ES2291899T3 - Uso de polmorfismos en oatp-c humano asociados con un efecto sobre la farmacocinetica de la estatina en seres humanos en terapia que usa estatina. - Google Patents
Uso de polmorfismos en oatp-c humano asociados con un efecto sobre la farmacocinetica de la estatina en seres humanos en terapia que usa estatina. Download PDFInfo
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Abstract
Un método de diagnóstico que comprende: (a) usar una muestra biológica procedente de un ser humano al que se le identifica que necesita un tratamiento con rosuvastatina, en el que la muestra comprende un ácido nucleico que codifica OATP-C; (b) ensayar el ácido nucleico para determinar la presencia, en al menos un alelo, de un codón que codifica alanina en la posición correspondiente a la posición 174 de SEQ ID NO: 1, y (c) si se encuentra (b) en al menos un alelo, diagnosticar que es probable que el ser humano tenga una capacidad reducida para transportar el agente rosuvastatina a las células.
Description
Uso de polimorfismos en OATP-C
humano asociados con un efecto sobre la farmacocinética de la
estatina en seres humanos en terapia que usa estatina.
Se describe aquí el uso de polimorfismos en
OATP-C humano en terapia estatínica debido a que
están asociados con un efecto sobre la farmacocinética de la
estatina (PK) en seres humanos, especialmente la farmacocinética de
rosuvastatina. También se describe aquí el uso de polimorfismos de
OATP-C a la hora de predecir la eficacia y
seguridad de las estatinas, cuya captación en el hígado está mediada
por OATP-C, especialmente rosuvastatina.
El gen de OATP-C (algunas veces
denominado LST1, OATP2, SLCO1B1, SLC21A6 u OATP1B1) se ha clonado
por cuatro grupos diferentes, se ha anotado y publicado con los
números de acceso de EMBL AB026257 (OATP-C, 2452
pb), AF205071 (OATP2, 2830, aquí SEQ ID), AJ132573 (OATP2, 2778), y
AF060500 (LST-1). Konig (2000) J Biol Chem 275,
23161-23168 describe la organización genómica de
OATP 1, 2 y 8. La Solicitud de Patente Internacional WO 00/08157
describe genes transportadores de aniones humanos, y algunos
polimorfismos.
El gen del polipéptido C transportador de
aniones orgánicos (OATP) independiente de Na+ es un miembro de la
familia supergénica de OATP implicado en el transporte
multifuncional de aniones orgánicos. OATP-C
transporta un amplio intervalo de moléculas, por ejemplo el anión
orgánico taurocolato, esteroides conjugados: DHEAS,
estradiol-17\beta-D-glucurónico
y estrona-3-sulfato, eicosanoides:
PGE_{2}, tromboxano B_{2}, leucotrieno C_{4} y E_{4}, y
hormonas del tiroides T4 y T3. También se ha demostrado que el
OATP-C está implicado en el transporte de
xenobióticos, y fármacos implicados en la reducción de lípidos, por
ejemplo estatinas. Las estatinas son una clase de fármacos que
inhiben
3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima
A (HMG-CoA). Son una terapia importante para
pacientes con enfermedades vasculares ateroscleróticas, y
generalmente son bien toleradas, aunque se han observado algunos
casos adversos raros en todas las estatinas comercializadas. Las
diferencias en la farmacocinética entre estatinas se han asociado
con diferencias en la relación de beneficio-riesgo
(Igel (2002) J Clin Pharmacol 42:835-45).
Generalmente se recomienda que a fin de ganar la
máxima relación de beneficio-riesgo de la terapia
estatínica, la dosis prescrita se debería de individualizar según
la meta de la terapia y la respuesta. Por ejemplo, la dosis de
partida habitual recomendada de la rosuvastatina es 10 mg una vez al
día en pacientes con hipercolesterolemia y dislipidemia mixta,
aunque también está disponible una dosis de 5 mg. Para pacientes con
hipercolesterolemia importante (LDL-C > 190
mg/dl) y dianas lipídicas agresivas, se puede considerar una dosis
de partida de 20 mg. La dosis de 40 mg se debería de reservar para
aquellos pacientes que no han logrado el objetivo de
LDL-C a 20 mg. Después de la iniciación y/o con la
determinación de rosuvastatina, los niveles lipídicos se deberían
de analizar en 2 a 4 semanas y la dosis se debería de ajustar en
consecuencia.
La pravastatina es transportada activamente
desde la circulación hasta el hígado vía el transportador de
OATP-C (Hsiang, B. Journal of Biological Chemistry.
274(52), 37161-37168, 1999). Se ha demostrado
que la rosuvastatina es un sustrato para OATP-C
in vitro (Brown (2001) Atherosclerosis Supplements 2, p. 90,
poster abstract P174). Se han dado a conocer en la bibliografía y
en las bases de datos de SNP numerosos polimorfismos en
OATP-C. La identificación de SNP en
OATP-C se dio a conocer en el documento EP 1186672.
El polimorfismo en OATP-C se ha dado a conocer por
Tamai et al (2000), BBRC, 273, 251-60, y se
ha revisado por Tirona (2002) Adv Drug Deliery Reviews
54:1343-52. Tirona mostró que algunos polimorfismos
de OATP-C, incluyendo la variante V174A, estaban
asociados con un transporte reducido de sustratos endógenos in
vitro. Usando un sistema celular diferente, Nozawa et al
(2001) J Pharmacol Exp Ther, 302, 804-13,
encontraron que la variante V 174A (OATPC*5) no afectó el
transporte de sustrato. Tirona estableció que quedaba por determinar
la importancia in vivo de polimorfismos de
OATP-C.
OATP-C.
Niemi et al (julio 2004) Pharmacogenetics
14(7), 429-440 describe SNP en OATPC,
incluyendo SNP promotores. Los autores dan a conocer una
correlación significativa entre la PK (farmacocinética) de la
pravastatina y un haplotipo que contiene un SNP promotor, en un
conjunto de voluntarios sanos.
Nishizato (2003) Clin Pharmacol Ther
73:554-65 publicó datos in vivo que
muestran que el alelo OATPC*15, que contiene tanto el polimorfismo
N130D como el V174A, tuvo un efecto sobre la farmacocinética de
pravastatina en voluntarios sanos japoneses. Nishizato no dio a
conocer el efecto del alelo OATP-C*5, que no se
había detectado hasta la fecha en la población japonesa, y
estableció que son necesarios muchos estudios clínicos para
investigar este efecto. No ha habido estudios de farmacocinética en
pacientes que toman pravastatina. No ha habido estudios de
farmacogenética en voluntarios sanos o en pacientes que toman
rosuvastatina. Por tanto, las observaciones de Nishizato et
al., realizadas en voluntarios sanos japoneses, no predicen los
perfiles de PK de pacientes o de otras poblaciones, o los perfiles
de PK de otras estatinas que pueden diferir en cuanto a la afinidad
por diferentes
transportadores.
transportadores.
Los análisis de formación de modelos de PK de
población, que usan datos recogidos por AstraZeneca en el programa
de desarrollo clínico de rosuvastatina, confirman que los
voluntarios sanos y los pacientes difieren con respecto a su
distribución de rosuvastatina. Los pacientes que reciben estatinas
para reducir los lípidos pueden estar con otros fármacos
transportados por OATP-C, y las interacciones
fármaco-fármaco pueden afectar al perfil de PK de
las estatinas (Int J Clin Pharmacol Ther (2002), 40,
439-50). Los pacientes a los que se les prescriben
estatinas también pueden tener otras complicaciones hepáticas y
renales que afecten a la distribución y excreción de estatinas.
Existe un capítulo completo en el libro de texto Clinical
Pharmacokinetics (capítulo 16, páginas 248-266 en
la 3ª edición 1995, Rowland & Tozer, publicado por Williams
& Wilkins) que comienza:
- "La enfermedad es una fuente principal de variabilidad en la respuesta de fármacos. Para muchas enfermedades, esto es debido principalmente a diferencias en la farmacocinética..."
Por tanto, existe la necesidad de identificar
qué polimorfismos en OATP-C tienen un efecto sobre
la farmacocinética in vivo de rosuvastatina y de otras
estatinas en pacientes con enfermedad vascular o con una
predisposición a ella. La invención se basa en el descubrimiento de
que el polimorfismo V 174A, y/o un polimorfismo en desequilibrio
enlazante con él, tiene un efecto estadísticamente significativo
sobre la farmacocinética de la estatina en pacientes. El
polimorfismo V 174A puede afectar a la respuesta a estatinas,
especialmente rosuvastatina.
Según un aspecto de la invención, se proporciona
un método de diagnóstico según la reivindicación 1 aneja.
También se describe aquí un método en el que,
como alternativa, el ácido nucleico se ensaya para determinar la
presencia de un alelo de un polimorfismo en desequilibrio enlazante
con dicho codón que codifica alanina en la posición que corresponde
a la posición 174 de SEQ. ID. NO. 1, preferiblemente -26A>G,
-118A>C, -309T>C,
-878A>G, -903C>T, -1054G>T, -1215T>A, o -1558T>C, todos de SEQ ID NO:2; o T2122G, C2158T, A2525C, o G2651A, todos de SEQ ID NO:3.
-878A>G, -903C>T, -1054G>T, -1215T>A, o -1558T>C, todos de SEQ ID NO:2; o T2122G, C2158T, A2525C, o G2651A, todos de SEQ ID NO:3.
Más preferiblemente, dicho polimorfismo es
-118A>C o -1558T>C de SEQ ID NO:2. Los alelos de polimorfismos
en -118 y -1558 están en desequilibro enlazante significativo con
el alelo de alanina en la posición 174 de SEQ ID NO:1 (p = 0,009 y
0,025 respectivamente, analizado por el programa ASSOCIATE; véase
Ott J (1999) Analysis of human genetic linkage, 3ª edición. Johns
Hopkins University Press, Baltimore).
Lo más preferible, el polimorfismo de (b)(ii) es
-118A>C de SEQ ID NO:2; el Ejemplo 2 aquí más abajo describe el
efecto funcional de este polimorfismo.
Para cualquier posición variante, por ejemplo
-26A>G, esto indica que en la posición 26 A se sustituye por G.
Esto se puede ensayar detectando G en esa posición, o detectando que
no hay ningún A en esa posición. Se aplican consideraciones
similares a cualquier posición variante.
Preferiblemente, el agente terapéutico es una
estatina, el ser humano está siendo tratado con un nivel de dosis
de estatina, y la etapa (c) comprende además diagnosticar al ser
humano como adecuado para la valoración a otro nivel de
dosificación mayor de estatina, que comprende monitorizar una
disminución de la relación beneficio-riesgo que
resulta de la capacidad reducida para transportar la estatina a las
células.
Más preferiblemente, el agente terapéutico es
rosuvastatina.
Como se describe adicionalmente aquí, el agente
terapéutico es uno de atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina,
pravastatina, o simvastatina.
Preferiblemente, el ser humano está siendo
tratado con al menos 5 mg diariamente de una rosuvastatina. Más
preferiblemente, el ser humano está siendo tratado con al menos 10
mg diariamente de una rosuvastatina. Más preferiblemente, el ser
humano está siendo tratado con al menos 20 mg diariamente de una
rosuvastatina. Más preferiblemente, el ser humano está siendo
tratado con al menos 40 mg diariamente de una rosuvastatina.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona un método de diagnóstico según la reivindicación 7
aneja.
Como se describe aquí, el agente terapéutico es
preferiblemente una estatina, el ser humano está siendo tratado con
un nivel de dosificación de estatina, y la etapa (c) comprende
además diagnosticar al ser humano como adecuado para la valoración
a otro nivel de dosificación mayor de estatina, que comprende
monitorizar una disminución de la relación
beneficio-riesgo que resulta de la capacidad
reducida para transportar la estatina a las
células.
células.
Como se describe aquí, el método comprende
preferiblemente además medir el nivel del polipéptido de OATPC con
valina y/o alanina en la posición 174, para determinar de ese modo
la presencia o ausencia del polimorfismo -118A>C en el ácido
nucleico de OATP-C.
Preferiblemente, como se describe aquí, el
método es aquel que comprende además medir el nivel de polipéptido
de OATP-C para determinar la presencia o ausencia
del alelo OATP-C*15, para determinar de ese modo la
presencia o ausencia del polimorfismo -118A>C en el ácido
nucleico de OATP-C.
Sin desear estar ligados por consideraciones
teóricas, el nivel de expresión de proteína de cada una de las
diferentes formas alélicas de OATPC se puede determinar cuando el
nivel de expresión de la variante Ala174 aumenta debido a la
actividad promotora potenciada en presencia de la variante del
promotor -118C enlazado. Por ejemplo, determinando la relación de
isoformas de las proteínas Val174:Ala174, en la que la proteína de
función reducida Ala 174 está presente en exceso del transportador
de función normal Val 174 en sujetos heterocigóticos en la posición
174 en la secuencia de aminoácidos. En otro ejemplo, determinando el
nivel absoluto de expresión de OATPC en sujetos homocigóticos con
Ala174, y comparando el nivel de expresión absoluto con el de la
media de población para sujetos homocigóticos para la variante
Val174 en el que la expresión relativa del alelo Ala 174 está
incrementada en presencia del alelo del promotor enlazado -118C, en
comparación con los alelos de Ala174 enlazados a la variante del
promotor -118A. En otro ejemplo, determinando el nivel absoluto de
expresión de OATPC en sujetos homocigóticos con Ala174, y
comparando el nivel de expresión absoluto con el de la media de
población, se pueden predecir sujetos homocigóticos con Ala174, con
los niveles más elevados de expresión de OATPC, que tengan una o
más copias de la variante del promotor -118C a través de la
actividad de transcripción incrementada de la forma alélica
minoritaria del promotor de OATPC.
Según la presente invención, el aminoácido en la
posición 174 se determina que es alanina, y el agente terapéutico es
rosuvastatina.
Según la descripción adicional proporcionada
aquí, el agente terapéutico es uno de atorvastatina, cerivastatina,
fluvastatina, pravastatina, o simvastatina.
Preferiblemente, el ser humano está siendo
tratado con al menos 5 mg diariamente de una rosuvastatina. Más
preferiblemente, el ser humano está siendo tratado con al menos 10
mg diariamente de una rosuvastatina. Más preferiblemente, el ser
humano está siendo tratado con al menos 20 mg diariamente de una
rosuvastatina. Más preferiblemente, el ser humano está siendo
tratado con al menos 40 mg diariamente de una rosuvastatina.
Se describe aquí adicionalmente un método de
diagnóstico in vitro para identificar un paciente que
requiera potencialmente un nivel de dosis de estatina por encima
del nivel de la dosis mínima recomendada, o para identificar un
paciente en el que se debería de monitorizar la valoración hasta un
nivel de dosis de estatina por encima del nivel de dosis mínima
recomendada, método el cual comprende ensayar una muestra biológica
procedente de un paciente para determinar la presencia de alanina
en la posición 174 del polipéptido de OATP-C y/o un
polimorfismo en desequilibrio enlazante con la misma.
La muestra biológica es convenientemente una
muestra de sangre, un fluido de lavado broncoalveolar, esputo, un
fluido hepático u otro fluido corporal o tejido obtenido de un
sujeto. Se apreciará que la muestra de ensayo puede igualmente ser
una secuencia de ácido nucleico que corresponde a la secuencia en la
muestra de ensayo, es decir, que toda o una parte de la región en
el ácido nucleico de la muestra se puede amplificar primeramente
usando una técnica conveniente, por ejemplo PCR, antes del análisis
de la variación alélica. Preferiblemente, el paciente se ensaya
para determinar la presencia de alanina en la posición 174 a través
del análisis del polipéptido directamente, o a través del análisis
del material genético que codifica el polipéptido. Puesto que los
pacientes portan 2 copias del gen de OATPC, pueden tener un genotipo
homocigótico o heterocigótico. Los polimorfismos en desequilibrio
enlazante con alanina en 174 se pueden ensayar como una alternativa
para determinar directamente la presencia de alanina
en 174.
en 174.
Será manifiesto para la persona experta en la
técnica que hay un gran número de procedimientos analíticos que se
pueden usar para detectar la presencia o ausencia de nucleótidos
variantes en una o más posiciones polimórficas de la invención. En
general, la detección de la variación alélica requiere una técnica
de discriminación de mutación, opcionalmente una reacción de
amplificación y opcionalmente un sistema de generación de señales.
La Tabla 1 enumera un número de técnicas de detección de mutación,
algunas basadas en PCR. Éstas se pueden usar en combinación con un
número de sistemas de generación de señales, una selección de los
cuales se enumera en la Tabla 2. En la Tabla 3 se enumeran otras
técnicas de amplificación. Muchos métodos actuales para la
detección de la variación alélica se repasan por Nollau et
al., Clin. Chem. 43, 1114-1120, 1997, y en
textos estándares, por ejemplo "Laboratory Protocols for Mutation
Detection", editado por U. Landegren, Oxford University Press,
1996 y "PCR", 2ª edición de Newton & Graham, BIOS
Scientific Publishers Limited, 1997.
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- General: secuenciación de ADN, secuenciación mediante hibridación
- Barrido: PTT*, SSCP, DGGE, TGGE, ruptura, análisis de heterodúplex, CMC, ruptura enzimática en los desemparejamientos
- *Nota: no es útil para la detección de polimorfismos de promotores
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- Basadas en la Hibridación
- Hibridación en fase sólida: transferencias por puntos, MASDA, transferencias por puntos inversas, conjuntos ordenados de oligonucleótidos (chips de ADN)
- Hibridación en fase de disolución: Taqman^{TM} - documentos US-5210015 y US-5487972 (Hoffmann-La Roche), Molecular Beacons - Tyagi et al (1996), Nature Biotechnology, 14, 303; documento WO 95/13399 (Public Health Inst. New York)
- Basadas en la extensión: ARMS^{TM}, ALEX^{TM} - patente europea nº EP 332435 B1 (Zeneca Limited), COPS - Gibbs et al (1989), Nucleic Acids Research, 17, 2347.
- Basadas en la incorporación: minisecuenciación, APEX
- Basadas en enzimas de restricción: RFLP, PCR generadora del sitio de restricción
- Basadas en ligación: OLA
- Otras: ensayo invasor
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- Fluorescencia: FRET, amortiguación de la fluorescencia, polarización de la fluorescencia - patente del Reino Unido nº 2228998 (Zeneca Limited)
- Otros: quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, Raman, radioactividad, colorimetría, ensayo de protección de la hibridación, espectrometría de masas
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SSR, NASBA, LCR, SDA,
ADN-b
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- \quad
- Inmunoensayo
- \quad
- Inmunohistología
- \quad
- Secuenciación peptídica
\newpage
Las técnicas de detección de mutación preferidas
incluyen ARMS^{TM}, ALEX^{TM}, COPS, Taqman, Molecular Beacons,
RFLP, y PCR a base de sitios de restricción y técnicas de FRET. Las
técnicas de inmunoensayo son conocidas en la técnica, por ejemplo A
Practical Guide to ELISA de D M Kemeny, Pergamon Press 1991;
Principles and Practice of Immunoassay, 2ª edición, C P Price y D J
Newman, 1997, publicado por Stockton Press en USA y Canadá, y por
Macmillan Reference en el Reino Unido. Las técnicas histológicas se
describen en Theory and Practice of Histological Techniques de J D
Bancroft y A Stevens, 4ª edición, Churchill Livingstone, 1996. La
secuenciación proteínica se describe en Laboratory Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology, Volumen 9, Sequencing of
Proteins and Peptides, G Allen, 2ª edición revisada, Elsevier,
1989.
Los métodos particularmente preferidos incluyen
métodos a base de RFLP y ARMS^{TM}. El método ARMS^{TM} es un
método especialmente preferido.
Los anticuerpos se pueden preparar usando
cualquier método adecuado. Por ejemplo, el polipéptido purificado
se puede utilizar para preparar anticuerpos específicos. El término
"anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos
monoclonales, y los diversos tipos de constructos de anticuerpos
tales como por ejemplo F(ab')_{2}, Fab y Fv de cadena
sencilla. Los anticuerpos se definen para que se unan
específicamente si se unen a la variante alélica de
OATP-C con una K_{a} mayor o igual que alrededor
de 10^{7} M^{-1}. La afinidad de unión se puede determinar
usando técnicas convencionales, por ejemplo aquellas descritas por
Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660 (1949).
Los anticuerpos policlonales se pueden generar
fácilmente a partir de una variedad de fuentes, por ejemplo
caballos, vacas, cabras, ovejas, perros, pollos, conejos, ratones o
ratas, usando procedimientos que son bien conocidos en la técnica.
En general, el antígeno se administra al animal hospedante
típicamente a través de inyección parenteral. La inmunogenicidad
del antígeno se puede potenciar a través del uso de un adyuvante,
por ejemplo el adyuvante completo o incompleto de Freund. Tras las
inmunizaciones de recuerdo, se recogen muestras pequeñas de suero y
se ensayan para determinar la reactividad frente al antígeno. Los
ejemplos de diversos ensayos útiles para tal determinación incluyen
los descritos en: Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane
(eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998; así como
procedimientos tales como inmunoelectroforesis en contracorriente
(CIEP), radioinmunoensayo, radioinmunoprecipitación, ensayos
inmunoabsorbentes enlazados a enzima (ELISA), ensayos de
transferencia de punto, y ensayos de sándwich; véanse las patentes
U.S. n^{os} 4.376.110 y 4.486.530.
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar
fácilmente usando procedimientos bien conocidos; véase, por
ejemplo, los procedimientos descritos en las patentes U.S. n^{os}
RE 32.011, 4.902.614, 4.543.439 y 4.411.993; Monoclonal Antibodies,
Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press,
Kennett, McKearn, y Bechtol (eds.), (1980).
Los anticuerpos monoclonales se pueden producir
usando técnicas alternativas, tales como las descritas por
Alting-Mees et al., "Monoclonal Antibody
Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas",
Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990), que
se incorpora aquí como referencia. De forma similar, se pueden
construir compañeros de unión usando técnicas de ADN recombinante,
para incorporar las regiones variables de un gen que codifica un
anticuerpo de unión específico. Tal técnica se describe en Larrick
et al., Biotechnology, 7:394 (1989).
Una vez aislados y purificados, los anticuerpos
se pueden usar para detectar la presencia de variantes
polipeptídicas particulares en una muestra, usando protocolos de
ensayo consolidados; véase, por ejemplo, "A Practical Guide to
ELISA" de D. M. Kemeny, Pergamon Press, Oxford, Inglaterra.
Las estatinas ya afectadas para uso en seres
humanos incluyen atorvastatina, cerivastatina, fluvastatina,
pravastatina y simvastatina. Se dirige al lector a las siguientes
referencias para información adicional: Drugs and Therapy
Perspectives (12 de mayo de 1997), 9:1-6; Chong
(1997) Pharmacotherapy 17:1157-1177; Kellick (1997)
Formulary 32:352; Kathawala (1991) Medicinal Research Reviews,
11:121-146; Jahng (1995) Drugs of the Future
20:387-404, y Current Opinion in Lipidology, (1997),
8, 362-368. Un fármaco estatínico preferido es el
compuesto 3a (S-4522) en Watanabe (1997) Bioorganic
and Medicinal Chemistry 5:437-444; ahora denominado
rosuvastatina, véase Olsson (2001) American Journal of Cardiology,
87, suplemento 1, 33-36.
Preferiblemente, la estatina es rosuvastatina.
Preferiblemente, al paciente se le prescriben al menos 40 mg de
rosuvastatina diariamente, más preferiblemente al paciente se le
prescriben al menos 60 mg de rosuvastatina diariamente, y
especialmente al paciente se le prescriben al menos 80 mg de
rosuvastatina diariamente.
Preferiblemente, el paciente se ensaya
adicionalmente para determinar la presencia de valina en la posición
174 del polipéptido de OATP-C, con lo cual la
presencia de tanto valina como alanina en la posición 174 indica
heterocigocidad en este lugar.
Preferiblemente, el polimorfismo en
desequilibrio enlazante con OATP-C de alanina 174 se
selecciona de al menos uno de:
- a)
- OATP-C de Asp130; o
- b)
- sitios de unión a factor de transcripción NF1 de consenso en las posiciones -26A>G o -118A>C con relación al sitio de iniciación de la transcripción (SEQ ID No 2); o
- c)
- -309T>C, -878A>G, -903C>T, -1054G>T, -1215T>A o -1558T>C, en los que las posiciones nucleotídicas se dan con relación al sitio de iniciación de la transcripción (SEQ ID No 2); o
- d)
- polimorfismos en la región 3'UTR del gen OATP-C seleccionados de T2122G, C2158T, A2525C, y G26S1A, en los que la posición de los nucleótidos está dada con relación al ATG, y el A del ATG es el nucleótido +1 (número de acceso de secuencia AF205071 y SEQ ID No 3).
El sitio de iniciación de la transcripción se
define en Jung, D. 2001 Journal of Biological Chemistry.
276(40), 37206-37214.
En una realización, la muestra biológica se
ensaya para determinar la presencia de un aminoácido en la posición
del polipéptido de OATP-C, a través del análisis del
material genético que codifica el polipéptido.
Otro aspecto de la invención proporciona un
método in vitro para monitorizar un paciente para determinar
un suceso adverso relacionado con la terapia estatínica, en el que
el método comprende ensayar una muestra biológica procedente del
paciente en busca de un parámetro que indique un suceso adverso, y
en el que el paciente se selecciona para tal monitorización
mediante un método descrito aquí.
Preferiblemente, el paciente tiene un genotipo
OATPC*5 o *15. Puesto que los pacientes portan 2 copias del gen de
OATPC, pueden ser de genotipo homocigótico o heterocigótico.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona un método para la detección de un polimorfismo en OATPC
en un ser humano, método el cual comprende determinar la secuencia
del ser humano en al menos una de las siguientes posiciones
polimórficas:
- a)
- sitios de unión al factor de transcripción NF1 de consenso en las posiciones -26A>G o -118A>C con relación al sitio de iniciación de la transcripción; o
- b)
- -309T>C, -878A>G, -903C>T, -1054G>T, -1215T>A o -1558T>C, en las que las posiciones nucleotídicas se dan con relación al sitio de iniciación de la transcripción; o
- c)
- polimorfismos en la región 3'UTR del gen OATP-C seleccionados de T2122G, C2158T, A2525C, y G2651A, en los que la posición de los nucleótidos está dada con relación al ATG, y el A del ATG es el nucleótido +1 (número de acceso de secuencia AF205071 y SEQ ID No 3).
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona un gen de OATPC humano o su hebra complementaria que
comprende un polimorfismo alélico variante en una o más de las
posiciones definidas aquí, o un fragmento del mismo de al menos 20
bases que comprende al menos un nuevo polimorfismo.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona un cebador específico de alelos capaz de detectar un
polimorfismo del gen de OATPC, preferiblemente en una o más de las
posiciones según se definen aquí.
Se usa un cebador específico de alelos,
generalmente junto con un cebador constante, en una reacción de
amplificación tal como una reacción de PCR, que proporciona la
discriminación entre alelos a través de la amplificación selectiva
de un alelo en una posición de secuencia particular, por ejemplo
como se usa para los ensayos ARMS^{TM}. El cebador específico de
alelos tiene preferiblemente 17-50 nucleótidos, más
preferiblemente alrededor de 17-35 nucleótidos, más
preferiblemente alrededor de 17-30 nucleótidos.
Un cebador específico de alelos preferiblemente
corresponde exactamente con el alelo a detectar, pero también se
contemplan sus derivados, en los que alrededor de
6-8 de los nucleótidos en el término 3' se
corresponden con el alelo a detectar, y en los que hasta 10, tal
como hasta 8, 6, 4, 2, ó 1 de los nucleótidos restantes pueden
variar sin afectar significativamente a las propiedades del
cebador.
Los cebadores se pueden fabricar usando
cualquier método de síntesis conveniente. Los ejemplos de tales
métodos se pueden encontrar en textos estándares, por ejemplo
"Protocols for Oligonucleotides and Analogues; Synthesis and
Properties", Methods in Molecular Biology Series; Volumen 20; Ed.
Sudhir Agrawal, Humana ISBN:
0-89603-247-7;
1993; 1ª Edición. Si se requiere, el cebador o cebadores se pueden
marcar para facilitar la detección.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona una sonda oligonucleotídica específica de un alelo,
capaz de detectar un polimorfismo del gen de OATPC, preferiblemente
en una o más de las posiciones definidas aquí.
La sonda oligonucleotídica específica de un
alelo tiene preferiblemente 17-50 nucleótidos, más
preferiblemente alrededor de 17-35 nucleótidos, más
preferiblemente alrededor de 17-30 nucleótidos.
El diseño de tales sondas será manifiesto para
el biólogo molecular con pericia normal. Tales sondas tienen
cualquier longitud conveniente, tal como hasta 50 bases, hasta 40
bases, más convenientemente hasta 30 bases de longitud, tal como,
por ejemplo, 8-25 u 8-15 bases de
longitud. En general, tales sondas comprenderán secuencias de bases
totalmente complementarias al locus correspondiente de tipo natural
o variante en el gen. Sin embargo, si se requiere, se pueden
introducir uno o más desemparejamientos, con la condición de que no
se vea afectado indebidamente el poder discriminatorio de la sonda
oligonucleotídica. Las sondas de la invención pueden tener tanto
uno o más marcadores para facilitar la detección.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona un cebador específico de un alelo o una sonda
oligonucleotídica específica de un alelo, capaz de detectar un
polimorfismo del gen de OATPC en una de las posiciones definidas
aquí.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona un kit de diagnóstico que comprende una sonda
oligonucleotídica específica de un alelo de la invención y/o un
cebador específico de un alelo de la invención.
Los kits de diagnóstico pueden comprender un
envase apropiado e instrucciones para uso en métodos de la
invención. Tales kits pueden comprender además un tampón o tampones
y polimerasa o polimerasas apropiados, tales como polimerasas
termoestables, por ejemplo polimerasa taq.
Según otro aspecto de la presente invención, se
proporciona un método para tratar a un paciente que necesite un
tratamiento con una estatina, método el cual comprende:
- i)
- usar un método de diagnóstico in vitro para identificar a un paciente que requiera potencialmente un nivel de dosis de estatina por encima del nivel de dosis mínima recomendada, o para identificar a un paciente en el que se debería de monitorizar la valoración del nivel de dosis de estatina por encima del nivel de dosis mínima recomendada, y método el cual comprende ensayar una muestra biológica procedente del paciente para determinar la presencia de alanina en la posición 174 del polipéptido de OATP-C y/o un polimorfismo en desequilibrio enlazante con la misma; y
- ii)
- administrar una cantidad eficaz del fármaco.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona el uso de una estatina en la preparación de un
medicamento para tratar a un paciente con enfermedad vascular o con
predisposición a ella, en el que el paciente se identifica mediante
un diagnóstico in vitro para identificar a un paciente que
requiera potencialmente un nivel de dosis de estatina por encima
del nivel de la dosis mínima recomendada, o para identificar a un
paciente en el que se debería de monitorizar la valoración hasta un
nivel de dosis de estatina por encima del nivel de la dosis mínima
recomendada, y en el que el método comprende ensayar una muestra
biológica procedente del paciente para determinar la presencia de
alanina en la posición 174 del polipéptido de OATP-C
y/o un polimorfismo en desequilibro enlazante con el mismo.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona un método para clasificar a un paciente que necesite la
terapia estatínica, que comprende ensayar una muestra biológica
procedente del paciente para determinar la presencia de alanina en
la posición 174 del polipéptido de OATP-C y/o un
polimorfismo en desequilibrio enlazante con la
misma.
misma.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona un método para identificar a un paciente en terapia
estatínica que requiera la monitorización de sucesos adversos, que
comprende ensayar una muestra biológica procedente del paciente
para determinar la presencia de alanina en la posición 174 del
polipéptido de OATP-C y/o un polimorfismo en
desequilibrio enlazante con la misma.
- "Suceso adverso" significa el desarrollo de una afección médica indeseable, o el deterioro de un estado médico preexistente tras o durante la exposición a un producto farmacéutico, ya sea que se considere o no casualmente relacionado con el producto. Una afección médica indeseable puede ser síntomas (por ejemplo, náuseas, dolor de pecho), indicios (por ejemplo taquicardia, hígado agrandado), o los resultados anormales de una investigación (por ejemplo, hallazgos de laboratorio, electrocardiograma).
- "Desequilibrio enlazante" significa la aparición de alelos en lugares genéticos juntos, más a menudo de lo que sería de esperar por el azar.
- "Paciente" significa una persona que está recibiendo tratamiento médico.
- "Dosis" significa la cantidad a administrar de una vez, tal como una cantidad específica de medicación. Para rosuvastatina, la dosis de partida de un adulto es habitualmente 10 mg diariamente. Se pueden requerir dosis mayores para producir perfiles lipídicos deseados en algunos pacientes.
- "Relación beneficio riesgo" significa la relación entre los riesgos y los beneficios de un tratamiento o procedimiento dado.
Un riesgo aceptable se refiere al potencial de
sufrir una enfermedad o lesión que será tolerada por un individuo a
cambio de los beneficios de usar una sustancia o procedimiento que
provocarán tal enfermedad o lesión. La aceptabilidad del riesgo
depende de los datos científicos, factores sociales, económicos y
políticos, y de los beneficios percibidos que surgen de un
compuesto químico o procedimiento que crea el riesgo o riesgos en
cuestión.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona un método para ensayar un suceso adverso en un paciente,
método el cual comprende:
- (a)
- identificar un paciente que
- (i)
- tiene necesidad de un tratamiento con un agente terapéutico que es transportado por OATP-C, y
- (ii)
- tiene (A) una alanina en la posición de aminoácidos de OATP-C que corresponde a la posición 174 de SEQ ID NO:1, o (B) un polimorfismo en desequilibrio enlazante con (A);
- (b)
- proporcionar una muestra biológica procedente de un paciente después de que el paciente sigue un tratamiento con el agente terapéutico; y
- (c)
- ensayar la muestra para determinar un parámetro indicativo de un suceso adverso relacionado con el tratamiento con el agente terapéutico.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona un método de tratamiento que comprende:
- (a)
- identificar un paciente que necesite de tratamiento con un agente terapéutico que es transportado por OATP-C;
- (b)
- determinar si el paciente tiene uno o ambos de:
- (i)
- una alanina en la posición de aminoácidos de OATP-C que corresponde a la posición 174 de SEQ ID NO:1, o
- (ii)
- un polimorfismo en desequilibrio enlazante con (i); y
- (c)
- prescribir una dosis apropiada de un agente terapéutico.
Preferiblemente, el método comprende además:
- (d)
- monitorizar el paciente para determinar un suceso adverso que esté relacionado con el transporte reducido del agente terapéutico.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona un método para caracterizar el genotipo de un ser humano
que se identifica que necesita un tratamiento con un fármaco
transportable mediante OATP-C, comprendiendo el
método:
- (a)
- proporcionar una muestra de ácido nucleico procedente del ser humano, en el que la muestra comprende un primer nucleótido en una posición que corresponde a la posición 620 de SEQ ID NO: 1;
- (b)
- ensayar la muestra para determinar la identidad del primer nucleótido;
- (c)
- registrar la identidad del primer nucleótido en un medio de impresión o legible por una máquina; y
- (d)
- comunicar la identidad del primer nucleótido al ser humano o a la persona que cuida del ser humano.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona un método para evaluar un gen de OATP-C
en un ser humano, comprendiendo el método:
- (a)
- recibir de un cliente la petición para realizar un análisis de haplotipo de un ser humano, en el que el ser humano necesita de un tratamiento con un agente terapéutico transportable por OATP-C;
- (b)
- aceptar una muestra de ácido nucleico del ser humano;
- (c)
- ensayar la muestra para determinar la presencia de una variante descrita aquí; y
- (d)
- proporcionar los resultados del ensayo a la parte,
evaluando de ese modo el gen de
OATP-C.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona un método para evaluar la farmacogenética de un fármaco,
comprendiendo el método:
- (a)
- proporcionar una muestra de ácido nucleico procedente de un ser humano;
- (b)
- determinar la presencia de una variante de OATP-C descrita aquí; y
- (c)
- correlacionar (i) la identidad del nucleótido con (ii) la respuesta del ser humano tras la administración de un fármaco, evaluando de ese modo la farmacogenética del fármaco.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona un medio accesible por ordenador, que comprende una base
de datos que incluye una pluralidad de registros, en la que cada
registro asocia (a) información que identifica a un sujeto con (b)
información que indica si el sujeto tiene una variante descrita
aquí, y en la que cada registro asocia además (a) con (c)
información que identifica la presencia o ausencia de un suceso
adverso en el sujeto, que resulta de la administración al sujeto de
un fármaco transportable por OATP-C.
Según otro aspecto de la invención, se
proporciona un artículo de un medio legible por ordenador que tiene
instrucciones codificadas sobre el mismo, haciendo las instrucciones
que un procesador lleve a cabo un método que comprende:
- (a)
- recibir información que indica si un sujeto tiene una variante descrita aquí; y
- (b)
- sugerir una dosis apropiada de un agente transportable por OATP-C, en el que la sugerencia se basa en la información de (a).
Preferiblemente, el artículo es aquel en el que
la dosis sugerida se presenta en formato impreso o en formato
electrónico.
La invención se ilustrará ahora mediante los
siguientes Ejemplos no limitantes, en los que:
La Figura 1 muestra el efecto del polimorfismo
V174A sobre los niveles plasmáticos de rosuvastatina. La correlación
entre el genotipo, para 3 SNP no sinónimos en
OATP-C, y los valores plasmáticos de rosuvastatina
normalizados a la dosis (ng/ml/mg) ilustran que la variante 174Ala
está asociada con mayores concentraciones plasmáticas. (WT =
homocigoto de tipo salvaje, HET = heterocigoto, VAR = variante
homocigótica). Ninguno de los 52 sujetos analizados tuvieron
variante homocigótica para las variantes Val174Ala o Pro155Thr. De
los 52 sujetos analizados, se registró que 42 eran de origen
caucásico. Los otros 10 sujetos eran hispanos, negros o
asiáticos.
La Figura 2 muestra el efecto del haplotipo
OATP-C*15 sobre los niveles plasmáticos de
rosuvastatina. La correlación entre haplotipos de
OATP-C y los valores plasmáticos de rosuvastatina
normalizados a la dosis (ng/ml/mg) ilustran que el haplotipo
OATP-C*15 está asociado con mayores concentraciones
plasmáticas. Véase la Tabla 1 más abajo para una descripción de las
variantes de aminoácidos para cada haplotipo. No se muestran los
resultados para pares de haplotipos de sujetos con n = 3 o menor
(*15/*14, *1b/*14, *1b/*15).
En las Figuras 1 y 2, las líneas superior e
inferior de la "caja" son los percentiles 25º y 75º de la
muestra. La distancia entre la parte superior y la parte inferior
de la caja es el intervalo intercuartil. La línea en el medio de la
caja es la mediana de la muestra. Las "patillas", que se
extienden por encima y por debajo de la caja, muestran la extensión
del resto de la muestra (excepto que existan valores aislados).
Suponiendo que no existen valores aislados, el máximo de la muestra
es la parte superior de la patilla superior. El mínimo de la
muestra es la parte inferior de la patilla inferior. Por defecto, un
valor aislado es un valor que está alejado más de 1,5 veces el
intervalo intercuartil desde la parte superior o la parte inferior
de la caja. Los puntos de datos individuales son valores
alejados.
alejados.
La Figura 3 muestra el efecto de la variante
Val174A1a sobre los niveles plasmáticos de rosuvastatina en
pacientes tratados durante 6 semanas con diferentes dosis de
rosuvastatina. Los niveles plasmáticos de rosuvastatina a las 6
semanas se han normalizado a la dosis para el análisis. Los niveles
medios plasmáticos de rosuvastatina fueron mayores en sujetos
heterocigotos para el polimorfismo Val174Ala, en comparación con
sujetos homocigotos de tipo salvaje (Val/Val). La asociación entre
el alelo de la variante V174A y los niveles de PK plasmáticos de
rosuvastatina fueron mayoritariamente evidentes a las dosis más
elevadas de rosuvastatina.
La Figura 4 muestra que hay una tendencia a
incrementar las concentraciones plasmáticas medias de rosuvastatina
en aquellos sujetos que son heterocigotos para el SNP az0005537.
Este SNP está localizado dentro de un sitio de unión a factor de
transcripción NF1 putativo a -118 pb en dirección 5' del comienzo de
la transcripción. Los datos mostrados son para dos estudios de fase
III independientes en los que se recogieron los datos de PK. El
genotipo 11 es el genotipo homocigótico de tipo salvaje (az0005537
A/A), y el genotipo 12 es el genotipo heterocigótico (az0005537
A/C).
La Figura 5 muestra que los sujetos que tienen
la variante 174A enlazada y el alelo C minoritario en el SNP
az0005537 tienen una tendencia a mayores concentraciones plasmáticas
medias de rosuvastatina, en comparación con sujetos con la variante
V174 y el alelo az0005537 habitual mayoritario (A). Por tanto, el
alelo az0005537 variante (C) parece que tiene un efecto aditivo
sobre los niveles plasmáticos de rosuvastatina.
Puesto que los alelos de SNP az0005537 están en
desequilibrio enlazante con aquellos de V174A de OATPC, el alelo
variante en el SNP en la región promotora puede incrementar la
expresión del alelo de OATPC de función reducida, dando como
resultado mayores niveles plasmáticos de rosuvastatina en sujetos
que tienen ambas variantes polimórficas. Los datos mostrados son la
combinación de dos estudios clínicos de fase III en los que se
recogieron los datos de PK. Los sujetos heterocigóticos para la
variante V174A se han estratificado en dos grupos, basándose en el
genotipo para el polimorfismo az0005537 del promotor: NF1 WT =
sujetos con genotipo de tipo salvaje A/A en el SNP az0005537; NF1
het = sujetos con el genotipo heterocigótico A/C en el SNP
AZ0005537.
De forma resumida, el gen de
OATP-C se secuenció en 79 sujetos humanos sometidos
a ensayo clínico. De estos pacientes, 52 habían recibido
rosuvastatina durante al menos 6 semanas para enfermedad
dislipidémica, y se les tomaron medidas de PK del plasma después de
6 semanas de tratamiento. Los datos para estos 52 pacientes se
usaron para mostrar que algunas variantes polimórficas en
OATP-C tuvieron un efecto funcionalmente
significativo sobre los niveles plasmáticos de las estatinas.
El promotor, los exones y las regiones no
traducidas de 3' de OATP-C se secuenciaron
completamente mediante secuenciación con terminador de ADN en ADN
recogido de 79 sujetos en ensayos clínicos. Se usaron trazas de
secuenciación para registrar los genotipos en busca de SNP conocidos
(es decir, disponibles en la bibliografía o en las bases de datos
de SNP) en OATP-C. Se encontraron algunos nuevos SNP
en el promotor y en la región 3'UTR de OATP-C.
Se determinaron las concentraciones plasmáticas
medias de rosuvastatina normalizadas a la dosis para los genotipos
para cada variante polimórfica en el gen de OATP-C.
Los datos de los genotipos de OATP-C para 3 SNP, a
saber, la posición de aminoácidos 130 asparagina \rightarrow
ácido aspártico (Asn130Asp), 155 prolina \rightarrow treonina
(Pro155Thr) y 174 valina \rightarrow alanina (Va1174Ala), se
utilizó para determinar el par haplotípico para cada sujeto. Las
concentraciones plasmáticas medias de rosuvastatina normalizadas a
la dosis se determinaron para los sujetos agrupados por el par
haplotípico.
Todos los sujetos que dieron su autorización
tratados con rosuvastatina (n = 271), procedentes de los 2 ensayos
clínicos que incluyen los 52 pacientes originales, se genotiparon
subsiguientemente, usando TaqMan^{TM}, en busca de las variantes
de OATP-C. Los datos para SNP que provocan las
variantes N130D, P155T y V174A se utilizaron para asignar los pares
haplotípicos de OATPC a cada sujeto, como se describió
previamente.
Los datos de secuenciación revelaron un número
de SNP no dado a conocer previamente, 8 en la región promotora
(Jung, D. 2001 Journal of Biological Chemistry. 276(40),
37206-37214) y 4 en la región 3'UTR de
OATP-C. Estos SNP representan otro aspecto de la
invención. Estos 12 nuevos SNP se identificaron vía secuenciación
del gen de OATP-C en 79 sujetos. De estos nuevos
SNP, 8 SNP se localizaron en el promotor de OATP-C.
Dos de estos SNP se localizaron en los sitios de unión del factor
de transcripción NF1 de consenso en las posiciones -26A>G y
-118A>C, con relación al sitio de iniciación de la transcripción
(véase SEQ ID NO 2). Otros nuevos SNP en dirección 5' incluyeron
-309T>C, -878A>G, -903C>T, -1054G>T, -1215T>A y
-1558T>C, en los que las posiciones nucleotídicas se dan con
relación al sitio de iniciación de la transcripción como se
describe por Jung et al (SEQ ID NO 2). Se localizaron otros 4
nuevos SNP en la región 3'UTR del gen de OATP-C, a
saber, T2122G, C2158T, A2525C, y G2651A, en los que la posición
nucleotídica se da con relación al ATG (véase SEQ ID NO 3).
Los datos de genotipos de OATP-C
para 3 SNP, Asn130Asp, Pro155Thr y Val174Ala, se utilizaron para
determinar los haplotipos. Para este análisis se usó el paquete
SNPHAP (Clayton, David SNPHAPv0.2 2002
http://www-gene.cimr.cam.ac.uk/clayton/software/snphap.txt).
Los haplotipos también se predijeron usando el paquete PHASE
(Stephens, M. 2001 American Journal of Human Genetics 68,
978-989), y se encontró que daba los mismos
haplotipos predichos. Se encontró que los haplotipos concordaban
con los dados a conocer previamente (Tirona 2001). El SNP del
promotor -118A>C, en el sitio de unión a NF1, estaba en un
fuerte desequilibrio enlazante con la variante codificante de
Val174Ala (delta = 0,3).
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La Tabla 4 muestra la distribución de genotipos
para la variante V174A entre sujetos clasificados en grupos de PK
"elevados" y "bajos", basándose en la distribución de los
niveles plasmáticos de PK de rosuvastatina en 2 ensayos de fase
III. Los subgrupos elevados y bajos representan aquellos sujetos con
valores de PK en el 10º y el 90º percentil, en comparación con la
distribución de los valores de PK plasmáticos observados para la
cohorte del ensayo completo. El genotipo heterocigótico Val/Ala es
más común en aquellos sujetos con niveles de PK plasmáticos
"elevados", y más frecuente que lo que sería de esperar por
pasar basándose en la frecuencia de alelos de población de la
variante V174A [chi al cuadrado p = 0,037 cuando n = 52 (todos los
sujetos) y p = 0,019 cuando n = 42 (sólo sujetos caucásicos)] y
[ensayo exacto p = 0,055 cuando n = 52 (todos los sujetos) y p =
0,043 cuando n = 42 (sólo sujetos caucásicos)].
Los datos de secuencias y de genotipos
procedentes de 79 sujetos se usaron para determinar las frecuencias
alélicas y haplotípicas. Las concentraciones plasmáticas de
rosuvastatina estuvieron sólo disponibles para 52 de estos 79
sujetos, y por tanto sólo hubo un pequeño número de sujetos para
algunos de los grupos de pares haplotípicos.
La variante V174A habitualmente se produce como
el alelo OATPC*15. La variante V174A también se ha observado en el
alelo OATPC*5 en poblaciones caucásicas, pero no en poblaciones de
japoneses. Sin embargo, no se han observado diferencias
estadísticamente significativas en frecuencias de estos alelos entre
poblaciones.
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A) Secuencias
Proteínicas
Secuencias proteínicas determinadas mediante
traducción de ADNc con número de acceso AF205071
\vskip1.000000\baselineskip
2) Secuencia de la proteína de
OATPC OATPC*15 (D130 y A174) - SEQ ID NO:
4
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B) Secuencia de ADNc de OATPC
(AF205071) para los SNP de
3'UTR
La región codificante son los nucleótidos 135 a
2210. Se describe la posición de los polimorfismos en dirección 3'
del ATG (mayúsculas) cuando la A del ATG es +1.
Se subrayan los polimorfismos T2122G, C2158T,
A2525C, G2651A.
\newpage
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SEQ ID NO: 3
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
C) Secuencia de la región
promotora de OATPC a partir de
AC022335
-26A>G o -118A>C, y -309T>C,
-878A>G, -903C>T, -1054G>T, -1215T>A o -1558T>C, en
los que las posiciones nucleotídicas se dan con relación al sitio
de iniciación de la transcripción (como se define por Jung et
al) y según la siguiente secuencia de promotor y de flanqueo de
5' (a partir de AC022335).
El comienzo de la transcripción se señala con
una flecha. Los SNP se señalan en mayúsculas.
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
SEQ ID NO:2
Se ha determinado la constatación de una
relación in vivo de genotipo-fenotipo entre
variantes de OATP-C y el perfil farmacocinético de
estatinas, una clase habitual de fármacos usada en el tratamiento de
hipercolesterolemia/dislipidemia. La observación de mayores
concentraciones plasmáticas de rosuvastatina en pacientes con la
variante de OATP-C de Ala174 indica que el
transporte de rosuvastatina por la variante Ala174 es menor que el
de la variante de OATP-C de Val174. De este modo,
la variante Ala174 provoca una captación reducida de estatinas en el
hígado, y por consiguiente niveles plasmáticos más elevados. La
concentración plasmática del fármaco es un factor a la hora de
alterar la relación de beneficio-riesgo de la
terapia estatínica. Las variantes de OATP-C N130D y
P155T no parece que afectan a la disposición farmacocinética de
rosuvastatina.
La correlación genotipo-fenotipo
entre variantes de OATP-C y niveles plasmáticos
in vivo de estatinas se puede utilizar para optimizar la
dosis de la estatina, apropiada para cada individuo, vía un ensayo
de diagnóstico para determinar el SNP o la variante proteínica. La
optimización del nivel plasmático será importante en sujetos que
requieran dosis elevadas de estatina para adecuar la reducción de
los niveles de colesterol al umbral deseado.
La prueba de que los polimorfismos en
OATP-C afectan a la disposición in vivo de
estatinas indica que las variantes de OATP-C pueden
afectar a la respuesta clínica frente a las estatinas y otros
fármacos clínicamente importantes que son transportados por
OATP-C. La correlación de polimorfismos en
OATP-C con el final de las concentraciones
plasmáticas de rosuvastatina del tratamiento normalizadas a la
dosis, determinadas en sujetos tratados durante 6 semanas con
diferentes dosis de rosuvastatina, ha mostrado que las variantes de
OATP-C tienen un efecto funcional sobre la
disposición farmacocinética in vivo de rosuvastatina. Los
sujetos heterocigóticos para la variante Val174Ala tienen mayores
concentraciones plasmáticas medias de rosuvastatina, en comparación
con los sujetos homocigóticos para la variante Val174 de tipo
salvaje en la posición de aminoácidos 174. Se encontró que los
sujetos con una sola copia del alelo OATP-C*15
(heterocigóticos para las variantes Val174Ala y Asn130Asp) tienen
concentraciones plasmáticas medias mayores que los sujetos con los
haplotipos OATP-C*1a, OATP-C*1b, y
OATP-C*14. La observación de mayores concentraciones
de rosuvastatina en sujetos con la variante de
OATP-C Ala174 indica que el transporte por la
variante Ala174 es menor que el de la variante de
OATP-C Val174. La variante Ala174 provoca una
captación reducida de estatinas en el hígado, y tiene un impacto
sobre la respuesta clínica a las estatinas. Las variantes de
OATP-C que afectan al perfil farmacocinético de las
estatinas se pueden asociar con una menor relación
beneficio-riesgo de la terapia estatínica, como
resultado de las elevadas concentraciones de estatinas en la
circulación. La correlación de genotipo-fenotipo
entre variantes de OATP-C y los niveles plasmáticos
in vivo de las estatinas se puede utilizar para optimizar la
dosis de estatinas, apropiada para cada individuo, vía un ensayo de
diagnóstico para el SNP o la variante proteínica. La optimización
del nivel plasmático será importante en sujetos que requieran dosis
elevadas de estatina para una adecuada reducción de los niveles de
colesterol hasta el umbral
deseado.
deseado.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 4 muestra que hay una tendencia a
incrementar las concentraciones plasmáticas medias de rosuvastatina
en aquellos sujetos que son heterocigóticos para el SNP az0005537.
Este SNP está localizado dentro de un sitio de unión al factor de
transcripción NF1 putativo, en -118 pb en dirección 5' del comienzo
de la transcripción.
La Figura 5 muestra que los sujetos que tienen
la variante 174A enlazada y el alelo C minoritario en el SNP
az0005537 tienen una tendencia a mayores concentraciones plasmáticas
medias de rosuvastatina, en comparación con sujetos con la variante
V174 pero con el alelo az0005537 común principal (A). Por tanto,
parece que el alelo az0005537 variante (C) tiene un efecto aditivo
sobre los niveles plasmáticos de rosuvastatina.
Puesto que los alelos de SNP az0005537 están en
desequilibrio enlazante con aquellos de V174A de OATPC, el alelo
variante en el SNP en la región promotora puede incrementar la
expresión del alelo de OATPC de función reducida, dando como
resultado un aumento de los niveles plasmáticos de rosuvastatina en
sujetos que tengan ambas variantes polimórficas.
Cuando se considera V174A sola con la cohorte
completa de muestras (n = 267), V174A WT en comparación con el
heterocigoto de V174A tiene un valor de la prueba de t de p = 0,055.
Sin embargo, si se considera V174VWT frente al heterocigoto del
compuesto (az0005537) de V174A&NF1, entonces el valor de la
prueba de la t es p = 0,032, que es estadísticamente significativo.
Esto sugiere que el SNP de NF1 de OATPC también puede ser un
determinante de la disposición farmacocinética de rosuvastatina. Los
datos funcionales in vitro preliminares apoyan la hipótesis
de que el alelo az0005537 C variante está asociado con la expresión
aumentada. El polimorfismo del promotor puede llevar a la expresión
alélica diferencial con una mayor expresión del alelo de OATPC de
función
reducida.
reducida.
\newpage
Se analizaron los polimorfismos -118A>C o
-1558T>C de SEQ ID NO:2 como se expone más abajo.
Los alelos de los polimorfismos en -118 y -1558
están en desequilibrio enlazante significativo con el alelo de
alanina en la posición 174 de SEQ ID NO:1 (p = 0,009 y 0,025,
respectivamente, analizado mediante el programa ASSOCIATE, véase
Ott J (1999) Analysis of human genetic linkage, 3ª edición. Johns
Hopkins University Press, Baltimore).
<110> AstraZeneca AB
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<120> 101170
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<130> AFG 101170
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<140> PCT/GB2004/003236
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<141>
26-07-2004
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<150> GB 0317592.4
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<151>
26-07-2003
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<160> 5
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 691
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 2050
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<212> ADN
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<213> Homo Sapiens
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 2830
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<212> ADN
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<213> Homo Sapiens
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<400> 3
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens
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<400> 5
Claims (13)
1. Un método de diagnóstico que comprende:
- (a)
- usar una muestra biológica procedente de un ser humano al que se le identifica que necesita un tratamiento con rosuvastatina, en el que la muestra comprende un ácido nucleico que codifica OATP-C;
- (b)
- ensayar el ácido nucleico para determinar la presencia, en al menos un alelo, de un codón que codifica alanina en la posición correspondiente a la posición 174 de SEQ ID NO: 1, y
- (c)
- si se encuentra (b) en al menos un alelo, diagnosticar que es probable que el ser humano tenga una capacidad reducida para transportar el agente rosuvastatina a las células.
2. Un método según cualquier reivindicación
anterior, en el que el agente terapéutico es una estatina, el ser
humano está siendo tratado con un nivel de dosificación de estatina,
y la etapa (c) comprende además diagnosticar al ser humano como
adecuado para la valoración a otro nivel más elevado de dosis de
estatina, que comprende monitorizar la disminución de la relación
beneficio-riesgo que resulta de la capacidad
reducida para transportar la estatina a las células.
3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en
el que el ser humano está siendo tratado con al menos 5 mg de una
rosuvastatina diariamente.
4. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en
el que el ser humano está siendo tratado con al menos 10 mg de una
rosuvastatina diariamente.
5. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en
el que el ser humano está siendo tratado con al menos 20 mg de una
rosuvastatina diariamente.
6. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en
el que el ser humano está siendo tratado con al menos 40 mg de una
rosuvastatina diariamente.
7. Un método de diagnóstico que comprende:
- (a)
- usar una muestra biológica procedente de un ser humano al que se le identifica que necesita un tratamiento con rosuvastatina, en el que la muestra comprende un polipéptido de OATP-C;
- (b)
- determinar si el aminoácido de OATP-C que corresponde a la posición 174 de SEQ ID NO: 1 es una valina; y
- (c)
- si el aminoácido no es una valina, diagnosticar que es probable que el ser humano tenga una capacidad reducida para transportar rosuvastatina a las células.
8. Un método según la reivindicación 7, en el
que el agente terapéutico es una estatina, el ser humano está
siendo tratado con un nivel de dosis de estatina, y la etapa (c)
comprende además diagnosticar al ser humano como adecuado para la
valoración a otro nivel más elevado de dosis de estatina, que
comprende monitorizar una disminución de la relación
beneficio-riesgo que resulta de la capacidad
reducida para transportar la estatina a las células.
9. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 7-8, en el que el aminoácido en la
posición 174 se determina que es alanina.
10. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 7-9, en el que un ser humano está
siendo tratado con al menos 5 mg de una rosuvastatina
diariamente.
11. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 7-9, en el que un ser humano está
siendo tratado con al menos 10 mg de una rosuvastatina
diariamente.
12. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 7-9, en el que un ser humano está
siendo tratado con al menos 20 mg de una rosuvastatina
diariamente.
13. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 7-9, en el que un ser humano está
siendo tratado con al menos 40 mg de una rosuvastatina
diariamente.
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