KR100924468B1 - Ｉｌ-1 유전자 집단 및 관련된 염증성 다형성과 일배체형 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 IL-1 유전자좌 내에서 발견되는 신규한 IL-1 유사 유전자의 구조 및 조직을 포함하는 IL-1 유전자 집단으로부터의 유전자 정보의 확인 및 사용과 관련한 방법 및 조성물과, 이 유전자 내의 다형성 및 관련 일배체형을 제공한다. 그에 의해 본 발명은 IL-1 관련 표현형 (예를 들어 염증성 질환 위험성의 증가 또는 감소)의 예견 및 IL-1 일배체형 관련 염증성 표현형의 치료에 있어서 이전에 동정된 IL-1α, IL-1β 및 IL-1RN 유전자를 포함하는 IL-1 유전자좌로부터 입수가능한 유용한 유전자 정보 레퍼토리를 확장시킨다.
IL-1 유전자, 염증성 다형성, 일배체형

Description

ＩＬ-1 유전자 집단 및 관련된 염증성 다형성과 일배체형{THE IL-1 GENE CLUSTER AND ASSOCIATED INFLAMMATORY POLYMORPHISMS AND HAPLOTYPES}
IL-1은 일차적인 염증성 사이토카인이며 급성 및 만성의 병리학적인 염증성 질환 둘 모두의 매개에 연루되어 있다. 기능적으로 유사한 두 분자인 IL-1α 및 IL-1β는 개별적인 유전자 (각각 IL1A 및 IL1B)에 의해 코딩된다. 상기 패밀리의 세번째 유전자 (IL1RN)는 IL-1α 및 IL-1β와 결합하는 수용체에 대하여 경쟁하는 항염증성의 비-시그널링 분자인 IL-1 수용체 길항제 (IL-1ra)를 코딩한다. IL-1α, IL-1β 및 IL-1ra를 쌍으로 비교해 보면 각각의 경우에 있어서 동일성이 <25%이지만, IL-1β 및 IL-1ra의 X-선 결정법 (crystallography)에 의하면 밀접하게 유사한 폴드가 나타난다 (문헌 [Priestle et al. (1989) PNAS USA 86: 9667-967]); 문헌 [Vigers et al. (1994) Biol Chem 269: 12874-12879]). 구조적으로는, 상기 단백질은 베타-트레포일 (trefoil)로 알려진 12개의 패킹된 (packed) β-시트의 단일 도메인으로 구성되어 있다. 대부분의 패킹 상호 작용은 주쇄 원자가 그 특징이 되기 때문에 다소의 불변성 아미노산이 IL-1 폴드의 생성에 필요한 잔기이며 따라서 상기 유전자의 코딩 서열의 광범한 다양화가 가능해졌다고 주장되어 왔다. 매우 유사한 폴드가 임의의 검출가능한 서열 유사성 없이 대두 트립신 억제제에서 성취되었다. 모든 세가지 단백질은 제I형 IL-1 수용체 (IL-1R1)인 IL-1에 대한 단지 기능적인 시그널링 수용체에 결합한다 (문헌 [Sims et al. (1993) PNAS USA 90: 6155-6159] 참조).
IL-1은 주로 자극된 단핵세포, 대식세포 및 각질세포의 생성물로서 특징화되었지만, 평활근 및 내피 세포로부터 방출되는 IL-1에 있어서 중요한 역할이 제안되었다 (문헌 [Ross (1993) Nature 362: 801-9]에 개설됨). IL-1R1을 통한 시그널링은 이 수용체의 세포질 To1l-유사 도메인을 포함한다 (문헌 [Heguy et al. (1992) J Biol Chem 267: 2605-2609]). 기능적인 IL-1 수용체가 조직에 폭넓게 분포되어 있다. 현재로는 IL-1ra는 IL-1R1과 두번째 수용체 성분인 IL-1 수용체 부속 (accessory) 단백질 IL-1RacP 사이의 상호 작용을 활성화시키지 못한다는 점에서 IL-1과는 다르다고 생각되고 있다. 상기는 유사한 도메인 구조를 가지는 IL-1R1의 먼 친척이지만 IL-1에 대한 내재적인 친화성은 전혀 가지지 않는 막통과 (transmembrane) 단백질이다 (문헌 [Greenfeder et al. (1995) J Biol Chem 270: 13757-13756]; 문헌 [Wesche et al., (1997) J Biol Chem 272: 7727-7731]).
IL-1 유전자 집단은 2번 염색체의 긴 팔(arm) 상에 존재하며 (2q13) 430 Kb의 영역 내에서 적어도 IL-1α (IL-1A), IL-1β (IL-1B), 및 IL-1 수용체 길항제 (IL-1RN)의 유전자를 포함한다 (문헌 [Nicklin, et al. (1994) Genomics, 19: 382-4]). 말단 유전자 IL1A 및 IL1RN의 최대 분리물은 인간 게놈 DNA의 제한 효소 절단물의 순간 충격 젤 전기 영동법에 의하면 430 kb인 것으로 추정되었으며 (문헌 [Nicklin, et al. (1994) Genomics, 19: 382-4]), 세 유전자의 배향은 자연적 클론의 서열 분석으로 결정되었다 (문헌 [Nothwang et al. (1997) Genomics 41: 370- 378]). IL-18은 IL-1 구조 패밀리의 네번째 구성원인 것으로 나타났다 (문헌 [Bazan et al. (1996) Nature 379: 591]). 이것도 전염증성 (proinflammatory) 사이토카인이기는 하지만, 그의 활성은 IL1의 활성에 필적한다. IL-18은 IL-1R1보다는 관련 수용체 (IL-18R1)에 결합하는데 (문헌 [Torigoe et al. (1997) J Biol Chem 272: 25737-25742]), 이는 IL-1RacP보다는 관련 부속 단백질인 IL-18RacP를 고용한다 (문헌 [Born et al. (1998)]). IL-18 유전자인 IL18은 11번 염색체 상에 존재한다 (문헌 [Nolan et al., (1998) Genomics 51: 161-3]).
IL-1 유사 요소를 포함하는 어떠한 다른 단백질이 시판되는 대중적인 cDNA 데이터베이스로부터 동정되었다 (문헌 [Mulero et al. (1999) Biochem Biophys Res Commun 5: 702-6]; 문헌 [Smith et al. (2000) J Biol Chem 275: 1169-1175]; 문헌 [Kumar et al., (2000) J Biol Chem 275: 10308-10314]; 문헌 [Busfield et al. (2000) Genomics 66: 213-216]; 문헌 [Lin et al. (2001) J Biol Chem 276: 20597-20602]). 하나의 IL-1 유사 유전자가 IL-1 집단이 혼입된 YAC 클론과의 혼성화에 의한 cDNA 선발 후에 또한 동정되었다 (문헌 [Barton et al., (2000) Eur J Immunol 30: 3299-3308]). 상기 IL-1 유전자 및 그의 생성물 (즉, 인터류킨-1-유사 단백질 1 유전자/생성물)이 본 발명자들의 계류중인 미국 특허 출원 제09/617720호에 상세하게 기술되어 있는데, 상기 특허 출원의 내용은 본 명세서에 참고로 인용된다. 최근에 6개의 새로운 유전자에 대한 일정한 명명 시스템이 상기 유전자의 발견에 연루되어 있는 연구자에 의해 합의되었으며 (문헌 [Sims et al. (2001) Trends Immunol 22: 536-537] 참조) 본 명세서에서 사용될 것이다. 이전에 공지된 4개의 IL-1 패밀리 구성원을 인지하여, 새로운 인간 유전자가 IL1F5, IL1F6, IL1F7, IL1F8 (즉, IL-1L1), IL1F9 및 IL1F10으로 명명되었다. 단백질 생성물은 (IL1F7 유전자의 두번째로 기술된 잠정적인 단백질 생성물을 의미하는) IL-1F7b의 스타일로 명명된다. 상기 유전자들은 일반적으로 인간과 생쥐 사이에서 보존되어 있는 것으로 나타났다.
본 발명자들은 이전에 내용 전체가 본 명세서에 참고로 인용된 미국 특허 제6,268,142호에서 SNP를 포함하여 IL-1 염증성 일배체형과 관련된 특정 다형성 및 염증성 질환의 진단 및 치료에서의 그의 용도를 기술하였다. 본 발명자들은 이전에 내용 전체가 본 명세서에 인용된 미국 특허 출원 제09/617720호 및 동 제09/969,215호 [공개 번호: US 2002/0182612]에서 IL-1B 대립유전자 2 (+6912) 다형성에 기초한 치료제 및 진단제를 기술하였다.
또한, 내용 전체가 또한 본 명세서에 인용된 미국 특허 출원 제010/300011호 (또한 PCT US 02/37222)에서 본 발명자들은 IL-1B 유전자의 상류 영역의 것을 포함하여 염증성 및 감염성 질환에 대한 민감성 및 전사에 영향을 주는 기능적 다형성을 기술 및 특징화하였다. 또한 본 발명자들은 이전에 내용 전체가 본 명세서에 인용된 미국 특허 출원 제09/617720호에서 IL-1-유사 유전자 및 그의 생성물 (즉, 인터류킨-1-유사 단백질 1 유전자/생성물, 즉, IL-1F8)을 기술하였다. 본 발명자들은 본 발명에서 전체 IL-1 유전자좌가 염증성 질환에 중심적으로 연루되어 있다는 것을 인지하여 상세한 IL-1 유전자좌 다형성, 연관성, 질환 관련성 및 인간 IL-1 유전자좌에서의 유전자 아이덴티티 (identity)를 검출하기 위한 조성물을 지지하 는 기능적 분석과 염증성 질환의 예견, 진단 및 치료에 있어서의 그의 용도를 또한 제공한다.
발명의 개요
일반적으로 본 발명은 검출을 위한 조성물 및 방법과 IL-1 일배체형 (예를 들어 염증성 질환 또는 병의 발병의 위험성 증가 또는 위험성 감소와 관련된 IL-1 일배체형)을 제공한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, IL-1 일배체형은 질환 또는 병의 발병의 위험성 증가 또는 위험성 감소와 관련된 것이지만, 본 발명은 질환 또는 병의 발병에 있어서의 위험성 증가와도 관련이 없고 위험성 감소와도 관련이 없는 IL-1 일배체형 (예를 들어 "정상" 또는 "야생형" 유전형)의 검출을 위한 재료 및 방법을 반드시 포함한다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명은 염증성 질환 또는 장애와 관련된 IL-1 대립유전자 또는 대립유전자-예를 들어 도 1, 2A, 2B, 7A 또는 7B 중 임의의 도면에 도시된 하나 이상의 연관된 IL-1 대립유전자와 연관 불균형 상태로 존재하는 임의의 IL-1 대립유전자의 검출에 의해 대상이 IL-1 염증성 일배체형과 관련된 질환 또는 병을 가지는지 또는 상기 질환 또는 병이 쉽게 발병될 것인지를 결정하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 연관된 대립유전자는 적어도 0.5, 바람직하게는 적어도 0.6, 0.7, 0.8 또는 0.9의 염증 관련 대립유전자와의 연관 불균형값 (D')을 가진다.
다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 염증성 질환 또는 장애의 위험성 감소 와 관련된 IL-1 대립유전자 또는 "보호" 대립유전자-예를 들어 도 1, 2A, 2B, 7A 또는 7B 중 임의의 도면에 도시된 하나 이상의 연관된 IL-1 대립유전자와 연관 불균형 상태로 존재하는 임의의 IL-1 대립유전자의 검출에 의해 대상이 IL-1 염증성 일배체형과 관련된 질환 또는 병의 발병에 있어서 감소된 위험성을 가지는지를 결정하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 연관된 대립유전자는 적어도 0.5, 바람직하게는 적어도 0.6, 0.7, 0.8 또는 0.9의 "보호 대립유전자"와의 연관 불균형값 (D')을 가진다. 특정의 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명은 새롭게 동정된 SNP에 기초하여 4가지의 새로운 IL-1 일배체형 (hap1-4)을 포함한다. 하나의 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 발명은 IL-1A(+4845) 대립유전자 2 (IL-1A(-889) 대립유전자 2와 100%의 LD); IL1B(+3954) 대립유전자 2; 및 IL-1B(-511) 대립유전자 1을 포함하는 전염증성 IL-1 (전술한 일배체형: 3322146121과 일관됨)인 hap1 (IL-1 일배체형 패턴 1)을 제공한다. 다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 도 3A 및 3B에 도시되어 있는 다수의 hap1 일배체형 패턴의 두가지 이상의 대립유전자를 포함하는 hap1 일배체형을 제공한다. 바람직한 실시 형태에 있어서 hap 1 일배체형은 도 3A 및 B에 나타내어져 있는 IL-1 TTC/2-2-1 패턴을 포함한다.
다른 실시 형태에 있어서 본 발명은 전술한 일배체형: 4411233212와 일관되며 IL-1 A(+4845) 대립유전자 1 (IL-1A(-889) 대립유전자 1과 100% LD); IL-1B(+3954) 대립유전자 IL-1B(-511) 대립유전자 2를 포함하는 IL-1 일배체형, hap2를 제공한다. 다른 실시 형태에 있어서 본 발명은 도 4A 및 4B에 도시되어 있는 다수의 hap 2 일배체형 패턴의 두가지 이상의 대립유전자를 포함하는 hap 2 일배체형을 제공한다. 바람직한 실시 형태에 있어서 hap 2 일배체형은 도 4A 및 4B에 나타내어져 있는 IL-1 GCT/1-1-2 패턴을 포함한다.
또다른 실시 형태에 있어서 본 발명은 전술한 ("야생형") 대립유전자 패턴 **111***과 일관되며 IL-1 A(+4845) 대립유전자 1 (IL-1A(-889) 대립유전자 1과 100% LD); IL1B(+3954) 대립유전자 1; 및 IL-1B(-511) 대립유전자 1을 포함하는 IL-1 일배체형, hap 3을 제공한다. 바람직한 실시 형태에 있어서 본 발명은 도 5A 및 5B에 도시되어 있는 다수의 hap 3 일배체형 패턴의 두가지 이상의 대립유전자를 포함하는 hap 3 일배체형을 제공한다. 바람직한 실시 형태에 있어서 hap 3 일배체형은 도 5A 및 5B에 나타내어져 있는 IL-1 hap3 GCC/1-1-1 패턴을 포함한다.
또다른 실시 형태에 있어서 본 발명은 IL-1B(+3954) 대립유전자; IL1B(-511) 대립유전자 1; 및 IL-1 B(-3737) 대립유전자 1을 포함하는 새로운 IL-1 일배체형 패턴 (hap4)과 일관되는 새롭게 동정된 SNP를 제공한다. 바람직한 실시 형태에 있어서 본 발명은 도 6A 및 6B에 도시되어 있는 다수의 hap 4 일배체형 패턴의 두가지 이상의 대립유전자를 포함하는 hap4 일배체형을 제공한다. 바람직한 실시 형태에 있어서 hap3 일배체형은 도 6A 및 6B에 나타내어져 있는 IL-1 hap4 CCC/1-1-1 패턴을 포함한다.
또한 본 발명의 목적은 IL-1 유전자 집단, 특히 IL-1 집단의 신규한 IL-1-유사 유전자로부터의 서열 정보의 이용과 관련한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다. 이러한 서열 정보를 유전자 데이터와 통합시키는 것이 다른 목적이다. 따라서 본 발명은 유전자의 구조와 조직 및 관련된 다형성에 대한 상세한 정보를 제공하는 IL-1 집단의 지도를 제공한다. 본 발명의 또다른 목적은 IL-1 유전자 집단과 관련된 질환 또는 장애를 예견 및 진단하는 방법을 제공하는 것이다. 또한 도 4에 도시되어 있는 IL-1 다형성의 확인을 위한 하나 이상의 핵산을 포함하는 다수의 인간 IL-1 유전자 집단 서열 확인체를 제공하는 것이 목표이다.
발명의 상세한 설명
4.1. 일반론
사이토카인 인터류킨 (IL)-1 유전자의 여러 상동체가 이전에 동정된 IL-1 유전자 집단에 지도화되지만, 상기 영역의 대중적인 서열 분석은 비교적 느린 편이었다. 따라서 본 발명자들은 이 전체 유전자 집단의 콘티그 (contig) 를 작제하고 이에 주석을 달았다. 또한, 본 유전자 집단 (IL-1A, IL1B 및 IL-RN에서의 SNP 포함) 및 관련 IL-1 일배체형에서의 신규한 인간 다형성 유전자좌를 도 1-11에 요약된 바와 같이 위치화 및 동정하였다. 본 발명의 특징은 수반되는 본 발명의 상세한 설명 및 실시예에서 더 입증된다.
4.2. 정의
편의를 위하여, 본 명세서, 실시예 및 첨부된 청구의 범위에서 이용되는 특정 용어 및 구의 의미가 이하에 제공되어 있다.
"대립유전자"라는 용어는 상이한 다형성 영역에서 발견되는 상이한 서열 변이체를 나타낸다. 예를 들어 IL-1RN(VNTR)은 5가지 이상의 상이한 대립유전자를 가진다. 서열 변이체는 제한됨이 없이 삽입, 결실, 또는 치환을 포함하여 단일 또 는 다중 염기 변화일 수 있거나 다양한 갯수의 서열 반복일 수 있다.
"대립유전자 패턴"이라는 용어는 하나 이상의 다형성 영역에서의 대립유전자(들)의 아이덴티티를 나타낸다. 예를 들어 대립유전자 패턴은 IL-1RN (VNTR) 대립유전자 1에 있어서 IL-1RN 유전자좌의 VNTR에서 하나 이상의 IL-1RN 대립유전자 1의 하나 이상의 카피 (copy)를 가지는 대립유전자 패턴인 다형성 부위에서의 단일 대립유전자로 구성될 수 있다. 대안적으로는, 대립유전자 패턴은 단일 다형성 부위에서의 동종성 또는 이종성 상태로 구성될 수 있다. 예를 들어 IL1-RN (VNTR) 대립유전자 2,2는 동종성 IL-RN (VNTR) 대립유전자 2 상태에 해당하는 IL1-RN의 VNTR 마커에 2개의 카피의 두번째 대립유전자가 존재하는 대립유전자 패턴이다. 대안적으로는, 대립유전자 패턴은 하나보다 많은 다형성 부위에서의 대립유전자의 아이덴티티로 구성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "항체"라는 용어는 IL-1 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 전체 항체 또는 그의 결합 단편을 포함하는 결합 제제를 나타내려는 것이다. 항체는 통상의 기술을 사용하여 단편화될 수 있으며 전체 항체에 있어서 상기한 바와 동일한 방식으로 이 단편에 있어서의 유용성을 스크리닝할 수 있다. 예를 들어 F(ab).sub.2 단편은 펩신을 이용한 항체의 처리에 의해 생성될 수 있다. 생성된 F(ab).sub.2 단편은 다이설파이드 가교가 감소되도록 처리하여 Fab 단편을 생성할 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 본 항체의 하나 이상의 CDR 영역에 의해 부여되는 IL-1B 폴리펩티드에 대한 친화성을 가지는 2특이성 (bispecific)이며, 단일쇄이고 인간화된 키메라 분자를 포함하려는 것이다.
본 발명의 목적에 있어서 서로 바꾸어서 사용되는 "생물학적 활성" 또는 "생활성" 또는 "활성" 또는 "생물학적 기능"은 IL-1 폴리펩티드 (그의 천연 또는 변성 구조), 또는 그의 임의의 서브서열 (subsequence)에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 수행되는 이펙터 (effector) 또는 항원 기능을 의미한다. 생물학적 활성은 표적 펩티드, 예를 들어 IL-1 수용체에 결합하는 것을 포함한다. IL-1 생활성은 IL-1 폴리펩티드에 직접 영향을 줌으로써 조정될 수 있다. 대안적으로는, IL-1 생활성은 IL-1 유전자의 발현의 조정과 같은 IL-1 폴리펩티드의 수준의 조정에 의해 조정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "생활성 IL-1 폴리펩티드 단편"이라는 용어는 전장 IL-1 폴리펩티드의 단편을 나타내는데, 이 단편은 야생형 IL-1 폴리펩티드의 활성을 특이적으로 모방하거나 길항한다. 이 생활성 단편은 바람직하게는 인터류킨 수용체와 상호 작용할 수 있는 단편이다.
IL-1과 같은 폴리펩티드의 활성에 대하여 사용되는 "이상 활성"이라는 용어는 야생형 또는 천연 폴리펩티드의 활성과 다르거나 건강한 대상에 있어서의 이 폴리펩티드의 활성과 다른 활성을 나타낸다. 폴리펩티드의 활성은 그의 천연 대응체의 활성보다 더 강력하기 때문에 이상할 수 있다. 대안적으로는, 활성이 그의 천연 대응체의 활성에 비하여 더 약하거나 없기 때문에 이상할 수 있다. 이상 활성은 활성에 있어서의 변화일 수도 있다. 예를 들어 이상 폴리펩티드는 상이한 표적 펩티드와 상호 작용할 수 있다. 세포는 IL-1 유전자좌 폴리펩티드를 코딩하는 IL-1 유전자좌 유전자의 과다 발현 또는 불충분 발현으로 인한 이상 IL-1 활성을 가질 수 있다.
"세포", "숙주 세포" 또는 "재조합 숙주 세포"는 특정의 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 나타내기 위하여 본 명세서에서 서로 바꾸어 사용되는 용어이다. 어떠한 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인하여 다음 세대에서 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제 부모 세포와 동일할 수는 없지만 본 명세서에서 사용되는 용어의 범주 이내에 여전히 포함된다.
"키메라", "모자이크", "키메라 포유류" 등은 적어도 게놈-포함 세포의 일부에서 넉-아웃 (knock-out) 또는 넉-인 (knock-in) 작제물을 포함하는 트랜스제닉 포유류를 나타낸다.
"대조" 또는 "대조 샘플"이라는 용어는 이용되는 검출 기술에 적당한 임의의 샘플을 나타낸다. 대조 샘플은 이용되는 대립유전자 검출 기술의 생성물 또는 시험될 재료를 포함할 수 있다. 또한 대조는 양성 또는 음성 대조일 수 있다. 예로는, 대립유전자 검출 기술이 PCR 증폭, 이어서 크기 분류법일 경우, 대조 샘플은 적당한 크기의 DNA 단편을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 대립유전자 검출 기술이 돌연변이 단백질의 검출을 포함할 경우, 대조 샘플은 돌연변이 단백질 샘플을 포함할 수 있다. 그러나 대조 샘플이 시험될 재료를 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어 대조는 IL-1 유전자 집단의 게놈 DNA 또는 클로닝된 부분의 샘플일 수 있다. 그러나 시험될 샘플이 게놈 DNA일 경우 대조 샘플은 고도로 정제된 게놈 DNA 샘플인 것이 바람직하다.
"IL-1 다형성과 관련된 질환 및 병"이라는 구는 IL-1 복합체 내의 하나 이상 의 대립유전자의 동정에 기초하여 대상에 있어서 민감성이 나타내어질 수 있는 다양한 질환 또는 병을 나타낸다. 예로는 전신성 염증 반응 (SIRS)을 포함하는 염증성 또는 퇴행성 질환; 알츠하이머병 (및 만성 신경염증, 아교세포 활성화; 미세 아교세포 증가; 신경염 플라크 형성; 및 치료에 대한 응답을 포함하는 관련 병 및 증상); 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 관절염 (및 급성 관절 염증, 항원-유도된 관절염, 만성 림프구성 갑상선염과 관련된 관절염, 콜라겐-유도된 관절염, 연소성의 만성 관절염; 연소성의 류마토이드 관절염, 골관절염, 예후 및 스트렙토코커스 (streptococcus)-유도된 관절염을 포함하는 관련 병 및 증상), 천식 (및 기관지 천식; 만성 기도 폐색성 질환; 만성 폐쇄성 폐질환, 연소성 천식 및 직업성 천식을 포함하는 관련 병 및 증상); 심혈관질환 (및 죽상경화증; 자가 면역 심근염, 만성 심장 저산소증, 울혈성 심부전, 관상동맥 질환, 대동맥 평활근 세포 활성화; 심근세포 아폽토시스(apoptosis); 및 심근 세포 기능의 면역제어를 포함하는 심근증 및 심근 세포 기능장애; 자가면역 당뇨병, 인슐린-의존성 (제1형) 당뇨병, 당뇨성 치주염, 당뇨성 망막병증, 및 당뇨성 신장병증을 포함하는 당뇨병 및 관련 병과 증상을 포함하는 관련 병 및 증상); 위장 염증 (및 만성 소화 장애증, 관련된 골 감소증, 만성 결장염, 크론씨병, 염증성 장질환 및 궤양성 대장염을 포함하는 관련 병 및 증상); 위궤양; 간염, 콜레스테롤 담석 및 간섬유증, HIV 감염 (및 퇴행성 반응, 신경 퇴행성 반응, 및 HIV 관련 호지킨씨병을 포함하는 관련 병 및 증상), 가와사키 증후군 (및 피부 점막 림프절 증후군, 경부 림프선종, 심장 동맥 손상, 부종, 열, 백혈구 증가, 경증 빈혈, 박피, 발진, 결막 적열 (conjunctiva redness), 혈소판 증가증을 포함하는 관련 질환 및 병); 다발성 경화증, 신장병증 (및 당뇨성 신장병증, 말기 신부전증, 사구체신염, 굳패스쳐 증후군, 혈액 투석 생존 및 신장 허혈성 재관류 상해를 포함하는 관련 질환 및 병), 신경 퇴행성 질환 (및 급성 신경 퇴행, 노화 및 신경 퇴행성 질환에서의 IL-1의 유도, 시상하부 신경 세포의 IL-1 유도된 형성성 및 만성 스트레스 과다 반응성을 포함하는 관련 질환 및 병), 눈병증 (및 당뇨성 망막병증, 그레이브스 눈병증, 및 포도막염을 포함하는 관련 질환 및 병), 골다공증 (및 폐포, 대퇴, 요골, 척추 또는 손목의 골 소실 또는 골절 발생, 폐경후 골 소실, 매스 (mass), 골절 발생 또는 골소실율을 포함하는 관련 질환 및 병), 중이염 (성인 또는 소아), 췌장염 또는 췌장 샘포염, 치주 질환 (및 성인에서 일찍 시작되는 당뇨성의 것을 포함하는 관련 질환 및 병); 만성 폐질환, 만성부비동염, 유리질막 질환, 저산소증 및 SIDS에서의 폐 질환을 포함하는 폐질환; 재협착; 류마티스성 관절염, 류마티스성 아쇼프 소체, 류마티스병 및 류마티스성 심근염을 포함하는 류마티스; 만성 림프구성 갑상선염을 포함하는 갑상선염; 만성 전립샘염, 만성 골반통 증후군 및 요석증을 포함하는 요로 감염. 자가면역 질환, 예를 들어 원형 탈모증을 포함하는 면역 장애, 자가면역 심근염, 그레이브스 질환, 그레이브스 안병증, 태선 경화증, 다발성 경화증, 건선, 전신성 홍반성 낭창, 전신성 경화증, 갑상선 질환 (예를 들어 갑상샘종 및 갑상샘종 림포마토사 (struma lymphomatosa) (하시모토 갑상선염, 림프샘종 모양 갑상샘종), 수면장애 및 만성 피로 증후군 및 비만 (비당뇨병성이거나 당뇨병과 관련됨), 박테리아, 바이러스 (예를 들어 사이토메갈로바이러스, 뇌염, 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스, 인 간 면역 결핍 바이러스, 인플루엔자 바이러스) 또는 원충 (예를 들어 플라스모듐 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 파동편모충 (trypanosomes))에 의해 야기되는 감염성 질환, 예를 들어 리슈만편모충증, 나병, 라임병, 라임 심장염, 말라리아, 뇌말라리아, 수막염, 말라리아와 관련된 요새관간질 신장염 (tubulointestitial nephritis); 대뇌 외상 (중풍 및 허혈, 뇌염, 뇌병증, 간질, 주생기 뇌손상, 연장된 열성 발작, SIDS 및 지주막하 출혈을 포함)을 포함하는 외상에 대한 반응, 저체중아 출생 (예를 들어 뇌성마비), 폐손상 (급성 출혈성 폐 손상, 굳패스쳐 증후군, 급성 허혈성 재관류), 직업상의 환경 오염 물질에 의해 야기되는 심근 기능 이상 (예를 들어 유독성 오일 증후군 규폐증에 대한 민감성), 방사선 외상, 및 상처 치유 반응 (예를 들어 화상 또는 열에 의한 상처, 만성 상처, 외과적 상처 및 척수 손상)의 효율성; 유방암 관련 골용해 전이를 포함하는 신생물에 대한 민감성, 악액질, 결장직장암, 과대증식성 질환, 호지킨씨병, 백혈병, 림프종, 대사성 질환 및 종양, 전이, 골수종, 및 다양한 암 (유방, 전립샘, 난소, 결장, 폐 등을 포함), 식욕부진 및 악액질; 수정능/생식능을 포함하는 호르몬 조절, 임신 가능성, 조기 진통, 조기 진통에 의한 저체중아 출생을 포함하는 산전 및 산후 합병증, 뇌성마비, 패혈증, 하이포티록시네르니아 (hypothyroxinernia), 산소 의존, 뇌 이상, 조기 폐경 징후, 이식 (거부 또는 수락)에 대한 대상의 반응, 급성기의 반응 (예를 들어 열 반응), 종합적인 염증 반응, 급성 호흡 곤란 반응, 급성의 전신성 염증 반응, 상처 치유, 유착, 면역 염증 반응, 신경 내분비 반응, 발열 및 저항성, 급성기의 반응, 스트레스 반응, 질환 감수성, 반복 동작 스트레스, 테니스 엘보, 및 통증 관 리 반응을 들 수 있다.
"유전자 붕괴" 및 "표적화 붕괴"라는 구 또는 임의의 유사한 구는 이 유전자의 야생형 카피와 비교할 경우 이 유전자의 세포에서의 발현이 방지되도록 천연 DNA 서열을 부위 특이적으로 중단시키는 것을 나타낸다. 중단은 유전자에 대한 결실, 삽입 또는 변형, 또는 임의의 그의 조합에 의해 야기될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "일배체형"이라는 용어는 통계학적으로 유의한 수준으로 (p.sub.corr <0.05) 군으로 함께 유전되는 (연관 불균형 상태로 존재함) 대립유전자 세트를 나타내려는 것이다. 본 명세서에서 사용되는 "IL-1 일배체형"이라는 구는 IL-1 유전자좌의 일배체형을 나타낸다. IL-1 염증성 또는 전염증성 일배체형은 작용제 활성 증가 및/또는 길항제 활성 감소를 암시하는 일배체형을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 "IL-1 유전자 집단" 및 "IL-1 유전자좌"라는 용어는 적어도 IL-1A, IL-1B 및 IL-1RN 유전자와 임의의 기타 연관된 서열을 포함하여 2번 염색체의 2q13 영역의, 또는 상기 영역 근처의 모든 핵산을 포함한다 (문헌 [Nicklin et al., Genomics 19:3 82-84, 1994]). 본 명세서에서 사용되는 "IL-1A", "IL-1B", 및 "IL-1RN"이라는 용어는 각각 IL-1, IL-1, 및 IL-1 수용체 길항제를 코딩하는 유전자를 나타낸다. IL-1A, IL-1B, 및 IL-1RN의 유전자 접근 번호는 각각 X03833, X04500, 및 X64532이다.
"L-1의 기능적 돌연변이"는 표현형 변경으로 이어지는 (즉, IL-1 유전자 또는 단백질의 기능에 영향을 줌) IL-1 유전자 집단 내의 돌연변이를 나타낸다. 그 예로는 IL-1A(+4845) 대립유전자 2, IL-1B (+3954) 대립유전자 2, IL-1B (+6912) 대립유전자 2 및 IL-1RN (+2018) 대립유전자 2를 들 수 있다.
"IL-1X (Z) 대립유전자 Y"는 IL-1 유전자좌 다형성 부위에서 나타나며 Y라고 칭해지는 특정 대립유전자 형태를 나타내는데, 여기서 X는 IL-1A, B, 또는 RN이며 뉴클레오티드 Z에, 또는 뉴클레오티드 Z 근처에 위치하며, 뉴클레오티드 Z는 특정 IL-1 유전자 X의, 뉴클레오티드 +1인 주요 전사 개시 부위와 관련하여 넘버링된다. 본 발명에서 추가로 사용되는 4179X 용어 "IL-1X 대립유전자 (Z)"는 뉴클레오티드 Z에, 또는 뉴클레오티드 Z 근처에 위치하는 유전자 X에서의 IL-1 다형성 부위의 모든 대립유전자를 나타낸다. 예를 들어 "IL-1RN (+2018) 대립유전자"라는 용어는 마커 +2018에서의 IL-1RN 유전자의 다른 형태를 나타낸다. "IL-1RN (+2018) 대립유전자 1"은 센스 가닥의 +2018 위치에서 사이토신 (C) 을 포함하는 IL-1RN 유전자 형태를 나타낸다. 문헌 [Clay et al., Hum. Genet. 97: 723-26, 1996]. "IL-1RN (+2018) 대립유전자 2"는 플러스 가닥의 +2018 위치에서 티민 (T)을 포함하는 IL-1RN 유전자 형태를 나타낸다. 대상이 2개의 동일한 IL-1RN 대립유전자를 가질 경우, 이 대상은 동종성이라고 하거나 동종성 상태를 가진다고 한다. 대상이 2개의 상이한 IL-1RN 대립유전자를 가질 경우, 이 대상은 이종성이라고 하거나 이종성 상태를 가진다고 한다. "IL-1RN (+2018) 대립유전자 2,2"라는 용어는 동종성 IL-1RN (+2018) 대립유전자 2 상태를 나타낸다. 역으로, "IL-1RN (+2018) 대립유전자 1,1"이라는 용어는 동종성 IL-1RN (+2018) 대립유전자 1 상태를 나타낸다. "IL-1RN (+2018) 대립유전자 1,2"라는 용어는 이종성 대립유전자 1 및 2 상태를 나타낸 다.
"IL-1 표현형"이라는 용어는 IL-1 유전자좌의 유전자 아이덴티티- 즉, 염증성 질환 또는 장애의 "정상적인" (예를 들어 평균 또는 "야생형") 관련 가능성 뿐만 아니라 염증성 질환 또는 병에 걸리기 쉬운 소질의 증가 및 감소를 포함하는 아이덴티티로부터 생기는 임의의 표현형을 나타내려는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 "IL-1 관련"이라는 것은 인간 2번 염색체 (2q 12-14) 상의 인간 IL-1 유전자좌의 유전자와 관련된 모든 유전자를 포함하려는 것이다. 이는 인터류킨-1.알파를 코딩하는 IL-1A 유전자, 인터류킨-1.베타를 코딩하는 IL-1B 유전자, 및 인터류킨-1 수용체 길항체를 코딩하는 IL-1RN (또는 IL-1ra) 유전자를 포함하며 인간의 2번 염색체 (2q 13-14)에 위치하는 인간 IL-1 유전자 집단의 IL-1 유전자를 포함한다. 또한 상기 IL-1 관련 유전자는 인간의 2번 염색체 (2q12) 상에 위치하는 제I형 및 제II형 인간 IL-1 수용체 유전자 및 19.5 cM 위치에서 생쥐의 1번 염색체 상에 위치하는 그의 생쥐 상동체를 포함한다. 인터류킨-1.알파., 인터류킨-1.베타., 및 인터류킨-1RN은 이들이 모두 제I형의 IL-1 수용체에 결합하는 만큼 많이 관련되어 있지만, 단지 인터류킨-1.알파. 및 인터류킨-1.베타.만이 제I형의 IL-1 수용체를 활성화시키는 작용제 리간드이며, 반면 인터류킨-1RN은 천연 길항제 리간드이다. "IL-1"이라는 용어가 유전자 생성물 또는 폴리펩티드에 관련하여 사용될 경우, 이는 인간의 2번 염색체 (2q 12-14) 상의 인터류킨-1 유전자좌에 의해 코딩되는 모든 유전자 생성물 및 기타 종 또는 그의 핌셔널 (fimctional) 변이체 유래의 상응하는 상동체를 나타내려는 것이다. 이와 같이 IL-1이라는 용어는 염증성 응답을 촉진하는 분비 폴리펩티드, 예를 들어 IL-1a 및 IL-1.베타.와, 염증성 응답을 길항하는 분비 폴리펩티드, 예를 들어 IL-1 수용체 길항체 및 제II형의 IL-1 (유인형 (decoy)) 수용체를 포함한다.
"IL-1 수용체" 또는 "IL-1R"은 IL-1 유전자좌에 의해 코딩되는 리간드에 결합할 수 있고/있거나 상기 리간드로부터의 시그널을 전달할 수 있는 다양한 세포막 결합 단백질 수용체를 나타낸다. 상기 용어는 인터류킨-1 (IL-1) 분자에 결합할 수 있으며 포유류 원형질 막 단백질로서의 그의 천연 구조에 있어서는 이 IL-1에 의해 제공되는 시그널을 세포로 전달하는 데에 아마도 역할을 하는 임의의 단백질에 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 IL-1 결합 또는 시그널 전달 활성을 가지는 천연 단백질의 유사체를 포함한다. 예로는 미국 특허 제4,968,607호에 기술되어 있는 인간 및 쥐 IL-1 수용체를 들 수 있다. "IL-1 핵산"이라는 용어는 IL-1 단백질을 코딩하는 핵산을 나타낸다.
"IL-1 폴리펩티드" 및 "IL-1 단백질"은 도 1, 2 및 3에 도시되어 있는 IL-1 게놈 DNA 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 그의 단편과 그의 상동체를 포함하려는 것이며 작용제 및 길항제 폴리펩티드를 포함한다.
"위험성 증가"는 특정의 다형성 대립유전자를 보유하지 않는 집단 구성원에 있어서의 질환 또는 병의 발생 빈도와 비교하여 특정의 다형성 대립유전자를 보유하는 개체에 있어서의 질환 또는 병의 발생 빈도가 통계학적으로 더 크다는 것을 나타낸다.
"위험성 감소"는 특정의 다형성 대립유전자를 보유하지 않는 집단 구성원 또는 전체로서의 집단에 있어서의 질환 또는 병의 발생 빈도와 비교하여 특정의 다형성 대립유전자를 보유하는 개체에 있어서의 질환 또는 병의 발생 빈도가 통계학적으로 더 적음을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 "상호 작용"이라는 용어는 분자 사이의 검출가능한 관계 또는 관련성 (예를 들어 생화학적 상호 작용), 예를 들어 단백질-단백질간, 단백질-핵산간, 핵산-핵산간 및 천연 형태의 단백질-소분자간 또는 핵산-소분자간 상호 작용을 포함하려는 것이다.
본 명세서에서 핵산, 예를 들어 DNA 또는 RNA와 관련하여 사용되는 "단리"라는 용어는 각각 거대분자의 천연원에 존재하는 다른 DNA 또는 RNA로부터 분리된 분자를 나타낸다. 예를 들어 본 IL-1 폴리펩티드 중 하나를 코딩하는 단리 핵산은 바람직하게는 자연적으로 인접하여 게놈 DNA 중 IL-1 유전자의 측면에 위치하는 10 킬로베이스 (kb) 이하의 핵산 서열, 더 바람직하게는 5 kb 이하의 이러한 천연의 측면에 위치하는 서열, 가장 바람직하게는 1.5 kb 미만의 이러한 천연의 측면에 위치하는 서열을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 단리라는 용어는 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 경우 세포 물질, 바이러스 물질, 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나 화학적으로 합성될 경우 화학 전구체 또는 기타 화학 물질이 실질적으로 없는 핵산 또는 펩티드를 또한 나타낸다. 또한, "단리 핵산"은 단편으로는 천연적으로 존재하지 않으며 천연 상태로는 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하려는 것이다. "단리"라는 용어는 다른 세포 단백질로부터 단리된 폴리펩티드를 나타내기 위하여 본 명세서에서 사용되기도 하며 정제 및 재조합 폴리펩티드 둘 모두를 포함하려는 것이다.
"넉-인" 트랜스제닉 동물은 그의 게놈 내로 도입된 변형 유전자를 가지며 변형 유전자는 외인성 또는 내인성 기원의 것일 수 있는 동물을 나타낸다.
"넉-아웃" 트랜스제닉 동물은 내인성 유전자의 발현이 부분적으로 또는 완전히 억제된 동물 (예를 들어 적어도 유전자의 일부의 결실, 적어도 유전자의 일부의 제2 서열로의 대체, 정지 코돈의 도입, 주요 아미노산을 코딩하는 염기의 돌연변이 또는 인트론 접합부의 제거 등에 기초)을 나타낸다.
"넉-아웃 작제물"은 세포에 있어서 내인성 DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 감소 또는 억제하는 데에 사용될 수 있는 핵산 서열을 나타낸다. 간단한 예에 있어서, 넉-아웃 작제물은 유전자의 주요 부분이 결실된 IL-1RN 유전자와 같은 유전자로 이루어져 있어 활성 단백질이 그로부터 발현될 수 없다. 대안적으로는, 다수의 종결 코돈이 천연 유전자에 부가되어 단백질의 조기 종결이 야기될 수 있거나 인트론 접합부가 불활성화될 수 있다. 전형적인 넉-아웃 작제물에 있어서, 몇몇의 유전자 일부는 선발가능한 마커 (예를 들어 neo 유전자)로 대체되어 이 유전자가 IL-1RN 5'/neo/IL-1RN3'으로 표시될 수 있는데, 여기서 IL-1RN 5' 및 IL-1RN 3'은 각각 IL-1RN 유전자 부분에 대하여 상류 및 하류인 게놈 또는 cDNA 서열을 나타내며, neo는 네오마이신 내성 유전자를 나타낸다. 다른 넉-아웃 작제물에 있어서, 선발가능한 제2 마커가 측면에 위치하는 위치에서 부가되어 이 유전자는 IL-1RN/neo/IL-1RN/TK로 표시될 수 있는데, 여기서 TK는 전술한 작제물의 IL-1RN 5' 또는 IL-1RN 3' 서열에 부가될 수 있으며 적당한 배지에서 추가로 선발될 수 있는 (즉, 선발가능한 음성 마커임) 티미딘 키나제이다. 이러한 2-마커 작제물에 의해 일반적으로 TK 서열을 보유하는 비-상동성 재조합 사건으로부터 상동성 재조합 사건이 선발되게 되는데, 2-마커 작제물에는 측면에 위치하는 TK 마커가 제거되어 있다. 유전자 결실 및/또는 대체는 엑손, 인트론, 특히 인트론 접합부, 및/또는 프로모터와 같은 조절 영역으로부터 생길 수 있다.
"연관 불균형"은 주어진 대조 집단에서 각각의 대립유전자의 개별적인 발생 빈도로부터 예상되는 것보다 더 큰 빈도로 2개의 대립유전자가 공동-유전되는 것을 나타낸다. 독립적으로 유전되는 2개의 대립유전자의 예상되는 발생 빈도는 제1 대립유전자의 빈도 x 제2 대립유전자의 빈도이다. 예상 빈도에서 공동으로 발생하는 대립유전자는 "연관 불균형" 상태라고 한다. 연관 불균형의 원인은 종종 불명확하다. 이는 특정 대립유전자 조합의 선택 또는 유전적으로 이종성인 집단의 새로운 혼합으로 인한 것일 수 있다. 부가적으로, 질환 유전자에 매우 단단하게 연관된 마커의 경우, 특정 염색체 영역에서 재조합 사건을 통하여 성취될 평형에 있어서 충분한 시간이 경과하지 않아 최근의 과거에 질환 돌연변이가 발생했다면 대립유전자 (또는 연관된 대립유전자 군)의 질환 유전자와의 결부가 예상된다. 하나보다 많은 대립유전자로 이루어진 대립유전자 패턴을 언급하자면, 제1 대립유전자 패턴은 제1 대립유전자 패턴을 포함하는 모든 대립유전자가 제2 대립유전자 패턴의 대립유전자 중 하나 이상과 연관 불균형 상태로 존재할 경우 제2 대립유전자 패턴과 연관 불균형 상태이다. 연관 불균형의 예로는 IL-1RN (+2018)과 IL-1RN (VNTR) 다 형성 부위의 대립유전자들 사이에 발생하는 것이 있다. IL-1RN (+2018)의 2개의 대립유전자는 IL-1RN (VNTR)의 가장 빈도수가 큰, 대립유전자 1 및 대립유전자 2인 2개의 대립유전자와의 연관 불균형이 100%이다.
"마커"라는 용어는 개체들 사이에서 다양한 것으로 알려진 게놈 중 서열을 나타낸다. 예를 들어 IL-1RN 유전자는 다양한 갯수의 직렬 반복체 (variable number of tandem repeat, VNTR)로 구성된 마커를 가진다.
"돌연변이 유전자" 또는 "돌연변이" 또는 "기능적 돌연변이"는 돌연변이 유전자를 가지지 않는 대상과 비교하여 돌연변이 유전자를 가지는 대상의 표현형을 변경시킬 수 있는 대립유전자 형태의 유전자를 나타낸다. 돌연변이에 의해 야기되는 표현형 변경은 특정 약제에 의해 교정되거나 보상될 수 있다. 대상이 이러한 돌연변이에 대하여 동종성이어서 변경된 표현형을 가질 경우, 돌연변이는 열성이라고 한다. 하나의 카피의 돌연변이 유전자가 대상의 표현형의 변경에 충분할 경우, 돌연변이는 우성이라고 한다. 대상이 하나의 카피의 돌연변이 유전자를 가지며 (이 유전자에 있어서) 동종성 대상의 표현형과 이종성 대상의 표현형 사이의 중간인 표현형을 가질 경우 돌연변이는 공동 우성이라고 한다.
본 발명의 "비인간 동물"은 포유류, 예를 들어 설치류, 비인간 영장류, 양, 개, 소, 염소 등, 양서류, 예를 들어 제노푸스 (Xenopus) 속의 구성원, 및 트랜스제닉 조류 (예를 들어 닭, 새 등)을 포함한다. "키메라 동물"이라는 용어는 재조합 유전자가 발견되거나, 재조합 유전자가 동물의 모든 세포는 아니지만 일부 세포에서 발현되는 동물을 나타내기 위하여 본 명세서에서 사용된다. "조직-특이적 키 메라 동물"이라는 용어는 재조합 IL-1 유전자 중 하나가 일부 조직에서 존재하고/하거나 발현되거나 붕괴되었지만 다른 조직에서는 그러하지 않음을 나타낸다. "비인간 포유류"라는 용어는 인간을 제외한 포유류 (Mammalia) 문의 임의의 구성원을 나타낸다.
본 명세서에서 사용되는 "핵산"이라는 용어는 데옥시리보핵산 (DNA), 및 적당할 경우 리보핵산 (RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 이 용어는 또한 등가물로서 뉴클레오티드 유사체 (예를 들어 펩티드 핵산)로부터 만들어진 RNA 또는 DNA 유사체, 그리고 기술된 실시 형태에 사용가능할 경우 단일 (센스 또는 안티센스) 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 "기능성 식품"이라는 용어는 질환 또는 장애, 특히 염증성 질환과 관련된 질환 또는 장애의 치료에 가치가 있을 수 있는 식품 및 식이성 보조 식품의 FDA 정의를 포함한다. 따라서 "기능성 식품"은 건강 이득의 성취에 사용될 수 있는 영양 성분을 포함한다. 이러한 성분은 "식품", 즉 "기능성 식품" 또는 식이성 보조 식품의 형태일 수 있다. 1994년 10월에 식이성 보조식품 건강 교육법안 (Dietary Supplement Health and Education Act, ("DSHEA"))이 법률로 서명되었다. DSHEA는 수백만의 소비자가 식이성 보조 식품이 건강 이득을 제공할 수 있다고 믿는다는 것을 인정한 것이다. 상기 법안의 통과에 있어서의 의회의 취지는 소비자의 식이성 보조 식품에의 접근성과 안전성 문제를 나타내거나 허위 또는 오도성 라벨링을 지니는 보조 식품에 대하여 행하는 FDA의 권한 사이의 균형을 생각해 낸 것이었다. DSHEA는 식이성 보조 식품의 안전성 및 라벨링에 대한 새로운 규정 틀을 창조하였다. FDA는 DSHEA를 유효하게 하는 방식으로 DSHEA를 강제하도록 하였다. 따라서 본 명세서에서 사용되는 "기능성 식품"은 섭취되어 규정식을 보충하도록 하며 "식이성 성분"을 포함하는 당 업계에 공지된 식이성 보조 식품 (예를 들어 비타민, 미네랄, 허브 및 기타 보조 식품)을 포함한다. 식이성 성분은 비타민, 미네랄, 허브 또는 기타 식물 채취물, 아미노산, 및 식이성 물질, 예를 들어 효소를 포함할 수 있다. 식이성 성분은 대사 생성물, 구성물, 추출물, 농축물, 또는 이들 성분의 조합일 수도 있다. 기능성 식품 보조 식품은 정제, 캡슐, 액체, 및 바 (bar)를 포함하는 형태일 수 있다.
"다형성"이라는 용어는 하나 이상의 형태의 유전자 또는 그의 일부 (예를 들어 대립유전자 변이체)가 공동으로 존재한다는 것을 나타낸다. 2가지 이상의 상이한 형태가 존재하는 유전자의 일부, 즉, 2가지 상이한 뉴클레오티드 서열이 "유전자의 다형성 영역"으로 칭해진다. 유전자의 다형성 영역의 특정 유전자 서열이 대립유전자이다. 다형성 영역은 단일 뉴클레오티드일 수 있는데, 그의 아이덴티티는 다른 대립유전자에 있어서는 상이하다. 다형성 영역은 여러 뉴클레오티드의 길이일 수도 있다.
"질환 경향", 또한 질환에 걸리기 쉬운 "소질" 또는 질환에 대한 "민감성"이라는 용어 또는 임의의 유사한 구는 특정 대립유전자가 대상의 특정 질환 (예를 들어 혈관계 질환)의 발병과 관련되어 있거나 상기 발병의 전조라는 것임이 여기서 밝혀졌음을 의미한다. 따라서 대립유전자는 건강한 개체와 비교시 질환을 가진 개 체에 있어서의 빈번하게 과다 표시된다. 따라서 이러한 대립유전자는 심지어 증상전의 개체 또는 질환에 걸리기 전의 개체에 있어서도 질환을 예견하는 데에 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "소분자"는 약 5 kD 미만의 분자량, 가장 바람직하게는 약 4 kD 미만의 분자량을 가지는 조성물을 나타내려는 것이다. 소분자는 핵산, 펩티드, 펩티도미메틱(peptidomimetic), 탄수화물, 지질 또는 기타 유기 또는 무기 분자일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "특이적으로 혼성화하는" 또는 "특이적으로 검출하는"이라는 용어는 샘플 핵산의 대략 6개 이상의 연속 뉴클레오티드에 혼성화하는 핵산 분자의 능력을 나타낸다.
"전사 조절 서열"은 본 명세서 전반에 걸쳐 작동가능하게 결합된 단백질 코딩 서열의 전사를 유도 또는 제어하는 DNA 서열, 예를 들어 개시 시그널, 인핸서, 및 프로모터를 나타내기 위하여 사용되는 일반적인 용어이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "트랜스진"이라는 용어는 세포 내로 도입된 핵산 서열 (예를 들어 IL-1 폴리펩티드 중 하나를 코딩하는 것 또는 그의 안티센스 전사체)을 의미한다. 트랜스진은 트랜스진이 도입되는 트랜스제닉 동물 또는 세포에 대하여 부분적으로 또는 완전히 이종성, 즉, 외래물질일 수 있거나 트랜스진이 도입되며 트랜스진이 삽입되는 세포의 게놈을 변경시키는 방식으로 동물의 게놈 내로 삽입되도록 디자인되거나 삽입되는 (예를 들어 트랜스진은 천연 유전자의 위치와는 상이한 위치에 삽입되거나 그의 삽입이 넉아웃으로 이어짐) 트랜스제닉 동물 또는 세포의 내인성 유전자에 대하여 동종성이다. 트랜스진은 에피좀 (episome)의 형태로 세포 내에 존재할 수도 있다. 트랜스진은 선발된 핵산의 최적 발현에 필요할 수 있는 하나 이상의 전사 조절 서열 및 임의의 기타 핵산, 예를 들어 인트론을 포함할 수 있다.
"트랜스제닉 동물"은 하나 이상의 동물 세포가 인간 개재에 의해, 예를 들어 당 업계에 잘 알려진 트랜스제닉 기술에 의해 도입되는 이종성 핵산을 포함하는 임의의 동물, 바람직하게는 비인간 포유류, 조류 또는 양서류를 나타낸다. 핵산은 신중한 유전자 조작에 의한, 예를 들어 재조합 바이러스를 이용한 감염 또는 미세주입법에 의한 세포 전구체 내로의 도입에 의해 직접 또는 간접적으로 세포 내로 도입된다. 유전자 조작이라는 용어는 고전적인 이종 교배법 또는 시험관내 수정법은 포함하지 않으며 오히려 재조합 DNA 분자의 도입에 관한 것이다. 상기 분자는 염색체 내에 통합될 수 있거나, 염색체외적으로 복제하는 DNA일 수 있다. 본 명세서에서 기술되는 전형적인 트랜스제닉 동물에 있어서, 트랜스진은 세포가 IL-1 폴리펩티드 중 하나의 재조합체 형태, 예를 들어 작용형 또는 길항형을 발현하도록 한다. 그러나 재조합 유전자가 침묵성 (silent)인 트랜스제닉 동물도 예를 들어 하기의 FLP 또는 CRE 리콤비나제 (recombinase) 의존성 작제물로 고려된다. 또한 "트랜스제닉 동물"은 유전자 중 하나 이상의 유전자의 유전자 붕괴가 재조합 및 안티센스 기술 둘 모두를 포함하는 인간 개입에 의해 야기된 재조합 동물을 또한 포함한다. 상기 용어는 모든 자손 세대를 포함하려는 것이다. 따라서 창립 동물 및 모든 F1, F2, F3 등의 그의 자손이 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 "치료"라는 용어는 병 또는 질환의 하나 이상의 증상의 치유 및 개선을 포함하려는 것이다.
"벡터"라는 용어는 결합된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 나타낸다. 바람직한 하나의 벡터 형태는 에피좀, 즉 염색체외 복제가 가능한 핵산이다. 바람직한 벡터는 결합된 핵산의 자율 복제 및/또는 발현이 가능한 것이다. 본 명세서에서 작동가능하게 결합된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 "발현 벡터"로 칭해진다. 일반적으로 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 그의 벡터 형태로는 염색체에 결합되지 않는 원형의 이중 가닥 DNA 루프로 일반적으로 나타내어지는 "플라스미드"의 형태이다. 본 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 형태이기 때문에 서로 바꾸어서 사용된다. 그러나 본 발명은 동등한 기능을 하며 본 발명에서 다음에 당 업계에 공지되는 다른 형태의 발현 벡터를 포함하고자 한다.
"야생형 대립유전자"라는 용어는 대상에서 2개의 카피로 존재할 경우 야생형 표현형을 나타내는 유전자의 대립유전자를 나타낸다. 특정 유전자의 여러 상이한 야생형 대립유전자가 존재할 수 있는데, 이는 유전자에서의 특정 뉴클레오티드 변화가 뉴클레오티드가 변화된 2개의 카피의 유전자를 가지는 대상의 표현형에 영향을 주지 않을 수 있기 때문이다.
4.3 대립유전자의 검출
다수의 방법이 인간 다형성 유전자좌의 특정 대립유전자의 검출에 이용가능하다. 특정의 다형성 대립유전자의 바람직한 검출 방법은 부분적으로는 다형성의 분자적 성질에 따라 달라진다. 예를 들어 다형성 유전자좌의 다양한 대립유전자 형태는 DNA의 단일 염기쌍이 상이할 수 있다. 이러한 단일 뉴클레오티드 다형성 (또는 SNP)은 모든 공지된 다형성의 약 80%를 포함하는 유전적 변이성의 주요 원인이며, 그의 인간 게놈에서의 밀도는 1,000 염기쌍 당 평균 1인 것으로 추정된다. SNP는 가장 빈번하게는 (DNA에서 나타나는 4개의 상이한 뉴클레오티드 염기에 상응하는 4개 이하의 상이한 형태의 SNP가 이론적으로 가능하기는 하지만) 단지 2가지의 상이한 형태로 2대립유전자로 나타난다. 그럼에도 불구하고 SNP는 다른 다형성보다 돌연변이적으로 더욱 안정하여 SNP는 마커와 비공지 변이체 사이의 연관 불균형을 이용하여 질환 야기 돌연변이를 지도화하는 관련성 연구에 적합하게 된다. 부가적으로, SNP는 일반적으로 단지 2개의 대립유전자를 가지기 때문에 SNP는 길이 측정법보다는 간단한 플러스/마이너스 분석법에 의해 유전형이 결정될 수 있어 이들은 더욱 순종적으로 자동화되게 한다.
다양한 방법이 개체에 있어서의 특정 단일 뉴클레오티드 다형성 대립유전자의 존재의 검출에 이용가능하다. 이 분야의 진보로 인해 정확하며 용이하고 값싼 대규모 SNP 유전형 결정법이 제공되었다. 가장 최근에는, 예를 들어 동적 대립유전자 특이적 혼성화법 (dynamic allele-specific hybridization, DASH), 마이크로플레이트 정렬 대각선 젤 전기영동법 (microplate array diagonal gel electrophoresis, MADGE), 파이로서열결정법 (pyrosequencing), 올리고뉴클레오티드-특이적 라이게이션법, TaqMan 시스템과, 다양한 DNA "칩" 기술, 예를 들어 Affymetrix SNP 칩을 포함하는 여러 새로운 기술이 기술되었다. 이러한 방법은 일 반적으로 PCR에 의한 표적 유전자 영역의 증폭을 필요로 한다. 침윤성 절단에 의한 작은 시그널 분자의 생성, 이어서 질량 분광 분석법 또는 고정화된 맹꽁이자물쇄(padlock) 프로브 및 회전-원식 (rolling-circle) 증폭에 기초한 새롭게 개발된 또다른 방법은 PCR의 필요성을 결국은 제거할 수 있다. 당 업계에 공지된 특정의 단일 뉴클레오티드 다형성의 여러 검출 방법이 이하에 요약되어 있다. 본 발명의 방법은 모든 이용가능한 방법을 포함하는 것으로 이해된다.
단일 뉴클레오티드 다형성의 분석을 돕기 위하여 여러 방법이 개발되었다. 하나의 실시 형태에 있어서, 단일 염기 다형성은 예를 들어 먼디, 씨.알. (Mundy, C. R.)의 미국 특허 제4,656,127호에 개시되어 있는 바와 같이 특수 엑소뉴클레아제-내성 뉴클레오티드를 사용하여 검출할 수 있다. 이 방법에 따르면, 다형성 부위의 인접한 3'의 대립유전자 서열에 상보성인 프라이머에 의해 특정의 동물 또는 인간으로부터 수득된 표적 분자에 대한 혼성화가 가능하게 된다. 표적 분자 상의 다형성 부위가 존재하는 특정 엑소뉴클레아제-내성 뉴클레오티드 유도체에 상보성인 뉴클레오티드를 포함하는 경우, 상기 유도체는 혼성화된 프라이머의 말단에 혼입된다. 이러한 혼입에 의해 프라이머는 엑소뉴클레아제에 대하여 내성을 가지게 됨으로써 그의 검출이 가능해진다. 샘플의 엑소뉴클레아제-내성 유도체의 아이덴티티는 공지되어 있기 때문에 프라이머가 엑소뉴클레아제에 대하여 내성을 가지게 되었다는 발견은 표적 분자의 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드가 반응에 사용된 뉴클레오티드 유도체의 다형성 부위에 상보성이라는 것을 나타낸다. 이러한 방법은 다량의 외부의 서열 데이터의 결정을 필요로 하지 않는다는 점에서 이점을 가 진다.
본 발명의 다른 실시 형태에 있어서, 용액에 기초한 방법이 다형성 부위의 뉴클레오티드의 아이덴티티 결정에 사용된다. 코헨, 디. (Cohen, D.) 등의 프랑스 특허 제2,650,840호; PCT 출원 제W091/02087호. 미국 특허 제4,656,127호의 먼디의 방법에서와 마찬가지로, 다형성 부위의 3'에 인접한 대립유전자에 상보성인 프라이머가 이용된다. 이 방법에 의해 다형성 부위의 뉴클레오티드에 상보성일 경우 프라이머의 말단에 혼입되게 되는 표지된 디데옥시뉴클레오티드 유도체를 사용하여 상기 부위의 뉴클레오티드의 아이덴티티를 결정한다.
Genetic Bit Analysis 또는 GBA.TM.으로 공지된 대안적인 방법이 괼렛, 피. (Goelet, P.) 등 (PCT 출원 제92/15712호)에 의해 기술되었다. 괼렛, 피. 등의 방법에서는 다형성 부위의 3'의 서열에 상보성인 프라이머 및 표지된 종결자의 혼합물이 사용된다. 따라서 혼입된 표지 종결자는 평가될 표적 분자의 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드에 의해, 그리고 상기 뉴클레오티드에 상보성인 것에 의해 측정된다. 코헨 등 (프랑스 특허 제2,650,840호; PCT 출원 제W091/02087호)의 방법과는 대조적으로 괼렛, 피. 등의 방법은 바람직하게는 이종성 상 분석법인데, 여기서 프라이머 또는 표적 분자는 고체상에 고정화된다.
최근에는 DNA 중 다형성 부위의 분석을 위한 여러 프라이머-안내 뉴클레오티드 혼입 절차가 기술되었다 (문헌 [Komher, J. S. et al., Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989)]; 문헌 [Sokolov, B. P., Nucl. Acids Res. 18:3671 (1990)]; 문헌 [Syvanen, A.-C., et al., Genomics 8:684-692 (1990)]; 문헌 [Kuppuswamy, M. N. et al., Proc. Nad. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1143-1147 (1991)]; 문헌 [Prezant, T. R. et al., Hum. Mutat. 1: 159-164 (1992)]; 문헌 [Ugozzoli, L. et al., GATA 9:107-112 (1992)]; 문헌 [Nyren, P. et al., Anal. Biochem. 208:171-175 (1993)]). 상기 방법은 이 방법 모두가 다형성 부위의 염기들 사이에서의 구별을 위하여 표지된 데옥시뉴클레오티드의 혼입에 의존적이라는 점에서 GBA.TM.과 상이하다. 이러한 포맷에 있어서, 시그널은 혼입된 데옥시뉴클레오티드의 갯수에 비례하기 때문에 동일한 뉴클레오티드 런 (run)에서 나타나는 다형성은 이 런의 길이에 비례하는 시그널을 생성할 수 있다 (문헌 [Syvanen, A.-C., et al., Amer. J. Hum. Genet. 52:4659 (1993)]).
단백질 번역의 조기 종결을 생성하는 돌연변이에 있어서 단백질 절단 시험 (protein truncation test, PTT)은 효율적인 진단 접근법을 제공한다 (문헌 [Roest, et. al., (1993) Hum. Mol Genet. 2:1719-21]; 문헌 [van der Luijt, et. al., (1994) Genomics 20:1-4]). PTT에 있어서, RNA는 처음에 입수가능한 조직으로부터 단리되어 역전사되며, 목적 절편은 PCR로 증폭된다. 이어서 역전사 PCR 생성물은 RNA 폴리머라제 프로모터 및 진핵생물 번역의 개시를 위한 서열을 포함하는 프라이머를 포함하는 네스티드 (nested) PCR 증폭을 위한 주형으로 사용된다. 목적 영역의 증폭 후 프라이머 내로 혼입된 독특한 모티프에 의해 순차적인 PCR 생성물의 시험관내 전사 및 번역이 가능해진다. 번역 생성물의 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동시, 절단된 폴리펩티드의 출현은 번역의 조기 종결을 야기하는 돌연변이가 존재함을 나타내는 것이다. 상기 기술의 변이에 있어서, (RNA에 대치되는) DNA는 목적하는 표적 영역이 단일 엑손으로부터 유래된 경우 PCR 주형으로 사용된다.
임의의 세포 형태 또는 조직은 본 명세서에 기술되어 있는 진단법에 사용하기 위한 핵산 샘플의 수득에 이용될 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, DNA 샘플은 공지된 기술 (예를 들어 정맥 천자)로 수득되는 체액, 예를 들어 혈액 또는 타액으로부터 수득된다. 대안적으로는 핵산 시험은 건조 샘플 (예를 들어 모발 또는 피부) 상에서 수행될 수 있다. RNA 또는 단백질을 사용할 경우 이용될 수 있는 세포 또는 조직은 IL-1 유전자를 발현해야 한다.
진단 절차는 핵산 정제가 전혀 필요하지 않도록 생체 또는 절제물로부터 수득되는 환자 조직의 조직 절편 (고정 및/또는 동결됨) 상에서 원위치에서 직접 수행될 수도 있다. 핵산 시약은 이러한 원위치 절차에 있어서 프로브 및/또는 프라이머로 사용될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Nuovo, G. J., 1992, PCR in situ hybridization: protocols and applications, Raven Press, N.Y.] 참조).
하나의 핵산 서열의 검출에 주로 초점을 맞춘 방법 외에도, 이러한 검출 방법에서 프로필이 또한 평가될 수 있다. 핑거프린트 (fingerprint) 프로필이 예를 들어 차별적 표시 (differential display) 절차, 노던 (Nothern) 분석법 및/또는 RT-PCR의 이용에 의해 생성될 수 있다.
바람직한 검출 방법으로는 IL-1 전염증성 일배체형의 하나 이상의 대립유전자의 영역과 중복되며 돌연변이 또는 다형성 영역 주위에 약 5, 10, 20, 25, 또는 30개의 뉴클레오티드를 가지는 프로브를 사용한 대립유전자 특이적 혼성화법이 있 다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에 있어서, 재협착에 연루된 다른 대립유전자 변이체에 특이적으로 혼성화할 수 있는 여러 프로브를 고체상 지지체, 예를 들어 "칩" (약 250,000개 이하의 올리고뉴클레오티드를 유지할 수 있음)에 부착시킨다. 올리고뉴클레오티드는 리쏘그래피를 포함하는 다양한 공정에 의해 고체 지지체에 결합될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 포함하며 "DNA 프로브 정렬"로도 명명되는 이러한 칩을 사용한 돌연변이 검출 분석법이 예를 들어 문헌 [Cronin et al. (1996) Human Mutation 7:244]에 기술되어 있다. 하나의 실시 형태에 있어서 칩은 유전자의 하나 이상의 다형성 영역의 모든 대립유전자 변이체를 포함한다. 이어서 고체상 지지체는 시험 핵산과 접촉되며 특이적 프로브로의 혼성화가 검출된다. 따라서 하나 이상의 유전자의 다수의 대립유전자 변이체의 아이덴티티가 간단한 혼성화 실험에서 확인될 수 있다.
이러한 기술은 분석 전의 핵산 증폭 단계를 또한 포함할 수 있다. 증폭 기술은 당 업계의 숙련자에게 공지되어 있으며, 클로닝, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 특정 대립유전자의 폴리머라제 연쇄 반응 (ASA), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 네스티드 폴리머라제 연쇄 반응, 자가 지속성 서열 복제 (문헌 [Guatelli, J. C. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. SE USA 87:1874-1878]), 전사에 의한 증폭 시스템 (문헌 [Kwoh, D. Y. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177]), 및 Q-베타 레플리카제 (문헌 [Lizardi, P. M. et al., 1988, Bio/Technology 6:1197])을 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다.
증폭 생성물은 크기 분석법, 제한 효소 절단에 이은 크기 분석법, 반응 생성 물 중의 특정 태그의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 검출법, 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 (ASO) 혼성화법, 대립유전자 특이적 5' 엑소뉴클레아제 검출법, 서열 결정법, 혼성화법 등을 포함하는 다양한 방법으로 분석될 수 있다.
PCR에 기초한 검출 방법은 동시적인 복수개의 마커의 다중 증폭을 포함할 수 있다. 예를 들어 크기 면에서 중복되지 않으며 동시에 분석될 수 있는 PCR 생성물을 생성하는 PCR 프라이머를 선택하는 것은 당 업계에 잘 알려져 있다. 대안적으로는, 차별적으로 표지되어 각각이 차별적으로 검출될 수 있는 프라이머를 이용하여 상이한 마커를 증폭시키는 것이 가능하다. 물론 혼성화에 기초한 검출 방법에 의해 샘플 중의 다수의 PCR 생성물이 차별적으로 검출되게 된다. 복수개의 마커가 다중 분석되게 하는 다른 기술이 당 업계에 공지되어 있다.
단순히 예시적인 실시 형태에 있어서, 본 방법은 (i) 환자로부터 세포 샘플을 수집하는 단계, (ii) 샘플 세포로부터 핵산 (예를 들어 게놈, mRNA 또는 이들 둘 모두)를 단리하는 단계, (iii) 이 핵산 샘플을 대립유전자의 혼성화 및 증폭이 일어나게 하는 조건 하에 IL-1 전염증성 일배체형의 하나 이상의 대립유전자의 5' 및 3'에 특이적으로 혼성화하는 하나 이상의 프라이머와 접촉시키는 단계, 및 (iv) 증폭 생성물을 검출하는 단계를 포함한다. 이 검출 방법은 특히 상기와 같은 분자가 매우 적은 갯수로 존재할 경우 핵산 분자의 검출에 유용하다.
본 분석법의 바람직한 실시 형태에 있어서, IL-1 전염증성 일배체형의 대립유전자는 제한 효소 절단 패턴에서의 변경에 의해 동정된다. 예를 들어 샘플 및 대조 DNA를 단리하고, (선택적으로) 증폭시키고, 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 로 절단하고, 단편의 길이 크기를 젤 전기영동법으로 결정한다.
또다른 실시 형태에 있어서, 당 업계에 공지된 다양한 서열 결정 반응 중 임의의 반응을 사용하여 대립유전자의 서열을 직접 결정할 수 있다. 예시적인 서열 결정 반응은 맥심 (Maxim)과 길버트 (Gilbert) (문헌 [(1977) Proc. Natl Acad Sci USA 74:560]) 또는 생어 (Sanger) (문헌 [Sanger et al (1977) Proc. Nat. Acad. Sci USA 74:5463])에 의해 개발된 기술에 기초한 것을 포함한다. 또한 질량 분광분석법 (예를 들어 PCT 공보 제WO94/16101호; 문헌 [Cohen et al. (1996) Adv Chromatogr 36:127-162]; 및 문헌 [Griffin et al. (1993) Appl Biochem Biotechnol 38:147-159] 참조)을 포함한 다양한 자동화 서열 결정 절차 중 임의의 것이 본 분석의 수행시 이용될 수 있다는 것도 고려된다. 특정의 실시 형태에 있어서, 단지 1개, 2개 또는 3개의 핵산 염기의 출현이 서열 결정 반응에서 결정될 필요가 있다는 것은 당 업계의 숙련자에게는 명백하다. 예를 들어 단지 1개의 핵산이 검출될 경우 예를 들어 A-트랙 (track) 등이 실시될 수 있다.
추가의 실시 형태에 있어서, 절단제 (예를 들어 뉴클레아제, 히드록실아민 또는 오스뮴 테트록사이드, 그리고 피페리딘을 이용)로부터의 보호를 이용하여 RNA/RNA 또는 RNA/DNA 또는 DNA/DNA 헤테로듀플렉스에서의 미스매칭 (mismatched) 염기를 검출할 수 있다 (문헌 [Myers, et al. (1985) Science 230:1242]). 일반적으로 "미스매치 절단"의 당 업계의 기술은 야생형 대립유전자를 포함하는 (표지된) RNA 또는 DNA를 샘플과 혼성화시킴으로써 형성되는 헤테로듀플렉스를 제공함으로써 출발한다. 이중 가닥 듀플렉스는 대조 가닥과 샘플 가닥 사이의 염기쌍 미스매치 로 인하여 존재하는 것과 같은 듀플렉스의 단일 가닥 영역을 절단하는 약제로 처리된다. 예를 들어 RNA/DNA 듀플렉스는 RNase로 처리하고 DNA/DNA 혼성체는 S1 뉴클레아제로 처리하여 미스매치 영역을 효소로 절단시킬 수 있다. 다른 실시 형태에 있어서, DNA/DNA 또는 RNA/DNA 듀플렉스는 미스매치 영역을 절단시키기 위하여 히드록실아민 또는 오스뮴 테트록사이드 및 피페리딘으로 처리될 수 있다. 미스매치 영역의 절단 후에 이어서 생성된 물질을 변성 폴리아크릴아마이드 젤 상에서 크기에 의해 분리하여 돌연변이 부위를 결정한다. 예를 들어 문헌 [Cotton et al (1988) Proc. Natl Acad Sci USA 85:4397]; 및 문헌 [Saleeba et al (1992) Methods Enzymol. 217:286] 참조. 바람직한 실시 형태에 있어서 대조 DNA 또는 RNA는 검출을 위하여 표지될 수 있다.
또다른 실시 형태에 있어서 미스매치 절단 반응에서는 이중 가닥 DNA에서의 미스매치 염기쌍을 인식하는 하나 이상의 단백질 (소위 "DNA 미스매치 복구" 효소)이 이용된다. 예를 들어 대장균 (E. coli)의 mutY 효소는 G/A 미스매치에서 A를 절단하며 HeLa 세포 유래의 티미딘 DNA 글리코실라제는 G/T 미스매치에서 T를 절단한다 (문헌 [Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662]). 예시적인 실시 형태에 따르면, IL-1 유전자좌 일배체형의 대립유전자에 기초한 프로브는 시험 세포(들) 유래의 cDNA 또는 기타 DNA 생성물에 혼성화한다. 듀플렉스는 DNA 미스매치 복구 효소로 처리되며 존재할 경우 절단 생성물은 전기영동 프로토콜 등으로부터 검출될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,459,039호 참조.
다른 실시 형태에 있어서, 전기영동상의 이동성의 변경을 이용하여 IL-1 유 전자좌 대립유전자를 동정한다. 예를 들어 단일 가닥 구조의 다형성 (single strand conformation polymorphism, SSCP)을 이용하여 돌연변이 핵산과 야생형 핵산 사이의 전기영동 상의 이동성 차이를 검출할 수 있다 (문헌 [Orita et al. (1989) Proc Nad. Acad. Sci USA 86:2766], 또한 문헌 [Cotton (1993) Mutat Res 285:125-144]; 및 문헌 [Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:73-79] 참조). 샘플 및 대조 IL-1 유전자좌 대립유전자의 단일 가닥 DNA 단편을 변성시키고 재생시킨다. 단일 가닥 핵산의 이차 구조는 서열에 따라 달라지며, 생성되는 전기영동 상의 이동성의 변경에 의해 심지어 단일 염기 변화도 검출할 수 있게 된다. DNA 단편은 표지된 프로브로 표지되거나 검출될 수 있다. 이 분석법의 감도는 (DNA보다는 차라리) 이차 구조가 서열 변화에 더욱 더 민감한 RNA의 사용에 의해 증강될 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 본 방법은 헤테로듀플렉스 분석법을 이용하여 전기영동 상의 이동성의 변화에 기초하여 이중 가닥 헤테로듀플렉스 분자를 분리한다 (문헌 [Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5]).
또다른 실시 형태에 있어서, 변성제 구배를 포함하는 폴리아크릴아마이드 젤에서의 대립유전자의 이동을 변성 구배 젤 전기영동법 (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)을 사용하여 분석한다 (문헌 [Myers et al. (1985) Nature 313:495]). DGGE가 분석 방법으로 사용될 경우, DNA는 예를 들어 PCR에 의해 대략 40 bp의 고용점의 GC-풍부 (rich) DNA의 GC 클램프를 부가함으로써 완전히 변성되지는 않는 것을 보증하기 위하여 변형된다. 추가의 실시 형태에 있어서, 온도 구배를 변성제 구배 대신 사용하여 대조 및 샘플 DNA의 이동성의 차이를 확인한다 ( 문헌 [Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys Chem 265:12753]).
다른 대립유전자 검출 기술의 예로는 선택적 올리고뉴클레오티드 혼성화법, 선택적 증폭법, 또는 선택적 프라이머 연장법을 들 수 있지만, 그에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어 공지된 돌연변이 또는 뉴클레오티드 차이 (예를 들어 대립유전자 변이체에서의 차이)가 중앙에 두어진 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조하고 이어서 단지 완벽한 매치가 발견될 경우에만 혼성화되는 조건 하에서 표적 DNA에 혼성화시킨다 (문헌 [Saiki et al. (1986) Nature 324:163]); 문헌 [Saiki et al (1989) Proc. Natl Acad. Sci USA 86:6230]). 이러한 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 혼성화 기술을 사용하여, 올리고뉴클레오티드가 PCR 증폭 표적 DNA에 혼성화할 경우 반응 당 하나의 돌연변이 또는 다형성 영역을 시험할 수 있거나, 올리고뉴클레오 혼성화 막에 부착되어 표지된 표적 DNA와 혼성화될 경우 다수의 상이한 돌연변이 또는 다형성 영역을 시험할 수 있다.
대안적으로는, 선택적 PCR 증폭법에 의존적인 대립유전자 특이적 증폭 기술을 본 발명과 함께 사용할 수 있다. 특이적 증폭용의 프라이머로 사용되는 올리고뉴클레오티드는, 적당한 조건 하에서 미스매치가 방해될 수 있거나 폴리머라제 연장을 감소시킬 수 있는 (증폭이 차별적인 혼성화에 의존적이도록) 분자의 중앙 (문헌 [Gibbs et al (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448]), 또는 하나의 프라이머의 3' 말단 끝에서 (문헌 [Prossner (1993) Tibtech 11:238] 목적하는 돌연변이 또는 다형성 영역을 소지할 수 있다. 또한 돌연변이 영역 내에 신규한 제한 효소 부위를 도입하여 절단에 기초한 검출을 창조하는 것이 바람직할 수 있다 (문헌 [Gasparini et al (1992) Mol. Cell Probes 6:1]). 특정 실시 형태에 있어서 증폭에 있어서 Taq 리가제를 사용하여 증폭을 또한 실시할 수 있음이 예상된다 (문헌 [Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189]). 이러한 경우에 있어서, 라이게이션은 5' 서열의 3' 말단에서 완벽한 매치가 존재할 경우에만 라이게이션이 일어나 증폭의 존재 또는 부재를 찾음으로써 특이적 부위에서 공지된 돌연변이의 존재를 검출하는 것이 가능해진다.
다른 실시 형태에 있어서, 대립유전자 변이체의 동정은 예를 들어 미국 특허 제4,998,617호 및 문헌 [Landegren, U. et al., (1988) Science 241:1077-1080]에 기술되어 있는 바와 같이 올리고뉴클레오티드 라이게이션 분석법 (oligonucleotide ligation assay, OLA)을 사용하여 실시한다. OLA 프로토콜에서는 표적의 단일 가닥의 인접 서열에 혼성화할 수 있도록 고안된 2개의 올리고뉴클레오티드가 사용된다. 이 올리고뉴클레오티드 중 하나는 예를 들어 바이오티닐화된 분리 마커에 결합되며, 다른 하나는 검출가능하게 표지된다. 정확한 상보성 서열이 표적 분자에서 발견될 경우, 올리고뉴클레오티드는 그의 말단이 인접하여 라이게이션 기질을 창조하도록 혼성화된다. 이어서 라이게이션에 의해 아비딘 또는 다른 바이오틴 리간드를 사용하여 표지 올리고뉴클레오티드가 회수되게 한다. 니커슨, 디.에이. (Nickerson, D. A.) 등은 PCR 및 OLA의 속성을 조합한 핵산 검출 분석법을 기술하였다 (문헌 [Nickerson, D. A. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8923-27]). 상기 방법에 있어서 PCR은 후에 OLA를 사용하여 검출되는 표적 DNA의 기하급수적인 증폭의 성취에 사용된다.
상기 OLA 방법에 기초한 여러 기술이 개발되었으며 IL-1 유전자좌 일배체형의 대립유전자의 검출에 사용될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,593,826호에는 3'-아미노기 및 5'-포스포릴화 올리고뉴클레오티드를 가지는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 포스포르아미데이트 결합을 가지는 콘주게이트를 형성하는 OLA가 개시되어 있다. 문헌 [Tobe et al. (1996) Nucleic Acids Res 24: 3 728]에 기술되어 있는 OLA의 다른 변이법에 있어서, PCR과 조합된 OLA에 의해 단일 마이크로타이터 웰에서 2개의 대립유전자가 분류되게 된다. 대립유전자-특이적 프라이머 각각을 독특한 합텐, 즉 디그옥시제닌 및 플루오레신으로 표시함으로써 각각의 OLA 반응물이 상이한 효소 리포터, 알칼라인 포스파타제 또는 양고추냉이 퍼옥시다제로 표지된 합텐 특이적 항체의 사용에 의해 검출될 수 있다. 상기 시스템에 의해 2가지의 상이한 색상을 생성하는 고 처리 포맷을 사용하여 2개의 대립유전자를 검출하게 된다.
본 발명의 다른 실시 형태는 재협착이 발병하기 쉬운 것을 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 키트는 IL-1 유전자좌 일배체형의 하나 이상의 대립유전자의 5' 및 3'에 혼성화하는 5' 및 3' 올리고뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. PCR 증폭 올리고뉴클레오티드는 후속되는 분석에 있어서 편리한 크기의 PCR 생성물을 생성하기 위하여 25 내지 2500개의 염기쌍만큼 떨어져서, 바람직하게는 약 100 내지 약 500개의 염기만큼 떨어져서 혼성화하여야 한다.
특히 바람직한 프라이머는 도 8-11에 기술되어 있는 뉴클레오티드 서열을 포 함한다. 본 발명의 방법에 의한 IL-1 다형성 대립유전자의 증폭 및 검출에 사용하기 위한 부가적인 올리고뉴클레오티드의 고안은 인간 IL-1 유전자좌를 포함하는 인간 염색체 2q13으로부터의 갱신된 서열 정보, 및 상기 유전자좌에 있어서 입수가능한 갱신된 인간 다형성 정보 둘 모두의 유용성에 의해 도움을 받는다. 예를 들어 IL-1A, IL-1B 및 IL-1RN의 DNA 서열이 각각 도 1 (젠뱅크 (GenBank) 접근 번호: X03 833), 도 2 (젠뱅크 접근 번호: X04500) 및 도 3 (젠뱅크 접근 번호: X64532)에 도시되어 있다. 상기 유전자에서의 인간 다형성의 검출에 적합한 프라이머는 상기 서열 정보 및 프라이머 서열의 고안 및 최적화에 있어서 당 업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 손쉽게 고안될 수 있다. 이러한 프라이머 서열의 최적의 고안은 예를 들어 구매가능한 프라이머 선택 프로그램, 예를 들어 Primer 2.1, Primer 3 또는 GeneFisher의 사용에 의해 성취될 수 있다 (문헌 [Nicklin M. H. J., Weith A. Duff G. W., "A Physical Map of the Region Encompassing the Human Interleukin-l.alpha., interleukin-lß, and Interleukin-1 Receptor Antagonist Genes" Genomics 19: 382 (1995)]; 문헌 [Nothwang H. G., et al. "Molecular Cloning of the Interleukin-1 gene Cluster: Construction of an Integrated YAC/PAC Contig and a partial transcriptional Map in the Region of Chromosome 2q13 Genomics 41:370 (1997)]; 문헌 [Clark, et al. (1986) Nucl. Acids. Res., 14:7897-7914]을 또한 참조 [공개된 정오표 (erratum)가 문헌 [Nucleic Acids Res., 15:868 (1987)] 및 URL http://www.gdb.org의 Genome Database (GDB) 프로젝트에서 나타남].)
키트에서의 사용에 있어서, 올리고뉴클레오티드는 합성 올리고뉴클레오티드, 제한 효소 단편, cDNA, 합성 펩티드 핵산 (peptide nucleic acid, PNA) 등과 같은 다양한 천연 및/또는 합성 조성물 중 임의의 것일 수 있다. 본 분석 키트 및 방법에서는 분석에서 동정을 용이하게 하는 표지된 올리고누클레오티드도 이용될 수 있다. 이용될 수 있는 표지의 예로는 방사성 표지, 효소, 형광 화합물, 스트렙타비딘, 아비딘, 바이오틴, 자성 부분, 금속 결합 부분, 항원 또는 항체 부분 등을 들 수 있다.
본 키트는 선택적으로 DNA 샘플링 수단도 포함할 수 있다. DNA 샘플링 수단은 당 업계의 숙련자에게 잘 알려져 있으며, 기재, 예를 들어 필터 페이퍼, AmpliCard.TM. (유니버시티 오브 셰필드, 영국 에스10 2제이에프 셰필드 소재; 문헌 [Tarlow, J W, et al., J of Invest. Dermatol. 103:387-389 (1994)]) 등; DNA 정제 시약, 예를 들어 Nucleon.TM. 키트, 용해 완충제, 프로티나제 용액 등; PCR 시약, 예를 들어 10x 반응 완충제, 열안정성 폴리머라제, dNTP 등; 및 대립유전자 검출 수단, 예를 들어 HinfI 제한 효소, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드, 건조 혈액으로부터의 네스티드 PCR을 위한 축중 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함할 수 있으나 그에 한정되는 것은 아니다.
4.4. 약물유전체학
특정 질환 또는 병의 발병에 대한 민감성과 관련된, 특정 질환 또는 병에 기여하는 다른 유전적 결함에 대한 정보와 함께이거나 단독인 특정 대립유전자에 대한 지식에 의해 "약물유전체학"의 목표인 개체의 유전적 프로필에 따른 예방 또는 치료의 맞춤이 가능해진다. 따라서, 혈관계 장애에 있어서의 개체의 IL-1 프로필과 집단 프로필과의 비교에 의해 특정 환자 또는 환자 집단 (즉, 유전자 변경이 동일한 환자 군)에 있어서 안전하며 유효할 것으로 기대되는 약물 또는 기타 치료적 섭생을 선택 또는 고안하게 된다.
또한 유전적 프로필에 기초하여 가장 큰 임상적 이득을 나타낼 것으로 기대되는 집단을 표적화하는 능력은 1) 이미 시판된 약물의 보존; 2) 환자 하위집단에 특이적인 안전성 또는 효능상의 제한성의 결과로 임상적 개발이 중단된 약물 후보의 구조; 및 3) 후보 치료제 및 더욱 최적의 약물 표지에 있어서 값이 덜 비싼 가속화된 개발 (예를 들어 원인이 되는 돌연변이에 대한 다양한 투여량의 약제의 영향의 측정이 유효량의 최적화에 유용하기 때문임)을 가능하게 할 수 있다.
특정 치료제를 이용한 개체의 치료는 단백질 (예를 들어 IL-1.알파., IL-1.베타., 또는 IL-1Ra), mRNA 및/또는 전사 수준의 측정에 의해 모니터링될 수 있다. 검출된 수준에 따라 치료적 섭생이 유지되거나 조정될 수 있다 (투여량에 있어서의 증가 또는 감소). 바람직한 실시 형태에 있어서, 약제를 이용한 대상의 유효한 치료는 (i) 약제의 투여 이전에 투여전 샘플을 대상으로부터 수득하는 단계; (ii) 투여전 샘플 중의 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 수준 또는 양을 검출하는 단계; (iii) 하나 이상의 투여 후 샘플을 대상으로부터 수득하는 단계; (iv) 투여후 샘플 중의 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 발현 수준 또는 활성을 검출하는 단계; (v) 투여전 샘플 중의 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 발현 또는 활성 수준을 각각 투여후 샘플 중의 상응하는 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA와 비교하는 단계; 및 (vi) 그에 따라 약제를 대상에게 투여하는 것을 변경하는 단계를 포함한다.
대상의 세포도 치료제의 투여 전후에 수득하여 IL-1 유전자 이외의 유전자의 발현 수준을 검출하여 치료제가 해로울 수 있는 유전자의 발현을 증가 또는 감소시키지 않는지를 증명할 수 있다. 이는, 예를 들어 전사 프로필화 방법의 이용에 의해 행해질 수 있다. 따라서 생체내에서 치료제에 노출된 세포로부터의 mRNA와 치료제에 노출되지 않은 동일한 유형의 세포로부터의 mRNA는 역전사되고 다수의 유전자로부터의 DNA를 포함하는 칩에 혼성화되어 치료제로 처리된 세포 및 치료제로 처리되지 않은 세포에서의 유전자의 발현이 비교될 수 있다.
4.5. IL-1 다형성과 관련된 질환 및 병의 치료제
IL-1 다형성 또는 일배체형과 관련된 질환 또는 병의 치료제는 대상에 있어서 특정 질환 또는 병의 증상의 발병을 예방 또는 지연시키거나 상기 증상을 완화시키는 임의의 약제 또는 치료적 섭생 (조제약, 기능성 식품 및 외과적 방법)을 나타낸다. 치료제는 폴리펩티드, 펩티도미메틱, 핵산 또는 기타 무기 또는 유기 분자, 바람직하게는 비타민, 미네랄 및 기타 영양소를 포함하는 "소분자"일 수 있다. 바람직하게는 치료제는 천연 폴리펩티드의 약효의 모방 또는 증가 (작용) 또는 억제 (길항)에 의해 IL-1 폴리펩티드의 하나 이상의 활성, 예를 들어 수용체와의 상호 작용을 조절할 수 있다. 작용제는 야생형 단백질 또는 야생형의 하나 이상의 생활성, 예를 들어 수용체 결합 활성을 가지는 그의 유도체일 수 있다. 작용제는 유전자의 발현을 상향조절하거나 하나 이상의 단백질 생활성을 증가시키는 화합물일 수도 있다. 또한 작용제는 폴리펩티드의 다른 분자, 예를 들어 수용체와의 상 호 작용을 증가시키는 화합물일 수 있다. 길항제는 단백질과 다른 분자, 예를 들어 수용체 사이의 상호 작용을 억제하거나 감소시키는 화합물 또는 시그널 전달 또는 번역후 프로세싱을 차단하는 약제 (예를 들어 IL-1 전환 효소 (ICE) 억제제)일 수 있다. 따라서 바람직한 길항제는 수용체에 결합하는 것을 억제 또는 감소시킴으로써 그 이후의 수용체 활성화를 차단하는 화합물이다. 길항제는 또한 유전자의 발현을 하향조절하거나 존재하는 단백질의 양을 감소시키는 화합물일 수 있다. 길항제는 우성의 네가티브 형태의 폴리펩티드, 예를 들어 표적 펩티드, 예를 들어 수용체와 상요작용할 수 있지만 이 수용체의 활성화는 촉진하지 못하는 형태의 폴리펩티드일 수 있다. 길항제는 또한 우성의 네가티브 형태의 폴리펩티드, 안티센스 핵산 또는 RNA와 특이적으로 상호 작용할 수 있는 리보자임일 수 있다. 또다른 길항제는 폴리펩티드에 결합하여 그의 작용을 억제하는 분자이다. 이러한 분자는 생물학적 활성을 가지지 않으며, 수용체에 결합하는 것을 억제하는 펩티드, 예를 들어 표적 펩티드 형태를 포함할 수 있다. 따라서, 이러한 펩티드는 단백질의 활성 부위에 결합하여 이 단백질이 표적 펩티드와 상호 작용하는 것을 방해한다. 또다른 길항제는 분자의 에피토프와 특이적으로 상호 작용하여 결합이 폴리펩티드의 생물학적 기능을 간섭하도록 하는 항체를 포함한다. 또다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 길항제는 폴리펩티드와 표적 수용체 사이의 상호 작용을 억제할 수 있는 분자와 같은 소분자이다. 대안적으로는 소분자는 수용체 결합 부위 이외의 부위와의 상호 작용에 의해 길항제로서 기능할 수 있다.
IL-1의 조절자 (예를 들어 IL-1.알파. 펩티드, IL-1.베타. 또는 IL-1 수용 체 길항제) 또는 IL-1 유전자와 연관 불균형 상태로 존재하는 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 단백질, 펩티드, 펩티도미메틱, 소분자, 또는 핵산을 포함하는 임의의 형태의 화합물을 포함할 수 있다. 바람직한 작용제는 핵산 (예를 들어 IL-1 단백질 또는 IL-1 단백질에 의해 상향 또는 하향 조절되는 유전자를 코딩함), 단백질 (예를 들어 IL-1 단백질 또는 그에 의해 상향 또는 하향 조절되는 단백질) 또는 소분자 (예를 들어 IL-1 단백질의 발현 또는 결합을 조절함)을 포함한다. 예를 들어 본 명세서에 기술된 분석법을 이용하여 동정될 수 있는 바람직한 길항제는 핵산 (예를 들어 단일 (안티센스) 또는 이중 가닥 (트라이플렉스 (triplex) DNA 또는 PNA 및 리보자임), 단백질 (예를 들어 항체) 및 IL-1 전사 및/또는 단백질 활성을 저해 또는 억제하는 작용을 하는 소분자를 포함한다.
4.6. 유효량 및 제형과 용도
이러한 화합물의 독성 및 치료 효능을 예를 들어 LD50 (집단의 50%에 대한 치사량) 및 Ed50 (집단의 50%에 있어서의 치료적 유효량)을 결정하기 위한 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준의 제약적 절차에 의해 측정될 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 투여량 비는 치료 인덱스이며 LD50/ED50의 비로 표현될 수 있다. 큰 치료 인덱스를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용되는 한, 영향을 받지 않은 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화함으로써 부작용을 감소시키기 위하여 영향을 받은 조직 부위에 상기 화합물을 표적화하는 전달 시스템의 고안에 주의하여야 한다.
세포 배양물 분석 및 동물 연구로부터 수득한 데이터를 인간에 있어서 사용하기 위한 투여량 범위의 공식화에 사용할 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없는, 또는 독성이 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 이내이다. 투여량은 이용되는 투여형과 이용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 이내에서 달라질 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 화합물에 있어서, 치료적 유효량은 처음에 세포 배양물 분석으로부터 추정할 수 있다. 투약량은 세포 배양물에서 결정된 IC50 (즉, 최대 증상 억제치의 절반이 성취되게 하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 성취하도록 동물 모델에서 공식화할 수 있다. 이러한 정보를 이용하여 인간에 있어서의 유용한 투약량을 정확하게 결정할 수 있다. 혈장 중 수준은 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피로 측정할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 사용하여 통상의 방식으로 제형화할 수 있다. 따라서 화합물 및 그의 생리학적으로 허용가능한 염과 용매화물은 예를 들어 주사, 흡입법 또는 통기법 ((입 또는 코를 통한)에 의하거나 경구, 구강, 비경구 또는 장 투여에 의한 투여를 위하여 제형화할 수 있다.
이러한 요법에 있어서 본 발명의 화합물은 전신 및 국소 또는 국부 투여를 포함하는 다양한 투여 로드를 위하여 제형화할 수 있다. 일반적으로 기술 및 제형은 문헌 [Remmington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, Pa]에서 찾아볼 수 있다. 전신 투여에 있어서는 근육내, 정맥내, 및 피하 주사를 포함하는 주사가 바람직하다. 주사에 있어서 본 발명의 화합물은 액체 용액, 바람직하게는 생리학적으로 상용성인 완충액, 예를 들어 행크액 (Hank's solution) 또는 링거액 (Ringer's solution) 중에 제형화될 수 있다. 또한 본 화합물은 고체 형태로 제형화되어사용 직전에 재용해 또는 현탁될 수 있다. 동결 건조된 형태도 포함된다.
경구 투여에 있어서는 본 조성물은 예를 들어 제약적으로 허용가능한 부형제, 예를 들어 결합제 (예를 들어 예비젤라틴화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전제 (예를 들어 락토스, 미정질 셀룰로오스 또는 인산수소칼슘); 윤활제 (예를 들어 스테아르산마그네슘, 활석 또는 실리카); 붕해제 (예를 들어 감자 전분 또는 소듐 스타치 글리콜레이트); 또는 습윤제 (예를 들어 소듐 라우릴 설페이트)를 이용하여 통상의 방법으로 제조되는 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 정제는 당 업계에 잘 알려진 방법으로 코팅될 수 있다. 경구 투여용의 액체 제제는 예를 들어 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있거나 사용 전에 물 또는 기타 적합한 비히클로 구성하기 위한 건조 제품으로 제시될 수 있다. 이러한 액체 제제는 제약적으로 허용가능한 첨가제, 예를 들어 현탁제 (예를 들어 소르비톨 시럽, 셀룰로오스 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 유화제 (예를 들어 레시틴 또는 아라비아 고무); 비수성 비히클 (예를 들어 아티온드유 (ationd oil), 유성 에스테르, 에틸 알콜 또는 분류된 식물유); 및 보존제 (예를 들어 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산)을 이용하여 통상 의 방법으로 제조될 수 있다. 이 제제는 적합할 경우 완충염, 착향제, 착색제 및 감미제를 또한 함유할 수 있다.
경구 투여용 제제는 활성 화합물의 방출이 제어되도록 적합하게 제형화될 수 있다. 구강 투여에 있어서 본 조성물은 통상적인 방식으로 제형화된 정제 또는 로젠지제의 형태를 취할 수 있다. 흡입에 의한 투여에 있어서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 편리하게는 적합한 추진제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 기체를 사용하여 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 제시물의 형태로 전달된다. 가압 에어로졸의 경우 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어 흡입체 또는 통기체에서 사용하기 위한, 본 화합물 및 적합한 분말 기재, 예를 들어 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 포함하는 젤라틴 캡슐 및 카트리지가 제형화될 수 있다.
본 화합물은 주사, 예를 들어 일시 주사 (bolus injection) 또는 연속 주입에 의해 비경구 투여를 위하여 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 보존제가 첨가된 단위 투여형, 예를 들어 앰풀 또는 다중 투여 용기의 형태로 제시될 수 있다. 본 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있으며 제형화제, 예를 들어 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로는 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어 무발열원 살균수로 구성하기 위한 분말 형태로 존재할 수 있다.
본 화합물은 예를 들어 통상의 좌약제 기재, 예를 들어 코코아 버터 또는 기 타 글리세라이드를 함유하는 직장용 조성물, 예를 들어 좌약제 또는 체류형 관장제로도 제형화될 수 있다.
전술한 제형 외에도, 본 화합물은 저장용 제제로도 제형화될 수 있다. 이러한 장기간 작용 제형은 이식 (예를 들어 피하 또는 근육내) 또는 근육내 주입에 의해 투여될 수 있다. 이와 같이 예를 들어 본 화합물은 적합한 중합체성 또는 소수성 재료 (예를 들어 허용가능한 오일 중 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지를 이용하여, 또는 잘 용해되지 않는 유도체, 예를 들어 잘 용해되지 않는 염으로서 제형화될 수 있다. 다른 적합한 전달 시스템은 장기간에 걸친 약물의 비침윤성 국소 전달의 가능성을 제공하는 미소구체를 포함한다. 이러한 기술에서는 염증 또는 허혈을 야기함이 없이 심장 또는 기타 기관의 임의의 선택된 부분 내로 관상 카테터를 통하여 주입될 수 있는 전모세관 크기의 미소구체가 이용된다. 투여된 치료제는 상기 미소구체로부터 서서히 방출되며 주위 조직 세포 (예를 들어 내피 세포)에 의해 섭취된다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피적 방법에 의한 것일 수 있다. 경점막 또는 경피 투여에 있어서 투과될 장ㅂ겨에 적당한 침투제가 제형에서 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 경점막 투여의 경우 담즙염 및 후시딕산 유도체를 포함한다. 또한 세제가 투과를 돕기 위하여 사용될 수 있다. 경점막 투여는 비강용 스프레이를 통한 것이거나 좌약제를 사용하는 것일 수 있다. 국소 투여에 있어서는, 본 발명의 올리고머는 당 업계에 일반적으로 공지된 연고, 고약, 젤, 또는 크림으로 제형화된다. 세척 용액이 상해 또는 염증의 치료를 위하여 국소적으로 사용되어 치유를 촉진할 수 있다.
본 조성물은 필요할 경우 활성 성분을 포함하는 하나 이상의 단위 투여형을 포함할 수 있는 팩 또는 디스펜서 장치에서 제시될 수 있다. 팩은 예를 들어 금속 또는 플라스틱 호일, 예를 들어 발포제 팩을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치에는 투여 설명서가 수반될 수 있다.
4.7. 치료제를 동정하기 위한 분석
IL-1 다형성 또는 일배체형과 관련된 질환 또는 장애의 발병을 야기하거나 상기 발병에 기여하는 돌연변이의 동정에 기초하여, 본 발명은 추가로 치료제의 동정을 위한 세포-기초 또는 무세포 분석법을 그 특징으로 한다. 하나의 실시 형태에 있어서, IL-1 수용체 또는 IL-1 유전자와 연관 불균형 상태인 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 수용체를 그의 세포막 외부 표면에서 발현하는 세포를 단독의 시험 화합물의 존재 하에 또는 시험 화합물과 다른 단백질의 존재 하에 인큐베이션시키고 시험 화합물과 수용체 사이 또는 단백질 (바람직하게는 태그된 단백질)과 수용체 사이의 상호 작용을 마이크로피지오미터 (microphysiometer)를 사용하여 검출한다 (문헌 [McConnell et al. (1992) Science 257:1906]). 수용체와 시험 화합물 또는 단백질 사이의 상호 작용은 배지의 산성화에 있어서의 변화로서 마이크로피지오미터에 의해 검출된다. 따라서 이러한 분석 시스템은 예를 들어 단백질-단백질 상호 작용의 간섭에 의해 기능하는 길항제 분자와, 예를 들어 수용체의 활성화에 의해 기능하는 작용제 분자의 동정 수단을 제공한다.
또한 세포 또는 무세포 분석법은 IL-1 유전자 또는 그와 연관 불균형 상태인 유전자의 발현을 조정하거나 mRNA의 번역을 조정하거나 mRNA 또는 단백질의 안정성을 조정하는 화합물의 동정에 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 실시 형태에 있어서 IL-1 또는 다른 단백질을 생성할 수 있는 세포를 시험 화합물과 인큐베이션시키고 세포 배지에 생성된 단백질의 양을 측정하여 시험 화합물과 접촉시키지 않은 세포로부터 생성된 단백질 양과 비교한다. 단백질과 비교한 화합물의 비특성은 예를 들어 하나 이상의 대조 유전자의 발현량을 측정하는 다양한 대조 분석에 의해 확인될 수 있다. 특히 이러한 분석법을 사용하여 안티센스, 리보자임 및 트리플렉스 화합물의 효능을 측정할 수 있다.
무세포 분석법을 사용하여 단백질과 상호 작용할 수 있는 화합물을 동정함으로써 단백질의 활성을 변형시킬 수 있다. 이러한 화합물은 예를 들어 단백질의 구조를 변형시킴으로써 수용체에 결합하는 그의 능력에 영향을 줄 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서 이러한 화합물의 동정을 위한 무세포 분석법은 본질적으로는 결합 파트너의 존재 또는 부재 하에 단백질 및 시험 화합물 또는 시험 화합물 라이브러리를 포함하는 반응 혼합물로 구성된다. 시험 화합물은 예를 들어 결합 파트너의 유도체, 예를 들어 생물학적으로 불활성인 표적 펩티드, 또는 소분자일 수 있다.
따라서 하나의 예시적인 본 발명의 스크리닝 분석법은 단백질 또는 그의 기능적 단편을 시험 화합물 또는 시험 화합물 라이브러리와 접촉시키는 단계 및 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함한다. 검출 목적에 있어서는, 본 분자는 특정 마커로 표지될 수 있으며 시험 화합물 또는 시험 화합물 라이브러리는 상이한 마커 로 표지될 수 있다. 이어서 시험 화합물과 단백질 또는 그의 단편과의 상호 작용은 인큐베이션 단계 및 세척 단계 후에 2개의 표지의 수준을 측정함으로써 검출될 수 있다. 세척 단계 후의 2개의 표지의 존재는 상호 작용을 암시하는 것이다.
분자들 사이의 상호 작용은 광학 현상인 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance, SPR)을 검출하는 실시간 BIA (Biomolecular Interaction Analysis, Pharmacia Biosensor AB)의 사용에 의해 또한 확인될 수 있다. 검출은 생물특이적 경계면에서의 거대분자의 질량 농도의 변화에 의존적이며 상호 작용체의 표지를 필요로 하지 않는다. 하나의 실시 형태에 있어서, 시험 화합물 라이브러리는 센서 표면, 예를 들어 미세-흐름 셀의 하나의 벽을 형성하는 센서 표면 상에 고정화될 수 있다. 이어서 단백질 또는 그의 기능적 단편을 포함하는 용액을 센서 표면 위로 연속적으로 흘려보낸다. 시그널 기록 상에 나타나는 공명 각에서의 변화는 상호 작용이 일어났음을 나타낸다. 이러한 기술은 예를 들어 Pharmacia사의 BIAtechnology Handbook에 더 기술되어 있다.
본 발명의 다른 예시적인 스크리닝 분석법은 (a) (i) IL-1 또는 기타 단백질, (ii) 적당한 수용체, 및 (iii) 시험 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계; 및 (b) 단백질과 수용체의 상호 작용을 검출하는 단계를 포함한다.
시험 화합물의 부재 하에서의 상호 작용과 비교하여 시험 화합물의 존재 하에서의 단백질과 수용체의 상호 작용에 있어서의 통계학적으로 유의한 변화 (강화 또는 억제)는 잠재적인 길항제 (억제제)를 나타낸다. 본 분석법의 화합물들은 동시에 접촉될 수 있다. 대안적으로는, 단백질은 먼저 적당한 시간양 동안 시험 화 합물과 접촉시키고, 이어서 수용체를 반응 혼합물에 첨가할 수 있다. 본 화합물의 효능은 다양한 농도의 시험 화합물을 사용하여 수득된 데이터로부터 투여량 응답 곡선을 생성함으로써 평가될 수 있다. 또한, 대조 분석은 비교를 위한 기준선의 제공을 위하여 수행될 수도 있다.
단백질과 수용체 사이의 복합체 형성은 다양한 기술로 검출할 수 있다. 복합체 형성의 조정은 예를 들어 검출가능하게 표지된 단백질, 예를 들어 방사성 동위원소로 표지되거나, 형광성이 되도록 표지되거나, 또는 효소에 의해 표지된 단백질 또는 수용체를 사용하거나 면역 분석법에 의하거나 크로마토그래피에 의한 검출에 의해 정량화될 수 있다.
일반적으로 단백질 또는 수용체를 고정화하여 하나 또는 둘 모두의 단백질의 비목합화 형태로부터의 복합체의 분리를 돕고 분석의 자동화를 도모하는 것이 바람직하다. 단백질 및 수용체의 결합은 반응물을 포함하기에 적합한 임의의 용기에서 이루어질 수 있다. 그 예로는 마이크로타이터 플레이트, 시험관, 및 마이크로-원심분리관을 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 단백질이 매트릭스에 결합되게 하는 도메인이 부가된 융합 단백질이 제공될 수 있다. 예를 들어 글루타치온-S-트랜스퍼라제 융합 단백질이 글루타치온 세파로스 비드 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma Chemical사제) 또는 글루타치온 유도화 마이크로타이터 플레이트 상에 흡착될 수 있으며, 이어서 이것은 수용체, 예를 들어 35S-표지 수용체와 조합되며, 약간의 더욱 엄격한 조건이 요망될 수 있기는 하지만 예를 들어 염 및 pH에 있어서 생리학적 조건에서 복합체 형성에 전도성인 조건 하에 시험 화합물, 및 혼합물을 인큐베이션한다. 인큐베이션 후, 비드를 세척하여 모든 미결합 표지를 제거하고, 후속적으로 복합체를 해리시킨 후 상청액 중에서 또는 직접 (예를 들어 섬광기에 둔 비드) 방사성 동위원소 표지를 측정한다. 대안적으로는 복합체를 매트릭스로부터 해리시키고 SDS-PAGE로 분리시키고, 비드 분획물에서 발견되는 단백질 또는 수용체의 수준을 첨부된 실시예에 기술한 바와 같은 표준 전기영동 기술을 이용하여 젤로부터 정량화한다. 매트릭스에 단백질을 고정화하는 다른 기술도 본 분석법에서 사용하기 위해 이용가능하다. 예를 들어 단백질 또는 수용체는 바이오틴 및 스트렙타비딘의 콘쥬게이션을 이용하여 고정화할 수 있다. 트랜스제닉 동물을 작용제 및 길항제의 동정 또는 후보 치료제의 안전성 및 효능의 확인을 위하여 또한 만들 수 있다. 본 발명의 트랜스제닉 동물은 적당한 내인성 프로모터의 제어 하에 또는 이종성 프로모터의 제어 하에 재협착을 야기하는 돌연변이를 포함하는 비인간 동물을 포함할 수 있다.
트랜스제닉 동물은 적당한 프로모터 또는 그의 단편의 제어 하에 트랜스진, 예를 들어 리포터 유전자를 포함하는 동물일 수도 있다. 이러한 동물은 예를 들어 유전자 발현의 조정에 의해 IL-1 단백질의 생성을 조정하는 약물의 동정에 유용하다. 비인간 트랜스제닉 동물을 수득하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서 재협착을 야기하는 돌연변이의 발현은 예를 들어 원하는 패턴으로 발현을 제어하는 시스-작용 서열을 이용하는 특정 서브세트의 세포, 조직 또는 발달 단계에 한정된다. 본 발명에 있어서, 이러한 모자이크성 단백질 발현은 다수의 형태의 계통 분석에 필수적이며 부가적으로 예를 들어 그렇지 않을 경우에는 정상인 배아 내에서 작은 조직 패치에서 발달을 총체적으로 변경시킬 수 있는 발현 수준의 영향을 평가하는 수단을 제공할 수 있다. 이 때문에 조직-특이적 조절 서열 및 조건부의 조절 서열이 특정의 공간 패턴에서의 돌연변이의 발현의 제어에 사용될 수 있다. 또한 일시적인 발현 패턴이 예를 들어 조건부의 재조합 시스템 또는 원핵 생물 전사 조절 서열에 의해 제공될 수 있다. 생체 내에서 부위-특이적인 유전자 조작을 통하여 돌연변이가 발현이 조절될 수 있게 하는 유전적 기술은 당 업계의 숙련자에게 공지되어 있다.
본 발명의 트랜스제닉 동물은 모두 ㅂ고수개의 그의 세포 내에 본 발명의 돌연변이 야기 트랜스진을 포함하는데, 트랜스진은 "숙주 세포"의 표현형을 변경시킨다. 예시적 실시 형태에 있어서, 박테리오파지 P1의 cre/loxP 리콤비나제 시스템 (문헌 [Lakso et al. (1992) PNAS 89:6232-6236]; 문헌 [Orban et al. (1992) 15 PNAS 89:6861-6865]) 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 FLP 리콤비나제 시스템 (문헌 [O'Gorman et al. (1991) Science 251:1351-1355]; PCT 공보 제WO92/15694호)은 생체내 부위-특이적인 유전자 재조합 시스템의 생성에 사용될 수 있다. Cre 리콤비나제는 loxP 서열 사이에 위치하는 개재 표적 서열의 부위-특이적 재조합을 촉매한다. loxP 서열은 Cre 리콤비나제가 결합하며 Cre 리콤비나제 매개 유전자 재조합에 필요한 34개의 염기쌍의 뉴클레오티드 반복 서열이다. loxP 서열의 배향은 Cre 리콤비나제가 존재할 경우 개재 표적 서열이 절제되는지 또는 역위되는지를 결정하여 (문헌 [Abremski et al. (1984) J Biol. Chem. 259:1509-1514]); loxP 서열이 직접적인 반복체로 배향되어 있을 경우 표적 서열의 절제를 촉매하며 loxP 서열이 역위 반복체로 배향되어 있는 경우 표적 서열의 역위를 촉매한다.
따라서 표적 서열의 유전자 재조합은 Cre 리콤비나제의 발현에 의존적이다. 리콤비나제의 발현은 조절적으로 제어되는, 예를 들어 외부에서 첨가되는 약제에 의해 조직-특이적으로, 발달기 특이적으로 유도될 수 있거나 억제될 수 있는 프로모터 요소에 의해 조절될 수 있다. 이러한 조절된 제어는 단지 리콤비나제 발현이 상기 프로모터 요소에 의해 매개되는 세포에서만 표적 서열의 유전자 재조합으로 이어진다. 따라서 돌연변이를 야기하는 트랜스진의 발현의 활성화는 리콤비나제 발현의 제어를 통하여 조절될 수 있다.
돌연변이을 야기하는 트랜스진의 발현을 조절하는 cre/loxP 리콤비나제 시스템의 사용은 Cre 리콤비나제 및 본 단백질 둘 모두를 코딩하는 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 동물의 작제를 필요로 한다. Cre 리콤비나제 및 재협착을 야기하는 돌연변이 트랜스진 둘 모두를 포함하는 동물이 "이중" 트랜스제닉 동물의 작제를 통하여 제공될 수 있다. 이러한 동물을 제공하는 편리한 방법은 각각이 트랜스진을 포함하는 두 트랜스제닉 동물을 교배시키는 것이다.
유사한 조건부 트랜스진이 트랜스진의 발현을 돕기 위하여 동시에 발현될 원핵 생물 단백질을 필요로 하는 원핵 생물 프로모터 서열을 사용하여 제공될 수 있다. 예시적 프로모터 및 상응하는 트랜스-활성화 원핵 생물 단백질이 미국 특허 제4,833,080호에 주어져 있다.
또한 조건부 트랜스진의 발현은 트랜스활성화 단백질, 예를 들어 리콤비나제 또는 원핵 생물 단백질을 코딩하는 유전자가 조직에 전달되어 세포 형태에 특이적인 방식과 같은 방식으로 발현되게 되는 유전자 요법과 유사한 방법에 의해 유도될 수 있다. 이 방법에 의해 트랜스진은 트랜스활성자의 도입에 의해 "턴 온 (turned on)"시까지 성체에서 여전히 침묵성일 수 있다.
예시적 실시 형태에 있어서, 본 발명의 "비인간 트랜스제닉 동물"은 비인간 동물의 생식 세포 내로의 트랜스진의 도입에 의해 제조된다. 다양한 발달기의 표적 배아 세포가 트랜스진의 도입을 위하여 사용된다. 다른 방법이 표적 배아 세포의 발달기에 따라 사용된다. 본 발명의 실시에 사용되는 임의의 특정 동물주(들)가 종합적인 양호한 건강, 우수한 배아 수율, 배아에서의 우수한 전핵 가시성, 및 우수한 생식 적합성에 대하여 선택된다. 또한 일배체형은 소중한 인자이다. 예를 들어 트랜스제닉 생쥐를 생성할 경우, C57BUJ6 또는 FVB 계열과 같은 주가 종종 사용된다 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, Me.). 바람직한 주는 H.sup.b, H-2.sup.d 또는 H-2.sup.q 일배체형, 예를 들어 C57BL/6 또는 DBA/1을 포함하는 것이다. 본 발명의 실시에 사용되는 계열(들)은 그 자신이 트랜스제닉 계열일 수 있고/있거나 넉아웃일 수 있다 (즉, 부분적으로 또는 완전히 억제된 하나 이상의 유전자를 가지는 동물로부터 수득됨).
하나의 실시 형태에 있어서, 트랜스진 작제물은 단일기의 배아 내로 도입된다. 접합체는 미세주입에 있어서의 가장 우수한 표적이다. 생쥐에 있어서 웅성 전핵은 1-2 pl의 DNA 용액이 재현가능하게 주입되게 하는 직경 면에서 대략 20 마 이크로미터의 크기에 이른다. 유전자 이전을 위한 표적으로 접합체를 사용하면 대부분의 경우 주입된 DNA가 첫번째 난할 전에 숙주 유전자 내로 혼입된다는 점에서 주요 잇점이 있다 (문헌 [Brinster et al. (1985) PNAS 82:443 8-4442]). 그 결과, 트랜스제닉 동물의 모든 세포는 혼입된 트랜스진을 지닌다. 이는 일반적으로 창설자의 자손에게 트랜스진을 효율적으로 전하는 데에도 반영되는데, 이는 배아 세포의 50%에 트랜스진이 잠복하고 있기 때문이다.
보통은 수정된 배아는 전핵이 나타날 때적합한 배지에서 인큐베이션된다. 대략 이때에 트랜스진을 포함하는 뉴클레오티드 서열이 하기하는 바와 같이 자성 또는 웅성 전핵 내로 도입된다. 생쥐와 같은 일부 종에 있어서 웅성 전핵이 바람ㅈ기하다. 외인성 유전 물질이 난자 핵 또는 접합체 자성 전핵에 의한 프로세싱 이전에 접합체의 웅성 DNA 상보체에 부가되는 것이 가장 바람직하다. 난소 핵 또는 자성 전핵은 아마도 웅성 DNA의 프로타민을 히스톤으로 대체함으로써 웅성 DNA 상보체에 영향을 주는 분자를 방출하여 자성 및 웅성 DNA 상보체의 조합을 도와 배수 접합체를 형성하는 것으로 생각된다. 따라서 외인성 유전 물질을 자성 전핵에 의해 영향을 받기 이전에 DNA의 웅성 상보체 또는 임의의 다른 DNA 상보체에 부가하는 것이 바람직하다. 예를 들어 외인성 유전 물질은 웅성 및 자성 전핵이 잘 분리되어 둘 모두가 세포 막에 인접하여 위치하는 경우인 웅성 전핵의 형성 후 가능한 한 빨리 초기 웅성 전핵에 부가된다. 대안적으로는 외인성 유전 물질은 탈축합되도록 유도된 후 정자의 핵에 부가될 수 있다. 이어서 외인성 유전 물질을 포함하는 정자는 난자에 부가될 수 있거나 탈축합된 정자는 난자에 부가될 수 있는데 트랜스진 작제물은 가능한 한 빨리 그 후에 부가된다.
트랜스진 뉴클레오티드 서열의 배아 내로의 도입은 예를 들어 미세주입법, 전기천공법, 또는 리포펙션 (lipofection)과 같은 당 업계에 공지된 임의의 방법으로 성취될 수 있다. 트랜스진 뉴클레오티드 서열의 배아 내로의 도입에 이어, 배아를 다양한 시간양 동안 시험관내에서 인큐베이션시키거나, 대리체 수주 내로 재이식시키거나 이 둘 모두를 행할 수 있다. 시험관내에서 인큐베이션하여 성숙시키는 것은 본 발명의 범주 이내이다. 한가지 일반적인 방법은 종에 따라 약 1-7일 동안 시험관 내에서 배아를 배양하고, 이어서 배아를 대리체 숙주 내로 재이식하는 것이다.
본 발명의 목적에 있어서 접합체는 본질적으로 완전한 유기체로 발달할 수 있는 이배체 세포 형성체이다. 일반적으로 접합체는 배우자(들)로부터 2개의 일베체 해의 융합에 의해 자연적으로 또는 인공적으로 형성된 핵을 포함하는 난세포로 이루어진다. 따라서 배우자 핵은 자연적으로 양립할 수 있는 것, 즉, 분화할 수 있고 기능성 유기체로 발달할 수 있는 생육성 접합체를 생성하는 것이어야 한다. 일반적으로 정배수체 접합체가 바람직하다. 홀배수체 접합체가 수득되면 염색체의 갯수는 배우자가 유래하는 유기체의 정배수체 갯수와 관련하여 하나보다 크게 달라서는 아니된다.
유사한 생물학적 고려 사항 외에도, 물리적인 것이 접합체의 핵 또는 접합체 액의 일부를 형성하는 유전 물질에 부가될 수 있는 외인성 유전 물질의 양 (예를 들어 부피)을 또한 지배한다. 유전 물질이 전혀 제거되지 않으면 부가될 수 있는 외인성 유전 물질의 양은 물리적으로 붕괴됨이 없이 흡수되는 양에 의해 제한된다. 일반적으로 삽입되는 외인성 유전 물질의 부피는 약 10 피코리터를 초과하지 않는다. 물리적인 부가 효과는 접합체의 생육성을 물리적으로 파괴할 정도로 커서는 아니된다. DNA 서열의 갯수 및 다양성의 생물학적 제한 사항은 특정 접합체 및 외인성 유전 물질의 기능에 따라 달라지며 당 업계의 숙련자에게는 자명할 것인데, 이는 외인성 유전물질을 포함하여 생성된 접합체의 유전 물질은 생물학적으로 분화 및 접합체의 기능적 유기체로의 발달을 개시 및 유지할 수 있어야 하기 때문이다.
접합체에 부가되는 트랜스진 작제물의 카피수는 부가되는 외인성 유전 물질의 총 양에 의존적이며 유전자 형질전환이 일어나도록 할 수 있는 양이다. 이론적으로는 단지 하나의 카피가 필요하지만, 일반적으로는 예를 들어 하나의 카피가 기능성이 되게 하는 것을 보증하기 위하여 다수의 카피, 예를 들어 1,000-20,000카피의 트랜스진 작제물이 이용된다. 본 발명과 관련해서는, 외인성 DNA 서열의 표현형 발현의 증강을 위하여 삽입된 외인성 DNA 서열 각각의 하나보다 많은 기능성 카피를 가지는 것이 종종 유익하다.
세포, 핵막 또는 기타의 존재하는 세포 또는 유전자 구조에 대하여 해를 끼치지 않는 한 외인성 유전 물질을 핵 유전자 물질 내로 부가되게 하는 임의의 기술이 이용될 수 있다. 외인성 유전 물질은 미세주입법에 의해 우선적으로 핵 유전 물질 내로 삽입된다. 세포 및 세포 구조의 미세주입은 공지되어 있으며 당 업계에서 이용된다.
재이식은 표준 방법을 사용하여 성취된다. 일반적으로 대리체 숙주를 마취 시키고, 배아를 난관 내로 삽입한다. 특정 숙주 내로 이식되는 배아의 갯수는 종에 따라 다르지만, 일반적으로는 이 종이 자연적으로 생산하는 자손의 갯수에 필적한다.
임의의 적합한 방법으로 대리체 숙주의 트랜스제닉 자손에 있어서 트랜스진의 존재 및/또는 발현을 스크리닝할 수 있다. 스크리닝은 종종 적어도 일부의 트랜스진에 상보성인 프로브를 사용하여 서던 블롯 또는 노던 블롯 분석으로 성취된다. 트랜스진에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에서는 트랜스진 생성물의 존재에 대한 대안적이거나 부가적인 스크리닝 방법으로서 이용될 수 있다. 일반적으로 DNA는 꼬리 조직으로부터 제조되며 서던 분석 또는 PCR로 트랜스진에 대하여 분석된다. 대안적으로는 임의의 조직 또는 세포 유형이 본 분석에서 사용될 수 있기는 하지만 가장 높은 수준으로 트랜스진을 발현할 것으로 생각되는 조직 또는 세포에 있어서 트랜스진의 존재 및 발현을 시험한다.
트랜스진의 존재를 평가하는 대안적이거나 부가적인 방법은 제한됨이 없이 적합한 생화학적 분석법, 예를 들어 효소 및/또는 면역학적 분석법, 특정 마커 또는 효소 활성에 있어서의 조직학적 착색, 유세포 계측 분석법 등을 포함한다. 혈액의 분석이 혈액 중의 트랜스진 생성물의 존재의 검출과, 다양한 형태의 혈액 세포 및 기타 혈액 구성물의 수준에 대한 트랜스진의 영향의 평가에 또한 유용할 수 있다.
트랜스제닉 동물의 자손은 트랜스제닉 동물과 적합한 파트너와의 교배, 또는 트랜스제닉 동물로부터 수득되는 난자 및/또는 정자의 시험관내 수정에 의해 수득 될 수 있다. 파트너와의 교배가 수행될 경우, 파트너는 트랜스제닉 및/또는 넉아웃일 수 있거나 트랜스제닉 및/또는 넉아웃일 수 없는데, 파트너가 트랜스제닉일 경우 파트너는 동일하거나 상이한 트랜스진을 포함할 수 있거나 둘 모두를 포함할 수 있다. 대안적으로는, 파트너는 부모계일 수 있다. 시험관내 수정법이 사용될 경우, 수정된 배아는 대리체 숙주 내로 이식되거나 시험관내에서 인큐베이션되거나 둘 모두일 수 있다. 상기 방법 또는 기타 적당한 방법의 사용에 의해 어느 하나의 방법을 사용하여 자손에 있어서 트랜스진의 존재를 평가할 수 있다.
본 발명에 따라 생성된 트랜스제닉 동물은 외인성 유전 물질을 포함한다. 또한 이러한 실시 형태에 있어서 이 서열은 바람직하게는 특정 유형의 세포에서 트랜스진 생성물이 발현되게 하는 전사 제어 요소, 예를 들어 프로모터에 부착된다.
레트로바이러스 감염을 비인간 동물 내로의 트랜스진의 도입에 또한 사용할 수 있다. 발달 중인 비인간 배아를 시험관내에서 배반포기로 배양할 수 있다. 상기 시간 동안 난할구가 레트로바이러스 감염의 표적일 수 있다 (문헌 [Jaenich, R. (1976) PNAS 73:1260-1264]). 효율적인 난할구 감염은 투명대의 제거를 위한 효소 처리에 의해 수득된다 (문헌 [Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986]). 트랜스진의 도입에 사용되는 바이러스 벡터 시스템은 일반적으로 트랜스진을 보유하는 복제-결함성 레트로바이러스이다 (문헌 [Jahner et al. (1985) PNAS 82:6927-6931]; 문헌 [Van der Putten et al. (1985) PNAS 82:6148-6152]). 트랜스펙션은 단일층의 바이러스 생성 세포 상에서 난할구를 배양함으로써 용이하게, 그리고 효율적으로 수득된다 ( 문헌 [Van der Putten, supra]; 문헌 [Stewart et al. (1987) EMBO J 6:383-388]). 대안적으로는, 감염은 후기에 수행될 수 있다. 바이러스 또는 바이러스 생성 세포는 난할구 내로 주입될 수 있다 (문헌 [Jahner et al. (1982) Nature 298:623-628]). 대부분의 창설자는 트랜스진에 대하여 모자이크성인데 이는 혼입이 단지 트랜스제닉 비인간 동물을 형성하는 세포의 서브세트에서만 일어나기 때문이다. 또한, 창설자는 일반적으로 자손에서 분리되는 게놈에 있어서 상이한 위치에서 트랜스진의 다양한 레트로바이러스 삽입을 포함할 수 있다. 또한, 임신중기의 배아의 자궁내 레트로바이러스 감염에 의해 트랜스진을 생식 세포 내로 도입하는 것도 가능하다 (문헌 [Jahner et al. (1982) supra]).
트랜스진 도입을 위한 세번째 표적 세포 유형은 배아 줄기 세포 (ES)이다. ES 세포는 시험관내에서 배양되며 배아와 융합되는 예비이식 배아로부터 수득된다 (문헌 [Evans et al. (1981) Nature 292:154-156]; 문헌 [Bradley et al. (1984) Nature 309:255-258]; 문헌 [Gossler et al. (1986) PNAS 83:9065-9069]; 및 문헌 [Robertson et al. (1986) Nature 322:445-448]). 트랜스진은 DNA 트랜스펙션 또는 레트로바이러스 매개 트랜스펙션에 의해 ES 세포 내로 효율적으로 도입될 수 있다. 이러한 형질전환 ES 세포는 그 후 비인간 동물 유래의 배반포와 조합될 수 있다. 그 후 ES 세포에는 배아가 이식되며 ES 세포는 생성되는 키메라 동물의 생식 세포에 기여한다. 개관을 위해서는 문헌 [Jaenisch, R. (1988) Science 240:1468-1474] 참조. 본 발명은 어떠한 방식으로든 제한적인 것으로 파악되어서는 아니되는 하기 실시예로 더욱 예시된다. 모든 인용된 참고 문헌 (본 명세서 전반에 걸쳐 인용된 문헌의 참고 문헌, 허여된 특허, 공개된 특허 출원을 포함함)의 내용은 본 명세서에 특별히 참고로 인용되어 있다. 본 발명의 실시에서는, 달리 나타내지 않는 한, 당 업계의 기능 이내인 통상적인 기술이 이용된다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어 문헌 [Molecular Cloning A Laboratory Manual, (2nd ed., Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)]; 문헌 [DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985)]; 문헌 [Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984)]; 미국 특허 제41.683,195호; 미국 특허 제4,683,202호; 및 문헌 [Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds., 1984)] 참조.
도 1은 IL-1 유전자 집단 유전자좌 도처의 대표적인 SNP의 연관 불균형을 개략적으로 나타낸다.
도 2 (A 및 B)는 IL-1 유전자 집단 도처의 대표적인 SNP의 연관 불균형의 대표적인 정량적인 값 (D' 값은 사선 아래에 나타냄) 및 그의 통계학적 유의성 (1-p 값은 사선 위에 나타냄)을 도시한다.
도 3 (A 및 B)은 IL-1 일배체형 패턴 1 (hap 1)의 SNP의 조직 (T-T-C = 2_2_1)을 도시한다.
도 4 (A 및 B)는 IL-1 일배체형 패턴 2 (hap 2)의 SNP의 조직 (G-C-T = 1_1_2)을 도시한다.
도 5 (A 및 B)는 IL-1 일배체형 패턴 3 (hap 3)의 SNP의 조직 (G-C-C) = 1_1_1)을 도시한다.
도 6 (A 및 B)은 IL-1 일배체형 패턴 4 (hap 4)의 SNP의 조직 (C-C-C = 1_1_1)을 도시한다.
도 7 (A 및 B)은 강력한 연관 불균형 상태로 존재하며 LD 표에 구체적으로 포함되어 있지 않은 SNP를 도시한다.
도 8은 IL-1A 유전자 다형성의 아이덴티티 및 위치를 도시한다.
도 9는 IL-1B 유전자 다형성의 아이덴티티 및 위치를 도시한다.
도 10 (A 및 B)은 IL-1 RNic 유전자 다형성의 아이덴티티 및 위치를 도시한다.
도 11은 IL-1 RNsec 유전자 다형성의 아이덴티티 및 위치를 도시한다.
도 12는 IL-1α 변이체의 칼파인 (calpain) 프로테아제에 의한 절단에서의 상이성이 IL-1A +4845의 대립유전자 1 및 2에 상응한다는 것을 도시한다.
도 13은 IL-1 +4845의 대립유전자 1 및 대립유전자 2 변이체를 발현하는 벡터로 안정하게 트랜스펙션된 섬유아세포의 증식 속도를 도시한다.
도 14 (A 및 B)는 IL-1A SNP 작제물의 유전형 (A) 및 섬유아 세포계에서의 선발된 리포터의 활성 (B)을 도시한다.
도 15 (A, B, C, 및 D)는 IL-1B SNP 작제물의 유전형 (A) 및 섬유아 세포계에서의 선발된 리포터의 활성 (B)과; 14 및 15 위치에서 나타나는 대립유전자 2를 포함하는 다른 세트의 IL-1B 작제물의 유전형 (C) 및 섬유아 세포주에서의 선발된 리포터의 활성 (D)을 도시한다.
도 16 (A 및 B)은 IL-1RN SNP 작제물 (A) 및 섬유아 세포계에서의 선발된 리포터의 활성 (B)을 도시한다.
도 17은 IL-1 유전자 집단의 지도를 도시하며, 규모 막대 (kb 단위)가 정렬을 돕기 위하여 데이터 위 및 아래에 제공되어 있다.
도 18 (A-G)은 공지된 10가지의 IL-1 패밀리의 구성원의 3개의 공통 엑손의 코딩 서열의 정렬을 도시한다.
도 19는 IL-1 유전자 집단 내의 선발된 다형성 마커의 지도상의 위치를 도시한다.
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시 형태를 더욱 지지하지만 배타적으로 그를 대표하는 것은 아니다.
실시예 1: IL-1 유전자좌 지도화 및 특징화
IL-1 폴드를 가지는 단백질을 코딩하는 6개의 신규한 유전자를 동정하였다. 고전적인 패밀리는 염증성 시그널링에 연루되어 있다. 클론 기초의 방사성 혼성체 지도화에 의해 2번 염색체 상에서 ~400 kb 간격으로 3개의 원래의 유전자 패밀리 구성원 (IL1A, IL1B, IL1RN)으로서 동일한 유전자 집단에 근접하여 또는 동일한 유전자 집단 이내에 모든 6개의 신규한 유전자가 두어졌다. 본 발명자들은 불완전한 대중적 데이터베이스 서열을 본 발명자들 자신의 서열과 조합하여 대조 서열 및 모든 신규한 유전자를 포함하는 지도를 생성하여 유전자의 구조를 결정하고, 엑손을 정확하게 위치화하며 종래의 SNP와 미세위성 (microsatellite) 마커 사이의 거리를 결정하였다. 중심립 (centromere)에서 말단소립 (telomere)까지의 유전자 순서는 IL1A-IL1B-IL1F7-IL1F9-IL1F6-IL1F8-IL1F5-IL1F1O-IL1RN인데, IL1A, IL1B 및 IL1F8은 단지 중심립을 향하여 전사된다. 유전자 순서는 유전자들 사이의 진화 관계에 관련된다. 엑손 경계의 중요한 특징은 보존되어 있다. 유전자 집단 내의 다른 IL-1 패밀리 구성원에 있어서의 증거는 전혀 존재하지 않는다.
최근에는 IL-1 수용체 관련 단백질 2 (IL-1Rrp2, 유전자 IL1RL2)로 공지된 IL-1R1에 가장 밀접하게 관련된 수용체가 트랜스펙션된 세포 상의 IL-1F9에 응답성을 부여하며 응답은 가장 밀접하게 IL-1ra를 닮은 IL-1F5에 의해 매우 효과적으로 억제된다고 밝혀졌다. IL-1F5와의 상호 작용은 고친화성인 것으로 보인다. IL-1F5 및 IL-1F9 둘 모두는 상피에 비교적 풍부하며, 이들은 상기 특정의 구획에서 염증 조절에서 그 역할을 하는 것으로 제안되었다. 다른 유전자의 기능은 알려져 있지 않지만, IL-1F7과 IL-18R1 사이 (문헌 [Pan et al., 2001]), 그리고 IL-1F10과 IL-1R1 사이(문헌 [Lin et al., 2001])의 낮은 친화성의 상호 작용이 보고되었다. 새로운 IL-1 패밀리 구성원에 있어서의 생물학적 역할은 조사중이지만 mRNA 발현은 IL-1α, IL-1β, IL-1ra 및 IL-18에서 보여지는 것보다 훨씬 더 한정적인 것으로 나타났다. 따라서 새로운 IL-1 패밀리 구성원의 기능에 연루된 세포 유형은 IL-1의 경우에서보다 훨신 더 특수화되는 것이 가능하다.
재료 및 방법
서열 결정 및 서열 어셈블리.
이전에 유전자 집단에 지도화되었던 (문헌 [Nicklin et al., 1994]; 문헌 [Notwang et al., 1996]; 문헌 [Barton et al., 2000]) IL1A, IL1B, IL1RN 및 IL1F5를 포함하는 공개 도메인 (문헌 [Lander et al., 2001])의 부분 서열에 따라 BAC를 동정하였다. 9개의 선발된 BAC는 RP11-1124, RP11-477F18, RP11-55417, RP11-368A17, RP11-434113, RP11-67L14, RP11-725J3, RP11-339F22, RP11-97Jl4 및 RP11-65I12이다. 다수의 공개 데이터는 미완성이며 순서 또는 배향 정보를 전혀 포함하지 않는다. 서로에 대한 개개의 BAC의 공개 서열의 정렬에 의해 최소의 중복 정보가 제공되었다. 이 영역을 가로지르는 최소로 타일링된 (tiled) 골격을 생성하기 위하여 7개의 BAC를 선택하고 (RP11-477F18, RP11-55417, RP11-434I13, RP11-67L14, RP11-725J3, RP11 339F22, RP11-97J14) 3X 적용범위로 서열 결정하였다. 작은 인서트 플라스미드 클론 (~3500 bp)을 정방향 및 역방향 둘 모두로 서열 결정하여 클론의 쌍 판독치 (paired reads)를 제공하였다. PHRED 및 PHRAP (문헌 [Ewing et al., 1998]; 문헌 [Ewing and Green, 1998])를 베이스 콜 (base call) 및 7개의 BAC의 어셈블리에 있어서 사용하였다. 내부 콘티그 보기 도구를 사용하여 생성된 어셈블리를 분석하였다. 본 발명자들은 쌍 판독치가 다른 콘티그 말단인 서열 결정된 콘티그 말단의 매칭에 의해 콘티그를 배열하였다. 이러한 낮은 적용 범위에서, BAC는 다수의 콘티그에 어셈블링되었지만, 순서 및 배향은 확립되지 않았다. 내부적으로 서열 결정된 7개의 BAC에 있어서의 공개 데이터와, 외부적으로 완성된 2개의 BAC (RP11-1I24 및 RP11-65I12)를 젠뱅크로부터 들여왔다. 다양한 소프트웨어 도구를 사용하여 내부, 공개, 및 중복 서열을 비교 및 정렬하여 모든 입수가능한 데이터에 걸친 순서 및 배향 정보를 제공하였다. 이어서 콘티그를 이 정렬로부터 선택하여 이 영역에 걸친 가능한 한 많은 인접 서열을 창조하고 시퀸처 (Sequencher) (버전 4 5)를 사용하여 어셈블링하였다.
서열 정렬 및 엑손 할당.
프라이머 및 cDNA 서열을 처음에 NCBI 서버 상에서 실행되는 2-서열 BLAST 루틴으로 게놈 서열에 매칭시켰다 (문헌 [Altschul et al., 1997]). 엑손을 est2genome 루틴으로 정렬시키고 (문헌 [Mott, 1997]), HGMP 서버 (영국 캠브리지 소재) 상에서 실행시켰다. 이 프로그램을 콘센서스 (consensus) 엑손 경계를 확인하도록 설정하였다. 짧아서 확인될 수 없는 5' 엑손을 콘센서스 스플라이스 (splice) 제공 다이뉴클레오티드 (GT)에서 종결되는 가장 밀접하게 상응하는 서열에 수동으로 위치화하였다. mRNA 크기 데이터가 크게 입수가능하지는 않기 때문에 3' 말단의 비코딩 영역을 지도화하려는 시도는 전혀 하지 않았다.
결과
IL-1 집단의 서열
900 킬로베이스 영역을 내부 및 공개 서열을 조합하는 14개의 순서화된 입접 서열로 어셈블링하였다. 이 서열의 말단소립 부분은 PAX8 유전자를 포함하였다. 그 후 7개의 콘티그로 이루어진 총 496 kb의 더 짧은 영역을 이 영역으로부터 추출하였다. 본 발명자들은 최근의 공개 데이터베이스의 최신 정보에 의해 이 서열의 6개의 갭 중 5개를 패치하였다 (도 17 참조). 본 발명자들은 본 보고서에서 기술된 바와 같이 495475개의 뉴클레오티드의 주석이 달린 서열을 공개 데이터베이스에 제출하였다 (접근 ***). 단일의 나머지 갭 (도 17에서 "갭"으로 표시)은 IL-1 집 단의 중심립이다. 서열은 완성된 양질의 것이 아니지만 완성된 서열을 위한 틀을 제공하며 본 발명자들로 하여금 IL-1 집단 내의 유전자의 구조를 조사하게 해 준다. 새로운 지도는 이전에 공개된 지도와 일관되지만 (문헌 [Nicklin et al., 1994]; 문헌 [Nothwang et al., 1996]) 불완전한 공개 게놈 어셈블리 프로젝트와는 실질적으로 다르다 (문헌 [Lander et al., 2001]).
중심립 쪽으로 가장 가깝게 동정된 측면 유전자는 IL과 관련되어 있지 않다. 이는 세포질 막 포스페이트 수송체 SLC20A1 (이전에 긴팔원숭이-꼬리없는 원숭이 백혈병 바이러스 수용체인 GLVR1의 인간 상동체로 동정됨; 접근 XM_002217)로서 이는 도 1에서 복제 원점의 좌측으로 63 kb 내지 45 kb 사이에 지도화된다. 본 유전자 집단의 말단소립 쪽으로는 TIC (접근 NM_012455)가 있는데, 이는 가장 그럴듯하게는 말단소립 측면에서 ARF6-선택성 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자이다 (MN and Tomas Klenka, 집필 중인 원고). 그의 지도 위치는 도 17에 도시되어 있다.
유전자 구조
본 발명자들은 IL-1 패밀리의 cDNA 서열 모두를 게놈 설 상에 지도화하였는데 (도 17), 여기서 유전자의 범위는 흑색 직사각형으로 나타내었다. 도 17에는 IL-1 유전자 집단의 지도가 도시되어 있다. 규모 바 (kb 단위)가 정렬을 돕기 위하여 데이터의 위 및 아래에 제공되어 있다. 기술된 데이터원은 상부의 3개의 선으로 나타내어져 있다. "신규한 서열"은 전적으로 Genome Therapeutics에서 결정하였다. "공개 DB"는 젠뱅크로부터 취해진 서열을 나타낸다. "조합된 서열"은 2가지 출처의 조합으로부터 어셈블링하였다. 콘티그를 표시하는 바 위에는 전술된 다형성 마커의 위치 (문헌 [Cox et al., 1996] 및 문헌 [di Giovine et al., 2000]에 요약됨)가 표지된 화살표로 나타내어져 있다. 빈 단일 갭도 나타내어져 있다. 본문에 정의된 CpG-풍부 영역이 "CpGr"로 나타내어져 있다. 이전의 지도화에 사용된 드문 절단체의 제한 효소 부위 집단의 유망한 부위가 "Xrec", "Yrec?", 및 "Zrec"로 또한 표시되어 있다. 도 18의 cDNA 서열의 콘티그 상에서의 지도화의 정도는, 회색으로 나타내어진 비-사이토카인 유전자 TIC를 제외하고는, 콘티그 선 아래의 진한 흑색 사각형에 의해 나타내어진다. CE1, CE2 및 CE3을 위한 코딩 서열의 위치는 수직 막대에 의해 나타낸다. 전사의 방향을 나타내기 위한 셰브론(chevron)이 유전자 기호를 선행하거나 뒤따른다. 도 17은 또한 IL-1 집단의 상세한 구조를 보여준다. 각 유전자는 중심립로부터 말단소립으로의 순서로 열거된다. "유전자"는 유전자를 위한 통상의 유전자좌 명칭이다. "배향"은 기탁된 서열이 센스 가닥인 "정방향"이거나, 또는 기탁된 서열이 안티-센스인 "역방향"이다. "위치"는 각 엑손에 해당하는 기탁 서열 상의 뉴클레오티드 번호이다.
cDNA 서열이 불완전한 것으로 알려진 경우, 엑손의 가능한 연장은 "<" 및 ">" 기호로 나타낸다. "엑손"은 상응하는 전사체들 중 하나를 위한 cDNA에서의 그 존재에 기초하여 각 엑손에 부여하는 이름이며; 따라서 IL1RN-a4/b5/c6은 cDNA a (X52015)의 4번째 엑손, cDNA b (M55646)의 5번째 엑손 및 cDNA c의 6번째 엑손이다. 해당하는 mRNA들의 아이덴티티는 일치되었다(**). 이웃한 엔트리들에 대한 별표(*)는 두 엑손이 교번적 프로모터의 이용 결과로서 스플라이스 공여 부위를 공유함을 나타낸다. "엑손 경계"는 인트론에 인접한 엑손 내의 15개의 뉴클레오티드 서열이다. 어느 한쪽 말단의 생략 부호(....)는 cDNA 서열이 절단되어 엑손이 불완전할 가능성이 높음을 나타낸다. "엑손 유형"은 엑손의 코딩 능력을 나타낸다: 5'N, 5'-비번역 영역; 5'SO, 가능하게 번역된 5'의 짧은 개봉 판독 프레임; Ps, 펩티드 전서열(이것이 제안되었음을 나타냄); cs, 비보존된 코딩 서열; CE, 보존된 엑손; 3'N, 3'-비번역된 영역. 생략 부호는 엑손 부여가 완전하지 않을 수도 있으며 일부 또는 모든 비-코딩 서열이 생략되었음을 나타낸다. "코딩"는 각 엑손에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 나타낸다. 엑손은 cDNA 명칭 및 그들이 구성하는 기탁물 (박스의 상부에 나타내어짐)에 의해 동정된다. 각 엑손의 코딩 능력은 소문자로 나타내진다. 이탤릭체 잔기들은 부분적으로 다음 엑손에서 코딩된다. 숫자 위첨자는 코돈 내에 함유된 언급된 엑손에서 염기의 수를 나타낸다. 이 잔기는 다음 엑손으로부터 생략된다. 가교 코돈 내의 뉴클레오티드는 "엑손 경계" 박스내에서 이탤릭체로 표시된다. 후속되는 엑손이 교번성일 경우, 가교 잔기는 바뀔 수 있다. 이것은 괄호로 나타내진다. 밑줄 그어진 잔기는 엑손의 말단의 완전한 코돈들로부터 오며 그들의 코돈은 "엑손 경계" 박스에서 밑줄그어져 있다. 별표는 번역 종결을 나타낸다. ILA는 가장 중심부에 있는 유전자이며 이웃한 유전자 IL1B처럼 중심립을 향하여 전사된다. 이 집단의 가장 말단에 있는 구성원인 IL1RN으로 끝나는 나머지 유전자들은 말단소립을 향하여 전사되지만, 단 IL1F8은 예외이다. 본 발명자들이 공통 엑손 (CE) 1, 2, 및 3으로 명명한, 각 유전자의 마지막 세 개의 엑손들은 IL-1-상동성 도메인(도 18에 나타나며 그 밖의 곳에서 정의됨)을 코딩하며 이 서열내의 컴팩트(compact) 영역에 해당한다. CE1, CE2 및 CE3은 도 1에서 수직 막대로 나타내지나, 도 17의 해상도에서 일부는 구별되지 않을 수 있다. 코딩 내용을 거의 또는 전혀 갖지 않는 부가의 엑손들이 이들 유전자들의 대부분의 전폭을 상당히 확장시킨다. 가장 큰 폭은 IL1RN 및 IL1F8이다. 후자의 경우, 첫번째 비코딩 엑손은 그 유전자의 나머지의 20kb 말단이다. 이 유전자들의 지도화의 상세 사항은 각 엑손으로부터의 코딩된 펩티드 서열과 함께 주어진다. 스플라이스 변형체가 존재하는 경우, 이 정보는 독자가 다른 가능한 단백질 형태들을 조합할 수 있도록 한다. 이들 형태 모두가 생물학적으로 관련성이 있을지 여부는 현재로서는 명확하지 않다 (토의 참고).
도 18 (시트 1-7)은 IL-1 패밀리의 10개의 공지의 구성원들의 세 개의 공통 엑손들의 코딩 서열의 배열을 보여준다. 각 경우에, 공통 엑손은 전사체의 마지막 세 개이다; 예를 들어, IL-1α의 7 엑손들중 엑손 5, 6, 및 7. 배열은 아미노산 아이덴티티와 유사한 잔기들의 블록을 눈으로 찾아서 이루어졌다. 이어서 갭을 최소화하였다. IL-1β 및 IL-1ra를 위한 결정 데이터를 포함시켜 이 배열을 더 정교하게 하는 데 이용하였다. 세 개의 공통 엑손 부분의 번역이 순서대로 나타난다. 숫자는 각 엑손에 의해 코딩되는 성숙 생성물의 처음과 마지막 코돈을 나타낸다. 유전자 생성물은 그들의 가능한 계통발생론에 따라 열거된다. (!)는 단백질 분해 부위에서의 프로세싱이 성숙한 단백질을 생성하지만, 전서열의 일부가 또한 첫번째 공통 엑손내에서 코딩됨을 나타낸다. 블록화된 잔기들은 적어도 세 개의 서열에 공통된다. 단순히 하기 위하여, 유사성은 나타내지 않는다. IL-1β 및 IL-1ra의 경우, 코딩 서열 아래의 첫번째 라인상에서("결정학적 특징"으로 표지됨), β-시트 의 말단의 대략적인 위치가 수직 막대에 의해 나타내지고 시트의 폭은 회색으로 나타내지며 시트의 번호로 표지된다. 다음 라인에서("접촉"으로 표지됨), 숫자는 각 잔기의 측쇄와 상호 작용하는 IL-1R의 도메인을 나타낸다. 넘버링된 잔기는 프로그램 RasMol(Sayle and Milner-White)으로 가시화될 때, 제I형 IL-1 수용체의 무거운 원자의 4Å내에 위치하는 적어도 하나의 무거운 원자(C,N,O,S)를 함유한다(PDB 데이터). IL-1F5 (NMR로 표지됨) 아래의 라인에서, (^)는 그들의 α-13C NMR 시그널에서 강한(>0.7 ppm) 업필드 이동을 보여주는 IL-1F5의 잔기를 나타내며, 이는 그것이 β-시트내에 위치할 가능성이 높음을 나타내는 것으로 생각된다. 블록의 마지막 라인("컨센서스"로 표지됨)은 그 위치에서 적어도 7/10번 발생하는 잔기를 소문자로 나타낸다. 대문자가 되면, 이 잔기는 모든 경우에 존재한다. 생략 부호는 특정 서열의 시트 1이 아마도 이전의 엑손에서 시작함을 나타낸다. (*)는 번역 종결을 나타낸다.
CpG-풍부 영역.
프로그램 CpGplot(Larsen et al.,1992)을 이용하여 60% C+G 함량(CpG 디뉴클레오티드의 예상 빈도가 60%이고 300뉴클레오티드 길이임)을 갖는 다섯 개의 가능한 CpG 섬들을 동정하였다. 첫번째와 마지막 두개의 CpG-풍부 서열을 제외하고는, 이들 영역은 짧으며 아마도 "CpG 섬들"을 구성하지 않는다. 따라서 IL-1 집단에는 CpG 섬이 없다. 본 발명자들은 물리적 지도화를 위해 이전에 사용되었던 (Nicklin et al.,1994) 제한 효소 부위들의 집단의 위치를 알기 위해 노력하였다. CpG-풍부 서열은 도 1에서 CpGr로 표지된다. 두 개는 추가로 Xrec와 Zrec로 표지된다. 이들 두 영역은 이전에 동정되었던 특이적 희귀 절단 제한 효소 부위를 함유하며, 따라서 아마도 이전에 할당된 대로, 집단의 인접부위에 해당한다. 서열 데이터는 게놈 DNA의 제한 분해의 서던 혼성화로부터의 이전의 추정치 430kb와 비교하여 392kb 길이를 생성한다. IL1B를 지도화하기 위해 이전에 이용되었던 NaeI와 EagI 부위의 밀접한 짝짓기가 Yrec?으로 표지된 부위 주변에서 보여지지만, 덜 엄격한 파라미터로도 프로그램 CpGplot에 의해 선택되지 않았다. 단지 Xrec와 Zrec만이 상당한 CpG 섬들을 나타낸다. 데이터베이스 조사 및 대중적인 게놈 주석달기 노력은 아직 이들 유전자좌들 중 어느 것과 연관된 유전자를 밝히지 못하였다. 한 가지 가능성은 시험된 모든 조직에서 풍부하게 발현되는 비-사이토카인 유전자인 TIC의 미인식 상부 엑손을 Zrec가 나타낸다는 것이다 (Tomas Klenka and MN, 미공개 데이터).
IL-1 집단내의 다형성 마커.
본 발명자들은 이전에 개시되었던 이 영역내의 다형성을 조사하였다 (도 17에서 화살표에 의해 나타내지며 도 19에 열거됨). 이 결과 본 발명자들은 이전에 개시된 불균형을 다시 평가하게 되었다 (문헌 [Cox et al., 1998]). 본 발명자들의 분석 결과 지도 거리와 불균형의 붕괴간의 보다 더 나은 상관 계수를 얻었다 (데이터는 표시 안함).
추가의 IL-1-유사 유전자들을 위한 IL-1 집단의 스캐닝
본 발명자들은 IL-1 집단내에 추가의 IL-1-유사 서열들이 있는지를 조사하였다. 상대적으로 작은 크기때문에, 이 집단의 게놈 서열은 BLAST 알고리즘 (문헌 [Altschul et al., 1997])을 이용한 매우 낮은 엄격도 조사도 가능하였다. 2 서열 BLAST 비교를 위한 NCBI 서버를 그 자동 설정값으로 이용하였으나, 단 민감도는 게놈 당 5000 히트를 예상하도록 (그 자동 설정값 10으로부터) 상승시켰다. 각각의 엑손의 번역을 IL-1 집단 게놈 서열의 TBLASTN 분석을 위해 제출하였다. 이 알고리즘은 게놈 서열 단편으로부터 유래된 6개의 가능한 판독 프레임에 대한 코딩 서열의 조사를 수행한다. 본 발명자들은 엑손 구조가 보존될 것이며, 따라서 그들이 종결 코돈으로 방해되면 매치가 감소될 것으로 가정하였다.
보다 덜 연관된 서열 중 하나이기 때문에, 본 발명자들은 먼저 IL1A의 CE3으로 조사하였다. 이것은 단지 그 자신과만 매치하였다. IL1B의 CE3은 IL1A를 제외한 IL-1 집단상의 모든 공지의 패밀리 구성원의 CE3에 반응하였다. 하나의 방해되지 않은 히트가 발견되었으나, 이것은 단지 6개의 동일한 추정적 잔기만을 공유하였으며, CE3에 대해 일반적인 것보다 길었으며 사실상 IL1B내에 역 배향으로 놓여 있었다. 상응하는 가능한 상부 CE2에 대한 증거가 없었기 때문에 이 서열은 고려하지 않았다. 이어서 IL1F5의 CE3를 조사하였으며, 이 또한 IL1A를 제외한 모든 CE3에 반응하였다. 하나의 긴, 가능한 CpG-풍부 엑손은 CE3의 보존된 핵심 잔기들이 결핍되었다. 다른 분리물로서, 본 발명자들은 IL18의 CE3를 이용하였다(기탁번호 XM_041373). 이것은 IL-1 집단로부터의 IL1F5에 반응하였으며 신규 서열은 없었다. 이어서 IL1A와 IL1B로부터의 CE2 (엑손 6)을 시험하였다. 전자는 단지 그 자신에만 반응하였으며, 후자는 IL1F6, IL1F8, IL1F9 및 IL1F10에 반응하였으며 그외 다른 서열에는 반응하지 않았다. IL1F5의 CE2는 IL1RN, IL1F6, IL1F9 및 IL1F10에 반응하였으나, 신규한 비방해 엑손은 없었다. IL18의 CE2는 아무것에도 반응하지 않았다. 마지막으로 IL1F9의 CE2를 시험하였다. 이것은 IL1F6, IL1F8, IL1RN, IL1F10의 CE2에 반응하였으며 다른 서열에는 반응하지 않았다. 추가의 IL-1 패밀리 유전자가 매우 다른 서열을 갖거나 또는 보다 단편화된 엑손 구조를 갖는 다는 점에서 다른 패밀리 구성원 모두와 다르지 않는 한은 IL-1 집단내에 추가의 IL-1 패밀리 유전자들은 없는 것으로 결론내렸다.
진화적 고려
IL-1 패밀리의 계통발생론을 조사하기 위하여, 도 2a에서 나타난 CE3의 배열에서 프로그램 Tree-Puzzle (Strimmer and von Haesler, 1996)을 운영하였다. IL-18은 이 패밀리의 외부그룹 구성원으로 고정하였다. 그 결과는 도 3에 나타난 방사형 덴드로그램(Page, 1996)에 나타난다.
실시예 2: 염증성 유전자 및 관상 심장 질환의 케이스-코홀트(Case-Cohort) 연구(공동 사회에서 아테롬성 동맥경화증 위험(ARIC)의 하부-연구 프로젝트)
ARIC은 아테롬성 동맥경화증의 병인학 및 자연 역사, 임상적 아테롬성 동맥경화 질환의 병인학, 및 심장 혈관 위험 인자, 의학적 보호, 및 질병에서의 인종, 성, 장소 및 시간에 의한 변화를 조사하기 위해 고안된 장래 코호트 연구이다.
ARIC 코호트는 4개의 미국 공동사회로부터의 기준선 45-64세의 15,792명의 확률 샘플로 이루어진다. ILGN은 ARIC 프로그램내의 모든 참가자들의 유전자형을 결정하는 것을 두 개의 공동 하부-연구의 목적을 충족하기에 적합한 것으로 승인하였다. 일어나기 쉬운 심장혈관 사건들의 진행중인 연구에서, 본 발명자들은 임의 로 샘플링된 코호트 대조군과 함께, 급성 임상 사건을 경험한 955 ARIC 참가자들로부터의 DNA 샘플을 보유하고 있다. 이들 샘플은 장기 모니터링의 처음 11년동안의 모든 일어나기 쉬운 심장혈관 사건들을 나타낸다. 모든 샘플의 유전자형 결정이 최근에 완료되었으며 부분적인 결과가 나왔다. 이들 결과는 200mg/dl 미만의 총 콜레스테롤(TC)를 갖는 대상에 있어, 임상 사건의 위험과 IL-1(+4845) 대립유전자 2간의 상당한 연합성을 입증한다. 이들 발견의 핵심 양상은 하기를 포함한다:
·임상적 사건과 상당히 연관된 +4845 유전자형 (생존 분석 상대적 위험성 ~ 4.0, p<.01)
·분석은 모든 연령을 포함함
·다변수 모델에서, IL-1 유전자형 발견은 연령, 성별, 흡연, 인종, 당뇨병, 고혈압, BMI, LDL, HDL과 무관하였다
·TC<200인 대상의 수는 955였다.
유전자좌: IL1A(+4845), 총 콜레스테롤 < 200mg/dl 층
첫번째 급성 관상 동맥 질병 사건까지의 시간
각 표내에는 세개의 모델이 있다. 첫번째는 유전자형 변수를 갖는 조 모델이다. 이것은 조정 컬럼에서 "조"에 의해 동정된다. 조정 컬럼에서 "그룹 1"을 갖는 모델은 연령, 성별 및 인종/센터에 대해 조정된다. 조정 컬럼에서 "그룹 2를 갖는 모델은 연령, 성별, 인종/센터, 현재 흡연 여부(예/아니오), 당뇨병 여부(예/아니오), 고혈압(예/아니오), LDL 콜레스테롤, 및 HDL 콜레스테롤에 대해 조정된다.
'1.1'의 기준선에 대한 '1.2'와 '2.2'의 비교
Figure 112004032845594-pct00001
'1.1'과 '1.2'를 함께 기준선으로 한 '2.2'의 비교
Figure 112004032845594-pct00002
'1.2'를 갖는 대상을 제외한, '1.1'의 기준선에 대한 '2.2'의 비교
Figure 112004032845594-pct00003
실시예 3: 골다공성 골절의 샌프란시스코 연구(SOF)
샌프란시스코의 유니버시티 오브 캘리포니아에서의 스티븐 커밍 (Steven Cummings) 박사의 지시하에서의 골다공성 골절의 다-센터 연구는 4개의 다른 임상 센터로부터의 유럽/코카시안 출신의 여성들의 큰 코호트로 이루어진다. 이들 여성들은 힙, 손목 및 척수 골절 및 허리 척수 및 대퇴목에서의 골 미네랄 밀도의 변화를 포함한 다양한 의학적 및 라이프스타일 발견들에 대해 1986년부터 검사하였다. 기준선 방문에서(1986/1987) 모든 참가자들은(n=9,704) 65세 이상이었고 외래진료를 받았으며 입원하지 않았다. 혈액 샘플을 약 4,000 명으로부터 수집하여 DNA 분 석을 위하여 -70℃에서 저장하였다.
SOF 코호트에서 죽음의 원인에 대한 최근의 분석은 IL-1A(4845) 대립유전자 2가 심장혈관 질환에 기인한 조기 사망과 상당히 연관되어 있음을 결정하였다.
Figure 112004032845594-pct00004
실시예 4: +4845 IL-1 SNP's의 기능적 분석
+4845 SNP는 비-동의어성 SNP이다(즉, IL-1a 사이토카인의 아미노산을 변화시키며 아미노산 변화로 이끄는 자연-발생 다형성). 변이체 단백질은 바큘로바이러스 벡터를 이용하여 곤충 세포에서 발현되며 구조 및 기능 차이에 대해 분석된다. 곤충 세포 및 포유류 세포에서의 단백질 발현을 위해 이용된 변이체 cDNAs는 서열 분석에 의해 아미노산 변화를 야기하는 하나의 SNP만을 함유하는 것으로 확인된다. 이 SNP에 관련된 두개의 데이터가 있다.
웨스턴 블롯 분석에서(도 12 참고), IL-1a 사이토카인의 2개의 변이체들이 칼파인 분해로 상이하게 처리됨을 보여주는 데이터를 제공한다. 칼파인은 전장 IL-1a 사이토카인(31kDa)을 절단하여 성숙 단백질(17 kDa)을 형성하는 것으로 알려진 효소이다. 대립유전자-1(Ala) IL-1a 사이토카인은 하나의 17 kDa 분자가 되는 반면, 대립유전자-2(Ser) IL-1a 사이토카인은 2개의 밴드를 생성하여, 하나는 대립 유전자-1에서 발견되는 밴드와 크기가 동일하며 다른 하나는 분자량이 약간 더 크다. 이 결과는 2 변이체들에서 구조적 차이가 있음을 나타낸다. 또한 Ala에서 Ser으로의 돌연변이가 단백질의 차등적인 번역후 변형을 야기하여, 예를 들어 인산화 또는 미리스톨화의 차이를 야기하는 것으로 가정한다. 이 아미노산 변화는 번역후 변형을 위한 인지 시그널의 변형(첨가 또는 제거)를 야기할 수 있다.
발현 벡터내의 ala 및 ser 변이체 cDNA로 안정적으로 트랜스펙션된 섬유아세포는 다른 증식 속도를 갖는 것으로 발견되었다. 대립유전자-2 변이체는 대립유전자-1 변이체보다 더 빠른 성장 속도를 가지며 이는 대립유전자-2가 프로염증성 프로파일을 예측한다는 본 발명자들의 주장을 뒷받침한다.(도 13 참고). 따라서, 대립유전자-2 변이체에서 변형된 아미노산은 대립유전자-1 변이체보다 더 강력한 프로염증성 사이토카인의 증거를 보여준다.
실시예 5: IL-1A, IL-1B 및 IL-1RN SNP의 체계적인 기능 분석
본 실시예에서, 선택된 IL-1A, IL-1B 및 IL-1RN 다형성을 그렇지 않으면 "야생형"인 IL-1 서열의 배경에서 구성하여 그 효과를 섬유아세포 세포주에서 측정하였다.
리포터-프로모터 작제물에 의해 IL-1A, IL-1B 및 IL-1RN 유전자 프로모터 SNP의 전사를 분석하였다. 각 유전자의 데이터는 별도의 도면 (즉, 각각 도 14, 15 및 16)에 있다. 도 14, 15 및 16 패널 A (및 도 15D)는 SNP 및 별도의 루시퍼라제 작제물에서 생성된 다양한 대립유전자-2 돌연변이를 보여주며 또한 트랜스펙션 분석에서 조사된 SNP로 주석이 달린 프로모터-루시퍼라제 작제물의 상이한 길이 들을 보여준다. 또한, 야생형(모든 좌에서 대립유전자-1)에 대하여 유전자 전사의 활성 변화를 보여주는 기능성 SNP만에 대한 루시퍼라제 분석 결과를 제공한다. B 유전자의 경우, SNP #14(-511) 및 SNP #2(-31)가 또한 대립유전자-2인 백본내의 기능성 SNP를 위한 데이터를 제공한다.
이들 작제물을 섬유아세포 세포주(즉, WI38-염증 반응에서 IL-1의 특이적 역할의 모델임)에서 시험되었음을 주목한다. 따라서, IL-1-매개된 염증성 질환과 질병들의 다른 기작적 양상의 모델인 다른 세포주들이 특이적으로 시험될 것이다. 예를 들어, 인간 세포 단핵구 세포주(예, U937) 및 인간 각질세포 세포주(예, A143) 및 인간 골모세포 세포주에서 골다공증에 대한 IL-1 염증 과정의 효과를 조사한다.
실시예 6: IL-1 유전자 집단 SNP의 주석달기
IL-1 유전자 집단 전체에 걸쳐 다형성을 추가로 주석을 달았다(도 8-11 참고). 이들 다형성은 본원에서 뒷받침되는 것처럼 확립된 IL-1 일배체형 내에서 발생하기 때문에(도 1-7 참고), 이들은 본 발명에서 지지되는 조성물과 방법을 제공한다.
등가물과 참고 문헌에 의한 통합
당업자는 일상적인 실험을 이용하여 본원에서 개시된 구체적 폴리펩티드, 핵산, 방법, 분석 및 시약에 대한 무수한 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 본 발명의 범위내이며 첨부되는 청구항에 의해 보호되는 것으로 간주된다.
본 출원은 학문적 교재, 공개된 논문 및 특허 출원과, 허여된 미국 및 외국 특허를 포함한다. 이러한 인용물 모두의 전체 내용이 본 명세서에 참고로 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> Interleukin Genetics, Inc. <120> The IL-1 Gene Cluster and Associated Inflammatory Polymorphisms and Haplotypes <130> 24299-524-034 / PC-2K7741/CAR <140> Korean Patent Application No. 10-2004-7011470 <141> 2003-01-27 <150> PCT/US03/02232 <151> 2003-01-27 <150> 60/351,951 <151> 2002-01-25 <160> 277 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcatgagcca cggcacccag ccact 25 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tgaactagaa ctcaagaaat tga 23 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cacactctca tatgaattct ccat 24 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 catattctgg gaccttcaat aaa 23 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 aaaagttatg tttttctctt cattca 26 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tctttataag ccatcacttg gtg 23 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 cgagaggtgg gtgcctgaag ccacc 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 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sapiens <400> 20 gcctaggtca gcacctttta g 21 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 gcccccacct gcccacccca 20 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 cctttttcta acatcttgtt ctcta 25 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 tttgccttct acttttaagt t 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 aaatacttct tgaagccgag c 21 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 ctgagtgtga ccaggcatcc tc 22 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 gcctgggtcc cagacttgac aaa 23 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 agaaaagaca tagagtagga 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 tccaaaggaa ggacaaggtc 20 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 gggaggagaa tggaatgtcc cttggactct 30 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 gaagaagccc attggagatg atg 23 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 gataactggc tgcgaagccc atgat 25 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 ggaagacagg atctgataca tac 23 <210> 33 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 cctgtcactg gctttgatcc tcctt 25 <210> 34 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 atcctccttc gttcagcttg taatc 25 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 cactcccttg gataatgcag agcgag 26 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 agagagctcc tgaggcagag aac 23 <210> 37 <211> 29 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 ttttgaaagc cataaaaaca gcgagggag 29 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 gctctgggat tctcttcagc caatcttcat 30 <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 39 actactttcc cattacaagt ccctccag 28 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 aaattttgcc gcctcgcctc acgag 25 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 41 ctatcttctt cgacacatgg gataacg 27 <210> 42 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 ccttctcccc gcccccatcc ctagg 25 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 43 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acagg 25 <210> 101 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 101 ctcccccacc aggctgggag ctctg 25 <210> 102 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 102 gcaaaaaaga tatggggcag cactg 25 <210> 103 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 aacagcctct actggaaaca accca 25 <210> 104 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 104 aaagttccct acttcctgtg acttc 25 <210> 105 <211> 14 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105 cctgtcgccc cctg 14 <210> 106 <211> 14 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 106 tctgtcgccc cctg 14 <210> 107 <211> 14 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 107 cttgtcgccc cctg 14 <210> 108 <211> 14 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 108 cccgtcgccc cctg 14 <210> 109 <211> 14 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 cctttcgccc cctg 14 <210> 110 <211> 14 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 110 cctgccgccc cctg 14 <210> 111 <211> 14 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 111 cctgttgccc cctg 14 <210> 112 <211> 8 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 112 gccccctg 8 <210> 113 <211> 8 <212> DNA 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<213> Homo sapiens <400> 252 Glu Glu Ile Ser Val Val Pro Asn Arg Trp Leu Asp Ala Ser Leu Ser 1 5 10 15 Pro Val Ile Leu Gly Val Gln Gly Gly Ser Gln Cys Leu Ser Cys Gly 20 25 30 Val Gly Gln Glu Pro Thr Leu Thr Leu Glu 35 40 <210> 253 <211> 74 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 253 Pro Val Asn Ile Met Glu Leu Tyr Leu Gly Ala Lys Glu Ser Lys Ser 1 5 10 15 Phe Thr Phe Tyr Arg Arg Asp Met Gly Leu Thr Ser Ser Phe Glu Ser 20 25 30 Ala Ala Tyr Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Val Pro Glu Ala Asp Gln 35 40 45 Pro Val Arg Leu Thr Gln Leu Pro Glu Asn Gly Gly Trp Asn Ala Pro 50 55 60 Ile Thr Asp Phe Tyr Phe Gln Gln Cys Asp 65 70 <210> 254 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 254 ggcagtggga ctgggggcaa gatactacat 30 <210> 255 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 255 aattaaatat gcagaacaac tgctgtgcag 30 <210> 256 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 256 gctgtggcct ctccttccct acagctggag 30 <210> 257 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 257 agaagatctg catactccct acagctggag 30 <210> 258 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 258 gatgtgaaca ttgagttatt gtaaacctct 30 <210> 259 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 259 Met Cys Ser Leu Pro Met Ala Arg Tyr Tyr Ile 1 5 10 <210> 260 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 260 Ile Lys Tyr Ala Asp Gln Lys Ala Leu Tyr Thr Arg Asp Gly Gln Leu 1 5 10 15 Leu Val Gly Asp Pro Val Ala Asp Asn Cys Cys Ala Glu 20 25 <210> 261 <211> 72 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 261 Met Ser Ser Ser Phe Leu Pro Glu Pro Leu Pro Ala Lys Ser Leu Gln 1 5 10 15 His Gly Val Pro Leu Ser Leu Asp Ser Ser Leu Ser Ser Leu Leu Glu 20 25 30 Lys Ile Cys Ile Leu Pro Asn Arg Gly Leu Ala Arg Thr Lys Val Pro 35 40 45 Ile Phe Leu Gly Ile Gln Gly Gly Ser Arg Cys Leu Ala Cys Val Glu 50 55 60 Thr Glu Glu Gly Leu Gln Leu Glu 65 70 <210> 262 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 262 Lys Ile Cys Thr Leu Pro Asn Arg Gly Leu Asp Arg Thr Lys Val Pro 1 5 10 15 Ile Phe Leu Gly Ile Gln Gly Gly Ser Arg Cys Leu Ala Cys Val Glu 20 25 30 Thr Glu Glu Gly Leu Gln Leu Glu 35 40 <210> 263 <211> 68 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 263 Asp Val Asn Ile Glu Glu Leu Tyr Lys Gly Gly Glu Glu Ala Thr Arg 1 5 10 15 Phe Thr Phe Phe Gln Ser Ser Ser Gly Ser Ala Phe Arg Leu Glu Ala 20 25 30 Ala Ala Trp Pro Gly Trp Phe Leu Cys Gly Pro Ala Glu Pro Gln Gln 35 40 45 Pro Val Gln Leu Thr Lys Glu Ser Glu Ala Arg Thr Lys Phe Tyr Phe 50 55 60 Glu Gln Ser Trp 65 <210> 264 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 264 gggcagctcc acccttcccc atggctttag 30 <210> 265 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 265 ctgacttgta tgaagatgct gactcaaagg 30 <210> 266 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 266 gctgcagtca cagaagatgc aagccttcag 30 <210> 267 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 267 agacgatctg ccgacgatgc aagccttcag 30 <210> 268 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 268 aatctgggat gttaaatgtc aatttagaag 30 <210> 269 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 269 aaaagataga tgtggagact ccagctggag 30 <210> 270 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 270 gcagttaaca tcactaatct tgaaaatgcc 30 <210> 271 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Wherein X is Glu or Ala <400> 271 Met Ala Leu Xaa 1 <210> 272 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 272 Asp Leu Tyr Glu Glu Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Gly Glu Asp Asn 1 5 10 15 Ala Asp Ser Lys Glu 20 <210> 273 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 273 Met Glu Ile Cys Arg Gly Leu Arg Ser His Leu Ile Thr Leu Leu Leu 1 5 10 15 Phe Leu Phe His Ser Glu Thr Ile Cys Arg Gly Arg Lys Ser Ser Lys 20 25 30 Met Gln Ala Phe Arg 35 <210> 274 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 274 Thr Ile Cys Arg Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg 1 5 10 15 <210> 275 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 275 Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu 1 5 10 15 Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu 20 25 30 <210> 276 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 276 Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile 1 5 10 15 His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr 20 25 30 Arg Leu Gln Leu Glu 35 <210> 277 <211> 71 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 277 Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys Arg 1 5 10 15 Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser 20 25 30 Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln 35 40 45 Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys 50 55 60 Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu 65 70

Claims (39)

  1. 인간 피검체가 관상 동맥 질환에 걸리기 쉬운지 여부를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 피검체 유래의 핵산 샘플 중에서 인간 인터류킨 1A 유전자(IL-1A)의 +4845 위치에서 대립유전자를 검출하는 단계를 포함하고, IL-1A(+4845) 대립유전자 2의 존재는 상기 피검체가 관상 동맥 질환에 걸리기 쉬운 것을 나타내고, 상기 IL-1A(+4845) 대립유전자 2는 IL-1A 유전자의 +4845 위치에서 티민(T)으로서 정의되는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 피검체 유래의 핵산 샘플 중에서 IL-1B 유전자의 +3954 위치에서 대립유전자를 검출하는 단계를 추가로 포함하고, IL-1B(+3954) 대립유전자 2의 존재는 상기 피검체가 관상 동맥 질환에 걸리기 쉬운 것을 추가로 나타내고, 상기 IL-1B(+3954) 대립유전자 2는 IL-1B 유전자의 +3954 위치에서 티민(T)으로서 정의되는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 피검체 유래의 핵산 샘플 중에서 IL-1B 유전자의 -511 위치에서 대립유전자를 검출하는 단계를 추가로 포함하고, IL-1B(-511) 대립유전자 1의 존재는 상기 피검체가 관상 동맥 질환에 걸리기 쉬운 것을 추가로 나타내고, 상기 IL-1B(-511) 대립유전자 1은 IL-1B 유전자의 -511 위치에서 시토신(C)으로서 정의되는 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 대립유전자 패턴은 IL-1A(+4845) 대립유전자 2에 대해 동형 접합성(homozygous)인 것인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 검출 단계는 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출하기 위한 방법을 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 검출 단계는 대립유전자 특이성 혼성화, 서열결정, 올리고뉴클레오티드 특이성 연결, 효소 절단 또는 겔 전기영동 중 1 이상을 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 검출 단계는 상기 핵산을 증폭시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 검출 단계는 대립유전자 특이성 혼성화를 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 검출 단계는 인간 IL-1A 유전자의 +4845 위치에서 단일 뉴클레오티드 다형성 주위의 5 내지 30 뉴클레오티드 길이의 분리된 핵산을 사용하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 분리된 핵산은 뉴클레오티드 서열 GCCTAGGTCAGCACCTTTTAG 또는 이의 상보체를 포함하는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 분리된 핵산은 뉴클레오티드 서열 GCCTAGGTCATCACCTTTTAG 또는 이의 상보체를 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 피검체는 200 mg/dl 미만의 전체 콜레스테롤을 보유하는 것인 방법.
  13. 인간 IL-1A 유전자의 +4845 위치에서 단일 뉴클레오티드 다형성 주위의 5 내지 30 뉴클레오티드 길이의 분리된 폴리뉴클레오티드.
  14. 제13항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 GCCTAGGTCAGCACCTTTTAG 또는 이의 상보체의 12 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  15. 제13항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열 GCCTAGGTCATCACCTTTTAG 또는 이의 상보체의 12 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 것인 분리된 폴리뉴클레오티드.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 분리된 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 키트.
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