ES2356167T3 - Método de diagnóstico y terapia para enfermedades asociadas con un haplotipo inflamatorio il-1. - Google Patents
Método de diagnóstico y terapia para enfermedades asociadas con un haplotipo inflamatorio il-1. Download PDFInfo
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Abstract
Un método para predecir la sensibilidad de un sujeto humano a la periodontopatía, que comprende la etapa de identificar en una muestra de DNA genómico del sujeto un modelo alélico que comprende una de las siguientes series de alelos de IL-1B: (1)alelo 1 (-511), alelo 1 (-1468) y alelo 2 (-3737); (2)alelo 2 (-511), alelo 2 (-1468) y alelo 1 (-3737); (3)alelo 1 (-511), alelo 1 (-1468) y alelo 1 (-3737); o (4)alelo 2 (-511), alelo 1 (-1468) y alelo 1 (-3737), en donde la presencia de uno cualquiera de los modelos alélicos 1, 3 o 4 indica que dicho sujeto tiene mayor sensibilidad a la periodontopatía y en donde la presencia del modelo alélico 2 indica que el sujeto tiene menor sensibilidad a la periodontopatía.
Description
Método de diagnóstico y terapia para
enfermedades asociadas con un haplotipo inflamatorio
IL-1.
La agrupación de genes IL-1 está
en el brazo largo del cromosoma 2 (2q13) y contiene al menos los
genes IL-1\alpha (IL-1A),
IL-1\beta (IL-1B), y el
antagonista del receptor de IL-1
(IL-1RN), dentro de una región de 430 Kb (Nicklin,
et al., (1994) Genomics, 19: 382-4).
Las moléculas agonistas, IL-1\alpha y
IL-1\beta, tienen una actividad
pro-inflamatoria potente y están en el principio de
muchas cascadas inflamatorias. Sus acciones, frecuentemente vía la
inducción de otras citoquinas, tales como IL-6 e
IL-8, conducen a la activación y el reclutamiento de
leucocitos en el tejido dañado, la producción local de agentes
vasoactivos, respuesta de fiebre en el cerebro y respuesta de la
fase hepática aguda. Todas las tres moléculas IL-1
se unen a los receptores de IL-1 de tipo I y tipo
II, pero solamente el receptor de tipo I transduce una señal al
interior de la célula. En contraste, el receptor de tipo II es
liberado de la membrana celular y actúa como receptor señuelo. El
antagonista del receptor y el receptor de tipo II, por tanto, son
ambos anti-inflamatorios en sus acciones.
La producción inapropiada de
IL-1 desempeña un papel central en la patología de
muchas enfermedades autoinmunes e inflamatorias, incluyendo artritis
reumatoide; trastorno intestinal inflamatorio, psoriasis y
similares. Además, hay diferencias
inter-individuales estables en las tasas de
producción de IL-1, y algo de esta variación puede
ser explicado por diferencias genéticas en los loci de los
genes IL-1. Por tanto, los genes
IL-1 son candidatos razonables para determinar parte
de la sensibilidad genética a las enfermedades inflamatorias, la
mayoría de las cuales tienen una etiología multifactorial con un
componente poligénico.
Determinados alelos de la agrupación de genes
IL-1 se sabe que están asociados con estados
morbosos particulares. Por ejemplo, para el alelo 2 de
IL-1RN con repeticiones en tándem de número variable
(abreviadamente VNTR por la expresión inglesa Variable Number of
Tandem Repeats) se ha demostrado que está asociado con
osteoporosis (Patente de EE.UU. Nº 5.698.399), nefropatía en
diabetes mellitus (Blakemore, et al., (1996) Hum.
Genet. 97(3): 369-74), alopecia
areata (Cork, et al., (1995) J. Invest.
Dermatol. 104(5 Supp.): 15S-16S; Cork
et al., (1996) Dermatol. Clin. 14:
671-8), enfermedad de Graves (Blakemore, et
al., (1995) J. Clin. Endocrinol. 80(1):
111-5), lupus eritematoso sistémico (Blakemore,
et al., (1994) Arthritis Rheum. 37:
1380-85), esclerosis del liquen (Clay, et
al., (1994) Hum. Genet. 94: 407-10), y
colitis ulcerosa (Mansfield, et al., (1994)
Gastroenterol. 106(3): 637-42).
Además, se ha encontrado que el alelo 2 de
IL-1A del marcador -889.y el alelo 2 de
IL-1B (TagI) del marcador +3954 están asociados con
la periodontopatía (Patente de EE.UU. Nº 5.686.246; Kornman y
diGiovine (1998) Ann. Periodont. 3: 327-38;
Hart y Kornman (1997) Periodontol. 2000 14:
202-15; Newman (1997) Compend. Contin. Educ.
Dent. 18: 881-4; Kornman et al., (1997)
J. Clin. Periodontol. 24: 72-77). También se
ha encontrado que el alelo 2 de IL-1A del marcador
-889 está asociado con la artritis crónica juvenil, particularmente
la iridociclitis crónica (McDowell, et al., (1995)
Arthritis Rheum. 38: 221-28). También se ha
encontrado que el alelo 2 de IL-1B (TagI) del
marcador +3954 de IL-1B está asociado con la
psoriasis y la diabetes dependiente de insulina en pacientes con
DR3/4 (diGiovine, et al., (1995) Cytokine 7: 606;
Pociot, et al., (1992) Eur. J. Clin. Invest. 22:
396-402). Adicionalmente, se ha encontrado que el
alelo 1 de IL-1RN (VNTR) está asociado con la
retinopatía diabética (véanse las solicitudes USSN 09/037472, y
PCT/GB97/02790). Además, se ha encontrado que el alelo 2 de
IL-1RN (VNTR) está asociado con la colitis ulcerante
en la población caucásica de Norte América y Europa (Mansfield, J.
et al., (1994) Gastroenterology 106:
637-42). Es muy interesante saber que esta
asociación es particularmente fuerte con poblaciones de judíos
ashkenazis étnicamente relacionados (solicitud PCT WO97/25445).
\vskip1.000000\baselineskip
Los métodos tradicionales para el cribado de
enfermedades heredables han dependido de la identificación de
productos génicos anormales (por ejemplo, la anemia de células
falciformes) o de un fenotipo anormal (por ejemplo, el retraso
mental). Estos métodos son de una utilidad limitada para las
enfermedades heredables que comienzan tarde y para las que no
existen fenotipos fácilmente identificables, tales como, por
ejemplo, las enfermedades vasculares. Con el desarrollo de la
metodología del cribado genético sencillo y barato ahora es posible
identificar polimorfismos que indican una propensión a desarrollar
la enfermedad, incluso cuando la enfermedad es de origen poligénico.
El número de enfermedades que pueden ser cribadas por métodos de la
biología molecular continúa creciendo con la mayor comprensión de
las bases genéticas de los trastornos multifactoriales.
El cribado genético (también denominado
genotipificación o cribado molecular), puede ser definido
ampliamente como un análisis para determinar si un paciente tiene
mutaciones (alelos o polimorfismos) que causan un estado morboso o
están "ligadas" a la mutación que causa el estado morboso. El
ligamiento se refiere al fenómeno de que las secuencias de DNA que
están próximas entre sí en el genoma tienden a ser heredadas
conjuntamente. Dos secuencias pueden estar ligadas debido a alguna
ventaja selectiva de la herencia conjunta. Más típicamente, sin
embargo, dos secuencias polimorfas se heredan conjuntamente porque
debido a la infrecuencia relativa con la que los eventos de
recombinación meióticos ocurren dentro de la región entre los dos
polimorfismos. Los alelos polimórficos heredados conjuntamente se
dice que se encuentran en desequilibrio del ligamiento uno con el
otro debido a que, en una población humana dada, tienden ambos a
estar presentes conjuntamente o de otro modo no lo están en absoluto
en cualquier miembro particular de la población. Realmente, cuando
se encuentran polimorfismos múltiples en una región cromosómica dada
están en desequilibrio del ligamiento uno con el otro, definiendo un
"haplotipo" genético cuasi estable. En contraste, los eventos
de recombinación que ocurren entre dos loci polimórficos
hacen que lleguen a estar separados en distintos cromosomas
homólogos. Si la recombinación meiótica entre dos polimorfismos
ligados físicamente ocurre con suficiente frecuencia, los dos
polimorfismos aparecerán segregados independientemente y se dice de
ellos que está en equilibrio de ligamiento.
Aunque la frecuencia de la recombinación
meiótica entre dos marcadores es generalmente proporcional a la
distancia física entre ellos en el cromosoma, la presencia de
"puntos calientes", así como regiones de recombinación
cromosómica reprimida puede dar como resultado discrepancias entre
la distancia física y la de recombinación entre los dos marcadores.
Por tanto, en determinadas regiones cromosómicas, múltiples
locis polimórficos que se extienden en un amplio dominio
cromosómico pueden encontrarse en desequilibrio de ligamiento uno
con respecto al otro y, por ello definir un haplotipo genético de
amplia extensión. Además, cuando se encuentra una mutación causante
de una enfermedad dentro de o en unión con este haplotipo, se pueden
usar uno o más alelos polimórficos del haplotipo como indicador de
diagnóstico o pronóstico de la probabilidad de desarrollar la
enfermedad. Esa asociación entre polimorfismos de otro modo benignos
y un polimorfismo causante de la enfermedad ocurre si la mutación
causante de la enfermedad surgió en un pasado reciente, de modo que
no ha transcurrido un tiempo suficiente para conseguir el equilibrio
a través de eventos de recombinación. Por lo tanto, la
identificación de un haplotipo humano que abarque o esté dentro de
un cambio mutacional causante de la enfermedad, sirve como medida
predictiva de la probabilidad de un individuo de tener heredada una
mutación causante de la enfermedad. Importantemente, dichos métodos
de pronóstico o diagnóstico se pueden utilizar sin necesidad de la
identificación y aislamiento de la lesión causante de la enfermedad.
Esto es significativo debido a que puede ser difícil y laboriosa la
determinación precisa del defecto molecular implicado en un proceso
morboso, especialmente en el caso de enfermedades multifactoriales
tales como los trastornos inflamatorios.
Realmente, la correlación estadística entre un
trastorno inflamatorio y un de polimorfismo de IL-1
no indica necesariamente que el polimorfismo cause directamente el
trastorno. En su lugar el polimorfismo correlacionado puede ser una
variante alélica benigna que está ligada a (es decir, en
desequilibrio del ligamiento con) una mutación causante del
trastorno que ha ocurrido en el pasado evolutivo humano reciente, de
modo que no ha transcurrido suficiente tiempo para que se consiga el
equilibrio a través de eventos de recombinación en el segmento
cromosómico intercalado. Por tanto, para los fines de análisis para
diagnóstico y pronóstico de una enfermedad particular, la detección
de un alelo polimórfico asociado con la enfermedad puede ser
utilizado sin la consideración de si el polimorfismo está
directamente implicado en la etiología de la enfermedad. Por otra
parte, cuando un locus polimorfo benigno está en un
desequilibrio del ligamiento con un locus polimorfo
aparentemente causante de la enfermedad, todavía son probables otros
loci polimorfos que están en desequilibrio del ligamiento
estén también en desequilibrio del ligamiento con el locus
polimorfo causante de la enfermedad. Por tanto, estos otros
loci polimorfos también serán un pronóstico o diagnóstico de
la probabilidad de tener heredado el locus polimorfo causante
de la enfermedad. Realmente, un haplotipo humano de amplia extensión
(que describe el modelo típico de la herencia conjunta de alelos de
un conjunto de marcadores polimorfos ligados) puede servir como
diana para fines de diagnóstico una vez que se haya establecido una
asociación entre una enfermedad o estado particular y un haplotipo
humano correspondiente. Por tanto, la determinación de la
probabilidad de un individuo de desarrollar una enfermedad o estado
particular se puede realizar caracterizando uno o más alelos
polimorfos asociados a la enfermedad (o incluso uno o más haplotipo
asociados a la enfermedad) si determinar o caracterizar
necesariamente la variación genética causante.
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La presente invención proporciona un método para
predecir en un sujeto humano la sensibilidad a padecer la
periodontopatía, que comprende la etapa de identificar en una
muestra de DNA genómico de un sujeto un modelo alélico que comprende
uno de los siguientes conjuntos de alelos IL-1B:
- (1)
- (-511) alelo 1, (-1468) alelo 1 y (-3737) alelo 2;
- (2)
- (-511) alelo 2, (-1468) alelo 2 y (-3737) alelo 1;
- (3)
- (-511) alelo 1, (-1468) alelo 1 y (-3737) alelo 1; o
- (4)
- (-511) alelo 2, (-1468) alelo 1 y (-3737) alelo 1,
en donde la presencia de uno cualquiera de los
modelos 1, 3 o 4 indica que dicho sujeto ha aumentado la
sensibilidad a la periodontopatía, y en donde la presencia del
modelo alélico 2 indica que el sujeto tiene una sensibilidad
disminuida a la periodontopatía.
\vskip1.000000\baselineskip
El sujeto es homocigótico para cada uno de los
alelos. La transcripción de IL-1B alterado da como
resultado la producción de IL-1B alterada. El sujeto
es de etnicidad asiática, tal como japonesa, china, taiwanesa o
vietnamita.
Un alelo que comprende un haplotipo inflamatorio
de IL-1 puede ser detectado por cualquiera de una
variedad de técnicas que incluyen: 1) realizar una reacción de
hibridación entre una muestra de ácido nucleico y una sonda que es
capaz de hibridarse con el alelo; 2) secuenciar al menos una porción
del alelo; o 3) determinar la movilidad electroforética del alelo o
sus fragmentos (por ejemplo, fragmentos generados por la digestión
con endonucleasas). El alelo puede ser sometido opcionalmente a una
etapa de amplificación antes de la realización de la etapa de
detección. Los métodos de amplificación incluyen por ejemplo la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de
la ligasa (LCR), la amplificación con desplazamiento de cadenas
(abreviadamente en lo sucesivo SDA por la expresión inglesa
Strand Displacement Amplification), clonación y variaciones
de los anteriores (por ejemplo RT-PCR y
amplificación específica de alelos). Los oligonucleótidos necesarios
para la amplificación se seleccionan, por ejemplo, dentro de los
loci del gen IL-1, bien los que flanquean el
marcador de interés (como se requiere para la amplificación por PCR)
o bien directamente los que están solapados con el marcador (como en
la hibridación de oligonucleótidos específica de alelos,
abreviadamente en lo sucesivo ASO, por la expresión Allele
Specific Oligonucleotide). Por ejemplo, la muestra se
hibrida con un conjunto de cebadores, que se hibridan en 5' y 3' en
una secuencia con sentido o antisentido para el alelo asociado al
haplotipo inflamatorio de IL-1 y se somete a
amplificación por PCR.
Un alelo que contiene un haplotipo inflamatorio
de IL-1 también se detecta indirectamente, por
ejemplo analizando el producto proteínico codificado por el DNA. Por
ejemplo, cuando el marcador en cuestión da como resultado la
traducción de una proteína mutante, la proteína se detecta por
cualquiera de una variedad de métodos de detección de proteínas.
Dichos métodos incluyen inmunodetección y ensayos bioquímicos, tales
como fraccionamiento por tamaños, en donde la proteína experimenta
un cambio en el peso molecular aparente, a través de truncamiento,
prolongación, plegamiento alterado o modificaciones posteriores a la
traducción alteradas.
Se describen kits para realizar los análisis
antes descritos. El kit puede incluir medios de recogida de muestras
de ácidos nucleicos y medios para determinar si un sujeto lleva al
menos un alelo que comprende un haplotipo inflamatorio de
IL-1. Opcionalmente, el kit contiene una muestra de
control positivo o negativo o un patrón y/o un dispositivo
algorítmico para evaluar los resultados y reactivos y componentes
adicionales que incluyen, por ejemplo reactivos de amplificación del
DNA, DNA-polimerasa, reactivos de amplificación de
ácidos nucleicos, enzimas de restricción, tampones, un dispositivo
de muestreo de ácidos nucleicos, dispositivo de purificación de DNA,
desoxinucleótidos, oligonucleótidos (por ejemplo sondas y cebadores)
etc.
El control puede ser un control positivo o
negativo. Además, la muestra de control puede contener los productos
positivos (o negativos) de la técnica de detección de alelos
empleada. Por ejemplo, cuando la técnica de detección de alelos es
amplificación por PCR, seguida por fraccionamiento por tamaños, la
muestra de control puede comprender fragmentos de DNA fragmentos del
tamaño apropiado. Análogamente, cuando la técnica de detección de
alelos implica la detección de una proteína mutante, la muestra de
control puede comprender una muestra de la proteína mutada. Sin
embargo, se prefiere que la muestra de control contenga el material
que se va analizar. Por ejemplo, los controles pueden ser una
muestra del DNA genómico o una porción clonada de la agrupación de
genes IL-1. Preferiblemente, la muestra de control
es una muestra altamente purificada de DNA genómico en donde la
muestra a analizar es el DNA genómico.
Los oligonucleótidos presentes en dicho kit se
usan para amplificación de la región de interés o para la
hibridación directa de oligonucleótidos específicos de alelos (ASO)
a los marcadores en cuestión. Por tanto, los oligonucleótidos
flanquean el marcador de interés (como es requerido para la
amplificación por PCR) o están solapados directamente con el
marcador (como en la hibridación ASO).
También se proporcionan ácidos nucleicos
aislados de una longitud menor de 250, 200, 150, 100, 50, 25 o menos
nucleótidos que contienen la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID
NO; 36-39. Opcionalmente, el ácido nucleico se fija
a un soporte sólido o semi-sólido o está presente
como una matriz (chip) de oligonucleótidos.
La información obtenida usando los análisis y
kits descritos en la presente memoria (sola o junto con la
información sobre otro defecto genético o factor ambiental, que
contribuya a la enfermedad o estado que está asociado al haplotipo
inflamatorio de IL-1) es útil para determinar si un
sujeto no sintomático tiene o es probable que desarrolle la
enfermedad o estado particular. Además, la información puede
permitir una propuesta más personalizada para impedir el comienzo o
progreso de la enfermedad o estado. Por ejemplo, esta información
puede facilitar al profesional clínico prescribir más eficazmente
una terapia que estará dirigida a la base molecular de la enfermedad
o estado.
Se describen métodos para tratar o prevenir el
desarrollo de una enfermedad o estado que está asociado con un
haplotipo inflamatorio de IL-1 en un sujeto por
administración al sujeto de un agente terapéutico adecuado de la
invención. En incluso otro aspecto, la invención proporciona ensayos
in vitro o in vivo para cribar los compuestos de
ensayo para identificar agentes terapéuticos para tratar o prevenir
el desarrollo de una enfermedad o estado que está asociado con un
haplotipo inflamatorio de IL-1. El ensayo comprende
poner en contacto una célula transfectada con una mutación causante,
que está unida operativamente con un promotor apropiado, con un
compuesto de ensayo y determinar el nivel de expresión de una
proteína en la célula en presencia y en ausencia del compuesto de
ensayo. La mutación causante da como resultado una producción
disminuida del antagonista del receptor de IL-1, y
una producción aumentada del antagonista del receptor de
1L-1 en presencia del compuesto de ensayo indica que
el compuesto es un agonista de la actividad antagonista del receptor
de IL-1. Alternativamente, la mutación causante da
como resultado una producción aumentada de
IL-1\alpha o IL-\beta, y una
producción disminuida de IL-1\alpha o
IL-\beta en presencia del compuesto de ensayo
indica que el compuesto es un antagonista de la actividad de
IL-1\alpha o IL-1\beta.
A no ser que se definan de otro modo todos los
términos científicos y técnicos usados en la presente memoria tienen
los mismos significados que son usualmente entendidos por los
expertos ordinarios en la técnica a la que pertenece la presente
invención. Aunque en la práctica o análisis de la presente invención
se pueden usar materiales y métodos similares o equivalentes a los
descritos en la presente memoria, se describen a continuación
materiales y métodos adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes
de patentes, patentes, y otras referencias mencionadas en la
presente memoria se incorporan como referencia en su totalidad. En
caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria, que incluye
las
definiciones. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son solo ilustrativos y no se pretende que sean limitativos.
definiciones. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son solo ilustrativos y no se pretende que sean limitativos.
Otras realizaciones y ventajas se exponen en la
siguiente descripción y reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
La Fig. 1 es una representación esquemática de
la agrupación de genes IL-1 que incluye unos cuantos
marcadores polimórficos.
La Fig. 2 es una gráfica que representa la
correlación entre los valores del desequilibrio de ligamiento y la
distancia física como se describe en la presente memoria.
La Fig. 3 muestra la del secuencia ácido
nucleico para IL-1A (GEN X03833; SEQ ID NO. 1).
La Fig. 4 muestra la secuencia del ácido
nucleico secuencia para la IL-1B (GEN X04500; SEQ ID
NO. 2).
La Fig. 5 muestra la secuencia del ácido
nucleico para IL-1RN secretada (GEN X64532; SEQ ID
NO. 3).
La Fig. 6 muestra construcciones con
polimorfismo de un solo nucleótido (abreviadamente en lo sucesivo
SNP por la expresión inglesa Single Nucleotide Polymorphism)
dentro de la región del promotor de IL-1B. La
construcción parental en donde todos los SNP son el alelo 1 están
indicadas por pGL3(IL1)BS para los SNP
1-15,
pGL(3-IL1)BS(3)K(M)
para los SNP 2-15, y
pGL3-(IL1)BL(3)KM para los SNP
2-17 (los paréntesis indican partes de los
identificadores de las construcciones que no aparecen en el gráfico
de la Fig. 7). Debajo de cada serie parental están las
construcciones en donde los SNP individuales han sido convertidos en
el alelo 2 por mutagénesis dirigida a un sitio.
Las Fig.7 A-B muestran la
localización de los SNP y las construcciones de promotor. En la Fig.
7A, las posiciones de los SNP se indican dentro de la región del
promotor del gen IL-1B en la línea de la parte
superior. Las líneas de la parte inferior representan las longitudes
de la región del promotor usadas en las diferentes construcciones
del indicador (luciferasa), cuyos resultados de actividad
transcripcional se muestran en la Fig. 7B. Están indicados los
sitios KpnI y BamHI. En las series de IL-1BS, los
SNP están indicados por líneas verticales.
La Fig. 8 muestra construcciones de plásmidos de
los SNP dentro de la región del promotor de IL-1B en
la cual los SNP 14 y 15 se han mantenido mayoritariamente constantes
en el alelo 2. La construcción parental, en donde todos los SNP
excepto el 14 y el 15 son el alelo 1 está identificada como
pGL-BS.2. Debajo están las construcciones en donde
el SNP individual ha sido convertido en el alelo 2 mediante
mutagénesis dirigida al sitio. Los SNP del alelo 2 SNP aparecen
resaltados.
La Fig. 9A-B muestra la
localización de los SNP y las construcciones del promotor. En la
Fig. 9A, las posiciones de los SNP están indicadas dentro de la
región del promotor del gen IL-1B en la línea de la
parte superior. Las líneas inferiores representan las longitudes de
la región del promotor usadas en las diferentes construcciones del
indicador (luciferasa) cuyos resultados de la actividad
transcripcional relativa se muestran en la Fig. 9B. Están indicados
los sitios KpnI y BamHI. En la serie de IL-1BS, los
SNP están indicados por líneas verticales.
La Fig. 10 es un diagrama que muestra el
análisis de transfección del SNP 4 en diferentes modelos alélicos de
los SNP 14 y 15. La actividad del promotor de los alelos construidos
denominados A-D como se miden por la actividad de la
luciferasa de luciérnaga se muestra a diferentes dosis de LPS
(lipopolisacárido) (0, 1, 10 y 100 ng/ml) y 20 ng/ml de
miristato-acetato de forbol (abreviadamente PMA por
la expresión inglesa Phorbol 12-myristate
13-acetate). La actividad de luciferasa de
luciérnaga se normalizó a la actividad de Renilla para
controlar la eficacia de la transfección. Cada construcción se
transfectó por triplicado y la transfección para cada construcción
se repitió al menos tres veces.
La Fig. 11 es un diagrama que muestra el
análisis de transfección del SNP 10. Las actividades del promotor de
las construcciones A (rombo) y B (círculo) como se miden por la
actividad de luciferasa de luciérnaga se muestran a diferentes dosis
de LPS (0, 1, 10 y 100 ng/ml) y 20 ng/ml de PMA. La actividad de
luciferasa de luciérnaga se normalizó a la actividad de
Renilla para controlar la eficacia de la transfección. Cada
construcción se transfectó por triplicado y la transfección para
cada construcción se repitió al menos tres veces.
La Fig. 12 es un diagrama que demuestra el
análisis de transfección de los SNP 14 y 15. La actividad del
promotor de las construcciones con los modelos de alelos
representados como A-D como se mide por la actividad
de luciferasa de luciérnaga se muestra a diferentes dosis de LPS (0,
1, 10 y 100 ng/ml) y 20 ng/ml de PMA. La actividad de luciferasa de
luciérnaga se normalizó a la actividad de Renilla para
controlar la eficacia de la transfección. Cada construcción se
transfectó por triplicado y la transfección para cada construcción
se repitió al menos tres veces.
La Fig. 13 es un diagrama que muestra el
análisis de transfección del haplotipo del promotor que comprende
los SNP 10, 14 y 15. Las combinaciones alélicas se muestran para los
plásmidos A-C. Las actividades del promotor de las
construcciones A (rombo), B (cuadrado) y C (triángulo) como se miden
por la actividad de luciferasa de luciérnaga se muestran a
diferentes dosis de LPS (0, 1, 10 y 100 ng/ml) y 20 ng/ml de PMA. La
actividad de luciferasa de luciérnaga se normalizó a la actividad de
Renilla para controlar la eficacia de la transfección. Cada
construcción se transfectó por triplicado y la transfección para
cada construcción se repitió al menos tres veces.
La Fig. 14 es una imagen fotográfica de los
resultados de un ensayo de cambio de movilidad electroforética del
SNP 4. Se muestran las secuencias de ambos alelos 1 y 2 oligómeros
bicatenarios etiquetados del SNP 4 usadas para el análisis del
cambio de la movilidad (abreviadamente en lo sucesivo EMSA por la
expresión inglesa Electrophoretic Mobility Shift Assay). Se
usaron las proteínas nucleares aisladas de las células
THP-1 tratadas a las 0, 2, 4, 6 y 24 horas con LPS
(100 ng/ml) y PMA (20 ng/ml). Las localizaciones de la sonda libre y
los complejos retardados se indican por flechas.
La Fig. 15 es una imagen fotográfica de los
resultados de un ensayo de cambio de movilidad electroforética del
SNP 4, usando sondas no etiquetadas para competir con la unión
específica. Se muestran las secuencias de ambos alelos 1 y 2
oligómeros bicatenarios marcados del SNP 4 usadas para el ensayo
EMSA. Para determinar la especificidad de unión se usaron los
oligómeros bicatenarios no etiquetados para los alelos 1 y 2 en el
ensayo EMSA para competir con las sondas etiquetadas.
La Fig. 16 una imagen fotográfica de los
resultados del análisis de super-cambio de los
anticuerpos NF-kB para el SNP 4. Los anticuerpos
NF-kB para ambas subunidades p50 y p65 se usaron en
el ensayo EMSA para determinar que los complejos
DNA-proteínas formados fueron debidos a las
proteínas NF-kB.
La Fig. 17 una imagen fotográfica de los
resultados de un ensayo de cambio de movilidad electroforética del
SNP 10. Se muestran las secuencias de ambos alelos 1 y 2 oligómeros
bicatenarios etiquetados de SNP 10 usadas para el ensayo EMSA. Se
usaron las proteínas nucleares aisladas de las células
THP-1 tratadas a las 0, 2, 4, 6 y 24 horas con LPS
(100 ng/ml) y PMA (20 ng/ml). Las localizaciones de la sonda libre y
de los complejos retardados están indicadas por flechas.
La Fig. 18 es una imagen fotográfica de los
resultados de un ensayo de cambio de movilidad electroforética del
SNP 10 que muestra la especificidad de la formación del complejo
para el SNP 10. Se muestran las secuencias de los alelos 1 y 2 de de
los oligómeros bicatenarios etiquetados usadas para el ensayo EMSA.
Para determinar la especificidad de unión los alelos 1 y 2 de los
oligómeros bicatenarios no etiquetados se usaron en el ensayo EMSA
para competir por la unión de las sondas etiquetadas.
La Fig. 19 es una imagen fotográfica de los
resultados de un ensayo de cambio de movilidad electroforética del
SNP 14. Se muestran las secuencias de los alelos 1 y 2 de de los
oligómeros bicatenarios marcados del SNP 14 usadas para el ensayo
EMSA. Se usaron las proteínas nucleares aisladas de las células
THP-1 tratadas a las 0, 2, 4, 6 y 24 horas con LPS
(100 ng/ml) y PMA (20 ng/ml). Las localizaciones de la sonda libre y
de los complejos retardados están indicadas por flechas.
La Fig. 20 una imagen fotográfica de los
resultados de un análisis del cambio de la movilidad electroforética
resultados del SNP 15. Se muestran las secuencias de ambos alelos 1
y 2 de de los oligómeros bicatenarios etiquetados del SNP 15 usados
para el ensayo EMSA. Se usaron las proteínas nucleares aisladas de
las células THP-1 tratadas a las 0, 2, 4, 6 y 24
horas con LPS (100 ng/ml) y PMA (20 ng/ml). Las localizaciones de la
sonda libre y de los complejos retardados están indicadas por
flechas.
La Fig. 21 es una imagen fotográfica de los
resultados de un ensayo de cambio de movilidad electroforética del
SNP 15 que muestra la especificidad de la formación del complejo
para el SNP 15. Se muestran las secuencias de los alelos 1 y 2 de de
los oligómeros bicatenarios etiquetados de SNP 15 usados para el
ensayo EMSA. Para determinar la especificidad de unión los alelos 1
y 2 de los oligómeros bicatenarios no etiquetados se usaron en el
ensayo EMSA para competir por la unión de las sondas marcadas.
La Fig. 22 es un diagrama que muestra la
gravedad de la periodontitis en sujetos por medida de la profundidad
de las cavidades en las encías de los sujetos.
La Fig. 23 es un diagrama que muestra la
frecuencia de los haplotipos IL-1B en sujetos
japoneses y de raza blanca.
La Fig. 24 es un diagrama que muestra las
cantidades relativas de IL-1\beta en fluidos
gingivales de individuos de raza blanca que tienen haplotipos de
IL-1B que tienen haplotipos IL-1B
específicos.
La Fig. 25 es un diagrama que demuestra el
riesgo reducido de periodontitis in en sujetos japoneses que tienen
un genotipo IL-1B específico.
La Fig. 26 es un diagrama que demuestra la
asociación de haplotipos IL-1B y la gravedad de
periodontitis en sujetos japoneses.
Por conveniencia, se facilitan a continuación el
significado de ciertos términos y frases empleados en esta parte
descriptiva de la memoria, los ejemplos y las reivindicaciones
anexas.
El término "alelo" se refiere a las
diferentes variantes de secuencias encontradas en diferentes
regiones polimórficas. Por ejemplo, IL-1RN (VNTR)
tiene al menos cinco alelos diferentes. Las variantes de secuencias
pueden ser cambios de una sola base o de múltiples bases, incluyendo
sin limitación inserciones, deleciones o sustituciones, o puede ser
un número variable de repeticiones de secuencias.
La expresión "modelo alélico" se refiere a
la identidad de un alelo o alelos en una o más regiones
polimórficas. Por ejemplo, un modelo alélico puede consistir en un
solo alelo en un sitio polimórfico, como el alelo 1 para
IL-1RN (VNTR), que es un modelo alélico que tiene al
menos una copia del alelo 1 de IL-1RN en las VNTR de
los loci del gen IL-1RN. Alternativamente,
un modelo alélico puede consistir en un estado homocigótico o
heterocigótico en un solo sitio polimórfico. Por ejemplo, el alelo
2,2 de IL1-RN (VNTR) es un modelo alélico en el que
hay dos copias del segundo alelo en el marcador de las VNTR de
IL-1RN que corresponde al estado del alelo 2 de
IL-RN (VNTR) homocigótico. Alternativamente, un
modelo alélico puede consistir en la identidad de alelos en más de
un sitio polimórfico.
El término "anticuerpo" tal como se usa en
la presente memoria se refiere a un agente de unión que incluye un
anticuerpo completo o uno de sus fragmentos de unión que es
específicamente reactivo con un polipéptido IL-1.
Los anticuerpos pueden ser fragmentados usando técnicas
convencionales y los fragmentos pueden ser cribados para su utilidad
del modo descrito antes para los anticuerpos completos. Por ejemplo,
los fragmentos F(ab)2 pueden ser generados tratando un
anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab)2 resultante
puede ser tratado para reducir los puentes disulfuro para producir
los fragmentos Fab. Los anticuerpos de la presente invención
incluyen además moléculas quiméricas y humanizadas, monocatenarias y
bi-específicas que tienen afinidad para un
polipéptido IL-1B conferida por al menos una región
determinante de la complementariedad (abreviadamente en lo sucesivo
CDR por la expresión inglesa Complementarity Determining
Region) del anticuerpo.
"Actividad biológica" o "bioactividad"
o "actividad" o "función biológica", que se usan
intercambiablemente para los fines de la presente memoria significa
una función efectora o antigénica que es realizada directamente o
indirectamente por un polipéptido IL-1 (tanto en su
conformación natural como desnaturalizada), o por cualquiera de sus
sub-secuencias. Las actividades biológicas incluyen
unión a un péptido diana, por ejemplo, un receptor de
IL-1. Las actividades biológicas también incluyen la
transcripción de un gen IL-1, tal como
IL-1B. Una bioactividad de IL-1
puede ser modulada afectando directamente a un polipéptido
IL-1. Alternativamente, una bioactividad de
IL-1 puede ser modulada, modulando el nivel de un
polipéptido IL-1, tal como modulando la expresión de
un gen IL-1.
Como se usa en la presente memoria la expresión
"fragmento bioactivo de un polipéptido IL-1" se
refiere a un fragmento del polipéptido IL-1 de
longitud completa, en donde el fragmento mimetiza o antagoniza
específicamente la actividad del polipéptido IL-1 de
tipo natural. El fragmento bioactivo es preferiblemente un fragmento
capaz de interactuar con un receptor de interleuquina.
La expresión "una actividad aberrante", tal
como se aplica a una actividad de un polipéptido tal como
IL-1, se refiere a una actividad que difiere de la
actividad del polipéptido del tipo silvestre o natural del
polipéptido en un sujeto sano. Una actividad de un polipéptido puede
ser aberrante porque es más fuerte que la actividad de su
correspondiente natural. Alternativamente, una actividad puede ser
aberrante porque sea más débil o esté ausente con respecto a la
actividad de su correspondiente natural. Una actividad aberrante
también puede ser un cambio de actividad. Por ejemplo un polipéptido
aberrante puede interactuar con un péptido diana diferente. Una
célula puede tener una actividad aberrante de IL-1
debido a la sobre-expresión o
sub-expresión de un gen del locus
IL-1 que codifica un polipéptido del locus
IL-1.
"Células", "células hospedantes" o
"células recombinantes" son términos usados intercambiablemente
en la presente memoria para referirse no solamente a la célula
sujeto particular, sino a la progenie o progenie potencial de dicha
célula. Debido a ciertas modificaciones puede ocurrir, en
generaciones subsiguientes debido a influencias mutacionales o
ambientales, que dicha progenie pueda no ser de hecho idéntica, a la
célula parental, pero todavía está incluida dentro del alcance de
término tal como se usa en la presente memoria.
Una "quimera", "mosaico", "mamífero
quimérico " y similares, se refiere a un mamífero transgénico no
humano con una construcción desactivada
(knock-out) o activada
(knock-in) en al menos algunas de sus células
que contienen el genoma.
El término "animal" tal como se usa en la
presente memoria nunca se refiere a un ser humano.
Los términos "control" o "muestra de
control" se refieren a cualquier muestra apropiada para la
técnica de detección apropiada empleada. La muestra de control puede
contener los productos de la técnica de detección de alelos empleada
o la materia que se ha de analizar. Además, los controles pueden
ser positivos o negativos. A modo de ejemplo, cuando la técnica de
detección de alelos es la amplificación por PCR, seguida por
fraccionamiento por tamaños, la muestra de control puede comprender
fragmentos de DNA de un tamaño apropiado. Análogamente, cuando la
técnica de detección de alelos implique la detección de una proteína
mutada, la muestra de control puede comprender una muestra de una
proteína mutante. Sin embargo, se prefiere que la muestra de control
comprenda el material que se ha de analizar. Por ejemplo, los
controles pueden ser una muestra de DNA genómico o una porción
clonada del agrupamiento de genes de IL-1. Sin
embargo, cuando la muestra que se ha de analizar es DNA genómico, la
muestra de control es preferiblemente una muestra de control
altamente purificada de DNA genómico.
La frase "enfermedades y estados asociados con
los polimorfismos de IL-1" se refiere a una
variedad de enfermedades o estados, cuya sensibilidad a los cuales
puede estar indicada en un sujeto basado en la identificación de uno
o más alelos dentro del complejo IL-1. Ejemplos
incluyen: enfermedad inflamatoria o degenerativa, incluyendo:
respuesta inflamatoria sistémica (abreviadamente SIRS por la
expresión inglesa Systemic Inflammatory Response Syndrome);
enfermedad de Alzheimer (y estados y síntomas asociados que
incluyen: neuroinflamación crónica, activación glial; aumento de las
microglias; formación de placas neuríticas; y respuesta a terapia);
esclerosis lateral amilotrópica (abreviadamente ALS por la expresión
inglesa Amylotropic Lateral Sclerosis), artritis (y estados y
síntomas asociados incluyendo: artritis aguda, artritis inducida por
antígenos, artritis asociada con tiroiditis linfocítica crónica,
artritis inducida por colágeno, artritis crónica juvenil; artritis
reumatoide juvenil, osteoartritis, prognosis y artritis inducida por
estreptococos), asma (y estados y síntomas asociados, incluyendo:
asma bronquial; enfermedad obstructiva crónica de las vías
respiratorias; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma
juvenil y asma ocupacional); enfermedades cardiovasculares (y
estados y síntomas asociados, incluyendo: aterosclerosis;
miocarditis autoinmunitaria, hipoxia cardiaca crónica, insuficiencia
cardiaca congestiva, arteriopatía coronaria, miocardiopatía y
disfunción de células cardíacas, incluyendo: activación de las
células musculares lisas aórticas; apoptosis de las células
cardíacas; e inmunomodulación de la función de las células
cardíacas; diabetes y estados y síntomas asociados, incluyendo
diabetes autoinmune, diabetes dependiente de insulina (Tipo 1),
periodontitis diabética, retinopatía diabética, y nefropatía
diabética); inflamaciones gastrointestinales (y estados y síntomas
relacionados, incluyendo la enfermedad celiaca, osteopenia asociada,
colitis crónica, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria
intestinal y colitis ulcerosa); úlceras gástricas; inflamaciones
hepáticas, cálculos biliares de colesterol y fibrosis hepática,
infección por el VIH (y estados y síntomas relacionados, incluyendo
respuestas degenerativas, respuestas neurodegenerativas, y
enfermedad de Hodgkin asociada al VIH), síndrome de Kawasaki (y
estados y síntomas asociados, incluyendo síndrome de los ganglios
linfáticos mucocutáneos, linfadenopatía cervical, lesiones de las
arterias coronarias, edema, fiebre, aumento de leucocitos, anemia
leve, descamación de la piel, erupción cutánea, enrojecimiento
conjuntival, trombocitosis; esclerosis múltiple, nefropatías (y
estados y síntomas asociados, incluyendo nefropatía diabética,
nefropatía terminal, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture,
lesiones por supervivencia de hemodiálisis y reperfusión isquémica
renal), enfermedades neurodegenerativas (y estados y síntomas
asociados, incluyendo neurodegeneración aguda, inducción de
IL-1 en el envejecimiento y enfermedad
neurodegenerativa, plasticidad inducida por IL-1 de
las neuronas hipotalámicas e hiper-reactividad
crónica por estrés), oftalmopatías (y estados y síntomas asociados,
incluyendo retinopatía diabética, oftalmopatía de Graves, y uveitis,
osteoporosis (y estados y síntomas asociados, incluyendo disminución
de la masa ósea o frecuencia de fractura alveolar, femoral, radial,
vertebral o de la muñeca, disminución de la masa ósea
posmenopáusica, tumores, frecuencia de fracturas o tasa de
disminución de la masa ósea), otitis media (en adultos o niños),
pancreatitis o acinitis pancreática, periodontitis o periodontopatía
(y estados y síntomas asociados, incluyendo en adultos, de
iniciación temprana y diabética); enfermedades pulmonares,
incluyendo neumopatía crónica, sinusitis crónica, enfermedad de las
membranas hialinas, hipoxia y enfermedad pulmonar en el síndrome de
muerte súbita del latente (abreviadamente SIDS por la expresión
inglesa (Sudden Infant Death Syndrome); reestenosis;
reumatismo incluyendo artritis reumatoide, nódulos de Aschoff
reumáticos, enfermedades reumáticas y miocarditis reumática;
tiroiditis incluyendo tiroiditis linfocítica crónica; infecciones de
las vías urinarias incluyendo prostatitis crónica, síndrome del
dolor pélvico crónico y urolitiasis. Trastornos inmunológicos,
incluyendo enfermedades autoinmunitarias, tales como alopecia
aerata, miocarditis autoinmune, enfermedad de Graves, oftalmopatías
de Graves, esclerosis del liquen, esclerosis múltiple, psoriasis,
lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica, enfermedades del
tiroides (por ejemplo bocio y estruma linfomatosa (tiroiditis de
Hashimoto, bocio linfadenoide), trastornos del sueño y síndrome de
fatiga crónica y obesidad (no diabética o asociada con diabetes).
Resistencia a las enfermedades infecciosas, tales como
leishmaniosis, lepra, enfermedad de Lyme, carditis de Lyme, malaria,
malaria cerebral, meningititis, nefritis
túbulo-intersticial asociada con malaria), que son
causadas por bacterias, virus (por ejemplo citomegalovirus,
encefalitis, virus de Epstein-Barr, virus de la
inmunodeficiencia humana, virus de la gripe) o protozoos (por
ejemplo, Plasmodium falciparum, tripanosomas). traumatismo,
incluyendo traumatismo cerebral (incluyendo ictus e isquemias,
encefalitis, encefalopatías, epilepsia, lesión cerebral perinatal,
convulsiones febriles, SIDS y hemorragias subaracnoidea), bajo peso
al nacer (por ejemplo parálisis cerebral), lesiones pulmonares
(lesiones pulmonares hemorrágicas agudas, síndrome de Goodpasture,
reperfusión isquémica aguda), disfunción miocárdica, causada por
contaminantes laborales y medioambientales (por ejemplo sensibilidad
al síndrome del aceite tóxico y silicosis), traumatismo por
radiación, y eficacia de las respuestas de cicatrización de heridas
(por ejemplo heridas por quemaduras o térmicas, heridas crónicas,
heridas quirúrgicas y lesiones de la médula espinal). Sensibilidad a
neoplasias, incluyendo metástasis osteolítica asociadas a cáncer de
mama, caquexia, cáncer colo-rectal, enfermedades
hiper-proliferantes, enfermedad de Hodgkin,
leucemias, linfomas, enfermedades metabólicas y tumores, metástasis,
mielomas y diversos cánceres (incluyendo de mama, próstata, ovario,
colon, pulmón, etc), anorexia y caquexia. Regulación hormonal
incluyendo fertilidad/fecundidad, probabilidad de un embarazo,
incidencia de parto prematuro, complicaciones prenatales y
neonatales incluyendo bajo peso al nacer prematuro, parálisis
cerebral, septicemia, hipotiroxinemia, dependencia del oxígeno,
deformidad craneal, menopausia temprana. Una respuesta del sujeto a
trasplantes (rechazo o aceptación), respuesta en fase aguda (por
ejemplo, respuesta febril), respuesta inflamatoria general,
respuesta a la dificultad respiratoria aguda, respuesta inflamatoria
sistémica aguda, cicatrización de heridas, adherencia, respuesta
inmuno-inflamatoria, respuesta neuroendocrina,
desarrollo y resistencia a la fiebre, respuesta en fase aguda,
respuesta al estrés, sensibilidad a enfermedades, estrés por
movimiento repetitivo, epicondilitis, y tratamiento y respuesta del
dolor.
Las frases "interrupción del gen" e
"interrupción dianizada" o cualquier frase similar se refieren
a la interrupción específica de un sitio de una secuencia de DNA de
modo que se impida la expresión de ese gen en la célula en
comparación con la copia de tipo natural del gen. La interrupción
puede ser causada por deleciones, inserciones o modificaciones en el
gen o cualquiera de sus combinaciones.
El término "haplotipo" como se usa en la
presente memoria está destinado a referirse a un conjunto de alelos
que se heredan juntos como un grupo (están en desequilibrio de
ligamiento) a niveles estadísticamente significativos (p_{corr}
< 0,05). Como se usa en la presente memoria, la frase "un
haplotipo de IL-1" se refiere a un haplotipo en
los loci de IL-1. Un haplotipo de
IL-1 inflamatorio o pro-inflamatorio
se refiere a un haplotipo que es indicativo de actividades
agonistas aumentadas y/o antagonistas disminuidas. Un haplotipo
inflamatorio o pro-inflamatorio de
IL-1 se refiere también a un haplotipo que es
indicativo de una expresión alterada de los genes
IL-1, tales como una expresión aumentada de
IL-1B.
Los términos "agrupación de genes
IL-1 " y "loci de
IL-1" como se usan en la presente memoria
incluyen la totalidad del ácido nucleico en o cerca de la región
2q13 del cromosoma 2, incluyendo al menos los genes
IL-1A, IL-1B y
IL-1RN y cualesquiera otras secuencias unidas.
(Nicklin et al., Genomics 19: 382-84, 1994).
Los términos "IL-1A",
"IL-1B", y "IL-1RN" como
se usan en la presente memoria se refieren a los genes que codifican
los antagonistas de los receptores de IL-1A,
IL-1B, y IL-1, respectivamente. Los
números de acceso a los genes (en el banco de datos GenBank) para
IL-1A, IL-1B, y
IL-1RN son X03833, X04500, y X64532,
respectivamente.
"Mutación funcional de
IL-1" se refiere a una mutación dentro de la
agrupación de genes IL-1 que da como resultado un
fenotipo alterado (es decir, afecta a la función de un gen o
proteína de IL-1).Ejemplos incluyen: el alelo 2 de
IL-1A(+4845), el alelo 2 de IL-1B
(+3954), el alelo 2 de IL-1B (+6912), el alelo 1 de
IL-IB (+3737), el alelo 1 de IL-1B
(-1468); y el alelo 2 de IL-1RN (+2018).
"Alelo Y de IL-1X (Z)" se
refiere a una forma alélica particular, denominada Y, que está
presente en un sitio polimórfico del locus
IL-1 en el gen X, en donde X es
IL-1A, B o RN y situado en o cerca del nucléotido Z,
en donde el nucléotido Z está numerado con respecto al sitio del
comienzo transcripcional principal, que es el nucléotido +1, del gen
X particular de IL-1. Como se usa además en la
presente memoria, la expresión "alelo (Z) de
IL-1X" se refiere a todos los alelos de un sitio
polimórfico en IL-1 en el gen X posicionado en o
cerca del nucléotido Z. Por ejemplo, la expresión "alelo
IL-1RN (+2018)" se refiere a formas alternativas
del gen IL-1RN en el marcador +2018. "Alelo 1 de
L-1RN (+2018)" se refiere a una forma del gen
IL-1RN que contiene una citosina (C) en la posición
+2018 de la cadena con sentido. Clay et al., Hum. Genet.
97:723-26, 1996. "Alelo 2 de
IL-1RN (+2018)" se refiere a una forma del gen
IL-1RN que contiene una timina en la posición (T)
+2018 de de la cadena positiva (+). Cuando un sujeto tiene dos
alelos IL-1RN idénticos, se dice que el sujeto es
homocigótico, o que tiene un estado homocigótico. Cuando un sujeto
tiene dos alelos IL-1RN diferentes, se dice que el
sujeto es heterocigótico, o que tiene el estado heterocigótico. La
expresión "alelo 2,2 de IL-1RN (+2018)" se
refiere al estado 2 del alelo 2 de IL-1 RN (+2018)
homocigótico. Inversamente, la expresión "alelo 1,1 de
IL-1RN (+2018)" se refiere al estado del alelo 1
de IL-1RN (+2018) homocigótico. La expresión
"alelo 1,2 de IL-1RN (+2018)" se refiere a los
estados 1 y 2 del alelo heterocigótico.
"Relacionado con IL-1" como
se usa en la presente memoria se emplea para incluir todos los genes
relacionados con los genes del locus IL-1
humano en el cromosoma 2 humano (2q 12-14). Estos
incluyen los genes IL-1 de la agrupación de genes
IL-1 humanos localizada en el cromosoma 2 (2q
13-14) que incluye: el gen IL-1A que
codifica interleuquina-1\alpha, el gen
IL-1B gene que codifica
interleuquina-1\beta, y el gen
IL-1RN (o IL-1ra) que codifica el
antagonista del receptor de interleuquina-1. Además,
estos genes IL-1 relacionados incluyen los genes de
los receptores de IL-1 de tipo I y tipo II
localizados en el cromosoma 2 (2q 12) y sus homólogos de ratón
localizados en el cromosoma 1 del ratón en la posición 19,5 cM. La
interleuquina-1\alpha, la
interleuquina-1\beta y la
interleuquina-1RN están relacionadas tanto más
cuanto que todas se unen a los receptores de tipo l de
IL-1, sin embargo sólo la
interleuquina-1\alpha y la
interleuquina-1\beta son ligandos agonistas que
activan los receptores de tipo I de IL-1, mientras
que la interleuquina-1RN es un ligando antagonista
que se presenta de modo natural. Cuando se usa el término
"IL-1" con referencia un producto o polipéptido
génico, pretende significar que se refiere a todos los productos
génicos codificados por el locus de la
interleuquina-1 en el cromosoma 2 (2q
12-14) humano y sus homólogos correspondientes de
otras especies o sus variantes funcionales. El término
IL-1 incluye por tanto los polipéptidos secretados
que promueven una respuesta inflamatoria, tal como
IL-1\alpha y IL-1\beta, así como
un polipéptido secretado que antagoniza las respuestas
inflamatorias, tales como el antagonista del receptor de
IL-1 y el receptor de tipo II de
IL-1 (señuelo).
Un "receptor de IL-1" o
"IL-1R" se refiere a receptores proteínicos
unidos a la membrana de diversas células capaces de unirse a, y/o
transducir, una señal de un ligando codificado por el locus
IL-1. El término se aplica a cualquiera de las
proteínas que son capaces de unirse a moléculas de
interleuquina-1 (IL-1) y, en su
configuración natural como proteínas de membrana en el plasma de
mamífero, desempeñan presumiblemente una función en transducir la
señal proporcionada por IL-1 a una célula. Como se
usa en la presente memoria, el término incluye análogos de las
proteínas naturales con unión a IL-1 o actividad
transductora de señales. Ejemplos incluyen los receptores de
IL-1 humanos y de múridos descritos en la Patente de
EE.UU. Nº 4.968.607. La expresión "ácido nucleico de
IL-1" se refiere a un ácido nucleico que codifica
una proteína IL-1.
Un "polipéptido IL-1" y
"proteína IL-1" se emplea para abarcar
polipéptidos que comprenden la secuencia de aminoácidos codificada
por las secuencias del DNA genómico de IL-1
mostradas en la Figuras 1, 2, y 3, o sus fragmentos, y sus homólogos
e incluyen polipéptidos agonistas y antagonistas.
"Riesgo aumentado" se refiere a una
frecuencia estadísticamente superior de que se produzca la
enfermedad o estado en un individuo que lleva un alelo polimórfico
particular en comparación con la frecuencia de que se produzca la
enfermedad o estado en un miembro de una población que no lleva el
alelo polimórfico particular.
El término "interactuar" tal como se usa en
la presente memoria se emplea para significar relaciones o
asociaciones detectable (por ejemplo, interactuaciones bioquímicas)
entre moléculas naturales, tales como interactuaciones entre
proteína-proteína, proteína-ácido nucleico, ácido
nucleico-ácido nucleico y proteína-molécula pequeña
o ácido nucleico-molécula pequeña.
El término "aislado" como se una en la
presente memoria con respecte a ácidos nucleicos, tales como DNA o
RNA, se refiere a moléculas separadas de otros DNA o RNA,
respectivamente, que están presentes en la fuente natural de la
macromolécula. Por ejemplo, un ácido nucleico aislado que codifica
uno de los polipéptidos IL-1 objeto incluye no más
de 10 kilobases (kb) de la secuencia del ácido nucleico que flanquea
natural e inmediatamente el gen IL-1 en el DNA
genómico, más preferiblemente no más de 5 kb de dichas secuencias
flanqueantes que se presentan de modo natural, y más preferiblemente
menos de 1,5 kb de dichas secuencias flanqueante que se presentan de
modo natural. El término aislado como se usa en la presente memoria
se refiere también a un ácido nucleico o péptido que está
sustancialmente exento de material celular, material viral, o medio
de cultivo cuando es producido por técnicas de DNA recombinante, o
precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza
químicamente. Además, un "ácido nucleico aislado" se emplea
para incluir fragmentos de un ácido nucleico que no se presentan de
modo natural como fragmentos y no se encontrarían en estado natural.
El término "aislado" se usa también en la presente memoria para
referirse a polipéptidos que están aislados de otras proteínas
celulares y se emplea para abarcar tanto polipéptidos purificados
como recombinantes.
Un animal transgénico activado
("knock-in") se refiere a un animal no
humano que ha tenido un gen modificado introducido en su genoma y el
gen modificado puede ser de origen exógeno o endógeno.
Un animal transgénico inactivado
("knock-out") se refiere a un animal no
humano en el cual hay una supresión parcial o completa de la
expresión de un gen endógeno (por ejemplo, basado en la deleción de
al menos una porción del gen, reemplazamiento de al menos una
porción del gen con una segunda secuencia, introducción de codones
de parada, mutación de bases que codifican aminoácidos críticos, o
la eliminación de un empalme de intrones, etc.).
Una "construcción desactivada
(knock-out)" se refiere a una secuencia de
ácido nucleico que se puede usar para disminuir o suprimir la
expresión de una proteína codificada por secuencias de DNA endógeno
en una célula. En un ejemplo sencillo, la construcción desactivada
está constituida por un gen, tal como el gen IL-1RN,
con una deleción en una porción crítica del mismo, de modo que no se
puede expresar a partir del mismo la proteína activa.
Alternativamente, a un gen natural se le pueden añadir cierto número
de codones de terminación para provocar la terminación temprana de
la proteína o puede ser desactivado un empalme de intrones. En una
típica construcción desactivada, alguna porción del gen está
reemplazada con un marcador seleccionable (tal como el gen
neo) de modo que el gen puede ser representado como sigue:
IL-1RN 5'/neo/ IL-1RN 3', donde
IL-1RN5' y IL-1RN 3', se refieren a
secuencias genómicas o de cDNA que están, respectivamente en una
posición situada hacia el extremo 5 y respectivamente en una
posición situada hacia el extremo 3', respectivamente con respecto a
una porción del gen 1L-1RN y donde neo se
refiere a un gen de resistencia a neomicina. En otra construcción
desactivada, un segundo marcador seleccionable está añadido en una
posición flanqueante de modo que el gen puede ser representado como:
IL-1RN/neo/IL-1RN/TK, donde TK es un
gen de la timidina-quinasa que puede ser añadido a
la secuencia IL-1RN5' o 1L-1RN3' de
la construcción precedente y que además puede ser seleccionado
contra (es decir, es una marcador seleccionable negativo) en medios
apropiados. Esta construcción de dos marcadores permite la selección
de eventos de recombinación homólogos, que elimina el marcador con
TK flanqueante, a partir de eventos de recombinación no homólogos
que típicamente retienen las secuencias TK. La deleción y/o el
reemplazamiento de genes pueden ser de exones, intrones,
especialmente empalmes de intrones, y/o las regiones reguladoras
tales como los promotores.
"Desequilibrio de ligamiento" se refiere a
la herencia conjunta de dos alelos a frecuencias mayores que la que
se podría esperar a partir de las frecuencias separadas que
presentan cada alelo en una población de control dada. La frecuencia
esperada de presentación de dos alelos que se heredan conjuntamente
es la frecuencia del primer alelo multiplicada por la frecuencia del
segundo alelo. Los alelos que se presentan conjuntamente a las
frecuencias esperadas se dice que están en "desequilibrio de
ligamiento". La causa del desequilibrio de ligamiento
frecuentemente no está clara. Puede ser debida a la selección para
ciertas combinaciones de alelos o a la mezcla reciente de
poblaciones genéticamente heterogéneas. Además, en el caso de
marcadores que estén vinculados muy fuertemente a un gen de una
enfermedad, se espera una asociación de un alelo (o grupo de alelos
unidos) con el gen de la enfermedad si la mutación de la enfermedad
ocurrió en pasado reciente, de modo que no transcurrido suficiente
tiempo para que sea conseguido el equilibrio a través de los eventos
de recombinación en la región cromosómica específica. Cuando se hace
referencia a modelos alélicos que están constituidos por más de un
alelo, un primer modelo alélico está en desequilibrio de ligamiento
con un segundo modelo alélico si todos los alelos que comprende el
primer modelo alélico están en desequilibrio de ligamiento con al
menos uno de los alelos del segundo modelo alélico. Un ejemplo de
desequilibrio de ligamiento es el que ocurre entre los alelos en los
sitios polimórficos IL-1RN (+2018) y
IL-1RN (VNTR). Los dos alelos en
IL-1RN (+2018) están 100% en desequilibrio de
ligamiento con los dos alelos más frecuentes de
IL-1RN (VNTR), que son el alelo 1 y el alelo 2.
El término "marcador" se refiere a una
secuencia del genoma que se sabe que varía entre individuos. Por
ejemplo, el gen IL-1RN tiene un marcador que
consiste en un número variable de repeticiones en tándem
(VNTR).
Un "gen mutado " o "mutación" o
"mutación funcional" se refiere a una forma alélica de un gen,
que es capaz de alterar el fenotipo de un sujeto que tiene el gen
mutado respecto a un sujeto que no tiene el gen mutado. El fenotipo
alterado causado por una mutación puede ser corregido o compensado
para ciertos agentes. Si un sujeto debe ser homocigótico para esta
mutación que tiene un fenotipo alterado, se dice que la mutación es
recesiva. Si una copia del gen mutado es suficiente para alterar el
fenotipo del sujeto, se dice que la mutación es dominante. Si un
sujeto tiene una copia del gen mutado y tiene un fenotipo que es
intermedio entre el de un sujeto homocigótico y el de un sujeto
heterocigótico (para ese gen), se dice que la mutación es
co-dominante.
Un "animal no humano" de la invención
incluye mamíferos tales como roedores, primates no humanos, ovejas,
perros, vacas, cabras, etc., anfibios, tales como los miembros del
género Xenopus, y aves transgénicas (por ejemplo, pollos,
pájaros, etc.). La expresión "animal quimérico" se usa en la
presente memoria para referirse a animales no humanos en los cuales
se encuentra el gen recombinante, o en los cuales se expresa el gen
recombinante en algunas pero no en todas las células del animal. La
expresión "animal quimérico específico de tejido" indica que
está presente uno de los genes IL-1 y/o está
expresado o interrumpido en algunos tejidos pero no en otros. El
término "mamífero" se refiere a cualquier miembro de la clase
mamífero, excepto seres humanos.
Como se usa en la presente memoria, el término
"ácido nucleico" se refiere a polinucléotidos u
oligonucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (DNA), y,
cuando sea apropiado, ácido ribonucleico (RNA). El término debe
entenderse también para incluir, como equivalentes análogos RNA o
DNA hechos de análogos de nucléotidos (por ejemplo, ácidos nucleicos
de péptidos) y como aplicables a la realización que describe
polinucléotidos, monocatenarios (con sentido o antisentido) y
bicatenarios.
Los términos "periodontitis" y
"periodontopatía" se refieren a un trastorno dental que es el
resultado del progreso de la gingivitis, que implica inflamación e
infección del tejido, incluyendo ligamentos y huesos, que sostienen
la dentadura. La periodontitis es frecuentemente diagnosticada por
examen que muestra la encía de color rojo púrpura hinchada y blanda.
Los depósitos de placa y sarro pueden ser visibles en la base de los
dientes, con cavidades alargadas en las encías. Las encías son
indoloras usualmente o suavemente sensibles, salvo que esté presente
un absceso dental. Se pueden perder los dientes y reabsorber las
encías. La gravedad de la periodontitis se cuantifica midiendo la
profundidad de las cavidades (PC, también denominada "profundidad
de sondeo") en las cavidades de las encías de un sujeto.
El término "polimorfismo" se refiere a la
coexistencia de más de una forma de un gen o una de sus porciones
(por ejemplo, variante alélica). Una porción de un gen del cual hay
al menos dos formas diferentes, es decir, dos secuencias de
nucleótidos diferentes, se denomina una "región polimórfica de un
gen". Una secuencia genética específica en una región polimórfica
de un gen es un alelo. Una región polimórfica puede ser de un solo
nucléotido, cuya identidad difiere en alelos diferentes. Una región
polimórfica también puede tener una longitud de varios
nucléotidos.
La expresión "propensión a enfermedad,"
también "predisposición" o "sensibilidad" a enfermedad o
cualquier frase similar, significa que ciertos alelos descubiertos
por la presente invención están asociados con, o son predictivos de,
una incidencia del sujeto de desarrollar una enfermedad particular
(por ejemplo, una enfermedad vascular). Los alelos están por tanto
sobre-expresados en frecuencia en individuos con
enfermedad en comparación con los individuos sanos. Por tanto, estos
alelos se pueden usar para predecir la enfermedad incluso en
individuos pre-sintomáticos o en un estado previo a
la enfermedad.
"Molécula pequeña" como se usa en la
presente memoria, está destinada a referirse a una composición, que
tiene un peso molecular de menos de aproximadamente 5 kD y más
preferiblemente aproximadamente 4 kD. Moléculas pequeñas pueden ser
ácidos nucleicos, péptidos, péptido-miméticos,
carbohidratos, lípidos u otras moléculas orgánicas o
inorgánicas.
Como se usa en la presente memoria, la expresión
"se hibrida específicamente " o "detecta específicamente"
se refiere a la capacidad de una molécula de ácido nucleico de
hibridarse a al menos aproximadamente 6 nucléotidos consecutivos de
un ácido nucleico de una muestra.
"Secuencia reguladora transcripcional" es
un término genérico usado a través de la memoria para referirse
secuencias de DNA, tales como señales de iniciación, potenciadores,
y promotores, que inducen o controlan la transcripción de secuencias
codificadoras de proteínas con las que están unidos
operativamente.
Como se usa en la presente memoria, el término
"transgén" significa una secuencia de ácido nucleico (que
codifica, por ejemplo, uno de los polipéptidos IL-1
o un de transcrito antisentido para el mismo) que ha sido
introducido en una célula. Un transgén podría ser parcial o
enteramente heterólogo, es decir, extraño, al animal o célula
transgénico en el cual está introducido, o, es homólogo para un gen
endógeno del animal o célula transgénico en el cual está
introducido, pero que está diseñado para ser insertado, o está
insertado, en el genoma del animal de tal modo que altera el genoma
de la célula en la cual está insertado (por ejemplo, está insertado
en una localización que difiere del gen natural o su inserción da
como resultado una inactivación o knockout). Un transgén
puede estar presente también en una célula en forma de un episoma.
Un transgén puede incluir una o más secuencias reguladoras de la
transcripción y cualquier otro ácido nucleico, tal como intrones,
que pueden ser necesarios para la expresión óptima de un acido
nucleico seleccionado.
Un "animal transgénico" se refiere a un
mamífero preferiblemente no humano, un ave o un anfibio, en el cual
una o más de las células del animal contienen ácido nucleico
heterólogo introducido por medio de intervención humana, tal como
métodos transgénicos muy conocidos por los expertos en la técnica.
El ácido nucleico se introduce en la célula, directa o
indirectamente mediante la introducción en un precursor de la
célula, por medio de manipulación genética deliberada, tal como por
micro-inyección o por infección con un virus
recombinante. La expresión manipulación genética no incluye cría
cruzada clásica, o fertilización in vitro, sino que más bien
está dirigida a la introducción de una molécula de DNA recombinante.
Esta molécula puede estar integrada con un cromosoma, o puede ser
DNA que se replica extra-cromosómicamente. En los
animales transgénicos típicos descritos en la presente memoria, el
transgén hace que las células expresen una forma recombinante de uno
de los polipéptidos de IL-1, por ejemplo formas
agonísticas o antagonísticas. Sin embargo, también están
considerados los animales transgénicos en los cuales el gen
recombinante es silencioso, como por ejemplo, la construcción
dependiente de recombinasa FLP o CRE descrita más adelante. Además,
"animal transgénico" también incluye los animales recombinantes
no humanos en los cuales la interrupción de genes de uno o más genes
es causada por intervención humana, incluyendo tanto recombinación
como técnicas antisentido. El término está destinado a incluir todas
las generaciones de la progenie. Por tanto, están incluidos el
animal fundador y todos los F1, F2, F3, y así sucesivamente, de su
progenie.
El término "tratamiento" como se usa en la
presente memoria se pretende que abarque el curado, así como la
mejora de al menos un síntoma de un estado o enfermedad.
El término "vector" se refiere a una
molécula de ácido nucleico, que es capaz de transportar otro ácido
nucleico al cual ha estado unido. Un tipo de vector preferido es un
episoma, es decir, un ácido nucleico capaz de replicación
extra-cromosómica. Los vectores preferidos son los
capaces de replicación autónoma y/o expresión de ácidos nucleicos a
los cuales están unidos. Los vectores capaces de dirigir la
expresión de genes a los que están unidos operativamente se
denominan en la presente memoria "vectores de expresión". En
general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de DNA
recombinante están frecuentemente en la forma de "plásmidos"
que se refieren generalmente a bucles de DNA bicatenario circular lo
cuales, en su forma de vectores no se encuentran en el cromosoma. En
la presente memoria, "plásmido" y "vector" se usan
intercambiablemente puesto que el plásmido es la forma más
comúnmente usada de vector. Sin embargo, la invención está destinada
a incluir dichas otras formas de vectores de expresión que sirven
como equivalentes funcionales y que han llegado a ser conocidos en
la técnica con posterioridad a esto.
El término "alelo de tipo natural" se
refiere a un alelo de un gen que, cuando está presente en dos copias
en un sujeto da como resultado un fenotipo de tipo natural. Puede
haber diferentes de alelos de tipo natural de un gen específico,
puesto que ciertos cambios de nucleótidos en un gen no pueden
afectar al fenotipo de un sujeto que tiene dos copias del gen con
los cambios de nucléotidos.
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La presente invención se basa al menos en parte,
en la identificación de ciertos modelos de haplotipos inflamatorios
y la asociación (hasta una extensión estadísticamente significativa)
de estos modelos con el desarrollo de ciertas enfermedades o
estados. Por tanto, la detección de los alelos que comprenden un
haplotipo, solo o junto con otros medios en un sujeto puede indicar
que el sujeto tiene o está predispuesto al desarrollo de una
enfermedad o estado. Sin embargo, debido a que estos alelos están en
desequilibrio de ligamiento con otros alelos, la detección de dichos
otros alelos unidos puede indicar también que el sujeto tiene o está
predispuesto al desarrollo de una enfermedad o estado particular.
Por ejemplo, el haplotipo 44112332 comprende el siguiente
fenotipo:
Otros tres polimorfismos en un exón alternativo
de IL-1RN (exón lic, que produce una forma
intracelular del producto génico) están también en desequilibrio de
ligamiento con el alelo 2 de IL-1RN (VNTR) (Clay
et al., (1996) Hum. Genet. 97:723-26).
Estos incluyen: el exón lic (1812) de IL-1RN
(GenBank: X77090 en 1812); el polimorfismo del exón lic (1868) de
IL-1RN (GenBank: X77090 en 1868); y el polimorfismo
del exón lic (1887) de IL-1RN (GenBank: X77090 en
1887). Además, todavía otro polimorfismo en el promotor para la
forma intracelular empalmada alternativamente del gen, el
polimorfismo Pic (1731) (GenBank: X77090 en 1731), está también en
desequilibrio de ligamiento con el alelo 2 del locus
polimórfico (VNTR) de IL-1RN. Para cada uno de estos
loci, se ha determinado la variante de secuencia del alelo 2
en desequilibrio de ligamiento con el alelo 2 del locus
(VNTR) de IL-1RN (Clay et al., (1996) Hum.
Genet. 97:723-26).
El haplotipo 33221461 haplotipo comprende el
siguiente genotipo:
Los individuos con el haplotipo 44112332 son
típicamente sobre-productores tanto de proteínas
IL-1\alpha como IL-1\beta, por
estimulación. En contraste, los individuos con el haplotipo 33221461
son típicamente sub-productores de
IL-1ra. Cada haplotipo da como resultado una
respuesta pro-inflamatoria neta. Cada alelo dentro
de un haplotipo puede tener un efecto, así como un efecto de
genotipo compuesto. Además, pueden estar asociadas enfermedades
particulares con ambos modelos de haplotipos.
La Tabla 1 siguiente expone un número de
marcadores de genotipo y diversas enfermedades y estados a los
cuales se ha encontrado que están asociados estos marcadores en una
extensión estadísticamente significativa.
\vskip1.000000\baselineskip
También se describen en la presente memoria
alelos y haplotipos de IL-1B adicionales que modulan
la expresión y los estados inflamatorios de
IL-1\beta. En la presente memoria se describen los
SNP en las posiciones -3737 de IL-1B y -1468 de
IL-1B. Los individuos con un haplotipo que incluye
el alelo 1 de IL-1B (-511), el alelo 1 de
IL-1B (-1468) y el alelo 2 de IL-1B
(-3737) son típicamente sobre-productores de ambas
proteínas IL-1\beta, por estimulación. Los
individuos con un haplotipo que incluye el alelo 1 de
IL-1B (-511), el alelo 1 de IL-1B
(-1468) y el lelo 1 de IL-1B (-3737) son también
típicamente sobre-productores de ambas proteínas
IL-1\beta. En contraste, los individuos con un
haplotipo que incluye el alelo 2 de IL-1B (-511), el
alelo 2 de IL-1B (-1468) y el alelo 1 de
IL-1B (-3737) son típicamente
sub-productores de IL-1. Cada alelo
dentro de un haplotipo puede tener un efecto, así como un efecto de
genotipo compuesto. Además, pueden estar asociadas enfermedades
particulares con ambos modelos de haplotipos. Debe advertirse que el
SNP en la posición -1468 de IL-1B también ha sido
etiquetado IL-1B (-1464) y IL-1B
(-1473). (Véase, Lee, et al, J. Gastroenterol. 2004,
39:429-433).
Además de los modelos alélicos descritos
anteriormente, como se describe en la presente memoria, un experto
en la técnica puede identificar fácilmente otros alelos (incluyendo
polimorfismos y mutaciones) que estén en desequilibrio de ligamiento
con un alelo asociado con una enfermedad o trastorno. Por ejemplo,
puede recogerse una muestra de un ácido nucleico de un primer grupo
de sujetos sin un trastorno particular, así como DNA de un segundo
grupo de sujetos con el trastorno. Las muestras de ácido nucleico
pueden ser comparadas para identificar los alelos que están
sobre-representados en el segundo grupo comparado
con el primer grupo, en donde dichos alelos están supuestamente
asociados con un trastorno, que es causado por, o al que contribuye,
una regulación inapropiada de la interleuquina 1. Alternativamente,
pueden ser identificados los alelos que están en desequilibrio de
ligamiento con un alelo que está asociado con el trastorno, por
ejemplo, genotipificando una población grande y realizando una
análisis estadístico para determinar que alelos aparecen más
usualmente juntos que lo esperado. Preferiblemente el grupo se
elige para estar constituido por individuos relacionados.
Genéticamente los individuos relacionados incluyen individuos de la
misma raza, el mismo grupo étnico, o incluso la misma familia. A
medida que aumenta el grado de relación genética entre un grupo de
control y un grupo de ensayo, aumenta el valor predictivo de los
alelos polimórficos que están incluso más distantemente ligados a un
alelo causante de enfermedad. Esto es porque ha transcurrido menos
tiempo evolutivo para permitir polimorfismos que estén ligados a lo
largo de un cromosoma en una población fundadora para redistribuirse
a través de eventos de cruzamientos genéticos. Por tanto se pueden
desarrollar análisis de genotipificación para el diagnóstico
específico de raza, específico de etnia e incluso específico de
familia para la detección de alelos de enfermedad que surgieron en
incluso tiempos más recientes de la evolución humana, por ejemplo,
después de la divergencia de las principales razas humanas, después
de la separación de las poblaciones humanas en distintos grupos
étnicos, e incluso dentro de la historia reciente de una línea
familiar particular.
El desequilibrio de ligamiento entre dos
marcadores polimórficos o entre un marcador polimórfico y una
mutación causante de una enfermedad es un estado metaestable.
Estando ausente la presión selectiva o la presentación reiterada
ligada esporádica de los eventos mutacionales subyacentes, los
polimorfismos llegarán a estar finalmente disociados por los eventos
de recombinación cromosómica y alcanzarán por tanto el equilibrio de
ligamiento a través del curso de la evolución humana. Por tanto, la
probabilidad de encontrar un alelo polimórfico en desequilibrio de
ligamiento con una enfermedad o estado puede aumentar con cambios en
al menos dos factores: disminución de la distancia física entre el
marcador polimórfico y la mutación causante de la enfermedad, y
disminución del número de generaciones meióticas disponibles para la
disociación del par ligado. La consideración del último factor
sugiere que, cuanto más estrechamente estén relacionados dos
individuos más probablemente compartirán un cromosoma o región
cromosómica parental común que contiene los polimorfismos ligados y
menos probablemente que este par ligado habrá llegado a desligarse a
través de los eventos de cruzamiento meiótico que ocurren en cada
generación. Como resultado, cuánto más estrechamente relacionados
estén dos individuos, más probablemente es que sean heredados
conjuntamente los polimorfismos ampliamente espaciados. Por
consiguiente, para individuos relacionados por raza, etnicidad o
familia comunes, la fiabilidad de los loci polimórficos
incluso los más distantemente espaciados puede ser fiable como un
indicador de la herencia conjunta de una mutación causante de una
enfermedad ligada.
Se pueden diseñar sondas apropiadas para
hibridarse a un gen específico del locus
IL-1, tal como IL-1A,
IL-1B o IL-1RN o un gen relacionado.
Estas secuencias de DNA genómicos se muestran en las Figuras 3, 4 y
5, respectivamente, y corresponden además a la SEQ ID NOS. 1, 2 y 3,
respectivamente. Alternativamente, estas sondas pueden incorporar
otras regiones de locus genómicos relevantes, incluyendo
secuencias intergénicas. Realmente la región 1L-1
del cromosoma 2 humano abarca unas 400.000 pares de bases y,
suponiendo una media de un polimorfismo de un solo nucleótido cada
1.000 pares de bases, incluye unos 400 loci de SNP solamente.
Incluso otros polimorfismos disponibles para uso con la presente
invención son obtenibles desde diversas fuentes públicas. Por
ejemplo, la base de datos del genoma humano reúne los SNP
intragénicos, es buscable por secuencias y usualmente contiene
aproximadamente 2.700 entradas
(http://hgbase.interactiva.de). También está disponible una
base de datos de polimorfismo humano mantenida por el Massachusetts
Institute of Technology (MIT SNP database
(http://www.genome.wi.mit.edu/SNP/
human/index.html)). A partir de dichas fuentes se pueden encontrar los SNP, así como otros polimorfismos humanos.
human/index.html)). A partir de dichas fuentes se pueden encontrar los SNP, así como otros polimorfismos humanos.
Por ejemplo, el examen de la región de
IL-1 del genoma humano en una cualquiera de estas
bases de datos revela que los genes de locus
IL-1 están flanqueados por un marcador polimórfico
próximo al centrómero denominado marcador microsatélite AFM220ze3 en
127,4 cM (centiMorgans) (véase Nº de acceso en GenBank Z17008) y un
marcador polimórfico distal denominado marcador de anclaje
microsatélite AFM087xa1 en 127,9 cM (véase Nº de acceso en GenBank
Z16545). Estos loci polimórficos humanos son ambos
polimorfismos microsatélites de repetición del dinucleótido CA, y,
como tales, muestran un alto grado de heterocigosidad en poblaciones
humanas. Por ejemplo, un alelo de AFM220ze3 genera un producto de
amplificación por PCR de 211 pb con un cebador en 5' de la secuencia
TGTACCTAAGCCCACCCTTTAGAGC (SEQ ID No. 4) y un cebador en 3' de la
secuencia TGGCCTC
CAGAAACCTCCAA (SEQ ID No. 5). Además, un alelo de AFM087xa1 genera un producto de amplificación por PCR de 177 pb con un cebador en 5' de la secuencia GCTGATATTCTGGTGGGAAA (SEQ ID No. 6) y un cebador en 3' de la secuencia GGCAAGAGCAAAACTCTGTC (SEQ ID No. 7).
CAGAAACCTCCAA (SEQ ID No. 5). Además, un alelo de AFM087xa1 genera un producto de amplificación por PCR de 177 pb con un cebador en 5' de la secuencia GCTGATATTCTGGTGGGAAA (SEQ ID No. 6) y un cebador en 3' de la secuencia GGCAAGAGCAAAACTCTGTC (SEQ ID No. 7).
El promotor IL-1B humano es de
interés en identificar polimorfismos asociados con la producción
alterada de IL-1\beta. Se usan dos conjuntos de
cebadores para amplificar el promotor IL-1B que
contienen extremos 3' diferentes. Los cebadores
IL-1BF1 5'cccACGCGTGAGTGAAAGGAATCCCGTTAGAAGT (SEQ ID
NO: 33) y IL-1BR2
5'cccACGCGTGCCTGTTGTGCCTTGTGCCTCGAAG (SEQ ID NO: 34) se usan para
generar el fragmento del promotor IL-1B,
IL-1BS, (+32 a -5326) (S = corto; sin el primer
exón). IL-1BR1
5'cccACGCGTGGCTGCTTCAGA
CACCTGTGTA (SEQ ID NO: 35) se usa para generar el fragmento del promotor IL-1BL (+471 a -5326) (L= largo; que contiene el primer exón y el SNP 17 (+45)).
CACCTGTGTA (SEQ ID NO: 35) se usa para generar el fragmento del promotor IL-1BL (+471 a -5326) (L= largo; que contiene el primer exón y el SNP 17 (+45)).
Los cebadores equivalentes que corresponden a
secuencias únicas que presentan 5' y 3' para estos polimorfismos de
repetición del dinucleótido CA en el cromosoma 2 humano serán
evidentes para los expertos en la técnica. Los cebadores
equivalentes razonables incluyen los que se hibridan dentro de
aproximadamente 1 kb del cebador diseñado, y que además están en
cualquier parte desde aproximadamente 17 pb a aproximadamente 27 pb
de longitud. Una directriz general para diseñar cebadores para la
amplificación de secuencias genómicas cromosómicas humanas únicas es
que posean una temperatura de fusión de al menos aproximadamente
50ºC, en donde se puede estimar una temperatura de fusión aproximada
usando la fórmula T_{fusión} = [2xnúmero de A o
T)+4x(número de G o C)].
Numerosos loci polimórficos están
presentes entre estos dos polimorfismos de repetición del
dinucléotido CA y proporcionan dianas adicionales para la
determinación de un alelo de pronóstico en una familia u otro grupo
de individuos genéticamente relacionados. Por ejemplo, el sitio web
del National Center for Biotechnology Information
(www.ncbi.nlm.nih.gov/genemap/) contiene un lista de cierto
número de marcadores de polimorfismo en la región del locus
IL-1 y proporciona una guía para diseñar cebadores
apropiados para la amplificación y análisis de esos marcadores.
Por consiguiente, los segmentos nucleotídicos de
la invención pueden usarse por su capacidad para formar
selectivamente moléculas dúplex con tramos complementarios de
cromosoma 2 humano, q12-13 o cDNA de esa región o
proporcionar cebadores para la amplificación del DNA o el cDNA de
esta región. El diseño de sondas apropiadas para este fin requiere
la consideración de cierto número de factores. Por ejemplo, los
fragmentos que tienen una longitud de entre 10, 15 o 18 nucléotidos
hasta aproximadamente 20, o a aproximadamente 30 nucléotidos,
encontrarán una utilidad particular. Las secuencias más largas, por
ejemplo, 40, 50, 80, 90, 100, incluso hasta la longitud completa,
son incluso más preferidas para ciertas realizaciones. Las
longitudes de oligonucleótidos de al menos aproximadamente 18 a 20
nucléotidos son bien aceptadas por los expertos en la técnica como
suficiente para permitir una hibridación suficientemente específica
para ser útil como sonda molecular. Además dependiendo de la
aplicación prevista, se podrán emplear condiciones variables de
hibridación para conseguir grados variables de selectividad de sonda
para la secuencia diana. Para aplicaciones que requieren alta
selectividad, se deseará típicamente emplear condiciones
relativamente estrictas para formar los híbridos. Por ejemplo,
condiciones de sal relativamente bajas y/o alta temperatura, tales
como las proporcionadas por NaCl 0,02 M – 0,15 M a temperaturas de
aproximadamente 50ºC a aproximadamente 70ºC. Dichas condiciones
selectivas pueden tolerar poco, si existe, desapareamiento entre la
sonda y la cadena molde o diana.
En un sujeto se pueden detectar o monitorizar
otros alelos u otros indicios de un trastorno junto con la detección
de los alelos descritos antes, por ejemplo, identificar espesores de
paredes de vasos sanguíneos (por ejemplo, como se mide por
ultrasonido), o si el sujeto es fumador, bebedor, tiene sobrepeso o
si está sometido a estrés o a ejercicios.
\vskip1.000000\baselineskip
Hay disponibles muchos métodos para detectar
alelos específicos en loci polimórficos humanos. El método
preferido para detectar un alelo polimórfico específico dependerá,
en parte, de la naturaleza molecular del polimorfismo. Por ejemplo,
las diversas formas alélicas del locus polimórfico pueden
diferir en un solo par de bases del DNA. Dichos polimorfismos de un
solo nucléotido (o SNP) son los principales contribuyentes a la
variación genética, que comprende un 80% de todos los polimorfismos
conocidos, y su densidad en el genoma humano se estima que es por
término medio de 1 por cada 1.000 pares de bases. Los SNP son muy
frecuentemente bialélicos que se presentan en solamente dos formas
diferentes (aunque son teóricamente posibles hasta cuatro formas
diferentes de un SNP, correspondientes a las cuatro bases de
nucleótidos diferentes que existen en el DNA). No obstante, los SNP
son mutacionalmente más estables que otros polimorfismos, lo que les
hace adecuados para estudios de asociación en los cuales el
desequilibrio de ligamiento entre marcadores y una variante
desconocida se usa para cartografiar mutaciones causantes de una
enfermedad. Además, debido a que los SNP tienen típicamente solo dos
alelos, pueden ser sometidos a genotipificación mediante un sencillo
ensayo más/menos en lugar de una medida prolongada, lo que les hace
más susceptibles de automatización.
Una variedad de métodos está disponible para
detectar la presencia de polimorfismo de un solo nucleótido
particular en un individuo. Los avances en este campo han
proporcionado precisión, facilidad y genotipificación de los SNP
barato y a gran escala. Muy recientemente, por ejemplo, se han
descrito nuevas técnicas que incluyen hibridación dinámica
específica de alelos (abreviadamente DASH por la expresión inglesa
Dynamic Allele-Specific Hybridization),
electroforesis en gel diagonal en matrices de microplacas,
abreviadamente MADGE por la expresión inglesa Microplate Array
Diagonal Gel Electrophoresis),
piro-secuenciación, ligamiento específico de
oligonucleótidos, el sistema TaqMan, así como diversas tecnologías
de "chips" de DNA, tal como los chips Affymetrix SNP. Estos
métodos requieren la amplificación de la región genética diana,
típicamente por PCR. Incluso otros métodos recientemente
desarrollados, basados en la generación de pequeñas moléculas de
señal por escisión invasiva seguido por espectrometría de masas o
sondas candados inmovilizadas y amplificación por círculo rodante,
podrían finalmente eliminar la necesidad de la PCR. Se recogen
resumidamente más adelante varios de los métodos conocidos en la
técnica para detectar polimorfismos de un solo nucleótidos
específicos. El método de la presente invención se entiende que
incluye todos los métodos disponibles.
Se han desarrollado varios métodos para
facilitar tal análisis de los polimorfismos de un solo nucleótido.
En una realización, el polimorfismo de una sola base se puede
detectar usando un nucleótido resistente a exonucleasas
especializadas, como se ha descrito, por ejemplo, en Mundy, C. R.
(Patente de EE.UU. Nº 4.656.127). De acuerdo con el método, se
permite que un cebador complementario a la secuencia alélica
inmediatamente 3' respecto al sitio polimórfico se hibride a una
molécula diana obtenida de un animal o ser humano particular. Si el
sitio polimórfico en la molécula diana contiene un nucléotido que es
complementario al derivado de nucleótido resistente a la exonucleasa
particular presente, entonces el derivado se incorporará sobre el
extremo del cebador hibridado. Dicha incorporación convierte al
cebador en resistente a la exonucleasa, y por ello permite su
detección. Puesto que se conoce la identidad del derivado resistente
a la exonucleasa de la muestra, un hallazgo de que el cebador ha
llegado a ser resistente a las exonucleasas revela que el nucléotido
presente en el sitio polimórfico de la molécula diana era
complementario al del derivado de nucléotido usado en la reacción.
Este método tiene la ventaja de que no requiere la determinación de
grandes cantidades de datos de secuencias.
Se describe un método basado en una disolución
para determinar la identidad del nucléotido de un sitio polimórfico.
Cohen, D. et al. (Patente francesa 2.650.840; solicitud de
patente PCT Nº WO91/02087). Como en el método de Mundy de la patente
de EE.UU. Nº 4.656.127, se emplea un cebador que es complementario a
las secuencias alélicas inmediatamente 3' a un sitio polimórfico. El
método determina la identidad del nucléotido de ese sitio usando
derivados de didesoxinucléotidos marcados, que, si son
complementarios al nucléotido del sitio polimórfico se incorporarán
en (extremo) del cebador.
Se describe un método alternativo, conocido como
Genetic Bit Analysis o GBA^{TM} Goelet, P. et al.,
(solicitud de patente PCT Nº 92/15712). El método de Goelet, P.
et al., usa mezclas de terminadores marcados y un cebador que
es complementario a la secuencia 3' para un sitio polimórfico. El
terminador marcado que se incorpora se determina por tanto por el, y
es complementario al, nucléotido presente en el sitio polimórfico de
la molécula diana que se evalúa. En contraste con el método de Cohen
et al., (Patente francesa 2.650.840; solicitud PCT Nº
WO91/02087) el método de Goelet, P. et al., es
preferiblemente un ensayo en fase heterogénea, en el que el cebador
o la molécula diana está inmovilizado en un fase sólida.
Recientemente, se han descrito varios métodos de
incorporación de nucleótidos guiados por cebador para analizar
sitios polimórficos en DNA (Komher, J. S. et al., Nucl. Acids.
Res. 17:7779-7784 (1989); Sokolov, B. P.,
Nucl. Acids Res. 18:3671 (1990); Syvanen, A. -C., et al.,
Genomics 8:684-692 (1990); Kuppuswamy, M. N.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.)
88:1143-1147 (1991); Prezant, T. R. et al., Hum.
Mutat. 1:159-164 (1992); Ugozzoli, L. et al.,
GATA 9:107-112 (1992); Nyren, P. et al.,
Anal. Biochem. 208:171-175 (1993)). Estos
métodos difieren del GBA ^{TM} en que todos se basan en la
incorporación de desoxinucleótidos marcados para discriminar entre
bases en un sitio polimórfico. En dicho formato, puesto que la señal
es proporcional al número de desoxinucleótidos incorporados, los
polimorfismos que pueden estar presentes en experimentos del mismo
nucléotido pueden dar como resultado señales que son proporcionales
a la longitud del experimento (Syvanen, A. -C., et al., Amer.
J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993)).
Para mutaciones que producen terminación
prematura de la traducción de proteínas, el ensayo de truncamiento
de proteínas (abreviadamente en lo sucesivo PTT por la expresión
inglesa Protein Truncation Test) ofrece una aproximación
eficaz al diagnóstico (Roest, et al., (1993) Hum. Mol.
Genet. 2:1719-21; van der Luijt, et al.,
(1994) Genomics 20:1-4). Por el PTT, el RNA
se aísla inicialmente a partir de tejido disponible y se somete a
transcripción inversa, y el segmento de interés se amplifica por
PCR. Los productos de la transcripción inversa y la PCR se usan
luego como molde para la amplificación por PCR anidada con un
cebador que contiene un promotor de RNA-polimerasa y
una secuencia para iniciar la traducción en eucariotas. Después de
la amplificación de la región de interés, los restos únicos
incorporados en el cebador permiten la transcripción y traducción
secuenciales in vitro de los productos de la PCR. Por
electroforesis en gel de dodecil-sulfato
sódico-poliacrilamida de los productos de la
traducción, la aparición de polipéptidos truncados señala la
presencia de una mutación que causa una terminación prematura de la
traducción. En una variación de esta técnica, el DNA (en oposición
al RNA) se usa como molde para la PCR cuando la región diana de
interés se deriva de un solo exón.
Se puede utilizar cualquier tipo de célula o
tejido para obtener muestras de ácido nucleico para uso en los
diagnósticos descritos en la presente memoria. En una realización
preferida, la muestra de DNA se obtiene a partir de un fluido
corporal, por ejemplo, sangre, obtenida por técnicas conocidas (por
ejemplo, punción en vena) o saliva. Alternativamente, el ensayo del
ácido nucleico se puede realizar en muestras secas (por ejemplo,
cabello o piel). Cuando se usa RNA o proteína, las células o tejidos
que pueden ser utilizados deben expresar un gen
IL-1.
Los métodos de diagnóstico se pueden realizar
también directamente in situ en secciones de tejidos (fijadas
y/o congeladas) de tejido de pacientes obtenidos de biopsias o
resecciones, tales que no es necesaria una purificación del ácido
nucleico. Los reactivos de ácido nucleico se pueden usar como sondas
y/o cebadores para tales métodos in situ (véase, por ejemplo,
Nuovo, G.J., 1992, PCR in situ hybridization: protocols and
applications, Rayen Press, NY).
Además de los métodos que ponen el énfasis
principalmente en la detección de una secuencia de ácido nucleico,
también se pueden determinar perfiles en dichos esquemas de
detección. Los perfiles de las huellas pueden ser generados, por
ejemplo, utilizando un método de presentación diferencial, análisis
Northern y /o RT-PCR.
Un método de detección preferido es una
hibridación específica de alelos que usa sondas que solapan una
región de al menos un alelo de un haplotipo
pro-inflamatorio de IL-1 y que
tienen aproximadamente 5, 10, 20, 25 o 30 nucléotidos alrededor de
la mutación o región polimórfica. En una realización preferida de la
invención, se unen a un soporte en fase sólida varias sondas capaces
de hibridarse específicamente a otras variantes alélicas implicadas
en una reestenosis, por ejemplo, un "chip" (que puede
contener hasta aproximadamente 250.000 oligonucleótidos). Los
oligonucleótidos pueden estar unidos a un soporte sólido mediante
una variedad de procesos, incluyendo litografía. El análisis de la
detección de la mutación que usa estos chips que comprenden
oligonucleótidos, también denominado "matrices de sondas de
DNA" está descrito por ejemplo por Cronin et al., (1996)
Human Mutation 7:244. En una realización, un chip
comprende todas las variantes alélicas de al menos una región
polimórfica. El soporte en fase sólida se pone luego en contacto con
un ácido nucleico de ensayo y se detecta la hibridación a las sondas
específicas. Por consiguiente, se puede identificar en un sencillo
experimento de hibridación la identidad de numerosas variantes
alélicas de uno o más genes.
Estas técnicas pueden comprender también la
etapa de amplificar el ácido nucleico antes del análisis. Los
métodos de amplificación son conocidos por los expertos en la
técnica e incluyen, pero sin limitación, clonación, reacción en
cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la polimerasa
de alelos específicos (ASA), reacción en cadena de la ligasa (LCR),
reacción en cadena con la polimerasa anidada, replicaciones de
secuencias auto-sostenida (Guatelli, J.C. et
al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87:1874-1878), sistema de amplificación
transcripcional (Kwoh, D.Y. et al., 1989, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86:1173-1177), y
Q-Beta Replicase (Lizardi, P.M. et
al., 1988, Bio/Technology 6:1197).
Los productos de amplificación pueden analizarse
por una variedad de modos, incluyendo análisis por tamaños,
digestión por restricción seguida de análisis por tamaños, detección
de cebadores oligonucleotídicos con una etiqueta específica en los
productos de reacción, hibridación de oligonucleótidos específica de
alelos (ASO), detección por 5' exonucleasa específica de alelos,
secuenciación, hibridación, y similares.
La detección basada en PCR significa que puede
incluir amplificación múltiple de una variedad de marcadores
simultáneamente. Por ejemplo, es bien conocido en la técnica
seleccionar cebadores de PCR para generar productos de PCR que no se
solapan en tamaño y pueden ser analizados simultáneamente.
Alternativamente, es posible amplificar diferentes marcadores con
cebadores que están etiquetados diferentemente y por tanto cada uno
puede ser detectado diferencialmente. Naturalmente, la detección
basada en hibridación significa permitir la detección diferencial de
múltiples productos de PCR en una muestra. En la técnica se conocen
otros métodos para permitir análisis múltiples de una pluralidad de
marcadores.
En una realización meramente ilustrativa, el
método incluye las etapas de: (i) recoger una muestra de células de
un paciente, (ii) aislar el ácido nucleico (por ejemplo, genómico,
mRNA o ambos) de las células de la muestra, (iii) poner en contacto
la muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores que se hibridan
específicamente en 5' y 3' a al menos un alelo de un haplotipo
pro-inflamatorio IL-1 en condiciones
tales que ocurre la hibridación y la amplificación del alelo, y (iv)
detectar el producto de amplificación. Estos esquemas de detección
son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido
nucleico si dichas moléculas están presentes en números muy
bajos.
En una realización preferida del análisis
pertinente, el alelo de un haplotipo
pro-inflamatorio de IL-1 se
identifica por alteraciones en los modelos de escisión por enzimas
de restricción. Por ejemplo, se aíslan el DNA de muestra y de
control, se amplifica (opcionalmente), se digiere con una o más
endonucleasas de restricción, y se determinan por electroforesis en
gel los tamaños de la longitud de los fragmentos.
En incluso otra realización, se pueden usar
cualquiera de las reacciones de secuenciación conocidas en la
técnica para secuenciar directamente el alelo. Reacciones de
secuenciación ilustrativas incluyen las basadas en las técnicas
desarrolladas por Maxam y Gilbert ((1977) Proc. Natl Acad Sci
USA, 74:560) o por Sanger (Sanger et al., (1977) Proc.
Nat. Acad. Sci USA 74:5463). También se contempla que cualquiera
de una variedad de métodos de secuenciación automatizados pueda ser
utilizada cuando se realizan los análisis pertinentes (véase, por
ejemplo Biotechniques (1995) 19:448), que incluyen secuenciar
por espectrometría de masas (véase por ejemplo la publicación de la
solicitud de patente PCT WO 94/16101; Cohen et al., (1996)
Adv. Chromatogr., 36:127-162; y Griffin et
al., (1993) Appl. Biochem. Biotechnol,
38:147-159). Será evidente para los expertos en la
técnica que, para ciertas realizaciones, se necesita determinar la
presencia de solamente uno, dos o tres de las bases de los ácidos
nucleicos en la reacción de secuenciación. Por ejemplo, se puede
llevar a cabo una huella de A (adenina) o similar, por ejemplo,
cuando solamente se detecte un ácido nucleico.
\newpage
En una realización adicional, se puede usar la
protección de los agentes de escisión (tales como una nucleasa,
hidroxilamina o tetróxido de osmio y/con piperidina) para detectar
bases desapareadas en heterodúplex RNA/DNA o RNA/DNA o DNA/DNA
(Myers, et al., (1985) Science, 230:1242). En general,
la técnica de "escisión de desapareamientos" comienza
proporcionando los heterodúplex formados hibridando RNA o DNA
(marcados) que contienen el alelo de tipo natural con la muestra.
Los dúplex bicatenarios se tratan con un agente que escinde las
regiones monocatenarias de los dúplex, tales como las que existirán
debido a los desapareamientos de bases entre las cadenas de control
y de la muestra. Por ejemplo, los dúplex RNA/DNA se pueden tratar
con RNasa y los híbridos DNA/DNA ser tratados con nucleasa S1 para
digerir enzimáticamente las regiones desapareadas. En otras
realizaciones, los dúplex DNA/DNA o RNA/DNA se pueden tratar con
hidroxilamina o tetróxido de osmio y con piperidina para digerir las
regiones desapareadas. Después de la digestión de las regiones
desapareadas, el material resultante se separa luego por tamaño
sobre geles de poliacrilamida desnaturalizantes para determinar el
sitio de la mutación. Véase, por ejemplo, Cotton et al.,
(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4397; y Saleeba et
al., (1992) Métodos Enzymol. 217:286-295.
En una realización preferida, el DNA o RNA de control se puede
etiquetar para detección.
En incluso otra realización, la reacción de
escisión de desapareamientos emplea una o más proteínas que
reconocen pares de bases desapareadas en los DNA bicatenarios (las
denominadas "enzimas de reparación de desapareamientos de
DNA"). Por ejemplo, la enzima mutY de E. coli escinde los
desapareamientos A en G/A y la timidina
DNA-glicosilasa de las células HeLa escinde los
desapareamientos T en G/T (Hsu et al., (1994)
Carcinogenesis, 15:1657-1662). De acuerdo con
una realización ilustrativa, una sonda basada en el alelo del
haplotipo del locus de IL-1 se hibrida a un
cDNA u otro de producto de DNA de una(s) célula(s) de
ensayo. El dúplex se trata con la enzima reparadora de
desapareamientos del DNA, y los productos escindidos, si los
hubiere, pueden ser detectados por protocolos de electroforesis o
similares. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº
5.459.039.
En otras realizaciones, las alteraciones en la
movilidad electroforética se usarán para identificar un alelo del
locus IL-1. Por ejemplo, el polimorfismo
conformacional monocatenario (abreviadamente en lo sucesivo SSCP por
la expresión inglesa Single Strand Conformation Polymorphism)
se puede usar para detectar diferencias en la movilidad
electroforética entre los ácidos nucleicos de tipo mutante y de tipo
natural (Orita et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86:2766, véase también Cotton (1993) Mutat. Res.
285:125-144; y Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech.
Appl., 9:73-79). Los fragmentos de DNA
monocatenarios de los alelos de IL-1 de la muestra y
del control se desnaturalizan y se les deja
re-naturalizar. La estructura secundaria de los
ácidos nucleicos monocatenarios varía de acuerdo con la secuencia, y
la alteración resultante en la movilidad electroforética permite la
detección de incluso un cambio de una sola base. Los fragmentos de
DNA pueden ser etiquetados o detectados con sondas etiquetadas. La
sensibilidad del análisis puede ser mejorada usando RNA (en lugar de
DNA), en el cual la estructura secundaria es más sensible a un
cambio en la secuencia. En una realización preferida, el método
pertinente utiliza análisis de heterodúplex para separar moléculas
de heterodúplex bicatenarias basándose en cambios de la movilidad
electroforética (Keen et al., (1991) Trends Genet.,
7:5).
En todavía otra realización, se analiza el
movimiento de los alelos en geles de poliacrilamida que contienen un
gradiente de desnaturalizante usando electroforesis de gen en
gradiente (abreviadamente en lo sucesivo DGGE por la expresión
inglesa Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) (Myers et
al., (1985) Nature, 313:495). Cuando la DGGE se usa como
el método de análisis, se modificará el DNA para asegurar que no se
desnaturaliza completamente, por ejemplo añadiendo una pinza o
abrazadera de GC de aproximadamente 40 pb de DNA rico en GC de alto
punto de fusión por PCR. En una realización adicional, se usa un
gradiente de temperatura en lugar de un gradiente de agente
desnaturalizante para identificar diferencias en la movilidad del
DNA de la muestra y del control (Rosenbaum y Reissner (1987)
Biophys. Chem. 265:12753).
Ejemplos de otras técnicas para detectar alelos
incluyen, pero sin limitación, hibridación de oligonucleótidos
selectivos, amplificación selectiva o extensión de cebadores
selectivos. Por ejemplo, pueden prepararse cebadores
"oligonucleotídicos" en los cuales la mutación o la diferencia
de nucléotidos conocida (por ejemplo, en variantes alélicas) es
colocada centralmente y luego hibridada a un DNA diana en
condiciones que permiten la hibridación solamente si se encuentra un
apareamiento perfecto (Saiki et al., (1986) Nature,
324:163); Saiki et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci
USA 86:6230). Dichas técnicas de hibridación de oligonucleótidos
específica de alelos se puede usar para analizar una mutación o
región polimórfica por reacción cuando los oligonucleótidos se
hibridan a un DNA diana amplificado por PCR o un número de
diferentes mutaciones o regiones polimórficas cuando los
oligonucleótidos se unen a la membrana hibridante y se hibridan con
el DNA diana etiquetado.
Alternativamente, se puede usar junto con la
presente invención la tecnología de amplificación específica de
alelos que depende de la amplificación por PCR selectiva. Los
oligonucleótidos usados como cebadores para la amplificación
específica pueden llevar la mutación o la región polimórfica de
interés en el centro de la molécula (de modo que la amplificación
depende de la hibridación diferencial) (Gibbs et al., (1989)
Nucleic Acids Res., 17:2437-2448) o en el
extremo 3' de un cebador donde, en condiciones apropiadas, puede
impedir o reducir la extensión por la polimerasa (Prossner (1993)
Tibtech., 11:238. Además puede ser deseable introducir un
nuevo sitio de restricción en la región de la mutación para crear
una detección basada en la escisión (Gasparini et al., (1992)
Mol. Cell Probes, 6:1). Se anticipa que en ciertas
realizaciones la amplificación se puede realizar también usando Taq
ligasa para la amplificación (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci
USA, 88:189). En tales casos, la ligación ocurrirá solamente si
hay un perfecto apareamiento en el extremo 3' de la secuencia en 5'
que lo haga posible para detectar la presencia de una mutación
conocida en un sitio específico buscando la presencia o ausencia de
la amplificación.
En otra realización la identificación de la
variante alélica se lleva a cabo usando un ensayo de ligamiento de
oligonucleótidos (abreviadamente en lo sucesivo OLA por la expresión
inglesa Oligonuclotide Ligation Assay), como se describe, por
ejemplo, en la patente de EE.UU. Nº 4.998.617 y en Landegren, U.
et al., ((1988) Science,
241:1077-1080). El protocolo OLA usa dos
oligonucleótidos que están diseñados para ser capaces de hibridarse
a secuencias contiguas de una sola cadena de una diana. Uno de los
oligonucleótidos se une a un marcador de separación, por ejemplo,
biotinilado y el otro está etiquetado detectablemente. Si la
secuencia complementaria precisa se encuentra en una molécula diana,
los oligonucleótidos se hibridarán de tal modo que sus extremos
estén contiguos y creen un sustrato de ligamiento. El ligamiento
permite entonces que el oligonucleótido marcado sea recuperado
usando avidina u otro ligando de biotina. Nickerson, D. A. et
al., han descrito un análisis de detección de ácidos nucleicos
que combina los atributos de la PCR y el OLA (Nickerson, D. A. et
al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
87:8923-27). En este método,
la PCR se usa para conseguir la amplificación exponencial del DNA diana, que luego se detecta usando el OLA.
la PCR se usa para conseguir la amplificación exponencial del DNA diana, que luego se detecta usando el OLA.
Se han desarrollado varias técnicas basadas en
este método OLA y se pueden usar para detectar alelos de un
haplotipo del locus IL-1. Por ejemplo, la
Patente de EE.UU. Nº 5.593.826 describe un OLA que usa un
oligonucleótido que tiene un grupo 3'-amino y un
oligonucleótido 5'-fosforilado para formar un
conjugado que tiene un enlace fosforamidato. En otra variación del
OLA descrito en Tobe et al., ((1996) Nucleic Acid
Res., 24: 3728), el OLA combinado con la PCR permite determinar
el tipo de dos alelos en un solo pocillo de microtitulación.
Marcando cada uno de los cebadores específicos de alelos con un
hapteno único, es decir, digoxigenina y fluoresceína, cada reacción
de OLA puede ser detectada usando anticuerpos específicos del
hapteno que están etiquetados con diferentes informadores
enzimáticos, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano silvestre.
Este sistema permite la detección de los dos alelos usando un
formato de alto rendimiento que conduce a la producción de dos
colores diferentes.
Otra realización de la invención está dirigida a
kits para detectar una predisposición para desarrollar una
reestenosis. Este kit puede contener uno o más oligonucleótidos,
incluyendo 5' y 3' oligonucleótidos que se hibridan 5' y 3' a al
menos un alelo de un haplotipo del locus
IL-1. Los oligonucleótidos de la amplificación por
PCR deben hibridarse entre 25 y 2500 pares de bases separadas,
preferiblemente entre aproximadamente 100 y aproximadamente 500
bases separadas, para producir un producto de PCR de tamaño
conveniente para análisis posteriores.
Los cebadores particularmente preferidos para
uso en el método de diagnóstico de la invención incluyen las SEQ ID
NO: 8-23 y 36-39.
El diseño de oligonucleótidos adicionales para
la amplificación y detección de alelos polimórficos de
IL-1 por el método de la invención se facilita por
la disponibilidad de tanto información actualizada de secuencias del
cromosoma humano 2q13 - que contienen el locus
IL-1 humano-, como de información actualizada de
polimorfismos humanos disponible para este locus. Por
ejemplo, la secuencia de DNA para IL-1A,
IL-1B y IL-1RN se muestra en la
Figuras 1 (Nº de acceso en GenBank X03833), 2 (Nº de acceso en
GenBank X04500) y 3 (Nº de acceso en GenBank X64532)
respectivamente. Los cebadores adecuados para la detección de un
polimorfismo humano en estos genes pueden ser diseñados fácilmente
usando información de secuencias y métodos estándares conocidos en
la técnica para el diseño y optimización de secuencias de cebadores.
El diseño óptimo de dichas secuencias de cebadores se puede
conseguir, por ejemplo, mediante el uso de programas de selección de
cebadores comercialmente disponibles, tales como Primer 2.1, Primer
3 o GeneFisher (véase también, Nicklin M.H.J., Weith A. Duff G.W.,
"A Physical Map de the Region Encompassing the Human
Interleukin-1\alpha,
interleukin-1\beta, and
Interleukin-1 Receptor Antagonist Genes"
Genomics, 19: 382 (1995); Nothwang H.G., et al.,
"Molecular Cloning of the Interleukin-1 gene
Cluster: Construction of an Integrated YAC/PAC Contig and a partial
transcriptional Map in the Region of Chromosome 2q13"
Genomics, 41: 370 (1997); Clark, et al., (1986)
Nucl. Acids. Res., 14:7897-7914 [la lista de
erratas publicadas aparece en Nucl. Acids Res., 15:868 (1987)
y el proyecto de Genome Database (GDB) en la URL
http://www.gdb.org).
Para uso en un kit, los oligonucleótidos pueden
ser de cualquier variedad de composiciones naturales y/o sintéticas,
tales como oligonucleótidos sintéticos, fragmentos de restricción,
cDNA, ácidos nucleicos de péptidos sintéticos (abreviadamente en lo
sucesivo PNA por la expresión inglesa Peptide Nucleic Acids),
y similares. El kit para análisis y el método pueden emplear también
oligonucleótidos etiquetados para permitir la fácil identificación
en los análisis. Ejemplos de etiquetas que pueden emplearse incluyen
radio-etiquetas, enzimas, compuestos fluorescentes,
estreptavidina, avidina, biotina, restos magnéticos, restos de unión
de metales, restos de antígenos o anticuerpos y similares.
El kit puede, opcionalmente, incluir también
medios de muestreo de DNA. Los medios de muestreo de DNA son bien
conocidos por los expertos en la técnica y pueden incluir, pero sin
limitación, sustratos, tales como papeles de filtro, el
AmpliCard^{TM} (Universidad de Sheffield, Sheffield, England S10
2JF; Tarlow, JW, et al., J. of Invest. Dermatol.,
103:387-389 (1994)) y similares; reactivos de
purificación de DNA, tales como kits Nucleon^{TM}, tampones de
lisis, soluciones de proteinasa y similares; reactivos de PCR, tales
como tampones para reacción de 10 veces, polimerasa termoestable,
dNTP y similares; y medios de detección de alelos, tales como la
enzima de restricción HinfI,
oligonucleótidos específicos de alelos, cebadores de oligonucleótidos degenerados para PCR anidada de sangre seca.
oligonucleótidos específicos de alelos, cebadores de oligonucleótidos degenerados para PCR anidada de sangre seca.
\vskip1.000000\baselineskip
El conocimiento de los alelos particulares
asociados con una sensibilidad a desarrollar una enfermedad o estado
particular, solos o en asociación con la información sobre otros
defectos genéticos que contribuyen a la enfermedad o estado
particular permite la personalización de la prevención o tratamiento
de acuerdo con el perfil genético del individuo, y esto es lo que
constituye el objeto de la "farmacogenómica". Por tanto, la
comparación de un perfil de IL-1 individual con el
perfil de la población para un trastorno vascular, permite la
selección o diseño de fármacos u otros regímenes terapéuticos que
se espera que sean seguros y eficaces para un paciente o población
de pacientes particular (es decir, un grupo de pacientes que tienen
la misma alteración genética).
Además, la capacidad para señalar como diana las
poblaciones que se espera muestren el beneficio clínico más alto,
basado en el perfil genético, puede facilitar: 1) el
reposicionamiento de fármacos ya comercializados; 2) el rescate de
candidatos a fármacos cuyo desarrollo clínico ha sido interrumpido
como resultado de limitaciones de seguridad o eficacia, que son
específicas de un sub-grupo de pacientes; y 3) un
desarrollo acelerado y menos costoso para agentes terapéuticos
candidatos y un etiquetado de fármacos más óptimo (por ejemplo, ya
que medir el efecto de varias dosis de un agente sobre la mutación
causante es útil para optimizar la dosis eficaz).
El tratamiento de un individuo con un agente
terapéutico particular puede ser monitorizado determinando la
proteína (por ejemplo IL-1\alpha,
IL-1\beta o IL-1Ra), el mRNA y/o
el nivel de transcripción. Dependiendo del nivel detectado, el
régimen terapéutico puede mantenerse o ajustarse luego (aumentando o
disminuyendo la dosis). En una realización preferida la eficacia de
tratar un sujeto con un agente comprende las etapas de: (i) obtener
una muestra para la pre-administración de un sujeto
antes de la administración del agente; (ii) detectar el nivel o
cantidad de una proteína, mRNA o DNA genómico en la muestra para la
pre-administración; (iii) obtener una o más muestras
del sujeto para la pos-administración; (iv) detectar
el nivel de expresión o actividad de la proteína, mRNA o DNA
genómico en la muestra administración; (v) comparar el nivel de
expresión o actividad de la proteína, mRNA o DNA genómico en la
muestra de pre-administración con la proteína
correspondiente, mRNA o DNA genómico en la muestra de la
pos-administración, respectivamente; y (vi) alterar
consecuentemente la administración del agente al sujeto.
Las células de un sujeto se pueden obtener
también antes y después de la administración de un agente
terapéutico para detectar el nivel de expresión de genes distintos
del gen IL-1 para verificar que el agente
terapéutico no aumenta ni disminuye la expresión de genes que
podrían ser perjudiciales. Esto puede hacerse, por ejemplo, usando
el método del perfilado transcripcional. Por tanto, el mRNA
procedente de células expuestas in vivo a un agente
terapéutico y mRNA procedente del mismo tipo de células que no
fueron expuestas al agente terapéutico podrían ser sometidos a
reversión, transcritos e hibridados a un chip que contuviera DNA de
numerosos genes para comparar con ello la expresión de genes en
células tratadas y no tratadas con el agente terapéutico.
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Los agentes terapéuticos para enfermedades o
estados asociados con un polimorfismo o haplotipo de
IL-1 se refieren a cualquier agente a régimen
terapéutico (incluyendo productos farmacéuticos, productos
nutricéuticos y medios quirúrgicos) que impide o pospone el
desarrollo de los síntomas o su alivio de la enfermedad o estado
particular en el sujeto. El agente terapéutico puede ser un
polipéptido, un peptidomimético, ácido nucleico u otra molécula
orgánica o inorgánica, preferiblemente una "molécula pequeña"
que incluye vitaminas, minerales y otros nutrientes. Preferiblemente
el agente terapéutico puede modular al menos una actividad de un
polipéptido IL-1, por ejemplo, interactuación con un
receptor, mimetizando o potenciando (agonizando) o inhibiendo
(antagonizando) los efectos de un polipéptido de origen natural. Un
agonista puede ser una proteína de tipo natural o uno de sus
derivados que tiene al menos una bioactividad de tipo natural, por
ejemplo, actividad de unión a receptores. Un agonista puede ser
también un compuesto que sobre-regula la expresión
de un gen o que aumenta al menos una bioactividad de una proteína.
Un agonista puede ser también un compuesto que aumenta la
interactuación de un polipéptido con otra molécula, por ejemplo, un
receptor. Un antagonista puede ser un compuesto que inhibe o
disminuye la interactuación entre una proteína y otra molécula, por
ejemplo, un receptor o un agente que bloquea la transducción de
señales o el procesamiento pos-traducción (por
ejemplo, el inhibidor de la enzima convertidora de
1L-1 (ICE). Por consiguiente, un antagonista
preferido es un compuesto que inhibe o disminuye la unión a un
receptor y con ello bloquea la activación subsiguiente del receptor.
Un antagonista puede ser también un compuesto que
sub-regula la expresión de un gen o que reduce la
cantidad de una proteína presente. El antagonista puede ser una
forma negativa dominante de un polipéptido, por ejemplo, una forma
de un polipéptido que sea capaz de interactuar con un péptido diana,
por ejemplo, un receptor, pero que no promueve la activación del
receptor. El antagonista puede ser también un ácido nucleico que
codifica una forma negativa dominante de un polipéptido, un ácido
nucleico antisentido o una ribozima capaz de interactuar
específicamente con un RNA. Incluso otros antagonistas son moléculas
que se unen a un polipéptido e inhiben su acción. Dichas moléculas
incluyen péptidos, por ejemplo, formas de péptidos dianas que no
tienen actividad biológica, y que inhiben la unión a los receptores.
Así, dichos péptidos se unirán al sitio activo de una proteína e
impedirán la interactuación con los péptidos dianas. Incluso otros
antagonistas incluyen anticuerpos que específicamente interactúan
con un epítopo de una molécula, de tal modo que la unión interfiere
con la función biológica del polipéptido. En otra realización
preferida, el antagonista es una molécula pequeña, tal como una
molécula capaz de inhibir la interactuación entre un polipéptido y
un receptor diana. Alternativamente, la molécula pequeña puede
funcionar como un antagonista interactuando con sitios distintos del
sitio de unión al receptor.
Los moduladores de IL-1 (por
ejemplo, antagonista de los receptores de
1L-1\alpha, IL-1\beta o
IL-1) o una proteína codificada por un gen que está
en desequilibrio de ligamiento con un gen IL-1
pueden comprender cualquier tipo de compuesto, incluyendo una
proteína, péptido, peptidomimético, molécula pequeña o ácido
nucleico. Los agonistas preferidos incluyen ácidos nucleicos (por
ejemplo, los que codifican una proteína IL-1 o un
gen que está sobre- o sub-regulado por una proteína
IL-1), proteínas (por ejemplo proteínas
IL-1 o una proteína que está sobre- o
sub-regulada) o una molécula pequeña (por ejemplo,
que regula la expresión o unión de una proteína
IL-1). Los antagonistas preferidos que pueden ser
identificados, por ejemplo, usando los análisis descritos en la en
la presente memoria, incluyen ácidos nucleicos (por ejemplo, DNA
monocatenario (antisentido) o DNA o PNA bicatenario (tríplex) y
ribozimas), proteína (por ejemplo anticuerpos) y moléculas pequeñas
que actúan para suprimir o inhibir la transcripción de
IL-1 y/o la actividad de la proteína.
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La toxicidad y eficacia terapéutica de dichos
compuestos puede ser determinada por métodos farmacéuticos
estándares en cultivos celulares o animales de experimentación, por
ejemplo, para determinar la DL_{50} (la dosis letal para 50% de
la población) y la DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en
50% de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y
terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como
DL_{50}/DE_{50}. Se prefieren los compuestos que exhiben índices
terapéuticos grandes. Aunque pueden usarse compuestos que exhiban
efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado en diseñar un
sistema de administración que dirija dichos compuestos al sitio de
los tejidos afectados con el fin de minimizar el daño potencial a la
células no infectadas y, con ello, reducir los efectos
secundarios.
Los datos obtenidos de ensayos en cultivos
celulares y estudios en animales se pueden usar en formular un
intervalo de dosificaciones para uso en seres humanos. La
dosificación de dichos compuestos está preferiblemente dentro de las
concentraciones circulantes que incluyen la DE_{50} con poca o
ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este
intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía
de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el
método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser
estimada inicialmente a partir de ensayos en cultivos celulares. En
modelos animales se puede formular una dosis para conseguir un
intervalo de concentración circulante en plasma que incluya la
CI_{50} (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que
consigue la inhibición semi-máxima de los síntomas)
como se determina en cultivos celulares. Dicha información se puede
para determinar más precisamente las dosis útiles en seres humanos.
Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por
cromatografía de líquidos de alta resolución.
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Las composiciones para uso de acuerdo con la
presente descripción pueden ser formuladas de un modo convencional
usando uno o más vehículos o excipientes fisiológicamente
aceptables. Por tanto, los compuestos y sus sales y solvatos
fisiológicamente aceptables pueden ser formulados para
administración, por ejemplo, inyección, inhalación o insuflación (a
través de la boca o de la nariz) o administración oral, bucal,
parenteral o rectal.
Para dicha terapia los compuestos de la
invención pueden ser formulados para una variedad de cargas de de
administración, incluyendo administración sistémica y tópica o
localizada. Las técnicas y formulaciones generalmente se pueden
encontrar en Remmington's Pharmaceutical Sciences, Meade
Publishing Co., Easton, PA. Para la administración sistémica se
prefiere la inyección, incluyendo la intramuscular, intravenosa,
intraperitoneal y subcutánea. Para inyección, los compuestos de la
invención se pueden formular en soluciones líquidas, preferiblemente
en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de
Hank o solución de Ringer. Además, los compuestos pueden ser
formulados en forma sólida y re-disueltos o puestos
en suspensión inmediatamente antes de su uso. También están
incluidas las formas liofilizadas.
Para la administración oral las composiciones
pueden tomar la forma de, por ejemplo, comprimidos o capsulas
preparadas por medios convencionales con excipientes
farmacéuticamente aceptables, tales como agentes aglutinantes (por
ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o
hidroxipropil-metilcelulosa); cargas (por ejemplo,
lactosa, celulosa microcristalina o
hidrógeno-fosfato de calcio); lubricantes (por
ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por
ejemplo, almidón de patata o almidón-glicolato
sódico); o agentes humectantes (por ejemplo,
lauril-sulfato sódico). Los comprimidos pueden estar
revestidos por métodos bien conocidos en la técnica. Las
preparaciones líquidas para la administración oral puede tomar la
forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones o pueden
ser presentadas como un producto seco para reconstitución con agua u
otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones
líquidas pueden ser preparadas por medios convencionales con
aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de puesta
en suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de
celulosa o grasas hidrogenadas comestibles). Los agentes
emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma acacia); vehículos no
acuosos, (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol
etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por
ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o
ácido sórbico). Las preparaciones pueden contener también sales
tampones, agentes aromatizantes, colorantes y edulcorantes según sea
apropiado.
Las preparaciones para administración oral
pueden ser formuladas adecuadamente para dar una liberación
controlada del compuesto activo. Para administración bucal las
composiciones pueden tener la forma de comprimidos o píldoras
formuladas de la manera usual. Para la administración por
inhalación, los compuestos para uso de acuerdo con la presente
invención se suministran convenientemente en forma de presentación
de spray de aerosol, desde envases presurizados o un nebulizador,
con el uso de un gas propulsor adecuado, por ejemplo,
diclorodifluorometano, triclorofluorometano,
diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En
el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación puede
ser determinada proporcionando una válvula para suministrar una
cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina
para uso en un inhalador o insuflador se pueden formula conteniendo
una mezcla de polvos y una base de polvos adecuada, tal como lactosa
o almidón.
Los compuestos pueden ser formulados para
administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, inyección
de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden
ser presentadas en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en ampollas
o en envases multidosis, con un conservante añadido. Las
composiciones pueden adoptar las formas de suspensiones, soluciones
o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener
agentes de formulación de suspensiones, tales como agentes de puesta
en suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el
ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstitución
con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril exenta de
pirógenos antes de su uso.
Los compuestos se pueden formular también en
composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de
retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorios usuales,
tales como manteca de coco u otros glicéridos.
Además de las formulaciones descritas
previamente, los compuestos se pueden formular también como una
preparación de liberación retardada. Dichas formulaciones de acción
prolongada pueden ser administradas por implantación (por ejemplo
subcutáneamente o intramuscularmente) o por inyección intramuscular.
Así, por ejemplo, los compuestos pueden ser formulados con
materiales polímeros o hidrófobos (por ejemplo, en forma de una
emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico o
como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal
escasamente soluble. Otros sistemas de administración adecuados
incluyen microesferas que ofrecen la posibilidad de un suministro no
invasivo local de fármacos en un periodo prolongado de tiempo. Esta
tecnología utiliza microesferas de tamaño
pre-capilar que pueden ser inyectadas mediante un
catéter coronario en cualquier parte seleccionada por ejemplo el
corazón u otros órganos sin causar inflamación o isquemia. El agente
terapéutico administrado se libera lentamente desde estas
microesferas y es absorbido por las células del tejido circundante
(por ejemplo, las células endoteliales).
La administración sistémica puede ser también
por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración
transmucosal o transdérmica se usan en la formulación agentes
penetrantes apropiados para la barrera que ha de ser atravesada por
permeación. Dichos agentes penetrantes se conocen generalmente en la
técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración
transmucosal sales biliares y derivados del ácido fusídico. Además
se pueden usar detergentes para facilitar la permeación. La
administración transmucosal puede ser a través de sprays nasales o
usando supositorios. Para la administración tópica los oligómeros de
la invención se formulan en ungüentos, bálsamos, geles o cremas como
es generalmente conocido en la técnica. Para tratar una lesión o
inflamación se puede usar localmente una solución de lavado para
acelerar el curado.
Las composiciones pueden ser presentadas, si se
desea, en un envase o dispositivo dispensador que puede contener una
o más formas de dosificación unitaria que contenga el ingrediente
activo. El envase o dispositivo dispensador puede estar acompañado
por las instrucciones para la administración.
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Basándose en la identificación de las mutaciones
que causan o contribuyen al desarrollo de una enfermedad o trastorno
que está asociado con un polimorfismo o haplotipo de
IL-1, la invención se caracteriza además por
análisis basados en células o exentos de células para identificar
agentes terapéuticos. En una realización, una célula que expresa un
receptor de IL-1, o un receptor para una proteína
que está codificada por un gen que está en desequilibrio de
ligamiento con un gen de IL-1, sobre la superficie
exterior de su membrana celular se incuba en presencia de un
compuesto de ensayo sólo o en presencia de un compuesto de ensayo y
otra proteína y se detecta la interactuación entre compuesto de
ensayo y el receptor o entre la proteína (preferiblemente una
proteína señalada como diana) y el receptor, por ejemplo, usando un
microfisiómetro (McConnell et al., (1992) Science,
257:1906).
Una interactuación entre el receptor y el
compuesto de ensayo o la proteína se detecta por el microfisiómetro
como un cambio en la acidez del medio. Este sistema de análisis
proporciona por tanto un medio de identificar antagonistas
moleculares que, por ejemplo, funcionen por interferencia con la
interactuación proteína-receptor, así como agonista
molecular que, por ejemplo, funcione activando un receptor.
Los análisis celulares o exentos de células se
pueden usar también para identificar compuestos que modulan la
expresión de un gen IL-1 o un gen en desequilibrio
de ligamiento con él, modular la traducción de un mRNA, o que
modulan la estabilidad de un mRNA o proteína. Por consiguiente, en
una realización, se incuba una célula que es capaz de producir una
proteína IL-1 o de otro tipo con un compuesto de
ensayo y la cantidad de proteína producida en el medio celular se
mide y compara con la producida por una célula que no ha estado en
contacto con el compuesto de ensayo. La especificidad del compuesto
frente a la proteína puede ser confirmada por diversos análisis de
control, por ejemplo, midiendo la expresión de uno o más genes de
control. En particular, este análisis se puede usar para determinar
la eficacia de compuestos antisentido, ribozimas y tríplex.
Los análisis exentos de células se pueden usar
también para identificar compuestos que sean capaces de interactuar
con una proteína, para modificar con ello la actividad del la
proteína. Dicho compuesto puede modificar, por ejemplo, la
estructura de una proteína afectando a su capacidad de unión a un
receptor. En una realización preferida, los análisis exentos de
células para identificar dichos compuestos consisten esencialmente
en una mezcla de reacción que contienen una proteína y un compuesto
de ensayo o una quimioteca de compuestos de ensayo en presencia o
ausencia de una pareja de unión. Un compuesto de ensayo puede ser,
por ejemplo, un derivado de una pareja de unión, por ejemplo, un
péptido diana biológicamente inactivo o una molécula pequeña.
Por consiguiente, un análisis de escrutinio
ilustrativo de la presente descripción incluye las etapas de poner
en contacto una proteína o uno de sus fragmentos funcionales con un
compuesto de ensayo o quimioteca de compuestos de ensayo y detectar
la formación de complejos. Para los fines de detección, la molécula
puede ser etiquetada con un marcador específico y el compuesto de
ensayo o la quimioteca de compuestos de ensayos etiquetados con un
marcador diferente. La interactuación de un compuesto de ensayo con
una proteína o uno de sus fragmentos se puede detectar luego
determinando el nivel de las dos etiquetas después de una etapa de
incubación y una etapa de lavado. La presencia de los dos marcadores
después de la etapa de lavado es indicativa de una
interactuación.
Una interactuación entre moléculas puede ser
también identificada usando un análisis de interactuación
biomolecular (abreviadamente en lo sucesivo BIA por la expresión
inglesa Biomolecular Interaction Analysis), de Pharmacia Biosensor
AB, en tiempo real que detecta la resonancia del plasmón de
superficie (SPR = Surface Plasmon Resonance) un fenómeno
óptico. La detección depende de cambios en la concentración másica
de macromoléculas en la interface bioespecífica, y no requiere
ningún etiquetado de las entidades que interactúan. En una
realización, un quimioteca de compuestos de ensayo puede ser
inmovilizada sobre una superficie sensora, por ejemplo, que forma
una pared que forma una celda de micro-flujo. Una
solución que contiene la proteína o uno de sus fragmentos
funcionales se hace fluir luego continuamente sobre la superficie
sensora. Un cambio en el ángulo de resonancia como es mostrado en
el registro de la señal, indica que ha ocurrido una interactuación.
Esta técnica está descrita, por ejemplo, en BlAtechnology
Handbook por Pharmacia.
Otro análisis de escrutinio ilustrativo de la
presente descripción incluye las etapas de: (a) formar una mezcla de
reacción que incluye: (i) una proteína IL-1 o de
otro tipo, (ii) un receptor apropiado, y (iii) un compuesto de
ensayo; y (b) detectar una interactuación de la proteína y el
receptor. Un cambio estadísticamente significativo (potenciación o
inhibición) en la interactuación de la proteína y el receptor en la
presencia del compuesto de ensayo, relativo a la interactuación en
la ausencia del compuesto de ensayo, indica un antagonismo potencial
(inhibidor). Los compuestos de este análisis pueden ser puestos en
contacto simultánemente. Alternativamente, una proteína se puede
poner en contacto primeramente con un compuesto de ensayo durante
una cantidad apropiada de tiempo, tras lo cual se añade el receptor
a la mezcla de reacción. La eficacia del compuesto puede
determinarse generando curvas de dosis-respuestas a
partir de los datos obtenidos usando diversas concentraciones del
compuesto de ensayo. Además, se puede realizar un análisis de
control para proporcionar una línea base para la comparación.
La formación de un complejo entre una proteína y
un receptor puede ser detectada por una variedad de técnicas. La
modulación de la formación de complejos puede ser cuantificada
usando, por ejemplo, proteínas etiquetadas detectablemente, tales
como proteínas o receptores radio-etiquetadas,
etiquetadas fluorescentemente o enzimáticamente, por inmunoensayo o
por detección cromatográfica.
Típicamente, será deseable inmovilizar la
proteína o el receptor para facilitar la separación de formas
complejas deformas no complejadas de una o de ambas de las
proteínas, así como acomodar la automatización del ensayo. La unión
de la proteína y el receptor se puede conseguir en cualquier
recipiente adecuado para contener los reaccionantes. Ejemplos
incluyen places de microtitulación, tubos de ensayo, y tubos de
micro-centrífuga. En una realización se puede
proporcionar una proteína de fusión que añade un dominio que permite
que la proteína sea unida a una matriz. Por ejemplo, las proteínas
de fusión de glutation-S-transferasa
pueden ser adsorbidas sobre perlas de
glutation-Sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o
placas de microtitulación derivatizadas con glutatión, que luego se
combinan con el receptor, por ejemplo, un receptor etiquetado con
^{35}S, y el compuesto de ensayo, y la mezcla se incuba en
condiciones que conducen a la formación de complejos, por ejemplo en
condiciones fisiológicas en cuanto a sal y pH, aunque puede ser
deseable, en condiciones ligeramente más estrictas. Tras la
incubación, las perlas se lavan para eliminar la etiqueta no unida,
y la matriz inmovilizada y radio-etiquetada se
determina directamente (por ejemplo, colocando las perlas en un
dispositivo destellante), o en el líquido sobrenadante después de
que los complejos sean subsiguientemente disociados.
Alternativamente, los complejos pueden ser disociados de la matriz,
separados por SDS-PAGE, y el nivel de proteína o de
receptor encontrado en la fracción de perlas cuantificado a partir
del gel usando técnicas electroforéticas estándares, tales como las
descritas en los ejemplos anexos. También están disponibles otras
técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices para uso en el
análisis pertinente. Por ejemplo, la proteína o el receptor pueden
ser inmovilizados utilizando la conjugación de biotina y
estreptavidina. Se pueden obtener animales transgénicos también para
identificar agonistas y antagonistas o para confirmar la seguridad y
eficacia de un agente terapéutico candidato. Los animales
transgénicos de la invención pueden incluir animales no humanos que
contienen una mutación causante de la reestenosis bajo el control de
un promotor endógeno apropiado o bajo el control de un promotor
heterólogo.
Los animales transgénicos pueden ser también
animales que contengan un transgén, tal como un gen informador, bajo
el control de un promotor apropiado o uno de sus fragmentos. Estos
animales son útiles, por ejemplo, para identificar fármacos que
modulan la producción de una proteína IL-1, es
decir, modulando la expresión del gen. Los métodos para obtener
animales transgénicos no humanos son bien conocidos en la técnica.
En realizaciones preferidas, la expresión de la mutación causante de
la reestenosis está restringida a subconjuntos específicos de
células, tejidos o fases del desarrollo que utilizan, por ejemplo,
secuencias de acción cis que controlan la expresión en el modelo
deseado. En la presente invención, dicha expresión en mosaico de una
proteína puede ser esencial para muchas formas de análisis de
linajes y pueden proporcionar adicionalmente medios para determinar
los efectos de, por ejemplo, el nivel de expresión que podría
alterar extremadamente el desarrollo en pequeños parches de tejido
dentro de un embrión por los demás normal. Para este fin, se pueden
usar secuencias reguladoras específicas de tejidos y secuencias
reguladoras condicionales para controlar la expresión de la mutación
en ciertos modelos espaciales. Además, pueden proporcionarse modelos
temporales de expresión, por ejemplo, sistemas de recombinación
condicionales o secuencias reguladoras transcripcionales
procarióticas. Las técnicas genéticas, que permiten que la expresión
de una mutación pueda ser reguladas mediante manipulación genética
específica del sitio in vivo, son conocidas por los expertos
en la técnica.
Los animales transgénicos descritos incluyen
todos dentro de una pluralidad de sus células un transgén de la
mutación causante, que altera el fenotipo de la "célula
hospedante". En una realización ilustrativa, puede usarse el
sistema de recombinasa cre/IoxP del bacteriófago P1 (Lakso
et al., (1992) PNAS, 89:6232-6236;
Orban et al., (1992) PNAS,
89:6861-6865) o el sistema de recombinasa FLP de
Saccharomyces cerevisiae (O'Gorman et al., (1991)
Science, 251:1351-1355; publicación
PCT WO 92/15694) para generar sistemas de recombinación
genética específicos del sitio in vivo. La recombinasa
Cre cataliza la recombinación específica del sitio de una
secuencia diana intercalada localizada entre las secuencias
loxP. Las secuencias loxP son secuencias de repetición
de nucleótidos de 34 pares de bases a las cuales se una la
recombinasa Cre y son requeridas para la recombinación
genética mediada por la recombinasa Cre. La orientación de
las secuencias loxP determina si la secuencia diana
intercalada es escindida o invertida cuando está presente la
recombinasa Cre (Abremski et al., (1984) J. Biol.
Chem. 259:1509-1514); catalizando la escisión de
la secuencia diana cuando las secuencias loxP están
orientadas como repeticiones directas y cataliza la inversión de la
secuencia diana cuando las secuencias loxP están orientadas
como repeticiones inversas.
Por consiguiente, la recombinación genética de
la secuencia diana es dependiente de la expresión de la recombinasa
Cre. La expresión de la recombinasa puede ser regulada por
elementos promotores que están sometidos a control regulador, por
ejemplo, específico de la fase de desarrollo del tejido, inducible o
reprimible por agentes añadidos externamente. Este control regulado
dará como resultado recombinación genética de la secuencia diana
solamente en células en donde la expresión de la recombinasa esté
mediada por el elemento promotor. Por tanto, la activación de la
expresión del transgén de la mutación causante puede ser regulada
mediante el control de la expresión de la recombinasa.
El uso del sistema recombinasa cre/loxP
para regular la expresión de un transgén causante requiere la
construcción de un animal transgénico que contenga los transgenes
que codifican tanto la recombinasa Cre como la proteína
pertinente. Los animales que contienen tanto la recombinasa
Cre como el transgén de la mutación causante de la
reestenosis pueden ser obtenidos a través de la construcción de
animales transgénicos "dobles". Un método conveniente para
obtener dichos animales es aparear dos animales transgénicos que
contenga cada uno un transgén.
Se pueden proporcionar transgenes condicionales
similares usando secuencias de promotores procarióticos que
requieren que sean simultáneamente expresadas proteínas
procarióticas para facilitar la expresión del transgén. En la
patente de EE.UU. Nº 4.833.080 se dan promotores ilustrativos y las
proteínas procarióticas transactivantes correspondientes.
Además, la expresión de los transgenes
condicionales puede ser inducida por métodos similares a la terapia
de genes en donde se suministra al tejido un gen que codifica la
proteína transactivante, por ejemplo una recombinasa o una proteína
procariota, y se hace que se exprese, tal como en un modo
específico del tipo de célula. Mediante este método, el transgén
podría permanecer silencioso en un adulto hasta ser "conectado"
mediante la introducción del transactivador.
En una realización ilustrativa, los "animales
transgénicos no humanos" de la invención se obtienen
introduciendo transgenes en la línea germinal del animal no humano.
Para introducir los transgenes pueden utilizarse células diana
embrionarias en diversas etapas de desarrollo. Se utilizan
diferentes métodos dependiendo de la etapa de desarrollo de la
célula diana embrionaria. La(s) línea(s)
específica(s) de cualquier animal no humano
utilizada(s) para realizar esta invención se
selecciona(n) para conseguir buena salud general, buen
rendimiento de embriones, buena visibilidad pronuclear en el embrión
y buena aptitud reproductiva. Además, el haplotipo es un factor
significativo. Por ejemplo, cuando se quieren obtener ratones
transgénicos, se utilizan con frecuencia razas tales como las líneas
C57BL/6 o FVB (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Las razas
preferidas son aquellas con haplotipos H-2b,
H-2d o H-2q, tales como C57BL/6 o
DBA/1. La(s) línea(s) utilizada(s) para
realizar esta invención puede(n) ser ella(s)
misma(s) transgénica(s) y/o puede(n) estar
desactivada(s) (es decir, obtenida de animales que tienen uno
o más genes parcial o completamente suprimidos).
En una realización, la construcción transgénica
se introduce en un embrión de una sola etapa. El cigoto es la mejor
diana para micro-inyección. En el ratón, el
pronúcleo macho alcanza el tamaño de aproximadamente 20 micrómetros
de diámetro que permite la inyección reproducible de
1-2 pl de solución de DNA. El uso de cigotos como
diana para la transferencia de genes tiene la ventaja principal de
que en la mayoría de los casos el DNA inyectado se incorporará al
gen hospedante antes de la primera escisión (Brinster et al.,
(1985) PNAS, 82:4438-4442). En consecuencia,
todas las células del animal transgénico llevarán el transgén
incorporado. Esto se reflejará también en general en la transmisión
eficiente del transgén a la descendencia del animal fundador,
puesto que el 50% de las células germinales albergará el
transgén.
Normalmente, se incuban embriones fertilizados
en medios adecuados hasta que aparecen los pronúcleos.
Aproximadamente en ese momento, la secuencia nucleotídica que
comprende el transgén se introduce en el pronúcleo hembra o macho
como se describe más adelante. En algunas especies tales como
ratones, se prefiere el pronúcleo macho. Se prefiere mejor, que el
material genético exógeno sea añadido al complemento de DNA macho
del cigoto antes de que sea procesado por el núcleo del óvulo o el
pronúcleo hembra del cigoto. Se sabe que el núcleo del óvulo o
pronúcleo hembra libera moléculas que afectan al complemento de DNA
macho, quizás sustituyendo las protaminas del DNA macho por
histonas, facilitando con ello la combinación de los complementos de
DNA hembra y macho para formar el cigoto diploide. Así, se prefiere
que el material genético exógeno sea añadido al complemento macho de
DNA o cualquier otro complemento de DNA antes de que sea afectado
por el pronúcleo hembra. Por ejemplo, el material genético exógeno
se añade al pronúcleo macho temprano, tan pronto como sea posible
después de la formación del pronúcleo macho, que es cuando los
pronúcleos macho y hembra están bien separados y ambos están
situados próximos a la membrana celular. Alternativamente, el
material genético exógeno podría añadirse al núcleo del esperma
después que haya sido inducido para experimentar descondensación. El
esperma que contiene el material genético exógeno puede añadirse
entonces al óvulo o el esperma descondensado podría añadirse al
óvulo añadiéndose después tan pronto como sea posible las
construcciones transgénicas.
La introducción de la secuencia nucleotídica
transgénica en el embrión puede realizarse por cualquier medio
conocido en la técnica, tal como, por ejemplo,
micro-inyección, electroporación o lipofección.
Después de la introducción de la secuencia nucleotídica transgénica
en el embrión, dicho embrión puede ser incubado in vitro
durante diversos periodos de tiempo o reimplantado en el hospedante
sustituto o ambas técnicas. La incubación in vitro hasta la
madurez está incluida en el alcance de esta invención. Un método
usual es incubar los embriones in vitro durante
aproximadamente 1-7 días, dependiendo de las
especies y a continuación reimplantarlos en el hospedante
sustituto.
Para los fines de esta invención, un cigoto es
esencialmente la formación de una célula diploide que es capaz de
convertirse en un organismo completo. Generalmente, el cigoto
comprenderá un huevo que contiene un núcleo formado, natural o
artificialmente, por la fusión de dos núcleos haploides procedentes
de un gameto o gametos. Por tanto, los núcleos de los gametos deben
ser naturalmente compatibles, es decir, que den como resultado un
cigoto viable capaz de experimentar diferenciación y convertirse en
un organismo funcional. En general, se prefiere un cigoto euploide.
Si se obtiene un cigoto aneuploide, entonces el número de cromosomas
no debe variar en más de uno respecto al número euploide del
organismo del que se originó cada gameto.
Además de consideraciones biológicas similares,
las físicas también gobiernan la cantidad (por ejemplo, volumen) de
material genético exógeno que se puede añadir al núcleo del cigoto o
al material genético que forma una parte del núcleo del cigoto. Si
no se retira material genético, entonces la cantidad de material
genético exógeno que puede añadirse está limitada por la cantidad
que será absorbida sin ser físicamente perjudicial. En general, el
volumen de material genético exógeno insertado no será superior a
aproximadamente 10 picolitros. Los efectos físicos de adición no
deben ser tan grandes que destruyan físicamente la viabilidad del
cigoto. El límite biológico del número y variedad de secuencias de
DNA variará dependiendo del cigoto particular y de las funciones del
material genético exógeno y será fácilmente evidente para los
expertos en la técnica, debido a que el material genético,
incluyendo el material genético exógeno, del cigoto resultante debe
ser biológicamente capaz de iniciar y mantener la diferenciación y
el desarrollo del cigoto en un organismo funcional.
El número de copias de las construcciones
transgénicas que se añade al cigoto es dependiente de la cantidad
total de material genético exógeno añadido y será la cantidad que
permita que tenga lugar la transformación genética. Teóricamente,
solo se requiere una copia; sin embargo, generalmente, se utilizan
numerosas copias, por ejemplo, 1.000-20.000 copias
de la construcción transgénica, con el fin de garantizar que la
copia sea funcional. En cuanto a la presente invención, será con
frecuencia una ventaja tener más de una copia funcional de cada una
de las secuencias de DNA exógenas insertadas para mejorar la
expresión fenotípica de las secuencias de DNA exógeno.
Puede utilizarse cualquier técnica que permita
la adición del material genético exógeno en el material genético
nucleico siempre que no destructivo para la célula, la membrana
nuclear u otras estructuras celulares o genéticas existentes. El
material genético exógeno se inserta preferiblemente en el material
genético nucleico por micro-inyección. La
micro-inyección de células y estructuras celulares
es conocida y usada en la técnica.
La reimplantación se consigue utilizando métodos
estándares. Generalmente, se anestesia el hospedante sustituto y se
insertan los embriones en el oviducto. El número de embriones
implantado en un hospedante particular variará según las especies,
pero será en general comparable al número de descendientes que las
especies producen de forma natural.
Se puede escrutar la descendencia transgénica
del hospedante sustituto para detectar la presencia y/o expresión
del transgén por cualquier método adecuado. La selección se realiza
con frecuencia por análisis de transferencia Southern o
transferencia Northern, utilizando una sonda complementaria con al
menos una porción del transgén. Se puede emplear el análisis de
transferencia Western utilizando un anticuerpo contra la proteína
codificada por el transgén como método alternativo o adicional para
escrutar la presencia del producto transgénico. Típicamente, el DNA
se prepara a partir del tejido de la cola y se analiza por análisis
Southern o por PCR para determinar el transgén. Alternativamente, se
analizan los tejidos o células que se cree que expresan el transgén
a niveles más altos para determinar la presencia y expresión del
transgén utilizando análisis Southern o PCR, aunque pueden usarse
para este análisis cualesquiera tejidos o tipos de células.
Métodos alternativos o adicionales para evaluar
la presencia del transgén incluyen, sin limitación, valoraciones
bioquímicas adecuadas, tales como valoraciones enzimáticas y/o
inmunológicas, razas histológicas para detectar un marcador
particular o actividades enzimáticas, análisis por citometría de
flujo y similares. El análisis de la sangre también puede ser útil
para detectar la presencia del producto transgénico en la sangre,
así como para evaluar el efecto del transgén sobre los niveles de
diversos tipos de células sanguíneas y otros constituyentes de la
sangre.
La progenie de los animales transgénicos se
puede obtener apareando el animal transgénico con una pareja
adecuada, o por fertilización in vitro de huevos y/o esperma
obtenidos del animal transgénico. Cuando se realiza el apareamiento
con una pareja, dicha pareja puede ser o no ser transgénica y/o
inactivada; si es transgénica, puede contener el mismo o diferentes
transgenes o ambos. Alternativamente, la pareja puede ser una línea
parental. Si se usa la fertilización in vitro, el embrión
fertilizado puede implantarse en un hospedante sustituto o incubarse
in vitro, o ambas cosas. Utilizando cualquier método, se
puede evaluar la progenie para determinar la presencia del transgén
aplicando los métodos antes descritos u otros métodos
apropiados.
Los animales transgénicos producidos de acuerdo
con la presente invención incluirán material genético exógeno.
Además, en dichas realizaciones la secuencia se unirá a un elemento
de control de la transcripción, por ejemplo, un promotor, que
permite preferiblemente la expresión del producto transgénico en un
tipo específico de célula.
También se puede utilizar la infección
retroviral para introducir el transgén en un animal no humano. El
embrión no humano en desarrollo se puede cultivar in vitro
hasta la etapa del blastocisto. Durante este tiempo, los blastómeros
pueden ser dianas para la infección retroviral (Jaenich, R. (1976)
PNAS 73:1260-1264). La infección eficaz de
los blastómeros se obtiene por tratamiento enzimático para eliminar
la zona pelúcida (Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds.
(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986). El
sistema vector viral utilizado para introducir el transgén es
típicamente un retrovirus de replicación defectuosa que lleva el
transgén (Jahner et al., (1985) PNAS,
82:6927-6931; Van der Putten et al., (1985)
PNAS, 82:6148-6152). La transfección se
obtiene fácil y eficazmente cultivando los blastómeros sobre una
monocapa de células productoras de virus (Van der Putten,
supra; Stewart et al., (1987) EMBO J.,
6:383-388). Alternativamente, la infección se puede
realizar en una etapa posterior. El virus o las células productoras
de virus se pueden inyectar en el blastocele (Jahner et al.,
(1982) Nature, 298:623-628). La mayoría de
los fundadores serán mosaicos para el transgén puesto que la
incorporación sólo ocurre en un subconjunto de células que formaban
el animal transgénico no humano. Además, el fundador puede contener
diversas inserciones retrovirales del transgén en diferentes
posiciones en el genoma que generalmente se segregarán en la
descendencia. Por otra parte, también es posible introducir los
transgenes en la línea germinal por infección retroviral
intrauterina del embrión en la mitad de la gestación (Jahner et
al., (1982) supra).
Un tercer tipo de célula diana para la
introducción de los transgenes es la célula madre embrionaria. Las
células madre embrionarias se obtienen de embriones antes de la
implantación cultivados in vitro y fusionados con embriones
(Evans et al., (1981) Nature,
292:154-156; Bradley et al., (1984)
Nature, 309:255-258; Gossler et al.,
(1986) PNAS, 83: 9065-9069; y Robertson et
al., (1986) Nature, 322:445-448). Los
transgenes se pueden introducir eficazmente en las células madre por
transfección de del DNA o por traducción mediada por un retrovirus.
Dichas células madre embrionarias transformadas se pueden combinar a
continuación con blastocistos procedentes de un animal no humano.
Las células madre colonizan a continuación el embrión y contribuyen
a la línea germinal del animal quimérico resultante. Veáse una
revisión de Jaenisch, R. (1988) en Science,
240:1468-1474.
La presente invención está además ilustrada por
los siguientes ejemplos que no deben considerarse de ningún modo
como limitativos. El contenido de todas las referencias citadas
(incluyendo las referencias bibliográficas, las patentes concedidas
y las solicitudes de patentes publicadas que se citan a lo largo de
esta solicitud) se incorporan expresamente como referencia. La
práctica de la presente invención empleará, salvo indicación
contraria, métodos convencionales que están incluidos en la técnica.
Dichos métodos están completamente explicados en la bibliografía.
Véase, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual,
(2nd ed., Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds., Cold Spring Harbor
Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N.
Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait
ed., 1984); Patente de EE.UU. Nº 4.683.195; Patente de EE.UU. Nº.
4.683.202; y Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S.
J. Higgins eds., 1984).
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Todos los sujetos humanos fueron donantes de
sangre sanos, de raza blanca, no relacionados entre sí de Sheffield
(n = 112). Los sujetos fueron tipificados en los loci
indicados en la Tabla 1.
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Las secuencias de los cebadores y las etiquetas
fluorescentes utilizadas en la amplificación por PCR de los
marcadores se muestran en la Tabla 3.
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\newpage
Las condiciones de reacción eran las incluidas
en la Tabla 4.
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\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de la PCR 222/223, gz5/gz6,
gaat.p33330 y Y31 se examinaron por electroforesis en gel de agarosa
y el resto de los productos de la PCR se mezclaron de acuerdo con la
intensidad de tinción con bromuro de etidio. 2 g/l de la mezcla se
analizaron en un secuenciador automático ABI 373A y se determinaron
los tamaños de los alelos utilizando el programa informático
Genescan and Genotyper. Los alelos se agruparon globalmente
utilizando un sencillo programa de ordenador y numerados en orden de
tamaño.
Los productos de la PCR -889 se sometieron a
digestión con NcoI y los fragmentos resultantes fueron ordenados por
tamaños por PAGE al 8%. El alelo 1 produce fragmentos de 83 y 16 pb.
El alelo 2 produce un fragmento de 99 pb.
Los productos de la PCR +3954 se sometieron a
digestión con la enzima de restricción Taq I. El alelo 1 produce
fragmentos de 97, 85 y 12 pb y el alelo 2 produce fragmentos de 182
y 12 pb.
Los productos de la PCR -511 se sometieron a
digestión con Aval y Bsu36I y los fragmentos fueron ordenados por
tamaños por PAGE al 8%. El alelo 1 produce fragmentos de 190 y 114
pb cuando se sometió a digestión con Aval y un fragmento de 304 pb
cuando se sometió a digestión con Bsu36I. El alelo 2 produce un
fragmento de 304 pb cuando se sometió a digestión con Aval y
fragmentos de 190 y 114 pb cuando se sometió a digestión con
Bsu36I.
Los productos de la PCR VNTR fueron ordenados
por tamaños por electroforesis sobre gel de agarosa al 2% a 90V
durante 45 minutos. El alelo 1 tiene 4 repeticiones y el producto de
la PCR tiene 412 pb, el alelo 2 tiene 2 repeticiones y el producto
de la PCR tiene 240 pb, el alelo 3 tiene 3 repeticiones y el
producto de la PCR tiene 326 pb, el alelo 4 tiene 4 repeticiones y
el producto de la PCR tiene 498 pb, el alelo 5 tiene 6 repeticiones
y el producto de la PCR tiene 584 pb.
Las distancias intergénicas se determinaron por
estimación basándose en los tamaños de los insertos de los clones
PAC correspondientes a partir de un conjunto de clones contiguos que
abarca la agrupación de genes de IL-1 (Nicklin,
et al., Genomics 19:382-4 (1994)). Las
distancias intragénicas se determinaron a partir de la secuencia de
nucleótidos correspondientes obtenidos de la base de datos
GENBANK.
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Debido a que cuatro de los marcadores estudiados
en la presente invención son multialélicos, se realizó un análisis
preliminar para determinar que combinaciones alélicas entre pares de
loci contribuían al mayor desequilibrio, con el fin de que el
desequilibrio no fuera enmascarado cuando se agruparan los alelos en
sistemas bialélicos. Se utilizó el programa E.H. de Xie y Ott
(Handbook of Human Genetic Linkage, 1994, John Hopkins
University Press, 188-98), incorporado aquí como
referencia, para estimar las frecuencias de haplotipos bajo H_{0}
(sin ligamiento) y H_{1} (permitido el ligamiento alélico). Se
encontró que la estrategia de agrupamiento de alelos elaborada tenía
algunas ventajas sobre los métodos utilizados corrientemente, en que
se detectó el desequilibrio entre casi todas las combinaciones de
marcadores en parejas examinadas y existía buena correlación entre
el desequilibrio y la distancia física.
Más específicamente, se utilizó el programa E.H.
de Xie y Ott para determinar las estimaciones de probabilidad máxima
de desequilibrio (D_{j}) entre cada combinación de alelos en
parejas, donde D_{ij} = h_{ij}-p_{i}q_{j}
son las frecuencias para el alelo i en el locus 1 y para el
alelo j en el locus 2 respectivamente, y h_{ij} es la
frecuencia del haplotipo ij. El programa calculó los valores de
probabilidad máxima para las frecuencias de los haplotipos (y por
consiguiente frecuencias de los alelos) bajo H_{0} (sin
asociación) y las frecuencias de los haplotipos bajo H_{1}
(permitida la asociación alélica). Para marcadores con más de dos
alelos, la estimación por E. H. para las frecuencias de los alelos
está mal relacionada con las frecuencias de los alelos estimadas
directamente en la población de muestra y por consiguiente no dieron
ninguna confianza a las estimaciones de D_{ij} dadas. Por
consiguiente no era necesario agrupar alelos de los marcadores
multialélicos en un sistema bialélico. El análisis de los marcadores
en un formato bialélico tiene las ventajas adicionales de que la
anotación ^D_{ij}, p_{j} y q_{j} se pueden simplificar en ^D,
p y q respectivamente, donde p y q se definen como las frecuencias
de los alelos más raros en ambos loci (de tal forma que sin
pérdida de generalidad p \alpha q \alpha 0,5) y ^D es el
desequilibrio estimado entre dichos alelos.
En un sistema bialélico, la potencia es también
mucho más sencilla de determinar utilizando ecuaciones como las
detalladas por Hill (Hill, Heredity, 33:
229-39 (1974)). Además, el signo de ^D se hace más
informativo, de tal forma que ^D > 0 cuando se asocian los alelos
más raros en cada uno de los dos loci y ^D < 0 cuando el
alelo raro en un locus se asocia con el alelo común en el
otro locus.
Debido a que el método de agrupamiento de alelos
afectaba claramente a la potencia para detectar el desequilibrio
(Zouros, et al., Gent. 85: 543-50 (1977);
Weir, et al., Gent. 88: 633-42 (1976)), se
realizó un análisis preliminar para garantizar que el agrupamiento
no enmascaraba el desequilibrio entre subconjuntos de alelos. En
este análisis, se calculó \delta_{ij} =
(O'_{ij}-E_{ij})//E_{ij} para cada haplotipo,
donde E_{ij} es el número esperado de haplotipos ij suponiendo el
equilibrio (E_{ij} = 2n p_{i}q_{j}, donde n = número de
individuos en el estudio) y O'_{ij} es una estimación básica para
el recuento de haplotipos observados, determinada como sigue. Todos
los genotipos que podrían ser resueltos sin ambigüedad eran un
haplotipo contado. Cada heterocigoto doble
(i_{1}i_{2}/j_{1}j_{2}) podría ser resuelto en dos posibles
conjuntos de haplotipos, [i_{1}J_{1},i_{2}j_{2}] o
[i_{1}J_{2},i_{2}j_{1}]. Utilizando las frecuencias de
haplotipos estimadas a partir del recuento de haplotipos sin
ambigüedad, se calculó la probabilidad de cada conjunto y se usó
como recuento "parcial". De este modo los genotipos ambiguos
eran también haplotipos contados y los recuentos totales (ambiguos
más no ambiguos) constituían las O'_{ij} utilizadas en
\delta_{ij}. Una vez estabilizado, se utilizaron la magnitud y
signo de los \delta_{ij} para determinar que combinación alélica
mostraba mayor desviación de la hipótesis nula de no asociación.
Esta información se utilizó para agrupar alelos en los loci
multialélicos en sistemas bialélicos para poder utilizar eficazmente
el programa E.H.
Con el fin de comparar el grado de desequilibrio
entre diferentes combinaciones de loci en parejas, se calculó
una medida independiente de la frecuencia del desequilibrio \simD,
(la proporción de desequilibrio máximo posible en la dirección
dada), donde \simD = ^D/|D_{max}| (Thompson, et al., Am.
J. Hum. Gent. 42: 113-24 (1988)). La relación
entre p y q es tal que p \alpha q \alpha 0,5, por consiguiente
puede escribirse que -pq \alpha D \alpha
p(1-q), tal que cuando ^D<0, D_{max} =
-pq y cuando ^D>0, D_{max} = p(1-q). La
salida del programa E.H. incluía probabilidades logarítmicas para
los valores máximos del parámetro de probabilidad bajo H_{0} y
H_{1}, y puesto que -2ln
(L_{0}/L_{1})\simX^{2}_{1}, donde L_{0} y L_{1}
son las probabilidades bajo H_{0} y H_{1}, se podrían entonces
determinar los valores de p para cada ensayo.
Las varianzas asintóticas para ^D, bajo H_{0}:
D = 0 y H_{1}, se calcularon utilizando la fórmula definida por
Hill
(Heredity, 33: 229-39 (1974)) para datos genotípicos. Utilizándolas, se pudo calcular la potencia para cada comparación en parejas.
(Heredity, 33: 229-39 (1974)) para datos genotípicos. Utilizándolas, se pudo calcular la potencia para cada comparación en parejas.
Se identificaron haplotipos comunes que
contenían todos 8 loci a partir del análisis preliminar de
\delta_{ij} antes descrito y respaldados por la magnitud y signo
de los desequilibrios una vez que los alelos en los loci
multialélicos fueron agrupados. Para estos loci, fue
identificado en el haplotipo el alelo en el grupo que contribuía en
mayor medida al desequilibrio. Para estimar las frecuencias de
haplotipos en la población, se determinaron las tasas de transporte
de al menos una copia de los alelos pertinentes en la población.
Estos no representan verdaderos haplotipos puesto que la fase es
desconocida. Se utilizaron técnicas de simulación de Monte Carlo
para analizar la desviación significativa de una distribución nula
simulada para estos transportes combinados suponiendo que no hay
asociación.
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Se han identificado diversos marcadores
bialélicos y multialélicos en los genes de IL-1 y
alrededor de ellos. Sin embargo, no han sido identificados hasta
ahora el grado de desequilibrio del ligamiento entre los marcadores
y la prevalencia de haplotipos multimarcadores en la población
general.
La Figura 1 muestra las posiciones relativas de
los 8 loci marcadores utilizados en este estudio. Muestras de
DNA de 212 voluntarios sanos no relacionados fueron genotipificadas
para cada uno de estos marcadores, y las estimaciones resultantes de
frecuencias de alelos se muestran en la Tabla 5.
\vskip1.000000\baselineskip
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Para determinar el desequilibrio del ligamiento
entre combinaciones de loci en parejas, se utilizó el
programa de ordenador de Xie y Ott. Se encontró que este programa
era el más eficaz cuando se utilizaba con sistemas bialélicos, por
consiguiente se agruparon los alelos en los loci
multialélicos del modo más apropiado para cada comparación en
parejas, de forma que no se enmascarara el desequilibrio entre
subconjuntos de alelos.
En la Tabla 6, los desequilibrios entre parejas
de loci se expresan como \simD, la relación entre ^D y su
valor máximo D_{max}, y se muestran junto con la distancia física
aproximada entre los loci en kilopares de bases.
La Tabla 7 muestra la potencia para detectar el
50% de D_{max} para cada combinación de loci y los valores
de p para cada D correspondiente.
Se detectó el desequilibrio del ligamiento
significativo (p_{corr} < 0,05) entre la mayor parte de las
combinaciones de loci, sólo con algunas excepciones. Estas
incluyen las comparaciones entre el marcador VNTR y los marcadores
bialélicos más distantes, +3954 y -889, en los que el desequilibrio
se produce en dirección negativa y en consecuencia se reduce la
potencia (Tabla 7). La correlación entre el desequilibrio \simD y
la distancia física era r = -0,752 (p < 0,0001, unilateral)
(Figura 2).
Con el fin de comparar diferentes métodos de
agrupamiento para los marcadores multialélicos, se calculó \simD
para todas las comparaciones que implicaban 222/223 utilizando dos
estrategias de agrupamiento adicionales. La primera consistía en una
propuesta de "alelo común frente al resto" y la segunda en un
agrupamiento basado en el tamaño del alelo, utilizando la
distribución bimodal de la frecuencia del alelo frente al tamaño que
se observaba para todos los marcadores multialélicos examinados. Los
resultados de este análisis se muestran en la Tabla 8, donde se
comparan los valores de \simD para los tres métodos de
agrupamiento.
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Se puede observar que el desequilibrio no se
detecta en varios casos utilizando estas otras estrategias de
agrupamiento, principalmente 222/223 con -511 y gaat.p33330 en la
propuesta común frente al resto, 222/223 con Y31 tanto en la
propuesta común frente al resto como en la del tamaño de los alelos
y 222/223 con VNTR en la propuesta del tamaño de los alelos.
El examen de qué alelos de los loci
multialélicos contribuyeron en mayor grado al desequilibrio, a
partir de la determinación de \delta_{ij} reveló la existencia
de 2 haplotipos que contenían alelos de los 8 loci. Estos se
confirmaron por examen de las frecuencias de haplotipos y valores
del desequilibrio obtenidos después del agrupamiento. El primer
haplotipo: alelos 44112332 (expresados en orden cromosómico, véase
la Fig. 1) es el más común (transporte de 34/198) y está presente 7
veces más frecuentemente que lo esperado (esperado = 4,5/198) (p
< 0,000001). El segundo haplotipo: alelos 33221461 (transporte de
2/206) estaba presente 4 veces más frecuentemente que lo esperado
(esperado 0,5/206), pero esto no era estadísticamente significativo
(p \sim 0,106). Sin embargo, el examen de un tamaño de muestra
mayor podía ayudar a aumentar el significado estadístico de este
hallazgo.
Los datos presentados indican un grado
significativo de desequilibrio del ligamiento en un tramo de
aproximadamente 400 Kb del cromosoma 2q13. El desequilibrio era
grande tanto para los tres marcadores en el gen de
IL-1\alpha, lo que podría esperarse, pero también
entre alguno de los marcadores más separados (-899/+3954; \simD =
+0,804, distancia física = 50 Kb) (Tabla 6). Sin embargo, \simD
disminuyó considerablemente entre los extremos más alejados del
agrupamiento. Dentro del gen de IL-1\beta, se
obtuvo un valor moderado de \simD (+3954/-511; \simD = -0,617),
aunque este valor no era significativo cuando de corrigió para
comparaciones múltiples, reflejando probablemente la reducción en
potencia cuando el desequilibrio se produce en la dirección negativa
(Thompson, et al., Am. J. Hum. Gent. 42:
113-24 (1988)).
En general, existe una buena correlación entre
la distancia física y el desequilibrio del ligamiento (Figura 2); r
= -0,752. La fiabilidad de r propiamente dicha depende parcialmente
de la fiabilidad de las estimaciones tanto de la distancia física
como de \simD. En distancias cortas, las distancias físicas son
exactas puesto que se determinan a partir de secuencias de DNA
conocidas, mientras que las estimaciones de distancias largas son
menos precisas. La potencia puede ser considerada provisionalmente
como un indicador de la fiabilidad de \simD, puesto que si la
potencia es baja esto indica que el tamaño de la muestra era
demasiado pequeño y con tamaños de muestras pequeños las
estimaciones de \simD pueden no ser fiables.
El éxito de la estrategia elaborada de
agrupamiento se indica en la Tabla 8, que presenta varios casos en
los que el desequilibrio entre los loci particulares es
aparentemente bajo o no detectado cuando se emplean otros métodos de
agrupación usualmente utilizados. Las desventajas de la estrategia
de agrupamiento utilizada en la presente invención son que dicha
estrategia es bastante laboriosa puesto que la información utilizada
para el agrupamiento se basaba en una estimación aproximada de las
frecuencias de haplotipos "observadas" (véase el Ejemplo 2).
Para los marcadores más polimórficos la mayor heterocigosis
significa que la estimación de \delta_{ij} era menos precisa
puesto que había una mayor proporción de haplotipos ambiguos. A
pesar de este inconveniente, se procuró tener en cuenta tanto el
signo como la magnitud de \delta_{ij} y las frecuencias de los
alelos relacionados.
El método pudo simplificarse, en un estudio
suficientemente amplio, sólo considerando los haplotipos no ambiguos
cuando se determina el agrupamiento. La determinación de
\delta_{ij} utiliza todo el conocimiento anterior para el
agrupamiento de los marcadores multialélicos y esta puede ser la
razón por la que se detectó el desequilibrio entre casi todas las
combinaciones de marcadores en parejas.
Los dos haplotipos que contienen los 8
marcadores, así como otros haplotipos más cortos, son de particular
interés puesto que es probable que las combinaciones particulares de
alelos de los genes de IL-1 puedan actuar
conjuntamente para determinar un fenotipo inflamatorio global. La
comprensión de cuales marcadores están en un desequilibrio de
ligamiento fuerte no sólo permite un diseño más racional de los
estudios genéticos sino que también puede proporcionar claves para
comprender el mecanismo de la enfermedad. Por consiguiente, además
de los alelos identificados en la presente memoria, el haplotipo de
IL-1 (44112332) puede contener los siguientes
alelos:
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Se investigó la presencia de los dos haplotipos
descritos en la presente memoria en poblaciones sanas y enfermas
para determinar si los haplotipos estaban asociados a una enfermedad
inflamatoria. En el ejemplo 3 se compararon 81 pacientes con
diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM) y con
nefropatía con 198 sujetos sanos étnicamente similares y 147
pacientes con NIDDM sin nefropatía. Se realizó la genotipificación
como en el ejemplo 1.
El haplotipo de IL-1 (44112332)
era portado por 24 de 79 de los pacientes con NIDDM y nefropatía y
25 de 141 de los pacientes con NIDDM sin nefropatía. Sin embargo, no
se encontró el segundo haplotipo (3322146 1) en los pacientes con
nefropatía (0/8 1). El haplotipo de IL-1 (44112332)
estaba significativamente sobre-representado en el
grupo de pacientes en comparación con el grupo de control sano
(24/79 frente a 34/198; p = 0,015) y en el grupo con NIDDM sin
nefropatía (24/79 frente a 25/141; p = 0,03).
\vskip1.000000\baselineskip
Es un ejemplo profético o predictor. Se
examinaron otras enfermedades como en el Ejemplo 4. Se encontró que
el haplotipo de IL-1 (44112332) está asociado a la
arteriopatía coronaria, osteoporosis, nefropatía en diabetes
mellitus, alopecia areata, enfermedad de Graves, lupus eritematoso
diseminado, esclerosis del liquen y colitis ulcerosa.
Igualmente, el haplotipo de IL-1
(33221461) está asociado a la periodontopatía, artritis crónica
juvenil, psoriasis, diabetes dependiente de la insulina y
retinopatía diabética.
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Es un ejemplo predictor. Se identificaron más
marcadores por análisis de las secuencias y enzimas de restricción
de la región 2q13-14. Se identificó que estos nuevos
marcadores pertenecen a un haplotipo de IL-1 de la
manera descrita en los Ejemplos 2 y 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Es un ejemplo predictor. Un paciente con un
historial familiar de colitis ulcerosa se genotipificó para
determinar la presencia del haplotipo de IL-1
(44112332). La genotipificación se realizó como en el Ejemplo 1 y se
detectó que el paciente llevaba uno o más alelos del haplotipo. El
paciente se trató por consiguiente con antagonistas de
IL-1 para evitar la enfermedad.
Un segundo paciente con un historial familiar de
arteriopatía coronaria se genotipificó para detectar el agrupamiento
de genes IL-1. Se encontró que el paciente llevaba
uno o más alelos del haplotipo de IL-1 (44112332) y
que era homocigótico para el alelo 2 de VNTR. Por tanto, era 5,4
veces más probable que el paciente desarrollara la arteriopatía
coronaria que la población general y se trató exhaustivamente para
evitar la enfermedad.
\vskip1.000000\baselineskip
Es un ejemplo predictor se tipificaron, como en
el Ejemplo 1, 400 cromosomas más y se valoró el desequilibrio de
ligamiento como en el Ejemplo 2. Se encontró que el haplotipo de
IL-1 (33221461) estaba presente aproximadamente 4
veces más frecuentemente que lo que se esperaba
(p-0,05).
De manera similar, se determinó que estaban
presentes los siguientes marcadores en el haplotipo de IL- 1
(44112332) (p << 0,05).
(44112332) (p << 0,05).
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudiaron el gen IL-1B y
otros miembros del agrupamiento de genes IL-1. En
particular, se investigó el IL-1B debido a que
diversas enfermedades están asociadas a los SNP en su región en
dirección 5'. Se identificaron diversos SNP nuevos, como se muestra
en las Tablas 9ª-E. Se utilizaron valoraciones con genes indicadores
para analizar las combinaciones alélicas de los SNP en la región
promotora de IL-1B, algunas de las cuales
representan haplotipos frecuentes en la población. Una construcción
control tiene el tipo natural (designado alelo 1) en todos los
alelos que contienen SNP. La actividad transcripcional diferencial
de alelos individuales en las valoraciones indicadoras se estudió
más a fondo analizando la unión de proteínas nucleares al DNA
alélico en valoraciones del desplazamiento de la
electro-movilidad.
\newpage
Se seleccionaron veinticinco voluntarios sanos
de diferente origen étnico, auto-descrito. Cada
sujeto proporcionó un consentimiento escrito informado y el
protocolo fue aprobado por el Comité de ética de la Universidad de
Sheffield (U.K.). A partir de muestras de sangre se preparó DNA
genómico. El DNA se envió a Genome Therapeutics Corporation
(Waltham, MA, USA) para su secuenciación y cartografiado de los SNP
de alta densidad. La secuencia genómica públicamente disponible en
la región de IL-1 se utilizó para establecer la
secuencia de referencia de esta región para identificación de los
SNP. Además, se escrutó una genoteca del cromosomas artificiales
bacterianos (abreviadamente en lo sucesivo BAC por la expresión
inglesa Bacterial Artificial Chromosomes) comercialmente
disponible para identificar clones de BAC que abarcan la región de
IL-1. Se utilizaron BAC positivos para generar un
pequeña genoteca de insertos de plásmidos con insertos de 3 a 3,5
kb. Se estudiaron cuatro genes (IL-1A,
IL-1B, IL-RN e
IL-1F5) y se identificaron los SNP para cada gen en
las regiones del exón y 5 kb del extremo 5' del gen. La detección de
los SNP se realizó automáticamente utilizando el programa PolyPhred
en un instrumento ABI 3700, seguido de inspección visual de los SNP
recogidos en las Tablas 9A-E.
\vskip1.000000\baselineskip
En el gen IL-1A, la cartografía
reveló un total de 25 SNP. Dos SNP estaban en las regiones del exón
y dieron como resultado cambios no sinónimos. Uno de ellos en el
Exón 5 era conocido y se encontraba en la posición +4845, el otro en
el Exón 4 tenía una frecuencia baja (2%) y los intentos posteriores
para confirmarlos en otra población no mostraron variación. De los
11 SNP en la región promotora, 3 sólo se encontraron en un sujeto
(2%) y los otros 8 estaban también en la base de datos pública del
National Center for Biotechnology Information (NCBI dbSNP). Los 12
SNP restantes eran bien intrónicos (n=9) o se encontraban en la
región no traducida (abreviadamente en lo sucesivo UTR por la
expresión inglesa UnTranslated Region) 3' (n=3) del Exón 7.
Diez de estos se encontraban también en la base de datos pública y
los 2 restantes tenían una frecuencia muy baja
(2-4%) en nuestra población.
Para identificar las variantes en el gen de
IL-1B (IL-1F2) que más probablemente
eran funcionales, los siete exones y las regiones intrónicas
adyacentes, 5 kb en dirección 5' del gen y 2 kb en la región 3', que
comprendían 12 kb, se secuenciaron en un panel de 25 individuos
sanos étnicamente diversos. Se identificaron veinte SNP (Tabla 9B).
Es significativo que en siete exones secuenciados sólo se identificó
un SNP en una región codificadora, el SNP sinónimo bien descrito en
+3954. Existían tres SNP intrónicos, tres SNP en la UTR 3' del exón
7 y un SNP en la UTR 5' de exón 1 identificado. Los 12 SNP restantes
estaban en la región promotora/potenciadora. Dos de los 12 SNP
promotores no se encontraban en las bases de datos públicas y seis
de los 12 tenían frecuencias de alelos menores \leq 4%. Se
confirmó la presencia de 5 SNP previamente indicados en las
posiciones -511 (SNP 14), -31 (SNP15), -1468 (SNP10), +3954 (SNP 25)
y +3877 (SNP 24) en el gen de IL-1B. Estos SNP se
han asociado a estados clínicos. También se identificó la existencia
de otros cinco SNP: -3893 (SNP3); -3737 (SNP4), +5548 (SNP30), +6911
(SNP37) y +7214 (SNP 38).
\vskip1.000000\baselineskip
No se identificaron SNP no sinónimos en los
exones de IL-1B. Fueron identificados SNP que
alteraban la actividad transcripcional y/o la unión al factor de
transcripción. Ajustando todos los SNP al alelo 1 excepto el SNP
individual del foco, se realizó el escrutinio de la actividad del
promotor después de la transfección de las construcciones de SNP en
células THP-1. El análisis por transfección con
construcciones parentales de longitud variable mostró que la
deleción del fragmento distal entre SNP 1 y SNP 10 potenció la
actividad promotora, indicando fuertes represores en esta región.
Una mayor actividad promotora de los plásmidos que contenían esta
región entre SNP 17 y el comienzo del exón también reveló la
existencia de potenciadores en la UTR en 5'. Con el fin de evitar la
interferencia de los represores y potenciadores durante la
identificación de los SNP funcionales individuales en la región
promotora, se analizaron los SNP 2 a 17 en los fondos de plásmidos
con o sin la región UTR en 5' en dirección 3' del SNP 15 (posible
potenciador). También se analizaron los SNP 10 a 17 en los fondos de
plásmidos con y sin fuerte interferencia potencial desde las
regiones promotoras en dirección 5'. Debido a que se encontró que el
clon del BAC inicial contenía el alelo 2 tanto en el SNP 14 como 15,
se escrutaron también los SNP individuales para la actividad
transcripcional en este fondo. Los resultados
aquí recogidos utilizaron el plásmido promotor más largo que contenía secuencias en dirección 5' incluyendo SNP 2.
aquí recogidos utilizaron el plásmido promotor más largo que contenía secuencias en dirección 5' incluyendo SNP 2.
Se anotaron los SNP y se agruparon en forma
esquemática con relación a su posición en el gen, cDNA, y la
proteína como base para desarrollar una clara estrategia para
sondear las diferencias específicas de los alelos en la función
génica.
Se identificaron cinco SNP funcionales; B4, B7,
B10, B14 y B15, demostrando las diferencias alélicas en la
transcripción. Los SNP, B4, B10, B14 y B15 se presentan con elevada
frecuencia (>25%) en la población utilizada para el
descubrimiento de los SNP; mientras que B7 se encontró sólo en el 2%
de los sujetos secuenciados.
\vskip1.000000\baselineskip
El promotor de IL-1B humano se amplificó
por PCR a partir del clon del BAC RP11-67L14
(IL-1B, BAC PAC Resources, Children's Hospital
Oakland Research Institute) utilizando
DNA-polimerasa turbo Pfu turbo (Stratagene,
CA). Se utilizaron dos conjuntos de cebadores para amplificar el
promotor de IL-1B que contenía diferentes extremos 3'. Se
utilizaron los cebadores de IL-1BF1
5'cccACGCGTGAGTGAAAGGAATCCCGTTAGAAGT (SEQ ID NO: 33) e
IL-1BR2 5'cccACGCGTGCCTGTTGTGCCTTGTGCCTCGAAG (SEQ ID
NO: 34) para generar el fragmento promotor de IL-1B,
IL-1BS (+32 a -5326) (S = corto; sin el primer
exón). Se utilizó IL-1BR1
5'cccACGCGTGGCTGCTTCAGACACCTGTGTA (SEQ ID NO: 35) para generar el
fragmento promotor de IL-1BL (+471 a -5326)
(L=largo; que contenía el primer exón y SNP 17 (+45)). Los
fragmentos promotores de IL-1B amplificados se clonaron en el
vector pCRBlunt II-TOPO utilizando el kit de
clonación Zero Blunt TOPO PCR (Invitrogen, CA) y a continuación se
subclonó en el vector pGL3-Basic (Promega, WI) en
dirección a 5' del gen indicador de la luciferasa para generar
construcciones parentales con diferentes longitudes de la región
promotora. La secuenciación de los clones del DNA del BAC reveló que
los SNP en las posiciones 14 y 15 eran los alelos secundarios. Estos
SNP se convirtieron secuencialmente en las secuencias de los alelos
principales por mutagénesis dirigida al sitio de modo que las
construcciones en serie parentales tanto para el plásmido más largo
(que contenía los SNP 2-15 utilizando el sitio KpnI
justo en dirección 5' del SNP 2) como para un plásmido corto (que
contenía la región promotora fuera del sitio BamHI entre los SNP 9 y
10) eran uniformemente el alelo 1 en los 13 SNP (12 en la región
flanqueante en 5' y 1 en el primer exón). La mutagénesis dirigida al
sitio del SNP individual a las secuencias del alelo 2 se realizó con
el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange XL (Stratagene,
CA). Se confirmó el éxito de la mutagénesis del promotor de
IL-1B por análisis de secuenciación y se volvió a clonar en
el vector pGL3-Basic original para evitar posibles
mutaciones introducidas por la PCR en el vector. El DNA utilizado en
la transfección celular fue preparado por el kit EndoFree Plasmid
Maxi (Qiagen, CA) para garantizar la mínima contaminación con
endotoxinas. Los genotipos de las construcciones de SNP de
IL-1B se recogen en la Tabla 6.
\vskip1.000000\baselineskip
La línea de células monocíticas humanas,
THP-1, se obtuvo de American Type Culture Collection
(ATCC, VA). Las células THP-1 se desarrollaron en un
medio RPMI 1640 (ATCC, VA) complementado con suero de bovino fetal
al 10% (Hyclone, UT). Las células se subcultivaron cada dos días y
se mantuvieron a una densidad celular entre 2 x10^{5} a 7 x
10^{5} células/ml. El lipopolisacárido (LPS; de Escherichia
coli 055:B5) y
12-miristato-13-acetato
de forbol (PMA) se obtuvieron de Sigma (MO).
Anti-NF-\kappaB p50
(11-119) y
anti-NF-\kappaB
p65(c-20) fueron adquiridos a Santa Cruz
Biotechnology, Inc. (CA).
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de la transfección, las células
THP-1 se contaron, lavaron y volvieron a poner en
suspensión en medio RPMI natural a 1,5-2 x10^{7}
células/ml. Para la transfección, se mezclaron 200 ng de
construcciones promotoras de pGL-IL1 y 6,25 ng de
phRL-TK (Promega, WI) con 750 \mul de RPMI, 50
\mul de TRIS 1 M a pH 7,4, 100 \mul de
DEAE-dextrano (2mg/ml) en solución salina tamponada
con fosfato y 100 \mul de células THP-1. Las
mezclas se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Las células se
centrifugaron, lavaron, volvieron a poner en suspensión en 0,5 ml de
medio de cultivo y se transfirieron a una placa de cultivo de 24
pocillos. Dieciocho a veinticuatro horas después de la transfección,
se estimularon las células con
12-miristato-13-acetato
de forbol (PMA, 20 ng/ml) y lipopolisacárido (LPS) durante 6 horas.
A continuación se lisaron las células en 100 \mul de tampón de
lisis pasivo (Promega, WI). Se analizó el lisado celular (20\mul)
para determinar las actividades tanto de la luciferasa de luciérnaga
como la de Renilla utilizando el sistema de valoración del
indicador dual-luciferasa (Promega, WI). La
actividad de la luciferasa se midió con un luminómetro 1450
MicroBeta (Perkin Elmer, MA). La actividad promotora se normalizó a
la actividad de la Renilla a partir de
phRL-TK transfectado conjuntamente. Cada
construcción se transfectó y valoró para determinar por triplicado
la actividad promotora y se realizó la transfección para cada
construcción al menos tres veces.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron células THP-1 como
se ha descrito anteriormente y se recolectaron sin tratamiento o se
trataron con 100 ng/ml de LPS y 20 ng/ml de PMA durante varios
periodos de tiempo. Los extractos nucleares se prepararon según
Andrews N.C. y Faller D.V.^{31}. En resumen, las células se
volvieron a poner en suspensión en tampón A frío
(Hepes-KOH 10 mM, pH 7,9 - MgCl_{2} 1,5 mM - KCl
10 mM - DTT 0,5 mM - AEBSF 2 mM) y se incubaron sobre hielo durante
10 minutos. Los sedimentos nucleares se volvieron a poner en
suspensión en tampón C frío (Hepes-KOH 20 mM, pH 7,9
- glicerol al 25% - NaCl 420 mM - MgCl_{2} 1,5 mM -EDTA 0,2 mM
-DTT 0,5 mM - AEBSF 2 mM) durante 30 minutes sobre hielo. Después de
centrifugación durante 2 minutos a 4ºC, se conservaron los extractos
nucleares a -80ºC. Se sintetizaron los oligonucleótidos de cada SNP
(MWG Biotech, High Point, NC) y se purificaron en gel de
poliacrilamida al 10%. Los oligonucleótidos monocatenarios
complementarios se re-asociaron y etiquetaron con
\alpha-^{32}P-dGTP por relleno
con Klenow (exo-). Para la unión proteína-DNA, se
incubaron 7 \mug de extractos nucleares con 5,0 X 10^{4} cpm de
sondas marcadas con ^{32}-P durante 20 minutos a
la temperatura ambiente en un volumen de 20 \mul de tampón de
unión (Hepes-KOH 12 mN, pH 7,9 - MgCl_{2} 1,5 mM -
KCl 60 mM - EDTA 0,2 mM - DTT 0,5 mM - AEBSF 0,4 mM - glicerol al
10%) y 2 \mug de Poly (dI-dC) (Sigma, St. Louis,
MO). Los complejos proteína-DNA se resolvieron sobre
gel de poliacrilamida al 4% y se visualizaron por exposición a
películas de rayos X. Para las valoraciones de competición con
oligonucleótidos fríos, se incubaron extractos nucleares con una
sonda fría durante 10 minutos a la temperatura ambiente antes de la
adición de la sonda etiquetada. En las valoraciones del
superdesplazamiento de anticuerpos, se añadieron 1-2
\mug de anticuerpo después de la unión de los extractos nucleares
a la sonda marcada y se incubó durante 15 minutos a la temperatura
ambiente antes de la carga del gel. Las secuencias de
oligonucleótidos son las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
SNP B4 (-3737)
SNP B4 no mostró diferencias de transcripción
por alelo, sobre los fondos de los demás
\newpage
SNP incluidos en el alelo 1 (Figura 10).
El análisis EMSA muestra diferencias
significativas en la unión de proteínas entre sondas que contienen
el alelo 1 y el alelo 2 de SNP B4. (Figuras 15-17)
Tanto el alelo 1 como el 2 muestran unión constante de una banda de
migración rápida (complejo 3) a las 0, 4, 6 y 24 horas de
estimulación con LPS de las células. El alelo 1 muestra una fuerte
unión de dos complejos de alta movilidad después de la estimulación
con LPS. El complejo 1 consiste en dos bandas próximas entre sí y
está presente al comenzar las 4 horas. A las 24 horas, desaparece la
banda inferior del complejo 1 y se vuelve evidente el complejo 2
(Figura 15) y la competición con la sonda no marcada demostró la
especificidad de la unión (Figura 16). El alelo 2 también se unió al
complejo 2 a las 24 horas pero no había pruebas del complejo 1 en
cualquiera de estos momentos. Debido a la presencia de un elemento
regulador NF-\kappaB próximo a SNP B4, se
utilizaron anticuerpos tanto para subunidades p50 como p65 de
NF-\kappaB en la incubación de la EMSA de las
sondas del alelo-1 y el alelo-2.
Como se muestra en la Figura 17, pistas 7 y 8, el anticuerpo p50es
capaz de superdesplazar ambas bandas del complejo 1 y el anticuerpo
p65 es capaz de super-desplazar sólo la banda
superior del complejo 1. Este resultado indica que
NF-\kappaB estimulado por LPS/PMA se une
preferiblemente al alelo 1 de SNP B4.
\vskip1.000000\baselineskip
SNP B10 (-1468)
En la construcción de fondo con los demás SNP
situados en el alelo 1, A) la presencia del alelo 2 en SNP 1310
produjo una actividad transcripcional ligeramente menor. (Véase la
Figura 11).
El análisis EMSA con sondas que contenían el
alelo-1 y el alelo-2 de SNP10
demostró claras diferencias en los perfiles de unión de las
proteínas (Figura 18-19) con el alelo 2 de SNP B 10
que se unía a un grupo de proteínas de alta movilidad (HMG)
(complejo 1) más fuertemente que el alelo 2. La competición con una
sonda no marcada mostró que esta fuerte preferencia de unión era
específica del alelo (Figura 19).
\vskip1.000000\baselineskip
SNP B14 (-511)
Los resultados del análisis transcripcional para
efectos individuales de diversos alelos sólo en SNP 14 se incluyen
en la Figura 12. En las construcciones de fondo en las que los demás
SNP son el alelo 1 (Fig. 20), SNP B14 se convirtió en el alelo 2
(Fig. 20) y mostró una actividad promotora mayor.
La EMSA con sondas que contenían variantes
alélicas de SNP 14 mostró 2 complejos distintos formados con esta
sonda pero sin diferencias alélicas en la movilidad de complejos
proteinicos. (Figura 20). Sin embargo, la actividad promotora
potenciada por el alelo 2 de SNP 14 indica que puede haber
diferencias sutiles en las composiciones de las proteínas entre los
dos complejos unidos a elementos reguladores que rodean el alelo 1 y
2 del SNP 14 lo que conduce al impacto funcional en la actividad
transcripcional.
\vskip1.000000\baselineskip
SNP 15 (-31)
El efecto de variación alélica sólo en SNP B15
en la actividad transcripcional está también incluido en las Figuras
21-22. Con la conversión de SNP B15 en el alelo 2
(Figura 21), se produjo una reducción significativa de la actividad
promotora en comparación con la construcción base (Figura 21).
El perfil proteínico en EMSA de SNP B15 es
notablemente diferente para las sondas del alelo-1
(T) que para las del alelo-2 (C) (Figura 22). Como
se muestra en la Figura 22, se formaron dos bandas intensas con la
sonda del alelo 1 mientras que se formaron 3 bandas distintas con el
alelo 2. Se realizó una valoración de competición en frío para
determinar la especificidad de la unión de las proteínas a estas
sondas alélicas (Figura 22) y se indicó que la unión proteínica del
complejo 1 es muy específica para el alelo 2, mientras que los
complejos II y III tienen mayor afinidad para el alelo 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Una indicación de la gravedad de la
periodontitis en un sujeto es la profundidad de las cavidades
(abreviadamente PD por la expresión ingles pocket depth). Se
clasifica periodontitis grave en un sujeto que tiene una PD>2 en
una o más cavidades en las encías. La PD se midió en sujetos que
tenían diversos genotipos de IL-1B como se muestra
en la Tabla 10A (por ejemplo, un sujeto con el genotipo BP1 tiene
dos alelos del alelo 1 de IL-1B (-511), dos alelos
del alelo 1 de IL-1B (-1468) y dos alelos del alelo
2 de IL-1B (-3737). La Tabla 10B muestra la
distribución en porcentaje de los haplotipos de
IL-1B en sujetos con grados variables de
periodontitis, medidos por el número de cavidades en las encías por
sujeto (menos de 2 cavidades, entre 2 y 4 cavidades, entre 4 y 10
cavidades, más de 10 cavidades).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Como se muestra en la Tabla 10B y en la Figura
23, los sujetos que tienen los genotipos BP1, BP3 o BP4 tienen mayor
probabilidad de desarrollar periodontitis grave, mientras que los
sujetos que tienen el genotipo BP2 tienen menor probabilidad de
desarrollar periodontitis grave.
\vskip1.000000\baselineskip
Anteriormente, en múltiples estudios se
asociaron en hombres de raza blanca las variaciones específicas de
los genes de IL-1 (IL-1A(+4845),
IL-1A(-889) e IL-1B(+3954)) con el
aumento de la gravedad de la periodontitis. Estos SNP de
IL-1 son de baja prevalencia en las poblaciones
asiáticas que han sido estudiadas, que incluyen japoneses, coreanos
y chinos. Puesto que la prevalencia de un polimorfismo y su
penetración con relación a la expresión de la enfermedad afecta el
tamaño de la muestra necesario para identificar la asociación entre
el alelo de interés y la expresión de la enfermedad, la mayor parte
de los estudios anteriores en poblaciones asiáticas han sido
demasiado pequeños para evaluar fielmente si
IL-1A(+4845) e IL-1B(+3954) están
asociados a la periodontopatía. Este ejemplo detalla las variaciones
específicas de los genes de IL-1 que predicen la
periodontitis más grave en adultos japoneses. Esto se realizó
analizando los haplotipos en las agrupaciones de genes de
IL-1 para determinar las variaciones genéticas
asociadas a la varianza clínica en la periodontitis, utilizando la
cartografía de SNP de elevada densidad de todos los exones y
regiones reguladoras de los genes para IL-1\alpha
(IL-1A), IL-1\beta
(IL-1B) y el gen para el antagonista receptor
IL-1 (IL-1RN), que abarca la
agrupación de nueve genes de IL-1 en el cromosoma
2q13-14.
Existen varios haplotipos predominantes de
IL-1 que se definen por seis SNP. De los 64
haplotipos posibles, 23 haplotipos constituyen más del 98% de los
haplotipos en la raza blanca y afroamericana. Los mismos haplotipos
constituyen más del 97% de los haplotipos observados en pacientes
japoneses. (Véase la Tabla 11A). Los haplotipos que contienen el
alelo 2 en IL-1RN(+2018) sólo representan el 3,7% de
los haplotipos, lo que produciría un índice esperado de individuos
homocigóticos en dicho locus de aproximadamente 1/1000
sujetos. El alelo 2 en IL-1A(+4845) y en
IL-1B(+3954) era también tan poco frecuente que sólo
se esperaría que aproximadamente 1/100 individuos fueran
homocigóticos en dicho locus. Los haplotipos se estimaron
utilizando el programa haplo.score versión 1.0 (Schaid et
al, 2002). Este programa informático aplica una versión del
algoritmo EM (Excoffier and Slatkin, 1995) para valorar
correctamente la ambigüedad de fase.
Se ha identificado tres SNP en el promotor de
IL-1B que son funcionales y altamente prevalentes en
sujetos japoneses. Estos SNP incluyen IL-1B (-511),
IL-1B (-1468) e IL-1B (-3737). La
Figura 24 muestra la distribución de las frecuencias relativas en
los haplotipos de los alelos recogidos en la Tabla 11A en sujetos de
raza blanca y japoneses. Los autores de la presente invención han
determinado que los haplotipos predominantes, basados en estos 3
SNP, muestran diferencias significativas en los niveles de
IL-1\beta en el fluido gingival (GCF). La Figura
25 demuestra que los sujetos de raza blanca que tienen el genotipo
H1 o H3 presentan mayor inflamación, medida en comparación con los
demás haplotipos utilizando una estadística de puntuación. Una
estadística de puntuación es una estadística utilizada para evaluar
el significado estadístico de estimaciones paramétricas calculadas
por métodos de probabilidad máxima. También se denomina algunas
veces estadística de puntuación eficaz. El ensayo se basa en
el comportamiento de la función de probabilidad logarítmica en el
punto en el que la estimación paramétrica respectiva es igual a 0,0
(cero); específicamente, se usa la derivada (pendiente) de la
función de probabilidad logarítmica evaluada en el valor de
hipótesis nula del parámetro (parámetro = 0,0).
En sujetos de etnia japonesa, se ha determinado
que la predisposición a la periodontopatía y la gravedad de dicha
enfermedad están afectadas por el haplotipo de
IL-1.
Un método para medir la periodontopatía utiliza
el ensayo generalizado de hemorragia por sondamiento (en inglés
Bleeding on Probing (BOP). Como se muestra en la Figura 26,
los sujetos japoneses que tienen un genotipo que es homocigótico en
el alelo 2 de IL-1B (-511), homocigótico en el alelo
2 de IL-1B (-1468) y homocigótico en el alelo 1 de
IL-1B (-373) tienen menor riesgo de periodontitis
medido por el ensayo generalizado de BOP. Esta disminución del
riesgo se observa en dos aumentos diferentes en porcentaje en las
superficies cubiertas de placa.
Otro método para medir la periodontopatía que
permite obtener la asociación entre haplotipos específicos de
IL-1 y la gravedad de la periodontitis implica la
medida de la profundidad del sondeo y el nivel de acoplamiento de la
sonda de un sujeto. Estas medidas se realizan a individuos, cuyos
haplotipos están identificados, y se determinan el porcentaje medio
de los sitios medidos que tengan una profundidad de sondeo mayor que
4 mm o el nivel de acoplamiento de la sonda mayor o igual a 4 mm.
Como se muestra en la Figura 27, los sujetos japoneses que tienen un
haplotipo H1, H3 o H4 de IL-1 presentan una mayor
gravedad de la periodontitis en comparación con sujetos que tienen
un haplotipo H2, medido por estos métodos.
Claims (3)
1. Un método para predecir la sensibilidad de un
sujeto humano a la periodontopatía, que comprende la etapa de
identificar en una muestra de DNA genómico del sujeto un modelo
alélico que comprende una de las siguientes series de alelos de
IL-1B:
- (1)
- alelo 1 (-511), alelo 1 (-1468) y alelo 2 (-3737);
- (2)
- alelo 2 (-511), alelo 2 (-1468) y alelo 1 (-3737);
- (3)
- alelo 1 (-511), alelo 1 (-1468) y alelo 1 (-3737); o
- (4)
- alelo 2 (-511), alelo 1 (-1468) y alelo 1 (-3737),
en donde la presencia de uno cualquiera de los
modelos alélicos 1, 3 o 4 indica que dicho sujeto tiene mayor
sensibilidad a la periodontopatía y en donde la presencia del modelo
alélico 2 indica que el sujeto tiene menor sensibilidad a la
periodontopatía.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El método de la reivindicación 1, en donde el
sujeto es homocigótico para cada uno de los alelos en el modelo
alélico.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en
donde dicho sujeto es de etnia asiática.
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|---|---|---|---|
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| AT (1) | ATE490341T1 (es) |
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