ES2267787T3

ES2267787T3 - Polimorfismos en la region promotora del gen cyp2d6 humano y su uso en aplicaciones diagnosticas y terapeuticas.

Info

Publication number: ES2267787T3
Application number: ES01946895T
Authority: ES
Inventors: Sebastian Raimundo; Ulrich Zanger
Original assignee: Epidauros Biotechnologie AG
Current assignee: Epidauros Biotechnologie AG
Priority date: 2000-01-31
Filing date: 2001-01-30
Publication date: 2007-03-16
Anticipated expiration: 2021-01-30
Also published as: ATE333504T1; AU2001257913A1; EP1276880A2; US20120270948A1; CA2398104A1; DE60121567D1; EP1276880B1; DE60121567T2; WO2001055432A2; US20040224424A1; WO2001055432A3; US8129112B2; JP2004506405A; CA2398104C

Abstract

Un procedimiento para diagnosticar hipo- o hipersensibilidad adquirida hacia los fármacos, relacionado con la presencia de una variante molecular del promotor del gen CYP2D6 que comprende la determinación en una muestra de un sujeto, de la presencia de un polinucleótido seleccionado de un grupo constituido por: (a) un polinucleótido variante molecular que tiene la secuencia de ácidos nucleicos con ID SEC NO:1, donde dicho polinucleótido tiene una G en la posición del nucleótido correspondiente a la posición del nucleótido -1584 del promotor CYP2D6, tal como se muestra en la Figura 1; (b) un polinucleótido variante molecular capaz de hibridar con el promotor del CYP2D6, tal como se muestra en la Figura 1, donde dicho polinucleótido tiene supresión, adición y/o sustitución de al menos un nucleótido en la posición correspondiente a la posición - -1584 del promotor CYP2D6, tal como se muestra en la Figura 1; y (c) un polinucleótido variante molecular capaz de hibridar con el promotor CYP2D6, tal como se muestra en la Figura 1, donde dicho polinucleótido capaz de hibridar con el promotor CYP2D6 tiene una G en la posición correspondiente a la posición -1584 del promotor CYP2D6, tal como se muestra en la Figura 1, en donde la presencia de dicho polinucleótido se considera indicativa de dicha hipo- o hipersensibilidad adquirida hacia los fármacos en dicho procedimiento.

Description

Polimorfismos en la región promotora del gen CYP2D6 humano y su uso en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a los medios y procedimientos para la diagnosis y el tratamiento del espectro fenotípico, así como el solapamiento de características clínicas, con varias formas de expresión y/o función anómala heredada del gen citocromo P-450 (CYP)2D6. Por consiguiente, la presente solicitud describe los polinucleótidos de los promotores de las variantes moleculares del gen CYP2D6, los cuales, por ejemplo, están asociados a una respuesta anómala a fármacos, o a una predisposición individual a varias enfermedades y trastornos comunes causados por sub- o sobre-metabolización del fármaco, y a los vectores que comprenden a dichos nucleótidos. Además, la presente solicitud describe a las células huésped que comprenden a esos nucleótidos o vectores. Asimismo, la presente solicitud describe procedimientos para la identificación y la obtención de fármacos candidatos para la terapia de trastornos relacionados con la disfunción del gen CYP2D6, así como procedimientos para la diagnosis del estado de dichos trastornos. La presente invención también proporciona kits que comprenden oligonucleótidos que hibridan al promotor CYP2D6 y/o que son capaces de ser extendidos dentro de esta región de manera útil, para la diagnosis de sujetos que son, por ejemplo, metabolizadores intermedios o ultra-rápidos de fármacos.

Antecedentes de la invención

El gen citocromo P450 CYP2D6 pertenece a la familia CYP2 de los P450s, y es la única isozima funcionalmente activa de la subfamilia CYP2D en humanos. Está involucrado en el metabolismo de hasta el 25% de todos los fármacos usados terapéuticamente (Hardman et al., 1995). El gen que codifica su síntesis se localiza en el locus CYP2D, en la región q13.1 sobre el brazo largo del cromosoma 22 (Eichelbaum et al., 1987). Forma parte de un grupo de genes que contienen también dos pseudogenes, el CYP2D7P y el CYP2D8P (Kimura et al., 1989). Como otros miembros de la familia de genes CYP2 humanos, los genes CYP2D están constituidos por 9 exones y 8 intrones. La enzima exhibe un polimorfismo genético común (Meyer y Zanger, 1997). De hecho, esta fue la primera enzima citocroma P450 para la cual se demostró un polimorfismo, que se nombró como el polimorfismo debrisoquina/esparteína, basado en los dos sustratos involucrados en su descubrimiento (Mahgoub et al., 1977; Eichelbaum et al., 1979). Dependiendo del manejo metabólico de esos dos fármacos sonda, entre el 5 y el 10% de los sujetos de las poblaciones europeas tienen una capacidad severamente dañada para formar los metabolitos mayores, 4-hidroxidebrisoquina y la 2-dehidroesparteína. Se designó a estos sujetos como metabolizadores pobres (MP), y al resto de la población se la denominó metabolizadores extensivos (ME). El rasgo "metabolismo pobre" se hereda en un modo recesivo autosomal, es decir, los MPs son portadores de dos alelos no funcionales. La base molecular de este polimorfismo ha sido investigada de manera amplia, y se han descrito más de 30 alelos funcionales y no funcionales, lo que permite predecir el fenotipo MP en caucásicos, con una fiabilidad del 99%. (Daly et al., 1996; y CYP Allele Nomenclature Web-Site: http://www.imm.ki.se/CYPalleles/cyp2d6.htm).

Existe una variabilidad en la actividad del CYP2D6 que se multiplica por 50 entre los metabolizadores extensivos (hablando genéticamente, portadores de al menos un alelo funcional), que ha llevado a la designación del fenotipo "extensivo" más rápido como "ultra-rápido" (MU), y al más lento como metabolizador "intermedio" (MI). Hay evidencia en la literatura de que esos sub-fenotipos son clínicamente pertinentes. Los individuos con el fenotipo MU corren el riesgo de experimentar fallo terapéutico debido a la eliminación anormalmente rápida del fármaco, mientras que los MIs pueden ser comparables a los MPs en su riesgo de desarrollar efectos secundarios adversos y toxicidad.

El descubrimiento de la duplicación del gen CYP2D6, proporcionó una explicación molecular para el fenotipo MU, lo que, sin embargo, solamente se aplica a una fracción de los MUs (Johansson et al., 1993; Dahl et al., 1995). Dos alelos CYP2D6 previamente descritos, dan lugar a una actividad menor de la enzima y causan el fenotipo MI en individuos que no portan un alelo funcional normal. Sin embargo, ambos alelos (*9: Broly y Meyer, 1993; *10: Yokota et al., 1993) aparecen con una frecuencia de solo el 2% en la población caucásica, y solo un 20% de los MIs tienen genotipos informativos que involucren a esos dos alelos (es decir, *9/*0, *10/*0 y *10/*10; Sachse et al., 1997; Griese et al., 1998). El 80% de los MIs tienen, por tanto, genotipos "poco informativos", es decir, genotipos que también están asociados a los fenotipos normales extensos o a los metabolizadores ultra-rápidos. Por tanto, se ha mantenido poco claro el saber si el sub-fenotipo MI tiene una base genética, o si es un fenómeno epigenético.

Está claro que las mutaciones que aparecen de manera natural, si existen, pueden tener efectos en la metabolización del fármaco, y en la eficacia de las terapias con fármacos. Sin embargo, se desconoce cuántas de estas variaciones existen, y con qué frecuencia, y en qué posiciones de los genes CYP2D6 humanos, aparecen.

Por consiguiente, hasta el momento no están lo suficientemente disponibles, pero son, no obstante, altamente deseables, los medios y procedimientos para la diagnosis y el tratamiento de distintas formas de intolerancia individual hacia los fármacos, y también de la ineficacia de la terapia con fármacos, consecuencia de los polimorfismos del gen CYP2D6 que interfieren, p.e., con el tratamiento quimioterapéutico de enfermedades.

De esta manera, el problema técnico de la presente invención es cumplir con las necesidades descritas arriba.

La solución a este problema técnico se consigue proporcionando las formas de realización caracterizadas en las reivindicaciones.

Resumen de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de nuevas variaciones, hasta ahora desconocidas, en las secuencias de nucleótidos del promotor del gen CYP2D6, y en la distribución demográfica de esos alelos. Basándose en el conocimiento de esas nuevas secuencias, se diseñaron pruebas diagnósticas, y reagentes para esas pruebas, para la detección específica y el genotipado de los alelos promotores del CYP2D6 en humanos, incluyendo tanto homocigotos como heterocigotos, tanto alelos frecuentes como alelos raros del promotor del CYP2D6. La determinación del estado del alelo promotor del CYP2D6 de humanos con estas pruebas, es útil para la optimización de terapias con los numerosos sustratos de CYP2D6. De esta manera, la presente solicitud describe polinucleótidos de la variante molecular del promotor del CYP2D6, y formas de realización relacionadas con ello, como son vectores y células huésped transferidas con los mismos.

Por consiguiente, la invención proporciona procedimientos para ser usados en la terapia de los trastornos relacionados con hipo- o hipersensibilidad adquirida hacia los fármacos, así como procedimientos para la diagnosis del estado de esos trastornos, mediante el empleo del polinucleótido variante molecular, tal como se define aquí. La invención también proporciona métodos in vitro para el desarrollo de un perfil fármaco-dinámico de fármacos que son sustratos del producto génico CYP2D6, para un paciente o para mejorar la terapia de enfermedades, con drogas que son objetivos del producto génico CYP2D6, mediante el uso de un polimorfismo de nucleótido único del gen CPY2D6, tal como se define aquí.

Además, la invención proporciona procedimientos para la diagnosis de una capacidad reducida o mejorada para eliminar los sustratos de CYP2D6, tal como se describe aquí.

En otra forma de realización, la presente invención proporciona un cebador o sonda, tal como se define aquí, que puede ser empleado en los usos que se describen aquí.

En una forma de realización posterior, la invención proporciona kits útiles para llevar a cabo los procedimientos de la presente invención, tal como se describe aquí.

Las nuevas formas variantes del gen CYP2D6 que se ajustan a la invención, proporcionan el potencial para el desarrollo de un perfil fármaco-dinámico de fármacos, para un paciente dado.

Descripción de la invención

El descubrimiento y caracterización de las variaciones en los genes CYP2D6, y las pruebas diagnósticas para la discriminación de distintos alelos CYP2D6 en individuos humanos, proporcionan una herramienta muy potente para mejorar la terapia de enfermedades, con fármacos que son objetivos del producto génico CYP2D6, y cuya metabolización es, por tanto, dependiente de la actividad del CYP2D6. La diagnosis del estado alélico individual del CYP2D6 permite una terapia más enfocada, p.e., abriendo la posibilidad de aplicar regímenes de dosis individuales de los fármacos. Esto también puede ser útil como herramienta pronosticación para el resultado de la terapia. Además, las pruebas diagnósticas para el genotipo CYP2D6 mejorarán la terapia con fármacos establecidos, y ayudarán a correlacionar los genotipos con la actividad de los fármacos, o sus efectos secundarios.

De esta manera, la presente invención proporciona un modo para explotar la biología molecular y la investigación farmacológica para la terapia con fármacos, mientras se evitan sus potenciales efectos perjudiciales que se deben a la expresión de la expresión variante del gen CYP2D6.

Por consiguiente, puede utilizarse un polinucleótido en los procedimientos y usos de la invención, que se selecciona de un grupo constituido por:

(a): un polinucleótido variante molecular que tiene la secuencia de ácidos nucleicos con ID SEC NO: 1, donde en la posición del nucleótido correspondiente a la posición del nucleótido -1584 del promotor CYP2D6, como el que se muestra en la Figura 1, hay una G;

(b): un polinucleótido variante molecular capaz de hibridar con el promotor CYP2D6, como el que se muestra en la Figura 1, donde dicho polinucleótido tiene en una posición que se corresponde con la posición - 1584 del promotor CYP2D6, como el que se muestra en la Figura 1, al menos una supresión, adición y/o sustitución de nucleótido; y

(c): un polinucleótido variante molecular capaz de hibridar con el promotor CYP2D6, como el que se muestra en la Figura 1, donde dicho polinucleótido tiene en una posición que se corresponde con la posición - 1584 del promotor CYP2D6, como el que se muestra en la Figura 1, una G.

En una forma de realización preferida, la supresión, adición y/o sustitución de nucleótidos, da lugar a una expresión modificada del gen CYP2D6 variante, comparado con el correspondiente gen silvestre.

En el contexto de la presente invención, el término promotor, gen o proteína CYP2D6 "variante molecular", tal como se usa aquí, significa que dicho promotor, gen o proteína CYP2D6 difiere del promotor, gen o proteína CYP2D6 silvestre por medio de sustitución(es), adición(es) y/o supresión(es) de nucleótidos (Se describen secuencias genómicas del gen CYP2D6, incluyendo al promotor, p.e. en Genbank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenbankOverview.html [número de acceso: M33388]).

El término "correspondiente", tal como se usa aquí, significa que una posición no viene determinada solamente por el número de los nucleótidos precedentes. De acuerdo con la presente invención, la posición de un nucleótido dado que puede ser suprimido, sustituido, o que comprende uno o más nucleótidos adicionales, puede variar debido a supresiones o a nucleótidos adicionales en otro lugar del promotor o del gen. Por lo tanto, se entiende que bajo una "posición correspondiente", de acuerdo con la presente invención, implica que los nucleótidos pueden diferir en el número indicado, pero aún pueden tener nucleótidos vecinos similares. Estos nucleótidos, que también pueden ser intercambiados, suprimidos o que pueden comprender nucleótidos adicionales, también están comprendidos en el término "posición correspondiente". Dichos nucleótidos pueden, por ejemplo, formar junto a sus vecinos secuencias que pueden estar implicadas en la regulación de la expresión del gen, de la estabilidad del correspondiente ARN, o de la edición del ARN.

El término "hibridantes", tal como se usa aquí, se refiere a los polinucleótidos que son capaces de hibridar con los polinucleótidos de la invención, o partes de los mismos, que están asociados con la expresión modificada del gen CYP2D6 variante, comparado con el correspondiente gen silvestre. Por lo tanto, dichos polinucleótidos hibridantes están asociados también con dicha expresión modificada del gen CYP2D6 variante, comparado con el correspondiente gen silvestre. Además, dichos polinucleótidos pueden ser útiles como sondas en análisis de Northern blot o Southern blot de las preparaciones de ARN o ADN, respectivamente, o pueden ser utilizados como polinucleótidos sonda en análisis mediante PCR dependiente de su tamaño respectivo. La invención también comprende a los polinucleótidos hibridantes, que son útiles para el análisis de las interacciones ADN-proteína vía, p.e., análisis de retardo de la movilidad electroforética (EMSA). Preferiblemente, dichos polinucleótidos hibridantes comprenden al menos 10, más preferiblemente al menos 15, nucleótidos de longitud, mientras que un polinucleótido hibridante de la presente invención que será usado como sonda, comprende preferiblemente al menos 100, más preferiblemente 200, o lo más preferible, al menos 500 nucleótidos de longitud.

Se conoce bien en el arte como realizar experimentos de hibridación con moléculas de ácido nucleico, es decir, la persona experta en la materia conoce qué condiciones de hibridación tiene que usar de acuerdo con la presente invención. Existen referencias a estas condiciones de hibridación en libros de texto como el Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. De acuerdo con la presente invención, se prefieren los polinucleótidos capaces de hibridar con los polinucleótidos de la invención, o con partes de los mismos, que están asociados con la expresión modificada del gen CYP2D6 variante, comparado con el correspondiente gen silvestre, bajo rigurosas condiciones de hibridación, es decir, que no existirá hibridación cruzada con polinucleótidos no relacionados, como son aquellos polinucléotidos que pueden no modificar la expresión del gen CYP2D6 variante, comparado con el correspondiente gen silvestre.

De acuerdo con la presente invención, la moda y la distribución demográfica de las nuevas variaciones genéticas, hasta ahora sin identificar, del gen CYP2D6, han sido analizadas mediante análisis de la secuencia de regiones pertinentes de los genes CYP2D6 humanos de distintos individuos. Es un hecho bien conocido que el ADN genómico de los individuos, que alberga la estructura genética individual de todos los genes, incluyendo el CYP2D6, puede ser fácilmente purificado a partir de muestras individuales de sangre. Estas muestras de ADN individual, son utilizadas para el análisis de la composición de las secuencias de los alelos del gen CYP2D6, que están presentes en los individuos que proporcionaron las muestras de sangre. Todos los estudios sobre el polimorfismo de CYP2D6 presentados previamente, estaban restringidos y enfocados hacia la secuencia codificante que comprende 9 exones. Este trabajo representa el primer análisis de mutación sistemático de la región promotora del gen. El propósito fue identificar las mutaciones, si hay alguna que esté relacionada con la actividad de la enzima modificada in vivo, basándose en la suposición de que las mutaciones del promotor pueden afectar a la transcripción genética, lo que puede dar lugar a niveles mayores o menores de ARNm, y por tanto llevar a mayores o menores cantidades de enzima expresada en el hígado. Sorprendentemente, podría descubrirse que las mutaciones en el promotor de CYP2D6 están asociadas con actividad mejorada o reducida de la enzima CYP2D6, respectivamente. El análisis de las secuencias se llevó a cabo mediante amplificación con PCR de las regiones pertinentes del gen CYP2D6, más la posterior purificación de los productos PCR, seguida del secuenciado automático del ADN mediante métodos establecidos; ver los ejemplos. En particular, un subgrupo del 10% al 15% de los caucásicos se denomina "metabolizadores intermedios" fenotípicos de los sustratos fármacos de CYP2D6, porque aún tienen una función residual in vivo de este citocromo P450, severamente dañada. El genotipado basado en los alelos de CYP2D6 normalmente conocidos, no predice este fenotipo. De acuerdo con la presente invención, una búsqueda sistemática a lo largo de 1,6 kb de la secuencia 5'-flanqueante del CYP2D6, reveló 6 mutaciones de las cuales tres estaban exclusivamente asociadas con el alelo funcional CYP2D6*2, y una de esas co-segregado con actividad CYP2D6*2 incrementada, en un estudio familiar. En una muestra poblacional representativa, la proporción metabólica urinaria mediana (MR_{S}) para la oxidación de esparteína, estaba reducida en más de 4 veces en individuos con el nuevo alelo variante (*2[-1584G]: MR_{S}=0,53, N=27) comparado con los individuos a los que les faltaba la mutación (*2[-1584C]: MR_{S}=2,33, N=12; P<0,0001). Esta primera variante funcional promotora del gen CYP2D6 tuvo una frecuencia estimada de entre el 20% y el 25% en la población general, y permite establecer un genotipo para la identificación de más del 50% de caucásicos con el fenotipo metabolizador intermedio.

Un parámetro importante que tiene que ser considerado en el intento de determinar el genotipo CYP2D6 individual, y de identificar las nuevas variantes del CYP2D6 mediante secuenciado directo del ADN de los productos PCR a partir de ADN genómico de sangre humana, es el hecho de que cada humano alberga (normalmente, con muy pocas excepciones anormales) dos copias genéticas de cada gen autosomal (diploidía). Debido a eso, ha de tenerse mucho cuidado en la evaluación de las secuencias para poder identificar inequívocamente no solo variaciones en la secuencia homocigótica, sino también variaciones heterocigóticas. Los detalles de los distintos pasos durante la identificación y caracterización de los nuevos polimorfismos del gen CYP2D6 (homocigóticos y heterocigóticos) son descritos en los ejemplos de abajo.

Las mutaciones en el gen CYP2D6 detectadas de acuerdo con la presente invención, se ilustran en la Figura 1 y en la Tabla 2, respectivamente. Los procedimientos del análisis de mutación siguieron protocolos estándar, y se describen en detalle en los ejemplos. En general, estos métodos usados de acuerdo con la presente invención para evaluar el espectro fenotípico, además de las características de solapamiento clínico con otras formas de metabolización de fármacos, y tolerancia a los fármacos modificada en pacientes con mutaciones en el gen CYP2D6, abarcan, p.e., análisis del haplotipo, análisis de polimorfismo de conformación de hebra única (SSCP), y secuenciado directo y mediante PCR. En base a la minuciosa caracterización clínica de muchos pacientes, los fenotipos pueden correlacionarse con esas mutaciones, además de con las mutaciones que habían sido descritas anteriormente. Como es evidente para el experto en la materia, este nuevo conocimiento de genética molecular puede ser ahora utilizado para caracterizar exactamente el genotipo del paciente índice en el que un fármaco dado provoca un efecto inusual, y también el de su familia.

Durante los últimos 20 años, la heterogeneidad genética había sido reconocida de manera creciente como una fuente significativa de variación en la respuesta a los fármacos. Muchas comunicaciones científicas (Meyer and Zanger, 1997; West et al., 1997) han demostrado claramente que algunos fármacos funcionan mejor, o que pueden ser incluso altamente tóxicos, en unos pacientes con respecto a otros, y que esas variaciones en las respuestas de los pacientes a los fármacos pueden estar relacionadas con una base molecular. Este concepto "farmacogenómico" reconoce las correlaciones entre las respuestas a los fármacos y los perfiles genéticos de los pacientes (Marshall, 1997a y 1997b). En este contexto de variabilidad demográfica respecto a la terapia con fármacos, se han propuesto los farmacogenómicos como una útil herramienta en la identificación y selección de pacientes que pueden responder a un fármaco particular, sin mostrar efectos secundarios. Esta identificación/selección puede basarse en la diagnosis molecular de los polimorfismos genéticos mediante genotipado del ADN, a partir de leucocitos de la sangre del paciente. Para los proveedores de la sanidad, como organizaciones para el mantenimiento de la salud en los EEUU, y los servicios gubernamentales de sanidad pública en muchos países europeos, esta aproximación a los farmacogenómicos puede representar un modo de mejorar la sanidad y de reducir los gastos generales, puesto que existe un gran coste debido a terapias innecesarias, fármacos ineficaces, y fármacos con efectos secundarios.

Los polinucleótidos aquí descritos pueden ser, p.e., ADN, ADN genómico, o ADN producido sintéticamente, o una molécula de ácido nucleico quimérica producida de manera recombinante, que comprenda a cualquiera de aquellos polinucleótidos, tanto solos como en combinación. Dichos polinucleótidos pueden formar parte de un vector (particularmente plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos utilizados convencionalmente en ingeniería genética) que comprenda un polinucleótido de la invención. Estos vectores pueden comprender además genes como genes marcadores que permiten la selección de dicho vector en una célula huésped apropiada, y bajo condiciones apropiadas. Pueden usarse procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la materia, para construir vectores recombinantes; ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y., y en Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994). La presente solicitud describe además a las células huésped transformadas con un polinucleótido o con un vector de la invención. Dicha célula huésped puede ser una célula eucariota o
procariota.

Con los polinucleótidos CYP2D6 variantes y los vectores de la invención, ahora es posible estudiar in vivo e in vitro la eficacia de los fármacos en relación con las mutaciones particulares en el gen CYP2D6 de un paciente, y el fenotipo afectado. De esta manera, un objeto particular de la presente invención concierne a la selección fármaco/pro-fármaco y a la formulación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades susceptibles de ser tratadas con quimioterapia, teniendo en cuenta el polimorfismo de la forma variante del promotor del gen CYP2D6 que co-segrega con el fenotipo afectado del paciente a ser tratado. Esto permite la solicitud segura y económica de fármacos que, por ejemplo, fueron considerados hasta ahora inapropiados para la terapia del cáncer, p.e., debido a sus efectos secundarios en algunos pacientes y/o a su perfil farmacológico poco fiable con respecto a los mismos o distintos fenotipos de la enfermedad. Los medios y procedimientos aquí descritos, pueden ser usados, por ejemplo, para mejorar las recomendaciones de dosificación, y permite a quien receta, el anticipar los ajustes de dosis necesarios dependiendo del grupo de pacientes considerado.

Por consiguiente, en una forma de realización más importante, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar un trastorno relacionado con la capacidad reducida o aumentada para la eliminación de sustratos CYP2D6, o la susceptibilidad a ese trastorno, que comprende la determinación de la presencia de una mutación en el promotor del gen CYP2D6 en una muestra de un sujeto.

De acuerdo con esta forma de realización de la presente invención, el procedimiento para probar el estado de un trastorno o susceptibilidad ante ese trastorno, puede llevarse a cabo usando un polinucleótido o una molécula de ácido nucleico de la invención, p.e. en forma de una Southern blot o de un análisis in situ. Dicha secuencia de ácido nucleico puede hibridar con el promotor o con una región codificante del gen CYP2D6, o con una región no codificante, p.e. un intrón, y debería ser capaz de ser extendido en la región promotora del CYP2D6. Adicionalmente, dicha prueba puede ser realizada en conjunción con un bloqueo real, p.e. de la transcripción del gen, y por lo tanto se espera que tenga relevancia terapéutica. Además, puede utilizarse también un cebador u oligonucleótido para hibridar con uno de los genes CYP2D6 mencionados más arriba. Los ácidos nucleicos utilizados para la hibridación pueden, por supuesto, ser etiquetados convenientemente mediante la incorporación o unión de, p.e. un radioactivo u otro marcador. Estos marcadores son bien conocidos en el arte. El etiquetado de dichas moléculas de ácido nucleico puede efectuarse mediante métodos convencionales.

Adicionalmente, la presencia de promotores del gen CYP2D6 variante puede monitorizarse usando un par cebador que hibrida específicamente con una región del gen que abarca al promotor CYP2D6, y mediante la realización de una reacción de amplificación acorde con los procedimientos estándar. La hibridación específica de las sondas o cebadores mencionados arriba, ocurre preferiblemente bajo rigurosas condiciones de hibridación. El término "condiciones rigurosas de hibridación" es bien conocido en el arte; ver, por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" second ed., CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989; "Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach", Hames and Higgins eds., IRL Press, Oxford, 1985. Además, el ADN genómico obtenido del sujeto puede ser secuenciado para identificar mutaciones que pueden ser huellas dactilares características de las mutaciones en el promotor del gen CYP2D6. La presente invención también comprende métodos en los que una huella dactilar puede ser generada mediante RFLPs de ADN obtenido del sujeto, opcionalmente el ADN puede ser amplificado antes del análisis, métodos que son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, el fragmento clonado o amplificado, p.e., de la muestra de ácido nucleico, es analizado mediante uno de los varios métodos conocidos en el arte. El ácido nucleico puede secuenciarse mediante el método dideoxi u otros métodos. La hibridación con la secuencia variante puede ser utilizada también para determinar su presencia, mediante Southern blots, dot blots, etc. El patrón de hibridación de una secuencia variante y de una secuencia control con una matriz de sondas de oligonucleótidos inmovilizadas en un soporte sólido, tal como se describe en el documento US-A-5,445,934, o en el documento WO95/35505, puede ser utilizado también como un medio para detectar la presencia de secuencias variantes. Se usan el análisis de polimorfismo de conformación de hebra única (SSCP), la electroforesis en gel con gradiente de desnaturalización (DGGE), la detección de corte desajustado, y el análisis heteroduplex en matrices de gel, para detectar los cambios conformacionales creados por la variación en la secuencia del ADN, en forma de alteraciones en la movilidad electroforética. Alternativamente, allí donde un polimorfismo crea o destruye un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción (polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción, RFLP), la muestra es digerida con esa endonucleasa, y el tamaño de los productos se fracciona para determinar si el fragmento fue digerido. El fraccionamiento se lleva a cabo mediante electroforesis en gel o por capilaridad, particularmente en geles de acrilamida o de
agarosa.

La persona experta en la materia, pueden idear sencillamente modificaciones posteriores de las formas de realización de la invención mencionadas arriba, sin ningún experimento indebido a partir de este descubrimiento; ver, p.e. los ejemplos. En una forma de realización preferida de la presente invención, los métodos descritos arriba comprenden PCR, reacción en cadena de la ligasa, digestión por restricción, secuenciado directo, técnicas de amplificación del ácido nucleico, o técnicas de hibridación. La revisión diagnóstica puede llevarse a cabo para polimorfismos que están relacionados genéticamente con una variante fenotípica en la actividad o la expresión de CYP2D6, particularmente a través del uso de marcadores microsatélites o de polimorfismos de nucleótido único (SNP). El microsatélite o el polimorfismo SNP en si mismos, no pueden ser expresados fenotípicamente, pero están relacionados con secuencias que dan lugar a actividad o expresión modificadas. Dos variantes polimórficas pueden encontrarse en desequilibrio de enlace, p.e. donde los alelos muestren asociaciones no aleatorias entre genes, incluso aunque los loci individuales se hallen en equilibrio de Hardy-Weinberg. El análisis del enlace puede llevarse a cabo solo, o en combinación con detección directa de polimorfismos fenotípicamente evidentes. El uso de marcadores microsatélite para el genotipado, está bien documentado. Para ejemplos, ver Mansfield et al., Genomics 24 (1994), 225-233; y Ziegle et al., Genomics 14 (1992), 1026-1031. El uso de SNPs para el genotipado es ilustrado en Golevieva, Am, J. Genet. 59 (1996), 570-578; y en Underhill et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996), 196-200.

En una forma preferida de realización de la presente invención, el sustrato para el cual se observa eliminación reducida o mejorada, se selecciona a partir del grupo constituido por antiarrítmicos, antagonistas del receptor beta adrenérgico, antidepresivos tricíclicos, inhibidores selectivos de la re-absorción de serotonina (SSRI), neurolépticos, opiáceos, agentes anticancerígenos, anfetaminas. La presente solicitud prevé que en el procedimiento descrito arriba, un paso más avanzado (que comprende la administración al sujeto de un medicamento para abolir o aliviar dicho trastorno, de acuerdo con todas las aplicaciones del procedimiento de la invención) permite el tratamiento de una enfermedad dada antes del comienzo de los síntomas clínicos debidos a la respuesta de fenotipo causada por el gen CYP2D6. Por ejemplo, dichos medicamentos son agentes quimioterapéuticos como los descritos más
arriba.

Además, la presente invención se refiere al uso de un oligo- o polinucleótido para la detección de un polinucleótido de la invención y/o para el genotipado de los correspondientes alelos promotores CYP2D6 individuales, tal como se describen aquí. Preferiblemente, dicho oligo- o polinucleótido es un polinucleótido de la invención descrito anteriormente. En una forma de realización preferida en particular, dicho oligonucleótido tiene entre 20 y 40 nucleótidos de longitud, más preferiblemente entre 20 y 30 nucleótidos, y comprende la secuencia de nucleótidos con cualquiera de las ID SEC NOS: 2, 3, 5 o de las 7 a la 10, o una secuencia complementaria.

Por lo tanto, en otra forma de realización más, la presente invención se refiere a un cebador o sonda constituidos por un oligonucleótido tal como se define en la reivindicación 8. En este contexto, el término "constituido por" significa que la secuencia de nucleótidos descrita arriba, y empleada para el cebador o la sonda de la invención, no tiene ninguna secuencia adicional de nucleótidos del gen CYP2D6 inmediatamente adyacente en sus finales 5' y/o 3'. Sin embargo, en el cebador y las sondas de la presente invención pueden estar presentes otras porciones como etiquetas, p.e. moléculas de biotina, marcadores de histidina, fragmentos de anticuerpo, oro coloidal, etc. además de secuencias de nucleótidos que no se corresponden con el gen CYP2D6. Además, también es posible el uso de secuencias particulares de nucleótidos descritas arriba, y combinarlas con otras secuencias de nucleótidos derivadas del gen CYP2D6, donde esas secuencias adicionales de nucleótidos están intercaladas con porciones distintas de ácidos nucleicos, o donde el ácido nucleico que interviene no se corresponde con las secuencias de nucleótidos del gen CYP2D6. Además, es evidente para la persona experta en la materia que los oligonucleótidos pueden ser modificados, por ejemplo, mediante columnas de tiofosfato y/o bases análogas bien conocidas en la materia (Flanagan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999), 3513-8; Witters, Breast Cancer Res. Treat. 53 (1999), 41-50; Hawley, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 9 (1999), 61-9; Peng Ho, Brian Res. Mol. Brain Res. 62 (1998), 1-11; Spiller, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 8 (1998), 281-93; Zhang, J. Pharmacol. Exp. Ther. 278 (1996), 971-9; Shoji, Antimicrob. Agents Chemother. 40 (1996), 1670-5; Crooke, J. Pharmacol. Exp. Ther. 277 (1996) 923-37). Se prevé una matriz de oligonucleótidos, donde las posiciones discretas sobre la matriz son complementarias a una o más de las secuencias polimórficas provistas, p.e. oligonucleótidos de al menos 12 nt., frecuentemente 20 nt. o mayores, y que incluyen la secuencia que flanquea la posición polimórfica. Esta matriz puede comprender una serie de oligonucleótidos, cada una de las cuales puede hibridar específicamente con un polimorfismo distinto. Para ejemplos de matrices, ver Hacia et al., Nature Genetics 14 (1996), 441-447; Lockhart et al., Nature Biotechnol. 14 (1996), 1675-1680; y De Risi et al., Nature Genetics 14 (1996), 457-460.

Gracias a la presente invención, pueden determinarse la selección particular de fármacos, el régimen de dosificación y los correspondientes pacientes a ser tratados, de acuerdo con la presente invención. Las recomendaciones de dosificación se indicarán en el etiquetado del producto permitiendo a quien prescribe, el anticipar los ajustes de las dosis dependiendo del grupo de pacientes considerado, con información que evita la prescripción del fármaco erróneo a los pacientes erróneos, en las dosis erróneas.

Además, la presente invención está relacionada con un kit para desarrollar un método como el aquí descrito, que comprende cualquiera de los oligonucleótidos o polinucleótidos anteriormente descritos, y medios opcionalmente convenientes para la detección, e instrucciones para el desarrollo de un procedimiento de la invención.

El kit de la invención puede contener otros ingredientes más, como marcadores y componentes de selección para los medios selectivos apropiados, para la generación de células transgénicas. El kit de la invención puede ser usado ventajosamente para el desarrollo de un procedimiento de la invención, y puede ser, entre otras cosas, empleado en distintas aplicaciones, p.e. en el campo diagnóstico, o como herramienta de investigación. Las partes del kit de la invención pueden estar empaquetadas individualmente en viales, o bien en combinación en unidades contenedoras o multi-contenedoras. La fabricación del kit sigue preferiblemente procedimientos estándar que son conocidos por los expertos en la materia. El kit o las composiciones diagnósticas pueden usarse en procedimientos para la detección de la expresión de una forma mutante del gen CYP2D6, de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención descritos arriba, empleando, por ejemplo, técnicas de amplificación y/o hibridación de ácido nucleico tales como las descritas aquí anteriormente y en los ejemplos.

La presente solicitud también prevé el uso de un fármaco o pro-fármaco, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de un trastorno diagnosticado mediante el procedimiento descrito antes aquí.

A partir de la descripción y ejemplos de la presente invención, y abarcadas por ella, se desvelan, o son obvias, esta y otras formas de realización. Puede recuperarse literatura más avanzada concerniente a uno de los procedimientos, usos y compuestos a ser empleados de acuerdo con la presente invención, a partir de bibliotecas públicas, usando dispositivos electrónicos, por ejemplo. Por ejemplo, la base de datos pública "Medline" puede ser utilizada y está disponible en Internet, p.e. en la dirección \underbar{http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html}. Bases de datos y direcciones más avanzadas, como son \underbar{http://www.ncbi.nlm.nih.gov/}, \underbar{http://www.infobiogen.fr/}, \underbar{http://www.fmi.ch/biology/research\_to} \underbar{ols.html}, \underbar{http://www.tigr.org/}, son conocidas por aquel experto en la materia, y pueden obtenerse también utilizando, p.e. \underbar{http://www.lycos.com}. En Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364 se da una visión general de la información de la patente en biotecnología, y un informe de fuentes relevantes de información de patentes útil para la investigación retrospectiva, y para la conciencia actual.

Los procedimientos, uso y kits de la invención pueden utilizarse para la diagnosis y el tratamiento de todo tipo de enfermedades hasta ahora desconocidas, que están relacionadas con, o son dependientes de, los promotores del gen CYP2D6 variante. Las composiciones, procedimientos y usos de la presente invención, pueden ser empleadas de manera deseable en humanos, aunque el tratamiento en animales también es abarcado por los procedimientos y usos aquí descritos.

Breve descripción de las figuras

Figura 1:: Secuencia de la región promotora CYP6D2, ubicación de los cebadores y de las mutaciones. Los cebadores que van hacia delante (==>) y hacia atrás (<==) están subrayados. La numeración está acorde con el nuevo sistema de numeración, con la A del codón de iniciación siendo +1, y la base 5' del ATG siendo -1 (a partir del sitio web de nomenclatura del alelo CYP, \underbar{http://www.imm.ki.se/CYPalleles}). La región 5' sin traducir está en negrita (de acuerdo con Kimura et al., 1989). Las mutaciones están en negrita. Las reglas de nomenclatura IUPAC:

\quad: K = G o T

\quad: Y = C o T

\quad: R = A o G

\quad: S = C o G

Figura 2:: Análisis del fenotipo y el genotipo CYP2D6 en una familia.

A:: Pedigrí de una familia analizada para los fenotipos y genotipos CYP2D6, y la secuencia CYP2D6*2 en la posición -1584 bp.

B:: Secuenciado directo de los fragmentos PCR genómicos de la región flanqueante-5' del CYP2D6. Los alelos *2 paterno y maternos (ver Parte A) fueron amplificados y secuenciados específicamente alrededor de la mutación en -1584 pb.

Figura 3:: Análisis del fenotipo y el genotipo CYP2D6 en poblaciones caucásicas.

A:: Distribución de la proporción metabólica de la esparteína, MR_{S}, en una población representativa previamente caracterizada (N = 195, Griese et al., 1998). MU, metabolizador ultra-rápido (intervalo: MR_{S} < 0,2); ME; metabolizador extensivo (intervalo: MR_{S} < 1,2); MI, metabolizador intermedio (intervalo: 1,2 < MR_{S} < 20); MP, metabolizador pobre (intervalo: MR_{S} > 20).

B:: Distribución MR_{S} para todos los 39 individuos de la población mostrada en A, que tienen el genotipo CYP2D6*2/*0. Las barras con tramado corresponden a los individuos con el alelo variante CYP2D6*2[-1584G], y las barras negras corresponden a los individuos con el alelo *2[-1584C].

Figura 4:: Expresión de la proteína microsomal CYP2D6 en relación con el polimorfismo del promotor CYP2D6. Se determinó el genotipo del promotor en la posición -1584 pb, y se calculó la media \pm desviación estándar de la proteína CYP2D6 para todos los individuos (0-3 genes) con genotipo homocigótico silvestre (-1584 CC, "s"), o al menos un promotor mutante (-1584 CG o GG, "m"), y por consiguiente, para individuos con dos o una copia del gen funcional. La significancia estadística: *P=0,026; **P=0,001; ***P<0,0001 (t-test).

Figura 5:: Relación entre la proteína microsomal CYP2D6 y el fenotipo de oxidación del fármaco in vivo, y los genotipos CYP2D6 que involucran la mutación del promotor -1584 C/G. El contenido de la proteína microsomal CYP2D6 se representa mediante barras negras (colocadas a la izquierda), y la proporción metabólica para la oxidación de esparteína se representa mediante barras con tramado (colocadas a la derecha). Se indica el número de individuos en cada grupo. La diferencia en la expresión de proteína entre los genotipos *2G/*0 y *2C/*0 fue de 3,1 veces (7,1 \pm 4,4 pmol/mg, Cl 4,8-9,1 y 2,3 \pm 1,4 pmol/mg, Cl 0,01-4,6, respectivamente; P=0,002, t-test) y de 5,6 veces en la MR_{S} in vivo (P<0,001, t-test).

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La invención será descrita ahora mediante la referencia a los siguientes ejemplos, que son meramente ilustrativos, y no deben ser interpretados como una limitación del alcance de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1

Se obtuvieron las muestras genómicas, aisladas mediante técnicas estándar a partir de muestras de sangre humana, de voluntarios sanos bajo la consideración de todos los requisitos legales, éticos y médicos del comité local de ética. Se obtuvieron y procesaron las muestras de sangre de >50 individuos mediante métodos de cromatografía de intercambio de iones (Qiagen), para aislar el ADN.

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1. Descripción de procedimientos Muestras de ADN y condiciones de PCR

Se aisló el ADN de leucocitos de individuos caucásicos a partir de muestras de sangre mediante procedimientos estándar. Todos los individuos incluidos en este estudio habían sido fenotipados previamente con esparteína, y genotipados para el polimorfismo CYP2D6 usando métodos publicados (Stüven et al., 1996; Griese et al., 1998). Para investigar la región promotora del gen CYP2D6, se amplificó el ADN genómico utilizando un par de cebadores upf14 y upr1669, diseñados para amplificar específicamente un fragmento de 1656 pb que contiene casi toda la secuencia 5'-flanqueante conocida (Figura 1, Tabla 1). Las partes alícuotas de cada producto PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa para asegurar una amplificación correcta.

Las amplificaciones se realizaron en un volumen de 50 \mul que contenía a los cebadores (0,4 \muM), el dNTP (200 \muM), \sim100 ng de ADN genómico, y el sistema de Polimerasa Extendida de Alta Fidelidad (Boheringer Mannheim). Tras calentar a 95ºC durante 2 minutos, se sometió en un termociclador PTC-200 (MJ Research) a ciclos térmicos de 15 s a 95ºC, 30 s a 61ºC y 2 min a 72ºC, durante 33 ciclos, y a un ciclo de 7 min a 72ºC. El alelo *2 también se amplificó específicamente utilizando un cebador 10B, que fue diseñado con una secuencia específica del 2* en el intrón 1 (Johansson et al., 1993), en lugar del upr1669. En este caso, la amplificación dio lugar, tal como se esperaba, a un fragmento de ADN de \sim1.9 kb a partir de todas las muestras de ADN con un genotipo *2.

TABLA 1 Cebadores oligonucleótidos

1

Secuenciado del producto PCR

Los productos PCR se secuenciaron directamente usando cebadores anidados etiquetados con infrarrojo-800
(MWG Biotech, Ebersberg, Alemania), mediante el kit Thermo Sequenase de ciclos de secuenciado con cebador etiquetado con fluorescente (Amersham Life Sciences, Little Chalfont, Inglaterra). Las secuencias de nucleótidos de los cebadores se muestran en la Tabla 1. El análisis del secuenciado se realizó en un secuenciador de ADN automático (Licor 4200, MWG Biotech, Ebersberg, Alemania), utilizando software Base ImagIR 4.00, de análisis de imagen y recopilación de datos.

2. Descripción de los resultados

Se detectaron un total de 8 mutaciones en la región con dirección hacia arriba de la secuencia, del gen CYP2D6 (Tabla 2).

TABLA 2 Polimorfismos de nucleótido único (SNP) en el promotor CYP2D6

SNP^{1}	alelos mutantes^{2}	N^{3}	frecuencia^{4}	función
-1584 C\rightarrowG	70% de *2	>30	\sim20%	actividad
				incrementada
-1426 C\rightarrowT^{5}	4, 10	>30	\sim20%	neutral
-1235 C\rightarrowG^{5}	2, 4, *10	>30	\sim50%	neutral
-1000 G\rightarrowA^{5}	4, 10	>30	\sim20%	neutral
-740 C\rightarrowT	*2	>30	\sim30%	desconocida
-680 G\rightarrowA	*2	>30	\sim30%	desconocida
-365 G\rightarrowA	*1	1	rara	desconocida
-322 T\rightarrowC	*2	1	rara	desconocida
^{1} \begin{minipage}[t]{158mm} Numeración de las bases de acuerdo con la Nomenclatura de Alelos del Citocromo Humano P450 (CYP) (secuencia silvestre tal como se publica en Kimura et al., 1989). Se secuenciaron completamente más de 60 individuos en su totalidad (genotipos que comprendían los alelos 1, 2, 4, 5, 9, 10), en su secuencia 5' flanqueante del CYP2D6; se presenta una recopilación de los resultados.\end{minipage}
^{2} Los alelos con la secuencia mutada indicada; los alelos que no se mencionan, tienen la secuencia silvestre.
^{3} Número aproximado de alelos observados con la secuencia mutante.
^{4} Frecuencias estimadas para la población completa.
^{5} Descrito por primera vez para el locus CYP2D6 chino (Johansson et al., 1994).

La comparación de sus patrones de ligamiento en individuos con distintos genotipos CYP2D6 reveló que algunas de esas mutaciones aparecen en algunos alelos distintos, mientras que en otros parecen estar asociadas muy específicamente con un alelo conocido en particular (Tabla 2).

Se descubrió que una nueva mutación C a G encontrada en el 70% de los alelos *2 secuenciados en la posición -1584 pb, en referencia al codón de iniciación (Figura 1), estaba asociada fuertemente con razones metabólicas bajas (es decir, con una mayor actividad de la enzima in vivo). Se pudo demostrar en un análisis familiar, que el alelo [-1584G] segrega con bajos valores de MR_{S}, mientras que el alelo [-1584C] segrega con altos valores de MR_{S}
(Figura 2).

De los 39 individuos con genotipo CYP2D6*2/*0 (indicando el *0 a cualquiera de los alelos no funcionales analizados, *3, *4, *5, *6, *7, *8), la MR_{S} mediana de los individuos con el promotor -1584G variante fue de 0,53 en comparación con el valor de 2,33 para los portadores de *2[-1584C] (Figura 3; P<0,0001, test de Mann-Whitney).

De las otras mutaciones descritas en la Tabla 2, tres mutaciones funcionalmente neutrales fueron descritas previamente en el locus CYP2D6 derivado de individuos chinos (Johansson et al., 1994). Otras dos nuevas mutaciones fueron asociadas específicamente con todos los alelos *2 secuenciados, y se observaron otras dos mutaciones raras.

3. Significado de los descubrimientos de la invención

La fuerte asociación de la mutación común C a G en la posición -1584 pb, con la actividad incrementada de la enzima, mejora significativamente la correlación entre el genotipo y el fenotipo en el polimorfismo CYP2D6. En particular, este descubrimiento es una firme indicación de que no solo se hereda genéticamente el fenotipo PM, si no que también se hereda el sub-fenotipo caracterizado por una baja actividad enzimática. Específicamente, las pruebas para la mutación en la posición -1584 pb permitirán identificar una gran fracción de los "metabolizadores intermedios". Los análisis muestran que más del 60% de los MIs tienen en genotipo *2/*0 (*0 se usa para cualquier alelo no funcional, es decir, *3, *4, *5, *6, *7, *8 y otros). Sin embargo, esta genotipo es común también entre metabolizadores extensivos normales, y por tanto no permite por si mismo el predecir el fenotipo MI. La presencia de la secuencia silvestre (C) en la posición -1584 pb, es un marcador de la baja actividad del genotipo *2/*0, mientras que la presencia de la mutación (G) es un marcador de la alta actividad. La detección de C o G en la posición -1584 pb, en conjunción con la identificación del genotipo *2/*0, permitirá por tanto el hacer una predicción cuantitativa de la capacidad metabólica in vivo del fármaco.

Aproximadamente el 10% de la población son fenotípicamente metabolizadores intermedios (Griese et al., 1998). Se ha demostrado que esos individuos tienen una capacidad dramáticamente reducida para la eliminación de los sustratos CYP2D6, lo que es casi tan bajo como le sucede a los metabolizadores pobres. Puede asumirse, por tanto, que las dosis normales de fármacos que son afectadas por los polimorfismos de CYP2D6, darán lugar a efectos secundarios adversos, o a fallos terapéuticos, en los MIs en un grado comparable con el de los PMs. Además de la debrisoquina y la esparteína, muchos otros fármacos son metabolizados ineficazmente en los sujetos PM, incluyendo los antiarrítimicos, los antagonistas del receptor beta-adrenérgico, los antidepresivos, los neurolépticos, los opioides, las anfetaminas, y otros (Eichelbaum and Gross, 1990; Meyer and Zanger, 1997).

Ejemplo 2

Se cuantificó inmunológica y enzimáticamente al CYP2D6 en biopsias de hígado, a partir de 76 individuos con fenotipo de oxidación de esparteína conocido. Se determinaron todos los alelos conocidos importantes, incluyendo el polimorfismo promotor -1584 C/G.

1. Descripción de los procedimientos

Muestras de pacientes y de hígados. El tejido hepático se obtuvo como espécimenes de biopsia de escisión, de pacientes que sufrían colecistectomía entre 1983 y 1986, y se almacenó a -80ºC. Todos los pacientes incluidos aquí habían sido fenotipados con respecto a su fenotipo metabolizador de la esparteína, antes de la laparotomía (Osikowska-Evers et al., 1987).

Genotipado CYP2D6. Los alelos CYP2D6 fueron asignados basándose en la determinación de las mutaciones clave apropiadas, usando ensayos PCR conocidos para los alelos *2, *3, *4, *5, *6, *7, *8, *9, y *10 (Stüven et al., 1996; Griese et al., 1998). La mutación C/G se determinó usando un nuevo método de PCR en tiempo real (Zanger et al., 2001).

Preparación del ADN y de los microsomas hepáticos. El ADN genómico se aisló a partir de una fracción de tejido hepático, usando el kit QIAamp Tissue (Qiagen, Hilden, Alemania). Los microsomas se prepararon mediante procedimientos estándar (Zanger et al., 1988b).

Cuantificación de la proteína CYP2D6 en los microsomas hepáticos. El anticuerpo monoclonal, Mab114 (Zanger et al., 1988a) se utilizó para la cuantificación del CYP2D6 en fracciones microsomales, mediante inmunotransferencia. El anticuerpo unido se detectó con el Sistema de detección ECL Western Blot (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Alemania). Se analizó la luminiscencia mediante auto-radiografía y cuantificación densitométrica, utilizando un escáner óptico (Hirschmann, Neuried, Alemania) (Zanger et al., 2001).

Determinación de la actividad de la enzima. Se midió la hidroxilación 1' de bufuralol mediada con hidroperóxido de cumeno, como un análisis in vitro específico de la enzima para CYP2D6. Las condiciones del análisis fueron similares a las descritas anteriormente (Zanger et al., 1988b).

Métodos estadísticos. Los datos se analizaron mediante el análisis de Kruskal-Wallis, no paramétrico de la varianza, para establecer una diferencia global entre los grupos de genotipo y fenotipo. Se usaron el t-test de Student, o el U-test de Mann-Whitney, para comparaciones entre pares, dependiendo de si los grupos de datos estaban distribuidos normalmente o no, lo que se probó mediante el método de Kolmogorov y Smirnov. Las medias de los datos están representadas con las desviaciones estándar (SD), las medianas están representadas con los valores mínimos y máximos observados, y, cuando se indica, se dan los intervalos de confianza (IC) superiores e inferiores al 95%. Se consideró como significativo un valor de P de 0,05 o menor (n.s., no significativo). Los cálculos estadísticos se llevaron a cabo usando el software GraphPad Instat 3.00 (Graph Pad Inc, San Diego, CA).

2. Descripción de los resultados

Análisis del polimorfismo del promotor -C/G. El promotor mutante tipo G estaba presente en 37 de los 152 alelos, lo que se corresponde con una frecuencia global del 24,3%. Estaba fuertemente ligado al alelo 2, y solo se detectó una vez en una muestra (*1/*1) a la que le faltaba el alelo *2. Con independencia del genotipo o del número de alelos funcionales, los individuos con el promotor -1584 C/C expresaron, de media, menos de la mitad de la proteína CYP2D6 (5,5 \pm 3,9 pmol/mg, Cl 4,2-6,8, no estando incluidos 5 metabolizadores pobres) en comparación con los individuos con genotipos -1584 C/G o G/G (10,9 \pm 7,1 pmol/mg, Cl 8,4-13,3, P=0,001, U-test). Se observaron diferencias similares entre grupos con uno o dos alelos funcionales (Fig. 4).

Expresión del CYP2D6 y fenotipo en relación con el genotipo. Teniendo en cuenta el polimorfismo -1584 C/G, se podrían haber distinguido un total de 19 genotipos en esta muestra de población. Para simplificar el análisis, los genotipos que involucraban alelos nulos, que no contribuían a la expresión de CYP2D6 y a la función in vivo, se agruparon juntos y se denominaron colectivamente *0. Este análisis reveló que el promotor -1584 G estaba asociado consistentemente con una mayor expresión y función de la proteína.

La diferencia más grande y significativa se encontró entre los genotipos heterocigóticos 2[G]/*0 y *2[C]/*0, debido a la ausencia de alelos funcionales desconcertantes. La diferencia en la expresión de la proteína fue de 3,1 veces (7,1 \pm 4,4 pmol/mg, Cl 4,8-9,1 y 2,3 \pm 1,4 pmol/mg, Cl 0,01-4,6, respectivamente; P=0,002, t-test) y de 5,6 veces en el MRS in vivo (P<0,001, t-test) (Fig. 5). Además, el genotipo *2[C]/*0 fue un pronosticador específico del fenotipo MI, y se contaron de cuatro a siete MIs en toda la muestra de población (Tabla 3), mientras que los 17 portadores del genotipo *2[G]/*0 tuvieron valores de MRS<1, y fueron por tanto MEs fenotípicos. El incremento en la expresión de la proteína, asociado con el alelo *2[G], fue lo suficientemente fuerte como para ser incluso significativo en el fondo del alelo silvestre, en los genotipos mezclados *1/*2[G] y *1/*2[C] (Fig. 4M P=0,026, t-test).

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TABLA 3 Propiedades fenotípicas y genotípicas de los individuos con fenotipo metabolizador ultra-rápido (MU) e intermedio (MI)

Individuo #	MR	Genotipo	Genotipo	CYP2D6
	(esparteína)	CYP2D6	-1584 pb	(pmol/mg)^{1}
Metabolizadores ultra-rápidos
24	0,07	1/2x2	CG	24,4
38	0,15	2/2	GG	17,9
58	0,17	1/2	CG	34,4
54	0,19	1/2	CG	18,3
Metabolizadores intermedios
30	1,26	1/4	CC	7,94
21	1,90	6/10	CC	0,81
64	2,08	2/4	CC	2,48
66	2,17	2/4	CC	2,87
75	3,03	2/4	CC	0,25
72	4,13	2/4	CC	3,60
69	6,46	1/1	CC	0,50
^{1} El contenido de la proteína CYP2D6 microsomal determinado por el anticuerpo monoclonal Mab114

En el intervalo más bajo de MRS (alta actividad), existió una destacada sobre-representación del promotor -1584G. Hasta un MRS del 0,37, todos los alelos *2 (n=17) fueron del tipo -1584G, mientras que no se encontraron entre los individuos con el fenotipo MI. Entre los individuos con fenotipo MU, cinco de los ocho alelos de los cuatro individuos MU portaban la mutación -1584G.

3. Significancia de los datos

Esos datos demostraron una expresión y una función de la proteína significativamente incrementada, en conjunción con el promotor -1584G, y confirmaron la significancia del polimorfismo del promotor -1584 C/G para la expresión de la proteína CYP2D6, y el fenotipo resultante in vivo. Coinciden con el supuesto de una transcripción incrementada del gen como consecuencia de la alteración de un sitio putativo de unión por consenso NF-Kappa B, por una mutación -1584 C>G (Raimundo et al., 2000).

Referencias

Broly F, Meyer UA (1993). Debrisoquine oxidation polymorphism: phenotypic consequences of a 3-base-pair deletion in exon 5 of the CYP2D6 gene. Pharmacogenetics 3:123-130.

Dahl ML, Johansson I, Bertilsson L, Ingleman Sundberg M, Sjoqvist F (1995). Ultrarapid hydroxilation of debrisoquine in a Swedish population. Analysis of the molecular genetic basis. J Pharmacol Exp Ther 274:516-520.

Daly AK, Brockmöller J, Broly F, Eichelbaum M, Evans WE, Gonzalez FJ, Huang J-D et al (1996). Nomenclature for human CYP2D6 alleles. Pharmacogenetics 6:193-201.

Eichelbaum M, Spannbrucker N, Steincke B, Dengler JJ (1979). Defective N-oxidation of sparteine in man: a new pharmacogenetic defect. Eur J Clin Pharmacol 16:183-187.

Eichelbaum M, Baur MP, Dengler HJ, Osikowska Evers BO, Tieves G, Zekorn C, Rittner C (1987). Chromosomal assignment of human cytochrome P-450 (debrisoquine/sparteine type) to chromosome 22. Br. J. Clin. Pharmacol. 23:455-458.

Eichelbaum M, Gross AS (1990). The genetic polymorphism of debrisoquine/sparteine metabolism-clinical aspects. Pharmacol Ther 46:377-394.

Griese U, Zanger UM, Brudermanns U, Gaedigk A, Milkus G, Mörite K, Stüven T, Eichelbaum M (1998). Assessement of the predictive power of genotypes for the in-vivo catalytic function of CYP2D6 in a German population. Pharmacogenetics 8:15-26.

Hardman JG, Gilman, Limbird LE (ed) (1995). Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics. Ninth Edition McGraw-Hill.

Johansson I, Oscarson M, Yue QY, Bertilsson L, Sjoqvist F, Ingleman-Sundberg M (1994). Genetic analysis of the Chinese cytochrome P4502D locus: characterization of variant CYP2D6 genes present in subjects with diminished capacity for debrisoquine hydroxilation. Mol Pharmacol. 46:452-459.

Johansson I, Lundqvist E, Bertilsson L, Dahl ML, Sjoqvist F, Ingelman Sundberg M (1993). Inherited amplification of an active gene in the cytochrome P450 CYP2D6 locus as a cause of utlrarapid metabolism of debrisoquine. Proc Natl Acad Sci USA 90:11825-11829.

Kimura S, Umeno M, Skoda RC, Meyer UA, Gonzalez FJ (1989). The human debrisoquine 4-hidroxylase (CYP2D) locus: sequence and identification of the polymorphic CYP2D6 gene, a related gene, and a pseudogene. Am J Hum Genet 45:889-904.

Mahgoub A, Idle JR, Dring LG, Lancester R, Smith RL (1977). Polymorphic hydroxilation of debrisoquine in man. Lancet ii:584-586.

Marshall A (1997a). Laying the foundations for personalized medicines. Nat Biotechnol 15:954-957.

Marshall A (1997b). Getting the right drug into the right patient. Nat Biotechnol 15:1249-1252.

Marez D, Legrand M, Sabbagh N, Lo Guidice J-M, Spire C, Lafitte J-J, Meyer UA et al., (1997). Polymorphism of the cytochrome P450 CYP2D6 gene in a Europan population: Characterization of 48 mutations and 53 alleles, their frequencies and evolution. Phramacogenetics 7:193-202.

Meyer UA, Zanfer UM (1997). Molecular mechanisms of genetic polymorphisms of drug metabolism. Annu Rev Pharmacol Toxicol 37:269-296.

Osikowska-Evers B, Dayer P, Meyer UA, Robertz GM, Eichelbaum M. Evidence for altered catalytic properties of the cytochrome P-450 involved in sparteine oxidation in poor metabolizers. Clin Pharmacol Ther 1988; 41:320-325.

Raimundo S, Fischer J, Eichelbaum M, Griese EU, Schawb M, Zanger UM. Elucidation of the genetic basis of the common "intermediate metabolizer" phenotype for drug oxidation by CYP2D6. Pharmacogenetics 2000; 10:577-581.

Sachse C, Brockmöller J, Bauer S, Roots I (1997). Cytochrome P450 2D6 variants in a Caucasian population: allele frequencies and phenotypic consequences. Am J Hum Genet 60:284-295.

Stüven T, Griese EU, Kroemer HK, Eichelbaum M, Zanger UM (1996). Rapid detection of CYP2D6 null-alleles by long distance and multiplex polymerase chain reaction. Pharmacogenetics 6:417-421.

West WL, Knight EM, Pradhan S, Hinds TS (1997). Interpatient variability: genetic predisposition and other genetic factors. J Clin Pharmacol. 37:635-48.

Yokota H, Tamura S, Furuya H, Kimura S, Watanabe M, Kanazawa I, Kondo I et al., (1993). Evidence for a new variant CYP2D6 allele CYP2D6J in a Japanese population associated with lower in vivo rates of sparteine metabolism. Pharmacogenetics 3:256-263.

Zanger UM, Hauri HP, Loeper J, Homberg JC, Meyer UA. Antibodies against human cytochrome P-450db1 in autoimmune hepatitis type II. Proc Natl Acad Sci USA 1988a; 85:8256-8260.

Zanger UM, Villbois F, Hardwick JP, Meyer UA. Absence of hepatic cytochrome P450bufl causes genetically deficient debrisoquine oxidation in man. Biochemistry 1988b; 27:5447-5454.

Zanger UM, Immunoisolation of human microsomal cytochromes P450 using autoantibodies. Methods Enzymol 1991; 206:201-209.

Zanger UM, Fischer J, Raimundo S, Stüven T, Evert BO, Schwab M, Eichelbaum M. Comprehensive Analysis of the Genetic Factors Determining Expression and Function of Hepatic CYP2D6. Pharmacogenetics 2001 (in press).

<110> EPIDAUROS Biotechnologie AG

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<120> Polimorfismos en la región promotora del gen humano CYP2D6 y su uso en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas

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<130> D2760 PCT

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<140>

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<141>

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<160> 10

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1669

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

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<400> 1

2

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<210> 2

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

gcctggacaa cttggaagaa cc

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22

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<210> 3

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

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<400> 3

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aggaagatgg ccactatcac

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20

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<210> 4

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

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<400> 4

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gaacaagtgg acaagtgtct g

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21

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<210> 5

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

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<400> 5

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ccatacctgc ctcactacc

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19

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<210> 6

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

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<400> 6

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ttcccaccag atttctaatc ag

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22

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<210> 7

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

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<400> 7

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cagcaccctt atctgtcact

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20

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<210> 8

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<211> 19

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

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<400> 8

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gtcctcctcc actgctttc

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19

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<210> 9

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<211> 23

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

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<400> 9

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ttagacaggg tctcactctg ttg

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23

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<210> 10

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificial

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<400> 10

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gacggagatt tcctcttgtt gc

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Claims

1. Un procedimiento para diagnosticar hipo- o hipersensibilidad adquirida hacia los fármacos, relacionado con la presencia de una variante molecular del promotor del gen CYP2D6 que comprende la determinación en una muestra de un sujeto, de la presencia de un polinucleótido seleccionado de un grupo constituido por:

(a): un polinucleótido variante molecular que tiene la secuencia de ácidos nucleicos con ID SEC NO:1, donde dicho polinucleótido tiene una G en la posición del nucleótido correspondiente a la posición del nucleótido -1584 del promotor CYP2D6, tal como se muestra en la Figura 1;

(b): un polinucleótido variante molecular capaz de hibridar con el promotor del CYP2D6, tal como se muestra en la Figura 1, donde dicho polinucleótido tiene supresión, adición y/o sustitución de al menos un nucleótido en la posición correspondiente a la posición -1584 del promotor CYP2D6, tal como se muestra en la Figura 1; y

(c): un polinucleótido variante molecular capaz de hibridar con el promotor CYP2D6, tal como se muestra en la Figura 1, donde dicho polinucleótido capaz de hibridar con el promotor CYP2D6 tiene una G en la posición correspondiente a la posición -1584 del promotor CYP2D6, tal como se muestra en la Figura 1,

en donde la presencia de dicho polinucleótido se considera indicativa de dicha hipo- o hipersensibilidad adquirida hacia los fármacos en dicho procedimiento.

2. El procedimiento de la Reivindicación 1, donde la supresión, adición y/o sustitución de nucleótidos da lugar a una expresión o actividad modificada del promotor del gen CYP2D6 variante, comparado con el correspondiente gen tipo silvestre.

3. Un procedimiento para diagnosticar una capacidad aumentada o reducida para la eliminación de los sustratos CYP2D6, que comprende la determinación de la presencia de un polinucleótido tal como el definido en la Reivindicación 1, en una muestra de un sujeto.

4. El procedimiento de la Reivindicación 3, donde dicho sustrato es seleccionado de antiarrítmicos, antagonistas del receptor beta adrenérgico, antidepresivos tricíclicos, inhibidores selectivos de la re-absorción de serotonina (SSRI), neurolépticos, opiáceos, agentes anticancerígenos o anfetaminas.

5. El procedimiento de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, que comprende PCR, reacción en cadena de la ligasa, digestión por restricción, secuenciado directo, técnicas de amplificación de ácidos nucleicos, o técnicas de hibridación.

6. En uso de un oligo- o polinucleótido para la diagnosis de la hipo- o hipersensibilidad adquirida hacia los fármacos, relacionado con la presencia de una variante molecular del promotor del gen CYP2D6 que comprende la determinación en una muestra de un sujeto, de la presencia de un polinucleótido seleccionado de un grupo constituido por:

(a): un polinucleótido variante molecular que tiene la secuencia de ácidos nucleicos con ID SEC NO:1, donde en la posición del nucleótido correspondiente a la posición de nucleótido -1584 del promotor CYP2D6, tal como se muestra en la Figura 1, es una G;

(b): un polinucleótido variante molecular capaz de hibridar con el promotor del CYP2D6, tal como se muestra en la Figura 1, donde dicho polinucleótido tiene en la posición correspondiente a la posición -1584 del promotor CYP2D6, tal como se muestra en la Figura 1, supresión, adición y/o sustitución de al menos un nucleótido; y

(c): un polinucleótido variante molecular capaz de hibridar con el promotor CYP2D6, tal como se muestra en la Figura 1, donde dicho polinucleótido tiene en la posición correspondiente a la posición -1584 del promotor CYP2D6, tal como se muestra en la Figura 1, una G.

7. El uso de la Reivindicación 6, donde dicho polinucleótido es un polinucleótido variante tal como el definido en la Reivindicación 1.

8. El uso de la Reivindicación 6, donde dicho oligonucleótido comprende la secuencia de nucleótidos con cualquiera de las ID SEC NOs: 2, 3, 5 o 7, hasta 10, y tiene una longitud de 20 a 40 nucleótidos.

9. Un cebador o sonda constituida por un oligonucleótido tal como el definido en la Reivindicación 8.

10. Un kit útil para realizar un procedimiento de una de las Reivindicaciones 1 a 5, que comprende oligonucleótidos o polinucleótidos capaces de detectar la presencia de un polinucleótido variante tal como el definido en la Reivindicación 1.

11. Un procedimiento in vitro para el desarrollo de un perfil farmacodinámico de fármacos que son sustratos del gen CYP2D6 producto, para un paciente o para mejorar la terapia de enfermedades, con fármacos que son objetivos del gen CYP2D6 producto, que comprende la determinación de un polimorfismo de nucleótido único del gen CYP2D6 en la posición -1584, tal como se define en la Reivindicación 1.

12. El procedimiento de la Reivindicación 11, donde dicha enfermedad es cáncer.