 들어 "(한) 성분"은 하나의 성분 또는 하나 이상의 성분을 의미한다.

IL-1과 같은 폴리펩티드의 활성에 적용되는 용어 "이상 활성"은 야생형 또는 천연 폴리펩티드의 활성과 다르거나 또는 건강한 피험체의 폴리펩티드의 활성과 다른 활성을 의미한다. 폴리펩티드의 활성이 천연 대응쌍의 활성보다 강하면 이상 활성일 수 있다. 또는, 활성이 천연 대응쌍의 활성보다 약하거나 또는 활성이 없으면 이상 활성이라고 할 수 있다. 또한 이상 활성은 활성 변화일 수 있다. 예를 들어, 이상 폴리펩티드는 상이한 표적 펩티드와 상호작용할 수 있다. 세포는 IL-1 좌 폴리펩티드를 암호화하는 IL-1 좌 유전자의 과다발현 또는 과소발현으로 인한 IL-1 이상 활성을 보유할 수 있다.

"연령 관련 암"은 노령 개체군에서 발병율이 증가하는 임의의 형태의 신생물을 의미한다. 대부분의 암은 연령 관련되어 있고, 유방암, 전립선암 및 자궁내막암 등이 특히 그러하다.

"노화 관련 증상"은 노령 개체군에서 발생 빈도수가 증가하는 임의의 광범위한 건강 상태이다. 이러한 건강 상태의 비제한적인 예로는 결합 조직 기능 손상(예, 골다공증, 골관절염, 연골세포 프로테오글리칸 합성 감소 및 류마티스성 관절염, 상처 치유 감소, 쇠약, 근육 소모병), 비정상 면역계 기능(예, T 세포 증식 감소, IL-1 생성 증가, IL-1에 대한 반응성 감소, 감염성 질병에 대한 감수성 증가), 신경학적 기능 손상(예, 알츠하이머병, 치매, 장기간의 손상, 청각 손상, 안구 기능 손상, 예컨대 망막 변성, 단기간의 기억력, 시냅스 유연성 감소, 학습능력 손상, 불면증, 우울증), 심혈관 질환(예, 관상 동맥 질환, 중풍, 말초 동맥 질환, 죽상경화증, 울혈성 심부전, 고혈압) 및 연령 관련 암 등이 있다.

"노화 관련 표현형"은 EOA와 관련되거나 EOA의 가능성 증가와 관련된 피험체 또는 세포의 표현형이다. EOA 관련 표현형은 EOA-관련 대립유전자를 갖는 피험체또는 세포에서 발견되는 임의의 표현형이며, 이러한 표현형은 EOA-관련 대립유전자가 결여된 피험체 또는 세포에서 발견되는 것과는 다르다. 이러한 표현형은 본질적으로 바이오마커의 임의의 특징을 포함한다. EOA-관련 표현형은 EOA에 직접 관련되지 않지만, EOA에 대한 지표로서 기능할 수 있다. "비-EOA 관련 표현형"은 EOA 또는 EOA 형성 가능성 증가와 관련되지 않은 표현형이다.

용어 "대립유전자'는 상이한 다형성 영역에서 발견되는 상이한 서열 변형체를 의미한다. 예를 들어, IL-1RN(VNTR)은 5개 이상의 상이한 대립유전자를 갖는다. 서열 변형체는 1개 또는 복수개 염기 변화, 비제한적인 예로서 삽입, 결실 또는 치환될 수 있거나, 또는 다양한 수로 서열 반복될 수 있다.

용어 "대립유전자 패턴"은 하나 이상의 다형성 영역에서의 대립유전자(들)의 정체를 의미한다. 예를 들어, IL-1RN (VNTR) 대립유전자 1에 대해서, 대립유전자 패턴은 다형성 부위에서 하나의 대립유전자로 구성될 수 있으며, IL-1RN 유전자 좌의 VNTR에서 IL-1RN 대립유전자 1의 하나 이상의 카피를 갖는 대립유전자 패턴이다. 또는 대립유전자 패턴은 단일 다형성 부위에서 동형접합성 또는 이형접합성 상태로 구성될 수 있다. 예를 들어, IL1-RN (VNTR) 대립유전자 2,2는, IL-1RN의 VNTR 마커에서 제2 대립유전자의 2개 카피가 있으며 동형접합성 IL-1RN (VNTR) 대립유전자 2 상태에 해당하는 대립유전자 패턴이다. 대안적으로, 대립유전자 패턴은 하나 이상의 다형성 부위에서의 대립유전자 정체로 구성될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "항체"는 IL-1B 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 전체 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 결합제를 의미하는 것이다. 종래 기법을 사용하여 항체를 단편화하고, 전체 항체에 대해 전술한 바와 동일한 방식으로 유용성 단편을 스크리닝하였다. 예를 들어, 펩신으로 항체를 처리하여 F(ab)₂단편을 생성할 수 있다. 생성된 F(ab)₂단편을 처리하여 이황화 결합을 환원시켜 Fab 단편을 산출할 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 항체의 하나 이상의 CDR 영역에 의해 부여되는 IL-1B 폴리펩티드에 대해 친화도를 갖는 2특이적, 1본쇄, 그리고 키메라 및 인간화된 분자를 포함하고자 한다.

본 명세서에서 호환적으로 사용된 "생물학적 활성" 또는 "생활성" 또는 "활성" 또는 "생물학적 기능"은 IL-1 폴리펩티드(천연 또는 변성 형태) 또는 이의 임의의 부분서열에 의해 직접 또는 간접 실시되는 효과기 또는 항원성 기능을 의미한다. 이들 용어는 IL-1 단백질 및 유전자의 성질, 예컨대 발현 레벨과 전사후 변형을 포함하는 것이다. 생물학적 활성은 표적 펩티드, 예컨대 IL-1 수용체에 대한 결합을 포함한다. IL-1 생활성은 IL-1 폴리펩티드에 직접 영향을 주어 조절할 수 있다. 또는 IL-1 폴리펩티드의 레벨을 조절하여, 예컨대 IL-1 유전자의 발현을 조절하여 IL-1 생활성을 조절할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "IL-1 폴리펩티드의 생활성 단편"은 전길이 IL-1 폴리펩티드의 단편을 의미하는 것으로서, 단편은 야생형 IL-1 폴리펩티드의 활성을 특이적으로 모방하거나 길항한다. 생활성 단편은 인터루킨 수용체와 상호작용할 수 있는 단편인 것이 바람직하다.

용어 "바이오마커"는 피험체 또는 세포의 표현형을 의미한다. 바이오마커는광범위한 세포내 및 세포외 사건과 전체 유기체의 생리학적 변화를 포함한다. 바이오마커는 이들 중 임의의 것일 수 있으며, 반드시 염증 반응에 관련되어야 하는 것은 아니다. 세포에 대해서, 바이오마커는 본질적으로 임의 측면의 세포 기능일 수 있다. 예를 들어, IL-1 생활성 뿐 아니라 전사 인자, 중간 대사물질, 시토킨, 프로스타노이드, 스테로이드 호르몬(예, 에스트로겐, 프로게스테론, 안드로스텐디온 또는 테스토스테론), 생식선자극호르몬(예, LH 및 FSH), 유전자 전사체, 단백질의 번역후 변형, 생식선자극호르몬 방출 호르몬(GnRH), 카테콜아민(예, 도파민 또는 노르에피네프린), 오포이드, 액티빈, 인히빈, 시그널링 분자의 생성 레벨 또는 속도일 수 있다. 바이오마커는 단백질 레벨 및/또는 변형의 전체 프로테옴 분석 또는 전사체 레벨의 전체 게놈 분석을 포함할 수 있다. 또한, 바이오마커는 리포터 유전자일 수 있다 예를 들어, IL-1 프로모터 또는 EOA 관련 대립유전자를 포함하는 IL-1 프로모터를 리포터 유전자에 작동가능하게 결합할 수 있다. 별법으로서, 프로모터는 IL-8프로모터와 같은 IL-1 조절 프로모터일 수 있다. 이러한 방식에서, 리포터 유전자의 활성은 프로모터 활성을 반영한다. 적절한 리포터 유전자로는 GUS, LacZ, 녹색 형광 단백질 (GFP) (및 이의 변형체, 예컨대 적색 형광 단백질, 시안 형광 단백질, 황색 형광 단백질 및 청색 형광 단백질) 또는 본질적으로 생성물이 쉽게 검출되는 임의의 다른 유전자 등이 있다. 기타 바람직한 바이오마커로는 전술한 바와 같이 면역 및 염증 반응에 관여하는 인자와, IL-1 생성 및 시그널링에 관련된 인자 등이 있다. 피험체에서, 바이오마커는 예를 들어 전술한 임의의 것과 심전도 파라미터, 폐 기능, IL-6 활성, 뇨 파라미터 또는 조직 파라미터일 수 있다."EOA 관련 바이오마커"는 EOA와 관계된 것으로 밝혀지거나 또는 EOA 관련 대립유전자를 포함하는 피험체 또는 세포에서 우선적으로 발견되는 상기한 것 중 임의의 것일 수 있다.

"심혈관 질환"은 본 명세서에 정의된 바와 같이 임상적 증세 및 임상적 증상을 비롯한 임상 사건을 특징으로 하는 심혈관 병이다. 임상적 증세는 의사에게 병의 존재를 알려주는 환자에 의해 보고되는 경험이다. 임상적 증상은 의사에게 병의 존재를 알려주는 신체 검사 또는 실험 조사에서 나타나는 객관적인 발견이다. "심혈관 질환"은 "관상 동맥 질환" 및 "말초 혈관 질환"(뇌혈관 질환을 포함함)을 모두 포함한다. 심혈관 질환에서의 임상적 증세은 가슴 통증, 호흡 단축, 허약, 실신 발작, 의식 변화, 팔다리 통증, 발작 야간 호흡 곤란, 기좌 호흡, 일시적 허혈 발작, 및 환자가 경험하는 기타 현상 등이 있다. 심혈관 질환에서의 임상적 증상으로는 EKG 비정상, 변경된 말초 펄스, 동맥 잡음, 비정상 심장 소리, 수포음, 목정맥 확장, 신경학적 변형 및 의사가 식별할 수 있는 기타 발견을 포함한다. 심근경색(MI) 또는 중풍("뇌혈관 사고" 또는 "CVA")과 같은 심혈관 질환에서는 임상적 증세 및 임상적 증상을 조합할 수 있으며, 이 경우 환자는 일부 현상(증세)을 보고하고 의사는 근본이 되는 병의 지표인 모든 다른 현상(증상)을 감지한다. "심혈관 질환"은 유약 판 장애, 폐색 질환 및 협착증의 심혈관 질환과 관련된 질병을 포함한다. 예를 들어, 하기에 개시된 바와 같이 유약판 질병으로부터 생기는 심혈관 질환은 "유약판 질병(fragile plaque disease)"이라고 할 수 있다. 유약판 질병과 관련된 임상 사건은 후속 급성 혈전증 또는 원위 색전증을 갖는 유약판의 파열이 특징인 증상 및 증세를 포함한다. 유약판 질환의 예로는 일부 중풍 및 심근경색 등이 있다. 또 다른 예로서, 폐색 질병으로부터 생기는 심혈관 질환을 "폐색성 질환"이라고 한다. 폐색성 질환과 관련된 임상 사건은 동맥의 진행성 폐색이 표적 조직에 도달하는 순환량에 영향을 주는 증상 및 증세를 포함한다. 진행성 동맥 폐색은 순환량이 조직을 유지하는 데 불충분한 경우 조직 사망으로 진행될 수 있는 진행성 허혈을 초래할 수 있다. 폐색성 질환의 증상 및 증세는 절뚝거림, 휴식시 통증, 앙기나 및 괴저와 혈관 협착증 및 원위 관류 감소를 나타내는 물리적 및 실험적 발견을 포함한다. 또 다른 예로서, 재협착증으로부터 생긴 심혈관 질환은 스텐트내(in-stent) 협착 질병이라고 명명할 수 있다. 스텐트내 협착증 질환은, 예를 들어 경피 경관 혈관성형술과 같은 절차의 일부로서 배치한 동맥 스텐트의 진행성 막힘으로부터 생기는 증상 및 증세를 말한다. 여기서, 스텐트는 새로 확장된 구조로 혈관을 유지하는 것을 도와주기 위한 것이다. 스텐트내 협착증을 수반하는 임상 사건은 재구성된 동맥의 재협착의 원인이 된다.

"심혈관 병"은 광범위하게 관상 동맥 병 및 말초 동맥 병(뇌혈관 병 포함)을 의미한다. 용어 "심혈관 병"은, 구조 이상, 조직 이상, 생화학 이상 또는 임의의 다른 이상과 관련없이 임의의 동맥 비정상에 적용할 수 있다. 이 용어는 유약판을 특징으로 하는 병(본 명세서 중에는 "유약판 질환"이라고 함), 혈관 폐색을 특징으로 하는 병(본 명세서 중에는 "폐색성 질환'이라고 함), 및 재협착을 특징으로 하는 질병을 포함한다. "심혈관 병"은 주로 임의의 의료 또는 수술 시술 전에 동맥에서 발생할 수 있다. 1차 심혈관 병은 죽상경화증, 동맥 폐색, 동맥류 형성 및 혈전증 등이 있다. "심혈관 병"은 2차로 의료 또는 수술 시술 후에 발생할 수 있다. 2차 심혈관 병은 외상후 동맥류 형성, 재협착증 및 수술후 이식편 폐색을 포함한다.

"세포", "숙주 세포" 또는 "재조합 숙주 세포"는 특정 피험체 세포 뿐 아니라 이러한 세포의 자손 또는 가능한 자손을 의미하기 위해 호환적으로 사용된다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인하여 차세대에서 일부 변형이 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 부모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 용어의 범위 내에 포함된다.

용어 "키메라", "모자이크", "키메라 포유류" 등은 게놈 함유 세포 내의 적어도 일부 중에 넉아웃 또는 넉인 작제물을 갖는 포유류를 의미한다.

용어 "포함한다" 및 "포함하는"은 포괄적이고 개방적인 의미로 사용되어, 추가의 성분이 포함될 수 있다는 의미를 나타낸다.

용어 "대조군" 또는 "대조군 샘플"은 사용된 검출 기법에 적절한 임의의 샘플을 의미한다. 대조군 샘플은 사용된 대립유전자 검출 기법의 생성물 또는 시험할 물질을 포함할 수 있다. 또한, 대조군은 양성 또는 음성 대조군일 수 있다. 예를 들어, 대립유전자 검출 기법이 PCR 증폭 후의 크기 분류인 경우, 대조군 샘플은 적절한 크기의 DNA 단편을 포함할 수 있다. 유사하게, 대립유전자 검출 기법이 돌연변이된 단백질의 검출을 포함하는 경우, 대조군 샘플은 돌연변이 단백질 샘플을 포함할 수 있다. 그러나, 대조군 샘플은 시험할 물질을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 대조군은 IL-1 유전자 클러스터의 클로닝된 부분 또는 게놈 DNA의 샘플일 수 있다. 그러나, 시험할 샘플이 게놈 DNA인 경우, 대조군 샘플은 바람직하게는게놈 DNA의 고도로 정제된 샘플이다.

"임상 사건"은 임상적으로 보고가능한 질병 증세 또는 임상적으로 식별가능한 질병 증상의 발생이다. "임상적으로 식별가능한"은 증상이 건강 관리 제공자에 의해 인식될 수 있음을 의미한다. "임상적으로 보고가능한"은 증세가 건강 관리 제공자에게 설명될 수 있는 유형의 현상임을 의미한다. 임상 사건은, 일반적으로 건강 관리 제공자에게 환자가 설명할 수 있는 종류의 현상인 한 특정 환자가 직접 보고할 수 없더라도 임상적으로 보고가능한 증세를 포함할 수 있다.

"결합 조직"은 공지된 용어로서, 뼈, 근육, 연골, 힘줄, 인대 및 피부를 비롯한 조직을 의미한다. 결합 조직 기능은 구조 유지, 유연성, 변형성, 인장 강도, 수축 강도, 손상에 대한 치유, 리모델링 및 저항 능력을 포함한다.

"질병 관련 대립유전자" 또는 "질병과 관련된 대립유전자"는, 피험체 내에서의 존재가 피험체가 특정 질병을 갖거나 또는 이의 발생에 대한 감수성이 있음을 나타내는 대립유전자를 의미한다. 질병 관련 대립유전자의 한 종류는 "노화 관련 대립유전자"로서, 피험체에서의 이의 존재는 피험체가 노화 관련 질병의 조기 개시 또는 조기 노화에 감수성이라는 것을 제시한다. 이들은 세포 분열에 대한 능력 감소, 세포 노화 및 조기 사멸과 관련된 대립유전자를 포함한다. 노화 관련 대립유전자의 예로는 IL-1 패턴 1을 포함하는 대립유전자, 즉 IL-1A +4825의 대립유전자 2; IL-1B의 +3954 마커의 대립유전자 2; 및 IL-1RN의 +2018 마커의 대립유전자 1; 및 IL-1B 유전자의 (-511) 마커의 대립유전자 1 또는 전술한 대립유전자 중 하나와 연관 비평형 상태에 있는 대립유전자 등이 있다.

용어 "유전자 중단" 및 "표적화된 중단" 또는 임의의 유사 어구는 유전자의 야생형 카피와 비교하여 세포내 유전자의 발현을 막는 천연 DNA 서열의 부위 특이적 중단을 의미한다. 유잔자에 대한 결실, 삽입 또는 변형, 또는 이의 임의의 조합에 의해 중단이 유발될 수 있다.

"노화 관련 증상의 조기 개시" 또는 "노화 관련 증상의 조기 개시 또는 진행" 또는 "EOA"는 노화 관련 증상이 특정 개체 및 특정 증상에 대해 예상되는 것보다 더 조기에 일어나거나 또는 조기에 진행되는 상황을 의미한다. 예상되는 개시 연령은 개체에 관해 알려진 정보량에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 여러 조건들이 남성보다는 여성에서 더 늦게 영향을 미친다. 따라서, 이들 증상에 대한 예측 개시 연령은 여성이 더 늦다. 워너 증후군 돌연변이 개체는 노화 관련 증상을, 전체적으로 개체군보다 휠씬 일찍 약 10∼15세에 개시할 것으로 예측된다. 개체에 관한 임의의 정보의 부재 하에서, 예측 개시 연령은 해당 증상에 대한 전체 개체군에 대한 것이다.

"EOA 치료제"는 노화 관련 증상의 발생을 예방 또는 지연시키거나, 또는 노화 관련 증상의 조기 개시 증세를 경감시키는 임의의 제제이다. EOA 치료제는 폴리펩티드, 펩티드모사체, 핵산, 기타 무기 또는 유기 분자, 또는 영양약학제품(nutraceutical), 바람직하게는 "소분자"일 수 있다. EOA 치료제는 하나 이상의 EOA 관련 표현형을 조절할 수 있는 것이 좋다. 예를 들어, EOA 치료제는 천연 IL-1 폴리펩티드의 효과를 모방 또는 강화(작용)하거나 또는 억제(길항)하여 IL-1 폴리펩티드의 활성, 예컨대 IL-1과의 상호작용을 조절할 수 있다. IL-1 작용제는 야생형 IL-1 단백질 또는 야생형 IL-1의 하나 이상의 생활성(예, 수용체 결합 활성)을 갖는 이의 유도체일 수 있다. IL-1 작용제는 IL-1 유전자의 발현을 상향조절하거나 또는 IL-1 단백질의 하나 이상의 생활성을 증가시키는 화합물일 수 있다. 작용제는 IL-1 폴리펩티드와 또 다른 분자, 예컨대 인터루킨 수용체의 상호작용을 증가시키는 화합물일 수 있다. IL-1 길항제는 IL-1 단백질과 또 다른 분자(예, IL-1 수용체와 같은 수용체) 간의 상호작용을 억제하거나 감소시키는 화합물일 수 있다. 따라서, 바람직한 길항제는 IL-1 수용체에 대한 결합을 억제 또는 감소시켜 후속되는 IL-1 수용체의 활성화를 차단하는 화합물이다. 길항제는 존재하는 IL-1 단백질의 양을 감소시키거나 IL-1 좌 유전자의 발현을 하향조절하는 화합물일 수 있다. IL-1 길항제는 IL-1 폴리펩티드의 우성 음성 형태, 예컨대 표적 펩티드(예, IL-1 수용체)와 상호작용할 수 있지만 IL-1 수용체의 활성화를 촉진할 수 없는 IL-1 폴리펩티드 형태일 수 있다. IL-1 길항제는 IL-1 폴리펩티드의 우성 음성 형태를 암호화하는 핵산, IL-1 안티센스 핵산, 또는 IL-1 RNA와 특이적으로 상호작용할 수 있는 리보자임일 수 있다. 또 다른 IL-1 길항제는 IL-1 폴리펩티드에 결합하여 그 작용을 억제하는 분자이다. 이러한 분자로는 펩티드, 예컨대 생물학적 활성을 갖지 않고 IL-1 수용체에 대한 IL-1의 결합을 억제하는 IL-1 표적 펩티드 형태 등이 있다. 따라서, 이러한 펩티드는 IL-1의 활성 부위에 결합하여 표적 펩티드(예, IL-1 수용체)와의 상호작용을 막는다. 또 다른 IL-1 길항제는 IL-1 분자의 에피토프와 특이적으로 상호작용하는 항체를 포함하여, 결합이 IL-1 좌 폴리펩티드의 생물학적 기능을 저해한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, IL-1 길항제는 IL-1 폴리펩티드및 표적 IL-1 수용체 간의 상호작용을 억제할 수 있는 분자와 같은 소분자이다. 또는, 소분자는 IL-1 수용체 결합 부위 이외의 부위와 상호작용하여 길항제로서 기능할 수 있다. 길항체는 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질 또는 이의 조합을 비롯한 임의 부류의 분자일 수 있지만, 치료 목적에는 소분자가 바람직하다.

용어 "노화 관련 증상의 조기 진행" 또는 "EPA"는 피험체에서의 노화 관련 증상 진행 속도가 전체 개체군에서보다 더욱 신속하게 일어나는 상황을 의미하는데 사용된다. 조기 개시 및 조기 진행은 현저하게 중복되고 관련되어 있는 상황이며, 문맥에 명백히 제시되지 않으면, 조기 개시에 관하여 개시된 구체예들 각각을 조기 진행에 적용할 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "해플로타입(haplotype)"은 통계학적 유의 수준(p_corr0.05)에서 일군으로서 함께 유전되는(연관 비평형 상태에 있음) 대립유전자 세트를 의미하는 것이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "IL-1 해플로타입"은 IL-1 좌에서의 해플로타입을 의미한다. 3개 이상의 IL-1 전구염증성 해플로타입이 공지되어 있다. IL-1(44112332) (본 명세서에서는 패턴 2이라고도 함) 해플로타입은 IL 수용체 길항제 활성과 관련되어 있는 반면, IL-1 (33221461) (패턴 1이라고도 함) 해플로타입은 IL-1α및 β작용제 활성과 관련되어 있다. IL-1 (44112332) 해플로타입은 다음 대립유전자를 포함한다: IL-1RN (+2018) 대립유전자 2; IL-1RN (VNTR) 대립유전자 2; IL-1A (222/223) 대립유전자 4; IL-1A (gz5/gz6) 대립유전자 4; IL-1A (-889) 대립유전자 1; IL-1B (+3954) 대립유전자 1; IL-1B (-3737) 대립유전자 1; IL-1B (-511) 대립유전자 2; gaat.p33330 대립유전자 3; Y31 대립유전자 3; IL-1RN 엑손 lic (1812) 대립유전자 2; IL-1RN 엑손 lic (1868) 대립유전자 2; IL-1RN 엑손 lic (1887) 대립유전자 2; Pic (1731) 대립유전자 2; IL-1A (+4845) 대립유전자 1; IL-1B (+6912) 대립유전자 1; IL-1B (-31) 대립유전자 2. IL-1 (33221461) 해플로타입은 다음과 같은 대립유전자를 포함한다: IL-1RN (+2018) 대립유전자 1; IL-1RN (VNTR) 대립유전자 1; IL-1A (222/223) 대립유전자 3; IL-1A (gz5/gz6) 대립유전자 3; IL-1A (-889) 대립유전자 2; IL-1B (+3954) 대립유전자 2; IL-1B (-3737) 대립유전자 1; IL-1B (-511) 대립유전자 1; gaat.p33330 대립유전자 4; Y31 대립유전자 6; IL-1RN 엑손 lic (1812) 대립유전자 1; IL-1RN 엑손 lic (1868) 대립유전자 1; IL-1RN 엑손 lic (1887) 대립유전자 1; Pic (1731) 대립유전자 1; IL-1A (+4845) 대립유전자 2; IL-1B (+6912) 대립유전자 2; IL-1B (-31) 대립유전자 1. 제3 해플로타입(패턴 3)은 다음 대립유전자를 포함한다: IL-1A (+4845) 대립유전자 1; IL-1A (-889) 대립유전자 1; IL-1B (+3954) 대립유전자 1; IL-1B (-511) 대립유전자 1; IL-1B (-3737) 대립유전자 2; IL-1RN (+2018) 대립유전자 1; IL-1RN (VNTR) 대립유전자 1.

본 명세서에 사용된 "IL-1 작용제"는 IL-1 생물학적 경로 중의 유전자의 생활성 또는 IL-1 생활성을 모방, 상향조절(강화 또는 보충)하거나 또는 증가시키는 제제를 의미한다. IL-1 작용제는 프로모터 영역에서의 IL-1 유전자 발현, mRNA 스플라이싱 기전의 조절, mRNA의 안정화, 번역을 위한 단백질의 인산화, proIL-1에서 성숙 IL-1로의 전환과 IL-1의 분비를 비롯하여 각종 상이한 레벨로 작용할 수 있다. IL-1 합성을 증가시키는 작용제로는 리포다당류, IL-1B, cAMP 유도제, NFκB활성화제, AP-1 활성화제, TNF-α, 산화된 LDL, 후기 당화 산물(AGE), 전단 응력, 저산소증, 과산소증, 허혈 재관류 손상, 히스타민, 프로스타글란딘 E2(PGE2), IL-2, IL-3, IL-12, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 단핵구 콜로니 자극 인자(M-CSF), 줄기 세포 인자, 혈소판 유래의 성장 인자(PDGF), 보체 C5A, 보체 C5b9, 피브린 분해 산물, 플라스민, 트롬빈, 9-히드록시옥타데카엔산, 13-히드록시옥타데카엔산, 혈소판 활성 인자(PAF), 인자 H, 레틴산, 요산, 칼슘 피로포스페이트, 폴리뉴클레오시드, c-반응성 단백질, 안티트립신, 담배 항원, 콜라겐, 인테그린, LFA-3, 항-HLA-DR, 항-IgM, 항-CD3, CD40 결찰, 식물적혈구응집소(CD2), sCD23, 자외선 B, 감마선, 물질 P, 이소프로테레놀, 메탐페타민 및 멜라토닌 등이 있다. IL-1 mRNA를 안정화시키는 작용제는 박테리아 내독소 및 IL-1 등이 있다. 이용가능한 IL-1 1형 수용체의 수를 증가시켜 기능하는 다른 작용제로는 IL-1, PKC 활성화제, 덱사메타손, IL-2, IL-4 및 PGE2 등이 있다. 기타 바람직한 길항제는 IL-1에 의해 활성화되거나 또는 IL-1 시그널 변환 경로에 이용되는 시그널 변환 인자를 저해 또는 억제한다(예, NFκB 및 AP-1, PI3 키나제, 포스포리파제 A2, 단백질 키나제 C, JNK-1,5-리폭시게나제, 시클로옥시게나제 2, 티로신 인산화, iNOS 경로, Rac, Ras, TRAF). 또 다른 작용제는 IL-1에 의해 발현이 유도되는 유전자의 생활성을 증가시킨다. 이러한 유전자의 예로는, IL-1, IL-1Ra, TNF, IL-2, IL-3, IL-6, IL-12, GM-CSF, G-CSF, TGF, 피브리노겐, 우로키나제 플라스미노겐 억제제, 1형 및 2형 플라스미노겐 활성화제 억제제, p-셀렉틴 (CD62), 피브리노겐 수용체, CD-11/CD18, 프로테아제 넥신-1, CD44, 기질 메탈로프로테인아제-1 (MMP1), MMP-3, 엘라스타제, 콜라게나제, 메탈로프로테인아제-1의 조직 억제제 (TIMP- 1), 콜라겐, Apo CIII를 증가시키는 트리글리세라이드, 아포리포단백질, ICAM-1, ELAM-1, VCAM-1, L-셀렉틴, 데코린, 줄기 세포 인자, 백혈병 억제 인자, IFNa, b, g, L-8, IL-2 수용체, IL-3 수용체, IL-5 수용체, c-kit 수용체, GM-CSF 수용체, 시클로옥시게나제-2 (COX-2), 2형 포스포리파제 A2, 유도성 질소 산화물 신타제(iNOS), 엔도텔린-1,3, 감마 글루타밀 트랜스퍼라제, Mn 슈퍼옥시드 디스뮤타제, C-반응성 단백질, 피브리노겐, 혈청 아밀로이드 A, 메탈로티오네인, 세룰로플라스민, 리소자임, 크산틴 데히드로게나제, 크산틴 옥시다제, 혈소판 유래 성장 인자 A쇄(PDGF), 흑색종 성장 자극 활성(gro-a, b, g), 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1), 액티빈 A, 프로-오피오멜라노코르티오트로핀, 코르티코트로핀 방출 인자, B 아밀로이드 전구체, 기저막 단백질-40, 라미닌 B1 및 B2, 구성성 열 충격 단백질 p70, P42 유사분열인자, 활성화 단백질 키나제, 오르니틴 데카르복실라제, 헴 옥시게나제 및 G-단백질 α 서브유닛 등이 있다.

본 명세서에 사용된 "IL-1 길항제"는 IL-1 생활성을 하향조절하거나 감소시키는 제제를 의미한다. IL-1 길항제는 임의의 각종 상이한 레벨, 예컨대 프로모터 영역에서의 IL-1 유전자 발현, mRNA 스플라이싱 기전의 조절, mRNA의 안정화, 번역을 위한 단백질의 인산화, proIL-1의 성숙 IL-1로의 전환 및 IL-1의 분비에 작용할 수 있다. IL-1 생성의 길항제로는 코르티코스테로이드, 리폭시게나제 억제제, 시클로옥시게나제 억제제, γ-인터페론, IL-4, IL-10, IL-13, 트랜스포밍 성장 인자 β(TGF-β), ACE 억제제, n-3 다중불포화 지방산, 항산화제 및 리질 환원제 등이있다. IL-1 mRNA를 탈안정화시키는 길항제는 탈아데닐화를 촉진하는 제제를 포함한다. 번역을 위한 IL-1 단백질의 인산화를 억제 또는 예방하는 길항제로는 피리디닐-이미다졸 화합물, 예컨대 테부펠론과 미세관 형성을 억제하는 화합물(예, 콜치신, 빈블라스틴 및 빈크리스틴) 등이 있다. proIL-1의 성숙 IL-1로의 전환을 억제 또는 예방하는 길항제로는 인터루킨 전환 효소(ICE) 억제제, CXrm-A, 전사체 X, 내인성 테트라펩티드 경쟁성 기질 억제제, 트립신, 엘라스타제, 키모트립신, 키마제 및 기타 비특이적 프로테아제 등이 있다. IL-1의 분비를 막거나 억제하는 길항제는 음이온 수송을 차단하는 제제를 포함한다. IL-1 수용체 상호작용을 저해하는 길항제로는 I형 IL-1 수용체의 당화를 억제하는 제제, IL-1RI에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, IL-1RI에 대한 항체, IL-1RacP에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 등이 있다. 이용가능한 IL-1 1형 수용체의 수를 감소시켜 기능하는 다른 길항제로는 TGF-α, COX 억제제, IL-1 II형 수용체를 증가시키는 인자, 덱사메타손, PGE2, IL-1 및 IL-4 등이 있다. 기타 바람직한 길항제는 IL-1에 의해 활성화되거나 또는 IL-1 시그널 변환 경로에서 이용되는 시그널 변환 인자를 저해하거나 억제한다(예,NFkB 및 AP-1, PI3 키나제, 포스포리파제 A2, 단백질 키나제 C, JNK-1, 5-리폭시게나제, 시클로옥시게나제 2, 티로신 인산화, iNOS 경로, Rac, Ras, TRAF). 또 다른 길항제는 IL-1에 의해 발현이 유도되는 유전자의 생활성을 저해한다. 이러한 유전자의 예로는, IL-1, IL-lRa, TNF, IL-2, IL-3, IL-6, IL-12, GM-CSF, G-CSF, TGF, 피브리노겐, 우로키나제 플라스미노겐 억제제, 1형 및 2형 플라스미노겐 활성화제 억제제, p-셀렉틴 (CD62), 피브리노겐 수용체, CD-11/CD18, 프로테아제 넥신-1, CD44, 기질 메탈로프로테인아제-1 (MMP-1), MMP-3, 엘라스타제, 콜라게나제, 메탈로프로테인아제-1의 조직 억제제 (TIMP-1), 콜라겐, Apo CIII를 증가시키는 트리글리세라이드, 아포리포단백질, ICAM-1, ELAM-1, VCAM-1, L-셀렉틴, 데코린, 줄기 세포 인자, 백혈병 억제 인자, IFNa, β, γ, L-8, IL-2 수용체, IL-3 수용체, IL-5 수용체, c-kit 수용체, GM-CSF 수용체, 시클로옥시게나제-2 (COX-2), 2형 포스포리파제 A2, 유도성 질소 산화물 신타제(iNOS), 엔도텔린-1,3, 감마 글루타밀 트랜스퍼라제, Mn 슈퍼옥시드 디스뮤타제, C-반응성 단백질, 피브리노겐, 혈청 아밀로이드 A, 메탈로티오네인, 세룰로플라스민, 리소자임, 크산틴 데히드로게나제, 크산틴 옥시다제, 혈소판 유래 성장 인자 A쇄(PDGF), 흑색종 성장 자극 활성(gro-a, b, g), 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1), 액티빈 A, 프로-오피오멜라노코르티오트로핀, 코르티코트로핀 방출 인자, B 아밀로이드 전구체, 기저막 단백질-40, 라미닌 B1 및 B2, 구성성 열 충격 단백질 p70, P42 유사분열인자, 활성화 단백질 키나제, 오르니틴 데카르복실라제, 헴 옥시게나제 및 G-단백질 α 서브유닛 등이 있다. 기타 바람직한 길항제로는, 히메니알디신, 허비마이신(예, 허바마이신 A), CK-103A 및 이의 유도체 (예. 4,6-디히드로피리다지노[4,5-c]피리다진-5 (1H)-온), CK-119, CK-122, 요오도메타신, 아플라톡신 B1, 렙틴, 헤파린, 이중환 이미다졸(예, SB203580), PD15306 HCl, 포도카르프산 유도체, M-20, 인간 [Gly2] 글루카곤 유사 펩티드-2, FR167653, 스테로이드 유도체, 글루코코르티코이드, 퀴에르세틴, 테오필린, NO-신테타제 억제제, RWJ 68354, 유클립톨 (1.8-시네올), 마그노살린, N-아세틸시스테인, 알파-멜라토닌-자극 호르몬(a-MSH), 트리클로잔(2,4,4'-트리클로로-2'-히드록시디페닐 에테르), 프로스타글란딘 E2 및 4-아미노피리딘 에타크린산 및 4,4'-디이소티오시아나토스틸벤 2,2'-디설폰산(DIDS), 글루코스, 리포포스포글리칸, 아스피린, 이화-차단제, 디아세르헤인, 티올-조절제, 아연, 모르핀, 류코트리엔 생합성 억제제 (예, MK886), 혈소판 활성 인자 수용체 길항제 (예, WEB 2086), 아미오다론, 트라닐라스트, S-메틸-L-티오시트룰린, 베타-아드레노수용체 길항제(예, 프로카테롤, 클렌부테롤, 페노테롤, 테르부탈린, 히알루론산, 항-TNF-a 항체, 항-IL-1a 자가항체, IL-1 수용체 길항제, IL-1R-관련 키나제, 가용성 TNF 수용체 및 항염증성 시토킨(예, IL-4, IL-13, IL-10, IL-6, TGF-β, 안지오텐신 II, 가용성 IL-1 II형 수용체, 가용성 IL-1 I형 수용체, 조직 플라스미노겐 활성화제, 아연 핑거 단백질 A20 IL-1 펩티드(예, (Thr-Lys-Pro-Arg) (Tuftsin), (Ile-Thr-Gly-Ser-Glu) IL-1-알파, Val-Thr-Lys-Phe-Tyr-Phe, Val-Thr-Asp-Phe-Tyr-Phe, 인터페론 알파2b, 인터페론 베타, IL-1-베타 유사체(예, IL-1-베타 트리펩티드: Lys-D-Pro-Thr), 당화된 IL-1-알파, 및 IL-1ra 펩티드 등이 있다.

본 명세서에 사용된 "IL-1 유전자 클러스터" 및 "IL-1 좌"는 적어도 IL-1A, IL-1B 및 IL-1RN 유전자와 임의의 다른 연관된 서열을 포함하는 염색체 2의 2q13 영역 또는 그 근처의 모든 핵산을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "IL-1A", "IL-1B", 및 "IL-1RN"은 각각 IL-1α, IL-1β 및 IL-1 수용체 길항제 또는 IL-1ra를 암호화하는 유전자를 의미한다. 이 영역에서의 DNA는 맵핑되어 있다. Nicklin 등의 문헌[Genomics 19: 382-84, 1994; Nothwang H. G., et al., Genomics 41: 370, 1997; Clark, et al., Nucl. Acids. Res. 14: 7897-914, 1986, (erratum atNucleic Acids Res. 15: 868, 1987)]. IL-1A 및 IL-1B에 대한 유전자 수탁 번호(GEN)는 각각 X03833 및 X04500이다. 일반적으로, IL-1RN에 대한 뉴클레오티드 위치는 단백질의 분비형인 GEN X64532에서의 뉴클레오티드 서열을 참조하며, 직접 표현되어 있거나 또는 문맥상 포함되는 것과 같은 다른 언급이 없으면, 세포내 형태(GEN X77090)를 기준으로 한다. IL-1RA의 2가지 형태는 2개의 처음 엑손의 교대 사용으로 단일 유전자가 암호화한다. 일반적으로 문헌[Lennard et al., Crit. Rev. Immuno. 15: 77-105, 1995] 참조.

"IL-1 기능 돌연변이"는 변형된 표현형(즉, IL-1 유전자 또는 단백질의 기능에 영향을 주는 표현형)을 산출하는 IL-1 유전자 클러스터 내의 돌연변이를 의미한다. 예로는 IL-1A (+4845) 대립유전자 2, IL-1B (+3954) 대립유전자 2, IL-1B (+6912) 대립유전자 2 및 IL-1RN (+2018) 대립유전자 2 등이 있다.

"IL-1X (Z) 대립유전자 Y"는 유전자 X에서의 IL-1 좌 다형성 부위에서 발생하여, 뉴클레오티드 Z 또는 그 부근에 위치하는 Y로 명명된 특정 대립유전자 형태를 의미하며, 여기서 X는 IL-1A, B 또는 RN 또는 IL-1 유전자 좌 중의 일부 다른 유전자이며, 뉴클레오티드 Z는 특정 IL-1 유전자 X의 주요 전사 개시 부위에 대하여 번호를 매긴 것으로서, 뉴클레오티드 + 1이다. 또한, 본 발명에서 사용된 용어 "IL-1X 대립유전자 (Z)"는 Z 또는 그 부근에 위치한 유전자 X에서의 IL-1 다형성 부위의 모든 대립유전자를 의미한다. 예를 들어, 용어 "IL-1RN (+2018) 대립유전자"는 마커 +2018에서 IL-1RN 유전자의 대안 형태를 의미한다. "IL-1RN (+2018) 대립유전자 1"은 센스 스트랜드의 위치 +2018에서 시토신(C)을 포함하는 IL-1RN 유전자 형태를 의미한다. Clay et al., Hum. Genet. 97: 723-26, 1996. "IL-1RN (+2018) 대립유전자 2"는 플러스 스트랜드의 +2018 위치에서 티미딘(T)을 포함하는 IL-1RN 유전자 형태를 의미한다. 피험체가 2개의 동일한 IL-1RN 대립유전자를 갖는 경우, 피험체는 동형접합성이라고 일컬어지거나 또는 동형접합 상태를 갖는다고 한다. 피험체가 2개의 다른 IL-1RN 대립유전자를 갖는 경우, 피험체는 이종접합성이라고 일컬어지거나 또는 이종접합 상태를 갖는다고 한다. 용어 "IL-1RN (+2018) 대립유전자 2,2"는 동형접합성 IL-1 RN (+2018) 대립유전자 2 상태를 의미한다. 반대로 용어 "IL-1RN (+2018) 대립유전자 1,1"은 동형접합성 IL-1 RN (+2018) 대립유전자 1 상태를 의미한다. 용어 "IL-1RN (+2018) 대립유전자 1,2"는 이형접합성 대립유전자 1 및 2 상태를 의미한다.

"IL-1 관련된"은 인간 염색체 2(2q 12-14) 상에서 인간 IL-1 좌 유전자(locus gene)에 관련된 모든 유전자를 포함하는 의미이다. 이들은 인터루킨-1α를 암호화하는 IL-1A 유전자, 인터루킨-1β를 암호화하는 IL-1B 유전자 및 인터루킨-1 수용체 길항제를 암호화하는 IL-1RN(또는 IL-1ra) 유전자를 포함하는, 염색체 2(2q 13-14)에 위치한 인간 IL-1 유전자 클러스터의 IL-1 유전자를 포함한다. 또한, 이들 IL-1 관련 유전자는 인간 염색체 2(2q12)에 위치된 I형 및 II형 IL-1 수용체 유전자 및 위치 19.5 cM에서 마우스 염색체 1상에 위치된 그들의 마우스 상동체를 포함한다. 인터루킨-1, 인터루킨-1 및 인터루킨-1RN은 그들 모두가 IL-1 I형 수용체에 결합하는 것 만큼 관련되어 있으나, 인터루킨-1RN이 자연 발생적인 길항제 리간드인데 반해 인터루킨-1 및 인터루킨-1만이 IL-1 I형 수용체를 활성화시키는 작용제 리간드이다. "IL-1"이 유전자 생성물 또는 폴리펩티드에 관한 참조 문헌에 사용되는 경우, 이는 인간 염색체(2q 12-14) 상의 인터루킨-1 좌에 의해 암호화된 모든 유전자 생성물 및 다른 종으로부터 유래하는 그들의 상응하는 상동체 또는 이의 기능적 변이체를 의미하는 것이다. 따라서, IL-1이라는 용어는 염증 반응을 촉진시키는 분비 폴리펩티드, 예를 들어 IL-1 및 IL-1β뿐만 아니라 염증 반응을 길항하는 분비된 폴리펩티드, 예를 들어 IL-1α 수용체 길항제 및 IL-1 II형(디코이) 수용체를 포함한다.

"IL-1 수용체" 또는 "IL-1R"은 IL-1 좌-암호화된 리간드에 결합할 수 있거나, 상기 리간드로부터 신호를 전달할 수 있는 여러가지 세포 막 결합된 단백질 수용체를 의미한다. 상기 용어는 인터루킨-1(IL-1)을 결합할 수 있는 임의의 단백질에 적용되며, 포유동물 혈장 막 단백질로서 그들의 천연 배치로 세포에 IL-1에 의해 제공된 신호를 전달하는 데 중요한 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 본원에 사용한 바와 같이, 상기 용어는 IL-1 결합 활성 또는 신호 전달 활성을 보유하는 천연 단백질의 유사체를 포함한다. 그 예로는 미국 특허 제4,968,607에 기술된 인간 및 쥐과동물 IL-1 수용체를 들 수 있다. "IL-1 핵산"은 IL-1 단백질을 암호화하는 핵산을 의미한다.

"IL-1 폴리펩티드" 및 "IL-1 단백질"은 도 1, 도 2 및 도 3에 나타낸 IL-1 게놈 DNA에 의해 암호화된 아미노산 서열 또는 이의 단편, 및 이의 상동체를 포함하고, 작용제 및 길항제 폴리펩티드를 포함하는 의미이다.

"면역계(immune system)"는 바이러스, 박테리아, 기생충, 장내 기생충, 균류, 곤충, 원생동물 등에 의한 감염을 예방하며, 일반적으로 외래 물질 또는 비자기 물질에 대한 보호를 제공하기 위해 기능하는, 세포와 인자들로 이루어진 복잡한 시스템이다. 또한, 면역계는 신체의 손상된 세포 또는 사멸된 세포, 예를 들어 암세포를 파괴하는 기능도 수행한다. 또한, 면역계는 자기와 비자기를 구별하고, 염증 및 전신성 쇼크를 매개하는 기능도 담당한다. 손상된 면역계는 이들 활성중 임의의 활성에 결함이 생긴 것을 의미한다.

본원에 사용한 "...을 포함하는(including)"이라는 용어는 "...을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다"라는 의미로 사용된 것이며, "...을 포함하는"과 "...을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다"라는 용어는 상호교환적으로 사용된 것이다.

"증가된 위험(Increased risk)" 또는 "증가된 감수성(Increased susceptibility)"은 특정 다형성 대립유전자를 보유하는 개체에서 질병이나 질환의 출현 빈도가 특정 다형성 대립유전자를 보유하지 않는 다수의 군집내에서 상기 질병이나 질환의 출현 빈도 보다 통계학적으로 더 높다는 것을 의미한다.

"상호작용하다(interact)"는 분자들 사이에 검출할 수 있는 관계 또는 회합(예를 들어 생화학적 상호작용)을 의미하는 것으로, 그 예로는 자연적으로 단백질-단백질, 단백질-핵산, 핵산-핵산 및 단백질-소 분자 또는 핵산-소 분자를 의미한다.

"분리된(isolated)"은 DNA 또는 RNA와 같은 핵산에 대해 사용되는데, 거대분자의 천연 소스내에 존재하는 다른 각각의 DNA 또는 RNA로부터 분리된 분자를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 IL-1 폴리펩티드중 하나를 암호화하는 분리된 핵산은 게놈 DNA 내에서 IL-1 유전자와 자연적으로 가장 측접하는 10 kb 이하의 핵산 서열을 포함하는 것이 바람직하며, 상기한 바와 같은 자연 발생하는 측접 서열 1.5 kb 미만을 포함하는 것이 더 바람직하다. 본원에 사용된 '분리된'이란 용어는 재조합 DNA 기법으로 생성되는 경우 세포성 물질, 바이러스성 물질 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 보유하지 않는 핵산 또는 펩티드를 의미한다. 또한, "분리된 핵산"은 단편으로서 자연발생하지 않으며, 자연 상태에서 확인되지 않는 핵산 단편을 포함하는 의미이다. 또한, 본원에 사용한 용어 '분리된'은 다른 세포성 단백질로부터 분리된 폴리펩티드를 의미하며, 정제된 폴리펩티드 및 재조합 폴리펩티드 둘 다를 포함하는 의미하다.

"넉-인(knock-in)" 트랜스게닉 동물은 그의 게놈내로 변형된 유전자가 도입된 동물을 의미하는 것이며, 변형된 유전자는 외인성 유전자일 수도 있고 내인성 유전자일 수도 있다.

"넉-아웃(knock-out)" 트랜스게닉 동물은 내인성 유전자의 발현이 부분적으로 또는 완전하게 억제된 동물을 의미한다(예를 들어, 상기 유전자의 적어도 일부분의 결실, 상기 유전자의 적어도 일부분의 제2 서열로의 치환, 정지 코돈의 도입, 결정적인 아미노산을 암호화하는 염기의 돌연변이 또는 인트론 연접부의의 제거 등에 기초한다).

"넉-아웃 작제물(knock-out construct)"은 세포 내에서 내인성 DNA 서열에의해 암호화된 단백질의 발현을 감소 또는 억제하는 데 사용할 수 있는 핵산 서열을 의미한다. 단순한 예에서, 넉-아웃 작제물은 유전자의 결정적인 부분에 결실이 일어나 그로부터 활성 단백질이 발현될 수 없는, IL-1RN 유전자와 같은 유전자를 포함한다. 대안으로, 다수의 종결 코돈을 천연 유전자에 첨가하여 단백질의 조기 종결을 유발하거나 인트론 연접부를 불활성화시킬 수 있다. 전형적인 넉-아웃 작제물에서, 상기 유전자의 일부분은 선택가능한 마커(예를 들어, 네오(neo) 유전자)로 치환되어, 상기 유전자는 다음과 같이 나타낼 수 있다: IL-1RN5'/neo/IL-1RN3'(이때, IL-1RN5' 및 IL-1RN3'은 각각 IL-1RN의 일부분에 대해 상류 및 하류인 게놈 서열 또는 cDNA 서열을 의미하며, 네오는 nEOAycin 내성 유전자를 의미한다). 다른 넉-아웃 작제물에서, 제2 선택가능한 마커는 측접 위치내에 부가하여 상기 유전자는 다음과 같이 나타낼 수 있다: IL-1RN/neo/IL-1RN/TK(이때, TK는 이전 작제물의 IL-1RN5' 또는 IL-1RN3' 서열에 부가될 수 있으며, 적합한 배지에서 선택할 수 있는, 즉 네가티브 선택가능한 마커인 티미딘 키나제이다). 상기 2개의 마커 작제물은 상동성 재조합 과정의 선택을 가능하게 하며, 전형적으로 TK 서열을 보유하는 비상동성 재조합 과정으로부터 측접하는 TK 마커를 제거한다. 유전자 결실 및/또는 치환은 엑손, 인트론, 구체적으로 인트론 연접부 및/또는 조절 영역, 예를 들어 프로모터에서 일어날 수도 있다.

"연관 비평형(linkage disequilibrium)"은 주어진 대조용 군집에서 각각의 대립유전자의 개별적인 출현 빈도로부터 예상할 수 있는 것 보다 더 큰 빈도로 2개의 대립 유전자의 동시 유전을 의미한다. 독립적으로 유전되는 2개의 대립유전자의예상된 출현 빈도는 제1 대립유전자의 빈도에 제2 대립유전자의 빈도를 곱한 것이다. 예상된 빈도로 동시에 발생하는 빈도는 "연관 평형(linkage equilibrium)"이라 칭한다. 연관 비평형의 원인은 종종 명백하지 않다. 이는 특정 대립유전자 조합에 대한 선택에 기인하는 것일수도 있고, 유전적으로 이종성인 군집의 새로운 혼합에 기인하는 것일 수도 있다. 또한, 질병 유전자에 매우 견고하게 결합하는 마커의 경우, 질병 돌연변이가 바로 이전에 일어나는 경우, 대립 유전자(또는 결합된 대립유전자 군)과 질병 유전자와의 회합이 예상되므로, 특정 염색체 영역내에서 재조합 과정을 통해 달성하려는 평형을 위해 충분한 시간이 경과되지 않는다. 하나 이상의 대립유전자를 포함하는 대립유전자 패턴을 언급하는 경우, 제1 대립유전자 패턴은, 제1 대립유전자 패턴을 포함하는 모든 대립유전자가 제2 대립유전자 패턴의 대립유전자의 하나 이상과 연관 비평형인 경우, 제2 대립유전자 패턴과 연관 비평형이다. 연관 비평형의 예는 IL-1RN(+2018) 및 IL-1RN(VNTR) 다형성 위치에서 대립유전자 사이에서 발생하는 것을 들 수 있다. IL-1RN(+2018)에서 2개의 대립유전자는 대립유전자 1 및 대립유전자 2인, IL-1RN(VNTR)의 가장 빈번한 2개의 대립유전자와 100% 연관 비평형이다.

"마커(maker)"는 개체들 사이에서 다양한 것으로 알려진 게놈내 서열을 의미한다. 예를 들어, IL-1RN 유전자는 가변수의 직렬 반복부(VNTR)로 구성되는 마커를 보유한다. 주어진 마커에서 상이한 서열 변이체는 대립유전자, 돌연변이 또는 다형성이라 칭한다. 예를 들어, VNTR 마커는 5개 이상의 상이한 대립유전자를 보유하는데, 이들중 3개는 흔한 것이 아니다. 상이한 대립유전자는 치환, 삽입 또는 결실을포함하는 단일 염기 변화를 보유할 수 있거나, 또는 치환, 삽입, 결실, 반복, 역위 및 이의 조합을 포함하는, 다수의 염기에 영향을 미치는 변화를 보유할 수 있다.

"조절하다(modulate)"는 생활성을 조절하는 물질의 능력을 의미한다. IL-1 생활성에 적용하는 경우, 작용제 또는 길항제는 예를 들어, IL-1 합성, 수용체 상호작용 또는 IL-1 매개된 신호 전달 메카니즘을 작동 작용하거나 길항 작용함으로써 생활성을 조절할 수 있다.

"돌연변이된 유전자(mutated gene)" 또는 "돌연변이(mutation)" 또는 "기능적 돌연변이(functional mutation)"는 유전자의 대립유전자 형태를 의미하는 것으로, 이는 돌연변이된 유전자를 보유하지 않은 개체에 대해 돌연변이된 유전자를 보유하는 개체의 표현형을 변경시킬 수 있다. 돌연변이에 의해 유발된, 변경된 표현형은 특정 제제에 의해 보정되거나 보상될 수 있다. 개체가 변경된 표현형을 보유하기 위해 이 돌연변이에 대해 동형접합성이어야 하는 경우, 상기 돌연변이는 열성이라 칭한다. 돌연변이된 유전자의 한 사본이 개체의 표현형을 변경시키기에 충분한 경우, 상기 돌연변이는 우성이라 칭한다. 임의 개체가 돌연변이된 유전자의 한 사본을 보유하고, 동형접합성 개체의 표현형과 이형접합성 개체의 표현형 사이의 표현형을 보유하는 경우, 상기 돌연변이는 공동우성이다.

"신경학적 기능(neurological function)"은 중추신경계, 말초신경계, 자율신경계 및 신경 세포와 신경 세포에 의해 조절된 세포에 의한 호르몬과 인자의 생성을 포함하는, 신경계의 모든 활성을 의미한다.

본 발명의 "비인간 동물(non-human animal)"은 설치류, 비인간 영장류, 양,개, 소, 염소 등과 같은 포유류를 포함하는 의미이다. 바람직한 비인간 동물은 래트와 마우스를 포함하는 설치류로부터 선택되고, 가장 바람직하게는 마우스, 트랜스게닉 양서류, 예를 들어 제노퍼스(Xenopus) 속의 구성원으로부터 선택되며, 또한 트랜스게닉 닭은 예를 들어, 배아 형성 및 조직 형성을 에 영향을 미칠 수 있는 제제를 이해하고 확인하기 위한 중요한 도구를 제공한다. 본원에 사용한 "키메라 동물(chimeric animal)"은 동물의 일부 세포(모든 세포는 아님)에서 재조합 유전자가 확인되거나 발현되는 동물을 의미한다. "조직 특이성 키메라 동물"은 다른 조직이 아닌 일부 조직에서 재조합 IL-1 유전자중 하나가 존재하고/하거나 발현되거나 붕괴되는 것을 의미한다. "비인간 동물"은 인간을 제외하고, 포유류의 임의의 구성원을 의미한다.

본원에 사용한 바와 같이, "핵산"은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 데옥시리보핵산(DNA)을 의미하고, 경우에 따라 리보핵산(RNA)을 의미하기도 한다. 또한, 상기 용어는 뉴클레오티드 유사체(예를 들어, 펩티드 핵산)으로 제조한 RNA 또는 DNA의 유사체를 등가물로서 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 경우에 따라 단일(센스 또는 안티센스) 및 이중 스트랜드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

"영양약학제품(nutraceuticals)"은 비타민, 미네랄, 단백질, 아미노산, 당, 식물성 에스트로겐, 플라보노이드, 페놀류, 안토시아닌, 카로티노이드, 상기 물질들의 중합체 및 상기 물질들의 혼합물을 포함하는 물질을 의미한다.

본원에 사용한 용어 "또는"은 명백하게 달리 언급하지 않는 한 "및/또는"의의미이다.

"다형성(polymorphism)"은 유전자 또는 이의 부분(예를 들어, 대립유전자)의 하나 이상의 형태가 공존하는 것을 의미한다. 2개 이상의 상이한 형태가 존재하는 유전자의 부분, 즉 2개의 상이한 뉴클레오티드 서열은 "다형성 영역(polymorphic region)"이라 언급한다. 본원에 사용한 바와 같이, "다형성 영역"은 단일 뉴클레오티드로 이루어진 다형성 부위, 예를 들어 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 포함하나, 이로 제한되는 것은 안니다. 다형성 영역에서 특이적인 유전 서열은 대립유전자이다. 다형성 영역은 단일 뉴클레오티드일 수도 있고, 상이한 대립유전자에서 다른 아이덴티티일 수도 있다. 또한, 다형성 영역은 길이가 하나 이상의 뉴클레오티드일 수 있으며, 길이가 상당히 긴 것도 가능하다.

본원에 사용한 용어 "경향(propensity)"는 질환 또는 질병 상태를 의미하는 것인데, 질환 또는 질병의 "경향"은 "감수성" 또는 "소인(predisposition)"과 상호교환적으로 사용된다. 질환 또는 질병 상태에 관한 참조문헌에서 사용된 바와 같이 "경향"은 개체가 향후 질환 또는 질병이 발생할 증가된 위험에 처해 있음을 나타낸다. 예를 들어, 대립유전자가 특정 질환 또는 질병과 관련되어 있거나, 그렇게 예측되는 경우, 상기 대립유전자를 보유하는 개체는 특정 질환 또는 질병이 발생할 더 큰 위험을 보유한다.

"반응성 산소종(reactive oxygen species)"은 산화로 인해 발생하는 탄소 라디칼, 퍼옥사이드, 산소 라디칼, 수퍼옥사이드 및 산화로 인해 발생하는 금속 라디칼을 포함한다.

"소 분자(small molecule)"는 분자량이 약 5 kD, 가장 바람직하게는 약 4 kD인 조성물을 의미한다. 소 분자는 핵산, 펩티드, 펩티드유사체, 탄수화물, 지질 또는 기타 유기 또는 무기 분자일 수 있다.

본원에 사용한 용어 "특이적으로 하이브리드화하다(specifically hybridizes)" 또는 "특이적으로 검출하다(specifically detects)"는 샘플 핵산의 거의 6개 이상의 보존적 뉴클레오티드에 하이브리드화하는 핵산 분자의 능력을 의미한다.

"전사 조절 서열(transcriptional regulatory sequence)"은 본 명세서 전체에 걸쳐 사용된 일반적인 용어이며, 개시 신호, 인핸서 및 프로모터와 같은 DNA 서열을 의미하며, 이들은 이들이 작동가능하게 결합된 단백질 암호 서열의 전사를 유도 또는 조절한다.

본원에 사용한 용어 "트랜스유전자(transgene)"는 세포내에 도입된 핵산 서열(암호화 서열, 예를 들어 IL-1 폴리펩티드중 하나를 암호화하는 서열 또는 그것에 대한 안티센스 전사체)을 의미한다. 트랜스유전자는 그것이 도입되는 트랜스게닉 동물 또는 세포의 내인성 유전자에 대해 부분적으로 또는 전적으로 이종 유전자, 즉 외래 유전자이거나, 또는 그것이 도입되는 트랜스게닉 동물 또는 세포의 내인성 유전자에 대해 동종 유전자이나, 동물의 게놈내로 삽입되도록 구성되거나 삽입되어 그것이 삽입된 세포의 게놈을 변경시키는 유전자이다(예를 들어, 천연 유전자의 위치와는 상이한 위치에서 삽입되거나, 그의 삽입은 녹아웃을 일으킨다). 또한, 트랜스유전자는 에피좀의 형태로 세포내에 존재한다. 트랜스유전자는 하나 이상의 전자 조절 서열을 포함할 수 있으며, 선택된 핵산의 최적 발현을 위해 필요할 수 있는 임의의 다른 핵산, 예를 들어 인트론을 포함할 수 있다.

"트랜스게닉 동물(transgenic animal)"은 동물의 세포중 하나 이상이 인위적인 방법, 예를 들어 당업계에 널리 알려진 트랜스게닉 기법에 의해 도입된 이종 핵산을 함유하는 임의의 동물, 바람직하게는 비인간 포유류, 조류 또는 양서류를 의미한다. 상기 핵산은 세포내로 직접적으로 또는 간접적으로 도입되는데, 세포의 전구물질 내로 도입하거나, 유전자 조작, 예를 들어 미세주입 또는 재조합 바이러스를 이용하는 감염에 의해 도입된다. '유전자 조작"이라는 용어는 고전적인 교배, 또는 시험관내 수정을 포함하나, 오히려 재조합 DNA 분자를 도입하는 것을 의미한다. 상기 분자는 염색체 내로 통합되거나, 염색체와는 독립적으로 복제하는 DNA일 수도 있다. 본원에 기술한 전형적인 트랜스게닉 동물에서, 트랜스유전자는 세포로 하여금 IL-1 폴리펩티드중 하나의 재조합 형태, 예를 들어 작용제형 또는 길항제형을 발현하도록 한다. 그러나, 예를 들어, 후술하는 FLP 또는 CRE 리컴비나제 의존성 작제물의 경우에는 재조합 유전자가 침묵 유전자인 트랜스게닉 동물도 고려할 수 있다. 또한, "트랜스게닉 동물"은 하나 이상의 유전자의 유전자 붕괴가 재조합 기법 또는 안티센스 기법 등에 의해 인위적으로 유발된 재조합 동물도 포함한다. 상기 용어는 모든 자손 세대를 포함하는 의미이다. 따라서, 선조 동물 및 모든 F1, F2, F3 등 이의 자손이 포함된다.

"치료하는(treating)"이란 용어는 질병의 하나 이상의 증상 또는 질환과 관련된 하나 이상의 비정상을 치료하는 것 뿐만 아니라 경감시키는 것을 의미한다.

"벡터"란 용어는 한 핵산을 그 핵산이 연결되는 다른 핵산에 전달할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 바람직한 한 유형의 벡터는 에피좀, 즉 염색체와는 독립적으로 복제할 수 있는 핵산이다. 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있는 벡터는 "발현 벡터"라 칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 자신의 형태로 염색체에 결합하니 않는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미하는 "플라스미드" 형태이다. 본원에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호 대체가능한 용어인데, 그 이유는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터의 형태이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 동일한 기능을 수행하며 당업계에 후속적으로 공지되는 다른 형태의 발현 벡터를 포함하는 것으로 의도된다.

"야생형 대립유전자(wild-type allele)"란 용어는 개체 내에서 2개의 사본이 존재하는 경우, 야생형 표현형을 생성하는 유전자의 대립유전자를 의미한다. 특정 유전자의 몇가지 상이한 유형의 대립유전자가 존재할 수 있는데, 그 이유는 유전자내 특정 뉴클레오티드 변화는 뉴클레오티드가 변화된 유전자의 2개의 사본을 보유하는 개체의 표현형에 영향을 미치지않을 수 있기 때문이다.

예측 의약

노화와 관련된 다형성

본 발명은 노화 관련 질환의 초기 발병과 관련된 대립유전자의 동정에 적어도 부분적으로 기초한다. 따라서, 개체 내에서 단독으로 또는 다른 수단과 병용하는 이들 대립유전자의 검출은 상기 개체가 EOA를 보유하거나, EOA에 대한 소인이 있는지를 나타낸다. 예를 들어, EOA와 관련된 IL-1 다형성 대립유전자는 하기 마커들[IL-1A(+4845), IL-lB(+3954) 및 IL-1RN (VNTR)] 각각의 대립유전자 2를 포함하거나, 또는 상기한 대립유전자중 하나와 연관 비평형인 대립유전자를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기한 IL-1 다형성 좌(polymorphic loci) 중 하나 이상의 특정 대립유전자 패턴의 존재를 사용하여 EOA 발병에 대한 개체의 감수성을 예측한다. 구체적으로, EOA와 여러가지 관련성을 나타내는 IL-1 유전자 클러스터내 좌에서 대립유전자의 3가지 패턴이 존재한다. 이들 패턴은 본원에서 패턴 1, 패턴 2 및 패턴 3으로 칭한다. 바람직한 구체예에서, 이들 패턴중 임의 패턴의 검출은 개체가 EOA를 보유할 것이라는 대략적인 정보를 제공한다. 패턴 1은 수명 단축과 관련되어 있다. 패턴 2의 검출은 개체가 조기 세포성 노화에 대한 소인이 있음을 나타낸다.

이들 IL-1 좌 다형성은 IL-lA/IL-1B/IL-1RN 유전자 클러스터내 단일 염기 변이를 나타낸다(참조: 도 4). IL-lA(+4845) 다형성은 염증성 시토킨 IL-1a를 암호화하는 IL-1A의 엑손 V내 위치 +4845에서 단일 염기 변이(대립유전자 1은 G이고, 대립유전자 2는 T임)를 나타낸다(Gubler 등, (1989) Interleukin, inflammation and disease (Bomford and Henderson, eds.) p.31-45, Elsevier publishers; and Van den velden and Reitsma (1993) Hum Mol Genetics 2:1753-50). IL-lA(+4845) 다형성은 상기 유전자의 암호 영역내에서 발생하며, 암호화된 단백질내 단일 아미노산 변이를 초래한다(Van den Velden and Reitsma (1993) Hum Mol (Genet 2: 1753). IL-lB(+3954) 다형성은 Taq I 제한 단편 길이 다형성(RFLP)으로서 최초 기술되었으며(Pociot 등, (1992) But J Clin Invest 22: 396-402), 후속적으로 IL-lB 유전자의 엑손 V내 +3954 위치에서 단일 염기 변이(대립유전자 1은 C이고, 대립유전자 2는 T임)로 특성이 규명되었다(di Giovine 등, (1995) Cytokine 7: 600-606). IL-1B의 오픈 리딩 프레임내 단일 뉴클레오티드 변화는 암호화된 IL-1 베타 폴리펩티드의 서열에 정성적으로 영향을 미치지않는 것으로 나타났는데, 그 이유는 상기 변화가 대립유전자 1의 TTC 페닐알라닌 코돈(F)의 제3 위치에서 발생하며, 따라서 대립유전자 2는 단지 IL-1B 유전자 생성물의 아미노산 105를 암호화하는 상기 위치에서 TTT 페닐알라닌 코돈을 대체하기 때문이다. 또한, IL-1RN(+2018) 다형성(Clay 등, (1996) Hum Genet 97: 723-26)은 단일 염기 변이(대립유전자 1은 T이고, 대립유전자 2는 C임)이고, 또한 엑손 2(8006)로 칭한다(8006에서 GenBank:X64532). 최종적으로, 직렬 반복부의 IL-RN 변수(VNTR) 다형성은 제2 인트론 1L-1 수용체 길항제 암호화 유전자 내에서 발생한다(Steinkasserer (1991) Nucleic Acids Res 19; 5090-5). IL-1RN(VNTR) 다형성의 대립유전자 2는 86개 염기쌍 서열의 2개의 반복부에 상응하는 반면, 대립유전자 1은 4개의 반복부에 상응하며, 대립유전자 3은 3개의 반복부에 상응하며, 대립유전자 4는 5개의 반복부에 상응하며, 대립유전자 5는 6개의 반복부에 상응한다(Tarlow 등, (1993) Hum Genet 91: 403-4). 개체내 이들 IL-1 대립유전자 변이체중 임의의 한 변이체의 검출은 개체가 노화 관련 질환의 조기 발병에 대해 증가된 감수성을 보유함을 암시하는 것이다.

그러나, 이들 대립유전자는 다른 대립유전자와 연관 비평형이기 때문에, 다른 연관된 대립유전자의 검출은 개체가 노화 관련 질환의 조기 발병에 대한 증가된 감수성을 보유하고 있음을 나타낼 수 있다. 예를 들어, IL-l(33221461) 일배체형의 하기 대립유전자들은 연관 비평형이다:

IL-lA의 222/223 마커의 대립유전자 3

IL-lA의 gz5/gz6 마커의 대립유전자 3

IL-lA의 -889 마커의 대립유전자 2

IL-lB의 +3954 마커의 대립유전자 2

IL-lB의 -3737 마커의 대립유전자 1

IL-lA의 -511 마커의 대립유전자 1

gaat.p33330 마커의 대립유전자 4

Y31 마커의 대립유전자 6

IL-lRN의 VNTR 또는 (+2018) 마커의 대립유전자 1

따라서, IL-lB(-511)의 대립유전자 1 및 IL-1RN(VNTR)의 대립유전자 1은 서로 강한 연관 비평형이고, 이들 각각은 IL-1B의 -511 마커의 대립유전자 1과 연관 비평형이다. 또한, 본 발명의 대안적인 구체예에서, IL-lA의 222/223 마커, IL-lA의 gz5/gz6 마커, IL-lA의 -889 마커, IL-lB의 +3954 마커, IL-1B/IL-lRN 유전자간 영역의 gaat.p33330 마커 또는 IL-1B/IL-lRN 유전자간 영역의 Y31 마커에서 유전형 분석을 수행하며, 하나 이상의 바람직한 EOA-예측 대립유전자에 연관된 다형성 대립유전자의 존재가 검출된다.

또한, IL- 1RN(+2018) 다형성의 대립유전자 2는 44112332 인간 일배체형의 일부분인 IL-lRN(VNTR) 다형성 좌의 대립유전자 2와 연관 비평형인 것으로 알려져 있다. 44112332 일배체형은 다음과 같은 유전형을 포함한다:

IL-lA의 222/223 마커의 대립유전자 4

IL-lA의 gz5/gz6 마커의 대립유전자 4

IL-lA의 -889 마커의 대립유전자 1

IL-lB의 +3954 마커의 대립유전자 1

IL-lB의 -3737 마커의 대립유전자 1

IL-lA의 -511 마커의 대립유전자 2

gaat.p33330 마커의 대립유전자 3

Y31 마커의 대립유전자 3

IL-lRN의 VNTR 마커의 대립유전자 3

유사하게, IL-lRN 교호 엑손(엑손 lic, 유전자 생성물의 세포내 형태를 생성함)내 3개의 다른 다형성은 IL-1RN(VNTR)의 대립유전자 2와 연관 비평형이다(Clay 등, (1996) Hum Genet 97: 723-26). 이들은 IL-lRN 엑손 lic(1812) 다형성(1812에서 GenBank:X77090); IL-lRN 엑손 lic(1868) 다형성(1868에서 GenBank:X77O9O); 및 IL-1RN 엑손 lic(1887) 다형성 (1887에서 GenBank:X77090)을 포함한다. 또한, 상기 유전자의 교대로 스플라이싱된 세포내 형태를 위한 프로모터내 다른 다형성인 Pic(1731) 다형성(1731에서 GenBank:X77090)도 IL-lRN(VNTR) 다형성 좌의 대립유전자 2와 연관 비평형이다(Clay 등, (1996) Hum Genet 97: 723-26). 이들 IL-lRN 다형성 좌 각각에 대해 상응하는 서열 교호부는 다음과 같다.

대립유전자#	엑손 2(IL-1RN의 +2018)	엑손 1ic-1(GB:X77090의 1812)	엑손 1ic-2(GB:X77090의 1868)	엑손 1ic-3(GB:X77090의 1887)	Pic(GB:X77090의 1731)
1	T	G	A	G	G
2	C	A	G	C	A

이들 다형성 좌 각각에 있어서, 대립유전자 1 서열 변이체는 IL-1RN(VNTR) 좌의 대립유전자 1과 연관 비평형인 것으로 결정되었다(Clay 등, (1996) Hum Genet 97: 723-26).

패턴 3이라 칭하는 제3 일배체형은 연관 비평형 상태로 다음과 같은 대립유전자를 포함한다.

IL-1A의 -889 마커의 대립유전자 1

IL-1A의 +4845 마커의 대립유전자 1

IL-1B의 +3954 마커의 대립유전자 1

IL-1B의 -511 마커의 대립유전자 1

IL-1B의 -3737 마커의 대립유전자 2

IL-1RN의 +2018 마커의 대립유전자 1

IL-1RN의 VNTR 마커의 대립유전자 1

패턴 3은 3가지 패턴중 가장 낮은 염증을 일으키는 것으로 생각된다. 한 연구에서, 60세를 넘는 239명의 개체를 대상으로 C-반응성 단백질(CRP)에 대해 평가하였다. 확실한 패턴 1을 가진 개체는 패턴 3 보다 75% 더 높은 CRP를 보유하였다. 확실한 패턴 2를 가진 개체는 패턴 3 보다 11-26% 더 높은 CRP를 보유하였다. 패턴 3을 가진 개체는 혈관형성 및 스텐트를 시술한 후 관상동맥 재발협착증에 대한 위험이 더 높았다. 또한, 패턴 3을 가진 개체는

i. 조기 만성 질병에 대한 감소된 위험

ii. 항염증제에 대한 유해 반응 및

iii. 감염성 질병 및 이들의 합병증에 대한 증가된 위험

을 나타낼 수 있는 것으로 생각된다.

상기한 대립유전자 패턴 이외에, 당업자는 본원의 기재 내용을 참조하여 EOA와 관련된 대립유전자와 연관 비평형인 다른 대립유전자(다형성 및 돌연변이를 포함함)를 용이하게 동정할 수 있다. 예를 들어, 공지된 EOA 관련 대립유전자가 없는 제1 군의 개체로부터 유래한 핵산 샘플 뿐만 아니라 하나 이상의 EOA 관련 대립유전자를 보유하는 제2 군의 개체로부터 유래한 DNA를 수집할 수 있다. 이어서, 상기 핵산 샘플을 비교하여 제1 군과 비교시 제2 군에 과도하게 나타난 대립유전자를 동정할 수 있는데, 이때 상기 대립유전자들은 아마도 EOA와 관련되어 있을 것이다. 대안으로, EOA 관련 대립유전자와 연관 비평형인 대립유전자는 예를 들어 대형 군집의 유전형을 분석하고 통계학적 분석을 수행하여 대립유전자가 예상보다 더 공통적으로 함께 나타나는가를 결정함으로써 동정할 수 있다. 바람직하게는, 상기 군은 유전적으로 관련된 개체를 포함하는 것으로 선택된다. 유전적으로 관련된 개체는 동일한 종(race), 동일한 인종 집단(ethnic group) 또는 심지어 동일한 가계(family)로부터 유래하는 개체를 포함한다. 대조군과 시험군 사이의 유전적 관련성의 정도가 증가함에 따라, 발병 대립유전자에 더 약하게 연관된 다형성 대립유전자의 예측값도 증가한다. 그 이유는 덜 경과된 진화 시간이 선조군 내에서 염색체를 따라 연관된 다형성의 유전적 교차 현상을 통해 재분배를 가능하게 하기 때문이다. 따라서, 종 특이성, 인종 집단 특이성 및 가계 특이성 진단 유전형 분석법이 개발되어, 예를 들어 주 인간 종의 발산후, 인간 군집의 구별되는 인종 집단으로의 분리후, 및 특정 가계의 최근 내력에서 최근의 인간 진화에서 발생한 질병 대립유전자의 검출이 가능하게 되었다.

두개의 다형성 마커 또는 하나의 다형성 마커와 발병 돌연변이 사이의 연관 비평형은 준안정 상태이다. 선택적 압력 또는 근복적인 돌연변이 현상의 산발적인 관련 재발이 없으면, 다형성은 염색체 재조합 현상에 의해 실질적으로 단절될 것이며, 인간 진화 과정을 통해 연관 평형에 도달할 것이다. 따라서, 질병 또는 질환과 연관 비평형 상태의 다형성 대립유전자를 발견하는 것은 2가지 이상의 요인, 즉 다형성 마커와 발병 돌연변이 사이의 물리적인 거리의 감소 및 연관된 쌍의 분리를 위해 사용할 수 있는 감수분열 세대 수의 감소의 변화에 따라 증가할 수 있다. 후자의 요인을 고려하는 것은 두 개체가 더 밀접하게 관련되어 있을수록, 이들이 연관된 다형성을 함유하는 공통적인 모 염색체 또는 염색체 영역을 더 공유할 것이며이 연관된 쌍은 감수분열성 교차 현상이 발생하는 각 세대를 통해 덜 연관될 것이라는 것을 암시한다. 결과적으로, 두 개체가 더 밀접하게 관련되어 있을 수록, 넓게 배치된 다형성이 더 동시유전될 수 있다. 따라서, 공통적인 종, 인종 집단 또는 가계에 의해 관련된 개체에 있어서, 더욱 더 넓게 배치된 다형성 좌의 신뢰성은 연관된 발병 돌연변이의 유전의 지표로서 사용할 수 있다.

적합한 프로브는 IL-1 좌의 특이적인 유전자, 예를 들어 IL-lA, IL-lB 또는 IL-1RN 또는 관련 유전자에 하이브리드화하도록 구성할 수 있다. 이들 게놈 DNA 서열은 도 1, 도 2 및 도 3에 각각 나타냈으며, 각각 서열 번호 15, 서열 번호 16 및 서열 번호 17에 상응한다. 대안으로, 이들 프로브는 유전자간 서열을 포함하는 관련 게놈 좌의 다른 영역에 혼입될 수 있다. 실제로, 인간 염색체 2의 IL-1 영역은 400,000 염기쌍에 걸치며, 평균적으로 매 1,000 염기쌍 당 하나의 단일 뉴클레오티드 다형성을 포함하여 단독으로 400 SNP를 포함한다. 그러나, 본 발명에 사용할 수 있는 다른 다형성은 여러가지 공용 소스로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 게놈 데이타베이스는 분자간 SNP를 포함하며, 서열에 의해 조사할 수 있으며, 현재 약 2,7000 엔트리를 함유한다(http://hgbase.interactiva.de). 또한, 메사추세츠 공과대학에서 관리하는 인간 다형성 데이타베이스(MIT SNP 데이타베이스 (http://www.genome.wi.mit.edu/SNP/human/index.html))도 사용할 수 있다. 이러한 소스로부터, SNPs 뿐만 아니라 다른 인간 다형성도 확인할 수 있다).

예를 들어, 이들 데이타베이스중 하나에서 인간 게놈의 IL-1 영역의 조사를 통해 IL-1 좌 유전자가 127.4 cM에서 마이크로새틀라이트 마커(microsatellitemarker) AFM22Oze3로 지정된 동원체 인접 다형성 마커(centiMorgans)(참조: GenBank Acc. No. Z17008) 및 127.9 cM에서 마이크로새틀라이트 고정 마커 AFMO87Xal로 지정된 이격 다형성 마커(참조: GenBank Aco. No. Z16545)와 측접하는 것을 확인하였다. 이들 인간 다형성 좌는 둘 다 CA 디뉴클레오티드 반복 마이크로새틀라이트 다형성이고, 인간 군집에서 높은 정도의 이형접합도를 나타낸다. 예를 들어, AFM22Oze3의 한 대립유전자는 서열이 TGTACCTAAGCCCACCCTT-TAGAGC(서열 번호 18)인 5' 프라이머와 서열이 TGGCCTCCAGAAACCTCCAA(서열 번호 19)인 3' 프라이머를 이용하여 211 bp PCR 증폭 생성물을 생성한다. 또한, AFMO87xal의 한 대립유전자는 서열이 GCTGATATTCTGGTGGGAAA(서열 번호 20)인 5' 프라이머와 서열이 GGCAAGAGCAAAACTCTGTC(서열 번호 21)인 3' 프라이머를 이용하여 177 bp PCR 증폭 생성물을 생성한다. 이들 인간 염색체 2 CA 디뉴클레오티드 반복 다형성의 5' 및 3'에 발생하는 독특한 서열에 상응하는 등가의 프라이머는 당업자에게는 명백할 것이다. 이상적인 등가의 프라이머는 약 1 kb의 지정된 프라이머내에 하이브리드화하며 추가로 약 17 bp 내지 약 27 bp중 임의의 위치에 존재하는 것을 포함한다. 독특한 인간 염색체 게놈 서열의 증폭을 위한 프라이머를 구성하기 위한 일반 지침은 프라이머가 약 50℃ 이상의 융점을 보유하도록 하는 것인데, 대략적인 융점은 T_용융= [2 x (A 또는 T의 #) + 4 x (G 또는 C의 #)] 식을 이용하여 산정할 수 있다.

다수의 다른 인간 다형성 좌는 이들 2개의 CA 디뉴클레오티드 반복 다형성 사이에서 발생하며, 유전적으로 관련된 개체의 가계 또는 다른 군에서 EOA 예후 대립유전자를 결정하기 위한 추가의 표적을 제공한다. 예를 들어, 내쇼날 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션 웹 사이트(www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/)는 IL-1 좌의 상기 영역내 다수의 다형성 마커 목록을 제공하며, 이들 마커의 증폭 및 분석을 위해 적합한 프라이머를 구성하는 데 필요한 지침을 제공한다.

따라서, 본 발명의 뉴클레오티드 분절은 인간 염색체 2q 12-13 또는 상기 영역에서 유래하는 cDNA와 이중 분자를 선택적으로 형성하거나 상기 영역으로부터 DNA 또는 cDNA의 증폭을 위한 프라이머를 제공한다. 이 목적을 위해 적합한 프로브의 구성은 다수의 인자를 고려해야 한다. 예를 들어, 길이가 10, 15 또는 18 뉴클레오티드 내지 약 20 또는 약 30 뉴클레오티드인 단편이 특히 유용할 것이다. 더 긴 서열, 예를 들어 40, 50, 80, 90, 100 뉴클레오티드, 심지어 전장 서열이 특정 구체예를 위해 한층 더 바람직하다. 약 18 내지 20 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드의 길이는 당업자에 의해 충분히 특이적인 하이브리드화를 가능하게 하기에 충분하며, 분자 프로브로서 유용한 것으로 받아들여진다. 또한, 적용 분야에 따라, 표적 서열을 향하는 프로브의 다양한 선택도를 획득하기 위해 당양한 하이브리드화 조건을 사용할 수 있을 것이다. 예를 들어, 상대적으로 낮은 염 및/또는 고온 조건, 예를 들어 약 50℃ 내지 약 70℃에서 0.02 M-0.15 M NaCl의 조건을 사용할 수 있다. 이러한 선택적인 조건은 프로브와 주형 또는 표적 스트랜드 사이에 미스매치를 거의 용인하지 않을 수 있다.

다른 대립유전자 또는 EOA의 다른 징후는 상기한 대립유전자의 검출과 함께 개체 내에서 검출하거나 모니터링할 수 있다.

대립유전자의 검출

인간 다형성 좌에서 특이적인 대립유전자를 검출하기 위해 다수의 방법을 사용할 수 있다. 특이적인 대립유전자를 검출하기 위한 바람직한 방법은 다형성의 분자 특성에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들어, 다형성 좌의 여러가지 대립유전자 형태는 DNA의 단일 염기쌍에 의해 달라질 수 있다. 이러한 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)은 유전적 변이에 대한 주 기여자인데, 알려진 모든 다형성의 80%를 차지하며, 인간 게놈 내에서 그들의 밀도는 1000 염기쌍 당 평균 1로 산정된다. (DNA에서 발생하는 4개의 상이한 뉴클레오티드 염기에 상응하는 4개 이하의 상이한 SNP가 이론적으로 가능함에도 불구하고) SNP는 단지 2개의 상이한 형태로 가장 빈번하게 이대립유전자성으로 발생하는 것이다. 그럼에도 불구하고, SNP는 다른 다형성에 비해 돌연변이적으로 더 안정하며, 마커와 미지의 변이체 사이의 연관 비평형이 발병 돌연변이를 지도화하기 위해 사용되는 회합 연구에 적합하다. 또한, SNP는 전형적으로 단지 2개의 대립유전자를 보유하기 때문에, 이들은 길이 측정 보다 단순한 +/- 분석법에 의해 유전형을 분석할 수 있으며, 자동화에 더 효과적이다.

개체내에 특정 단일 뉴클레오티드 다형성 대립유전자의 존재 검출에 사용할 수 있는 여러가지 방법이 있다. 이 분야의 발전은 정확하고, 용이하며, 저렴한 대용량 SNP 유전형 분석법을 제공하고 있다. 예를 들어, 최근에 개발된 몇몇 새로운 기법들로는 동적 대립유전자 특이성 하이브리드화(DASH), 마이크로플레이트 어레이 대각 겔 전기영동(MADGE), 파이로시퀀싱, 올리고뉴클레오티드 특이성 연결, TaqMan 시스템 뿐만 아니라 여러가지 DNA "칩" 기법, 예를 들어 아피매트릭스(Affymetrix) SNP 칩을 들 수 있다. 이들 방법은 전형적으로 PCR에 의한 표적 유전자 영역의 증폭을 필요로 한다. 새롭게 개발된 다른 방법은 침입성 절단에 의한 소 신호 분자의 생성에 이은 질량 분광법 또는 고정화된 패드록 프로브 및 롤링-서클 증폭에 기초하는데, 이 방법은 실질적으로 PCR의 필요성을 제거한다. 특이적인 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출하기 위한 업계에 공지된 몇몇 방법에 대해서는 개략적으로 후술한다. 본 발명의 방법은 사용할 수 있는 모든 방법을 포함하는 것으로 이해된다.

단일 뉴클레오티드 다형성의 분석을 용이하게 하기 위해 몇몇 방법이 개발되었다. 한 구체예에서, 단일 염기 다형성은 예를 들어 미국 특허 4,656,127(Mundy, C.R.)에 기술된 바와 같이 특정화된 엑소뉴클레아제 내성 뉴클레오티드를 이용하여 검출할 수 있다. 상기 방법에 따르면, 다형성 위치에 대해 바로 3' 대립유전자 서열에 상보적인 프라이머는 특정 동물 또는 인간으로부터 얻은 표적 분자에 하이브리드화할 수 있다. 표적 분자 상의 다형성 위치가 특정 엑소뉴클레아제-내성 뉴클레오티드 유도체에 상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 경우, 상기 유도체는 하이브리드화된 프라이머의 단부 상에 혼입될 것이다. 이러한 혼입은 프라이머가 엑소뉴클레아제에 내성을 갖게 하며, 결과적으로 그의 검출을 가능하게 한다. 상기 샘플의 엑소뉴클레아제-내성 유도체의 아이덴티티가 공지되어 있기 때문에, 프라이머가 엑소뉴클레아제에 대해 내성이라는 발견은 표적 분자의 다형성 위치 내에 존재하는 뉴클레오티드가 상기 반응에 사용된 뉴클레오티드 유도체의 뉴클레오티드에 상보적이라는 것을 의미한다. 이 방법은 다량의 외부 서열 데이타의 결정이 필요하지 않다는 장점이 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 용매계 방법을 이용하여 다형성 위치의 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정할 수 있다(Cohen, D. 등의 프랑스 특허 2,650,840; PCT 국제 공개 W091/02087). 미국 특허 4,656,127에서의 Mundy의 방법처럼, 다형성 위치의 바로 3' 대립유전자 서열에 상보적인 프라이머를 사용한다. 이 방법은 다형성 위치의 뉴클레오티드에 상보적인 경우 상기 프라이머의 말단 상에 혼입될 표지된 디데옥시뉴클레오티드 유도체를 이용하여 그 위치의 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정한다.

제네틱 비트 분석법 또는 GBA(상표명)으로 공지된 대안적인 방법은 Goelet, P. 등의 PCT 국제 공개 92/15712에 기재되어 있다. Goelet, P. 등의 방법은 표지된 종결자와 다형성 위치의 3' 서열에 상보적인 프라이머의 혼합물을 이용한다. 혼입되는 표지된 종결자는 평가하려는 표적 분자의 다형성 위치내에 존재하는 뉴클레오티드(표지된 종결자와 상보적임)에 의해 결정된다. Cohen, D. 등의 프랑스 특허 2,650,840; PCT 국제 공개 W091/02087에 기재된 방법과는 대조적으로, Goelet, P. 등의 방법은 바람직하게도 불균일 상 분석법이며, 이때 프라이머 또는 표적 분자는 고체 상에 고정화된다.

DNA 내에서 다형성 위치를 분석하기 위한 최근의 몇몇 프라이머 유도된 뉴클레오티드 혼입 과정은 문헌에 기술되어 있다(Konter, J. S. 등, Nuci. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989); Sokolov, B. P., NucI. Acids Res. 18:3671 (1990); Syvanen, A. -C. 등, Genomics 8:684-692 (1990); Kuppuswamy, M. N. 등, Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 88:1143-1147 (1991); Prezant, T. R. 등, Hum. Mutat. 1:159-164 (1992); Ugozzoli, L. 등, GATA 9:107-112 (1992); Nyren, P. 등, Anal.Biochem. 208:171-175 (1993)). 이들 방법은 모두 다형성 위치에서 염기들 사이를 구분하기 위해 표지된 데옥시뉴클레오티드의 혼입에 의존한다는 점에서 GBA(상표명)와 다르다. 이러한 포맷에서, 신호는 혼입된 데옥시뉴클레오티드의 수에 비례하기 때문에, 동일한 뉴클레오티드의 런(run)에서 발생하는 다형성은 상기 런의 길이에 비례하는 신호를 생성할 수 있다(Syvanen, A. -C. 등, Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59(1993)).

단백질 번역을 조기에 종결시키는 돌연변이에 있어서, 단백질 절두 테스트(protein truncation test; PTT)는 효율적인 진단법을 제공한다(Roest 등, (1993) Hum. Mol. Genet. 2:1719-21; van der Luijt 등, (1994) Genomics 20:1-4). PTT에 있어서, RNA는 이용할 수 있는 조직으로부터 최초 분리하고 역전사시키며, 소정의 절편은 PCR로 증폭시킨다. 이어서, 역전사 PCR의 생성물은 진핵성 번역을 개시하기 위해 RNA 폴리머라제 프로모터 및 서열을 함유하는 프라이머와 함께 네스티드 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용된다. 소정 영역의 증폭후, 프라이머내로 혼입된 독특한 모티프는 PCR 생성물의 일련의 시험관내 전사 및 번역을 가능하게 한다. 번역 생성물의 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동시, 절두된 폴리펩티드의 출현은 번역의 조기 종결을 유발하는 돌연변이의 존재를 나타내는 것이다. 이 방법을 변형한 방법에서, 소정 표적 영역이 단일 엑손으로부터 유도되는 경우, DNA(RNA에 대향하는 것으로서)가 PCR 주형으로 사용된다.

임의의 세포 유형 또는 조직을 이용하여 본원에 개시한 진단학에서 사용하기 위한 핵산 샘플을 얻을 수 있다. 바람직한 구체예에서, 상기 DNA 샘플은 공지된 기법(예를 들어, 정맥천자)을 이용하여 체액, 예를 들어 혈액이나 타액으로부터 얻는다. 대안으로, 핵산 테스트는 건조 샘플(예를 들어, 모발 또는 피부)에 대해 수행할 수 있다. RNA 또는 단백질을 사용하는 경우, 사용할 수 있는 세포 또는 조직은 IL-1 유전자를 발현하여야 한다.

또한, 진단 과정은 계내 직접 생검 또는 적출로부터 얻은 환자 조직의 조직 절편(고정 조직 절편 및/또는 동결 조직 절편)에 대해 수행할 수 있으며, 핵산 정제는 불필요하다. 핵산 시약은 상기한 바와 같은 계내 과정을 위한 프로브 및/또는 프라이머로서 사용할 수 있다(참조: 예를 들어, Nuovo, G.J., 1992, PCR in situ hybridization: protocols and applications, Raven Press, NY).

또한, 하나의 핵산 서열의 검출에 주로 집중되는 방법 이외에, 프로필도 이러한 검출 과정에 도움이 될 수 있다. 핑거프린트 프로필은 예를 들어 디스플레이 과정, 노던 분석 및/또는 RT-PCR을 이용하여 생성할 수 있다.

바람직한 검출 방법은 IL-1 전염증성 일배체형의 하나 이상의 대립유전자의 한 영역과 중첩하고 돌연변이 영역 또는 다형성 영역 주위에 약 5, 10, 20, 25 또는 30개의 뉴클레오티드를 보유하는 프로브를 이용하는 대립유전자 특이성 하이브리드화이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, EOA에 관련된 다른 대립유전자 변이체에 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 몇몇 프로브는 고체상 지지체, 예를 들어 "칩"(약 250,000개 이하의 올리고뉴클레오티드를 유지할 수 있음)에 부착한다. 올리고뉴클레오티드는 리소그래피를 포함하는 여러가지 과정에 의해 고형 지지체에 결합시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이들 칩을 이용하는 돌연변이검출 분석은 "DNA 프로브 어레이"라고도 칭하는데, 이는 예를 들어 문헌(Cronin 등, (1996) Human Mutation 7:244)에 기술되어 있다. 한 구체예에서, 칩은 한 유전자의 하나 이상의 다형성 영역의 모든 대립유전자 변이체를 포함한다. 이어서, 고형상 지지체는 테스트 핵산과 접촉시키고, 특이적인 프로브에 대한 하이브리드화를 검출한다. 따라서, 하나 이상의 유전자의 다수의 대립유전자 변이체의 아이덴티티는 간단한 하이브리드화 실험으로 확인할 수 있다.

또한, 이들 기법은 분석 이전에 핵산을 증폭시키는 단계를 포함할 수도 있다. 증폭 기법은 당업자에게 공지되어 있으며, 그 예로는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 특이적인 대립유전자의 폴리머라제 연쇄 반응(ASA), 리가제 연쇄 반응(LCR), 네스티드 폴리머라제 연쇄 반응, 자가 지지된 서열 복제(Guatelli, J.C. 등, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사 증폭 시스템(Kwoh, D.Y. 등, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177) 및 Q-베타 리플리카제(Lizardi, P.M. 등, 1988, BiolTechnology 6:1197)를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

증폭 생성물은 여러 가지 방법, 예를 들어 크기 분석, 제한 절단후 크기 분석, 반응 생성물 내에서 특이적인 태깅된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 검출, 대립유전자 특이성 올리고뉴클레오티드(ASO) 하이브리드화, 대립유전자 특이성 5' 엑소뉴클레아제 검출, 서열결정, 하이브리드화 등으로 분석할 수 있다.

PCR 기초한 검출 수단은 다수의 마커를 동시에 다중 증폭하는 것을 포함한다. 예를 들어, 크기가 중첩되지 않는 PCR 생성물을 생성하기 위해 PCR 프라이머를선택하고 동시에 분석할 수 있는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 대안으로, 시차 표지되어 각각이 시차적으로 검출될 수 있는 프라이머를 이용하여 상이한 마커를 증폭시킬 수도 있다. 물론, 하이브리드화 기초한 검출 수단은 한 샘플내에서 다수의 PCR 생성물의 시차 검출을 가능하게 한다. 다수의 마커의 다중 분석을 가능하게 하는 다른 기법은 공지되어 있다.

단지 예시적인 구체예에서, 상기 방법은 (i) 환자로부터 세포의 샘플을 수집하는 단계, (ii) 세포 샘플로부터 핵산(예를 들어, 게놈, mRNA 또는 둘 다)을 분리하는 단계, (iii) 대립유전자의 하이브리드화와 증폭이 일어날 수 있는 조건 하에서 IL-1 전염증성 일배체형의 하나 이상의 대립유전자의 5' 및 3'에 특이적으로 하이브리드화하는 하나 이상의 프라이머와 상기 핵산 샘플을 접촉시키는 단계; 및 (iv) 증폭 생성물을 검출하는 단계를 포함한다. 이들 검출 방식은 핵산 분자가 매우 소수로 존재하는 경우에 그 핵산 분자의 검출을 위해 특이 유용하다.

본 분석법의 바람직한 구체예에서, IL-1 전염증성 일배체형의 대립유전자는 제한 효소 절단 패턴의 변경에 의해 확인된다. 예를 들어, 샘플 및 대조용 DNA는 분리하고, 증폭하고(임의로), 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 단편 길이 크기는 겔 전기영동으로 결정한다.

다른 구체예에서, 당업계에 알려진 임의의 다양한 서열결정 반응을 이용하여 대립유전자의 서열을 직접적으로 결정한다. 예시적인 서열결정 반응은 Maxim 및 Gilbert((1977) Proc. NatI Acad Sci USA 74:560) 또는 Sanger(Sanger 등, (1977) Proc. Nat. Acad. Sci USA 74:5463)에 의해 개발된 기법에 기초한 것들을 포함한다. 또한, 본 분석법의 수행시, 임의의 다양한 자동 서열결정 과정을 이용할수 있음도 고려해야 하는데(참조: 예를 들어, Biotechniques (1995) 19:448), 그 예로는 질량 분광법에 의한 서열결정을 들 수 있다(참조: 예를 들어, PCT 출원 국제 공개 WO 94/16101; Cohen 등, (1996) Adv Chromatogr 36:127-162; and Griffin 등, (1993) AppI Biochem Biotechnol 38:147-159). 특정 구체예에서, 단지 하나, 두개 또는 세개의 핵산 염기의 출현이 서열결정 반응에서 결정될 필요가 있다. 예를 들어, 단지 하나의 핵산이 검출되는 경우, A-트랙 등을 수행할 수 있다.

추가의 구체예에서, 절단 제제(예를 들어, 뉴클레아제, 히드록실아민 또는 오스뮴 테트록사이드 및 피페리딘)로부터 보호하여 RNA/RNA 또는 RNA/DNA 또는 DNA/DNA 이종이중체에서 미스매치된 염기를 검출할 수 있다(Myers 등, (1985) Science 230:1242). 일반적으로, "미스매치 절단"이라는 기법은 야생형 대립유전자를 함유하는 (표지된) RNA 또는 DNA와 상기 샘플을 하이브리드화시켜 형성된 이종이중체를 제공함으로써 개시한다. 상기 이중 스트랜드 이중체는 이중체의 단일 스트랜드 영역(대조용 스트랜드와 샘플 스트랜드 사이의 염기쌍 미스매치에 기인하여 존재할 것임)을 절단하는 제제로 처리한다. 예를 들어, RNA/DNA 이중체는 RNase로 처리하고, DNA/DNA 하이브리드는 S1 뉴클레아제로 처리하여 미스매치된 영역을 효소적으로 절단할 수 있다. 다른 구체예에서, DNA/DNA 또는 RNA/DNA 이중체는 히드록실아민 또는 오스뮴 테트록사이드로 처리하고 피페리딘으로 처리하여 미스매치된 영역을 절단할 수 있다. 미스매치된 영역의 절단후, 생성된 물질은 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 크기에 의해 분리하여 돌연변이의 위치를 결정한다. 참조: 예를 들어, Cotton 등, (1988) Proc. Nati Acad Sci USA 85:4397; 및 Saleeba 등, (1992) Methods Euzymol. 217:286-295. 바람직한 구체예에서, 대조용 DNA 또는 RNA는 검출을 위해 표지할 수 있다.

다른 구체예에서, 미스매치 절단 반응은 이중 스트랜드 DNA 내에서 미스매치된 염기쌍을 인식하는 하나 이상의 단백질(소위 "DNA 미스매치 수복" 효소)을 이용한다. 예를 들어, 이. 콜라이의 mutY 효소는 G/A 미스매치에서 A를 절단하고, HeLa 세포로부터 유래하는 티미딘 DNA 글리코실라제는 G/T 미스매치에서 T를 절단한다(Hsu 등, (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662). 예시적인 구체예에 따라, IL-1 좌 일배체형의 대립유전자에 기초한 프로브는 테스트 세포(들)로부터 유래한 cDNA 또는 다른 DNA 생성물에 하이브리드화한다. 상기 이중체는 DNA 미스매치 수복 효소로 처리하고, 존재한다면 절단 생성물은 전기영동으로 검출할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,459,039를 참조할 수 있다.

다른 구체예에서, 전기영동에서 이동성의 변경을 이용하면 IL-1 좌 대립유전자가 동정될 것이다. 예를 들어, 단일 스트랜드 구조 다형성(single strand conformation polymorphism;SSCP)을 이용하여 돌연변이 핵산과 야생형 핵산의 전기영동에서의 이동성 차이를 검출할 수 있다(Orita 등, (1989) Proc NatI. Acad. Sci USA 86:2766, Cotton (1993) MutatRes 285:125-144; 및 Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:73-79). 샘플 및 대조용 IL-1 좌 대립유전자의 단일 스트랜드 DNA 단편은 변성되고 재생가능하다. 단일 스트랜드 핵산의 2차 구조는 서열에 따라 달라지며, 전기영동에서 결과적으로 나타나는 이동성의 변경은 심지어 한개의 단일 염기 변화를 검출할 수 있다. 상기 DNA 단편은 표지되거나 표지된 프로브로 검출할 수 있다. 상기 분석법의 감도는 (DNA 보다는 오히려) 2차 구조가 서열 변화에 더 민감한 RNA를 이용하여 증강시킬 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 방법은 전기영동에서 이동성의 변화에 기초하는 이종이중체 분석을 이용하여 이중 스트랜드 이종이중체 분자를 분리한다(Keen 등, (1991) Trends Genet 7:5).

다른 구체예에서, 변성제의 구배를 함유하는 폴리아크릴아미드 겔 내에서 대립유전자의 이동은 변성 구배 겔 전기영동(DGGE)을 이용하여 분석한다(Myers 등, (1985) Nature 3 13:495). 분석 방법으로서 DGGE를 사용하는 경우, DNA는 예를 들어 고용융 GC-풍부한 DNA의 약 40 bp의 GC 클램프를 첨가하여 완전히 변성되지 않도록 변형될 것이다. 추가의 구체예에서, 변성제 구배 대신에 온도 구배를 이용하여 대조용 DNA 및 샘플 DNA의 이동성의 차이를 확인한다(Rosenbaum 및 Reissner (1987) Biophys Chem 265:12753).

대립유전자를 검출하기 위한 다른 기법의 예로는 선택적인 올리고뉴클레오티드 하이브리드화, 선택적인 증폭 또는 선택적인 프라이머 연장을 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 공지된 돌연변이 또는 뉴클레오티드 차이(예를 들어, 대립유전자 변이체에서)가 중앙에 위치하여 완벽한 매치가 확인되는 경우에만 하이브리드화를 허용하는 조건 하에서 표적 DNA에 하이브리드화되는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조할 수 있다(Saiki 등, (1986) Nature 324:163); Saiki 등, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230). 이러한 대립유전자 특이적인 올리고뉴클레오티드 하이브리드화 기법을 이용하여, 올리고뉴클레오티드가 PCR 증폭된 표적 DNA에 하이브리드화되는 경우 반응당 하나의 돌연변이 또는 다형성 영역을 테스트하고, 올리고뉴클레오티드가 하이브리드화 막에 부착되고 표지된 표적 DNA에 하이브리드화하는 경우 다수의 상이한 돌연변이 또는 다형성 영역을 테스트할 수 있다.

대안으로, 선택적인 PCR 증폭에 의존하는 대립유전자 특이적인 증폭 기법을 본 발명과 함께 사용할 수 있다. 특이적인 증폭을 위한 프라이머로서 사용된 올리고뉴클레오티드는 상기 분자의 중심에서 소정의 돌연변이 영역 또는 다형성 영역을 을 보유할 수 있거나(증폭은 시차 하이브리드화에 기초함)(Gibbs 등, (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448), 또는 적합한 조건에서 미스매치를 방지하거나 폴리머라제 연장을 감소시키는 경우 한 프라이머의 가장 3' 단부에 소정의 돌연변이 영역 또는 다형성 영역을 보유할 수 있다(Prossner (1993) Tibtech 11:238). 또한, 돌연변이 영역 내로 신규한 제한 위치를 도입하여 절단 기초한 검출을 수행하는 것이 바람직할 수도 있다(Gasparini 등, (1992) Mol. Cell Probes 6:1). 특정 구체예에서, 증폭은 증폭을 위한 Taq 리가제를 이용하여 수행할 수도 있는 것으로 생각된다(Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189). 이 경우, 연결은 단지 5' 서열의 3' 단부에 완전한 매치가 존재하는 경우에만 일어나 증폭의 존재 또는 부재를 확인함으로써 특이적인 위치에서 공지된 돌연변이의 존재를 검출하는 것이 가능하다.

다른 구체예에서, 대립유전자 변이체의 동정은 예를 들어, 미국 특허 4,998,617 및 문헌(Landegren, U. 등, (1988) Science 241:1077-1080)에 기술된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 연결 분석법(OLA)을 이용하여 수행된다. 상기 OLA 프로토콜은 표적의 단일 스트랜드의 인접 서열에 하이브리드화할 수 있도록 구성된 2개의 올리고뉴클레오티드를 이용한다. 상기 올리고뉴클레오티드중 하나는 분리 마커에 연결되어 있고, 예를 들어 비오티닐화되어 있고, 다른 하나는 검출가능하게 표지되어 있다. 정확한 상보적 서열이 표적 분자 내에서 확인되는 경우, 상기 올리고뉴클레오티드는 그들의 말단이 인접하도록 하이브리드화하여 연결 기재를 생성한다. 이어서, 연결은 표지된 올리고뉴클레오티드가 아비딘 또는 다른 비오틴 리간드를 이용하여 회수하는 것을 가능하게 해준다. Nickerson, D. A. 등은 PCR과 OLA의 특성을 결합한 핵산 검출 분석법을 기술하고 있다(Nickerson, D. A. 등, (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8923-27). 이 방법에서, PCR을 이용하여 표적 DNA를 지수적으로 증폭시키고, 이어서 OLA를 이용하여 검출한다.

이 OLA 방법에 기초한 몇몇 기법이 개발되었으며, 이를 이용하여 IL-1 좌 일배체형의 대립유전자를 검출할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 5,593,826은 3'-아미노기 및 5'-인산화 올리고뉴클레오티드를 이용하여 포스포르아미데이트 연결을 보유하는 접합체를 형성하는 것에 대해 기술하고 있다. 문헌(Tobe 등, (1996) Nucleic Acids Res 24: 3728)에 기술된 OLA의 다른 방법에서, PCR과 병용하는 OLA는 단일 미량역가 웰에서 2개의 대립유전자의 유형 구분을 가능하게 해준다. 독특한 햅텐, 즉 디곡시게닌 및 플루오레세인을 보유하는 대립유전자 특이적인 각각의 프라이머에 마킹함으로써, 각각의 OLA 반응은 상이한 효소 리포터, 알칼리성 포스파타제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다제로 표지한 햅탠 특이적인 항체를 이용하여 검출할 수 있다. 이 시스템은 2가지의 다른 색의 발색을 유도하는 고 처리량 포맷을 이용하여 2개의 대립유전자의 검출을 가능하게 해준다.

본 발명의 다른 구체예는 EOA 발병 소인을 검출하는 키트에 관한 것이다. 이 키트는 IL-1 좌 일배체형의 하나 이상의 대립유전자의 5' 및 3'에 하이브리드화하는 5' 및 3' 올리고뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다. PCR 증폭 올리고뉴클레오티드는 25내지 2500 염기쌍 떨어져, 바람직하게는 약 100 내지 약 500 염기 떨어져 하이브리드화되어 후속 분석을 위해 편리한 크기의 PCR 생성물을 생성하여야만 한다.

본 발명의 진단 방법에 사용하기 위해 특히 바람직한 프라이머 쌍은 다음과 같은 프라이머를 포함한다:

5' ATG GTT TTA GAA ATC ATC AAG CCT AGG GCA 3' (서열 번호 1) 및

5' AAT GAA AGG AGG GGA GGA TGA CAG AAA TGT 3' (서열 번호 2);

5' TGG CAT TGA TCT GGT TCA TC 3' (서열 번호 3) 및

5' GTT TAG GAA TCT TCC CAC TT 3' (서열 번호 4);

5' CTC AGG TGT CCT CGA AGA AAT CAA A 3' (서열 번호 5) 및

5' GCT TTT TTG CTG TGA GTC CCG 3' (서열 번호 6);

5' CTC AGC AAC ACT CCT AT 3' (서열 번호 7) 및

5' TCC TGG TCT GCA GCT AA 3' (서열 번호 8);

5' CTA TCT GAG GAA CAA ACT AGT AGC 3 (서열 번호 9) 및

5' TAG GAC ATT GCA CCT AGG GTT TGT 3' (서열 번호 10);

5' ATT TTT TTA TAA ATC ATC AAG GCT AGG GCA 3' (서열 번호 11) 및

5' AAT TAA AGG AGG GAA GAA TGA CAG AAA TGT 3' (서열 번호 12);

5' AAG CTT GTT CTA CCA CCT GAA CTA GGC 3' (서열 번호 13) 및

5' TTA CAT ATG AGC CTT CCA TG 3' (서열 번호 14).

본 발명의 방법에 의해 IL-1 다형성 대립유전자의 증폭 및 검출에 사용하기 위한 추가의 올리고뉴클레오티드의 구성은 인간 IL-1 좌를 함유하는 인간 염색체 2q13으로부터 유래하는 갱신된 서열 정보 및 이 좌에 대해 사용할 수 있는 갱신된 인간 다형성 정보의 이용가능성으로 인해 용이해진다. 예를 들어, IL-1A, IL-1B 및 IL-1RN에 대한 DNA 서열은 도 1(GenBank Accession No. X03833), 도 2(GenBank Accession No. X04500) 및 도 3(GenBank Accession No. X64532)에 각각 나타냈다. 이들 유전자에서 인간 다형성의 검출을 위한 적합한 프라이머는 상기 서열 정보 및 상기 구성을 위해 당업계에 공지된 표준 기법 및 프라이머 서열의 최적화를 이용하여 용이하게 구성할 수 있다. 이러한 프라이머 서열의 적합한 구성은 예를 들어 프라이머 2.1, 프라이머 3 또는 GeneFisher와 같은 시판되고 있는 프라이머 선택 프로그램을 이용하여 달성할 수 있다(참조: Nicklin M.H.J., Weith A. Duff G.W., "A Physical Map of the Region Encompassing the Human Interleukin-1 interleultin-1, and Interleukin-l Receptor Antagonist Genes" Genomics 19: 382 (1995); Nothwang H.G. 등, "Molecular Cloning of the Interleukin-l gene Cluster: Construction of an Integrated YAC/PAC Contig and a partial transcriptional Map in the Region of Chromosome 2q13" Genomics 41: 370 (1997); Clark 등,(1986) Nucl. Acids. Res., 14:7897-7914[published erratum appears in Nucleic Acids Res., 15:868 (1987) and the Genome Database(GDB) project at the URL http://www.gdb.org).

키트를 사용함에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 임의의 다양한 천연 및/또는 합성 조성물, 예를 들어 합성 올리고뉴클레오티드, 제한 단편, cDNA, 합성 펩티드 핵산(PNA) 등일 수 있다. 또한, 상기 분석 키트 및 방법은 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상기 분석에서 용이한 확인을 가능하게 할 수 있다. 사용할 수 있는 표지의 예로는 방사능 표지, 효소, 형광 화합물, 스트렙타비딘, 아비딘, 비오틴, 자성 부분, 금속 결합 부분, 항원 또는 항체 부분 등을 들 수 있다.

임의로 상기 키트는 DNA 샘플링 수단을 포함한다. DNA 샘플링 수단은 당업자에게는 잘 알려져 있는 것이며, 기재, 예를 들어 여과지, 앰플리카드(상표명)(유니버시티 오브 쉐필드, 잉글랜드 쉐필드 에스10 2제이에프; Tarlow, JW 등, J. of Invest. Dermatol. 103: 387-389 (1994)) 등; DNA 정제 시약, 예를 들어 뉴클레온(상표명) 키트, 용해 완충액, 프로테이나제 용액 등; PCR 시약, 예를 들어 10x 반응 완충액, 열안정성 폴리머라지, dNTP 등; 및 대립유전자 검출 수단, 예를 들어HinfI제한 효소, 대립유전자 특이성 올리고뉴클레오티드, 건조 혈액으로부터 네스티드 PCR을 위한 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함한다.

연령 관련 치료법 및 약리 유전학

약리 유전학

환자를 신속하게 유전자형을 확인하는 능력은 근본적으로 치료 물질 또는 질병 예방 물질의 시험 방법 및 개발을 변화시킨다. 현재, 질병 치료 물질 또는 예방 물질의 효능은 환자 집단에 대하여 상기 효능을 시험함으로써 평가된다. 환자 집단중 다수의 변수들이 유전자 다양성의 영향에 대하여 제어되지만, 통상적으로 상기 유전자 다양성의 영향은 시험되지는 않는다. 결과적으로 약물은 유전적으로 다양한 환자의 집단에서 관찰될때에는 통계학적으로 비효율적이지만, 특정의 유전적 특징을 보유하는 환자군을 선택하는데에는 매우 효율적인 것으로 파악될 수 있다. 환자들이 유전자형에 의하여 분리되지 않으면, 선택된 개체군에 대하여 매우 큰 효능을 나타내는 다수의 약물은 대게 개체군에 대하여 무용한 것으로서 거부될 것이다.

EOA와 관련된 특정 대립유전자에 관한 지식은, 그 단독으로 또는 EOA(EOA의 유전자 프로필)에 기여하는 다른 유전자 결함에 대한 정보와 함께, "약리 유전학"의 목표인, 개개인의 유전자 프로필에 대한 치료를 맞출 수 있도록 한다. 예를 들어, 본원에 나타낸 바와 같이, EOA 관련 대립유전자 예컨대, IL-1 RN(+2018) 대립유전자 2를 보유하는 개체는 EOA에 대한 소인을 가지고 있다. 그러므로, 질병에 대한 개체군의 프로필과 개체의 IL-1 프로필을 비교하면, 특정 환자 또는 환자 개체군(즉, 동일한 유전자 변형이 발생한 환자 집단)에 대하여 안전하고 유효한 것으로 추정되는 약물을 선별하거나 또는 디자인할 수 있다.

IL-1 유전자 프로필 또는 EOA 유전자 프로필을 기초로 하여, 가장 임상학적으로 유익할 것으로 추측되는 개체군을 표적화하는 능력은 1) 판매율이 저조한 시판중인 약물의 재배치 ; 2) 안전성 또는 환자 일부 군에 특이적인 효능의 한계로 인하여 임상 개발이 중지된 약물 후보 물질의 구제 ; 및 3) 약물 후보 물질에 대하여 가속화되고 저렴한 개발 및 (예를 들어, EOA 유발성 돌연변이에 대한 다양한 투여량의 제제의 효과를 측정하는 것은 유효 투여량을 최적화하는데 유용하므로) 보다 최적인 약물 라벨링을 가능하게 한다.

하나의 구체예에서, 개체의 IL-1 유전자형 및 EOA 소인은 예를 들어, 운동 및 식습관을 변화시키는 것을 비롯하여 추천 라이프스타일을 맞추는데 사용될 수 있다. 상기 IL-1 유전자형은 또한 특정 IL-1 유전자형 및 EOA 소인을 보유하는 개체에 유익할 것으로 예측되는 기능성 식품을 추천하는데 사용될 수도 있다.

다른 구체예에서, 개체 유전자형 및 EOA 소인은 환자들을 1 이상의 치료 방법으로부터 이득을 얻을 것 같거나 또는 얻을것 같지 않는 군들로 나눔으로써 치료 비용을 관리하는데 사용될 수 있다. 개체의 적절한 치료 방법은 이 개체의 집단을 각각의 군으로 분류하여 결정될 수 있으며, 이러한 방법은 불필요하고 비효율적이거나 또는 부적절한 치료를 받고 있는 환자의 수를 줄일수 있다. 환자들은 유전자형을 기초로 하거나, 또는 다른 정보 예컨대, 라이프스타일, 연령, 비만도, 임상 병력, 기타 위험 인자 등과 유전자형 모두를 기초로 하여 분류될 수 있다. 환자들은 1 이상의 군으로 분류될 수 있다.

IL-1 생성 및 분자 신호전달 경로

치료적 개입 표적 및 EOA 바이오마커와 같은 것들을 보다 잘 이해하기 위해서, IL-1 신호전달 및 생성에 대한 일반적인 기작을 이해할 필요가 있다. IL-1은 세포내 및 세포간 신호전달 현상의 복잡한 그물 경로의 일부이다. 다수의 단백질이 염증 반응 더욱 일반적으로는, 면역 반응에 관여한다. 이러한 단백질의 예로서는인터루킨, TNF, NF-κB, 면역글로불린, 응집 인자, 리폭시게나제 및 보조 수용체, 길항제 및 상기 반응을 위한 가공 효소가 있다.

IL-1 폴리펩티드, IL-1α 및 IL-1β는 박테리아 리포다당류(LPS), TNF, IL-1 자신, 기타 대식세포 유도성 시토킨으로 자극된 활성화 대식세포에 의하여 다량으로 생성되거나, 또는 CD4⁺T 세포와 접촉한다. 상기 IL-1 프로모터는 cAMP 반응 요소, AP-1 결합 부위 및 NF-κB 결합 부위를 포함하여 몇몇 조절 요소를 포함한다. 전사를 조절하기 위해서는 AP-1 모두(Jun 및 Fos)는 활성화되어 핵으로 전위되어야 한다. NF-κB는 보통 IκB와 결합하여 세포질에 보유된다. NF-κB-IkB 복합체는 IkB의 인산화에 의하여 파괴된다. IkB 인산화는 유사분열물질 활성화 단백질 키나제(MAP 키나제) 경로 및 기타 키나제 경로의 활성화를 통한 세포 표면 수용체로부터의 신호전달에 의하여 조절될 수 있다. Jun 및 Fos는 또한 Jun의 경우 조절 키나제 예컨대, JNK의 기질이다.

IL-1A 및 B 전사체는 MAP 키나제 경로에 의하여 조절될 수도 있는 과정에 의하여 프로단백질로 번역된다. MAP 키나제 인산화의 억제제 예컨대, 트레뷰펠론은 IL-1 전사체의 번역을 감소시킨다. IL-1α및 β전구체 단백질은 막으로의 국소화 및 인터루킨 전환 효소(ICE) 또는 카스포즈 Ⅰ 에 의한 성숙한 IL-1으로의 전환을 위하여, 미리스토일화(myristoylation)를 필요로 한다. 트립신, 엘라스타제, 키모트립신 및 비만 세포 키마제를 비롯한 기타 세포외 프로테아제는 또한 IL-1 성숙에 있어서 부수적인 역할을 할 수도 있다. ICE는 eICE 동형체, ICE α, β 및 γ 동형체에 대한 항체, 우두 생성 Crm-A 단백질 및 내인성 테트라펩티드 경쟁적 억제제를비롯한 몇몇 제제에 의하여 억제될 수 있다.

성숙 IL-1α및 IL-1β는 유사한 활성을 보유하며 동일한 수용체와 상호작용한다. 이러한 인자에 대한 1차적 수용체는 제Ⅰ형 IL-1 수용체이다. 활성 신호전달 복합체는 IL-1 리간드, 제Ⅰ형 수용체 및 IL-1 수용체 보조 단백질로 이루어져 있다. 제Ⅱ형 수용체 및 상기 제Ⅰ형 및 제Ⅱ형 수용체의 가용형은 생체적합성 IL-1에 대하여 경쟁하기 위해서 수용체를 유인하는 것으로 보인다. 또한, IL-1 신호전달의 천연 억제제인 IL-1 수용체 길항제는 단핵구에 의하여 생성된다. IL-1ra는 또한 간세포에 의하여 생성되며, 간에서 생성된후 혈류로 분비되어 면역 반응 및 염증 반응을 조절하는 급성기 단백질(acute phase protein)의 주성분이다.

IL-1 신호전달 복합체는 전술한 바와 같은 NF-κB 및 AP-1의 활성을 포함하는, 몇몇 세포내 신호전달 경로를 활성화시킨다. 신호전달에 있어서, IL-1은 PI-3 키나제, 포스포리파제 A2, 단백질 키나제 C, JNK 경로, 5-리폭시게나제, 시클로옥시게나제 2, p38 MAP 키나제, p42/44 MAP 키나제, p54 MAP 키나제, Rac, Ras, TRAF-6, TRAF-2 및 기타 다수의 인자를 포함하는 인자의 숙주 활성에 영향을 미친다. IL-1은 또한 IL-1 유전자 클러스터 일원, TNF, 기타 인터루킨 유전자(2,3,6,8,12,2R,3R 및 5R), TGF-β, 피브리노겐, 기질 메탈로프로테아제 1, 콜라겐, 엘라스타제, 백혈병 억제 인자, IFNα, β, γ, COX-2, 유도성 산화질소 신타제, 메탈로티오네인 및 다수의 것을 포함하는 다수의 유전자의 발현에 영향을 미치기도 한다.

EOA 관련 바이오마커

EOA에 대한 유전자 시험을 수행하는 이외에, 개체의 EOA 진행 정도 또는 EOA 발병 개체를 모니터하기 위한 시험을 수행하는 것이 바람직할 것이다. 다시 말하면, 임의의 바이오마커들은 노화 관련 증상의 조기 개시에 대한 시간 조절 및/또는 진행의 지표일 수 있다. 이러한 바이오마커들을 확인하고 이를 모니터하여 노화 관련 증상의 개시 및 진행에 대한 정보를 제공하는 것이 바람직하다. 개체의 유전자형에 맞추어진 바이오마커들을 찾는 것도 특히 바람직하다.

바람직한 구체예에서, EOA와 관련되어 있는 것으로 추정되는 바이오마커는 상이한 IL-1 유전자형을 포함하는 개체 또는 세포를 이용하여 확인할 수 있다. 바이오마커의 세트는 EOA 관련 대립유전자 예컨대, IL-1RN(VNTR) 대립유전자 2 또는 IL-1(44112332) 또는 (33221461) 단상형의 다른 대립유전자를 보유하는 개체 또는 세포내에서 관찰될 수 있다. 바이오마커의 동일 세트는 EOA 관련 대립유전자를 보유하지 않는 다른 개체 또는 세포내에서 관찰될 수 있다. IL-1 유전자형에 따라서 차이를 나타내는 바이오마커는 EOA를 예후하는데 유용할 것이다. 이러한 차이는 EOA 관련 표현형을 구성한다.

임의의 바이오마커와 EOA 사이의 관련성은 임의의 바이오마커를 다양한 연령대의 개체 개체군에서 측정하는 실험을 수행함으로써 추가로 확인될 수 있으며, 이때 일부 실험에서는 이미 연령 관련 증상을 규명하기 시작하였다. 필요에 따라서, 개체가 노화하는 시간에 걸쳐 복수회 측정을 수행할 수 있다. EOA 관련 대립유전자의 존재 또는 부재에 관하여는 개체에서 측정하는 것이 바람직하다. 임의의 바이오마커와 연령 관련 증상의 조기 개시 사이의 상관성을 측정하는데 표준적인 통계학적 방법이 사용될 수 있다.

EOA-관련 바이오마커의 측정은 개체의 EOA 진행에 관한 현재의 위험성에 대한 지표로서, 또는 노화 과정으로의 진행 또는 이에 관한 지표로서 사용될 수 있다.

세포에 관하여, 바이오마커는 근본적으로 특정 세포 기능에 관한 임의의 측면 예를 들어, 신호전달 분자, 전사 인자, 중간 대사물질, 시토킨, 프로스타노이드, 스테로이드 호르몬(예를 들어, 에스트로겐, 프로게스테론, 안드로스텐디온 또는 테스토스테론), 고나도트로핀(예를 들어, LH 및 FSH), 유전자 전사체, 단백질의 번역후 변형, 고나도트로핀 방출 호르몬(GnRH), 카테콜아민(예를 들어, 도파민 또는 노르에피네프린), 오피오이드, 액티빈, 인히빈 및 IL-1 생물활성의 수준 또는 비율일 수 있다. 바이오마커는 전사체 수준의 전체 게놈 분석 또는 단백질 수준 및/또는 변형의 전체 protEOAe 분석을 포함할 수 있다. 또한, 바이오마커는 리포터 유전자일 수 있다. 예를 들어, IL-1 프로모터 또는 EOA 관련 대립유전자를 포함하는 IL-1프로모터는 필요에 따라서 리포터 유전자에 연결될 수 있다. 대안적 방법에서, 프로모터는 IL-1 조절 프로모터 예컨대, IL-8일 수 있다. 이러한 방식으로, 상기 리포터 유전자의 활성은 프로모터의 활성을 반영하게 된다. 적당한 리포터 유전자는 루시페라제(luc), GUS, LacZ, 녹색 형광 단백질(GFP)(및 이들의 변이체 예컨대, RFP, CFP, YFP 및 BFP), 또는 근본적으로 용이하게 확인되는 기타 유전자를 포함한다. 개체에서, 바이오마커는 예를 들어, 전술한 것들중 임의의 것과 심전도 매개변수, 폐기능, IL-6 활성, 뇨 매개변수 또는 조직 매개변수일 수 있다. 다른 바람직한 바이오마커로서는, 전술한 바와 같은 면역 반응 및 염증 반응에 관여하는 인자와, IL-1 생성 및 신호전달에 관여하는 인자를 포함한다.

EOA 치료제

EOA 치료제는 단백질, 펩티드, 펩티도모의체, 소분자, 핵산 또는 기능 식품을 비롯한, 임의의 유형의 화합물을 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, EOA 치료제는 IL-1 생성 또는 신호전달에 관여하는 인자의 조절제이다. 특정 바람직한 구체예에서, EOA 치료제는 IL-1 생물활성의 조절제(예컨대, IL-1α, IL-1β또는 IL-1 수용체 작용제 또는 길항제)이다. 바람직한 길항제로서는 핵산(예컨대, IL-1 단백질을 암호화하는 핵산 또는 IL-1 단백질에 의하여 상향 조절 또는 하향 조절되는 유전자), 단백질(예컨대, IL-1 단백질 또는 IL-1 단백질에 의하여 상향 조절 또는 하향 조절되는 단백질) 또는 소분자(예컨대, IL-1 단백질의 발현을 조절하는 소분자)를 포함한다. 바람직한 길항제는 예를 들어, 본원에 기술된 분석법을 사용하여 확인될 수 있으며, 여기서 상기 길항제로서는 IL-1 전사 및/또는 IL-1 활성을 억제시키거나 또는 저해시키는 기능을 갖는 핵산(예컨대, 1본쇄 (안티센스) 또는 2본쇄(삼중체) DNA 또는 PNA 및 리보자임), 단백질(예컨대, 항체) 및 소분자 또는 기능 식품을 포함한다.

생체내 및 세포계 스크리닝 분석법

EOA를 유발시키거나 또는 이에 기여하는 IL-1 돌연변이의 확인을 기초로 하여, 본 발명은 생체내 및 세포계 분석법 예를 들어, EOA 치료제를 확인하기 위한 방법을 제공하는 것을 추가의 특징으로 한다. 하나의 구체예에서, EOA 관련 대립유전자를 보유하는 세포는 시험 화합물과 접촉되며, 이로써 1 이상의 바이오마커가 측정된다. 1 이상의 바이오마커가 변형되어 세포의 표현형이 EOA 관련 대립유전자를 보유하지 않는 세포의 표현형과 더욱 근접하게 닮게 되면, 시험 물질은 EOA 치료제로서 유용할 수 있다.

일례로서, EOA와 관련된 IL-1 대립유전자가 이 대립유전자를 보유하는 세포가 IL-1 폴리펩티드를 과잉 생산하도록 만든다고 가정해 보자. 이 경우 상기 IL-1 폴리펩티드의 수준은 바이오마커로서 사용된다. 시험 물질을 사용한 처리는 세포가 IL-1 폴리펩티드를 낮은 수준으로 생성하도록 만들고, 또한 상기 세포가 EOA-관련 대립유전자를 보유하지 않는 세포에서 더욱 근접하게 닮은 IL-1 폴리펩티드를 생성하도록 만든다. 따라서, 시험 물질은 EOA 치료제로서 유효할 것으로 생각된다. 이러한 방식으로, 대립유전자 특이적 효과를 나타내는 시험 물질을 확인할 수 있다. IL-1 신호전달 경로에 대응하는 상기 화합물의 특이성은 원하는 경우 다양한 조절 분석법 예를 들어, 1 이상의 조절 유전자의 발현을 측정함으로써 확인될 수 있다. 구체적으로, 이러한 분석법은 IL-1 안티센스, 리보자임 및 삼중체 화합물의 효능을 측정하는데 사용될 수 있다.

다른 변형예에서, 세포는 시험 화합물 및 IL-1 단백질과 접촉되며, 이러한 시험 화합물과 IL-1 수용체 사이의 상호작용, 또는 IL-1 단백질(바람직하게는 태깅된 IL-1 단백질)과 IL-1 수용체 사이의 상호작용은 예를 들어, 마이크로피지오미터(microphysiometer)(McConnell 등, 1992, Science 257:1906)에 의하여 확인된다. IL-1 수용체와 시험 화합물 또는 IL-1 단백질중 어느 하나와의상호작용은 상기 마이크로피지오미터에 의하여 배지 산성도의 변화를 통하여 확인된다. 따라서 이러한 분석 시스템은 분자적 길항제를 확인하는 수단 예를 들어, IL-1 단백질-IL-1 수용체 상호작용을 방해하는 작용과, 예를 들어, IL-1 수용체를 활성화시키는 작용을 하는 분자적 길항제를 제공한다.

본질적으로 임의의 배양가능한 세포 유형은 세포계 분석법에 사용될 수 있다. 특히, 세포는 면역 세포 예컨대, 단핵구, 대식세포 또는 흉선세포, 또는 기타 유형의 세포 예컨대, 섬유아세포 또는 암컷 생식기로부터 유래한 세포일 수 있다. 세포는 IL-1 수용체를 발현시키는 것이 바람직하다.

다른 변형예에서, EOA 관련 대립유전자를 보유하는 개체는 시험 화합물과 접촉되며, 이로써 1 이상의 바이오마커가 측정된다. 1 이상의 바이오마커가 세포의 표현형이 EOA 관련 대립유전자를 보유하지 않는 세포의 표현형과 근접하게 닮도록 변화하면, 시험 물질은 EOA 치료제로서 유효할 것으로 보인다. 개체는 인간 또는 인간을 제외한 트랜스게닉 동물일 수 있다.

바람직한 구체예에서, 세포성 또는 생체내 분석법은 IL-1 유전자의 발현을 조절하고, IL-1 mRNA의 번역을 조절하는 화합물, 또는 IL-1 mRNA 또는 단백질의 안정성 또는 활성을 조절하는 화합물을 확인하는데 사용된다. 따라서, 하나의 구체예에서, IL-1 단백질을 생성할 수 있는 세포는 시험 화합물과 함께 항온처리되며, 세포 배지중에 생성된 IL-1 단백질의 양을 측정하여, 시험 화합물과 접촉하지 않은 세포로부터 생성된 IL-1 단백질의 양과 비교한다. 다른 변형예에서, IL-1 생물활성을 측정하여 시험 화합물과 접촉하지 않은 세포에서 측정된 생물활성과 비교한다.뿐만 아니라, 다양한 IL-1 대립유전자를 함유하는 상이한 세포에 대한 시험 물질의 효과도 비교될 수 있다.

무세포 분석법

무세포 분석법은 또한 IL-1 단백질과 상호작용할 수 있는 화합물을 확인하여, IL-1 단백질의 활성을 변화시키는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물은 예를 들어, IL-1 단백질의 구조를 변형시킬 수 있으며, 이로써 이것이 IL-1 수용체에 결합하는 능력에 영향을 미칠 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이러한 화합물을 확인하는 무세포 분석법은 근본적으로 결합 파트너의 존재 또는 부재하에 IL-1 단백질을 함유하는 반응 혼합물과, 시험 화합물 또는 시험 화합물의 라이브러리로 이루어져 있다. 시험 화합물은 예를 들어, IL-1 결합 파트너 예컨대, 생물학적 불활성 표적 펩티드 또는 소분자의 유도체일 수 있다.

그러므로, 본 발명의 하나의 예시적인 스크리닝 분석법은 IL-1 단백질 또는 이의 기능적 단편을 시험 화합물 또는 시험 화합물의 라이브러리와 접촉시키는 단계 및 복합체 형성을 확인하는 단계를 포함한다. 확인하기 위하여, 분자는 특이적 마커 및 상이한 마커로 표지화된 시험 화합물 또는 이 시험 화합물의 라이브러리로 표지화될 수 있다. 이후 시험 화합물과 IL-1 단백질 또는 이의 단편의 상호작용은 항온처리 단계 및 세척 단계 이후에 2개의 표지의 수준을 측정함으로써 확인될 수 있다. 상기 세척 단계 이후 2개의 표지가 존재하면 상호작용이 있었다는 것을 나타낸다.

분자간 상호작용은 또한 광학 현상인 표면 플라스몬 공명(SPR)을 확인하는실시간 BIA(Biomolecular Interaction Analysis, Pharmacia Biosensor AB)를 사용하여 확인될 수 있다. 확인 방법은 생물 특이적 계면에서 거대분자의 질량 농도의 변화에 따라서 다르며, 임의의 상호작용 물질을 표지화할 필요도 없다. 하나의 구체예에서, 시험 화합물의 라이브러리는 예컨대, 미세 유동 세포의 하나의 벽을 형성하는 센서 표면상에 고정화될 수 있다. IL-1β단백질 또는 이의 기능적 단편을 함유하는 용액은 이후 연속적으로 상기 센서 표면상에 흘려보내어 진다. 신호 기록상에 나타난 공명각의 변화는 상호작용이 발생하였다는 것을 시사한다. 이러한 기법은 또한 예를 들어, BIAtechnology Handbook(Pharmacia)에 기술되어 있다.

본 발명의 다른 예시적인 스크리닝 방법은 (a) (ⅰ) IL-1 단백질, (ⅱ) IL-1 수용체 및 (ⅲ) 시험 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계 ; 및 (b) IL-1 단백질과 IL-1 수용체와의 상호작용을 확인하는 단계를 포함한다. 시험 화합물 부재하의 IL-1 단백질과 IL-1 수용체의 상호작용에 대한 시험 화합물 존재하의 IL-1 단백질과 IL-1 수용체의 상호작용에 있어서의 통계학적으로 유의적인 변화(촉진 또는 억제)는 이 시험 화합물이 시험 화합물에 대하여 IL-1 생물활성의 유력한 길항제(억제제)임을 시사한다. 이 분석법의 화합물은 동시에 접촉될 수 있다. 이와는 달리, IL-1 단백질은 처음에 적당한 시간동안 시험 화합물과 접촉되며, 그후 임의의 IL-1β수용체가 상기 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 상기 화합물의 효능은 다양한 농도의 시험 화합물을 사용하여 얻어진 데이터로부터 유래한 투여량 반응 곡선을 작성하여 평가할 수 있다. 더욱이, 조절 분석법은 또한 비교용 기준선을 제공하기 위하여 수행될 수 있다.

IL-1 단백질과 IL-1 수용체 사이의 복합체 형성은 다양한 기법에 의하여 확인될 수 있다. 상기 복합체 형성의 조절은 예를 들어, 확인 가능하도록 표지화된 단백질 예컨대, 방사능 표지, 형광 표지 또는 효소 표지된 IL-1 단백질 또는 IL-1 수용체를 사용하거나, 면역분석법 또는 크로마토그래피 확인에 의하여 정량될 수 있다.

통상적으로, IL-1 단백질 또는 IL-1 수용체를 고정화시켜 단백질중 어느 하나 또는 두개의 단백질의 비복합체화된 형태로부터 복합체의 분리를 촉진시키고, 또한 이 분석법의 자동화를 수행하는 것이 바람직할 것이다. IL-1 단백질과 IL-1 수용체의 결합은 반응물을 함유하기에 적당한 임의의 용기중에서 수행될 수 있다. 그 예로서는 미세역가 플레이트, 시험관 및 미세원심분리 튜브를 포함한다. 하나의 구체예에서, 단백질을 기질에 결합시킬 수 있는 도메인이 첨가된 융합 단백질이 제공될 수 있다. 예를 들어, 글루타치온-S-트랜스퍼라제/IL-1β(GST/IL-1β) 융합 단백질은 약간 엄중한 조건이 바람직할 수 있음에도 불구하고, 글루타치온 세파로즈 비드(Sigma Chemical, St. Louis, MO)상에 또는 글루타치온 유도체화된 미세역가 플레이트에 흡착된후, IL-1 수용체 예컨대, 35S-표지화된 IL-1 수용체, 시험 화합물 및 복합체 형성을 유도하는 조건 예를 들어, 염과 pH에 대한 생리적 조건하에서 항온처리된 혼합물과 복합화된다. 항온처리후, 비드를 세척하여 임의의 미결합 표지와, 고정화되어 직접 방사능 표지 측정된 기질(예를 들어, 섬광제중에 방치한 비드)을 제거하거나, 상기 비드는 결과적으로 복합체를 해리시킨 이후의 상청액중에 남게된다. 이와는 달리, 상기 복합체는 상기 기질로부터 해리되어, SDS-PAGE에 의하여 분리되고, 비드 분획중에서 발견되는 IL-1 단백질 또는 IL-1 수용체의 수준은 표준적인 전기 영동 기법 예컨대, 이하 실시예에 기술된 바와 같은 기법을 사용하여 겔로부터 정량될 수 있다. 기질상에 단백질을 고정화시키는 다른 기법도 또한 본 분석법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, IL-1 단백질 또는 IL-1 수용체중 어느 하나는 바이오틴 및 스트렙타비딘을 접합시켜 고정화될 수 있다.

트랜스게닉 동물

전술한 바와 같이, 트랜스게닉 동물은 예를 들어, EOA 치료제의 스크리닝을 보조하기 위해서 제조될 수 있다. 본 발명의 트랜스게닉 동물로서는 적당한 IL-1 프로모터의 제어하에 있거나 또는 이종 프로모터의 제어하에 있는 IL-1 돌연변이(이 돌연변이는 인간에 있어서 EOA 발병 원인임)를 포함하는, 인간을 제외한 동물을 포함할 수 있다. 본 발명의 트랜스게닉 동물은 또한 EOA 표현형을 나타내는 수준으로 발현된 IL-1 유전자를 포함할 수도 있다. 상이한 IL-1 대립유전자의 효과를 비교하기 위하여, 트랜스게닉 동물은 다양한 IL-1 대립유전자를 보유하도록 제조될 수 있으며, 이로써 EOA 표현형간 차이가 확인될 수 있다. 상이한 대립유전자 및 상이한 발현 수준을 시험함으로써, 후보 약물을 시험하는데 최적인 EOA 표현형을 나타내는 동물을 제조 및 확인할 수 있다.

트랜스게닉 동물은 또한 IL-1 프로모터 또는 이의 단편의 제어하에 있는 트랜스유전자 예컨대, 리포터 유전자를 포함하는 동물일 수도 있다. 상기 동물은 예를 들어, 유전자 발현을 조절함으로써 예컨대, IL-1의 생성을 조절하는 약물을 확인하는데 유용하다. 특정 변형예에서, IL-1 대립유전자는 프로모터 돌연변이일 수있다. 이러한 경우, 변형된 프로모터를 적당한 리포터 유전자에 작동적으로 융합시키는 것이 특히 바람직하다.

인간을 제외한 트랜스게닉 동물을 얻는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 바람직한 구체예에서, EOA 유발성 돌연변이의 발현은 예를 들어, 목적 패턴으로 발현을 조절하는 cis-작용 서열을 이용하는 세포, 조직 또는 발생 단계의 특정 하위세트에 제한되어 있다. 본 발명에 있어서, 이러한 IL-1 단백질의 모자이크식 발현은 다양한 형태의 계통 분석에 필수적일 수 있으며, 정상적인 배에 존재하는 조직의 작은 패치의 발생을 상당한 정도로 변형시킬 수 있는 발현 수준의 효과를 평가하는 추가적인 수단을 제공할 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 조직 특이적 조절 서열 및 조건적 조절 서열을 사용하여 특정 입체 패턴으로 IL-1 돌연변이의 발현을 조절할 수 있다. 더욱이, 일시적인 발현 패턴은 예를 들어, 조건적 재조합 시스템 또는 원핵생물 전사 조절 서열에 의하여 제공될 수 있다. IL-1 돌연변이를 발현시킬 수 있는 유전자 기법은 생체내 부위 특이적 유전자 조작에 의하여 조절될 수 있으며, 이에 관하여는 당업자에게 널리 공지되어 있다.

본 발명의 모든 트랜스게닉 동물은 이의 다수의 세포내에 본 발명의 EOA 유발성 돌연변이 트랜스유전자를 포함하며, 이때 상기 트랜스유전자는 "숙주 세포"의 표현형을 변형시킨다. 예시적인 구체예에서, 박테리오파지 P1의cre/loxP재조합효소 시스템(Lakso 등(1992) PNAS 89:6232-6236 ; Orban 등(1992) PNAS 89:6861-6865) 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 FLP 재조합효소 시스템[O'Gorman 등, 1991, Science 251:1351-1355 ; PCT 공개공보 WO92/15694]은 생체내 부위 특이적 유전자 재조합 시스템을 제조하는데 사용될 수 있다. Cre 재조합효소는loxP서열 사이에 위치하는 개재 표적 서열의 부위 특이적 재조합을 촉매화한다.loxP서열은 Cre 재조합효소가 결합하는 34개의 염기쌍 뉴클레오티드 반복 서열로서, Cre 재조합효소 매개성 유전자 재조합에 필요한 서열이다. 상기loxP서열의 방향은 Cre 재조합효소가 존재할때 개재 표적 서열이 절단되었는지 또는 역위되었는지 여부[Abremski 등(1984) J.Biol.Chem.259:1509-1514] ;loxP서열이 직접적인 반복부로서 배향될때 표적 서열의 절단을 촉매화 하는지와,loxP서열이 역위 반복부로서 배향될때 표적 서열의 역위를 촉매화하는지 여부를 결정한다.

그러므로, 표적 서열의 유전자 재조합은 Cre 재조합효소의 발현에 의존성이다. 상기 재조합효소의 발현은 예를 들어, 조직 특이적, 발생 단계 특이적, 외부적으로 첨가된 제제에 의하여 유도 가능하거나 또는 억제 가능하도록 조절 제어되는 프로모터 요소에 의하여 조절될 수 있다. 이와 같은 조절된 제어(regulated control)는 재조합효소 발현이 프로모터 요소에 의하여 매개되는 세포에서만 표적 서열의 유전자 재조합을 발생시킬 것이다. 그러므로, 상기 EOA 유발성 돌연변이 트랜스유전자 발현의 활성화는 재조합효소 발현을 제어함으로써 조절될 수 있다.

cre/loxP 재조합효소 시스템을 사용하여 EOA 유발성 돌연변이 트랜스유전자의 발현을 조절하는데에는 Cre 재조합효소 및 개개의 단백질을 모두 암호화하는 트랜스유전자를 함유하는 트랜스게닉 동물의 작제를 필요로 한다. "이중" 트랜스게닉 동물을 작제함으로써 상기 Cre 재조합효소 및 EOA 유발성 돌연변이 트랜스유전자를모두 함유하는 동물이 제공될 수 있다. 이러한 동물을 제공하는데에 있어 편리한 방법은 각각 트랜스유전자를 함유하는 2 마리의 트랜스게닉 동물을 교배시키는 것이다.

트랜스유전자의 발현을 촉진하기 위하여 원핵생물 단백질이 동시에 발현되어야 하는 원핵생물 프로모터 서열을 사용하여 유사한 조건적 트랜스유전자가 제공될 수 있다. 대표적인 프로모터 및 해당 트랜스 작용성 원핵생물 단백질은 미국 특허 제4,833,080호에 제시되어 있다.

뿐만 아니라, 조건적 트랜스유전자의 발현은 트랜스활성화(transactivation) 단백질 예컨대, 재조합효소 또는 원핵생물 단백질을 암호화하는 유전자를 조직에 전달하여 예컨대, 세포 유형 특이적 방식으로 발현시키는 유전자 치료법 유사 방법에 의하여 유도될 수 있다. 이 방법에 의하여, 트랜스유전자는 상기 트랜스활성화제를 도입하여 "발현(turned on)"될 때까지 침묵 상태로 성체에 유지될 수 있다.

대표적인 구체예에서, 본 발명의 "인간을 제외한 트랜스게닉 동물(transgenic non-human animals)"은 트랜스유전자를 인간을 제외한 동물의 생식계통에 도입함으로써 제조된다. 다양한 발생 단계에 있는 배의 표적 세포는 트랜스유전자를 도입시키는데 사용될 수 있다. 배 표적 세포의 발생 단계에 따라서 상이한 방법이 사용된다. 본 발명의 실시에 사용된 임의의 동물의 특이적 세포주(들)는 전반적인 양호한 건상 상태, 양호한 배 수율, 배에서의 양호한 전핵 가시성(visibility) 및 양호한 생식 적합성에 대하여 선택된다. 뿐만 아니라, 단상형은 중요한 인자이다. 예를 들어, 트랜스게닉 마우스가 제조될때,스트레인(strain) 예컨대, C57BL/6 또는 FVB 세포주가 종종 사용된다(Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). 바람직한 스트레인으로서는 H-2b, H-2d 또는 H-2q 단상형을 보유하는 스트레인 예컨대, C57BL/6 또는 DBA/1이 있다. 본 발명의 실시에 사용된 세포주(들)은 그것들 자체로서 트랜스게닉이며/이거나, 비발현된(knockout) 것(즉, 1 이상의 유전자가 부분적으로 또는 완전히 발현 억제된 동물로부터 얻어진 것)일 수 있다.

하나의 구체예에서, 트랜스유전자 작제물은 단일 단계의 배에 도입된다. 접합자는 미세주입을 위한 최고의 표적이다. 마우스에서, 수컷의 전핵은 크기가 대략 지름 20 ㎛에 이르며, 이로 인하여 DNA 용액 1∼2 pl를 반복적으로 주입시킬 수 있다. 접합체를 유전자 전이를 위한 표적으로서 사용하면, 대부분의 경우 주입된 DNA가 숙주 유전자에 혼입된후 절단될 것이라는 점에서 주요 이점이 있다[Brinster 등, (1985) PNAS 82:4438-4442]. 결과로서, 트랜스게닉 동물의 모든 세포는 혼입된 트랜스유전자를 운반할 것이다. 생식 세포중 50%가 이 트랜스유전자를 보유할 것이므로, 상기와 같은 운반을 통하여 트랜스유전자를 일반적으로 창시자 세포의 자손으로 효율적으로 전달시킬 것이다.

보통, 수정된 배는 전핵이 출현할 때까지 적당한 배지중에서 항온처리된다. 이때, 트랜스유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열은 전술한 바와 같이 암컷 또는 수컷 전핵으로 도입된다. 몇몇 종 예컨대, 마우스에 있어서는, 수컷의 전핵이 바람직하다. 외인성 유전 물질이 접합자의 수컷 DNA 상보체에 첨가된후 난자 핵 또는 접합자 암컷의 전핵에 의하여 프로세싱되는 것이 가장 바람직하다. 난자 핵 또는암컷 전핵은, 아마도 수컷 DNA의 프로타민과 히스톤을 치환시켜 암컷 및 수컷 DNA 상보체의 복합화를 촉진하여 이배체 접합자를 형성함으로써, 수컷 DNA 상보체에 영향을 미치는 분자를 방출시킬 것으로 생각된다.

따라서, 외인성 유전 물질을 수컷의 DNA의 상보체 또는 DNA의 임의의 다른 상보체에 첨가한후, 암컷의 전핵에 의하여 영향을 받게 할 수 있다. 예를 들어, 외인성 유전 물질은 가능한한 수컷 전핵을 형성한 후, 수컷 및 암컷 전핵이 잘 분리되어 두개 모두 세포막에 인접하여 위치되었을때, 조기 수컷 전핵에 첨가된다. 이와는 달리, 외인성 유전 물질은 탈응축이 수행되도록 유도된후의 정자 핵에 첨가될 수 있었다. 이후 상기 외인성 유전 물질을 함유하는 정자는 난자에 첨가되거나, 또는 탈응축된 정자는 상기 난자에 트랜스유전자 작제물과 함께 첨가될 수 있었으나, 상기 작제물은 가능한한 정자가 첨가된 이후에 첨가될 수 있었다.

트랜스유전자 뉴클레오티드 서열을 배로 도입하는 것은 당업계에 공지된 임의의 수단 예를 들어, 미세주입, 전기천공법 또는 리포펙션에 의하여 수행될 수 있다. 상기 트랜스유전자 뉴클레오티드 서열을 배에 도입한후, 상기 배를 다양한 시간 동안 시험관내에서 항온처리시킬 수 있거나, 또는 대리 숙주(surrogate host)에 재이식시킬 수 있거나, 또는 상기 두가지 모두 수행 가능하다. 성숙할 때까지의 시험관내 항온처리하는 것은 본 발명의 범위내에 포함된다. 통상적인 하나의 방법은, 종에 따라서 상기 배를 시험관내에서 약 1∼7일 동안 항온처리한후, 이를 대리 숙주에 재이식하는 것이다.

본 발명의 목적에 있어서, 접합자는 근본적으로 완전한 유기체로 발생될 수있는 이배체 세포를 형성한다. 일반적으로, 접합자는 자연적으로 생성되었거나 또는 배우자(들)로부터 유래된 2개의 반수체 핵을 융합시켜 인공적으로 생성된 핵을 함유하는 난자로 이루어질 것이다. 따라서, 배우자 핵은 자연적으로 화합 가능한 것 즉, 기능적 유기체로의 분화 및 발생을 진행시킬 수 있는 다양한 접합자를 생성시키는 것이어야 한다. 일반적으로, 정배수체 접합자가 바람직하다. 이수체 접합자가 얻어지면, 둘중 어느 하나의 배우자로부터 기원한 유기체의 정배수체의 수에 있어서, 염색체 수는 1개를 초과하도록 다양해서는 안된다.

유사한 생물학적 고려 이외에, 물리적인 고려 사항은 또한 상기 접합자의 핵에 첨가될 수 있거나 또는 접합자의 핵의 일부를 형성하는 유전 물질에 첨가될 수 있는 외인성 유전 물질의 양(예컨대, 부피)을 좌우하기도 한다. 유전 물질이 제거되지 않으면, 첨가될 수 있는 외인성 유전 물질의 양은 물리적으로 파괴되지 않은채 흡수될 양으로 제한된다.

일반적으로, 삽입된 외인성 유전 물질의 부피는 약 10 피코리터를 초과하지 않을 것이다. 이러한 첨가의 물리적 효과는 접합자의 생존능을 물리적으로 손상시킬 정도로 켜서는 안된다. 외인성 유전 물질을 비롯하여, 생성된 접합자의 유전 물질은 생물학적으로 접합자의 기능적 유기체로의 분화 및 발생을 개시 및 유지시킬 수 있으므로, DNA 서열의 수 및 다양성에 대한 생물학적 제한은 특정 접합자 및 외인성 유전 물질의 기능에 따라서 다양할 것이며, 또한 이는 당업자에게 명백할 것이다.

접합자에 첨가되는 상기 트랜스유전자 작제물 복사체의 수는 첨가된 외인성유전 물질의 총량에 따라 다르며, 이는 유전자 형질전환을 발생시킬 수 있는 양 일 것이다. 이론적으로는 1개의 복사체만이 필요하지만 ; 1개의 복사체가 기능성이라는 것을 입증하기 위하여는 일반적으로 트랜스유전자 작제물의 다수의 복사체 예를 들어, 1,000∼20,000개의 복사체가 사용된다. 본 발명에 있어서는, 각각의 삽입된 외인성 DNA 서열중 1개 이상의 기능성 복사체를 보유하여 외인성 DNA 서열의 표현형 발현을 강화시킨다는 이점이 있을 것이다.

외인성 유전 물질을 핵 유전 물질에 첨가할 수 있는 임의의 기법은 이 기법이 세포, 핵막 또는 기타 실재하는 세포 또는 유전자 구조물을 파괴하지 않는 한, 이용될 수 있다. 외인성 유전 물질은 미세 주입법에 의하여 핵 유전 물질로 삽입되는 것이 바람직하다. 세포 및 세포 구조물의 미세 주입법은 당업계에 공지된 것이며 또한 널리 사용된다.

재이식은 표준적인 방법을 사용하여 수행된다. 일반적으로, 대리 숙주를 마취시킨후, 배를 난관에 삽입한다. 특정 숙주로 이식된 배의 수는 종에 따라서 다양할 것이지만, 대게는 종이 자연적으로 생산하는 자손의 수와 거의 동일하다.

상기 대리 숙주의 트랜스게닉 자손은 임의의 적당한 방법에 의하여 트랜스유전자의 존재 및/또는 발현에 대해서 스크리닝될 수 있다. 스크리닝은 종종 트랜스유전자의 최소한의 부분과 상보성인 프로브를 사용하는 서던 블롯 또는 노던 블롯 분석법에 의하여 수행된다. 트랜스유전자에 의하여 암호화되는 단백질에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석법은 트랜스유전자 생성물의 존재에 관하여 스크리닝하는 대안적 방법 또는 부가적 방법으로서 사용될 수 있다. 통상적으로, DNA는 미부 조직으로부터 제조되며, 트랜스유전자에 대한 서던 분석법 또는 PCR에 의하여 분석된다. 대안적으로, 임의의 조직 또는 세포 유형이 이 분석법에 사용될 수 있지만, 가장 높은 수준으로 트랜스유전자를 발현시키는 것으로 추정되는 조직 또는 세포는 서던 분석법 또는 PCR을 이용하여 트랜스유전자의 존재 및 발현에 대하여 시험된다.

트랜스유전자의 존재를 평가하기 위한 대안적 또는 부가적 방법으로서는 적당한 생화학적 분석법 예컨대, 효소 및/또는 면역학적 분석법, 특정 마커 또는 효소 활성에 대한 해부학적 스트레인, 유동 혈구계측 분석법 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 혈액의 분석법은 또한 혈중 트랜스유전자 생성물의 존재를 확인하고, 트랜스유전자가 다양한 유형의 혈액 세포 및 기타 혈액 성분의 수준에 미치는 영향을 평가하는데 유용할 수 있다.

트랜스게닉 동물의 자손은 트랜스게닉 동물과 적당한 파트너를 교배시키거나, 또는 트랜스게닉 동물로부터 얻어진 난자 및/또는 정자의 시험관내 수정을 통하여 얻을 수 있다. 파트너와의 교배가 수행되는 경우, 상기 파트너는 트랜스게닉 및/또는 발현억제된 것일 수 있거나 또는 그러한 것일 수 없으며 ; 상기 파트너가 트랜스게닉일 경우, 이는 동일하거나 또는 상이한 트랜스유전자를 함유할 수 있으며, 또는 둘다를 함유할 수도 있다. 대안적으로, 상기 파트너는 부모 세포주일 수 있다. 시험관내 수정법이 사용되는 경우, 수정된 배는 대리 숙주에 이식될 수 있거나, 또는 시험관내 항온처리될 수 있으며, 또는 상기 두가지 모두 수행될 수 잇다. 상기 방법중 어느 하나를 수행하면, 자손은 전술한 방법 또는 기타 적당한 방법을사용하여 트랜스유전자의 존재에 대하여 평가될 수 있다.

본 발명에 의하여 제조된 트랜스게닉 동물은 외인성 유전 물질을 포함할 것이다. 뿐만 아니라, 이러한 구체예에서 상기 서열은 바람직하게는 특정 유형의 세포내에서 트랜스유전자의 생성물을 발현시킬 수 있는 전사 조절 요소 예를 들어, 프로모터에 부착될 것이다.

레트로바이러스 감염은 또한 트랜스유전자를 인간을 제외한 동물에 도입시키는데 사용될 수도 있다. 인간을 제외한 동물의 발생중인 배는 시험관내 배양되어 배반포 단계로 될 수 있다. 이 시기에, 할구는 레트로바이러스 감염에 대한 표적일 수 있다[Jaenich, R.(1976) PNAS 73:1260-1264]. 할구는 효소 처리에 의하여 효율적으로 감염되어 투명대가 제거된다[Manipulating the Mouse Embryo, Hogan 편저, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986]. 트랜스유전자를 도입시키는데 사용된 바이러스 벡터 시스템은 통상적으로 트랜스유전자를 보유하는 복제 결핍 레트로바이러스이다[Jahner 등(1985) PNAS 82:6927-6931 ; Van der Putten 등(1985) PNAS 82:6148-6152]. 형질감염은 할구를 바이러스 생산 세포의 단일층상에서 배양함으로써 용이하고 효율적으로 얻어진다[Van der Putten, 상동 ; Stewart 등(1987) EMBO J.6:383-388]. 대안적으로, 감염은 후기 단계에서 수행될 수 있다. 바이러스 또는 바이러스 생산 세포는 포배강에 주입될 수 있다[Jahner 등 (1982) Nature 298:623-628]. 인간을 제외한 트랜스게닉 동물을 형성한 세포의 하위세트에서만이 공조하여 발현되므로, 창시자 세포의 대부분은 트랜스유전자에 대하여 모자이크 형태일 것이다. 또한, 창시자 세포는 게놈의 상이한 위치에 트랜스유전자의 다양한 레트로바이러스 삽입체를 포함할 수 있으며, 이 삽입체는 일반적으로 자손대에서 분리될 것이다. 뿐만 아니라, 임신중기의 배의 자궁내 레트로바이러스 감염에 의하여 트랜스유전자를 생식세포주에 도입할 수도 있다[Jahner 등(1982) 상동].

트랜스유전자 도입을 위한 세번째 유형의 표적 세포는 배 줄기 세포(ES)이다. ES 세포는 시험관내 배양된 이식전 배로부터 얻어지는 것으로서, 배와 융합된다[Evans 등(1981) Nature 292:154-156 ; Bradley 등(1984) Nature 309:255-258 ; Gossler 등(1986) PNAS 83:9065-9069 ; 및 Robertson 등(1986) Nature 322:445-448]. 트랜스유전자는 DNA 형질감염 또는 레트로바이러스 매개성 형질도입에 의하여 ES 세포에 효율적으로 도입될 수 있다. 이러한 형질감염된 ES 세포는 이후 인간을 제외한 동물로부터 유래된 배반포와 복합화될 수 있다. 이후 상기 ES 세포는 배에 이식되어. 생성된 키메라 동물의 생식 세포주를 생성한다. 자세한 사항은 문헌[Jaenisch, R.(1988) Science 240:1468-1474]을 참조하시오.

유효 투여량

예컨대, Ld50(The Dose Lethal To 50% Of The Population ; 개체군의 50%에 치명적인 투여량) 및 Ed50(The Dose Therapeutically Effective In 50% Of The Population ; 개체군의 50%에 치료적으로 유효한 투여량)을 측정하기 위하여, 이러한 화합물의 독성 및 치료 효능은 표준적인 약학적 방법에 의하여 세포 배양액 또는 실험 동물에서 측정될 수 있다. 독성 효과 및 치료 효과 사이의 투여량의 비율은 치료 지수로서, LD50/ED50의 비율로 표현될 수 있다. 치료 지수가 큰 화합물이바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있으나, 비감염 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화하기 위해서는 이러한 화합물을 발병 조직의 부위에 표적화하는 전달 시스템을 디자인하는데 주의를 기울여야 하며, 이와 같이 함으로써 부작용을 줄일 수 있다.

세포 배양 분석법 및 동물 연구법으로부터 얻어진 데이터는 인간에 사용되는 투여량 범위를 정례화하는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 독성이 거의 없거나 아예 없는 ED50을 포함하는 순환 농도(circulating concentration)의 범위내에 있는 것이 바람직하다. 투여량은 사용된 투여형 및 이용된 투여 경로에 따라서 상기 범위내에서 다양할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용된 임의의 화합물에 있어서, 처음에 세포 배양 분석법으로부터 치료학적 유효량이 측정될 수 있다. 세포 배양액에서 측정되는 바와 같이, 투여량은 동물 모델에서 정례화되어 IC50을 포함하는 순환 혈장 농도(즉, 증상을 최대수준의 절반으로 억제할 수 있는 시험 화합물의 농도) 범위를 이룰수 있다. 이러한 정보는 인간에서 더욱 정확하게 유효 투여량을 결정하는데 사용될 수 있다. 혈장중 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의하여 측정될 수 있다.

제제화 및 용도

본 발명에 사용되는 약학 조성물은 1 이상의 생리적 허용 담체 또는 부형제를 사용하여 통상적인 방식으로 제제화될 수 있다. 따라서, 화합물 및 이의 생리학적 허용 염 그리고 용매화물은 예를 들어, 주사, 흡입 또는 취입(입 또는 코를 통한 취입) 또는 경구, 협측, 비경구 또는 직장 투여와 같은 투여용으로 제제화될 수있다.

이러한 치료법에 있어서, 본 발명의 화합물은 전신 투여 및 국소 또는 국재 투여를 비롯한 다양한 투여에 있어서의 적재량으로 제제화될 수 있다. 일반적으로 기법 및 제제화는 문헌[Remmington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PA]에 공지되어 있다. 전신 투여에 있어서는, 근육내, 정맥내, 복강내 및 피하 주사를 비롯한 주사가 바람직하다. 주사에 있어서, 본 발명의 화합물은 액상 용액 바람직하게는, 생리적 혼화성 완충액 예컨대, Hank 용액 또는 Ringer 용액중에서 제제화될 수 있다. 또한, 화합물은 고형으로 제제화될 수 있으며, 사용 직전에 재용해 또는 현탁될 수 있다. 동결 건조된 형태도 포함된다.

경구 투여에 있어서, 약학 조성물은 예를 들어, 약학적 허용 부형제 예컨대, 결합제(예컨대, 예비 젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로즈) ; 충전제(예컨대, 락토즈, 미세결정질 셀룰로즈 또는 인산수소칼슘) ; 윤활제(예컨대, 스테아르산 마그네슘, 활석 또는 실리카) ; 붕괴제(예컨대, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트) ; 또는 습윤제(예컨대, 나트륨 라우릴 설페이트)를 사용하여 통상의 방법으로 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 정제는 당업계에 널리 공지된 방법에 의하여 코팅될 수 있다. 경구 투여용 액상 제제는 예를 들어, 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있으며, 또는 사용전 물이나 기타 적당한 비이클로 조제하기 위한 건조 생성물로 제공될 수도 있다. 이러한 액상 제제는 약학적 허용 첨가제 예컨대, 현탁제(예컨대, 소르비톨 시럽, 셀룰로즈 유도체 또는 수소화 식용 지방) ; 유화제(예를 들어, 레시틴 또는아카시아) ; 비수성 비이클(예컨대, ationd 오일, 유질 에스테르, 에틸 알코올 또는 분획화된 식물성 오일) ; 및 보존제(예컨대, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르빈산)를 사용하여 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 제제는 또한 적당한 완충 염, 향미제, 착색제 및 감미제를 함유할 수도 있다.

경구 투여용 제제는 적당히 제제화되어 활성 화합물을 조절 방출시킬 수 있다. 협측 투여에 있어서, 조성물은 통상적인 방법으로 제제화된 정제 또는 로진즈 형태를 취할 수 았다. 흡입에 의한 투여에 있어서, 본 발명에 사용되는 화합물은 적당한 추진제 예컨대, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적당한 기체를 사용하여 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이를 제공하는 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 단위 투여형이 결정될 수 있다. 예를 들어, 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 젤라틴으로 된 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 적당한 분말 기제 예컨대, 락토즈 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 제제화될 수 있다.

화합물은 주사 예컨대, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제제화될 수 있다. 주사 제제는 보존제가 부가되어 단위 투여형 예컨대, 앰플 또는 복수 투여 용기의 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 유질 또는 수성 비이클중 현탁액, 용액 또는 유액과 같은 형태를 취할 수 있으며, 제제화제 예컨대, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 이와는 달리, 활성 성분은 사용전 적당한 비이클 예컨대, 무발열원 멸균수로 조제되는 분말 형태일 수 있다.

화합물은 또한 직장 투여용 조성물 예를 들어, 통상의 좌제 기제 예컨대, 코코아 버터 또는 기타 글리세리드를 함유하는 예컨대, 좌제 또는 정체 관장으로 제제화될 수도 있다.

전술한 바 이외에, 화합물은 또한 데포 제제로 제제화될 수도 있다. 이러한 장기 활성 제형은 이식(예를 들어, 피하 또는 근육내 이식) 또는 근육내 주사에 의하여 투여될 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 화합물은 적당한 중합체 또는 소수성 물질(예를 들어, 적합한 오일중 유액) 또는 이온 교환 수지를 사용하여 제제화될 수 있으며, 또는 잘 용해되지 않는 유도체 예를 들어, 잘 용해되지 않는 염으로서 제제화될 수 있다.

전신 투여는 또한 경점막 또는 경피적 수단에 의하여 수행될 수도 있다. 경점막 또는 경피 투여를 위하여, 투과될 차단막에 적당한 추진제가 상기 제형에 사용된다. 이러한 추진제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 경점막 투여용 담즙염 및 후시딘산 유도체를 포함한다. 또한 투과를 촉진하기 위하여 세제가 사용될 수도 있다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌제를 사용하여 수행될 수 있다. 국소 투여에 있어서, 본 발명의 올리고머는 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제제화된다. 세척 용액은 국소적으로 사용되어 손상 또는 염증을 치료하여 치료 효과를 개선시킬 수 있다.

임상학적 설정에 있어서, EOA 치료 유전자에 대한 유전자 전달 시스템은 다수의 방법중 임의의 방법을 사용하여 환자에 도입될 수 있으며, 여기서 각각의 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 유전자 전달 시스템의 약학적 제제는 정맥내 주사에 의하여 전신 도입될 수 있으며, 단백질의 표적 세포로의 특이적 형질도입은 유전자 전달 비이클, 리포터 유전자의 발현을 제어하는 전사 조절 서열로 인한 세포형 또는 조직형 발현, 또는 이의 조합에 의하여 제공되는 형질 감염의 특이성으로 인하여 우세하게 수행된다. 다른 구체예에서, 재조합 유전자의 초기 전달은 국소화된 동물로 이 유전자가 도입됨에 따라서 더욱 제한된다. 예를 들어, 유전자 전달 비이클은 카테터(미국 특허 제5,328,470호 참조) 또는 정위 주사(예를 들어, Chen 등(1994) PNAS 91:3054-3057)에 의하여 도입될 수 있다. EOA 치료 유전자는 예를 들어, 문헌[Dev 등(1994) Cancer Treat Rev.20:105-115]에 기술된 기법을 사용하는 전기천공법에 의하여 유전자 치료 작제물중에 전달될 수 있다.

본 발명의 유전자 치료 작제물 또는 화합물의 약학 제제는 근본적으로 허용 희석제중의 유전자 전달 시스템으로 이루어지거나, 또는 유전자 전달 비이클 또는 화합물이 매립된 서방형 기질을 포함할 수 있다. 대안적으로, 완전 유전자 전달 시스템이 재조합 세포 예컨대, 레트로바이러스 벡터로부터 원래의 상태로 제조될 수 있는 경우, 약학 제제는 유전자 전달 시스템을 생성하는 1 이상의 세포를 포함할 수 있다.

필요에 따라서, 조성물은 활성 성분을 함유하는 1 이상의 단위 투여형을 포함할 수 있는 팩 또는 분배 장치로 제공될 수 있다. 상기 팩은 예를 들어 금속 또는 플라스틱 호일 예컨대, 발포제 팩을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 분배 장치는 투여 지침을 수반할 수 있다.

이하 일반적으로 기술된 본 발명은 다음의 실시예를 참고로 하여 보다 용이하게 이해할 수 있을 것이며, 이는 본 발명의 임의의 측면 및 구체예를 예시할 목적으로만 포함된 것이지, 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

실시예 1 : 노화와 대립유전자간의 관련성

Mayo 클리닉에서 실시된 연구에 따르면, 502명의 성인 카프카스인에 있어서 특정 유전자형의 보유율은 연령이 증가함에 따라 유의적으로 감소한다는 것을 발견하였는데, 이는 연령 관련 질병으로 인하여 이러한 유전자형이 선택적으로 소실된다는 것을 시사하는 것이다(도 1 및 도 8 참조).

IL-1A(+4845) 및 IL-1B(+3954)[이들 둘다는 강한 연관 비평형상태에 있으며, 이는 본 발명자들이 패턴 1이라 칭하는 특성에 해당함]에 대한 대립유전자 2의 보유은 연령이 증가함에 따라서 감소하였다.

IL-1RN(+2018)에서의 대립유전자 2의 보유율은 연령이 증가함에 따라서 감소하였다. 이 마커는 IL-1A(+4845) 및 IL-1B(+3954)와 음성 연관 비평형상태에 있으며, 패턴 2의 특징을 이룬다. 따라서, RN(+2018) 대립유전자 2는 패턴 1의 효과를 반영할 뿐만 아니라, IL-1RN(+2018)(및 패턴 2)과 노화 사이의 독립적 관계를 제시하는 것으로 파악된다.

실시예 2 : 내피 세포 노화와 관련된 IL-1RN 대립유전자 2

IL-1 유전자형은 내피 세포에서의 노화 프로그램에 영향을 줌으로써 내피 세포의 수명을 예측하게 한다. IL-1 유전자형 패턴은 다양한 세포 유형에서 노화를예측하는데 사용될 수 있으며, 또한 다수의 면역 염증성 질병의 진행에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다.

연구 방법 디자인

인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 분리하여 이를 배양액중에 유지시켰다. 상기 세포에서 개체군 배가(population doubling)의 횟수를 평가하였으며, 이를 IL-1RN VNTR 다형성과 상관시켰다. 북유럽 카프카스인 공여자로부터 세포를 얻었다. 시험된 공여 HUVEC 개체군중, 11개는 IL-1RN VNTR 1.1을 보유하였으며, 8개는 IL-1RN VNTR 1.2를 보유하였고, 2개는 IL-1RN VNTR 2.2를 보유하였다. 시험된 가설은 세포 개체군 배가 횟수가 감소된 희귀성 IL-1VNTR 대립유전자 2와 관련이 있었으며, 이는 노화의 지표가 된다.

결과 :

IL-1ra 유전자형과 배양액중 누적 개체군 배가의 횟수 사이에 상당한 관련성이 관찰되었다. VNTR 다형성의 2개의 대립유전자의 존재는 배양액중 HUVEC의 증식 능력의 감소와 관련되었다. 이 효과는 동형접합 상태에서 가장 특징적으로 나타났으나, 임의의 2개의 대립유전자의 존재는 복제능의 상당한(p = 0.0448) 감소와 관련되었다. IL-1RN(VNTR) 대립유전자 2는 패턴 2의 일부이다. 어떠한 특정 기작으로 정립할 의도는 없지만, IL-1 유전자형은 산화질소 수준에 미치는 효과를 통하여 HUVEC 노화에 영향을 미칠수 있다. 시토킨의 IL-1군은 산화질소의 수준을 조절하는 것으로 공지되어 있으며, 상기 산화질소는 부분적으로는 텔로머라제 활성의 연령 의존적 감소를 지연시킴으로써 배양액중 내피 세포의 노화를 지연시키는 것으로 보인다.

실시예 3 : 특정 IL-1 대립유전자를 검출하는 예시적인 방법

정맥 천자에 의하여 혈액을 취하고 이를 -20℃에 응집되지 않은 상태로 보관한 다음, DNA를 추출하였다. 혈액 10㎖를 저장성 적혈구 세포(RBC) 용해 용액[10 mM Tris, 0.32 수크로즈, 4mM MgCl₂, 1% Triton X-100] 40㎖에 첨가하고, 거꾸로 하여 4분 동안 실온(RT)에서 혼합하였다. 이후 샘플을 1300 g에서 15분 동안 원심분리시키고, 상청액을 흡출하여 폐기한 다음, 세포 펠렛에 RBC 용해 용액 30㎖를 더 넣었다. 원심분리후, 상기 펠렛을 백혈구(WBC) 용해 용액(0.4M Tris, 60 mM EDTA, 0.15M NaCl, 10% SDS) 2㎖중에 재현탁시키고, 이를 새로운 15㎖들이 폴리프로필렌 튜브로 옮겼다. 나트륨 퍼클로레이트를 최종 농도 1M이 되도록 첨가하고, 처음에 는 실온에서 15분 동안 회전 혼합기상에서 이 튜브를 역으로 뒤집은 다음, 이를 65℃에서 25분 동안 항온처리하면서, 주기적으로 뒤집어주었다. 클로로포름(-20℃에서 보관) 2㎖를 첨가한후, 샘플을 10분 동안 실온에서 혼합하여 다시 이를 3분 동안 800 g에서 원심분리시켰다. 이 단계에서는 3001 Nucleon Silica 현탁액(Scotlab, UK)을 사용하고, 1400 g에서 5 분 동안 원심분리함으로써 상들이 매우 뚜렷하게 구별되었다. 생성된 수성 상층을 새로운 15㎖들이 폴리프로필렌 튜브에 옮기고, 냉각 에탄올(-20℃에서 보관)을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 이를 유리 후크로 스풀링하여 5001 TE 또는 멸균수를 포함하는 1.5㎖들이 에펜도르프 튜브로 옮겼다. TE중에서 밤새도록 재현탁시킨 다음, 260㎚에서 분광계로 게놈성 DNA 수율을 계산하였다. 샘플 분취량을 100 ug/㎖로 희석시키고, 이를 미세적가 용기로옮긴후 4℃에서 보관하였다. 장래 사용하기 위하여 스톡을 -20℃에서 보관하였다.

일반적으로, 대립유전자는 PCR후 제한효소 분해 또는 프로브를 사용한 혼성화에 의하여 확인된다. 대표적인 위치에 대한 대표적인 프라이머 세트 및 분석법을 제시하였다.

IL-1RN(+2018).PCR 프라이머를 디자인하여(게놈 서열에 미스매치시켜) 2개의 대립유전자상의 2개의 효소 절단 부위를 조작한 결과, RFLP 분석법을 수행할 수 있었다. 유전자 수탁 번호는 X64532이다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같았다 :

5'-CTATCTGAGGAACAACCAACTAGTAGC-3'

5'-TAGGACATTGCACCTAGGGTTTGT-3'

[96℃, 1분] ; [94℃, 1분 ; 57℃, 1분 ; 70℃, 2분] ×35 ; [70℃, 5분] ×1 ; 4℃에서 사이클링을 수행하였다. 각각의 PCR 반응물을 25㎕ 만큼의 분취액 2개로 나누었으며 ; 특정 10X 제한 완충액 3㎕ 이외에, 이 분취액중 하나에는 Alu1 5 유니트를 첨가하고, 다른 하나에는 Msp1 5 유니트를 첨가하였다. 37℃에서 밤새도록 항온처리하였다. 9% PAGE로 전기영동하였다.

2개의 효소는 각각 2개의 상이한 대립유전자들을 절단하였다. Alu1은 대립유전자 1에 대하여 126bp 및 28bp 단편을 생성하였던 반면에, 대립유전자 2(154bp)는 분해하지 않았다. Msp1은 대립유전자 2로 125bp 및 29bp를 생성하였던 반면에, 대립유전자 1은 절단되지 않았다(154bp). 그러므로, (PAGE에서 순서대로 분리된) 상기 2개의 반응물은 상동접합자에 대하여는 분해에 있어서 역 패턴을 나타낼 것이며, 이형접합자에 대하여는 동일한 패턴을 나타낼 것이다. 대립유전자의 빈도는 0.74 및 0.26이다.

IL-1RN(VNTR).다음과 같은 방법에 따라서 IL1-RN(VNTR) 마커의 유전자형을 확인할 수 있다. 전술한 바와 같이, IL1-RN(+2018) 마커의 2개의 대립유전자과 가장 빈번하게 나타나는 2개의 IL-1RN(VNTR) 대립유전자(대립유전자 1 및 대립유전자 2)과의 연관 비평형도는 >97%이다. 유전자 수탁 번호는 X64532이다. PCR 증폭에 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같았다 :

5'-CTCAGCAACACTCCTAT-3'

5'-TCCTGGTCTGCAGGTAA-3'

[96℃, 1분] ×1 ; [94℃, 1분 ; 60℃, 1분 ; 70℃, 2분] ×35 ; [70℃, 5분] ×1 ; 4℃에서 사이클링을 수행하였다. 90V, 30분 동안 2% 아가로즈에서 전기영동을 수행하였다. PCR 생성물 크기는 반복부의 수를 직접적으로 나타낸다 : 가장 빈번하게 나타나는 대립유전자(대립유전자 1)은 412 bp 생성물을 형성하였다. 측접하는 영역이 66bp에 걸쳐서 확장되어 있으므로, 나머지 344 bp는 86bp 반복부를 4개 내포한다. 이와 유사하게, 240 bp 생성물은 2개의 반복부(대립유전자 2)를, 326 bp 생성물은 3개의 반복부(대립유전자 3)를, 498 bp 생성물은 5개의 반복부(대립유전자 4)를, 584 bp 생성물은 6개의 반복부(대립유전자 6)를 내포하였다. 가장 빈번하게 나타나는 4개의 대립유전자에 대한 빈도는 0.734, 0.241, 0.021 및 0.004였다.

IL-1A(-889).다음과 같은 방법에 따라서 IL-1A(-889) 마커의 유전자형을확인하였다[McDowell등, Arthritis Rheum.38:221-28, 1995]. 대립유전자 1(-889의 C)을 증폭시켜 RFLP 분석법을 수행할 수 있을때, PCR 프라이머중 하나는 염기가 변형되어 NcoI 부위를 생성하였다. 유전자 수탁번호는 X03833이다. PCR 중폭에 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같았다 :

5'-AAG CTT GTT CTA CCA CCT GAA CTA GGC-3'

5'-TTA CAT ATG AGC CTT CCA TG-3'

MgCl₂를 최종 농도 1 mM로 사용하고, PCR 프라이머를 0.8 μM로 사용하였다. [96℃, 1분] ×1 ; [94℃, 1분 ; 50℃, 1분 ; 72℃, 2분] ×45 ; [72℃, 5분] ×1 ; 4℃에서 사이클링을 수행하였다. 각 PCR 반응물에 특정 10X 제한 완충액 3㎕ 이외에 NcoI 6 유닛을 첨가하였다. 37℃에서 밤새도록 항온처리하였다. 6% PAGE로 전기영동을 수행하였다.

NcoI 분해를 통하여 길이 83 bp 및 16 bp인 단편들을 생성하는 반면에, 제한 효소는 대립유전자 2를 절단하지 않는다. 이에 대응하여, 이종접합자는 3개의 밴드를 나타낼 것이다. 2개의 대립유전자에 대한 빈도는 0.71 및 0.29였다.

IL-1A(+4845).다음의 방법에 따라서 IL-1A(+4845) 마커의 유전자형을 확인할 수 있었다. PCR 프라이머는 대립유전자 1에 Fun 4H1 제한 부위를 생성시켜 RFLP 분석을 가능하게 하였다. 유전자 수탁 번호는 X03833이다. PCR 증폭용으로 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같았다 :

5'-ATG GTT TTA GAA ATC ATC AAG CCT AGG GCA-3'

5'-AAT GAA AGG AGG GGA GGA TGA CAG AAA TGT-3'

MgCl₂를 최종 농도 1 mM로 사용하고, PCR 프라이머를 0.8 μM로 사용하였다. 여기에 5% DMSO를 첨가하였고, 이때 DNA 주형은 150ng/50㎕ PCR였다. [95℃, 1분] ×1 ; [94℃, 1분 ; 56℃, 1분 ; 72℃, 2분] ×35 ; [72℃, 5분] ×1 ; 4℃에서 사이클링을 수행하였다. 각 PCR 반응물에 특정 10X 제한 완충액 2㎕ 이외에 Fun 4H1 2.5 유닛을 첨가하였다. 37℃에서 밤새도록 항온처리하였다. 9% PAGE로 전기영동을 수행하였다.

Fun 4H1는 76bp의 일정한 밴드(대립유전자에 상관없이 존재)를 생성하였으며, 대립유전자 1에 대하여는 밴드 2개(29bp 및 124bp), 대립유전자 2에 대하여는 밴드 1개(153bp)를 추가로 형성할 것이다. 상기 2개의 대립유전자에 대한 빈도는 0.71 및 0.29였다.

IL-1B(-511).다음의 방법에 따라서 상기 IL-1B(-511) 마커의 유전자형을 확인할 수 있다. 유전자 수탁 번호는 X04500이다. PCR 중폭에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같았다 :

5'-TGG CAT TGA TCT GGT TCA TC-3'

5'-GTT TAG GAA TCT TCC CAC TT-3'

MgCl₂를 최종 농도 2.5mM로 사용하고, PCR 프라이머를 1 μM로 사용하였다. [95℃, 1분] ×1 ; [95℃, 1분 ; 53℃, 1분 ; 72℃, 2분] ×35 ; [72℃, 5분] ×1 ; 4℃에서 사이클링을 수행하였다. 각각의 PCR 반응물을 2개의 분취액으로 나누었으며 ; 이중 하나의 분취액에는 AvaI 3 유닛을 첨가하고, 다른 하나의 분취액에는Bsu 36I 3.7 유닛을 첨가하였다. 상기 두개의 분취액에 특정 10X 제한 완충액 3㎕를 첨가하였다. 37℃에서 밤새도록 항온처리하였다. 9% PAGE로 전기영동을 수행하였다.

2개의 제한효소는 각각 2개의 대립유전자중 하나를 절단하였으며, 이로써 RFLP 분석법을 수행할 수 있었다. AvaI은 대립유전자 1로 190 bp 및 114 bp와 같은 2개의 단편을 생성할 것이며, 대립유전자 2는 절단하지 않는다(304 bp). Bsu 36I는대립유전자 2로 190 bp 및 11 bp의 단편을 2개 생성할 것이며, 대립유전자 1은 절단하지 않는다. 2개의 대리형질에 대한 빈도는 0.61 및 0.39였다.

IL-1B(+3954).다음의 방법에 따라서 IL-1B(+3954) 마커의 유전자형을 확인할 수 있다. 유전자 수탁 번호는 X04500이다. PCR 증폭에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머는 다음과 같았다 :

5'-CTC AGG TGT CCT CGA AGA AAT CAA A-3'

5'-GCT TTT TTG CTG TGA GTC CCG-3'

MgCl₂를 최종 농도 2.5mM로 사용하고, 이때 DNA 주형 농도는 150ng/50㎕ PCR였다. [95℃, 2분] ×1 ; [95℃, 1분 ; 67.5℃, 1분 ; 72℃, 1분] ×35 ; [72℃, 5분] ×1 ; 4℃에서 사이클링을 수행하였다. 특정 10X 제한 완충액 3㎕ 이외에, 각각의 PCR 반응물에 TaqI(Promega) 10 유닛을 첨가하였다. 65℃에서 밤새도록 항온처리하였다. 9% PAGE로 전기영동을 수행하였다.

제한 효소 절단으로 12 bp의 일정한 밴드와 대립유전자 1에 해당하는 85 bp 및 97 bp의 추가의 밴드 2개 또는 대립유전자 2에 해당하는 182 bp의 밴드 1개중어느 하나를 생성하였다. 상기 2개의 대립유전자에 대한 빈도는 0.82 및 0.18였다.

IL-1B(-3737) :이 대립유전자의 확인 방법에 관하여는 미국 가명세서 출원 제60/331,681호(2001년 11월 19일 출원)에 기술되어 있다.

참고문헌의 인용

본원에 언급된 모든 공개공보 및 특허는, 각각의 공개공보 또는 특허가 구체적으로 그리고 개별적으로 참고용으로 인용되었다고 기술된 바와 같이, 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되었다. 분쟁이 발생하였을 경우, 본원에 정의된 사항들을 포함하는 본 출원이 조정할 것이다.

균등 범위

지금까지 본 발명의 특정 구체예를 기술하였으나, 전술한 상세한 설명은 예시적인 것이지 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 상기 상세한 설명 및 이하의 청구항을 참고로 할때, 본 발명의 다양한 변형예는 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 전체 범위는 다음의 청구항과 함께 이의 전체 균등 범위를, 그리고 이러한 변형예와 함께 상세한 설명을 참고로 하여 결정되어야 할 것이다.

Claims

IL-1 패턴 1, 패턴 2 및/또는 패턴 3의 하나 이상의 대립유전자에 대한 피험체의 유전자형을 평가하는 단계를 포함하는 노화 관련 증상의 조기 개시 또는 진행에 대한 피험체의 감수성을 결정하는 방법으로서, IL-1 패턴 1, 패턴 2 및/또는 패턴 3의 하나 이상의 대립유전자의 존재 또는 부재가 노화 관련 증상의 조기 개시 또는 진행에 대한 피험체의 감수성에 관한 정보를 제공하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 피험체의 유전자형을 평가하는 단계는 이미 알려져 있는 피험체의 유전자형에 관한 정보를 얻는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 피험체의 유전자형을 평가하는 단계는,

(a) 피험체로부터 핵산 샘플을 얻는 것; 및

(b) IL-1 패턴 1, 패턴 2 및/또는 패턴 3의 하나 이상의 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 피험체가 IL-1 패턴 1 또는 패턴의 대립유전자를 갖는다는 것은 그 피험체가 노화 관련 증상의 조기 개시 또는 진행에 감수성임을 나타내는 것인 방법.
제1항에 있어서, 패턴 1의 하나 이상의 대립유전자가 IL-1A (222/223) 대립유전자 4, IL-1A (gz5/gz6) 대립유전자 4, IL-1A (-889) 대립유전자 1, IL-1B/IL-1RN 유전자간 영역의 gaat.p33330 마커의 대립유전자 3, IL-1B/IL-1RN 유전자간 영역의 Y31 마커의 대립유전자 3, IL-1RN (+2018) 대립유전자 2, IL-1A (+4845) 대립유전자 1, IL-1B (+3954) 대립유전자 1, IL-1B (-3737) 대립유전자 1 및 IL-1RN (VNTR) 대립유전자 2로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서 패턴 2의 하나 이상의 대립유전자가 IL-1A (222/223) 대립유전자 3, IL-1A (gz5/gz6) 대립유전자 3, IL-1A (-889) 대립유전자 2, IL-1B/IL-1NR 유전자간 영역의 gaat.p33330 마커의 대립유전자 4, IL-1B/IL-1RN 유전자간 영역의 Y31 마커의 대립유전자 6, IL-1RN (+2018) 대립유전자 1, IL-1A (+4845) 대립유전자 2, IL-1B (+3954) 대립유전자 2, IL-1B (-3737) 대립유전자 1 및 IL-1RN (VNTR) 대립유전자 1로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 패턴 3의 하나 이상의 대립유전자가 IL-1A (-889) 대립유전자 1, IL-1A (+4845) 대립유전자 1, IL-1B (-3737) 대립유전자 2, IL-1B (+3954) 대립유전자 1, IL-1RN (+2018) 대립유전자 1 및 IL-1RN (VNTR) 대립유전자 1로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 하나 이상의 대립유전자가 IL-1RN (VNTR) 대립유전자 2,IL-1RN (+2018) 대립유전자 2, IL-1A (+4845) 대립유전자 2 및 IL-1B (+3954) 대립유전자 2로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 노화 관련 증상이 결합 조직 기능 손상, 심혈관 질환, 연령 관련 암, 비정상 면역계 기능 및 신경학적 기능의 손상으로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
IL-1 패턴 1 또는 패턴 2 또는 패턴 3의 하나 이상의 대립유전자에 대한 피험체의 유전자형을 평가하는 단계, 및 노화 관련 증상의 조기 개시에 대한 피험체의 감수성에 적절한 치료법 또는 생활양식 권장사항을 선택하는 단계를 포함하는 피험체에 대한 적절한 치료법 또는 생활양식 권장사항을 선택하는 방법으로서, IL-1 패턴 1, 패턴 2 및/또는 패턴 3의 하나 이상의 대립유전자의 존재 또는 부재가 노화 관련 증상의 조기 개시 또는 진행에 대한 피험체의 감수성에 관한 정보를 제공하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 치료법은 영양약학제품(nutraceutical)을 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 피험체의 유전자형을 평가하는 단계는 이미 알려져 있는 피험체의 유전자형에 관한 정보를 얻는 것을 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 피험체의 유전자형을 평가하는 단계는,

(a) 피험체로부터 핵산 샘플을 얻는 것; 및

(b) IL-1 패턴 1, 패턴 2 및/또는 패턴 3의 하나 이상의 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 치료법 또는 생활양식 변화로부터 이익을 얻을 것 같은 피험체를 분류하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 피험체에 관해 임상적으로 관련된 추가 정보를 평가하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 패턴 1의 하나 이상의 대립유전자가 IL-1A (222/223) 대립유전자 4, IL-1A (gz5/gz6) 대립유전자 4, IL-1A (-889) 대립유전자 1, IL-1B/IL-1RN 유전자간 영역의 gaat.p33330 마커의 대립유전자 3, IL-1B/IL-1RN 유전자간 영역의 Y31 마커의 대립유전자 3, IL-1RN (+2018) 대립유전자 2, IL-1A (+4845) 대립유전자 1, IL-1B (+3954) 대립유전자 1, IL-1B (-3737) 대립유전자 1 및 IL-1RN (VNTR) 대립유전자 2로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
제9항에 있어서, 패턴 2의 하나 이상의 대립유전자가 IL-1A (222/223) 대립유전자 3, IL-1A (gz5/gz6) 대립유전자 3, IL-1A (-889) 대립유전자 2, IL-1B/IL-1NR 유전자간 영역의 gaat.p33330 마커의 대립유전자 4, IL-1B/IL-1RN 유전자간 영역의 Y31 마커의 대립유전자 6, IL-1RN (+2018) 대립유전자 1, IL-1A (+4845) 대립유전자 2, IL-1B (+3954) 대립유전자 2, IL-1B (-3737) 대립유전자 1 및 IL-1RN (VNTR) 대립유전자 1로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
제9항에 있어서, 패턴 3의 하나 이상의 대립유전자가 IL-1A (-889) 대립유전자 1, IL-1A (+4845) 대립유전자 1, IL-1B (-3737) 대립유전자 2, IL-1B (+3954) 대립유전자 1, IL-1RN (+2018) 대립유전자 1 및 IL-1RN (VNTR) 대립유전자 1로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
IL-1 패턴 1, 패턴 2 및/또는 패턴 3의 하나 이상의 대립유전자에 대한 피험체의 유전자형을 평가하는 단계를 포함하는 피험체의 내피 세포의 세포분열 가능성을 예측하는 방법으로서, IL-1 패턴 1, 패턴 2 및/또는 패턴 3의 하나 이상의 대립유전자의 존재 또는 부재가 피험체의 내피 세포의 세포분열 가능성에 관한 정보를 제공하는 것인 방법.
제19항에 있어서, 피험체의 유전자형을 평가하는 단계는 이미 알려져 있는 피험체의 유전자형에 관한 정보를 얻는 것을 포함하는 것인 방법.
제19항에 있어서, 피험체의 유전자형을 평가하는 단계는,

(a) 피험체로부터 핵산 샘플을 얻는 것; 및

(b) IL-1 패턴 1, 패턴 2 및/또는 패턴 3의 하나 이상의 대립유전자를 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
제19항에 있어서, 피험체의 유전자형을 평가하는 단계가 IL-1RN (VNTR) 좌에서의 유전자형을 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
(a) EOA-관련 대립유전자를 갖는 하나 이상의 피험체 중에서 바이오마커를 측정하여 제1 측정치를 얻는 단계; 및

(b) 비-EOA-관련 대립유전자를 갖는 하나 이상의 피험체 중에서 바이오마커를 측정하여 제2 측정치를 얻는 단계

를 포함하는 노화 관련 표현형을 결정하는 데 유용한 바이오마커를 확인하는 방법으로서, 상기 제1 측정치가 제2 측정치와 다른 경우 제1 측정치는 노화 관련 표현형이고 바이오마커는 노화 관련 표현형을 결정하는 데 유용한 바이오마커인 것인 방법.
(a) 패턴 1, 패턴 2 및/또는 패턴 3의 하나 이상의 대립유전자로 구성된 DNA를 함유하는 세포 중에서 바이오마커를 관찰하여 바이오마커의 제1 측정치를 얻는 단계;

(b) 세포를 시험 물질과 접촉시키는 단계; 및

(c) 세포 중의 바이오마커를 관찰하여 바이오마커의 제2 측정치를 얻는 단계를 포함하는 노화 관련 증상의 조기 개시 또는 진행을 예방하거나 감소시킬 것 같은 시험 물질을 확인하는 시험 물질의 스크리닝 방법으로서, 상기 노화 관련 표현형으로부터 비노화 관련 표현형으로의 바이오마커 측정치 변화로 노화 관련 질병 및 증상의 조기 개시 또는 진행을 예방 또는 감소시킬 것 같은 시험 물질이 확인되는 것인 방법.
제24항에 있어서, 세포는 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)인 것인 방법.
제24항에 있어서, 바이오마커는 IL-1B mRNA, IL-1A mRNA, IL-1RN mRNA, IL-1b 단백질, IL-1a 단백질, IL-1ra 단백질 및 배양물 중에서의 누적 세포군 배가로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
(a) 시험 유전자를 세포 중 하나 이상으로 도입할 수 있는 조건 하에서 패턴 1, 패턴 2 및/또는 패턴 3의 하나 이상의 대립유전자로 구성된 DNA를 함유하는 세포를 시험 유전자와 접촉시키는 단계; 및

(b) 피험체 중의 하나 이상의 바이오마커를 관찰하는 단계를 포함하는 피험체의 노화 관련 증상의 조기 개시 또는 진행을 예방하거나 감소시킬 것 같은 유전자를 확인하는 유전자의 스크리닝 방법으로서, 상기 노화 관련 표현형으로부터 비노화 관련 표현형으로의 바이오마커 변화로 노화 관련 질병 및 증상의 조기 개시를 예방 또는 감소시킬 것 같은 시험 유전자가 확인되는 것인 방법.
제27항에 있어서, 하나 이상의 바이오마커는 IL-1B mRNA, IL-1A mRNA, IL-1RN mRNA, IL-1b 단백질, IL-1a 단백질, IL-1ra 단백질 및 배양물 중에서의 누적 세포군 배가로 구성된 군에서 선택되는 것인 방법.
IL-1RN (VNTR) 대립유전자 2에 대해 이종접합성인 배양된 내피 세포를 포함하는 세포 조성물.
제29항에 있어서, 배양된 내피 세포는 인간 제대 내피 세포인 것인 세포 조성물.
IL-1RN (VNTR) 대립유전자 2에 대해 동형접합성인 배양된 내피 세포를 포함하는 세포 조성물.
제24항에 개시된 방법으로 확인된 물질과 피험체를 접촉시키는 단계를 포함하는 노화 관련 증상의 조기 개시 또는 진행을 예방 또는 감소시키는 방법으로서, 피험체를 그 물질과 접촉시키면 노화 관련 증상의 조기 개시가 예방 또는 감소되는 것인 방법.
제27항에 개시된 방법으로 확인된 유전자와 피험체를 접촉시키는 단계를 포함하는 노화 관련 증상의 조기 개시를 예방 또는 감소시키는 방법으로서, 피험체를 그 유전자와 접촉시키면 노화 관련 증상의 조기 개시가 예방 또는 감소되는 것인 방법.
제24항에 개시된 방법으로 확인된 물질과 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 배양된 세포의 노화를 예방 또는 감소시키는 방법으로서, 세포를 그 물질과 접촉시키면 배양된 세포의 노화가 예방 또는 감소되는 것인 방법.
제27항에 개시된 방법으로 확인된 유전자와 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 배양된 세포의 노화를 예방 또는 감소시키는 방법으로서, 세포를 그 유전자와 접촉시키면 배양된 세포의 노화가 예방 또는 감소되는 것인 방법.
(a) 피험체 중에서 제22항에 기재된 방법으로 확인된 하나 이상의 바이오마커를 관찰하는 단계; 및

(b) 바이오마커가 노화 관련 표현형을 유도하는 정도를 결정하는 단계를 포함하는 피험체의 노화 관련 증상 시기를 결정하는 방법으로서,

바이오마커가 노화 관련 표현형을 유도하는 정도가 클수록, 노화 관련 증상의 시기가 더 후기인 것인 방법.