KR101059898B1 - 염증성 질환 및 감염성 질환에 대한 감수성 및 전사에 영향을 미치는 인터루킨-1 좌의 기능적 다형성 - Google Patents

염증성 질환 및 감염성 질환에 대한 감수성 및 전사에 영향을 미치는 인터루킨-1 좌의 기능적 다형성 Download PDF

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Abstract

본 발명은 치주 질환 및 알츠하이머병과 같은 염증성 질환 및 감염성 질환에 대한 감수성 및 유전자의 전사에 영향을 미치는 인터루킨-1 베타(IL-B) 유전자의 상류 영역(IL-1B(-3737))과 관련된 다형성을 검출하기 위한 방법 및 제제를 제공한다.

Description

염증성 질환 및 감염성 질환에 대한 감수성 및 전사에 영향을 미치는 인터루킨-1 좌의 기능적 다형성{FUNCTIONAL POLYMORPHISMS OF THE INTERLEUKIN-1 LOCUS AFFECTING TRANSCRIPTION AND SUSCEPTIBILITY TO INFLAMMATORY AND INFECTIOUS DISEASES}
1. 발명의 배경
IL-1 유전자 클러스터는 2번 염색체의 긴 팔(2q13)에 위치하며, 430 Kb의 영역 내에 적어도 IL-1α(IL-1A), IL-1β(IL-1B) 및 IL-1 수용체 길항제(IL-1RN)에 대한 유전자를 포함한다(Nicklin 등(1994) Genomics, 19:382-4). 효능제 분자 IL-1α 및 IL-1β는 강력한 염증전 활성을 보유하며, 다수의 염증 캐스캐이드의 선두에 위치한다. 흔히 IL-6 및 IL-8과 같은 다른 사이토카인의 유도를 통해 이루어지는 이들의 작용은 백혈구의 활성화 및 손상된 조직으로의 백혈구의 유입, 혈관작용성 물질의 국소 생산, 뇌 및 간 급성 단계 반응에서의 열 반응을 유도한다. 3가지 IL-1 분자 모두 I형 및 II형 IL-1 수용체에 결합하지만 I형 수용체만이 신호를 세포 내부에 전달한다. 이와는 대조적으로, II형 수용체는 세포 막으로부터 방출되어 방해용(decoy) 수용체로서 작용한다. 그러므로 수용체 길항제 및 II형 수용체는 둘 다 이들의 작용에 있어서 항염증성을 띠게 된다.
IL-1의 부적절한 생산은 류머티즘성 관절염, 염증성 장 질환, 건선 등을 비롯한 다수의 자가면역 질환 및 염증성 질환의 병리에 있어서 중요한 역할을 한다. 또한, IL-1 생산율에 있어서의 개체간 차이는 안정하며, 이러한 편차 중 일부는 IL-유전자 좌에서의 유전적 차이에 의한 것일 수 있다. 따라서, IL-1 유전자는 염증성 질환에 대한 유전적 감수성 중 일부를 결정하기 위한 적절한 후보 물질이 되며, 염증성 질환 중 대부분은 다원성 성분을 갖는 다인성 병인을 갖는다.
IL-1 유전자 클러스터로부터의 특정 대립유전자는 특정 질병 상태와 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, IL-1RN(VNTR) 대립유전자 2는 골다공증(미국 특허 제5,698,399호), 당뇨병에서의 신장병(Blakemore 등(1996) Hum. Genet. 97(3): 369-74), 원형탈모증(Cork 등(1995) J. Invest. Dermatol. 104(5 Supp.):15S-16S; Cork 등(1996) Dermatol Clin 14:671-8), 그레이브스병(Blakemore 등(1995) J. Clin. Endocrinol. 80(1):111-5), 전신성 홍반성 낭창(Blakemore 등(1994) Arthritis Rheum. 37:1380-85), 경화성 태선(Clay 등(1994) Hum. Genet 94:407-10), 및 궤양성 대장염(Mansfield 등(1994) Gastoenterol. 106(3):637-42)과 관련이 있는 것으로 확인되었다.
게다가, 마커 -889로부터의 IL-1A 대립유전자 2 및 마커 +3954로부터의 IL-1B(TaqI) 대립유전자 2는 치주 질환과 관련이 있는 것으로 확인되었다(미국 특허 제5,686,246호; Kornman 및 diGiovine(1998) Ann Periodont 3:327-38; Hart 및 Kornman(1997) Periodontol 2000, 14:202-15; Newman(1997) Compend Contin Educ Dent 18:881-4; Kornman 등(1997) J. Clin Periodontol 24:72-77). 또한, 마커 -889로부터의 IL-1A 대립유전자 2는 소아 만성 관절염, 특히 만성 홍채모양체염(McDowell 등(1995) Arthritis Rheum. 38:221-28)과 관련이 있는 것으로 확인되었다. IL-1B의 마커 +3954로부터의 IL-1B(TaqI) 대립유전자 2는 또한 DR3/4 환자에서 건선 및 인슐린 의존형 당뇨병과 관련이 있는 것으로 확인되었다(di Giovine 등(1995) Cytokine 7:606; Pociot 등(1992) Eur J. Clin. Invest. 22:396-402). 또한, IL-1RN(VNTR) 대립유전자 1은 당뇨병성 망막증과 관련이 있는 것으로 확인되었다(USSN 09/037472, 및 PCT/GB97/02790 참조). 또한, IL-1RN(VNTR)의 대립유전자 2는 북아메리카 및 유럽 출신의 백인에서 발병하는 궤양성 대장염과 관련이 있는 것으로 확인되었다(Mansfield, J. 등(1994) Gastroenterology 106:637-42). 흥미로운 사실은, 이러한 연관성은 민족학적으로 관련된 아시케나지 유대인 집단 내에서 특히 강하다는 것이다(PCT W097/25445). 또한, 염증성 질환과 IL-1 다형성과의 연관성 및 이의 검출을 위한 광범위한 방법 및 조성물이 미국 특허 제5,685,246호, 제5,698,399호, 제6,140,047호, 제6,251,598호 및 제6,268,142호에 기재되어 있으며, 상기 특허는 모두 본원에서 참고로 인용한다. 또한, IL-1 좌에 근거가 있는 염증성 질환에 대한 형질전환 모델은 미국 특허 제6,437,216호에 기재되어 있으며, 그 내용은 본원에 참고로 인용한다.
유전성 질환을 스크리닝하는 전통적 방법은 비정상적인 유전자 생성물(예, 겸상 적혈구 빈혈증) 또는 비정상적인 표현형(예, 정신 지체)의 동정에 의존하였다. 이들 방법은 늦은 개시 및 확인이 용이하지 않은 표현형, 예를 들어 맥관 질환과 관련이 있는 유전성 질환에 대해 제한된 유용성을 갖는다. 저비용의 간단한 유전자 스크리닝 방법이 개발됨으로써, 현재는 질환이 다인성인 경우에도 질환 발달 경향을 나타내는 다형성을 확인할 수 있게 되었다. 분자 생물학적 방법에 의해 스크리닝할 수 있는 질환의 수는 다인성 장애의 유전적 기초에 대한 이해가 증가함에 따라 계속 늘어가고 있다.
유전자 스크리닝(유전자 형별법 또는 분자 스크리닝이라고도 부름)은 환자가 질병 상태를 유발하거나 또는 질병 상태를 유발하는 돌연변이에 "연관되어 있는" 돌연변이(대립유전자 또는 다형성)를 보유하는지를 결정하기 위한 테스트로서 광범위하게 정의할 수 있다. 연관성(linkage)은 게놈 내에 서로 가까이 위치하는 DNA 서열들이 함께 유전되는 경향을 보유하는 현상을 말한다. 두 개의 서열은 동시 유전의 몇 가지 선택적인 장점으로 인하여 연관될 수 있다. 그러나 보다 전형적으로는, 두 개의 다형성 서열은 감수분열 재조합이 두 개의 다형간의 영역 내에서 발생하는 상대적 빈도가 낮음으로 인하여 동시 유전된다. 동시 유전된 다형성 대립유전자는 서로 연관 불균형이 있다고 하는데, 왜냐하면, 특정 인간 집단에서 이들은 집단의 임의의 특정한 구성원에서 둘 다 함께 일어나거나 또는 전혀 일어나지 않는 경향이 있기 때문이다. 실제로, 특정 염색체 영역에서 다수의 다형이 서로 연관 불균형 상태에 있는 것으로 확인되면, 이들은 유사 안정성 유전적 "일배체형"을 정의한다. 이와는 대조적으로, 두 개의 다형성 좌 사이에서 발생하는 재조합 사건은 이들이 별개의 상동성 염색체 상으로 분리되도록 한다. 두 개의 물리적 연관성이 있는 다형간의 감수분열 재조합의 발생 빈도가 충분하다면, 이 두 다형은 독립적으로 분리되는(segregate) 것으로 나타나고, 연관 균형 상태에 있다고 말한다.
염증성 장애와 IL-1 다형성간의 통계적 상관성이 반드시, 다형성이 장애를 직접적으로 유발함을 암시하지는 않는다. 오히려 상관성이 있는 다형성은 최근의 인간 진화 역사에서 발생한 장애 유발 돌연변이와 연관되어서(즉, 연관 불균형 상태에 있어서), 개입 염색체 단편에서 재조합 현상을 통해 균형이 이루어지기에는 충분한 시간이 경과하지 않은 양성(benign) 대립유전자 변이체일 수 있다. 따라서, 특정 질환에 대한 진단 및 예후 분석의 목적을 위해서는 그 질환과 관련된 다형성 대립유전자의 검출은 다형성이 질환의 병인에 직접 관련되어 있는지를 고려하지 않고 이용할 수 있다. 뿐만 아니라, 특정 양성 다형성 좌가 명백한 질환 유발 다형성 좌와의 연관 불균형 상태로 존재하는 경우, 양성 다형성 좌와 연관 불균형 상태에 있는 또다른 다형성 좌 역시 질환 유발 다형성 좌와의 연관 불균형 상태로 존재할 가능성이 있다. 따라서 이러한 다른 다형성 좌 역시 유전된 질환 유발 다형성 좌를 가질 가능성의 예후 및 진단 도구가 될 수 있을 것이다. 실제로 광범위한 인간 일배체형(연관된 다형성 마커 세트의 대립유전자의 전형적인 동시 유전 패턴을 설명함)은, 특정 질환 또는 상태와 해당 인간 일배체형간에 관련성이 도출될 수 있다면 진단 목적의 대상이 될 수 있다. 따라서, 특정 질환 상태의 개체의 발병 가능성은 반드시 원인성 유전적 변형을 결정하거나 규명할 필요 없이 하나 이상의 질병 관련 다형성 대립유전자(또는 하나 이상의 질병 관련 일배체형)를 규명함으로써 결정할 수 있다.
그러나, 특정 염증성 질환 또는 상태의 발병 경향과 통계학적으로 관련된 IL-1 일배체형에서의 하나 이상의 연관된 대립유전자의 검출이 염증성 질환의 예측 및 치료를 위한 유용한 진단 방법을 제공할지라도, 궁극적으로 가장 믿을만한 다형성 지표는 질병 병인의 기본 구성요소와 가장 큰 관련이 있는 대립유전자(즉, 원인성 돌연변이 또는 "기능성 돌연변이")가 될 것이다.
예를 들어, 전 세계적으로 수행된 다수의 연구에 의해 조직 내 3가지 화학물질이 보다 심각한 질환 또는 활발히 진행되고 있는 질환과 일관적으로 관련이 있다는 것을 확인하였다. 그러한 화학물질은 인터루킨(IL-1), 프로스타글란딘-E2(PGE2) 및 콜라겐을 파괴하는 효소 및 골 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)이다(참고 문헌: Offenbacher, S. (1996), Ann. Periodontol. 1:821; Page, R. C. 및 Kornman, K. S.(1997), Periodontology 2000 14:112). 이러한 화학물질은 염증 반응의 중요한 매개체이며, 골 손실에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. IL-1은 PGE2 및 매트릭스 메탈로프로테이나제 둘 다의 주요 조절자이다. 최근 연구(참고 문헌: Assuma, R. 등(1998), J. Immunol. 160:403)에 의하면, 치은 조직에서의 IL-1 및 TNFα의 특이적 차단은 어떠한 플라크 억제 조치 없이도 치주 질환의 원숭이 모델에서 골 손실의 상당 부분을 차단하였다. 조직 및 치은열구액(CGF)에서의 IL-1 농도 또는 세포로부터의 IL-1 생성 및 골 손실 및 보다 진전된 또는 진행성 치주염과의 상관성에 관한 다수의 연구 보고서가 있다(참고 문헌 예: Gemmell, E. 및 Seymour, G. J.(1998), J. Dent. Res. 77:16; Ishihara, Y. 등(1997), J. Periodontal Res. 32:524; McGee, J. M. 등(1998), J. Periodontol. 69:865; Okada, H. 및 Murakami, S.(1998), Crit. Rev. Oral Biol. Med. 9:248; Roberts, F. A. 등(1997), Oral Microbiol. Immunol. 12:336; Salvi, G. E. 등(1998), J. Periodontal Res. 33:212; Stashenko, P. 등(1991), J. Clin. Periodontol. 18:548; Yavuzyilmaz, E. 등(1995), Aust. Dent. J. 40(1):46). 예를 들어, 최근의 연구(참고 문헌: Cavanaugh, P. F. 등(1998), J. Periodont. Res. 33:75)는, IL-1의 치은열구액 농도와 비교한 골 손실의 심각성을 고찰하여 치은열구액에서의 더 높은 IL-1 농도는 비교적 더 많은 골 손실과 관련이 있음을 암시하였다.
최근에는 골 파괴에 있어서 IL-1의 중요한 역할이 마우스 모델에서 확인되었다(Lorenzo, J. A. 등(1998), Endocrinology 139 (6):3022). 완전한 IL-1 시스템을 가진 마우스의 난소를 절제하여 폐경기 중의 에스트로겐 고갈을 자극하면, 이 마우스는 상당한 골 밀도를 상실하였다. IL-1 시스템이 차단된 마우스를 생성하면 에스트로겐 고갈은 골 손실을 초래하지 않았다. 이는 적어도 마우스에서는 IL-1이 에스트로겐 고갈 후의 골 손실에 있어서 필수적임을 시사한다. IL-1은 다른 연구에서도 치주염의 필수 요소인 것으로 확인되었다(참고 문헌: Assuma, R. 등(1998), J. Immunol. 160:403). 연구자들은 원숭이에서도 치주염을 유발시켰다. 한 그룹의 원숭이는 IL-1 및 유사한 화학물질인 TNFα를 특이적으로 차단하는 화학물질로 처리하였다. IL-1 및 TNFα를 차단한 동물들은 심각한 박테리아 감염을 보유함에도 불구하고 훨씬 더 적은 골 손실을 나타내었다.
수년 동안 일부 사람들은 다른 사람들보다 더 고농도의 IL-1을 생산하는 것으로 알려져 왔다. 일정 시점 IL-1 농도가 더 높은 사람들은 훗날 다시 조사해도 IL-1 농도가 더 높은 사람이 될 것이며, IL-1의 고 생산은 가계로 이어지는 경향이 있다. 그 사람이 박테리아 감염에 노출될 경우 IL-1을 다량 생산하도록 하는 특이적인 IL-1 유전자 변형이 존재한다고 알려져 있지는 않다. 백인의 약 30%가 이러한 유전적 요인을 보유하고 있다.
몇몇 연구에서는, 실험실에서 그램 음성 박테리로부터의 박테리아 생성물과 함께 항온처리한 말초 백혈구(참고 문헌: Mark, L.L. 등(2000), J. Periodontal Res. 35(3):172; diGiovine, F. S. 등(1995), Cytokine 7:606; Pociot, F. 등(1992), Eur. J. Clin. Invest. 22:396; Galbraith, G. M. 등(1997), J. Periodontol. 68:832)는, 이 백혈구가 IL-1 유전자에 특이적 변형을 가진 사람("유전형 양성")으로부터 유래된 것이라면, 현저히 더 많은 IL-1β를 생산하였다. 그러나 아마도 더 중요한 것은, IL-1 농도가 유전형 양성 치주 조직에서 더 높다는 것일 것이다. 최근 연구에 의하면, IL-1α및 IL-1β농도는 유전형 음성 환자의 치은열구액에서보다 유전형 양성 환자의 치은열구액에서 훨씬 더 높았다(참고 문헌: Engebretson, S. P. 등(1999), J. Periodontol. 70(6):567; Shirodaria, S. 등(2000), J. Dent. Res. 79(11):1864). 실제로, 한 연구에서는(Engebretson, S. P. 등(1999), J. Periodontol. 70 (6):567), 유전형 양성 및 유전형 음성간의 가장 큰 차이점은 최소 포켓 깊이(< 4 mm)를 가진 부위에서 확인되었다.
또한, 프로빙에 대한 출혈은 염증 반응의 임상적 지표로서 간주될 수 있다. Lang 및 그 동료들(참고 문헌: Lang, N. P. 등(2000), J. Periodontal. Res. 35 (2):102)은 임상 리콜 프로그램에서 320명 이상의 무작위적으로 선택된 환자들을 평가하였다. 139명의 비흡연자 중에서 유전형 양성 환자는 유전형 음성 환자들보다 4회의 유지 왕진 동안 출혈 부위의 수가 증가하는 가능성이 훨씬 더 높았다.
요약하면, IL-1 유전형에 대해 양성인 환자들은 a) 이들의 백혈구에 의해 생산된 증가된 IL-1 농도, 2) 치은열구액 중의 증가된 IL-1 및 3) 프로빙에 대한 증가된 출혈을 갖는 경향이 있다.
진단 도구는 이미 존재하는 질병의 일부 양상을 확인하기 위해 사용된다. 진단 테스트의 예는 방사능 사진뿐 아니라 활발한 골 손실의 생화학적 마커를 포함한다. 특이적 진단 도구에 대한 유효성의 평가는, 질병이 실제로 존재하는 경우에는 진단 도구가 질병 변화를 얼마나 잘 검출하는지, 실제로 질병이 존재하지 않는 경우에는 테스트가 "양성"을 얼마나 잘 피하는지의 평가에 기초한다.
의학 및 치의학에서의 예후는 질병의 미래 양상에 대한 위험을 예측하기 위함을 목적으로 한다. 미래에 대해서는 사실이 없기 때문에, 예후는 미래에 발생하는 사건의 확률을 포함한다. 모든 환자들은 예보라는 개념에 익숙하다. 강우 확률 60%라는 일기 예보는 비가 내릴 것을 담보하지는 못하지만, 그 예보에 따라 대부분의 사람들이 그 날 다른 의상을 선택하게 된다. 마찬가지로, 고콜레스테롤은 그 사람이 미래에 심작 발작을 일으킬 것이라고 보장은 못하지만, 이는 일정 연령 이전에 급성 관상동맥 사건의 발병률을 2배 이상으로 만든다.
IL-1 유전형에 대해 양성인 사람들은 일반화된 심각한 치주염에 걸릴 가능성이 더 크다(참고 문헌의 예: Gore, E. A. 등(1998), J. Clin. Periodontol. 25:781, Kornman, K. S. 및 diGiovine, F. S.(1998), Ann. Periodontol. 3:327; Kornman, K. S. 등(1997), J. Clin. Periodontol. 24:72; McDevitt, M. J. 등(2000), J. Periodontal 71:156). 최근 연구(McDevitt, M. J. 등(2000), J. Periodontal 71:156,90)에서는, 흡연한 적이 없거나 잠깐 흡연한 경험이 있는 피험체를 대상으로 치주 질환 및 IL-1 유전형을 조사하였다. 다변량 회귀 모델은 환자의 연령, 과거 흡연 경력 및 IL-1 유전형이 성인 시절의 치주 골 손실의 심각성과 유의적인 관련이 있음을 입증하였다. 비흡연자 또는 과거 가벼운 흡연자(< 5 pk-yr)의 경우, IL-1 유전형 양성인 환자는 IL-1 유전형 음성인 환자보다 중간 정도 내지 심각한 정도의 치주 질환에 걸릴 가능성이 3배 이상 더 컸다.
치주 유지 환자 집단을 대상으로 한 연구(참고 문헌: McGuire 및 Nunn, McGuire, M. K. 등(1999), J. Periodontol. 70(1):49)에서는, 치주 질환 치료를 받은 후 5 내지 14년 동안 추적한 환자를 조사하였다. 이들은, 존재한다면, 어느 인자가 치주 유지 단계 중에 환자에서 치아 손실을 예측하는지를 결정하려는 시도를 하였다. 이들은 단 두 개의 예보 물질을 발견하였다. IL-1 유전형 및 과다 흡연은 미래의 치아 손실과 유의적인 관련이 있었다. IL-1 양성 유전형은 유전형 음성보다 치아 손실을 보일 가능성이 2.7배 더 높았고, 과다 흡연자는 유전형 양성자보다 치아 손실을 보일 가능성이 2.9배 더 높았다. 유전형 양성이고 과다 흡연자인 환자들은 유전형 음성인 비흡연자보다 치아 손실 가능성이 7.7배 더 높았다. 예후를 제공하는 데 전통적으로 사용되는 임상적 파라미터는 비흡연자인 IL-1 유전형 음성 환자에서만 유효한 것으로 확인되었다.
또다른 연구에서는 치료 결과의 예보 물질을 평가하였다. 뿐만 아니라, 또다른 연구(참고 문헌: DeSanctis, M. 및 Zuchelli, G.(2000), J. Periodontol. 71:606)에서는, 파괴된 치주 유착을 재생시키기 위한 조직 재생 유도(GTR) 수술 후의 치주 조직의 장기간 안정성은 유전형 양성 환자에서 현저히 뚜렷하였다고 보고하였다(참고 문헌: DeSanctis, M. 및 Zuchelli, G.(2000), J. Periodontol. 71:606).
치주염과 같은 만성 질환은 경시적으로 복잡한 생물학적 상호작용을 연루시킨다는 것을 강조하는 것이 중요하다. IL-1 유전자 발현과 몇 개의 단일 뉴클레오티드 다형간의 관계는 그 복잡한 생물학적 과정의 특히 중요한 측면이다. 따라서, IL-1B 또는 IL-1A(또는 기타 IL-1 좌 유전자)의 생산을 증가시키는 기능적 다형성은 IL-1 베타 또는 IL-1 알파의 생산 증가와 관련이 있는 치주 질환뿐 아니라 기타 염증성 질환 및 상태의 예측 및 진단에도 유용하다. 예를 들어, 증가된 IL-1B 생산은 류머티즘성 관절염, 알츠하이머병, 염증성 장 질환 및 이식편 대 숙주 질환의 발병에 관여한다는 것이 확인되었다(참고 문헌 예: Dinarello (2000) Chest 118:503-08). 뿐만 아니라, IL-1 좌 유전자의 발현 감소와 관련된 기능적 다형성 역시 염증성 질환에 관여할 수 있다. 예를 들어 IL-1RN(IL-1 좌 수용체 길항제)의 발현 감소를 유발하는 기능적 다형성은 인터루킨 농도의 증가 및 그로 인한 염증성 질환을 유발할 수 있다. 따라서, 하나 이상의 IL-1 유전자의 전사 또는 발현에 영향을 주는 IL-1 좌에 있어서의 기능적 다형성을 확인하는 것이 유용할 것이다.
2. 발명의 개요
본 발명의 한 측면은, 피험체가 증가된 인터루킨, 특히 IL-1 베타 생산과 관련된 질환 또는 상태가 발병되었거나 소인이 있는지를 결정하기 위한 신규 방법 및 키트를 제공한다. 한 구체예에서, 이 방법은 피험체의 핵산이 IL-1B(-3737) 다형성 대립유전자를 포함하는지를 결정하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서 검출된 IL-1B(-3737) 대립유전자는 증가된 IL-1B 발현 및 염증성 질환과 관련된 1형 대립유전자이지만, 2형 대립유전자의 검출은 테스트 피험체의 한 염색체 또는 두 염색체 모두에서의 1형 대립유전자의 부재를 확인하기 때문에 특히 유용하다.
특히 바람직한 구체예에서 본 발명은 인간 IL-1B(-3737) 다형성 좌로부터의 게놈 서열의 약 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 서열을 제공한다. 바람직한 핵산은 -3737 IL-1B 대립유전자 1 서열: TCTAGACCAGGGAGGAGAATGGAATGTCCCTTGGACTCTGCATGT에 상응하는 핵산뿐 아니라, -3737 IL-1B 대립유전자 2 서열: TCTAGACCAGGGAGGAGAATGGAATGTTCCTTGGACTCTGCATGT에 상응하는 핵산을 포함한다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 인간 IL-1B(-1469) 다형성 좌로부터의 게놈 서열의 약 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 서열을 제공한다. 바람직한 핵산은 -1469 IL-1B 대립유전자 1 서열: ACAGAGGCTCACTCCCTTGCATAATGCAGAGCGAGCACGATACCTGG에 상응하는 핵산뿐 아니라, -1469 IL-1B 대립유전자 2 서열: ACAGAGGCTCACTCCCTTGTATAATGCAGAGCGAGCACGATACCTGG에 상응하는 핵산 서열을 포함한다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 인간 IL-1B(-999) 다형성 좌로부터의 게놈 서열의 약 20개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 분리된 핵산 서열을 제공한다. 바람직한 핵산은 -999 IL-1B 대립유전자 1 서열: GATCGTGCCACTgcACTCCAGCCTGGGCGACAGGGTGAGACTCTGTCTC에 상응하는 핵산뿐 아니라, -999 IL-1B 대립유전자 2 서열: GATCGTGCCACTgc- ACTCCAGCCTGGGCGACAGCGTGAGACTCTGTCTC에 상응하는 핵산 서열을 포함한다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 핵산은 전술한 것 중 어느 하나의 상보 서열뿐 아니라, -3737, -1469 또는 -999 IL-IB 다형성 좌에서의 대립유전자 변이체에 상응하는 3' 말단을 갖는 것과 같은 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
특히 바람직한 또다른 구체예에서 본 발명은 인간 피험체에서 염증성 질환 또는 상태의 증가된 발병 가능성을 예측 또는 진단하는 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 측면에서, 염증성 질환은 인터루킨, 특히 IL-1B의 증가된 발현과 관련이 있는 질환이며, 상기 방법은 인간 피험체로부터 핵산 샘플을 얻는 단계 및 -3737 IL-1B 대립유전자의 실체가 1형 프로모터 서열인지 2형 프로모터 서열인지를 결정하기 위하여 분석하는 단계를 요한다. 1형 IL-1B 프로모터 서열의 존재는 염증성 질환의 증가된 발병 가능성의 진단 도구가 된다. 본 발명의 이러한 측면은 증가된 인터루킨 생산, 특히 증가된 IL-1B 생산과 관련된 염증성 질환 또는 상태, 예컨대 치주 질환 및 알츠하이머병을 진단하는 데 특히 유용하다.
본 발명의 방법에 의해 진단 또는 예측이 가능한 기타 염증성 질환 및 상태는 하기의 것들을 포함한다. "IL-1 다형성과 관련된 질환 및 상태"란 구절은 다양한 질환 또는 상태, IL-1 복합체 내의 하나 이상의 대립유전자의 확인을 기초로 피험체에 나타날 수 있는 감수성을 말한다. 그 예로는 염증성 또는 퇴행성 질환이 포함되며, 예컨대, 전신성 염증성 반응(SIRS); 알츠하이머병(및 관련 상태 및 증상, 예컨대, 만성 신경염증, 글리아 활성화; 증가된 마이크로글리아; 신경염 플라크 형성; 및 치료요법에 대한 반응); 근위축성 측삭 경화증(ALS), 관절염(및 관련 상태 및 증상, 예컨대, 급성 관절 염증, 항원 유도성 관절염, 만성 림프성 갑상선염 관련 관절염, 콜라겐 유도성 관절염, 소아 만성 관절염; 소아 류머티즘성 관절염, 골관절염, 예후 및 스트렙토코커스 유도성 관절염), 천식(및 관련 상태 및 증상, 예컨대, 기관지 천식; 만성 폐색성 기도 질환; 만성 폐색성 폐 질환, 소아 천식 및 직업성 천식); 심혈관 질환(및 관련 상태 및 증상, 예컨대, 아테롬성 동맥 경화증; 자가면역 심근염, 만성 심장 저산소증, 울혈성 심부전, 관상동맥 질환, 심근증 및 심장 세포 기능장애, 예컨대, 대동맥 평활근 세포 활성화; 대동맥 세포 아폽토시스; 및 심장 세포 기능의 면역변조; 당뇨 및 관련 상태 및 증상, 예컨대 자가면역 당뇨, 인슐린 의존성(1형) 당뇨, 당뇨 치주염, 당뇨 망막증, 및 당뇨 신장병); 위장 염증(및 관련 상태 및 증상, 예컨대 복강 질환, 관련 골결핍증, 만성 대장염, 크론병, 염증성 장 질환 및 궤양성 대장염); 위궤양; 간 염증, 콜레스테롤 담석 및 간 섬유증, HIV 감염(및 관련 상태 및 증상, 예컨대 퇴행성 반응, 신경퇴행성 반응, 및 HIV 관련 호지킨병), 카와사키 증후군(및 관련 질환 및 상태, 예컨대, 점막피부 림프절 증후군, 자궁경관 임파종, 관상동맥 병변, 부종, 발열, 증가된 백혈구, 경빈혈증, 박피, 발진, 결막 홍증, 혈전증; 다발성 경화증, 신장병(및 관련 질환 및 상태, 예컨대, 당뇨병성 신장병, 말기 신장 질환, 사구체신염, 굿패스쳐 증후군, 혈액투석 생존 및 신장 국소빈혈 재관류 상해), 신경퇴행성 질환(및 관련 질환 및 상태, 예컨대, 급성 신경퇴행, 노화 및 신경퇴행성 질환에서 IL-1의 유도, 시상하부 뉴런의 IL-1 유도성 가소성 및 만성 스트레스 과반응성), 눈병(및 관련 질환 및 상태, 예컨대, 당뇨병성 망막증, 그레이브스 눈병, 및 포도막염, 골다공증(및 관련 질환 및 상태, 예컨대, 치조, 대퇴부, 요골, 척추 또는 손목 골 손실 또는 골절 발생, 폐경기후 골량 손실, 골절 발생 또는 골 손실 비율), 중이염(성인 또는 소아), 췌장염 또는 췌장 소포염, 치주 질환(및 관련 질환 및 상태, 예컨대, 성인, 조발성 및 당뇨병성); 폐 질환, 예컨대, 만성 폐 질환, 만성 정맥두염, 히알린막 질환, 저산소증 및 SIDS에서의 폐 질환; 재발협착증; 류머티즘, 예컨대, 류머티즘성 관절염, 류머티즘성 아쇼프 소체, 류머티즘성 질환 및 류머티즘성 심근염; 갑상선염, 예컨대, 만성 림프성 갑상선염; 요로 감염증, 예컨대, 만성 전립선염, 만성 골반통 증후군 및 요로 결석증이 있다. 면역 장애, 예컨대, 자가면역 질환, 예컨대, 원형탈모증, 자가면역 심근염, 그레이브스병, 그레이브스 눈병, 태선 경화증, 다발성 경화증, 건선, 전신성홍반성낭창, 전신 경화증, 갑상선 질환(예, 갑상선종 및 갑상선 임파종증(하시모토 갑상선염, 임파선양조직 갑상선종), 수면 장애 및 만성 피로 증후군 및 비만증(비당뇨병성 또는 당뇨병 관련)도 예로 들 수 있다. 감염성 질환, 예컨대, 리슈만편모충증, 나병, 라임병, 라임 심장염, 말라리아, 대뇌 말라리아, 수막염, 말라리아 관련 관상장 신염)은 박테리아, 바이러스(예, 사이토메갈로바이러스, 뇌염, 엡슈타인-바 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 인플루엔자 바이러스) 또는 원생동물(예, 열대열원충, 트리파노솜)에 의해 유발되며, 이러한 감염성 질환에 대한 저항성도 예가 된다. 외상에 대한 반응, 예컨대, 대뇌 외상(예컨대, 발작 및 국소빈혈, 뇌염, 뇌질환, 간질, 주생기 뇌 손상, 장기간 발열 발작, SIDS 및 지주막하출혈), 저체중출산(예, 뇌성마비), 폐 손상(급성 출혈 폐 손상, 굿패스쳐 중후군, 급성 국소빈혈 재관류), 직업 및 환경적 오염원에 의해 유발되는 심근 기능장애(예, 독성유 증후군 규폐증에 대한 감수성), 방사선 외상, 및 상처 치유 반응의 효율(예, 화상 또는 열상, 만성 상처, 수술 상처 및 척수 외상)에 대한 반응도 있다. 종양 형성에 대한 감수성, 예컨대, 유방암 관련 골용해성 전이, 악액질, 결장직장암, 과증식성 질환, 호지킨병, 백혈병, 임파종, 대사 질환 및 종양, 전이, 골수종, 및 다양한 암들(예컨대, 유방방, 전립선암, 난소암, 결장암, 폐암 등), 식욕감퇴 및 악액질에 대한 감수성도 있다. 호르몬 조절, 예컨대, 수정능력/생식력, 임신 확률, 조산 발생률, 태아 및 신생아 합병증, 예컨대, 저체중아 조산, 뇌성 마비, 폐혈증, 갑상선산혈증, 산소 의존증, 두개골 기형, 조발 폐경도 있다. 이식편에 대한 피험체의 반응(거부 또는 수용), 급성 단계 반응(예, 발열 반응), 전신 염증 반응, 급성 호흡 곤란 반응, 급성 전신 염증 반응, 상처 치유, 유착, 면역염증성 반응, 신경내분비성 반응, 발열 진전 및 저항, 급성 단계 반응, 스트레스 반응, 질환 감수성, 반복 운동 스트레스, 테니스 엘보, 및 통증 관리 및 반응도 있다.
본 발명의 또다른 측면은, 인간 피험체의 핵산 샘플을 테스트하여, -3737 IL-1B 대립유전자의 실체가 1형 프로모터 서열인지 2형 프로모터 서열인지를 결정함으로써, 인간 피험체가 치료 약물로 효과적으로 치료될 수 있는지를 결정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 측면의 바람직한 구체예에서 1형 IL-1B 프로모터 서열의 존재는 인간 피험체가 치료 약물로 효과적으로 치료될 수 있음을 나타낸다.
또다른 구체예에서, IL-1B(-3737) 2형 대립유전자는 IL-1 염증성 일배체형의 한 성분이며, 그 존재는 증가된 IL-1 베타 발현(예, IL-1(3344146))의 지표가 된다. 본 발명의 이러한 측면의 바람직한 구체예에서 본 발명은 -3737 IL-1B 1형 대립유전자와 관련된 IL-1 일배체형의 존재를 검출함으로써 증가된 인터루킨 생산과 관련된 염증성 질환 또는 상태의 발병 가능성 증가를 진단 또는 예측하는 방법을 제공하는데, 이때 -3737 IL-1B 1형 대립유전자와 관련된 IL-1 일배체형의 존재는 염증성 질환 또는 상태의 증가된 발병 가능성의 진단 도구가 된다.
IL-1 염증성 일배체형을 포함하는 대립유전자는 1) 핵산 샘플과 대립유전자 에 하이브리드화할 수 있는 프로브간의 하이브리드화 반응을 수행하는 단계; 2) 대립유전자의 적어도 일부분을 서열분석하는 단계; 또는 3) 대립유전자 또는 이의 단편(예, 엔도뉴클레아제 분해에 의해 생성된 단편들)의 전기영동성을 결정하는 단계를 포함하는 유용한 다양한 기법들 중 임의의 방법을 이용하여 검출할 수 있다. 경우에 따라 대립유전자로 검출 단계의 수행 전에 증폭 단계를 실시할 수 있다. 바람직한 증폭 방법은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), 가닥 치환 증폭(SDA), 클로닝 및 상기한 방법의 변형법(예, RT-PCR 및 대립유전자 특이적 증폭)으로 이루어진 군에서 선택된다. 증폭에 필요한 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 IL-1 유전자 좌 내로부터 소정의 마커의 측면에 존재하는 것(PCR 증폭에 요구되는 바와 같이) 또는 마커와 직접 중첩되는 것(ASO 하이브리드화에서와 같이)을 선택할 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서 샘플은 프라이머 세트와 하이브리드화하는데, 이 프라이머 세트는 혈관 질환 관련 대립유전자에 대해 센스 또는 안티센스 서열에서 5' 및 3'에 하이브리드화하며, PCR 증폭에 사용된다.
IL-1 염증성 일배체형을 포함하는 대립유전자는, 예를 들어 DNA에 의해 코딩되는 단백질 생성물을 분석함으로써 간접적으로 검출할 수도 있다. 예를 들어 해당 마커가 돌연변이 단백질의 번역을 유도하는 경우, 그 단백질은 다양한 단백질 검출 방법 중 임의의 방법에 의해 검출할 수 있다. 이러한 방법은 면역검출법 및 생화학적 테스트, 예를 들어 크기 분별법을 포함하는데, 이때 단백질은 절두화, 연장, 변경된 폴딩 또는 변경된 번역후 변형을 통해 겉보기 분자량에 변화를 갖는다.
또다른 측면에서 본 발명은 전술한 분석을 수행하기 위한 키트를 특징으로 한다. 이 키트는 핵산 샘플 수집 수단 및 피험체가 IL-1 염증성 일배체형을 포함하는 하나 이상의 대립유전자를 보유하는지를 결정하기 위한 수단을 포함한다. 이 키트는 또한, 결과를 평가하기 위한 대조군 샘플(양성 또는 음성) 또는 표준 물질 및/또는 알고리즘 디바이스와, DNA 증폭 시약, DNA 폴리머라제, 핵산 증폭 시약, 제한 효소, 완충액, 핵산 샘플링 디바이스, DNA 정제 디바이스, 데옥시뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드(예, 프로브 및 프라이머) 등을 비롯한 추가 시약 및 성분들을 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, 대조군은 양성 또는 음성 대조군일 수 있다. 또한, 대조군 샘플은 이용된 대립유전자 검출 기법의 양성(또는 음성) 생성물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 대립유전자 검출 기법이 PCR 증폭을 수행한 후 크기 분별법을 수행하는 경우, 대조군 샘플은 적절한 크기의 DNA 단편들을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 대립유전자 검출 기법이 돌연변이 단백질의 검출을 포함하는 경우, 대조군 샘플은 돌연변이 단백질 샘플을 포함할 수 있다. 그러나 대조군 샘플이 테스트할 물질을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 대조군은 게놈 DNA 샘플 또는 IL-1 유전자 클러스터의 클로닝된 부분일 수 있다. 그러나 대조군 샘플은 테스트할 샘플이 게놈 DNA인 경우에 고도로 정제된 게놈 DNA 샘플이다.
상기 키트에 존재하는 올리고뉴클레오티드는 소정 영역의 증폭 또는 해당 마커에 대한 직접적인 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드(ASO) 하이브리드화를 위해 이용될 수 있다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 소정 마커의 측면에 위치할 수 있거나(PCR 증폭에 요구되는 바와 같이) 또는 마커와 직접 중첩될 수 있다(ASO 하이브리드화에서와 같이).
본원에서 기술하는 분석 및 키트를 사용하여 얻어지는 정보(단독으로, 또는 IL-1 염증성 일배체형과 관련이 있는 질환 또는 상태에 기여하는, 환경적 요인 또는 기타 유전적 결함에 대한 정보와 함께)는 무증상 피험체가 특정 질환 또는 상태를 보유하거나 발병 가능성이 있는지를 결정하는 데 유용하다. 뿐만 아니라, 이 정보는 질환 또는 상태의 개시 또는 진행을 예방하는 방법을 더욱 체계화할 수 있다. 예를 들어 이러한 정보에 의하면 의사는 질환 또는 상태의 분자적 기초를 다루는 치료법을 더욱 효과적으로 처방할 수 있다.
또다른 측면에서 본 발명은 본 발명의 적절한 치료제를 피험체에게 투여함으로써 피험체에서 IL-1 염증성 일배체형과 관련된 질환 또는 상태의 치료 또는 발병을 예방하는 방법을 특징으로 한다. 또다른 측면에서 본 발명은 IL-1 염증성 일배체형과 관련된 질환 또는 상태를 치료하거나 발병을 예방하기 위한 치료제를 동정하기 위하여 테스트 화합물들을 스크리닝하는 시험관내 또는 생체내 분석을 제공한다. 한 구체예에서, 상기 분석은 적절한 프로모터에 기능적으로 연결된 원인성 돌연변이로 형질감염된 세포와 테스트 화합물을 접촉시키는 단계 및 테스트 화합물 존재 및 부재 하에 세포 내의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서 원인성 돌연변이는 테스트 화합물 존재 하에 IL-1 수용체 길항제의 생산을 감소시키고, IL-1 수용체 길항제의 생산을 증가시키는데, 이는 테스트 화합물이 IL-1 수용체 길항제 활성의 작용제임을 암시하는 것이다. 또다른 바람직한 구체예에서 원인성 돌연변이는 테스트 화합물 존재 하에 IL-1α또는 IL-1β의 생산을 증가시키고, IL-1α또는 IL-1β의 생산을 감소시키는데, 이는 테스트 화합물이 IL-1α또는 IL-1β활성의 길항제임을 암시하는 것이다. 또다른 구체예에서, 본 발명은 인간을 제외한 형질전환 동물 및 IL-1α또는 IL-1β활성의 길항제 또는 IL-1Ra 활성의 작용제를 동정하는 데 있어서의 이의 용도를 특징으로 한다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 인간 피험체로부터의 핵산 샘플 중에서 하기 다형 중 어느 하나의 IL-1B, 즉 IL-1B4 대립유전자 1(TGCATAGGGTC), IL-1B3 대립유전자 1(TGCATAGGGTC), IL-1B7 대립유전자 1(TGCATAGGGTC), IL-lB15 대립유전자 1(TGCATAGGGTC), IL-1B4 대립유전자 2(TGTATAGGGTC), IL-1B3 대립유전자 2(TACATAGGGTC), IL-1B7 대립유전자 2(TGCATGGGGTC), 및 IL-1B15 대립유전자 2(TGCATAGGGTT)를 검출함으로써 인간 피험체에서 변경된 IL-1B 발현과 관련된 염증성 질환 또는 상태의 발병 가능성을 예측하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한, IL-1B SNP, 예컨대 IL-1B4 대립유전자 1(TGCATAGGGTC), IL-1B3 대립유전자 1(TGCATAGGGTC), IL-1B7 대립유전자 1(TGCATAGGGTC), IL-1B15 대립유전자 1(TGCATAGGGTC), IL-1B4 대립유전자 2(TGTATAGGGTC), IL-1B3 대립유전자 2(TACATAGGGTC), IL-1B7 대립유전자 2(TGCATGGGGTC), 또는 IL-1B15 대립유전자 2(TGCATAGGGTT)를 포함하는 분리된 뉴클레오티드와 같은 IL-1 염증성 유전형의 검출을 위한 핵산을 포함한다.
특히 바람직한 측면에서 본 발명은 IL-1 SNP를 동정하고, IL-1 유전자 발현 또는 IL-1 유전자 전사 인자의 결합에 SNP가 미치는 효과를 기능적으로 평가함으로써 변경된 IL-1 유전자 발현과 관련된 기능적 다형성을 검출하는 방법을 제공한다. 이 방법에 의하면, SNP가 변경된 IL-1 유전자 발현 또는 IL-1 유전자 전사 인자의 변경된 결합과 관련이 있는 경우, 그 SNP는 변경된 IL-1 유전자 발현과 관련이 있는 기능적 다형성이며, 따라서 염증성 질환 또는 상태의 변경된 발병 가능성과 관련이 있다.
본 발명의 다른 구체예 및 장점들은 후술하는 상세한 설명 및 특허청구의 범위에 기재한다.
3. 도면의 간단한 설명
도 1은 상류 프로모터 영역을 포함하여 IL-1B 유전자 서열을 도시한다. -3737 대립유전자 1은 진한 글씨로 표시하였고, 상응하는 검출 올리고뉴클레오티드는 밑줄로 표시하였다(GenBank 등록 번호 X04500 및 AC04500 참고). -1469 및 -999 다형성 검출 올리고뉴클레오티드 및 개개의 다형성 부위 역시 밑줄로 표시하고 진한 글씨로 표시하였다.
도 2는 IL-1B 유전형과 관련된 IL-1B 전사율에 있어서의 편차를 보여준다.
도 3은 IL-1B 근위 프로모터 및 원위 인핸서 게놈 영역의 개략도를 도시한 것이다.
도 4는 IL-1B 프로모터의 전사 활성에 -31 및 -511 다형성 상태가 미치는 영향이 없음을 보여준다.
도 5는 IL-1B 상류 프로모터 영역의 클로닝 방법을 보여준다.
도 6은 -511 1형 프로모터와 2형 프로모터간의 전사의 차이를 보여준다.
도 7은 1형 클론과 2형 클론의 용량/반응 관계를 보여준다.
도 8은 1형 IL-1B 클론과 2형 IL-1B 클론간의 용량 및 시간 반응성을 보여준다.
도 9는 DNA 기질에 대한 NF-κB p50 호모다이머의 결합을 보여준다.
도 10은 RAW 세포로의 -3737(SNP 발견 결과의 주석에 의하면 IL-1B4로도 알려져 있음) SNP의 형질감염 분석을 보여준다.
도 11은 기능적 다형성 형질감염 분석에서 테스트한 IL-1B 작제물의 서열을 보여준다.
도 12는 THP-1 세포에서의 부가적인 기능성 SNP의 기능성 분석으로부터 얻은 결과를 보여준다.
4. 발명의 상세한 설명
4.1 개론
본 발명은 변경된 IL-1 베타 생산율과 관련된 IL-1B 유전자에서의 다형성의 발견에 관한 것이다. 이 다형에서의 유전형의 확인은 IL-1 생산이 발병, 예컨대 치주 질환 및 기타 염증성 질환, 특히 알츠하이머병에 기여하는 질환에 대한 감수성에 대하여 유용한 유전적 테스트를 제공한다(참고 문헌: McGeer 및 McGeer (2001) Arch Neurol 58:1790-2; 및 De Luigi 등(2001) Mech Ageing Dev 122:1985-95).
4.2. 정의
편의상, 본 명세서, 실시예 및 첨부하는 특허청구의 범위에서 사용한 특정한 용어 및 구절의 의미는 다음과 같다.
"대립유전자"란 용어는 상이한 다형성 영역에서 발견되는 상이한 서열 변이체를 말한다. 예를 들어, IL-1RN(VNTR)은 적어도 5개의 상이한 대립유전자를 갖는다. 서열 변이체는 단일 또는 다중 염기 변화, 비제한적인 예로 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 염기 변화일 수 있거나, 다양한 수의 서열 반복체일 수 있다.
"대립유전자 패턴"이란 용어는 하나 이상의 다형성 영역에서의 대립유전자(들)의 실체를 말한다. 예를 들어 대립유전자 패턴은 IL-1RN(VNTR) 대립유전자 1에 대해서는 다형성 부위에서 단일 대립유전자로 이루어질 수 있으며, 상기 IL-1RN(VNTR) 대립유전자 1은 IL-1RN 유전자 좌에서 IL-1RN 대립유전자 1을 적어도 1 카피 갖는 대립유전자 패턴이다. 또는, 대립유전자 패턴은 단일 다형성 부위에서 동질접합 상태 또는 이질접합 상태로 이루어질 수 있다. 예를 들어 IL1-RN(VNTR) 대립유전자 2,2는 동질접합 IL-RN(VNTR) 대립유전자 2 상태에 상응하는 IL-1RN의 VNTR 마커에서 제2의 대립유전자가 2 카피 존재하는 대립유전자 패턴이다. 또는, 대립유전자 패턴은 하나 이상의 다형성 부위에 존재하는 대립유전자의 실체로 이루어질 수 있다.
본원에서 사용되는 "항체"란 용어는 IL-1 폴리펩티드와 특이적으로 반응하는 전체 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 결합 물질을 말한다. 항체는 통상적 기법을 이용하여 단편화할 수 있고, 단편은 전체 항체에 대하여 전술한 것과 동일한 방식으로 유용성을 갖는지에 대하여 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, F(ab)2 단편은 항체를 펩신으로 처리하여 생성할 수 있다. 형성된 F(ab)2 단편은 이황화 결합을 환원시켜 Fab 단편을 생성하도록 처리할 수 있다. 본 발명의 항체는 항체의 하나 이상의 CDR 영역에 의해 부여되는 IL-1B 폴리펩티드에 대한 친화성을 갖는 이중 특이적 분자, 단일쇄 분자, 및 키메라 및 인간화 분자를 추가로 포함한다.
"생물학적 활성" 또는 "생물활성" 또는 "활성" 또는 "생물학적 기능"은 상호 교환적으로 사용되며, 본 발명의 목적상 IL-1 폴리펩티드(천연 형태이든지 변성된 형태이든지 간에) 또는 이의 임의의 부분서열에 의해 직접 또는 간접적으로 이루어지는 효과기 또는 항원성 기능을 의미한다. 생물학적 활성은 표적 펩티드, 예를 들어 IL-1 수용체에 대한 결합을 포함한다. IL-1 생물활성은 IL-1 폴리펩티드에 직접 영향을 줌으로써 조절할 수 있다. 대안으로, IL-1 생물활성은 IL-1 폴리펩티드의 수준을 조절함으로써, 예컨대 IL-1 유전자의 발현을 조절함으로써 조절할 수 있다.
본원에서 사용되는 "IL-1 폴리펩티드의 생물활성 단편"이란 용어는 전장 IL-1 폴리펩티드의 단편을 말하는데, 이때 상기 단편은 야생형 IL-1 폴리펩티드의 활성을 특이적으로 모방하거나 또는 그 활성에 대해 길항작용을 한다. 생물활성 단편은 바람직하게는 인터루킨 수용체와 상호작용할 수 있는 단편이다.
IL-1과 같은 폴리펩티드의 활성에 적용되는 바와 같이, 용어 "변종 활성"은 야생형 또는 본래의 폴리펩티드의 활성과 상이하거나 건강한 피험체의 폴리펩티드 활성과 상이한 활성을 나타낸다. 본래의 폴리펩티드의 활성보다 더 강하기 때문에, 폴리펩티드의 활성은 변종될 수 있다. 선택적으로, 본래의 활성에 비해 활성이 약하거나 활성이 없기 때문에도 폴리펩티드의 활성은 변종될 수 있다. 변종 활성은 또한 활성에 있어서의 변화일 수 있다. 예를 들어, 변종 폴리펩티드는 서로 상이한 타겟 펩티드와 상호작용할 수 있다. 세포는 IL-1 좌 폴리펩티드를 코딩하는 IL-1 좌 유전자의 과량발현 또는 소량발현으로 인한 변종 IL-1 활성을 가질 수 있다.
"세포", "숙주 세포" 또는 "재조합 숙주 세포"는 명세서에서 호환되서 사용되는 용어로, 특정 피험체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손 또한 나타낸다. 돌연변이나 환경적 영향으로 인해 이어지는 세대에 어떤 변형이 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 부모 세포와 실질상 동등하게는 아니더라도, 명세서에서 사용된 용어의 범위 내에 여전히 포함될 것이다.
"키메라", "모자이크", "키메릭 포유류" 등은 게놈 함유 세포의 적어도 일부에 넉-아웃 또는 넉-인 작제물을 가진 형질전환 포유류를 나타낸다.
용어 "대조구" 또는 "대조 샘플"은 사용된 검출 기술에 적절한 샘플의 어떤 것을 나타낸다. 대조 샘플은 사용된 대립유전자 검출 기술의 산물 또는 테스트된 물질을 포함할 수 있다. 더욱이, 대조구는 양성적 또는 음성적 대조구일 수 있다. 예로서, 대립유전자 검출 기술이 크기 분획이 뒷따르는 PCR 증폭일때, 대조 샘플은 적절한 크기의 DNA 단편을 포함할 수 있다. 유사하게, 대립유전자 검출 기술이 돌연변이 단백질의 검출을 포함할때, 대조 샘플은 돌연변이 단백질 샘플을 포함할 수 있다. 그러나, 대조 샘플은 테스트될 물질을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 대조구는 게놈 DNA 또는 IL-1 유전자 클러스터의 클로닝된 부분의 샘플일 수 있다. 그러나, 테스트되는 샘플이 게놈 DNA인 경우라면, 대조 샘플은 게놈 DNA의 고도로 순수분리된 샘플인 것이 바람직하다.
구 "IL-1 다형성과 연관된 질환 및 상태"는 다양한 질환 또는 상태, 즉 IL-1 복합체 내의 하나 이상의 대립유전자의 동일화에 근거한 피험체에서 표시될 수 있는 감수성을 나타낸다. 그 예로는 염증성 또는 퇴행성 질환이 포함되며, 예컨대, 전신성 염증성 반응(SIRS); 알츠하이머병(및 관련 상태 및 증상, 예컨대, 만성 신경염증, 글리아 활성화; 증가된 마이크로글리아; 신경염 플라크 형성; 및 치료요법에 대한 반응); 근위축성 측삭 경화증(ALS), 관절염(및 관련 상태 및 증상, 예컨대, 급성 관절 염증, 항원 유도성 관절염, 만성 림프성 갑상선염 관련 관절염, 콜라겐 유도성 관절염, 소아 만성 관절염; 소아 류머티즘성 관절염, 골관절염, 예후 및 스트렙토코커스 유도성 관절염), 천식(및 관련 상태 및 증상, 예컨대, 기관지 천식; 만성 폐색성 기도 질환; 만성 폐색성 폐 질환, 소아 천식 및 직업성 천식); 심혈관 질환(및 관련 상태 및 증상, 예컨대, 아테롬성 동맥 경화증; 자가면역 심근염, 만성 심장 저산소증, 울혈성 심부전, 관상동맥 질환, 심근증 및 심장 세포 기능장애, 예컨대, 대동맥 평활근 세포 활성화; 대동맥 세포 아폽토시스; 및 심장 세포 기능의 면역변조; 당뇨 및 관련 상태 및 증상, 예컨대 자가면역 당뇨, 인슐린 의존성(1형) 당뇨, 당뇨 치주염, 당뇨 망막증, 및 당뇨 신장병); 위장 염증(및 관련 상태 및 증상, 예컨대 복강 질환, 관련 골결핍증, 만성 대장염, 크론병, 염증성 장 질환 및 궤양성 대장염); 위궤양; 간 염증, 콜레스테롤 담석 및 간 섬유증, HIV 감염(및 관련 상태 및 증상, 예컨대 퇴행성 반응, 신경퇴행성 반응, 및 HIV 관련 호지킨병), 카와사키 증후군(및 관련 질환 및 상태, 예컨대, 점막피부 림프절 증후군, 자궁경관 임파종, 관상동맥 병변, 부종, 발열, 증가된 백혈구, 경빈혈증, 박피, 발진, 결막 홍증, 혈전증; 다발성 경화증, 신장병(및 관련 질환 및 상태, 예컨대, 당뇨병성 신장병, 말기 신장 질환, 사구체신염, 굿패스쳐 증후군, 혈액투석 생존 및 신장 국소빈혈 재관류 상해), 신경퇴행성 질환(및 관련 질환 및 상태, 예컨대, 급성 신경퇴행, 노화 및 신경퇴행성 질환에서 IL-1의 유도, 시상하부 뉴런의 IL-1 유도성 가소성 및 만성 스트레스 과반응성), 눈병(및 관련 질환 및 상태, 예컨대, 당뇨병성 망막증, 그레이브스 눈병, 및 포도막염, 골다공증(및 관련 질환 및 상태, 예컨대, 치조, 대퇴부, 요골, 척추 또는 손목 골 손실 또는 골절 발생, 폐경기후 골량 손실, 골절 발생 또는 골 손실 비율), 중이염(성인 또는 소아), 췌장염 또는 췌장 소포염, 치주 질환(및 관련 질환 및 상태, 예컨대, 성인, 조발성 및 당뇨병성); 폐 질환, 예컨대, 만성 폐 질환, 만성 정맥두염, 히알린막 질환, 저산소증 및 SIDS에서의 폐 질환; 재발협착증; 류머티즘, 예컨대, 류머티즘성 관절염, 류머티즘성 아쇼프 소체, 류머티즘성 질환 및 류머티즘성 심근염; 갑상선염, 예컨대, 만성 림프성 갑상선염; 요로 감염증, 예컨대, 만성 전립선염, 만성 골반통 증후군 및 요로 결석증이 있다. 면역 장애, 예컨대, 자가면역 질환, 예컨대, 원형탈모증, 자가면역 심근염, 그레이브스병, 그레이브스 눈병, 태선 경화증, 다발성 경화증, 건선, 전신성홍반성낭창, 전신 경화증, 갑상선 질환(예, 갑상선종 및 갑상선 임파종증(하시모토 갑상선염, 임파선양조직 갑상선종), 수면 장애 및 만성 피로 증후군 및 비만증(비당뇨병성 또는 당뇨병 관련)도 예로 들 수 있다. 감염성 질환, 예컨대, 리슈만편모충증, 나병, 라임병, 라임 심장염, 말라리아, 대뇌 말라리아, 수막염, 말라리아 관련 관상장 신염)은 박테리아, 바이러스(예, 사이토메갈로바이러스, 뇌염, 엡슈타인-바 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 인플루엔자 바이러스) 또는 원생동물(예, 열대열원충, 트리파노솜)에 의해 유발되며, 이러한 감염성 질환에 대한 저항성도 예가 된다. 외상에 대한 반응, 예컨대, 대뇌 외상(예컨대, 발작 및 국소빈혈, 뇌염, 뇌질환, 간질, 주생기 뇌 손상, 장기간 발열 발작, SIDS 및 지주막하출혈), 저체중출산(예, 뇌성마비), 폐 손상(급성 출혈 폐 손상, 굿패스쳐 중후군, 급성 국소빈혈 재관류), 직업 및 환경적 오염원에 의해 유발되는 심근 기능장애(예, 독성유 증후군 규폐증에 대한 감수성), 방사선 외상, 및 상처 치유 반응의 효율(예, 화상 또는 열상, 만성 상처, 수술 상처 및 척수 외상)에 대한 반응도 있다. 종양 형성에 대한 감수성, 예컨대, 유방암 관련 골용해성 전이, 악액질, 결장직장암, 과증식성 질환, 호지킨병, 백혈병, 임파종, 대사 질환 및 종양, 전이, 골수종, 및 다양한 암들(예컨대, 유방방, 전립선암, 난소암, 결장암, 폐암 등), 식욕감퇴 및 악액질에 대한 감수성도 있다. 호르몬 조절, 예컨대, 수정능력/생식력, 임신 확률, 조산 발생률, 태아 및 신생아 합병증, 예컨대, 저체중아 조산, 뇌성 마비, 폐혈증, 갑상선산혈증, 산소 의존증, 두개골 기형, 조발 폐경도 있다. 이식편에 대한 피험체의 반응(거부 또는 수용), 급성 단계 반응(예, 발열 반응), 전신 염증 반응, 급성 호흡 곤란 반응, 급성 전신 염증 반응, 상처 치유, 유착, 면역염증성 반응, 신경내분비성 반응, 발열 진전 및 저항, 급성 단계 반응, 스트레스 반응, 질환 감수성, 반복 운동 스트레스, 테니스 엘보, 및 통증 관리 및 반응도 있다.
구 "유전자의 파괴" 및 "목표된 파괴" 또는 어느 유사한 구는 유전자의 야생형 카피와 비교하여, 세포내 그 유전자의 발현을 억제하기 위한 본래의 DNA 서열의 위치 특이적 방해를 나타낸다. 이 방해는 유전자에 결실, 삽입 또는 변형 또는 그들의 조합에 의해 초래될 수 있다.
명세서에 사용된 용어 "일배체형"은 통계적으로 통계적으로 의미있는 수치(pcorr<0.05)로 그룹으로 함께 유전되는(연관 불균형에 있는) 대립유전자 한 세트를 나타낸다. 명세서에서 사용한대로, 구 "IL-1 일배체형"은 IL-1 좌의 일배체형을 나타낸다. IL-1 염증성 또는 프로염증성 일배체형은 증가하는 효능제 및/또는 감소하는 길항제 활성을 지시하는 일배체형을 나타낸다.
"상동" 또는 "동일" 또는 "유사"는 두 펩티드 사이 또는 두 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 나타낸다. 상동 및 동일은 비교 목적으로 정렬된 각 서열에서의 위치를 비교함으로써 각각 결정될 수 있다. 비교된 서열내에서 동등한 위치가 동일한 염기 또는 아미노산으로 채워져 있을때, 그 위치에서 분자는 동일하다. 동등한 위치가 동일한 또는 유사한 아미노산 잔기로 채워져 있을때(예, 입체적 및/또는 전기적 성질의 유사), 그 위치에서 분자는 상동(유사)하다고 언급될 수 있다. 상동/유사 또는 동일의 %로서의 표현은 비교되는 서열을 공유하는 위치에서의 동일한 또는 유사한 아미노산의 수의 함수를 나타낸다. "비연관된" 또는 "비-상동성인" 서열은 40% 이하의 동일을 공유하며, 바람직하게는 본 발명의 서열과 25% 이하의 동일을 공유한다.
용어 "상동"은 유사한 기능 또는 모티프를 가지는 유전자 또는 단백질을 확인하는데 사용되는 서열 유사성에 대한 수학적으로 기초한 비교를 서술한다. 본 발명의 핵산 및 단백질 서열은, 예를 들어, 다른 패밀리 구성원, 관련된 서열 또는 상동체를 확인하기 위한 공공 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "질문 서열"로서 사용될 수도 있다. 이러한 검색은 Altschul 등(1990) J Mol. Biol. 215:403-10의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(version 2.0)을 사용하여 수행할 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 단어길이=12로 수행되며, 본 발명의 핵산 분자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 단어길이=3으로 수행되어, 본 발명의 단백질 분자와 상동성이 있는 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적으로 틈이 있는 배열을 얻기 위해, Gapped BLAST를 Altschul 등(1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402에서 서술된대로 이용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할때, 개개의 프로그램(예, XBLAST 및 BLAST)의 디폴트 변수가 사용될 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 보라.
명세서에서 사용된 용어 "IL-1 유전자 클러스터" 및 "IL-1 좌"는 IL-1A, IL-1B 및 IL-1RN 유전자, 및 다른 연관된 서열을 적어도 포함하는 염색체 2의 2q13 부위에 또는 그 근처에 있는 모든 핵산을 포함한다(Nicklin 등, Gemomics 19: 382-84, 1994). 명세서에서 사용된 용어 "IL-1A", "IL-1B", 및 "IL-1RN"는 IL-1, IL-1, 및 IL-1 수용체 길항제를 각각 코딩하는 유전자를 나타낸다. IL-1A, IL-1B, 및 IL-1RN의 유전자 가입 번호는 각각 X03833, X04500, 및 X64532이다.
"IL-1 기능성 돌연변이" 또는 "원인성 돌연변이"는 바뀌어진 표현형을 나타내는 IL-1 유전자 클러스터내의 돌연변이를 나타낸다(즉, IL-1 유전자 또는 단백질의 기능에 영향). 예에는 IL-1A(+4845) 대립유전자 2, IL-1B(+3954) 대립유전자 2, IL-1B(+6912) 대립유전자 2 및 IL-1RN(+2018) 대립유전자 2가 포함된다.
"IL-1X(Z) 대립유전자 Y"는 유전자 X내의 IL-1 좌 다형성 부위에서 발생하는 Y라고 칭하는 특정 대립유전자 형태를 나타내며, 여기서 X는 IL-1A, B, 또는 RN이며 뉴클레오티드 Z에 또는 그 근처에 위치하고, 뉴클레오티드 Z는 특정 IL-1 유전자 X의 뉴클레오티드 +1인 주된 전사 개시 부위와 비교하여 번호를 붙인다. 명세서에서 사용된대로, 용어 "IL-IX 대립유전자(Z)"는 뉴클레오티드 Z에 또는 그 근처에 위치한 유전자 X내의 IL-1 다형성 부위의 모든 대립 유전자를 나타낸다. 예를 들어, 용어 "IL-1RN(+2018) 대립유전자"는 마커 +2018에서의 IL-1RN 유전자의 선택적 형태를 나타낸다. "IL-1RN(+2018) 대립유전자 1"은 센스 스트랜드의 위치 +2018에서 시토신(C)을 포함하는 IL-1RN 유전자의 형태를 나타낸다. Clay 등, Hum. Genet. 97:723-26, 1996. "IL-1RN(+2018) 대립유전자 2"는 플러스 스트랜드의 위치 +2018에서 티민(T)을 포함하는 IL-1RN 유전자의 형태를 나타낸다. 피험체가 두개의 동등한 IL-1RN 대립유전자를 가지는 경우, 피험자는 동질접합하다 또는 동질접합 상태를 가지고 있다고 말해진다. 피험체가 두개의 상이한 IL-1RN 대립유전자를 가지는 경우, 피험자는 이질접합하다 또는 이질접합 상태를 가지고 있다고 말해진다. 용어 "IL-1RN(+2018) 대립유전자 2,2"는 동질접합 IL-1RN(+2018) 대립유전자 2 상태를 나타낸다. 반대로, 용어 "IL-1RN(+2018) 대립유전자 1,1"은 동질접합 IL-1RN(+2018) 대립유전자 1 상태를 나타낸다. 용어 "IL-1RN(+2018) 대립유전자 1,2"는 이질접합 대립유전자 1 및 2 상태를 나타낸다.
명세서에서 사용된 "IL-1 관련된"은 인간 염색체 2 상의 인간 IL-1 좌 유전자와 관련된 모든 유전자를 포함하는 의미이다(2q 12-14). 이들은 염색체 2 상에 위치한 인간 IL-1 유전자 클러스터의 IL-1 유전자들을 포함하며(2q 13-14), 여기에는 인터루킨-1α를 코딩하는 IL-1A 유전자, 인터루킨-1β를 코딩하는 IL-1B 유전자, 및 인터루킨-1 수용체 길항제를 코딩하는 IL-1RN(또는 IL-1ra) 유전자가 포함된다. 더욱이, 이러한 IL-1 관련된 유전자들은 인간 염색체 2에 위치한 유형 I 및 유형 II의 인간 IL-1 수용체 유전자(2q12), 및 마우스 염색체 1의 19.5 cM 위치의 이들의 마우스 상동체를 포함한다. 인터루킨-1α, 인터루킨-1β, 및 인터루킨-1RN은 만히 관련되어, 모두 IL-1 유형 I 수용체에 결합할 수 있으나, 단지 인터루킨-1α및 인터루킨-1β만이 IL-1 유형 I 수용체를 활성화시키는 효능제 리간드이며, 반면 인터루킨-1RN은 본질적으로 길항제 리간드를 나타낸다. 용어 "IL-1"이 유전자 산물 또는 폴리펩티드와 관련해서 사용될때, 이는 인간 염색체 2 상의 인터루킨-1 좌(2q 12-14) 및 다른 종에서 온 이들의 상응되는 상동체 또는 기능성 변이체에 의해 코딩되는 유전자 산물 모두를 나타내는 의미이다. 그러므로, 용어 IL-1은 IL-1 수용체 길항제 및 IL-1 유형 II(유인) 수용체와 같은 염증성 반응을 길항하는 분비 폴리펩티드는 물론, IL-1α 및 IL-1β와 같은 염증성 반응을 촉진하는 분비 폴리펩티드를 포함한다.
"IL-1 수용체" 또는 "IL-1R"는 IL-1 좌-코딩하는 리간드로부터의 신호에 결합하고 및/또는 이를 도입할 수 있는 다양한 세포막 결합 단백질 수용체를 나타낸다. 이 용어는 인터루킨-1(IL-1) 분자에 결합할 수 있는 단백질 어떤것에도 적용되는데, 이는 포유류 플라스마 막 단백질로서의 그들의 본래의 형태에서 아마도 IL-1에 의해 제공되는 신호를 세포로 도입하는 역할을 담당할 것이다. 명세서에서 사용된 바대로, 이 용어는 IL-1-결합 또는 신호 도입 활성을 가진 본래의 단백질 유사체를 포함한다. 예에는 미국 특허 번호 4,968,607에서 서술된 인간 및 쥐과 IL-1 수용체가 포함된다. 용어 "IL-1 핵산"은 IL-1 단백질을 코딩하는 핵산을 나타낸다.
"IL-1 폴리펩티드" 및 "IL-1 단백질"은 명세서에 포함된 도면에서 나타낸 IL-1 게놈 DNA 서열이 코딩하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 그들의 단편, 및 그들의 상동체를 포함하며, 효능제 및 길항제 폴리펩티드를 포함한다.
"증가하는 위험"은 특정 다형성 대립유전자를 보유하지 않은 개체의 구성원에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도에 비교하여, 특정 다형성 대립유전자를 보유한 개체에서의 질환 또는 상태의 발생 빈도가 통계적으로 높음을 나타낸다.
명세서에 사용된 용어 "상호작용"은 자연상의 단백질-단백질, 단백질-핵산, 핵산-핵산 및 단백질-소분자 또는 핵산-소분자 간의 상호작용과 같은, 분자들 간의 검출가능한 관계 또는 연관(예, 생화학적 상호작용)을 포함하는 의미이다.
DNA 또는 RNA와 같은 핵산에 대해 명세서에 사용된 용어 "분리된"은 고분자의 자연원에 존재하는 다른 DNA 또는 RNA로부터 각각 분리된 분자를 나타낸다. 예를 들어, 피험체 IL-1 폴리펩티드 중 하나를 코딩하는 분리된 핵산은 바람직하게는 게놈 DNA 내에 IL-1 유전자의 측면에 직접 본래 위치하는 10 kb의 핵산 서열만을 포함하며, 더 바람직하게는 측면 서열의 5 kb만을 포함하며, 가장 바람직하게는 측면 서열의 1.5 kb 이하를 포함한다. 명세서에서 사용된 용어 "분리된"은 또한 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 세포내 물질, 바이러스 물질, 또는 배양 배지 또는 화학적 전구체 또는 기타 화학적으로 합성된 화학물질이 실질상 존재하지 않아 핵산 또는 펩티드를 나타낸다. 더욱이, "분리된 핵산"은 본래 단편으로 존재하지 않고 자연 상태에서 발견되지 않는 핵산 단편을 포함하는 의미이다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어 "분리된"은 기타 세포내 단백질로부터 분리된 폴리펩티드를 나타내며, 순수 및 재조합 폴리펩티드 모두를 나타내는 의미이다.
"넉-인" 형질전환 동물은 게놈으로 도입된 변형된 유전자 및 외생 또는 내생 오리진일 수 있는 변형된 유전자를 가지는 동물을 나타낸다.
"넉-아웃" 형질전환 동물은 내생 유전자의 발현이 부분적 또는 완전 억제되는 동물을 나타낸다(예, 유전자의 적어도 한 부위에 결실, 제2 서열을 가진 유전자가 적어도 한 부위에 치환, 종료 코돈의 도입, 결정적인 아미노산을 코딩하는 염기의 돌연변이, 또는 인트로 연결부위의 제거, 등).
"넉-아웃 작제물"은 세포내의 내생 DNA 서열에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 감소 또는 억제하기 위해 사용될 수 있는 핵산 서열을 나타낸다. 간단한 예로, 넉-아웃 작제물은 유전자의 결정적인 부분에 결실이 있어, 그로부터 활성 단백질을 발현할 수 없는 IL-1RN 유전자와 같은 유전자로 구성된다. 선택적으로, 여러 종결 코돈을 본래 유전자에 첨가하여 단백질의 초기 종료를 초래할 수 있으며, 또는 인트론 연결부위를 불활성화할 수도 있다. 전형적인 넉-아웃 작제물에서, 유전자의 몇 부위가 선별 마커(neo 유전자와 같은 것)로 대체되며, 이 유전자는 이하와 같다. IL-1RN 5'/neo/IL-1RN 3', 여기서 IL-1RN5' 및 IL-1RN 3'는 IL-1RN 유전자 부분의 업스트림 및 다운스트림의 게놈 또는 cDNA 서열을 각각 나타내며, neo는 네오마이신 저항 유전자를 나타낸다. 다른 넉-아웃 작제물에서, 제2의 선별 마커는 측면 위치에 첨가되며, 이 유전자는 다음과 같다. IL-1RN/neo/IL-1RN/TK, 여기서 TK는 서열의 앞선 작제물의 IL-1RN5' 또는 IL-1RN3' 서열의 어느 쪽에 첨가될 수 있으며, 더욱이 적절한 배지에서 대항적으로 선별될 수 있는(즉, 음성 선별 마커), 티민 키나제 유전자이다. 이러한 두가지-마커 작제물은 전형적으로 TK 서열을 보유하고 있는 비상동 재조합과 측면 TK 마커가 제거된 상동 재조합과의 선별을 가능하게 한다. 유전자 결실 및/또는 대체는 엑손, 인트론,특히 인트론 연결부위, 및/또는 프로모터와 같은 조절부위에 일어날 수 있다.
"연관 불균형"은 주어진 대조구 집단에서 각 대립유전자의 분리 발생 빈도가 기대되는 것보다 더 큰 두 대립유전자의 동시유전을 나타낸다. 독립적으로 유전되는 두 대립유전자에서의 기대되는 발생 빈도는 제2 대립유전자의 빈도에 배가 되는 제1 대립유전자의 빈도이다. 기대되는 빈도가 동시발생하는 대립유전자를 "연관 불균형" 상태에 있다고 말한다. 연관 불균형의 원인은 대체로 불명확하다. 이는 어떤 대립유전자의 조합의 선별 또는 유전적 이형 집단의 최근 혼합에 의한 것일 수 있다. 이에 덧붙여, 질환 유전자와 강하게 연결된 마커의 경우, 만약 질환 돌연변이가 최근 과거에 발생했다면, 특정 염색체 위치에서의 재조합으로 얻어진 균형을 위해 충분한 시간이 경과하지 않게 하기 위해, 대립유전자(또는 연결된 대립유전자들의 그룹)의 질환 유전자와의 연관이 기대되어진다. 하나 이상의 대립유전자로 구성된 대립유전자 패턴을 나타낼 때, 만약 제1 대립유전자 패턴을 포함하는 모든 대립유전자가 제2 대립유전자 패턴의 적어도 하나의 대립유전자와 연관 불균형에 있다면, 제1 대립유전자 패턴은 제2 대립유전자 패턴과 연관 불균형에 있다. 연관 불균형의 예는 IL-1RN(+2018) 및 IL-1RN(VNTR) 다형성 부위에 있는 대립 유전자 간에 발생하는 것이다. IL-1RN(+2018)의 두가지 대립 유전자는 대립유전자 1 및 대립유전자 2 상의 IL-1RN(VNTR)의 두개의 가장 빈번한 대립유전자와 100% 연관 불균형에 있다.
용어 "마커"는 개인간에 다양하다고 알려진 게놈내 서열을 나타낸다. 예를 들어, IL-1RN 유전자는 나란한 반복서열의 다양한 수(variable number of tandem repeat, VNTR)로 구성되는 마커를 가진다.
"돌연변이 유전자" 또는 "돌연변이" 또는 "기능성 돌연변이"는 돌연변이 유전자를 가지지 않는 피험체에 비해, 돌연변이 유전자를 가진 피험체의 표현형을 변화시킬 수 있는 유전자의 대립유전자 형태를 나타낸다. 돌연변이에 의해 초래된 변화된 표현형은 어떤 시약에 의해 고쳐지거나 보상될 수 있다. 만약 피험체가 변화된 표현형을 가지는 이 돌연변이에 대해 동질접합 하다면, 이 돌연변이는 열성이라고 말해진다. 만약 돌연변이 유전자의 한 카피만으로도 피험체의 표현형을 바꾸기에 충분하다면, 이 돌연변이는 우성이라고 말해진다. 만약 피험체가 돌연변이 유전자의 한 카피만을 가지고, 동질접합 및 이질접합 피험체 간의 (그 유전자에 대해)중간적인 표현형을 가진다면, 그 돌연변이는 복합-우성이라고 말해진다.
본 발명의 "비-인간 동물"에는 설치류, 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 염소 등과 같은 포유류, 제노퍼스 속의 구성원 같은 양서류, 및 형질전환 조류(예, 닭, 새 등)가 포함된다. 명세서에 사용된 용어 "키메릭 동물"은 재조합 유전자가 발견되는 동물 또는 재조합 유전자가 동물의 일부 세포에서 발현되나 모든 세포에서 발현되지는 않는 동물을 나타낸다. 용어 "조직-특이적 키메릭 동물"은 재조합 IL-1 유전자 중 하나가 기타 조직이 아닌 일부 조직에서 존재하고 및/또는 발현되거나 또는 파괴된 것을 가리킨다. 용어 "비-인간 포유류"는 인간을 제외한 포유류 문의 구성원을 나타낸다.
명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA), 및 적절하다면 리보핵산(RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 이 용어는 또한, 동등하게, 뉴클레오티드 유사체(예, 펩티드 핵산)로부터 제조된 RNA 또는 DNA 중 어느 하나의 유사체, 및, 서술된 구체예에 적용된대로, 단일(센스 또는 안티센스) 및 이중나선 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해된다.
용어 "다형성"은 유전자 또는 그 부분(예, 대립유전자 변이체)의 하나 이상 형태의 동시존재를 나타낸다. 적어도 두가지의 상이한 형태, 즉 두가지의 상이한 뉴클레오티드 서열이 있는 유전자 부분은 "유전자의 다형성 부위"로서 언급된다. 유전자의 다형성 부위에서의 특정 유전자 서열은 대립유전자이다. 다형성 부위는 상이한 대립유전자 내에서 상이한 단일 뉴클레오티드일 수 있다. 다형성 부위는 또한 수개의 뉴클레오티드 길이일 수도 있다.
용어 "질환에 대한 성향" 또한 "경향" 또는 질환 또는 어떤 유사한 상태에 대한 "감수성"은 어떤 대립유전자가 특정 질환(예, 혈관 질환)이 발전하고 있는 피험체의 발병과 연관되거나 이를 예상하는데 발견되는 것을 의미한다. 그러므로, 대립유전자는 건강한 개체와 비교하여 질환을 가지고 있는 개체에서 높은 발생 빈도를 보인다. 따라서, 이러한 대립유전자들을 예비-증상 또는 예비-질환 개체에서도 질환을 예측하는데 사용할 수 있다.
명세서에서 사용된 "소분자"는 분자량이 약 5 kD 이하인, 가장 바람직하게는 약 4 kD 이하인 조성물을 나타낸다. 소분자는 핵산, 펩티드, 펩티도미메틱, 탄수화물, 지질 또는 기타 유기 또는 무기 분자일 수 있다.
명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "특이적으로 하이브리드화하다" 또는 "특이적으로 검출하다"는 샘플 핵산의 적어도 거의 6개의 연속적 뉴클레오티드를 하이브리드화할 수 있는 핵산 분자의 능력을 나타낸다.
"전사 조절 서열"은 작동적으로 연결된 단백질 코딩 서열의 전사를 유도하고 조절하는, 개시 신호, 인핸서, 및 프로모터와 같은 DNA 서열을 나타내는, 상세한 설명에 사용된 유전 용어이다.
명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "이종 유전자"는 세포내로 도입될 수 있는 핵산 서열(예를 들어, IL-1 폴리펩티드 중 하나를 코딩하는, 또는 그것의 안티센스 전사체)을 의미한다. 이종 유전자는 도입되어질 형질전환 동물 또는 세포에 대해 부분적 또는 전체적으로 이종성, 즉, 이질적일 수 있으며, 또는 도입되어질, 그러나 삽입되도록 설계된 또는 삽입된, 삽입된 세포의 게놈을 변화시키는 방식대로 동물의 게놈에 삽입된, 형질전환 동물 또는 세포의 내생 유전자에 대해 상동성일 수 있다(예, 본래 유전자의 위치와 상이한 위치에 삽입되어, 이러한 삽입은 넉아웃을 초래한다). 이종 유전자는 또한 에피좀의 형태로 세포내에 존재할 수 있다. 이종 유전자는 선택된 핵산의 최적 발현을 위해 필수적일 수 있는, 하나 이상의 전사 조절 서열 및 인트론과 같은 다른 핵산을 포함할 수 있다.
"형질전환 동물"은 동물의 하나 이상의 세포가 본 기술분야에서 알려진 형질전환 기술과 같은 인간의 개입으로 인해 도입된 이종성 핵산을 포함하는, 어떤 동물, 바람직하게 비-인간 포유류, 새 또는 양서류을 나타낸다. 핵산은 세포에 직접적으로 또는 간접적으로 도입되는데, 이는 미세주입 또는 재조합 바이러스 감염과 같은 고안된 유전자 조작에 의해 세포의 전구체에 도입되는 것이다. 용어 유전 조작은 재조합 DNA 분자의 도입을 직접하지 않는, 전통적인 교배육종 또는 체외수정을 포함하지 않는다. 이러한 분자는 염색체내에 삽입되거나, 염색체 외적으로 복제하는 DNA일 수 있다. 명세서에서 서술된 전형적인 형질전환 동물에서, 이종 유전자는 IL-1 폴리펩티드 중 하나의 재조합 형태(예, 효능제 또는 길항제 형태 중 하나)를 발현하는 세포를 초래한다. 그러나, 재조합 유전자가 싸일런트한 경우의 형질전환 동물 또한 관찰될 것이다(예를 들어, 이하에서 서술될 FLP 또는 CRE 재조합효소 의존성 작제물). 더욱이, "형질전환 동물"은 또한 하나 이상의 유전자의 파괴가 재조합 및 안티센스 기술 모두를 포함하는 인간의 개입에 의해 초래된, 재조합 동물을 포함한다. 이 용어는 모든 자손 세대를 포함한다. 그러므로, 설립 동물 및 모든 F1, F2, F3, 등, 그들의 자손 모두가 포함된다.
명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "치료"는 상태 또는 질환의 적어도 하나의 증상을 개선하는 것은 물론이고 치유하는 것을 포함한다.
용어 "벡터"는 벡터와 연결되어있는 다른 핵산을 운반시킬 수 있는 핵산 분자를 나타낸다. 바람직한 벡터의 한 유형은 에피솜, 즉, 염색체와 별도로 복제할 수 있는 핵산이다. 바람직한 벡터는 자가 복제 및/또는 연결된 핵산의 발현을 할 수 있어야 한다. 작동하도록 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터를 명세서에서 "발현 벡터"로 표현한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 "플라스미드" 형태인데, 이는 일반적으로 원형의 이중나선 DNA 루프이고, 벡터 형태에서 염색체에 결합하지 않는다. 본 상세설명에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 혼용해서 사용되는데, 이는 플라스미드가 벡터의 가장 통상적인 형태이기 때문이다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 제공하고, 이것에 관하여 그 결과로 본 기술분야에 공지된 발현 벡터의 이러한 다른 형태들도 포함한다.
용어 "야생형 대립유전자"는 야생형 표현형을 나타내는 피험체 내에서 유전자의 대립유전자 두 카피가 존재할때의 그 대립유전자를 나타낸다. 유전자내에서 변화한 어떤 뉴클레오티드가 뉴클레오티드 변화를 가진 유전자의 두 카피를 가지는 피험체의 표현형에 영향을 주지 않을 수도 있기 때문에, 특정 유전자의 여러 상이한 야생형 대립유전자일 수 있다.
4.3. 예측 의학
4.3.1. IL-1 염증성 일배체형 및 연관된 질환 및 상태
본 발명은 적어도 부분적으로는 어떤 염증성 일배체형 패턴의 확인, 특히 IL-1B(-3737) 다형성 대립유전자를 포함하는 것, 및 이러한 패턴과 어떤 질환 또는 상태의 발달과의 연관(통계적으로 중요한 범위에)에 근거한다. 그러므로, 일배체형을 홀로 또는 피험체의 다른 수단과 함께 포함하는 대립유전자의 검출은 피험체가 특정 질환 또는 상태에 걸렸거나 걸리기쉬운 상태임을 나타낸다. 그러나, 이러한 대립유전자는 다른 대립 유전자와 연관 불균형에 있기 때문에, 이러한 다른 연결된 대립유전자의 검출은 또한 피험체가 특정 질환 또는 상태에 걸렸거나 걸리기쉬운 상태임을 나타낸다. 예를 들어, 44112332 일배체형은 이하의 유전형을 포함한다.
Figure 112010048524075-pat00001

IL-1RN 선택적 엑손(유전자 산물의 세포내 형태를 생산하는 엑손 lic)에서의 세가지의 다른 다형성은 또한 IL-1RN(VNTR)의 대립유전자 2와 연관 불균형 상태에 있다(Clay 등(1996) Hum Genet 97:723-26). 이들은 IL-1RN 엑손 lic(1812) (GenBank:X77090 at 1812); IL-1RN 엑손 1ic(1868) 다형성(GenBank:X77090 at 1868); 및 IL-1RN 엑손 1ic(1887) 다형성(GenBank:X77090 at 1887)을 포함한다. 더욱이, 유전자의 선택적으로 스플라이스된 세포내 형태를 위한 프로모터상의 다른 다형성, Pic(1731) 다형성(GenBank:X77090 at 1731), 또한 IL-1RN(VNTR) 다형성 좌의 대립유전자 2와 연관 불균형 상태에 있다. 이러한 다형성 좌 각각에서, 대립유전자 2 서열 변이체는 IL-1RN(VNTR) 좌의 대립유전자 2와 연관 불균형 상태에 있음이 결정되었다(Clay 등(1996) Hum Genet 97:723-26). 33221461 일배체형은 이하의 유전자형을 포함한다.
Figure 112010048524075-pat00002

44112332 일배체형을 가지는 개체는 전형적으로 자극하에 IL-1α및 IL-1β 단백질 둘을 과량 생산한다. 반대로, 33221461 일배체형을 가지는 개체는 전형적으로 IL-1ra를 소량 생산한다. 각각의 일배체형은 최종적으로 프로염증성 반응을 초래한다. 일배체형 내의 각각의 대립유전자는 복합 유전형 효과는 물론 효과를 가질지도 모른다. 덧붙여, 특정 질환은 일배체형 패턴 두가지 모두와 연관될 수도 있다.
이하 표 1은 유전형 마커의 수 및 마커가 통계적으로 중요한 정도로 연관되어 있음이 밝혀진 다양한 질환 및 상태를 설명한다.
[표 1]
Figure 112010048524075-pat00003

상기에서 서술된 대립유전자 패턴에 덧붙여, 명세서에 사용된 바와 같이, 본 기술분야의 당업자라면 쉽게 질환 또는 장애와 연관된 대립유전자와의 연관 불균형 상태에 있는 다른 대립유전자(다형성 및 돌연변이 포함)도 확인할 수 있다. 예를 들어, 장애를 가진 피험체의 제2군으로부터 DNA는 물론, 특정 장애를 가지지 않은 피험체의 제1군으로부터 핵산 샘플을 회수할 수 있다. 그 후, 핵산 샘플을 제1군에 비해 제2군에서 과량 나타나는 대립유전자를 확인 비교하여, 이러한 대립유전자가 비적절한 인터루킨 1 조절이 초래하거나 기여하는 장애와 연관되었음을 추정할 수 있다. 선택적으로, 장애와 연관된 대립유전자와 연관 불균형 상태에 있는 대립유전자를 확인할 수 있는데, 예를 들어, 예상치보다 더 빈번하게 함께 나타나는 대립유전자를 결정하기 위한 큰 집단의 제노타이핑 및 통계적 분석의 수행을 통해 확인될 수 있다. 군을 유전적으로 관련있는 개체들로 구성되도록 선택하는 것이 바람직하다. 유전적으로 관련있는 개체들은 동일 인종, 동일 인종 집단, 또는 동일 가족을 포함한다. 대조군 및 테스트군 간의 유전적 관련성의 정도가 증가할수록, 질병-유발 대립유전자와 더 멀리 연결된 다형성 대립유전자의 기대 수치도 증가한다. 설립 개체내의 염색체를 통해 연결되는 다형성이 유전적 크로스-오버를 통해 재분배되기 에는 적은 진화 시간이 지나가기 때문이다. 따라서, 인종-특이적, 인종집단-특이적, 및 가족-특이적 진단상 제노타이핑 분석이 인간 진화의 더 최근 시간에 일어난(예, 주된 인류로 분기된 후, 및 특정 가족 라인의 최근 역사내) 질환 대립유전자의 검출을 위해 개발될 수 있다.
두가지의 다형성 마커 간의 또는 하나의 다형성 마커와 질환-유발 돌연변이 간의 연관 불균형은 준안정적 상태에 있다. 선별 강요의 부재 또는 기초가 되는 돌연변이 현상의 산발성 연결 재발생시, 다형성은 염색체 재조합 현상에 의해 결국 분열될 것이고, 인간 진화의 과정을 통해 연관 균형에 다다를 것이다. 그러므로, 질환 또는 상태와 연관 불균형 상태에 있는 다형성 대립유전자의 발견 가능성은 적어도 두가지 요인(예, 다형성 마커 및 질환-유발 돌연변이 간의 물리적 거리의 감소, 및 연결된 쌍의 분리를 유용하게 하는 감수분열 세대 수의 감소)에 있어서의 변화로 증가할지도 모른다. 후자 요인에 대한 고려는 두 개체가 더 가깝게 관련될수록, 그들은 동일한 부모 염색체 또는 연결된 다형성을 포함하는 염색체 부위를 더 많이 공유하게 될 것이며, 연결된 쌍이 각 세대에서 일어나는 감수분열 크로스-오버를 통해 더 적게 비연결될 것이다. 결과적으로, 두 개체간에 더 가깝게 관련될수록, 다형성이 함께 유전될 더 넓은 공간이 있게 될 것이다. 따라서, 공통 인종, 인종 집단, 또는 가족과 관련된 개체의 경우, 더 멀리 공간을 둔 다형성 좌의 신뢰도는 연결된 질환-유발 돌연변이의 진화의 척도로서 의존될 수 있다.
적절한 프로브는 IL-1 좌의 특정 유전자, 예컨대 IL-1A, IL-1B 또는 IL-1RN 또는 관련 유전자에 하이브리드화하기 위해 계획될 것이다. 이러한 게놈 DNA 서열은 기술 분야에 공지되어 있으며, 도 3, 4, 및 5에서 각각 나타낸, 더 자세하게는 SEQ ID 번호 1, 2 및 3에 각각 대응되는 www.ncbi.nlm.nih.gov에서 이용가능하다. 실제로, 단일 뉴클레오티드 다형성 하나가 평균 1,000 bp 마다 존재한다고 가정하면, 인간 염색체 2의 IL-1 부위는 일부 400,000 bp에 걸쳐 퍼져 있으며, 좌 하나에 400 SNP를 포함한다. 그러나, 당면한 발명에 사용할 수 있는 다른 다형성들을 다양한 출판원으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 게놈 데이타베이스는 유전자내의 SNP를 수집했으며, 이는 거의 2,700 엔트리를 포함하는 서열에 의해 검색가능하다(http://hgbase.interactiva.de). 또한, Massachusetts Institute of Technology (MIT SNP database (http://www.genome.wi.mit.edu/SNP/human/index.html))가 보유하는 인간 다형성 데이타베이스도 이용가능하다. 다른 인간 다형성은 물론 이러한 SNP원으로부터 발견될 것이다.
예를 들어, 이러한 데이타베이스 어느 하나에서 인간 게놈의 IL-1 부위의 조사는 IL-1 좌 유전자가가 동원체 근처의 다형성 마커(127.4 cM(센티모르간) 위치에 마이크로세틀리트 마커 AFM220ze3로 디자인됨(GenBank Acc. No. Z17008를 보라)) 및 말초 다형성 마커(127.9 cM 위치에 마이크로세틀리트 앵커 마커 AFMO87xa1로 디자인됨(GenBank Ace. No. Z16545를 보라))의 측면에 위치함을 밝혔다. 이러한 인간 다형성 좌는 두개의 CA 디뉴클레오티드 반복서열 마이크로세틀리트 다형성이며, 이와 같이 인간 개체에서 높은 이형접합 정도를 나타낸다. 예를 들어, AFM220ze3의 하나의 대립유전자는 서열 TGTACCTAAGCCCACCCTTTAGAGC의 5' 프라이머 및 서열 TGGCCTCCAGAAACCTCCAA의 3' 프라이머를 사용하여, 211 bp PCR 증폭 산물을 발생시킨다. 게다가, AFMO87xa1의 하나의 대립유전자는 서열 GCTGATATTCTGGTGGGAAA의 5' 프라이머 및 서열 GGCAAGAGCAAAACTCTGTC의 3' 프라이머를 사용하여, 177 bp PCR 증폭 산물을 발생시킨다. 이러한 인간 염색체 2 CA 디뉴클레오티드 반복서열 다형성의 5' 및 3'에 존재하는 유일한 서열에 상응하는 동등한 프라이머는 본 기술분야의 당업자에게 명백할 것이다. 적당한 동등 프라이머는 디자인된 프라이머의 약 1 kb 내에서 하이브리드화되는 것 및 약 17 bp~27 bp 길이로 어느 곳에 위치하는 것을 포함한다. 유일한 인간 게놈 서열을 증폭하기 위한 프라이머의 디자인을 위한 일반적 가이드라인은, 프라이머가 적어도 50℃의 융해 온도를 가져야 한다는 것이며, 여기서 대략적인 융해 온도는 공식 Tmelt=[2*(# of A 또는 T)+4*(# of G 또는 C)]를 사용하여 계산될 수 있다.
여러 다른 인간 다형성 좌는 두개의 CA 디뉴클레오티드 반복서열 다형성 간에 발생하며, 가족내 또는 다른 유전적으로 관련있는 개체들의 군에서 예상 대립유전자의 결정을 위한 추가적 목표를 제시함다. 예를 들어, National Center for Biotechnology Information 웹 사이트(www.ncbi.nlm.nih.gov/유전자map/)는 IL-1 좌 부위의 여러 다형성 마커를 열거하며, 이러한 마커의 증폭 및 분석에 적절한 프라이머를 디자인하는 요령을 제공한다.
따라서, 본 발명의 뉴클레오티드 단편은 인간 염색체 2 q 12-13 또는 그 부위의 cDNA의 상보적 스트레치로 두플렉스 분자를 선택적으로 형성하거나, 또는 이 부위의 DNA 또는 cDNA의 증폭을 위한 프라이머를 제공하는 능력을 위해 사용될 것이다. 이러한 목적에 적절한 프라이머는 여러 인자들의 고려를 요구한다. 예를 들어, 10, 15, 또는 18 뉴클레오티드에서 약 20, 또는 약 30 뉴클레오티드까지의 길이를 가지는 단편들은 특정 유용성이 있다. 더 긴 서열, 예컨대 40, 50, 80, 90, 100, 또는 전체 길이도 어떤 구체예에서는 더 바람직할 수 있다. 적어도 약 18 내지 20 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드 길이가 본 기술분야의 당업자에게 수용될 것이며, 이는 분자 프로브로서 유용하게 특이적 하이브리드화를 하기에 충분하다. 게다가, 계획된 적용분야에 따라, 목표 서열에 대한 프로브의 특이성 정도가 다양하므로, 하이브리드화 조건도 다양하게 사용하길 바랄 것이다. 높은 특이성을 원하는 경우, 전형적으로 하이브리드를 형성하기에 상대적으로 엄격한 조건을 사용하고자 할 것이다. 예를 들어, 약 50℃~70℃에서 0.02 M-0.15M NaCl과 같은 상대적으로 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건. 이러한 선별 조건을 견딜 수 없을 수도 있으며, 만약 그렇다면 프로브와 주형 또는 목표 가닥간의 미스매치가 발생한다.
다른 대립유전자 또는 다른 장애의 인디시아는 상기 서술된 대립유전자의 검출과 함께 피험체에서 검출되거나 모니터될 수 있으며, 예를 들어, 혈관 벽 두께를 확인하거나(예, 초음파로 측정), 또는 피험체의 흡연, 음주, 과체중, 스트레스, 운동 여부를 확인하는 방법이 있다.
4.3.2. 대립유전자의 검출
인간 다형성 좌에 위치하는 특정 대립유전자를 검출하는 여러 방법들이 유용하다. 특정 다형성 대립유전자를 검출하는 바람직한 방법은 부분적으로 다형성의 분자적 성질에 의존할 것이다. 예를 들어, 다형성 좌의 다양한 대립유전자 형태는 DNA의 단일 bp만이 상이할 수도 있다. 이러한 단일 뉴클레오티드 다형성(또는 SNP)은 유전적 다양성에 주된 기여자이고, 모든 알려진 다형성의 80%를 차지하며, 이들의 인간 게놈에서의 밀도는 1,000 bp 당 평균 하나로 예측된다. SNP는 대개의 경우 빈번하게 (DNA내 발생하는 4가지의 상이한 염기에 대응되는 SNP의 4가지 상이한 형태가 이론적으로 가능함에도 불구하고) 단지 두가지의 상이한 형태에서만 양대립유전자-발생성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, SNP는 다른 다형성보다 돌연변이적으로 더 안정하여, 마커와 알려진 변이체 간의 연관 불균형을 질환-유발 돌연변이의 지도를 작성하는데 사용하는 연관된 연구 분야에 적합하다. 덧붙여, SNP는 전형적으로 단지 2개의 대립유전자만을 포함하기 때문에, 길이 측정보다 단순 플러스/마이너스 분석만으로도 유전형을 결정할 수 있어, 자동화를 가능하게 한다.
다양한 방법들이 개체내의 특정 단일 뉴클레오티드 다형성 대립유전자의 존재를 검출하는데 유용하다. 이 분야에서의 발달은 정확하고, 용이하며, 저렴한 큰 규모의 SNP 제노타이핑을 제공하는 것이다. 가장 최근에, 예를 들어, 다이나믹 대립유전자-특이적 하이브리드화(DASH), 마이크로플레이트 어레이 다이아고날 겔 전기영동(MADGE), 피로시퀀싱, 올리고뉴클레오티드-특이적 결찰, TaqMan 시스템, Affymetrix SNP 칩과 같은 다양한 DNA "칩" 기술을 포함하는 여러 신규 기술들이 밝혀져왔다. 이러한 방법들은 전형적으로 PCR에 의한 목표 유전 부위의 증폭을 요구한다. 다른 새롭게 개발된 방법들(침략적 절단 후 질량 스펙트로메트리로 작은 신호 분자의 발생, 또는 고정된 패드락 프로브 및 롤링-서클 증폭에 근거함)이 PCR의 필요를 마침내 제거할 수 있을지도 모른다. 특정 단일 뉴클레오티드 다형성을 검출하기 위한 본 기술분야에 공지된 여러 방법들을 이하에 요약하였다. 본 발명의 방법은 모든 이용가능한 방법들을 포함하는 것으로 이해되어진다.
여러 방법들이 단일 뉴클레오티드 다형성의 분석을 용이하게 하기위해 개발되어 왔다. 한 구체예에서, 단일 염기 다형성은 예를 들어 Mundy, C. R.(미국 특허 번호 4,656,127)에 공개된바와 같이, 특별한 엑소뉴클레아제-저항성 뉴클레오티드를 사용하여 검출될 수 있다. 이 방법에 따르면, 대립유전자 서열에 상보적인 프라이머(3'이 직접 다형성 부위에 상보적임)는 특정 동물 또는 인간으로부터 얻은 목표 분자에 하이브리드화 되어진다. 만약 목적 분자상의 다형성 부위가 존재하는 특정 엑소뉴클레아제-저항성 뉴클레오티드 유도체에 상보적인 뉴클레오티드를 포함한다면, 그 유도체는 하이브리드화된 프라이머의 끝에 결합할 것이다. 이러한 결합은 엑소뉴클레아제에 대해 저항성이 있는 프라이머를 표현하며, 이것의 검출을 허락한다. 샘플의 엑소뉴클레아제-저항성 유도체의 존재가 알려지면, 프라이머가 엑소뉴클레아제에 대해 저항성을 가지게 된다는 발견이 목적 분자의 다형성 부위에 존재하는 뉴클레오티드가 반응에 사용된 뉴클레오티드 유도체의 다형성 부위와 상보적이라는 것이 밝혀진다. 이 방법은 많은 양의 외부 서열 데이타의 결정이 요구되지 않는다는 이점을 가진다.
본 발명의 다른 구체예에서, 용액-기초 방법을 다형성 부위의 뉴클레오티드의 존재를 결정하는데 사용하였다. Cohen, D. 등(프랑스 특허 2,650,840; PCT 출원 번호 WO91/02087). 미국 특허 번호 4,656,127의 Mundy 방법에서처럼, 대립유전자 서열에 상보적인 프라이머(3'이 직접 다형성 부위에 상보적임)를 사용한다. 이 방법은 표지된 디데옥시뉴클레오티드 유도체를 사용하여, 이 부위의 뉴클레오티드의 동일성을 결정하는데, 만약 다형성 부위의 뉴클레오티드에 상보적이라면, 프라이머의 끝에 결합할 것이다.
유전적 비트 분석 또는 GBATM로 알려진, 대안적 방법은 Goelet, P. 등(PCT 출원 번호 92/15712)에 의해 서술된다. Goelet, P. 등의 방법은 표지된 종결자 및 다형성 부위의 서열 3'에 상보적인 프라이머의 혼합물을 사용한다. 결합되어지는 표지된 종결자는 평가되어질 목표 분자의 다형성 부위 내에 존재하는 뉴클레오티드에 의해 또는 이에 상보적인 것에 의해 결정된다. Cohen 등의 방법(프랑스 특허 2,650,840; PCT 출원 번호 WO91/02087)에 대조적으로, Goelet, P. 등의 방법은 이형 상 분석이 바람직한데, 이는 프라이머 또는 목적 분자를 고체 상에 고정시키는 것이다.
최근에, DNA내 다형성 부위를 분석하기 위한, 여러 프라이머-안내 뉴클레오티드 결합 과정들이 서술되었다(Komher, J. S. 등, Nucl. Acids. Res. 17:7779-7784 (1989); Sokolov, B. P., Nucl. Acids Res. 18:3671 (1990); Syvanen, A. -C. 등, Genomes 8:684-692 (1990); Kuppuswamy, M. N. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1143-1147 (1991); Prezant, T. R. 등, Hum. Mutat. 1:159-164 (1992); Ugozzoli, L. 등, GATA 9:107-112 (1992); Nyren, P. 등, Anal. Biochem. 208:171-175 (1993)). 이러한 방법들은 다형성 부위의 염기간 구분을 위해, 표지된 데옥시뉴클레오티드의 결합에 의존한다는 점에서, GBATM와 상이하다. 이러한 체제에서, 신호는 결합된 데옥시뉴클레오티드의 수에 비례하기 때문에, 동일 뉴클레오티드의 런에 발생된 다형성은 런의 길이와 비례한 신호를 나타낼 수 있다(Syvanen, A. -C., 등, Amer. J. Hum. Genet. 52:46-59 (1993)).
단백질 번역의 미성숙한 종결을 초래하는 돌연변이의 경우, 단백질 절단 테스트(PTT)는 유효한 진단상 접근을 제공한다(Roest, 등(1993) Hum. Mol. Genet. 2:1719-21; van der Luijt, 등(1994) Genomes 20:1-4). PTT를 위해, 먼저 RNA를 이용가능한 조직으로부터 분리하고, 역-전사한 후, 흥미있는 단편을 PCR로 증폭한다. 그 후, 역전사 PCR 산물을 네스티드 PCR 증폭을 위한 주형으로 사용하며, RNA 중합효소 프로모터 및 진핵세포 번역 개시 서열을 포함하는 프라이머를 사용한다.흥미있는 부위를 증폭한 후, 프라이머에 결합되는 유일한 모티프가 PCR 산물의 일련의 생체밖 전사 및 번역을 허가한다. 번역 산물의 소디엄 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서, 절단된 폴리펩티드의 존재는 번역의 미성숙한 종결을 초래하는 돌연변이의 존재를 나타낸다. 이러한 다양한 기술에서, 흥미있는 목표 부위가 단일 엑손에서 유래될 때에는 DNA(RNA와 반대되는)가 PCR 주형으로 사용된다.
어떤 세포 유형 또는 조직은 명세서에 서술된 진단에 사용되기 위한 핵산 샘플을 얻기 위해 사용될 것이다. 바람직한 한 구체예에서, DNA 샘플은 신체 유체, 예를 들어 공지된 기술로 얻은 혈액(예, 정맥 천자) 또는 타액에서 얻는다. 선택적으로, 핵산 테스트는 건조 샘플(예, 머리카락 또는 피부)에서도 수행될 수 있다. RNA 또는 단백질을 사용할 때, 사용되어질 세포 또는 조직은 IL-1 유전자를 발현해야만 한다.
진단 과정은 핵산 분리가 필요하지 않는 생체검사 또는 절제로부터 얻은 환자 조직의 조직 절편(고정된 및/또는 냉동된)에 직접적으로 인 시투로 수행될 수 있다. 핵산 시약은 각 인 시투 과정을 위해, 프로브 및/또는 프라이머로 사용될 수 있다(예를 들어, Nuovo, G. J., 1992, PCR in situ hybridization: protocols and applications, Raven Press, NY을 보라).
주로 핵산 서열의 검출에 초점이 맞추어졌던 방법에 추가하여, 프로파일이 이러한 검출 설계에 또한 사용되게 되었다. 핑거프린트 프로파일은 예를 들어, 차별적 전시 과정, 노던 분석 및/또는 RT-PCR을 사용하여, 발생될 것이다.
바람직한 검출 방법은 IL-1 프로염증성 일배체형의 적어도 하나의 대립유전자 위치와 오버랩되고, 돌연변이 또는 다형성 부위 주위에 약 5, 10, 20, 25, 또는 30 뉴클레오티드를 가지는 프로브를 사용하는, 대립유전자 특이적 하이브리드화이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 레스테노시스 내에 포함되는 다른 대립유전자 변이체에 특이적으로 하이브리드화 될 수 있는 여러 프로브를 고체 상 지지체, 예를 들어 "칩"(이는 약 250,000개의 오리고뉴클레오티드를 보유할 수 있다)에 붙힌다. 올리고뉴클레오티드는 석판술을 포함한 다양한 과정을 통해 고체 지지체에 결합될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이러한 칩을 사용한 돌연변이 검출 분석은, 또한 "DNA 프로브 어레이"라는 용어로도 사용되는데, 예를 들어 Cronin 등(1996) Human Mutation 7:244에 서술되어 있다. 한 구체예에서, 칩은 유전자의 적어도 하나의 다형성 부위에서의 모든 대립유전자 변이체를 포함한다. 고체 상 지지체는 테스트 핵산과 접촉하게 되고, 특정 프로브에 대한 하이브리드화로 검출된다. 이에 따라, 하나 이상의 유전자의 여러 대립유전자 변이체의 존재를 단순한 하이브리드화 실험에서 확인할 수 있다.
이러한 기술들 또한 분석 전에 핵산을 증폭하는 단계를 포함할 것이다. 증폭 기술은 본 기술분야의 당업자에게 공지되어 있으며, 클로닝, 중합효소 연쇄 반응(PCR), 특정 대립 유전자의 중합효소 연쇄 반응(ASA), 리가아제 연쇄 반응(LCR), 네스티드 중합효소 연쇄 반응, 자가 유지 서열 복제(Guatelli, J. C. 등, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 전사적 증폭 시스템(Kwoh, D. Y. 등, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), 및 Q-베타 복제효소(Lizardi, P. M. 등, 1988, Bio/Technology 6:1197)를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다.
증폭 산물은 크기 분석, 크기 분석에 이은 제한 효소 처리, 반응 산물내의 특정 태그 올리고뉴클레오티드 프라이머의 검출, 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드(ASO) 하이브리드화, 대립유전자-특이적 5' 엑소뉴클라제 검출, 시퀀싱, 하이브리드화 등을 포함하는 다양한 방식으로 분석될 것이다.
PCR 기초 검출 수단은 동시에 일어나는 다수 마커의 복잡한 증폭을 포함한다. 예를 들어, 크기가 오버랩되지 않아 자동적으로 분석 가능한 PCR 산물을 생산하기 위한 PCR 프라이머의 선택은 본 기술분야에 공지되어 있다. 선택적으로, 차별적으로 표지되어 각각이 차별적으로 검출되는 프라이머로 상이한 마커들을 증폭하는 것이 가능하다. 물론, 하이브리드화 기초 검출 수단이 샘플내의 다중 PCR 산물의 차별적인 검출을 허용한다. 다수 마커의 복잡한 분석을 위한 다른 기술들은 본 기술분야에 공지되어 있다.
단지 설명적인 구체예에서, 방법은 (i) 환자 세포로부터 샘플을 수집하는 단계, (ii) 핵산(예, 게놈, mRNA 또는 양쪽)을 샘플의 세포로부터 분리하는 단계, (iii) 핵산 샘플을 대립유전자의 하이브리드화 및 증폭이 일어날 수 있는 조건하에서, IL-1 프로염증성 일배체형의 적어도 하나의 대립유전자의 5' 및 3'에 특이적으로 하이브리드화하는 하나 이상의 프라이머와 접촉하는 단계, 및 (iv) 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다. 이러한 검출 설계는 핵산 분자가 매우 낮은 수로 존재하는 경우의 핵산 분자의 검출에 특히 유용하다.
피험체 분석의 바람직한 구체예에서, IL-1 프로염증성 일배체형의 대립유전자는 제한 효소 절단 패턴들의 선택으로 확인된다. 예를 들어, 샘플 및 대조 DNA 를 분리하고, 증폭하고(선택적으로), 하나 이상의 제한 효소로 가수분해하고, 단편 길이 크기를 겔 전기영동으로 결정한다.
또다른 구체예에서, 본 기술분야에 공지된 다양한 시퀀싱 반응은 직접적으로 대립유전자의 서열을 결정하는데 사용된다. 대표적인 시퀀싱 반응은 Maxim and Gilbert((1977) Proc. Natl Acad Sci USA 74:560) 또는 Sanger(Sanger 등(1977) Proc. Nat. Acad. Sci USA 74:5463)에 의해 개발된 기술에 근거한 것을 포함한다. 질량 스펙트로메트리에 의한 시퀀싱(예를 들어, PCT 공개 WO 94/16101; Cohen 등(1996) Adv Chromatogr 36:127-162; 및 Griffin 등(1993) Appl Biochem Biotechnol 38:147-159을 보라)을 포함하는, 다양한 자동화 시퀀싱 과정은 피험체 분석을 수행할 때 유용할 것이라고 또한 예상된다(예를 들어, Biotechniques (1995) 19:448을 보라). 어떤 구체예에서는 단지 하나, 둘 또는 세개의 핵산 염기가 시퀀싱 과정으로 결정될 필요가 있다는 것을 본 기술분야의 당업자는 명백히 알 것이다. 예를 들어, 단지 하나의 핵산만이 검출되어져야 하는 A-트랙 등도 수행될 수 있다.
추가적 구체예에서, 절단제(뉴클레아제, 히드록시아민 또는 오스민 테트록시드 및 피페리딘과 같은 것)로부터의 보호는 RNA/RNA 또는 RNA/DNA 또는 DNA/DNA 헤테로두플렉스 내에서 미스매치된 염기를 검출하는데 사용될 수 있다(Myers, 등(1985) Science 230:1242). 일반적으로, "미스매치 절단"의 기술은 샘플과 야생형 대립유전자를 포함한 (표지된) RNA 또는 DNA를 하이브리드화 함으로써 형성된 헤테로두플렉스를 제공함으로써 시작된다. 이중 나선 두플렉스를 두플렉스의 단일 가닥 부위를 절단할 수 있는 제제로 처리하는데, 이는 대조구 및 샘플 가닥 간의 염기쌍 미스매치에 의해 존재하는 단일 가닥을 인식하도록 하기 위함이다. 예를 들어, RNA/DNA 두플렉스는 RNase로 처리할 수 있으며, DNA/DNA 하이브리드는 S1 뉴클레아제로 처리하여, 미스매치된 부위를 효소적으로 가수분해하도록 한다. 다른 구체예에서, DNA/DNA 또는 RNA/DNA 두플렉스 중 어는 하나는 미스매치 부분을 가수분해하기 위해, 히드록시아민 또는 오스민 테트록시드 및 피페리딘으로 처리할 수 있다. 미스매치 부분의 가수분해 후, 돌연변이 부위를 검출하기 위해, 결과 물질을 변성 폴리아크릴아미드 겔로 크기별로 분리한다. 예를 들어, Cotton 등(1988) Proc. Natl Acad Sci USA 85:4397; 및 Saleeba 등(1992) Methods Enzymol. 217:286-295을 보라. 바람직한 구체예에서, 대조 DNA 또는 RNA는 검출을 위해 표지될 수 있다.
또다른 구체예에서, 미스매치 절단 반응은 이중나선 DNA에서 미스매치된 염기쌍을 인식하는 하나 이상의 단백질(그래서, "DNA 미스매치 회복" 효소라고 불리움)을 사용한다. 예를 들어, 대장균의 mutY 효소는 G/A 미스매치의 A를 절단하고, HeLa 세포의 티미딘 DNA 글리코실라제는 G/T 미스매치의 T를 절단한다(Hsu 등(1994) Carcinogenesis 15:1657-1662). 대표적인 실시예에 따라, IL-1 좌 일배체형의 대립유전자 상에 기초한 프로브는 테스트 세포(들)의 cDNA 또는 다른 DNA 산물과 하이브리드화한다. 두플렉스를 DNA 미스매치 회복 효소로 처리하고, 절단 산물이 있다면, 이를 전기영동 방법 등으로 검출할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,459,039을 보라.
한 구체예에서, 전기영동 이동성의 변화는 IL-1 좌 대립유전자를 확인하는데 사용될 것이다. 예를 들어, 단일 가닥 형태 다형성(SSCP)은 돌연변이체와 야생형 핵산 간의 전기영동 이동성의 차이를 검출하는데 사용될 것이다(Orita 등(1989) Proc Natl. Acad. Sci USA 86:2766, 또한 Cotton (1993) Mutat Res 285:125-144; 및 Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:73-79을 보라). 샘플 및 대조 IL-1 좌 대립유전자의 단일 가닥 DNA 단편은 변성되고, 재생이 가능하다. 단일가닥 핵산의 2차 구조는 서열에 따라 다양하며, 전기영동 이동성에 있어서의 결과적인 차이는 단지 하나의 염기 변화도 검출할 수 있게 해준다. DNA 단편은 표지되거나, 또는 표지된 프로브로 검출될 수 있다. 이 분석의 민감도는 (DNA보다) RNA를 사용하여 개선될 수 있으며, 이는 이 2차 구조가 서열 변화에 더 민감하기 때문이다. 바람직한 구체예에서, 피험체 방법은 헤테로두플렉스 분석을 이용하여, 전기영동 이동성의 변화에 근거하여, 이중나선 헤테로두플렉스 분자를 분리하게 한다(Keen 등(1991) Trends Genet 7:5).
다른 구체예에서, 변성제 구배를 포함하는 폴리아크릴아미드 겔에서의 대립유전자의 이동은 변성 구배 겔 전기영동(DGGE)(Myers 등(1985) Nature 313:495)을 사용하여 분석하였다. DGGE를 분석 방법으로 사용할 때, DNA가 완전히 변성되지 않았을 경우를 대비하여 변형시킨다. 예를 들어, PCR에 의해 고-융해성 GC-풍부 DNA의 거의 40 bp의 GC 크램프를 첨가함으로써 변형시킨다. 추가적 구체예에서, 대조구 및 샘플 DNA의 이동성의 차이를 확인하기 위해 온도 구배는 변성제 구배에 위치하여 사용한다(Rosenbaum 및 Reissner (1987) Biophys Chem 265:12753).
대립유전자를 검출하는 다른 기술의 예에는 선별적 올리고뉴클레오티드 하이브리드화, 선별적 증폭, 또는 선별적 프라이머 연장을 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 알려진 돌연변이 또는 뉴클레오티드 차이 부분(예, 대립유전자 변이체에서)을 중심에 위치시키고, 완전한 매치가 발견되야만 하이브리드화되는 조건하에서, 목표 DNA를 하이브리드화하여 제조될 수 있다(Saiki 등(1986) Nature 324:163; Saiki 등(1989) Proc. Natl Acad. Sci USA 86:6230). 이러한 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드 하이브리드화 기술은 올리고뉴클레오티드를 PCR로 증폭된 목표 DNA에 하이브리드화 할때, 반응당 하나의 돌연변이 또는 다형성 부위를 테스트하는데 사용되거나, 또는 올리고뉴클레오티드가 하이브리드화 막에 결합하고 표지된 목표 DNA와 하이브리드화 할때, 상이한 돌연변이 또는 다형성 부위의 수를 테스트하는데 사용될 것이다.
선택적으로, 선택적 PCR 증폭에 의존하는 대립유전자 특이적 증폭 기술은 현 발명과 관련해서 사용될 것이다. 특이적 증폭을 위해 프라이머로 사용된 올리고뉴클레오티드는 분자의 중심부(증폭이 차별적인 하이브리드화에 의존하도록 하기 위해) (Gibbs 등(1989) Nucleic acids Res. 17:2437-2448) 또는 프라이머의 3' 끝(적절한 조건에서, 미스매치가 억제되고 또한 중합효소의 연장을 감소한다)(Prossner (1993) Tibtech 11:238)에 흥미있는 돌연변이 또는 다형성 부위를 가질 수 있다. 추가적으로, 절단-기초 검출을 위해 돌연변이 부위에 신규한 제한효소 자리를 도입하는데에도 바람직할 것이다(Gasparini 등(1992) Mol. Cell Probes 6:1). 어떤 구체예에서는, 증폭을 위해 Taq 리가아제를 사용하여 증폭을 수행할 수도 있을 것이다(Barany(1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189). 이러한 경우에 있어서, 결찰은 5' 서열의 3' 끝이 정확히 매치되는 경우만 일어나며, 이는 증폭의 존재 또는 부존재를 관찰함으로써, 특정 위치에 알려진 돌연변이의 존재 여부를 검출하는 것을 가능하게 한다.
다른 구체예에서, 예를 들어, 미국 특허 제4,998,617호 및 문헌[Landegren, U 등,(1998)Science 241:1077-1080]에 기술된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드 결찰 분석법(OLA)을 이용하여 대립유전자 변이체의 동정을 수행하였다. 상기 OLA 프로토콜은 표적의 단일 가닥에 인접하는 서열에 하이브리드화될 수 있도록 디자인된 2개의 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 상기 올리고뉴클레오티드중 하나는 분리 마커에 결합 예컨대, 바이오틴화되어 있으며, 다른 하나는 검출 가능하도록 표지화되어 있다. 정확한 상보성 서열이 표적 분자내에서 발견되면, 상기 올리고뉴클레오티드는 말단부와 인접하도록 하이브리드화되어, 결찰 기질을 형성하게 될 것이다. 이후 결찰시킴으로써 표지화된 올리고뉴클레오티드는 아비딘이나, 또는 다른 바이오틴 리간드를 사용하여 회수될 수 있다. 문헌[Nickerson, D.A. 등]에 따르면, 핵산 검출 분석법은 PCR과 OLA의 기여도를 합한 방법이라고 기술되어 있다[Nickerson, D.A. 등,(1990), Proc.Natl.Acad.Sci,USA 87:8923-27]. 이 방법에서, PCR은 표적 DNA를 기하급수적으로 증폭시키는데 사용되며, 이후 이 DNA는 OLA를 사용하여 검출된다.
이러한 OLA 방법을 바탕으로 한 몇몇 기법이 개발되었으며, 이 기법들은 IL-1좌 단상형의 대립유전자를 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,593,826호에는 3'-아미노기와 5'-인산화된 올리고뉴클레오티드를 보유하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 포스포라미데이트 결합을 갖는 접합체를 형성하는 OLA에 관하여 개시되어 있다. 문헌[Tobe 등(1996) Nucleic Acids Res.24:3728]에 개시된 OLA의 다른 변법에서, PCR과 결합된 OLA를 통하여 단일의 미세역가 웰내 두개의 대립유전자를 형별화할 수 있다. 유일한 햅텐 즉, 디곡시게닌 및 플루오세인으로 각각의 대립유전자 특이적 프라이머를 마킹함으로써, 상이한 효소 리포터, 알칼리성 포스파타제 또는 호오스래디쉬 퍼옥시다제로 표지화된 햅텐 특이적 항체를 사용하여 각각의 OLA 반응을 검출할 수 있다. 이 시스템을 통하여 두개의 상이한 색을 발색시키는 고처리량 포멧을 사용하여 2개의 대립형질을 검출할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예는 재발협착증 진행의 소인을 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. 이 키트는 IL-1좌 반수체의 하나 이상의 대립유전자의 5' 및 3'에 하이브리드화되는 5' 및 3' 올리고뉴클레오티드를 비롯한 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 함유할 수 있다. PCR 증폭 올리고뉴클레오티드는 25∼2500 염기쌍, 바람직하게는 약 100∼약 500 염기쌍 떨어진 간격의 뉴클레오티드에 하이브리드화되어, 후속 분석에 편리한 크기를 갖는 PCR 생성물을 생성하여야 한다.
본 발명의 진단 방법에 사용하는데 특히 바람직한 프라이머로서는 다음의 것들을 포함한다:
TCTAGACCAGGGAGGAGAATGGAATGT C CCTTGGACTCTGCATGT;
IL-1B(-3737) 다형성 대립유전자 검출용으로서,
TCTAGACCAGGGAGGAGAATGGAATGT T CCTTGGACTCTGCATGT;
IL-1B(-1469) 다형성 대립유전자 검출용으로서,
ACAGAGGCTCACTCCCTTG C ATAATGCAGAGCGAGCACGATACCTGG 와
ACAGAGGCTCACTCCCTTG T ATAATGCAGAGCGAGCACGATACCTGG ; 및
IL-1B(-999) 다형성 대립유전자 검출용으로서,
GATCGTGCCACTgcACTCCAGCCTGGGCGACAG G GTGAGACTCTGTCTC 와
GATCGTGCCACTgcACTCCAGCCTGGGCGACAG C GTGAGACTCTGTCTC.
본 발명의 방법에 의한 IL-1 다형성 대립유전자의 증폭 및 검출에 사용되는 부가의 올리고뉴클레오티드의 디자인은 인간 염색체 2q13[인간 IL-1좌를 포함하는 염색체]으로부터 얻어진 최신의 서열 정보와 이 좌에 대하여 입수 가능한 최신의 인간 다형성 정보를 이용함으로써 촉진된다. 예를 들어, IL-1A, IL-1B 및 IL-1RN에 대한 DNA 서열을 도 1(GenBank 수탁 번호 X03833), 도 2(GenBank 수탁 번호 X04500) 및 도 3(GenBank 수탁 번호 X64532)에 각각 나타내었다. 이러한 유전자에서 인간 다형성을 검출하는데 적당한 프라이머는 프라이머 서열의 디자인 및 최적화에 관한 당업계에 공지된 서열 정보 및 표준적인 기법을 사용하여 용이하게 디자인될 수 있다. 이러한 프라이머 서열의 최적의 디자인은 예를 들어, 프라이머 2.1, 프라이머 3 또는 GeneFisher[Nicklin M. H. J. , Weith A.Duff G. W. , "A Physical Map of the Region Encompassing the Human Interleukin-1α, interleukin-1β, and Interleukin-1 Receptor Antagonist Genes" Genomics 19: 382 (1995); Nothwang H. G. , 등 "Molecular Cloning of the Interleukin-1 gene Cluster: Construction of an Integrated YAC/PAC Contig and a partial transcriptional Map in the Region of Chromosome 2q1 3" Genomics 41: 370 (1997); Clark, 등 (1986) Nucl. Acids. Res. , 14: 7897-7914 [published erratum appears in Nucleic Acids Res. , 15: 868 (1987) and the Genome Database (GDB) project at the URL http://www. gdb. org]와 같은 시판중인 프라이머 선별 프로그램을 사용함으로써 수행 가능하다.
키트에 사용하기 위한, 올리고뉴클레오티드는 다양한 천연 및/또는 합성 조성물 예컨대, 합성 올리고뉴클레오티드, 제한 단편, cDNA, 합성 펩티드 핵산(PNAs) 등중 임의의 것일 수 있다. 이러한 분석 키트 및 방법은 또한 표지화된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 분석중 용이하게 동정할 수 있다. 사용될 수 있는 표지의 예로서는 방사능 표지, 효소, 형광 화합물, 스트렙타비딘, 아비딘, 바이오틴, 자성 부분, 금속 결합 부분, 항원 또는 항체 부분 등을 포함한다.
상기 키트는 또한 DNA 샘플링 수단을 포함할 수도 있다. DNA 샘플링 수단은 당업계의 숙련자에게 널리 공지되어 있으며, 기질 예컨대, 필터 종이인 AmpliCard(상표명)[University of Sheffield, Sheffield, England S10 2JF; Tarlow, JW, 등 , J. of Invest. Dermatol. 103: 387-389 (1994)) 등; DNA 정제 시약 예컨대, Nucleon(상표명) 키트, 용해 완충액, 프로테이나제 용액 등; PCR 시약, 예컨대, 10X 반응 완충액, 항온성 중합효소, dNTPs 등;그리고 대립유전자 검출 수단 예컨대, HindfI 제한 효소, 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드, 건조 혈로부터 유래된 네스팅된 PCR(nested PCR)용 축퇴성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
4.3.3 약물유전학
특정 질병 또는 상태의 진행에 대한 감수성과 관련된 특정 대립유전자에 관한 지식은 단독으로, 또는 특정 질병 또는 상태에 기여하는 다른 유전적 결함에 대한 정보와 함께 개체의 유전적 프로필에 따른 예방법 또는 치료법에 맞출수 있으며, 이것이 곧 "약물유전학"의 목표이다. 따라서, 맥관 질환에 있어서 군집 프로필에 대한 개체의 IL-1 프로필을 비교하면 특정 환자 또는 환자 군집(즉, 동일한 유전자 변형을 갖는 환자 군집)에 대하여 안전하고 효과적인 것으로 예상되는 약물 또는 기타 치료 방법의 선택 또는 디자인이 가능하다.
더욱이, (예를 들어, 원인성 돌연변이에 대한 제제의 다양한 투여량의 효과를 측정하는 것은 유효 투여량을 최적화하는데 유용하므로) 유전적 프로필을 바탕으로 임상학적 이익을 가장 많이 나타내는 것으로 예측되는 군집을 표적화하는 능력은 1) 이미 시판되고 있는 약물의 재배치 ; 2) 환자 하위 군-특이적인 안전성 또는 효능을 제한한 결과로서 임상학적 진행이 불연속적인 후보 약물의 구제 ; 및 3) 후보 치료제 및 보다 최적인 약물 표지화를 위한 신속하고 비용이 덜 드는 개발을 가능하게 할 수 있다.
개체를 특정 치료제로 치료하는 것은 단백질(예컨대, IL-1α, IL-1β 또는 IL-1Ra), mRNA 및/또는 전사 수준을 측정함으로써 모니터될 수 있다. 검출된 수준에 따라서, 이후의 치료 방법은 유지되거나 또는 조절(투여량의 증가 또는 감소)될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 피험체를 제제로 처리하는데 있어서의 효능은 (ⅰ) 제제를 투여하기 이전에 피험체로부터 예비투여 샘플을 얻는 단계; (ⅱ) 예비투여 샘플중 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 수준 또는 양을 검출하는 단계; (ⅲ) 피험체로부터 하나 이상의 투여후 샘플을 얻는 단계; (ⅳ) 투여후 샘플에서 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 발현 또는 활성 수준을 검출하는 단계; (ⅴ) 예비투여 샘플중 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA의 발현 또는 활성 수준과, 투여후 샘플중 해당 단백질, mRNA 또는 게놈 DNA 각각의 발현 또는 활성 수준을 비교하는 단계; 및 (ⅵ) 이에 따라서 피험체에의 제제의 투여량을 변경시키는 단계를 포함한다.
피험체의 세포는 또한 치료제가 유해할 수 있는 유전자의 발현을 증가 또는 감소시키지 않는 치료제를 확인하는 IL-1 유전자 이외의 유전자의 발현 수준을 검출하기 위한 치료제의 투여 이전 및 이후에 얻어질 수 있다. 이는 예를 들어, 전사 프로필링 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 그러므로, 생체내 치료제에 노출된 세포로부터 유래된 mRNA와 치료제에 노출되지 않은 동일 유형의 세포로부터 유래된 mRNA는 역전사되어 다양한 유전자로부터 유래된 DNA를 함유하는 칩에 하이브리드화되어, 치료제로 처리된 세포와 처리되지 않은 세포에서 유전자의 발현을 비교할 수 있다.
4.4 IL-1 다형성과 관련된 질병 및 상태에 대한 치료제
IL-1 다형성 또는 반수체와 관련된 질병 또는 상태에 대한 치료제는 피험체내 특정 질병 또는 상태의 진행을 막거나 지연시키거나, 또는 이 질병 또는 상태의 증상을 완화시키는 임의의 제제 또는 치료 방법(약학 제제, 기능 식품 및 외과적 수단 포함)을 의미한다. 상기 치료제는 폴리펩티드, 펩티도모의체, 핵산 도는 기타 무기 또는 유기 분자, 바람직하게는 비타민, 미네랄 및 기타 영양소를 비롯한 "소분자"일 수 있다. 상기 치료제는, 천연 발생 폴리펩티드의 효과를 모의 또는 촉진(효능화) 또는 억제(길항)시킴으로써 IL-1 폴리펩티드의 하나 이상의 활성 예컨대, 수용체와의 상호작용을 조절할 수 있다. 효능제는 야생형 단백질이거나, 또는 야생형의 하나 이상의 생물 활성 예컨대, 수용체 결합 활성을 보유하는 이의 유도체일 수 있다. 효능제는 또한 유전자의 발현을 상승 조절하거나, 또는 단백질의 하나 이상의 생물활성을 증가시키는 화합물일 수도 있다. 효능제는 또한 다른 분자 예를 들어, 수용체와 폴리펩티드의 상호 작용을 증가시키는 화합물일 수도 있다. 길항제는 단백질과 다른 분자 예컨대, 수용체 또는 신호 전달 또는 번역후 프로세싱을 억제하는 제제(예를 들어, IL-1 전환 효소(ICE) 억제제) 사이의 상호작용을 억제하거나 또는 감소시키는 화합물일 수 있다. 따라서, 바람직한 길항제는 수용체에의 결합을 억제 또는 감소시켜 수용체의 후속 활성화를 억제하는 화합물이다. 길항제는 또한 유전자의 발현을 하향 조절하거나, 또는 존재하는 단백질의 양을 감소시키는 화합물일 수도 있다. 길항제는 폴리펩티드의 우성적 음의 형태 예컨대, 표적 펩티드 예를 들어, 수용체와 상호작용할 수 있으나, 이 수용체의 활성화를 촉진시키지는 않는 폴리펩티드의 형태일 수 있다. 길항제는 또한 폴리펩티드의 우성적 음의 형태를 암호화하는 핵산, 안티센스 핵산 또는 RNA와 특이적으로 상호 작용할 수 있는 리보자임일 수도 있다. 또 다른 길항제는 폴리펩티드에 결합하여 그 작용을 억제하는 분자이다. 이러한 분자로서는 예를 들어, 생물 활성을 보유하지 않는 표적 펩티드 형태와, 수용체로의 결합을 억제하는 표적 펩티드 형태를 포함한다. 그러므로, 이러한 펩티드는 단백질의 활성 부위에 결합하여 이것이 표적 펩티드와 상호작용하는 것을 막을 것이다. 또 다른 길항제로서는 분자의 에피토프와 특이적으로 상호작용하여, 상호간 결합이 폴리펩티드의 생물학적 기능을 방해하는 항체를 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 길항제는 소분자 예컨대, 폴리펩티드 및 표적 수용체 사이의 상호 작용을 억제할 수 있는 분자이다. 이와는 달리, 소분자는 수용체 결합 부위 이외의 부위와 상호 작용함으로써 길항제로서의 역할을 할 수 있다.
IL-1 유전자와의 연관 불균형을 이루는 유전자에 의하여 암호화된 단백질 또는 IL-1(예를 들어, IL-1α, IL-1β 또는 IL-1 수용체 길항제)의 조절제는 임의의 종류의 화합물 예컨대, 단백질, 펩티드, 펩티도모의체, 소분자 또는 핵산을 포함할 수 있다. 바람직한 효능제로서는 핵산(예컨대, IL-1 단백질 또는 IL-1 단백질에 의하여 상승 조절 또는 하향 조절되는 유전자를 암호화하는 핵산), 단백질(예를 들어, IL-1 단백질 또는 이로써 상승 조절 또는 하향 조절되는 단백질) 또는 소분자(예컨대, IL-1 단백질의 발현 또는 결합을 조절하는 분자)를 포함할 수 있다. 예컨대, 본원에 기술된 분석법을 사용하여 동정될 수 있는 바람직한 구체예로서는 핵산(예컨대, 단일의 (안티센스) 또는 이중 가닥의 (삼중체) DNA 또는 PNA 및 리보자임), 단백질(예를 들어, 항체), 및 IL-1 전사 및/또는 단백질 활성을 억제 또는 저해하는 소분자를 포함한다.
4.4.1 유효 투여량
이러한 화합물의 독성 및 치료 효능은 세포 배양액 또는 실험 동물에서 예를 들어, LD50(군집의 50%에 치명적인 투여량) 및 Ed50(군집의 50%에 치료학적으로 유효한 투여량)을 측정하기 위한 표준적인 제약학적 방법에 의하여 측정될 수 있다. 독성을 나타내는 투여량 및 치료학적으로 유효한 투여량 사이의 비율은 치료 지수로서, LD50/ED50의 비율로서 나타낼 수 있다. 치료 지수가 큰 화합물이 바람직하다. 독성의 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 화합물을 발병 조직의 부위에 표적화시켜 비감염 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화시킴으로써부작용을 줄이는 전달 시스템을 디자인하는데는 주의가 요구된다.
세포 배양 분석법과 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에 사용되는 일정 범위의 투여량을 공식화하는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 또는 아예 없는, ED50을 포함하는 일정 범위의 순환 농도인 것이 바람직하다. 투여량은 사용된 투여형과 이용된 투여 경로에 따라서 상기 범위내에서 다양할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용된 임의의 화합물에 있어서, 치료학적 유효량은 처음에 세포 배양 분석법으로부터 측정될 수 있다. 투여량은 동물 모델에서 공식화되어, 세포 배양액내에서 측정된 IC50(즉, 증상의 최대 억제량의 절반을 이루는 테스트 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 이룰 수 있다. 이러한 정보는 인간에 유효한 투여량을 보다 정확하게 측정하는데 사용될 수 있다. 혈장내 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의하여 측정될 수 있다.
4.4.2. 제형화 및 용도
본 발명에 의하여 사용되는 조성물은 하나 이상의 생리적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 사용하는 통상의 방식으로 제형화될 수 있다. 그러므로, 화합물 및 이의 생리학적 허용 가능한 염과 용매화물은 예를 들어, 주사, 흡입 또는 취입(구강 또는 비강을 통한) 또는 경구, 협측, 비경구 또는 직장 투여에 의한 투여용으로 제형화될 수 있다.
이러한 치료법에서, 본 발명의 화합물은 다양한 투여 로드(load) 예컨대, 전신 투여 및 국소 또는 국부 투여용으로 제형화될 수 있다. 일반적으로 기법 및 제형은 문헌[Remmington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co. , Easton, PA]에서 찾아볼 수 있다. 전신 투여에 있어서는, 근육내, 정맥내, 복강내 및 피하 주사를 비롯한 주사가 바람직하다. 주사에 있어서, 본 발명의 화합물은 액상 용액 바람직하게는, 생리적으로 혼화성인 완충액 예컨대, Hank 용액 또는 Ringer 용액내 제형화될 수 있다. 더욱이, 화합물은 고체 형태로 제형화되어 사용 직전에 재용해 또는 현탁될 수 있다. 동결 건조 형태도 포함된다.
경구 투여에 있어서, 조성물은 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 부형제 예컨대, 결합제(예를 들어, 예비겔화된 보리 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로스);충전제(예컨대, 락토즈, 미세결정질 셀룰로스 또는 인산수소칼슘);윤활제(예컨대, 스테아르산마그네슘, 활석 또는 실리카);붕해제(예컨대, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트);또는 습윤제(예컨대, 나트륨 라우릴 설페이트)를 사용하는 통상의 수단에 의하여 제조된 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수 있다. 이러한 정제는 당 업계에 널리 공지된 방법에 의하여 코팅될 수 있다. 경구 투여용 액상 제제는 예를 들어, 용액, 시럽 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있거나, 또는 사용전에 물 또는 기타 적당한 비이클과의 구성을 위한 건조 생성물로서 제공될 수 있다. 이러한 액상 제제는 약학적으로 허용 가능한 첨가제 예컨대, 현탁제(예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화된 식용 지질);유화제(예컨대, 레시틴 또는 아카시아);비수성 비이클(예컨대, 아몬드 오일, 유질 에스테르, 에틸 알콜 또는 분류된 식물성 오일); 및 보존제(예컨대, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르빈산)를 사용하여 통상의 수단으로 제조될 수 있다. 상기 제제는 또한 적당하게는 완충 염, 풍미제, 착색제 및 감미제를 함유할 수도 있다.
경구 투여용 제제는 적당히 제형화되어 활성 화합물을 제어 방출시킬 수 있다. 협측 투여의 경우, 조성물은 통상의 방식으로 제형화된 정제 또는 로진즈의 형태를 취할 수 있다. 흡입에 의한 투여의 경우, 본 발명에 의하여 사용되는 화합물은 편리하게는, 적당한 추진제 예컨대, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적당한 가스를 사용하여 에어로졸 분무 제공 형태로 가압 팩이나 분무기로부터 전달된다. 가압 에어로졸의 경우, 단위 투여량은 계량된 양을 전달하는 밸브를 통하여 결정될 수 있다. 예컨대, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물의 분말 혼합물 및 적당한 분말 기제 예컨대, 락토스 또는 전분을 함유하도록 제형화될 수 있다.
화합물은 주사 예컨대, 농축괴 주사 또는 연속 침출에 의한 비경구 투여용으로 제형화될 수 있다. 주사용 제형은 부가의 보존제와 함께 단위 투여형 예를 들어, 앰플 또는 복수 투여용 용기의 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 유질 또는 수성 비이클중 현탁액, 용액 또는 유액의 형태를 취할 수 있으며, 제형화 제제 예컨대, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 이와는 달리, 활성 성분은 사용전 적당한 비이클 예를 들어, 멸균 무발열원 물로 구성되는 분말의 형태일 수 있다.
화합물은 또한 예를 들어, 통상의 좌제 기제 예컨대, 코코아 버터 또는 기타 글리세리드를 함유하는 직장 투여용 조성물 예컨대, 좌제 또는 보유성 관장제로서 제형화될 수도 있다.
전술한 바와 같은 제형에 더하여, 화합물은 또한 데포 제제(depot preparation)로 제형화될 수도 있다. 이러한 장기 작용성 제형은 이식(예를 들어, 피하 또는 근육내 이식) 또는 근육내 주사에 의하여 투여될 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 화합물은 적당한 중합체 또는 소수성 재료(예를 들어, 허용 가능한 오일중 유액으로서) 또는 이온 교환 수지와 함께 제형화될 수 있거나, 또는 드물게는 가용성 유도체 예컨대, 드물게는 가용성 염으로서 제형화될 수 있다. 기타 적당한 전달 시스템은 장기간에 걸친 약물의 국부 비침투성 전달에 대한 가능성을 제공하는 미소구를 포함한다. 이 기법은 예비모세관 크기의 미소구를 이용하는 것으로서, 관상 카테터를 통하여 예를 들어, 심장이나 기타 기관의 특정 선택 부위로 염증 또는 국소빈혈을 일으키지 않고 주입될 수 있다. 투여된 치료제는 이와 같은 미소구로부터 서서히 방출되어, 주변의 조직 세포(예컨대, 상피 세포)에 의하여 취하여진다.
전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의하여 이루어질 수도 있다. 경점막 또는 경피 투여에 있어서, 침투될 차단막에 적당한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 경점막 투여 담즙산염 및 후시딘산 유도체를 포함한다. 또한, 세제는 침투를 촉진시키는데 사용될 수 있다. 경점막 투여는 비내 분무에 의하거나 또는 좌제를 사용할 수도 있다. 국소 투여에 있어서, 본 발명의 올리고머는 당업계에 일반적으로 공지되어 있는 바와 같은 연고, 고약, 겔 또는 크림으로 제형화된다. 세척 용액은 치료를 돕기 위하여 상처 또는 염증 부위에 국부적으로 사용될 수 있다.
원한다면, 상기 조성물은 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여형을 함유할 수 있는 팩 또는 분배 장치에 제공될 수 있다. 상기 팩은 예를 들어, 금속 또는 플라스틱 호일 예컨대, 발포고 팩을 포함할 수 있다. 상기 팩 또는 분배 장치는 투여에 관한 지침을 수반할 수 있다.
4.5. 치료제를 동정하기 위한 분석법
IL-1 다형성 또는 반수체와 관련된 질병 또는 이상의 진행을 유발시키거나 또는 이에 기여하는 돌연변이를 동정하는 것에 바탕을 둔, 본 발명은 치료제의 동정을 위한 세포계 또는 무세포 분석법임을 추가의 특징으로 한다. 하나의 구체예에서, IL-1 수용체를 발현하는 세포, 또는 IL-1 유전자와의 연관 불균형을 이루는 유전자에 의하여 암호화되는 단백질에 대한 세포막의 외표면상 수용체는 테스트 화합물이 단독으로 존재하거나, 또는 테스트 화합물과 다른 단백질이 함께 존재하는 조건하에 항온처리되며, 이때 상기 테스트 화합물과 수용체 사이의 상호작용, 또는 단백질(바람직하게는 태깅된 단백질)과 수용체 사이의 상호작용은, 마이크로피지오미터(microphysiometer)를 사용하여 검출된다[McConnell 등(1992) Science 257: 1906]. 수용체와 테스트 화합물 또는 단백질중 어느 하나와의 상호작용은 배지의 산성화 변화율로서 마이크로피지오미터로 검출된다. 그러므로 이 분석 시스템은 예를 들어, 단백질-수용체 상호작용을 방해함으로써 작용하는 분자 길항제와, 예를 들어, 수용체를 활성화함으로써 작용하는 분자 효능제를 동정하는 수단을 제공한다.
세포 또는 무세포 분석법은 또한 IL-1 유전자 또는 이와 연관 불균형 상태에 있는 유전자의 발현을 조절하거나, mRNA의 번역을 조절하거나, 또는 mRNA나 단백질의 안정성을 조절하는 화합물을 동정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 하나의 구체예에서, IL-1을 생성할 수 있는 세포, 또는 기타 단백질은 테스트 화합물과 함께 항온처리되며, 세포 배지중에 생성된 단백질의 양을 측정하여 이를 테스트 화합물과 접촉시키지 않은 세포로부터 생성된 단백질 양과 비교한다. 화합물과 단백질 사이의 특이성은 다양한 제어 분석법 예를 들어, 하나 이상의 조절 유전자의 발현을 측정함에 의하여 확인할 수 있다. 구체적으로, 이 분석법은 안티센스, 리보자임 및 삼중체 화합물의 효능을 측정하는데 사용될 수 있다. 무세포 분석법은 또한 단백질과 상호작용할 수 있는 화합물을 동정하여, 단백질의 활성을 변형시키는데 사용될 수 있다. 이러한 화합물은 예를 들어, 단백질 구조를 변형시켜 수용체에 결합될 수 있도록 만들 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이러한 화합물을 동정하기 위한 무세포 분석법은 본질적으로 결합 파트너의 존재 또는 부재하에 단백질 및 테스트 화합물 또는 테스트 화합물의 라이브러리를 함유하는 반응 혼합물을 포함한다. 테스트 화합물은 예를 들어, 결합 파트너의 유도체 예컨대, 생물학적으로 불활성인 표적 펩티드, 또는 소분자일 수 있다.
따라서, 본 발명의 하나의 대표적인 스크리닝 분석법은 단백질 또는 이의 기능성 단편과 테스트 화합물 또는 이 테스트 화합물의 라이브러리를 접촉시키는 단계, 및 복합체의 형성을 검출하는 단계를 포함한다. 검출을 위해서, 분자를 특이적 마커 및 테스트 화합물 또는 상이한 마커로 표지화된 이 테스트 화합물의 라이브러리로 표지화할 수 있다. 단백질 또는 이의 단편과 테스트 화합물의 상호작용은 이후 항온처리 단계 및 세척 단계 이후에 2개의 표지 수준을 측정함으로써 검출될 수 있다. 세척 단계 이후 2개의 표지가 존재하는 것은 상호작용에 대한 지표이다.
분자들간 상호작용은 또한 표면 플라스몬 공명(SPR) 즉, 광학적 현상을 검출하는 실시간 BIA(Biomolecular Interaction Analysis, Pharmacia Biosensor AB)를 사용하여 동정될 수도 있다. 검출은 생물특이적 계면에서의 거대 분자에 관한 물질 농도의 변화에 따라 달라지며, 상호작용 물질의 표지화가 전혀 필요치 않다. 하나의 구체예에서, 테스트 화합물의 라이브러리는 예를 들어, 미세 유동성 세포의 하나의 벽을 형성하는 센서 표면상에 고정될 수 있다. 이후 단백질 또는 이의 기능적 단편을 함유하는 용액은 계속해서 센서 표면상에 유동화된다. 신호 기록상에 나타난 공명각 변화는 상호작용이 발생하였음을 나타내는 것이다. 이 기법은 BIAtechnology Handbook by Pharmacia에 더욱 상세히 기술되어 있다.
본 발명의 다른 대표적인 스크리닝 분석법은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) (ⅰ) IL-1 또는 기타 단백질, (ⅱ) 적당한 수용체 및 (ⅲ) 테스트 화합물을 포함하는 반응 혼합물을 제조하는 단계 ;
(b) 단백질과 수용체간 상호작용을 검출하는 단계.
테스트 화합물의 부재하에서의 단백질과 수용체간 상호작용에 대한, 테스트 화합물의 존재하에서의 단백질과 수용체 사이의 상호작용에 있어서 통계학적으로 유의적인 변화(촉진 또는 억제)는 잠재적인 길항제(억제제)임을 나타낸다. 본 분석법의 화합물들은 동시에 접촉될 수 있다. 이와는 달리, 단백질은 처음에 적당한 시간 동안 테스트 화합물과 접촉될 수 있으며, 이후 이 수용체는 반응 혼합물에 첨가될 수 있다. 상기 화합물의 효능은 다양한 농도의 테스트 화합물을 사용하여 얻어진 데이터로부터 유래된 투여량 반응 곡선을 작성함으로써 평가될 수 있다. 더욱이, 대조용 분석법은 또한 비교에 대한 기준을 제공하기 위하여 수행될 수도 있다. 단백질과 수용체 사이의 복합체 형성은 다양한 기법에 의하여 검출될 수 있다. 복합체의 형성을 조절하는 것은 예를 들어, 검출 가능하도록 표지화된 단백질 예컨대 방사능 표지된, 형광 표지된, 또는 효소 표지된 단백질 또는 수용체를 사용하여, 면역분석법 또는 크로마토그래피 검출법으로 정량화될 수 있다.
통상적으로, 단백질들중 하나 또는 둘다의 비복합체형으로부터 복합체를 분리하는 것을 촉진하고, 분석법의 자동화를 조절하는 단백질 또는 수용체중 어느 하나를 고정화시키는 것이 바람직할 것이다. 단백질 및 수용체의 결합은 반응물을 함유하는데 적당한 임의의 용기에서 이루어질 수 있다. 그 예로서는 미세역가 평판, 테스트 튜브 및 미세원심분리 튜브를 포함한다. 하나의 구체예에서, 융합 단백질은 단백질을 기질에 결합시킬 수 있는 도메인을 제공할 수 있다. 예를 들어, 글루타치온-S-트랜스퍼라제 융합 단백질은 글루타치온 세파로스 비드[Sigma Chemical, St. Louis, MO] 또는 글루타치온 유도체화 미세역가 평판상에 흡착되어, 이후 수용체 예컨대, 35S-표지화된 수용체, 테스트 화합물 및 복합체를 형성시킬 수 있는 조건하 예를 들어, 염과 pH에 대한 생리학적 조건(이보다 약간 더 엄격한 조건이 바람직할 수 있지만)에서 항온처리된 혼합물과 합체될 수 있다. 항온처리후, 상기 비드는 세척되어 임의의 미결합 표지, 고정화된 기질 그리고 직접 측정된 방사능 표지(예컨대, 신틸란트중에 존재하는 비드)가 제거되거나, 또는 복합체가 해리된 이후의 상청액중에 존재할 수 있다. 이와는 달리, 상기 복합체는 SDS-PAGE에 의해 분리된 기질로부터 해리될 수 있으며, 비드 분획중에서 발견된 단백질 또는 수용체의 수준은 이하의 실시예에 기술된 바와 같은 표준적인 전기영동 기법을 사용하여 겔로부터 정량화될 수 있다. 단백질을 기질상에 고정화시키는 다른 기법도 또한 본 분석법에 사용될 수도 있다. 예를 들어, 단백질 또는 수용체는 바이오틴 및 스트렙타비딘의 접합체를 사용하여 고정화될 수 있다. 형질전환 동물은 또한 효능제 및 길항제를 동정하기 위해 제조될 수도 있거나, 또는 후보 치료제의 안전성 및 효능을 확인하기 위해 제조될 수도 있다. 본 발명의 형질전환 동물은, 적당한 내생 프로모터의 제어하에 있거나 또는 이종 프로모터의 제어하에 있는 재발협착증 원인성 돌연변이를 포함하는 비인간 동물을 포함할 수 있다.
형질전환 동물은 또한 적당한 프로모터 또는 이의 단편의 제어하에 있는 이종 유전자 예컨대, 리포터 유전자를 함유하는 동물일 수도 있다. 이러한 동물은 예를 들어, 유전자 발현을 조절함으로써 IL-1 단백질의 생성을 조절하는 약물을 동정하는데 유용하다. 형질전환된 비인간 동물을 얻는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 바람직한 구체예에서, 재발협착증 원인성 돌연변이의 발현은 예를 들어, 목적 패턴으로 발현을 제어하는 시스-작용성(cis-acting) 서열을 이용하는 세포, 조직 또는 발달 단계에 있는 특정 하위 세트에 한정되어 있다. 본 발명에서, 단백질의 이러한 모자이크식 발현은 다양한 형태의 계통 분석에 필수적일 수 있을 뿐만 아니라, 기타의 정상적인 배내 조직의 작은 패치에 있어서 발달을 다량 변형시킬 수 있는 발현 수준의 효과를 평가하는 수단을 제공할 수도 있다. 이러한 목적을 위하여, 조직-특이적 조절 서열 및 조건부 조절 서열은 특정한 입체적 패턴으로 돌연변이의 발현을 제어하는데 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 일시적인 발현 패턴은 예를 들어, 조건부 재조합 시스템 또는 원핵생물 전사 조절 서열에 의하여 제공될 수 있다. 돌연변이를 발현시킬 수 있는 유전자 기법은 생체내 부위-특이적 유전자 조작을 통하여 조절될 수 있으며, 이는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명의 형질전환 동물은 모두 그 복수개의 세포내에 본 발명의 원인성 돌연변이 이종 유전자를 포함하며, 여기서 상기 이종 유전자는 "숙주 세포"의 표현형을 바꾼다. 예시적인 구체예에서, 박테리오파지 P1의 cre / loxP 재조합효소 시스템[Lakso 등(1992) PNAS 89 : 6232-6236; Orban 등(1992) PNAS 89 : 6861-6865] 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 FLP 재조합효소 시스템[O'Gorman 등 (1991) Science 251: 1351-1355; PCT publication WO 92/15694]은 생체내 부위-특이적 유전자 재조합 시스템을 제조하는데 사용될 수 있다. Cre 재조합효소는 loxP 서열 사이에 위치하는 개입 표적 서열의 부위-특이적 재조합을 촉진한다. loxP 서열은 34개의 염기쌍으로 이루어진 뉴클레오티드 반복 서열로서, Cre 재조합효소가 결합하고 Cre 재조합효소 매개성 유전자 재조합에 필요한 서열이다. loxP 서열의 배향은 Cre 재조합효소가 존재할 경우 상기 개입 표적 서열이 절개되었는가, 아니면 역위되었는가를 결정해주는 것으로서[Abremski 등(1984) J. Biol.Chemin. 259: 1509-1514]; loxP 서열이 직접 반복부 형태로 배향될 때에는 표적 서열의 절개를 촉진하고, loxP 서열이 역위 반복부 형태로 배향될 때에는 표적 서열의 역위를 촉진한다. 따라서, 표적 서열의 유전자 재조합은 Cre 재조합효소의 발현에 따라서 달라진다. 재조합효소의 발현은 외부적으로 첨가된 제제에 의한 조절적 제어 예를 들어, 조직-특이적, 발달 단계-특이적, 유도성 또는 억제성 제어에 의하여 조절되는 프로모터 요소에 의하여 조절될 수 있다. 이와 같은 조절된 제어는 재조합효소 발현이 프로모터 요소에 의하여 매개되는 세포에서만 표적 서열의 유전자 재조합을 발생시킬 것이다. 그러므로, 원인성 돌연변이 이종 유전자의 발현을 활성화시키는 것은 재조합효소 발현의 제어에 의하여 조절될 수 있다.
원인성 돌연변이 이종 유전자 발현을 조절하기 위하여 cre / loxP 재조합효소 시스템을 사용하는 경우에는 Cre 재조합효소 및 본 발명의 단백질 둘다를 암호화하는 이종 유전자를 함유하는 형질전환 동물을 작제할 필요가 있다. 상기 Cre 재조합효소 및 재발협착증 원인성 돌연변이 이종 유전자를 함유하는 동물은 "이중" 형질전환 동물의 작제를 통하여 제공될 수 있다. 이러한 동물을 제공하는 편리한 방법은 각각 이종 유전자를 함유하는 두개의 형질전환 동물을 교접시키는 것이다.
유사한 조건부 이종 유전자는 이종 유전자의 발현을 촉진시키기 위하여 원핵생물 단백질이 동시에 발현되어야 하는 원핵생물 프로모터 서열을 사용하여 제공될 수 있다. 대표적인 프로모터 및 상응하는 교류 활성화(trans-activating) 원핵생물 단백질은 미국 특허 제4,833,080호에 제시되어 있다. 더욱이, 조건부 이종 유전자의 발현은 교류 활성화 단백질 예컨대, 재조합효소 또는 원핵생물 단백질을 암호화하는 유전자가 조직으로 전달하여 예컨대, 세포 유형 특이적 방식으로 발현시키는, 유전자 요법과 유사한 방법에 의하여 유도될 수 있다. 이러한 방법에 의하여, 이종 유전자는 전이 작용제가 도입됨으로 인하여 "작동 개시(turn on)"될 때까지 성체에 침묵의 상태로 남을 수 있었다.
대표적인 구체예에서, 본 발명의 "형질전환된 비인간 동물"은 비인간 동물의 생식계통으로 이종 유전자를 도입함으로써 제조된다. 다양한 발달 단계에 있는 배 표적 세포는 이종 유전자를 도입하는데 사용될 수 있다. 배 표적 세포의 발달 단계에 따라서 상이한 방법이 사용된다. 본 발명을 실시하는데 사용되는 임의의 동물의 특정 계통은 전반적인 양호한 건강 상태, 양호한 배 수득율, 배에 있어서의 양호한 전핵 가시성, 그리고 양호한 생식 적합성을 기준으로 선택된다. 더욱이, 반수체는 유의적인 인자이다. 예를 들어, 형질전환 마우스가 제조될 경우, 예컨대, 품종 C57BL/6 또는 FVB 계통이 종종 사용된다[Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME]. 바람직한 품종으로서는 H-2b, H-2d 또는 H-2q 반수체를 보유하는 품종 예컨대, C57BL/6 또는 DBA/1이 있다. 본 발명을 실시하는데 사용된 세포주(들)은 형질전환될 수 있으며/있거나, 넉-아웃될 수 있다[즉, 하나 이상의 유전자가 부분적으로 억제된 또는 완전히 억제된 동물로부터 얻은 세포주].
하나의 구체예에서, 이종 유전자 작제물은 단일 단계의 배에 도입된다. 접합체는 미세주입을 위한 최선의 표적이다. 마우스에서, 수컷 전핵의 크기는 지름 약 20 마이크로미터에 이르게 되어, 1∼2 pℓ의 DNA 용액을 반복적으로 주사할 수 있게 된다. 접합체를 유전자 전이용 표적으로서 사용하면, 대부분의 경우 주사된 DNA는 처음 전달되기 이전에 숙주 유전자로 혼입될 것이라는 점이 주요 이점이다[Brinster 등 (1985) PNAS 82:4438-4442]. 결과적으로, 형질전환 동물의 모든 세포는 혼입된 전이 유전자를 운반할 것이다. 생식 세포의 50%가 이종 유전자를 보유할 것이기 때문에, 일반적으로 이는 또한 이종 유전자가 기반 동물의 자손으로 효율적으로 전이되었음을 반영하게 될 것이다.
보통, 수정된 배는 전핵이 출현할 때까지 적당한 배지내에서 항온처리된다. 이즈음에, 이종 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열은 이하에 기술한 바와 같이 암컷 또는 수컷의 전핵으로 도입된다. 일부 종 예컨대, 마우스에서는 수컷 전핵이 바람직하다. 외생 유전 물질은 접합체의 수컷 DNA 상보체에 첨가된후 난자의 핵이나 접합체 암컷 전핵에 의해 프로세싱되는 것이 가장 바람직하다. 상기 난자 핵 또는 암컷 전핵은 아마도 수컷 DNA의 프로타민을 히스톤으로 치환시키고, 이로써 암컷 및 수컷 DNA 상보체가 접합하여 이배성 접합체를 형성하는 것을 촉진하는, 수컷 DNA 상보체에 영향을 미치는 분자를 방출하는 것으로 생각된다. 그러므로, 외생 유전 물질이 DNA의 수컷 상보체 또는 임의의 기타 DNA 상보체에 첨가된후 암컷 전핵에 의하여 영향을 받는 것이 바람직하다. 예를 들어, 외생 유전 물질은 수컷 전핵을 형성한후 될 수 있으면 빨리 즉, 수컷 및 암컷 전핵이 잘 분리되어 있어서, 두개가 세포막에 인접하게 위치하게 될때, 초기의 수컷 전핵에 첨가된다. 이와는 달리, 외생 유전 물질은 탈응축을 수행하도록 유도된후에 정자의 핵에 첨가될 수 있었다. 이후 외생 유전 물질을 함유하는 정자는 난자에 첨가될 수 있거나, 또는 탈응축된 정자는 그후에 될 수 있으면 빨리 이종 유전자 작제물을 사용하여 난자에 첨가될 수 있었다.
이종 유전자 뉴클레오티드 서열을 배에 도입하는 것은 당업계에 공지된 임의의 수단 예컨대, 미세주입, 전기천공, 또는 리포펙션에 의해 수행될 수 있다. 이종 유전자 뉴클레오티드 서열을 배에 도입한후, 배를 다양한 시간 동안 시험관내 항온처리할 수 있거나, 또는 대리모에 재이식할 수 있거나, 또는 상기 두가지 경우 모두를 수행할 수 있다. 성숙을 위한 시험관내 항온처리는 본 발명의 범위내에 포함된다. 약 1∼7일 동안 시험관내 배를 항온처리하는 하나의 일반적인 방법은 종에 따라서 상이한데, 대리모에 이 배를 재이식하는 것이다.
본 발명의 목적을 위하여, 접합체는 완전한 유기체로 발달할 수 있는 이배체 세포를 형성하는데 필수적이다. 일반적으로 접합체는 자연적으로, 또는 배우자(들)로부터 유래된 두개의 반수성 핵을 융합하여 인공적으로 형성한 핵을 함유하는 난자로 이루어질 것이다. 그러므로, 배우자 핵은 자연적으로 순응할 수 있는 것 즉, 기능성 유기체로의 분화 및 발달을 진행할 수 있는 생존 접합체를 생성하는 것이어야 한다. 일반적으로, 정배수성 접합체가 바람직하다. 정배수성 접합체가 얻어지면, 염색체 수는 기원 배우자중 어느 하나로부터 유래된 유기체의 정배수체 수에 비하여 하나 이상 차이가 나서는 안된다.
유사한 생물학적 관점에 더하여, 물리적 관점은 또한 접합체의 핵에 첨가될 수 있거나 또는 접합체 핵의 일부분을 형성하는 유전 물질에 첨가될 수 있는 외생 유전 물질의 양(예를 들어, 부피)을 좌우하기도 한다. 유전 물질이 제거되지 않으면, 첨가될 수 있는 외생 유전 물질의 양은 물리적으로 파괴되지 않은채 흡수될 양에 의하여 제한된다. 일반적으로, 삽입된 외생 유전 물질의 부피는 약 10 피코리터를 초과하지 않는다. 첨가에 대한 물리적 효과는 접합체의 생존을 물리적으로 파괴할 정도로 커서는 안된다. 생성된 접합체의 외생 유전 물질을 비롯한 유전 물질이 접합체가 기능성 유기체로 분화 및 발달하는 것을 생물학적으로 개시 및 유지시킬 수 있어야 하므로, DNA 서열의 수 및 다양성에 대한 생물학적 제한은 특정 접합체 및 외생 유전 물질의 기능에 따라서 다양할 것이며, 이는 당업자에게 명백히 알려질 것이다.
접합체에 첨가된 이종 유전자 작제물의 복사체 수는 첨가된 외생 유전 물질의 총량에 따라서 달라질 것이며, 이는 유전자 형질전환을 발생시킬 수 있는 양일 것이다. 이론적으로는 하나의 복사체만이 필요하지만;그러나, 일반적으로 하나의 복사체가 작용성임을 확인하기 위해서는 다수의 복사체 예를 들어, 1,000∼20,000개의 복사체의 이종 유전자 작제물이 이용된다. 본 발명에 있어서의 이점은, 외생 DNA 서열의 표현형 발현을 강화시키기 위해서는 삽입된 각각의 외생 DNA 서열중 하나 이상의 기능성 복사체를 보유한다는 것 일것이다.
세포, 핵막 또는 기타 존재하는 세포 또는 유전자 구조체에 대하여 파괴적이지 않는한, 외생 유전 물질을 핵 유전 물질에 첨가할 수 있는 임의의 기법이 사용될 수 있다. 외생 유전 물질은 미세주입법에 의하여 핵 유전 물질로 삽입되는 것이 바람직하다. 세포 및 세포 구조의 미세 주입법은 당 업계에 공지되어 있으며 또한 사용되고 있다.
재이식은 표준적인 방법을 사용하여 수행된다. 일반적으로, 대리모는 마취된후, 이의 난관에 배가 삽입된다. 특정 숙주에 이식된 배의 수는 종에 따라서 다양할 것이지만, 일반적으로는 자연적으로 생성된 종의 자손의 수에 필적할 것이다.
대리모의 형질전환된 자손은 임의의 적당한 방법에 의하여 이종 유전자의 존재 및/또는 발현에 대하여 스크리닝될 수 있다. 스크리닝은 종종 이종 유전자중 최소한의 부분에 상보성인 프로브를 사용하는, 서던 블롯 또는 노던 블롯 분석법에 의하여 수행된다. 이종 유전자에 의하여 암호화된 단백질에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석법은 이종 유전자 생성물의 존재에 대한 스크리닝을 위한 대안적이거나 또는 부가적인 방법으로서 사용될 수 있다. 통상적으로, DNA는 꼬리의 조직으로부터 준비되어, 이종 유전자에 대한 서던 분석법 또는 PCR에 의하여 분석된다. 대안적으로, 임의의 조직 또는 세포 유형이 이 분석법에 사용될 수 있음에도 불구하고, 이종 유전자를 가장 높은 수준으로 발현하는 것으로 추측되는 조직 또는 세포는 서던 분석법 또는 PCR을 사용하는 이종 유전자의 존재 및 발현에 대하여 테스트된다.
이종 유전자의 존재를 평가하는 대안적인 또는 부가적인 방법으로서는 적당한 생화학적 분석법 효소 및/또는 면역학적 분석법, 예컨대, 특정 마커 또는 효소 활성에 대한 해부학적 염색법, 유동 혈구계측 분석법 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 혈액의 분석은 또한 혈중 이종 유전자 생성물의 존재를 검출하는데 뿐만 아니라, 이종 유전자가 다양한 유형의 혈액 세포 및 기타 혈액 성분의 농도에 미치는 영향을 평가하는데 유용할 수도 있다.
형질전환 동물의 자손은 형질전환 동물과 적당한 파트너를 교합시키거나, 또는 형질전환 동물로부터 얻어진 난자 및/또는 정자를 시험관내 수정시킴으로써 얻을 수 있다. 파트너와 교접되는 경우, 이 파트너는 형질전환성 및/또는 넉아웃될 수 있거나, 또는 될 수 없으며;이것이 형질전환성인 경우, 동일하거나 또는 상이한 이종 유전자를 함유하거나, 또는 이들 둘다를 함유할 수 있다. 대안적으로, 상기 파트너는 부모의 계통일 수 있다. 시험관내 수정법이 사용되는 경우, 수정된 배는 대리모에 이식될 수 있거나 또는 시험관내에서 항온처리될 수 있거나, 또는 두가지 경우를 모두 수행할 수도 있다. 둘중 어느 하나의 방법을 사용하면, 자손은 전술한 방법, 또는 기타의 적당한 방법을 사용하여 이종 유전자의 존재에 대해 평가될 수 있다.
본 발명에 따라서 제조된 형질전환 동물은 외생 유전 물질을 포함할 것이다. 또한, 이러한 구체예에서, 서열은 예컨대, 특정 유형의 세포에서 이종 유전자 생성물을 발현시킬 수 있는 전사 제어 요소 예를 들어, 프로모터에 부착될 것이다.
이종 유전자를 비인간 동물에 도입하는데는 레트로바이러스 감염법도 사용될 수 있다. 비인간 배를 난할기에 이를 때까지 시험관내 배양시킬 수 있다. 이때, 할구는 레트로바이러스 감염에 대한 표적일 수 있다[Jaenich, R. (1976) PNAS 73: 1260-1264]. 할구는 투명대를 제거하는 효소 처리에 의하여 효율적으로 감염된다[Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986]. 이종 유전자를 도입하는데 사용된 바이러스 벡터 시스템은 통상적으로 이종 유전자를 운반하는 복제-결핍 레트로바이러스이다[Jahner 등 (1985) PNAS 82:6927-6931;Van der Putten 등 (1985) PNAS 82 :6148-6152]. 형질감염은 바이러스 생산 세포의 단일층상 할구를 배양함으로써 용이하고 효율적으로 얻어진다[Van der Putten, supra ; Stewart 등 (1987) EMBO J. 6: 383-388]. 대안적으로, 감염은 후기 단계에서 수행될 수 있다. 바이러스 또는 바이러스 생산 세포는 포배강에 주입될 수 있다[Jahner 등 (1982) Nature 298: 623-628]. 이종 유전자의 도입은 형질전환 비인간 동물을 형성하는 세포의 하위세트에서만 이루어지므로, 대부분의 기반 동물은 이종 유전자에 대하여 모자이크 형태를 띨 것이다. 뿐만 아니라, 상기 기반 동물은 일반적으로 자손을 분리시킬 게놈내 상이한 위치에 존재하는 이종 유전자를 다양한 레트로바이러스에 의하여 삽입될 수 있다. 뿐만 아니라, 임신 중기의 배의 자궁내 레트로바이러스 감염에 의해 이종 유전자를 생식 세포로 도입할 수도 있다[Jahner 등 (1982) supra].
이종 유전자 도입용 표적 세포의 세번째 유형은 배 줄기 세포(ES)이다. ES 세포는 시험관내 배양된 이식전 배로부터 유래되어 배와 융합된다[Evans 등 (1981) Nature 292: 154-156; Bradley 등 (1984) Nature 309: 255-258 ; Gossler 등 (1986) PNAS 83: 9065-9069; and Robertson 등 (1986) Nature 322: 445-448]. 이종 유전자는 DNA 형질감염에 의하거나 또는 레트로바이러스-매개성 형질도입에 의하여 ES 세포로 효율적으로 도입될 수 있다. 이와같이 형질전환된 ES 세포는 이후 비인간 동물로부터 유래된 배반포와 결합될 수 있다. 이후 상기 ES 세포는 배에 정착하여 생성된 키메라 동물의 생식 세포에 영향을 미칠 것이다[Jaenisch, R. (1988) Science 240: 1468-1474. 참조]. 본 발명은 어떠한 방식으로든 한정적인 것으로 해석되어서는 안되는 다음의 실시예들에 의해 더욱 상세히 기술된다. 언급된 모든 참조문헌(본원의 전반에 걸쳐 언급된 참조 논문, 등록 특허, 공포된 특허출원 포함)은 참조문헌으로 인용된 것이 명백하다. 달리 언급이 없는한, 본 발명의 실시에는 당업자에게 알려진 통상의 기법을 사용할 것이다. 이러한 기법은 문헌을 통하여 상세히 설명된다. 예를 들어, 문헌[Molecular Cloning A Laboratory Manual, (2nd ed. , Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989) ; DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed. , 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. , 1984); U. S. Patent No. 4,683, 195; U. S. Patent No. 4,683, 202; and Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds.,1984]을 참조하시오.
5. 실시예
5.1. IL -1B (-3737) 다형성의 분자 분석
본 실시예에서, 미리 알고 있지 않은 IL-1B 유전자의 상류 다형성의 대립유전자를 클로닝하고, 서열 결정한 다음 그 전사 효과를 분석하였다. IL-1 유전자 클러스터의 마커 사이의 고도의 연관 불균형은 이미 확인된 바 있으며, -3737에서의 새로운 다형성은 IL-1 베타 생성 속도의 변경과 염증에 대한 감수성 및 감염성 질병과 관련되어 있는 -511, -31, 및 +3954에서의 다형성과 연관되어 있다. 신규한 기능성 다형성에서의 유전형이 확인되면, IL-1 생성이 병인이 되는 질병에 대해 감수성인 유전 테스트를 더욱 직접적으로 실시할 수 있다.
인터루킨-1B(IL-1B) 유전자의 상이한 대립유전자의 전사 활성을 조사하였다. 이러한 조사는, 북유럽인들의 IL1B 대립유전자 상태가 치주염(Kornman, K. S. 등 (1999), J. Periodontal Res. 34:353), 및 위암(El-Omar, E. 등 (2000), Nature 404:398)을 비롯한 여러 만성 염증성 질병에 관여하기 때문에 매우 흥미로운 것이다.
이들 관계의 기초가 되는 분자 기전의 해석은, 합리적인 중재법의 고안을 가능하게 하여 병리 과정을 조절할 수 있고 예후성 유전자 테스트의 실행을 개선시키기 때문에 중요하다. IL1 유전자 클러스터에서의 집중적인 연관 불균형(Cox, A. 등 (1998), Am. J. Hum. Genet. 62:1180 참조)은, 현재 알려진 '마커' 다형성을 질병 과정과 인과 관계에 있는 다른 다형성('병원성 다형성')과 연관 관계에 있도록 한다. 인종에 따라 달라질 수 있는 '마커'와 '병원성' 다형성 사이의 연관도는 '마커' 다형성을 이용하는 유전자 테스트의 포괄적인 성능의 중요한 결정인자가 될 것이다. 이러한 상황을 이해한다면, 북유럽인 외에 실시되는 시판 'PST 테스트'의 유용성이 감소된다는 것을 알 것이다. Kornman, K. S. 등 (1999), J. Periodontal Res. 34:353; Armitage, G. C. 등 (2000), J. Periodontol 71:164.
만성 염증성 질병(예, 심혈관 질환, 치주염 및 위암)에 대한 감수성 증가를 담당하는 기능성 IL-1 SNP의 동정은, 예후적 유전자 테스트의 개선뿐 아니라 병리 과정을 조절하는 합리적인 중재법 고안에도 중요하다. 본 연구는 IL1B 전사에 대한 다형성의 영향을 조사하기 위해 고안되었다. IL1B-31(TATA 박스) 다형성 및 위암과의 관계를 진술한 El-Omar와 그 연구진들(El-Omar, E. 등 (2000), Nature 404:398 참조)은, TATA 박스에 대한 전사 인자 결합의 변경이 IL1B 유전자의 전사차에 관련되어 있으며, 관찰된 질병 관계(위암)에 인관 관계로 관여한다고 시사한 바 있다. 그러나, 전사 분석은 논문에 제시된 바 없었다. 본 연구에서는 (-3737) IL-1B 다형성과 IL-1B의 현재 알려진 SNP의 전사 활성을 조사하였다.
IL1B mRNA 확장을 측정하는 전사율(nuclear run on) 분석을 실시하였다. 생체외 말초혈 단핵구(PBMC)에서 이들 실험을 실시하였다. LPS 1 ㎍/㎖로 백혈구를 자극하고, 2 시간 후에 핵 추출물을 제조하였다. IL1B 클러스터에서의 상이한 유전형을 바탕으로 선택된 범위의 개체로부터 세포를 추출하였다.
각 개체를, 3가지 별도 사례에 대해 연구하고, 개체당 평균 전사 활성을 계산하였다. +3953 IL1B 다형성의 효과를 조사하기 위해 실험을 고안하였다; 다형성과 관련하여 IL1B 활성의 유의적인 차이는 관찰되지 않았다. 그러나, 데이터를 재분석하여 -511 다형성의 효과를 조사하였을 때, 대립유전자 특이적인 전사차는 명백하였다(도 2 참조).
도 2에 제시된 데이터는 IL1B 전사와 -511 다형성 상태의 관계를 뒷받침한다. 다른 연관된 다형성의 기여를 배제하는 것은 아니다. 각 다형성보다는 해플로타입이 류머티즘성 관절염, 염증성 장 질환의 경중 및 결핵 등의 일부 질병과 관련된 것으로 보고된 바 있지만(예, Cox, A. 등 (1998), Am. J. Hum. Genet. 62:1180; Wilkinson, R. J. 등 (1999), J. Exp. Med. 189:1863; Heresbach, D.등 (1997), Am. J.Gastroenterol. 92:1164; Cox, A. 등 (1999), Hum. Mol. Genet. 8:1707 참조), 이 데이터 세트는 해플로타입으로 재분석하기에는 너무 작을 수 있다(Cox, A. 등 (1998), Am. J. Hum. Genet. 62:1180 참조).
IL1B 프로모터 구조
IL1B 프로모터는 전사 개시자의 상류 약 4 kb 이상 연장되는 광범위한 구조체이다. 이 프로모터는 하기에 개략적으로 예시되어 있다(도 3). 1990년대 초의 일부 연구에서는 돌연변이유발로 그 기능을 연구하였다. 그 방법은 모든 경우에 유사하였고 리포터 유전자에 프로모터 단편을 결찰시키는 것으로 구성되었다. 엑손 1은 비코딩성이고 ATG는 엑손 2에 있으며; NcoI 제한 부위(CCATGG)는 IL1B 암호 서열의 리포터 유전자로의 치환을 용이하게 하여 엑손 1과 천연 스플라이스 시그널을 갖도록 하는 제1 코돈을 포함한다.
이들 연구에서는 2개의 주요 프로모터 영역, 즉 +547(ATG)에서 약 -lOOO bp로 연장되는 근위 프로모터 영역과 -4000 내지 -2757에 있는 원위 프로모터 영역의 존재가 입증되었다(도 2). 원위 프로모터는 '인핸서'로서 문헌에 광범위하게 언급되어 있지만(예, Bensi,G. 등 (1990), Cell Growth Differ. 1:491; Clark, B. D. 등 (1986)[공개된 오류가 Nucleic Acids Res 1987 Jan 26;15(2):868에 나타나 있음], Nucleic Acids Res. 14:7897; Cogswell, J. P. 등 (1994), J. Immunol. 153:712; Shirakawa, F. 등 (1993), Mol. Cell Biol. 13:1332), 방향 무관성은 실험적으로 정립된 바 없다.
근위 프로모터
근위 프로모터는 복수의 유효 전사 인자 결합 부위를 포함하고; NF-kB 유사 성분이 중요한 것으로 실험에 의해 밝혀졌다(Hiscott, J. 등 (1993), Mol. Cell Biol. 13:6231; Monks, B. G. 등 (1994), Mol. Immunol. 31:139; Zhang, Y. and Rom, W. N. (1993), Mol. Cell Biol. 13:3831; Krauer, K. G. 등 (1998), Virology 252:418; Tsukada, J. 등 (1997), Blood 90:3142, NF-IL6 (C/EBP), Shirakawa, F. 등 (1993), Mol. Cell Biol. 13:1332; Zhang, Y. and Rom, W. N. (1993), Mol. Cell Biol. 13:3831; Godambe, S. A.등 (1994), J. Immunol. 153:143; Godambe, S. A. 등 (1994), DNA Cell Biol. 13:561, and PU-1 like elements, Buras, J. A. 등 (1995), [공개된 오류는 Mol Immunol 1995 Oct; 32 (14-15) 1175에 나타나 있음], Mol. Immunol. 32:541; Kominato, Y. 등 (1995), Mol. Cell Biol. 15:59; Lodie, T. A. 등 (1997), J. Immunol. 158:1848; Wara-aswapati, N. 등 (1999), Mol. Cell Biol. 19:6803 참조).
원위 프로모터
원위 프로모터는 다수의 전사 인자 결합 부위(Shirakawa, F. 등 (1993), Mol. Cell Biol. 13:1332 참조)를 포함하는 코어부(-2982 →-2729) (Bensi, G. 등 (1990), Cell Growth Differ. 1:491 참조)로 구성된다. 이 영역은 단핵구에서 IL1B 유전자의 LPS 또는 PMA 유도에 필요하다(Bensi, G. 등 (1990), Cell Growth Differ. 1:491; Shirakawa, F. 등 (1993), Mol. Cell Biol. 13:1332). -2982 →-2729 영역의 C/EBP 및 NF-kB 결합 부위는 기능적으로 중요하다는 것이 실험에 의해 확인되었다(Cogswell, J. P. 등 (1994), J. Immunol. 153:712; Shirakawa, F. 등 (1993), Mol. Cell Biol. 13:1332; Gray, J. G. 등 (1993), Mol. Cell Biol. 13:6678 참조). 결실 돌연변이유발법으로부터 원위 프로모터의 짧은 -2982 →-2729 영역이 전체 원위 프로모터 영역의 활성의 약 60∼70%를 담당하고 있음이 확인되고(Cogswell, J. P. 등 (1994), J. Immunol. 153:712; Shirakawa; F. 등 (1993), Mol. Cell Biol. 13:1332) 남은 약 30%의 활성에 관여하는 -3753 내지 -2982 영역의 서열은 정해지지 않았다.
하기와 같은 실험을 실시하여, 리포터 작제물을 사용하여 상기 제시된 대립유전자 특이적 전사 변이체를 입증할 수 있는가; -31 또는 -511 다형성이 전사 변이체와 인과 관계로 관련됨을 입증할 수 있는가; 그리고 전사차와 관련된 추가의 다형성을 발견할 수 있는가를 검토한다. 연구된 영역에서의 그러한 조절 다형성의 존재가, 연구된 영역 밖에 위치하는 생리 조절과 관련된 다른 연관된 다형성의 존재를 배제하는 것은 아닌 것으로 받아들여진다.
방법
IL1B 함유 코스미드
코스미드 pCOS-IL1Bus1은 본 실험실의 Dr M. Nicklin이 제공하였다. Nicklin 박사는 1993년에 EMBL 게놈 DNA 라이브러리로부터 하이브리드화에 의해 상기 코스미드를 분리하였다. 이 라이브러리의 작제에 사용된 개체의 인종 기원은 알려지지 않았다. Nicklin 박사는 제한 지도를 제공하였다. DH5α 이.콜리에서 형질전환시키고 카나마이신 50 ㎍/㎖ LB 아가 평판에서 유지하였다. 5 ㎍/㎖ 카나마이신을 함유하는 20 ㎖ 2 ×YT 배지에서 37℃ 하에 단일 콜로니로부터 증폭시켰다.
IL1B를 함유하는 코스미드로부터 유도된 리포터 작제물
일련의 플라스미드를 작제하였다. 예비 실험으로 벡터 pGL3-인핸서가 아니라 벡터 pGL3-기본형(프로메가로부터 입수가능)이 계획한 형질감염 실험에 적절하다는 것을 확인하였다. 먼저, 벡터 pGL3-기본형을 NcoI 및 BamHI로 절단하고 근위 IL1B 프로모터(-1815 →+547)를 포함하는 코스미드 PCOS-IL1BusI로부터의 NcoI-BamHI 단편을 결찰시켜서, 플라스미드 pILG-A1을 형성하였다. 이어서, 또한 원위 프로모터를 포함하는 제2 플라스미드를 만들었다. 이 플라스미드는, 코스미드 pCOS-IL1Bus1 및 pILG-A1을 Asp718I 및 HindIII로 분해하고 원위 프로모터 -4000 내지 -1815를 절단된 pILG-A1 벡터에 결찰시켜 작제함으로써, pILG-S1을 형성하였다. pILG-S1 및 pILG-A1을 고유 내부 제한 부위로 분해하고 Klenow DNA 폴리머라제로 채우고 분자간 재결찰시켜 일련의 IL1B 프로모터의 결실 돌연변이체를 형성하였다. 그 결과 생성된 플라스미드는 하기 표 1에 제시되어 있다.
[표 1]
Figure 112010048524075-pat00004

IL1B 프로모터의 돌연변이유발
클론 S1에 대해 자동화된 이중 가닥의 서열 분석을 실시하였다. 얻은 서열 정보를 이용하여, -511 및 -31 잔기를 다른 염기로 변경하여 올리고뉴클레오티드를 고안하였다(El-Omar, E. 등 (2000), Nature 404:398; and di Giovine, F. S. 등 (1992), Hum. Mol. Genet. 1:450 참조). 이들 올리고뉴클레오티드를 '-31 프로브 1' 및 '-511 프로브 1'로 명명한다. 이들 올리고뉴클레오티드의 서열은 하기에 제시된 바와 같다(또한, 도 1에 밑줄로 표시되어 있다). 이들 서열을 사용하고 제조자의 권고 사항에 따라 GeneEditor 시스템(프로메가)을 이용하여 pILG-A1 플라스미드를 돌연변이시켰다. 올리고뉴클레오티드를 개별적으로 그리고 함께 사용하여 -31 및 -511 상태의 모든 가능한 조합을 산출하였다. 이중 가닥 DNA 서열 결정에 의해 성공적인 돌연변이유발과 2차 돌연변이의 부재를 확인하였다.
pILG-A1 유도체는 IL1B 프로모터의 -1815 →+547 단편만을 포함하므로, 이들 삽입부를 포함하는 벡터를 Asp718I 및 XmaI(SmaI)으로 분해하고, 2형 원위 프로모터를 포함하는 pILG-S1 Asp718I →XmaI 단편은 돌연변이된 근위 프로모터 상에 결찰시켰다. 생성된 벡터는 하기 표 2에 제시되어 있다.
[표 2]
Figure 112010048524075-pat00005

인간 혈액 및 세포주로부터의 DNA 추출과 유전형 결정
본 실험은 제조자의 지시에 따라서 Centra PureGene 혈액 키트를 이용하여 실시되었다. 50 ㎕ TE 완충액에서 DNA를 재현탁시키고 -20℃에서 보관하였다. ATCC에서 권장한 대로 하기와 같은 세포주를 배양하였다: HL60, A549 세포, U937, MonoMac6, EHEB-1. 이들 모든 세포주는 백인의 것이다. 1 x 107 세포를 추출하였다. 한 사람의 지원자의 PBMC로부터 DNA를 추출하였다. 참여한 유일한 지원자인 Dr. Ken Kornman(인터루킨 제네틱스 인코포레이티드의 R & D 디렉터)은 실험에 대해 동의하였다. 전술한 바와 같이 TaqMan 방법으로 세포주의 유전형을 결정하였다. 얻은 유전형이 하기 표 3에 제시되어 있다.
[표 3]
Figure 112010048524075-pat00006

인간 IL1B 프로모터의 PCR 클로닝
인간 IL1B 프로모터의 PCR 클로닝에 대한 조건을 최적화하였다. 교정 효소(Pfu 및 Pfx)를 조사하였지만 교정/Taq 조합만을 이용하여 산물이 관찰되었다. 최종 사용된 조건은 삼블록 써머사이클러, 벽이 얇은 튜브, 오일, 25 ㎕ 반응, 500 pg 주형, 200 nM dNTPs, 1 mM 프라이머 ILG-9 및 ILG-18, 1 x 헤르쿨라제 폴리머라제 완충제(스트라타젠으로부터 입수가능)였다. 헤르쿨라제는 Pfu-turbo 및 Taq DNA 폴리머라제의 혼합물이다. 사이클링은 다음과 같다: 94도 2분, 0.5 ㎕ 헤르쿨라제 폴리머라제로 고온 출발, 30 사이클(94도 30초, 66도 30초, 72도, 6분). 50 ㎕로 생성물을 희석하고, 제조자(클론테크)의 지시에 따라 Chromospin 200 겔 여과 컬럼을 사용하여 폴리머라제 및 완충제를 제거하였다. 용출된 생성물을 하기 효소로 분해하였다: 10U Asp 718I, 0.02U NcoI. 그 결과 내부 및 3' NcoI 부위의 부분 분해가 실현되었다. 혼합물을 열 불활성화시키고, 적절한 비율로 Asp718I-NcoI 분해된 pGL3-기본형 벡터로 결찰시키고, 라이브러리 효율 DH5α세포(라이프 테크놀러지)로 형질전환시켰다. 원위 인핸서에 대한 PCR 스크리닝 및/또는 제한 분석으로 양성 콜로니를 확인하였다.
각 주형으로부터 각 유전형의 2 이상의 클론을 얻었다. 완전히 독립적인 PCR 반응으로부터 클론이 유도되어, PCR 사이클에서 초기에 돌연변이가 발생한다고 하더라도, PCR 돌연변이는 복수의 분리물에서의 발생을 기초로 다형성과 구별될 수 있다.
플라스미드를 LB 배지에서 배양하였다. 최대량 제조를 위해서 150 ㎖ 배양물을 사용하였다. 내독소 무함유 TE 완충제(퀴아겐)와 튜브(Cryovials, 전사 분석을 위해 사용된 모든 플라스미드에서 ElutioPlasmid 최대량 제조가 실시되었고, 제조자의 지시에 따라서 퀴아겐 엔도프리 최대량제조 시스템을 사용하였지만, 단 양호한 침전을 산출하는 절차인 최종 이소프로판올 침전 단계는 산요 스윙 아웃 조직 배양 원심분리시 3,500 rpm에서 50 ㎖의 내독소 무함유 1회용 원심분리 튜브에서 실시하였다. Nalgene)에서 제조 및 보관하였다. 2 이상이 경우에 대해 UV 분광사진분석으로 농도를 측정하고, 제한 분석 및 겔 정량으로 확인하였다.
다형성의 확인
분리 및 서열 결정 목적으로 고안된 내부 프라이머 세트를 사용하여 자동화된 서열 결정법으로 클론을 분리 및 서열 결정하였다. Factura base calling 알고리즘(ABI)으로 평가했을 때 모호성이 > 2%면 서열은 허용되지 않는다. Factura 1.1로 모호성을 표시한 후에, AutoAssembler 2.1(ABI)에 1회 통과시켜 서열 트레이스를 단일 콘티그로 조립하였다. 불량한 조립 및 염기 서열 할당(base calling) 영역의 수동 편집을 실시하였다. 얻은 콘티그와 주석을 단 크로마토그램을 CD에 연결한다. 디폴트 파라미터를 이용하여 AutoAssember로 컨센서스를 계산하고, 얻은 서열을 정열하고 Genetyx-Mac 7.3(소프트웨어 디벨로프먼트 코포레이션) 및/또는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov로부터 실행가능한 독립적 Mac으로서 얻은 ClustalX를 사용하여 조사하였다. 육안 검사로 정렬된 서열에서의 다형성을 검색하였고, 다형성은 동일한 위치에서 하나 이상의 서열에서 더욱 빈번하게 발생하는 서열 사이의 차이로 간주하였다. 하나의 서열에서만 발견되는 단일 염기쌍 차이는 아마도 PCR에 의해 유도된 돌연변이인 것으로 생각되어, 그렇게 표시하였다.
세포주
RAW264.7 세포(ECACC 91062702)를 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 열 불활성화된 태아 송아지 혈청을 함유하는 RPMI1640에서 배양하였다. 낮은 내독소(< 10 mIU/㎖) 혈청을 사용하였다(라이프 테크놀러지). 매 3∼4일마다 1:6(면적:면적) 스크랩핑하여 세포를 분할하였다.
형질감염 및 전사 분석
96 웰 평판에서 완전 배지 100 ㎕ 중 2.5 x 104 세포/웰의 밀도로 RAW264.7 세포를 평판배양하였다. 24 시간 후에 반딧불이 루시퍼라제의 발현을 유도하는 발현 벡터 400 ng과, 구성성 프로모터 하에서 레닐라 루시퍼라제의 발현을 유도하는 pTK-rLuc(프로메가) 100 ng으로 형질감염시켰다. 이는 제조자의 지시에 따라 2.5 ㎕의 Superfect(퀴아겐)를 사용하여 실시하였다. 첨가 2.5 시간 후에 배지/DNA/리포좀 혼합물을 흡인하고 예온된 완전 배지 150 ㎕로 교체하였다. 24시간 후에, 효능제를 첨가하고 효능제 첨가 6시간 후에 양쪽 루시퍼라제 활성을 분석하였다(이중-루시퍼라제, 프로메가). 표준화된 루시퍼라제 활성을 반딧불이/레닐라 루시퍼라제 발광으로서 표시하였다.
결과 및 고찰
본 연구에서는 분화된 대식세포 유사 세포주인 RAW264 세포를 이용하였는 데, 이 세포는 IL1B 프로모터의 연구에 적절한 모델로 이미 확인된 바 있다. Shirakawa, F. 등 (1993), Mol. Cell Biol. 13:1332. 이 결과는 플라스미드에 도입된 IL1B 프로모터의 효과적인 유도를 위해 원위 프로모터가 필요하다는 것을 보여준다(도면 참조).
2형 프로모터의 활성에 대한 -31 또는 -511 다형성의 돌연변이 효과
IL1B 프로모터의 -31 TATA 박스 다형성은 대립유전자 사이의 전사 변이체에 관여하고, 이에 따른 병리 효과는 IL1B 표현형과 연루되어 있는 것으로 제안된 바 있다(El-Omar, E. 등 (2000), Nature 404:398 참조). 일부 다른 유전자에 대한 그러한 기전이 문헌에 개시된 바 있다(예컨대, Antonarakis, S. E. 등 (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 81:1154; Humphries, A. 등 (1999), Blood Cells Mol. Dis. 25:210; Peltoketo, H. 등 (1994), Genomics 23:250; Takihara, Y. 등 (1986), Blood 67:547 참조). 방법 항목에 개시된 바와 같이 게놈 DNA 라이브러리로부터 얻은 -511 프로모터 작제물을 부위 지정 돌연변이유발법으로 돌연변이시켜 -31 및 -511 위치에서 다형성의 모든 가능한 조합을 갖는 2형 작제물을 얻었다. 개별적으로 또는 조합하여 이들 다형성의 원인이 되는 전사 활성은 이 방법으로 구별될 수 있어야 한다. 1형 프로모터가 돌연변이된 이들 부위를 갖는 전환 실험은, 2형 프로모터를 이용하여 데이터를 보완한다(도 4 참조).
도 4는 실시된 3가지 대표적인 실험을 도시하는 데, 이중 관찰된 -31 또는 -511 대립유전자 상태와 관련된 전사 변이체는 없었다. 좌측 패널에서, 적용된 LPS의 농도와 프로모터 반응 간의 용량 의존 관계가 돌연변이형(-31=2, -511=2) 및 야생형(-31=1, -511=1) 프로모터에 대해 제시되어 있다. 2개의 프로모터의 전사는 테스트된 모든 농도에서 대등하였다.
상이한 공급원으로부터의 IL1B 대립유전자의 클로닝
장거리 PCR을 사용하여 IL1B 프로모터를 증폭시켰다. 이를 위해서 최적화시켜야 했지만, 특이적 증폭이 실현되었다. 교정 폴리머라제만을 사용한 초기 시도는 성공하지 못하였다(도 5 참조). 생성물을 클로닝하기 위해서, PCR 생성물을 Asp718I 및 NcoI로 분해하고 리포터 벡터 pGL3-기본형으로 결찰시켰다. 서열 독립적 클로닝법은 사용하지 않기로 하였는데, 그 이유는 삽입체에 대해 양성 선택하는 선택계 없이도 얻어지는 수율이 매우 낮기 때문이다. 이 방법은 바람직하지 않은 서열에서 이상한 돌연변이를 유발할 수 있으며, 제어하기 어렵다.
PCR에 의해 얻은 클론
시도된 모든 PCR 주형으로부터 생성물을 얻었지만, 클로닝은 일정 비율에서만 성공적이었다. KK 주형 및 EHEB-1 주형으로부터의 생성물에 대해 2개; MonoMac6 DNA로부터 1개의 독립적 반응을 얻었다. 각 반응으로부터 1개의 클론을 취하였다. 표 4에는 얻은 클론이 제시되어 있다. 요약하면, 2개의 1형 클론(둘다 EHEB-1 세포주에서 얻음), KK DNA로부터 얻은 2개의 2형 클론, MonoMac6 DNA로부터 얻은 1개의 2형 클론이 있다.
[표 4]
Figure 112010048524075-pat00007

-511 1형 및 2형 프로모터 간의 전사 변이체의 평가
상기 작제물로 RAW264 세포를 형질감염시키고, 리포다당류의 양을 다양하게 첨가한 다음 전사 활성을 측정하였다. 2가지 조제물, 즉 시판용 조제물과 S.Vogel 박사가 제공한 고도로 정제된 조제물을 시험하였다. pILG-S1과 그 돌연변이체를 이용한 초기 실험에서 양 조제물에 대해 유사한 결과를 얻었으며, 이들 실험에서는 고도로 정제된 조제물만을 사용하였다. IL1B 대립유전자의 전사를 조사하기 위해 3가지 세트의 실험을 실시하였다. 3가지 실험에서 모두 1형 및 2형 프로모터 활성 사이에 차이를 나타내었다.
도 6은 3가지 실험 중 하나를 도시한다. 상이한 대립유전자로 웰을 형질감염시켰다. 각 프로모터로 3개의 웰을 형질감염시켰다. 각 웰에 대한 형질감염 혼합물을 별도로 두었다. 좌측 패널은, 세포가 300 pg/㎖ LPS로 자극된 경우 각 웰의 전사 활성을 나타낸다. 2형 프로모터에 비하여 1형 프로모터를 이용한 경우에 전사 활성 증가가 관찰된다. 1형 대 2형 프로모터의 기하 평균차는 유의적인 차이이다(P < 0.01, Kruskall-Wallis). 우측 패널은 저 용량의 LPS에서만 이 현상이 분명하다는 것을 보여준다. 이 패널은 각 용량에서 형질감염된 3개의 삼중 웰의 평균을 도시한다. 오차 막대는 (명백함을 위해) 도시하지 않았으나, 편차는 각 지점에서 평균의 약 15∼20%이다. 더욱 고 용량에서는(6시간 째, 이 실험에서 사용된 시점임), 저 용량에서 나타난 차이가 분명하지 않다.
제2 실험(도 7)에서 용량과 유전형의 관계를 더욱 상세하게 테스트하였다. 클론 pILG-AJ2(2형, KK 유래) 및 pILG-AM1(1형, EHEB-1 유래)만을 테스트하였다(도 6 참조). 그 결과는 상기 실험과 정확하게 동일한 패턴을 나타내었다. 특히, 신규 IL-1B (-3737) 다형성 중 하나를 함유하는 플라스미드는 대립유전자 1 및 대립유전자 2 사이의 전사율에 있어서 2∼3 배 차이를 나타내었으며, 대립유전자 1이 더 높은 전사율과 관련이 있었다. 이 효과는 LPS 용량 < 10 ng/㎖에서 유의적이었다. 프로모터 활성에 대한 차등 효과는 신규 SNP의 대립유전자의 특정 돌연변이에 의해 확인되었다. 따라서, IL-1B 유전자로부터 먼 상류 인핸서 영역에서의 신규한 IL-1B(-3737) 다형성은 LPS에 대해 반응하는 전사의 기능적 차이를 유발하는 것으로 보인다.
제3 실험(도 8)에서는 분석 시점과 관찰된 차이와의 관계와 마찬가지로 용량 반응 관계를 다시 테스트하였다. 이 실험에서 AM1 및 AJ2(1형 및 2형) 클론 사이의 차이가 있었지만, 용량 반응 곡선의 형상은 다소 달랐다. 이러한 차이의 이유는 명확하지 않다. 모든 실험은 명백하게 동일한 방식으로 실시되었지만, 정확한 세포 밀도와 같은 기술적 차이는 세포 양식을 변경할 수 있을 것이다.
도 8의 하부 패널은 다른 모든 실험에서 사용된 시점인 6시간 째에 관찰된 차이에 대한 샘플링 시간의 영향을 도시한다. 시간은 관찰된 차이의 중요한 결정인자는 아니었다. 동시에 비히클을 대조군 웰에 첨가하였다: 이들 실험에서 리포터 유도가 관찰되지 않았다(도시되지 않음). 요약하면, 이 실험은 실시된 모든 실험에서 입증가능한 전사 활성의 명백하고 재현가능한 차이가 있다(1형 > 2형)는 것을 입증한다.
클론의 서열결정 및 신규 다형성의 기능적 퍼텐셜의 평가
관찰된 기능적 차이를 고려하여, 방법 항목에 개시된 바와 같이 얻은 게놈 클론을 서열 결정하고 분석하였다. 5개의 다형성이 검출되었다. 2개는 기지의 것으로서, -31 및 -511 다형성이다. 3개는 신규한 것이다.
이들 신규한 다형성의 게놈 약 20 bp 상류 및 하류를, BLAST 검색(http://www. ncbi . nlm . nih . gov / blast)에 의해 비중복 인간 DNA 데이터베이스와 비교하였다. (http://transfac.gbfbraunschweig.de/TRANSFAC/index.html)의 생물정보과학 서버를 사용하여 동일한 단편이 사용된 TRANSFAC 4.0 데이터베이스에서 전사 결합 부위를 찾았다.
사용된 서열은 하기에 제시된 바와 같다:
-3737에서의 다형성:
5' TCTAGACCAGGGAGGAGAATGGAATGT(C/T)CCTTGGACTCTGCATGT 3'
제시된 서열은 IL-1B 프로모터의 -3737에서 C/T 다형성을 포함한다. 대립유전자 1은 C이고 대립유전자 2는 T이다.
-1469에서의 다형성:
5' ACAGAGGCTCACTCCCTTG(C/T)ATAATGCAGAGCGAGCACGATACCTGG 3'
제시된 서열은 IL-1B 프로모터의 -1469에서 C/T 다형성을 포함한다. 대립유전자 1은 C이고 대립유전자 2는 T이다.
-999에서의 다형성:
5' GATCGTGCCACTgcACTCCAGCCTGGGCGACAG(G/C)GTGAGACTCTGTCTC 3'
제시된 서열은 IL-1B 프로모터의 -999에서 C/T 다형성을 포함한다. 대립유전자 1은 G이고 대립유전자 2는 C이다.
-3737과 -1469 단편은 인간 IL-1B 유전자에서만 발견된다. -999 단편은 >200 유전자에서 발견되는 데, 이것이 시사하는 바는 이 단편이 반복 성분의 일부라는 것이다. -999 반복 성분에서는 전사 인자 결합 부위가 발견되지 않았지만, 2개의 다른 단편은 모두 염증전(proinflammatory) 전사 인자에 대한 컨센서스 서열을 포함한다. -3737 다형성은 NF-kB 컨센서스 결합 서열에 존재하는 반면, -1469는 NF-IL6 (C/EBP) 컨센서스 결합 서열에 존재한다. 양 사례에서 - 스트랜드와 정렬된다. 검색 엔진의 출력이 제시된다. 좌측에서의 코드는 형질감염 입력에 연결되어 있다. 제시된 확율은, 2개의 상이한 알고리즘을 사용하여 계산된 정합의 양호성을 반영한 것이며, 양호한 정합성을 나타낸다.
-3737 5'TCTAGACCAGGGAGGAGAATGGAATGT(C/T)CCTTGGACTCTGCATGT 3'
행렬 코드 개시 P1 P2
V$NFKB_Q6 ｜ 19(-)| 1.000 ｜ 0.927 ｜aaGGGAcattccat
-1469 5' ACAGAGGCTCACTCCCTTG(C/T)ATAATGCAGAGCGAGCACGATACCTGG 3'
행렬 코드 개시 P1 P2
V$CEBP_C ｜ 11 (-) ｜ 0.992 ｜ 0.901| tgcattatGCAAGggagt
V$CEBPB_01 ｜ 14 (-)| 1.000 ｜ 0.967｜ gcattatGCAAggg
이들 결과는 하기 표 5에 요약되어 있다:
[표 5]
Figure 112010048524075-pat00008

결론
전에 알려지지 않은 -3737 다형성은, 돌연변이유발에 의해 총 프로모터 활성의 최대 30%를 담당하고 있는 것으로 밝혀진 원위 프로모터의 영역 내의 후보 NF-kB 결합 부위에 있다. 프로모터의 상이한 대립유전자가 리포터 유전자의 상류에 배치되었을 때 재현가능하고 유의적인 차이가 발견되었다. 이러한 영역에서의 연관 불균형은, 리포터 유전자의 전사에 대한 검출할 수 없는 독립적 효과를 갖는 것으로 본 실험에서 입증된 -31 및 -511에서의 공지된 SNP를 갖는 해플로타입을 형성한다. 그 결과에 의해 입증되는 것은, 근위 상류 다형성과 관련된 질병이 이들 다형성에 의해 유발되는 기능적 변경에 의해 역학적으로 설명될 수 없으며, 원위 상류 프로모터의 -3737에서 새로 발견된 기능 변경 다형성에 대한 연관이 더욱 잘 설명된다는 점이다.
실험 개요
1. RAW264.7 대식세포 유사 세포는 인간 IL-1B 프로모터의 단편에 반응한다. Asp718I(-4000) → NcoI(+547)을 포함하는 단편은 최대 반응성에 필요하였다. 그 결과는 공개된 데이터와 일치한다.
2. 인간 IL-1B 프로모터의 이 영역은 장거리 PCR에 의해 클로닝될 수 있다.
3. IL-1B 대립유전자 1형(-511)의 대립유전자 2개와 2형(-511)의 대립유전자 3개는, 주형으로서 카프카스 기원의 DNA를 사용하여 독립 PCR 반응으로부터 얻었다.
4. 이들 클론의 전사 분석은 LPS를 이용한 유도 후에 전사율에 통계학적으로 유의적인 차이를 나타내었다. 이들 차이는 실시된 모든 실험에서 확인되었다.
5. IL-1B 프로모터의 LPS 유도는 형질감염 별로 용량 의존 관계에 차이가 있었다. 그 이유는 분명하지 않았다. 일부 실험에서 1형 및 2형 대립유전자 간의 차이는, 1형과 2형의 전사율의 차이가 약 2∼3배인 최적 이하의 LPS 용량에서 분명하였다.
6. -31 및 -511에서의 2형 대립유전자의 돌연변이유발은 프로모터의 전사 활성에 영향을 미치지 않았다.
7. 따라서, 1형 및 2형 프로모터 사이의 전사차는 현재까지 발견되지 않은 다형성(들)에 기인해야 한다. 얻은 클론의 자동화된 이중 가닥 서열결정을 실시하여 미지의 다형성을 동정하였다.
8. 다형성은 상이한 클론의 동일한 위치에서 발생하는 변이체로서 정의된다. 하나의 클론에서만 관찰되는 단일 염기쌍 변화는 PCR 유도된 돌연변이인 것으로 간주되었다. DNA의 확장체(IL-1B Asp718I(-4000) → NcoI(+547)) 중에 5개의 다형성이 검출되었다. -511 및 -31에서의 다형성 중 2개는 이미 알려진 것이고, 나머지 3개는 문헌에 기재된 적이 없는 것이다.
Figure 112010048524075-pat00009

9. 아직 알려지지 않은 -3737 다형성은 프로모터 활성의 최대 30%와 관련된 것으로 돌연변이유발에 의해 이미 확인된 원위 프로모터 영역 내의 후보 NF-kB 결합 부위에 있다.
5.2. IL -1B(-3737) 다형성은 중국인의 치주염과 관련되어 있다
IL-1A(+4845) 및 IL-1B(+3954)와 같은 일부 IL-1 유전자 다형성은 백인의 치주염 질병의 경중과 관련되어 있지만, 중국인을 비롯한 일부 인종에서는 드물게 발견된다. IL-1b에 대한 먼 상류의 인핸서 영역에 존재하는 신규한 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), IL-1B(-3737)가 이러한 상황에서 연구된 적이 없었다. 명백하게, IL-1B(-3737) 다형성의 대립유전자 1은 전사율을 증가시키는 것으로 밝혀졌다(상기 참조). 본 연구에서는 IL-1B(-3737) 유전형의 개체군 분포를 평가하고 중국계의 질병과 관련이 있는 것으로 결정하였다.
방법
IL-1B(-3737) 및 기타 IL-1 SNP에 대한 유전형 결정은 TaqMan법을 사용하여 실시하였다. IL-1B(-3737)의 분포는 미지의 치주염 상태에 있는 500명의 성인 백인(연령 27∼77세)과 중국계 300명(연령 21∼69세)에서 평가하였다. 생물학적 모계 및 부계의 조부 및 증조부가 본토 중국, 타이완, 마카오 또는 홍콩 기원인 경우에는 피험체를 중국계인 것으로 간주하였다. 이 연구에 참여시킨 피험체는 일반적인 건강 상태가 양호하고 14개 이상의 자연치를 갖고 있었다. 중국인의 IL-1B(-3737)와 치주염 질환의 관계는 다변량 기호 논리 회귀 모델로 결정하였다.
결과
IL-1B(-3737) 유전형은 하기 표에 제시된 바와 같이 분포되어 있었다.
Figure 112010048524075-pat00010

백인에서 저 전사 유전형 IL-1B(-3737) = 2.2(n=97)를 보유한 피험체 중 88.3%는, IL-1A(+4845) 및 IL-1B(+3954)에서 대립유전자 2를 포함하는 복합 IL-1 유전형(PST(등록상표))에 대해 음성이었다. 복합 IL-1 유전형에 대해 양성인 피험체(n=201) 중에서, 94%는 IL-1B(-3737)에서 고 전사 대립유전자인 대립유전자 1을 보유하였다. 비흡연자인 중국인 피험체(n=163)에서 IL-1B(-3737) 유전형은 질병과 유의적으로 관련되어 있었으며(OR=3.027; 95% CI: 1.139-8.046; p=0.026), 고 전사 유전형 1.1을 보유하는 군에서는 위험 증가가 있다.
결론
백인에서 복합 IL-1 유전형에 대해 양성인 대부분의 개체는 전사율을 증가시키는 새로 발견된 IL-1B(-3737) 유전형에 대해서도 양성이었다. IL-1B(-3737) 유전자 다형성은 중국에서 빈번하게 발생하고, 유전형 분포는 중국인 및 백인에서 유사한 것으로 밝혀졌다. 중국인의 IL-1B(-3737) 고 전사 유전형은 치주 질환과 유의적으로 관련되어 있었다.
5.3. -3737 및 기타 IL -1 기능성 다형성에 대한 NF - kB 결합의 BIAcore 결합 분석
p50 호모이량체와 DNA의 상호작용의 반응 속도 분석
스트렙타비딘 센서 칩에 부착된 DNA 기질과 단백질의 상호작용에 대한 반응 속도 파라미터를 얻기 위해서 BIAcore를 이용하여 NF-kB p50의 결합을 연구하였다. 듀플렉스 1은 컨센서스 NK-kB 결합 부위를 포함하였으며, 듀플렉스 2 및 3은 컨센서스 서열 중 단일 뉴클레오티드 다형성에서 차이가 난다(표 6 참조). 일정 농도의 단백질을, 저염 농도(75 mM NaCl) 및 고염 농도(150 mM NaCl)에서 센서 칩 표면에 통과시켰다. Hart 등(Nucleic Acids Res. 27,1063-1069 (1999))은 염 농도가 DNA 인식의 특이성 및 친화도에 영향을 준다는 것을 밝힌 바 있다. 저염 농도에서 DNA 기질에 대한 NF-kB p50의 결합은 도 9A에 도시되어 있다. 도 9는 DNA 기질에 대한 NF-kB p50 호모이량체의 결합을 도시한다. (A) 75 mM NaCl에서 상이한 듀플렉스 DNA 기질에 대한 NF-kB p50(17.5 nM)의 결합을 도시하는 센서그램. (B) 150 mM NaCl에서 상이한 듀플렉스 DNA 기질에 대한 NF-kB p50(17.5 nM)의 결합을 도시하는 센서그램. 3개의 모든 DNA 기질에 대한 결합이 관찰되지만, 해리 속도 상수(해리 구배)는 3개 복합체에서 다르다는 것을 센서그램으로부터 명백하게 확인할 수 있다. 결합 및 해리 속도 상수는 센서그램의 결합 및 해리 상태로부터 별도로 계산되며, 표 7에 제시되어 있다. 이들 결과는, NF-kB p50이 1-5 × 106(M-1s-1) 범위의 유사한 결합 속도 상수를 갖는 상이한 DNA 기질에 결합한다는 것을 보여준다. 그러나, 각종 DNA-단백질 복합체에 대한 해리 속도 상수는 유의적으로 다르다. NF-kB p50-컨센서스 DNA 복합체(듀플렉스 1)는 최저 해리 속도 상수를 갖는다(즉, 가장 안정한 복합체이다). 평형 해리 상수는 실험 ka 및 kd 값을 이용하여 계산하였으며, 표 7에 제시되어 있다. NF-kB p50은 (75 mM 염 농도에서)15 pM의 친화도로 컨센서스 서열에 결합하는 것으로 확인되었는데, 이것은 이전의 SPR 분석(Hart 등, 1999)과 일치하는 것이며, 듀플렉스 2의 친화도는 130 pM이고 듀플렉스 3의 치환도는 2000 pM이었다.
그 다음 생리적인 조건(0.15M NaCl)과 더욱 유사한 고염 농도에서 SPR 분석을 반복하였다. NF-kB p50의 DNA 기질에 대한 결합은 도 9B에 도시되어 있다. 그 결과는 이들 조건하에서 듀플렉스 3에 대한 결합이 관찰되지 않는다는 것으로 보여준다. 또, 듀플렉스 1 및 2는 유사한 결합을 나타내지만 해리 반응 속도는 다르며, (반응의 수준으로 확인되는 바와 같이) 듀플렉스 2에 대한 단백질 결합 수준은 75 mM NaCl에서의 결합과 비교하여 휠씬 낮다. 150 mM NaCl에서의 결합에 대한 반응 속도 데이터는 표 7에 제시되어 있다. 이 결과는 또한 결합 속도 상수는 유사하지만, 해리 속도 상수는 유의적으로 다르다는 것을 보여준다. 단백질-DNA 복합체에 대한 해리 속도 상수는 75 mM NaCl에서의 속도에 비하여 높았으며, 이는 염 농도가 높을 수록 복합체의 안정성이 감소된다는 것을 의미한다. 또한, 듀플렉스 1/2-NF-kB p50 복합체의 해리 속도 상수는, 저염 농도에서 4배 차이가 관찰된 것에 비하여, 고염 농도에서 36배 차이가 있었다. 컨센서스 서열-NF-kB p50 결합에 대한 평형 해리 상수는 각각 0.2 nM 및 12 nM이며, 이것은 저염 조건에서 친화도가 9배 차이로 관찰되는 것과 비교하여 60배의 친화도 차이를 나타낸다. 이들 결과는, 염 농도가 높을 수록 DNA 기질에 대한 전체 친화도는 감소되지만, DNA 인식의 특이성은 증가하며, 듀플렉스 3에 대한 결합은 관찰되지 않고 듀플렉스 2와 컨센서스 서열을 비교하면 친화도 차이가 60배라는 것을 보여준다.
IF-kB 결합 부위의 분자 인식
DNA 기질에 결합한 NF-kB p50 호모이량체의 상호작용에 대한 2개의 결정 구조를 얻은 바 있다(Muller 등 (1995) Nature, 373, 311-317; Ghosh 등 (1995) Nature, 373, 303-310 참조). 2개의 동시 결정 구조는 상이한 길이 및 서열의 DNA 기질을 포함하지만, 유사성이 많다. 각 p50 호모이량체 서브유닛에서 2개의 Arg 측쇄는 2개의 중심 구아닌에 대한 1쌍의 수소 결합을 나타낸다(G2 및 G3, 표 6 참조). 이들 접촉은 DNA 인식의 가장 중요한 성분일 것으로 예측된다(Muller 등, 1995). Lys 잔기는 최내부의 G4에 특이적으로 접촉하는 것으로 확인되지만, Lys 측쇄의 비교적 비제약적인 특성으로 인하여 특이성의 예측가능성이 적어진다. 최외부 G1은 Muller 등(1995)의 구조에서 His 측쇄와 접촉하는 것으로 확인되었다. 측쇄와 염기 사이에 여러가지 다른 특이적 상호작용이 있으며, 이는 2개의 공동 결정 구조에 있어서 약간의 차이가 있다. 이것이 시사하는 바는, DNA 결합 성분의 일부가 가요성이며, 컨센서스 서열의 가변부 내의 상이한 서열을 인식할 수 있다는 것이다. p50 호모이량체의 DNA 인식에 대한 SNP의 효과는, SPR 실험에서 듀플렉스 2 및 3을 사용하여 얻은 반응 속도 데이터를 비교하여 조사하였다. 듀플렉스 3은, 듀플렉스 2의 G/C 염기쌍과 비교하여 +4 위치에서 A/T 염기쌍을 포함한다. G4는 결정 구조에서 Lys(Ghosh 등(1995)의 번호매김에 따라 241)과 중요한 상호작용을 하는 것으로 확인된다(도 9 참조). 그러나, 구아닌을 아데닌으로 치환하면 이러한 상호작용이 없어지고 아데닌의 N6 아미노기와 Lys 측쇄 사이에 가능한 입체 충돌을 나타낸다. 이러한 상호작용의 효과는, 저염 조건에서 친화도가 15배 감소된 제시된 친화도 데이터에서 명백하게 입증된다. 고염 농도에서는, 단백질-DNA 복합체의 불안정성과 매우 빠른 해리 속도로 인하여 듀플렉스 3에 대한 결합이 관찰되지 않는 것처럼, 이러한 차이가 더욱 커질 것으로 예상된다. 이들 결과는 NF-kB p50의 분자 인식에 대한 SNP의 급격한 효과를 입증한다. 또한, 이 결과는 컨센서스 서열의 G1 위치에서 변경의 효과를 보여준다. 듀플렉스 1(컨센서스 서열)과 비교하여, 듀플렉스 2는 1 및 12번 위치에서 A/T 염기쌍을 포함한다. 결정 구조(Muller 등, 1995)는 각 p50 서브유닛에서 His67이 G1과 접촉하며(도 9D 참조), G1을 아데닌으로 다시 치환하면 이러한 상호작용은 없어진다는 것을 보여준다. 또, 이러한 효과는 친화도 데이터에서도 확인된다. 저염 농도에서 친화도가 9배 감소하며, 고염 농도에서는 60배 차이가 난다. 결론적으로, 제시된 친화도 데이터는, G4에서 A4로의 변경이 G1에서 A1으로의 변경과 비교하여 NF-kB p50의 DNA 상호작용의 친화도에 휠씬 많은 영향을 준다는 것을 제시한다. 친화도에 대한 이들 효과는 구조 데이터로 쉽게 조정할 수 있다.
재료 및 방법
올리고뉴클레오티드 기질
시아노에틸 포스포르아미디트 화학을 이용하여 어플라이드 바이오시스템즈 394 DNA 합성기에서 올리고뉴클레오티드 합성을 실시하였다. 비오틴 포스포르아미디트는 글렌 리서치로부터 입수하였다. 하나의 가닥이 5' 말단에서 비오티닐화된 23 염기 길이의 상보성 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 3개의 듀플렉스 DNA 기질을 형성하였다. 어닐링은, 5분간 95℃로 가열하고 35분간 25℃로 냉각하여 10 mM 트리스-HCl(pH 7.4), 0.1M NaCl, 3 mM EDTA 중 최종 DNA 농도를 1 μM로 하여 실시하였다. 듀플렉스 DNA 작제에 사용된 서열은 다음과 같았다:
듀플렉스 1
5'-비오틴-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC 및
상보성 5'-GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT.
듀플렉스 2
5'-비오틴-GAGAATGGAATGTCCCTTGGACT 및
상보성 5'- AGTCCAAGGGACATTCCATTCTC.
듀플렉스 3
5'-비오틴-GAGAATGGAATGTTCCTTGGACT 및
상보성 5'- AGTCCAAGGAACATTCCATTCTC.
밑줄 친 부분은 p50 결합 부위이며, 굵은 글씨로 표시된 부분은 본 연구에서 분석된 SNP를 나타낸다.
표면 플라즈몬 공명
BIAcore2000TM(스웨덴 웁살라)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 실시하였다. 올리고뉴클레오티드를 HBS 완충액(10 mM HEPES pH 7.4, 75-150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% (v/v) 계면활성제 P20)에서 최종 농도 1 ng/㎖로 희석하고, 올리고뉴클레오티드의 약 50 반응 단위(RU)가 센서 칩 표면에 결합할 때까지 10 ㎕/분의 유속으로 스트렙타비딘 센서 칩(SA)에 통과시켰다. 150 mM 또는 75 mM NaCl을 포함하는 HBS 완충액 중에서 재조합(인간) NF-kB p50(프로메가)을 희석하고, DNA 충전된 센서 칩에 20 ㎕/분의 유속으로 3분간 일정 농도(2∼100 nM)를 주입하여 5분간 해리시켰다. 10 ㎕의 1M NaCl을 주사하여 결합된 단백질을 제거하였다. 재생 절차는 DNA에 대한 NF-kB p50의 능력을 변화시키지 않았다. BIAevaluation 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 실시하였다. (주사된 단백질과 전개 완충액의 조성의 차이로 인해 생기는) 주입 초기 및 말기의 큰 굴절율 변화의 영향을 없애기 위해서, 스트렙타비딘 표면에서 얻은 대조군 센서그램을 각 단백질 주입으로부터 감하였다. 모든 분석은 25℃에서 실시하였다.
속도 반응 분석
2성분이 연계된 복합체 형성 속도는 하기 수학식 1로 표시된다:
[수학식 1]
Figure 112010048524075-pat00011
여기서 dR/dt는 SPR 시그널의 변화 속도이고, C는 피분석물의 농도이며, Rmax는 RU에서 최대 피분석물 결합능이며, R은 시점 t에서의 RU의 SPR 시그널이다. 상기 수학식은 다음과 같이 재배열될 수 있다:
Figure 112010048524075-pat00012
센서그램은 5개의 상이한 피분석물 농도의 최소값에서 기록하였으며, R에 대한 dR/dT를 각 농도에 대해 플롯하였다. 이들 라인 (KaC + kd) 각각의 구배는 관찰된 결합 속도 -kobs를 나타낸다. C에 대한 -kobs의 플롯을 이용하여 하기 수학식으로부터 ka를 결정하였다.
Figure 112010048524075-pat00013
샘플 주입 말미에 완충액을 전개하여 단백질을 교체하고 결합된 단백질을 DNA로부터 해리시켰다. 전개 완충액 중 단백질 농도는 0이고 재결합은 무시할 만하다고 가정하였기 때문에, 하기 수학식을 사용하여 0차 해리로 가정하고 선형 회귀 분석으로 해리 속도 상수를 계산할 수 있다:
Figure 112010048524075-pat00014
상기 식에서, dR/dt는 SPR 시그널의 변화 속도이고, R 및 R0는 t 및 t0에서의 반응이다. kd는 해리 속도 상수이다.
평형 해리 상수(KD)는 속도 상수의 비로부터 얻을 수 있다:
Figure 112010048524075-pat00015
[표 6]
SPR 결합 분석에 사용된 올리고데옥시뉴클레오티드 기질. 컨센서스 서열과 번호매김 방법은 하기에 제시되어 있다. X는 퓨린이고 Y는 피리미딘이다.
Figure 112010048524075-pat00016
[표 7]
올리고데옥시뉴클레오티드 기질에 대한 p50의 결합의 반응 속도 상수(Ka 및 Kd) 및 계산된 평형 결합 상수(KD)
Figure 112010048524075-pat00017
5.4. 추가의 기능성 다형성의 발견
유전자 발견 그룹은 IL-1B4 SNP(-3737)이 RAW 세포에서의 형질감염 분석에 의해 기능성임을 확인하였으며(도 10 참조), 또한 다음과 같이 이 분석에서 기능성인 다른 다형성을 발견하였다. 기능적 SNP 분석에 대한 구성 및 서열 정보 방법은, 형성 및 분석된 모든 작제물의 명칭을 나타낸 도 11에 제시되어 있다.
IL-1B3, IL-1B7 및 IL-1B15라고 명명한 3가지 추가의 기능성 SNP가 확인되었다(이들 SNP 명칭은 도 11에 도시된 각 대립유전자 2 다형성에 대한 명명 체계를 이용한다).
IL-1B3 대립유전자 2 및 IL-1B15 대립유전자-2는 RAW(쥐 대식세포) 및 THP-1 세포(인간 단핵 세포)에서 전사율을 감소시킨다(도 11의 서열 데이터와 도 10 및 도 12의 실험 데이터 참조). IL-1B7 대립유전자-2(유전형 TGCATGGGGTC)는 RAW 세포에서 전사율을 감소시키고(도 10 참조), IL-1B7 대립유전자-2는 THP-1 세포에서 전사율을 증가시킨다(도 12 참조)(대립유전자 1 SNP). 도 10은 IL-1B3(유전형 TACATAGGGTC) 및 IL-1B15(유전형 TGCATAGGGTT)가 RAW 세포에서 IL-1B의 발현을 유의적으로 감소시킨다는 것을 보여준다.
참고 인용
본 명세서 중에 인용된 모든 특허 및 공개 문헌은 참고로 인용된다.
등가물
당업자는 일반적인 실험을 실시하여 본 명세서 중에 개시된 특정 구체예와 동등한 여러 구체예들을 인식하거나 또는 확인할 수 있다. 그러한 등가물을 하기 특허청구범위에 포함하고자 한다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

  1. -1469 IL-1B 다형성 대립유전자를 포함하는 인간 게놈 서열의 20개의 연속 뉴클레오티드로 구성되는 분리된 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 20개의 연속 뉴클레오티드는 -1469 IL-1B 대립유전자 1 서열: ACAGAGGCTCACTCCCTTGCATAATGCAGAGCGAGCACGATACCTGG에 상응하는 것인 분리된 핵산.
  3. 제1항에 있어서, 20개의 연속 뉴클레오티드는 -1469 IL-1B 대립유전자 2 서열: ACAGAGGCTCACTCCCTTGTATAATGCAGAGCGAGCACGATACCTGG에 상응하는 것인 분리된 핵산.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 서열의 상보 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  5. 제1항에 있어서, IL-1B의 -1469에 상응하는 뉴클레오티드는 핵산 분자의 3' 말단에 위치하는 것인 분리된 핵산.
  6. 제5항에 있어서, 검출 가능한 표지를 더 포함하는 것인 분리된 핵산.
  7. -1469 IL-1B 1형 대립유전자의 IL-1 SNP를 동정하는 단계; 및
    IL-1 유전자 발현 또는 IL-1 유전자 전사 인자의 결합에 SNP가 미치는 효과를 기능적으로 평가하는 단계
    를 포함하는, 변경된 IL-1 유전자 발현과 관련된 기능적 다형성을 검출하는 방법으로서, 상기 SNP가 변경된 IL-1 유전자 발현 또는 IL-1 유전자 전사 인자의 변경된 결합과 관련이 있는 경우 그 SNP는 변경된 IL-1 유전자 발현과 관련된 기능적 다형성인 방법.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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