DE60121567T2

DE60121567T2 - Polymorphismen in der promoterregion des humanen cyp2d6 gens und deren diagnostische und therapeutische verwendung

Info

Publication number: DE60121567T2
Application number: DE60121567T
Authority: DE
Inventors: Sebastian Raimundo; Ulrich Zanger
Original assignee: Epidauros Biotechnologie AG
Current assignee: Epidauros Biotechnologie AG
Priority date: 2000-01-31
Filing date: 2001-01-30
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2021-01-31
Also published as: CA2398104A1; WO2001055432A2; EP1276880B1; DE60121567D1; WO2001055432A3; US20120270948A1; ATE333504T1; AU2001257913A1; CA2398104C; ES2267787T3; JP2004506405A; EP1276880A2; US20040224424A1; US8129112B2

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf Mittel und Verfahren zur Diagnose und Behandlung des phänotypischen Spektrums sowie der überlappenden klinischen Merkmale mit mehreren Arten von vererbter abnormer Expression und/oder Funktion des Cytochrom P-450 (CYP)2D6-Gens. Demgemäß beschreibt die vorliegende Anmeldung Polynucleotide von molekularen Varianten der CYP2D6-Genpromotoren, welche zum Beispiel verbunden sind mit abnormer Arzneistoff-Reaktion oder individueller Veranlagung zu mehreren üblichen Krankheiten und Störungen, die durch Arzneistoffunter- oder -übermetabolisierung verursacht werden, und zu Vektoren, die solche Polynucleotide umfassen. Darüber hinaus beschreibt die vorliegende Anmeldung Wirtszellen, die solche Polynucleotide oder Vektoren umfassen. Außerdem beschreibt die vorliegende Anmeldung Verfahren zur Identifizierung und Erhaltung von Arzneistoffkandidaten zur Therapie von Störungen in Bezug auf die Dysfunktion des CYP2D6-Gens sowie Verfahren zur Diagnose des Zustands solcher Störungen. Die vorliegende Erfindung stellt darüber hinaus Kits bereit, die Oligonucleotide umfassen, die mit dem CYP2DG-Promotor hybridisieren und/oder in der Lage sind, verlängert zu werden in diese Region, die verwendbar sind zur Diagnose von Testpersonen, die zum Beispiel ultrarapide oder intermediäre Metabolizer von Arzneistoffen sind.
Hintergrund der Erfindung
Cytochrom P450-CYP2D6 gehört zur CYP2-Familie von P450s und ist das einzige funktionell aktive Isoyzm der CYP2D-Unterfamilie bei Menschen. Es ist am Metabolismus von bis zu 25% aller therapeutisch verwendeten Arzneistoffe beteiligt (Hardman et al., 1995). Das seine Synthese codierende Gen befindet sich im CYP2D-Genort bei q13.1 auf dem langen Arm von Chromosom 22 (Eichelbaum et al., 1987). Es ist Teil eines Genclusters, das auch zwei Pseudogene CYP2D7P und CYP2D8P enthält (Kimura et al., 1989). Wie andere Mitglieder der menschlichen CYP2-Genfamilie bestehen die CYP2D-Gene aus 9 Exons und 8 Introns. Das Enzym weist einen üblichen genetischen Polymorphismus auf (Meyer und Zanger, 1997). In der Tat war es das erste Cytochrom P450-Enzym, für welches ein genetischer Polymorphismus gezeigt wurde, welcher der Debrisoquin/Spartein-Polymorphismus genannt wurde, auf der Grundlage der zwei Substrate, die bei seiner Entdeckung beteiligt waren (Mahgoub et al., 1977; Eichelbaum et al., 1979). Abhängig von der metabolischen Verwertung dieser zwei Sonden-Arzneistoffe haben zwischen 5 und 10 der Testpersonen von europäischen Bevölkerungen eine stark beeinträchtigte Kapazität, die Hauptmetaboliten 4-Hydroxydebrisoquin und 2-Dehydrospartein zu bilden. Diese Testpersonen wurden als schwache Metabolizer (PM) bezeichnet, der Rest der Bevölkerung als so genannte extensive Metabolizer (EM). Die Eigenschaft ,schwacher Metabolismus' wird auf eine autosomal-rezessive Weise vererbt, d.h. PMs sind Träger von zwei nicht-funktionellen Allelen. Die molekulare Grundlage dieses Polymorphismus wurde ausführlich erforscht und mehr als 30 funktionelle und nicht funktionelle Allele wurden beschrieben, welche es ermöglichen, den PM-Phänotyp bei Kaukasiern mit einer geschätzten 99%igen Zuverlässigkeit vorherzusagen. (Daly et al., 1996 und CYP Allele Nomenclature Web-Site: http://www.imm.ki.se/CYPalleles/cyp2d6.htm).
Eine über 50-fache Variabilität an CYP2D6-Aktivität existiert unter extensiven Metabolizern (Trägern von genetisch mindestens einem funktionellen Allel), welche zur Bezeichnung des schnellsten „extensiven" Phänotypen als „ultrarapiden" (UM) und des langsamsten als „intermediären" Metabolizer (IM) führte. Es gibt einen Hinweis in der Literatur, dass diese Subphänotypen klinisch relevant sind. Individuen mit dem UM-Phänotyp haben das Risiko, therapeutisches Versagen auf Grund von abnorm schneller Clearance des Arzneistoffs zu erfahren, während IMs in ihrem Risiko, ungünstige Nebenwirkungen und Toxizität zu entwickeln, mit PMs vergleichbar sind. Eine molekulare Erklärung für den UM-Phänotyp wurde durch die Entdeckung der CYP2D6-Genverdopplung bereitgestellt, welche allerdings nur für einen Teil von UMs gilt (Johansson et al., 1993; Dahl et al., 1995). Zwei früher beschriebene CYP2D6-Allele wirken sich in einer geringeren Enzymaktivität aus und verursachen den IM-Phänotypen bei Individuen, die kein normales funktionelles Allel tragen. Jedoch kommen beide dieser Allele (*9: Broly und Meyer, 1993; *10: Yokota et al., 1993) mit einer Häufigkeit von nur 2 % bei der kaukasischen Bevölkerung vor und nur etwa 20% der IMs haben informative Genotypen, die diese zwei Allele einbeziehen (d.h. *9/0, *10/0 und *10/10; Sachse et al., 1997; Griese et al., 1998). 80% der IMs haben daher „nicht-informative" Genotypen, d.h. Genotypen, die auch mit dem normal extensiven oder ultrarapiden Metabolizer-Phänotypen verbunden sind. Es blieb daher unklar, ob der IM-Subphänotyp eine genetische Grundlage hat oder ob er ein epigenetisches Phänomen ist.
Es ist klar, dass natürlich vorkommende Mutationen, wenn sie existieren, Wirkungen auf Arzneistoffmetabolisierung und Wirksamkeit von Therapien mit Arzneistoffen haben können. Es ist jedoch unbekannt, wie viele solcher Variationen existieren, und mit welcher Häufigkeit und bei welchen Positionen in den menschlichen CYP2D6-Genen.
Demgemäß waren Mittel und Verfahren zur Diagnose und Behandlung einer Vielfalt von Arten von individueller Arzneistoffunverträglichkeit und Unwirksamkeit von Arzneistofftherapie, welche aus CYP2D6-Genpolymorphismen resultieren, die z.B. chemotherapeutische Behandlung von Krankheiten stören, bisher nicht genügend verfügbar, aber dennoch höchst erstrebenswert.
Demnach ist das technische Problem der vorliegenden Erfindung, die voranstehend beschriebenen Bedürfnisse zu erfüllen.
Die Lösung des technischen Problems wird durch Bereitstellen der in den Patentansprüchen charakterisierten Ausführungsformen erzielt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf den Befund von neuen, bisher unbekannten Variationen in den Nucleotidsequenzen des CYP2D6-Genpromotors und der Populationsverteilung dieser Allele. Auf der Grundlage der Kenntnis dieser neuen Sequenzen wurden diagnostische Tests und Reagenzien für solche Tests entworfen zum spezifischen Nachweis und Genotypisierung von CYP2D6-Promotorallelen bei Menschen, einschließlich homozygoter wie heterozygoter, häufiger wie seltener Allele des CYP2D6-Promotors. Die Bestimmung des CYP2D6-Promotor-Allel-Zustands der Menschen mit solchen Tests ist verwendbar für die Optimierung von Therapien mit zahlreichen Substraten von CYP2D6.
Demnach beschreibt die vorliegende Anmeldung Polynucleotide einer molekularen Variante des CYP2D6-Genpromotors und dazu gehörige Ausführungsformen, wie Vektoren und damit transferierte Wirtszellen.
Demgemäß stellt die Erfindung Verfahren bereit mit Verwendung in Therapie von Störungen in Bezug auf erworbener Arzneistoffhypo- oder -hypersensitivität sowie Verfahren zur Diagnose des Zustands solcher Störungen durch Verwendung der molekularen Variante des Polynucleotids, wie hierin definiert. Die Erfindung stellt auch in vitro-Verfahren zur Entwicklung eines pharmakodynamischen Profils von Arzneistoffen bereit, die Substrate des CYP2D6-Genprodukts sind, für einen Patienten oder zur Verbesserung der Therapie von Krankheiten mit Arzneistoffen, die Ziele des CYP2D6-Genprodukts sind, durch Verwendung eines Einzelnucleotid-Polymorphismus des CYP2D6-Gens, wie hierin definiert.
Darüber hinaus stellt die Erfindung Verfahren zur Diagnose einer reduzierten oder gesteigerten Clearance-Kapazität von CYP2D6-Substraten bereit, wie hierin beschrieben.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung einen Primer oder eine Sonde bereit, wie hierin beschrieben, welcher) bei den Anwendungen verwendet werden kann (können), wie hierin beschrieben.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung Kits bereit, verwendbar zur Ausführung der Verfahren der vorliegenden Erfindung, wie hierin beschrieben.
Die neuen Arten der CYP2D6-Gen-Variante gemäß der Erfindung stellen das Potenzial zur Entwicklung eines pharmakodynamischen Profils von Arzneistoffen für einen gegebenen Patienten bereit.
Beschreibung der Erfindung
Der Befund und die Charakterisierung von Variationen bei den CYP2D6-Genen und diagnostische Tests zur Abgrenzung von verschiedenen CYP2D6-Allelen bei menschlichen Individuen stellen ein sehr starkes Hilfsmittel zur Verbesserung der Therapie von Krankheiten mit Arzneistoffen bereit, die Ziele des CYP2D6-Genprodukts sind, und deren Metabolisierung daher abhängig von der CYP2D6-Aktivität ist. Die Diagnose des individuellen allelen CYP2D6-Zustands gestattet eine gezieltere Therapie, z.B. durch Eröffnung der Möglichkeit, individuelle Dosierungsschemata von Arzneistoffen zu verwenden. Sie kann auch als prognostisches Hilfsmittel für den Therapie-Ausgang verwendbar sein. Darüber hinaus werden diagnostische Tests zur Genotypisierung von CYP2D6 die Therapie mit bewährten Arzneistoffen verbessern und helfen, Genotypen mit Arzneistoffaktivität oder Nebenwirkungen zu korrelieren.
Demnach stellt die vorliegende Erfindung einen Weg bereit, um Molekularbiologie und pharmakologische Forschung zur Arzneistofftherapie auszunutzen, unter Umgehung ihrer möglichen schädlichen Wirkungen, welche auf Expression der Expression der Variante des CYP2D6-Gens beruhen.
Demgemäß kann bei den Verfahren und Verwendungen der Erfindung ein Polynucleotid verwendet werden, welches aus einer Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:

(a) einer molekularen Variante des Polynucleotids, das die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:1 hat, wobei an der Nucleotidposition, die der Nucleotidposition -1584 des CYP2D6-Promotors entspricht, wie in 1 gezeigt, sich ein G befindet;
(b) einer molekulare Variante des Polynucleotids, das in der Lage ist, mit dem CYP2D6-Promotor, wie in 1 gezeigt, zu hybridisieren, wobei das Polynucleotid an einer Position, die der Position -1584 des CYP2D6-Promotors entspricht, wie in 1 gezeigt, mindestens eine Nucleotiddeletion, -addition und/oder -substitution aufweist; und
(c) einer molekularen Variante des Polynucleotids, das in der Lage ist, mit dem CYP2D6-Promotor, wie in 1 gezeigt zu hybridisieren, wobei das Polynucleotid an einer Position, die der Position -1584 des CYP2D6-Promotors entspricht, wie in 1 gezeigt, ein G aufweist.

In einer bevorzugten Ausführungsform wirkt sich die Nucleotiddeletion, -addition und/oder -substitution in einer geänderten Expression der CYP2D6-Genvariante aus, verglichen mit dem entsprechenden Wildtypgen.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „molekulare Variante" des CYP2D6-Promotors, -Gens oder -Proteins, wie hierin verwendet, dass sich der CYP2D6-Promotor, das CYP2D6-Gen oder das CYP2D6-Protein vom Wildtyp-CYP2D6-Promotor, -Gen oder -Protein durch Nucelotidsubstitution(en), -addition(en) und/oder -deletion(en) unterscheidet (Genomische Sequenzen des CYP2D6-Gens, einschließlich des Promotors, werden zum Beispiel in Genbank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankOverview.html [Zugangsnummer M33388] beschrieben).
Der Begriff „entsprechend", wie hierin verwendet, bedeutet, dass eine Position nicht nur durch die Anzahl der vorstehenden Nucleotide bestimmt wird. Die Position eines gegebenen Nucleotids gemäß der vorliegenden Erfindung, welches deletiert oder substituiert sein kann oder ein oder mehr zusätzliche(s) Nucleotid(e) umfassen kann, kann auf Grund von Deletionen oder zusätzlichen Nucleotiden anderswo im Promotor oder im Gen variieren. Demnach muss unter einer „entsprechenden Position" gemäß der vorliegenden Erfindung verstanden werden, dass sich Nucleotide in der angezeigten Zahl unterscheiden, aber noch gleiche benachbarte Nucleotide haben. Die Nucleotide, welche ausgetauscht oder deletiert sein können oder zusätzliche Nucleotide umfassen, werden auch durch den Begriff „entsprechende Position" eingeschlossen. Die Nucleotide können zum Beispiel zusammen mit ihren Nachbarn Sequenzen bilden, welche bei der Regulation der Genexpression, Stabilität der entsprechenden RNA oder beim RNA-Editing beteiligt sein können.
Der Begriff „Hybridisierung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Polynucleotide, welche in der Lage sind, mit Polynucleotiden der Erfindung oder Teilen davon zu hybridisieren, welche mit geänderter Expression der Variante des CYP2D6-Gens, verglichen zum entsprechenden Wildtyp-Gen, in Zusammenhang stehen. Demnach stehen die hybridisierenden Polynucleotide auch im Zusammenhang mit der geänderten Expression der Variante des CYP2D6-Gens, verglichen zum entsprechenden Wildtyp-Gen. Daher können die Polynucleotide als Sonden bei Northern- oder Southern Blot-Analyse von jeweils RNA- oder DNA-Präparationen verwendbar sein, oder können als Oligonucleotidprimer bei PCR-Analyse, abhängig von ihrer jeweiligen Größe, verwendet werden. Auch von der Erfindung umfasst sind hybridisierende Polynucleotide, welche zur Analyse von DNA-Protein-Wechselwirkungen über z.B. die Analyse der Verschiebung der elektrophoretischen Beweglichkeit (EMSA) verwendbar sind. Vorzugsweise umfassen die hybridisierenden Polynucleotide mindestens eine Länge von 10, mehr bevorzugt mindestens 15 Nucleotiden, während ein hybridisierendes Polynucleotid der vorliegenden Erfindung, das als Sonde verwendet werden soll, vorzugsweise 100, mehr bevorzugt 200 oder am meisten bevorzugt 500 Nucleotide lang ist.
Es ist auf dem Fachgebiet gut bekannt, wie Hybridisierungsexperimente mit Nucleinsäuremolekülen durchzuführen sind, d.h. ein(e) Fachmann/Expertin weiß, welche Hybridisierungsbedingungen sie/er gemäß der vorliegenden Erfindung anzuwenden hat. Solche Hybridisierungsbedingungen werden in Standardlehrbüchern beschrieben wie Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Polynucleotide bevorzugt, welche in der Lage sind, mit Polynucleotiden der Erfindung oder Teilen davon, welche mit geänderter Expression der Variante des CYP2D6-Gens, verglichen mit dem entsprechenden Wildtyp-Gen verbunden sind, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren, d.h. welche nicht kreuz-hybridisieren mit Polynucleotiden ohne Bezug, wie Polynucleotide, die nicht die Expression der Variante des CYP2D6-Gens, verglichen zum entsprechenden Wildtyp-Gen, ändern würden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden die Art und die Bevölkerungsverteilung der neuen bisher nicht identifizierten genetischen Variationen beim CYP2D6-Gen durch Sequenzanalyse von relevanten Regionen der menschlichen CYP2D6-Gene aus vielen unterschiedlichen Individuen analysiert. Es ist eine gut bekannte Tatsache, dass genomische DNA von Individuen, welche den individuellen genetischen Aufbau aller Gene beherbergen, einschließlich CYP2D6, leicht aus individuellen Blutproben aufbereitet werden kann. Diese individuellen DNA-Proben werden dann für die Analyse der Zusammensetzung der Sequenz der Allele des CYP2D6-Gens verwendet, die beim Individuum, welches die Blutprobe bereitstellt, vorhanden sind. Alle früher berichteten Studien zum CYP2D6-Polymorphismus wurden auf die codierende Sequenz, welche 9 Exons umfasst, begrenzt und fokussiert. Diese Arbeit repräsentiert die erste systematische Mutationsanalyse der Promotorregion des Gens. Die Absicht war, Mutationen zu identifizieren, wenn überhaupt, die mit geänderter Enzymaktivität in vivo verbunden sind, auf Grundlage der Annahme, dass Promotormutationen Gentranskription beeinflussen können, welche sich in höhere oder niedrigere mRNA-Niveaus auswirken können und somit zu höheren oder niedrigeren Mengen von in Leber exprimiertem Enzym führen. Überraschenderweise konnten Mutationen beim CYP2D6-Promotor gefunden werden, die jeweils mit gesteigerter oder reduzierter CYP2D6-Enzymaktivität verbunden sind. Die Sequenzanalyse wurde durch PCR-Amplifikation der relevanten Regionen des CYP2D6-Gens, nachfolgender Reinigung der PCR-Produkte, gefolgt von automatisierter DNA-Sequenzierung mit bewährten Verfahren ausgeführt; s. die Beispiele. Insbesondere werden eine Untergruppe von 10 bis 15 % Kaukasier phänotypisch „intermediäre Metabolizer" von CYP2D6-Arzneistoffsubstraten genannt, weil sie stark erniedrigte, dennoch restliche in vivo-Funktion dieses Cytochroms P450 haben. Die Genotypisierung, basierend auf den gegenwärtig bekannten CYP2D6-Allelen sagt diesen Phänotyp nicht vorher. Gemäß der vorliegenden Erfindung ergab eine systematische Suche durch 1.6 kb der CYP2D6 5'-flankierenden Sequenz 6 Mutationen, von denen drei ausschließlich mit dem funktionellen CYP2D6*2-Allel assoziiert waren und eines dieser cosegregierte mit erhöhter CYP2D6*2-Aktivität bei einer Familienstudie. In einer repräsentativen Bevölkerungsprobe war das mittlere Urin-metabolische Verhältnis (MR_S) für Spartein-Oxidation über 4-fach reduziert bei Individuen mit der neuen Allel-Variante (*2[-1584G]: MR_S = 0.53, N=27), verglichen mit Individuen, bei denen die Mutation fehlt (*2[-1584C]: MR_S = 2.33, N=12; P<0.0001). Die erste funktionelle Promotorvariante des CYP2D6-Gens hat eine geschätzte Häufigkeit von 20% bis 25% bei der allgemeinen Bevölkerung und ermöglicht es, einen Genotyp zur Identifizierung von über 50% der Kaukasier mit dem Phänotyp des intermediären Metabolizers festzustellen.
Ein wichtiger Parameter, der beim Bestreben bedacht werden musste, den individuellen CYP2D6-Genotyp zu bestimmen und neue CYP2D6-Varianten durch direkte DNA-Sequenzierung von PCR-Produkten aus genomischer DNA von menschlichem Blut zu identifizieren, ist die Tatsache, dass jeder Mensch zwei Genkopien von jedem autosomalen Gen (Diploidie) beherbergt (üblicherweise, mit sehr wenigen abnormen Ausnahmen). Deswegen musste große Mühe bei der Auswertung der Sequenzen eingesetzt werden, um eindeutig nicht nur homozygote Sequenzvariationen sondern auch heterozygote Variationen identifizieren zu können. Die Details der unterschiedlichen Schritte bei der Identifizierung und Charakteristisierung von neuen CYP2D6-Genpolymorphismen (homozygoten und heterozygoten) werden in den Beispielen nachstehend beschrieben.
Die Mutationen beim nachgewiesenen CYP2D6-Gen gemäß der vorliegenden Erfindung werden jeweils in 1 und Tabelle 2 veranschaulicht. Die Verfahren der Mutationsanalyse folgten Standardprotokollen und werden im Detail in den Beispielen beschrieben. Allgemein umfassen solche Methoden, die gemäß der vorliegenden Erfindung zur Auswertung des phänotypischen Spektrums sowie der überlappenden klinischen Merkmale mit anderen Arten der Arzneistoffmetabolisierung und geänderter Arzneistoffverträglichkeit bei Patienten mit Mutationen im CYP2D6-Gen zu verwenden sind, zum Beispiel Haplotyp-Analyse, Einzelstrangkonformations-Polymorphismus-Analyse (SSCA), PCR und direkte Sequenzierung. Auf der Basis von gründlicher klinischer Charakterisierung von vielen Patienten können diese Phänotypen dann mit diesen Mutationen sowie mit Mutationen, die früher beschrieben worden waren, korreliert werden. Wie für den Fachmann ersichtlich, kann diese neue molekulargenetische Kenntnis nun verwendet werden, um genau den Genotyp des Index-Patienten, bei dem gegebener Arzneistoff eine ungewöhnliche Wirkung bringt, und seiner Familie zu charakterisieren.
Über die vergangenen 20 Jahre wurde genetische Heterogenität zunehmend als ein signifikanter Ursprung von Variation in Arzneistoffreaktion erkannt. Viele wissenschaftliche Mitteilungen (Meyer und Zanger, 1997; West et al., 1997) zeigten deutlich, dass einige Arzneistoffe bei einigen Patienten besser funktionieren oder sogar stark toxisch sind als bei anderen und dass diese Variationen bei Patientenreaktionen auf Arzneistoffe auf molekulare Grundlage bezogen werden kann. Dieses „pharmakogenomische" Konzept macht Korrelationen zwischen Arzneistoffreaktionen und genetischen Profilen des Patienten aus (Marshall, 1997a und 1997b). In diesem Zusammenhang der Bevölkerungsvariabilität im Hinblick auf Arzneistofftherapie wurden Pharmakogenomics als verwendbares Hilfsmittel bei der Identifizierung und Auswahl von Patienten vorgeschlagen, welche auf einen besonderen Arzneistoff ohne Nebenwirkungen reagieren. Diese Identifizierung/Auswahl kann auf molekularer Diagnose von genetischen Polymorphismen durch DNA-Genotypisierung aus Leukozyten im Patientenblut beruhen. Für die Versorger des Gesundheitswesen, wie Gesundheitsverwaltungs-Organisationen in den USA und öffentliche Gesundheitsdienste der Regierung in vielen europäischen Ländern, kann die Herangehensweise der Pharmakogenomics sowohl das Gesundheitswesen verbessern als auch die allgemeinen Kosten reduzieren, weil es beträchtliche Kosten bei unnötigen Therapien, unwirksamen Arzneistoffen und Arzneistoffen mit Nebenwirkungen gibt.
Das hierin beschriebene Polynucleotid kann z.B. DNA, genomische DNA oder synthetisch hergestellte DNA sein oder ein rekombinant hergestelltes chimäres Nucleinsäuremolekül, das beliebige von jenen Polynucleotiden entweder alleine oder in Kombination umfasst. Die Polynucleotide können Teil eines Vektors sein, besonders konventionell in der Gentechnik verwendete Plasmide, Cosmide, Viren und Bacteriophagen, die ein Polynucleotid der Erfindung umfassen. Solche Vektoren können weiter Gene umfassen, wie Markergene, welche die Auswahl des Vektors in einer passenden Wirtszelle und unter passenden Bedingungen ermöglichen. Verfahren, welche Fachleuten gut bekannt sind, können angewendet werden, um rekombinante Vektoren zu konstruieren; s. zum Beispiel die Methoden beschrieben in Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. und Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994). Die vorliegende Anmeldung beschreibt darüber hinaus mit einem Polynucleotid oder einem Vektor der Erfindung transformierte Wirtszellen. Die Wirtszelle kann eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein.
Mit den Polynucleotiden der CYP2D6-Variante und Vektoren der Erfindung ist es nun möglich, in vivo und in vitro die Wirksamkeit von Arzneistoffen in Bezug auf besondere Mutationen im CYP2D6-Gen eines Patienten und den betroffenen Phänotypen zu studieren. Somit betrifft ein besonderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung Arzneistoff/Prodrug-Auswahl und Formulierung von pharmazeutischen Zusammensetzungen für die Behandlung von Krankheiten, welche zugänglich für Chemotherapie sind, wobei der Polymorphismus der Variantenform des CYP2D6-Genpromotors beachtet wird, die mit dem betroffenen Phänotypen des zu behandelnden Patienten cosegregiert. Dies ermöglicht die sichere und wirtschaftliche Anwendung von Arzneistoffen, welche zum Beispiel bisher für nicht geeignet gehalten wurden für Therapie von z.B. Krebs auf Grund von entweder ihren Nebenwirkungen bei einigen Patienten und/oder ihrem unzuverlässigen pharmakologischen Profil hinsichtlich des/der gleichen oder verschiedenen Phänotyps/Phänotypen der Krankheit. Die hierin beschriebenen Mittel und Verfahren können verwendet werden, um zum Beispiel Dosierungsempfehlungen zu verbessern und ermöglichen dem Verordner, die notwendigen Dosisangleichungen, abhängig von der betrachteten Patientengruppe, vorherzusagen.
Demgemäß bezieht sich die vorliegende Erfindung in einer weiteren wichtigen Ausführungsform auf ein Verfahren zur Diagnose einer Störung in Bezug auf reduzierte oder gesteigerte Clearance-Kapazität von CYP2D6-Substraten oder einer Anfälligkeit für solch eine Störung, welche die Bestimmung der Anwesenheit einer Mutation im Promotor des CYP2D6-Gens in einer Probe von einer Testperson umfasst.
Gemäß der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Testen des Zustands einer Störung oder einer Anfälligkeit für solch eine Störung durch Verwendung eines Polynucleotids oder eines Nucleinsäuremoleküls der Erfindung bewirkt werden, z.B. in Form einer Southern Blot- oder in situ-Analyse. Die Nucleinsäuresequenz kann mit dem Promotor oder einer codierenden Region des CYP2D6-Gens oder mit einer nicht codierenden Region, z.B. einem Intron hybridisieren und sollte in der Lage sein, in die CYP2D6-Region verlängert zu werden. Zusätzlich kann das Testen in Verbindung mit einer effektiven Blockierung, z.B. der Transkription des Gens, ausgeführt werden und somit wird erwartet, dass es therapeutische Relevanz hat. Darüber hinaus kann auch ein Primer oder Oligonucleotid zur Hybridisierung mit einem der vorstehend erwähnten CYP2D6-Gene verwendet werden. Die zur Hybridisierung verwendeten Nucleinsäuren können natürlich durch Einbau oder Anfügung eines z.B. radioaktiven oder anderen Markers in geeigneter Weise markiert werden. Solche Marker sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Die Markierung der Nucleinsäuremoleküle kann durch konventionelle Verfahren erfolgen.
Zusätzlich kann die Anwesenheit der Variante des CYP2D6-Genpromotors durch Verwendung eines Primerpaars kontrolliert werden, das spezifisch mit einer Region des Gens hybridisiert, die den CYP2D6-Promotor umfasst, und durch Ausführung einer Amplifikationsreaktion gemäß Standardverfahren. Eine spezifische Hybridisierung der vorstehend erwähnten Sonden oder Primer geschieht vorzugsweise bei stringenten Hybridisierungsbedingungen. Der Begriff „stringente Hybridisierungsbedingungen" ist auf dem Fachgebiet gut bekannt; s. zum Beispiel Sambrook et al., „Molecular Cloning, A Laboratory Manual" zweite Ausgabe, CHS Press, Cold Spring Harbor, 1989; „Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach", Hames und Higgins Hrsg., IRL Press, Oxford, 1985. Darüber hinaus kann die von der Testperson erhaltene genomische DNA sequenziert werden, um Mutationen zu identifizieren, welche charakteristische Fingerabdrucke von Mutationen im CYP2D6-Genpromotor sein können. Die vorliegende Erfindung umfasst weiter Verfahren, worin solch ein Fingerabdruck durch RFLPs von DNA, erhalten von der Testperson, erzeugt werden kann, gegebenenfalls kann die DNA vor der Analyse amplifiziert werden, nach Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Zum Beispiel wird die Nucleinsäure der Probe, z.B. ein amplifiziertes oder cloniertes Fragment, durch eines einer Anzahl von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren analysiert. Die Nucleinsäure kann durch Didesoxy- oder anderer Methoden sequenziert werden. Die Hybridisierung mit der Sequenz der Variante kann auch verwendet werden, um ihre Anwesenheit durch Southern-Blots, Dot-Blots usw. zu bestimmen. Das Hybridisierungsmuster einer Kontrolle und einer Sequenz der Variante mit einem Array von Oligonucleotidsonden, immobilisiert auf einem festen Träger, wie beschrieben in US-A-5,445,934 oder in WO95/35505, kann auch als Mittel verwendet werden, um die Anwesenheit von Sequenzen der Variante nachzuweisen. Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse (SSCP), denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese (DGGE), Fehlanpassungs-Spaltungs-Nachweis und Heteroduplex-Analyse in Gelmatrizen werden verwendet, um durch Variation der DNA-Sequenz erzeugte Konformationsänderungen wie Änderungen in elektrophoretischer Beweglichkeit nachzuweisen. Alternativ, wo ein Polymorphismus eine Erkennungsstelle für eine Restriktionsendonuclease erzeugt oder zerstört (Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus, RFLP), wird die Probe mit dieser Endonuclease verdaut und die Produkte werden nach Größe fraktioniert, um zu bestimmen, ob das Fragment verdaut wurde. Die Fraktionierung wird durch Gel- oder Kapillarelektrophorese durchgeführt, besonders durch Acrylamid- oder Agarosegele.
Weitere Modifikationen der vorstehend erwähnten Ausführungsform der Erfindung können leicht durch den Fachmann ohne unzumutbares Experimentieren aus dieser Offenbarung entworfen werden; s. z.B. die Beispiele. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen die vorstehend beschriebenen Verfahren PCR, Ligase-Kettenreaktion, Restriktionsverdau, direktes Sequenzieren, Nucleinsäureamplifikations-Techniken oder Hybridisierungs-Techniken. Diagnostisches Screenen kann für Polymorphismen durchgeführt werden, die genetisch mit einer phänotypischen Variante bei CYP2D6-Aktivität oder -Expression verbunden sind, besonders durch die Verwendung von Mikrosatellitenmarker oder Einzel-Nucleotid-Polymorphismen (SNP). Der Mikrosatelliten- oder SNP-Polymorphismus selbst können nicht phänotypisch exprimiert werden, aber ist mit Sequenzen verbunden, die sich in geänderter Aktivität oder Expression auswirken. Zwei polymorphe Varianten können im Bindungs-Ungleichgewicht sein, d.h. wo Allele Nicht-Zufalls-Verbindungen zwischen Genen zeigen, sogar obwohl individuelle Genorte im Hardy-Weinberg-Gleichgewicht sind. Die Verbindungsanalyse kann alleine oder in Kombination mit direktem Nachweis von phänotypisch erwiesenen Polymorphismen durchgeführt werden. Die Verwendung von Mikrosatellitenmarkern zur Genotypisierung ist gut dokumentiert. Für Beispiele, s. Mansfield et al., Genomics 24 (1994), 225-233; und Ziegle et al., Genomics 14 (1992), 1026-1031. Die Verwendung von SNPs zur Genotypisierung wird veranschaulicht in Golevieva, Am, J. Hum. Genet. 59 (1996), 570-578; und in Underhill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 196-200.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Substrat, für welches reduzierte oder gesteigerte Clearance beobachtet wird, aus der Gruppe ausgewählt, die aus Antiarrhythmika, Antagonisten des Beta-adrenergen Rezeptors, tricyclischen Antidepressiva, selektiven Serotonin-Wiederaufnahme-Inhibitoren (SSRI), Neuroleptika, Opiaten, Anti-Krebs-Mitteln, Amphetaminen besteht. Die vorliegende Anmeldung sieht voraus, dass im vorstehend beschriebenen Verfahren ein weiterer Schritt, der die Verabreichung eines Medikaments an die Testperson umfasst, um die Störung zu beheben oder zu lindern gemäß allen Anwendungen des Verfahrens der Erfindung, die Behandlung einer gegebenen Krankheit vor dem Ausbruch klinischer Symptome ermöglicht, auf Grund der phänotypischen Reaktion, verursacht durch das CYP2D6-Gen. Zum Beispiel sind die Medikamente chemotherapeutische Mittel, wie vorstehend beschrieben.
Darüber hinaus bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines Oligo- oder Polynucleotids zum Nachweis eines Polynucleotids der Erfindung und/oder zur Genotypisierung von entsprechenden individuellen CYP2D6-Promotor-Allelen, wie hierin beschrieben. Vorzugsweise ist das Oligo- oder Polynucleotid ein Polynucleotid der vorher beschriebenen Erfindung. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Oligonucleotid etwa 20 bis 40, mehr bevorzugt 20 bis 30 Nucleotide Lang und umfasst die Nucleotidsequenz einer beliebigen von SEQ ID NOS: 2, 3, 5 oder 7 bis 10 oder eine komplementäre Sequenz.
Daher bezieht sich die vorliegende Erfindung in einer noch weiteren Ausführungsform auf einen Primer oder eine Sonde, die aus einem Oligonucleotid besteht, wie in Anspruch 8 definiert. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff „besteht aus", dass die vorstehend beschriebene und für den Primer oder die Sonde der Erfindung verwendete Nucleotidsequenz keine weitere Nucleotidsequenz des CYP2D6-Gens unmittelbar angrenzend an sein 5'- und/oder 3'-Ende hat. Jedoch können andere Teile wie Markierungen, z.B. Biotinmoleküle, Histidin-Markierungszeichen, Antikörperfragmente, kolloidales Gold usw. ebenso wie Nucleotidsequenzen, welche nicht dem CYP2D6-Gen entsprechen, im Primer und in den Sonden der vorliegenden Erfindung anwesend sein. Darüber hinaus ist es auch möglich, die vorstehend beschriebenen besonderen Nucleotidsequenzen zu verwenden und sie mit anderen Nucleotidsequenzen, abgeleitet aus dem CYP2D6-Gen, zu kombinieren, wobei diese zusätzlichen Nucleotidsequenzen mit anderen Teilen als Nucleinsäuren vermischt werden oder wobei die dazwischenliegende Nucleinsäure nicht der Nucleotidsequenz des CYP2D6-Gens entspricht. Darüber hinaus ist es für den Fachmann erwiesen, dass das Oligonucleotid modifiziert werden kann, zum Beispiel, mit Thiophosphat-Hauptketten und/oder Basenanaloga, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind (Flanagan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999), 3513-8; Witters, Breast Cancer Res. Treat. 53 (1999), 41-50; Hawley, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 9 (1999), 61-9; Peng Ho, Brain Res. Mol. Brain Res. 62 (1998), 1-11; Spiller, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8 (1998), 281-93; Zhang, J. Pharmacol. Exp. Ther. 278 (1996), 971-9; Shoji, Antimicrob. Agents Chemother. 40 (1996), 1670-5; Crooke, J. Pharmacol. Exp. Ther. 277 (1996), 923-37). Ein Array von Oligonucleotiden wird vorausgesehen, wo getrennte Positionen auf dem Array komplementär zu einer oder mehr der bereitgestellten polymorphen Sequenzen sind, z.B. Oligonucleotide von mindestens 12 nt. häufig 20 nt. oder größer, und einschließlich der die polymorphe Position flankierenden Sequenz. Solch ein Array kann eine Reihe von Oligonucleotiden umfassen, von welchen jedes spezifisch mit einem unterschiedlichen Polymorphismus hybridisieren kann. Zu Beispielen von Arrays s. Hacia et al., Nature Genetics 14 (1996), 441-447; Lockhart et al., Nature Biotechnol. 14 (1996), 1675-1680; und De Risi et al., Nature Genetics 14 (1996), 457-460.
Dank der vorliegenden Erfindung können die besondere Arzneistoffauswahl, das Dosierungsschema und die entsprechenden zu behandelnden Patienten gemäß der vorliegenden Erfindung bestimmt werden. Die Dosierungsempfehlungen werden in der Produktmarkierung angezeigt werden und ermöglichen es den Verordner, Dosisangleichungen abhängig von der betrachteten Patientengruppe vorzunehmen, mit Information, die das Verschreiben des falschen Arzneistoffs den falschen Patienten bei der falschen Dosis vermeidet.
Darüber hinaus bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Kit zur Ausführung eines Verfahrens, wie hierin beschrieben, das ein beliebiges der zuvor beschriebenen Oligonucleotide oder Polynucleotide umfasst und gegebenenfalls passende Mittel zum Nachweis und Anleitungen zur Ausführung eines Verfahrens der Erfindung.
Der Kit der Erfindung kann weitere Zutaten enthalten, wie Selektionsmarker und Komponenten für selektive Media, passend für die Herstellung von transgenen Zellen. Der Kit der Erfindung kann zweckmäßigerweise zur Ausführung eines Verfahrens der Erfindung verwendet werden und könnte unter anderem bei einer Vielfalt von Anwendungen verwendet werden, z.B. im diagnostischen Bereich oder als Forschungs-Hilfsmittel. Die Teile des Kits der Erfindung können individuell in Fläschchen oder in Kombination in Behältern oder Multicontainer-Einheiten verpackt werden. Die Fertigung des Kits folgt vorzugsweise Standardverfahren, welche dem Fachmann bekannt sind. Der Kit oder die diagnostischen Zusammensetzungen können für Verfahren zum Nachweis der Expression einer Mutationsart des CYP2D6-Gens gemäß einer beliebigen der voranstehend beschriebenen Verfahren der Erfindung verwendet werden, unter Verwendung von zum Beispiel Nucleinsäurehybridisierung und/oder Amplifikationsmethoden wie jene hierin vorher und in den Beispielen beschrieben.
Die vorliegende Erfindung sieht auch die Verwendung eines Arzneistoffs oder eines Prodrugs zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung oder Prävention einer Störung vor, die durch das hierin vorher beschriebene Verfahren diagnostiziert wurde.
Diese und andere Ausführungsformen werden offenbart oder sind offensichtlich von der und umfasst durch die Beschreibung und durch die Beispiele der vorliegenden Erfindung. Weitere Literatur, die ein beliebiges dieser Verfahren, Verwendungen und anzuwendender Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft, können von öffentlichen Bibliotheken unter Verwendung elektronischer Geräte abgefragt werden.
Zum Beispiel kann die öffentliche Datenbank „Medline" benutzt werden, welche im Internet verfügbar ist, z.B. unter http://www.ncbi.nlm.nih.giv/PubMed/medline.html. Weitere Datenbanken und Adressen wie http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/, sind dem Fachmann bekannt und können erhalten werden unter Verwendung von z.B. http://www.lycos.com. Eine Übersicht von Patentinformation in Biotechnologie und einen Überblick von relevanten Quellen von Patentinformation, verwendbar für rückblickende Suche und für gegenwärtige Erkenntnis, wird gegeben in Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
Die Verfahren, Verwendung und Kits der Erfindung können verwendet werden zur Diagnose und Behandlung aller Arten von Krankheiten, von denen bisher unbekannt war, dass sie bezogen auf oder abhängig von CYP2D6-Genpromotor-Varianten sind. Die Zusammensetzungen, Verfahren und Verwendungen der vorliegenden Erfindung können wünschenswerterweise bei Menschen verwendet werden, obwohl Tierbehandlung auch durch die hierin beschriebenen Verfahren und Verwendungen umfasst wird.
Kurze Beschreibung der Figuren
1: Sequenz der CYP2D6-Promotorregion, Lage von Primern und Mutationen. Vorwärts (==>)- und umgekehrte (<==) Primer unterstrichen. Nummerierung gemäß des neuen Nummerierungssystems mit dem A als Startcodon +1 und die Base 5' von ATG als -1(CYP-Allel-Nomenklatur Website http://www.imm.ki.se/CYPalleles). 5'-nichttranslatierte Region fett gedruckt (gemäß Kimura et al., 1989). Mutationen fett gedruckt. IUPAC Nomenklaturregeln:
K = G oder T
Y = C oder T
R = A oder G
S = C oder G
2: CYP2D6-Phänotyp- und -Genotyp-Analyse in einer Familie.

A: Stammbaum einer Familie, analysiert auf CYP2D6-Phänotpyen, -Genotypen und auf die CYP2D6*2-Sequenz an Position -1584 bp.
B: Direkte Sequenzierung von genomischen PCR-Fragmenten der CYP2D6-5'-flankierenden Region. Die väterlichen und mütterlichen *2-Allele (s. Teil A) wurden spezifisch amplifiziert und um die Mutation bei – 1584 bp herum sequenziert.

3: CYP2D6-Phänotyp- und -Genotyp-Analyse bei kaukasischen Bevölkerungen.

A: Verteilung des Spartein-metabolischen Verhältnisses MR_S in einer früher charakterisierten repräsentativen Bevölkerung (N = 195, Griese et al., 1998). UM, ultrarapider Metabolizer (Bereich: MR_S < 0.2); EM, extensiver Metabolizer (Bereich: MR_S < 1.2); IM, intermediärer Metabolizer (Bereich: 1.2 < MR_S < 20); PM, schwacher Metabolizer (Bereich: MR_S < 20).
B: MR_S-Verteilung für alle 39 Individuen der in A gezeigten Bevölkerung, welche den Genotyp CYP2D6*2/*0 hatten. Schraffierte Balken entsprechen Individuen mit der Allel-Varianten CYP2D6*2[-1584G], schwarze Balken Individuen mit dem *2[-1584C]-Allel.

4: Mikrosomale CYP2D6-Proteinexpression in Bezug auf CYP2D6-Promotor-Polymorphismus. Der Promotor-Genotyp bei -1584 bp wurde bestimmt und Mittelwert ± SD des CYO2D6-Proteins wurde für alle Individuen (0-3 Gene) mit homozygotem Wildtyp-Genotyp (-1584 CC, „wt") oder mindestens einer Promotor-Mutante (-1584 CG oder GG, „m") und demgemäß für Individuen mit zwei oder einer funktionellen Genkopie berechnet. Statistische Signifikanz: *P=0.026; **P=0.001; ***P<0.0001 (t-Test).
5: Beziehung zwischen mikrosomalem CYP2D6-Protein und in vivo Arzneistoff-Oxidation-Phänotyp und CYP2D6-Genotypen, die die -1584 C/G-Promotormutation einschließen. Der Gehalt des mikrosomalen CYP2D6-Proteins wird durch schwarze Balken (linke Ordinate) repräsentiert und das metabolische Verhältnis für Spartein-Oxidation durch schraffierte Balken (rechte Ordinate). Die Anzahl der Individuen in jeder Gruppe wird angezeigt. Der Unterschied in Proteinexpression zwischen Genotypen *2G/*0 und *2C/*0 war 3.1fach (7.1 ± 4.4 pmol/mg, Cl 4.8-9.1 und 2.3 ± 1.4 pmol/mg, Cl 0.01-4.6, jeweils; P = 0.002, t-Test) und 5.6fach bei dem in vivo MR_S (P < 0.001, t-Test).
Die Erfindung wird nun durch Verweis auf die folgenden Beispiele beschrieben werden, welche lediglich veranschaulichend sind und nicht als Beschränkung des Anwendungsbereichs der vorliegenden Erfindung auszulegen sind.
Beispiele
Beispiel 1
Genomische Proben, die nach Standardmethoden aus Blutproben von gesunden Freiwilligen isoliert wurden, wurden unter Berücksichtigung aller legalen, ethischen und medizinischen Auflagen der örtlichen Ethikkommission erhalten. Blutproben von >50 Individuen wurden erhalten und durch Ionenaustauschchromatographie-Verfahren (Qiagen) aufgearbeitet, um DNA zu isolieren.
1. Beschreibung von Verfahren:
DNA-Proben und PCR-Bedingungen:
Leukozyten-DNA aus kaukasischen Individuen wurde durch Standardverfahren aus Blutproben isoliert. Alle in dieser Studie eingeschlossenen Individuen waren vorher mit Spartein phänotypisiert und auf den CYP2D6-Polymorphismus genotypisiert worden unter Verwendung publizierter Verfahren (Stüven et al., 1996; Griese et al., 1998). Um die Promotorregion des CYP2D6-Gens zu erforschen, wurde genomische DNA amplifiziert unter Verwendung eines Primerpaars upf14 und upr1669, hergestellt, um spezifisch ein 1656 bp-Fragment zu amplifizieren, welches fast die ganze bekannte 5'-flankierende Sequenz enthält (1, Tabelle 1). Aliquots von jedem PCR-Produkt wurden Agarosegelelektrophoresen unterworfen, um einwandfreie Amplifikation sicherzustellen.
Amplifikationen wurden in einem 50 μl-Volumen ausgeführt, das Primer (0.4 μM), dNTP (200 μM), ~100 ng genomische DNA und das Expand-High-Fidelity-Polymerase-System (Boehringer Mannheim) enthielt. Nach 2 min Erhitzen bei 95°C, wurde thermisches Cycling von 15 s bei 95°C, 30 s bei 61°C und 2 min bei 72°C für 33 Zyklen durchgeführt und 7 min bei 72°C für 1 Zyklus an einem PTC-200 Thermocycler (MJ Research). Das *2-Allel wurde auch spezifisch unter Verwendung des Primers 10B anstatt von upr1669 spezifisch amplifiziert, welcher innerhalb einer *2-spezifischen Sequenz in Intron 1 hergestellt worden war (Johansson et al. 1993). In diesem Fall resultierte die Amplifikation in einem ~1.9 kb-DNA-Fragment, wie erwartet, aus allen DNA-Proben mit einem *2-Genotyp. Tabelle 1: Oligoncleotidprimer
Sequenzierung des PCR-Produkts
PCR-Produkte wurden direkt unter Verwendung von Infrarot-800-markierten ineinander geschachtelten Primer (MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland) mit dem Thermo Sequenase Fluoreszenz-markiertem Primerzyklus-Sequenzierungs-Kit (Amersham Life Sciences, Little Chalfont, England) sequenziert. Die Nucleotidsequenzen der Primer sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Sequenzierungsanalyse wurde an einem automatisiertem DNA-Sequenzer (Licor 4200, MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland) durchgeführt unter Verwendung der Base ImagIR-Datensammlung und Bildanalyse-Software 4.00.
2. Beschreibung von Ergebnissen:
Insgesamt wurden 8 Mutationen in der Stromaufwärts-Region des CYP2D6-Gens nachgewiesen (Tabelle 2). Tabelle 2: Einzel-Nucleotid-Polymorphismen (SNP) im CYP2D6-Promotor

¹ Basennummerierung gemäß der Allel-Nomenklatur des menschlichen Cytochrom P450 (CYP) (Wildtyp-Sequenz wie von Kumra et al. 1989 publiziert). Insgesamt mehr als 60 Individuen (Genotypen, umfassend Allele *1, *2, *4, *5, *9, *10) wurden vollständig in ihrer 5'-flankierenden Sequenz von CYP2D6 sequenziert; eine Aufstellung der Ergebnisse wird dargestellt.
² Allele mit mutierter Sequenz, wie angezeigt; nicht erwähnte Allele hatten Wildtyp-Sequenz.
³ Ungefähre Anzahl von beobachteten Allelen mit Sequenz-Mutante.
⁴ Geschätzte Häufigkeiten für die gesamte Bevölkerung.
⁵ Zuerst beschrieben für chinesischen CYP2D-Genort (Johansson et al., 1994).

Der Vergleich ihrer Verknüpfungsmuster bei Individuen mit unterschiedlichen CYP2D6-Genotypen offenbarte, dass einige dieser Mutationen in einer Anzahl von unterschiedlichen Allelen auftreten, während andere eher spezifisch mit einem bestimmten bekannten Allel verbunden zu sein scheinen (Tabelle 2).
Für eine neue C zu G-Mutation, die in 70% der sequenzierten *2-Allele bei – 1584 bp relativ zum Startcodon gefunden wurde (1), wurde gefunden, dass sie stark mit niedrigeren metabolischen Verhältnissen (d.h. mit höherer Enzymaktivität in vivo) verbunden ist. In einer Familienanalyse konnte gezeigt werden, dass das [-1584G]-Allel mit niedrigen MR_S-Werten segregiert, während das [-1584C]-Allel mit hohen MR_S-Werten segregiert (2).
Von 39 Individuen mit Genotyp CYP2D6*2/*0 (wobei *0 beliebige der analysierten nicht-funktionellen Allele *3, *4, *5, *6, *7, *8 anzeigt) war der mittlere MR_S von Individuen mit der -1584G-Promotor-Variante 0.53 verglichen mit 2.33 für Träger von *2[-1584C] (3; P<0.0001, Mann-Whitney-Test). Von den anderen in Tabelle 2 beschriebenen Mutationen wurden drei funktionell neutrale Mutationen früher im CYP2D-Genort, abgeleitet von einem chinesischen Individuum, beschrieben (Johansson et al., 1994). Zwei weitere neue Mutationen waren spezifisch mit allen sequenzierten *2-Allelen assoziiert und zwei weitere seltene Mutationen wurden beobachtet (Tabelle 2).
3. Signifikanz der Befunde der Erfindung:
Die starke Assoziation der üblichen C zu G-Mutation bei -1584 bp mit erhöhter Enzymaktivität verbessert signifikant die Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp beim CYP2D6-Polymorphismus. Insbesondere ist diese Entdeckung ein starkes Anzeichen, dass nicht nur der PM-Phänotyp genetisch vererbt wird, sondern auch der Sub-Phänotyp, der durch geringe Enzymaktivität charakterisiert ist. Spezifisch wird das Testen auf die Mutation bei -1584 bp es ermöglichen, einen großen Anteil der „intermediären Metabolizer" zu identifizieren. Die Analysen zeigen, dass über 60 % der IMs den *2/*0-Genotyp haben (0 steht für ein beliebiges nicht-funktionelles Allel, d.h. *3, *4, *5, *6, *7, *8 und andere). Jedoch ist dieser Genotyp auch unter den normalen extensiven Metabolizern üblich und daher ermöglicht er allein es nicht, den IM-Phänotypen vorherzusagen. Die Anwesenheit der Wildtyp-Sequenz (C) bei Position -1584 bp ist ein Marker für geringe Aktivität des *2/*0-Genotyps, während die Anwesenheit der Mutation (G) ein Marker für hohe Aktivität ist. Der Nachweis von C oder G an Position -1584 bp in Verbindung mit der Identifizierung des *2/*0-Genotypen wird es daher ermöglichen, eine quantitative Vorhersage auf die in vivo-Arzneistoffmetabolismus-Kapazität zu machen.
Etwa 10 % der Bevölkerung sind phänotypisch intermediäre Metabolizer (Griese et al., 1998). Es wurde gezeigt, dass diese Individuen eine dramatisch reduzierte Clearance-Kapazität von CYP2D6-Substraten haben, welche fast so niedrig ist wie die von schwachen Metabolizern. Es kann daher angenommen werden, dass normale Arzneistoffdosen, die von CYP2D6-Polymorphismen betroffen sind, bei IMs zu nachteiligen Nebenwirkungen oder therapeutischen Versagen in einem mit dem von PMs vergleichbaren Ausmaß führen werden. Außer Debrisoquin und Spartein werden viele andere Arzneistoffe wirkungslos bei PM-Testpersonen metabolisiert, einschließlich Antiarrhythmika, Antagonisten des Beta-adrenergen Rezeptors, Antidepressiva, Neuroleptika, Opioide, Amphetamine und andere (Eichelbaum und Gross, 1990; Meyer und Zanger, 1997).
Beispiel 2
CYP2D6 wurde immunologisch und enzymatisch in Leberbiopsien aus 76 Individuen mit bekanntem Sparteinoxidation-Phänotyp quantifiziert. Alle wichtigen bekannten Allele, einschließlich der Polymorphismus des -1584 C/G-Promotors, wurden bestimmt.
1. Beschreibung von Verfahren:
Patienten und Leberproben. Lebergewebe wurde als Keilbiopsie-Proben von Patienten, die sich zwischen 1983 und 1986 Gallenblasenentfernung unterzogen, erhalten und bei –80°C gelagert. Alle hier eingeschlossenen Patienten waren hinsichtlich ihres Spartein-Metabolizer-Phänotyps vor der Laparotomie phänotypisiert worden (Osikowska-Evers et al., 1987).
CYP2D6-Genotypisierung. CYP2D6-Allele wurden auf der Grundlage der Bestimmung von geeigneten Schlüsselmutationen unter Verwendung bewährter PCR-Assays für Allele *2, *3, *4, *5, *6, *7, *8, *9 und *10 zugeordnet (Stüven et al., 1996; Griese et al., 1998). Die C/G-Mutation wurde unter Verwendung eines neuen Echtzeit-PCR-Verfahrens bestimmt (Zanger et al., 2001).
Präparation von DNA und Lebermikrosomen. Genomische DNA wurde aus einem Teil des Lebergewebes unter Verwendung des QIAamp Tissue-Kits (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert. Mikrosomen wurden durch Standardverfahren präpariert (Zanger et al., 1988b).
Quantifizierung von CYP2D6-Protein in Lebermikrosomen. Der monoclonale Antikörper Mab 114 (Zanger et al., 1988a) wurde zur Quantifizierung von CYP2D6 in mikrosomalen Fraktionen durch Immun-Blotting verwendet. Gebundener Antikörper wurde mit dem ECL Western Blot Detection-System (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) nachgewiesen. Lumineszenz wurde durch Autoradiographie und densitometrische Quantifizierung unter Verwendung eines optischen Messfühlers analysiert (Hirschmann, Neuried, Deutschland) (Zanger et al., 2001).
Bestimmung von Enzymaktivität. Als ein spezifischer in vitro-Enzym-Assay für CYP2D6 wurde Cumolhydroperoxid-vermittelte Bufuralol 1'-Hydroxylierung gemessen. Die Testbedingungen waren gleich wie vorher beschrieben (Zanger et al., 1988b).
Statistische Verfahren. Daten wurden durch nicht-parametrische Varianzanalyse von Kruskal-Wallis analysiert, um einen gesamten Unterschied zwischen Genotyp- oder Phänotypgruppen festzusetzen. Der Student-t-Test oder der Mann-Whitney-U-Test wurde für Paarvergleiche verwendet, abhängig davon, ob die Datensätze normalverteilt waren oder nicht, welches durch das Verfahren von Kolmogorov und Smirnov getestet wurde. Mittelwerte von Daten wurden mit Standardabweichungen (SD) repräsentiert, Medianwerte mit minimalen und maximalen beobachteten Werten, und, wo angezeigt, werden die niedrigeren und höheren 95 % Konfidenzintervalle (Cl) gegeben. Ein P-Wert von 0.05 oder weniger wurde als signifikant betrachtet (n.s., nicht signifikant). Statistische Berechnungen wurden unter Verwendung der Software GraphPad Instat 3.00 (Graph Pad Inc. San Diego, CA) durchgeführt.
2. Beschreibung der Ergebnisse
Analyse des Polymorphismus des -C/G-Promotors. Die Promotor-Mutante Typ G war in 37 von 152 Allelen vorhanden, entsprechend einer gesamten Häufigkeit von 24.3 %. Sie war stark mit dem *2-Allel verbunden und wurde nur einmal in einer Probe (*1/*1) nachgewiesen, der ein *2-Allel fehlte. Unabhängig vom Genotyp oder der Anzahl von funktionellen Allelen exprimierten Individuen mit -1584 C/C-Promotortyp im Durchschnitt weniger als die Hälfte CYP2D6-Protein (5.5 ± 3.9 pmol/mg, Cl 4.2-6.8, 5 schwache Metabolizer nicht eingeschlossen), verglichen mit Individuen mit -1584 C/G- oder G/G-Genotypen (10.9 ± 7.1 pmol/mg, Cl 8.4-13.3, P = 0.001, U-Test). Ähnliche Unterschiede wurde zwischen Gruppen mit einem und zwei funktionellen Allelen beobachtet (4).
CYP2D6-Expression und Phänotyp in Bezug auf Genotyp. Bei Berücksichtigung des -1584 C/G-Polymorphismus konnten insgesamt 19 Genotypen bei dieser Bevölkerungsprobe unterschieden werden. Um die Analyse zu vereinfachen, wurden Genotypen unter Einbeziehung von Null-Allelen, welche keinen Beitrag zur CYP2D6-Expression und in vivo-Funktion leisten, zusammen angeordnet und gemeinsam *0 genannt. Diese Analyse offenbarte, dass der -1584 G-Promotortyp konsistent mit höherer Proteinexpression und -funktion verbunden war.
Der größte und am meisten signifikante Unterschied wurde zwischen den heterozygoten Genotypen *2[G]/*0 und *2[C]/*0 gefunden, auf Grund der Abwesenheit von konfundierenden funktionellen Allelen. Der Unterschied in Proteinexpression war 3.1-fach (7.1 ± 4.4 pmol/mg, Cl 4.8-9.1 und 2.3 ± 1.4 pmol/mg, Cl 0.01-4.6, jeweils; P = 0.002, t-Test) und 5.6-fach beim in vivo-MRS (P < 0.001, t-Test) (5). Zudem war Genotyp *2[C]/*0 ein spezifisches Anzeichen für den IM-Phänotyp und machte vier von sieben IMs in der ganzen Bevölkerungsprobe aus (Tabelle 3), während alle 17 Träger des *2[G]/*0-Genotyps MRS-Werte < 1 hatten und demnach phänotypisch EMs waren. Der Anstieg in Proteinexpression, verbunden mit dem *2[G]-Allel war stark genug, um sogar auf dem Hintergrund des Wildtyp-Allels bei den gemischten Genotypen *1/*2[G] und *1/*2[C] signifikant zu sein (4; P = 0.026, t-Test). Tabelle 3: Phänotypische und genotypische Eigenschaften von Individuen mit dem Phänotyp des ultrarapiden (UM) und des intermediären (IM) Metabolizers.

¹ Mikrosomaler CYP2D6-Proteingehalt wie durch den monoclonalen Antikörper Mab 114 bestimmt.

Im niedrigeren MRS-Bereich (hohe Aktivität) gab es eine auffällige Überrepräsentation des -1584 G-Promotortyps. Bis zu einem MRS von 0.37 waren alle *2-Allele (n = 17) vom -1584G-Typ, während er nicht unter Individuen mit dem IM-Phänotyp gefunden wurde. Unter Individuen mit UM-Phänotyp trugen fünf von acht Allelen der vier UM-Individuen die -1584 G-Mutation.
3. Signifikanz der Daten
Diese Daten zeigten signifikant erhöhte Proteinexpression und -funktion in Verbindung mit dem -1584 G-Promotortyp und bestätigten die Signifikanz des Polymorphismus des -1584 C/G-Promotors für CYP2D6-Proteinexpression und den resultierenden in vivo-Phänotyp. Sie sind in Übereinstimmung mit der Annahme von erhöhter Gentranskription als Konsequenz der Veränderung einer mutmaßlichen NF-kappa B-Consensus-Bindungsstelle durch Mutation -1584 C > G (Raimundo et al., 2000).
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Diagnose einer erworbenen Arzneistoff-Hypo- oder – Hypersensitivität, die in Beziehung steht mit dem Vorhandensein einer molekularen Variante des CYP2D6-Genpromotors, umfassend die Bestimmung des Vorhandenseins eines Polynucleotids in einer Probe einer Testperson, wobei das Polynucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einer molekularen Variante eines Polynucleotids mit der Nucleinsäuresequenz von SEQ ID NO:1, wobei das Polynucleotid ein G an der Nucleotidposition aufweist, die der Nucleotidposition -1584 des CYP2D6-Promotors wie in 1 gezeigt entspricht; b) einer molekularen Variante eines Polynucleotids, das in der Lage ist, mit dem CYP2D6-Promotor, wie in 1 gezeigt, zu hybridisieren, wobei das Polynucleotid mindestens eine Nucleotiddeletion, -addition und/oder -substitution an der Position aufweist, die der Position -1584 des CYP2D6-Promotors wie in 1 gezeigt entspricht; und c) einer molekularen Variante eines Polynucleotids, das in der Lage ist, mit dem CYP2D6-Promotor wie in 1 gezeigt zu hybridisieren, wobei das Polynucleotid, das in der Lage ist, mit dem CYP2D6-Promotor zu hybridisieren, ein G an der Position aufweist, die der Position -1584 des CYP2D6-Promotors wie in 1 gezeigt entspricht; wobei angenommen wird, dass das Vorhandensein des Polynucleotids in diesem Verfahren auf die erworbene Arzneistoff-Hypo- oder -Hypersensitivität hinweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei sich die Nucleotiddeletion, -addition und/oder -substitution in einer geänderten Expression oder Aktivität der CYP2D6-Genpromotor-Variante auswirkt, verglichen mit dem entsprechenden Wildtypgen.
Verfahren zur Diagnose einer reduzierten oder gesteigerten Clearance-Kapazität von CYP2D6-Substraten, umfassend die Bestimmung des Vorhandenseins eines Polynucleotids gemäß der Definition in Anspruch 1 in einer Probe einer Testperson.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Substrat ausgewählt ist aus Antiarrhythmika, Antagonisten des Beta-adrenergen Rezeptors, tricyclischen Antidepressiva, selektiven Serotonin-Wiederaufnahme-Inhibitoren (SSRI), Neuroleptika, Opiaten, Anti-Krebs-Mitteln oder Amphetaminen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend PCR, Ligase-Kettenreaktion, Restriktionsverdau, direktes Sequenzieren, Nucleinsäureamplifikations-Techniken oder Hybridisierungs-Techniken.
Verwendung eines Oligo- oder Polynucleotids zur Diagnose erworbener Arzneistoff- Hypo- oder -Hypersensitivität, die in Beziehung steht mit dem Vorhandensein einer molekularen Variante des CYP2D6-Genpromotors, umfassend die Bestimmung des Vorhandenseins des Polynucleotids in einer Probe einer Testperson, wobei das Polynucleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) einer molekularen Variante des Polynucleotids, das die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:1 hat, wobei an der Nucleotidposition die der Nucleotidposition -1584 des CYP2D6-Promotors wie in 1 gezeigt, entspricht, sich ein G befindet; b) einer molekularen Variante des Polynucleotids, das in der Lage ist, mit dem CYP2D6-Promotor wie in 1 gezeigt zu hybridisieren, wobei das Polynucleotid an einer Position, die der Position -1584 des CYP2D6-Promotors wie in 1 gezeigt entspricht, mindestens eine Nucleotiddeletion, -addition und/oder -substitution aufweist; und c) einer molekularen Variante des Polynucleotids, das in der Lage ist, mit dem CYP2D6-Promotor wie in 1 gezeigt, zu hybridisieren, wobei das Polynucleotid an der Position, die der Position -1584 des CYP2D6-Promotors wie in 1 gezeigt, entspricht, ein G aufweist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Polynucleotid eine wie in Anspruch 1 definierte Variante eines Polynucleotids ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Oligonucleotid die Nucleotidsequenz von einer der SEQ ID NOs: 2, 3, 5 oder 7 bis 10 umfasst und eine Länge von 20 bis 40 Nucleotiden hat.
Primer oder Sonde, bestehend aus einem Oligonucleotid gemäß der Definition in Anspruch 8.
Kit, der zur Ausführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8 verwendbar ist, umfassend Oligonucleotide oder Polynucleotide, die in der Lage sind, das Vorhandensein einer Polynucleotidvariante gemäß der Definition in Anspruch 1 festzustellen.
In vitro-Verfahren zur Entwicklung eines pharmakodynamischen Profils von Arzneistoffen, die Substrate des CYP2D6-Genprodukts sind, für einen Patienten oder zur Verbesserung der Therapie von Krankheiten mit Arzneistoffen, die Ziele des CYP2D6-Genprodukts sind, umfassend die Bestimmung eines Einzelnucleotid-Polymorphismus des CYP2D6-Gens an Position -1584 gemäß der Definition in Anspruch 1.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Krankheit Krebs ist.