SK1502002A3 - A polynucleotide, a vector, a host cell, method for producing molecular variant mdr-1 protein, mdr-1 protein, an antibody, a nucleic acid molecule and a transgenic animal containing the same and the use thereof - Google Patents

Description

Polynukleotid, vektor, hostiteľská bunka, spôsob výroby molekulového variantného MDR-1 proteínu, MDR-1 proteín, protilátka, molekula nukleovej kyseliny a transgénny živočích s ich obsahom a ich použitie

Oblasť techniky

Predložený vynález sa vo všeobecnosti týka prostriedkov a spôsobov na diagnostiku a liečbu fenotypického spektra, ako aj klinických znakov prekrývajúcich sa s niekoľkými formami vrodenej abnormálnej expresie a/alebo funkcie génu na rezistenciu voči viacerým liečivám 1 (MDR-1). Konkrétnejšie sa predložený vynález týka polynukleotidov molekulových variantných MDR-1 génov, ktoré sú spojené, napríklad, s nedostatočným a/alebo zmeneným príjmom liečiv cieľovou bunkou, a vektorov obsahujúcich takéto polynukleotidy. Ďalej sa predložený vynález týka hostiteľských buniek obsahujúcich takéto polynukleotidy alebo vektory a ich použitia na produkciu variantných MDR-1 proteínov. Okrem toho sa predložený vynález týka variantných MDR-1 proteínov a protilátok, ktoré špecificky rozoznávajú takéto proteíny. Okrem toho sa predložený vynález zaoberá transgénnymi živočíchmi, s výnimkou ľudí, ktoré obsahujú vyššie opísané polynukleotidy alebo vektory. Navyše sa predložený vynález týka spôsobov na identifikáciu a získanie liekových kandidátov a inhibítorov na liečbu porúch týkajúcich sa nesprávnej funkcie MDR-1 génu, ako aj spôsobov na diagnostiku stavu takýchto porúch. Predložený vynález okrem toho poskytuje farmaceutické a diagnostické prostriedky, ktoré obsahujú vyššie opísané polynukleotidy, vektory, proteíny, protilátky a liečivá a inhibítory získateľné vyššie opísaným spôsobom. Uvedené prostriedky sú užitočné najmä na diagnostiku a liečbu rôznych ochorení s liekmi, ktoré sú substrátmi, inhibítormi alebo modulátormi MDR-1 génu alebo jeho produktu.

V texte tohto opisu je citovaných niekoľko dokumentov. Každý z tu citovaných dokumentov (vrátane opisov a inštrukcií výrobcov, atď.) je tu zahrnutých prostredníctvom odvolania sa naň; avšak nepredstavuje dokument predchádzajúceho stavu techniky vo vzťahu k predloženému vynálezu.

-2Doteraiší stav techniky

Ľudský MDR-1 gén kóduje integrálny membránový protein, ktorého funkciou je na energii závislý prenos rozličných látok z vnútra buniek a z bunkových membrán mimo bunku. Zatiaľ čo normálnou fyziologickou funkciou MDR-1 je s najväčšou pravdepodobnosťou ochrana buniek pred toxickými látkami, je tiež známe, že mnoho substrátov MDR-1 prenášača sú liečivá, ktoré boli vyvinuté na liečbu ľudských ochorení. Preto môže stupeň expresie a funkčnosti MDR-1 génového produktu priamo ovplyvňovať účinnosť akéhokoľvek liečiva, ktoré slúži ako substrát MDR-1. Je napríklad dobre známe, že hladiny expresie, a tým aj stupeň funkcie MDR-1, priamo ovplyvňujú účinnosť protinádorových liečiv pri liečbe rakoviny. V skutočnosti meno génu MDR znamená Multi-Drug-Resistance odolnosť voči viacerým liečivám, čo odráža pozorovanie, že protein kódovaný týmto génom spôsobuje, že nádorové bunky nereagujú na liečbu s mnohými liečivami, ktoré sú všetky substrátmi pre MDR-1 prenášač.

MDR-1 gén sa neexprimuje len v určitých rakovinových bunkách, kde môže priamo ovplyvňovať terapeutickú účinnosť liečiv poskytnutím ochrannej bariéry proti vstupu liečiva, ale aj v rozličných nemalígnych bunkách v rôznych orgánoch, napr. v hrubom čreve a v krvno-mozgovej bariére. Aj v týchto bunkách môže MDR-1 ovplyvňovať aktivitu a dostupnosť liečiv. Napríklad MDR-1 v hrubom čreve môže riadiť alebo modulovať stupeň príjmu liečiva z čreva po orálnom požití lieku. MDR-1 v krvno-mozgovej bariére môže tiež ovplyvňovať alebo riadiť stupeň, do ktorého sa MDR-1 substráty môžu dostať do mozgu. Tu môže zvýšená aktivita MDR-1 zabrániť vstupu dostatočných množstiev požadovaných mozgových liečiv do mozgu alebo naopak, MDR-1 varianty so zníženým účinkom vo vzťahu k určitým liečivám by mohli viesť k abnormálne zvýšenému akumulovaniu v mozgu, čo by mohlo viesť k nežiadúcim, alebo aj nebezpečným vedľajším účinkom liečiva.

Spoločným faktorom, ktorý riadi MDR-1 závislý prenos v malígnych, ako aj v normálnych bunkách a tkanivách, je aktivita MDR-1. Aktivita MDR-1 je naopak závislá na (i) úrovni expresie MDR-1 génu, ktorá determinuje množstvo MDR-1 proteínu syntetizované v bunkách, a na (ii) funkčnosti syntetizovaného MDR-1

-3proteínu, tzn. na tom, ktoré substráty sú rozoznávané a prenášané mimo bunku, a s akou účinnosťou.

Prvý z týchto parametrov, úroveň expresie MDR-1, bol intenzívne analyzovaný, najmä preto, že citlivosť nádorových buniek voči rakovinovej chemoterapii často inverzne koreiuje s nadreguláciou MDR-1 expresie: vysoká expresia MDR-1 často koreiuje s nedostatočnou účinnosťou rakovinovej chemoterapie. Hoci pozorovaná nadmerná expresia MDR-1 môže byť čiastočne pripísaná amplifikáciám MDR-1 génu, je známe, že musia existovať aj iné, doteraz neurčené, dôvody, a medzi nimi pravdepodobne alelické rozdiely. Malé rozdiely v MDR-1 génových sekvenciách u jednotlivých jedincov môžu byť príčinou rozdielnych úrovní expresie MDR-1 génu. Cieľovými oblasťami ľudského genómu, v ktorých by mohli existovať sekvenčné rozdiely priamo ovplyvňujúce expresiu MDR-1 génu, by mohli byť oblasti riadiace génovú expresiu: promótorové a zosilňovačové oblasti MDR-1 a oblasti, ktoré ovplyvňujú spôsob alebo účinnosť zostrihu MDR-1 pre-mRNAs. Okrem toho môžu byť úrovne expresie ovplyvňované štrukturálnymi zmenami v genóme, ako napríklad metyláciou, všeobecnými zmenami chromatínu a inými faktormi, ktoré sú zviazané s MDR-1, priamo v oblasti MDR-1 génu alebo v oblasti obklopujúcej MDR-1 gén. Je veľmi ťažké priamo nájsť takéto zviazané faktory alebo sekvencie a dokázať ich mechanizmus génovej aktivácie alebo represie. Avšak lineárna štruktúra ľudského genómu na definovaných chromozómoch poskytuje možnosť využiť identifikované polymorfizmy, ktoré samotné priamo neovplyvňujú expresné hladiny génov, ako markery iných, doteraz neidentifikovaných zmien v a okolo MDR-1 génu, ktoré ovplyvňujú úrovne expresie. Tento efekt je známy ako väzba: definované alelové a bázové varianty môžu slúžiť ako marker dôležitého fenotypu, aj keď samotné tieto zmeny nie sú príčinou tohto fenotypu.

Druhý parameter, funkčnosť syntetizovaného MDR-1 proteínu, tzn. to, ktoré substráty sú rozoznávané a prenášané von z bunky a s akou účinnosťou, je predovšetkým determinovaný aminokyselinovou sekvenciou proteínu, ktorý je kódovaný MDR-1 alelou. Je dobre známe, že aminokyselinové zmeny môžu meniť funkčnosť proteínov. Príkladmi prirodzene sa vyskytujúcich variantov, tzn.

-4rozličných aliel, ktoré majú priamy vplyv na účinky rôznych liečiv, sú napr. polymorfizmy cytochrómu P459 alebo polymorfizmy v TPMT, APOE a varianty iných génov. Známe sú aj varianty vzťahujúce sa k nádorom, napr. v p53 géne, ako mediátory takýchto fenotypov. Doteraz boli opísané len niektoré polymorfizmy v MDR-1 géne a boli dané do súvisu s klinickými účinkami (Mickley, Blood 91 (1998), 1749-1756). V tejto oblasti ostáva hlavnou otázkou to, či existuje viac takýchto polymorfizmov, a ak áno, či tieto polymorfizmy je možné dať do súvisu s účinkom liečiv a/alebo vedľajšími účinkami liečiv. Experimenty s umelo zavedenými mutáciami do MDR-1 génu jednoznačne ukazujú, že MDR-1 dosť citlivo reaguje na výmeny aminokyselín. Ukázalo sa, že umelé mutácie v MDR-1 géne, ktoré sa translatujú do proteínových zmien, môžu meniť substrátové spektrum, účinnosť prenosu substrátu, riadenie prenosu a aj citlivosť MDR-1 voči inhibovaniu špecifickými inhibičnými látkami. Je zrejmé, že prirodzene sa vyskytujúce mutácie, ak existujú, môžu mať podobné účinky. Avšak nie je známe ako veľa takýchto variantov existuje a s akou frekvenciou a v akých polohách v ľudskom MDR-1 géne.

Z toho vyplýva, že doteraz nie sú dostupné, ale napriek tomu sú veľmi želateľné, prostriedky a spôsoby na diagnostiku a liečbu rôznych foriem multiliečivovej rezistencie, ktorá je výsledkom MDR-1 génových polymorfizmov, a interferovania s citlivosťou, napr. s chemoterapeutickou liečbou ochorení, najmä rakoviny.

Takže technickým problémom predloženého vynálezu je splniť vyššie opísané potreby.

Riešenie tohto technického problému je dosiahnuté poskytnutím uskutočnení charakterizovaných v nárokoch.

Podstata vynálezu

Predložený vynález je založený na nájdení nových, doteraz neznámych, variantov v nukleotidových sekvenciách ľudského MDR-1 (multiliečivová rezistencia) génu a na zistení distribúcie týchto aliel v populácii. Na základe znalosti týchto nových sekvencií a na základe MDR-1 génových základných odchýlok sa navrhli

-5diagnostické testy a reakčné činidlá pre takéto testy na špecifickú detekciu a genotyping MDR-1 aliel u ľudí, vrátane homozygotov, ako aj heterozygotov, vrátane častých, ako aj zriedkavých aliel MDR-1 génu. Determinácia MDR-1 génového alelového statusu ľudí takýmito testami je užitočná na liečbu rôznych ochorení liečivami, ktoré sú substrátmi, inhibitormi alebo modulátormi MDR-1 génového produktu.

Podstatou vynálezu je polynukleotid molekulových variantných MDR-1 génov a ďalej vynález poskytuje napríklad vektory, hostiteľské bunky, varianty MDR-1 proteínov a spôsoby na ich výrobu.

Ďalej vynález poskytuje spôsoby na identifikáciu a získanie liekových kandidátov a inhibítorov MDR-1 na liečbu porúch majúcich vzťah k získanej multiliečivovej rezistencii alebo senzitivite, ako aj spôsoby na diagnostiku stavu takýchto porúch.

V ďalšom uskutočnení vynález poskytuje farmaceutické a diagnostické prostriedky, ktoré obsahujú vyššie opísané polynukleotidy, vektory obsahujúce tieto polynukleotidy, proteíny, protilátky proti nim a liečivá a inhibítory získateľné vyššie opísaným spôsobom.

Farmaceutické a diagnostické prostriedky, spôsoby a použitia podľa vynálezu sú užitočné na diagnostiku a liečbu vrodenej liekovej rezistencie pri liečbe nádorov a iných ochorení, ktoré sú závislé na liečbe liečivami. Nové varianty MDR-1 génov podľa vynálezu poskytujú potenciál na vývoj farmakodynamického profilu liečiv a prekurzorov pre daného pacienta.

Nájdenie a charakterizovanie odchýlok v MDR-1 géne a diagnostické testy na rozlíšenie rôznych MDR-1 aliel v ľudských jedincoch poskytujú veľmi účinný nástroj na zlepšenie liečby ochorení s liečivami, ktoré sú cieľmi produktu MDR-1 génu, a ktorých príjem bunkami je preto závislý na MDR-1. Diagnostika jednotlivých alelických MDR-1 stavov dovoľuje cielenejšiu liečbu, napr. umožnením aplikácie individuálnych dávkových režimov liečiv. Môže byť užitočná aj ako prognostický nástroj na výsledok terapie, čo je určite zlepšený prístup v porovnaní s použitím všeobecnej MDR-expresie ako prognostického markera. Navyše, diagnostické testy genotypu MDR-1 a nové MDR-1 varianty nebudú len zlepšovať liečbu stanovenými

-6liečivami a pomáhať korelovať genotypy s účinkom liečiv alebo vedľajšími účinkami. Tieto testy a sekvencie poskytujú aj reakčné činidlá na vývoj nových inhibítorov, ktoré špecificky modulujú aktivitu jednotlivých typov MDR-1. Jednoduchosť použitia špecifických inhibítorov jednotlivých (umelo vytvorených) MDR variantov a ich potenciálna terapeutická aplikácia boli v súčasnosti napríklad demonštrované v modelovom systéme (Moscow J. A. a ďalší, Blood 94 (1999), 52-61; Dey S. a ďalší, Biochemistry 38 (1999), 6630-6639).

Takže predložený vynález poskytuje nový spôsob využitia molekulárnej biológie a farmakologického výskumu na liekovú terapiu, pričom sa vyhýba potenciálnym nežiaducim účinkom, ktoré sú dôsledkom expresie variantných MDR1 génov.

Z toho vyplýva, že vynález sa týka polynukleotidu vybraného zo skupiny, ktorá obsahuje:

(a) polynukleotid majúci ktorúkoľvek nukleokyselinovú sekvenciu zo sekv. č.: 73,

74, 79, 80,85, 86, 91,92,97, 98,101,106, 107,112,113,116,119,122, 154,155, 160, 161, 166, 167, 172, 173, 178, 179, 184, 185, 190, 191, 196, 197, 202, 203,

208, 209, 214, 215, 220, 221, 226, 227, 232, 233, 238, 239, 244, 245, 250, 251,

256, 257, 262, 263, 268, 269, 274, 275, 280, 281, 286, 287, 292, 293, 298, 299,

304, 305, 310, 311, 316, 317, 322, 323, 328, 329, 334, 335, 340, 341, 346, 347,

352, 353, 358, 359, 364, 365, 370 alebo 371;

(b) polynukleotid kódujúci polypeptid s aminokyselinou vybranou zo sekv. č.: 372, 373, 374 alebo 375;

(c) polynukleotid kódujúci molekulový variant polypeptidu multiliečivovej rezistencie MDR-1, pričom má v polohe zodpovedajúcej polohe 140837, 141530, 141590, 171466, 171512 alebo 175068 MDR-1 génu (poradové č.: AC002457), v polohe zodpovedajúcej polohe 101 alebo 308 MDR-1 génu (poradové č.: M29432 alebo J05168), v polohe zodpovedajúcej polohe 83946 MDR-1 génu (poradové č.: AC005068), v polohe zodpovedajúcej polohe 78170 MDR-1 génu (poradové č.: AC005068), v polohe zodpovedajúcej polohe 176 MDR-1 génu (poradové č.: M29445 alebo J05168), v polohe zodpovedajúcej polohe 171456, 171404 alebo 175074 MDR-1 génu (poradové č: AC002457), v polohe zodpovedajúcej polohe

-777811 MDR-1 génu (poradové č.: AC005068) alebo polohe zodpovedajúcej polohe 137 MDR-1 génu (poradové č.: M29445 alebo J05168) zamenený nukleotid, deletovaný nukleotid, ďalší nukleotid alebo ďalší nukleotid a zamenený nukleotid;

(d) polynukleotid kódujúci molekulový variant MDR-1 polypeptidu, pričom polynukleotid má v polohe zodpovedajúcej polohe 140837, 171512, 171456, 171404, 139119, 139619, 140490 alebo 171511 MDR-1 génu (poradové č.: AC002457) C, v polohe zodpovedajúcej polohe 141530, 139177, 139479, 140118, 140568, 140727 alebo 174901 MDR-1 génu (poradové č.: AC002457) A, v polohe zodpovedajúcej polohe 141590, 139015, 140216, 140595, 175142 alebo 175180 MDR-1 génu (poradové č.: AC002457) G, v polohe zodpovedajúcej polohe 171466, 175068, 175074, 139064, 139276, 140576 alebo 145984 MDR-1 génu (poradové č.: AC002457) T, v polohe zodpovedajúcej polohe 101 MDR-1 génu (poradové č.: M29432 alebo J05168) A, v polohe zodpovedajúcej polohe 308 MDR-1 génu (poradové č.: M29432 alebo J05168) T, v polohe zodpovedajúcej polohe 83946, 78170, 70237 alebo 70200 MDR-1 génu (poradové č.: AC005068) T, v polohe zodpovedajúcej polohe 77811, 84032 alebo 73252 MDR-1 génu (poradové č.: AC0005068) G, v polohe zodpovedajúcej polohe 84701, 84074, 84119, 83973, 70371, 70253, 70204 alebo 43162 MDR-1 génu (poradové č.: AC005068) A, v polohe zodpovedajúcej polohe 43263 MDR-1 génu (poradové č.: AC005068) C alebo v polohe zodpovedajúcej polohe 176 alebo 137 MDR-1 génu (poradové č.: M29445 alebo J05168)T;

(e) polynukleotid kódujúci molekulový variant MDR-1 peptidu, pričom uvedený polypeptid obsahuje aminokyselinovú substitúciu v polohe 21, 103 alebo 400 MDR1 polypeptidu (poradové č.: P08183); a (f) polynukleotid kódujúci molekulový variant MDR-1 polypeptidu, pričom uvedený polypeptid obsahuje aminokyselinovú substitúciu N na D v polohe 21, F na S v polohe 103, F na L v polohe 103 alebo S na N v polohe 400 MDR-1 polypeptidu (poradové č.: P08183).

V kontexte predloženého vynálezu, tak ako je tu používaný, znamená výraz molekulový variant MDR-1 génu alebo proteínu to, že uvedený MDR-1 gén alebo proteín sa líši od divého typu MDR-1 génu alebo proteínu (genomické sekvencie

-8MDR-1 génu sú opísané, napríklad, pre exóny 1 až 7 pod poradovými číslami AC002457; pre exón 8 pod poradovými číslami M29429, J05168, AC005068; pre exón 9 pod poradovými číslami M29430, J05168, AC005068; pre exón 10 pod poradovými číslami M29431, J05168, AC005068; pre exóny 11 až 13 pod poradovými číslami M29432, J05168 a AC005068; pre exón 14 pod poradovými číslami M29433, J05168, AC005068; pre exón 15 pod poradovými číslami M29434, J05168, AC005068; pre exón 16 pod poradovými číslami M29435, J05168, AC005068; pre exón 17 pod poradovými číslami M29436, J05168, AC005068; pre exón 18 pod poradovými číslami M29437, J05168, AC005068; pre exón 19 pod poradovými číslami M29438, J05168, AC005068; pre exón 20 pod poradovými číslami M29439, J05168, AC005068; pre exón 21 pod poradovými číslami M29440, J05168, AC005068; pre exón 22 pod poradovými číslami M29441, J05168, AC005068; pre exón 23 pod poradovými číslami M29442, J05168, AC005068; pre exón 24 pod poradovými číslami M29443, J05168, AC005068; pre exón 25 pod poradovými číslami M29444, J05168, AC005068; pre exón 26 pod poradovými číslami M29445, J05168, AF016535, AC005568; pre exón 27 pod poradovými číslami M29446, J05168, AC005068; pre exón 28 pod poradovými číslami M29447, J05168, AC005068) nukleotidovou substitúciou (substitúciami), adíciou (adíciami) a/alebo deléciou (deléciami). Výhodne je výsledkom uvedenej nukleotidovej substitúcie (substitúcií) zodpovedajúca zmena v aminokyselinovej sekvencii MDR-1 proteínu.

Výraz zodpovedajúci, tak ako je používaný tu, znamená, že poloha nie je determinovaná len počtom predchádzajúcich nukleotidov, respektíve aminokyselín. Poloha daného nukleotidu alebo aminokyseliny podľa predloženého vynálezu, v ktorej môže byť delécia, substitúcia, alebo ktorá môže obsahovať jeden alebo viacero ďalších nukleotidov, sa môže meniť v dôsledku delécií alebo adícií nukleotidov alebo aminokyselín hocikde v géne alebo polypeptide. Takže pod zodpovedajúcou polohou treba podľa predloženého vynálezu rozumieť to, že nukleotidy alebo aminokyseliny sa môžu líšiť v uvedenom počte, ale ešte vždy môžu mať podobné susediace nukleotidy alebo aminokyseliny. Výraz zodpovedajúca poloha zahŕňa aj také nukleotidy alebo aminokyseliny, ktoré môžu byť

-9zamenené, deletované, alebo ktoré môžu zahŕňať ďalšie nukleotidy alebo aminokyseliny. Uvedené nukleotidy alebo aminokyseliny môžu napríklad spolu so svojimi susedmi tvoriť sekvencie, ktoré sa môžu podieľať na regulácii génovej expresie, na stabilite zodpovedajúcej RNA alebo editovaní RNA, ako aj sekvencie, ktoré môžu kódovať funkčné domény alebo motívy proteinu podľa vynálezu.

Podľa predloženého vynálezu bol analyzovaný modus a populačná distribúcia nových, doteraz neidentifikovaných, genetických odchýlok v MDR-1 géne sekvenčnou analýzou relevantných oblastí ľudského MDR-1 génu z mnohých rozličných jedincov. Je dobre známou skutočnosťou, že genomické DNA jednotlivcov, ktoré nesú individuálny genetický make-up všetkých génov, vrátane MDR-1 génu, sa môžu jednoducho purifikovať zo vzoriek krvi z týchto jednotlivcov. Tieto jednotlivé DNA vzorky sa potom použili na analýzu sekvenčného zloženia aliel MDR-1 génu prítomných v jednotlivcovi, ktorý poskytol vzorku krvi. Sekvenčná analýza sa uskutočňovala PCR amplifikáciou relevantných oblastí MDR-1 génu, následnou purifikáciou PCR produktov a potom automatizovaným DNA sekvenovaním zabehnutými metódami (ABI determinátorové cyklické sekvenovanie).

Jedným dôležitým parametrom, ktorý musel byť braný do úvahy, aby sa determinoval individuálny MDR-1 genotyp a identifikovali nové MDR-1 varianty priamym DNA sekvenovaním PCR produktov z ľudskej krvnej genómovej DNA bola skutočnosť, že každý človek nesie (zvyčajne, existuje len veľmi málo abnormálnych výnimiek) dve kópie génu každého autozomálneho génu (diploidita). Preto sa musel pri hodnotení sekvencii dávať veľký pozor, aby bolo možné jednoznačne identifikovať nie len odchýlky v homozygotnej sekvencii, ale aj heterozygotné odchýlky. Podrobnosti rozličných krokov pri identifikácii a charakterizácii nových MDR-1 génových polymorfizmov (homozygotných a hetorozygotných) sú opísané v príkladoch 1 a 2 nižšie.

Mutácie MDR-1 génu, detegované podľa predloženého vynálezu, sú ilustrované na obrázku 2 (označené šípkou). Spôsoby na analýzu mutácií sa uskutočňovali podľa štandardných protokolov a podrobne sú opísané v príkladoch. Vo všeobecnosti takéto spôsoby na použitie podľa predloženého vynálezu na zhodnotenie fenotypového spektra, ako aj klinických charakteristík prekrývajúcich

-10sa s inými formami multiliečivovej rezistencie a zmenenej tolerancie na liečivá u pacientov s mutáciami v MDR-1 géne zahŕňa, napríklad, analýzu haplotypu, analýzu polymorfizmov jednovláknovej konformácie (SSCA), PCR a priame sekvenovanie; pozri aj Mickley (1998) a tam citované publikácie. Na základe podrobnej klinickej charakterizácie mnohých pacientov je potom možné dať do súvisu fenotypy s týmito mutáciami, ako aj s mutáciami, ktoré boli opísané skôr. Ako je zrejmé pre priemerného odborníka v oblasti, tieto nové molekulárne genetické znalosti môžu byť teraz použité na presnú charakterizáciu genotypu označeného pacienta, u ktorého dané liečivo spôsobuje nezvyčajný účinok, a na presnú charakterizáciu jeho rodiny.

V priebehu posledných 20 rokov sa postupne zisťovalo, že genetická heterogenita je významným zdrojom odchýlok v responzívnosti na liečivá. Veľa vedeckých publikácií (Meyer, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37 (1997), 269-296 a West, J. Clin. Pharmacol. 37 (1997), 635-648) jasne ukázalo, že niektoré liečivá pracujú lepšie alebo môžu byť aj vysoko toxické v niektorých pacientoch a v iných nie, a že tieto odchýlky v odpovediach pacientov na liečivá sa môžu týkať molekulového základu. Tento farmakogenómový koncept usmernil korelácie medzi odpoveďami na liečivá a genetickými profilmi pacientov (Marshall, Náture Biotechnology, 15 (1997), 954-957; Marshall, Náture Biotechnology, 15 (1997), 1249-1252).

V tomto kontexte populačnej variability vo vzťahu k liekovej terapii sa farmakogenómový prístup navrhol ako užitočný nástroj na identifikáciu a selekciu pacientov, ktorý môžu odpovedať na konkrétne liečivo bez vedľajších účinkov. Táto identifikácia/selekcia môže byť založená napríklad na molekulovej diagnostike genetických polymorfizmov prostredníctvom genotypingu DNA z leukocytov z krvi pacienta a na charakterizácii ochorenia (Bertz, Clin. Pharmacokinet. 32 (1997), 210256; Engel, J. Chromatogra. B. Biomed. Appl. 678 (1996), 93-103). Pre financovateľov zdravotníckej starostlivosti, ako napríklad pre organizácie na udržiavanie zdravia v USA a vládne verejné zdravotné zariadenia v mnohých európskych krajinách, môže tento farmakogenómový prístup predstavovať spôsob tak na zlepšenie zdravotníckej starostlivosti, ako aj na zníženie režijných nákladov,

-11 kvôli vysokej cene nie nevyhnutných liečiv, neúčinných liečiv a liečiv s vedľajšími účinkami.

Mutácie vo variantných MDR-1 génoch niekedy vedú k aminokyselinovej delécii (deléciám), inzercii (inzerciám) a najmä substitúcii (substitúciám), a to buď k jednotlivým, alebo k ich kombinácii. Je samozrejme možné geneticky umelo skonštruovať takéto mutácie v divom type génov alebo v iných mutantných formách. Pre priemerného odborníka v oblasti sú spôsoby na zavedenie takýchto modifikácii do DNA sekvencie MDR-1 génu dobre známe; pozri napr. Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu vyššie opísaný polynukleotid kóduje variantný MDR-1 proteín alebo jeho fragment, ktorý obsahuje napr. jeden alebo viacero epitopov aminokyselinovej sekvencie kódovanej sekv. č.: 85, 97, 106 alebo 274.

Na skúmanie povahy zmien v aminokyselinovej sekvencií MDR-1 proteínu je možné použiť počítačové programy, ako napríklad BRASMOL, ktoré sa dajú získať z Internetu. Navyše je použitím iných vhodných počítačových programov možné uskutočňovať simulácie skladania a počítačové preformovávanie štrukturálnych motívov (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675-679). Počítače sa môžu používať na konformačné a energetické analýzy podrobných proteínových modelov (Monge, J. Mol. Eiiol. 247 (1995), 9951012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37-45). Tieto analýzy sa môžu používať na identifikáciu vplyvu konkrétnej mutácie na viazanie a/alebo transport liečiv.

Zvyčajne je uvedená aminokyselinová delécia, adícia alebo substitúcia v aminokyselinovej sekvencií proteínu kódovaného polynukleotidom podľa vynálezu dôsledkom jednej alebo viacerých nukleotidových substitúcií, inzercií alebo delécii alebo ich akejkoľvek kombinácie. Výhodne vedie takáto nukäleotidová substitúcia, inzercia alebo delécia k aminokyselinovej substitúcii Asn21 na Asp v exóne 2, Phe103 na Ser alebo Leu v exóne 5 a/alebo Ser400 na Asm v exóne 11 MDR-1 génu.

-12Polynukleotid podľa vynálezu môže ďalej obsahovať najmenej jednu inú nukleotidovú a voliteľne aminokyselinovú deléciu, adíciu a/alebo substitúciu, ako sú tie konkrétne uvedené vyššie, napríklad tie, ktoré sú opísané v predchádzajúcom stave techniky; napr. Mickley (1998). Toto uskutočnenie predloženého vynálezu umožňuje štúdium synergickýoh účinkov mutácií v MDR-1 géne na farmakologický profil liečiv u pacientov, ktorí nesú takéto mutantné formy génu alebo podobné mutantné formy, ktoré môžu byť napodobované vyššie opísanými proteínmi. Očakáva sa, že analýza uvedených synergickýoh účinkov poskytne hlbší pohľad na pôvod fenotypov multiliečivovej rezistencie určitých foriem rakoviny. Veľkým úžitkom tohto hlbšieho pohľadu bude vývoj diagnostických a farmaceutických prostriedkov týkajúcich sa rakoviny.

Takže vo výhodnom uskutočnení sa predložený vynález týka polynukleotidov molekulových variantov MDR-1 génov, v ktorých nukleotidová delécia, adícia a/alebo substitúcia vedú k zmenenej expresii variantného MDR-1 génu v porovnaní so zodpovedajúcim divým typom génu.

Polynukleotidom podľa vynálezu môže byť napr. DNA, cDNA, genómová DNA, RNA alebo synteticky vyrobená DNA alebo RNA alebo rekombinantné produkovaná chimérna molekula nukleovej kyseliny, ktorá obsahuje akýkoľvek z týchto polynukleotidov, buď samostatne alebo v kombinácii. Výhodne je uvedený polynukleotid časťou vektora, najmä plazmidov, kozmidov, vírusov a bakteriofágov bežne používaných v genetickom inžinierstve, ktoré obsahujú polynukleotid podľa vynálezu. Takéto vektory môžu obsahovať ďalšie gény, ako napríklad markerové gény, ktoré umožňujú selekciu takéhoto vektora vo vhodnej hostiteľskej bunke vo vhodných podmienkach.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vektora podľa vynálezu je polynukleotid podľa vynálezu operačne spojený so sekvenciami riadiacimi expresiu, ktoré umožňujú expresiu v prokaryotických alebo eukaryotických bunkách. Expresia uvedeného polynukleotidu zahŕňa transkripciu polynukleotidu, výhodne do translatovateľnej mRNA. Pre priemerného odborníka v oblasti sú dobre známe regulačné elementy zaisťujúce expresiu v eukaryotických bunkách, výhodne cicavčích bunkách. Zvyčajne zahŕňajú regulačné sekvencie zaisťujúce iniciáciu

-13transkripcie a voliteľne poly-A signály zaisťujúce termináciu transkripcie a stabilizáciu transkriptu. Ďalšie regulačné elementy môžu zahŕňať transkripčné, ako aj translačné zosilňovače. Možné regulačné elementy umožňujúce expresiu v prokaryotických hostiteľských bunkách zahŕňajú napr. lac, trp alebo tac promótor v E. coli, a príkladmi regulačných elementov umožňujúcich expresiu v eukaryotických hostiteľských bunkách sú A0X1 alebo GAL1 promótor v kvasinkách alebo CMV-, SV40-, RSV-promótor (vírus Rousovho sarkómu), CMV-zosilňovač, SV40zosilňovač alebo globínový intrón v cicavčích a iných živočíšnych bunkách. Okrem elementov, ktoré sú zodpovedné za iniciáciu transkripcie, môžu takéto regulačné elementy zahŕňať aj transkripčné terminačné signály, ako napríklad SV40-poly-A miesto alebo tk-poly-A miesto, za polynukleotidom. V tomto kontexte sú vhodné expresné vektory známe v oblasti, ako napríklad Okayama-Bergov cDNA expresný vektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (ln-vitrogene), pSPORTI (GIBCO BRL). Výhodne je uvedeným vektorom expresný vektor a/alebo vektor na génový prenos alebo smerovací vektor. Na dodanie polynukleotidov alebo vektora podľa vynálezu do cielenej bunkovej populácie môžu byť použité expresné vektory odvodené od vírusov, ako napríklad retrovírusov, vakcinia vírusu, adenoasociovaného vírusu, herpes vírusu alebo bovinného papiloma vírusu. Na konštrukciu rekombinantných vírusových vektorov je možné použiť spôsoby, ktoré sú pre priemerného odborníka v oblasti dobre známe; pozri napríklad techniky opísané v Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. a Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994). Alternatívne môžu byť polynukleotidy a vektory, ktoré sa majú dodať do cieľových buniek, rekonštituované do lipozómov.

Predložený vynález sa okrem toho týka hostiteľských buniek transformovaných s polynukleotidom alebo vektorom podľa vynálezu. Takáto hostiteľská bunka môže byť prokaryotická alebo eukaryotická bunka; pozri vyššie. Polynukleotid alebo vektor podľa vynálezu, ktorý sa nachádza v hostiteľskej bunke, môže byť buď integrovaný do genómu hostiteľskej bunky, alebo sa môže udržiavať extrachromozomálne. V tomto ohľade treba tiež zdôrazniť, že rekombinantná DNA

-14molekula podľa vynálezu môže byť používaná aj na zacielenie génu a/alebo náhradu génu na opravu mutantného génu alebo na vytvorenie mutantného génu prostredníctvom homologickej rekombinácie; pozri napríklad Mouellic, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990), 4712-4716; Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Press.

Hostiteľskou bunkou môže byť akákoľvek prokaryotická alebo eukaryotická bunka, ako napríklad bakteriálna, hmyzia, bunka húb, rastlinná, živočíšna alebo ľudská bunka. Výhodnými bunkami húb sú napríklad bunky rodu Saccharomyces, najmä bunky druhu S. cerevisiae. Výraz prokaryotický je mienený ako termín zahŕňajúci všetky baktérie, ktoré môžu byť transformované alebo transfekované polynukleotidom na expresiu variantného MDR-1 proteínu alebo jeho fragmentu. Prokaryotický hostitelia môžu zahŕňať gram negatívne, ako aj gram pozitívne baktérie, ako napríklad E. coli, S. typhimuríum, Serratia marcescens a Bacillus subtilis. Polynukleotid kódujúci mutantnú formu MDR-1 variantných proteínov môže byť použitý na transformovanie alebo transfekciu hostiteľa použitím ktorejkoľvek z techník, ktoré sú bežne známe pre priemerného odborníka v oblasti. V oblasti sú dobre známe spôsoby prípravy fúzovaných, operačne spojených génov a spôsoby ich expresie v baktériách alebo živočíšnych bunkách (Sambrook, vyššie). Tam opísané genetické konštrukty a spôsoby môžu byť využívané na expresiu variantných MDR-1 proteínov, napr. v prokaryotických hostiteľoch. Vo všeobecnosti sa expresné vektory obsahujúce promótorové sekvencie, ktoré uľahčujú účinnú transkripciu inzertovaného polynukleotidu, používajú v spojení s hostiteľom. Expresný vektor typicky obsahuje počiatok replikácie, promótor a terminátor, ako aj špecifické gény, ktoré sú schopné poskytnúť fenotypovú selekciu transformovaných buniek. Transformované prokaryotické hostiteľské bunky sa môžu pestovať vo fermentoroch a môžu sa kultivovať technikami, ktoré sú známe v oblasti, aby sa dosiahol optimálny bunkový rast. Proteíny podľa vynálezu sa potom môžu izolovať z rastového média, bunkových lyzátov alebo bunkových membránových frakcií. Izolácia a purifikácia mikrobiálne alebo inak exprimovaných polypeptidov podľa vynálezu sa môže uskutočňovať akýmkoľvek bežným prostriedkom, ako napríklad preparatívnymi chromatografickými separáciami a imunologickými separáciami,

- 15akými sú napríklad separácie zahŕňajúce použitie monoklonálnych a polyklonálnych protilátok.

Takže ďalšie uskutočnenie vynálezu sa týka spôsobu produkcie variantných MDR-1 proteínov a ich fragmentov, ktorý zahŕňa kultiváciu hostiteľskej bunky, ako bola definovaná vyššie, v podmienkach umožňujúcich expresiu proteínu a izolovanie produkovaného proteínu alebo fragmentu z kultúry.

V inom uskutočnení sa predložený vynález týka spôsobu produkcie buniek schopných exprimovať variantný MDR-1 gén, ktorý zahŕňa genetickú konštrukciu buniek s polynukleotidom alebo vektorom podľa vynálezu. Bunky získané spôsobom podľa vynálezu je možné použiť napríklad na testovanie liečiv metódami opísanými v D. L. Spector, R. D. Goldman, L. A. Leinwand, Celíš, a Lab manual, CSH Press 1998. Okrem toho môžu byť bunky používané na štúdium známych liečiv a ich neznámych derivátov z hľadiska ich schopnosti komplementovať deficienciu v transporte liečiva spôsobenú mutáciami v MDR-1 géne. Pri týchto uskutočneniach hostiteľským bunkám výhodne chýba alela divého typu, výhodne obe alely, MDR-1 génu a/alebo majú aspoň jednu alelu mutovanú. Alternatívne môže byť ako skrínovací a analyzačný systém použitá silne prevažujúca expresia mutovanej alely nad expresiou normálnej alely a porovnanie s rekombinantnou bunkovou líniou nadexprimujúcou normálnu alelu v podobnej úrovni. Bunky získateľné vyššie opísaným spôsobom môžu byť použité aj na skríningové metódy uvedené nižšie.

Okrem toho sa vynález týka variantného MDR-1 proteínu alebo jeho fragmentov kódovaných polynukleotidom podľa vynálezu alebo získateľných vyššie opísanými spôsobmi alebo z buniek produkovaných vyššie opísaným spôsobom. V tomto kontexte treba tiež zdôrazniť, že variantné MDR-1 proteíny podľa vynálezu môžu byť ďalej modifikované bežnými spôsobmi známymi v oblasti. Poskytnutím variantných MDR-1 proteínov podľa predloženého vynálezu je tiež možné determinovať časti relevantné pre ich biologickú aktivitu alebo inhibovanie biologickej aktivity, konkrétne ich aktivity týkajúcej sa transportu liečiv.

Predložený vynález sa ďalej týka protilátok, ktoré špecificky rozoznávajú variantný MDR-1 proteín podľa vynálezu. Výhodne protilátka špecificky rozoznáva

-16epitop obsahujúci jednu alebo viacero vyššie definovaných aminokyselinových substitúcií.

Protilátky proti variantnému MDR-1 proteínu podľa vynálezu je možné pripraviť dobre známymi spôsobmi použitím purifikovaného proteínu podľa vynálezu alebo od neho odvodeného (syntetického) fragmentu ako antigénu. Monoklonálne protilátky je napríklad možné pripraviť technikami, ako ich pôvodne opísal Kôhler a Milstein, Náture 256 (1975), 495 a Galfré, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3, ktoré zahŕňajú fúziu myšacích myelómových buniek so slezinnými bunkami odvodenými od imunizovaných cicavcov. Protilátkami môžu byť monoklonálne protilátky, polyklonálne protilátky alebo syntetické protilátky, ako aj fragmenty protilátok, ako napríklad Fab, Fv alebo scFv fragment, atď. Okrem toho môžu byť protilátky alebo ich fragmenty proti vyššie uvedeným polypeptidom získané použitím metód, ktoré sú opísané napr. v Harlow a Lane Antibodies, A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Tieto protilátky môžu byť použité napríklad na imunoprecipitáciu a imunolokalizáciu variantných MDR-1 proteínov podľa vynálezu, ako aj na monitorovanie prítomnosti takýchto variantných MDR-1 proteínov napríklad v rekombinantných organizmoch, a na identifikáciu zlúčenín interagujúcich s proteínmi podľa vynálezu. Na zvýšenie účinnosti fágových protilátok, ktoré sa viažu na epitop proteínu podľa vynálezu je napríklad možné použiť povrchovú plazmónovú rezonanciu, ako je využívaná v BIAcore systéme (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).

Okrem toho sa predložený vynález týka molekúl nukleových kyselín, ktoré predstavujú alebo obsahujú komplementárny reťazec ku ktorémukoľvek z vyššie opísaných polynukleotidov alebo jeho časť, takže obsahujú aspoň jeden nukleotidový rozdiel v porovnaní so zodpovedajúcimi nukleotidovými sekvenciami divého typu MDR-1 génu, ktorý je špecifikovaný vyššie opísanými nukleotidovými substitúciami, deléciami a adíciami. Takáto molekula môže byť buď kyselinou deoxyribonukleovou, alebo kyselinou ribonukleovou. Takéto molekuly zahŕňajú napríklad antisense RNA. Tieto molekuly môžu byť okrem toho spojené so sekvenciami, ktoré, keď transkribujú kód pre ribozým, produkujú tým ribozým, ktorý špecificky štiepi transkripty polynukleotidov podľa vynálezu.

-17Okrem toho sa predložený vynález týka vektora obsahujúceho nukleokyselinovú molekulu podľa vynálezu. Príklady takýchto vektorov sú opísané vyššie. Výhodne je nukleokyselinová molekula nachádzajúca sa vo vektore operatívne spojená s regulačnými elementárni umožňujúcimi expresiu v prokaryotických alebo eukaryotických hostiteľských bunkách; pozri vyššie.

Predložený vynález sa týka aj spôsobu produkcie transgénneho živočícha, okrem človeka, výhodne transgénnej myši, ktorý zahŕňa zavedenie polynukleotidu alebo vektora podľa vynálezu do zárodočnej bunky, embryotíckej bunky, kmeňovej bunky alebo vajíčka alebo do bunky, ktorá je od nich odvodená. Nehumánny živočích môže byť použitý v súlade so spôsobom podľa vynálezu, ktorý je opísaný nižšie, a môže byť netransgénnym zdravým živočíchom, alebo môže mať poruchu, ktorá je výhodne spôsobená najmenej jednou mutáciou v MDR-1 géne. Takéto transgénne živočíchy sa dobre hodia napr. na farmakologické štúdie liečiv v spojitosti s variantnými formami vyššie opísaných variantných MDR-1 proteínov, keďže tieto proteíny, alebo aspoň ich funkčné domény, sú v rámci druhov vyšších eukaryotov, najmä cicavcov, konzervované. Produkcia transgénnych embryí a ich skríning sa môže uskutočňovať ako je opísané napr. v A. L. Joyner Ed., Gene Targeting, A Practical Approach (1993), Oxford University Press. DNA embryí sa môže analyzovať napríklad použitím Southern blotov s vhodnou sondou.

Vynález sa týka aj transgénnych živočíchov, okrem človeka, ako napríklad transgénnych myší, potkanov, škrečkov, opíc, králikov, ošípaných, C. elegans a rýb, ako je napríklad parejnok, ktoré obsahujú polynukleotid alebo vektor podľa vynálezu, alebo, ktoré boli získané vyššie opísaným spôsobom, pričom výhodne je polynukleotid alebo vektor stabilne integrovaný do genómu nehumánneho živočícha, výhodne tak, aby prítomnosť polynukleotidu alebo vektora viedla k expresii variantného MDR-1 proteinu podľa vynálezu. Môže mať jednu alebo niekoľko kópií rovnakých alebo rozdielnych polynukleotidov variantného MDR-1 génu. Tento živočích má množstvo využití vrátane využitia ako výskumný model multiliečivovej rezistencie, a tým predstavuje nového a hodnotného živočícha vo vývoji terapií, liečby, atď. ochorení spôsobených deficienciou alebo poruchou

-18zadržiavania liečiv v bunke. Z toho vyplýva, že v tomto prípade je výhodným laboratórnym zvieraťom cicavec, ako napríklad myš alebo potkan.

Výhodne transgénny nehumánny živočích podľa vynálezu ďalej obsahuje najmenej jednu inaktivovanú alelu divého typu MDR-1 génu. Toto uskutočnenie umožňuje napríklad štúdium interakcie rôznych variantných foriem MDR-1 proteínov. Želateľné by mohlo byť aj inaktivovanie expresie alebo funkcie MDR-1 génu v určitom štádiu vývoja a/alebo života transgénneho živočícha. To je možné dosiahnuť napríklad použitím tkanivovo špecifických, vývojových a/alebo bunkovo regulovaných a/alebo inducibilných promótorov, ktoré riadia expresiu napr. antisense alebo ribozýmu nasmerovanému proti RNA transkriptu MDR-1 génu; pozri aj vyššie. Vhodným inducibilným systémom je napríklad tetracyklínom regulovaná génová expresia, ako je opísaná napr. v Gossen a Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. 89 USA (1992), 5547-5551) a v Gossen a ďalší (Trends Biotech. 12 (1994), 58-62). Podobne sa takýmito regulačnými elementárni môže riadiť expresia variantného MDR-1 génu.

S variantnými MDR-1 polynukleotidmi a proteínmi a vektormi podľa vynálezu je teraz možné študovať in vivo a in vitro účinnosť liečiv vo vzťahu ku konkrétnym mutáciám v MDR-1 géne pacienta a vo vzťahu k ovplyvnenému fenotypu. Okrem toho je možné variantné MDR-1 proteíny podľa vynálezu používať na determinovanie farmakologického profilu liečiv a na identifikáciu a prípravu ďalších liečiv, ktoré môžu byť účinnejšie na liečbu napr. rakoviny, najmä na zlepšenie určitých fenotypov spôsobených príslušnými mutáciami, akými sú tie, ktoré boli opísané vyššie.

Takže konkrétny predmet predloženého vynálezu sa týka selekcie liečiv/prekurzorov a formulovania farmaceutických prostriedkov na liečbu ochorení, ktoré je možné ovplyvniť chemoterapiou, berúc do úvahy polymorfizmus variantnej formy MDR-1 génu, ktorá kosegreguje s postihnutým fenotypom pacienta, ktorý sa má liečiť. To umožňuje bezpečnú a ekonomickú aplikáciu liečiv, ktoré boli napríklad doteraz považované za nevhodné na liečbu napr. rakoviny, buď kvôli ich vedľajším účinkom u niektorých pacientov, a/alebo kvôli ich nespoľahlivému farmakologickému profilu vo vzťahu k rovnakému alebo rôznemu fenotypu (fenotypom)

-19ochorenia. Tu opísané prostriedky a spôsoby môžu byť použité napríklad na zlepšenie dávkových odporúčaní a umožňujú predpisujúcemu lekárovi brať do úvahy nevyhnutné upravovania dávky v závislosti na danej pacientovej skupine.

V ďalšom uskutočnení sa predložený vynález týka spôsobu identifikácie a získania MDR-1 inhibítora, ktorý je schopný modulovať aktivitu molekulového variantu MDR-1 génu alebo jeho génového produktu, ktorý zahŕňa nasledujúce kroky:

(a) uvedenie variantného MDR-1 proteínu alebo bunky exprimujúcej molekulový variant MDR-1 génu, ktorá obsahuje polynukleotid podľa vynálezu, do kontaktu so zlúčeninou, ktorá sa má skrínovať, v podmienkach umožňujúcich transport liečiva sprostredkovaný MDR-1, v prítomnosti zlúčenín schopných poskytnúť detegovateľný signál ako odpoveď na transport liečiva, a (b) detegovanie prítomnosti alebo neprítomnosti signálu alebo zvýšenia signálu generovaného transportom liečiva, pričom prítomnosť alebo zvýšenie signálu naznačuje pravdepodobný inhibítor.

Výraz zlúčenina zahŕňa v spôsobe podľa vynálezu jedinú látku alebo viacero látok, ktoré môžu alebo nemusia byť rovnaké.

Takáto zlúčenina (zlúčeniny) môže byť chemicky syntetizovaná alebo produkovaná mikrobiálnou fermentáciou, ale môže byť napríklad aj zahrnutá vo vzorkách, napríklad v bunkových extraktov napr. z rastlín, živočíchov alebo mikroorganizmov. Okrem toho môžu byť takéto zlúčeniny v oblasti známe, ale doteraz sa o nich nevie, že sú užitočné ako inhibítory. Rôzne zlúčeniny je napr. možné pridávať do kultivačného média alebo sa môžu injektovať do bunky nehumánneho živočích podľa vynálezu.

Ak sa spôsobom podľa vynálezu identifikuje vo vzorke zlúčenina (zlúčeniny), potom je možné buď izolovať zlúčeninu z pôvodnej vzorky, ktorá bola identifikovaná ako obsahujúca otáznu zlúčeninu, alebo sa pôvodná vzorka môže, ak pozostáva z viacerých rozličných zlúčenín, napríklad ďalej rozdeliť, aby sa znížil počet rôznych látok na vzorku, a spôsob sa môže zopakovať s časťami pôvodnej vzorky. To, či vzorka alebo zlúčenina vykazuje požadované vlastnosti, sa môže determinovať napríklad tu opísanými spôsobmi alebo metódami uvedenými v literatúre (Spector a

-20ďalší, Celíš Manual; pozri vyššie). V závislosti na komplexnosti vzorky sa vyššie opísané kroky môžu uskutočňovať niekoľko krát, výhodne až dovtedy, kým vzorka identifikovaná spôsobom podľa vynálezu neobsahuje len obmedzený počet látok, alebo len jednu látku. Výhodne obsahuje vzorka látky s podobnými chemickými a/alebo fyzikálnymi vlastnosťami, a najvýhodnejšie sú tieto látky identické. Priemerný odborník v oblasti je schopný jednoducho uskutočňovať a navrhovať spôsoby podľa predloženého vynálezu napríklad v súlade s testami založenými na iných bunkách, ktoré sú opísané v doterajšom stave techniky, alebo použitím a modifikovaním tu opísaných spôsobov. Okrem toho priemerný odborník v oblasti bez problémov identifikuje, ktoré ďalšie zlúčeniny a/alebo enzýmy môžu byť použité na uskutočnenie spôsobov podľa vynálezu, napríklad enzýmy, ktoré, ak je to potrebné, konvertujú určitú zlúčeninu na prekurzor, ktorý na druhej strane predstavuje substrát pre MDR-1 proteín. Takáto úprava spôsobu podľa vynálezu je dobre zvládnuteľná priemerným odborníkom v oblasti a môže sa uskutočniť bez nadmerného experimentovania.

Zlúčeniny, ktoré môžu byť použité v súlade s predloženým vynálezom, zahŕňajú peptidy, proteíny, nukleové kyseliny, protilátky, malé organické zlúčeniny, ligandy, peptidomimetiká, PNAs a podobne. Takýmito zlúčeninami môžu byť aj funkčné deriváty alebo analógy známych liečiv, ako napríklad verapamilu alebo cyklosporínu. Spôsoby prípravy chemických derivátov a analógov sú pre priemerného odborníka v oblasti dobre známe a sú opísané napríklad v Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175th Avenue, New York, N.Y. 10010 USA a v Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Okrem toho účinky uvedených derivátov a analógov môžu byť testované spôsobmi známymi v oblasti alebo opísanými spôsobmi. Navyše môžu byť použité peptidové mimetiká a/alebo pomocou počítača navrhnuté vhodné deriváty alebo analógy liečiv, napríklad v súlade s nižšie opísanými metódami. Takéto analógy obsahujú molekuly, ktoré majú ako základ štruktúru známych MDR-substrátov a/alebo inhibítorov a/alebo modulátorov; pozri nižšie.

Vhodné počítačové programy môžu byť použité na identifikáciu interaktívnych miest pravdepodobného inhibítora a MDR-1 proteínu podľa vynálezu

-21 prostredníctvom vyhľadávania komplementárnych štrukturálnych motívov pomocou počítača (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120). Ďalšie vhodné počítačové systémy na navrhovanie proteínov a peptidov pomocou počítača sú opísané v doterajšom stave techniky, napríklad v Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N.Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Výsledky získané z vyššie opísaných počítačových analýz môžu byť použité v kombinácii so spôsobom podľa vynálezu riapr. na optimalizáciu známych inhibítorov. Vhodné peptidomimetiká a iné inhibítory je možné identifikovať aj prostredníctvom syntézy peptidomimetických kombinatoriálnych knižníc cez postupnú chemickú modifikáciu a testovaním výsledných zlúčenín, napr. tu opísanými spôsobmi. Spôsoby na generovanie a používanie peptidomimetických kombinatoriálnych knižníc sú opísané v doterajšom stave techniky, napríklad v Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 a Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715. Na navrhnutie peptidomimetických liečiv sa môže použiť aj trojrozmerná a/alebo kryštalografická štruktúra inhibítorov a MDR-1 proteínu podľa vynálezu (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).

Možno zhrnúť, že predložený vynález poskytuje spôsoby na identifikáciu a získavanie zlúčenín, ktoré môžu byť použité v špecifických dávkach na liečbu špecifických foriem ochorení, napr. rakoviny, ktorých chemoterapia komplikovaná nesprávnymi funkciami MDR-1 génu často vedie fenotypu rezistencie alebo citlivosti voči liečivám.

Vo výhodnom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu je uvedenou bunkou hostiteľská bunka geneticky manipulovaná polynukleotidom alebo vektorom alebo bunka získaná spôsobom podľa vynálezu alebo bunka nachádzajúca sa vo vyššie opísanom transgénnom nehumánnom živočíchovi.

V ďalšom uskutočnení sa predložený vynález týka spôsobu identifikácie a získavania MDR-1 inhibítora, ktorý je schopný modulovať aktivitu molekulového variantu MDR-1 génu alebo jeho génového produktu, ktorý zahŕňa nasledujúce kroky:

-22(a) uvedenie variantného MDR-1 proteínu podľa vynálezu do kontaktu s prvou molekulou, o ktorej je známe, že sa viaže na MDR-1 proteín, aby sa vytvoril prvý komplex uvedeného proteínu a uvedenej prvej molekuly;

(b) uvedenie prvého komplexu do kontaktu so zlúčeninou, ktorá sa má skrínovať; a (c) meranie, či uvedená zlúčenina vytesňuje prvú molekulu z prvého komplexu.

V uvedenom spôsobe merací krok výhodne zahŕňa meranie vytvorenia druhého komplexu proteínu a inhibítorového kandidáta. Výhodne merací krok zahŕňa meranie množstva prvej molekuly, ktorá nie je naviazaná na proteín.

Vo výnimočne výhodnom uskutočnení vyššie opísaného spôsobu je prvou molekulou Verapamil, Valspodar, Cyklosporín A alebo dexniguldipín. Okrem toho je výhodné, aby v spôsobe podľa vynálezu bola prvá molekula označená, napr. rádioaktívnou alebo fluorescenčnou značkou.

V ešte ďalšom uskutočnení sa predložený vynález týka spôsobu diagnostiky poruchy súvisiacej s prítomnosťou molekulového variantu MDR-1 génu alebo diagnostiky náchylnosti na takúto poruchu, ktorý zahŕňa:

(a) determinovanie prítomnosti polynukleotidu podľa vynálezu vo vzorke subjektu; a/alebo (b) determinovanie prítomnosti variantnej formy MDR-1 proteínu, napríklad s protilátkou podľa vynálezu.

Podľa tohto uskutočnenia predloženého vynálezu sa spôsob testovanie stavu poruchy alebo náchylnosti na takúto poruchu môže uskutočňovať použitím polynukleotidu alebo nukleokyselinovej molekuly podľa vynálezu, napr. vo forme Southern alebo Northern blotovej alebo in situ analýzy. Uvedená nukleokyselinová sekvencia môže hybridizovať s kódujúcou oblasťou oboch génov alebo z nekódujúcou oblasťou, napr. s intrónom. V prípade, že sa v spôsobe podľa vynálezu využíva komplementárna sekvencia, je možné takúto nukleovú kyselinu opäť použiť v Northern blotoch. Okrem toho sa testovanie môže uskutočňovať v spojení s aktuálnym blokovaním napr. transkripcie génu, čím sa očakáva jeho terapeutický význam. Okrem toho sa môže aj primér alebo oligonukleotid použiť na hybridizáciu s jedným z vyššie uvedených MDR-1 génov alebo so zodpovedajúcimi

-23mRNAs. Nukleové kyseliny používané na hybridizáciu môžu byť samozrejme bežným spôsobom značené začlenením alebo pripojením napr. rádioaktívneho alebo iného markera. Takéto markery sú v oblasti dobre známe. Značenie nukleokyselinových molekúl sa môže uskutočňovať bežnými spôsobmi. Okrem toho môže byť prítomnosť alebo expresia variantných MDR-1 génov monitorovaná použitím páru primérov, ktoré špecificky hybridizujú s oboma zodpovedajúcimi nukleokyselinovými sekvenciami, a uskutočňovaním PCR reakcie podľa štandardných postupov. Špecifická hybridizácie vyššie uvedených sond alebo primérov výhodne nastáva v prísnych hybridizačných podmienkach. Termín prísne hybridizačné podmienky je v oblasti dobre známy; pozri napríklad Sambrook a ďalší, Molecular Cloning, A Laboratory Manual druhé vyd., CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989; Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach, Hames and Higgins vyd., IRL Press, Oxford, 1985. Ďalej je možné sekvenovať mRNA, cRNA, cDNA alebo genomickú DNA získané zo subjektu, aby sa identifikovali mutácie, ktoré môžu byť charakteristickými otlačkami (fingerprints) mutácií MDR-1 génu. Predložený vynález ďalej zahŕňa spôsoby, ktorými sa takýto otlačok môže generovať prostredníctvom RFLPs DNA alebo RNA získaných zo subjektu, voliteľne sa DNA alebo RNA môžu pred analýzou amplifikovať, pričom tieto spôsoby sú v oblasti dobre známe. Získavanie RNA otlačkov sa môže uskutočniť napríklad poštiepením RNA vzorky subjektu s vhodným RNA-enzýmom, napríklad RNázou T_1t RNázou T₂ alebo podobne, alebo ribozýmom, a jej rozdelením, napríklad elektroforeticky, a detegovaním RNA fragmentov ako je opísané vyššie.

Priemerný odborník v oblasti je schopný jednoducho navrhnúť ďalšie modifikácie vyššie opísaného uskutočnenia vynálezu bez nadmerného experimentovania na základe tohto opisu; pozri napr. príklady. Ďalšie uskutočnenie predloženého vynálezu sa týka spôsobu, v ktorom sa determinácia uskutočňuje využitím protilátky podľa vynálezu alebo jej fragmentu. Protilátka používaná v spôsobe podľa vynálezu môže byť značená detegovateľnými príveskami, ako napríklad histidínom alebo biotínovou molekulou.

Vo výhodnom uskutočnení predloženého vynálezu vyššie opísané spôsoby zahŕňajú PCR, ligázovú reťazovú reakciu, štiepenie reštrikčnými endonukleázami,

-24priame sekvenovanie, techniky amplifikácie nukleovej kyseliny, hybridizačné techniky alebo imunotesty (Sambrook a ďalší, loc. cit. CSH cloning, Harlow a Lane loc. cit. CSH antibodies).

Vo výhodnom uskutočnení spôsobu podľa predloženého vynálezu je uvedenou poruchou rakovina.

V ďalšom uskutočnení vyššie opísaného spôsobu umožňuje ďalší krok zahŕňajúci podávanie liečiva subjektu na zrušenie alebo zmiernenie odchýlok v MDR-1 géne v súlade so všetkými aplikáciami spôsobu podľa vynálezu liečenie daného ochorenia pred nástupom klinických symptómov, ktoré sú dôsledkom fenotypovej odpovede spôsobenej MDR-1 génom.

Vo výhodnom uskutočnení spôsobu podľa vynálezu sú uvedeným liečivom chemoterapeutické činidlá, ako napríklad adriamycín, doxorubicín, paclitaxol (taxol) a iné MDR-substráty, Ambudkar SV. a ďalší, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 39 (1999), 361-398.

V inom výhodnom uskutočnení vyššie opísaných spôsobov uvedený spôsob ďalej zahŕňa zavedenie (i) funkčného a exprimovateľného divého typu MDR-1 génu alebo (ii) nukleokyselinovej molekuly alebo vektora podľa vynálezu do buniek.

V tomto kontexte a tak ako je tu v celom opise používaný, funkčný MDR-1 gén znamená gén kódujúci proteín, ktorý má časť alebo celú primárnu štrukturálnu konformáciu divého typu MDR-1 proteínu, tzn. vyznačuje sa biologickou vlastnosťou, ktorou je sprostredkovanie prenosu liečiv cez membránu. Toto uskutočnenie predloženého vynálezu je vhodné na liečbu rakoviny, zápalových ochorení, nervových , CNS ochorení alebo kardiovaskulárnych ochorení, najmä u ľudí. Detekcia expresie variantného MDR-1 génu by umožnila záver, že táto expresia má súvis s generovaním alebo udržiavaním zodpovedajúceho fenotypu ochorenia. V súlade s tým by mal byť aplikovaný krok na zníženie expresnej hladiny na nízku alebo na jej zrušenie. To sa môže uskutočniť napríklad aspoň čiastočnou elimináciou expresie mutantného génu biologickými prostriedkami, napríklad použitím ribozýmov, antisense nukleokyselinových molekúl, vnútrobunkových

-25protilátok alebo vyššie opísaných inhibítorov proti variantným formám týchto MDR-1 proteínov. Okrem toho je možné vyvinúť farmaceutické produkty, ktoré znižujú hladiny expresie zodpovedajúcich mutantných proteínov a génov.

V ďalšom uskutočnení sa vynález týka spôsobu produkcie farmaceutického prostriedku, ktorý zahŕňa kroky ktoréhokoľvek z vyššie opísaných spôsobov a syntetizovanie a/alebo formulovanie zlúčeniny identifikovanej v kroku (b) alebo jej derivátu alebo homológu do farmaceutický prijateľnej formy. Terapeuticky užitočné zlúčeniny identifikované spôsobom podľa vynálezu môžu byť formulované a podávané pacientovi, ako bolo diskutované vyššie. Použitia a terapeutické dávky stanovené priemerným odborníkov v oblasti ako vhodné pozri nižšie.

Okrem toho sa predložený vynález týka spôsobu prípravy farmaceutického prostriedku, ktorý zahŕňa kroky vyššie opísaných spôsobov; a formulovanie liečiva alebo prekurzora do formy vhodnej na terapeutickú aplikáciu a na predchádzanie alebo zlepšenie poruchy subjektu diagnostikovanej spôsobom podľa vynálezu.

Po in vivo podaní sa liečivá alebo prekurzory metabolizujú, aby sa eliminovali buď vylúčením, alebo metabolizovaním na jeden alebo viacero aktívnych alebo neaktívnych metabolitov (Meyer, J. Pharmacokinet. Biopharm. 24 (1996), 449-459). Takže namiesto použitia konkrétnej zlúčeniny alebo inhibítora identifikovaných a získaných v súlade so spôsobmi podľa predloženého vynálezu, môže sa použiť zodpovedajúca formulácia ako prekurzor, ktorý sa konvertuje na aktívny v pacientovi. Premyslené merania, ktoré sa môžu uskutočňovať na aplikáciu prekurzorov a liečiv, sú opísané v literatúre; pozri napríklad zhrnutie v Ozama, J. Toxicol. Sci. 21 (1996), 323-329).

Vo výhodnom uskutočnení spôsobu podľa predloženého vynálezu je liečivom alebo prekurzorom derivát liečiva ako je definovaný vyššie.

V ešte ďalšom uskutočnení sa predložený vynález týka inhibítora identifikovaného alebo získaného vyššie opísaným spôsobom. Výhodne sa inhibítor špecificky viaže na variantný MDR-1 proteín podľa vynálezu. Špecificita protilátok, nukleokyselinových molekúl a inhibítorov podľa predloženého vynálezu je výhodne aspoň v podstate rovnaká ako väzobná špecificita prirodzeného ligandu alebo väzobného partnera MDR-1 proteínu podľa vynálezu. Protilátka alebo inhibítor

-26môžu mať väzobnú afinitu voči MDR-1 proteinu podľa vynálezu najmenej 10⁵ M'¹, výhodne vyššiu ako 10⁷ M'¹ a výhodne do 10¹⁰ M'¹ v prípade, že by mali reprimovať aktivitu MDR-1. Takže vo výhodnom uskutočnení má supresívna protilátka alebo inhibítor podľa vynálezu afinitu najmenej približne 10'⁷ M, výhodne najmenej približne 10'⁹ M a najvýhodnejšie približne 10'¹¹ M.

Okrem toho sa predložený vynález týka použitia oligo- alebo polynukleotidu na detekciu polynukleotidu podľa vynálezu a/alebo na genotyping zodpovedajúcich jednotlivých MDR-1 aliel. Výhodne je oligo- alebo polynukleotidom polynukleotidová alebo nukleokyselinová molekula podľa vynálezu opísaná vyššie.

Vo výnimočne výhodnom uskutočnení má uvedený oligonukleotid dĺžku približne 10 až 100 nukleotidov, výhodnejšie 15 až 50 nukleotidov a obsahuje nukleotidovú sekvenciu vybranú zo sekv. č.: 1 až 179, alebo divý typ (wt)- alebo mutovanú (mut)-sekvenciu promótora alebo exónu MDR-1 génu, znázornenú v tabuľke 8, alebo sekvenciu, ktorá je komplementárna s ktoroukoľvek z nich.

Takže v ešte ďalšom uskutočnení sa predložený vynález týka primera alebo sondy pozostávajúcich z vyššie opísaného oligonukleotidu. V tomto kontexte výraz pozostávajúci z znamená, že nukleotidová sekvencia opísaná vyššie a využívaná primerom alebo sondou podľa vynálezu nemá žiadnu ďalšiu nukleotidovú sekvenciu MDR-1 génu na priľahlom 5’ a/alebo 3’ konci. Avšak v primeroch alebo v sondách podľa predloženého vynálezu sa môžu nachádzať iné časti, ako napríklad značky, napr. biotínové molekuly, histidín, protilátkové fragmenty, koloidálne zlato, atď., ako aj nukleotidové sekvencie, ktoré nezodpovedajú MDR-1 génu. Okrem toho je tiež možné použiť vyššie opísané konkrétne nukleotidové sekvencie a skombinovať ich s inými nukleotidovými sekvenciami odvodenými od MDR-1 génu, pričom tieto ďalšie nukleotidové sekvencie sú premiešané s inými ako nukleokyselinovými časťami, alebo nukleová kyselina nezodpovedá nukleotidovým sekvenciám MDR-1 génu.

Okrem toho sa predložený vynález týka použitia protilátky alebo látky, ktorá je schopná špecificky sa viazať na génový produkt MDR-1 génu, na detekciu variantného MDR-1 proteinu podľa vynálezu, na expresiu molekulového variantu

-27MDR-1 génu obsahujúceho polynukleotid podľa vynálezu a/alebo na rozlíšenie MDR-1 aliel obsahujúcich polynukleotid podľa vynálezu.

Okrem toho sa predložený vynález týka prostriedku, výhodne farmaceutického prostriedku, ktorý obsahuje protilátku, nukleokyselinovú molekulu, vektor alebo inhibítor podľa predloženého vynálezu a voliteľne farmaceutický prijateľný nosič. Tieto farmaceutické prostriedky obsahujúce napr. inhibítor alebo jeho farmaceutický prijateľné soli môžu byť vhodne podávané akýmkoľvek spôsobom, ktorý je bežne používaný na podávanie liečiv, napríklad orálne, topicky, parenterálne alebo inhaláciou. Prijateľné soli zahŕňajú acetát, metylester, hydrochlorid, sulfát, chlorid a podobne. Zlúčeniny sa môžu podávať v bežných dávkových formách pripravených kombináciou liečiva so štandardnými farmaceutickými nosičmi v súlade s bežnými postupmi. Tieto postupy môžu zahŕňať miešanie, granulovanie a spoločné stláčanie alebo rozpúšťanie zložiek, podľa toho, čo je vhodné pre požadovaný prípravok. Bude zrejmé, že forma a charakter farmaceutický prijateľného nosiča alebo riedidla bude diktovaná množstvom účinnej zložky, s ktorou sa má kombinovať, a spôsobom podávania a inými, dobre známymi premennými. Nosič (nosiče) musí byť prijateľný v tom zmysle, že musí byť kompatibilný s inými zložkami formulácie a nesmie byť pre recipienta škodlivý. Využívaný farmaceutický nosič môže byť napríklad buď tuhý, alebo kvapalný. Príkladmi tuhých nosičov sú laktóza, sadrovec, sacharóza, mastenec, želatína, agar, pektín, akácia, stearan horečnatý, kyselina steárová a podobne. Príkladmi kvapalných nosičov sú fosfátom tlmený fýziologický roztok, sirup, olej, ako napríklad arašidový a olivový olej, voda, emulzie, rôzne typy zmáčacích činidiel, sterilné roztoky a podobne. Podobne môže nosič alebo riedidlo zahŕňať materiál spôsobujúci časový odklad, ktorý je v oblasti dobre známy, ako napríklad glycerylmonostearan alebo glyceryldistearan, samostatne alebo s voskom.

Dávkový režim bude determinovaný ošetrujúcim lekárom a inými klinickými faktormi; výhodne podľa ktoréhokoľvek z vyššie opísaných spôsobov. Ako je v medicínskej oblasti dobre známe, dávky pre akéhokoľvek pacienta závisia na mnohých faktoroch vrátane pacientovej veľkosti, povrchovej oblasti tela, veku, na konkrétnej zlúčenine, ktorá sa má podávať, pohlaví, čase a spôsobe podávania,

-28všeobecnom zdraví a na iných liečivách, ktoré sa podávajú súčasne. Progres sa môže monitorovať periodickým hodnotením.

V prípadoch, kedy sa má koncentrácia mutovanej formy v bunkách redukovať, okrem toho prichádza do úvahy použitie farmaceutických prostriedkov, ktoré obsahujú antisense oligonukleotidy, ktoré špecificky hybridizujú s RNA kódujúcou mutované verzie MDR-1 génu podľa vynálezu, alebo, ktoré obsahujú protilátky špecificky rozoznávajúce MDR-1 protein, ktoré ale nerozoznávajú, alebo v podstate nerozoznávajú funkčnú formu divého typu.

Vďaka predloženému vynálezu je možné podľa neho determinovať selekciu konkrétnych liečiv, dávkový režim a zodpovedajúcich pacientov, ktorí sa majú liečiť. Dávkové odporúčania budú vyznačené na etikete produktu, čím sa predpisujúcemu lekárovi umožní upravovať dávky v závislosti na danej skupine pacienta, s informáciami, ktorá zabránia predpísaniu nesprávneho liečiva nesprávnemu pacientovi v nesprávnej dávke.

Okrem toho sa predložený vynález týka diagnostického prostriedku alebo kitu, ktorý obsahuje ktorýkoľvek z vyššie opísaných polynukleotidov, vektorov, hostiteľských buniek, variantných MDR-1 proteínov, protilátok, inhibítorov, nukleokyselinových molekúl alebo zodpovedajúcich vektorov podľa vynálezu a voliteľne vhodný prostriedok na detekciu.

Kit podľa vynálezu môže obsahovať ďalšie zložky, ako napríklad selekčné markery a komponenty selekčného média, vhodné na generovanie transgénnych buniek alebo živočíchov. Kit podľa vynálezu sa výhodne môže používať na uskutočňovanie spôsobu podľa vynálezu a inter alia by mohol byť využívaný na rôzne aplikácie, napr. v diagnostickej oblasti alebo ako výskumný nástroj. Časti kitu podľa vynálezu môžu byť balené jednotlivo v liekovkách alebo kombinované v nádobách alebo v multinádobových jednotkách. Výroba kitu sa výhodne uskutočňuje štandardnými postupmi, ktoré sú známe pre priemerného odborníka v oblasti. Kit alebo diagnostické prostriedky sa môžu používať na detekciu expresie mutantnej formy MDR-1 génu v súlade s ktorýmkoľvek z vyššie opísaných spôsobov podľa vynálezu využitím, napríklad imunotestovacích techník, ako napríklad rádioimunologických testov alebo enzymoimunologických testov, alebo

-29výhodne využitím techník nukleokyselinovej hybridizácie a/alebo amplifikácie, napríklad tých, ktoré sú opísané vyššie a v príkladoch.

Niektoré genetické zmeny vedú ku zmeneným konformačným stavom proteinu. Napríklad niektoré variantné MDR-1 proteíny majú terciárnu štruktúru, ktorá spôsobuje, že sú oveľa menej schopné uľahčovať transport liečiva. Opätovné nastolenie normálnej alebo regulovanej konformácie mutovaných proteínov je najelegantnejší a najšpecifickejší prostriedok ako opraviť tieto molekulové defekty, hoci je najťažší. Takže cieľom farmakologických manipulácií môže byť opätovné nastolenie proteínovej konformácie divého typu. Takže polynukleotidy a kódované proteíny podľa predloženého vynálezu môžu byť používané aj na navrhovanie a/alebo identifikáciu molekúl, ktoré sú schopné aktivovať funkciu divého typu MDR1 génu alebo proteinu.

V inom uskutočnení sa predložený vynález týka použitia liečiva alebo prekurzora na prípravu farmaceutického prostriedku na liečbu alebo prevenciu poruchy diagnostikovanej vyššie opísaným spôsobom.

Okrem toho sa predložený vynález týka použitia účinnej dávky nukleokyselinovej sekvencie kódujúcej funkčný a exprimovateľný divý typ MDR-1 proteinu na prípravu farmaceutického prostriedku na liečbu, prevenciu a/alebo oddialenie poruchy diagnostikovanej spôsobom podľa vynálezu. Gén kódujúci funkčný a exprimovateľný MDR-1 proteín sa môže zaviesť do buniek, ktoré môžu na druhej strane produkovať proteín, o ktorý je záujem. Génová terapia, ktorá je založená na zavedení terapeutických génov do buniek ex vivo alebo in vivo technikami, je jednou z najdôležitejších aplikácií génového prenosu. Vhodné vektory a spôsoby na in vitro alebo in vivo génovú terapiu sú opísané v literatúre a sú známe pre priemerného odborníka v oblasti; pozri napr. Giordano, Náture Medicíne 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Náture Medicíne 2 (1996), 714-716; WO94/29469; WO 97/00957 alebo Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640 a tam citované publikácie. Gén môže byť skonštruovaný na priame zavedenie do bunky alebo na zavedenie do bunky prostredníctvom lipozómov alebo vírusových vektorov

-30(napr. adenovírusových, retrovírusových). Výhodne je uvedenou bunkou bunka zárodočnej línie, embryotická bunka alebo bunka vajíčka alebo bunka od nej odvodená bunka, najvýhodnejšie je uvedenou bunkou kmeňová bunka.

Ako je zrejmé z vyššie uvedeného, výhodné je, aby bola pri použití podľa vynálezu nukleokyselinová sekvencia operatívne spojená s regulačnými elementárni umožňujúcimi expresiu a/alebo nasmerovanie MDR-1 proteínu do špecifických buniek. Vhodné génové dodávacie systémy, ktoré môžu byť využité v súlade s vynálezom, môžu zahŕňať lipozómy, receptorom sprostredkované dodávacie systémy, nahú DNA a vírusové vektory, ako napríklad herpes vírusy, retrovírusy, adenovírusy a adeno-asociované vírusy, okrem iných. Dodanie nukleových kyselín na špecifické miesto tela na génovú terapiu sa môže uskutočniť aj použitím biolistického dodávacieho systému, ktorý opisuje napr. Williams (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726-2729). Pre priemerného odborníka v oblasti molekulárnej biológie sú dobre známe štandardné metódy na transfekovanie buniek s rekombinantnou DNA, pozri napr. WO 94/29469; pozri aj vyššie. Génová terapia sa môže uskutočňovať priamym podávaním rekombinantnej DNA molekuly alebo vektora podľa vynálezu pacientovi, alebo transfekovaním buniek polynukleotidom alebo vektorom podľa vynálezu ex vivo a infúznym podaním transfekovaných buniek pacientovi.

Vo výhodnom uskutočnení použití a spôsobov podľa vynálezu je uvedenou poruchou rakovina alebo nervová, CNA alebo kardiovaskulárna choroba.

Ako je ukázané v príkladoch 6 a 8, polymorfizmy identifikované v súlade s predloženým vynálezom, najmä jednonukleotidový polymorfizmus (SNP) C3435T v exóne 26 MDR-1 génu, sú užitočné ako farmakogenetický faktor, ktorý umožňuje predpovedať hladiny rôznych MDR-1 substrátov a induktorov v krvi na zlepšenie bezpečnosti a účinnosti liečiva, tzn. na predpovedanie a predchádzanie vedľajším účinkom a interakciám liečiv a na zvýšenie pacientovej harmónie. Takýmito substrátmi a induktormi sú napríklad protikŕčové/protiepileptické liečivá, ako Fenytoín; kardiatické glykozidy, ako Digoxín; imunosupresívne liečivá, ako Cyklosporín A a FK506; makrolidové antibiotiká, ako Klaritromycín a Erytromycín; a makrocyklické antibiotiká, ako Rifampín. Takže predložený vynález sa týka aj

-31 použitia vyššie opísaných SNPs ako farmakogenetického faktora v súlade s vyššie uvedeným. Výhodne je polymorfizmus SNP v MDR-1 exóne 26 (C3435T), buď sám, alebo spolu s akýmkoľvek iným z vyššie opísaných SNP.

Ďalšie aplikácie polymorfizmov identifikovaných podľa predloženého vynálezu a prostriedkov a spôsobov, ktoré môžu byť použité v súlade s vyššie opísanými uskutočneniami, je možné nájsť v doterajšom stave techniky, ako je opísané napríklad v US-A 5856104, pričom tam opísané prostriedky a spôsoby na súdne testovanie, paternitné testovanie, korelovanie polymorfizmov s fenotypovými znakmi, genetické mapovanie fenotypových znakov, atď. môže byť rovnako aplikované v súlade s predloženým vynálezom.

Tieto a iné uskutočnenia sú opísané alebo sú zrejmé z opisu a príkladov predloženého vynálezu a sú nimi zahrnuté. Ďalšiu literatúru týkajúcu sa ktoréhokoľvek zo spôsobov, použití a zlúčenín na využitie podľa predloženého vynálezu je možné vyhľadať vo verejných knižniciach napríklad použitím elektronických zariadení. Využitá môže byť napríklad verejná databáza Medline, ktorá je dostupná na Internete, napríklad na adrese http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PuMed/medline.html. Ďalšie databázy a adresy, ako napríklad http://www.ncbi.nl.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/, sú pre priemerného odborníka v danej oblasti techniky známe a je možné ich získať napr. použitím http://www.lycos.com. Prehľad patentových informácií v biotechnológii a relevantných zdrojov patentových informácií užitočných na retrospektívne vyhľadávanie a na priebežné oboznamovanie sa nachádza v Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

Farmaceutické a diagnostické prostriedky, použitia, spôsoby podľa vynálezu môžu byť použité na diagnostiku a liečbu všetkých druhov doteraz neznámych ochorení, ktoré sa týkajú, alebo sú závislé na variantných MDR-1 génoch. Prostriedky, spôsoby a použitia podľa predloženého vynálezu môžu byť želateľne využité u ľudí, hoci aj liečba živočíchov je zahrnutá tu opísanými spôsobmi a použitiami.

-32Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1: Gél vybraných PCR fragmentov pred a po purifikácii. Agarózová (Appli Chem, Darmstadt) gólová elektroforéza (1,5% agarózový gél) MDR-1 PCR fragmentov pred (A) a po (B) purifikačnom kroku. M: markery molekulovej hmotnosti; 1 až 28: PCR fragmenty obsahujúce sekvencie exónov 1 až 28 ľudského MDR-1 génu vrátane relevantných sekvencii, ktoré ohraničujú tieto exóny.

Obrázok 2: Príklady homozygotných a heterozygotných MDR-1 aliel. Sekvencie PCR fragmentov obsahujúcich sekvencie exónov 1 až 28 ľudského MDR-1 génu vrátane relevantných sekvencii, ktoré ohraničujú tieto exóny, sa determinovali automatizovaným sekvenovaním použitím ABI Dyeterminator techník. Heterozygotné a homozygotné odchýlky od zverejnenej MDR-1 sekvencie je možné detegovať priamo v DNA sekvenčných profiloch.

Obrázok 3: Príklady diagnostiky homozygotných a heterozygotných MDR-1 aliel. Agarózová (AppliChem, Darmstadt) elektroforéza (1,5% agarózový gél) alelických špecifických PCR fragmentov exónu 2 (261 bp) a exónu 5 (180 bp).

Obrázok 4: Koreiovanie SNP v exóne 26 s expresiou MDR-1 v neindukovaných podmienkach. Western blot analýzami sa stanovovali MDR-1 fenotypy (expresia a aktivita) 21 dobrovoľníkov a pacientov. Stĺpcový graf ukazuje distribúciu MDR-1 expresie sformovanú do klastrov v súlade s MDR-1 genotypom v relevantnom SNP v exóne 26. Hodnota významnosti genotypovo-fenotypovej korelácie je p = 0,056 (n = 21).

Obrázok 5: Koreiovanie MDR-1 genotypu s in vivo príjmom digoxínu. MDR-1 genotyp v exóne 26 sa analyzoval u 14 zdravých dobrovoľníkov, ktorí sa podieľali na klinickej štúdii určujúcej krvné hladiny digoxínu v stabilných podmienkach (Johne a ďalší (1999), Clin. Pharmacol. Thr. 66, 338-345). Zistil sa štatisticky významný rozdiel (p = 0,006; Mann Whitney U 2 vzorkový test) pri porovnávaní maximálnych koncentrácií (C_max) digoxínu medzi dvoma skupinami 7 zdravých dobrovoľníkov majúcich buď T/T, alebo C/C genotyp. Hodnota priemerného rozdielu v C_max, 38 %, môže odrážať dôležitosť genotypu pre absorpciu digoxínu po orálnej aplikácii. Aplikovaná bola dávka 0,25 mg pri stabilnom stave digoxínu.

-33Vynález bude teraz opísaný s odvolaním sa na nasledujúce biologické príklady, ktoré sú len ilustratívne a nepredstavujú obmedzenie rozsahu predloženého vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Izolácia genomickej DNA z ľudskej krvi, generovanie a purifikácia MDR-1 fragmentov

Genomická DNA sa získala štandardnými technikami iónovej výmennej chromatografie (Quiagen kity na izoláciu genomickej DNA z krvi). Krv od všetkých jednotlivcov, ktorí boli testovaní (dobrovoľníci z oddelenia farmakológie na Charitee Berlín), sa získali berúc do úvahy všetky právne, etické a medicínske a byrokratické požiadavky Charitee kliniky v Berlíne, Nemecku.

Na získanie definovaných DNA fragmentov obsahujúcich špecifické časti ľudského MDR-1 génu prostredníctvom polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) sa aplikovali špecifické oligonukleotidové primery, 2 pre každý fragment. Tieto špecifické oligonukleotidové primery boli navrhnuté tak, aby sa viazali na sekvencie proti smeru expresie (upstream) a v smere expresie (downstream) rôznych exónov MDR-1 génu. Výsledné DNA fragmenty museli kódovať nie len exónové sekvencie, ale aj určité intrónové sekvencie na hraniciach medzi exónom a intrónom. O takýchto intrónových sekvenciách v blízkosti exónov je známe, že sú dôležité pre správne spracovanie a následnú expresiu proteín kódujúcej mRNA, čo je proces známy ako zostrih (splicing). Oligonukleotidové primerové páry boli optimalizované pre každý z 28 exónov ľudského MDR-1 génu, syntetizované a purifikované afinitnou chromatografiou (OPC kartridže). Sekvencie všetkých primérov sú uvedené v tabuľke 1.

Polymerázové reťazové reakcie sa uskutočňovali v podmienkach, ktoré boli optimalizované pre každý z fragmentov, ktoré pokrývali 28 exónov ľudského MDR-1 génu, ako aj oblasť jadra promótora a oblasť zosilňovača. PCR sa pre všetky exóny

-34uskutočňovali v reakčnom objeme 25 μΙ. 50 ng DNA templátu sa pridávalo do štandardného PCR tlmivého roztoku obsahujúceho 1,5mM MgCI₂ (Quiagen, Hilden) 50μΜ dNTP’s (Quiagen, Hilden), 25 pM každého primera (Metabion, Mníchov) a 0,625 U Taq polymerázy (Quiagen, Hilden). Všetky PCR sa uskutočňovali na Perkin Elmer termocykleri (model 9700) s počiatočným denaturačným krokom trvajúcim 2 minúty pri 94 °C a 36 amplifikačnými cyklami s denaturáciou pri 94 °C 45 sekúnd, 45 sekundovou aneláciou primeru, pričom teplota závisela na teplote topenia primeru (PCR podmienky: A až H), a 45 sekundami pri 72 °C, nasledovalo finálne predlžovanie pri 72 °C trvajúce 5 minút. Nasledujúce anelačné teploty A až H boli aplikované pre jednotlivé PCR podmienky: A: 53 °C; B: 56 °C; C: 55 °C; D: 57,5 °C; E: 58 °C; F: 59 °C; G: 54 °C; H: 60 °C.

PCR sa pre všetky fragmenty (promótorové a zosilňovačové) uskutočňovali v reakčnom objeme 50 μΙ. 50 ng templátovej DNA (výnimky: 100 ng promótorových fragmentov 1 až 3) sa pridávala do štandardného PCR tlmivého roztoku obsahujúceho 1,5mM MgCI₂ (Quiagen, Hilden), 200μΜ dNTP’s (Quiagen, Hilden), 30 pM každého primera (Metabion, Mníchov; výnimka: 20 pM pre fragment zosilňovača 1) a 1 U Taq polymerázy (Quiagen, Hilden). Všetky PCR sa uskutočňovali na Perkin Elmer termocykleri (model 9700) s počiatočným denaturačným krokom trvajúcim 3 minúty pri 94 °C a rozličnými amplifikačnými cyklami (30 pre promótorové fragmenty 2 a 4 a zosilňovačový fragment 1; 31 pre promótorový fragment 3; 32 pre promótorový fragment 1 a zosilňovačový fragment 2) s denaturáciou pri 94 °C trvajúcou 30 sekúnd, anelovaním primeru trvajúcim 30 sekúnd a pri teplote závislej na teplote topenia primeru (PCR podmienky: A a B), a 30 sekundami pri 72 °C, po ktorých nasledovalo finálne predlžovanie pri 72 °C trvajúce 2 minúty. Pre jednotlivé PCR podmienky A a B boli aplikované nasledujúce anelačné teploty: A: 58 °C; B: 56 °C.

Optimalizované PCR podmienky a výsledná veľkosť požadovaných a získaných fragmentov sú uvedené v tabuľke 1. Príklady výsledných fragmentov MDR-1 génu, ktoré boli použité na ďalšiu analýzu individuálneho genotypu, sú prezentované na obrázku 1.

-35Definované DNA fragmenty obsahujúce špecifické časti ľudského MDR-1 génu, exónové sekvencie, ako aj niektoré intrónové sekvencie na hraniciach exónov a intrónov sa spracovali, aby sa odstránili nezačlenené nukleotidy a zložky tlmivého roztoku, ktoré by inak mohli interferovať s následnou determináciou individuálneho MDR-1 genotypu priamym sekvenovaním DNA. Na túto purifikáciu boli použité štandardné techniky iónovej výmennej chromatografie (Quiagen kity na PCR purifikáciu). Pre všetky tieto fragmenty sa získali dostatočné výťažky purifikovaných fragmentov vhodných na priame sekvenčné analýzy DNA. Príklady purifikovaných MDR-1 génových fragmentov, ktoré boli použité na priamu sekvenčnú analýzu individuálneho MDR-1 genotypu, sú prezentované na obrázku 1.

Príklad 2

Identifikácia rôznych aliel MDR-1 génu determinovaním sekvencie v rôznych jedincoch

Na sekvenčnú analýzu relevantných oblastí ľudského MDR-1 génu z mnohých rozličných jedincov sa uskutočňovala PCR amplifikácia relevantných oblastí MDR-1 génu (pozri tabuľka 1) a purifikované PCR produkty sa následne sekvenovali zavedenými metódami (ABI dyeterminátorové cyklické sekvenovanie). Veľmi dôležitým parametrom, ktorý bolo potrebné brať do úvahy pri používaní tohto prístupu, bolo, že každý normálny ľudský jedinec nesie dve kópie MDR-1 génu. Kvôli tejto diploidite (autozomálnych génov, a MDR-1 je kódovaný autozomálne) sa musela venovať veľká pozornosť hodnoteniu sekvencií, aby bolo možné jednoznačne identifikovať nie len odchýlky homozygotnej sekvencie, ale aj heterozygotné odchýlky. Preto sa nikdy nespoliehalo len na jednu determinovanú sekvenciu, ale vždy sa získali aspoň dve sekvencie z každého definovaného MDR1 génového fragmentu z každého jedinca tým, že sa sekvenovali obe protiľahlé DNA reťazce.

Na prvotné hodnotenie MDR-1 odchýlok v ľudskej populácii sa uskutočnila sekvenčná analýza relevantných oblastí, vrátane všetkých exónov, ľudského MDR1 génu z genomickej DNA 24 rozličných jedincov. Tento počet individuálnych

-36vzoriek sa potom pre vybrané MDR-1 génové fragmenty rozšíril, pričom niektoré fragmenty boli analyzované zo 127 jedincov. V celej tejto práci sa sekvencie manuálne skúmali z hľadiska výskytu DNA sekvencii, ktoré sa líšili od zverejnených MDR-1 sekvencii, ktoré boli považované za sekvencie divého typu. Keďže populačná genetika umožňuje vypočítanie očakávanej frekvencie homozygotných vs. heterozygotných aliel definovaného génu (Hardy Weinbergov vzorec, pe² + 2pq + qe²= 1), bolo možné potvrdiť predpokladanú (na základe tohto vzorca) distribúciu homozygotných vs. heterozygotných aliel a odchýlok s experimentálnymi číslami. To slúži ako vnútorná kontrola a potvrdenie toho, že detegovaná sekvenčná odchýlka skutočne predstavuje novú alelu.

Použitím tohto prístupu, ktorý je znázornený na obrázku 2, sa objavilo a experimentálne potvrdilo niekoľko nových MDR-1 sekvenčných odchýlok. Osem polymorfizmov sa nachádza v intrónových sekvenciách v blízkosti ohraničenia exónov 5, 6, 12 a 17 (sekv. č.: 91, 154 a 160 pre exón 5), (sekv. č.: 101 a 166 pre exón 6), (sekv. č.: 116 pre exón 12) a (sekv. č.: 119 a 172 pre exón 17). Sedem polymorfizmov sa našlo v kódujúcej oblasti, po 2 v exónoch 2 a 26 a po jednom v exónoch 5, 11 a 12 a jeden v nekódujúcom exóne 1 (sekv. č.: 79 a 85 (pre exón 2), 122 a 178 (pre exón 26), 97 (pre exón 5), 106 (pre exón 11), 112 (pre exón 12) a 73 (pre exón 1). Tri odchýlky vedú k zmenám aminokyselinovej sekvencie MDR-1 proteínu (sekv. č.: 85 (pre N21D), 97 (pre F103S) a 106 (pre S400N)). Ich zmeny budú meniť MDR proteín. Jedna zmena, ktorá nemení proteín, je umiestnená priamo pred ATG translačným štartovacím kodónom (sekv. č.: 79). Je dobre známe, že táto poloha je veľmi dôležitá pre úroveň expresie proteínov prostredníctvom riadenia účinnosti translácie. Ďalšie polymorfizmy nemenia aminokyselinové zloženie MDR-1, ale sú stále užitočnými nástrojmi na MDR-1 genotyping, pretože každá z týchto odchýlok definuje novú MDR-1 alelu. Je známe, že expresia MDR-1 je medzi rôznymi jedincami značne rozdielna a jedným veľmi pravdepodobným vysvetlením tejto variability v úrovniach expresie sú alelické rozdiely priamo v oblasti MDR-1 génu alebo v oblastiach, ktoré ho obklopujú. Takže všetky nové a definované MDR-1 alely slúžia ako markery na determináciu MDR-1 génového statusu pacientov. Dôležitosť tohto MDR-1 genotypingu pre diagnostiku a terapiu

-37ochorení je pre odborníkov v oblasti dobre známa a podrobne bola vysvetlená aj vyššie v úvodnej kapitole.

Presné polohy a ďalšie podrobnosti o nových MDR-1 alelách, vrátane ich presnej sekvencie a sekvenčných odchýlok a homozygotnej vs. heterozygotnej distribúcie alely v populácii, sú uvedené v tabuľke 2. Očakávaná frekvencia homozygotov variantnej alely sa vypočítala na základe Hardy-Weinbergovej distribúcie. Odlišná báza je v sekvencii vytlačená tučné a je podčiarknutá. Obrázok 2 znázorňuje príklady zistenia a objavenia nových variantov v DNA vzorkách z homozygotných alebo heterozygotných jedincov.

Príklad 3

Spôsoby na špecifickú detekciu a diagnostiku MDR-1 aliel

Spôsoby na detekciu rôznych MDR-1 aliel, ktoré boli identifikované, využívajú charakteristický princíp, ktorým môžu byť špecifické sekvenčné rozdiely translatované do reakčných činidiel na rozlíšenie aliel. Tieto reakčné činidlá poskytujú nevyhnutnú kostru na vývoj diagnostických testov. Príklady takýchto reakčných činidiel zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na oligonukleotidy, ktoré sa líšia od MDR-1 sekvencie divého typu novo identifikovanou substitúciou. Často tieto charakteristické princípy diagnostických testov na determináciu individuálneho MDR-1 génového stavu zahŕňajú, ale nie sú obmedzené na rozdiely v účinnostiach hybridizácie takýchto reakčných činidiel s rôznymi MDR-1 allelami. Okrem toho je možné aplikovať rozdiely v účinnosti takýchto reakčných činidiel v enzymatických reakciách alebo rozdiely v účinnosti takýchto reakčných činidiel ako rozličných substrátov pre enzymatické reakcie, napr. reakcie ligáz alebo polymeráz alebo reštrikčných enzýmov. Pre odborníkov v oblasti sú princípy týchto testov dobre známe. Príkladmi sú PCR a LCR techniky, čipové hybridizácie alebo MALDI-TOF analýzy. Takéto techniky sú opísané v doterajšom stave techniky, napr. PCR technika: Newton, (1994) PCR, BIOS Scientific Publishers, Oxford; LCR technika: Shimer. Ligase Chain reaction. Methods Mol. Biol. 46 (1995), 269-278; čipová hybridizácia: Ramsay, DNA chips: State-of-the art. Náture Biotechnology 16 (1998),

-3840-44; a MALDI-TOF analýza: Ross, High level multiplex genotyping by MALDITOF mass spectrometry, Náture Biotechnology 16 (1998), 1347-1351. Iné princípy testov sú založené na aplikácii reakčných činidiel, ktoré špecificky rozoznávajú MDR-1 variant vo forme translatovaného exprimovaného proteínu. Príkladmi sú alelovo špecifické protilátky, peptidy, substrátové analógy, inhibítory alebo iné látky ktoré sa viažu na (a v niektorých prípadoch môžu aj modifikovať účinok) rôzne MDR-1 proteínové formy, ktoré sú kódované novými MDR-1 alelami. Tu prezentované príklady na demonštrovanie princípov diagnostických testov s reakčnými činidlami odvodenými od nových nukleotidových substitúcií definovaných touto prihláškou sú založené na PCR metódach. Je zrejmé, že aj ktorákoľvek z iných metód bude funkčná na diferenciáciu MDR-1 aliel aplikovaním opísaných špecifických reakčných činidiel.

Príklad 4

Diagnostika MDR-1 aliel špecifickou PCR

Alelovo špecifická PCR je technika dobre známa odborníkom v oblasti, ktorá umožňuje diferenciáciu aliel génov aplikáciou polymerázovej reťazovej reakcie s reakčnými činidlami (kombináciami primerov), ktoré sú špecificky navrhnuté na detekciu jednotlivých alelových sekvencii. Hlavnou zložkou takýchto testov, a jediným reakčným činidlom, ktoré poskytuje takýmto testom špecifickú, sú oligonukleotidy, ktoré sú navrhnuté tak, aby obsahovali sekvencie, ktoré špecificky rozlišujú odlišné alely génov.

V tomto príklade boli navrhnuté špecifické oligonukleotidy, ktoré môžu rozlišovať rôzne MDR-1 alely vďaka ich rozličnej hybridizačnej účinnosti pre rôzne alely a vďaka ich rôznej schopnosti slúžiť ako substráty pre enzymatické reakcie (v tomto príklade je enzýmom termostabilná polymeráza). V tabuľke 3 sú uvedené reakčné činidlá, ktoré boli špecificky navrhnuté a sú schopné detegovať prítomnosť a/alebo neprítomnosť novo definovaných mdr-1 aliel u jednotlivých ľudí, ako špecifické kombinácie primerov pre každú novú alelu. Návrh týchto reakčných činidiel je založený na novo objavených nukleotidových sekvenciách a bázových

-39substitúciách v ľudskom MDR-1 géne, ktoré sú prezentované v príklade 2 a uvedené v tabuľke 2 a znázornené na obrázku 2. Okrem návrhu špecifických reakčných činidiel potrebuje diagnostický test, ktorý je založený na princípe polymerázovej reťazovej reakcie, optimalizáciu testovacích podmienok, tzn. optimalizované PCR podmienky. Výsledok testu je v tomto prípade udávaný ako prítomnosť alebo neprítomnosť špecifických DNA fragmentov získaných použitím genomickej DNA od jednotlivých ľudí ako testovateľnej zložky (templátu). Príprava genomickej DNA z krvi jednotlivcov je opísaná v príklade 1.

PCR sa pre všetky fragmenty uskutočňovali v reakčnom objeme 20 μΙ. 50 ng DNA templátu sa pridávalo do štandardného PCR tlmivého roztoku (Quiagen, Hilden) obsahujúceho 1,5mM MgCI₂, 250μΜ dNTP’s (Quiagen, Hilden), 1 x Qroztok (Quiagen Hilden), 20 pM každého primera (Metabion, Mníchov; špecifický wt primer + spoločný primer a špecifický mut primer + spoločný primer) a 1 U Taq polymerázy (Quiagen, Hilden). Všetky PCR sa uskutočňovali na Perkin Elmer termocykleri (model 9700) s počiatočným denaturačným krokom trvajúcim 3 minúty pri 95 °C a 30 amplifikačnými cyklami s denaturáciou pri 94 °C trvajúcou 30 sekúnd, 30 sekundovou aneláciou priméru, pričom teplota závisela na teplote topenia priméru (PCR podmienky: A až E), a 30 sekundami pri 72 °C, nasledovalo finálne predlžovanie pri 72 °C trvajúce 8 minút. Nasledujúce anelačné teploty A až E boli aplikované pre jednotlivé PCR podmienky: A: 54 °C; B: 58 °C; C: 50 °C; D: 61 °C; E: 53 °C.

Odchyľujúca sa báza v zodpovedajúcej špecifickej primerovej sekvencii je podčiarknutá a vytlačená tučné. Prítomnosť alebo neprítomnosť špecifických DNA fragmentov v tomto teste vyjadruje prítomnosť alebo neprítomnosť testovanej alely.

Príklady takýchto odčítaní, ako výsledkov detekčnej diagnostiky MDR-1 aliel, sú znázornené na obrázku 3. Z týchto príkladov je zrejmé (tabuľka 3, obrázok 3), že tieto testy sú vhodné na rozlíšenie prítomnosti analyzovaných MDR-1 aliel u ľudí. Delegované môžu byť homozygotné, ako aj heterozygotné, časté, ako aj zriedkavé alely MDR-1 génu. Špecificita týchto testov sa opiera a úplne závisí len na špecifických oligonukleotidových reakčných činidlách, ktoré boli aplikované. Na

-40druhej strane bol návrh týchto reakčných činidiel závislý na sekvenčných informáciách objavených MDR-1 variantov a nových aliel, ktoré sú prezentované v príklade 2 a tabuľke 2.

Príklad 5

Diagnostika a korelovanie rôznych MDR-1 polymorfizmov s úrovňami expresie a in vivo aktivitou MDR-1 u pacientov

Na identifikáciu potenciálnych priamych korelácií MDR-1 polymorfizmov s klinicky relevantnými fenotypmi u ľudí sa účastníci štúdie na Dr. Margaréte FischerBosch Inštitúte pre klinickú farmakológiu v Študgarde podrobili stanovovaniu MDR-1 polymorfizmov v súlade s opisom v príkladoch 2 až 4. Hodnotili sa aj úrovne expresie MDR-1 v čreve a pečeni týchto pacientov zavedenou imunohistochemickou detekciou MDR-1 proteinu. V populácií účastníkov sa okrem meraní úrovní expresie MDR-1 v čreve uskutočňovali aj merania MDR-1 po indukcii génu rifampicínom. Stanovovala sa aj in vivo aktivita MDR-1 v neindukovaných a rifampicínom indukovaných podmienkach meraním krvných koncentrácií orálne podávaného digoxínu (1 mg), ktorý je známym MDR-1 substrátom, a ktorého koncentrácia v krvi je závislá aj na aktivite MDR-1 v čreve.

Výsledky MDR-1 meraní, rifampicínových indukčných experimentov a digoxínových experimentov, ako aj výsledky MDR-1 polymorfizmových detekčných analýz v populácií účastníkov dokazujú korelácie medzi expresiou MDR-1 génu, MDR-1 in vivo aktivitou a určitými polymorfizmami.

MDR-1 proteínové hladiny

Ako je uvedené v tabuľke 4, T/C polymorfizmus v polohe 176 v por. č.: M29445/J05168 v 26. exóne koreluje s expresnými hladinami MDR-1. Prítomnosť T alely v tejto polohe indikuje slabšie úrovne expresie MDR-1 v porovnaní so vzorkami, ktoré majú len zodpovedajúcu homozygotnú C alelu. Priemer rifampicínom indukovaných MDR-1 hladín v C alelovej populácii je oveľa vyšší ako priemer v T populácii (924 oproti 587 relatívnym jednotkám). V úplnom súlade s tým

-41 mali účastníci homozygotní v T alele najnižšiu detegovateľnú neindukovanú a indukovanú MDR-1 hladinu a účastníci homozygotní v C alele vykazovali najvyššiu hladinu zo všetkých testovaných účastníkov. Rozdiely v indukovaných MDR-1 expresných hladinách medzi týmito jednotlivcami boli 9 násobné.

MDR-1 in vivo aktivita

Tabuľka 5 uvádza výsledky meraní in vivo aktivity MDR-1 v neindukovaných a rifampicínom indukovaných podmienkach. To sa uskutočňovalo meraním krvných koncentrácií orálne podávaného digoxínu, ktorý je známym MDR-1 substrátom, a ktorého koncentrácia v krvi závisí aj na MDR-1 aktivite v čreve. V súlade s pozorovaním, že polymorfizmus v polohe 176 v por. č. M29445/J05168 v 26. exóne T/C koreluje s expresnými hladinami MDR-1, pozorovala sa aj korelácia tohto polymorfizmu s hladinami digoxínu v krvi, ktoré na druhej strane odrážajú in vivo aktivitu MDR-1 proteínu. Účastníci, ktorí majú T alelu (koreluje so slabšou MDR-1 expresiou, pozri tabuľku 4), obsahujú vyššie hladiny digoxínu v krvi v porovnaní so vzorkami, ktoré majú len zodpovedajúcu homozygotnú C alelu. Dôvodom je, že príjem MDR-1 substrátov, ako napríklad digoxínu, z čreva do krvi sa javí účinnejší u ľudí s nižšou expresiou MDR-1. To je úplne v súlade s funkciou MDR-1 v čreve, tzn. retransportom a vylučovaním substrátov z príjmajúcich buniek do lumenu čreva. Priemer neindukovanej, ako aj rifampicínom indukovanej digoxínovej koncentrácie v krvi (inverzne koreluje s aktivitou MDR-1) C alelickej populácie je konzistentne nižší ako priemer v T populácii (63,9 vs. 44,9 a 45 vs. 28,6 Dig AUC indukovaný). V úplnom súlade s tým mal účastník s homozygotnou T alelou najvyššiu detegovateľnú koncentráciu digoxínu v krvi po indukcii rifampicínom (57,3 Dig.AUC) a účastník homozygotný pre C alelu vykazoval najnižšiu hladinu zo všetkých účastníkov (12,3 Dig.AUC). Rozdiel v digoxínových krvných hladinách medzi týmito jednotlivcami bol viac ako 4-násobný.

MDR-1 v populácii pacientov

Výsledky našej analýzy korelácie MDR-1 expresných hladín, MDR-1 proteínovej aktivity a MDR-1 polymorfizmovej detekčnej analýzy sa ďalej potvrdili

-42analýzou MDR-1 expresie a MDR-1 genotypingom u rôznych pacientov z Dr. Margaréte Fischer-Bosch Inštitútu pre klinickú farmakológiu v Studgarte. Uskutočňovala sa imunohistológia na rôznych tkanivových vzorkách pacientov, najmä z čreva a pečene a tieto sa navzájom porovnávali, aby sa umožnilo relatívne porovnanie MDR-1 proteínu medzi týmito vzorkami. V každej sade experimentov sa vzorky pacientov rozdelili do skupín podľa intenzity farbenia MDR-1, tzn. 1. skupina sa rovná najvyššej MDR-1 intenzite a posledná skupina najnižšej MDR-1 intenzite.

Korelovanie tejto skupinovej analýzy s MDR-1 genotypom ukazuje, že T alela v polymorfizme v polohe 176 v por. č.: M29445/J05168 v exóne 26 koreluje s nižšou expresiou MDR-1 v porovnaní s pacientmi, ktorí nesú v tejto polohe homozygotnú C alelu. V tejto analýze vykazovali dva iné polymorfizmy určitú koreláciu s MDR-1 expresiou: homozygotný T genotyp v polohe 171466 v AC002457 (intrón 4) môže korelovať s vysokou expresiou a polymorfizmus (GA) v polohe 101 v exóne 11 (M29432/J05168) môže korelovať s nízkou expresiou.

Príklad 6

Hodnotenie genotypovej/fenotypovej korelácie polymorfizmu v exóne 26 (C3435T) s rozšíreným počtom vzoriek

Analyzovali sa ďalší dobrovoľníci v ďalšej experimentálnej štúdii v Dr. Margaréte Fischer-Bosch Inštitúte pre klinickú farmakológiu v Študgarte, aby sa podrobnejšie zhodnotila korelácia jednonukleotidového polymorfizmu (SNP) T/C v polohe 176 v por. č.: M29445/J05168, ktorý bol opísaný v predchádzajúcich príkladoch a teraz je označovaný aj ako MDR exón 26 SNP C3435T (poloha zodpovedá MDR-1 cDNA GenBank poradové č. AF016535, kodón TTC v exóne 10, F335, v tejto sekvencii chýba), s hladinami črevnej MDR-1 expresie (prvé výsledky sú uvedené v príklade 5). Expresné hladiny MDR-1 v čreve týchto dobrovoľníkov a pacientov sa stanovovali kvantitatívnou imunohistochémiou a Western blotmi biopsií a enterocytových prípravkov dvanástnika. Aby sa zaistilo to, že analýza bude odrážať špecifickú PGP expresiu v črevných enterocytoch, simultánne sa analyzoval ďalší markerový proteín, ktorý sa exprimuje v enterocytoch, vilín.

-43Výsledky tejto analýzy sú znázornené na obrázku 4. T/T genotyp je spojený s významne nižšími hladinami expresie MDR-1 v porovnaní s C/C genotypom. Jednotlivci s C/T genotypom vykazujú stredný fenotyp.

Na ďalšie hodnotenie korelácie MDR-1 genotypu s príjmom digoxínu črevom sa ďalší dobrovoľníci inej klinickej štúdie v Univerzitnom medicínskom centre Charite v Berlíne, u ktorých sa určovali krvného hladiny po orálnom podaní digoxínu (bez rifampicínovej indukcie a stanovovania PGP proteínu, Johne a ďalší (1999), Clin. Pharmacol. Thr. 66, 338-345), hodnotili z hľadiska ich MDR-1 genotypu v exóne 26. V tejto štúdii sa hodnotili maximálne plazmatické koncentrácie (C_max) počas stabilných digoxínových podmienok. Tento farmakokinetický parameter odhaľuje najmä rozdiely v absorpcii digoxínu medzi rozličnými skupinami. Obrázok 5 znázorňuje porovnanie digoxínového C_max 7 dobrovoľníkov nesúcich homozygotnú T/T alelu a 7 dobrovoľníkov s homozygotným C/C genotypom v exóne 26. Dobrovoľníci homozygotný pre T alelu vykazujú významne vyššie hladiny digoxínu v porovnaní s dobrovoľníkmi s C/C genotypom. Hodnota priemerného rozdielu 38 % v digoxínovom C_max medzi skupinami je štatisticky významná (p = 0,006, Mann Whitney U 2 vzorkový test) a odráža vplyv tohto polymorfizmu na digoxínové farmakokinetiky.

Príklad 7

Identifikácia nových MDR-1 polymorfizmov sekvenčnou analýzou veľkej skupiny rôznych jedincov

Rozšírený prieskum SNPs v ľudskom MDR-1 géne odhalil okrem rozličných novátorských MDR-1 polymorfizmov, množstvo ďalších nových polymorfizmov v MDR-1 géne, ktoré sú uvedené v tabuľke 8. V rámci nového skríningu sa počet jednotlivých vzoriek rozšíril pre všetky MDR-1 exóny, ako aj pre MDR-1 promótorové fragmenty, z ktorých niektoré boli analyzované až u 236 jednotlivcov.

Je možné, že okrem MDR-1 SNP v exóne 26 (C3435T), ktorý môže byť používaný na predpokladanie expresie PGP, môžu aj iné, zriedkavejšie polymorfizmy v oblastiach MDR-1 génu vplývať na expresiu. Napr. je veľmi

-44pravdepodobné, že promótorove polymorfizmy a SNP meniace protein majú dodatočný vplyv na expresiu a aktivitu MDR-1. Navyše, všetky tieto nové polymorfizmy môžu byť využívané na generovanie presného individuálneho MDR-1 genotypu, tzn. alelického zloženia, ktorý môže byť pre jednotlivcov unikátny, a tým veľmi užitočný na predpovedanie individuálnej liekovej odpovede závislej na MDR1.

Čím viac polymorfizmov bude známych v ľudskom MDR-1 géne, tým kompletnejší a tým užitočnejší bude opis individuálneho MDR-1 genotypu. Identifikácia týchto 32 nových MDR-1 polymorfizmov je ďalším dôležitým krokom smerom k dosiahnutiu cieľa, ktorým je stanovenie mnohých rozličných MDR-1 genotypov, ktoré predpovedajú výstup a vedľajšie účinky liekovej terapie.

Príklad 8

Determinácia MDR-1 polymorfizmu v exóne 26 (C3536T) ako farmakogenetického faktora, ktorý ovplyvňuje hladiny liečiv, v kombinácii s inými farmakogenetickými faktormi.

Protikŕčové liečivo Fenytoín je bežne používané na liečbu epilepsie, akútnej a chronickej supresie ventrikulárnych aritmií a pri digitálisovej intoxikácii. Úzky terapeutický rozsah s množstvom ťažkých vedľajších účinkov v kombinácii s nelineárnou farmakokinetikou (tzn. nadproporčné zvýšenie plazmatických hladín ako odpoveď na zvýšenie dávky) spôsobuje, že liečba Fenytoínom je náročná a veľmi sú žiaduce vhodné parametre na predpovedanie plazmatických hladín na základe danej dávky, aby sa zlepšil terapeutický výstup, a aby sa predchádzalo vedľajším účinkom.

Je známe, že polymorfné enzýmy 2C9 a 2C19 majú vplyv na metabolizmus Fenytoínu (Mamiya a ďalší 1998, Epilepsia Dec; 39(12): 1317-23), a ukázalo sa, že 2C9 defekty môžu viesť k abnormálnym krvným hladinám, ktoré môžu spôsobovať vedľajšie účinky alebo neúčinnosť liečiva (Aynacioglu a ďalší 1999, Br. J. Clin. Pharmacol. Sep; 48(3): 409-415). Avšak je tiež zrejmé, že 2C9 genotyping neumožňuje presné predpovedanie krvnej hladiny na základe danej dávky. Aj u

-452C9 genotypovaných jedincov, kompenzovaných zodpovedajúcim enzýmovým fenotypom, významne varírovali krvné hladiny.

Tabuľka 6 ukazuje, že MDR-1 SNP v exóne 26 (C3435T) hrá, okrem 2C9, jasnú úlohu vo fenytoínových krvných hladinách, a MDR-1 genotyping pre tento SNP umožňuje presnejšie korelovanie medzi fenytoínovou dávkou, genotypom a krvnými hladinami.

V rámci 2C9/19 enzýmových genotypových skupín môžu byť odchýlky hladín vysvetlené MDR-1 genotypom, najmä v skupine 2C9/19 slabých metabolizátorov, ktorí už vykazujú zvýšené krvné hladiny. Tu je MDR-1 genotyping schopný identifikovať podskupinu pacientov, u ktorých je zvýšené riziko, že budú vykazovať výnimočne vysoké krvné hladiny fenytoínu: Slabí metabolizátori, ktorý majú MDR-1 T/T genotyp. U týchto pacientov je zvýšené riziko, že budú čeliť nežiadúcim účinkom liečiva súvisiacim s predávkovaním. Napríklad v skupine 100 pacientov, ktorí dostávali fenytoín, vykazoval 2C9 deficientný pacient s nízkym PGP (T/T genotyp) najvyššiu koncentráciu v krvi, ktorá bola približne dvojnásobne zvýšená v porovnaní s normálnou populáciou. Korelácia medzi Cyp 2C9 genotypom a plazmatickými hladinami fenytoínu je štatisticky významná, ale významnosť sa zvyšuje, keď sa berie do úvahy MDR-1 T/T genotyp ako kovariant (p < 0,001, ANCOVA).

Tabuľka 6

Závislosť hladín fenytoínu na farmakogenetických komponentoch

MDR-1 genotyp	CCaCT	TT
črevné PGP	vysoká/stredná	nízka
Hladiny fenytoínu v krvi
2C9 metabolizátori	normálne	normálne
2C9 slabí a/alebo deficientní metabolizátori	vysoké	veľmi vysoké

Tabuľka 1

Veľkosť fragmentu i	Exóny: pre exóny 1 až 7: (poradie: AC002457)	572 bp	347 bp	385 bp	422 bp	353 pb	442 bp	390 bp	pre exóny 8 až 28: (poradie AC005068)	391 bp	406 bp
PCR podmienky	LU	ϋ	Q	D	O	LU	LU	O	<
Sekvencia primera	Priamy: 5’ CCC TTA ACT ACG TCC TGT AG 3’ Reverzný: 5’ GAG GAC TTC ACA CTA TCC AC 3'	Priamy: 5’ TCT TAC TGC TCT CTG GGC TTC 3’ Reverzný: 5’ CTC AGC CAA CAA ACT TCT GC 3’	Priamy: 5’ CAC TCA GTG ATA ACC ACG TA 3' Reverzný: 5’ GCA TCT CCA TTA ACA TAC CC 3'	Priamy: 5' GGG TGT CTT GGA CTA GGT TG 3’ Reverzný: 5' TGC CTC CTA CAG GAC TAA AC 3’	Priamy: 5’ CAC ACA GTC AGC AGA GAA GT 3' Reverzný: 5’ ACT ATC AAG AGT ATT GTT CTC C 3’	Priamy: 5’ GGA ATG AGT GGT CTC TTT GG 3’ Reverzný: 5' AAG GCA CTG GGA ACA AAA GG 3'	Priamy: 5’ TCC TAG TAG AAA CTT CTA CCC 3’ Reverzný: 5’ TTC CGT AGG GTG AGA GCA G 3’	Priamy: 5’ CAG ATT TTG CTC TAC ACA TGC 3’ Reverzný: 5’ ATT AGT TAT GCT GTA ATA CAT CC 3’	Priamy: 5’ CAT GTA TAT CAC AGG ACT GAA C 3'
Pozícia PCR primera	140510-140529 141081 - 141062	141423- 141442 141770- 141751	145681 - 145700 146066 - 146047	155899- 155918 156320- 156301	171308- 171327 171660- 171639	174661 - 174680 175102- 175083	175322-175342 175711 -175693	95327 - 95307 94937 - 94959	87858 - 87837
Označenie PCR fragm.	ex. 1	ex. 2	ex. 3	ex. 4	ex. 5	ex. 6	ex. 7	ex. 8	ex. 9

-47 CO

O í

O

ΙΟ

H

Q <:

$ o

o o

í o

í o

Co ·>.

c

Ľ

Φ >

Φ a:

r*

N.

CO

LO hoo

CL

Π

CM

CM co

O ” < O o

E 5 o 5

S o

<

o

H o

<

o <

o <

o

H· o

<

<

m in ·>.

> Ľ E φ

S? •c Φ CL <X ▼- o CO 00 00 xr ’M· 00 oo

T“ O 00 CO 00 Xt oo

CL n

co

CM

CM co čo o <

< υ < 2 o >o < Q 2 in

CO o

CO CM xt ’M· 00 oo

LO ''fr

Xŕ oo s

CL _Q

O

CO

CM in

CO

CO i

CO

OO

O>

CO o

CO σ>

σ>

co oo

CM

Q.

XI

ID os

CM o

CO σ>

co oo co

CM co

CO

CO

M·

CO

CO

CL

XI mCM

CO

CO

O

ΙΟ o

< o ^< 5 H A 0 ^H 0 O t

H o

H O t= t= ° 1= 0 o . I- m n

E co ·>.

c

Ľ

Φ >

Φ

QĹ o

CO

M*

CO

CO tCO CO 00 00

CO CO CO 00 oo

Q.

.a

CD

OS tn

LO in

CO

O) hCO

CO

CO σ>

rQ.

XI

CD

O

CM co <

O <

<

CO

O <

O

O š

O ť δ

O 0 μ in in >> c > t! E φ ca > c Φ 0. QĹ

CM M^- ’í“

CO 00 00 hi i CO

CO CM OO CO OO 00 r- rCO

Q.

Q r—

CM

M^-

CQ

CO

O

Ž <

Š <

o

É <

CO O 0 μ <:

«: o

Š < o < o «: t < ? O m in >>.

i

E φ ro > •C m Q. CĹ

LO O 00 o 00 h* h* hI t h- ιΟ 00 CM N00 l·· r- rCL

JD

CO

CO co co čo o O £ □ 8 o § g o o o o

Č o L o

<

< in in >>.

>- ΰ E φ co >

_C Q)

CL QC

CM

CO m

CM

O

M*

IO hIO

CO

O m

ri in tjo m

r00

CL

XI os

CM

CO co

O

O

CO O 0 0 o o o O g <t <

O <

$ < o <

O 3 in §

<

o o

m >.

E co c

Ľ

Φ >

Φ

CĹ t- CO 00 O) cm σ> CO CM h- rI I

T- co O hCO O) CO CM r- N0>

CL

XJ

CO

O <

O

Š g

ŕ <

č o

£ <

«:

ío

E m

co '’t o

hCM

M·

O ho

CM

-48oo

Ο g

s š

«:

ο

Η* o

N*

LO

CM co ol

XI

ΙΌ

NCN

O ^ω o o I- o t °

E t 0 0 «: o o h t= t

O

Ho

E lo

Q.

.Ω

CN

ΓΓΟ

Q.

X5

CO

Q.

xi s

CQ

o.

X5 o

CO

CN

u.

Q.

X3

CM

Q.

X)

LO

Ν'

CL

X5

ΓNCN

CL

XJ

ΓΟΟ

Ν’

Q.

X)

Ν'

ΓΙΟ <

ŕ §

E

ΪΩ ·>, c Ľ

Φ £ Ž >>

E co

CO

T“ T^-

CO Tio m (O CO

CN 00 N 05 CO o LO LO CO CD

CN co

O co O ^a< š s š ž 5t o

8 H <

υ !ľ O ό ·>. C

Ľ

Φ QĹ

IO m

>.

E co r- Γιο CN co co N LO i

CO O LO N LO

S t

1^

CO s

IO

Ν’ co lo co co

Ν' co

LO oo

CO o

CO

IO

I

ΓN o

co

LO

CQ CQ CM ’rIO CM O O m m o>

o o IO IO

CN

CM

CO

CN

CO čo O < < u ^υ < o Q ^< í

o o δ g o o t h I- 0 < < o <· H < O 0

O t

LO >,

E co

H

Ĺo c

L!

ω ω

0Ĺ

CM CN N* LO CN O 05 05 t Μι CN CO CO CO CN O 05 05

Ν’ N^-

IO

CM

CO

CO Q < 0 O 0 t č t 0 t

O <

O <

t

O <

<: 0 g S 8 S

S 9

IO

CO ČO 0 0 H . o

E 8 g

č o

£

H ιό 0

E

O LO

O

E t

<

o š

CO CO 0

O Ιό t ° ^H < 0 o 0 < ^< 5

8 0 0 0 ICO

CO ž

I“ o

ČO « O 0 t 0

IO >.

E co >>» c

D φ

>

φ

OĹ

LO

E co >.

c

D φ

>

φ

OĹ

E <

H «:

ČO

E

CO <

g

E to ·>.

c

Ľ

Φ >

Φ

DĹ

CN

O

CO

CO

Ν’

CO

CM

CO

CO

N

O

O

T—

CO

N

I

O

OO o

co

N^- ·*- Ν’ Γ- CO 05 IO 05 05

CO CO

CN CO 05 NT 05 LO 05 05

CO CO co co co lo CN O co co co co

I I

IO CD CO CO CM O oo oo CO CO

CO

CN

X

Φ

ΓCM

CO

CM

ΓΙΟ

N

CM

O

O

Φ

TJ

CO

L.

O

CL c

Φ £

-Φ >

O

Ό

E o

H §

0 t=

H 0 Q 0

S 5 s '

0 ? t ¹⁰ ín

S s ·*- é t- CO

E E 2 2 CL Q.

CO CM Γ- CN 00 CO 00 05 co co

CO CM LO Ν' oo co 00 05

CO CO c

Φ

E

CO t= ó

<

O δ

I— % O 0 H ŕ 0 <í 0 § 0 I— 0 ΙΪΩ [q

CN IO E E 2 2 Q. ΟΝ- OO O CO co oo 05 05

CO CO

LO 00 00 LO CN 00 05 05

CO CO

CN

C

Φ

E

570 bp	592 bp	pre zosilňovačové fragmenty (poradie: M57451, J05674)	338 bp	416 bp
ω	<	<	<
Prom 4f (p): 5’ TTA TGG CTT TGA AGT ATG AGT TA 3' : Prom 6r (r): 5’ GCA TGC TTG ACA GTT TCT GAG 3’	Prom 6f (p): 5' CTC AGA AAC TGT CAA GCA TGC 3’ Prom 7r (r): 5’ TTG GAA CGG CCA CCA AGA C 3’	Enh 1f (p): 5’'CCC TTC TAA CCA TGG CCA G 3’ Enh 3r (r): 5’ GTG CCT CCT GTC AAT GGT G 3’	Enh 2f (p): 5’ CTA CTG AAA CCG CAG CAT G 3’ Enh 4r (r): 5’ TTG GAG ACA GTG ACT CAC C 3'
139809- 139831 140378 - 140358	140358 - 140378 140949 - 140931	1 -19 338 - 320	279 - 297 694 - 676
fragment 3	fragment 4	fragment 1	fragment 2

Tabuľka 2 ro o

c

Φ ž

Φ (Λ i

*-»

D

E o

Q

Φ ro *1*

E ro o

c φ

_s

Φ m

ro

Ό c

φ ž

ω ro '5 c

φ ž

ro o

f

E o

x:

CC >o
o		Q) L.
		Φ
c	>>	XJ
CC	Ό	c
□	k_ CC	Φ
E	I	$

o

CD

N

O

E o

-C >

o ·

§) p

Φ

JC >.

j* o

D

O >

o c

ro

D

E r·W

TT

CM

O

O o

<

Φ o

Q.

>N

CC α ^E r; ⁰⁵ O ro Q. 4= >»

C x

φ φ

o o < o < o o O o Či O Pl u % ? o o g § h O «: Q. Ľ <

o

ΙΟ h“ o 0 š

0 č č š g

H O

F ° E ° < o p 0

CL Ľ

TT

O hCO oo

O o

’t ro

E £ s o P o £ o 5

O Q p s

Ol O % £' 0 o p 0 t ^υ

O . s b P

Q. _Ľ <

t < £ č < O 0 Q g s šl ti o P¹ 0 5 o 8 o ť 9 <

s s >- á

Q. U <

t <

b 2 <

O ä

o

H §

t o

o <

o o

£ o

!<

o <

o t= sei s

.. Q o 3 5 o

3 č či Ľ <

t <

£ e < o o 3 £ 0 < O 0 o o P o 5 P o

S Č s š Γ Š «:

o g

o

CM

Io>

o co c\í o

io in o

co m

o oj in

CM

CM

O

Q. L· to to m·

2' o í £ č

O o ŕ ^υ £ ŕ' sl o 0 g s o

<

o ž

o

O <č

Q ŕ- ^υ t ^υ o 2 H* Ol O o g 2 < č Q 5 o s

Q. L· υ

o

H č H 0 p č 15 0 υ < k h

§ š

O 0 O o n

O <č o

O

Ιt p

o 0 o ·- <

H £ g O o p o o S?

1= < (D 0 § š

O £

O

É < o š

o o. Ľ o*

V

V

Ol v

OJ !o

T

ΓΙΟ o

I—

H0

O

J“

I i

$

O

OJ oí to co to fO oo to o

m l~a>

το to

k.

o

Q

OJ (0 to

É s £ H O 0 < 0 O 0 t &

l·— o

O to o—

Tŕ

V

S

CO

-52O tl č 2 < o O Ιο o o

É e ? E § < o

.. p H

Ή I“ <

CL U

O o

O š o θ I t o o H O

P, O t íl ol o o g¹ 0 9

O ž t o o t § ŕ č , O

O Š 9 θ ž 1= o o I- o P. θ n' <1 O 0 o 9 0 o l t= .. o o p?

I S g

E Q. Ľ

O <

O

S š

ol

ΙΟ <

o <

o

Σ3

E

O <

o ξ

<

o <

o <ť <

! š i B θ

O 0 0 n

9

O ž t 0 0 t š

O o <

o s

«:

o

H §

o s

o o

CM in

-p θ' co o

o in

CM~ 'S θ' •xt

V

-p θ'

CM to o

m o

o

O <

Φ

Ή o

CL

O co

CM

C •o x

Φ

Q.

CM

CO

O

IO

O o

Φ

T3

CO o

Q.

C

O x

Φ

Φ

wt/mut: r: ACAAAAATTA/TGTAAAGGAAT mut/mut: r: CAAAAATTTGTAAAGGAATA		0 0 0 «: 0 Ι- Ο t| ol <: «: 1 ? ϋ
r: CAAAAATTAGTAAAGGAATA		p: GAAGAGATCGTGAGGG
12,90%		sp ď*· s CM
12,50%		25%
45,83 %		54,16%
78170		CO h- X“
ex. 17		ex. 26

-53=3

E

E <

O

O

O s

a o

E o

δ < 0 £ I < o

P¹ s 1 < 5 0 o Či. Ľ

O

CM o

o

Q.

co

CO

CO

M >.

C •o x

Φ

Φ ιο

O hO

É o

H o

ol

H £

υ

I— i

?' «:

o < ~ 0 E ä s S 1

E

Ol (D| ⁰

F 5 δ £ 5 S

O o £ E o o í² E í? δ 0 t:| ol § 8 Q 0 £ 2 t o

E xť ď’t o

o“

M

V

-p or't

ΙΟ

E

O o <

s š o o cl l:

P 0

S E o o £ E 0 < H O 0 <, gl g s

S δ o s δ

O o Q. Ľ o

CM θ'

M

V co co oo

Č s

ΓCO

Q. U

8 0 o

2 δ p «Ί o í Š¹ É Č !< ϋ u sp <T '’fr

O o“ o**

Tŕ

V co o

o o

O <

TJ co

L_

O

Q.

C

O x

Φ

Φ

1_

Q.

o^ b* hb*

1^ x

mut: p: GGCTTGAAGGTGTAAGAAT r: ATTCTTACACCTTCAAGCC	Pre exón 26; (poradie M29445, J05168)	wt/mut: p: GAACATTGCC/TTATGGAGAC r; GTCTCCATAG/AGCAATGTTC mut; p: GAACATTGCTTATGGAGAC ' r: GTCTCCATAAGCAATGTTC
	p; GAACATTGCCTATGGAGAC r: GTCTCCATAGGCAATGTTC
	0,04 %
	<4%
	4,17%
	137
	ex. 26

ΙΌ

ΙΌ

Tabuľka 3

QĹ

Ο

Q.

α3 >

ω

Ε

L.

Ω.

C >ο ο

ο

ο.

<0

Ω.

ο ΐΞ ’ο

Φ

Ω.

«Λ

JZ

O

O

CL

Ε

Τ3

Ο

Q.

É cn π

Φ

Ε

L.

Ω.

'>»

C

C ω

E

Ž' o

4= o

Φ

Ω.

>« í

Xľ o

o o

bm xr

CM o

o

O <

φ

Ό ra o

Q.

>N (D

□i
	x:
QĹ	o Ό
O	O
Q.	ω

>s

C

O

X

Φ

Φ

LU

Ω.

X)

IO

Ω.

.Ω m

o

CM

CL n

co

CM

O <

Q δ

H δ

0‘

H

Co

CO čo s s t £ í š H Š Š § 0 < < f“ $

§ ? . IO m _· C*

0 < o σ> o CD

O čo Q H o O O o < 0 < < <2 < t ° δ t q 0 δ θ^υ δ in ?

w ω o O Q. CL ~ E

O Γ co (O CO CO CM CM ai <ó o o Q. Q.

oo o

co

CM

CO

O

IO

O

O

4”

Φ

TO o

Q.

C o

x

0)

Φ

CO E CO

S iU

B B < <f 0 0 0 o šš o 0 0 o < < in in í Ϊ

P 5

CO CO r- ι»

I I « w o o Q_ Q_

O

N00 hUJ

Pre exón 26: (poradie: M29445, J05168) ex?26 176 ⁿPos.3435Cr(wt): 5' CTC.CTT.TGC.TGC.CCT.CAC.G 3' Exon26f: 5'GATCTGTGAACT,CTT,GTT, TTCA 3' 195 bp

Pos.3435Tr (mut): 5' CTC,CTT,TGC,TGC,CCT,CAC,A 3’

-57Tabuľka 4

Vzorky	Koncentrácia PGP	MDR-1 genotyp
neindukovaní účastníci	55 39 276 376	T-alela (T/T a T/C) prítomná
neinduk. účastníci, priemer	212	v polohe 176
rifampicínom indukovaní	142	Por. č. M29445/J05168 v
účastníci	1085 520 601	exóne 26
rifampicínom indukovaní účastníci, priemer	587
neindukovaní účastníci	96 302 291
neinduk. účastníci, priemer	230	T-alela chýba (len C/C) v polohe 176
rifampicínom indukovaní	423	Por. č. M29445/J05168
účastníci	1264 1086
rifampicínom indukovaní účastníci, priemer	924
najnižšia rif-indukovaná aktivita	142,1	homozygotný T/T v polohe 176, Por. č. M29445/J05168
najvyššia rif-indukovaná aktivita	1264,9	homozygotný C/C v polohe 176, Por. č. M29445/J05168

-58Tabuľka 5

Vzorky	Kone. digoxínu v krvi	MDR-1 genotyp
neindukovaní účastníci	63.6 64.1 73.2 54.7	T-alela (T/T a T/C) prítomná
neinduk. účastníci, priemer	63,9	v polohe 176
rifampicínom indukovaní	57,3	Por. č. M29445/J05168
účastníci	39 45,8 37,7
rifampicínom indukovaní účastníci, priemer	45
neindukovaní účastníci	55,6 30,8 48,3
neinduk. účastníci, priemer	44,9	T-alela chýba (len C/C) v polohe 176
rifampicínom indukovaní	39,6	Por. č. M29445/J05168
účastníci	12,3 33,9
rifampicínom indukovaní účastníci, priemer	28,6
najvyššia rif-indukovaná aktivita	57,3	homozygotný T/T v polohe 176, Por. č. M29445/J05168
najnižšia rif-indukovaná aktivita	12,3	homozygotný C/C v polohe 176, Por. č. M29445/J05168

O

Tabuľka 8: Nové MDR-1 SNPs

CO ’υ c

Q) ž

0)

CO i

D

E o

Φ

CO *cS i

□

E co

Ό c

CD >

Φ

CO

	o
	O)
	ň'
>	O
Φ	E
u_	o
LL	xz

c

CO +·· □

E

CO

Ό c

Φ ž

Φ

CO ’o c

Φ >

Φ

CO

8> > n? | E | £ E >

o

8) čr o

L.

Q) *-*

Φ l' >.

x:

o σ

o

CĹ

O

Q.

E

O) (Q

Ό

L.

CO x

E⁵ φ

xí c

Φ rin

N

CN

O

O

O <

CD

X3

O

Q.

CO >N

CO

CO >.

c o

x <u

OJ

Ν’

MN

OJ

S¹

C

CD

E

O)

OJ .fc o

>

o s

E e

Q.

CL

CN

O <o o

O) co

Ol dl gl y t= í o < S

Q

o. l:

Q. U

O o* ď*“ cn co o

o>

CO

O)

CO

O)

CO cr*

CO

CN

CO ó'

CN

CN σ>

co o 2> vť co

-60ο ο

ο

Η

Ο

Ο <

Ο Ο 0

ΟΙ Ο ο οι ο < ο 2 < Γ Ο ο ο ο ο ο < ο I- ι—

ο. Ľ

Χ<

θ' θ' to in ro>

co

O

Q. >fc

ο < ο Ο ΙΟ ο < ο ο ο t ^υ < ο ί ο ΟΙ tl ο ol ο ο ο & ο Ρ ο

< ο ο ίο ο < ο ο ο t ^υ < Ο ο ο <1 ο ρ ι-ι ο ο ο t

CD *£ ο Ρ ο

Ο η Ο ο Ο Ρ § g gs

ΟΙ

Q. Ľ x:

σ' t—

V

Xí σ*

1^

CO co r^

CM co

C35 ro

Σ3

Ε e5

Ο ο < CD Ο 0 Ο ο ϋ Ľ

Ο < Ο Ο t ο P ο ο η ^υ < ο ο ο οι Ο ο οι ο ο ο &

ο ο Ο 0 < ο <1 <:

É ο s < 0 ο 0 ο ο ď Ľ

CM o' σ' l'o>

CM r>05

CO

ΤΟ

CO

CM

O

g. £

CM

Ô g> c ro CL ¢:

b š e

I § n ^o| 0 o O < b 0

F 0 0 < 0 0 0 0 o §' a í E

5 5 ž s r

CO

O

Tj00 d>

co

F o £ < O

8 (- o □I 0

- Ol

A

3I o x § 3 č t

E § s

F o s a § š a * s § 5 a ϋ Ľ

SP θ'»

CO

CO

T

CM

O

M·

CO o

co o t £ s 5 8

H O F o §' a § % £ 0 5 u Ε ϋ ľ

CL u o

Osi o

* s$ θ'* σ>

ιη <?

©*

O)

CM

O

CD

O

M^-

CO m

o ’M

O) co o

§. £

á č $ í t H δ ° P o ti 9, g š g í o <

< o

Q. ίCM

Ó“ ď»

IO ŕ

ο Η υ υ ο

8' ο ľJ

Ε

Ο

ΟΙ ο

ο ο

<

ο §

ο

Q. Ľ ο

o <

o o

o

Μι h

υ <

ο ο

ΙΟ ο

ΙΟ «:

o o

I— o

t, § £ š' O o 9 ^υ

M ^υ

O o p

H O O o

Q. U

CO o

o ó* o

σ>

M·

CO < ο ο h“ ο

Η ο

<

ο ο

ο ο

ο <

ο ο

ο ο

α. u

ο. c

Q. U x$ σ'* o* σ'»

CO co“

CO

Ο <

Ο ο

δ «:

ο ο

<

<

ο ο

<

ο <

«:

ο οι ο ο I“ ο Ο δ £ ο ο *- <

o < o o

ΙΟ

I o

< „ o o h“ o δ

H cn O fí O O ^H < Q. Ľ •M· σί o*·

CO

O

CM σ>

<o

O m

NCO <:

o

S'

mut: p: TCCTCTGAGGATGTGCAGT r: ACTGCACATCCACAGAGGA	Pre exóny 10 až 26: (poradie AC005068)	wt/mut: p: AAAATTGCTG/ATCACTATCT r: AGATAGTGAC/TAGCAATTTT mut: p: AAAATTGCTATCACTATCT r: AGATAGTGATAGCAATTTT	wt/mut: p: GAGCACAACA/GGTCCAGCTG r: CAGCTGGACT/CGTTGTGCTC mut: p: GAGCACAACGGTCCAGCTG r: CAGCTGGACCGTTGTGCTC	wt/mut: p: TGGGCAGACG/AGTGGCCCTG r: CAGGGCCACC/TGTCTGCCCA mut: p: TGGGCAGACAGTGGCCCTG r: CAGGGCCACTGTCTGCCCA
	p: AAAATTGCTGTCACTATCT r: AGATAGTGACAGCAATTTT	p: GAGCACAACAGTCCAGCTG r: CAGCTGGACTGTTGTGCTC I	p: TGGGCAGACGGTGGCCCTG r: CAGGGCCACCGTCTGCCCA
	23%	0,001 %	0,03 %*
	25% i I	<1 %	< 1 %*
	45,8 %	0,5 %	3,4 %*
	84701	84032	84074
	ex. 10	ex. 12	ex. 12

ο §1 ο

ΙΟ ο

ο ο

<

ο ο

<

t| ο

<

-65ο ω ο

Η

Ο Ο

ο. l:

o o f- < r- O P o <c <

o í

Ol o

o o

<

o o b

O H I- < O O $ O o o. Ľ >%« o^·

CO o

·<

o**

V» ď*

Tt

CO* cn

CM ί § « a g E θ ο Ο Η Ο Ο č 2

Ο ο ο

ο ο

ί ο

ο

5ι

Ο

ΙΟ ο

ϋ «Č ϋ

ο fcl ol ol ο ο b ω < Ρ θ $1 2. Ο ρ Ο ο £ Ρ ο č §^s s §

Q. Ľ

O

O

ΙΟ o

2' o

ΙΟ

E

.. o □ <

<	o		<
o	o		o
H	Ι-		H
5	Ο		3
	H	□
Q.	L·'	E	Q.

§ “ § § g g i š

8' a¹ p u § Í?

o o p h < o o o o. u

Q. U o**

CO o

o·

CM

Ó* •e o

s«

O**

V sp ď*

O co“ co bCD

CO

CM

CO oo“

CM to

CM

CO b* σ>

ď*· co“ b*

CO o

b*· o

CM

Q. Ľ < < t $ ϋ

O <

H o ď o <

i- o p <

č 2

.. υ 2 ·- P

E Q. Ľ

š S

1= § o o H O O '

O

O ti

É υ

o

Q. Ľ

Q O I— o O o o .a,

S'

-66O «:

i o

CN

CO o

ď*

Ν’

O ď

CM cn'

CN co

ΙΛ

CN

O hO

CM ď* í—

V d·» v

hCO*

Ncd

CN

Ν' >co

CN

O

N·

S

CN

O r^· o

o

CM

O

h.

O

CM

O

CM

Š § $ t §

O Q

Ϊ5 2

O o

S¹

S o o · B š

3^0 E Q. U

wt/mut: p: TGAATGTTCA/CGTGGCTCCG r: CGGAGCCACT/GGAACATTCA mut: p: TGAATGTTCCGTGGCTCCG r: CGGAGCCACGGAACATTCA	wt/mut: p: CGGGTGGTGT/ACACAGGAAG r: CTTCCTGTGA/TCACCACCCG mut: p: CGGGTGGTGACACAGGAAG r: CTTCCTGTGTCACCACCCG
p: TGAATGTTCAGTGGCTCCG r: CGGAGCCACTGAACATTCA	p: CGGGTGGTGTCACAGGAAG r: CTTCCTGTGACACCACCCG
0,001 %	0,001 %
< 1 %	<1 %
0,5 %	% s‘o
43263	43162
ex 26	ex. 26

ca

0.

Z w

I

QĹ

Q 'Φ >

O oo

Φ

Ί5 ro ro σ

c

Φ

O)

Φ ο

c

4c (C -♦—<

E

E

Q.

>

O

4^

O

CD >»

N

O

E o

ro o

c

Φ >

.X

Φ 'CC

C ro >

>ro .x.

ro >υ

O ro 'Φ

C i_ ro io

Ό

O

Q.

>,

N 'CC

XI 'Φ

C >ca o

‘3

CA

O .x

Φ

CA

Φ*

C >o c

Φ >

x:

Φ (A — > Zl\

Φ ro

-Φ c

♦j c

ro □

E ro

Q.

-b 'Φ >

T3 >.

Φ ro δ

'3 ’ČČ'

Ό

Φ >

O

Q.

Ό

O

N n

£ '>»

4= o

TJ o

Φ ‘ô '3

XJ ’C

MM

CA

T3 'Ôľ >

O

E>

φ

X3

C

Φ >,

Έ ro

I

Φ σ

ro

-x 'TO

N ro c

ro ro >

ro >o o

Q.

ro

CA

OÍ

Q

Φ c

>o 'Φ c

Φ >o ro

-Sí >. ro >

>

o c

ro >o φ

E ro

I ľ

ro φ

ô c

φ

Š

Φ

-68Zoznam sekvencii <110> EPIDAUROS Biotechnológie Aktiengesellschaft <120> Polymorfizmy v ludskom MDR-1 géne a ich použitie na diagnostické a terapeutické aplikácie <130> D 1875 PCT <140>

<141>

<160> 376 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 1 cccttaacta cgtcctgtag <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 2 gaggacttca cactatccac <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 3 tcttactgct ctctgggctt c <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická

-69<400> 4 ctcagccaac aaacttctgc <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 5 cactcagtga taaccacgta <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 6 gcatctccat taacataccc <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 7 gggtgtcttg gactaggttg <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 8 tgcctcctac aggactaaac <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 9

-70cacacagtca gcagagaagt <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 10 actatcaaga gtattgttct cc <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 11 ggaatgagtg gtctctttgg <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 12 aaggcactgg gaacaaaagg <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 13 tcctagtaga aacttctacc c <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 14 ttccgtaggg tgagagcag

-71 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 15 cagattttgc tctacacatg c <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 16 attagttatg ctgtaataca tcc <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 17 catgtatatc acaggactga ac <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 18 ctagtagtgc atatgtctgt ag <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 19 gtgacagaat gagaacctgt c syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická <210> 20

-72<211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 20 tggagagctg gataaagtga c <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 21 aaattgatct gttagaagcc aag <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 22 actaggttta aatatacatg cac <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 23 gaacagtcag ttcctatatc c <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 24 gggcaacatc agaaagatgt g <210> 25 <211> 21 <212> DNA syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická

-73<213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 25 cacatctttc tgatgttgcc c <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 26 aagggcaaag ggcaaggac <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 27 tgggttttct gtggtagaaa t <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 28 gttggtttga actaagcctc <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 29 aaatttctct ctctttaggc c <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia

-74<220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 30 ttctgaagtt aaactatacc tg <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 31 ttcttattta ttttagacag cag <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 32 gcatctccct tcataccag <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 33 cattgataag gaataaggat agg <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 34 cctatcacaa accagactgc <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická <22 0>

-75syntetická <223> Opis umelej sekvencie:

<400> 35 atttccagcg tactaaggct c <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 36 acttggctgt tagtagccat g <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 37 gtcacagaaa catagcaagc c <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 38 caacaaatat aggagctagg c <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 39 acatcctgag tactaaatgc ag <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická

-76<400> 40 aaagcatgtg atatattcgt agg <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 41 tttctctaat ttgttttgtt ttgc <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 42 tttagtttga ctcaccttcc c <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 43 ccttccagat ccataactca g <210> 44 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 44 taccttctag ccaaagtaat cc <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 45

-77aagtgtaaag tgaggaccaa ac <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 46 ttcatgaggc ttcacagtag g <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 47 ttcatgaggc ttcacagtag g <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 48 ttgaaaggaa tctatgatct agg <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 49 ttcttctcat tgcagaacac a <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 50 tgtgaaagtg tgctcaccac

-78<210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 51 gatctgtgaa ctcttgtttt ca <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 52 gaagagagac ttacattagg c <210> 53 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 53 catgaaccat tcttagcttc tg <210> 54 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 54 ttgtgtcatc tttactctcc tg <210> 55 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 55 atgtgattat ggaataggtt gtc syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická <210> 56

-79<211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 56 tatttaacat ctcatacagt cag <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 57 ccaaggactg ttgaaagtag c <210> 58 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 58 ttgcatatgc aagtgtacag c <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 59 cacagggttg ttgttaagcc <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 60 tctgaggatg tttccacttt c <210> 61 <211> 23

-80<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 61 ttatggcttt gaagtatgag tta <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 62 gcatgcttga cagtttctga g <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 63 ctcagaaact gtcaageatg c <210> 64 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 64 ttggaacggc caccaagac <210> 65 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 65 cccttctaac catggccag <210> 66 <211> 19 <212> DNA

-81 <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 66 gtgcctcctg tcaatggtg <210> 67 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 67 ctactgaaac cgcagcatg <210> 68 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 68 ttggagacag tgactcacc <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 69 gctcattcga gtagcggctc t <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> y = t alebo c <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 70 ctcattcgag yagcggctct t syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická <210> 71

82<211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 71 agagccgcta ctcgaatgag <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <22 0>

<223> r = a alebo b <400> 72 agagccgctr ctcgaatgag <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 73 ctcattcgag cagcggctct t <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 74 agagccgctg ctcgaatgag <210> 75 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 75 cttcaggtcg ggatggatct tga

-83<210> 76 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> x = a alebo g <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 76 cttcaggtcg gratggatct tga <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 77 caagatccat cccgacctga <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> y = c alebo t <400> 78 caagatccat yccgacctga <210> 79 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 79 cttcaggtcg gaatggatct tga <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

-84<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 80 caagatccat tccgacctga <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 81 aaaotgaaca ataaaaggta <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> r = a alebo g <400> 82 aaactgaacr ataaaaggta <210> 83 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 83 taccttttat tgttcagttt aa <210> 84 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> y = t alebo c <400> 84 taccttttat ygttcagttt aa syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická <210> 85

-85<211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<221> CDS <222> (1).. (18) <400> 85 aaa ctg aac gat aaa agt gc

Lys Leu Asn Asp Lys Ser 1 5 <210> 86 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 86 taccttttat cgttcagttt aa <210> 87 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 87 gacataaatg gtatgtttgt tt <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> k = g alebo t <400> 88 agacataaat gktatgtttg t <210> 89 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia

-86<22 0>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 89 aacaaacata ccatttatgt ct <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> m = a alebo c <400> 90 aacaaacata mcatttatgt c <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 91 agacataaat gttatgtttg t <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 92 aacaaacata acatttatgt c <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 93 gatacagggt tcttcatgaa t <210> 94 <211> 21 <212> DNA syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická

-87<213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> y = c alebo t <400> 94 gatacagggt ycttcatgaa t <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 95 attcatgaag aaccctgtat c <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g <400> 96 attcatgaag raccctgtat c <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<221> CDS <222> (1)..(21) <400> 97 gat aca ggg tcc ttc atg aat

Asp Thr Gly Ser Phe Met Asn 1 5 <210> 98 <211> 21 <212> DNA

88<213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 98 attcatgaag gaccctgtat c <210> 99 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 99 taagcagcaa caatgtcgtg tgc <210> 100 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> y = c alebo t <400> 100 taagcagcaa yaatgtcgtg tgc <210> 101 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 101 agcagcaata atgtcgtgt <210> 102 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 102 ttcacttcag ttacccatc syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická <210> 103

-89<211> 18 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g <400> 103 tcacttcart tacccatc <210> 104 <211> 18 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 104 atgggtaac gaagtgaa <210> 105 <211> 18 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> y = c alebo t <400> 105 atgggtaayt gaagtgaa <210> 106 <211> 18 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<221> CDS <222> (2) . . (16) <400> 106 t cac ttc aat tac cca tc His Phe Asn Tyr Pro

5 <210> 107

-90<211> 18 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 107 atgggtaatt gaagtgaa <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 108 cttgaagggc ctgaacctga <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> y = c alebo t <400> 109 tcttgaaggg yctgaacctg <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 110 caggttcagg cccttcaaga <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g

-91 <400> 111 tcaggttcag rcccttcaag a <210> 112 <211> 18 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 112 cttgaagggt ctgaacct <210> 113 <211> 17 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 113 ggttcagacc cttcaag <210> 114 <211> 17 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 114 tcagcagtca cattgca <210> 115 <211> 17 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> y = c alebo t <400> 115 cagcagtyac attgcac <210> 116 <211> 17 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

-92<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 116 cagcagttac attgcac <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 117 caaaaattag taaaggaata <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> w = a alebo t <400> 118 acaaaaattw gtaaaggaat <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 119 caaaaatttg taaaggaata <210> 120 <211> 16 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 120 gaagagatcg tgaggg <210> 121 <211> 17 <212> DNA <213> Umelá sekvencia

-93<220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> y = c alebo t <400> 121 gaagagatyg tgagggc <210> 122 <211> 17 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 122 aagagattgt gagggca <210> 123 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 123 ggtttctctt caggtcggg <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 124 cggtttctct tcaggtcgga <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 125 ctcagccaac aaacttctgc <210> 126 <211> 24 <212> DNA

-94<213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 126 gaaacaagct agttaccttt tatt <210> 127 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 127 aaacaagcta gttacctttt atc <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 128 tcttactgct ctctgggctt c <210> 129 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 129 gaccaccaca aaacaaacat ac <210> 130 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 130 gaccaccaca aaacaaacat aa <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia

-95<220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 131 cacacagtca gcagagaagt <210> 132 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 132 cttcctccag attcatgaag a <210> 133 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 133 cttcctccag attcatgaag g <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 134 cacacagtca gcagagaagt <210> 135 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 135 aaaaggatgc acacgacatt g <210> 136 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

-96<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 136 caaaaggatg cacacgacat ta <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 137 ggaatgagtg gtctctttgg <210> 138 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 138 gaattcagaa atgttcactt cag <210> 139 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 139 gaattcagaa atgttcactt caa <210> 140 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 140 actaggttta aatatacatg cac <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická <400> 141 cctggtagat cttgaagggc <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 142 cctggtagat cttgaagggt <210> 143 <211> 21 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 143 gggcaacatc agaaagatgt g <210> 144 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 144 aggataggat atattccttt act <210> 145 <211> 23 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 145 aggataggat atattccttt aca <210> 146 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 146

-98tgggcatcac acttacccc <210> 147 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 147 ctcctttgct gccctcacg <210> 148 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 148 ctcctttgct gccctcaca <210> 149 <211> 22 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 149 gatctgtgaa ctcttgtttt ca <210> 150 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 150 gactaaagag acataaatg <210> 151 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> s = g alebo c

-99<400> 151 gactaaagas acataaatg <210> 152 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 152 catttatgtc tctttagtc <210> 153 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <22 0>

<223> s = g alebo c <400> 153 catttatgts tctttagtc <210> 154 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 154 gactaaagac acataaatg <210> 155 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 155 catttatgtg tctttagtc <210> 156 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

-100<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 156 atcattaaat gaaatgagt <210> 157 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> y = c alebo t <400> 157 atcattaaay gaatgagt <210> 158 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 158 acteatttca tttaatgat <210> 159 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g <400> 159 actcatttcr tttaatgat <210> 160 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 160 atcattaaac gaaatgagt <210> 161

-101 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 161 actcatttcg tttaatgat <210> 162 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 162 caacaatgtc gtgtgcatc <210> 163 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <22 0>

<223> y = c alebo t <400> 163 caacaatgty gtgtgcatc <210> 164 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 164 gatgcacacg acattgttg <210> 165 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g

102 <400> 165 gatgcacacr acattgttg <210> 166 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 166 caacaatgtt gtgtgcatc <210> 167 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 167 gatgcacaca acattgttg <210> 168 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 168 ggcttgaaga tgtaagaat <210> 169 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g <400> 169 ggcttgaagr tgtaagaat <210> 170 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

-103 <223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 170 attcttacat cttcaagcc <210> 171 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> y = c alebo t <400> 171 attcttacay cttcaagcc <210> 1172 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 172 ggcttgaagg tgtaagaat <210> 173 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 173 attcttacac cttcaagcc <210> 174 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 174 gaacattgcc tatggagac <210> 175 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia

-104 <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> y = c alebo t <400> 175 gaacattgcy tatggagac <210> 176 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 176 gtctccatag gcaatgttc <210> 177 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> r = a alebo g <400> 177 gtctccatar gcaatgttc <210> 178 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 178 gaacattgct tatggagac <210> 179 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 179 gtctccataa gcaatgttc syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická

-105 <210> 180 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 180 aacttactta tatctttga <210> 181 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g <400> 181 aacttacttr tatctttga <210> 182 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 182 tcaaagatat aagtaagtt <210> 183 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> y = c alebo t <400> 183 tcaaagatay aagtaagtt <210> 184 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

-106syntetická <223> Opis umelej sekvencie:

<400> 184 aacttacttg tatctttga <210> 185 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 185 tcaaagatac aagtaagtt <210> 186 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 186 agaaatagta taatcaaca <210> 187 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> w = a alebo t <400> 187 agaaatagtw taatcaaca <210> 188 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 188 tgttgattat actatttct <210> 189 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia syntetická syntetická syntetická syntetická

-107 <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> w = a alebo t <400> 189 tgttgattaw actatttct <210> 190 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 190 agaaatagtt taatcaaca <210> 191 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 191 tgttgattaa actatttct <210> 192 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 192 tagggagggt ttaaggcca <210> 193 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> y = c alebo t <400> 193 tagggagggy ttaaggcca

-108 <210> 194 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 194 tggccttaaa ccctcccta <210> 195 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g <400> 195 tggccttaar ccctcccta <210> 196 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 196 tagggagggc ttaaggcca <210> 197 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 197 tggccttaag ccctcccta <210> 198 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 198

-109 gaaaggtgag ataaagcaa <210> 199 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g <400> 199 gaaagggar ataaagcaa <210> 200 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 200 ttgctttate tcaccttte <210> 201 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <22 0>

<223> y = c alebo t <400> 201 ttgctttaty tcacctttc <210> 202 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 202 gaaaggtgaa ataaagcaa <210> 203 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia

-110<220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 203 ttgctttatt tcacctttc <210> 204 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 204 catttacccc agatggacc <210> 205 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> y = c alebo t <400> 205 catttacccy agatggacc <210> 206 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 206 ggtccatctg gggtaaatg <210> 207 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<22 0>

<223> r = a alebo g <400> 207 ggtccatctr gggtaaatg syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická

-111 <210> 208 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 208 catttaccct agatggacc <210> 209 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 209 ggtccatcta gggtaaatg <210> 210 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 210 gaggcgggcg gatcacgag <210> 211 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g <400> 211 gaggcgggcr gatcacgag <210> 212 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 212

-112ctcgtgatcc gcccgcctc <210> 213 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> y = c alebo t <400> 213 ctcgtgatcy gcccgcctc <210> 214 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 214 gaggcgggca gatcacgag <210> 215 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 215 ctcgtgatct gcccgcctc <210> 216 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 216 ggagaatggt gtgaacccg <210> 217 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická

-113<220>

<223> y = c alebo t <400> 217 ggagaatggy gtgaacccg <210> 218 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 218 cgggttcaca ccattctcc <210> 219 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g <400> 219 cgggttcacr ccattctcc <210> 220 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 220 ggagaatggc gtgaacccg <210> 221 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 221 gčgggttcacg ccattctcc <210> 222 <211> 19

-114<212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 222 gaggcgggcg gatcacgag <210> 223 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g <400> 223 gaggcgggcr gatcacgag <210> 224 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 224 ctcgtgatcc gcccgcctc <210> 225 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> y = c alebo t <400> 225 ctcgtgatcy gcccgcctc <210> 226 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická

-115<400> 226 atatggaaga aaattacaa <210> 212 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 227 ttgtaatttt cttccatat <210> 228 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 228 aacacgggca ttgatctga <210> 229 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g <400> 229 aacacgggcr ttgatctga <210> 230 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 230 tcagatcaat gcccgtgtt <210> 231 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

-116<223> Opis umelej sekvencie:

<22 0>

<223> y = c alebo t <400> 231 tcagatcaay gcccgtgtt <210> 232 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 232 aacacgggcg ttgatctga <210> 233 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 233 tcagatcaac gcccgtgtt <210> 234 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 234 tgtattaaat gcgaatccc <210> 235 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> y = c alebo t <400> 235 tgtattaaay gcgaatccc syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická <210> 236

-117 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 236 gggattcgca tttaataca <210> 237 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> r = a alebo g <400> 237 gggattcgcr tttaataca <210> 238 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 238 tgtattaaac gcgaatccc <210> 239 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 239 gggattcgcg tttaataca <210> 240 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 240 ttgaaagacg tgtctacat syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická

-118<210> 241 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g <400> 241 ttgaaagacr tgtctacat <210> 242 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 242 atgtagacac gtctttcaa <210> 243 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <22 0>

<223> y = c alebo t <400> 243 atgtagacay gtctttcaa <210> 244 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 244 ttgaaagaca tgtctacat <210> 245 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

-119<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 245 atgtagacat gtctttcaa <210> 246 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 246 cgtgtctaca taagttgaa <210> 247 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis tmelej sekvencie: syntetická <220>

<223> w = a alebo t <400> 247 cgtgtctacw taagttgaa <210> 248 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 248 ttcaacttat gtagacacg <210> 249 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <22 0>

<223> w = a alebo t <400> 249 ttcaacttaw gtagacacg <210> 250

-120 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 250 cgtgtctact taagttgaa <210> 251 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 251 ttcaacttaa gtagacacg <210> 252 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 252 atgtccccaa tgattcagc <210> 253 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> r = a alebo g <400> 253 atgtccccar tgattcagc <210> 254 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 254 gctgaatcat tggggacat syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická

-121 <210> 255 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> y = c alebo t <400> 255 gctgaatcay tggggacat <210> 256 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 256 atgtccccag tgattcagc <210> 257 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 257 gctgaatcac tggggacat <210> 258 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 258 ccgggccggg agcagtcat <210> 259 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie:

syntetická syntetická syntetická syntetická <220>

syntetická

122 <223> r = a alebo g <400> 259 ccgggccggr agcagtcat <210> 260 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 260 atgactgctc ccggcccgg <210> 261 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> y = c alebo t <400> 261 atgactgcty ccggcccgg <210> 262 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 262 ccgggccgga agcagtcat <210> 263 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 263 atgactgctt ccggcccgg <210> 264 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia

-123 <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 264 aaaatacttc ggaaatttg <210> 265 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> y = c alebo t <400> 265 aaaatactty ggaaatttg <210> 266 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 266 caaatttccg aagtatttt <210> 267 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> r = a alebo g <400> 267 caaatttccr aagtatttt <210> 268 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 268 aaaatacttt ggaaatttg syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická

-124<210> 269 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 269 caaatttcca aagtatttt <210> 270 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 270 gatacagggt tcttcatga <210> 271 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <22 0>

<223> y = c alebo t <400> 271 gatacagggy tcttcatga <210> 272 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 272 tcatgaagaa ccctgtatc <210> 273 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

-125<223> r = a alebo g <400> 273 tcatgaagar ccctgtatc <210> 274 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<221> CDS <222> (1) . . (18) <400> 274 gat aca ggg ctc ttc atg a

Asp Thr Gly Leu Phe Met 1 5 <210> 275 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 275 tcatgaagag ccctgtatc <210> 276 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 276 gtgcacgatg ttggggagc <210> 277 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g <400> 277 gtgcacgatr ttggggagc

-126 <210> 278 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 278 gctccccaac atcgtgcac <210> 279 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> y = c alebo t <400> 279 gctccccaay atcgtgcac <210> 280 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 280 gtgcacgata ttggggagc <210> 281 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 281 gctccccaat atcgtgcac <210> 282 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická <400> 282

-127 cattaaatga aggactggg <210> 283 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g <400> 283 cattaaatgr aggactggg <210> 284 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 284 cccagtcctt catttaatg <210> 285 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <22 0>

<223> y = c alebo t <400> 285 cccagtccty catttaatg <210> 286 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 286 cattaaatgg aggactggg <210> 287 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia

-128<220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 287 cccagtcctc catttaatg <210> 288 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 288 tcctctgaga atgtgcagt <210> 289 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g <400> 289 tcctctgagr atgtgcagt <210> 290 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 290 actgcaeatt ctcagagga <210> 291 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> y = c alebo t <400> 291 actgcacaty ctcagagga

-129 <210> 292 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 292 tcctctgagg atgtgcagt <210> 293 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 293 actgcacatc ctcagagga <210> 294 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 294 aaaattgctg tcactatct <210> 295 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> r = a alebo g <400> 295 aaaattgctr tcactatct <210> 296 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie:

syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická <400> 296

-130agatagtgac agcaatttt <210> 297 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> y = c alebo t <400> 297 agatagtgay agcaatttt <210> 298 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 298 aaaattgcta tcactatct <210> 299 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 299 agatagtgat agcaatttt <210> 300 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 300 gagcacaaca gtccagctg <210> 301 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická

-131 <220>

<223> r = a alebo g <400> 301 gagcacaacr gtccagctg <210> 302 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 302 cagctggact gttgtgctc <210> 303 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> y = c alebo t <400> 303 cagctggacy gttgtgctc <210> 304 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 304 gagcacaacg gtccagctg <210> 305 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 305 cagctggacc gttgtgctc <210> 306 <211> 19 <212> DNA

-132 <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 306 tgggcagacg gtggccctg <210> 307 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> r = a alebo g <400> 307 tgggcagacr gtggccctg <210> 308 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 308 cagggccacc gtctgccca <210> 309 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> y — c alebo t <400> 309 cagggccacy gtctgccca <210> 310 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická <400> 310

-133tgggcagaca gtggccctg <210> 311 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 311 cagggccact gtctgccca <210> 312 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 312 ctcgtcctgg tagatcttg <210> 313 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r — a alebo g <400> 313 ctcgtcctgr tagatcttg <210> 314 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 314 caagatctac caggacgag <210> 315 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická

- 134 <220>

<223> y = c alebo t <400> 315 caagatctay caggacgag <210> 316 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 316 ctcgtcctga tagatcttg <210> 317 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 317 caagatctat caggacgag <210> 318 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 318 gacccatgcg agctagace <210> 319 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g <400> 319 gacccatgcr agctagacc <210> 320 <211> 19 <212> DNA

-135<213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 320 ggtctagctc gcatgggtc <210> 321 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> y = c alebo t <400> 321 ggtctagcty gcatgggtc <210> 322 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 322 gacccatgca agctagacc <210> 323 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 323 ggtctagctt gcatgggtc <210> 324 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 324 actttgtcta atctcctgc syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická <210> 325

-136 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g <400> 325 actttgtctr atctcctgc <210> 326 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 326 gcaggagatt agacaaagt <210> 327 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> y = c alebo t <400> 327 gcaggagaty agacaaagt <210> 328 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 328 actttgtctg atctcctgc <210> 329 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická

-137<400> 329 gcaggagatc agacaaagt <210> 330 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 330 aatcattttc tgtgccaea <210> 331 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> m = a alebo c <400> 331 aatcattttm tgtgccaca <210> 332 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 332 tgtggcacag aaaatgatt <210> 333 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> k = g alebo t <400> 333 tgtggcacak aaaatgatt <210> 334 <211> 19 <212> DNA

-138 <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 334 aatcatttta tgtgccaca <210> 335 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 335 tgtggcacat aaaatgatt <210> 336 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 336 tctactggtg tttgtctta <210> 337 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> r = a alebo g <400> 337 tctactggtr tttgtctta <210> 338 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 338 taagacaaac accagtaga syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická <210> 339

-139 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<22 0>

<223> y = c alebo t <400> 339 taagacaaay accagtaga <210> 340 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 340 tctactggta tttgtctta <210> 341 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 341 taagacaaat accagtaga <210> 342 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 342 ttaattggcc attttggac <210> 343 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> y = c alebo t syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická

-140<400> 343 ttaattggcy attttggac <210> 344 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 344 gtccaaaatg gccaattaa <210> 345 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <22 0>

<223> r = a alebo g <400> 345 gtccaaaatr gccaattaa <210> 346 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 346 ttaattggct attttggac <210> 347 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 347 gtccaaaata gccaattaa <210> 348 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

-141 <223> Opis umelej sekvencie:

<400> 348 aattttctcc ttacgggtg <210> 349 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> m = a alebo c <400> 349 aattttctcm ttacgggtg <210> 350 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 350 cacccgtaag gagaaaatt <210> 351 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> k = g alebo t <400> 351 cacccgtaak gagaaaatt <210> 352 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 352 aattttctca ttacgggtg syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická <210> 353

-142 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 353 cacccgtaat gagaaaatt <210> 354 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 354 ttctccttac gggtgttag <210> 355 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> y = c alebo t <400> 355 ttctccttay gggtgttag <210> 356 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 356 ctaacacccg taaggagaa <210> 357 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> r = a alebo g

-143 <400> 357 ctaacaccck taaggagaa <210> 358 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 358 ttctccttat gggtgttag <210> 359 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 359 ctaacaccca taaggagaa <210> 360 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <400> 360 tgaatgttca gtggctccg <210> 361 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

<223> Opis umelej sekvencie: syntetická <220>

<223> m = a alebo c <400> 361 tgaatgttcm gtggctccg <210> 362 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <22 0>

-144<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 362 cggagccact gaacattca <210> 363 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> k = t alebo g <400> 363 cggagccack gaacattca <210> 364 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 364 tgaatgttcc gtggctccg <210> 365 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 365 cggagccacg gaacattca <210> 366 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 366 cgggtggtgt cacaggaag <210> 367 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická

-145<220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> w = a alebo t <400> 367 cgggtggtgw cacaggaag <210> 368 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 368 cttcctgtga caccacccg <210> 369 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<220>

<223> w = a alebo t <400> 369 cttcctgtgw caccacccg <210> 370 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 370 cgggtggtga cacaggaag <210> 371 <211> 19 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 371 cttcctgtgt caccacccg syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická

-146<210> 372 <211> 6 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <223> Opis umelej sekvencie:

<400> 372

Lys Leu Asn Asp Lys Ser 1 5 <210> 373 <211> 7 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <223> Opis umelej sekvencie:

<400> 373

Asp Thr Gly Ser Phe Met Asn 1 5 <210> 374 <211> 5 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <223> Opis umelej sekvencie:

<400> 374

His Phe Asn Tyr Pro 1 5 <210> 375 <211> 6 <212> PRT <213> Umelá sekvencia <223> Opis umelej sekvencie:

<400> 375

Asp Thr Gly Leu Phe Met 1 5 <210> 376 <211> 20 <212> DNA <213> Umelá sekvencia <220>

<223> Opis umelej sekvencie:

<400> 376 aaactgaacg ataaaaggta syntetická syntetická syntetická syntetická syntetická

ΤΡ Ί5Τ) -Z.pv£

Claims (41)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polynukleotid vybraný zo skupiny, ktorá obsahuje:

   (a) polynukleotid majúci ktorúkoľvek nukleokyselinovú sekvenciu zo sekv. č.: 73,

   74, 79, 80, 85, 86, 91, 92, 97, 98, 101, 106, 107, 112, 113, 116, 119, 122, 154, 155, 160, 161, 166, 167, 172, 173, 178, 179, 184, 185, 190, 191, 196, 197, 202, 203,

   208, 209, 214, 215, 220, 221, 226, 227, 232, 233, 238, 239, 244, 245, 250, 251,

   256, 257, 262, 263, 268, 269, 274, 275, 280, 281, 286, 287, 292, 293, 298, 299,

   304, 305, 310, 311, 316, 317, 322, 323, 328, 329, 334, 335, 340, 341, 346, 347,

   352, 353, 358, 359, 364, 365, 370 alebo 371;

   (b) polynukleotid kódujúci polypeptid s aminokyselinou vybranou zo sekv. č.: 372, 373, 374 alebo 375;

   (c) polynukleotid kódujúci molekulový variant polypeptidu multiliečivovej rezistencie MDR-1, pričom má v polohe zodpovedajúcej polohe 140837, 141530, 141590, 171466, 171512 alebo 175068 MDR-1 génu (poradové č.: AC002457), v polohe zodpovedajúcej polohe 101 alebo 308 MDR-1 génu (poradové č.: M29432 alebo J05168), v polohe zodpovedajúcej polohe 83946 MDR-1 génu (poradové č.: AC005068), v polohe zodpovedajúcej polohe 78170 MDR-1 génu (poradové č.: AC005068), v polohe zodpovedajúcej polohe 176 MDR-1 génu (poradové č.: M29445 alebo J05168), v polohe zodpovedajúcej polohe 171456, 171404 alebo 175074 MDR-1 génu (poradové č: AC002457), v polohe zodpovedajúcej polohe 77811 MDR-1 génu (poradové č.: AC005068) alebo polohe zodpovedajúcej polohe 137 MDR-1 génu (poradové č.: M29445 alebo J05168) zamenený nukleotid, deletovaný nukleotid, ďalší nukleotid alebo ďalší nukleotid a zamenený nukleotid;

   (d) polynukleotid kódujúci molekulový variant MDR-1 polypeptidu, pričom polynukleotid má v polohe zodpovedajúcej polohe 140837, 171512, 171456, 171404, 139119, 139619, 140490 alebo 171511 MDR-1 génu (poradové č.: AC002457) C, v polohe zodpovedajúcej polohe 141530, 139177, 139479, 140118, 140568, 140727 alebo 174901 MDR-1 génu (poradové č.: AC002457) A, v polohe zodpovedajúcej polohe 141590, 139015, 140216, 140595, 175142 alebo 175180 MDR-1 génu (poradové č.: AC002457) G, v polohe zodpovedajúcej polohe 171466,

   -148 175068, 175074, 139064, 139276, 140576 alebo 145984 MDR-1 génu (poradové č.: AC002457) T, v polohe zodpovedajúcej polohe 101 MDR-1 génu (poradové č.: M29432 alebo J05168) A, v polohe zodpovedajúcej polohe 308 MDR-1 génu (poradové č.: M29432 alebo J05168) T, v polohe zodpovedajúcej polohe 83946, 78170, 70237 alebo 70200 MDR-1 génu (poradové č.: AC005068) T, v polohe zodpovedajúcej polohe 77811, 84032 alebo 73252 MDR-1 génu (poradové č.: AC0005068) G, v polohe zodpovedajúcej polohe 84701, 84074, 84119, 83973, 70371, 70253, 70204 alebo 43162 MDR-1 génu (poradové č.: AC005068) A, v polohe zodpovedajúcej polohe 43263 MDR-1 génu (poradové č.: AC005068) C alebo v polohe zodpovedajúcej polohe 176 alebo 137 MDR-1 génu (poradové č.: M29445 alebo J05168) T;

   (e) polynukleotid kódujúci molekulový variant MDR-1 peptidu, pričom uvedený polypeptid obsahuje aminokyselinovú substitúciu v polohe 21, 103 alebo 400 MDR1 polypeptidu (poradové č.: P08183); a (f) polynukleotid kódujúci molekulový variant MDR-1 polypeptidu, pričom uvedený polypeptid obsahuje aminokyselinovú substitúciu N na D v polohe 21, F na S v polohe 103, F na L v polohe 103 alebo S na N v polohe 400 MDR-1 polypeptidu (poradové č.: P08183).
2. 2. Polynukleotid podľa nároku 1, kde nukleotidová delécia, adícia a/alebo substitúcia vedie k zmenenej expresii variantného MDR-1 génu v porovnaní so zodpovedajúcim génom divého typu.
3. 3. Vektor, ktorý obsahuje polynukleotid podľa nároku 1 alebo 2.
4. 4. Vektor podľa nároku 3, kde polynukleotid je operatívne spojený so sekvenciami riadiacimi expresiu, ktoré umožňujú expresiu v prokaryotických alebo eukaryotických bunkách.
5. 5. Hostiteľská bunka geneticky manipulovaná polynukleotidom podľa nároku 1 alebo 2 alebo vektorom podľa nároku 3 alebo 4.

   -1496. Spôsob výroby molekulového variantného MDR-1 proteínu alebo jeho fragmentu, v y z n a č u j ú c i sa tým, že zahŕňa (a) kultivovanie hostiteľskej bunky podľa nároku 5; a (b) izolovanie uvedeného proteínu alebo fragmentu z kultúry.
6. 7. Spôsob výroby buniek schopných exprimovať molekulový variantný MDR1 gén, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa genetickú manipuláciu buniek s polynukleotidom podľa nároku 1 alebo 2 alebo vektorom podľa nároku 3 alebo 4.
7. 8. MDR-1 protein alebo jeho fragment kódovaný polynukleotidom podľa nároku 1 alebo 2 alebo získateľný spôsobom podľa nároku 6 alebo získateľný z buniek vyrobených spôsobom podľa nároku 7.
8. 9. Protilátka, ktorá sa špecificky viaže na protein podľa nároku 8.
9. 10. Protilátka podľa nároku 9, ktorá špecificky rozoznáva epitop obsahujúci jednu alebo viacero aminokyselinových substitúcií definovaných v nároku 1 alebo 2.
10. 11. Molekula nukleovej kyseliny, ktorá je komplementárna s polynukleotidom podľa nároku 1 alebo 2.
11. 12. Molekula nukleovej kyseliny, ktorá je schopná špecificky rozoznávať a štiepiť polynukleotid podľa nároku 1 alebo 2.
12. 13. Vektor obsahujúci molekulu nukleovej kyseliny podľa nároku 11 alebo 12.
13. 14. Transgénny živočích, okrem človeka, vyznačujúci sa tým, že obsahuje najmenej jeden polynukleotid podľa nároku 1 alebo 2 alebo vektor podľa nároku 3 alebo 4.

    -15015. Transgénny živočích, okrem človeka, podľa nároku 14, vyznačujúci sa t ý m , že ešte obsahuje najmenej jednu inaktivovanú alelu divého typu MDR-1 génu.
14. 16. Transgénny živočích, okrem človeka, podľa nároku 14 alebo 15, vyznačujúci sa tý m , že ním je myš alebo potkan.
15. 17. Spôsob identifikácie a získavania MDR-1 inhibítora, ktorý je schopný modulovať aktivitu molekulového variantu MDR-1 génu, alebo jeho génového produktu, vyz n aču j ú ci sa t ý m , že zahŕňa nasledujúce kroky:

    (a) uvedenie proteínu podľa nároku 8 alebo bunky exprimujúcej molekulový variantný MDR-1 gén obsahujúci polynukleotid podľa nároku 1 alebo 2, do kontaktu so zlúčeninou, ktorá sa má skrínovať, v prítomnosti zložiek schopných poskytnúť detegovateľný signál ako odpoveď na prenos liečiva, a v podmienkach, ktoré umožňujú MDR-1 sprostredkovaný prenos liečiva, a (b) detegovanie prítomnosti alebo neprítomnosti signálu alebo zvýšenia signálu generovaného prenosom liečiva, pričom prítomnosť alebo zvýšenie signálu indikujú pravdepodobný inhibítor.
16. 18. Spôsob podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že uvedenou bunkou je bunka podľa nároku 5, získaná spôsobom podľa nároku 7 alebo bunka nachádzajúca sa v transgénnom nehumánnom živočíchovi podľa ktoréhokoľvek z nárokov 14 až 16.
17. 19. Spôsob identifikácie a získavania MDR-1 inhibítora, ktorý je schopný modulovať aktivitu molekulového variantu MDR-1 génu, alebo jeho génového produktu, vyz n a č u j ú c i sa tý m, že zahŕňa nasledujúce kroky:

    (a) uvedenie proteínu podľa nároku 8 do kontaktu s prvou molekulou, o ktorej je známe, že sa viaže na MDR-1 protein, na vytvorenie prvého komplexu uvedeného proteínu s prvou molekulou;

    -151 (b) uvedenie prvého komplexu do kontaktu so zlúčeninou, ktorá sa má skrínovať; a (c) meranie toho, či táto zlúčenina vytesňuje prvú molekulu z prvého komplexu.
18. 20. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že merací krok zahŕňa meranie vytvorenia druhého komplexu uvedeného proteínu a uvedenej zlúčeniny.
19. 21. Spôsob podľa nároku 19 alebo 20, vyznačujúci sa tým, že merací krok zahŕňa meranie množstva prvej molekuly, ktorá nie je naviazaná na uvedený proteín.
20. 22. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 19 až 21,vyznačujúci sa tým, že prvou molekulou je Verapamil, Valspodar, Cyklosporín A alebo dexniguldipín.
21. 23. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 19 až 22, vyznačujúci sa t ý m , že prvá molekula je značená.
22. 24. Spôsob diagnostiky poruchy majúcej súvis s prítomnosťou molekulového variantu MDR-1 génu alebo náchylnosti na takúto poruchu, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa:

    (a) stanovenie prítomnosti polynukleotidu podľa nároku 1 alebo 2 vo vzorke zo subjektu; a/alebo (b) stanovenie prítomnosti proteínu podľa nároku 8.
23. 25. Spôsob podľa nároku 24, vyznačujúci sa tým, že poruchou je rakovina.
24. 26. Spôsob podľa nároku 24 alebo 25, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa PCR, ligázovú reťazovú reakciu, reštrikčné štiepenie, priame sekvenovanie, techniky amplifikácie nukleovej kyseliny, hybridizačné techniky alebo imunotesty.

    -15227. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 24 až 26, v y z n a č u j ú c i sa tým, že ďalej zahŕňa podávanie lieku na zrušenie alebo zmiernenie poruchy subjektu.
25. 28. Spôsob podľa ktoréhokoľvek z nárokov 24 až 27, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že ďalej zahŕňa zavedenie:

    (i) funkčného a exprimovateľného MDR-1 génu divého typu alebo (ii) molekuly nukleovej kyseliny podľa nároku 11 alebo 12 alebo vektora podľa nároku 13, do buniek.
26. 29. Spôsob výroby farmaceutického prostriedku, vyznačujúci sa t ý m , že zahŕňa kroky spôsobu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 17 až 23; a (c) syntetizovanie a/alebo formulovanie zlúčeniny identifikovanej a získanej v kroku (b) alebo jej derivátu do farmaceutický prijateľnej formy.
27. 30. Spôsob prípravy farmaceutického prostriedku, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa formulovanie liečiva a/alebo prekurzora do formy vhodnej na terapeutickú aplikáciu a na predchádzanie alebo zlepšenie poruchy subjektu diagnostikovanej spôsobom podľa nároku 24 alebo 25.
28. 31. Spôsob podľa nároku 29 alebo 30, vyznačujúci sa tým, že zlúčeninovým liečivom alebo prekurzorom je derivát lieku definovaného v nároku 27.
29. 32. Inhibítor identifikovaný alebo získateľný spôsobom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 17 až 23.
30. 33. Inhibítor podľa nároku 32, ktorý sa špecificky viaže na proteín podľa nároku 8.

    -15334. Použitie oligonukleotidu alebo polynukleotidu na detekciu polynukleotidu podľa nároku 1 alebo 2 a/alebo na genotyping jednotlivých MDR-1 aliel.
31. 35. Použitie podľa nároku 34, pričom polynukleotidom je polynukleotid podľa nároku 1 alebo 2 alebo molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 11 alebo 12.
32. 36. Použitie podľa nároku 34, pričom oligonukleotid má dĺžku približne 15 až 50 nukleotidov a obsahuje ktorúkoľvek sekvenciu zo sekv. č.: 1 až 179 alebo zo sekvencií divého typu - wt alebo mutovaných - mut sekvencií promótora alebo exónu MDR-1 génu uvedených v tabuľke 8, alebo zo sekvencií, ktoré sú komplementárne s ktoroukoľvek z nich.
33. 37. Primér alebo sonda obsahujúce oligonukleotid ako je definovaný v nároku 36.
34. 38. Použitie protilátky alebo látky schopnej špecificky sa viazať na génový produkt MDR-1 génu na detekciu proteínu podľa nároku 8, na detekciu expresie molekulového variantu MDR-1 génu obsahujúceho polynukleotid podľa nároku 1 alebo 2 a/alebo na rozlíšenie MDR-1 aliel obsahujúcich polynukleotid podľa nároku 1 alebo 2.
35. 39. Prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje polynukleotid podľa nároku 1 alebo 2, vektor podľa nároku 3 alebo 4, hostiteľskú bunku podľa nároku 5 alebo získanú spôsobom podľa nároku 7, proteín podľa nároku 8, protilátku podľa nároku 9 alebo 10, molekulu nukleovej kyseliny podľa nároku 11 alebo 12, vektor podľa nároku 13, inhibitor podľa nároku 32 alebo primér alebo sondu podľa nároku 37.
36. 40. Prostriedok podľa nároku 39, vyznačujúci sa tým, že je diagnostickým alebo farmaceutickým prostriedkom.

    -154
37. 41. Použitie účinnej dávky liečiva alebo prekurzora na prípravu farmaceutického prostriedku na liečbu alebo prevenciu poruchy subjektu, ktorý vo svojom genóme zahŕňa polynukleotid podľa nároku 1 alebo 2.
38. 42. Použitie podľa nároku 41, pričom poruchou je rakovina alebo nervové, CNS alebo kardiovaskulárne ochorenie.
39. 43. Použitie jednonukleotidového polymorfizmu - SNP, MDR-1 génu ako farmakogenetického faktora na predpokladanie hladín MDR-1 substrátov a/alebo induktorov v krvi, na zlepšenie bezpečnosti a účinnosti liečiv, na predpokladanie a predchádzanie vedľajším účinkom a interakciám liečiv a/alebo na zlepšenie pacientovej harmónie.
40. 44. Použitie podľa nároku 43, pričom substrát a/alebo induktor je vybraný z protikŕčových/protiepileptických liečiv, srdcových glykozidov, imunosupresívnych liečiv, makrolídových antibiotík alebo makrocyklických antibiotík.
41. 45. Použitie podľa nároku 43 alebo 44, pričom SNP je SNP v MDR-1 exóne 26 - C3435T.