KR20080077207A - 심혈관 질환용 진단제 및 치료제 - Google Patents

심혈관 질환용 진단제 및 치료제 Download PDF

Info

Publication number
KR20080077207A
KR20080077207A KR1020087014678A KR20087014678A KR20080077207A KR 20080077207 A KR20080077207 A KR 20080077207A KR 1020087014678 A KR1020087014678 A KR 1020087014678A KR 20087014678 A KR20087014678 A KR 20087014678A KR 20080077207 A KR20080077207 A KR 20080077207A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
allele
disease
copies
subject
gene
Prior art date
Application number
KR1020087014678A
Other languages
English (en)
Inventor
케니스 에스 콘만
캐서린 마티네츠
쉘라 이 프랑시스
데빗 씨 크로스만
고든 더블유 더프
Original Assignee
인터레우킨 제네틱스, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 인터레우킨 제네틱스, 인코포레이티드 filed Critical 인터레우킨 제네틱스, 인코포레이티드
Publication of KR20080077207A publication Critical patent/KR20080077207A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)

Abstract

본 발명의 키트 및 방법은 심혈관 질환의 진단에 관한 것이다. 하나의 측면에서, 본 발명은 대상자가 취약 플라크 질환에 걸렸는지 여부를 측정하는 방법 및 키트를 개시한다. 하나의 측면에서, 본 발명은 대상자가 폐색 질환에 걸렸는지 여부를 측정하는 방법 및 키트를 개시한다. 하나의 측면에서, 본 발명은 대상자가 재협착 질환에 걸렸는지 여부를 측정하는 방법 및 키트를 개시한다. 본 발명의 다른 방법은 심혈관 질환을 앓는 환자를 위한 치료제를 선택하는 것에 관한 것이다.

Description

심혈관 질환용 진단제 및 치료제{DIAGNOSTIC AND THERAPEUTICS FOR CARDIOVASCULAR DISORDERS}
본 발명은 심혈관 질환의 진단 및 치료를 위한 키트 및 방법, 더욱 구체적으로, IL-1 유전자형 패턴과 관련된 질환의 진단에 관련되는 키트 및 방법에 관한 것이다.
죽상경화증(또는 동맥경화증)은 동맥류, 허혈, 혈전증, 색전증 형성 또는 기타 혈관 부전증을 초래할 수 있는, 동맥의 진행성 내강 협착 및 경화를 기술하기 위하여 사용되는 용어이다. 본 질병 과정은 인체내 임의의 전신 동맥에서 발생할 수 있다. 예를 들면, 뇌에 공급해주는 동맥(예컨대, 경동맥, 뇌내 등)내 죽상경화증은 뇌졸증을 초래할 수 있다. 괴저는 말초 동맥이 차단되었을 때 발생할 수 있고, 관상 동맥 질병은 심근에 산소와 영양분을 공급하는 동맥이 영향을 받았을 때 발생할 수 있다.
관상 동맥 질병은 죽상 플라크 침착과 심장 근육에 공급해주는 동맥의 진행성 내강 협착을 초래하는 다인성 질병이다. 죽상경화증 과정은, 결과적으로는 혈액 구획의 유체 상을 혈관벽으로부터 떨어져 있도록 유지시켜 주는 항상성 기전을 파괴시키는, 동맥벽에서의 지질 유도성의 생물학적 변화를 포함한다. 모든 손상에 대 한 정상적인 반응은 염증이기 때문에 죽상경화성 병변은 단핵 백혈구가 침윤, 세포 증식 및 이동, 세포외기질 인식, 및 신생혈관증식을 비롯한, 복합적 만성 염증 반응을 나타낸다. 실제로, 죽상 플라크는 염증 및 면역 세포의 혼합물, 섬유성 조직, 및 지방성 물질, 예로서, 저밀도 지질(LDL: low density lipid) 및 그의 변형물, 및 α-지질단백질로 구성된다. 내강 협착 또는 차단은 심장 근육에 산소와 영양분을 전달할 수 있는 능력을 감소시켜 심근경색, 협심증, 불안정 협심증, 및 심부전증과 같은 급성 심장사를 유발한다. 폐색은 보편적으로 느리게 진행되지만, 구성 동맥 플라크중 일부가 떨어져 나가 동맥내 모처에 머무름으로써 일시적으로 동맥을 차단할 경우, 또는 그보다 더 보편적으로, 혈전증이 동맥 내강내에서 발생하였을 경우, 혈액 공급은 갑자기 차단될 수 있다. 취약성 플라크를 오버레이하는 섬유성 캡의 파열이 관상 혈전증의 가장 보편적인 원인이다. 상기와 같은 공격시 차단 윈위부에 있는 근육 부피에 따라, 심근 조직중 일부는 기능을 정지할 수 있고, 이는 심장 근육을 약화시키고, 대개는 개체가 사망하게 할 수 있다.
수년간, 심장 질병 "임상적 사건," 예로서, 심근경색 또는 사망에 대한 절박한 위험의 가장 보편적인 척도는, 예로서, 혈관조영술과 같은 기법에 의해 평가되는 관상 동맥의 물리적 차단이었다. 80년대 초반 (DeWood)와 그의 동료들에 의해 이루어진 연구를 통해[N. Engl. J. of Med. (1980) 303:1137-40], 폐색 혈전이 대부분의 급성 심근경색의 원인이 되는 것으로 밝혀졌다. 심근경색은 고등급의 협착 부위의 폐색으로부터 발생한다는 것이 그 당시의 일반적 개념이었다. 1988년 (Little) 등[Circulation (1988) 78:1157-66]이 대부분의 경색증은, 이전에 혈관조 영술에서 50% 미만의 협착을 나타낸 관상 차단으로부터 발생한다고 나타내었다. 그러므로, 관상 협착증의 중증도가 이어지는 관상 차단의 위치를 정확하게 예측하지는 못했다. 이러한 연구를 통해 취약한 죽상경화 플라크의 중요성이 입증되었다.
취약한 죽상 플라크 부위에서의 파열이 급성 관상 증후군의 가장 흔한 원인이 된다는 것은 이제 분명하다. 그러한 플라크는 고등급의 협착증을 유발하지는 않지만, 급성 관상 증후군, 예로서, 불안정 협심증, 심근경색, 또는 급사를 유발할 수 있다. 파열되기 쉬운 플라크를 용이하게 확인할 수 있는 방법으로서 현재 이용가능한 것은 없다. 실제로, 취약한 플라크를 동정하기 위한 것으로서 임상적으로 유용한 영상 기법의 개발이 활발히 진행중인 연구의 중심이 된다. 그러한 플라크를 확인하기 위하여 사용되고 있는 몇몇 방법으로 예를 들면, 열조영술(죽상경화 플라크는 열적 이질성을 나타낸다), 분광법(작은 부피의 관산 동맥 조직내 존재하는 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 트리글리세리드, 인지질 및 칼슘 염의 양을 정량하기 위하여 사용된다), 방사성 동위원소 섬광조영술(취약한 플라크의 다양한 성분들, 예로서, 염증 세포는 방사성 동위원소 기법으로 영상화될 수 있다), 및 염증성 혈청 마커, 예로서, C-반응성 분자 수준의 검출을 포함한다.
급성 플라크 파열을 보이는 동맥 부위는 안정적이고 임상적 사건을 유발할 것 같지 않은 동맥 플라크에서 발견되지 않거나, 훨씬 더 낮은 수준으로 존재하는 만성의 염증성 성분을 특징으로 한다([Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature 1993;362:801-809] [Libby P. Molecular basis of the acute coronary syndromes. Circulation 1995;91:2844- 2850]). 여러 출처로부터 현재 공개되어 있는 임상 데이타는, 다양한 염증 성분이 관상 동맥 질병의 중증도와 임상적 결과에 강하게 독립적으로 영향을 미치다라는 것을 명확하게 입증한다([Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature 1993;362:801-809] [Libby P. Molecular basis of the acute coronary syndromes. Circulation 1995;91:2844-2850]). 추가로, 실험실 작업을 통해 전-염증성 매개 인자가 죽상경화증 과정에서 중요한 요소라는 것이 밝혀졌다([Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature 1993;362:801-809] [Libby P. Molecular basis of the acute coronary syndromes. Circulation 1995;91:2844-2850]).
죽상 플라크 구성의 원인 및 기전에 대한 많은 이론이 존재하지만, 완전히 이해되지는 않았다. 죽상경화증 발병에 관한 한가지 이론은 (1) 내피 세포 기능장애 및/또는 손상, (2) 단핵구 동원 및 대식세포 형성, (3) 지질 침착 및 변형, (4) 혈관 평활근 세포 증식, 및 (5) 세포외기질 합성이라는 단계를 포함한다. 이러한 이론에 따르면, 죽상경화증의 개시는 잠재적으로 가능하게 기계적 응력 또는 화학적 응력으로부터 형성된 손상 형태에 기인하는 것이다. 이어서, 이러한 손상에 대하여 신체가 어떻게 반응하는지가, 손상이 죽상경화성 병변으로 악화되는지 여부, 그리고 얼마나 빨리 손상이 죽상경화성 병변으로 악화되는지를 정의한다. 결국 동맥 내강 협착을 유발하고, 산소와 영양분인 혈류량에 의존하는 심장 조직을 손상시킬 수 있다.
수년간의 역학 연구를 통해 개인별 유전자 조성이 혈관 질병을 발병시키는 유의적인 위험 인자라고 제안되었다. 예를 들면, 심장 질병의 가족력이 관상 동맥 질병을 발병시키는 개인별 위험 증가와 관련이 있다. 과거로부터 지질 및 콜레스테롤 대사가 일차적으로 관상 동맥 질병에 유전적 영향을 미치는 것으로 여겨져 왔다. 예를 들면, 가족성 고콜레스테롤증에서 저-밀도 지질(LDL)에 대한 세포 수용체의 결핍은 고수준의 혈장 LDL 및 죽상경화증의 조기 발병과 관련이 있다[Brown & Goldstein, Sci, 191 (4223):150-4 (1976)].
염증은 일반적으로 죽상경화증의 발병 과정의 중요한 성분으로서 간주된다([Munro, Lab Invest., 58: 249-261 (1988)]; [Badimon, et al., Circulation , 87: 3-16 (1993)]; [Liuzzo, et al., N. E. J. M., 331 (7): 417-24 (1994)]; [Alexander, N. E. J. M., 331(7): 468-9 (1994)]). 혈관에 채워져 있는 내피 세포 에 대한 손상은 IL-1, TNFα를 비롯한 염증성 사이토카인의 축적과, 예로서, 프로스타글란딘 I2(PGI2: prostaglandin I2), 혈소판-유래 성장 인자(PDGF: platelet-derived growth factor), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF: basic fibroblast growth factor) 및 과립구 단핵구 세포 자극 인자(GM-CSF: granulocyte-monocyte cell stimulating factor)와 같은 성장 인자 및 프로스타노이드의 방출을 초래한다. 이들 인자는 혈관벽에 축적되는 단핵구와 같은 염증성 세포의 축적 및 조절을 유도한다. 이어서, 단핵구는 IL-1, TNFα, 프로스타글란딘 E2(PGE2: prostaglandin E2), bFGF를 비롯한 추가의 염증성 매개 인자 및 형질전환 성장 인자 α 및 β(TFG α: transforming growth factors α, TGF β)를 방출한다. 이들 염증성 매개 인자 모두 더 많은 염증성 세포를 손상된 부위로 동원하여, 내피 및 평활근 세포의 행동방식을 조절하고, 죽상 플라크의 축적을 일으킨다.
IL-1β를 비롯한 수개의 염증성 산물이 죽상경화증 병변 또는 병에 걸린 관상 동맥의 내피에서 확인된 바 있다[Galea, et al., Ath. Thromb. Vasc. Biol., 16: 1000-6 (1996)]. 또한, IL-1β의 혈청 농도는 관상 동맥 질환 환자에서 상승되는 것으로 밝혀졌다[Hasdai, et al., Heart, 76: 24-8 (1996)]. 과거로부터 염증성 반응 물질의 존재는 손상 또는 단핵구 활성화에 대한 반응인 것으로 여겨져 왔지만, 비정상적인 염증 반응은 관상 동맥 질병의 원인이 될 수 있거나, 질병에 대한 감수성을 증가시킬 수 있다.
혈관 질병을 치료하는데 있어 중요한 문제는 적절한 진단이다. 대개 본 질병의 첫번째 증세는 급사이다. 예를 들면, 관상 동맥 질병을 앓는 모든 개체중 대략 절반은 급사한다. 추가로, 결국은 관상 동맥 질병을 앓는 것으로 진단받은 환자중 40-60%의 경우, 심근경색이 본 질병에서 첫번째로 제시되는 것이다. 불행하게도, 그러한 초기 사건중 대략 40%는 환자가 감지하지 못한다. 이에 관상 죽상경화증 치료에 있어 취약한 플라크를 확인하고 안정화시키는 것이 중요한 요소가 되는 것으로 여겨지고 있다. 다양한 대상자에서의 일배체형 패턴 확인을 통해 심혈관 질환의 관리와 치료법은 혈관재생 및 더 침습적인 기타 방법보다는 플라크 안정화를 목표로 할 수 있다. 여러가지 이유에서 환자가 증상을 인식하는 것은 전체적인 관상 동맥 질병의 부담과는 상관이 없기 때문에 상기는 특히 중요한 것이다[Anderson & Kin, Am . Heart J., 123(5): 1312-23 (1992)].
경피적 경혈관 관상 동맥 확장술(PTCA: percutaneous transluminal coronary angioplasty)은 죽상 플라크를 혈관벽측으로 압착시킴으로써 폐색 관상 동맥 질병을 치료하는데 사용된다. PTCA가 광범위하게 사용되고 있고, 그의 초기 성공율은 90% 이상이었다. 그러나, 장기간의 PTCA 성공은 내강내 재협착증 또는 수술 부위의 재협착증에 의한 제한을 받게 된다. 이는 수술후 6개월 이내에 단일 혈관 수수을 받은 환자중 대략 30% 내지 40%의 환자에서, 및 다혈관 확장술을 받은 환자중 50%를 넘는 환자에서 발생한다.
스텐트 설치는 내강내 크기를 보다 넓게 회복시킬 수 있고, 이로써 대략 50%까지 재협착을 감소시키는 효과를 갖고 있기 때문에 주로 풍선 확장술을 대체하여 왔다. 아이러니하게, 스텐트 설치는 실제로 치료 부위의 신생내막 성장을 증가시키지만, 보다 큰 내강은 스텐트 설치로 달성될 수 있기 때문에 조직 성장은 보다 용이하게 수용되고, 충분한 내강 크기가 유지되는 바, 단독의 풍선 확장술과 비교할 때 재협착율은 스텐트 설치에 의해 거의 절반으로 감소하게 된다.
재협착에 관여하는 병리생리학적 기전은 완벽히 이해되지 못했다. 다수의 임상적, 해부학적 및 기술적 요소가 재협착 발병과 연계되었지만, 아직도 50% 이상의 과정이 설명되어야 한다. 그러나, 내피 손상 이후, 일련의 수복 기전이 개시되는 것으로 알려져 있다. 손상시 즉각 혈소판과 섬유소의 층이 손상된 내피상에 침착된다. 몇시간 내지 몇일 이내에, 염증 세포는 손상 부위를 침윤하기 시작한다. 손상후 24시간 이내에, 혈관 중간막에 위치하는 혈관 평활근 세포(SMCs: smooth muscle cells)는 DNA 합성을 개시한다. 몇일 후, 이러한 활성화된 합성 SMCs는 내탄력층을 통해 내강 표면쪽으로 이동하게 된다. 이러한 세포에 의한 연속적인 복제와 세포외기질 생산으로 신생내막이 형성된다. 세포 증식과 기질 침착이 진행됨에 따라 내막 두께는 증가하게 된다. 이러한 혈관 치유 과정이 과도하게 진행될 때의 병리학적 증상을 내막 과다형성 또는 근내막 과다형성이라 명명한다. 그러므로, 재협착과 연루된 혈관벽 치유의 생물 사건은 일반적인 상처 치유 과정과 구체적인 근내막 과다형성 과정을 포함한다. 염증은 일반적으로 이러한 두 과정의 중요한 성분으로서 간주된다([Munro and Cotran (1993) Lab. Investig. 58:249-261]; 및 [Badimon et al. (1993) Supp II 87:3-6). 따라서, 혈관벽에서의 급성 및 만성 염증의 효과를 이해함으로써 재협착과 관련 용태를 진단 및 치료하는 방법을 제안할 수 있다.
초기 단계에서, 염증은 백혈구가 혈관벽에 부착되는 것을 특징으로 한다. 손상된 내피의 표면에 백혈구가 부착되는 것은 내피 및 중성구 표면상의 수개의 복합 당단백질에 의해 매개된다. 이러한 결합 분자들중 2개: 내피세포 백혈구 부착 분자-1(ELAM-1: endothelial leukocyte adhesion molecule-1) 및 세포간 부착 분자-1 (ICAM-1: intercellular adhesion molecule)이 잘-특징화되어 있다. 염증 상태시, 관여하는 세포 표면에 중성구가 부착되는 것은 현저히 증가하게 되는데, 이는 주로 상기 결합 분자의 발현이 상향조절되고 증진되기 때문이다. 인터루킨-1(IL-1: interleukin-1), 종양 괴사 인자 알파(TNF: tumor necrosis factor), 림프독소 및 세균 내독소를 비롯한, 조직 손상에 대한 염증 반응의 1차 매개 인자로 여겨지는 물질은 모두는 상기 결합 물질의 생산을 증가시킨다.
손상된 혈관벽에 결합한 이후, 백혈구가 이동하게 된다. 일단 혈관벽내의 적 소에 위치하게 되면, 백혈구, 특히 활성화된 대식세포는 IL-1, TNF, 프로스타글란딘 E2(PGE2), bFGF를 비롯한 추가의 염증성 매개 인자 및 형질전환 성장 인자 α 및 β(TFG α, TFG β)를 방출한다. 이들 염증성 매개 인자 모두 더 많은 염증성 세포를 손상된 부위로 동원하여, 평활근의 추가적인 증식과 이동을 조절한다. 단핵구-대식세포에 의해 생산되는 것으로 주지되어 있는 성장 인자는 평활근 세포 및 섬유모세포 증식의 자극제인 단핵구- 및 대식세포-유래 성장 인자(MDGF: macrophage-derived growth factor)이다. MDGF는 혈소판-유래 성장 인자(PDGF와 유사한 것으로 이해되고 있으며; 실제로, 두 물질은 동일할 수 있다. 평활근 세포 증식을 자극함으로써 염증은 근내막 과다형성의 발생과 진행에 원인이 될 수 있다.
상기 언급된 화학적 염증성 매개 인자에 의해 혈관벽으로 유인되는 백혈구는 국부 손상을 악화시킬 수 있고, 치유 반응을 장기화시킴으로써 혈관벽에 직접적으로 영향을 미치는 물질을 생산한다. 첫번째로, 염증 과정에 의해 활성화된 백혈구는 콜라겐과 다른 구조 단백질을 분해할 수 있는 리소좀 효소를 분비한다. 혈관벽내에서 이러한 효소를 방출하는 것은 그의 세포외기질의 무결성에 영향을 줌으로써 SMCs와 다른 이동 세포가 보다 용이하게 벽을 통과할 수 있도록 할 수 있다. 그러므로, 이러한 리소좀 단백질 분해 효소의 방출은 본 과정을 증진시켜 근내막 과다형성을 일으킬 수 있다. 두번째로, 활성화된 백혈구는 그의 세포막상의 NADPH 시스템에 작용함으로써 유리 라디칼을 생산한다. 이러한 유리 라디칼은 세포 요소를 직접적으로 손상시킴으로써 국부 손상을 확장시키거나, 손상-염증-치유의 사이클을 장기화시킬 수 있다.
어떤 환자가 폐색 혈관 질병에 대한 침습적인 치료법, 예로서, 확장술 및 혈관내 스텐트 설치에 대하여 반응을 잘하는지를 결정하는 것이 바람직할 수 있다. 추가로, 협착증에 걸릴 위험이 높아 상기 용태를 예방하거나, 조정하거나, 가역화시키는 적합한 요법으로 표적화될 수 있는 환자를 동정하는 것이 바람직할 수 있다. 게다가, 재협착에 걸릴 위험이 있기 때문에 PTCA 및 스텐트 설치가 차선적인 치료 선택이 되는 개체를 동정하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 환자는 가능하게는 다른 약리학적 시술과 병용되는 혈관 재건 수술에 대한 조기 단계에서 후보자가 될 수 있다.
IL -1 유전자 클러스터의 유전적 특징
IL-1 유전자 클러스터는 염색체 2의 긴 아암(arm)(2q13)에 있고, 적어도, 430 Kb 영역 내에서 IL-1α(IL-1A), IL-1β(IL-1B), 및 IL-1 수용체 길항제(IL-1RN)에 대한 유전자를 포함한다[Nicklim et al. (1994) Genomics, 19: 382-4]. 효현제 분자인 IL-1α 및 IL-1β는 여러 염증성 캐스케이드를 개시하는 효능이 있는 전-염증성 활성을 갖는다. 대개는 예로서, IL-6 및 IL-8과 같은 다른 사이토카인의 유도를 통해 일어나는 이들의 작용은 백혈구를 활성화시켜 손상된 조직으로 동원하고, 혈관작용제의 국부 생성, 뇌에서의 발열 반응 및 간의 급성기 반응을 초래한다. 3개의 IL-1 분자 모두가 I형 및 II형 IL-1 수용체에 결합하지만, I형 수용체만이 신호를 세포 내부로 도입한다. 대조적으로 II형 수용체는 세포 막으로부터 유출되어 유인 수용체로서 작용한다. 그러므로, 수용체 길항제 및 II형 수용체는 모두 그 작용에 있어서 항염증성이다.
류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 건선 등을 비롯한 다수의 자가면역 및 염증성 질병의 병상에 있어서 부적합한 IL-1 생산이 중심적인 역할을 한다. 추가로, IL-1의 생산 속도에 있어 안정적인 개체간에 차이가 있고, 이러한 변동중 일부는 IL-1 유전자좌에서의 유전적 차이 때문일 수 있다. 따라서, IL-1 유전자는, 대부분이 다유전자 성분을 포함하는 다인성 병인을 갖는, 염증성 질병에 대하여 유전적으로 감수성인 부분을 결정하기에 적절한 후보물질이다.
IL-1 유전자 클러스터에서 유래한 일부 대립유전자는 특정 질환 상태와 관련되는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, IL-1RN(VNTR) 대립유전자 2는 골다공증(미국 특허 번호 제5,698,399호), 진성 당뇨병에서의 신장병증[Blakemore, et al. (1996) Hum. Genet. 97 (3): 369-74], 원형 탈모증([Cork, et al., (1995) J. Invest. Dermatol. 104 (5 Supp.):15S-16S]; [Cork et al. (1996) Dermatol Clin 14: 671-8]), 그레이브스병[Blakemore, et al. (1995) J. Clin. Endocrinol. 80 (1): 111-5], 전신 홍반성 루푸스[Blakemore, et al. (1994) Arthritis Rheum. 37: 1380-85], 경화 태선[Clay, et al. (1994) Hum. Genet 94: 407-10], 및 궤양성 결장염[Mansfield, et al. (1994) Gastoenterol. 106 (3): 637-42]과 관련이 있는 것으로 확인되었다.
추가로, 마커-889에서 유래한 IL-1A 대립유전자 2와 마커 +3954에서 유래한 IL-1B(TaqI) 대립유전자 2는 치주 질병과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다(미국 특허 번호 제5,686,246호; [Kornman and diGiovine (1998) Ann Periodont 3: 327-38]; [Hart and Kornman (1997) Periodontol 2000 14: 202-15; Newman (1997) Compend Contin Educ Dent 18: 881-4]; [Kornman et al. (1997) J. Clin Periodontol 24: 72-77]). 마커-889에서 유래한 IL-1A 대립유전자 2는 또한 소아 만성 관절염, 특히 만성 홍채섬모체염과 연관되어 있는 것으로 밝혀졌다[McDowell, et al. (1995) Arthritis Rheum. 38: 221-28]. IL-1B의 마커 +3954로부터 유래한 IL-1B(TaqI) 대립유전자 2는 DR3/4 환자의 인슐린 의존성 당뇨병 및 건선과 관련된 것으로 확인되었다([di Giovine, et al. (1995) Cytokine 7: 606]; [Pociot, et al. (1992) Eur J. Clin. Invest. 22: 396-402]). 추가로, IL-1RN(VNTR) 대립유전자 1은 당뇨 망막병증과 연관된 것으로 확인되었다(USSN 09/037472 및 PCT/GB97/02790을 참조할 수 있다). 추가로, IL-1RN(VNTR)의 대립유전자 2는 북아메리카 및 유럽의 백인의 궤양성 결장염과 관계된 것으로 알려져 있다[Mansfield, J. et al., (1994) Gastroenterology 106: 637-42]. 이러한 연관성은 인종적으로 관련된 아시케나지 유대인 군에서 특히 강하다는 것은 흥미로운 일이다(PCT W097/25445).
유전자형 스크리닝
유전 질병을 스크리닝하는 전통적인 방법은 비정상 유전자 산물(예, 겸상 적혈구 빈혈) 또는 비정상 표현형(예, 정신 지체)의 동정에 의존한다. 이들 방법은, 예로서, 혈관 질병과 같이 개시가 늦고 동정이 쉽지 않은 표현형을 갖는 유전 질병에 대해서 그 유용성이 제한된다. 단순하고 저렴한 유전자 스크리닝 방법이 개발되면서, 이제는 질병이 다유전자 기원의 질병이더라도 질병을 발생시키는 성향을 나타내는 다형태를 동정할 수 있게 되었다. 분자 생물학 방법으로 스크리닝할 수 있 는 질병의 수는 다인성 질환의 유전 기초에 대한 이해가 증가함에 따라 그와 함께 계속 증가되고 있다.
유전자 스크리닝(유전자 분석 또는 분자 스크리닝이라고도 한다)이란, 환자가 질병 상태를 유발하는 돌연변이(또는 대립유전자 또는 다형태)를 갖는지, 또는 질병 상태를 유발하는 돌연변이에 "연관"되어 있는지를 측정하는 시험으로서 광범위하게 정의할 수 있다. 연관이란 게놈 내에서 함께 근접해 있는 DNA 서열이 같이 유전되는 성향을 갖는 현상을 말한다. 2개의 서열은 동시 유전의 일부 선택적인 장점 때문에 연관될 수 있다. 그러나, 더욱 전형적으로는 2개의 다형태 서열은, 감수 분열 재조합 사건들이 이들 2개의 다형태 사이의 영역 내에서 발생하는 일이 상대적으로 드물기 때문에 동시 유전된다. 동시 유전된 다형태 대립유전자들은 서로 연관 비평형에 있다고 하는데, 그 이유는 주어진 인간 개체군에서 이들 대립유전자들은 개체군 내의 어떤 특정 구성원에서 함께 일어나거나 또는 그렇지 않으면 전혀 일어나지 않는 성향이 있기 때문이다. 실제로, 주어진 염색체 영역 중에서 다중의 다형태가 서로 연관 비평형 상태에 있는 것으로 확인된 경우, 이들을 의사-안정한 유전자 "일배체형"이라고 정의한다. 대조적으로, 2개의 다형태 유전자좌 사이에 발생하는 재조합 사건은 이들을 별도의 상동성 염색체로 분리시킬 수 있다. 2개의 물리적으로 연관된 다형태 간의 감수분열 재조합이 빈번히 일어나는 경우, 2개의 다형태는 독립적으로 격리되는 것으로 보이며, 이를 연관 평형이라고 한다.
2개의 마커 사이의 감수 분열 재조합의 빈도는 일반적으로 염색체 상에서의 이들 마커의 물리적 거리에 비례하지만, 저해된 염색체 재조합 영역과 "핫 스 폿(hot spots)"의 발생은 2개의 마커 사이의 물리적 거리와 재조합 거리 간에 불일치를 초래할 수 있다. 따라서, 일부 염색체 영역에서, 광범위한 염색체 도메인에 걸쳐있는 다중의 다형태 유전자좌는 서로 연관 비평형 상태에 있을 수 있으며, 따라서, 광범위하게 걸쳐있는 유전자 일배체형이라고 한다. 추가로, 질병을 유발하는 돌연변이가 이 일배체형 내에서 또는 이와 연관되어 발견되는 경우, 일배체형의 하나 이상의 다형태 대립유전자는 이 병의 발병 가능성의 진단 또는 예후 지표로서 사용할 수 있다. 다른 양성 다형태와 질병을 유발하는 다형태 간의 관련성은, 질병 돌연변이가 최근에 발생하여 재조합 사건을 통해 평형이 되기 위한 충분한 시간이 경과되지 않은 경우에 일어난다. 그러므로, 질병-유발 돌연변이 변화에 걸쳐 있거나, 연관되어 있는 인간 일배체형을 동정하는 것은, 개체가 그 질병을 유발하는 돌연변이를 유전할 가능성의 예측 척도로서 작용한다. 이러한 예후 또는 진단 방법은 질병을 유발하는 실제 병변의 동정 및 분리없이 이용할 수 있다는 것이 중요하다. 이것은, 특히 예로서, 염증성 질병과 같은 다인성 질병의 경우에 질병 과정에 관여하는 분자 결함을 정확히 결정하는 것은 어렵고 힘든 과정이므로 중요하다.
실제로, 질병과 IL-1 다형태 간의 통계학적 관계가, 다형태가 직접 질병을 유발함을 나타낼 필요는 없다. 그보다는 관련된 다형태는, 최근 인간 진화에서 발생하였던 질환-유발 돌연변이에 연관되어 있어서(즉, 연관 비평형 상태에 있는) 개입 염색체 분절 내의 재조합 사건을 통해 평형을 이룰 충분한 시간이 없었던 양성 대립유전자일 수 있다. 따라서, 특정 질병에 대한 진단 및 예후 검정을 위해서, 다형태가 질병의 병인과 직접 관련되는지를 고려하지 않고 그 질병과 관련된 다형태 대립유전자의 검출을 이용할 수 있다. 추가로, 주어진 양성 다형태 유전자좌가 외관상 질병-유발 다형태 유전자좌와 연관 비평형 상태에 있는 경우, 양성 다형태 유전자좌와 연관 비평형 상태에 있는 다른 다형태 유전자좌는 질병-유발 다형태 유전자좌와 연관 비평형 상태에 있을 가능성이 있다. 따라서, 이들 다른 다형태 유전자좌는 유전된 질병-유발 다형태 유전자좌를 갖을 가능성의 진단 또는 예후 지표가 될 것이다. 실제로, 일단 특정 질병 또는 증상과 상응하는 인간 일배체형 간에 관계가 도출되면 광범위하게 걸쳐있는 인간 일배체형(한 세트의 연관 다형태 마커의 대립유전자가 동시 유전되는 전형적인 패턴을 나타낸다)을 진단 목적으로 표적화할 수 있다. 따라서, 원인이 되는 유전자 변형을 결정하거나 특징화할 필요없이 하나 이상의 질병-관련 다형태 대립유전자(또는 하나 이상의 질병 관련 일배체형)를 특징화하여 개체에서 특정 질병 증상이 발생될 가능성을 결정할 수 있다.
본 발명의 요약
하나의 측면에서, 본 발명은 대상자가 심혈관 질환에 걸렸는지 여부를 측정하는 신규한 방법 및 키트를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 키트 및 방법은 취약 플라크 질환의 진단에 관한 것이다. 취약 플라크 질환의 존재를 진단하는 것은 임상적 사건, 예로서, 심근경색 및 뇌졸증을 특징으로 하는 취약 플라크 질병의 발병에 대한 소인이 있는 환자를 동정하는 것이다. 전구 증세 및 증상이 없는 본 질병의 개시는 갑작스러울 수 있고, 이는 파국적일 수 있기 때문에 취약 플라크 질병의 발병에 대한 소인이 있는 이들 개체를 진단하는 것은 특히 중요하다. 환자는 질환을 앓고 있기 때문에 어떤 환자가 질병에 걸릴 위험에 있는지를 측정하는 것이 질병 증상의 조기 진단과 적절한 치료제를 통한 질환 및 질병 치료에 대한 가능성을 연다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 키트 및 방법은 폐색 질환의 진단에 관한 것이다. 폐색 질환의 존재를 진단하는 것은 임상적 사건, 예로서, 허혈, 협심증, 파행, 안정시 동통 및 괴저를 특징으로 하는 폐색 질병의 발병에 대한 소인이 있는 환자를 동정하는 것이다. 따라서, 환자는 질환을 앓고 있기 때문에 어떤 환자가 질병에 걸릴 위험에 있는지를 측정하는 것은, 이환 혈관이 작용하는 조직에서 비가역적 조직 변화가 발생하기 이전 단계에서 조기 진단과 치료 시술에 대한 가능성을 연다.
추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명의 키트 및 방법은 재협착 질환의 진단에 관한 것이다. 재협착 질환의 존재를 진단하는 것은 스텐트로 치료받은 초기의 혈관 협착증의 재발과 관련된 임상적 사건을 특징으로 하는 재협착 질병의 발병에 대한 소인이 있는 환자를 동정하는 것이다. 따라서, 환자는 질환을 앓고 있기 때문에 어떤 환자가 질병에 걸릴 위험에 있는지를 측정하는 것은, 추후 협착증을 회피시킬 수 있는, 초기 혈관 협착증에 대한 요법을 선택할 수 있는 가능성을 연다. 그러한 환자는 경피적 경혈관 확장술보다는 외과적 혈관재생에 대한 후보자가 될 수 있거나, 예를 들면, 그러한 환자는 재협착 질환의 진행에 영향을 줄 수 있는 조기 단계에서 약리학적 또는 국소 시술로부터 이익을 얻을 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명의 방법은 전술한 유형의 심혈관 질환에 걸린 환자를 위한 치료법을 제공한다. 치료법은, 환자가 심혈관 질환과 관련된 대립유전자를 갖는지를 측정하고, 환자에게 심혈관 질환 치료에 적합한 치료제를 투여하는 것을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 방법은 심혈관 질환에 대한 위험 인자를 동정하고, 위험 인자가 환자에 미치는 영향을 감소시키는 치료 계획을 공식화하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 이러한 실시태양과 기타 실시태양은 적어도 부분적으로, IL-1 유전자 클러스터에서 4개의 다형태 유전자좌의 대립유전자의 패턴이 심혈관 질환과 관련되어 있다는 신규한 발견에 기초한다. 이러한 패턴을 본원에서 패턴 1, 2, 및 3으로 지칭한다. 패턴 1은 IL-1A(+4845) 또는 IL-1B(+3954) 대립유전자 2 및 IL-1B(-511) 또는 IL-1RN(+2018) 대립유전자 1, 또는 전술한 대립유전자중 하나와 연관 비평형 상태에 있는 대립유전자를 포함하는 대립유전자 패턴을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 이러한 대립유전자 패턴을 통해 취약 플라크 질환을 진단할 수 있다. 패턴 2는 IL-1B(-511) 또는 IL-1RN(+2018) 대립유전자 2, 및 IL-1A(+4845) 또는 IL-1B(+3954) 대립유전자 1, 또는 전술한 대립유전자중 하나와 연관 비평형 상태에 있는 대립유전자를 포함하는 대립유전자 패턴을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 이러한 대립유전자 패턴을 통해 취약 플라크 질환을 진단할 수 있다. 패턴 3은 IL-1A(+4845) 대립유전자 1 또는 IL-1B(+3954) 대립유전자 1, 및 IL-1B(-511) 대립유전자 1 또는 IL-1RN(+2018) 대립유전자 1, 또는 전술한 대립유전자중 하나와 연관 비평형 상태에 있는 대립유전자를 포함하는 대립유전자 패턴을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 이러한 대립유전자 패턴을 통해 재협착 질환을 진단할 수 있다.
심혈관 질환과 관련된 대립유전자는 1) 핵산 샘플과 대립유전자에 혼성화할 수 있는 프로브 사이의 혼성화 반응을 실시하는 것; 2) 대립유전자의 적어도 일부분을 서열 분석하는 것; 또는 3) 대립유전자 또는 그의 단편(예컨대, 엔도뉴클레아제 분해에 의해 생성된 단편)의 전기영동 이동도를 측정하는 것을 비롯한 여러 이용가능한 기법중 임의의 것에 의해 검출될 수 있다. 임의로는 검출 단계를 실시하기 이전에 대립유전자를 증폭 단계에 가할 수 있다. 바람직한 증폭 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction), 리가제 연쇄 반응(LCR: ligase chain reaction), 스트랜드 치환 증폭(SDA: strand displacement amplification), 클로닝, 및 상기의 변형(예컨대, RT-PCR 및 대립유전자 특이 증폭)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 증폭에 필요한 올리고뉴클레오티드는 예를 들면, IL-1 유전자좌내의 관심의 대상이 되는 마커 측면에 위치하는 것(PCR 증폭에 필요) 또는 마커와 직접 중첩되는 것(ASO 혼성화에서)으로부터 선택될 수 있다. 특히 바람직한 실시태양에서, 샘플을, 5' 및 3' 센스 또는 안티센스 서열로 혈관 질병 관련 대립유전자에 혼성화하는 한 세트의 프라이머와 혼성화하고, PCR 증폭시킨다.
심혈관 질환과 관련된 대립유전자는 또한 간접적으로, 예컨대, DNA에 의해 코딩되는 단백질 산물을 분석함으로써 검출될 수 있다. 예를 들면, 당해 마커가 돌연변이체 단백질의 번역으로 생성될 경우, 단백질은 다양한 단백질 검출 방법중 임의의 것에 의해 검출될 수 있다. 그러한 방법은 면역검출 및 생화학적 시험, 예로서, 절단, 신장, 변경된 폴딩 또는 변경된 번역후 변형을 통해 단백질의 겉보기 분자량이 변한 경우의 크기 분별을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 상술한 검정법을 실시하기 위한 키트를 특징으로 한다. 키트는 핵산 샘플 수집 수단, 및 대상자가 심혈관 질환 관련 대립유전자를 보유하는지를 측정하는 수단을 포함할 수 있다. 키트는 또한 양성 또는 음성 대조군 또는 기준 및/또는 결과를 평가하기 위한 알고리즘 장치, 및 DNA 증폭 시약, DNA 중합효소, 핵산 증폭 시약, 제한 효소, 완충액, 핵산 샘플링 장치, DNA 정제 장치, 데옥시뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드(예컨대, 프로브 및 프라이머) 등을 비롯한 추가의 시약 및 성분을 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, 대조군 샘플은 양성 또는 음성 대조군일 수 있다. 추가로, 대조군 샘플은 사용되는 대립유전자 검출 기법의 양성(또는 음성) 산물을 함유할 수 있다. 예를 들면, 대립유전자 검출 기법이 PCR 증폭 후의 크기 분별인 경우, 대조군 샘플은 적절한 크기의 DNA 단편을 포함할 수 있다. 유사하게, 대립유전자 검출 기법이 돌연변이된 단백질의 검출을 포함하는 경우, 대조군 샘플은 돌연변이체 단백질 샘플을 포함할 수 있다. 그러나, 대조군 샘플은 시험할 물질을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 대조군은 IL-1 유전자 클러스터의 클로닝된 부분 또는 게놈 DNA의 샘플일 수 있다. 그러나, 시험할 샘플이 게놈 DNA인 경우, 대조군 샘플은 바람직하게는 고도로 정제된 게놈 DNA 샘플이다.
상기 키트에 존재하는 올리고뉴클레오티드는 관심의 대상이 되는 영역의 증폭을 위해 사용될 수 있거나, 당해 마커에 대한 직접적인 대립유전자 특이성 올리고뉴클레오티드(ASO: allele specific oligonucleotide) 혼성화를 위해 사용될 수 있다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 관심의 대상이 되는 마커 측면에 위치하거나(PCR 증폭에 필요), 마커와 직접 중첩될 수 있다(ASO 혼성화에서).
본원에 기술된 검정법 및 키트를 사용하여 얻은 정보(단독 또는 예로서, 위험 인자, 예로서, 동시 질병, 유전적 결함 또는 혈관 질환의 원인이 되는 환경 인자에 관한 정보와 함께)는 증상을 보이지 않는 대상자가 심혈관 질환에 걸렸는지, 또는 심혈관 질환이 발병될 가능성이 있는지를 측정하는데 유용한다. 추가로, 정보를 통해 접근법을 보다 맞춤화시킬 수 있고, 작용 과정인 더 많은 침습적 방법의 사용을 포함하여야 하는지 여부, 또는 치료법이 플라크 안정화를 목표로 하여야 하는지 여부를 결정할 수 있다. 이러한 정보를 통해 의사는 질환의 분자 또는 유전적 원리를 다루는 요법을 보다 효과적으로 처방할 수 있게 된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 대상자에게 본 발명의 적절한 치료제를 투여함으로써 대상자에서 심혈관 질환의 발병을 치료 또는 예방하는 방법을 특징으로 한다. 추가의 또다른 측면에서, 본 발명은 심-혈관 질환을 치료 또는 예방하는 치료제를 동정하기 위하여 시험 화합물을 스크리닝하는 시험관내 또는 생체내 검정법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 검정법은 시험 화합물과, 적절한 프로모터에 작동가능하게 연결된 원인이 되는 돌연변이로 형질감염된 세포를 접촉시키고, 시험 화합물의 존재하 및 부재하에 세포에서의 단백질 발현 수준을 측정하는 것을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 원인이 되는 돌연변이는 IL-1 수용체 길항제의 전신 수준에 영향을 주고, IL-1RA의 혈청 수준을 증가시키는 바, 특정 화합물의 치료학적 효능은 그의 존재하에서 IL-1RA의 혈청 수준이 감소하는지 여부에 의해 평가될 수 있다. 또다른 바람직한 실시태양에서, 심혈관 질환의 원인이 되는 돌연변이가 IL-1α 또는 IL-1β의 생산을 증가시키고, 시험 화합물의 존재하에서는 IL-1α 또는 IL-1β의 생산을 감소시킨다면, 이는 화합물이 IL-1α 또는 IL-1β 활성의 길항제라는 것을 지시한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명은 IL-1α 또는 IL-1β 활성의 길항제 또는 IL-1Ra 활성의 효현제를 동정하는데 있어서의 인간을 제외한 동물 및 그의 용도를 특징으로 한다.
본 발명의 다른 특성과 잇점은 하기 상세한 설명 및 청구의 범위에 기술한다.
도 1은 염색체 2의 유전자 위치를 개략적으로 도시한다.
도 2는 IL-1 유전자 클러스터내 비평형 값을 표로 나타낸다.
도 3은 일배체형 패턴의 빈도를 막대 그래프로 제시한다.
도 4는 IL-1 유전자형 패턴 2에서의 대립유전자 및 그의 특정 임상적 상관관계의 개략도를 제시한다.
도 5는 유전자 마커에 관한 임상 시험의 특징을 나타낸다.
도 6은 IL-1 유전자형과 관상 동맥 협착증 사이의 연관성에 관한 막대 그래프를 제시한다.
도 7은 IL-1 유전자형과 재협착증 사이의 연관성에 관한 막대 그래프를 제시한다.
도 8은 IL-1RN(+2O18) 유전자좌에서의 동형접합성 및 이형접합성 대립유전자 패턴과 재협착증 및 표적 혈관 혈관재생(TVR: target vessel revascularization) 사이의 연관성을 나타내는 막대 그래프를 제시한다.
도 9는 콜레스테롤 수준, IL-1 패턴 및 임상적 사건 사이의 관계에 관한 개략적 흐름도를 제시한다.
도 10은 IL-1 다형태 및 취약 플라크 유형의 임상적 사건에 대한 위험과 상이한 총 콜레스테롤량 사이의 관계를 나타내는 막대 그래프를 제시한다.
도 11은 IL-1 유전자형 패턴에서의 대립유전자 및 특정의 그의 임상적 상관관계에 관한 개략도를 제시한다.
도 12는 IL-1 유전자형 패턴 2와 Lp(a) 수준에 관한 막대 그래프를 제시한다.
도 13은 IL-1 유전자형 패턴 2와 LDL 수준에 관한 막대 그래프를 제시한다.
도 14는 IL-1 유전자형과 C-반응성 단백질 수준 사이의 관계를 설명하는 막대 그래프를 나타낸다.
본 발명의 상세한 설명
4.1 정의
편의상, 본 명세서, 실시예, 및 첨부하는 청구의 범위에서 사용되는 특정 용어 및 구의 의미는 하기에 제공한다.
예로서, IL-1과 같은 폴리펩티드의 활성에 적용되는 용어 "비정상적인 활성"은 천연 폴리펩티드의 활성과 다르거나, 건강한 대상자의 폴리펩티드의 활성과 다 른 활성을 지칭한다. 폴리펩티드의 활성이 천연 대응물의 활성보다 강하기 때문에 비정상적인 활성일 수 있다. 별법으로, 활성이 천연 대응물의 활성에 비하여 약하거나 활성이 없기 때문에 비정상적인 활성이라고 할 수 있다. 또한 비정상적인 활성은 활성 변화일 수 있다. 예를 들면, 비정상적인 폴리펩티드는 상이한 표적 펩티드와 상호작용할 수 있다. 세포는 IL-1 유전자좌 폴리펩티드를 코딩하는 IL-1 유전자좌 유전자의 과다발현 또는 과소발현으로 인한 IL-1 비정상적인 활성을 보유할 수 있다.
용어 "대립유전자"는 상이한 다형태 영역에서 발견되는 상이한 서열 변이체를 지칭한다. 예를 들어, IL-1RN(VNTR)은 5개 이상의 상이한 대립유전자를 갖는다. 서열 변이체는 단일의 또는 복수개의 염기 변화, 비제한적으로, 삽입, 결실 또는 치환될 수 있거나, 다양한 수로 서열 반복될 수 있다.
용어 "대립유전자 패턴"은 하나 이상의 다형태 영역에서의 대립유전자 또는 대립유전자들의 아이덴티티를 지칭한다. 예를 들면, IL-1RN(VNTR) 대립유전자 1에 대해서, 대립유전자 패턴은 다형태 부위에서 하나의 대립유전자로 구성될 수 있으며, IL-1RN 유전자 유전자좌의 VNTR에서 IL-1RN 대립유전자 1의 하나 이상의 카피를 갖는 대립유전자 패턴이다. 별법으로, 대립유전자 패턴은 단일 다형태 부위에서 동형접합성 또는 이형접합성 상태로 구성될 수 있다. 예를 들면, IL-1-RN(VNTR) 대립유전자 2,2는, IL-1RN의 VNTR 마커에서 제2 대립유전자의 2개 카피가 있으며 동형접합성 IL-1RN(VNTR) 대립유전자 2 상태에 해당하는 대립유전자 패턴이다. 별법으로, 대립유전자 패턴은 하나 이상의 다형태 부위에서의 대립유전자 아이덴티티로 구성될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "항체"는 IL-1B 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 전체 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 결합 반응 물질을 지칭하고자 사용된다. 종래 기법을 사용하여 항체를 단편화하고, 전체 항체에 대해 전술한 바와 동일한 방식으로 단편을 스크리닝할 수 있다. 예를 들면, 펩신으로 항체를 처리하여 F(ab)2 단편을 생성할 수 있다. 생성된 F(ab)2 단편을 처리하여 이황화 결합을 환원시켜 Fab 단편을 생산할 수 있다. 추가로 본 발명의 항체는 항체의 하나 이상의 CDR 영역에 의해 부여되는 IL-1B 폴리펩티드에 대해 친화도를 갖는 이중특이성, 단일-쇄, 및 키메라 및 인간화된 분자를 포함하고자 한다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 "생물학적 활성" 또는 "생체활성" 또는 "활성" 또는 "생물학적 기능"은 IL-1 폴리펩티드(천연 또는 변성된 형태) 또는 그의 임의의 하위서열(단편)에 의해 직접 또는 간접적으로 수행되는 효과기 또는 항원성 작용을 의미한다. 생물학적 활성은 결합, 수용체로부터의 신호 전달 수행, 유전자 발현 또는 항원 효과기 작용 조절을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "IL-1 폴리펩티드의 생체활성 단편"은 전장의 IL-1 폴리펩티드의 단편을 지칭하는 것으로서, 단편은 야생형 IL-1 폴리펩티드의 활성을 특이적으로 모사하거나 길항한다. 생체활성 단편은 인터루킨 수용체와 상호작용할 수 있는 단편인 것이 바람직하다.
"세포," "숙주 세포" 또는 "재조합 숙주 세포"는 특정 대상자 세포 뿐만 아 니라, 이러한 세포의 자손 또는 가능한 자손을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인하여 차세대에서 일부 변형이 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 부모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 용어의 범위 내에 포함된다.
"키메라," "모자이크," "키메라 포유동물" 등은 게놈 함유 세포 내의 적어도 일부 중에 넉-아웃 또는 넉-인 작제물을 갖는 트랜스제닉 포유동물을 지칭한다.
용어 "대조군" 또는 "대조군 샘플"은 사용된 검출 기법에 적절한 임의의 샘플을 지칭한다. 대조군 샘플은 사용된 대립유전자 검출 기법의 산물 또는 시험할 물질을 포함할 수 있다. 추가로, 대조군은 양성 또는 음성 대조군일 수 있다. 일례로, 대립유전자 검출 기법이 PCR 증폭 후의 크기 분별인 경우, 대조군 샘플은 적절한 크기의 DNA 단편을 포함할 수 있다. 유사하게, 대립유전자 검출 기법이 돌연변이된 단백질의 검출을 포함하는 경우, 대조군 샘플은 돌연변이체 단백질 샘플을 포함할 수 있다. 그러나, 대조군 샘플은 시험할 물질을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 대조군은 IL-1 유전자 클러스터의 클로닝된 부분 또는 게놈 DNA의 샘플일 수 있다. 그러나, 시험할 샘플이 게놈 DNA인 경우, 대조군 샘플은 바람직하게는 고도로 정제된 게놈 DNA 샘플이다.
"심혈관 질환"은 임상적 증상 및 임상적 증세를 비롯한 임상적 사건을 특징으로 하는, 본원에 정의된 심혈관 질환이다. 임상적 증상은 환자가 의사에게 병리 존재에 대하여 언급함으로써 환자에 의해 보고된 경험이다. 임상적 증세는 의사에게 병리 존재에 대하여 지시하는 신체 검사 또는 실험실 검사상의 객관적인 결과이 다. "심혈관 질환"은 "관상 동맥 질병" 및 "말초 혈관 질병," 둘 모두를 포함하여, 상기 두개의 용어는 하기에서 정의된다. 심혈관 질환에서의 임상적 증상은 가슴 통증, 호흡 곤란, 쇠약, 졸도, 의식 변동, 극심한 통증, 발작성 야간 호흡 곤란, 일과성 허혈성 발작 및 환자가 경험하게 되는 기타 현상을 포함한다. 심혈관 질환에서 임상적 증세는 EKG 이상, 변경된 말초 맥박, 동맥류 잡음, 심장음 이상, 수포음 및 쌕쌕거림, 경정맥 팽창, 신경 변화와 같은 소견 및 의사가 식별한 기타 소견을 포함한다. 환자는 특정 현상(증상)을 보고하고, 의사는 근본적인 병리를 지시하는 모든 다른 현상(증세)을 인식하는 경우의 심혈관 질환, 예로서, 심근경색(MI: myocardial infraction) 또는 뇌졸증("뇌혈관 사고" 또는 "CVA(cerebrovascular accident)")에서는 임상적 증상 및 임상적 증세가 함께할 수 있다. "심혈관 질환"은 취약 플라크 질환, 폐색 질환 및 협착증의 심혈관 질환에 관한 질병을 포함한다. 예를 들면, 하기에 정의하는 용어인 취약 플라크 질환으로부터 유발된 심혈관 질환은 "취약 플라크 질병"으로 명명될 수 있다. 취약 플라크 질병과 관련된 임상적 사건은, 취약 플라크의 파열 이후의 급성 혈전증 또는 원위의 색전 형성이 특질인 증세 및 증상을 포함한다. 취약 플라크 질병의 일례로 특정 뇌졸증 및 심근경색을 포함한다. 또다른 일례로, 폐색 질환으로부터 유발된 심혈관 질환은 "폐색 질병"으로 명명될 수 있다. 폐색 질병과 관련된 임상적 사건은, 동맥의 진행성 폐색이 표적 조직에 도달하는 순화량에 영향을 주는 증세 및 증상을 포함한다. 진행성 동맥 폐색은, 순환량이 조직을 유지시키는데 불충분할 경우, 최종적으로는 조직 사멸로 진행될 수 있는 진행성 허혈을 초래할 수 있다. 폐색 질병의 증세 및 증상은 파행, 안정시 동통, 협심증, 및 괴저 뿐만 아니라, 혈관 협착증 및 원위 관류의 감소를 지시하는 신체 및 실험실상의 결과를 포함한다. 추가의 또다른 일례에서, 재협착증으로부터 유발된 심혈관 질환은 스텐트 내 협착증 질병으로 명명될 수 있다. 스텐트 내 협착증 질병은, 스텐트가 존재하는 것은 혈관이 새로 확장된 형태로 유지될 수 있도록 도움을 주고자 하는 것인 경피적 경혈관 확장술과 같은 시술의 일부로서 배치된 동맥 스텐트의 진행성 차단으로부터 유발되는 증세 및 증상을 포함한다. 스텐트 내 협착증 질병을 수반하는 임상적 사건은 재건된 동맥의 재협착증의 원인이 되는 것이다.
"심혈관 질환"은 광범위하게 관상 동맥 질환 및 말초 동맥 질환, 둘 모두를 지칭한다. 용어 "심혈관 질환"은 어떤 구조상의, 조직학상의, 생화학상의 또는 임의의 다른 비정상적인 것이든 간에 임의의 동맥 비정상적인 것에 적용될 수 있다. 이러한 용어는 취약 플라크를 특징으로 하는 질환(본원에서 "취약 플라크 질환"으로 명명된다), 혈관-폐색을 특징으로 하는 질환(본원에서 "폐색 질환"으로 명명된다), 및 재협착을 특징으로 하는 질환을 포함한다. "심혈관 질환"은 일차적으로, 즉, 임의의 의료적 또는 외과적 시술 이전에 동맥에서 발생할 수 있다. 원발성 심혈관 질환은 그 중에서도 죽상경화증, 동맥 폐색, 동맥류 형성 및 혈전증을 포함한다. "심혈관 질환"은 이차적으로, 즉, 의료적 또는 외과적 시술 이후에 동맥에서 발생할 수 있다. 속발성 심혈관 질환은 그 중에서도 외상후 동맥류 형성, 재협착증, 및 수술후 이식편 폐색을 포함한다.
"심혈관 질환의 원인이 되는 기능 돌연변이"는 대상자에서 심혈관 질환의 발 병을 유발하거나, 그의 원인이 되는 돌연변이를 지칭한다. 바람직한 돌연변이는 IL-1 복합체에서 발생한다. 그에 연결되어 있는 IL-1 유전자(예컨대, IL-1A, IL-1B 또는 IL-1RN) 또는 유전자 유전자좌 내에서 발생하는 심혈관 질환의 원인이 되는 기능 돌연변이는 예를 들면, 유전자의 오픈 리딩 프레임 또는 스플라이싱 패턴을 변경시킴으로써 불활성 또는 저활성 유전자 산물을 형성시킬 수 있다. 예를 들면, IL-1A 유전자좌의 인트론 6에서 발생하는 돌연변이는 5 내지 18개의 반복 단위에 상응하는, 46 bp 서열의 가변수의 직렬 반복부에 상응한다[Bailly, et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 1240-45]. 이러한 반복 서열은 전사 인자: SP1 부위, 바이러스 인핸서 요소, 글루코코르티코이드-반응 요소에 대한 3개의 잠재적인 결합 부위를 포함하며; 이로써, 다수의 반복 단위를 갖는 IL-1A 인트론 6 VNTR 대립유전자를 보유하는 개체에서 IL-1 유전자의 전사 조절은 변경될 수 있고, 결과적으로 염증성 사이토카인 생산은 교란될 수 있다. 사실상, 이러한 다형태 IL-1A 유전자좌에서 반복부의 수가 증가할수록 IL-1α 합성은 감소한다는 증거가 있다[Bailly et al. (1996) Mol Immunol 33: 999-1006]. 별법으로, 돌연변이는 과활성 유전자 산물을 일으킬 수 있다. 예를 들면, IL-1B(+6912의 G) 다형태의 대립유전자 2는 IL-1B mRNA의 3' UTR(비번역 영역)에서 발생하고, 이는 +6912의 IL-1B 유전자의 대립유전자 1과 관련된 수준과 비교해 보면 항정 상태하의 IL-1B mRNA 및 IL-1B 단백질, 둘 모두의 수준이 대략적으로 4-배 증가한 것과 관련이 있다. 추가로, IL-1B(-511) 돌연변이는 음성 글루코코르티코이드 반응 요소에 대한 프로모터 결합 부위 부근에서 발생한다[Zhang et al. (1997) DNA Cell Biol 16: 145-52]. 이러한 요소는 덱사메 토손에 의한 IL-1B 발현의 4-배 퇴보를 강화시키고, 이러한 음성 반응 요소의 결실은 IL-1B 프로모터 활성을 2.5-배 증가시킨다. 따라서, IL-1B(-511) 다형태는 사이토카인 생산과 염증 반응에 직접적으로 영향을 줄 수 있다. 이러한 일례는 IL-1A 또는 IL-1B 유전자에서 발생하는 유전자 변이체가 IL-1 사이토카인을 생산을 변경시키거나, IL-1 사이토카인 활성을 조절할 수 있다는 것을 입증한다.
"심혈관 질환 치료제"는 대상자에서 심혈관 질환의 발병을 예방하거나 지연시키거나, 심혈관 질환을 구성하는 비정상 범위를 감소시키는 임의의 제제 또는 치료 요법(약제, 건강식품 및 외과적 수단을 포하한다)을 지칭한다. 심혈관 질환 치료제는 취약 플라크 질환, 폐색 질환 및 재협착을 비롯한, 임의의 심혈관 질환의 치료에 관한 것일 수 있다. 각 카테고리의 심혈관 질환에 관한 치료제의 일례는 본원에서 제공된다. 치료제는 1 초과의 카테고리에 있는 심혈관 질환에 유용할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 치료제는 폴리펩티드, 펩티드모사체, 핵산, 또는 기타 무기 또는 유기 분자, 바람직하게는, 비타민, 미네랄, 및 다른 영양분을 비롯한 "소분자"일 수 있다. 바람직하게, 치료제는 천연적으로-발생된 폴리펩티드의 효과를 모사하거나, 강화(작용)하거나 또는 저해(길항)하여 적어도 하나의 IL-1 폴리펩티드의 활성, 예컨대, 수용체와의 상호작용을 조절할 수 있다. IL-1 효현제는 야생형 단백질 또는 야생형의 적어도 하나의 생체활성, 예컨대, 수용체 결합 활성을 갖는, 그의 유도체일 수 있다. IL-1 효현제는 또한 유전자의 발현을 상향조절하거나, 단백질의 적어도 하나의 생체활성을 증가시키는 화합물일 수 있다. IL-1 효현제는 또한 폴리펩티드와 또다른 분자, 예컨대, 수용체의 상호작용을 증가시키는 화합물일 수 있다. IL-1 길항제는 단백질과 또다른 분자, 예컨대, 수용체의 상호작용을 증가 또는 감소시키는 화합물, 또는 신호 전달 또는 번역후 프로세싱을 차단하는 제제(예컨대, IL-전환 효소(ICE: IL-1 converting enzyme) 저해제일 수 있다. 따라서, 바람직한 길항제는 수용체에 대한 결합을 증가 또는 감소시키고, 이로써 차후 수용체의 활성화를 차단시키는 화합물이다. IL-1 길항제는 또한 유전자 발현을 하향조절하거나, 존재하는 단백질의 양을 감소시키는 화합물일 수 있다. 길항제는 폴리펩티드의 우성 음성 형태, 예컨대, 표적 펩티드, 예컨대, 수용체와 상호작용할 수 있지만, 수용체의 활성화를 촉진할 수 없는 폴리펩티드 형태일 수 있다. 길항제는 폴리펩티드의 우성 음성 형태를 코딩하는 핵산, 안티센스 핵산, 또는 RNA와 특이적으로 상호작용할 수 있는 리보자임일 수 있다. 추가의 다른 길항제는 폴리펩티드에 결합하여 그 작용을 저해하는 분자이다. 그러한 분자로는 펩티드, 예컨대, 생물학적 활성을 갖지 않고 수용체에 대한 결합을 저해하는 표적 펩티드 형태를 포함한다. 따라서, 그러한 펩티드는 단백질 활성 부위에 결합하여 표적 펩티드와의 상호작용을 막을 것이다. 추가의 다른 길항제는 분자의 에피토프와 특이적으로 상호작용하는 항체를 포함하여, 결합이 폴리펩티드의 생물학적 기능을 간섭한다. 추가의 또다른 바람직한 실시태양에서, 길항제는 폴리펩티드 및 표적 수용체 간의 상호작용을 저해할 수 있는 분자와 같은 소분자이다. 별법으로, 소분자는 수용체 결합 부위 이외의 부위와 상호작용하여 길항제로서 작용할 수 있다. 바람직한 치료제로는 지질 강하제, 항혈소판제, 소염제 및 혈압강하제를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "뇌혈관 질병"은 차단된 말초 혈관이 뇌순환의 일부 가 되는 말초 혈관 질병(하기 정의되는 바와 같다) 유형이다. 뇌순환은 경동맥계 및 척추 동맥계를 포함한다. 뇌혈관 질병에 관한 이러한 정의는 구체적으로, 동맥 차단의 징후로서 발생하는 것이 아닌, 두개내 출혈을 포함시키고자 하는 것이다. 차단은 예로서, 플라크 파열 또는 색전 형성과 같은 기전에 의해 갑자기 발생할 수 있다. 근내막 과다형성을 통한 동맥 협착 및 플라크 형성과 함께 차단은 점진적으로 발생할 수 있다. 차단은 완전하거나 부분적인 것일 수 있다. 어느 정도의 차단과 차단 시간은 대뇌 허혈을 일으키는데, 이는 혈류량 감소는 수초에서 수분간 지속된다. 대뇌 허혈의 장기화는 대뇌 경색증을 일으킬 수 있다. 허혈 및 경색증은 국소적이거나 광범위한 것일 수 있다. 대뇌 허혈 또는 경색증은 "뇌졸증" 또는 "뇌혈관 사고(CVA: cerebrovascular accident)"로 명명된 임상적 사건인 비-경련성 초점성 신경학적 결함을 갑작스럽게 발병시킬 수 있다. 뇌혈관 질병은 광범위하게 2개의 병리 카테고리: 혈전증 및 색전증을 갖는다. 80-90%의 환자에서는 증상에 대한 경고없이 혈전 뇌졸증이 발생하고; 10 내지 20% 사이의 혈전 뇌졸증은 일과성 허혈 발작에 의해 예고된다. 뇌혈관 질병은 취약 플라크 질환과 관련이 있을 수 있다. 이러한 유형의 뇌혈관 질병의 증세 및 증상은 혈전 또는 색전 형성과 함께 갑작스러운 동맥 차단에 기인한 뇌졸증을 비롯한 취약 플라크와 관련이 있는 것이다. 뇌혈관 질병은 폐색 질환과 관련이 있을 수 있다. 이러한 유형의 뇌혈관 질병의 증세 및 증상은 전체 또는 국부 대뇌 허혈과 함께 혈류의 진행성 차단에 관한 것이다. 이러한 배경하에서, 뇌졸증을 비롯한 신경학적 변화도 관찰할 수 있다.
"임상적 사건"은 임상적으로 식별가능한 질병 증세 또는 임상적으로 보고가 능한 질병 증상의 발생이다. "임상적으로 식별가능한"은 증세가 건강 관리 제공자에 의해 인식될 수 있음을 지시한다. "임상적으로 보고가능한"은 증상이 건강 관리 제공자에게 설명될 수 있는 유형의 현상임을 지시한다. 임상적 사건은, 일반적으로 건강 관리 제공자에게 환자가 설명할 수 있는 유형의 현상인 한 특정 환자가 직접 보고할 수 없더라도 임상적으로 보고가능한 증상을 포함할 수 있다.
"관상 동맥 질병"("CAD: coronary artery disease")은 심장에 공급하는 동맥의 차단과 관련된 혈관 질환을 지칭한다. 차단은 예로서, 플라크 파열 또는 색전 형성과 같은 기전에 의해 갑자기 발생할 수 있다. 근내막 과다형성을 통한 동맥 협착 및 플라크 형성과 함께 차단은 전진적으로 발생할 수 있다. 심장에 공급하는 동맥의 차단으로부터 유발된 임상적 증세 및 증상은 관상 동맥 질병의 징후이다. 관상 동맥 질병의 징후는 협심증, 허혈, 심근경색, 심근병증, 울혈성 심부전증, 부정맥 및 동맥류 형성을 포함한다. 관상 순환에서 취약 플라크 질병은 심근경색으로서 표시되는 동맥 혈전증 또는 원위 색전 형성과 관련이 있는 것으로 이해되어야 한다. 관상 순환에서 폐색 질병은 통상 약리학적 시술 및 확장술로 치료되는 증상인 협심증 증상에 의해 수반된 동맥 협착증과 관련이 있는 것으로 이해되어야 한다.
"질병"은 임상적 증세 및 임상적 증상을 비롯한 임상적 사건을 특징으로 하는 질환이다. 본원에서 논의된 바 있는 질병으로는 심혈관 질환, 말초 혈관 질병, CAD, 뇌혈관 질병, 및 임의의 해부학적 위치에서 취약 플라크 질환, 폐색 질환 또는 재협착과 관련된 질병을 포함한다.
"질환 관련 대립유전자" 또는 "질환과 관련된 대립유전자"는, 대상자 내에서 의 존재가 대상자가 특정 질환을 앓거나, 그가 발병되기 쉽다는 것을 나타내는 대립유전자를 지칭한다. 질환 관련 대립유전자의 한가지 유형은 "심혈관 질환 관련 대립유전자"로서, 대상자에서의 그의 존재는 대상자가 심혈관 질환을 앓거나, 심혈관 질환이 발병되기 쉽다는 것을 지시한다. 이는 광범위하게 이들 범주내의 "취약 플라크 질환"과 관련된 대립유전자, "폐색 질환"과 관련된 대립유전자, 및 재협착과 관련된 대립유전자를 포함한다. "취약 플라크 질환"과 관련된 대립유전자의 일례로는 IL-1A +4825 대립유전자 2; IL-1B +3954 마커 대립유전자 2; 및 IL-1RN +2018 마커 대립유전자 1; 및 IL-1B 유전자 (-511) 마커 대립유전자 1 또는 전술한 대립유전자중 하나와 연관 비평형 상태에 있는 대립유전자를 포함한다. "폐색 질환"과 관련된 대립유전자의 일례로는 IL-1A +4825 대립유전자 1; IL-1B +3954 마커 대립유전자 1; 및 IL-1RN +2018 마커 대립유전자 2; 및 IL-1B 유전자 (-511) 마커 대립유전자 2 또는 전술한 대립유전자중 하나와 연관 비평형 상태에 있는 대립유전자를 포함한다. 재협착증과 관련된 대립유전자의 일례로는 IL-1B 유전자 -511 마커 대립유전자 1 또는 IL-1RN +2018 마커 대립유전자 1과 함께, IL-1A +4825 대립유전자 1 또는 IL-1B +3954 마커 대립유전자 1의 조합, 또는 전술한 대립유전자중 하나와 연관 비평형 상태에 있는 대립유전자를 포함한다. "치주 질환 관련 대립유전자 "는 대상자에서의 그의 존재가, 대상자가 치주 질환에 걸렸거나, 대상자에서 치주 질환이 발병되기 쉽다는 것을 지시하는 것인 대립유전자를 지칭한다.
구 "유전자의 붕괴" 및 "표적화된 붕괴" 또는 임의의 유사한 구는 유전자의 야생형 카피에 비해 세포에서 유전자의 발현을 방지하기 위한 고유 DNA 서열의 부 위 특이적 방해를 지칭한다. 상기 방해는 유전자에 대한 결실, 삽입 또는 변형, 또는 그의 임의의 조합에 의해 유발될 수 있다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "색전," "색전증" 또는 "색전 형성"은 동맥-대-동맥 색전증 또는 색전 형성을 지칭한다.
"취약 플라크 질환"은 동맥내 동맥경화성 과정의 일부로서 취약 플라크의 형성을 특징으로 하는 심혈관 질환을 지칭한다. 취약 플라크는 균열, 혈전 또는 파열되기 쉽다. 플라크의 무결성이 변경될 때, 이는 국부적으로 혈관을 기계적으로 차단할 수 있거나, 단편 또는 관련 응괴를 혈관내 하류로 보냄으로써 보다 원거리도 차단시킬 수 있다. 플라크 균열시, 이는 형성되는 국부 혈전의 병소가 될 수 있다. 취약 플라크 질환은 IL-1 유전자좌 대립유전자 패턴 1과 관련이 있다.
"취약 플라크 질환 치료제"는 대상자에서 취약 플라크 질환의 발병을 예방하거나 지연시키거나, 취약 플라크 질환을 구성하는 비정상 범위를 감소시키는 임의의 제제 또는 치료 요법(약제, 건강식품 및 외과적 수단을 포함한다)을 지칭한다. 본 용어는 취약 플라크를 안정화시킴으로써 작동하는 특정 제제, 항-혈전 또는 항-혈소판 효과를 갖는 특정 제제, 및 혈소판을 갖는 특정 제제를 포함한다. 취약 플라크 질환 관련 치료제의 일례로는 스타틴 약물, 항-프로스타글란딘 효과를 갖는 소염제, IL-1 및 TNF-알파에 대한 소염제 및 사이토카인 저해제, 예로서, 테니댑(Tenidap), 테트라사이클린 및 관련 제제 및 특정 MMP 저해제를 비롯한 기질 금속단백질분해효소(MMP: matrix metalloproteanase) 저해제 및 재조합 IL-1 수용체 길항제를 포함한다. 추가로, 본 용어는 IL-1을 차단하는 건강식품, 제제, 예로서, 어유, 오메가-3 지방산, 다불포화 지방산, 및 항산화 효과를 갖는 건강식품, 예로서, 부틸화된 하이드록시아니솔(BHA: butylated hydroxyanisol)을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "일배체형(haplotype)"은 통계학적 유의 수준(Pcorr<0.05)에서 일군으로서 함께 유전되는 (연관 비평형 상태에 있음) 대립유전자 세트를 지칭하는 것이다. 본원에서 사용되는 바, "IL-1 일배체형"이라는 구는 IL-1 유전자좌에서의 일배체형을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, "IL-1 효현제"는 IL-1 생물학적 경로 중의 유전자의 생체활성 또는 IL-1 생체활성을 모사, 상향조절(강화 또는 보충)하거나, 증가시키는 제제를 지칭한다. IL-1 효현제는 프로모터 영역에서의 IL-1 유전자 발현 조절, mRNA 스플라이싱 기전의 조절, mRNA의 안정화, 번역을 위한 단백질의 인산화, proIL-1에서 성숙 IL-1로의 전환과 IL-1의 분비를 비롯한 각종 상이한 레벨로 작용할 수 있다. IL-1 합성을 증가시키는 효현제로는 지질다당질, IL-1B, cAMP 유도제, NFκB 활성화제, AP-1 활성화제, TNF-α, 산화된 LDL, 진행 당화 종산물(AGE: advanced glycosylation end product), 전단 응력, 저산소증, 과산소증, 허혈 재관류 손상, 히스타민, 프로스타글란딘 E2(PGE2), IL-2, IL-3, IL-12, 과립구 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF), 단핵구 콜로니 자극 인자(M-CSF), 줄기 세포 인자, 혈소판-유래 성장 인자(PDGF), 보체 C5A, 보체 C5b9, 피브린 분해 산물, 플라스민, 트롬빈, 9-하이드록시옥타데카엔산, 13-하이드록시옥타데카엔산, 혈소판 활성화 인자(PAF: platelet activating factor), 인자 H, 레틴산, 요산, 칼슘 피로포스페이 트, 폴리뉴클레오시드, c-반응성 단백질, α-안티트립신, 담배 항원, 콜라겐, β-1 인테그린, LFA-3, 항-HLA-DR, 항-IgM, 항-CD3, 식물적혈구응집소(CD2), sCD23, 자외선 B, 감마선, 물질 P, 이소프로테레놀, 메탐페타민 및 멜라토닌을 포함한다. IL-1 mRNA를 안정화시키는 효현제는 세균 내독소 및 IL-1을 포함한다. 이용가능한 IL-1 1형 수용체의 수를 증가시켜 작용하는 다른 효현제로는 IL-1, PKC 활성화제, 덱사메타손, IL-2, IL-4 및 PGE2를 포함한다. 기타 바람직한 길항제는 IL-1에 의해 활성화되거나, IL-1 신호 전달 경로에 이용되는 신호 전달 인자를 방해하거나 저해한다(예, NF□B 및 AP-1, PI3 키나제, 포스포리파제 A2, 단백질 키나제 C, JNK-1,5-리폭시게나제, 사이클로옥시게나제 2, 티로신 인산화, iNOS 경로, Rac, Ras, TRAF). 또다른 효현제는 IL-1에 의해 발현이 유도되는 유전자의 생체활성을 증가시키며, 이러한 유전자로는 IL-1, IL-1Ra, TNF, IL-2, IL-3, IL-6, IL-12, GM-CSF, G-CSF, TGF-β, 피브리노겐, 우로키나제 플라스미노겐 저해제, 1형 및 2형 플라스미노겐 활성화제 저해제, p-셀렉틴(CD62), 피브리노겐 수용체, CD-11/CD18, 단백질 분해 효소 넥신-1, CD44, 기질 금속단백질분해효소-1(MMP-1), MMP-3, 엘라스타제, 콜라게나제, 금속단백질분해효소-1의 조직 저해제(TIMP-1), 콜라겐, Apo CIII를 증가시키는 트리글리세라이드, 아포리포단백질, ICAM-1, ELAM-1, VCAM-1, L-셀렉틴, 데코린, 줄기 세포 인자, 백혈병 저해 인자, IFN□, □, □, L-8, IL-2 수용체, IL-3 수용체, IL-5 수용체, c-kit 수용체, GM-CSF 수용체, 사이클로옥시게나제-2(COX-2), 2형 포스포리파제 A2, 유도성 질소 산화물 신타제(iNOS), 엔도텔린-1,3, 감마 글루타밀 트랜스퍼라제, Mn 슈퍼옥시드 디스뮤타제, C-반응성 단백질, 피브리 노겐, 혈청 아밀로이드 A, 메탈로티오네인, 세룰로플라스민, 리소자임, 크산틴 데히드로게나제, 크산틴 옥시다제, 혈소판 유래 성장 인자 A 쇄(PDGF), 흑색종 성장 자극 활성(gro-□, □, □), 인슐린-양 성장 인자-1(IGF-1), 액티빈 A, 프로-오피오멜라노코르티오트로핀, 코르티코트로핀 방출 인자, B 아밀로이드 전구체, 기저막 단백질-40, 라미닌 B1 및 B2, 구성성 열 충격 단백질 p70, P42 유사분열인자, 활성화 단백질 키나제, 오르니틴 데카르복실라제, 헴 옥시게나제 및 G-단백질 □ 하위유니트를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "IL-1 길항제"는 IL-1 생체활성을 하향조절하거나 감소시키는 제제를 지칭한다. IL-1 길항제는 임의의 각종 상이한 수준, 예컨대 프로모터 영역에서의 IL-1 유전자 발현의 조절, mRNA 스플라이싱 기전의 조절, mRNA의 안정화, 번역을 위한 단백질의 인산화, proIL-1의 성숙 IL-1로의 전환 및 IL-1의 분비에 작용할 수 있다. IL-1 생성의 길항제로는 코르티코스테로이드, 리폭시게나제 저해제, 사이클로옥시게나제 저해제, γ-인터페론, IL-4, IL-10, IL-13, 형질전환 성장 인자 β(TGF-β), ACE 저해제, n-3 다중불포화 지방산, 항산화제 및 지질 환원제를 포함한다. IL-1 mRNA를 탈안정화시키는 길항제는 탈아데닐화를 촉진하는 제제를 포함한다. 번역을 위한 IL-1 단백질의 인산화를 저해 또는 방해하는 길항제로는 피리디닐-이미다졸 화합물, 예로서, 테부펠론과 미세관 형성을 저해하는 화합물(예컨대, 콜치신, 빈블라스틴 및 빈크리스틴)을 포함한다. proIL-1의 성숙 IL-1로의 전환을 저해 또는 방해하는 길항제로는 인터루킨 전환 효소(ICE) 저해제, 예로서, εICE 동종형, ICE α, β, 및 γ 동종형 항체, CXrm-A, 전사체 X, 내인성 테트라펩티드 경쟁성 기질 저해제, 트립신, 엘라스타제, 키모트립신, 키마제 및 기타 비특이적 단백질 분해 효소를 포함한다. IL-1의 분비를 방해하거나 저해하는 길항제는 음이온 수송을 차단하는 제제를 포함한다. IL-1 수용체 상호작용을 저해하는 길항제로는 I형 IL-1 수용체의 당화를 저해하는 제제, IL-1RI에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, IL-1RI에 대한 항체, IL-1RacP에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이용가능한 IL-1 1형 수용체의 수를 감소시켜 작용하는 다른 길항제로는 TGF-β, COX 저해제, IL-1 II형 수용체를 증가시키는 인자, 덱사메타손, PGE2, IL-1 및 IL-4를 포함한다. 기타 바람직한 길항제는 IL-1에 의해 활성화되거나, IL-1 신호 전달 경로에서 이용되는 신호 전달 인자를 저해하거나 저해한다(예, NF□B 및 AP1, PI3 키나제, 포스포리파제 A2, 단백질 키나제 C, JNK-1, 5-리폭시게나제, 사이클로옥시게나제 2, 티로신 인산화, iNOS 경로, Rac, Ras, TRAF). 또다른 길항제는 IL-1에 의해 발현이 유도되는 유전자의 생체활성을 저해하며, 이러한 유전자로는, IL-1, IL-1Ra, TNF, IL-2, IL-3, IL-6, IL-12, GM-CSF, G-CSF, TGF, 피브리노겐, 우로키나제 플라스미노겐 저해제, 1형 및 2형 플라스미노겐 활성화제 저해제, p-셀렉틴(CD62), 피브리노겐 수용체, CD-11/CD18, 단백질 분해 효소 넥신-1, CD44, 기질 금속단백질분해효소-1(MMP-1), MMP-3, 엘라스타제, 콜라게나제, 금속단백질분해효소-1의 조직 저해제(TIMP-1), 콜라겐, Apo CIII를 증가시키는 트리글리세라이드, 아포리포단백질, ICAM-1, ELAM-1, VCAM-1, L-셀렉틴, 데코린, 줄기 세포 인자, 백혈병 저해 인자, IFN□, □, □, L-8, IL-2 수용체, IL-3 수용체, IL-5 수용체, c- kit 수용체, GM-CSF 수용체, 사이클로옥시게나제-2 (COX- 2), 2형 포스포리파제 A2, 유도성 질소 산화물 신타제(iNOS), 엔도텔린-1,3, 감마 글루타밀 트랜스퍼라제, Mn 슈퍼옥시드 디스뮤타제, C-반응성 단백질, 피브리노겐, 혈청 아밀로이드 A, 메탈로티오네인, 세룰로플라스민, 리소자임, 크산틴 데하이드로게나제, 크산틴 옥시다제, 혈소판 유래 성장 인자 A쇄(PDGF), 흑색종 성장 자극 활성(gro-□,□,□), 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1), 액티빈 A, 프로-오피오멜라노코르티오트로핀, 코르티코트로핀 방출 인자, B 아밀로이드 전구체, 기저막 단백질-40, 라미닌 B1 및 B2, 구성성 열 충격 단백질 p70, P42 유사분열인자, 활성화 단백질 키나제, 오르니틴 데카르복실라제, 헴 옥시게나제 및 G-단백질 □ 하위유니트를 포함한다. 기타 바람직한 길항제로는, 하이메니알디신, 허비마이신(예, 허바마이신 A), CK-103A 및 그의 유도체(예컨대, 4,6-디하이드로피리다지노[4,5-c]피리다진-5(1H)-온), CK-119, CK-122, 요오도메타신, 아플라톡신 B1, 렙틴, 헤파린, 이중환 이미다졸(예, SB203580), PD15306 HCl, 포도카르프산 유도체, M-20, 인간 [Gly2] 글루카곤 유사 펩티드-2, FR167653, 스테로이드 유도체, 글루코코르티코이드, 퀴에르세틴, 테오필린, NO-신테타제 저해제, RWJ 68354, 유클립톨(1.8-시네올), 마그노살린, N-아세틸시스테인, 알파-멜라토닌-자극 호르몬(□-MSH), 트리클로잔(2,4,4'-트리클로로-2'-하이드록시디페닐 에테르), 프로스타글란딘 E2 및 4-아미노피리딘 에타크린산 및 4,4'-디이소티오시아나토스틸벤 2,2'-디설폰산(DIDS), 글루코스, 리포포스포글리칸, 아스피린, 이화-차단제, 디아세르헤인, 티올-조절제, 아연, 모르핀, 류코트리엔 생합성 저해제(예, MK886), 혈소판 활성 인자 수용체 길항제(예, WEB 2086), 아미오다론, 트라닐라스트, S-메틸-L-티오시트룰린, 베타-아 드레노수용체 길항제(예, 프로카테롤, 클렌부테롤, 페노테롤, 테르부탈린, 하이알루론산, 항-TNF-□ 항체, 항-IL-1□ 자가항체, IL-1 수용체 길항제, IL-1R-관련 키나제, 가용성 TNF 수용체 및 항염증성 사이토카인(예, IL-4, IL-13, IL-10, IL-6, TGF-□, 안지오텐신 II, 가용성 IL-1 II형 수용체, 가용성 IL-1 I형 수용체, 조직 플라스미노겐 활성화제, 아연 핑거 단백질 A20 IL-1 펩티드(예컨대, (Thr-Lys-Pro-Arg)(Tuftsin), (Ile-Thr-Gly-Ser-Glu) IL-1-알파, Val-Thr-Lys-Phe-Tyr-Phe, Val-Thr-Asp-Phe-Tyr-Phe, 인터페론 알파2b, 인터페론 베타, IL-1-베타 유사체(예, IL-1-베타 트리펩티드: Lys-D-Pro-Thr), 당화된 IL-1-알파, 및 IL-1ra 펩티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "IL-1 유전자 클러스터" 및 "IL-1 유전자좌"는 적어도 IL-1A, IL-1B 및 IL-1RN 유전자와 임의의 다른 연관된 서열을 포함하는 염색체 2의 2q13 영역 또는 그 근처의 모든 핵산을 포함한다[Nicklin et al, Genomics 19: 382-84, 1994]. 본원에서 사용되는 바, 용어 "IL-1A," "IL-1B", 및 "IL-1RN"은 각각 IL-1α, IL-1β 및 IL-1 수용체 길항제 또는 IL-1ra를 코딩하는 유전자를 지칭한다. IL-1A, IL-1B 및 IL-1RN에 대한 유전자 수탁 번호는 각각 X03833, X04500 및 X64532이다.
"IL-1 기능 돌연변이"는 표현형(즉, IL-1 유전자 또는 단백질의 작용에 영향을 주는 표현형)이 변경된 IL-1 유전자 클러스터 내의 돌연변이를 지칭한다. 예로는 IL-1A(+4845) 대립유전자 2, IL-1B(+3954) 대립유전자 2, IL-1B(-511) 대립유전자 1 및 IL-1RN(+2018) 대립유전자 1을 포함한다.
"IL-1X(Z) 대립유전자 Y"는 유전자 X에서의 IL-1 유전자좌 다형태 부위에서 발생하여, 뉴클레오티드 Z 또는 그 부근에 위치하는 Y로 명명된 특정 대립유전자 형태를 의미하며, 여기서 X는 IL-1A, B 또는 RN 또는 IL-1 유전자 유전자좌 중의 일부 다른 유전자이며, 뉴클레오티드 Z는 특정 IL-1 유전자 X의 주요 전사 개시 부위에 대하여 번호를 매긴 것으로서, 뉴클레오티드 +1이다. 추가로, 본원에서 사용되는 바, 용어 "IL-1X 대립유전자(Z)"는 Z 또는 그 부근에 위치한 유전자 X에서의 IL-1 다형태 부위의 모든 대립유전자를 지칭한다. 예를 들면, 용어 "IL-1RN(+2018) 대립유전자"는 마커 +2018에서 IL-1RN 유전자의 대체 형태를 지칭한다. "IL-1RN(+2018) 대립유전자 1"은 센스 스트랜드의 위치 +2018에서 시토신(C)을 포함하는 IL-1RN 유전자 형태를 지칭한다[Clay et al., Hum . Genet. 97: 723-26, 1996]. "IL-1RN(+2018) 대립유전자 2"는 (+) 스트랜드의 +2018 위치에서 티미딘(T)을 포함하는 IL-1RN 유전자 형태를 지칭한다. 대상자가 2개의 동일한 IL-1RN 대립유전자를 갖는 경우, 대상자는 동형접합성이라고 일컬어지거나 또는 동형접합 상태를 갖는다고 한다. 대상자가 2개의 다른 IL-1RN 대립유전자를 갖는 경우, 대상자는 이종접합성이라고 일컬어지거나 이종접합 상태를 갖는다고 한다. 용어 "IL-1RN(+2018) 대립유전자 2,2"는 동형접합성 IL-1RN(+2018) 대립유전자 2 상태를 지칭한다. 반대로 용어 "IL-1RN(+2018) 대립유전자 1.1"은 동형접합성 IL-1RN(+2018) 대립유전자 1 상태를 지칭한다. 용어 "IL-1RN(+2018) 대립유전자 1.2"는 이형접합성 대립유전자 1 및 2 상태를 지칭한다.
"IL-1 관련된"은 인간 염색체 2(2q 12-14)상에서 인간 IL-1 유전자좌 유전 자(locus gene)에 관련된 모든 유전자를 포함하는 의미를 갖는다. 이들은 인터루킨-1α를 코딩하는 IL-1A 유전자, 인터루킨-1β를 코딩하는 IL-1B 유전자 및 인터루킨-1 수용체 길항제를 코딩하는 IL-1RN(또는 IL-1ra) 유전자를 포함하는, 염색체 2(2q 13-14)에 위치한 인간 IL-1 유전자 클러스터의 IL-1 유전자를 포함한다. 추가로, 이들 IL-1 관련 유전자는 인간 염색체 2(2q12)에 위치된 I형 및 II형 IL-1 수용체 유전자 및 위치 19.5 cM에서 마우스 염색체 1상에 위치된 그들의 마우스 상동체를 포함한다. 인터루킨-1α, 인터루킨-1β 및 인터루킨-1RN은 그들 모두가 IL-1 I형 수용체에 결합하는 것만큼 관련되어 있으나, 인터루킨-1RN이 천연적으로 발생된 길항제 리간드인데 반해, 인터루킨-1α 및 인터루킨-1β만이 IL-1 I형 수용체를 활성화시키는 효현제 리간드이다. 용어 "IL-1"이 유전자 산물 또는 폴리펩티드에 관한 참조 문헌에 사용되는 경우, 이는 인간 염색체(2q 12-14)상의 인터루킨-1 유전자좌에 의해 코딩된 모든 유전자 산물 및 다른 종으로부터 유래하는 그들의 상응하는 상동체 또는 그의 기능적 변이체를 의미하는 것이다. 따라서, IL-1이라는 용어는 염증 반응을 촉진시키는 분비된 폴리펩티드, 예로서, IL-1α 및 IL-1β 뿐만 아니라, 염증 반응을 길항하는 분비된 폴리펩티드, 예로서, IL-1α 수용체 길항제 및 IL-1 II형(유인) 수용체를 포함한다.
"IL-1 수용체" 또는 "IL-1R"은 IL-1 유전자좌-코딩된 리간드에 결합할 수 있거나, 상기 리간드로부터 신호를 전달할 수 있는 여러 세포막 결합된 단백질 수용체를 지칭한다. 상기 용어는 인터루킨-1(IL-1) 분자에 결합할 수 있는 임의의 단백질에 적용되며, 포유동물 혈장 막 단백질로서 그들의 천연 형태로 세포에 IL-1에 의해 제공된 신호를 전달하는데 중요한 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 본원에 서 사용되는 바, 상기 용어는 IL-1 결합 활성 또는 신호 전달 활성을 보유하는 천연 단백질의 유사체를 포함한다. 그 예로는 미국 특허 번호 제4,968,607호에 기술된 인간 및 뮤린 IL-1 수용체를 포함한다. 용어 "IL-1 핵산"은 IL-1 단백질을 코딩하는 핵산을 지칭한다.
"IL-1 폴리펩티드" 및 "IL-1 단백질"은 IL-1α, IL-1β 및 IL-1RN에 대한 IL-1 게놈 DNA에 의해 코딩된 아미노산 서열 또는 그의 단편, 및 그의 상동체를 포함하고, 효현제 및 길항제 폴리펩티드를 포함하는 것을 의미이다.
"스텐트 내 협착증"은 확장술시 배치된 스텐트내의 진행성 폐색을 지칭한다. 스텐트 내 협착증은 동맥 스텐트내에서 발생하는 재협착의 한 형태이다.
"위험이 증가되었다"는 것은 집단내 질병 또는 질환의 빈도와 비교하여 개체내 질병 또는 질환의 빈도가 통계학적으로 더 높다는 것을 지칭한다. 위험이 증가되었다는 것과 관련되어 확인되는 인자를 "위험 인자"로 명명된다. 특정 다형태 대립유전자를 보유하는 것이 특정 심혈관 질환에 대한 위험 인자가 되고, 특정 질병에 대한 위험이 증가된 것과 관련된다.
"상호작용하다"라는 것은 분자들 사이의 검출가능한 관계 또는 회합(예를 들면, 생화학적 상호작용), 예로서, 자연적으로 단백질-단백질, 단백질-핵산, 핵산-핵산 및 단백질-소 분자 또는 핵산-소분자 사이의 상호작용을 포함하는 것을 의미한다.
핵산, 예로서, DNA 또는 RNA와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "단리된"이 라는 것은 거대분자의 천연 기원내에 존재하는 다른 각각의 DNA 또는 RNA로부터 분리된 분자를 지칭한다. 예를 들면, 본 IL-1 폴리펩티드중 하나를 코딩하는 단리된 핵산은 게놈 DNA 내에서 IL-1 유전자와 자연적으로 가장 측면에 위치하는 10 킬로베이스(kb) 이하의 핵산 서열을 포함하는 것이 바람직하며, 상기한 바와 같은 자연 발생하는 측면에 위치하는 서열 1.5 kb 미만을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 본원에 사용된 단리된이라는 용어는 재조합 DNA 기법으로 생성되는 경우, 세포성 물질, 바이러스성 물질 또는 배양 배지, 또는 화학적으로 합성되는 경우, 화학적 전구체 또는 다른 화학물질을 실질적으로 보유하지 않는 핵산 또는 펩티드를 지칭한다. 게다가, "단리된 핵산"은 단편으로서는 천연적으로 발생하지 않으며, 자연 상태에서 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하는 의미를 갖는다. 또한, 본원에 사용한 용어 "단리된"은 다른 세포성 단백질로부터 단리된 폴리펩티드를 의미하며, 정제된 폴리펩티드 및 재조합 폴리펩티드 둘 모두를 포함하는 의미를 갖는다.
"녹-인(knock-in)" 트랜스제닉 동물은 그의 게놈내로 변형된 유전자가 도입된 동물을 지칭하는 것이며, 변형된 유전자는 외인성 유전자일 수도 있고 내인성 유전자일 수도 있다.
"녹-아웃(knock-out)" 트랜스제닉 동물은 내인성 유전자의 발현이 부분적으로 또는 완전하게 저해된 동물을 지칭한다(예컨대, 상기 유전자의 적어도 일부분의 결실, 상기 유전자의 적어도 일부분의 제2 서열로의 치환, 정지 코돈의 도입, 결정적인 아미노산을 코딩하는 염기의 돌연변이 또는 인트론 연접부의의 제거 등에 기초한다).
"녹-아웃 작제물"은 세포내에서 내인성 DNA 서열에 의해 코딩된 단백질의 발현을 감소 또는 저해하는데 사용될 수 있는 핵산 서열을 지칭한다. 간단한 일례로, 녹-아웃 작제물은 유전자의 결정적인 부분에 결실이 일어나 그로부터 활성 단백질이 발현될 수 없는, IL-1RN 유전자와 같은 유전자를 포함한다. 별법으로, 다수의 종결 코돈을 천연 유전자에 첨가하여 단백질의 조기 종결을 유발하거나 인트론 연접부를 불활성화시킬 수 있다. 전형적인 녹-아웃 작제물에서, 상기 유전자의 일부분은 선택가능한 마커(예로서, 네오 유전자)로 치환되어, 상기 유전자는 다음과 같이 나타낼 수 있다: IL-1RN5'/네오/IL-1RN3'(이때, IL-1RN5' 및 IL-1RN3'은 각각 IL-1RN의 일부분에 대해 상류 및 하류인 게놈 서열 또는 cDNA 서열을 의미하며, 네오는 네오마이신 내성 유전자를 지칭한다). 다른 녹-아웃 작제물에서, 제2 선택가능한 마커는 측면에 위치하는 위치 내에 부가하여 상기 유전자는 다음과 같이 나타낼 수 있다: IL-1RN/네오/IL-1RN/TK(여기에서, TK는 이전 작제물의 IL-1RN5' 또는 IL-1RN3' 서열에 부가될 수 있으며, 추가로, 적절한 배지에서 선택될 수 있는 (즉, 음성의 선택가능한 마커이다) 티미딘 키나제이다). 상기 2개의 마커 작제물은 상동성 재조합 과정의 선택을 가능하게 하며, 전형적으로 TK 서열을 보유하는 비상동성 재조합 과정으로부터 측면에 위치하는 TK 마커를 제거한다. 유전자 결실 및/또는 치환은 엑손, 인트론, 구체적으로 인트론 연접부 및/또는 조절 영역, 예로서, 프로모터에서 일어날 수도 있다.
"연관 비평형"은 주어진 대조용 집단에서 각각의 대립유전자의 개별적인 빈도로부터 예상할 수 있는 것보다 더 큰 빈도로 나타나는 2개의 대립 유전자의 동시 유전을 지칭한다. 독립적으로 유전되는 2개의 대립유전자의 예상된 빈도는 제1 대립유전자의 빈도에 제2 대립유전자의 빈도를 곱한 것이다. 예상된 빈도로 동시에 발생하는 빈도는 "연관 평형"이라 칭한다. 연관 비평형의 원인은 종종 명백하지 않다. 이는 특정 대립유전자 조합에 대한 선택에 기인하는 것일 수도 있고, 유전적으로 이종성인종 집단의 새로운 혼합에 기인하는 것일 수도 있다. 또한, 질병 유전자에 매우 타이트하게 연관된 마커인 경우, 질병 돌연변이가 바로 이전에 일어났다면 대립 유전자(또는 연관된 대립유전자 군)와 질병 유전자와의 회합이 예상되므로, 특정 염색체 영역내에서 재조합 과정을 통해 달성하려는 평형을 위해 충분한 시간이 경과하지 못한다. 1 초과의 대립유전자를 포함하는 대립유전자 패턴을 언급하는 경우, 제1 대립유전자 패턴은, 제1 대립유전자 패턴을 포함하는 모든 대립유전자가 제2 대립유전자 패턴의 대립유전자의 하나 이상과 연관 비평형이라면, 제2 대립유전자 패턴과 연관 비평형이다. 연관 비평형의 예는 IL-1RN(+2018) 및 IL-1RN(VNTR) 다형태 위치에서 대립유전자 사이에서 발생하는 것을 들 수 있다. IL-1RN(+2018)에서 2개의 대립유전자는 대립유전자 1 및 대립유전자 2인, IL-1RN(VNTR)의 가장 빈번한 2개의 대립유전자와 100% 연관 비평형이다.
"마커"는 개체들 사이에서 다양한 것으로 알려진 게놈내 서열을 지칭한다. 예를 들면, IL-1RN 유전자는 가변수의 직렬 반복부(VNTR: a variable number of tandem repeats)로 구성되는 마커를 보유한다.
"조정하다"라는 것은 생체활성을 조절할 수 있는 물질의 능력을 지칭한다. IL-1 생체활성에 적용하는 경우, 효현제 또는 길항제는 예를 들면, IL-1 합성, 수 용체 상호작용 또는 IL-1 매개된 신호 전달 기전을 작용 또는 길항시킴으로써 생체활성을 조정할 수 있다.
"돌연변이된 유전자" 또는 "돌연변이" 또는 "기능적 돌연변이"는 유전자의 대립유전자 형태를 의미하는 것으로, 이는 돌연변이된 유전자를 보유하지 않은 개체에 대해 돌연변이된 유전자를 보유하는 개체의 표현형을 변경시킬 수 있다. 돌연변이에 의해 유발된, 변경된 표현형은 특정 제제에 의해 보정되거나 보상될 수 있다. 개체가 변경된 표현형을 보유하기 위해 이 돌연변이에 대해 동형접합성이어야 하는 경우, 상기 돌연변이는 열성이라 칭한다. 하나의 돌연변이된 유전자 카피가 개체의 표현형을 변경시키기에 충분한 경우, 상기 돌연변이는 우성이라 칭한다. 대상자가 하나의 돌연변이된 유전자 카피를 보유하고, 동형접합성 대상자의 표현형과 이형접합성 대상자의 표현형 사이의 표현형을 보유하는 경우, 상기 돌연변이는 공동-우성이다.
본 발명의 "인간을 제외한 동물"은 설치류, 인간을 제외한 영장류, 양, 개, 소, 염소 등과 같은 포유동물,예로서, 제노퍼스(Xenopus) 속의 구성원과 같은 양서류, 및 트랜스제닉 조류(예컨대, 닭, 조류 등)을 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "키메라 동물"은 세포 전부가 아닌, 동물의 일부 세에서 재조합 유전자가 확인되거나 발현되는 동물을 지칭한다. 용어 "조직 특이성 키메라 동물"은 다른 조직이 아닌 일부 조직에서 재조합 IL-1 유전자중 하나가 존재하고/거나 발현되거나 붕괴되는 것을 지칭한다. 용어 "인간을 제외한 동물"은 인간을 제외하고, 포유동물의 임의의 구성원을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드, 예로서, 데옥시리보핵산(DNA)을 의미하고, 경우에 따라 리보핵산(RNA)을 지칭하기도 한다. 또한, 상기 용어는 뉴클레오티드 유사체(예컨대, 펩티드 핵산)으로부터 제조된 RNA 또는 DNA의 유사체를 등가물로서 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 경우에 따라 단일(센스 또는 안티센스) 및 더블-스트랜드 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"폐색 질환"은 동맥내 죽상경화성 내막 병변 존재과 관련된, 동맥벽의 진행성 비후화를 특징으로 하는 심혈관 질환을 지칭한다. 폐색 질환은 동맥의 진행성 차단을 일으킨다. 충분히 진행되면, 폐색 질환은 동맥에 의해 관류되는 조직에서 임상적 증세 및 증상이 발생할 수 있는 정도까지로 동맥내 흐름을 감소시킬 수 있다. 이러한 임상적 사건은 관류 조직의 허열과 관련이 있다. 중증일 경우, 허혈은 경색증 또는 괴저이라고 명명되는 조직 사멸을 수반한다. 폐색 질환은 IL-1 유전자좌 대립유전자 패턴 2a과 관련이 있다.
"폐색 질환 치료제"는 대상자에서 폐색 질환의 발병을 예방하거나 지연시키거나, 심혈관 질환을 구성하는 비정상 범위를 감소시키는 임의의 제제 또는 치료 요법약제, 건강식품 및 외과적 수단)을 지칭한다. 폐색 질환 치료제의 일례로는 항-산화제인 제제, 혈청 지질을 강하시키는 제제, 산화된 지질의 작용을 차단하는 제제, 및 지질 대상에 영향을 주거나, 다르게는, 지질-활성 효과를 갖는 다른 제제를 포함한다.
"말초 혈관 질병"("PVD: peripheral vascular disease")은 말초(즉, 비-관 상) 동맥의 차단으로부터 유발되는 심혈관 질환이다. 차단은 취약 플라크 질병에서 발생하는 것과 같이, 예로서, 플라크 파열 또는 색전 형성과 같은 기전에 의해 갑자기 발생할 수 있다. 차단은 폐색 질병에서와 같이, 근내막 과다형성 및 플라크 형성을 통해 동맥을 협착시키면서 점진적으로 발생할 수 있다. 차단은 완전하거나 부분적일 수 있다. 말초 동맥의 차단으로부터 유발된 임상적 증세 및 증상은 말초 혈관 질병의 소견이다. 말초 혈관 질병의 소견으로는 특히, 파행, 허혈, 장 협심증, 혈관-기초 신부전증, 일과성 허혈성 발작, 동맥류 형성, 말초 색전 형성 및 뇌졸증을 포함한다. 허혈성 뇌혈관 질병이 말초 혈관 질병의 한 유형이다.
"다형태"는 유전자 또는 그의 부분(예컨대, 대립유전자 변이체)의 1 초과의 형태가 공존하는 것을 의미한다. 2개 이상의 상이한 형태가 존재하는 유전자의 부분, 즉 2개의 상이한 뉴클레오티드 서열은 "유전자의 다형태 영역"이라 지칭한다. 유전자의 다형태 영역에서 특이적인 유전자 서열은 대립유전자이다. 다형태 영역은 단일 뉴클레오티드일 수도 있고, 상이한 대립유전자에서 다른 아이덴티티일 수도 있다. 또한, 다형태 영역은 길이가 수개의 뉴클레오티드일 수 있다.
용어 "질병에 대한 성향," 또한 질환에 대한 "소인" 또는 "감수성" 또는 임의의 유사한 구는 특정한 대립유전자가 대상자의 특정 질병(예를 들면, 심혈관 질환) 발병의 발생수와 관련되거나 이를 예측하는 것으로 밝혀진 것을 의미한다. 따라서, 건강한 개체와 비교하여 질병에 걸린 개체에서 대립유전자의 빈도는 과도하게 높다. 따라서, 이들 대립유전자는 심지어 증상 이전 또는 질병에 걸리기 이전에 개체에서 질병을 예측하는데 사용될 수 있다. 이러한 대립유전자가 질병의 근본이 되는 질환에 관련된다는 것으로 이해된다.
용어 "재협착증"은 질병에 걸린 혈관에서의 재건술 이후 발생하는 임의의 전폐색 병변을 지칭한다. 상기 용어는 선재성 협착증의 재발에 적용될 뿐만 아니라, 종전의 정상 혈관 예로서, 혈관 우회술 이후 부분적으로 폐색된 정맥 이식편에도 적용된다. 재협착증은 동맥에 대하여 이루어진 치료제 시술 이후 발생한 임의의 내강 협착을 지칭한다. 그러므로, 재협착증을 일으키는 손상으로는 죽상경화성 병변에 대한 외상(확장술로 관찰되는 것), 병변 절제(동맥 내막 절제로 관찰되는 것), 외부 외상(예컨대, 크로스-클램핑 손상), 또는 외과적 문합술을 포함한다. 재협착증은 혈관 재건시 어느 때나, 관상 맥관이든, 말초든 상관없이, 혈관 재건의 결과로서 발생할 수 있다[Colburn and Moore (1998) Myointimal Hyperplasia pp. 690-709 in Vascular Surgery: A Comprehensive Review (Philadelphia: Saunders, 1998)]. 예를 들면, 연구에서 관상 혈관성형술 이후 증후성 재협착율이 30-50%인 것으로 보고되었다([Berk and Harris (1995) Adv. Intern. Med. 40:455-501]을 참조할 수 있다). 경동맥 동맥 내막 절제술 이후에 추가의 일례로 연구된 환자중 20%에서는 50% 초과의 내강 협착이 일어났다[Clagett et al. (1986) J. Vase. Surg. 3:10-23]. 재협착증에 대한 추가의 또다른 일례는 서혜부 아래쪽 혈관 우회술에서 발견되는데, 이 경우, 40-60%의 인공 이식편과 20-40%의 정맥 이식편이 3년째에는 폐색된다([Dalman and Taylor (1990) Ann. Vase. Surg. 3:109-312], [Szilagyi et al. (1973) Ann. Surg. 178:232-246]). 정도가 다른 종합적 증상은 포함되는 상이한 혈관경, 잔류 질병 정도 및 국부 혈류역학을 비롯한 조합 인자에 기인하여 상이 한 해부학적 위치에서 전폐색 병변을 수반한다. 스텐트 내 협착증은 재협착증의 한 유형이다.
"재협착 질환 치료제"는 환자에서 재협착 질환의 발병을 예방하거나 지연시키거나, 재협착 질환을 구성하는 비정상 범위를 감소시키는 임의의 제제 또는 치료 요법약제, 건강식품 및 외과적 수단)을 지칭한다. 재협착증은 3단계를 포함하는 것으로 이해된다. 제1 단계는 처음 48시간 동안 백혈구를 손상 부위로 동원하고, 혈전을 형성하는 것을 특징으로 한다. 내피는 부착 분자 ICAM-1, E-셀렉틴, P-셀렉틴 및VCAM-1의 발현으로 활성화된다. 동시에, 대식세포 및 섬유모세포는 인테그린의 상향조절에 의핸 손상 부위로 이동하기 시작한다. 제2 단계는 혈관벽 중간막에서의 평활근 세포의 증식과, 내막으로의 세포 이동을 특징으로 한다. 평활근 세포의 증식과 이동을 조절하는 성장 인자 및 사이토카인은 혈소판, 백혈구 및 평활근 세포로부터 방출된다. 마지막 단계는 평활근 세포로부터 세포외기질을 분비하는 단계를 포함한다. 재협착 질환 치료제는 재협착 과정을 조절할 때 이러한 과정중 어느 것에 영향을 줄 수 있도록 작용할 수 있다. 재협착 질환 치료제는 NO 합성 과정에 영향을 주는 제제, 예로서, 트로글리타존 및 트라닐라스트를 포함할 수 있다. 재협착 질환 치료제는 재협착 또는 스텐트 내 재협착의 진행에 영향을 주는 방사선 요법과 같은 물리적 시술을 포함한다. 재협착 질환 치료제는 스텐트 변형 기법, 예로서, 유전자 변형 내피 세포와 함께 스텐트를 시딩하는 것, 헤파린 또는 관련 제제로 스텐트를 코팅하는 것, 약물-적재된 중합체 스텐트를 제공하는 것, 혈소판 당단백질 수용체 항체를 용리시키는 중합체-코팅된 스텐트를 구성하는 것 또는 다른 스텐트 변형을 포함한다. 재협착 질환 치료제는 유전 공학 기법, 예로서, 치료 유전자 전달을 포함하는 것, 및/또는 하이드로겔 코팅된 의료 장치에 플라스미드 DNA를 혼입시키는 것을 포함한다. 재협착 질환 치료제는 또한 재협착증 발병을 최소화하거나, 그를 회피하기 위한 외과적 조작 또는 외과적 치료 계획의 일부를 포함한다. 재협착 질환은 혈관내 조작이 쉬운 모든 천연 동맥에서, 그리고 혈관 이식편으로서 사용되는 자가 정맥에서 발생하는 것으로 이해된다. 근거리 또는 원거리 문합술 또는 정맥 이식편 그 자체의 내막 과다형성은 예를 들면, 서혜부 아래쪽 혈관 재건에 관한 후기의 기능상실의 주 원인으로서 기여한다. 인공 이식편 재건에 있어서, 이러한 문제들은 매우 특별한 것이다. 폐색 질환에 대한 성향을 진단하는 것이 혈관 재건에 사용되는 이식편 물질의 유형을 결정하는데 있어서 외과의를 가이드할 수 있거나, 본 시술의 보조물로서 사용되는 약제 선택에 영향을 줄 수 있다.
"위험 인자"는 위험이 증가되었다는 것과 관련하여 확인되는 인자이다. 심혈관 질환 또는 심혈관 질환에 대한 위험 인자는 상기 용태가 발병되거나, 상기 용태가 악화될 위험이 증가되었다는 것과 관련하여 확인되는 임의의 인자이다. 위험 인자는 또한 심혈관 질환을 앓는 환자에서 임상적 부작용 또는 임상적 유해 결과에 대한 위험 증가와 관련될 수 있다. 심혈관 질환에 대한 위험 인자는 흡연, 유해한 지질 프로파일, 지질 또는 콜레스테롤 증가, 당뇨병, 고혈압, 과응고 상태, 호모시스테인 수준 증가, 및 운동 부족을 포함한다. 특정 다형태 대립유전자를 보유한다는 것은 특정 심혈관 질환에 대한 위험 인자가 되고, 이는 특정 질환의 위험이 증가되었다는 것과 관련된다.
"소분자"는 분자량이 약 5 kD, 가장 바람직하게는 약 4 kD 미만인 조성물을 지칭하는 것을 의미한다. 소분자는 핵산, 펩티드, 펩티드유사체, 당질, 지질 또는 기타 유기 또는 무기 분자일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "특이적으로 혼성화한다" 또는 "특이적으로 검출한다"라는 용어는 샘플 핵산의 대략 6개 이상의 연속적인 뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 핵산 분자의 능력을 지칭한다.
본원에서 이해되는 바, "협착증"은 폐색 질환 또는 재협착증에서 관찰되는 바와 같이, 동맥의 협착을 지칭한다. 협착증은 협착된 동맥 분절을 통과하는 혈류량이 감소되었음을 반영하는 증상에 수반될 수 있는데, 이러한 경우, 협착증을 유발하는 질환은 질병(즉, 폐색 질병 또는 재협착 질병)이라 명명된다. 협착증은 혈관내 무증후성으로 존재할 수 있으며, 이는 예로서, 혈관조영술 또는 혈관 실험실 연구와 같은 진단학적 시술에 의해서만 검출될 수 있다.
"전사 조절 서열"은 본 명세서 전체에 걸쳐 사용된 일반적인 용어이며, 예로서, 개시 신호, 인핸서 및 프로모터와 같은 DNA 서열을 의미하며, 이들은 이들이 작동가능하게 연결된 단백질 코딩 서열의 전사를 유도 또는 조절한다.
본원에서 사용되는 바, 용어 "트랜스진"은 세포내에 도입된 핵산 서열(코딩화 서열, 예를 들면 IL-1 폴리펩티드중 하나를 코딩하는 서열 또는 그것에 대한 안티센스 전사체)을 지칭한다. 트랜스진은 그것이 도입되는 트랜스제닉 동물 또는 세포의 내인성 유전자에 대해 부분적으로 또는 전적으로 이종 유전자, 즉 외래 유전자이거나, 또는 그것이 도입되는 트랜스제닉 동물 또는 세포의 내인성 유전자에 대 해 동종 유전자이나, 동물의 게놈내로 삽입되도록 구성되거나 삽입되어 그것이 삽입된 세포의 게놈을 변경시키는 유전자이다(예컨대, 천연 유전자의 위치와는 상이한 위치에서 삽입되거나, 그의 삽입은 녹아웃을 일으킨다). 또한, 트랜스진은 에피좀의 형태로 세포내에 존재한다. 트랜스진은 하나 이상의 전사 조절 서열을 포함할 수 있으며, 선택된 핵산의 최적 발현을 위해 필요할 수 있는 임의의 다른 핵산, 예를 들면 인트론을 포함할 수 있다.
"트랜스제닉 동물"은 동물 세포중 하나 이상이 인간 개입에 의해, 예로서, 당업계에 공지된 트랜스제닉 기법에 의해 도입된 이종 핵산을 함유하는 임의의 동물, 바람직하게는 인간을 제외한 포유동물, 조류 또는 양서류를 지칭한다. 상기 핵산은 세포내로 직접적으로 또는 간접적으로 도입되는데, 세포의 전구물질 내로 도입하거나, 고의적인 유전자 조작, 예로서, 미세주입 또는 재조합 바이러스를 이용하는 감염에 의해 도입된다. 유전자 조작이라는 용어는 고전적인 교배, 또는 시험관내 수정을 포함하지 않으며, 오히려 재조합 DNA 분자를 도입하는 것에 관한 것이다. 상기 분자는 염색체 내에서 통합될 수 있거나, 또는 염색체와는 독립적으로 복제할 수 있는 DNA일 수 있다. 본원에 기술한 전형적인 트랜스제닉 동물에서, 트랜스진은 세포로 하여금 IL-1 폴리펩티드중 하나의 재조합 형태, 예를 들면 효현제 형태 또는 길항제 형태를 발현하게 한다. 그러나, 예를 들면, 후술하는 FLP 또는 CRE 재조합효소 의존성 작제물의 경우에는 재조합 유전자가 침묵 유전자인 트랜스제닉 동물도 고려할 수 있다. 게다가, "트랜스제닉 동물"은 하나 이상의 유전자의 유전자 붕괴가 재조합 기법 및 안티센스 기법, 둘 모두를 비롯한 인간 개입에 의해 유발되는 재조합 동물도 포함한다. 상기 용어는 모든 자손 세대를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 시조 동물 및 모든 F1, F2, F3 등, 그들의 자손들이 포함된다.
본원에서 사용되는 바, "치료하는"이란 용어는 질병의 하나 이상의 증상 또는 질환과 관련된 하나 이상의 비정상적인 것을 치유하는 것 뿐만 아니라 호전시키는 것을 지칭한다.
"치료 계획"은 위험 인자가 환자에게 미치는 효과를 변형시키기 위하여 착수된 1종 이상의 시술을 지칭한다. 심혈관 질환 또는 질병에 대한 치료 계획은 심혈관 질환 또는 질병에 관계되는 위험 인자를 지정할 수 있다. 치료 계획은 예로서, 금연과 같이, 환자의 행동방식을 변화시키는데 중점을 둔 개입을 포함할 수 있다. 치료 계획은 치료제를 환자에게 투여하는 중재를 포함할 수 있다. 일례로, 콜레스테롤 수준은 적절한 약물 치료로 저하될 수 있고, 당뇨병은 인슐린으로 조절될 수 있다. 니코틴 중독은 금단 약물 치료에 의해 치료될 수 있다. 치료 계획은 진단학적인 시술을 포함할 수 있다. 예를 들면, 고혈압 위험 인자의 존재가 고혈압 병인을 결정하는 진단학적 시술의 근원이 될 수 있다. 고혈압의 원인이 확인된 이후, 추가의 치료법을 가할 수 있다.
용어 "벡터"는 연결된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 바람직한 한 유형의 벡터는 에피좀, 즉, 염색체와는 독립적으로 복제할 수 있는 핵산이다. 바람직한 벡터는 그가 연결되어 있는 핵산을 독립적인 복제 및/또는 발현시킬 수 있는 것이다. 본원에서 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있는 벡터는 "발현 벡터"라고 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 그들의 벡터 형태로 염색체에 결합하지 않는 원형 더블 스트랜드 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"의 형태이다. 본원에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용되며, 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터 형태이다. 그러나, 본 발명은 등가의 기능을 수행하며 당업계에 후속적으로 공지되는 다른 형태의 발현 벡터를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "야생형 대립유전자"는 대상자에 2개의 카피가 존재하는 경우, 야생형 표현형을 발생시키는 유전자의 대립유전자를 지칭한다. 특정 유전자의 수개의 상이한 유형의 대립유전자가 존재할 수 있는데, 이는 유전자에서의 특정한 뉴클레오티드 변화가 뉴클레오티드 변화를 갖는 유전자의 두 카피를 갖는 대상자의 표현형에 영향을 미치지 않을 수 있기 때문이다.
4.2 일반
본 발명의 키트 및 방법은 적어도 부분적으로, IL-1 유전자 클러스터에서 4개의 다형태 유전자좌의 대립유전자의 패턴이 심혈관 질환과 관련되어 있다는 신규한 발견에 기초한다. 이러한 패턴을 본원에서 패턴 1, 2, 및 3으로 지칭한다. 패턴 1은 IL-1A(+4845) 또는 IL-1B(+3954) 대립유전자 2 및 IL-1B(-511) 또는 IL-1RN(+2018) 대립유전자 1, 또는 전술한 대립유전자중 하나와 연관 비평형 상태에 있는 대립유전자를 포함하는 대립유전자 패턴을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 이러한 대립유전자 패턴을 통해 취약 플라크 질환을 진단할 수 있다. 패턴 2는 IL-1B(-511) 또는 IL-1RN(+2018) 대립유전자 2, 및 IL-1A(+4845) 또는 IL-1B(+3954) 대립유전자 1, 또는 전술한 대립유전자중 하나와 연관 비평형 상태에 있는 대립유 전자를 포함하는 대립유전자 패턴을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 이러한 대립유전자 패턴을 통해 취약 플라크 질환을 진단할 수 있다. 패턴 3은 IL-1A(+4845) 대립유전자 1 또는 IL-1B(+3954) 대립유전자 1, 및 IL-1B(-511) 대립유전자 1 또는 IL-1RN(+2018) 대립유전자 1, 또는 전술한 대립유전자중 하나와 연관 비평형 상태에 있는 대립유전자를 포함하는 대립유전자 패턴을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 이러한 대립유전자 패턴을 통해 재협착 질환을 진단할 수 있다. 하나의 측면에서, 본 발명은 대상자가 심혈관 질환에 걸렸는지 여부를 측정하는 신규한 방법 및 키트를 제공한다. 하나의 측면에서, 본 발명은 대상자가 취약 플라크 질환에 걸렸는지 여부를 측정하는 신규한 방법 및 키트를 개시한다. 하나의 측면에서, 본 발명은 대상자가 폐색 질환에 걸렸는지 여부를 측정하는 신규한 방법 및 키트를 개시한다. 하나의 측면에서, 본 발명은 대상자가 재협착 질환에 걸렸는지 여부를 측정하는 신규한 방법 및 키트를 개시한다.
도 1에 나타낸 바와 같이, IL-1α, IL-1β 및 IL-1RN에 대한 유전자는 염색체 2상의 클러스터에 위치한다. 도 2에 나타낸 바와 같이, IL-1 유전자좌의 특정 유전자는 연관 비평형에 있는 것으로 이해된다. 추가로, 도 3에 도시한 바와 같이, 일배체형의 패턴을 동정할 수 있고, 집단내 그의 빈도를 확인할 수 있다. 3개의 일배체형 패턴인, 패턴 1, 2 및 3은 표 1에 나타낸 것과 같이 IL-1 유전자 클러스터에서 4개의 다형태 유전자좌에 의해 정의될 수 있다.
표 1
일배체형 IL-1A(+4845) IL-1B(+3954) IL-1B(-511) IL-1RN(+2018)
패턴 1 대립유전자 2 대립유전자 2 대립유전자 1 대립유전자 1
패턴 2 대립유전자 1 대립유전자 1 대립유전자 2 대립유전자 2
패턴 3 대립유전자 1 대립유전자 1 대립유전자 1 대립유전자 1
일배체형 패턴 1은 취약 플라크 질환과 관련되어 있다. 일배체형 패턴 2는 폐색 질환과 관련되어 있다. 일배체형 패턴 3은 재협착 질환과 관련되어 있다. 상기 논의된 바와 같이, 이들 대립유전자는 다른 대립유전자와 연관 비평형에 있기 때문에 상기의 다른 연관된 대립유전자를 검출하는 것 또한 대상자가 심혈관 질환에 걸렸는지 또는 심혈관 질환의 발병에 대한 소인이 있는지를 지시한다.
파열되기 쉬운 죽상경화 플라크(취약 플라크 질환에서 관찰되는 것과 같은 취약 플라크)는 특정 구조상의, 세포상의, 및 분자상의 특징을 갖는다. 취약성 플라크를 오버레이하는 섬유성 캡의 파열이 관상 혈전증의 가장 보편적인 원인이다. 전형적으로, 취약 플라크는 큰 지질 코어와, 종종 염증 세포에 의해 침윤되는 얇은 섬유성 캡을 갖는다. 코어를 형성하는 지질의 성질 또한 중요하다: 예를 들면, 콜레스테롤 에스테르 형태의 지질은 플라크를 연화시키고, 결정질 콜레스테롤은 그 반대의 효과를 가질 수 있다. 추가로, 염증 세포 침윤물임 플라크 취약성의 마커인 것으로 보인다. 수개의 인자, 예로서, 산화된 지질단백질, 감염체, 또는 자가항원, 예로서, 열 쇼크 단백질이 죽상경화 플라크에서 만성 염증 반응을 자극할 수 있다. 이어서, 플라크내로 활성화된 대식세포와 T 림프구가 유입되고, 이후, 사이토카인 및 기질-분해 단백질이 유입됨으로써 플라크의 결합 조직 구조를 약화시킨다. 기질 금속단백질 분해 효소 및 특정 사이토카인은 플라크 취약성의 발병에 중요한 인자 이다. 취약 플라크 질환의 진단 이후, 상술한 취약 플라크의 특징을 지정하는 치료제를 고안할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 경동맥 동맥벽 내막-중간 두께가 증가된 것인 유의적인 관상 동맥 협착증과 IL-1 유전자형 패턴 2 사이의 연관성을 개시한다. 패턴 2의 존재는 CAD 발병에 대한 위험 인자를 측정함으로써 측정될 수 있다. 이러한 패턴 및 그의 병리생리학적 상관물을 도 4에 도시한다. 연구 결과가 도 5에 요약되어 있는 임상 시험은 유전자 마커와 증후성 관상 동맥 협착증의 존재와의 연관성을 측정하기 위하여 수행되었다. 이러한 임상 시험의 결과는 도 6에 도시하는데, 여기에서, IL-1RN 유전자좌에서 대립유전자 2에 대해 동형접합성인 환자중 약 75%가 유의적인 관상 동맥 협착증을 갖는 것으로 측정되었다.
하나의 실시태양에서, 본 발명은 재협착과 IL-1 유전자형 패턴 3 사이의 연관성을 개시한다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 연구는 패턴 3 유전자형이 재협착에 대한 위험을 약 3-배 증가시키는 것과 관련이 있는 반면, 패턴 2 유전자형의 경우는 위험이 0.5, 패턴 1 유전자형의 경우에는 1.0이라는 것으로 나타낸다. 동일한 연구로부터 얻은 결과를 도시한 도 8은, IL-1RN(+2O18)에서 대립유전자 1에 대해 동형접합성인 대상자중 약 40%는 유의적인 재협착을 갖고, 25%는 표적 혈관 혈관재생을 필요로 한다는 것을 나타낸다.
특정 위험 인자가 병으로 고생하는 환자에게 미치는 효과와, 상술한 심혈관 질환중 하나 및 관련 질병의 발병 사이에는 관계가 있을 수 있고, 위험 인자의 효과와 관련 질병의 진행 사이에도 관계가 있을 수 있다고 이해된다. 근본적인 일배 체형 패턴을 진단하는 것은 특정 질환 또는 질병에 대한 위험 인자의 영향력을 감소시키기 위한 권고를 할 때 또는 시술을 디자인할 때 가이드가 될 수 있다.
예를 들면, 환자의 IL-1 유전자형 패턴은 총 콜레스테롤 수준이 심혈관 질환 및 질병에 미치는 효과와 관련시킬 수 있다. 특정 IL-1 유전자형 패턴의 존재하에 특정 혈청 콜레스테롤 수준이 존재하는 것은 관상 폐색 질병 및 취약 플라크 질병에 대하여 통계학적으로 측정가능한 위험과 관련이 있다. 이러한 연관성을 도 9에 개략적으로 도시한다. 도 10에는 상기 연관성을 입증한 몇몇 데이타가 요약되어 있다. 이러한 데이타는, 패턴 1의 존재가, 심지어 낮은 혈청 콜레스테롤의 존재하에서도 취약 플라크 유형의 현상에 대한 위험의 강한 예언자가 된다는 것을 지시한다. 취약 플라크 유형 현상은 또한, 혈청 콜레스테롤 수준과 강한 상관관계가 있기는 하지만, 패턴 2를 갖는 환자에서도 관찰된다. IL-1 유전자형 패턴 2의 일반적인 연관성은 도 11에 개략적으로 요약되어 있다.
본 발명의 방법 및 키트를 사용하여 IL-1 유전자형 패턴을, 폐색 CAD에 대한 교차비를 측정하기 위하여 대상자의 Lp(a) 수준과 관련시킬 수 있다. 콜레스테롤은 지질단백질 입자 형태로 체액으로 수송된다. 이들 응집체의 단백질 성분은 특이적인 세포-표적능을 갖는다. 각 지질단백질 입자는 밀도에 따라 분류되고, 1) 주종의 지질 코어, 및 2) 입자 쉘인 특이적인 아포지질단백질을 포함한다. 예를 들면, LDL은 아포지질단백질 B-100 쉘과 함께 콜레스테롤 코어를 갖는다. 지질단백질(a)[Lp(a): Lipoprotein(a)]은 LDL과, 플라스미노겐을 모사하는 단백질 쇄를 함유하는 지질단백질이다. Lp(a)는 섬유소에 대한 플라스미노겐 및 tPA의 결합을 간 섭하고, 플라스미노겐 활성제 저해제(PAT: plasminogen activator inhibitor) 합성을 자극하는 것으로 보인다. 연구는 Lp(a)와 관상 동맥 질병(CAD) 사이의 관계를 보여준다. IL-2 유전자형 패턴 대 Lp(a) 농도의 측정이 패턴 2 환자에서 증후성 관상 동맥 협착증과 Lp(a) 수준 사이의 관계를 나타내며, 이는 도 12에 도시되어 있다. IL-1B(-511) 대립유전자 2에 대하여 동형접합성인 환자는 낮은 Lp(a) 수준에도 불고하고, 증후성 협착증에 대한 위험이 현저히 증가되어 있다. 도 13은 LDL 상승과 관상 동맥 폐색에 대한 위험 사이의 관계를 나타내는데, 이는 패턴 2와 혈청 지질 수준의 상승 사이의 상호 관계를 지시한다.
본 발명의 방법 및 키트를 사용하여 C-반응성 단백질(CRP: C-reactive protein) 수준을 IL-1 유전자형 패턴에 관련시킬 수 있다. IL-1B(+3954)에서 대립유전자 2에 대하여 동형접합성인 패턴 1 대상자중 50% 초과는 0.20 초과의 CRP를 갖는 것으로 밝혀진 반면, IL-1B(+3954)에서 대립유전자 1에 대하여 동형접합성인 패턴 2 대상자는 동 시점의 단지 약 28%만이 0.20 초과의 CRP를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이러한 데이타는 도 14에 도시한다.
4.3 예측 의약
4.3.1 심혈관 질환과 관련된 다형태
본 발명은 적어도 부분적으로는 대상자에서 심혈관 질환의 발병과 관련된(통계학적으로 유의적인 정도로) 대립유전자의 동정에 기초한다. 그러므로, 대상자에서 이러한 대립유전자를 단독으로 또는 또다른 수단과 함께 검출하는 것은 대상자가 심혈관 질환에 걸렸는지, 또는 심혈관 질환의 발병에 대한 소인이 있는지를 지 시한다. 예를 들면, 하기 실시예에 나타내는 바와 같이, 관상 동맥 질환 또는 혈관 폐색에 의해 유발된 다른 혈관 질환의 발병에 대한 소인과 관련된 IL-1 다형태 대립유전자는 IL-1B(-511) 대립유전자 2, IL-1RN(VNTR) 대립유전자 2, IL-1RN(+2018) 대립유전자 2, IL-1A(+4845) 대립유전자 1 또는 IL-1B(+3954) 대립유전자 1 또는 전술한 대립유전자중 하나와 연관 비평형 상태에 있는 대립유전자를 포함한다.
본 발명은 또한 취약 플라크의 파열에 의해 유발된 심혈관 질환에 대한 소인 또는 보다 큰 위험과 관련된 IL-1 다형태 대립유전자를 개시한다. 이는 IL-1A(+4845) 대립유전자 2, IL-1B(+3954) 대립유전자 2, IL-1B(-511) 대립유전자 1, 및 IL-1RN(+2018) 대립유전자 1 또는 전술한 대립유전자중 하나와 연관 비평형 상태에 있는 대립유전자를 포함한다. 이러한 패턴은 또한 중증의 성인 치주염에 대한 위험이 증가되었다는 것과도 관련이 있다.
예를 들면, IL-1B(-511) 대립유전자 2 및 IL-1RN(VNTR) 대립유전자 2는 서로 연관 비평형에 있고, IL-1(44112332) 일배체형을 정의한 다수의 다른 IL-1 다형태와 연관 비평형에 있다[Cox, et al. (1998) Am. J. Hum. Genet. 62: 1180-88]. 특히, 44112332 일배체형은 하기 유전자를 포함한다:
IL-1A의 222/223 마커의 대립 유전자 4 IL-1A의 gz5/gz6 마커의 대립 유전자 4 IL-1A의 -889 마커의 대립 유전자 1 IL-1B의 +3954 마커의 대립 유전자 1 IL-1B의 -511 마커의 대립 유전자 2 gaat.p33330 마커의 대립 유전자 3 Y31 마커의 대립 유전자 3 IL-1R의 VNTR 마커의 대립 유전자 2
따라서, 본 발명의 대체 실시태양에서, IL-1A의 222/223 마커, IL-1A의 gz5/gz6 마커, IL-1A의 -889 마커, IL-1B의 +3954 마커, IL-1B/IL-1RN 유전자간 영 역의 gaat.p33330 마커, 또는 IL-1B/IL-1RN 유전자간 영역의 Y31 마커에서의 유전자형 분석을 측정하고, IL-1A의 222/223 마커의 대립 유전자 4, IL-1A의 gz5/gz6 마커의 대립 유전자 4, IL-1A의 -889 마커의 대립 유전자 1, IL-1B의 +3954 마커의 대립 유전자 1, gaat.p33330 마커의 대립 유전자 3, 또는 Y31 마커의 대립 유전자 3의 존재는 심혈관 질환, 특히 동맥 폐색에 의해 유발된 질환의 발병 가능성이 증가되었음을 지시한다. 특정 실시태양에서, 폐색 질병에 대한 소인을 진단하는 것은 폐색 임상적 사건의 발병률 증가와 관련된 생활양식 인자를 변형시킬 수 있거나, 폐색 증상 또는 증세의 위험을 감소시키는 치료 양식을 도입시킬 수 있다. 다른 실시태양에서, 폐색 질병에 대한 소인을 진단하는 것은 의사로 하여금 진단하기 어려운 질병, 예로서, 장 협심증, 신장혈관 고혈압 및 동맥 협착증이 본 증상 및 증세의 원인이 될 수 있는 것인 다른 상태에 대하여 설명하도록 주의를 줄 수 있다.
추가로, 엑손 2(8006)(8006에서 GenBank:X64532)으로도 지칭되는 IL-1RN(+2018) 다형태의 대립유전자 2[Clay et al. (1996) Hum Genet 97: 723-26]는 44112332 인간 일배체형의 일부분인 IL-1RN(VNTR) 다형태 유전자좌 대립유전자 2와 연관 비평형에 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, IL-1RN(+2018) 유전자좌(즉, +2018의 C) 대립유전자 2는 44112332 일배체형과 관련된 대립유전자 변이체이고, 그러므로, 개체에서 혈관 질환이 발병될 가능성을 결정하는 예후적 유전자형 분석에 대한 대체 표적을 제공한다. 유사하게, IL-1RN 교호 엑손(엑손 lic, 유전자 산물의 세포내 형태를 생성한다)내 3개의 다른 다형태는 IL-1RN(VNTR)의 대립유전자 2와 연관 비평형에 있다[Clay et al, (1996) Hum Genet 97: 723-26]. 이들은 IL- 1RN 엑손 lic(1812) 다형태(1812에서 GenBank:X77090); IL-1RN 엑손 lic(1868) 다형태(1868에서 GenBank:X77O9O); 및 IL-1RN 엑손 lic(1887) 다형태 (1887에서 GenBank:X77090)을 포함한다. 추가로, 상기 유전자의 선택적으로 스플라이싱된 세포내 형태를 위한 프로모터내 추가의 또다른 다형태인 Pic(1731) 다형태(1731에서 GenBank:X77090)도 IL-1RN(VNTR) 다형태 유전자좌의 대립유전자 2와 연관 비평형에 있다[Clay et al, (1996) Hum Genet 97: 723-26]. 이들 IL-1RN 다형태 유전자좌 각각에 대해 상응하는 서열 교호부는 다음과 같다.
대립유전자 번호 엑손 2 (IL-1RN의 +2018) 엑손 1ic-1 (GB:X77090의 1812) 엑손 1ic-2 (GB:X77090의 1868) 엑손 1ic-3 (GB:X77090의 1887) Pic (GB:X77090의 1731)
1 T G A G G
2 C A G C A
이들 다형태 유전자좌 각각에 있어서, 대립유전자 2 서열 변이체는 IL-1RN(VNTR) 유전자의 대립유전자 2와 연관 비평형인 것으로 측정되었다[Clay et al, (1996) Hum Genet 97: 723-26].
유사하게, 취약 플라크 질병의 발병에 대한 위험이 증가되었다는 것과 관련된 33221461은 하기 유전자형을 포함한다:
IL-1A의 222/223 마커의 대립 유전자 3 IL-1A의 gz5/gz6 마커의 대립 유전자 3 IL-1A의 -889 마커의 대립 유전자 2 IL-1B의 +3954 마커의 대립 유전자 2 IL-1B의 -511 마커의 대립 유전자 1 gaat.p33330 마커 의 대립 유전자 4 Y31 마커의 대립 유전자 6
IL-1RN의 +2018의 대립 유전자 1
IL-1A의 +4845의 대립 유전자 2
IL-1RN의 VNTR 마커의 대립 유전자 1
본 발명의 대체 실시태양에서, IL-1A의 -889 마커, IL-1B/IL-1RN 유전자간 영역의 gaat.p33330 마커, IL-1B/IL-1RN 유전자간 영역의 Y31 마커에서의 유전자형 분석을 측정하고, IL-1A의 -889 마커의 대립 유전자 1, gaat.p3330 마커의 대립 유전자 4, 또는 Y31 마커의 대립 유전자 6의 존재는 심혈관 질환, 특히 취약 플라크 질환의 위험이 증가되었음을 지시한다. 이러한 질환은 혈전증 및 색전 형성을 통해 임상적 사건을 일으킬 수 있다. 종종 임상적 사건은 앞서 허혈 증세로 예고되지 않는다. 본원에 개시한 바와 같이 만성 허혈은 취약 플라크 질병보다는 폐색 심혈관 질환과 더 관련되어 있다. 파국적 임상적 사건에 대한 소인에 관하여 조기 검출하는 것이 현 진단학상의 의료에 필요한 모든 설비에 유의적으로 부가될 것이다. 뇌혈관 순환에서 취약 플라크 임상적 사건은 대뇌 혈관을 차단시키고 비가역적 뇌 경색증을 일으킬 수 있는 급성 허혈을 유발함으로써 뇌졸증 또는 CVA를 유발할 수 있다. 심근 순환에서 취약 플라크 임상적 사건은 관상 혈관을 차단시키고 비가역적 심근 손상을 일으킬 수 있는 급성 허혈을 유발함으로써 심근경색을 유발할 수 있다. 비-대뇌 말초 맥관에서 취약 플라크 임상적 사건은 허혈의 돌연 발병을 일으켜 괴저 및 조직 손실을 일으킬 수 있다. 이들 취약 플라크 임상적 사건은 사전 경고없이 발생할 수 있기 때문에 위험이 증가되었다는 것과 관련된 유전자형을 동정하는 것이 이들 위험 상태에 있는 대상자의 임상적 모니터를 증가시킬 수 있고, 함께 보다 빠르고 보다 광범위하게 진단학적 또는 치료학적 시술을 가능케한다. 또다른 실시태양에서, 이는 또한 중증의 성인 치주염에 대한 위험이 증가되었다는 것도 지시한다. 추가의 또다른 실시태양에서, 중증의 성인 치주염이 존재하는 것은 취약 플라크 질병에 대한 위험이 증가되었다는 것을 지시한다.
상술한 대립유전자 패턴 이외에, 본원에 기술한 바와 같이, 당업자는 심혈관 질환와 관련된 대립유전자와 연관 비평형에 있는 다른 대립유전자(다형태 및 돌연변이를 포함한다)를 용이하게 동정할 수 있다. 예를 들면, 심혈관 질환을 앓지 않는 제1 군의 대상자로부터 유래한 핵산 샘플 뿐만 아니라, 심혈관 질환을 앓는 제2 군의 대상자로부터 유래한 DNA를 수집할 수 있다. 이어서, 상기 핵산 샘플을 비교하여 제1 군과 비교시 제2 군에 과도하게 나타난 대립유전자를 동정할 수 있는데, 이때 상기 대립유전자들은 아마도 심혈관 질환과 관련되어 있을 것이다. 별법으로, 심혈관 질환 관련 대립유전자와 연관 비평형에 있는 대립유전자는 예를 들면 대형 집단의 유전형을 분석하고 통계학적 분석을 수행하여 대립유전자가 예상보다 더 공통적으로 함께 나타나는가를 측정함으로써 동정할 수 있다. 바람직하게는, 상기 군은 유전적으로 관련된 개체를 포함하는 것으로 선택된다. 유전적으로 관련된 개체는 동일한 종, 동일한 인종군 또는 심지어 동일한 가계로부터 유래하는 개체를 포함한다. 대조군과 시험군 사이의 유전적 연관성의 정도가 증가함에 따라, 발병 대립유전자에 더 멀리 떨어져서 연관된 다형태 대립유전자의 예측값도 증가한다. 그 이유는 덜 경과된 진화 시간이 선조군 내에서 염색체를 따라 연관된 다형태의 유전적 교차 사건을 통해 재분배를 가능하게 하기 때문이다. 따라서, 종-특이성, 인종-특이성 및 가계-특이성 진단 유전형 분석법이 개발되어, 예를 들면 주 인간 종의 발산후, 인간 집단의 구별되는 인종군으로의 분리후, 및 특정 가계의 최근 내력에서 최근의 인간 진화에서 발생한 질병 대립유전자의 검출이 가능하게 되었다.
두개의 다형태 마커 또는 하나의 다형태 마커와 발병 돌연변이 사이의 연관 비평형은 준안정 상태이다. 선택적 압력 또는 근복적인 돌연변이 사건의 산발적인 관련 재발이 없으면, 다형태는 염색체 재조합 사건에 의해 결국은 단절될 것이며, 인간 진화 과정을 통해 연관 평형에 도달할 것이다. 따라서, 질병 또는 용태와 연관 비평형 상태에 있는 다형태 대립유전자를 발견할 수 있는 가능성은 2가지 이상의 요인: 즉, 다형태 마커와 발병 돌연변이 사이의 물리적인 거리의 감소 및 연관된 쌍의 분리를 위해 사용할 수 있는 감수분열 세대 수의 감소의 변화에 따라 증가할 수 있다. 후자의 요인을 고려하는 것은 두 개체가 더 밀접하게 관련되어 있을수록, 이들이 연관된 다형태를 함유하는 공통적인 모 염색체 또는 염색체 영역을 더 공유할 것이며, 이 연관된 쌍은 감수분열성 교차 사건이 발생하는 각 세대를 통해 덜 연관될 것이라는 것을 암시한다. 결과적으로, 두 개체가 더 밀접하게 관련되어 있을수록, 넓게 배치된 다형태가 더 동시유전될 수 있다. 따라서, 공통적인 종, 인종군 또는 가계에 의해 관련된 개체에 있어서, 더욱 더 넓게 배치된 다형태 유전자좌의 신뢰성은 연관된 발병 돌연변이의 유전의 지표에 의존할 수 있다.
본 발명에 따른 키트의 하나의 실시태양에 존재하는 올리고뉴클레오티드는 관심의 대상이 되는 영역을 증폭시키는데 사용될 수 있거나, 당해 마커에 대한 직접적인 대립유전자 특이성 올리고뉴클레오티드(ASO) 혼성화를 위해 사용될 수 있다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 관심의 대상이 되는 마커 측면에 위치하거나(PCR 증폭에 필요), 마커와 직접 중첩될 수 있다(ASO 혼성화에서). 상술한 검출 방법에서 사용하기에 적절한 프라이머의 일례로는:
5'-CTCAGCAACACTCCTAT-3' (서열번호: 1);
5'-TCCTGGTCTGCAGGTAA-3' (서열번호: 2);
(이는 인간 IL-1RN(VNTR) 다형태 유전자좌를 증폭시키고 형을 분석하는데 사용될 수 있다);
5'-CTA TCT GAG GAA CAA CCA ACT AGT AGC-3' (서열번호: 3);
5'-TAG GAC ATT GCA CCT AGG GTT TGT-3' (서열번호: 4);
(이는 인간 IL-1RN(+2018) 다형태 유전자좌를 증폭시키고 형을 분석하는데 사용될 수 있다);
5' TGGCATTGATCTGGTTCATC 3' (서열번호: 5);
5' GTTTAGGAATCTTCCCACTT 3' (서열번호: 6);
(이는 인간 IL-1B(-511) 다형태 유전자좌를 증폭시키고 형을 분석하는데 사용될 수 있다);
5' CTC AGG TGT CCT CGA AGA AAT CAA A 3' (서열번호: 7);
5' GCT TTT TTG CTG TGA GTC CCG 3' (서열번호: 8);
(이는 인간 IL-1B(+3954) 다형태 유전자좌를 증폭시키고 형을 분석하는데 사용될 수 있다); 및
5' ATG GTT TTA GAA ATC ATC AAG CCT AGG GCA 3' (서열번호: 9)
3' AAT GAA AGG AGG GGA GGA TGA CAG AAA TGT 3' (서열번호: 10)
(이는 인간 IL-1A(+4845) 다형태 유전자좌를 증폭시키고 형을 분석하는데 사용될 수 있다)을 포함한다.
적절한 프로브는 IL-1 유전자좌의 특이적인 유전자, 예로서, IL-1A, IL-1B 또는 IL-1RN 또는 관련 유전자에 혼성화하도록 디자인될 수 있다. 별법으로, 이들 프로브는 유전자간 서열을 포함하는 관련 게놈 유전자좌의 다른 영역에 혼입될 수 있다. 실제로, 인간 염색체 2의 IL-1 영역은 400,000 염기쌍에 달하고, 평균적으로 매 1,000 염기쌍 당 하나의 단일 뉴클레오티드 다형태를 포함하여 단독으로 400 SNP를 포함한다. 그러나, 본 발명에 사용할 수 있는 다른 다형태는 다양한 공공 공급처로부터 얻을 수 있다. 예를 들면, 인간 게놈 데이터베이스는 유전자간 SNPs를 수집하고, 서열에 의해 검색되며, 현재 대략 2,700개의 입력 정보를 함유하고 있다(http://base.interactiva.de). 또한, 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 (Massachusetts Institute of Technology)에서 관리되는 인간 다형성 데이터베이스((MIT SNP 데이터베이스 (http://www.genome.wi.mit.edu/SNP/human/index.html))도 이용가능하다. 이러한 공급처로부터 SNPs 뿐만 아니라, 다른 인간 다형성을 발견할 수 있다.
예를 들면, 이들 데이타베이스중 임의의 하나에서 인간 게놈의 IL-1 영역의 조사를 통해 IL-1 유전자좌 유전자가 127.4 cM에서 초위성체 마커 AFM22Oze3로 지정된 동원체 인접 다형태 마커(centiMorgans)(진뱅크 기탁 번호 Z17008을 참조할 수 있다) 및 127.9 cM에서 초위성체 고정 마커 AFMO87Xal로 지정된 이격 다형성 마커(진뱅크 기탁 번호 Z16545를 참조할 수 있다)와 측면에 위치하는 것을 확인하였다. 이들 인간 다형태 유전자좌는 둘 모두 CA 디뉴클레오티드 반복 초위성체 다형태이고, 인간 집단에서 높은 정도의 이형접합도를 나타낸다. 예를 들면, AFM22Oze3 의 한 대립유전자는 서열이 TGTACCTAAGCCCACCCTTTAGAGC(서열 번호: 14)인 5' 프라이머와 서열이 TGGCCTCCAGAAACCTCCAA(서열 번호: 15)인 3' 프라이머를 이용하여 211 bp PCR 증폭 산물을 생성한다. 추가로, AFMO87xal의 한 대립유전자는 서열이 GCTGATATTCTGGTGGGAAA(서열 번호: 16)인 5' 프라이머와 서열이 GGCAAGAGCAAAACTCTGTC(서열 번호: 17)인 3' 프라이머를 이용하여 177 bp PCR 증폭 산물을 생성한다. 이들 인간 염색체 2 CA 디뉴클레오티드 반복 다형태의 5' 및 3'에 발생하는 독특한 서열에 상응하는 등가의 프라이머는 당업자에게는 명백할 것이다. 이상적인 등가의 프라이머는 약 1 kb의 지정된 프라이머내에 혼성화하며 추가로 약 17 bp 내지 약 27 bp중 임의의 위치에 존재하는 것을 포함한다. 독특한 인간 염색체 게놈 서열의 증폭을 위한 프라이머를 디자인하기 위한 일반 가이드라인은 프라이머가 약 50 ℃ 이상의 융점을 갖고, 근사 융점이 식 T용융 = [2 x (A 또는 T의 수) + 4 x (G 또는 C의 수)]을 사용하여 추정될 수 있다는 것이다.
다수의 다른 인간 다형태 유전자좌는 이들 2개의 CA 디뉴클레오티드 반복 다형태 사이에서 발생하며, 유전적으로 관련된 개체의 가계 또는 다른 군에서 심혈관 질환 예후 대립유전자를 측정하기 위한 추가의 표적을 제공한다. 예를 들면, 내쇼날 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션 웹 사이트(www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/)는 IL-1 유전자좌의 상기 영역내 다수의 다형태 마커 목록을 제공하며, 이들 마커의 증폭 및 분석을 위해 적절한 프라이머를 디자인하는데 필요한 가이드라인을 제공한다.
따라서, 본 발명의 뉴클레오티드 분절은 그들의, 인간 염색체 2q 12-13 또는 cDNAs의 상보적 신장을 갖는 이중체 분자를 그 영역으로부터 선택적으로 형성하거나, 이 영역으로부터 DNA 또는 cDNA 증폭용 프라이머를 제공하는 능력에 대하여 사용될 수 있다. 이 목적을 위해 적절한 프로브 디자인은 다수의 인자를 고려해야 한다. 예를 들면, 길이가 10, 15 또는 18 뉴클레오티드 내지 약 20 또는 약 30 뉴클레오티드인 단편이 특히 유용할 것이다. 더 긴 서열, 예컨대, 40, 50, 80, 90, 100 뉴클레오티드, 심지어 전장 서열이 특정 실시태양을 위해 더욱더 바람직하다. 적어도 약 18 내지 20 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드의 길이는 당업자에 의해 충분히 특이적인 혼성화를 가능하게 하기에 충분하며, 분자 프로브로서 유용한 것으로 받아들여진다. 추가로, 적용 분야에 따라, 표적 서열을 향하는 프로브의 다양한 선택도를 획득하기 위해 다양한 혼성화 조건을 사용할 수 있을 것이다. 예를 들면, 상대적으로 낮은 염 및/또는 고온 조건, 예로서, 약 50□C 내지 약 70□C에서 0.02M-0.15M NaCl의 조건을 사용할 수 있다. 이러한 선택적인 조건은 프로브와 주형 또는 표적 스트랜드 사이에 미스매치를 거의 용인하지 않을 수 있다.
다른 대립유전자 또는 혈관 질환의 다른 징후는 예를 들면, 혈관벽 두께(예컨대, 초음파에 의해 측정)를 알아냄으로써, 또는 대상자가 흡연하는지, 음주하는지, 과체중인지, 스트레스를 받는지, 콜레스테롤이 높거나 콜레스테롤이 낮은지, 또는 Lp(a)가 높은지, 또는 운동하는지 여부를 알아냄으로써 상기한 대립유전자의 검출과 함께 대상자에서 검출하거나 또는 모니터링할 수 있다.
4.3.2 대립유전자 검출
인간 다형태 유전자좌에서 특이적인 대립유전자를 검출하기 위해 다수의 방법을 사용할 수 있다. 특이적인 대립유전자를 검출하기 위한 바람직한 방법은 다형태의 분자 특성에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들면, 다형태 유전자좌의 여러 대립유전자 형태는 DNA의 단일 염기쌍에 의해 달라질 수 있다. 그러한 단일 뉴클레오티드 다형태(또는 SNP)는 유전적 변이에 대한 주요 원인인데, 알려진 모든 다형태의 80%를 차지하며, 인간 게놈 내에서 그들의 밀도는 1000 염기쌍 당 평균 1로 산정된다. (DNA에서 발생하는 4개의 상이한 뉴클레오티드 염기에 상응하는 4개 이하의 상이한 SNP 형태가 이론상 가능함에도 불구하고) SNP는 단지 2개의 상이한 형태로 가장 빈번하게 이대립유전자성으로 발생하는 것이다. 그럼에도 불구하고, SNP는 다른 다형태에 비해 돌연변이적으로 더 안정하며, 마커와 미지의 변이체 사이의 연관 비평형이 발병 돌연변이를 지도화하기 위해 사용되는 회합 연구에 적합하다. 추가로, SNP는 전형적으로 단지 2개의 대립유전자를 보유하기 때문에, 이들은 길이 측정보다 단순한 +/- 분석법에 의해 유전형을 분석할 수 있으며, 자동화에 더 효과적이다.
다양한 방법들이 개체의 특정 단일 뉴클레오티드 다형태 대립 유전자의 존재를 검출하는데 이용될 수 있다. 이 분야에서의 진보는 정확하고 용이하고 저렴한 대규모 SNP 유전자형 분석을 제공하였다. 가장 최근, 예를 들면, 동적 대립유전자-특이적 혼성화(DASH: dynamic allele-specific hybridization), 마이크로플레이트 어레이 대각선 겔 전기영동(MADGE: microplate array diagonal gel electrophoresis), 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 올리고뉴클레오티드-특이적 결찰, 테크만(TaqMan) 시스템 뿐만 아니라 다양한 DNA "칩" 기술, 예로서, 에피메트릭스(Affymetrix) SNP 칩을 비롯한 수개의 신규한 기술들이 기술되었다. 이들 방법은 전형적으로 PCR에 의한 표적 유전적 영역의 증폭을 필요로 한다. 새롭게 개발된 다른 방법은 침습성 절단에 이어지는 질량 분광법 또는 고정화된 패드록 프로브 및 롤링-서클 증폭에 의한 작은 신호 분자의 생성에 기초하는데, 이 방법은 결국은 PCR의 필요성을 제거한다. 특이적인 단일 뉴클레오티드 다형태를 검출하기 위한 당업계에 공지된 수개의 방법에 대해서는 하기에 요약한다. 본 발명의 방법은 사용할 수 있는 모든 방법을 포함하는 것으로 이해된다.
단일 뉴클레오티드 다형태의 분석을 용이하게 하기 위해 수개의 방법이 개발되었다. 한 실시태양에서, 단일 염기 다형태는 예컨대, 미국 특허 번호 제4,656,127호(Mundy, C.R.)에 개시된 바와 같이 특정화된 엑소뉴클레아제-내성 뉴클레오티드를 이용하여 검출할 수 있다. 상기 방법에 따르면, 다형태 위치에 대해 바로 3' 대립유전자 서열에 상보적인 프라이머는 특정 동물 또는 인간으로부터 얻은 표적 분자에 혼성화할 수 있다. 표적 분자상의 다형태 위치가 존재하는 특정 엑소뉴클레아제-내성 뉴클레오티드 유도체에 상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 경우, 상기 유도체는 혼성화된 프라이머의 단부 상에 혼입될 것이다. 이러한 혼입은 프라이머가 엑소뉴클레아제에 내성을 갖게 하며, 결과적으로 그의 검출을 가능하게 한다. 상기 샘플의 엑소뉴클레아제-내성 유도체의 아이덴티티가 공지되어 있기 때문에, 프라이머가 엑소뉴클레아제에 대해 내성이라는 발견은 표적 분자의 다형태 위 치 내에 존재하는 뉴클레오티드가 상기 반응에 사용된 뉴클레오티드 유도체의 뉴클레오티드에 상보적이라는 것을 지칭한다. 이 방법은 다량의 외부 서열 데이타의 측정이 필요하지 않다는 장점이 있다.
본 발명의 또다른 실시태양에서, 용매계 방법을 이용하여 다형태 위치의 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정할 수 있다(프랑스 특허 2,650,840; PCT 국제 공개 W091/02087)(Cohen, D. et al.). 미국 특허 특허 번호 제4,656,127호(Mundy)의 방법처럼, 다형태 위치의 바로 3' 대립유전자 서열에 상보적인 프라이머를 사용한다. 상기 방법은 다형태 위치의 뉴클레오티드에 상보적인 것이 프라이머 말단으로 혼입되게 되는 경우, 표지된 디데옥시뉴클레오티드 유도체를 사용하여 그 위치의 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정한다.
제네틱 비트 어넬리시스(Genetic Bit Analysis) 또는 GBA™으로 알려진 대체 방법이 PCT 출원 92/15712(Goelet, P. et al.)에 의해 기재되어 있다. (Goelet, P. et al.) 등의 방법은 표지된 종결제 및 다형태 부위에 대해 서열 3'에 상보적인 프라이머의 혼합물을 사용한다. 따라서, 혼입되는 표지된 종결제는 평가되는 표적 분자의 다형태 부위에 존재하는 뉴클레오티드에 의해 측정되며, 상기 뉴클레오티드에 상보적이다. (프랑스 특허 2,650,840; PCT 국제 공개 W091/02087)(Cohen, D. et al.)의 방법과는 대조적으로, (Goelet, P. et al.)의 방법은 불균일 상 분석법이며, 이때 프라이머 또는 표적 분자는 고체상에 고정화된다.
최근, DNA 내에서 다형태 위치를 분석하기 위한 수개의 프라이머 유도된 뉴클레오티드 혼입 과정은 문헌에 기재되어 있다([Konter, J. S. et al., Nuci. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989)]; [Sokolov, B. P., NucI. Acids Res. 18:3671 (1990)]; [Syvanen, A. -C. et al., Genomics 8:684-692 (1990)]; [Kuppuswamy, M. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 88:1143-1147 (1991)]; [Prezant, T. R. et al., Hum. Mutat. 1:159-164 (1992)]; [Ugozzoli, L. et al., GATA 9:107-112 (1992)]; [Nyren, P. et al., Anal. Biochem. 208:171-175 (1993)]). 이들 방법은 모두 다형태 위치에서 염기들 사이를 구분하기 위해 표지된 데옥시뉴클레오티드의 혼입에 의존한다는 점에서 GBA™와 다르다. 이러한 포맷에서, 신호는 혼입된 데옥시뉴클레오티드의 수에 비례하기 때문에, 동일한 뉴클레오티드의 런(run)에서 발생하는 다형태는 상기 런의 길이에 비례하는 신호를 생성할 수 있다[Syvanen, A. -C. et al., Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59(1993)].
단백질 번역을 조기에 종결시키는 돌연변이에 있어서, 단백질 절단 시험(PTT: protein truncation test)은 효율적인 진단 접근법을 제공한다([Roest et al., (1993) Hum . Mol. Genet. 2:1719-21]; [van der Luijt et al., (1994) Genomics 20:14]). PTT에 있어서, RNA를 먼저 이용할 수 있는 조직으로부터 단리시키고, 역전사시키고, 관심의 대상이 되는 분절은 PCR로 증폭시킨다. 이어서, 역전사 PCR의 산물을 네스티드(nested) PCR 증폭에 대한 주형으로서, RNA 중합효소 프로모터 및 진핵 번역 개시용 서열을 함유하는 프라이머와 함께 사용한다. 관심의 대상이 되는 영역 증폭후, 프라이머로 혼입된 독특한 모티프는 PCR 산물의 순차적인 시험관내 전사 및 번역이 일어나게 한다. 번역 산물의 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동시, 절단된 폴리펩티드의 출현은 번역의 조기 종결을 일으키는 돌연변이의 존재를 신호로 전달한다. 이러한 기법의 변형으로, DNA(RNA에 대향하는 것으로서)는, 관심의 대상이 되는 표적 영역이 단일 엑손으로부터 유도되는 경우, PCR 주형으로서 사용된다.
임의의 세포 유형 또는 조직을 이용하여 본원에 기술된 진단학에서 사용하기 위한 핵산 샘플을 수득할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 상기 DNA 샘플은 공지된 기법(예컨대, 정맥천자)을 이용하여 체액, 예컨대, 혈액 또는 타액으로부터 수득한다. 별법으로, 핵산 시험은 건성 샘플(예컨대, 모발 또는 피부)에 대해 수행될 수 있다. RNA 또는 단백질을 사용하는 경우, 사용할 수 있는 세포 또는 조직은 IL-1 유전자를 발현하여야 한다.
또한, 진단 과정은 생검 또는 적출로부터 얻은 환자 조직의 조직 절편(고정 조직 절편 및/또는 동결 조직 절편)에 대해 계내에서 직접 수행될 수 있으며, 핵산 정제는 불필요하다. 핵산 시약은 상기한 바와 같은 계내 과정을 위한 프로브 및/또는 프라이머로서 사용될 수 있다(예를 들면, [Nuovo, G.J., 1992, PCR in situ hybridization: protocols and applications, Raven Press, NY]를 참조할 수 있다).
하나의 핵산 서열의 검출에 주로 초점을 맞춘 방법 외에, 프로파일은 이러한 검출 방식에서도 평가될 수 있다. 핑거프린트 프로파일은 예를 들면, 차별적 디스플레이 방법, 노던 분석 및/또는 RT-PCR을 이용하여 생성할 수 있다.
바람직한 검출 방법은 IL-1 전-염증성 일배체형의 하나 이상의 대립유전자의 한 영역과 중첩하고 돌연변이 영역 또는 다형태 영역 주위에 약 5, 10, 20, 25 또 는 30개의 뉴클레오티드를 보유하는 프로브를 이용하는 대립유전자 특이적인 혼성화이다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 심혈관 질환에 관여하는 다른 대립유전자 변이체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 수개의 프로브는 고체상 지지체, 예컨대, "칩"(약 250,000개 이하의 올리고뉴클레오티드를 수용할 수 있다)에 부착된다. 올리고뉴클레오티드는 리소그래피를 비롯한 여러 과정에 의해 고형 지지체에 결합시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이들 칩을 이용하는 돌연변이 검출 분석은 "DNA 프로브 어레이"라고도 칭하는데, 이는 예컨대, [Cronin et al., (1996) Human Mutation 7:244)에 기재되어 있다. 한 실시태양에서, 칩은 한 유전자의 하나 이상의 다형태 영역의 모든 대립유전자 변이체를 포함한다. 이어서, 고형상 지지체를 시험 핵산과 접촉시키고, 특이적인 프로브에 대한 혼성화를 검출한다. 따라서, 하나 이상의 유전자의 다수의 대립유전자 변이체의 아이덴티티는 간단한 혼성화 실험으로 확인할 수 있다.
이러한 기법은 또한 분석 이전에 핵산을 증폭시키는 단계를 포함할 수도 있다. 증폭 기법은 당업자에게 공지되어 있으며, 이는 클로닝, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 특이적인 대립유전자의 중합효소 연쇄 반응(ASA), 리가제 연쇄 반응(LCR), 네스티드 중합효소 연쇄 반응, 자가 지지된 서열 복제[Guatelli, J.C. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878], 전사 증폭 시스템[Kwoh, D.Y. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177] 및 Q-베타 복제효소[Lizardi, P.M. et al., 1988, Bio/Technology 6:1197]를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
증폭 산물은 크기 분석, 제한 분해후 크기 분석, 반응 산물내에서 특이적인 태깅된 올리고뉴클레오티드 프라이머의 검출, 대립유전자 특이성 올리고뉴클레오티드(ASO) 혼성화, 대립유전자 특이성 5' 엑소뉴클레아제 검출, 서열분석, 혼성화 등을 비롯한 다양한 방법으로 분석될 수 있다.
PCR 기초 검출 수단은 동시에 다수의 마커를 다중 증폭시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 크기가 중첩되지 않고 동시에 분석될 수 있는 PCR 산물을 생성하도록 PCR 프라이머를 선택하는 것은 당업계에 공지되어 있다. 별법으로, 차별적으로 표지되어 각각 차별적으로 검출될 수 있는 프라이머를 사용하여 상이한 마커를 증폭시킬 수 있다. 물론, 혼성화 기초 검출 수단은 샘플에서 다중 PCR 산물을 차별적으로 검출할 수 있게 한다. 다른 기술들이 당업계에 공지되어 있어 다수의 마커의 다중 분석이 가능하다.
단지 예시적인 실시태양에서, 본 방법은 (i) 환자로부터 세포의 샘플을 수집하는 단계, (ii) 세포 샘플로부터 핵산(예컨대, 게놈, mRNA 또는 둘 모두)을 단리시키는 단계, (iii) 대립유전자의 혼성화와 증폭이 일어날 수 있는 조건하에서 IL-1 전-염증성 일배체형의 하나 이상의 대립유전자의 5' 및 3'에 특이적으로 혼성화하는 하나 이상의 프라이머와 상기 핵산 샘플을 접촉시키는 단계; 및 (iv) 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 이들 검출 방식은 핵산 분자가 매우 소수로 존재하는 경우에 그 핵산 분자의 검출을 위해 특히 유용하다.
본 분석법의 바람직한 실시태양에서, IL-1 전-염증성 일배체형의 대립유전자는 제한 효소 절단 패턴의 변경에 의해 동정된다. 예를 들면, 샘플 및 대조군 DNA 는 단리시키고, 증폭하고(임의로), 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 단편 길이 크기는 겔 전기영동으로 측정한다.
추가의 또다른 실시태양에서, 당업계에 알려진 임의의 다양한 서열분석 반응을 이용하여 대립유전자의 서열을 직접적으로 분석할 수 있다. 예시적인 서열분석 반응은 (Maxim 및 Gilbert)[(1977) Proc. NatI Acad Sci USA 74:560] 또는 (Sanger)[Sanger et al., (1977) Proc. Nat. Acad. Sci USA 74:5463]에 의해 개발된 기법에 기초한 것들을 포함한다. 또한, 본 분석법의 수행시, 질량 분광법(예를 들면, PCT 출원 국제 공개 WO 94/16101; [Cohen et al., (1996) Adv Chromatogr 36:127-162]; 및 [Griffin et al., (1993) Appl Biochem Biotechnol 38:147-159]를 참조할 수 있다)을 비롯한, 임의의 다양한 자동 서열분석 방법을 이용할 수 있다는 것도 고려한다(예를 들면, [Biotechniques (1995) 19:448]을 참조할 수 있다). 특정 실시태양의 경우, 서열분석 반응에서 오직 하나, 두 개 또는 세 개의 핵산 염기의 출현만을 결정할 것을 필요로 한다는 것이 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들면, 단지 하나의 핵산이 검출되는 경우, A-트랙 등을 수행할 수 있다.
추가의 실시태양에서, 절단 제제(예컨대, 뉴클레아제, 하이드록실아민 또는 사산화오스뮴 및 피페리딘)로부터 보호하여 RNA/RNA 또는 RNA/DNA 또는 DNA/DNA 이종이중체에서 미스매치된 염기를 검출할 수 있다[Myers et al., (1985) Science 230:1242]. 일반적으로, "미스매치 절단"이라는 기법은 야생형 대립유전자를 함유하는 (표지된) RNA 또는 DNA와 상기 샘플을 혼성화시켜 형성된 이종이중체를 제공함으로써 개시된다. 더블-스트랜드 이중체를 예를 들면, 대조군과 샘플 스트랜드 사이의 염기쌍 미스매치로 인해 존재하는 이중체의 싱글-스트랜드 영역을 절단하는 제제로 처리한다. 예를 들면, RNA/DNA 이중체를 RNase로 처리하고, DNA/DNA 하이브리드를 S1 뉴클레아제로 처리하여 미스매치된 영역을 효소적으로 분해시킬 수 있다. 다른 실시태양에서, DNA/DNA 또는 RNA/DNA 이중체는 하이드록실아민 또는 사산화오스뮴로 처리하고 피페리딘으로 처리하여 미스매치된 영역을 분해할 수 있다. 미스매치된 영역의 분해후, 생성된 물질은 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서의 크기에 의해 분리하여 돌연변이 위치를 결정한다. 예를 들면, ([Cotton et al., (1988) Proc. Nati Acad Sci USA 85:4397]; 및 [Saleeba et al., (1992) Methods Euzymol. 217:286-295])를 참조할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 대조군 DNA 또는 RNA는 검출을 위해 표지할 수 있다.
추가의 또다른 실시태양에서, 미스매치 절단 반응은 더블-스트랜드 DNA 내에서 미스매치된 염기쌍을 인식하는 하나 이상의 단백질(소위 "DNA 미스매치 수복" 효소)을 이용한다. 예를 들면, E. 콜라이(E. coli)의 mutY 효소는 G/A 미스매치에서 A를 절단하고, HeLa 세포로부터 유래하는 티미딘 DNA 글리코실라제는 G/T 미스매치에서 T를 절단한다[Hsu et al., (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662]. 예시적인 실시태양에 따라, IL-1 유전자좌 일배체형의 대립유전자에 기초한 프로브는 시험 세포(들)로부터 유래한 cDNA 또는 다른 DNA 산물에 혼성화한다. 상기 이중체를 DNA 미스매치 수복 효소로 처리하고, 존재한다면 절단 산물은 전기영동 프로토콜로부터 검출될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 번호 제5,459,039호를 참조할 수 있다.
다른 실시태양에서, 전기영동 이동도의 변경을 이용하면 IL-1 유전자좌 대립유전자가 동정될 것이다. 예를 들면, 싱글-스트랜드 구조 다형태(SSCP: single strand conformation polymorphism)을 이용하여 돌연변이체 핵산과 야생형 핵산 사이의 전기영동 이동도 차이를 검출할 수 있다([Orita et al., (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA 86:2766], [Cotton (1993) MutatRes 285:125-144]; 및 [Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:73-79]를 참조할 수 있다). 샘플 및 대조군 IL-1 유전자좌 대립유전자의 싱글-스트랜드 DNA 단편은 변성되고 복원될 수 있다. 싱글-스트랜드 핵산의 2차 구조는 서열에 따라 변화하고, 전기영동 이동도에서 생성되는 변화는 심지어 단일 염기 변화의 검출을 가능하게 한다. DNA 단편을 표지화하거나, 표지된 프로브를 사용하여 검출할 수 있다. 검정법의 감도는 (DNA보다는) RNA를 사용함으로써 강화될 수 있으며, 여기서, 2차 구조는 서열 중 변화에 더 민감하다. 바람직한 실시태양에서, 본 대상 방법은 바람직한 실시태양에서, 본 방법은 전기영동 이동도의 변화에 기초하는 이종이중체 분석을 이용하여 더블-스트랜드 이종이중체 분자를 분리한다[Keen et al., (1991) Trends Genet 7:5].
추가의 또다른 실시태양에서, 변성제의 구배를 함유하는 폴리아크릴아미드 겔 내에서 대립유전자의 이동은 변성 구배 겔 전기영동(DGGE: denaturing gradient gel electrophoresis)을 이용하여 분석한다[Myers et al., (1985) Nature 3 13:495]. DGGE를 분석 방법으로 사용하는 경우, 예를 들면, PCR에 의한 고 용융 GC-풍부 DNA의 대략 40 bp의 GC 클램프(clamp)에 의해 DNA는 완전히 변성되지 않게끔 변형될 것이다. 추가의 실시태양에서, 변성제 구배 대신에 온도 구배를 사용하 여 대조군 및 샘플 DNA의 이동도에서의 차이를 확인한다[Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys Chem 265: 12753].
대립유전자를 검출하기 위한 다른 기법의 예로는 선택적인 올리고뉴클레오티드 혼성화, 선택적인 증폭 또는 선택적인 프라이머 연장을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 공지된 돌연변이 또는 뉴클레오티드 차이(예컨대, 대립유전자 변이체에서)가 중앙에 위치하여 완벽한 매치가 확인되는 경우에만 혼성화를 허용하는 조건하에서 표적 DNA에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조할 수 있다([Saiki et al., (1986) Nature 324:163]; [Saiki et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230]). 올리고뉴클레오티드가 PCR 증폭된 표적 DNA에 혼성화할 때에는 그러한 대립유전자 특이성 올리고뉴클레오티드 혼성화 기법을 사용하여 매 반응당 하나의 돌연변이 또는 다형태 영역을 시험할 수 있거나, 올리고뉴클레오티드가 혼성화 막에 부착되고, 표지된 표적 DNA와 혼성화할 때에는 다수의 상이한 돌연변이 또는 다형태 영역을 시험할 수 있다.
별법으로, 선택적 PCR 증폭에 의존하는 대립 유전자 특이적 증폭 기술을 본 발명과 함께 사용할 수 있다. 특이적 증폭에 대한 프라이머로 사용되는 올리고뉴클레오티드는 분자 중심에서(증폭이 차별적인 혼성화에 의존하도록)[Gibbs et al., (1989) Nucleic acids Res. 17: 2437-2448]), 또는 적절한 조건하에서, 미스매치가 중합효소 연장을 방지하거나 감소시킬 수 있는 한 프라이머의 맨 끝 3' 단부[Prossner (1993) Tibtech 11: 238]에 관심의 대상이 되는 돌연변이 또는 다형태 영역을 가질 수 있다. 추가로, 돌연변이의 영역에 신규한 제한 부위를 도입하여 절 단-기초 검출을 생성하는 것이 바람직할 수 있다[Gasparini et al (1992) Mol. Cell 프로브s 6:1]. 특정 실시태양에서, 증폭용 Taq 리가제를 사용하여 증폭을 또한 수행할 수 있을 것으로 예상된다[Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88: 189]). 이러한 경우, 오직 증폭의 존재 또는 부재를 찾음으로써 특이적 위치에서 공지된 돌연변이의 존재를 검출하는 것을 가능하게 하는 5' 서열의 3' 단부에서 완벽한 매치가 존재하는 경우에만 결찰이 일어날 것이다.
또다른 실시태양에서, 대립유전자 변이체의 동정은 예를 들면, 미국 특허 번호 제4,998,617호 및 [Landegren, U. et al., (1988) Science 241:1077-1080]에 기재되어 있는 바와 같은 올리고뉴클레오티드 결찰 검정법(OLA: oligonucleotide ligation assay)을 이용하여 수행된다. 상기 OLA 프로토콜은 표적의 싱글-스트랜드의 인접 서열에 혼성화할 수 있도록 디자인된 2개의 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 상기 올리고뉴클레오티드중 하나는 분리 마커에 연결되어 있고, 예를 들면, 비오티닐화되어 있고, 다른 하나는 검출가능하게 표지되어 있다. 정확한 상보적 서열이 표적 분자 내에서 확인되는 경우, 상기 올리고뉴클레오티드는 그들의 말단이 인접하도록 혼성화하여 결찰 기재를 생성한다. 이어서, 결찰은 표지된 올리고뉴클레오티드가 아비딘 또는 다른 비오틴 리간드를 이용하여 회수될 수 있도록 한다. (Nickerson, D. A. et al.)은 PCR과 OLA의 특성을 조합한 핵산 검출 검정법을 기재하고 있다[Nickerson, D. A. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8923-27]. 이러한 방법에서, PCR을 이용하여 표적 DNA를 지수적으로 증폭시키고, 이어서 OLA를 이용하여 검출한다.
이러한 OLA 방법에 기초한 수개의 기법이 개발되었으며, 이를 이용하여 IL-1 유전자좌 일배체형의 대립유전자를 검출할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 번호 제5,593,826호는 3'-아미노기 및 5'-인산화 올리고뉴클레오티드를 이용하여 포스포르아미데이트 결합을 갖는는 접합체를 형성하는 것에 대해 기술하고 있다. [Tobe et al., (1996) Nucleic Acids Res 24: 3728]에 기술된 OLA의 다른 방법에서, PCR과 병용하는 OLA는 단일 미량역가 웰에서 2개의 대립유전자의 유형 구분을 가능하게 해준다. 독특한 합텐, 즉, 디곡시게닌 및 플루오레세인으로 각각의 대립유전자-특이 프라이머를 마킹함으로써, 각각의 OLA 반응은 상이한 효소 리포터, 알칼리성 포스파타제 또는 호스래디쉬 퍼옥시다제로 표지한 합텐 특이 항체의 사용으로 검출할 수 있다. 이러한 시스템은 2가지 다른 색이 발색되도록 하는 초고속 포맷을 이용하여 2개의 대립유전자가 검출될 수 있도록 한다.
본 발명의 또다른 실시태양은 동맥 폐색에 기인하거나, 취약 플라크 형성에 기인하거나, 또는 재협착 형성에 기인하는 심혈관 질환의 발병 소인을 검출하는 키트에 관한 것이다. 이러한 키트는 IL-1 유전자좌 일배체형의 하나 이상의 대립유전자의 5' 및 3'에 혼성화하는 5' 및 3' 올리고뉴클레오티드를 비롯한, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 후속 분석을 위해 편리한 크기의 PCR 산물을 생성하기 위해 PCR 증폭 올리고뉴클레오티드는 25 내지 2500개의 염기쌍, 바람직하게는, 약 100 내지 약 500개의 염기쌍을 개별적으로 혼성화시켜야 한다.
본 발명의 진단 방법에 사용하기에 특히 바람직한 프라이머는 서열 번호 1-10을 포함한다.
본 발명의 방법에 의한 IL-1 다형태 대립유전자 증폭 및 검출에 사용되는 추가의 올리고뉴클레오티드의 디자인은 인간 IL-1 유전자좌를 함유하는 인간 염색체 2q13으로부터의 업데이트된 서열 정보 및 이 유전자좌에 이용가능한 업데이트된 인간 다형태 정보, 둘 모두를 이용할 수 있음으로써 용이해질 수 있다. 이들 유전자에서 인간 다형태의 검출용으로 적합한 프라이머를 이 서열 정보, 및 프라이머 서열의 디자인 및 최적화에 관해 당업계에 공지된 표준 기법을 사용하여 용이하게 디자인할 수 있다. 이러한 프라이머 서열의 최적의 디자인은 예를 들면, 상업적으로 이용가능한 프라이머 선택 프로그램, 예를 들면, 프라이머 2.1, 프라이머 3 또는 진피셔(GeneFisher)를 사용함으로써 달성될 수 있다(또한, [Nicklin M. H. J., Weith A. Duff G. W.,"A Physical Map of the Region Encompassing the Human Interleukin-1α, interleukin-1β, and Interleukin-1 Receptor Antagonist Genes" Genomics 19: 382 (1995)]; [Nothwang H. G., et al. "Molecular Cloning of the Interleukin-1 gene Cluster: Construction of an Integrated YAC/PAC Contig and a partial transcriptional Map in the Region of Chromosome 2ql3" Genomics 41: 370 (1997)]; [Clark et al., (1986) Nucl. Acids. Res., 14:7897-7914[published erratum appears in Nucleic Acids Res., 15:868 (1987)] 및 (the Genome Database(GDB) project at the URL http://www.gdb.org))을 참조할 수 있다).
키트에서 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드는 임의의 다양한 천연 및/또는 합성 조성물, 예로서, 합성 올리고뉴클레오티드, 제한 단편, cDNAs, 합성 펩티드 핵산(PNAs: peptide nucleic acids) 등일 수 있다. 검정용 키트 및 방법은 또한 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 검정법에서의 동정을 용이하게 할 수 있다. 사용될 수 있는 표지의 일례로 방사선-표지, 효소, 형광 화합물, 스트렙트아비딘, 아비딘, 비오틴, 자기 부분, 금속 결합 부분, 항원 또는 항체 부분 등을 포함한다.
임의적으로, 키트는 또한 DNA 샘플링 수단도 포함할 수 있다. DNA 샘플링 수단은 당업자에게 공지되어 있고, 기질, 예로서, 면 여과지, 앰플리카드 (AmpliCard)™(잉글랜드 쉐필드S10 2JF에 소재하는 University of Sheffield; [Tarlow, JW, et al., J. of Invest. Dermatol. 103: 387-389 (1994)]) 등; DNA 정제 시약, 예로서, 뉴클레오(Nucleo)™ 키트, 용해 완충액, 단백질 분해효소 용액 등; PCR 시약, 예로서, 1O x 반응 완충액, 열안정성 중합효소, dNTPs 등; 및 대립유전자 검출 수단, 예로서, HinfI 제한 효소, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드, 건조된 혈액으로부터 네스티드 PCR에 대한 축퇴 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
4.3.3 약물유전체학
심혈관 질환 발병에 대한 감수성과 관련된 특정 대립유전자에 대한 지식은 단독으로 또는 심혈관 질환의 원인이 되는 다른 유전적 결함에 대한 정보와 함께 "약물유전체학"의 목표인 개인의 유전적 프로파일에 따른 예방 또는 치료의 상업화를 가능하게 한다.
심혈관 질환의 예방 및 치료에 대한 한 접근법은 특정 질병에 대한 위험 인자를 동정하는 것에 관한 것이다.
예를 들면, 하기 마커: IL-1A +4845 또는 IL-1B(+3954)중 임의의 것의 대립유전자 2, 또는 하기 마커: IL-1B(-511) 또는 IL-1RN(+2018)중 임의의 것의 대립유전자 1, 또는 이들 대립유전자중 임의의 것과 연관 비평형에 있는 임의의 핵산 서열을 갖는 대상자는 취약 플라크의 형성을 특징으로 하는 심혈관 질환에 질렸거나, 그러한 심혈관 질환의 발병에 대한 소인이 있을 수 있고, 심근경색, 뇌졸증, 급성 말초 혈관 차단, 및 중형 내지 대형 동맥내 동맥류 형성의 위험이 증가될 소인이 있을 수 있다. 이러한 환자는 또한 중증의 성인 치주염의 발병에 대한 소인이 있을 수 있다.
심혈관 질환의 치료에 대한 또다른 접근법은 근본적인 질환의 진행을 간섭하거나, 질병의 증상 및 증세를 호전시키거나, 표적 조직을 보호함으로써 조직의 순환에 영향을 주는 심혈관 질환의 존재가 상기 표적 조직과 관련된 임상적 증상 및 증세가 발생하지 못하도록 하는 것에 관한 것이다.
일례로서, 특정 약물은 죽상경화 플라크에 대하여 안정화 효과 또는 취약 플라크 질병의 후유증에 대하여 다른 유익한 효과를 갖는다. 일례로서, β-아드레날린성 수용체 차단제는 심근경색의 재발을 감소시키고, 안지오텐신-전환 효소 저해제는 심근경색의 발병율을 감소시키며, 특정 항생제 및 항산화제 또한 플라크를 안정화시키는데 효과적인 것으로 나타났다. 지질 강하능을 갖는 약물, 예로서, 3-하이드록시-3메틸글루타릴-조효소 A 환원효소 저해제(스타틴) 또한 중요하다. 본원에 개시된 패턴 1 IL-1 유전자형의 개시내용에 기초하여, 이들 환자들은 혈관재생 또는 다른 침습적 기법보다는 플라크 안정화를 목표로 하는 치료제에 더 잘 반응할 수 있다.
세포 수준으로, 혈청 콜레스테롤을 강하시키는 것은 죽상 플라크내 염증 세포를 감소시킨다. 분자 수준으로, 지질 강하는 이들 플라크에서 금속단백질분해효소의 활성을 감소시키는 것으로 나타났다.
하나의 실시태양에서 기법, 예로서, 유전자 요법을 사용하여 취약성 플라크를 안정화시킬 수 있고, 예를 들면, 이는 기질 금속단백질분해효소의 조직 저해제의 과다발현 및 전-염증성 분자를 차단하기 위한 안티-센스 방법을 포함할 수 있다.
다른 한편으로, 하기 마커: IL-1A +4845 또는 IL-1B(+3954)중 임의의 것의 대립유전자 1, 또는 하기 마커: IL-1B(-511) 또는 IL-1RN(+2018)중 임의의 것의 대립유전자 2를 갖는 대상자는 특정 방법, 예로서, 혈관재생법, 또는 내막-중간막 동맥 비후화 진행을 변경시키는 방법에 더 잘 반응할 수 있다.
심혈관 질환 및 질병 관리에 대한 추가의 또다른 접근법은 심혈관 질환에 대한 위험이 증가된 용태를 관리하는 것을 포함한다.
죽상경화증 진행과 관련된 인자는 당뇨병, 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 고 지질단백질-a, 비만, 및 흡연을 포함한다. 이중, 약리학적 시술에 적용가능한 인자로는 i) 당뇨병, ii) 고혈압, 및 iii) 이상지혈증을 포함한다. 지질 강하 약물의 일례로는 음이온 교환 수지, 예로서, 콜레스티라민, 콜레스티폴; HMG CoA 환원효소 저해제 또는 (스타틴) 예로서, 심바스타틴, 프라카스타틴, 세리바스타틴, 플루바스타틴, 아토르바스타틴, 로바스타틴; 피브레이트 예로서, 페노피브레이트, 베자피브 레이트, 젬피브로질, 클로피브레이트, 시프로피브레이트; 니코틴산 및 유사체: 아시피목스, 니코푸라노스; 비-수용체 매개 LDL 제거를 증가시키고, LDL 산화를 감소시키는 프로부콜; 어유, 예로서, 막세파, 오마코; 및 콜레스테롤 흡수 저해제 예로서, 파마퀘시드, 티퀘시드를 포함한다.
따라서, 대상자에서 질병의 특정 분자 원리에 초점을 맞춘 치료제는 상기와 같은 유전자형 분석을 기초로 하여 개발될 수 있다. 따라서, 개인의 IL-1 프로파일을 심혈관 질환에 대한 집단 프로파일에 비교함으로써 특정 환자 또는 환자 집단(즉, 동일한 유전자 변경을 갖는 환자군)에게 안전하고 효능이 있는 것으로 예상되는 약물 또는 다른 치료 요법을 선택하거나 디자인할 수 있다.
추가로, 유전자 프로파일을 기초로 하여, 가장 임상학적으로 유익할 것으로 예상되는 집단을 표적화하는 능력은 1) 심혈관 질환의 예방 또는 치료용으로 이미 시판중인 약물의 재배치; 2) 안전성 또는 효능 제한의 결과로 이의 임상적 개발이 중단되었으며, 환자 아군-특이적인 약물 후보의 물질의 구제; 및 3) 후보 치료제의 가속화된 비용이 적게 드는 개발 및 보다 최적의 약물 표지화(예를 들면, 혈관 질환의 원인이 되는 돌연변이 상에 다양한 용량의 약제의 효과를 측정하는 것이 유효용량을 최적화하는 데 유용하기 때문)를 가능하게 할 수 있다.
단백질(예컨대, IL-1α, IL-1β 또는 IL-1Ra), mRNA 및/또는 전사 수준을 측정함으로써 특정 치료제를 사용한 개체의 치료법을 모니터링할 수 있다. 이어서, 검출되는 수준에 따라, 치료 요법을 유지시키거나 조절(용량의 증가 또는 감소)할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 약제를 사용하여 대상자를 치료하는 것에 관한 유효성은 (i) 약제를 투여하기 전 대상자로부터 투여전 샘플을 수득하는 단계; (ii) 상기 투여전 샘플에서 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 수준 또는 양을 검출하는 단계; (iii) 대상자로부터 하나 이상의 투여후 샘플을 수득하는 단계; (iv) 상기 투여후 샘플에서 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 발현 또는 활성 수준을 검출하는 단계; (v) 상기 투여전 샘플에서 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 발현 또는 활성 수준을 투여후 샘플에서 상응하는 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 경우와 각각 비교하는 단계; 및 (vi) 이로써 대상자에게 약제의 투여를 변화시키는 단계를 포함한다.
또한, 대상자의 세포를 치료제의 투여 전후에 수득하여 IL-1 유전자 이외의 유전자의 발현 수준을 검출함으로써 치료제가 유해할 수 있는 유전자의 발현을 증가시키지 않거나 또는 감소시키는지를 확인할 수 있다. 이는 예를 들면, 전사 프로파일링 방법을 사용함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 생체내에서 치료제에 노출된 세포로부터의 mRNA 및 치료제에 노출되지 않은 동일한 유형의 세포로부터의 mRNA를 역전사시키고, 다수의 유전자로부터 DNA를 함유하는 칩에 혼성화함으로써 치료제로 처리된 세포 및 치료제로 처리되지 않은 세포의 유전자의 발현을 비교할 수 있다.
4.4 심혈관 질환 및 질병 치료제
IL-1(예컨대, IL-1α, IL-1β 또는 IL-1 수용체 길항제) 또는 IL-1 유전자와 연관 비평형에 있는 유전자에 의해 코딩된 단백질의 조절제는 단백질, 펩티드, 펩티도모사체, 소분자, 또는 핵산을 비롯한, 임의 유형의 화합물을 포함한다. 바람직한 효현제는 핵산(예컨대, IL-1 단백질을 코딩하는 것 또는 IL-1 단백질에 의해 상 향- 또는 하향-조절되는 유전자), 단백질(예컨대, IL-1 단백질 또는 그에 의해 상향- 또는 하향-조절되는 단백질) 또는 소분자(예컨대, IL-1 단백질의 발현 또는 결합을 조절하는 것)을 포함한다. 동정될 수 있는 바람직한 길항제는 IL-1 전사 및/또는 IL-1 활성을 억제시키거나 또는 저해시키는, 핵산(예컨대, 싱글(안티센스) 또는 더블 스트랜드(삼중체) DNA 또는 PNA 및 리보자임), 단백질(예컨대, 항체) 및 소분자를 포함한다.
4.4.1. 유효 용량
예컨대, LD50(집단의 50%에게 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에게 치료학적으로 유효한 용량)을 측정하기 위하여, 이러한 화합물의 독성 및 치료 효능은 표준적인 약제학적 방법에 의하여 세포 배양물 또는 실험 동물에서 측정할 수 있다. 독성 효과 및 치료 효과 사이의 용량의 비는 치료 지수로서, LD50/ED50의 비로 표시될 수 있다. 치료 지수가 큰 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물을 사용할 수 있지만, 비감염 세포에 대한 잠재적 손상을 최소화함으로써 부작용을 감소시키기 위해 상기 화합물을 환부 조직의 부위에 표적화하는 전달 시스템을 디자인하는데 주의를 기울여야 한다.
세포 배양 검정법 및 동물 연구법으로부터 얻은 데이터는 인간에 사용되는 용량 범위를 공식화하는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 용량은 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위내에 있는 것이 바람직하다. 용량은 사용되는 제형 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 상기 범위내에서 달라질 수 있다. 본 발명의 방법에 사용된 임의의 화합물에 있어서, 세포 배양 검정법으로부터 먼저 치료학적 유효량이 예측될 수 있다. 용량을 동물 모델에서 공식화하여 세포 배양물에서 측정된 IC50(즉, 증상을 최대 수준의 절반으로 저해할 수 있는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 이룰 수 있다. 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 더욱 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다. 혈장중 수준은 예를 들면, 고성능 액체 크로마토그래피에 의하여 측정될 수 있다.
4.4.2 제형화 및 용도
본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 종래 방식으로 제형화될 수 있다. 따라서, 화합물 및 그의 생리학적으로 허용가능한 염 및 용매화물은 예를 들면, 주사, 흡입 또는 통기법(입 또는 코를 통한 통기법) 또는 경구, 협측, 비경구 또는 직장 투여에 의한 투여를 위해 제형화할 수 있다.
이러한 요법에 있어서, 본 발명의 화합물은 전신 투여 및 국부 또는 국부화된 투여를 비롯한 투여에 있어서의 다양한 적재량으로 제형화될 수 있다. 일반적으로 기법 및 제형화는 문헌[Remmington"s Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PA]에서 찾아볼 수 있다. 전신 투여에 있어서는, 근육내, 정맥내, 복강내 및 피하 주사를 비롯한 주사가 바람직하다. 주사에 있어서, 본 발명의 화합물은 액상 용액 바람직하게는, 생리학적 혼화성 완충액, 예컨대, 행크(Hank) 용액 또는 링거(Ringer) 용액중에서 제형화될 수 있다. 추가로, 화합물은 고형으로 제형화될 수 있으며, 사용 직전에 재용해되거나 현탁될 수 있다. 동결 건조된 형태도 포함된다.
경구 투여에 있어서, 조성물은 예를 들면, 약제학적으로 허용가능한 부형제 예로서, 결합제(예컨대, 예비젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로파일 메틸셀룰로스); 충진제(예컨대, 락토스, 미세결정질 셀룰로스 또는 인산수소칼슘); 윤활제(예컨대, 스테아르산 마그네슘, 활석 또는 실리카); 붕해제(예컨대, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트); 또는 습윤제(예컨대, 나트륨 라우릴 설페이트)를 사용하여 종래의 수단으로 제조된 정제 또는 캡슐 형태를 취할 수 있다. 정제는 당업계에 널리 공지된 방법에 의하여 코팅될 수 있다. 경구 투여용 액상 제제는 예를 들면, 액제, 시럽제 또는 현탁제의 형태를 취할 수 있으며, 또는 사용전 물 또는 다른 적합한 비히클과 구성되는 건조 산물로서 제공될 수 있다. 이러한 액상 제제는 약제학적으로 허용가능한 첨가제 예컨대, 현탁제(예컨대, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화 식용 지방); 유화제(예컨대, 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클(예컨대, 아티온드(ationd) 오일, 유성 에스테르, 에틸 알코올 또는 분획화된 식물성 오일); 및 방부제(예컨대, 메틸 또는 프로파일-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르빈산)를 사용하여 종래의 수단으로 제조될 수 있다. 제제는 또한 적당한 완충 염, 향미제, 착색제 및 감미제를 함유할 수 있다.
경구 투여용 제제는 활성 화합물의 방출을 조절할 수 있도록 적합하게 제형화될 수 있다. 협측 투여의 경우, 조성물은 종래 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지 형태를 취할 수 았다. 흡입에 의한 투여에 있어서, 본 발명에 사용되는 화합 물은 적합한 추진제, 예컨대, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무를 제공하는 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 제형 단위가 결정될 수 있다. 예컨대, 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 것으로, 예컨대, 젤라틴으로 된 캡슐 및 카트리지는 화합물과 적합한 분말 기재, 예컨대, 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
화합물은 주사 예컨대, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제제는 방부제를 첨가하여 예를 들면, 앰플 또는 다용량 용기 중에서 단위 투여 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중에서 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고, 제형화제, 예를 들면 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 별법으로, 활성 성분은 사용전 적합한 비히클, 예를 들면, 무발열원 멸균수로 구성되는 분말 형태로 사용될 수 있다.
또한, 화합물은 예를 들면, 종래의 좌약 기재, 예로서, 코코아 버터 또는 다른 글리세리드를 함유하는 직장 조성물, 예로서, 좌제 또는 아이덴티티 관장제로 제형화될 수 있다.
전술한 제형화 이외에, 화합물은 또한 데포 제제로 제형화될 수도 있다. 이러한 장기간 작용하는 제형은 이식(예컨대, 피하 또는 근육내 이식) 또는 근육내 주사에 의하여 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 화합물은 적합한 중합체 또는 소수성 물질(예컨대, 허용가능한 오일중 에멀젼) 또는 이온 교환 수지를 사용하여 제형화될 수 있으며, 또는 또는 거의 난용성인 유도체, 예를 들면, 거의 난용성인 염으로서으로서 제형화될 수 있다. 다른 적합한 전달 시스템은 장기간 동안 약물을 국부 비침습적으로 전달할 수 있는 가능성을 제공하는 미세구를 포함한다. 이러한 기술은 염증 또는 허혈을 유발하지 않고, 예컨대, 심장 또는 다른 기관의 임의의 선택된 부분으로 관상 카테터를 통해 주사될 수 있는 전모세혈관 크기의 미세구를 사용한다. 투여된 치료제는 이러한 미세구로부터 천천히 방출되고, 주위 조직 세포(예컨대, 내피 세포)에 의해 흡수된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여의 경우, 침투되는 장벽에 적절한 침투제를 제제중에 사용한다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 경점막 투여 담즙 염 및 후시드산 유도체를 포함한다. 추가로, 계면활성제를 사용하여 투과를 용이하게 할 수 있다. 경점막 투여는 비강 분무를 통해 또는 좌제를 사용하여 이루어질 수 있다. 국소 투여의 경우, 본 발명의 올리고머를 일반적으로 당업계에 공지된 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제형화한다. 세척액을 국부적으로 사용하여 상해 또는 염증를 치료함으로써 치유를 가속화시킬 수 있다.
조성물은 원하는 경우, 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 제형 형태를 함유할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치중에서 제공될 수 있다. 팩은 예를 들면, 금속 또는 플라스틱 호일, 예를 들면, 블리스터 팩을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치는 투여 설명서를 수반할 수 있다.
4.5 심혈관 질환 및 질병용 치료제를 동정하는 검정법
심혈관 질환의 발병을 유발하거나, 그의 원인이 되는 돌연변이의 동정에 기초하여, 본 발명은 예컨대, 심혈관 질환 치료제를 동정하는 세포-기초 또는 무세포 검정법을 추가의 특징으로 한다. 한 실시태양에서, IL-1 수용체, 또는 그의 세포막의 외부 표면상의, IL-1 유전자와 연관 비평형에 있는 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 수용체를 발현하는 세포를 단독의 시험 화합물의 존재하에서 또는 시험 화합물 및 또다른 단백질의 존재하에서 인큐베이션시키고, 예컨대, 미세생리검출기(microphysiometer)를 사용함으로써 시험 화합물과 수용체 간의 상호작용 또는 단백질(바람직하게는 태깅된 단백질)과 수용체간의 상호작용을 검출한다[McConnell et al. (1992) Science 257: 1906]. 수용체와 시험 화합물 또는 단백질 간의 상호작용은 배지의 산도의 변화에 따라 미세생리검출기에 의해 검출된다. 따라서, 이 검정 시스템은 예를 들면, 단백질-수용체 상호작용을 방해함으로써 작용하는 분자 길항제 뿐만 아니라 예를 들면, 수용체를 활성화시킴으로써 작용하는 분자 효현제를 동정하는 수단을 제공한다.
또한, 세포 또는 무세포 검정법을 사용하여 IL-1 유전자 또는 그와 연관 비평형에 있는 유전자의 발현을 조정하는 화합물, mRNA의 번역을 조정하는 화합물, 또는 mRNA 또는 단백질의 안정성을 조정하는 화합물을 동정할 수 있다. 따라서, 하나의 실시태양에서, IL-1, 또는 다른 단백질을 생산할 수 있는 단백질을 시험 화합물과 함께 인큐베이션시키고, 세포 배지에서 생산된 단백질의 양을 측정하고, 시험 화합물과 접촉시키지 않은 세포로부터 생산된 것과 비교한다. 단백질과 비교한 화 합물의 특이성을 다양한 대조군 분석, 예컨대, 하나 이상의 대조군 유전자의 발현을 측정함으로써 확인할 수 있다. 특히, 이러한 검정법을 사용하여 안티센스, 리보자임 및 삼중체 화합물의 효능을 측정할 수 있다.
또한, 무세포 검정법을 사용하여 단백질과 상호작용하여 단백질의 활성을 변형시킬 수 있는 화합물을 동정할 수 있다. 이러한 화합물은 예를 들면, 단백질의 구조를 변형시킴으로써 그의 수용체에 결합할 수 있는 능력에 영향을 미칠 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 이러한 화합물을 동정하는 무세포 검정법은 필수적으로 결합 파트너의 존재 또는 부재하의 단백질 및 시험 화합물 또는 시험 화합물의 라이브러리를 함유하는 반응 혼합물로 구성된다. 시험 화합물은 예컨대, 결합 파트너의 유도체, 예컨대, 생물학적으로 비활성인 표적 펩티드, 또는 소분자일 수 있다.
따라서, 본 발명의 한 예시적인 스크리닝 검정법은 단백질 또는 그의 기능적 단편을 시험 화합물 또는 시험 화합물의 라이브러리와 접촉시키고, 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함한다. 검출 목적을 위해, 분자는 특이적인 마커로 표지될 수 있고, 시험 화합물 또는 시험 화합물의 라이브러리는 상이한 마커로 표지될 수 있다. 이어서, 시험 화합물과, 단백질 또는 그의 단편의 상호작용은 인큐베이션 단계와 세척 단계 이후에 2개의 표지 수준을 측정함으로써 검출될 수 있다. 세척 단계 이후 2개의 표지가 존재하는 것은 상호작용을 지시한다.
또한, 분자들간의 상호작용을 광학적 현상인 표면 플라즈몬 공명(SPR: surface plasmon resonance)을 검출하는 실시간 BIA(Biomolecular Interaction Analysis, Pharmacia Biosensor AB)를 사용하여 동정할 수 있다. 검출은 이특이적 계면의 거대분자의 질량 농도 변화에 의존하고, 상호작용제의 표지화를 필요로 하지 않는다. 한 실시태양에서, 시험 화합물의 라이브러리는 예를 들면, 미세 유동 세포의 한 벽을 형성하는 센서 표면상에 고정될 수 있다. 이어서, 단백질 또는 그의 기능적 단편을 함유하는 용액을 연속적으로 센서 표면으로 유동시킨다. 신호 기록상에 나타나는 공명 각의 변화는 발생한 상호작용을 지시한다. 이 기법은 예를 들면, [BIAtechnology Handbook by Pharmacia]에 추가로 기재되어 있다.
본 발명의 또다른 예시적인 스크리닝 검정법은 (a) (i) IL-1 또는 다른 단백질, (ii) 적절한 수용체, 및 (iii) 시험 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 (b) 단백질 및 수용체의 상호작용을 검출하는 단계를 포함한다. 시험 화합물의 부재하에서의 상호작용에 비해 시험 화합물의 존재하에서의 단백질 및 수용체의 상호작용에서의 통계학적으로 유의적인 변화(증강 또는 저해)가 잠재적 길항제(저해제)를 지시한다. 이 검정법의 화합물을 동시에 접촉시킬 수 있다. 별법으로, 먼저 단백질을 적절한 시간 동안 시험 화합물과 접촉시킨 후, 수용체를 반응 혼합물에 첨가한다. 상기 화합물의 효능은 다양한 농도의 시험 화합물을 사용하여 얻은 데이터로부터 용량 반응 곡선을 작성함으로써 평가할 수 있다. 게다가, 대조군 검정법을 수행하여 비교에 대한 기준선을 제공할 수도 있다.
단백질과 수용체 사이의 복합체 형성은 다양한 기법에 의해 검출될 수 있다. 복합체 형성의 조정은 면역검정법, 또는 크로마토그래피 검출에 의해 예를 들면, 검출가능하게 표지된 단백질, 예로서, 방사표지된, 형광 표지된, 또는 효소적으로 표지된 단백질 또는 수용체를 사용하여 정량화될 수 있다.
전형적으로, 단백질 또는 수용체 단백질중 하나 또는 둘 모두의 복합체화되지 않은 형태로부터의 복합체 분리를 용이하게 할 뿐만 아니라, 검정법의 자동화를 가능케하기 위하여 단백질 또는 수용체를 고정화시키는 것이 바람직할 것이다. 단백질 및 수용체의 결합은 시약을 함유하기에 적합한 임의의 용기에서 수행될 수 있다. 일례로 미세역가판, 시험관 및 미세-원심분리관을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 단백질이 매트릭스에 결합할 수 있도록 하는 도메인을 첨가시키는 융합 단백질을 제공할 수 있다. 예를 들면, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 융합 단백질을 글루타티온 세파로스 비드(미주리주 세인트 루이스에 소재하는 Sigma Chemical) 또는 글루타티온 유도화된 미세역가판으로 흡착시킨 후, 수용체, 예를 들면 35S-표지된 수용체, 및 시험 화합물과 배합하고, 혼합물은 약간 더 엄격한 조건이 바람직할 수 있지만, 예컨대, 염 및 pH에 대한 생리학적 조건과 같이 복합체를 형성하는 조건하에서 인큐베이션시킬 수 있다. 인큐베이션후, 비드를 세척하여 임의의 비결합 표지를 제거하고, 매트릭스를 고정화시키고, 방사선표지를 직접(예컨대, 섬광체에 배치된 비드), 또는 복합체가 추후 해리된 후 상등액중에서 측정한다. 별법으로, 복합체를 매트릭스로부터 해리시킬 수 있고, SDS-PAGE에 의해 분리시킬 수 있으며, 비드 분획물중에서 발견되는 단백질 또는 수용체의 양은 첨부된 실시예에 기재된 것과 같은 표준 전기영동 기법을 사용하여 겔로부터 정량화할 수 있다. 단백질을 매트릭스상에 고정시키는 다른 기법 또한 본 검정법에 사용될 수 있다. 예를 들면, 단백질 또는 수용체를 비오틴 및 스트렙트아비딘의 접합체를 사용하여 고정화시킬 수 있다. 트랜스제닉 동물을 제작하여 효현제 및 길항제를 동정하거나, 후보 치료제의 안전성 및 효능을 확인할 수 있다. 본 발명의 트랜스제닉 동물은 적절한 내인성 프로모터의 조절하에서 또는 이종 프로모터의 조절하에서 심혈관 질환의 원인이 되는 돌연변이를 함유하는, 인간을 제외한 동물을 포함할 수 있다.
트랜스제닉 동물은 또한 적절한 프로모터 또는 그의 단편의 조절하에서 트랜스진, 예로서, 리포터 유전자를 함유하는 동물일 수 있다. 이들 동물은 예로서, 유전자 발현을 조절함으로써 예컨대, IL-1 단백질의 생산을 조절하는 약물을 동정하는데 유용하다. 인간을 제외한 트랜스제닉 동물을 수득하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 실시태양에서, 심혈관 질환의 원인이 되는 돌연변이의 발현은 예를 들면, 원하는 패턴으로의 발현을 조절하는 시스-작용 서열을 사용하는 세포, 조직 또는 발달 단계의 특이적 하위세트에 한정된다. 본 발명에서, 단백질의 이러한 모자이크 발현은 많은 형태의 계통 분석에 필수적일 수 있고, 이는 또한 예를 들면, 다른 정상 배아내의 조직의 작은 패치에서 발달을 전체적으로 변화시킬 수 있는 발현 수준의 영향을 평가는 수단을 제공할 수 있다. 이를 위해, 조직-특이적 조절 서열 및 조건적 조절 서열을 사용하여 특정한 공간 패턴에서 돌연변이의 발현을 조절할 수 있다. 게다가, 예를 들면, 조건적 재조합 시스템 또는 원핵 전사 조절 서열에 의해 일시적인 발편 패턴을 제공할 수 있다. 돌연변이의 발현을 가능케 하는 유전적 기법은 생체내 부위-특이적 유전자 조작을 통해 조절될 수 있고, 이는 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 모든 트랜스제닉 동물은 다수의 그들의 세포내에 본 발명의 심혈관 질환의 원인이 되는 돌연변이 트랜스진을 포함하는데, 트랜스진은 "숙주 세포"의 표현형을 변경시킨다. 예시적인 실시태양에서, 박테리오파지 P1의 cre/loxP 재조합효소 시스템([Lakso et al. (1992) PNAS 89: 6232-6236]; [Orban et al. (1992) PNAS 89: 6861-6865]) 또는 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)의 FLP 재조합효소 시스템([O'Gorman et al. (1991) Science 251: 1351-1355]; PCT 공보 WO 92/15694)을 사용하여 생체내 부위-특이적 유전적 재조합 시스템을 생성할 수 있다. Cre 재조합효소는 loxP 서열 사이에 위치한 개입 표적 서열의 부위-특이적 재조합을 촉매화한다. loxP 서열은 Cre 재조합효소가 결합하는 34개의 염기쌍 뉴클레오티드 반복 서열이고, Cre 재조합효소 매개 유전적 재조합에 필요하다. Cre 재조합효소가 존재하는 경우, loxP 서열의 배향이 개입 표적 서열이 절단되는지, 또는 역전되는지를 결정하며[Abremski et al. (1984) J. Biol . Chem. 259: 1509-1514], loxP 서열이 직접 반복부로서 배향된 경우, 표적 서열의 절단을 촉매화하고, loxP 서열이 역전 반복부로서 배향된 경우, 표적 서열의 역전을 촉매화한다.
따라서, 표적 서열의 유전적 재조합은 Cre 재조합효소의 발현에 의존적이다. 재조합효소의 발현은 외부로 첨가되는 약제에 의해 유도성이거나 또는 억제성인 조절적인 제어, 예를 들면, 조직-특이적, 발달 단계-특이적인 제어를 받게 되는 프로모터 요소에 의해 조절될 수 있다. 이 조절된 제어는 재조합효소 발현이 프로모터 요소에 의해 매개되는 세포에서만 표적 서열을 유전적으로 재조합시킨다. 따라서, 원인이 되는 돌연변이 트랜스진의 발현의 활성화는 재조합효소 발현의 제어를 통해 조절될 수 있다.
원인이 되는 돌연변이 트랜스진의 발현을 조절하는 cre/loxP 재조합효소 시스템의 사용은 Cre 재조합효소 및 대상 단백질 둘 모두를 코딩하는 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 동물의 작제를 필요로 한다. Cre 재조합효소 및 심혈관 질환의 원인이 되는 돌연변이 트랜스진 둘 모두를 함유하는 동물은 "이중" 트랜스제닉 동물의 작제를 통해 제공될 수 있다. 그러한 동물을 제공하는 용이한 방법은 각각 트랜스진을 함유하는 두 트랜스제닉 동물을 교배시키는 것이다.
트랜스진의 발현을 용이하게 하기 위해 동시에 발현되는 원핵 단백질을 필요로 하는 원핵 프로모터 서열을 사용하여 유사한 조건적 트랜스진을 제공할 수 있다. 예시적인 프로모터 및 대응하는 트란스-활성화 원핵 단백질은 미국 특허 번호 제4,833,080호에 제공되어 있다.
게다가, 조건적 트랜스진의 발현은 트란스활성화 단백질, 예컨대, 재조합효소 또는 원핵 단백질을 코딩하는 유전자가 조직으로 전달되고, 예를 들면 세포-유형 특이적 방식으로 발현될 수 있도록 하는 유전자 요법 유사 방법에 의해 유도될 수 있다. 이러한 방법에 의해, 트랜스진 트란스활성화제 도입에 의해 "가동(turn on)"될 때까지의 성인기까지는 침묵 상태로 유지될 수 있다.
예시적인 실시태양에서, 본 발명의 "인간을 제외한 트랜스제닉 동물"은 인간을 제외한 동물의 생식선으로 트랜스진을 도입시킴으로써 생산된다. 다양한 발달 단계에서의 배아 표적 세포를 사용하여 트랜스진을 도입할 수 있다. 배아 표적 세 포의 발단 단계에 따라 상이한 방법을 사용한다. 본 발명을 실시하는데 사용되는 임의의 동물의 특이적 계통(들)을 일반적인 양호한 건강 상태, 우수한 배아 생산, 배아중에서의 우수한 전핵 가시도 및 우수한 번식 적응도에 대해 선택한다. 추가로, 일배체형도 중요한 인자이다. 예를 들면, 트랜스제닉 마우스를 생산하고자 할 때, 균주, 예로서, C57BL/6 또는 FVB 세포주(메인주 바 하버에 소재하는 Jackson Laboratory)가 종종 사용된다. 바람직한 균주는 H-2b, H-2d 또는 H-2q 일배체형을 포함하는 것, 예로서, C57BL/6 또는 DBA/1이다. 본 발명을 실시하는데 사용되는 계통(들)은 그 자체로 트랜스제닉일 수 있고/있거, 녹아웃일 수 있다(즉, 하나 이상의 유전자가 부분적으로 또는 완전히 억제된 동물로부터 수득될 수 있다).
하나의 실시태양에서, 트랜스진 작제물을 단일 단계 배아로 도입한다. 접합자가 미세주사에 대한 최고의 표적이다. 마우스에서, 수컷 전핵은 1-2 pl의 DNA 용액을 재생가능하게 주사할 수 있는, 직경이 대략 20 마이크로미터인 크기에 도달한다. 유전자 전이에 대한 표적으로서의 접합자의 사용은 대부분의 경우 주사된 DNA가 제1 분할 이전에 숙주 유전자로 혼입될 것이라는 점에서 주요한 잇점을 갖는다[Brinster et al. (1985) PNAS 82: 4438-4442]. 결과적으로, 트랜스제닉 동물의 모든 세포는 혼입된 트랜스진을 가질 것이다. 또한, 이는 일반적으로, 배아 세포중 50%가 트랜스진을 포함할 것이기 때문에 시조의 자손에게 트랜스진을 유효하게 전달하게 할 것이다.
보통, 수정된 배아를 전핵이 나타날 때까지 적합한 배지 중에서 인큐베이션 시킨다. 이 무렵, 트랜스진을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 하기하는 바와 같이 여성 또는 수컷 전핵으로 도입시킨다. 일부 종, 예로서, 마우스에서는, 수컷 전핵이 바람직하다. 난자 핵 또는 접합자 여성 전핵에 의해 처리되기 전에 접합자의 수컷 DNA 보체에 외인성 유전적 물질을 첨가하는 것이 가장 바람직하다. 난자 핵 또는 여성 전핵이, 아마도 수컷 DNA의 프로타민을 히스톤으로 대체하여 여성 및 수컷 DNA 보체의 조합을 용이하게 함으로써 이배수체 접합자 형성을 용이하게 함으로써 수컷 DNA 보체에 영향을 미치는 분자를 방출하는 것으로 생각된다. 따라서, 여성 전핵에 의한 영향을 받기 전에 외인성 유전적 물질을 DNA의 수컷 보체 또는 DNA 의 임의의 다른 보체에 첨가하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 수컷 및 여성 전핵이 잘 분리되고, 둘 모두 세포막에 근접하게 위치하는 경우인 수컷 전핵의 형성 후 가능한 한 빨리 외인성 유전적 물질을 조기 수컷 전핵에 첨가한다. 별법으로, 외인성 유전적 물질이 탈응축을 하도록 유도한 후, 정자의 핵에 첨가할 수 있다. 이어서, 외인성 유전적 물질을 함유하는 정자를 난자에 첨가할 수 있거나, 탈응축된 정자를 그 후 가능한 한 빨리 트랜스진 작제물을 갖는 난자에 첨가할 수 있다.
트랜스진 뉴클레오티드 서열을 배아로 도입시키는 것은 당업계에 공지된 임의의 수단, 예를 들면, 미세주사, 전기천공 또는 리포펙션에 의해 달성될 수 있다. 트랜스진 뉴클레오티드 서열을 배아로 도입시킨 후, 다양한 시간 동안 배아를 시험관내에서 인큐베이션시키거나, 대리 숙주로 재이식하거나 또는 둘 모두할 수 있다. 성숙화를 위한 시험관내 인큐베이션은 본 발명의 범위에 속한다. 한 통상의 방법은 배아를 종에 따라 약 1-7일 동안 시험관내에서 인큐베이션시킨 후, 이들을 대리 숙 주로 재이식하는 것이다.
본 발명의 목적을 위해, 접합자는 필수적으로 완전한 유기체로 발생할 수 있는 이배수체 세포를 형성한다. 일반적으로, 접합자는 생식 세포 또는 생식 세포들로부터 2개의 일배체형 핵의 융합에 의해 천연적으로 또는 인공적으로 형성되는 핵을 함유하는 난자로 구성될 것이다. 따라서, 생식 세포 핵은 천연적으로 상용가능한 것들, 즉, 분화할 수 있고 기능성 유기체로 발생할 수 있는 생존가능한 접합자를 제공하는 것들이어야 한다. 일반적으로, 정배수체 접합자가 바람직하다. 홀배수체 접합자를 수득한 경우, 염색체의 갯수는 생식 세포가 유래하는 유기체의 정배수체 수에 대해 1 초과로 차이가 나지 않아야 한다.
유사한 생물학적 고려사항 이외에, 물리적 고려사항도 접합자의 핵에 첨가될 수 있거나, 접합자 핵의 부분을 형성하는 유전적 물질에 첨가될 수 있는 외인성 유전적 물질의 양(예컨대, 부피)을 지배한다. 유전적 물질을 제거하지 않으면, 첨가될 수 있는 외인성 유전적 물질의 양이 물리적으로 붕괴되지 않고 흡수되는 양에 의해 제한된다. 일반적으로, 삽입되는 외인성 유전적 물질의 부피 약 10 피코리터를 초과하지 않는다. 물리적인 첨가 효과는 접합자의 생육성을 물리적으로 파괴할 만큼 크지는 않아야 한다. DNA 서열의 수 및 다양성의 생물학적 한계는 특정 접합자 및 외인성 유전적 물질의 기능에 따라 변하게 되며, 생성된 접합자의 외인성 유전적 물질을 비롯한 유전적 물질이 접합자의 분화 및 기능적 유기체로의 발생을 생물학적으로 개시하고 유지시킬 수 있어야 하기 때문에 당업자에게 용이하게 이해될 것이다.
접합자로 첨가되는 트랜스진 작제물의 카피의 수는 첨가되는 외인성 유전적 물질의 총량에 의존적이고, 유전적 형질전환이 발생할 수 있는 양이 될 것이다. 이론적으로, 오직 하나의 카피만을 필요로 하지만, 일반적으로는 한 카피가 기능적인지 보장하기 위해 다수의 카피, 예를 들면, 1,000-20,000개 카피의 트랜스진 작제물이 사용된다. 본 발명과 관련하여, 종종 각각의 삽입된 외인성 DNA 서열의 1 초과의 기능성 카피를 가짐으로써 외인성 DNA 서열의 표현형 발현을 증강시키는 것이 유리할 것이다.
세포, 핵막 또는 다른 존재하는 세포 또는 유전적 구조물에 유해하지 않은 한, 외인성 유전적 물질을 핵 유전적 물질로 첨가할 수 있는 임의의 기법을 사용할 수 있다. 외인성 유전적 물질을 우선적으로 미세주사에 의해 핵 유전적 물질에 삽입할 수 있다. 세포 및 세포 구조물의 미세주사는 당업계에 공지되어 있고, 당업계에서 사용된다.
표준 방법을 사용하여 재이식을 수행한다. 통상, 대리 숙주를 마취시키고, 배아를 난관에 삽입한다. 특정 숙주로 이식되는 배아의 수는 종에 따라 다르지만, 통상 종이 천연적으로 생산하는 자손의 수와 유사하게 될 것이다.
대리 숙주의 트랜스제닉 자손을 임의의 적합한 방법에 의한 트랜스진의 존재 및/또는 발현에 대해 스크리닝할 수 있다. 스크리닝은 종종 적어도 일부의 트랜스진에 상보적인 프로브를 사용하여 써던 블롯 또는 노던 블롯 분석에 의해 수행된다. 트랜스진에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석은 트랜스진 산물의 존재에 대한 스크리닝에 대한 대안적인 또는 추가적인 방법으로 사용될 수 있다. 전형적으로, DNA는 꼬리 조직으로부터 제조되고, 트랜스진을 위한 써던 분석 또는 PCR에 의해 분석된다. 별법으로, 비록 이 분석에 임의의 조직 또는 세포 유형을 사용할 수 있지만, 트랜스진을 최고의 수준으로 발현시킨다고 생각되는 조직 또는 세포를 써던 분석 또는 PCR을 사용하여 트랜스진의 존재 및 발현에 대해 시험한다.
트랜스진의 존재를 평가하는 대안적인 또는 추가적인 방법은 적합한 생화학적 검정법, 예로서, 효소 및/또는 면역학적 검정법, 특정 마커 또는 효소 활성에 대한 조직학적 염색, 유세포 분석 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 혈액 분석도 혈중 트랜스진 산물의 존재를 검출할 뿐만 아니라, 트랜스진이 다양한 유형의 혈액 세포 및 다른 혈액 구성 성분의 수준에 대해 미치는 효과를 평가하는 데 유용할 수 있다.
트랜스제닉 동물을 적합한 파트너와 교배시킴으로써, 또는 트랜스제닉 동물로부터 수득한 난자 및/또는 정자의 시험관내 수정에 의해 트랜스제닉 동물의 자손을 얻을 수 있다. 파트너와의 교배를 수행하는 경우, 파트너는 트랜스제닉 및/또는 녹아웃이거나 아닐 수 있으며; 트랜스제닉인 경우, 동일하거나 상이한 트랜스진, 또는 둘 모두를 함유할 수 있다. 별법으로, 파트너는 모계일 수 있다. 시험관내 수정이 사용되는 경우, 수정된 배아를 대리 숙주에 이식하거나, 시험관내 인큐베이션시킬 수 있거나, 둘 모두를 수행할 수 있다. 이중 어느 방법을 사용함으로써 자손을 상술한 방법 또는 다른 적절한 방법을 사용하여 트랜스진의 존재에 대해 평가할 수 있다.
본 발명에 따라 생산된 트랜스제닉 동물은 외인성 유전적 물질을 포함할 것이다. 추가로, 이러한 실시태양에서, 서열은 바람직하게는 특이적 타입의 세포중에서 트랜스진 산물을 발현시키는 전사 제어 요소, 예컨대, 프로모터에 부착될 것이다.
또한, 레트로바이러스 감염을 사용하여 트랜스진을 인간을 제외한 동물내로 도입시킬 수 있다. 발생중인 인간을 제외한 배아를 포배 단계로 시험관내 배양할 수 있다. 이 기간 동안, 할구는 레트로바이러스 감염에 대한 표적이 될 수 있다[Jaenich, R. (1976) PNAS 73: 1260-1264]. 효소적 처리에 의해 투명대를 제거함으로써 유효하게 감염된 할구를 수득한다[Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986)]. 트랜스진으로 도입시키는데 사용된 바이러스 벡터 시스템은 전형적으로 트랜스진을 갖는 복제-결손 레트로바이러스이다([Jahner et al. (1985) PNAS 82: 6927-6931]; [Van der Putten et al. (1985) PNAS 82: 6148-6152]). 바이러스-생성 세포의 단층상에서 할구를 배양함으로써 용이하게 유효하게 형질감염시킨다([Van der Putten, 상기 동일]; [Stewart et al. (1987) EMBO J. 6: 383-388]). 별법으로, 후기 단계에서 감염을 수행할 수 있다. 바이러스 또는 바이러스-생성 세포를 할강에 주입할 수 있다[Jahner et al. (1982) Nature 298: 623-628]. 혼입은 오직, 인간을 제외한 트랜스제닉 동물을 형성하는 세포의 하위세트에서만 발생하기 때문에 대부분의 시조들은 트랜스진에 대해 모자이크성이 된다. 추가로, 시조는 일반적으로 자손에서 분리되는 게놈중의 상이한 위치에서 트랜스진의 다양한 레트로바이러스 삽입을 함유할 수 있다. 추가로, 임신중기 배아의 자궁내 레트로바이러스 감염에 의해 트랜스진을 배아 세포주로 도입시키는 것도 가능하다[Jahner et al. (1982) 상기 동일].
트랜스진 도입에 대한 제3 유형의 표적 세포는 배아 줄기 세포(ES: embryonal stem cell)이다. ES 세포는, 시험관내에서 배양되고 배아와 융합된 착상전의 배아로부터 수득된다([Evans et al. (1981) Nature 292: 154-156]; [Bradley et al. (1984) Nature 309: 255-258]; [Gossler et al. (1986) PNAS 83: 9065-9069]; 및 [Robertson et al. (1986) Nature 322: 445-448]). 트랜스진은 DNA 형질감염 또는 레트로바이러스 매개 형질도입에 의해 ES 세포로 유효하게 도입될 수 있다. 이후, 상기와 같이 형질전환된 ES 세포를 인간을 제외한 동물로부터 유래된 포배와 조합시킬 수 있다. 이후, ES 세포는 배아를 콜로니화하고, 생성되는 키메라성 동물의 배아 세포주에 기여한다. 리뷰를 위해, [Jaenisch, R. (1988) Science 240: 1468-1474]을 참조할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되는데, 이는 어떠한 방법으로든 제한적으로 해석되지 않아야 한다. 인용된 모든 참고 문헌(본 출원을 통해 인용된 참고 문헌, 등록된 특허, 공개된 특허 출원을 포함한다)의 내용은 본원에서 참고로 명백히 인용된다. 본 발명의 실시하는 달리 명시하지 않는 한, 당업계의 기술 범위내에 있는 종래 기법을 사용할 것이다. 그러한 기법은 문헌상에 전체적으로 설명되어 있다. 예를 들면, ([Molecular Cloning A Laboratory Manual, (2nd ed., Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)]; [DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985)]; [Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984)]; 미국 특허 번호 제4,683,195호; 미국 특허 번호 제4,683,202호; 및 [Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds., 1984)])를 참조할 수 있다.
5. 실시예
실시예 1: 단일 혈관 관상 동맥 질병에 대한 마커
본 연구의 목적은 관상 동맥 죽상경화증의 조기 형태, 즉, 단일 혈관 관상 동맥 질병을 앓는 환자가 하기 유전자: IL-1A(-889 마커), IL-1B(-511 및 +3954 마커), IL-1RN(VNTR 마커) 또는 TNFα(-308 마커)에서 특이적인 대립유전자를 가질 가능성이 높은지를 측정하는 것이었다. 다중 혈관 질병은 일반적으로 데이타 해석을 복잡하게 할 수 있는 다수의 인자가 관여할 수 있는, 후기 단계의 질병을 나타낸다. 그러므로, 가슴 통증에 대한 호소증상을 나타내는 환자를 심장전문의가 평가하였고, 1 초과의 관상 동맥에서 유의적인 죽상경화증에 대한 혈관조영술상의 증거를 갖는 환자는 분석으로부터 제외시켰다.
환자 코호트: 종래 기법를 사용하여 대퇴 또는 상완 동맥으로부터의 혈관조영술을 실시하였다. 검사한 환자중 여든 다섯명(85)은 혈관조영술에서는 뚜렷한 내강 이상을 갖지 않았고, 이들은 혈관조영술 소견상 정상적인 관상 동맥을 갖는 대조군으로서 분류되었다. 육안으로 평가하였을 때, 3개의 심장외막 관상 혈관중 1개가 내강 직경을 50% 축소시키는 심장외막 협착을 포함한다면, 환자는 단일 혈관 질병을 앓는 것으로 분류하였다. 쉰-여덟명(58)의 환자가 단일 혈관 관상 동맥 질병 을 갖는 것으로 밝혀졌다. 다중 혈관 질병을 앓는 환자는 제외시켰다. 대조군과 단일 혈관 질병군, 둘 모두의 평균 연령은 각각 57.6±10.4세, 및 56.4±9.4세로 유사하였다. 대조군에서 남성 대 여성의 비는 1:1.7이었고, 질병군에서는 2.6:1이었다.
일반적인 방법: 핵산 기법을 포함한 반응과 조작은 달리 언급하지 않는 한, 일반적으로 [Sambrook, et al, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]에 기재되어 있는 바와 같이 실시하였다. 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 [PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있는 바와 같이 수행하였다. 유전자형 분석 방법은 일반적으로 (미국 특허 번호 제4,666,828호; 제4,683,202호; 제4,801,531호; 제5,192,659호; 및 제5,272,057호 및 [McDowell, et al, Arthritis & Rheumatism , 38(2):221-8 (1995)])에 기재되어 있다.
DNA 제조: 염석 방법을 변형시켜 전혈로부터 DNA를 추출하였다(Nucleon II™, 영국 소재의 Scotlab).
IL -1 RN 유전자형 분석: IL-1RN 유전자와 관련된 대립유전자는 앞서 [Tarlow, et al., Human Genetics , 91:403-4 (1993)]에 기재되었다. PCR에 사용된 효소는 프로메가(Promega)(영국)로부터 입수하고, 열순환 반응기는 MJ 리서치 DNA 엔진(MJ Research DNA Engine) 또는 바이오메트라(Biometra)로부터 입수하였다. ABI DNA 합성기에서 하기 프라이머를 제조하였다.
5' CTCAGCAACACTCCTAT 3' (서열번호: 1)
5' TCCTGGTCTGCAGGTAA 3' (서열번호: 2)
마그네슘의 최종 농도는 1.75 mM이고, 사이클링 프로토콜은 96℃에서 1분 동안 1회 사이클; [94℃에서 1분 동안, 6O℃에서 1분 동안, 및 7O℃에서 1분 동안] 30회 사이클; 및 7O℃에서 2분 동안 1회 사이클로 하여 PCR 증폭을 실시하였다. PCR후, 상이한 대립유전자를, 브롬화 에티듐으로 염색된 2% 아가로스 겔상에서 전기영동시키고, 시각화하고, uv 광하에서 동정하였다. 각 실험에서 DNA를 갖지 않는 음성 대조군도 실시하였다.
IL-1RN 유전자의 인트론 2는 하기와 같은 다섯개(5)의 대립유전자를 발생시키는 가변수의 직렬 반복부(VNTR) 영역을 함유한다:
대립유전자 1은 4개의 반복부를 함유하고, 412 bp PCR 산물을 함유하고;
대립유전자 2는 2개의 반복부를 함유하고, 240 bp PCR 산물을 함유하며;
대립유전자 3은 3개의 반복부를 함유하고, 326 bp PCR 산물을 함유하고;
대립유전자 4는 5개의 반복부를 함유하고, 498 bp PCR 산물을 함유하며;
대립유전자 5는 6개의 반복부를 함유하고, 584 bp PCR 산물을 함유한다.
IL-1B (-511) 유전자형 분석
IL-1B -511 마커는 [diGiovine, Hum. Molec. Genet, 1(6):450 (1992)]에 기재되었다. IL-1B 염기 -511에서의 단일 염기 변이(C/T) 마커는 대립유전자 1상의 AvaI 부위(C), 및 대립유전자 2상의 Bsu36I 부위(T)에 기초하여 동정하였다. 95℃에서 2분 동안 1회 사이클, [95℃에서 1분 동안, 53℃에서 1분 동안, 및 74℃에서 1분 동안] 35회 사이클 및 74℃에서 4분 동안 1회 사이클로 하여 PCR을 실시하였 다. 37℃에서 8시간 동안 AvaI 및 Bsu36I을 사용한 제한 효소 분해, 이어서, 8% PAGE를 사용한 크기 분석을 통해 PCR 산물을 분석하였다. ABI DNA 합성기에서 하기 프라이머를 제조하였다([Clark, et al, Nucl . Acids . Res., 14:7897-7914 (1986)]([Nucleic Acids Res., 15(2):868 (1987)]에 공개된 오자가 나타난 것으로 보임); GENBANK X04500):
5' TGGCATTGATCTGGTTCATC 3'(-702/-682) (서열번호: 5)
5' GTTTAGGAATCTTCCCACTT 3'(-417/-397) (서열번호: 6)
결과: 대조군과 질병에 걸린 환자들 사이에 IL-1A(-889 마커), IL-1B(+3954 마커) 또는 TNFα(-308 마커)에 대하여 유전자에서 상이한 대립유전자의 빈도상의 유의적인 차이는 없었다. 그러나, 단일 혈관 질병 환자에서는 41% 대 대조군에서는 22%로, 단일 혈관 질병 환자에서 VNTR 마커 대립유전자 2는 유의적으로 과다하게 나타났다. 대립유전자 2의 하나 이상의 카피를 갖는 개체가 대립유전자 2에 대하여 음성인 환자보다 단일 혈관 관상 동맥 질병에 걸릴 가능성이 2.4배 더 높은 것으로 예측된다(교차비=2.44, p=0.003, 95% 신뢰구간=1.35-4.43).
추가로, 2개의 카피를 갖는 개체, 즉, IL-1RN 대립유전자 2에 대하여 동형접합성인 개체는 대립유전자 2에 대하여 음성인 환자보다 단일 혈관 관상 동맥 질병에 걸릴 가능성이 5.36배 더 높았다(교차비=5.36, p=0.005, 95% 신뢰구간=1.6-17.97).
38%인 대조군과 비교하여 단일 혈관 관상 질병에서는 IL-1B 유전자 -511 마커 대립유전자 2의 하나의 카피를 보유하는 것이 52%로 증가하였다. 대립유전자 2 의 하나 이상의 카피를 갖는 개체가 대립유전자 2에 대하여 음성인 환자보다 단일 혈관 관상 동맥 질병에 걸릴 가능성이 1.74배 더 높은 것으로 예측된다(교차비=1.74, p=0.1, 95% 신뢰구간=0.86-3.52).
이러한 소견은, IL-1RN 유전자의 대립유전자 2가 단일 혈관 협착증으로 나타나는 바와 같이, 관상 동맥 폐색 질병의 발병에 대하여 감수성인 마커라는 것을 지시한다. 이러한 대립유전자는, 질병-관련 대립유전자의 1개의 카피가 존재하는지(이형접합성) 또는 2개의 카피가 존재하는지(동형접합성) 여부에 따라 관상 동맥 질병에 대한 위험이 2.4배 내지 5.4배 증가되는 것과 관련이 있다. 이러한 대립유전자가 관상 동맥 질병에 대한 위험에 미치는 영향력은 다른 공통 위험 인자와 비교하여 표 1에 제시한다.
추가로, IL-1B 유전자에 대한 대립유전자는 단일 혈관 관상 동맥 질병과 관련이 있다는 것이 발견되었다. 이러한 대립유전자는 관상 동맥 질병에 대한 위험이 1.74배 증가된 것과 관련이 있다.
표 1
위험 인자 관상 동맥 질병에 대한 위험 증가
흡연(1팩/일) 2.5
주로 앉아서 생활하는 양식 1.9
중증 비만(여성) 3.3
고혈압 2.1
고콜레스테롤(>240) 2.4
IL-1RN(VNTR) 대립유전자 2 - 이형접합성 2.4
IL-1RN(VNTR) 대립유전자 2 - 동형접합성 5.4
IL-1B(-511) 대립유전자 2 1.74-1.92
실시예 2: 다중 혈관 관상 동맥 질병에 대한 마커
본 연구의 목적은 보다 후기의 또는 보다 확산된 형태의 관상 동맥 죽상경화증, 즉, 다중 혈관 관상 동맥 질병을 앓는 환자가 IL-1 유전자 클러스터 또는 TNFα에서 특이적인 대립유전자를 가질 가능성이 높은지를 측정하는 것이었다.
환자 코호트: 환자 코호트는 실시예 1에서와 같이 결정되었는데, 단, 육안으로 평가하였을 때, 1개 초과의 심장외막 관상 혈관이 내강 직경을 >50%로 축소시키는 심장외막 협착을 포함한다면, 환자는 다중 혈관 질병을 앓는 것으로 분류하였다. 검사한 환자중 여든 여섯명(86)은 혈관조영술 소견상 정상적인 관상 동맥을 갖는 대조군으로서 분류되었고, 315명의 환자는 다중 혈관 관상 동맥 질병을 앓는 것으로 밝혀졌다. 대조군과 단일 혈관 질병군, 둘 모두의 평균 연령은 각각 57.6±10.4세, 및 60.8±1.13세로 유사하였다. 대조군에서 남성 대 여성의 비는 1:1.7이었고, 질병군에서는 3.7:1이었다.
일반적인 방법: 반응 및 방법은 실시예 1과 같았다.
결과: 대조군과 질병에 걸린 환자들 사이에 IL-1A(-889 마커), IL-1B(+3954 마커), 및 IL-1RN(VNTR 마커)에 대하여 유전자에서 상이한 대립유전자의 빈도상의 유의적인 차이는 없었다. 그러나, 38%인 대조군과 비교하여 다중 혈관 관상 질병에서는 IL-1B 유전자 -511 마커 Bsu36I 대립유전자(대립유전자 2)의 하나의 카피를 보유하는 것이 54%로 증가하였다. -511 마커 대립유전자 2의 하나 이상의 카피를 갖는 개체가 대립유전자 2에 대하여 음성인 환자보다 다중 혈관 관상 동맥 질병에 걸릴 가능성이 1.92배 더 높은 것으로 예측된다(교차비+1.92, p=0.009, 95% 신뢰구간=1.17-3.16)
요약하면, IL-1B 유전자에 대한 대립유전자는 다중 혈관 관상 동맥 질병과 관련이 있다고 발견되었다. 이러한 대립유전자는 관상 동맥 질병에 대한 위험이 1.92배 증가된 것과 관련이 있다.
각각의 단일 혈관 및 다중 혈관 관상 동맥 질병은 IL-1 유전자 클러스터의 상이한 유전자와 연관이 있는 것으로 보인다. 이는, IL-1RA가 단일 혈관 표현형을 생산하는 방식으로 IL-1β 효과를 조정한다는 점에서 확실한 생물학적 특질로서 발생할 수 있다. 별법으로, 상기 두 유전자 모두는 실제 전체적으로 관상 동맥 질병 과 관련이 있고, 여기에서 관찰되는 연관성은 이러한 특정 집단이 관상 동맥 질병을 나타낸 방식으로부터 발생한다. 해석을 통해, IL-1 생물 현상과 관상 동맥 질병 사이의 강한 연관성이 확립되었다.
실시예 3: 인터루킨-1 유전자 변이체와 경동맥 동맥벽 두께의 연관성
경동맥 내막 중간막 벽 두께(IMT: intima-medial thickness)와 염색체 2상의 인터루킨-1(IL-1) 유전자 클러스터내 4개의 기본 이대립유전자성 마커(IL-1A(+4845), IL-1B(+3954), IL-1RN(+2018)) 사이의 연관성은 미국의 4개 지역으로부터 선택된 45-64세의 15,792명의 남녀 코호트인, 동맥경화증 위험 지역(ARIC: Atherosclerosis Risk in Communities) 참가자중에서 조사하였다. 원거리 벽 두께를 B-모드 초음파로 측정하고, 심혈관 질환의 위험이 가장 큰 개체를 동정하기 위하여 연역적으로 선택된, 평균 IMT 증가(≥ 1 mm)에 대한 절사점을 사용하여 분석하였다. 심혈관 질환에 대한 병력이 있는 참가자는 제외시킨 후, 52명의 흑인과 924명의 백인의 층화 무작위 샘플에 대하여 유전자형을 분석하였다. 연령, 성별 및 연구 센터에 대하여 조절된 기본 모델에서 흑인중에는 IL-1RN(+2018)의 공통 대립유전자(대립유전자 2)를 덜 보유하는 자는 보유하지 않는 자보다 평균 IMT가 ≥ 1 mm일 가능성이 더 높았다(16% 대 5% p=0.04). 백인중에서, IMT가 증가한 개체의 조절된 비율은 또한 IL-1RN(+2018) 대립유전자 2를 보유하는 백인에서 보다 높았지만(9% 대 6%), 이러한 차이는 통계학적으로 유의적이지 않았다(p=0.10). 어느 인종군에서든지 IL-1A(+4845), IL-1B(+3954) 또는 IL-1B(-511) 변이체와 경동맥 IMT 사이에는 어떤 연관성도 없었다.
실시예 4: 플라크 형성과 플라크의 취약성 증가와 관련된 IL -1 유전자형
IL-1 수용체 길항제에 대한 유전자와 연관된 IL-1B(-511) 유전자에서 다형태는 관상 동맥내 큰(혈관의 >50%가 폐색) 플라크가 존재하는 것 및 경동맥 동맥벽내 조기의 죽상경화성 변화(ARIC 데이타)와 강한 연관성을 갖고 있다. 이러한 데이타는, IL-1RN(+2O18) 대립유전자 2 및/또는 IL-1B(-511) 대립유전자 2를 포함하는 유전자 다형태 패턴은 큰, 폐색성 플라크의 전조가 된다는 것을 제안한다.
특정 IL-1 유전자형은 임상적 사건, 예로서, 혈전증 및 색전증에 대한 위험이 증가되었다는 것과 관련이 있다. 본 발명자는, 유전자좌 IL-1A(+4845) 및 IL-1B(+3954)중 어느 것 또는 그 둘 모두에서의 대립유전자 2가 염증 반응을 증가시키고, 이로써 플라크 취약성과 임상적 사건, 예로서, 혈전증 및 색전증에 대한 위험을 증가시키는 것으로 예측된다는 것을 제안한다. 이러한 위험은 콜레스테롤 수준이 낮은 개체에서 가장 큰데, 이는 심지어 IL-1 야생형에서도 더 높은 수준이 최대 염증 반응을 활성화시키는 것으로 예측되기 때문이다(예컨대, IL-1A(+4845)=1.1 및 IL-1B(+3954)=1.1).
본 발명자는, 보다 큰 폐색 플라크와 관련된 유전자형, 즉, IL-1RN(+2O18) 대립유전자 2 또는 IL-1B(-511) 대립유전자 2가 플라크 취약성에 대한 위험은 더 작다는 것에 대한 전조가 된다는 것을 제안한다.
임상적 사건에 대하여 장기간 동안 흥미를 갖고 연구된 대략 15,000명의 건강한 개체(ARIC)중, 370명의 혈전 또는 색전증 사건을 문서로 기록하였다. 비교용으로 대략 900여명의 무작위화된 층화 대조군을 선택하였다.
IL -1A(+4845) 및 IL -1B (+3954)에서의 대립유전자 2가 취약 플라크-관련된 임상적 사건에 영향을 준다:
● LDL<130인 경우(n=535)
IL-1A(+4845) 유전자형 2.2: 임상적 사건에 대한 교차비(OR + 95%CI) = 3.03 (0.96-9.1); p=0.059
● 총 콜레스테롤<200인 경우(n=425)
IL-1A(+4845) 유전자형 2.2: OR = 6.25(1.69-20.00); p=0.006
IL-1B(+3954) 유전자형 1.2 또는 2.2: OR = 2.58(1.25-5.31); p=0.010
IL -1 RN (+2 O18 )에서의 대립유전자 2는 취약 플라크-관련된 임상적 사건과 반비례 관계에 있고, 이로써, 죽상경화 플라크의 안정성을 제안한다:
● 모든 경우(n=1214)
IL-1RN(+2O18) 유전자형 1.2 또는 2.2: OR= 0.65(0.43-0.96); p=0.031
● LDL>160인 경우(n=343)
IL-1RN(+2O18) 유전자형 1.2 또는 2.2: OR= 0.33(0.14-0.73); p=0.058
● 총 콜레스테롤>240인 경우(n=307)
IL-1RN(+2O18) 유전자형 1.2 또는 2.2: OR=0.28(0.11-0.68); p=0.054
실시예 5: 일배체형 패턴 1과 일치하는 IL -1 복합 유전자형은 치주염과 관련이 있고, 일배체형 패턴 2와 일치하는 IL -1 유전자형은 폐색 심혈관 질환과 관련이 있다.
치주염, 심혈관 질환과 염색체 2상의 인터루킨-1(IL-1) 유전자 클러스터내 4개의 기본 이대립유전자성 마커(IL-1A(+4845), IL-1B(+3954), IL-1RN(+2018)) 사이의 연관성을 조사하였다.
2개의 일배체형 패턴을 표에 제시한 바와 같이, IL-1 유전자 클러스터내 4개의 다형태 유전자좌로 정의하였다(IL-1A(+4845), IL-1B(+3954), IL-1B(-511), IL-1RN(+2O18)). 하나의 패턴은 IL-1A(+4845) 및 IL-1B(+3954) 유전자좌, 둘 모두에 대립유전자 2를 포함한다. 다른 패턴은 IL-1B(-511) 및 IL-1RN(+2O18) 유전자좌, 둘 모두에 대립유전자 2를 포함한다.
표 2
일배체형 IL-1A(+4845) IL-1B(+3954) IL-1B(-511) IL-1RN(+2O18)
패턴 1 대립유전자 2 대립유전자 2 대립유전자 1 대립유전자 1
패턴 2 대립유전자 1 대립유전자 1 대립유전자 2 대립유전자 2
일배체형 패턴은 대립유전자 2가 하나의 유전자좌에서 발견되면, 다른 유전자좌에서도 발견될 가능성이 매우 높다는 것을 지시한다. 이전 데이타[Cox et al. (1998) Am. J. Hum. Genet. 62:1180-1188]는, 대립유전자 2가 IL-1A(+4845) 유전자 좌에서 발견되면, 대립유전자는 2 또한 대략 80%는 그 시점에 IL-1B(+3954) 유전자좌에 존재할 것이라는 것을 지시한다. 일배체형 패턴은 염색체 단일 카피에만 관련이 있다. 염색체 2의 카피는 2개 존재하고, 표준 유전자형 분석 방법을 통해서는 어떤 염색체 카피상에서 특이적인 대립유전자가 발견되는지 확인할 수 없기 때문에 특이적인 통계학적 프로그램을 사용하여 결정된 유전자형 패턴으로부터 일배체형 패턴을 추론한다.
이들 유전자 패턴 분포는 죽상경화증 연구의 일부분인 새로운 집단에서 평가하였다[Pankow et al. (1999) The ARIC study. European Atherosclerosis Society Annual Meeting, Abstract, #646]. 이 집단(N=1,368)에서, IL-1A(+4845) 유전자형 2.2는 대상자의 10.2%에서 확인되었다. 그러나, 유전자형 1IL-1B(+3954)=2.2를 갖는 대상자(N=95)에서, IL-1A(+4845) 유전자형 2.2는 대상자의 71.6%에서 확인되었다. 이는, IL-1A(+4845)에서의 대립유전자 2는 IL-1B (3954)에서의 대립유전자 2와 함께 동시에 유전되는데, 집단에서 이들 마커 각각의 분포를 가정할 때 예측되는 것보다 더욱더 높은 비율로 동시에 유전된다는 것을 지시한다. 패턴 2를 특징으로 하는 2개의 유전자좌에서의 대립유전자 2에 대한 유사한 데이타가 존재한다. 추가로, 유전자형 패턴 1이 확인되는 경우, 다른 패턴을 특징으로 하는 유전자좌중 어디에도 대립유전자 2가 존재할 가능성은 없다.
2개의 유전자형 패턴 또한 인터루킨-1의 기능적 생물 현상상의 특이적인 차이와 관련이 있다. 예를 들면, IL-1B(+3954)에 대립유전자 2의 카피를 1개 또는 2개 갖는 개체로부터 유래된 말초 단핵구는 LPS로 자극을 받았을 때, 유전자형 패턴 1IL-1B(+3954)=1.1을 갖는 개체로부터 유래된 단핵구보다 2 내지 4배 더 IL-1□을 생산하였다[DiGiovini, FS et al. (1995) Cytokine, 7:606). 최근에 중증 치주염을 앓는 개체로부터 단리된 말초 혈액 다형핵 백혈구에 대하여 유사하 데이타가 보고된 바 있다[Gore, EA et al. (1998) J. Clin. Periodontal., 25:781]. 추가로, 패턴 1을 지시하는 복합 유전자형을 갖는 대상자로부터 유래된 치은 열구액(GCF: gingival crevice fluid)은 상기 유전자형에 대하여 음성인 개체로부터 유래된 GCF보다 2 내지 3배 더 높은 수준의 IL-1□을 갖는다[Engelbretson, SP et al. (1999) J. Periodontal., in press]. 패턴 2의 경우, IL-1RN +2018의 대립유전자 2는 IL-1 수용체 길항제 단백질의 수준 감소와 관련이 있음을 지시하는 데이타도 있다. 따라서, 패턴 1 유전자형은 IL-1 효현제 증가와 관련이 있는 것으로 보이고, 패턴 2는 IL-1 수용체 길항제 수준 감소와 관련이 있는 것으로 보인다.
패턴 1과 일치하는 복합 IL-1 유전자형은 중증의 성인 치주염에 대한 감수성인 증가되었다는 것과 관련이 있다([Kornman, KS et al. (1997), 상기 동일]; [Gore, EA et al. (1998), 상기 동일]; [McGuire, MK et al. (1999) J. Periodontal., in press]; [McDevitt, MJ et al. (1999) J. Periodontal., in press]). IL-1 유전자형이 치주염에 미치는 효과의 한 측면은 순응된 치주 병원체를 포함하는 특이적인 세균 복합체의 치은하 수준을 상승시키는 것으로 보인다[Socransky, SS et al. (1999) IADR Annual Meeting, Abstract#3600]. 그러나, 패턴 1 유전자형은 폐색 심혈관 질환에 대한 위험 증가와는 관련이 없었다. ([Pankow et al., 상기 동일](Pankow and co-workers)을 참조할 수 있다)에 제시된 동맥경화증 위험 지역(ARIC) 연구로부터 얻은 데이타에서, 폐색 심혈관 질환을 지시하는 경동맥벽 내막-중간막 두께(IMT)에 대하여 초음파 측정을 개체를 IL-1 유전자 다형태에 대하여 층화 무작위 대조군 집단에 비교하였다. IL-1A(+4845) 또는 IL-1B(+3954), 어떤 것도 높은 IMT에 대한 위험과는 어떤 연관성도 보이지 않았다.
최근, 패턴 2를 특징으로 하는 유전자형은 폐색 관상 동맥 질병에 대한 감수성 증가와 관련이 있었지만, 치주염에 대한 위험 증가와는 관련이 없었다. 관상 동맥 질병에 대한 기록에서, 관상 협착증에 대한 혈관조영술상의 증거를 갖는 환자는 IL-1RN(+2018) 유전자좌 또는 IL-1B(-511) 유전자좌에서 대립유전자 2를 보유하는 보유자일 가능성이 현저히 더 높았다([Francis et al., 상기 동일]을 참조할 수 있다). 상기 유전자좌 둘 모두 일배체형 패턴 2의 특징이 된다. 상기 논의된 바와 같이, ARIC 연구에서, 높은 IMT 치수를 갖는 흑인이 IL-1RN(+2018) 대립유전자 2를 보유하는 것은 동일한 인종의 대조군보다 현저히 더 높았다. 높은 IMT 치수를 갖는 백인이 IL-1RN(+2018) 대립유전자 2의 카피를 1개 보유하는 것은 대조군보다 현저히 더 높았지만, 상기 유전자좌에서 동형접합성인 개체는 대조군과 상이하지 않았다. 본 연구에서 백인의 경우, IL-1RN(+2018) 대립유전자 2에 대해 동형접합성인 개체의 유병율은 다른 집단에서 관찰되는 것보다 실질적으로 더욱 낮았다는 것에 주의하여야 한다.
치주염을 앓는 개체 및 치은이 건강한 개체를 패턴 1 및 패턴 2에 일치하는 유전자형 패턴에 대하여 평가할 때, 중증의 성인 치주염을 앓는 개체는 패턴 1에 일치하는 유전자형의 우위성을 갖는 것으로 밝혀진 반면, 치주 상태가 건강한 개체 는 패턴 1이나 패턴 2, 어떤 것에서도 우위하지 않는 유전자형 패턴을 가졌다. 그러므로, 일배체형 패턴 1에 일치하는 IL-1 유전자형은 중증의 치주염 및 플라크 취약성 질환과 관련이 있지만, 폐색성 심혈관 질환과는 관련이 없는 반면, 일배체형 패턴 2에 일치하는 IL-1 유전자형은 폐색 심혈관 질환과 관련이 있지만, 치주염 또는 플라크 취약성과는 관련이 없다. IL-1 유전자형 패턴 1이 플라크 취약성에 직접적으로 영향을 준다는 것이 첫번째 기전일 수 있고; 또다른 기전은 패턴 1이 치주염에 직접 영향을 주고, 이것이 경구의 만성 염증 과정의 일부에서 발견된 치주 미생물을 통해 간접적으로 심혈관 질환에 영향을 줄 수 있다는 것이다. 또다른 기전은 IL-1 유전자형 패턴 2가 직접 심혈관 폐색 질환에 영향을 주지만, 치주염에는 영향을 주지 않는다는 것일 수 있다. 따라서, IL-1 유전자 다형태는, 심혈관 질환 및 중증 치주염, 둘 모두에서 동일한 방식으로 직접 면역염증 반응을 변경시키는 공통의 근본적인 기전에 의해, 및 경구 세균 적재량을 증가시키고, 심혈관 질환에 영향을 주는 간접적인 기전에 의해 심혈관 질환 및 중증 치주염, 둘 모두에 영향을 줄 수 있다. 일배체형 패턴 1에 일치하는 IL-1 유전자형은 면역-염증 반응 및 치은하 세균 적재량, 둘 모두를 증폭시킴으로써 집단중 일부분에서 치주염과 심혈관 질환 사이의 연관성에 영향을 줄 수 있다.
실시예 5: 메이요 의료원( Mayo Clinic ) 연구
연구 디자인 . 미국 미네소타주 로체스터에 소재하는 메이요 의료원에서 임상적으로-지시되는 관상 혈관조영술을 받은 18세 내지 75세의 환자가 본 연구에 대해 고려되었다. 만역 환자가 요법이 필요한 당뇨병을 앓고 있고, 흡연 경력이 년간 >50 팩이고, 이전 장기 이식을 받았거나 또는 그러한 계획이 있고, 임신중이고, 경피적 또는 외과적 관상 혈관재생을 받은 적이 있고, 활동성 출혈을 갖거나 헤모글로빈이 8g/dL 미만이고, 30일 이내에 수혈을 받은 적이 있고, 혈류역학적 상태가 불안정하고, 인간 면역결핍 바이러스로 감염되었고, 투석이 필요한 신부전증을 앓고 있고, 흉부에 방사선 요법에 대한 경력을 갖고 있다면, 환자를 상기에 포함시키기에는 부적격하였다. 504명의 환자는 본 연구에 적격이며, 본 기간 동안 관상 혈관조영술을 받은 환자중 >90%에 해당한다.
혈관조영술 분석 . 관상 혈관조영도는 휴대용 캘리퍼스를 사용하여 분석하거나 육안으로 분석하고, 정상적인 관상을 보이는 것(협착이 전혀 없거나 <10%인 평활근 동맥), 경미한 질병(내강 직경이 10% 내지 50% 축소된 관상 동맥), 단일 혈관 질병(단일 관상 동맥 또는 그의 주된 분지에서 ≥50%), 혈관 2개의 관상 동맥 질병(2개의 관상 동맥에서 내강 직경이 ≥50%로 협착) 및 혈관 3개의 질병(3개의 관상 동맥에서 내강 직경이 ≥50%로 협착)으로 분류하였다. 환자의 위험 인자 및 유전자분석에 대한 알지 못한 상태에서 혈관조영도를 분석하였다.
실험실 분석 . COBAS MIRA 시스템상에서 아포지질단백질 A1, 아포지질단백질 B, Lp(a) 및 섬유소원 검정법을 실시하였다. 본 검정법에 대한 정상 범위는 아포지질단백질 A1은 115-190 mg/dL; 아포지질단백질 B는 70-160 mg/dL; 및 Lp(a)는 2.5 -7.0 mg/dL이고; 섬유소원의 정상 범위는 보고되지 않았다. 총 혈장 호모시스테인을 측정하였다.
정의 비흡연자이거나 당뇨를 앓지 않는 환자의 부모 자식관계(first degree relative)에서 ≤55세일 때 관상 질병이 발병된 경우, 관상 질병에 대한 병력이 있는 것으로 간주하였다. 고지질혈증은 총 콜레스테롤이 ≥250 mg/dL이거나, LDL이 ≥150 mg/dL인 것, 또는 치료전 지질 값을 알지 못하는 환자가 지질-강하제로 현재 치료받고 있는 것으로서 정의한다. 협심증 및 심부전증은 각각 캐나다 심장 학회(Canadian Heart Association) 및 뉴욕주 분류 계획안(New York State classification schemes)에 따라 분류되었다.
통계학적 방법 . 값을 백분율, 및 평균 ± 표준편차로 표시한다. 교차비에 대한 95% 신뢰구간은 괄호로 제시한다.
관상 질병의 상관관계를 측정하는 예비 분석에서, 질병을 앓지 않거나, 경미한 질병, 1개-혈관 질병, 2개-혈관 질병, 및 3개-혈관 질병을 앓는 환자중 IL-1 클러스터 유전자중에서 다양한 종래의 위험 인자 및 최근의 위험 인자 뿐만 아니라, 대립유전자 변이체의 연관성을 시험하기 위하여 먼저 카이-제곱 시험 및 원-웨이 ANOVAs를 실시하였다. 이어서, 질병을 앓지 않거나, 경미한 질병을 앓는 환자와 1-, 2-, 또는 3개-혈관 협착증을 앓는 환자를 비교하기 위하여 관상 동맥 질병을 재분류하였다. 몇몇은 차단되어 있지만, 관상 협착이 <50%인 환자를 경미한 관상 질병을 앓는 것으로 간주하고, 차단되지 않는 환자(질병을 앓지 않는 환자)도 분류하고, 1, 2, 또는 3개의 관상 동맥에서 ≥50%가 협착된 환자는 추가 분석을 위해 함께 분류하였는데, 이러한 환자는 관상 동맥 협착 정도가 유의적인 것으로 간주되었기 때문이다. 경향에 대한 정확한 시험을 사용하여 다형태를 갖는 환자에 비례하 는 경향에 대하여 시험하였다.
주어진 사분위수 및 삼분위수 증가에 대해 기록된 교차비를 사용하여 사분위수 및 삼분위수에 따른 다양한 위험 임자에 대하여 로지스틱 회귀 모델을 피팅하였다. IL-1 클러스터 유전자의 대립유전자 변이체와 관상 동맥 질병의 연관성을 추가로 분석하기 위하여 각 모델에 포함된, 통계학적으로 유의적인 교란 요인을 사용하여 다중 로지스틱 회귀 모델을 피팅하였다. 종래의 위험 인자 및 최근의 위험 인자 모두를 모델에 포함된 것으로 간주하고, 본 모델에 포함된 모든 인자가 통계학적으로 유의적인, 최상의 피팅 모델을 수득하기 위하여 단계적인 방식으로 모델을 피팅하였다. 추가로, 잠재적인 효과 변경자는 본 모델에 포함된 것으로 간주하였다. 다중 로지스틱 회귀 모델에 대한 반응은 상기 정의된 바와 같은 유의적인 관상 동맥 협착의 존재 또는 부재였다.
본 연구에 포함된 모든 대상자를 분석하는 것 이외에도, ≤￡60세인 대상자 및 >60세인 대상자에 대하여 별개로 추가의 통계학적 분석을 실시하였다. 연령에 따른 분석이 적절하다고 간주되었는데, 이는 연령이 관상 동맥 질병에 대한 강한 위험 인자로 보였고, 다인성 질병에서 유전자 영향은 조기 발병 사례에서 가장 명확한 것으로 생각되기 때문이다. 추가로, 우위성을 통해 유전적 영향이 남성 및 여성에 대하여 상이한 결과를 초래한다는 것을 결정할 수 있기 때문에, 성별에 따른 하위세트 분석 또한 중요한 것으로 간주되었고, 남성과 여성을 몇몇 분석에서는 따로따로 처리하였다.
실시예 6: 뮌헨( Munich ) 연구
방법
환자
본 연구는 뮌헨 소재의 독일 심장센터(Deutsches Herzzentrum Munchen)와 뮌헨 기술 대학 산하 제1 의과 병원(1. Medizinische Klinik rechts der Isar der Technischen Universitat Munchen)에서 관상 스텐트 이식을 받은 적이 있는, 증후성 관상 동맥 질병을 앓는 1850명의 일관된 백인 환자를 포함하였다. 환자들 모두는 6개월째에 혈관조영술 추적 관찰에 대한 일정을 갖고 있었다. 본 연구에 참가한 모든 환자는 시술, 추적 관찰의 혈관조영술, 및 유전자형 측정에 대하여 동의서를 작성하였다. 본 연구 프로토콜은 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki)에 따랐고, 기관 윤리 위원회의 승인을 받았다.
표 1. 기준선의 임상적 특징
Figure 112008043293081-PCT00001
스텐트 설치 및 스텐트 시술후 요법에 대한 프로토콜에 대하여 당업자는 잘 알고 있다. 대부분의 스텐트를 종래 확장술 풍선상에 수동 부착식으로 이식시켰다. 시술후 요법은 아스피린(100 mg씩 1일 2회, 무기한) 및 티클로피딘(4주간 250 mg씩 1일 2회)으로 구성되었다. 스텐트 이식후 흐름 손상을 갖는 해체 또는 잔류 혈전으로 인하여 차선의 결과를 얻은 환자는 스텐트 삽입술 동안 볼루스 주입으로서, 및 이후 12-시간 동안 연속된 주입으로 압식시맙을 투여받은 추가의 요법을 받았다. 압식시맙 투여에 대한 결정은 수술자 재량하에 이루어졌다.
IL-1RN 유전자형 측정
QIAamp 블러트 키트(QIAamp Blood Kit)(독일 힐덴에 소재하는 Qiagen) 및 하이 퓨어 PCR 템플레이트 프리파레이션 키트(High Pure PCR Template Preparation)(독일 만하임에 소재하는 Boehringer Mannheim)를 사용하여 200 ml의 말초 혈액 백혈구로부터 게놈 DNA를 추출하였다.
IL-1RN 유전자형 분석은 ABI 프리즘 시퀀스 디텍션 시스템(ABI Prism Sequence Detection System)(독일 바이터슈타트에 소재하는 PE Applied Biosystems)를 사용하여 실시하였다. 5' 뉴클레아제 반응에서 대립유전자-특이 형광원성 프로브를 사용하는 것은 DNA 증폭 및 유전자형 측정을 단일 검정법 33과 조합한다. 엑손 2의 단일 염기쌍 다형태인 IL-1RN(+2018)은 본 연구 26에 대해 분석된 다형태였다. 프라이머 및 프로브의 뉴클레오티드 서열은 하기와 같았다: 전향 프라이머 5' GGG ATG TTA ACC AGA AGA CCT TCT ATC T 3', 역향 프라이머 5' CAA CCA CTC ACC TTC TAA ATT GAC ATT 3', 대립유전자 1 프로브 5' AAC AAC CAA CTA GTT GCT GGA TAC TTG CAA 3', 대립유전자 2 프로브 5' ACA ACC AAC TAG TTG CCG GAT ACT TGC 3'. 대립유전자 1에 대한 프로브를 형광 염료 6-카복시-플루오레세인(FAM)으로 표지하고, 대립유전자 2에 대한 프로브는 5' 단부를 형광 염료 테트라클로로-6-카복시-플루오레세인(TET)로 표지하였다. 2개의 프로브 모두는 그의 3' 단부를 소광체 6-카복시-테트라메틸-로다민(TAMRA)으로 표지하였다. 열변화(thermocycling) 프로토콜은 95℃에서 15초 동안의 변성; 및 64℃에서 1분 동안 어닐링/신장의 40회 사이클로 구성되었다. 원 대상자 코드와 관련이 없는 신규 대 상자 코드를 갖는 이중 DNA 샘플을 사용하여 20%의 환자에서 측정을 반복함으로써 유전자형을 확인하였다. 두 결과는 서로 100% 일치하였다.
혈관조영술 평가
변형된, 미국 심장병 학회/미국 심장 협회(American College of Cardiology/American Heart Association) 등급 시스템에 따라 관상 병변을 분류하였다. 7 분절 분열을 사용함으로써 양방향 혈관조영도에 기초하여 좌심실 기능을 정량적으로 평가하였다; 좌심실 기능 저하에 대한 진단은 조영 혈관조영도에서 2개 이상의 운동이 부족한 분절의 존재하에서 확립되었다. 스텐트 시술 직전, 스텐트 시술후 즉시, 그리고 후속 과정에서 자동 에지-검출 시스템 CMS(네덜란드 누에넨에 소재하는 Medis Medical Imaging Systems)를 사용하여 수득한 혈관조영도상에서 정량적 컴퓨터-보조 혈관조영술 분석을 오프-라인으로 실시하였다. 수술자는 환자의 IL-1RN 유전자형에 대해서는 알지 못했다. 평가하는 혈관조영도 모두에 대해 표적 병변의 동일한 투사를 사용하였다. 최소 내강 직경, 간입성 기준 직경, 직경 협착, 병변 길이 최대로 팽창한 풍선의 직경이 본 분석 시스템을 사용하여 수득한 혈관조영술 파라미터였다. 조기 내강 증대량은 시술 종결시의 최소 내강 직경과 시술 이전의 최소 내강 직경 사이의 차이로서 계산하였다. 후기의 내강 손실량은 시술 종결시의 최소 내강 직경과 추적 관찰 혈관조영술시의 최소 내강 직경 사이의 차이로서 계산하였다. 손실율은 후기 내강 손실량과 조기 내강 증대량 사이의 비로서 계산하였다.
정의 및 연구 종료점
본 연구의 1차 종료점은 재협착증이었다. 재협착증에 대한 2개의 기준을 평가하였다: 6개월째의 추적 관찰 혈관조영술에서 직경의 50%에서 협착이 일어난 것으로 정의되는 혈관조영술상의 재협착증 발생, 및 시술후 1년 이상 스텐트 시술받은 부위에 혈관조영술상의 재협착이 존재하는 경우의 허열 증상 또는 증세에 기인한 표적 혈관 혈관재생(PTCA 또는 대동맥 관상 동맥 우회술[CABG: aortocoronary bypass surgery])에 대한 필요성. 평가되는 다른 주요 부작용은 모든 원인으로부터 일어나는 사망, 및 심근경색이었다. 부검시 비심장성 사인인 것이 아니라면 모든 사망의 원인은 심장에 의한 것으로 간주하였다. 급성 심근경색의 진단은 EPISTENT 시험에서 적용된 기준에 기초하였다(새로운 병리학적 Q파 또는 상한의 3배 이상인, 크레아틴 키나제[CK: creatine kinase] 또는 그의 MB 동종효소의 값) 35. CK는 스텐트 시술 이후 48시간 동안에 걸쳐 전신적으로 측정하였다. 1년간의 추적 관찰을 통해 임상적 사건을 모니터하였다. 의사와 이루어진 의사와의 인터뷰 또는 전화상의 인터뷰를 인용하는 병원 재허가 기록에 의해 제공되는 정보에 기초하여 평가하였다. 인터뷰 당시 심장 증상을 나타낸 모든 환자는 외래 환자 진료소에서, 또는 담당 주치의에 의해 1회 이상의 진료 검사 및 심전도 검사를 받았다.
통계학적 분석
이산 변수는 계수 또는 백분율로 표시하고, 적절하게는, 카이-제곱 또는 피셔의 정확 검정과 비교하였다. 연속 변수 평균 SD로 표시하고, 2개 이상의 군에 대한 쌍을 이루지 않는, 양측 t-검정(unpaired, 2-sided t-test) 또는 분산분석에 의해 비교하였다. 주요 분석은 IL-11RN*2 대립유전자의 조합성 이형접합성 및 동형접 합성 보유자와, IL-11RN*1 대립유전자 동형접합성 보유자를 비교하는 것으로 구성되었다. 게다가, IL-1RN 유전자형과 재협착증 사이의 연관성은, IL-1RN*2 대립유전자의 보유자와 비보유자 사이의 비교가 0.30의 P-값을 나타낸 임상적 및 병변-관련 특징도 포함하는 다변량 로지스틱 회귀 모델에서 평가되었다. 이러한 다변량 모델에서, 본 발명자는 IL-1RN 유전자형과 연령 사이의 가능한 상호작용에 대하여 시험하였다. 다인성 과정, 예로서, 재협착증에 대하여 유전적 인자가 미치는 상대적인 기여도는 연령에 따라 감소할 수 있기 때문에, 본 발명자는 사전구체화된 <60세의 환자 하위군에 대한 추가의 분석을 수행하였다. 연속하여 본 발명자는 유전자 용량 효과, 즉, 0개, 1개, 또는 2개의 추정의 대립유전자의 존재하에서 단계적으로 증가하는 표현형 반응을 평가하는 성향에 대한 시험을 사용하였다. 통계학적 유의수준은 P-값 0.05에 대하여 허용되었다.
결과
환자의 특징화
본 연구 집단에서 관찰된 IL-1RN 유전자형은 954명(51.6%)에서 1/1, 742명(40.1%)에서 1/2, 및 154명(8.3%)에서 2/2였다. 따라서, 대립유전자 2 빈도는 0.28이었다. 관찰된 분포는 하디-와인버그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)에 따른다. 환자의 주요 기준선 특징은 표 1에 열거하고, IL-1RN*2 대립유전자의 보유자와 비보유자 사이를 비교하였다. IL-1RN*2 대립유전자 보유자와 비보유자 사이에서는 당뇨병에 대한 빈도가 더욱 높고 좌심실 기능은 저하된 경향을 나타내었다. 다른 특징들은 2개의 군 사이에서 고르게 분포하였다. 시술시의 혈관조영술상의 특징 및 시술상의 특징을 표 2에 나타내고, IL-1RN*2 대립유전자 보유자와 비보유자 사이의 유의적인 차이는 보이지 않았다.
표 2. 시술시의 병변 및 시술상의 특징
Figure 112008043293081-PCT00002
스텐트 시술 이후의 IL -1 ra 다형태 , 사망율 및 심근경색
표 3은 IL-1RN*2 대립유전자 보유자와 비보유자에서 관상 스텐트 시술 이후 처음 30일 이내에 관찰된 임상적 부작용을 나타낸다. IL-1RN*2 대립유전자의 존재 와 사망, 심근경색 또는 표적 혈관 혈관재생 사이에는 어떤 연관성도 존재하지 않았고, 이는 IL-1ra 유전자내 다형태가 관상 스텐트 시술 이후의 조기 혈전 사건에 대한 위험에 관하여 어떤 유의적인 영향도 주지 않는다는 것을 나타낸다.
표 3. 초기 30일 동안 기록된 부작용 발병율
Figure 112008043293081-PCT00003
1-년간의 추적 관찰은 IL-1RN*2 대립유전자의 존재와, 시술 이후의 사망율 또는 심근경색의 발병율 사이에는 어떤 상관관계도 없다는 것을 지시한다. 1년 동안, 사망율은, IL-1RN 1/2 및 IL-1RN 2/2 환자 조합군에서는 2.8%이고, IL-11/1 환자에서는 2.2%이었으며(P=0.42), 교차비는 1.28(95% 신뢰구간, 0.71-2.29)이었다. 비치명적인 심근경색의 발병율은 IL-1RN*2 대립유전자 보유자에서 3.5%이고, IL-1RN*1 대립유전자의 동형접합성 보유자에서는 3.9%이었으며(P=O.54), 각각의 교차비는 0.86(0.53-1.4)이었다.
스텐트 시술 이후의 IL-1ra 다형태 및 재협착증
중간적으로 188일 이후(사분위범위, 171-205일), 84%의 환자에서 관리 혈관조영술을 실시하였다. 관리 혈관조영술을 받은 환자의 비율은 IL-1RN*2 대립유전자의 존재 또는 부재에 의해 정의된 2개의 군에서와 유사하였다. 표 4는 6개월째의 혈관조영도의 정량적 평가 결과를 열거한다.
표 4. 추적 관찰 혈관조영술에서의 결과
Figure 112008043293081-PCT00004
스텐트 시술 이후의 과다형성 반응을 반영하는 손실율은 IL-1RN*2 대립유전자를 보유하는 환자에서 유의적으로 더욱 낮았다는 것은 주목할 만하다. 혈관조영술상 재협착 발병율 또한 IL-1RN 1/1 유전자형의 환자에서는 35.6%인 바, IL-1RN*2 대립유전자의 보유자에서는 30.2%로서 유의적으로 더욱 낮았다. 따라서, IL-1RN*2 대립유전자의 존재가 재협착율을 22% 감소시켰다는 것과 관련이 있다(교차비, 0.78 [0.63-0.97]). 표적 혈관 혈관재생에 대한 필요로서 표시되는 임상적 재협착 또한 IL-1RN*1 대립유전자에 대한 동형접합성 환자에서는 22.7%인 바, IL-1RN*2 대립유전자 보유자에서는 17.7%로서, 유의적으로 더욱 낮았고(P=0.026), 교차비는 0.73(0.58-0.92)이었다.
연령, 성별, 당뇨병의 존재 또는 부재, 흡연 습관, 좌심실 기능 저하 및 재협착증 병변, 혈관 크기(모든 변수는 단변량 분석에서 P-값 0.30으로 상이하였다)를 IL-1RN*2 대립유전자의 존재 또는 부재와 함께 혈관조영술상 재협착증에 대한 다변량 모델에 도입시켰다. 보다 연장자층(P=O.005), 당뇨병 존재(P<O.001), 재협 착증 병변(P<O.001) 및 작은 혈관 크기(P<O.001)는 재협착증에 대한 위험 증가와 독립적인 상관관계에 있었다. 반대로, IL-1RN*2 대립유전자의 존재는 재협착증에 대한 위험 감소와 독립적인 상관관계에 있고(P<0.001), 조절된 교차비는 0.81(0.71-0.92)이었다. 추가로, 보다 어린 환자에서 이러한 대립유전자가 갖는 점진적인 보다 강력한 보호 효과에 의해 반영되는 바, IL-1RN*2 대립유전자 존재와 연령 사이에 유의적인 상호작용이 있다(P=0.009).
사전구체화된 <60세의 환자 하위군(n=696)에서의 분석 결과는 표 5에 제시한다. 1년간의 추적 관찰시, 17.1%의 IL-1RN*2 대립유전자 보유자 및 24.9%의 동형접합성 IL-1RN*1 대립유전자 보유자는 표적 혈관 혈관재생을 필요로 하였다(P=0.013). 따라서, IL-1RN*2 대립유전자의 존재는 허혈-유도성 재시술의 필요성을 37% 감소시키는 것과 관련이 있었다(교차비: 0.63 [0.43-0.91]). (<60세의 590명 또는 85%의 환자에서 실시된) 6개월째 대조군 연구에 대하여 관찰된 정량적 혈관조영술 데이타는 표 5에 제시한다.
표 5. <60세 환자에서의 추적 관찰 혈관조영술 결과
Figure 112008043293081-PCT00005
혈관조영술상 재협착의 발병율은 IL-1RN 1/2 및 IL-1RN 2/2 환자 조합군에서 25.6%이고, IL-1RN 1/1 환자 사이에서는 38.5%였고(P<O.001), 이는 45% 감소된 것에 상응한다(교차비: 0.55 [0.39-0.78]). 재협착의 발병율은 IL-1RN*2 대립유전자에 대한 이형접합성 및 동형접합성과 함께 점진적으로 감소하였다. 혈관조영술상 재협착율은 IL-1RN 1/1 환자에서 38.5%였고, IL-1RN 1/2 환자에서 26.3%였고, IL-1RN 2/2 환자에서는 22.4%였다(P=0.001, 경향에 대한 시험). 표적 혈관 혈관재생율은 IL-1RN 1/1 환자에서 24.9%였고, IL-1RN 1/2 환자에서 17.9%였고, IL-1RN 2/2 환자에서는 13.2%였다(P=0.001, 경향에 대한 시험).
실시예 7. 복합 IL -1 유전자형과 심혈관 질환에 대한 소인의 연관성
IL-1 복합 유전자형을, 염증성 매개 인자의 발현 및 심장 부작용에 대한 위험과 관련시키는 연구를 실시하였다. 복합 유전자형이 동정되고, 그와, 심혈관 질환에 대한 소인의 위험 증가 또는 반대로 위험 감소에 관한 관계도 확인되었다. 또한, 인종 집단에서 우위한 유전자형도 확인되었다. IL-1 유전자 클러스터 복합 유전자형은 환경적 도전, 예로서, LDL("열악") 콜레스테롤의 존재하에 개체의 염증성 인자 발현을 식별함으로써 심장 질병에 대한 유전적 위험을 동정하여 건강한 개체에 도움을 주고, 개인별로 건강을 결정 (예로서, 영양 및 생활 방식)하여 심장을 건강하게 보존시키는데 유용한다.
IL-1 유전자 클러스터 유전자 변이와 생화학적 또는 임상적 결과 사이의 연관성을 평가하는 임상적 연구로부터 데이타를 수득하고, 데이타는 생체마커 변화 또는 질병 위험에 의해 측정된 바, 생물학적/분자적 기전, 질병 임상적 결과 연관성, 및 항-염증성 보충에 대한 반응에 IL-1 유전자 변이가 미치는 효과를 입증한 다.
표 7-1은 백인과 인(본원에서는 한국인)에서 우위한 IL-1 일배체형을 제공한다.
표 7-2에서 제공하는 데이타는 3개의 상이한 복합 유전자형 패턴중 하나를 갖는 개체는 염증의 과다-발현 및 CDV에 대한 위험 증가에 대하여 IL-1 유전자형 "양성"인 것으로 분류되지만, 2개의 상이한 복합 유전자형 패턴중 하나를 갖는 개체는 염증의 과다-발현 및 CDV에 대한 위험 감소에 대하여 IL-1 유전자형 "음성"인 것으로 분류될 것이라는 것을 입증한다.
표 7-3은 인종에 따른, 표 7-2에 나타내는 위험 패턴의 우위성을 제공한다.
표 7-1. 우성 IL-1 일배체형
Figure 112008043293081-PCT00006
표 7-2. CVD 위험 증가 또는 위험 감소와 관련된 IL -1 복합 유전자형
유전자 IL -A IL-1B 시험 추가 정보
SNP 유전자좌 +4845 +3954 +3877 -511 결과
위험 패턴
1a 2* 2* 1.1 1.1 양성 보다 어린 연령대층에서, IL-1β 및 CRP 생체마커의 발현 증가와 함께, CVD 및 1차 심장 마비 위험 증가
1.1 1.1 1.1 1.1 양성
1b 1.1 2* 2* 1.1 양성 보다 어린 연령대층에서, IL-1β 생체마커의 발현 증가와 함께, CVD 및 1차 심장 마비 위험 증가
2* 1,1 2* 1.1 양성
1.1 1.1 2* 1.1 양성
1c 2* 2* 1.1 1.2 양성 보다 어린 연령대층에서, CRP 생체마커의 발현 증가와 함께, CVD 및 1차 심장 마비 위험 증가
2* 1.1 1.1 1.2 양성
1,1 2* 1.1 1.2 양성
1.1 1.1 1.1 1.2 양성
비-위험 패턴 음성
1c' 2* 1.1 2* 1.2 음성 보다 어린 연령대층에서, CVD 및 1차 심장 마비 위험 감소
1.1 2* 2* 1.2 음성
1.1 1.1 2* 1.2 음성
1d 2* 2* 1.1 2.2 음성 보다 어린 연령대층에서, CVD 및 1차 심장 마비 위험 감소
1.1 2* * 2.2 음성
2* 1.1 * 2.2 음성
1.1 1.1 * 2.2 음성
"*"는 오직 하나의 대립유전자가 이러한 유전자형을 위해서는 존재하여야 한다는 것을 지시한다.
표 7-3. 인종에 따른 위험 패턴의 보급률
패턴 백인 일본인 중국인 한국인 흑인
위험 증가
1a 21% 5% 2% 2% 5%
1b 23.5% 30% 26% 19% 15%
1c 14.5% 3% 1% 4% 8%
"위험 증가"의 패턴 1 총합 59% 38% 29% 25% 28%
위험 감소 40.5% 62% 72% 75% 72%
총합 99.5% 100% 101% 100% 100%
염증성 매개 인자 증가와, 심혈관 질환의 위험 증가와 관련된 복합 유전자형 패턴의 연관성
보다 어린 연령대층에서 CVD 및 1차 심장 마비의 위험 증가와 IL-1β 및 CRP 생체마커의 발현 증가 사이의 상관관계를 입증하기 위하여 DARIC(치아 동맥경화증 위험 지역: DARIC: Dental Atherosclerosis Risk in Communities) 연구를 실시하였다.
복합 유전자형 1a 패턴은 GCF IL-1β의 32% 증가(p=0.01) 및 혈청내 CRP의 24% 증가와 관련이 있었다.
복합 유전자형 1b 패턴은 GCF IL-1β의 28% 증가(p=0.02)와는 연관성이 있지만, 혈청내 CRP 수준 증가와의 유의적인 연관성은 없었다.
복합 유전자형 1c 패턴은 GCF IL-1β 수준 증가와의 유의적인 연관성은 없지만, 혈청내 CRP의 54% 증가(p= 0.01)와 연관성이 있다.
또다른 연구도 유사한 결과를 생성하였는데, 이는 패턴 1a가 혈청내 CRP의 81% 증가(p=0.0001)와 연관성이 있고, 패턴 1b가 혈청내 CRP 증가와는 유의적인 연관성이 없으며, 패턴 1c가 혈청내 CRP의 32% 증가(p=0.04)와 연관성이 있음을 보여준다.
IL-1 유전자 변이 및 염증성 매개 인자와 관련된 추가 연구는 표 7-4에 기재한다.
표 7-4: IL-1 유전자 변이 및 염증성 매개 인자의 요약
매개 인자 매개 인자 공급원 질병 노출 (주석 1) 매개 인자 수준 증가와 관련된 IL -1 다형태 참고 문헌 설명
IL-1β 단백질 연관성 PBMCs (주석 2) 없음 IL-1B-511 1* [Iacoviello] (1) LPS 자극 결과: 1.1= 4500pg/ml 1.2= 2100pg/ml 2.2= 800pg/ml
비-연관 PBMCs 없음 IL-1B-511 2* [Hall] (2) 시험관 디자인이 복잡한 것에 기인하여, 실제 측정된 것은 명확하지 않은 바, 데이타를 본 항목에 기록하기는 하지만, 데이타는 유용하지 않다
CRP 연관 혈청 관상 심장 질병 IL-1B +3954 2* IL-1A +4845 2* [Berger] (3) 1a 및 1c에 일치하는 복합 유전자형-성분과는 대조적으로 단일 SNP 분석
혈청 없음 IL-1B-511 1* IL-1B +3954 2* [Eklund] (4) 복합 유전자형과는 대조적으로 단일 SNP 분석
혈청 관상 심장 질병 IL-1B +3954 2* [Latkovskis] (5) 복합 유전자형과는 대조적으로 단일 SNP 분석
주석 1. 본 연구의 대상자는 열거된 증상을 갖는다. 주석 2. PMBCs는 말초 혈액 단핵 세포이다.
표 7-4의 참고 문헌 1. [Iacoviello et al. Arterioscler Thromb Vase Biol 2005; 25: 222-227]. 2. [Hall et al. Arthritis Rheum 2004; 50(6): 1976-1983]. 3. [Berger et al. Cytokine.2002; 17:171-174]. 4. [Eklund et al. Eur Cytokine Netw 2003 Jul-Sep; 14(3): 168-171]. 5. [Latkovskis et al. Eur J Immunogenet 2004; 31 (5) : 207-213].
IL-1B(-511) 1.1 유전자형은 보다 어린 연령대층(<45 남성 및 <50세 여성 (OR=2.2))에서 MI에 대한 위험 증가와 관련되어 있음을 입증하는 연구가 가장 관심의 대상이 된다[Iacoviello]. 추가로, IL-1B(-511) 1.2 유전자형도 보다 어린 연령대층(<45 남성 및 <50세 여성 (OR=2.2))에서 MI에 대한 위험 증가와 관련되어 있다.
또한, 관상 동맥 질병을 앓는 개체가 질병을 앓지 않는 개체보다 MI에 대한 위험이 더 크다는 것, 다혈관 질병(MVD: multi-vessel disease)을 앓는 환자가 단일 혈관 질병(SVD: single vessel disease)을 앓는 환자보다 MI에 대한 위험이 더 크다는 것, 및 질병 정도와는 상관없이, IL-1A +4845 및 IL-1B +3954의 CVD 유전자형(패턴 1a 및 1c와 일치)에 대해 양성인 개체가 음성으로 시험된 개체보다 MI에 대한 위험이 증가되었다는 것을 밝혀낸, 메이요 의료원에서 실시된 연구도 관심의 대상이 된다. 메이요 연구는 또한 IL-1A(+4845) 및 IL-1B(+3954)에서의 양성 CVD 유전자형(패턴 1a 및 1c와 일치)은 또한 심장 카테터 삽입 시점(2세 더 어리다) 및 정형 및 비정형 가슴 통증을 나타내는 시점(2세 더 어리다)이 더 어린 것과 유의적인 연관성이 있음을 밝혀냈다. 마지막으로 본 연구는 CVD 시험에서 양성(즉, 위험 패턴 1a, 1b, 또는 1c)인 것으로 시험된, 관상 동맥 질병을 앓는 개체에서는 기재되어 있는 사전 심장 마비에 대한 위험 증가와 유의적인 연관성이 있다고 밝혀냈다.
CVD 패턴과 심근경색의 연관성 또한 측정하고 하기 표 7-5에 제공한다.
표 7-5: 심장 마비와 CVD 패턴 1의 연관성
"위험" 패턴 유전자형 p-값 교차비
1a 0.01 4.3
1b 0.02 4.1
1c 0.003 7.0
실시예 8. 한국 남성에서 복합 IL-1 유전자형과 심혈관 질환에 대한 소인의 연관성
한국 남성에 존재하는 IL-1 복합 유전자형을 염증성 매개 인자의 발현 및 심 장 부작용에 대한 위험과 관련시키는 연구를 실시하였다. 새로운 유전자 마커, IL-1B(+3877) 대립유전자, 및 IL-1B(+3877) 대립유전자 1의 2개의 카피, IL-1B(-511) 대립유전자 1의 1개의 카피, 및 IL-1B(-511) 대립유전자 2의 1개의 카피를 함유하는 복합 유전자형이 동정되었다. 표 8-1은 CVD와 연관된 IL-1 유전자형 패턴 및 이들 대립 유전자와 다른 IL-1 유전자 클러스터 대립유전자의 연관성을 나타낸다.
표 8-1
패턴 LD 블록 1(1) LD 블록 2(2)
1a + 1.1
1b - 1.1
1c + 1.2
1c' - 1.2
1d + 1.2
기준 - 2.2
(1). 백인에서의 마커는 IL-1A(+4845) 대립유전자 2 + IL-1B(+3954) 대립유전자 2를 포함하고; 아시아인(예컨대, 한국인)에서의 마커는 IL-1B(+3877) 1.1을 포함한다. (2) IL-1B(-511)를 비롯한, IL-1B 프로모터내 기능성 일배체형 마커
백인과 한국인 남성 대상자를 비교하는 연구를 실시하였다. 샘플 집단은 하기와 같았다: MI을 앓는 CAD+인 133명의 대상자(최고 ≤55세), MI을 앓지 않는 CAD+인 169명의 대상자(최고 ≤55세), 및 302명의 대조군. 평균 연령은 54세였다. C-반응성 단백질(CRP) 측정은 하기와 같았다. 3분위는 하기와 같이 분포하였다: <0.37; 0.37-1.08; >1.08 mg/l. CRP ≥ 3 mg/l는 12%의 코호트에서 발견되었다.
표 8-2에 나타낸 바와 같이 CRP 수준은 CVD와 관련된 유전자형과 연관성을 가졌다. 표 8-1에서와 같이, 백인에서의 마커는 IL-1A(+4845) 대립유전자 2 + IL-1B(+3954) 대립유전자 2를 포함하고; 아시아인(예컨대, 한국인)에서의 마커는 IL-1B(-511)을 비롯한, IL-1B 프로모터내 기능성 일배체형의 IL-1B(+3877) 1.1. 마커를 포함한다.
표 8-2 패턴 LD 블록 1(1) LD 블록 2(2) 백인 표현형 (CVD 증가) 한국인 표현형 (CVD 증가)
1a + 1.1 증가 (공통되지 않는 유전자형)
1b - 1.1
1c + 1.2 증가 증가
1 c' - 1.2
1d + 1.2 (공통되지 않는 유전자형) 증가
기준 - 2.2
CDV-관련 유전자형의 상대적인 분포는 표 8-3에서 제공한다. 표 8-1에서과 같이, 백인에서의 마커는 IL-1A(+4845) 대립유전자 2 + IL-1B(+3954) 대립유전자 2를 포함하고; 아시아인(예컨대, 한국인)에서의 마커는 IL-1B(+3877) 1.1을 포함한다.
표 8-3 패턴 LD 블록 1 LD 블록 2 백인 대상자(%) 백인 표현형 한국인 대상자(%) 한국인 표현형
1a + (-511) 1.1 21 조기 MI, CAD (1) 1
1b - (-511) 1.1 23.5 조기 MI , CAD (1) 20 조기 MI 대 CAD
1c + (-511) 1.2 14.5 조기 MI 7 조기 MI 대 CAD; 조기 MI 대 대조군
1 c' - (-511) 1.2 30 조기 MI 50 조기 MI
1d + (-511) 1.2 1 10 조기 MI 대 CAD; 조기 MI 대 대조군
기준 - (-511) 2.2 10 기준군 (2) 12 기준군
(1)은 예로서, oxPL과 같은 챌린지 존재하의 관상 동맥 질병의 위험 증가를 나타내고; (2)는 oxPL과 같은 챌린지 부재하의 관상 동맥 질병의 위험 증가를 나타낸다.
본 연구에서, 심근경색(MI)을 앓는 대상자는 대조군 대상자와 비교하였다. 133명의 CAD+ MI+ 및 302명의 대조군이 있었다; 데이타를 연령, BMI, 및 흡연에 대하여 조절하였다. MI의 위험을 지시하는 유전자형 패턴은 IL-1B(-511) 대립유전자 2의 2개의 카피 및 IL-1B(+3877) 대립유전자 1의 2개의 카피을 함유하는 것으로 측정되었다(패턴 1d; p-0.01). MI의 위험을 지시하는 또다른 유전자형 패턴은 IL-1B(-511) 대립유전자 1, IL-1B(-511) 대립유전자 2 및 IL-1B(+3877) 대립유전자 1의 2개의 카피를 함유한다(패턴 1c; p=0.09).
추가 분석에서, MI를 앓는 보다 어린 연령대층(55세 이하)의 대상자를 그보다 연장자층인(56세 이상) 대조군과 비교하였다. 97명은 ≤55세의 질병이 발병된 CAD+ MI+ 대상자이고, 132명은 56세 이상의 대조군이었다. 데이타를 BMI 및 흡연에 대하여 조절하였다. MI의 위험을 지시하는 유전자형 패턴은 IL-1B(-511) 대립유전자 2의 2개의 카피 및 IL-1B(+3877) 대립유전자 1의 2개의 카피(패턴 1d; p=0.01)을 함유하는 것으로 측정되었다. MI의 위험을 지시하는 또다른 유전자형 패턴은 IL-1B(-511) 대립유전자 1, IL-1B(-511) 대립유전자 2 및 IL- IB(+3877) 대립유전자 1의 2개의 카피(패턴 1c; p=0.05)를 함유한다.
추가로, MI를 앓는 대상자를 MI를 앓지 않는 대조군과 비교하였다. 133명은 MI 양성 대상자이고 169명은 MI 음성 대상자였다. 일반적으로, MI 음성 대상자가 보다 연장자층이고, 체중이 덜 나가고, 알콜 섭취량이 더 많았다. 데이타를 연령, BMI, 흡연, 혈청 지질 수준을 치료하는 약물 치료에 대하여 조절하였다. MI의 위험을 지시하는 유전자형 패턴은 IL-1B(-511) 대립유전자 1의 2개의 카피 및 IL-1B(+3877) 대립유전자 2(패턴 1b; p=0.15)을 함유하는 것으로 측정되었다. MI의 위험을 지시하는 또다른 유전자형 패턴은 IL-1B(-511) 대립유전자 1, IL-1B(-511) 대립유전자 2 및 IL-1B(+3877) 대립유전자 1의 2개의 카피(패턴 1c; p=0.02)를 함유 한다. MI의 위험을 지시하는 또다른 유전자형 패턴은 IL-1B(-511) 대립유전자 2의 2개의 카피 및 IL-1B(+3877) 대립유전자 1의 2개의 카피(패턴 1d; p=0.02)를 함유한다.
추가 분석에서, CAD 및 MI를 앓는 55세 이하의 대상자를 MI를 앓지 않고 CAD를 앓는 대조군과 비교하였다. 77명의 MI+ 대상자와 79명의 MI- 대상자가 있었다. MI 음성대상자는 보다 연장자층이고, 체중이 덜 나가고, 알콜 섭취량이 더 많은 경향이 있었다. 데이타를 BMI, 흡연, 및 HDL 함량에 대하여 조절하였다. MI의 위험을 지시하는 유전자형 패턴은 IL-1B(-511) 대립유전자 1의 2개의 카피 및 IL-1B(+3877) 대립유전자 2의 2개의 카피(패턴 1b; p=0.04)을 함유하는 것으로 측정되었다. MI의 위험을 지시하는 또다른 유전자형 패턴은 IL-1B(-511) 대립유전자 1, IL-1B(-511) 대립유전자 2 및 IL-1B(+3877) 대립유전자 1의 2개의 카피(패턴 1c; p=0.01)를 함유한다. MI의 위험을 지시하는 또다른 유전자형 패턴은 IL-1B(-511) 대립유전자 2의 2개의 카피 및 IL-1B(+3877) 대립유전자 1의 2개의 카피(패턴 1d; p=0.02)를 함유한다.
본 연구의 또다른 측면에서는 HDL 수준 및 MI 위험을 비교하였다. 156명의 대상자는 55세 이하로 CAD를 앓았다. HDL ≤40 mg/dl인 대상자에서는 MI에 대하여 관련된 IL-1 위험은 없는 것으로 측정되었다. HDL >40 mg/dl인 대상자의 경우(n=95), 하기와 같은 MI 위험 패턴이 관찰되었다. 패턴 1b(p=0.05); 패턴 1c(p= 0.04) 및 패턴 1d(p= 0.02).
추가로, CRP 수준을 건강한 대조군 대상자에서 측정하였다. 평균 연령이 54 세인 302명의 대상자를 분석하였다. CRP 3분위는 하기와 같았다: <0.37; 0.37-1.08; >1.08 mg/l. 12%의 코호트의 CRP 수준은 ≥ 3 mg/l인 것으로 밝혀졌다. IL-1B(+3877) 대립유전자 1의 2개의 카피를 함유하는 유전자형은 CRP가 40% 증가한 것과 관련이 있다(p=0.03). 이러한 결과는 IL-1B(-511)의 모든 유전자형 조합으로 확인되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Interleukin Genetics, Inc. <120> DIAGNOSTICS AND THERAPEUTICS FOR CARDIOVASCULAR DISORDERS <130> 24299-504-061 CIP3 <150> <151> 2006-11-17 <150> 11/283,168 <151> 2005-11-17 <160> 18 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 1 ctcagcaaca ctcctat 17 <210> 2 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 2 tcctggtctg caggtaa 17 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 3 ctatctgagg aacaaccaac tagtagc 27 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 4 taggacattg cacctagggt ttgt 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 5 tggcattgat ctggttcatc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 6 gtttaggaat cttcccactt 20 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 7 ctcaggtgtc ctcgaagaaa tcaaa 25 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 8 gcttttttgc tgtgagtccc g 21 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 9 atggttttag aaatcatcaa gcctagggca 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 10 aatgaaagga ggggaggatg acagaaatgt 30 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 11 gggatgttaa ccagaagacc ttctatct 28 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 12 caaccactca ccttctaaat tgacatt 27 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 13 aacaaccaac tagttgctgg atacttgcaa 30 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 14 tgtacctaag cccacccttt agagc 25 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 15 tggcctccag aaacctccaa 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 16 gctgatattc tggtgggaaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 17 ggcaagagca aaactctgtc 20 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer <400> 18 acaaccaact agttgccgga tacttgc 27

Claims (19)

  1. a) IL-IB(-511) 대립유전자 1의 2개의 카피, IL-IB(+3877) 대립유전자 1의 2개의 카피, IL-IB(+3954) 대립유전자 2, 및 IL-IA(+4845) 대립유전자 2; 및
    b) IL-IB(-511) 대립유전자 1의 2개의 카피, IL-IB(+3877) 대립유전자 1의 2개의 카피, IL-IB(+3954) 대립유전자 1의 2개의 카피, 및 IL-IA(+4845) 대립유전자 1의 2개의 카피로 구성된 군으로부터 선택되는 패턴을 검출하는 단계를 포함하는 대상자의 심혈관 질환에 대한 소인을 측정하는 방법으로서, 상기 패턴의 존재는 상기 대상자의 심혈관 질환에 대한 소인을 나타내는 측정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대상자는 IL-1β 및 C-반응성 단백질의 발현이 증가된 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 대상자는 심근경색 위험이 증가된 방법.
  4. a) IL-IB(-511) 대립유전자 1의 2개의 카피, IL-IB(+3877) 대립유전자 2, IL-IB(+3954) 대립유전자 2, 및 IL-IA(+4845) 대립유전자 1의 2개의 카피;
    b) IL-IB(-511) 대립유전자 1의 2개의 카피, IL-IB(+3877) 대립유전자 2, IL-IB(+3954) 대립유전자 1의 2개의 카피, 및 IL-IA(+4845) 대립유전자 2; 및
    c) IL-IB(-511) 대립유전자 1의 2개의 카피, IL-IB(+3877) 대립유전자 2, IL-IB(+3954) 대립유전자 1의 2개의 카피, 및 IL-IA(+4845) 대립유전자 1의 2개의 카피로 구성된 군으로부터 선택되는 패턴을 검출하는 단계를 포함하는 대상자의 심혈관 질환에 대한 소인을 측정하는 방법으로서,
    상기 패턴의 존재는 상기 대상자의 심혈관 질환에 대한 소인을 나타내는 측정 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 대상자는 IL-1β의 발현이 증가된 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 대상자는 심근경색 위험이 증가된 방법.
  7. a) IL-IB(-511) 대립유전자 1, IL-IB(-511) 대립유전자 2, IL-IB(+3877) 대립유전자 1의 2개의 카피, IL-IB(+3954) 대립유전자 2, 및 IL-IA(+4845) 대립유전자 2;
    b) IL-IB(-511) 대립유전자 1, IL-IB(-511) 대립유전자 2, IL-IB(+3877) 대립유전자 1의 2개의 카피, IL-IB(+3954) 대립유전자 1의 2개의 카피, 및 IL-IA(+4845) 대립유전자 2;
    c) IL-IB(-511) 대립유전자 1, IL-IB(-511) 대립유전자 2, IL-IB(+3877) 대립유전자 1의 2개의 카피, IL-IB(+3954) 대립유전자 2, 및 IL-IA(+4845) 대립유전자 1의 2개의 카피; 및
    d) IL-IB(-511) 대립유전자 1, IL-IB(-511) 대립유전자 2, IL-IB(+3877) 대 립유전자 1의 2개의 카피, IL-IB(+3954) 대립유전자 1의 2개의 카피, 및 IL-IA(+4845) 대립유전자 1의 2개의 카피로 구성된 군으로부터 선택되는 패턴을 검출하는 단계를 포함하는 대상자의 심혈관 질환에 대한 소인을 측정하는 방법으로서,
    상기 패턴의 존재는 상기 대상자의 심혈관 질환에 대한 소인을 나타내는 측정 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 대상자는 C-반응성 단백질의 발현이 증가된 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 대상자는 심근경색 위험이 증가된 방법.
  10. a) IL-IB(-511) 대립유전자 1, IL-IB(-511) 대립유전자 2, IL-IB(+3877) 대립유전자 2, IL-IB(+3954) 대립유전자 1의 2개의 카피, 및 IL-IA(+4845) 대립유전자 2;
    b) IL-IB(-511) 대립유전자 1, IL-IB(-511) 대립유전자 2, IL-IB(+3877) 대립유전자 2, IL-IB(+3954) 대립유전자 2, 및 IL-IA(+4845) 대립유전자 1의 2개의 카피;
    c) IL-IB(-511) 대립유전자 1, IL-IB(-511) 대립유전자 2, IL-IB(+3877) 대립유전자 2, IL-IB(+3954) 대립유전자 1의 2개의 카피, 및 IL-IA(+4845) 대립유전자 1의 2개의 카피;
    d) IL-IB(-511) 대립유전자 2의 2개의 카피, IL-IB(+3877) 대립유전자 1의 2 개의 카피, IL-IB(+3954) 대립유전자 2, 및 IL-IA(+4845) 대립유전자 2;
    e) IL-IB(-511) 대립유전자 2의 2개의 카피, IL-IB(+3954) 대립유전자 2, 및 IL-IA(+4845) 대립유전자 1의 2개의 카피 ;
    f) IL-IB(-511) 대립유전자 2의 2개의 카피, IL-IB(+3954) 대립유전자 1의 2개의 카피, 및 IL-IA(+4845) 대립유전자 2; 및
    g) IL-IB(-511) 대립유전자 2의 2개의 카피, IL-IB(+3954) 대립유전자 1의 2개의 카피, 및 IL-IA(+4845) 대립유전자 1의 2개의 카피로 구성된 군으로부터 선택되는 패턴을 검출하는 단계를 포함하는 대상자의 심혈관 질환에 대한 소인을 측정하는 방법으로서,
    상기 패턴의 존재는 상기 대상자의 심혈관 질환에 대한 소인 부재를 나타내는 측정 방법.
  11. IL-1A(+4845) 대립유전자 2 및 IL-1B(+3954) 대립유전자 2를 검출하는 단계를 포함하는 백인 대상자의 심혈관 질환에 대한 소인을 측정하는 방법으로서, 상기 대립유전자의 존재는 상기 대상자의 심혈관 질환에 대한 소인을 나타내는 측정 방법.
  12. 제11항에 있어서, IL-1B(+3877) 대립유전자 1 또는 IL-1B(-511) 대립유전자 1을 동정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  13. IL-1B(+3877) 대립유전자 1의 2개의 카피를 검출하는 단계를 포함하는 아시아인 대상자의 심혈관 질환에 대한 소인을 측정하는 방법으로서, 상기 대립유전자의 존재는 상기 대상자의 심혈관 질환에 대한 소인을 나타내는 측정 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 대상자는 한국인, 중국인 또는 일본인인 방법.
  15. 제13항에 있어서, IL-1B(-511) 대립유전자 2를 동정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  16. IL-1B(+3877) 대립유전자 2 및 IL-1B(-511) 대립유전자 1의 2개의 카피를 검출하는 단계를 포함하는 55세 이상인 아시아 남성 대상자의 심혈관 질환에 대한 소인을 측정하는 방법으로서, 상기 대립유전자의 존재는 상기 대상자의 심혈관 질환에 대한 소인을 나타내는 측정 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 대상자는 한국인, 중국인 또는 일본인인 방법.
  18. IL-1B(+3877) 대립유전자 1의 2개의 카피 및 IL-1B(-511) 대립유전자 2의 2개의 카피를 검출하는 단계를 포함하는 한국 남성 대상자의 심혈관 질환에 대한 소인을 측정하는 방법으로서, 상기 대립유전자의 존재는 상기 대상자의 심혈관 질환에 대한 소인을 나타내는 측정 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 대상자는 C-반응성 단백질의 발현이 증가된 방법.
KR1020087014678A 2005-11-17 2006-11-17 심혈관 질환용 진단제 및 치료제 KR20080077207A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/283,168 US7820383B2 (en) 1997-03-10 2005-11-17 Method for diagnosing myocardial infarction
US11/283,168 2005-11-17

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20080077207A true KR20080077207A (ko) 2008-08-21

Family

ID=37907991

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087014678A KR20080077207A (ko) 2005-11-17 2006-11-17 심혈관 질환용 진단제 및 치료제

Country Status (6)

Country Link
US (2) US7820383B2 (ko)
EP (1) EP1954833A2 (ko)
JP (1) JP2009515557A (ko)
KR (1) KR20080077207A (ko)
CN (1) CN101356286A (ko)
WO (1) WO2007061906A2 (ko)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7820383B2 (en) * 1997-03-10 2010-10-26 Interleukin Genetics, Inc. Method for diagnosing myocardial infarction
US6720141B1 (en) * 1999-11-01 2004-04-13 Interleukin Genetics, Inc. Diagnostics and therapeutics for restenosis
US20080311581A1 (en) * 2001-11-19 2008-12-18 David Wyllie Functional polymorphisms of the interleukin-1 locus affecting transcription and susceptibility to inflammatory and infectious diseases
KR100924468B1 (ko) * 2002-01-25 2009-11-03 인터레우킨 제네틱스, 인코포레이티드 Ｉｌ-1 유전자 집단 및 관련된 염증성 다형성과 일배체형
US20070264645A1 (en) * 2002-01-25 2007-11-15 Kenneth Kornman IL-1 gene cluster and associated inflammatory polymorphisms and haplotypes
EP1951903A2 (en) * 2005-10-25 2008-08-06 Interleukin Genetics, Inc. The il-1 gene cluster and associated inflammatory polymorphisms and haplotypes
US8101360B2 (en) * 2006-11-15 2012-01-24 Interleukin Genetics, Inc. IL-1 gene cluster, insulin resistance and coronary artery disease associated polymorphisms and haplotypes and methods of using same
WO2010002891A1 (en) * 2008-07-02 2010-01-07 Celera Corporation Genetic polymorphisms associated with autoinflammatory diseases, methods of detection and uses thereof
SG10201500180RA (en) 2009-05-29 2015-03-30 Xoma Us Llc CARDIOVASCULAR RELATED USES OF IL-1ß ANTIBODIES AND BINDING FRAGMENTS THEREOF
CN102109517A (zh) * 2010-12-14 2011-06-29 邵棠 心脑血管疾病生物标志物的联合检测方法及诊断试剂盒
ES2900740T3 (es) 2012-11-02 2022-03-18 Murray & Poole Entpr Ltd Tratamiento o prevención de episodios cardiovasculares mediante la administración de colchicina
JP6480420B2 (ja) 2013-04-16 2019-03-13 マレイ・アンド・プール・エンタープライゼズ・リミテッド コルヒチンの徐放性製剤およびその使用方法
US11886952B2 (en) * 2013-09-17 2024-01-30 Integrated Solutions International, Llc Systems and methods for point of sale age verification
JP2019503176A (ja) 2016-01-12 2019-02-07 インターロイキン ジェネティクス， インコーポレイテッド 処置に対する応答を予測するための方法
US10329620B2 (en) 2017-01-12 2019-06-25 Cardioforecast Ltd. Methods and kits for treating cardiovascular disease
CN109868312B (zh) * 2017-12-05 2023-07-28 上海市精神卫生中心 IL-1ra与奥氮平诱导的代谢不良反应
ES2964535T3 (es) * 2018-09-21 2024-04-08 Corflow Therapeutics Ag Aparato para la evaluación de la disfunción microvascular
US11880438B2 (en) 2018-10-17 2024-01-23 Integrated Solutions International, Llc Systems and methods for age restricted product activation
CN109634732B (zh) * 2018-12-10 2022-10-04 西安电子科技大学 针对isar成像基于遗传算法的资源调度方法
WO2020245402A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Cardioforecast Ltd Compositions and methods for treating lung, colorectal and breast cancer
WO2021028469A1 (en) 2019-08-12 2021-02-18 Sitokine Limited Compositions and methods for treating cytokine release syndrome and neurotoxicity
WO2021205013A1 (en) 2020-04-09 2021-10-14 Sitokine Limited Compositions and methods for treating covid-19
CN113933229B (zh) * 2021-09-27 2023-08-08 苏州市中心血站 血小板活化性能鉴别方法

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4582788A (en) 1982-01-22 1986-04-15 Cetus Corporation HLA typing method and cDNA probes used therein
US5110920A (en) 1982-01-22 1992-05-05 Cetus Corporation HLA typing method and DNA probes used therein
US4623619A (en) 1982-03-03 1986-11-18 Nordisk Insulinlaboratorium Method for the determination of liability in human individuals to develop atherosclerosis
US4666828A (en) 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4801531A (en) 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
EP0269260A3 (en) 1986-10-29 1988-06-22 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apoai-ciii-aiv, apoaii apob, apoci, and ldl receptor polymorphisms for genetic fingerprinting and predictive of atherosclerosis
US5268267A (en) 1987-08-21 1993-12-07 The General Hospital Corporation Method for diagnosing small cell carcinoma
US4968607A (en) 1987-11-25 1990-11-06 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
GB9301453D0 (en) 1993-01-26 1993-03-17 Clonit Spa Nucleotide proves
US5658729A (en) 1994-10-11 1997-08-19 The University Of British Columbia Method, reagent and kit for evaluating susceptibility to premature atherosclerosis
US5686246A (en) 1995-08-03 1997-11-11 Kornman; Kenneth S. Detecting genetic predisposition to periodontal disease
US5698399A (en) 1996-04-05 1997-12-16 Duff; Gordon W. Detecting genetic predisposition for osteoporosis
US6210877B1 (en) 1997-03-10 2001-04-03 Interleukin Genetics, Inc. Prediction of coronary artery disease
US7820383B2 (en) 1997-03-10 2010-10-26 Interleukin Genetics, Inc. Method for diagnosing myocardial infarction
US6524795B1 (en) 1997-03-10 2003-02-25 Interleukin Genetics, Inc. Diagnostics for cardiovascular disorders
US6720141B1 (en) 1999-11-01 2004-04-13 Interleukin Genetics, Inc. Diagnostics and therapeutics for restenosis
GB9723553D0 (en) 1997-11-07 1998-01-07 Duff Gordon W Prediction of the risk of chronic obstructive airway disease
GB9711040D0 (en) 1997-05-29 1997-07-23 Duff Gordon W Prediction of inflammatory disease
ATE403746T1 (de) * 1999-05-24 2008-08-15 Interleukin Genetics Inc Diagnose von restenose
CN100424182C (zh) 2001-06-15 2008-10-08 白介素遗传公司 衰老相关疾病早期发作的检测与治疗方法
KR101059898B1 (ko) 2001-11-19 2011-08-29 인터레우킨 제네틱스, 인코포레이티드 염증성 질환 및 감염성 질환에 대한 감수성 및 전사에 영향을 미치는 인터루킨-1 좌의 기능적 다형성
ES2356167T3 (es) 2004-05-03 2011-04-05 Interleukin Genetics, Inc. Método de diagnóstico y terapia para enfermedades asociadas con un haplotipo inflamatorio il-1.

Also Published As

Publication number Publication date
US7820383B2 (en) 2010-10-26
JP2009515557A (ja) 2009-04-16
US20090191564A1 (en) 2009-07-30
WO2007061906A2 (en) 2007-05-31
US20060252055A1 (en) 2006-11-09
CN101356286A (zh) 2009-01-28
EP1954833A2 (en) 2008-08-13
WO2007061906A3 (en) 2007-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2374916C (en) Diagnostics and therapeutics for cardiovascular disorders
US7820383B2 (en) Method for diagnosing myocardial infarction
EP1127168B1 (en) Method for determining the susceptibility to developing sepsis and therapeutics for the treatment of sepsis
AU2006203097B2 (en) Diagnostics and therapeutics for osteoporosis
US20090093396A1 (en) Diagnostics and therapeutics for restenosis
JP2005500032A (ja) 老化関連症状の早期発現を検出および治療する方法
US20100255475A1 (en) Diagnostics and therapeutics for osteoporosis
EP1680513B1 (en) Diagnostic for osteoporosis
US20090023147A1 (en) Diagnostics and therapeutics for osteoporosis
AU782836B2 (en) Diagnostics and therapeutics for restenosis
WO2010083294A2 (en) Diagnostics and therapeutics for osteoporosis

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid