MXPA02001094A

MXPA02001094A - Polimeros en el gen de mdr-1 humano y su uso en aplicaciones terapeuticas y de diagnostico.

Info

Publication number: MXPA02001094A
Application number: MXPA02001094A
Authority: MX
Inventors: Ulrich Brinkmann
Original assignee: Epidauros Biotechnologie Ag; Epidauros Biotechnologie Aktiengesellschaft
Priority date: 1999-07-30
Filing date: 2000-07-28
Publication date: 2003-07-21
Also published as: EP1232260A2; HRP20020093B1; BG65988B1; JP2011142909A; NO20100798L; AU1131901A; HUP0201997A2; PL354034A1; JP2003510021A; EE200200049A; NO20020470D0; ATE373710T1; HUP0201997A3; CZ2002329A3; DK1232260T3; DE60036487D1; ES2292481T3; EP1232260B1; WO2001009183A3; CA2376666A1

Abstract

La presente invención se refiere a métodos y medios generales para el diagnóstico y tratamiento del espectro fenotípico asícomo también las características clínicas de solapamiento con varias formas de función y/o expresión anormal heredada del gen de Resistencia a Multi Medicamento-1 (MDR-1). En particular, se proporcionan los polinucleótidos de genes de MDR-1 variantes, moleculares que, por ejemplo, se asocian con la toma alterada y/o insuficiente de medicamentos por una célula objetivo, y vectores que comprenden tales polinucleótidos. Además, se describen las células huésped que comprenden tales polinucleótidos o vectores y su uso para la producción de proteínas de MDR-1 variantes. Además, se proporcionan las proteínas de MDR-1 variantes y anticuerpos que reconocen específicamente tales proteínas asícomo también concierne a animales no humanos transgénicos que comprenden los vectores o polinucleótido arriba descritos. También se describen métodos para identificar y obtener inhibidores para la terapia de desordenes relacionados con el malfuncionamisnto del gen de MDR-1 asícomo también a métodos de diagnóstico del estatus de tales desordenes. Se proporcionan composiciones de diagnóstico y farmacéuticas que comprenden los inhibidores, anticuerpos, proteínas, vectores y polinucleótidos arriba descritos. Dichas composiciones son particularmenteútiles para el diagnóstico y tratamiento de varias enfermedades con medicamentos que son substratos, inhibidores o moduladores del producto genético de MDR

Description

POLIMORFISMOS EN EL GEN DE MDR-1 HUMANO Y SU USO EN APLICACIONES TERAPÉUTICAS Y DE DIAGNÓSTICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a medios t métodos de diagnóstico y tratamiento del espectro fenotípico así como también las características clínicas de solapamiento con varias formas de función y/o expresión anormal heredada del gen de Resistencia a Multi Medicamento-1 (MDR-1 ). En particular, la presente invención se refiere a polinucleótidos de genes de MDR-1 variantes, moleculares que, por ejemplo, se asocian con la toma alterada y/o insuficiente de medicamentos por una célula objetivo, y a vectores que comprenden tales polinucleótidos. Además, la presente invención se refiere a células huésped que comprenden tales polinucleótidos o vectores y su uso para la producción de proteínas de MDR-1 variantes. Además, la presente invención se refiere a proteínas de MDR-1 variantes y anticuerpos que reconocen específicamente tales proteínas. La presente invención también se refiere a animales no humanos transgénicos que comprenden los vectores o polinucleótidos arriba descritos. Además, la presente invención se refiere a métodos para identificar y obtener candidatos de medicamento e inhibidores para la terapia de desordenes relacionados con el malfuncionamiento del gen de MDR-1 así como también a métodos de diagnóstico del estatus de tales desordenes. La presente invención proporciona además composiciones de diagnóstico y farmacéuticas que comprenden los medicamentos, anticuerpos, proteínas, vectores y polinucleótidos arriba descritos, obtenibles por el método arriba descrito. Dichas composiciones son particularmente útiles para el diagnóstico y tratamiento de varias enfermedades con medicamentos que son substratos, inhibidores o moduladores del gen de MDR-1 o su producto. Varios documentos se citan por todo el texto de esta especificación. Cada uno de los documentos citados en la presente (incluyendo cualquier especificación del fabricante, instrucción, etc) se incorporan en la presente para referencia; sin embargo, no existe admisión de que cualquier documento citado es en realidad de técnica anterior en cuanto a la presente invención .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El gen de MDR-1 humano codifica una proteína de membrana integral cuya función es el transporte dependiente de energ ía de diferentes substancias desde el interior de las células y membranas celulares al exterior de la célula. Aunque la función fisiológica normal de MDR-1 es más probablemente la protección de las células de substancias tóxicas, también se sabe que muchos substratos del transportador de MDR-1 son medicamentos que se han desarrollado para el tratamiento de enfermedades humanas. Debido a eso, el grado de expresión y la funcionalidad del producto genético de MDR-1 puede afectar directamente la efectividad de cualquier medicamento que sirve como un substrato de MDR-1 . Por ejemplo, se sabe bien que los niveles de expresión, y por lo tanto el grado de la función de MDR-1 , afecta directamente la efectividad de los medicamentos anti-tumor en terapia de cáncer. De hecho, el nombre del gen "MDR" significa Resistencia a Multi Medicamento, que refleja la observancia de que la proteína codificada por este causa que las células cancerígenas se vuelvan refractarias al tratamiento con muchos medicamentos, todos de los cuales son substratos del transportador de MDR-1 . El gen de MDR-1 se expresa no solamente en ciertas células cancerígenas en donde puede afectar directamente la efectividad terapéutica de medicamentos al proporcionar una barrera protectora contra la entrada de medicamento, pero también en células no malignas preferentes en varios órganos, por ejemplo, en el colon y en la barrera cerebral, sanguínea. También en estas células MDR-1 puede afectar la actividad y disponibilidad de medicamentos. Por ejemplo, MDR-1 en colon puede controlar o modular el grado de toma de medicamento del colon después de la toma oral de medicamento. MDR-1 en la barrera cerebral, sanguínea también puede influenciar o controlar el grado al cual los substratos de MDR-1 pueden tomarse en el cerebro. Aquí, la actividad de MDR-1 puede prevenir la toma de cantidades suficientes de medicamentos cerebrales deseados en el cerebro, o viceversa, las variantes de MDR-1 con actividad reducida hacia ciertos medicamentos pueden conducir a acumulación anormalmente incrementada en el cerebro, conduciendo a efectos secundarios no deseados o aún peligrosos. El factor común que controla el transporte dependiente de MDR-1 en tejidos y células malignas como normales es la actividad de MDR-1 . La actividad de MDR-1 a su vez es dependiente de (i) los niveles de expresión del gen de MDR-1 que determina la cantidad de proteína de MDR-1 que se sintetiza en las células, y (ii) de la funcionalidad de la proteína de MDR-1 sintetizada, es decir, cuyos substratos se reconocen y transportan fuera de la célula con efectividad. El primero de estos parámetros, el nivel de expresión de MDR-1 , se han analizado intensivamente, particularmente debido a la sensibilidad de las células tumorales hacia la quimioterapia de cáncer, con frecuencia se correlaciona con efectividad insuficiente de quimioterapia de cáncer. Aunque la sobreexpresión de MDR-1 observada puede atribuirse parcialmente a las amplificaciones del gen de MDR-1 , se sabe que otras razonas hasta ahora no determinadas también pueden existir, entre ellas diferencias posiblemente alélicas. Las pequeñas diferencias en las secuencias de gen de MDR-1 en individuos pueden se causantes de diferentes niveles de expresión de gen de MDR-1 . Las regiones objetivo en el genoma humano donde pueden existir diferencias de secuencia que afectan directamente la expresión del gen de MDR-1 de influencia, serían las regiones de control de expresión del gen: las regiones aumentadoras y promotoras de MDR-1 y las regiones que influencian el modo o eficacia de empalme de pre-mARNs de MDR-1 . Además, los niveles de expresión pueden influenciarse por cambios estructurales en el genoma, tales como metilación , alteraciones generales de cromatina y otros factores que se enlazan a MDR-1 , en la región directamente en o rodeando el gen de M DR-1 . Es muy difícil encontrar directamente tales secuencias o factores enlazados y probar su mecanismo de represión o activación de gen . Sin embargo, la estructura lineal del genoma humano en cromosomas definidos abre la posibilidad de utiliza r polimorfismos identificados, que por sí mismos no se encuentran influenciado los niveles de expresión de genes, como marcadores para otros cambios hasta ahora no identificados en y alrededor del gen de MDR-1 que afectan los niveles de expresión. Este efecto se conoce como enlace: alelos definidos y variaciones de base pueden servir como un marcador para un fenotipo importante aún si estos cambios por sí mismos no son causantes de ese fenotipo. El segundo parámetro, la funcionalidad de la proteína de MDR-1 sintetizada, es decir, cuyos substratos se reconocen y transportan fuera de la célula con tal efectividad, se determina predominantemente por la secuencia de aminoácidos de la proteína que se codifica por el alelo de M DR-1 . Se sabe bien que los cambios de aminoácido pueden alterar la funcionalidad de proteínas. Ejemplos de variaciones que ocurren de manera natural, es decir, diferentes alelos que tienen un impacto directo en las acciones de varios medicamentos son , por ejemplo, polimorfismos P450 de citocromo, o polimorfismo en TPMT, APOE y una variedad de otros genes. También , las variaciones relacionadas de tumor, por ejemplo, en el gen p53 se conocen por mediar tales fenotipos. Hasta ahora , solamente algunos polimorfismos en el gen de MDR-1 se han descrito, y correlacionado con efectos clínicos (Mickley, Blood 91 (1 998), 1749-1 756). Una cuestión principal permanece en este campo si más de tales polimorfismos existente y, así, si estos pueden correlacionarse con actividad del medicamento y/o efectos secundarios del medicamento. Los experimentos con mutaciones artificialmente introducidas en el gen de MDR-1 muestran inambiguamente que MDR-1 reacciona muy sensible a intercambios de aminoácido. Se ha mostrado que las mutaciones artificiales en el gen de MDR-1 que se traducen en cambios de proteína pueden alterar el espectro de substrato, efectividad del transporte de substrato, control de transporte, y también la sensibilidad de MDR-1 hacia la inhibición con substancias inhibitorias específicas. Es claro que las mutaciones que ocurren de manera natural, si existen pueden tener efectos similares. Sin embargo, se desconocen, cuantas de tales variaciones existente, y con que frecuencia y en que posiciones en el gen de MDR-1 humano. De acuerdo con lo anterior, los medios y métodos para el diagnóstico y tratamiento de una variedad de formas de resistencia de multimedicamento que resultan de polimorfismos del gen de MDR-1 , y sensibilidad que interfieren, por ejemplo, con el tratamiento quimioterapéutico de enfermedades, en particular cáncer, hasta no se encuentran disponibles pero son sin embargo altamente deseables. De esta manera, el problema técnico de la presente invención es cumplir con las necesidades arriba descritas. La solución a este problema técnico se logra al proporcionar las modalidades caracterizadas en las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el descubrimiento de nuevas, hasta ahora variaciones desconocidas en las secuencias de nucleotidos del gen de MDR-1 humano (Resistencia a Multi Medicamento) y la distribución de población de estos alelos. En base al conocimiento de estas nuevas secuencias y desviaciones de base del gen de MDR-1 , pruebas de diagnóstico y reactivos para tales pruebas se diseñaron para la detección específica y genotipación de alelos de MDR-1 en humanos, incluyendo alelos homocigóticos así como también heterocígóticos, frecuentes como raros del gen de MDR-1 . La determinación del estado de alélelo del gen de MDR-1 de humanos con tales pruebas es útil para la terapia de varias enfermedades con medicamentos que son substratos, inhibidores o moduladores del producto genético de MDR-1 . En una primer modalidad, la invención proporciona polinucleótidos de genes de MDR-1 variantes, moleculares y modalidades relacionadas con los mismos tales como vectores, células huésped , proteínas de MDR-1 variantes y métodos para producir los mismos. En todavía otra modalidad, la invención proporciona métodos para identificar y obtener candidatos de medicamento e inhibidores de MDR-1 para la terapia de desordenes relacionados con la resistencia a multimedicamento adquirida o sensibilidad así como también métodos de diagnóstico del estatus de tales desordenes. En una modalidad adicional, la invención proporciona composiciones de diagnóstico y farmacéuticas que comprenden los polinucleótidos arriba descritos, vectores que contienen los mismos, proteínas, anticuerpos para los mismos y medicamentos e inhibidores obtenibles por el método arriba descrito. Las composiciones de diagnóstico y farmacéuticas, métodos y usos de la invención son útiles para el diagnóstico y tratamiento de resistencia a medicamento heredada en tumores y otras enfermedades, la terapia de las cuales depende del tratamiento de medicamento. Las nuevas formas variantes de genes de MDR-1 de acuerdo a la invención proporcionan el potencial para el desarrollo de un perfil farmacodinámico de medicamentos y promedicamentos para un paciente dado.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El descubrimiento y caracterización de variaciones en el gen de MDR-1 , y las pruebas de diagnóstico para la discriminación de diferentes alelos de MDR-1 en individuos humanos proporcionan una herramienta muy potente para mejorar la terapia de enfermedades con medicamentos que son objetivos del producto de gen del MDR-1 , y cuya toma celular es por lo tanto dependiente de MDR-1 . El diagnóstico del estatus de MDR-1 alélico individual permite una terapia más enfocada, por ejemplo, al abrir la posibilidad de aplicar regímenes de dosis individuales de medicamentos. También puede ser útil como herramienta de pronóstico para el efecto de terapia, ciertamente un planteamiento mejorado sobre el uso de expresión de MDR general como hacedor de pronóstico. Además, las pruebas de diagnóstico para genotipar MDR-1 , y las nuevas variantes de MDR-1 , no solamente mejorarán los medicamentos establecidos de terapia y ayudan a correlacionar genotipos con actividad del medicamento o efectos secundarios. Estas pruebas y secuencias también proporcionan reactivos para el desarrollo de nuevos inhibidores que modulan específicamente la actividad de los tipos individuales de MDR-1 . La viabilidad para utilizar inhibidores específicos de variantes de MDR individuales (artificialmente creados), y su aplicación terapéutica potencial, por ejemplo, se ha demostrado recientemente en un sistema modelo (Moscow, J.A. et al., Blood 94 (1999), 52-61; Dey S. et al., Biochemistry 38 (1999), 6630-6639). De esta manera, la presente invención proporciona una nueva manera de explotar la biología molecular e investigación farmacológica de terapia de medicamento mientras desvía sus efectos dañinos potenciales que se deben a la expresión de genes de MDR-1 variantes. De acuerdo con lo anterior, la invención se refiere a un polinucleotido seleccionado del grupo que consiste de: (a) un polinucleotido que tiene la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de SEQ ID NOs:73, 74, 79, 80, 85, 86, 91, 92, 97, 98, 101, 106, 107, 112, 113, 116, 119, 122, 154, 155, 160, 161, 166, 167, 172, 173, 178, 179, 184, 185, 190, 191, 196, 197, 202, 203, 208, 209, 214, 215, 220, 221, 226, 227, 232, 233, 238, 239, 244, 245, 250, 251, 256, 257, 262, 263, 268, 269, 274, 275, 280, 281, 286, 287, 292, 293, 298, 299, 304, 305, 310, 311, 316, 317, 322, 323, 328, 329, 334, 335, 340, 341, 346, 347, 352, 353, 358, 359, 364, 365, 370, 371 o 376; (b) un polinucleotido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 372, 373, 374 o 375; (c) un polinucleotido que codifica un polipéptido de Resistencia a Multi Medicamento (MDR-1) variante, molecular, en donde dicho polinucleótido se tiene en una posición que corresponde a la posición 140837, 141530, 141590, 171466, 171512 o 175068 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC002457), en una posición que corresponde a la posición 101 o 308 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: M29432 o J05168), en una posición que corresponde a la posición 78170 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC005068), en una posición que corresponde a la posición 176 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: M2944 o J05168), en una posición que corresponde a la posición 171456, 171404 o 175074 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC002457), en una posición que corresponde a la posición 77811 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC005068) o en una posición que corresponde a la posición 137 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: M29445 o J05168) un intercambio de nucleótido, una eliminación de nucleótido, un nucleótido adicional o un nucleótido adicional y un intercambio de nucleótido; un polinucleótido que codifica un polipéptido de MDR-1 de variante molecular, en donde dicho polinucleótido se tiene en una posición que corresponde a la posición 140837, 171512, 171456, 171404, 139119, 139619, 140490 o 171511 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC002457) una C, en una posición que corresponde a la posición 141530, 139177, 139479, 140118, 140568, 140727 o 174901 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC002457) una A, en una posición que corresponde a la posición 141590, 139015, 140216, 140595, 175142 o 175180 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC002457) una G, en una posición que corresponde la posición 171466, 175068, 175074, 139064, 139276, 140576 o 145984 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC002457) una T; en una posición que corresponde a la posición 101 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: M29432 o J05168) una A, en una posición que corresponde la posición 308 de! gen de MDR-1 (No. de Acceso: M29432 o J05168 una T, en una posición que corresponde a la posición 83946, 78170, 70237 o 70200 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC005068) una T, en una posición que corresponde a la posición 7781 1 , 84032 o 73252 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC005068) una G, en una posición que corresponde a la posición 84701 , 84074, 841 19, 83973, 70371 , 70253, 70204 o 43162 del gel de MDR-1 (No. de Acceso: AC005068) una A, en una posición que corresponde a la posición 43263 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC005068 una C o en una posición que corresponde a la posición 1 76 o 1 37 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: M29445 o J05168) una T; (e) un polinucleótído que codifica un péptido de MDR-1 variante, molecular, en donde dicho polipéptido comprende una substitución de aminoácido en la posición 21 , 103 o 400 del polipéptido de MDR-1 (No. de Acceso: P08183); y (f) un polinucleótído que codifica un polipéptido de MDR-1 variante, molecular, en donde dicho polipéptido comprende una substitución de aminoácido de N en D en la posición 21 , F en S en la posición 103, F en L en la posición 103 o S en N en la posición 400 del polipéptido de MDR-1 (No. de Acceso: P08183). En el contexto de la presente invención el término proteína o gen de MDR-1 "variante, molecular" como se utiliza en la presente significa que dicha proteína o gen de MDR-1 difiere de la proteína o gen de MDR-1 de tipo silvestre (secuencias genómicas del gen de MDR-1 se describen, por ejemplo, para exones 1-7; número de Acceso AC002457; para exon 8: número de Acceso 29429, J05168, AC005068, para exon 9: número de Acceso M29430, J05168, AC005068, para exon 10; número de Acceso M29431, J05168, AC005068; para exon 11 a 13: número de Acceso M29433, J05168, AC005068; para exon 15: número de Acceso M29434, J05168, AC005068; para exon 16: número de Acceso M29435, J05168, AC005068; para exon 17: número de Acceso M29436, J05168, AC005068; para exon 18: número de Acceso M29437, J05168, AC005068; para exon 19: número de Acceso 29438, J05168, AC005068; para exon 20: número de Acceso M29439, J05168, AC005068; para exon 21: número de Acceso M29440, J05168, AC005068; para exon 22: número de Acceso M29441, J05168, AC005068; para exon 23: número de Acceso M29442, J05168, AC005068; para exon 24: número de Acceso M29443, J05168, AC005068; para exon 25: número de Acceso M29444, J05168, AC005068; para exon 26: número de Acceso 29445, J05168, AF016535, AC005068; para exon 27: número de Acceso M29446, J05168, AC005068; para exon 26: número de Acceso 29447, J05168, AC005068) a manera de substltución(es), adición(es) y/o eliminación(es) de nucleótido. Preferentemente, dicha(s) substitución(es) de nucleótido(s) resulta(n) en un cambio correspondiente en la secuencia de aminoácidos de la proteína de MDR-1. El término "correspondiente" como se utiliza en la presente significa que una posición no solamente se determina por el número de los aminoácidos y nucleótidos precedentes, respectivamente. La posición de un aminoácido o nucleótido dado de acuerdo con la presente invención que puede eliminarse, substituirse o comprenderse de uno o más nucleótidos adicionales puede variar debido a las eliminaciones o aminoácidos o nucleótidos adicionales en otra parte en el gen o el polipéptido. De esta manera, bajo una "posición correspondiente" de acuerdo con la presente invención debe entenderse que los nucleótidos o aminoácidos pueden diferir en el número indicado pero pueden tener aún aminoácidos o nucleótidos vecinos similares. Tales nucleótidos o aminoácidos que pueden intercambiarse, eliminarse o comprenderse de aminoácidos o nucleótidos adicionales también se comprenden por el término "posición correspondiente". Dichos nucleótidos o aminoácidos pueden por ejemplo junto con sus vecinos formar secuencias que pueden incluirse en la regulación de expresión genética, estabilidad del ARN correspondiente o edición de ARN, así como también codificar motivos o dominios funcionales de la proteína de la invención. De acuerdo con la presente invención, el modo y distribución de población de nuevas variaciones genéticas hasta ahora no identificadas en el gen de MDR-1 se han analizado por análisis de secuencia de regiones relevantes del gen de MDR-1 humano de muchos individuos diferentes. Se conoce bien el hecho de que el ADN genómico de individuos, que alberga la elaboración genética individual de todos los genes, incluyendo MDR-1 puede purificarse fácilmente de muestras sanguíneas individuales. Estas muestras de ADN individuales se utilizan entonces para el análisis de la composición de secuencia de los alelos del gen de MDR-1 que se encuentran presentes en el individuo que proporciona la muestra sanguínea. El análisis de secuencia puede llevarse a cabo por amplificación de PCR de regiones relevantes del gen de MDR-1 , purificación subsecuente de los productos de PCR, seguida por la secuenciación automática de ADN con métodos establecidos (secuenciación del ciclo determinante ABI). Un parámetro importante que tiene que considerarse en el intento de determinar el genotipo de MDR-1 individual e identificar nuevas variantes de MDR-1 por secuenciación de ADN directa de productos PCR de ADN genómico de sangre humana es el hecho de que cada humano alberga (usualmente con muy pocas excepciones anormales) dos copias genéticas de cada gen autosomal (diploidi). Debido a eso, debe tenerse gran cuidado en la evaluación de las secuencias para ser capaz de identificar inambiguamente no solamente las variaciones de secuencia homocigóticas sino que también variaciones heterocigóticas. Los detalles de los diferentes pasos en la identificación y caracterización de los nuevos polimorfismos del gen de MDR-1 (homocigóticos y heterocigóticos) se describen en los ejemplos 1 y 2 de abajo. Las mutaciones en el gen de MDR-1 detectadas de acuerdo con la presente invención se ilustran en la Figura 2 (indicada por una flecha). Los métodos del análisis de mutación siguieron procedimientos estándar y se describe en detalle en los ejemplos. En general, tales métodos a utilizarse de acuerdo con la presente invención para evaluar el espectro fenotípico así como también las características clínicas de solapamiento con otras formas de resistencia a multimedicamento y tolerancia alterada a medicamentos en pacientes con mutaciones en el gen de MDR-1 comprenden por ejemplo, análisis de haplotipo, análisis de polimorfismo de conformación de un solo filamento (SSCA), PCR y secuenciación directa; ver también Mickiey (1 998), y referencias citadas en la presente. En la base de caracterización clínica directa de muchos pacientes, los fenotipos pueden correlacionarse entonces a estas mutaciones así como también a mutaciones que se han descrito anteriormente. Como es evidente para la persona experta en la materia, este nuevo conocimiento genético molecular puede utilizarse ahora para caracterizar exactamente el genotipo del paciente índice en donde un medicamento dado toma un efecto inusual y de su familia. Durante los últimos 20 años, la heterogeneidad genética se ha reconocido cada vez más como una fuente significativa de variación en la respuesta a medicamento. Muchas comunicaciones científicas (Meyer, Ann . Rev. Pharmacol. Toxicol. 37 (1997), 269-296 y West, J. Clin. Pharmacol. 37 (1997), 635-348) han mostrado claramente que algunos medicamentos funcionan mejor o pueden aún ser altamente tóxicos en algunos pacientes que en otros y que estas variaciones en las respuestas del paciente a medicamentos pueden relacionarse con base molecular. Este concepto "farmacogenómico" señala las correlaciones entre las respuestas a medicamentos y perfiles genéticos de pacientes (Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997), 954-957; Marshall, Nature Biotechnology, 1 5 (1 997), 1249-1 252). En este contexto de variabilidad de población con respecto a la terapia de medicamento, los farmacogenómicos se han propuesto como una herramienta útil en la identificación y selección de pacientes que puede responder a un medicamento particular sin efectos secundarios. Esta selección/identificación puede basarse en el diagnóstico molecular de polimorfismos genéticos al genotipar el ADN de leucocitos en la sangre del paciente, por ejemplo, y caracterización de enfermedad (Bertz, Clin. Pharmacokinet. 32 (1997), 210-256; Engel, J. Chromatogra. B. Biomed. Appl . 678 (1 996), 93-1 03) . Para los fundadores del cuidado de la salud, £j tales como organ izaciones de mantenimiento de salud en los E . U . y servicios de salud pública gubernamentales en muchos países Europeos, este planteamiento de farmacogenómicos puede representan una manera tanto para mejorar el cuidado de la salud como reducir los gastos generales debido a que existe un gran costo de medicamentos 0 innecesarios, medicamentos inefectivos y medicamentos con efectos secundarios. Las mutaciones en los genes de MDR-1 variantes algunas veces resu ltan en eliminación (es), inserción(es) y en particular substitución(es) de aminoácidos ya sea sola(s) o en combinación . !5 También es posible por supuesto formar genéticamente tales mutaciones en genes de tipo silvestre u otras formas mutantes. Los métodos para introducir ta les modificaciones en la secuencia de ADN de gen de MDR-1 se conocen bien por la persona experta en la materia , ver, por ejemplo, Sambrook Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor 0 Laboratory (1 989) N . Y. En una modalidad preferida de la invención , el polin ucleótido arriba descrito codifica una prote ína de MDR-1 variante o fragmento de la misma , por ejemplo, comprendiendo uno o más epítopos de la secuencia de aminoácidos codificada por SEQ ID NOs: 85, 97, 1 08 o 1 74. 5 La investigación de la naturaleza de las alteraciones en la secuencia de aminoácidos de los programas computaciones de proteína de MDR-1 puede utilizarse, tal como BRASMOL que se obtiene de la Internet. Además, las simulaciones de dobles y rediseño por computadora de motivos estructu ral pueden realizarse utilizando otros programas por com putadora (Olszewski Proteins, 25 ( 1 996) ; 286-2999 ; Hoffman , Comput. Appl . Biosci 1 1 (1 995), 675-579). Las computadoras pueden utilizarse para el análisis energético y conformacional de modelos de proteína detallados (Monge , J . Mol. Biol. 247 (1995) 995-101 2; Renouf, Adv. Exp. Med . Biol . 376 (1995), 37-45). Estos análisis pueden utilizarse para la identificación de la influencia de una mutación particular en unión y/o transporte de medicamentos. Usualmente, la eliminación , adición o substitución del aminoácido en la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el polinucleótido de la invención se debe a una o más substituciones, inserciones o eliminaciones de nucleótidos, o cualquier combinaciones de las mismas. Preferentemente, dicha substitución , inserción o eliminación de nucleótidos resulta en una substitución de aminoácido de Asn21 por Asp en exon 2; Phe 1 03 por Ser o Leu en exon 5 y/o Ser400 por Asn en exon 1 1 del gen de MDR-1 . El polinucleótido de la invención puede comprender además al menos un nucleótido y opcionalmente la eliminación, adición y/o substitución de aminoácido diferente a aquella especificada en la presente , anteriormente, por ejemplo aquellas descritas en la técnica anterior, por ejemplo, Mickley ( 1 998). Esta modalidad de la presente invención permite el estudio de efectos sinergísticos de las mutaciones en el gen de MDR-1 en el perfil farmacológico de medicamentos en pacientes que portan tales formas mutantes del gen o formas mutantes similares que pueden imitarse por las proteínas arriba descritas. Se espera que el análisis de dichos efectos sinergísticos proporcione penetraciones más profundas en el inicio de fenotipos resistentes a multimedicamento de ciertas formas de cáncer. A partir de dicha penetración profunda, el desarrollo de composiciones farmacéuticas y de diagnóstico relacionadas con el cáncer se beneficiarán grandemente. De esta manera, en una modalidad preferida, la presente invención se refiere a polinucleótidos de genes de MDR-1 variantes, moleculares, en donde la eliminación, adición y/o substitución de nucleótido resulta en expresión alterada del gen de MDR-1 variante en comparación con el gen de tipo silvestre correspondiente. El polinucleótido de la invención puede ser, por ejemplo, ADN, cADN , ADN genómico, ARN o ARN o ADN sintéticamente producido o una molécula de ácido nucleico quimérica recombinántemente producida que comprende cualquiera de aquellos polinucleótidos ya sea solos o en combinación. Preferentemente, dicho polinucleótido es parte de un vector, particularmente plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos utilizados convencionalmente en ingeniería genética que comprende un polinucleótido de la invención, tales vectores pueden comprender además genes tales como genes marcadores que permiten la selección de dicho vector en una célula huésped adecuada bajo condiciones adecuadas. En una modalidad preferida, adicional del vector de la invención, el polinucleótido de la invención se enlaza operativamente a las secuencias de control de expresión que permiten la expresión en células eucarióticas o procarióticas. La expresión de dicho polinucleótido comprende la transcripción del polinucleótido, preferentemente en un mARN traducible. Los elementos reguladores que aseguran la expresión en células eucarióticas, preferentemente células mamlferas, se conocen bien por aquellos expertos en la materia. Usualmente comprenden secuencias reguladoras que aseguran la iniciación de transcripción y opciona lmente señales de poli-A que aseguran la terminación de transcripción y estabilización de la transcripción. Los elementos regu ladores adicionales puede incluir también aumentadores de traducción . Los elementos reguladores posibles que permiten la expresión en células huésped procarióticas comprenden , por ejemplo, el promotor lac, trp o tac en E. coli, y ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped eucarióticas son el promotor AOX1 o GAL 1 en levadura o el promotor CMV, SV40, RSV (virus de sarcoma Rous), aumentador de CMV, aumentador de SV40 o un intron de globin en células de mamífero y de otro animal . Más allá de los elementos que son responsables de la iniciación de transcripción tales elementos reguladores pueden también comprender las señales de terminación de transcripción tales como el sitio SV40-poli-A o el sitio tk-poli-A, aguas abajo del polinucleótido. En este contexto, los vectores de expresión adecuados se conocen en la materia tales como vector de expresión de cADN Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcADN I , pcADN3 (In-vitrogene), pSPORTI (GIBCO BRL). Preferentemente, dicho vector es un vector de expresión y/o un vector objetivo o de transferencia de gen . Los vectores de expresión derivados de los virus tales como retrovirus, virus de vacu na , virus adeno-asociados, virus del herpes o virus de papiloma bovino, pueden utilizarse para suministrar los polinucleótidos o vector de la invención en población celular objetivo. Los métodos que se conocen bien por aquellos expertos en la materia, pueden utilizarse para construir vectores virales recombinantes, ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manial, Cold Spring Harbor Laboratory (1 989) N .Y. y Ausuble, Current Protocole in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N .Y. ( 1994). Alternativamente, los polinucleótidos y vectores de la invención pueden reconstituirse en liposomas para el suministro a células objetivo. La presente invención se relaciona además a células huésped tra nsformadas con un polin ucleótido o vector de la invención. Dicha célula huésped puede ser una célula procariótica o eucariótica; ver supra. El polinucleótido o vector de la invención que se encuentra presente en la célu la huésped puede ya sea integrarse en el genoma de la célula huésped o puede mantenerse extracromosomalmente. En este aspecto, también debe entenderse que la molécula de ADN recombinante de la invención puede utilizarse para "objetivo de gen" y/o "reemplazo de gen", para resta u rar un gen muíante o para crear un gen mutante a través de la recombinación homologa; ver por ejemplo, Mouellic, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87 (1 990), 4712-4716; Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Press. La célula huésped puede ser cualquier célula eucariótica o procariótica, tal como una célula bacterial, de insecto, fungal, vegetal, a nimal o humana. Las célu las fúngales preferidas son, por ejemplo, aq uellas del género Saccharomyces, en particular aquellas de las especies S . cerevisiae. El término "procariótica" significa incluir todas las bacterias que pueden transformarse o transfectarse con un polinucleótido para ia expresión de una proteína de DR-1 variante o fragmento de la misma . Los h uésped procarióticos pueden incluir bacterias de gram negativo así como también gram positivo tales como, por ejemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtiüs. Un polinucleótido que codifica una forma muíante de proteínas variantes de MDR-1 puede utilizarse para transformar o transfectar el huésped utilizando cualquiera de las técnicas comúnmente utilizadas conocidas por aquellos de experiencia ordinaria en la materia. Los métodos para preparar genes operativa mente enlazados, fusionados y expresarlos en células animales o bacteriales se conocen bien en la materia (Sambrook, supra). Las construcciones genéticas y métodos descritos en la presente pueden utilizarse para expresión de proteínas de MDR-1 variantes en, por ejemplo, h uésped procarióticos. En general, los vectores de expresión que contienen secuencias promotoras que facilitan la transcripción eficiente del polinucleótido insertado se utilizan en conexión con el huésped. El vector de expresión típicamente contiene un origen de replicación , un promotor, y un terminador así como también genes específicos que son capaces de proporcionar selección fenotípica de las células transformadas. Los huéspedes procarióticos transformados pueden desarrollarse en fermentadores y cultivarse de acuerdo con las técnicas conocidas en la materia para lograr el crecimiento celular óptimo.

Las prote ínas de la invención pueden aislarse entonces del medio desarrollado, lisatos celulares, o fracciones de membrana celulares. El aislamiento y purificación de los polipétidos microbialmente o de otra manera expresados de la invención puede ser por cualquier medio convencional tal como, por ejemplo, separaciones cromatográficas preparativas y separaciones inmunológicas tales como aquellas que incluyen el uso de anticuerpos policlonales o monoclonales. De esta manera, en una modalidad adicional la invención se refiere a un método para la producción de proteínas de MDR-1 variantes y fragmentos de los mismos que comprende cultivar una célula huésped como se define arriba bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína y recuperación del fragmento o proteína producida del cultivo. En otra modalidad, la presente invención se refiere a un método para producir células capaces de expresar un gen de MDR-1 vanante que comprende células que se forman genéticamente con el polinucleótido o con el vector de la invención. Las células obtenibles por el método de la invención pueden utilizarse, por ejemplo, para probar medicamentos de acuerdo con los métodos descritos en D. L. Spector, R. D. Goldman , L. A. Leinwand, Cells, a Lab Manual, CSH Press 1 998. Además, las células pueden utilizar para estudiar medicamentos conocidos y derivados desconocidos de los mismos por su habilidad para complementar la deficiencia de transporte de medicamento causada por mutaciones en el gen de MDR-1 . Para estas modalidades, las células huésped carecen preferentemente de un alelo de tipo silvestre, preferentemente ambos alelos del gen de MDR-1 y/o tiene al menos uno mutado del mismo, alternativamente, la fuerte sobreexpresión de un alelo mutado sobre el alelo normal y comparación con una estirpe recombinante que sobreexpresa el alelo normal en un nivel similar puede utilizare como un sistema de análisis y selección . Las células obtenibles por el método arriba descrito también pueden utilizarse por los métodos de selección referidos en la presente abajo. Además, la invención se refiere a una proteína de MDR-1 variante o fragmentos de la misma codificada por un polinucleótido de acuerdo con la invención u obtenible por los métodos arriba descritos o de las células producidas por el método arriba descrito. En este contexto también se entiende que las proteínas de MDR-1 variantes de acuerdo con la invención pueden modificarse además por los métodos convencionales conocidos en la materia. Al proporcionar las proteínas de MDR-1 variantes de acuerdo a la presente invención también es posible determinar las porciones relevantes para su actividad biológica o inhibición de las mismas, principalmente su actividad de transporte de medicamento. La presente invención se refiere además a anticuerpos que reconocen específicamente una proteína de MDR-1 variante de acuerdo a la invención . Ventajosamente, el anticuerpo reconoce específicamente un epítopo que contiene una o más substituciones de aminoácido, como se define arriba. Los anticuerpos contra la proteína de MDR-1 variante de la invención puede prepararse por métodos bien conocidos utilizando una proteína purificada de acuerdo con la invención o un fragmento (sintético) derivado de la misma como un antígeno. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse, por ejemplo, por las técnicas como se describen originalmente en Kóhler y Milstein, Nature 256 (1 975), 495, y Galfré, Meth. Enzymol. 73 ( 1 981 ), 3, que comprenden la fusión de células de mieloma de ratón a células de bazo derivadas de mamíferos inmunizados. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales o anticuerpos sintéticos así como también fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos Fab, Fv o scFv etc. Además, los anticuerpos o fragmentos de los mismos para los polipéptidos arriba mencionados pueden obtenerse al utilizar métodos que se describen, por ejemplo, en Harlow y Lañe "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Estos anticuerpos pueden utilizarse, por ejemplo, para la inmunoprecipitación e inmunolocalización de las proteínas de MDR-1 variantes de la invención así como también el monitoreo de la presencia de tales proteínas de MDR-1 variantes, por ejemplo, en organ ismos recombinantes, y para la identificación de compuestos que interactúan con las proteínas de acuerdo con la invención. Por ejemplo, la resonancia de plasmón de superficie como se emplea en el sistema BIAcore puede utilizarse para incrementar la eficiencia de anticuerpos fago que se unen a un epítopo de la proteína de la invención (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 ( 1 996); 97-1 05; Malmborg, J. Immunol. Methods 1 83 ( 1 995), 7-13). Además, las presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que representan o comprende el filamento complementario de cualquiera de los polinucleótidos arriba descritos o una parte de los mismos, comprendiendo así al menos una diferencia de nucleótido en comparación con las secuencias de nucleótidos del gen de MDR-1 de tipo silvestre correspondientes especificadas por las substituciones, eliminaciones y adiciones de nucleótido arriba descritas. Tal molécula puede ser ya sea un ácido deoxiribonucléico o un ácido ribonucléico . Tales moléculas comprenden, por ejemplo, ARN antisensible. Estas moléculas pueden además enlazarse a secuencias que cuando se tra nscriben codifican un ribosoma produciendo mediante lo cual un ribosoma que separa específicamente las transcripciones de polinucleótidos de acuerdo a la invención. Además, la presente invención se refiere a un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención . Ejemplos de tales vectores se describen arriba. preferentemente, la molécula de ácido nucleico presente en el vector se enlaza operativamente a elementos reguladores que permiten la expresión en células huésped procarióticas o eucarióticas; ver supra . La presente invención también se refiere a un método para la producción de un animal no humano transgénico, preferentemente ratón transgénico, que comprende la introducción de un polinucleótido o vector de la invención en una célula germinal, una célula embriónica, o un huevo o célula derivada de los mismos. El animal no humano puede utilizarse de acuerdo con el método de la invención descrito abajo y puede ser un a n imal saludable no transgénico, o puede tener un desorden , preferentemente un desorden causado por al menos una mutación en el gen de MDR-1 . Tales animales transgénicos se adecúan bien , por ejemplo, para estudios farmacológicos de medicamentos en conexión con formas variantes de las proteínas de MDR-1 variantes arriba descritas ya que estas proteínas o al menos sus dominios funcionales se conservan entre especies en ecuariotas más elevadas, particularmente en mamíferos. La producción de embriones transgénicos y la selección de aquellos pueden realizarse, por ejemplo, como se describe por A. L. Joyner Ed. , Gene Targeting, A Practical Approach (1993) Oxford University Press. El ADN de los embriones puede analizarse utilizando, por ejemplo, Southern blots con una sonda apropiada. La invención también se refiere a animales no humanos transgénicos tales como ratón transgénico, ratas, hámsteres, perros, monos, conejos, puercos, C. elegans y pescado tales como pescado torpedo que comprende un polinucleótido o vector de la invención u obtenido por el método arriba descrito, preferentemente en donde dicho polinucleótido o vector se integra establemente en el genoma de dicho animal no humano, preferentemente de manera que la presencia de dicho vector o polinucleótido conduce a la expresión de la proteína de MDR-1 variante de la invención. Puede tener una o varias copias de los mismos o diferentes polinucleótidos del gen de MDR-1 variante. Este animal tiene numerosas utilidades, incluyendo como un modelo de investigación para resistencia a multimedicamento y por lo tanto, presenta un nuevo y valuabie animal en el desarrollo de terapias, tratamiento, etc. , para enfermedades causadas por deficiencia o falla de retención del medicamento en la célula. De acuerdo con lo anterior, en este caso, el mamífero es preferentemente un animal de laboratorio tal como un ratón o rata.

Preferentemente, el animal no humano transgénico de la invención comprende además al menos un alelo de tipo silvestre inactivo del gen de MDR-1 . Esta modalidad permite, por ejemplo, el estudio de la interacción de varias formas variantes de proteínas de MDR-1 . También puede ser deseable inactivar la función o expresión del gen de MDR-1 en una cierta etapa de desarrollo y/o vida del animal transgénico. Esto puede lograrse al utilizar, por ejemplo, promotores inducibles y/o regulados por célula y/o de desarrollo, específicos de tejido que accionan la expresión de, por ejemplo, un ribosoma o antisensible dirigido contra la transcripción de ARN del gen de MDR-1 ; ver también supra. Un sistema inducible adecuado es por ejemplo expresión del gen regulado por tetraciclina como se describe, por ejemplo, por Gossen y Bujard (Proc. Nati. Acad. Sci. 89 USA (1992), 5547-5551 ) y Gossen et al., (Trends Biotech, 12 (1994), 58-62). Similar, la expresión del gen de MDR-1 variante puede controlarse por tales elementos reguladores. Con los polinucleótidos de MDR-1 variantes y proteínas y vectores de la invención , ahora es posible estudiar ¡n vivo e in vitro la eficiencia de medicamentos en relación con las mutaciones particulares en el gen de MDR-1 de un paciente y el fenotipo afectado. Además, las proteínas de MDR-1 variantes de la invención pueden utilizarse para determinar el perfil farmacológico de medicamentos y para la identificación y preparación de medicamentos adicionales que pueden ser más eficaces para el tratamiento de, por ejemplo, cáncer, en particular para la mejora de ciertos fenotipos causados por las mutaciones respectivas tales como aquellas arriba descritas.

De esta manera , un objeto particular de la presente invención concierne a la formulación y selección de medicamento/pro-medicamento de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de enfermedades que están sujetas a quimioterapia considerando el polimorfismo de la forma va ria nte del gen de MDR-1 que se cosegrega con el fenotipo afectado del paciente por tratarse. Esto permite la seguridad y aplicación económica de med icamentos que por ejemplo hasta la fecha se consideraban no apropiados para la terapia de, por ejemplo, cáncer debido a ya sea sus efectos secundarios en algunos pacientes y/o su perfil farmacológico no confiable con respecto al mismo o diferente(s) fenotipo(s) de la enfermedad . Los medios y métodos descritos en la presente pueden utilizarse , por ejemplo, para mejorar las recomendaciones de dosis y permitir al que prescribe anticipar los ajustes de dosis necesarios dependiendo del grupo de pacientes considerado. En una modalidad adicional, la presente invención se refiere a un método para identificar y obtener un inhibidor de MDR-1 capaz de modular la actividad de una variante molecular del gen de MDR-1 o su prod ucto genético, que comprende las etapas de (a) contactar la proteína de MDR-1 variante o una célula que expresa un gen de MDR-1 variante, molecular que comprende u n polinucleótido de la invención en la presencia de componentes capaces de proporcionar una señal detectable en respuesta al transporte de medicamento, con un compuesto a seleccionarse bajo condiciones para permitir el transporte de medicamento mediado por MDR-1 , y (b) detectar la presencia o ausencia de una señal o incremento de una señal generada del transporte de medicamento, en donde la presencia o incremento de la señal es indicativa de un inhibidor putativo. El término "compuesto" en un método de la invención incluye una substancia única o una pluralidad de substancias que pueden o no ser idénticas. Dicho(s) compuesto(s) puede(n) sintetizarse químicamente o producirse a través de fermentación microbial pero también puede(n) comprenderse de, por ejemplo, muestras, por ejemplo, extractos celulares, de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos. Además, dichos compuestos pueden conocerse en la materia pero hasta la fecha no se sabe que sean útiles como un inhibidor, respectivamente. La pluralidad de compuestos puede, por ejemplo, agregarse al medio de cultivo o inyectarse en una célula o animal no humano de la invención. Si una muestra que contiene (a) compuesto(s) se identifica en el método de la invención, entonces es posible ya sea aislar el compuesto de la muestra original identificada como conteniendo el compuesto, en cuestión o uno puede subdividir además la muestra original, por ejemplo, si consiste de una pluralidad de compuestos diferentes, para reducir el número de substancias diferentes por muestra y repetir el método con las subdivisiones de la muestra original. Puede determinarse entonces si dicha muestra o compuesto despliega las propiedades deseadas, por ejemplo, por los métodos descritos en la presente o en la literatura (Spector et al. , Cells manual: ver supra). Dependiendo de la complejidad de las muestras, las etapas descritas arriba pueden realizarse varias veces, preferentemente hasta que la muestra identificada de acuerdo con el método de la invención solamente comprenda un número limitado de o solamente una substancia(s). preferentemente, dicha muestra comprende substancias de propiedades físicas y/o químicas similares, y más preferentemente dichas substancias son idénticas. Los métodos de la presente invención pueden realizarse fácilmente y diseñarse por la persona experta en la materia, por ejemplo, de acuerdo con otros análisis en base a la célula descritos en la técnica anterior o al utilizar y modificar los métodos como se describen en la presente. Además, la persona experta en la materia reconocerá fácilmente que los compuestos adicionales y/o enzimas pueden utilizarse con objeto de realizar los métodos de la invención, por ejemplo, enzimas, si es necesario, que convierten un cierto compuesto en el precursor que a su vez representa un substrato para la proteína de MDR-1 . Tal adaptación del método de la invención se encuentra bien dentro de la experiencia de la persona experta en la materia y puede realizarse sin experimentación indebida. Los compuestos que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención incluyen péptidos, proteínas, ácidos nucléicos, anticuerpos, compuestos orgánicos pequeños, ligadnos, peptidomiméticas, PNAs y lo similar. Dichos compuestos también pueden ser análogos o derivados funcionales de medicamentos conocidos tales como verapamil o ciclosporin. Los métodos para la preparación de derivados químicos y análogos se conocen bien por aquellos de experiencia en la materia y se describen en, por ejemplo, Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer Edition Nueva York Inc. , 1 75 Fifth Avenue, Nueva York, N.Y. 1 0010 U.S. A. y Organic Synthesis, Wiley, Nueva York, USA. Además, dichos derivados y análogos pueden probarse para sus efectos de acuerdo con los métodos conocidos en la materia o como se describe. Además, las imitaciones de péptido y/o diseño auxiliado por computadora de análogos y derivados de medicamento apropiados pueden utilizarse, por ejemplo, de acuerdo a los métodos descritos abajo. Tales análogos comprenden moléculas que tienen como la estructura base de substratos de MDR conocidos y/o inhibidores y/o moduladores; ver infra. Los programas de computadora apropiados pueden utilizarse para ia identificación de sitios interactivos de un inhibidor putativo y la proteína de MDR-1 de la invención por el asistente de computadora busca los motivos estructurales complementarios (Fascina, Imnmunomethods 5 (1994), 1 14-120). Los sistemas de computadora apropiados, adicionales para el diseño auxiliado por computadora de proteína y péptidos se describen en la técnica anterior, por ejemplo, en Berry, Bichem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann , N.Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1 -13; Pabo Biochemistry 25 (1986), 5987-5991 . Los resultados obtenidos del análisis por computadora arriba descrito pueden utilizarse en combinación con el método de la invención para, por ejemplo, optimizar inhibidores conocidos. Los peptidomiméticos apropiados y otros inhibidores pueden también identificarse por la síntesis de bibliotecas combinatorias peptidomiméticas a través de la prueba y modificación química sucesiva de los compuestos resultantes, por ejemplo, de acuerdo a los métodos descritos en la presente. Los métodos para la generación y uso de bibliotecas combinatorias peptidomiméticas se describen en la técnica anterior, por ejemplo en Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 y Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715. Además, la estructura cristalográfica y/o tri-dimensional de inhibidores y la proteína de MDR-1 de la invención puede utilizarse para el diseño de medicamentos peptidomiméticos (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenberg, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996) 1545-1558). En resumen, la presente invención proporciona métodos para identificar y obtener compuestos que pueden utilizarse en dosis específicas para el tratamiento de formas específicas de enfermedades, por ejemplo, cáncer, la quimioterapia del cual se complica por los malos funcionamientos del gen de MDR-1 que resultan con frecuencia en un fenotipo sensible o resistente al medicamento. En una modalidad preferida del método de la invención dicha célula es una célula de u, obtenida por el método de la invención o se comprende en el animal no humano transgénico, arriba descrito. En una modalidad adicional, la presente invención se refiere a un método para identificar y obtener un inhibidor de MDR-1 capaz de modular la actividad de una variante molecular del gen de MDR-1 o su producto genético que comprende las etapas de (a) contactar la proteína de MDR-1 variante de la invención con una primer molécula conocida por unirse por la proteína MDR-1 para formar un primer complejo de dicha proteína y dicha primer molécula; (b) contactar dicho primer complejo con un compuesto por seleccionarse; y (c) medir si dicho compuesto desplaza dicha primer molécula de dicho primer complejo. Ventajosamente, en dicho método dicha etapa de medición comprende medir la formación de un segundo complejo de dicha proteína y dicho candidato inhibidor. Preferentemente, dicha etapa de medición comprende medir la cantidad de dicha primer molécula que no se une a dicha proteína. En una modalidad particularmente preferida del método arriba descrito de dicha primer molécula es Verapamil, Vaispodar, Ciclosporin A o dexniguldipina. Además, se prefiere que en el método de la invención dicha primer molécula se marque, por ejemplo, con una marca fluorescente o radioactiva. En todavía una modalidad adicional, la presente invención se refiere a un método para diagnosticar un desorden relacionado con la presencia de un gen de MDR-1 variante, molecular o susceptibilidad a tal desorden que comprende (a) determinar la presencia de un polinucleótido de la invención en una muestra de un sujeto; y/o (b) determinar la presencia de una forma variante de la proteína de MDR-1 , por ejemplo, con el anticuerpo de la invención . De acuerdo con esta modalidad de la presente invención , el método para probar el estatus de un desorden o susceptibilidad a tal desorden puede efectuase al utilizar un polinucleótido o una molécula de ácido nucleico de la invención, por ejemplo, en la forma de un Southern o Northern blot o análisis in situ. Dicha secuencia de ácidos nucleicos puede hibridizarse a una región de codificación de cualquiera de los genes o a una región sin codificación, por ejemplo, intron. En el caso de que una secuencia complementaria se emplee en el método de la invención, dicha molécula de ácido nucleico puede de nuevo utilizarse en Northern blots. Adicionalmente, dicha prueba puede hacerse junto con un bloqueo actual, por ejemplo, de la transcripción del gen y de esta manera se espera que tenga relevancia terapéutica. Además, una carga de inicio u oligonucleótido puede también utilizarse para hibridizarse a uno de los genes de MDR-1 arriba mencionados o mARNs correspondientes. Los ácidos nucleicos utilizados para la hibridización pueden, por supuesto , marcarse convenientemente al incorporar o unir, por ejemplo, un radioactivo u otro marcador. Tales marcadores se conocen bien en la materia. La marcación de dichas moléculas de ácido nucleico puede efectuarse por métodos convencionales. Adicionalmente, la presencia o expresión de genes de MDR-1 variantes puede monitorearse al utilizar un par de cargas de inicio que se hibridizan específicamente a cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes y al llevar a cabo una reacción de PCR de acuerdo con procedimientos estándar. La hibridización específica de las sondas o cargas de inicio arriba mencionadas preferentemente ocurre en condiciones de hibridización exigentes. El término "condiciones de hibridización exigentes" se conoce bien en la materia, ver por ejemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" segunda ed. , CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989; "N ucleic Acid Hybridisation , A Practical Approach", Hames y Higgins eds. , I RL Press, Oxford , 1 985. Además, mARN, cARN , cADN o ADN genomico obtenido del sujeto puede secuenciarse para identificar las mutaciones que pueden ser huellas digitales características de mutaciones del gen de MDR-1 . La presente invención comprende además los métodos en donde tal huella digital puede generarse por RFLPs de ADN o ARN obtenido del sujeto, opcionalmente el ADN o ARN pueden a mplificarse antes de analizarse, los métodos de los cuales se conocen bien en la materia . Las h uellas digitales de ARN pueden realizarse al, por ejemplo, digerir una muestra de ARN obtenida del sujeto con un ARN-Enzima adecuado, por ejemplo RNasa 1 , RNasa T2 o lo similar o un ribosoma y, por ejemplo, separar y detectar electroforéticamente los fragmentos de ARN como se describe arriba . Las modificaciones adicionales de la modalidad arriba descrita de la invención puede divisarse fácilmente por la persona experta en la materia, sin ning una experimentación indebida de esta descripción , ver, por ejemplo, los ejemplos. Una modalidad adicional de la presente invención se refiere a un método en donde dicha determinación se efectúa a l emplear un anticuerpo de la invención o fragmentos del mismo. El anticuerpo utilizado en el método de la invención puede marcarse con etiquetas detectables tales como señales de histidina o una molécula de biotina . En una modalidad preferida de la presente invención, los métodos arriba descritos comprenden PCR, reacción en cadena de ligasa , digestión de restricción, secuenciación directa , técnicas de amplificación de ácido nucleico, técnicas de hibridización o inmunoanálisis (Sambrook et al. , loe. cit. CHS cloning , Harlow y Lañe loe. Cit. CHS antibodies). En una modalidad preferida del método de la presente invención dicho desorden es cáncer. En una modalidad adicional del método arriba descrito, una etapa adicional que comprende administrar al sujeto un medicamento para abolir o aliviar dichas variaciones en el gen de MDR-1 de acuerdo con todas las aplicaciones del método de la invención , permite el tratamiento de una enfermedad dada antes del inicio de los síntomas clínicos debidos a la respuesta del fenotipo causada por el gen de MDR-1 . En una modalidad preferida del método de la invención dicho med icamento son agentes q uimioterapéuticos tales como adriamicina , doxorubicina, paclitaxol (taxol) y otros substratos de MDR. Ambudkar SV. , er al. , Annu . Rev. Pharmacol . Toxicol. 39 (1 999), 361 -398. E n otra modalidad preferida de los métodos arriba descritos, d icho método comprende además introducir (i) un gen de MDR-1 de tipo silvestre expresible y funcional o (ii) un vector o molécula de ácido nucleótido de la invención en células En este contexto y como se utiliza por toda esta especificación , el gen de MDR-1 "funcional" significa un gen en donde la proteína codificada tiene parte o toda la conformación estructural primaria de la proteína de MDR-1 de tipo silvestre, es decir, posee la propiedad biológica de mediar el transporte de medicamento a través de la membrana. Esta modalidad de la presente invención se ajusta para terapia de cáncer, enfermedades inflamatorias, neuronales, enfermedades de CNS o enfermedades cardiovasculares, en particular en humanos. La detección de la expresión de un gen de MDR-1 variante permitiría la conclusión de que dicha expresión se interrelaciona con la generación o mantenimiento de un fenotipo correspondiente de la enfermedad. De acuerdo con lo anterior, una etapa se aplicaría para reducir el nivel de expresión a niveles bajos o abolir el mismo Esto puede hacerse por ejemplo, por al menos la eliminación parcial de la expresión del gen muíante por medios biológicos, por ejemplo, por el uso de ribosomas, moléculas de ácido nucleico antisensibles, anticuerpos intracelulares o los inhibidores arriba descritos contra las formas variantes de estas proteínas de MDR-1 . Además, los productos farmacéuticos pueden desarrollarse, los cuales reducen los niveles de expresión de las proteínas mutantes correspondientes y genes. En una modalidad adicional, la invención se refiere a un método para la producción de una composición farmacéutica que comprende las etapas de cualquiera de los métodos arriba descritos y sintetizar y/o formular el compuesto identificado en la etapa (b) o un derivado u homólogo del mismo en una forma farmacéuticamente aceptable. Los compuestos terapéuticamente útiles identificados de acuerdo con el método de la invención pueden formularse y administrarse a un paciente como se trata arriba. Para usos y dosis terapéuticas determinadas apropiadas por un experto en la materia ver infra. Además, la presente invención se refiere a un método para la preparación de una composición farmacéutica que comprende las etapas de los métodos arriba descritos; y formular un medicamento o promedicamento en la forma adecuada para aplicación terapéutica y evitar o mejorar el desorden del sujeto diagnosticado en el método de la invención. Los medicamentos o pro-medicamentos después de su administración in vivo se metabolizan con objeto de eliminarse ya sea por excreción o por metabolismo en uno o más metabolitos activos o inactivos (Meyer, J. Pharmacokinet, Biopharm. 24 (1996), 449-459). De esta manera, en lugar de utilizar el inhibidor o compuesto actual identificado y obtenido de acuerdo con los métodos de la presente invención, una formulación correspondiente como un pro-medicamento puede utilizarse, el cual se convierte en su activo en el paciente. Las medidas precautorias que pueden tomarse para la aplicación de pro-medicamentos y medicamentos se describen en la literatura; ver, para revisión, Ozama, J. Toxicol. Sci. 21 (1996), 323-329). En una modalidad preferida del método de la presente invención dicho medicamento o pro-medicamento es un derivado de un medicamento como se define anteriormente. En una modalidad aún adicional la presente invención se refiere a un inhibidor identificado u obtenido por el método descrito anteriormente. Preferentemente, el inhibidor se une específicamente a la proteína de MDR-1 variante de la invención. Los anticuerpos, moléculas de ácido nucleico e inhibidores de la presente invención preferentemente tienen una especificidad al menos substancialmente idéntica a la especificad de unión del ligando natural o socio de unión de la proteína de MDR-1 de la invención. Un anticuerpo o un inhibidor puede tener una afinidad de unión a la proteína de MDR-1 de la invención de al menos 105 M1, preferentemente más elevada que 107 y ventajosamente hasta 108 M"1 en caso de que la actividad de MDR-1 deba reprimirse. Por lo tanto, en una modalidad preferida, un inhibidor o anticuerpo supresor de la invención tiene una afinidad de al menos aproximadamente 10"7 M, preferentemente al menos aproximadamente 10"9 M y más preferentemente al menos aproximadamente 10"11 M. Además, la presente invención se refiere al uso de un oligo o polinucleótido para la detección de un polinucleótido de la invención y/o para la genotipación de alelos de MDR-1 individuales correspondientes. Preferentemente dicho oligo o polinucleótido es una molécula de ácido nucleico o polinucleótido de la invención descrita antes. En una modalidad preferida particular dicho oligonucleotido es aproximadamente 10 a 100, más preferentemente 15 a 50 nucleótidos en longitud y comprende la secuencia de nucleótidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 179 de una secuencia mutada ("mut") o de tipo silvestre ("ts") del promotor o de un exon del gen de MDR-1 representado en la Tabla 8 o una secuencia complementaria de cualquiera de aquellos. Por lo tanto, en todavía una modalidad, la presente invención se refiere a una carga de inicio o sonda que consiste de un oligonucleotido como se define arriba. En este contexto, el término "que consiste de" significa que la secuencia de nucleótidos arriba descrita y empleada por la carga de inicio y sonda de la invención no tiene ninguna secuencia de nucleótidos adicional del gen de MDR-1 inmediatamente adyacente en su extremo 5' y/o 3'. Sin embargo, otros elementos tales como marcas, por ejemplo, moléculas de biotina, señales de histidina, fragmentos de anticuerpo, oro coloidal, etc, así como también secuencias de nucleótidos que no corresponde al gen de MDR-1 pueden estar presentes en la carga de inicio y sondas de la presente invención. Además, también es posible utilizar las secuencias de nucleótidos particulares arriba descritas y combinarlas con otras secuencias de nucleótidos derivadas del gen de MDR-1 en donde estas secuencias de nucleótidos adicionales se interponen con elementos diferentes a ácidos nucleicos o en donde el ácido nucleico no corresponde a las secuencias de nucleótidos del gen de MDR-1. Además, la presente invención se refiere al uso de un anticuerpo o un substancia capaz de unirse específicamente al producto genético de un gen de MDR-1 para la detección de la proteína de MDR-1 variante de la invención, la expresión de un gen de MDR-1 variante molecular comprende un polinucleótido de la invención y/o para distinguir alelos de MDR-1 comprende un polinucleótido de la invención. Además, la presente invención se refiere a una composición, preferentemente composición farmacéutica que comprende el anticuerpo, la molécula de ácido nucleico, el vector o el inhibidor de la presente invención, y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones farmacéuticas que comprende, por ejemplo, el inhibidor o sales farmacéuticamente aceptables del mismo pueden administrarse convenientemente por cualquiera de las vías convencionalmente utilizadas para administración de medicamentos, por ejemplo, oralmente, tópicamente, parenteralmente o por inhalación. Las sales aceptables comprenden acetato, metiléster, HCI, sulfato, cloruro y lo similar. Los compuestos pueden administrarse en formas de dosis convencionales preparadas al combinar los medicamentos con vehículos farmacéuticos estándar de acuerdo a procedimientos convencionales. Estos procedimientos pueden incluir mezclar, granular y comprimir o disolver los ingredientes según sea apropiado a la preparación deseada. Se apreciará que a forma y carácter del diluyente o carácter farmacéuticamente aceptable se dicta por la cantidad de ingrediente activo con el cual está por combinarse, la vía de administración y otras variables bien conocidas. El (los) vehículo(s) debe(n) ser "aceptable(s)" en el sentido de ser compatible(s) con los otros ingredientes de la formulación y no dañino(s) al receptor del (los) mismo(s). El vehículo farmacéutico empleado puede ser, por ejemplo, ya sea un sólido o un líquido. Los ejemplos de vehículos sólidos son la lactosa, térra alba, sucrosa, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, estearato de magnesio, ácido esteárico y lo similar. Los ejemplos de vehículos líquidos son solución de salina regulada de fosfato, jarabe, aceite tal como aceite de maní o aceite de olivo, agua, emulsiones, diversos tipos de humectantes, soluciones estériles y lo similar. De manera similar, el vehículo o diluyente puede incluir material retardador bien conocido en la materia, tal como mono-estearato de glicerilo o diesterato de glicerol solo o con una cera. El régimen de dosis se determinará por el médico y otros factores clínicos; preferentemente de acuerdo con cualquiera de los métodos arriba descritos. Como se sabe bien en las materias médicas, las dosis de cualquier paciente depende de muchos factores, incluyendo el tamaño del paciente, área de superficie corporal, edad, el compuesto particular a administrarse, sexo, tiempo y vía de administración, salud general, y otros medicamentos que se administran corrientemente. El progreso puede monitorearse por valoración periódica. Además, el uso de composiciones farmacéuticas que comprende oligonucleótidos antisensibles que específicamente se hibridizan en ARN que codifica versiones mutadas de un gen de MDR-1 de acuerdo con la invención y que comprenden anticuerpos que reconocen específicamente la proteína de MDR-1 mutada pero no o no substancíalmente la forma de tipo silvestre funcional, es concebible en caso en los cuales la concentración de la forma mutada en las células debe reducirse. Gracias a la presente invención, la selección de medicamento particular, régimen de dosis y pacientes correspondientes a tratarse pueden determinarse de acuerdo con la presente invención. Las recomendaciones de dosis se indicarán en la marcación del producto al permitir que el que prescribe anticipe los ajustes de dosis dependiendo del grupo de pacientes considerado, con información que evita prescribir el medicamento equivocado a los pacientes equivocados en la dosis equivocada. Además, la presente invención se refiere a un equipo o composición de diagnóstico que comprende cualquiera de los polinucleótidos, vectores, células huésped, proteínas de MDR-1 variantes, anticuerpos, inhibidores, moléculas de ácido nucleico o los vectores correspondientes, arriba mencionados de la invención, y opcionalmente medios adecuados para su detección. El equipo de la invención puede contener ingredientes adicionales tales como marcadores de selección y componentes para los medios selectivos adecuados para la generación de animales y células transgénicas. El equipo de la invención puede íi utilizarse ventajosamente para llevar a cabo un método de la invención y podría emplearse, ínter alia, en una variedad de aplicaciones, por ejemplo, en el campo de diagnóstico o como una herramienta de búsqueda. Las partes del equipo de la invención pueden empacarse individualmente en frascos o en combinación en contenedores o unidades de 0 multicontenedores. La elaboración del equipo sigue preferentemente procedimientos estándar que se conocen por la persona experta en la materia. El equipo o composiciones de diagnóstico pueden utilizarse por métodos para detectar la expresión de una forma muíante de gen de MDR- 1 de acuerdo con cualquiera de los métodos arriba descritos de la í> invención, empleando, por ejemplo, técnicas de inmuno análisis tales como radioinmunoanálisis o enzimainmunoanálisis o preferentemente hibridización de ácido nucleico y/o técnicas de amplificación tales como aquellas descritas en la presente antes y en los ejemplos. Algunos cambios genéticos conducen a los estados de 0 conformación de proteína alterados. Por ejemplo, algunas proteínas de MDR-1 variantes poseen una estructura terciaria que las vuelve menos capaces de facilitar el transporte del medicamento. La restauración de la conformación regulada o normal de proteínas mutadas es el medio más elegante y específico para corregir estos defectos moleculares, aunque es £> difícil. Las manipulaciones farmacológicas de esta manéra puede ayudar en la restauración de conformación de tipo silvestre de la proteína. De esta manera, los polinucleótidos y proteínas codificas de la presente invención también pueden utilizarse para diseñar y/o identificar las moléculas que son capaces de activar la función de tipo silvestre de una proteína o gen de MDR-1. En otra modalidad, la presente invención se refiere al uso de un medicamento o promedicamento para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o prevención de un desorden diagnosticado por el método descrito anteriormente. Además, la presente invención se refiere al uso de una dosis eficaz de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de MDR-1 de tipo silvestre expresable y funcional para la preparación de una composición farmacéutica para tratar, evitar y/o retrasar un desorden diagnosticado por el método de la invención. Un gen que codifica una proteína de MDR-1 expresable y funcional puede introducirse en las células que a su vez producen la proteína de interés. La terapia de gen, que se basa en introducir genes terapéuticos en las células por técnicas in vivo y ex vivo es una de las aplicaciones más importantes de transferencia genética. Los métodos y vectores para la terapia de gen in vivo y ex vivo se describen en la literatura y se conocen por la persona experta en la materia, ver, por ejemplo, Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992); 808-813; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; W094/29469; WO97/00957 o Schaper, Current Opinión in Biotechnology 7 (1996), 635-6340, y referencias citadas en la presente. El gen se puede diseñar para la introducción directa o para introducción a través de liposomas, o vectores virales (por ejemplo, adenoviral, retroviral) en la célula.' Preferentemente, dicha célula es una estirpe germinal, célula embriónica, o célula de huevo o derivada de las mismas, más preferentemente dicha célula es una célula germinal, Como es evidente a partir de lo anterior, se prefiere que en el uso de la invención la secuencia de ácidos nucleicos se enlace operativamente a elementos reguladores que permiten la expresión y/u objetivo de la proteína de MDR-1 a células específicas. Los sistemas de suministro de gen adecuados que pueden emplearse de acuerdo con la invención pueden incluir liposomas, sistemas de suministro mediados por receptor, ADN despojado, y vectores virales tales como virus del herpes, retrovirus, adenovirus, y virus adeno-asociados, entre otros. El suministro de ácidos nucleicos a un sitio específico en el cuerpo de la terapia de gen puede también llevarse a cabo utilizando un sistema de suministro biolístico, tal como aquel descrito por Williams (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726-2729). Los métodos estándar para transfectar las células con ADN recombinante se conocen bien por aquellos expertos en la materia de biología molecular, ver, por ejemplo, WO 94/29469, ver también supra. La terapia de gen puede llevarse a cabo al administrar directamente la molécula de ADN recombinante o vector de la invención a un paciente o al trasfectar las células con el polinucleótido o vector de la invención ex vivo e infundir las células transfectadas en el paciente. En una modalidad preferida de los usos y métodos de la invención, dicho desorden es cáncer o una enfermedad neuronal, CNS o cardiovascular. Como se muestra en los Ejemplos 6 y 8, los polimorfismos identificados de acuerdo con la presente invención, especialmente el polimorfismo de nucleotido único (SNP) C3435T en exon 26 del gen de MDR-1 son útiles como un factor farmacogenético que permite la predicción de los niveles de sangre de diversos substratos de MDR-1 e inductores para mejorar la eficacia y seguridad del medicamento, es decir, predecir y evitar los efectos secundarios e interacciones de medicamento y para incrementar la comodidad del paciente. Tales substratos e inductores son, por ejemplo, medicamentos anticonvulsionantes/antiepilépticos, como Fenitoin; glucósidos cardíacos, como Digoxin; medicamentos inmunosupresores como Ciclosporin A y FK506; antibióticos de macrolido, como Claritromicina y Eritromicina; y antibióticos macrocíclicos; como Rifampin. De esta manera, la presente invención también se refiere al uso de los SNPs arriba descritos como un factor farmacogenético de acuerdo con lo anterior. Preferentemente, el polimorfismo es el exon 26 de MDR-1 (C3435T) SNP ya sea solo o junto con cualquier SNP tal como aquellos arriba descritos. Las aplicaciones adicionales de los polimorfismos identificados de acuerdo con la presente invención y medios y métodos que pueden utilizarse de acuerdo con las modalidades arriba descritas pueden encontrarse en la técnica anterior, por ejemplo, como se describe en US-A-5,856,104, en donde los métodos y medios descritos para aplicaciones forenses, prueba de paternidad, correlación de polimorfismos con tratados fenotípicos, mapeo genético de tratados fenotípicos, etc., pueden aplicarse igualmente de acuerdo con la presente invención. Estas y otras modalidades se describen o son obvias a partir de y comprendidas por la descripción y ejemplos de la presente invención. La literatura adicional que concierne a cualquiera de los métodos, usos y compuestos a emplearse de acuerdo con la presente invención pueden recuperarse de bibliotecas públicas, utilizando por ejemplo dispositivos electrónicos. Por ejemplo, la base de datos pública "Medline" puede utilizarse, la cual se encuentra disponible en Internet, por ejemplo, bajo http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medicine.html. Las bases de datos adicionales y direcciones, tales como http://www.ncbi.nlm.nih.gov, http://www.infobiogen,fr/, http://www.fmi.ch/biology/researcg_tools.html, http://www.tigr.org/, se conocen por la persona experta en la materia y también pueden obtenerse utilizando, por ejemplo, http://www.lycos.com. Un resumen de la información de patente en biotecnología y una examen de fuentes relevantes útiles para la investigación retrospectiva y para el conocimiento actual se da en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364. Las composiciones de diagnóstico y farmacéuticas, usos, métodos de la invención pueden utilizarse para el diagnóstico y tratamiento de toda clase de enfermedades hasta ahora desconocidas que se relacionan con o depende de los genes de MDR-1 variantes. Las composiciones, métodos y usos de la presente invención pueden emplearse deseablemente en humanos, aunque el tratamiento animal también se comprende por los métodos y usos descritos en la presente. Breve descripción de las figuras Figura 1: Gel de fragmentos de PCR seleccionados, antes y después de la purificación. La electroforesis de gel de Agarosa (Appli Chem. Darmstadt) (15% de gel de agarosa) de fragmentos de PCR de MDR-1 antes (A) y después (B) de la etapa de purificación. M: marcadores de peso molecular, 1-28: fragmentos de PCR que contienen las secuencias de exones 1-28 del gen de MDR-1 humano, incluyendo secuencias relevantes que flanquean estos exones. Figura 2: Ejemplos de alelos de MDR-1 heterocigoticos y homocigóticos. Las secuencias de fragmentos de PCR que contienen las secuencias de exones 1-28 del gen de MDR-1 humano, incluyendo secuencias relevantes que flanquean estos exones, se determinan por la secuenciación automática utilizando las técnicas ABI Dyeterminator. Las desviaciones heterocigóticas y homocigóticas de la secuencia de MDR-1 publicada pueden detectarse directamente en los perfiles de secuencia de ADN. Figura 3: Ejemplos para el diagnóstico de alelos de MDR-1 heterocigoticos y homocigóticos. Electroforesis de gel de agarosa (AppliChem, Darmstadt) (1.5% de gel de agarosa) de los fragmentos de PCR específicos de alelo de exon 2 (261 bp) y exon 5 (180 bp). La invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos biológicos que son meramente ilustrativos y no se construyen como una limitación de alcance de la presente invención. Ejemplos Ejemplo 1: Aislamiento de ADN genómico de sangre humana, generación y purificación de fragmentos de gen de MDR-1 El ADN genómico se obtiene por técnicas de cromatografía de intercambio de ión (equipos Quiagen para el aislamiento de ADN genómico de la sangre). La sangre de todos los individuos que se prueban (voluntarios del departamento de Farmacología y Caridad de Berlín) se obtiene bajo la consideración de todo el requerimiento legal, ético y médico y burocrático de la Clínica de Caridad en Berlín, Alemania. Las cargas de inicio de oligonucleótidos específicas, 2 para cada fragmento, se aplican para obtener mediante reacción de cadena de polimerasa (PCR) fragmentos de ADN definidos que contienen partes específicas del gen de MDR-1 humano. Estas cargas de inicio de oligonucleótidos específicas se diseñan para unirse a secuencias aguas arriba y aguas debajo de los diversos exones del gen de MDR-1. Los fragmentos de ADN resultantes fueron par codificar no solamente las secuencias de exon, sino que también algunas secuencias de intron en los límites de exon-intron. Tales secuencias intrónicas cercanas a los exones se conocen por se importantes para el procesamiento correcto y subsecuente expresión de la proteína que codifica mARN, un proceso conocido como "empalme". Los pares de cargas de inicio de oligonucleótidos se perfeccionan para cada uno de los 28 exones del gen de MDR-1 humano, sintetizan, purifica por cromatografía de afinidad (cartuchos OPC). La secuencia para cada una de las cargas de inicio se lista en la Tabla 1. Las reacciones de cadena de polimerasa se realizan bajo condiciones que se perfeccionaron para cada uno de los fragmentos que cubren los 28 exones del gen de MDR-1 humano así como también el promotor de núcleo y región intensificadora. PCRs se llevaron a cabo para todos los exones en un volumen de reacción de 25 µ\. 50 ng de templado de ADN se agrega a un regulador de PCR estándar que contiene 1 .5 mM de MgCI2 (Quiagen , Hilden), 50 µ? de d NTP's (Quiagen, Hilden), 25 pMol de cada carga de inicio (Metabion, Munich) y 0.625 U Taq de polimerasa (Quiagen, Hilden). Todas las PCRs se realizan en un termociclador Perkin Elmer (modelo 9700) con una etapa de desnaturalización inicial de 2 min a 94°C y 36 ciclos de amplificación de desnaturalización a 94°C por 45 seg, ablandamiento de la carga de inicio dependiendo de la temperatura de fusión de la carga de inicio (condiciones de PCR: A-H) por 45 seg, y 45 seg por 72°C seguidos por una extensión final de 72°C por 5 min. Para las condiciones de PCR únicas A-H se aplican las siguientes temperaturas de ablandamiento: A: 53°C; B: 56°C; C : 55°C; D: 57.5°C; E : 58°C; F: 59°C; G : 54°C; H: 60°C. Las PCRs se llevaron a cabo para todos los fragmentos (promotor e intensificador) en un volumen de reacción de 50 µ\. 50 ng de templado de ADN (excepciones; 1 00 ng para fragmentos promotores 1 -3) se agrega a un regulador de PCR estándar que contiene 1 .5 mM de MgCI2 (Quiagen , Hilden), 200 µ? de dNTP's (Quiagen, Hilden), 30 pMol de cada carga de inicio (Metabion , Munich ; excepción . 20 pMol para fragmento intensificador 1 ) y 1 U Taq de polimerasa (Quiagen , Hilden). Todas las PCRs se realizan en un termociclador Perkin Elmer (modelo 9700) con una etapa de desnaturalización inicial de 3 min a 94°C y diferentes ciclos de amplificación (30 para el fragmento promotor 2+4 y fragmento intensificador 1 ; 31 para el fragmento promotor 3; 32 para el fragmento promotor 1 y fragmento intensificador 2) de desnaturalización 94°C por 30 seg, el ablandamiento de la carga de inicio dependiendo de la temperatur de fusión de la carga de inicio (condiciones de PCR: A y B) por 30 seg, y 30 seg por 72°C seguidos por una extensión final de 72°C por 2 min. Para las condiciones de PCR únicas A y B en las siguientes temperaturas de ablandamiento se aplican: A: 58°C; B: 56°C. Las condiciones de PCR optimizadas y el tamaño resultante de los fragmentos obtenidos y deseados se listan en la Tabla 1 . Ejemplos de los fragmentos de gen de MDR-1 resultantes que se utilizan para el análisis adicional del genotipo individual se presentan en la Figura 1 . Los fragmentos de ADN definidos que contiene partes específicas del gen de MDR-1 humano, secuencias de exon así como también algunas secuencias de intrón en los limites de exon-intron se procesan para remover los nucleótidos no incorporados o componentes de regulador que de otra manera pueden interferir con la determinación subsecuente del genotipo de MDR-1 individual por secuenciación directa de ADN. Para esta purificación, las técnicas de cromatografía de intercambio de ión estándar se utilizan (equipos Quiagen para purificación del fragmento de PCR). Para todos los fragmentos, las producciones suficientes de fragmentos purificados, substituibles por análisis de secuencia de ADN directo, se obtienen. Los ejemplos de fragmentos de gen de MDR-1 purificado que se utilizan para el análisis de secuencia directo del genotipo de MDR-1 individual se presentan en la Figura 1. Ejemplo 2: Identificación de diferentes alelos del gen de MDR-1 por determinación de secuencia en varios individuos Para el análisis de secuencia de las regiones relevantes del gen de MDR-1 humano de muchos diferentes individuos, la amplificación de PCR de las regiones relevantes del gen de MDR-1 se llevan a cabo (ver Tabla 1 ) y los productos de PCR purificados se secuencian subsecuentemente con métodos establecidos (secuenciación de ciclo del ABI dyeterminator) . Un parámetro muy i mportante que fue necesario para considerar utilizare este planteamiento fue que cada individuo humano normal aloja dos copias del gen de MDR- 1 . Debido a esta diploidal (de genes autosomales, y MDR-1 se codifica autosomalmente), debe tenerse mucho cuidado en la evaluación de las secuencias que son capaces de identificar inambiguamente no solamente las variaciones de secuencia homocigóticas sino que también las variaciones heterocigóticas. Debido a eso, nunca se baso solamente en una secuencia determinada, pero siempre obtuvo al menos dos secuencias de cada fragmento de gen de MDR-1 definido de cada individuo, al secuenciar ambos filamentos de ADN opuestos. Para la evaluación inicial de variaciones de MDR-1 en la población humana , el análisis de secuencia de las regiones relevantes, incluyendo todos los exones, del gen de MDR-1 humano se lleva a cabo del ADN genómico de 24 individuos diferentes. Este número de muestras individuales se extiende entonces para fragmentos de gen de MDR-1 seleccionados, algunos de los cuales se han analizado de 1 27 individuos. Las secuencias se inspeccionaron manualmente para la ocurrencia de secuencias de ADN que se desvían de las secuencias de MDR-1 publicadas, que se consideran como secuencias de "tipo silvestre" en todo de este trabajo. Debido a que la genética de la población permite un cálculo de la frecuencia esperada de alelos homocigótico vs. heterocigóticos de un gen definido (fórmula Hardy Weinberg , p e2 + 2pq +q e2 = 1 ), también fue posible confirmar la distribución predicha (con esa fórmula) de alelos homocigóticos vs. heterocigóticos y desviaciones con los descubrimientos experimentales. Esto sirve como control interno y confirmación que una desviación de secuencia detectada en realidad representa un alelo nuevo. Varias variaciones de secuencia de MDR-1 nuevas se describen y confirman experimentalmente utilizando este planteamiento que se muestra en la Figura 2. 8 polimorfismos aparecen en secuencias de intron cercanas a y que flanquean los exones 5, 6, 12 y 1 7 (SEQ ID NOs: 91 , 1 54 y 160 para exon 5, (SEQ ID NOs: 101 y 166 para exon 6), (SEQ ID NO: 1 16 para exon 1 2) y (SEQ I D NOs: 1 1 9 y 1 72 para exon 17). 7 polimorfismos se encontraron en la región de codificación , 2 en los exones 2 y 26, y uno en los exones 5, 1 1 y 1 2 y uno en el exon sin codificar 1 (SEQ ID NOs: 79 y 85 (para exon 2), 1 22 y 178 (para exon 26), 97 (para exon 5), 106 (para exon 1 1 ), 1 12 (para exon 1 2) y 73 (para exon 1 ), respectivamente). 3 variaciones resultan en cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína de MDR-1 (SEQ I D NOs: 85 (para N21 D), 97 (para F1 03S) y 1 06 (para S400N), respectivamente. Sus cambios alterarán la proteína de MDR. Un cambio que no altera la proteína se ubica directamente antes del codon inicial de traducción ATG (SEQ ID NO: 79). Se sabe bien que esta posición es muy importante para los niveles de expresión de proteínas al controlar la efectividad de traducción . Los polimorfismos adicionales no cambian la composición de aminoácido de MDR-1 , pero aún son herramientas útiles para la genotipación de MDR-1 debido a que cada una de estas variaciones definen un nuevo alelo de M DR-1 . Se sabe que la expresión de M DR-1 varía grandemente entre diferentes individuos, y una explicación muy probable de esta variabilidad en los niveles de expresión son las diferencias alélicas en la región directamente en y que rodean el gen de MDR-1 . De esta manera , nuevos y definidos alelos de MDR-1 sirven como marcadores para la determinación del estatus del gen de MDR-1 en pacientes. La importancia de esta genotipación de MDR-1 para el diagnóstico y terapia de enfermedades se conoce bien por expertos en la materia , y se ha explicado en detalle arriba en el capítulo de introducción . Las posiciones exactas y detalles adicionales de los nuevos alelos de MDR-1 , incluyendo las secuencia nueva exacta y la desviación de secuencia, y la distribución homocigótica vs. heterocigótica del alelo en la población se listan en la Tabla 2. La frecuencia esperada de homocigotos del alelo variante se calculan en la base de la distribución Hardy-Weinberg . La base desviadora en la secuencia está en negritas y subrayada. La Figura 2 muestra ejemplos del descubrimiento y aparición de nuevas variantes en muestras de AN de individuos homocigóticos y heterocigóticos. Ejemplo 3: Métodos para la detección específica y diagnóstico de alelos de MDR-1 Los métodos para detectar los diversos alelos de MDR-1 que se han identificado utilizan el principio que las diferencias de secuencia específicas pueden traducirse en reactivos para la diferenciación de alelo .

Estos reactivos proporcionan el estructura principal necesaria para el desarrollo de las pruebas de diagnóstico. Los ejemplos de tales reactivos incluyen, pero no se limitan a , oligonucleótidos que se desvían de la secuencia de MDR-1 de tipo silvestre en la substitución de base recientemente identificada. Frecuentemente, los principios de las pruebas de diagnóstico para la determinación del estatus del gen de MDR-1 incluyen, pero no se limitan a diferencias en las eficiencias de hibridización de tales reactivos a los diversos alelos de MDR-1 . Además, las diferencias en la eficacia de tales reactivos en, o como substratos diferentes para, reacciones enzimáticas, por ejemplo, ligasas o polimerasas o enzimas de restricción pueden aplicarse. Los principios de estas pruebas se conocen bien por expertos en la materia . Ejemplos son las técnicas de LCR y PCR, Hibridizaciones por chip o análisis de TOF. Tales técnicas se describen en la técnica anterior, por ejemplo, técnica PCR; Newton (1 994) PCR, BIOS Scientific Publishers, Oxford: técnica de LCR: Shimer, reacción de cadena de ligasa . Methods Mol . Biol. 46 (1 995) , 269-278; hibridización por chip: Ramsay, chips de AND: Estado en la material. Nature Biotechnology 1 6 (1998), 40-44; y análisis MALDI-TOF; Ross, High level multiplex genotypin by MALDI-TOF mass spectrometry, Nature Biotechnology 16 (1 998) , 1 347-1 351 . Otros principios de prueba se basan en la aplicación de reactivos que reconocen específicamente la variante de MDR-1 como proteína expresada traducida. Ejemplos son los anticuerpos específicos de alelos, péptidos, análogos de substrato, inhibidores y otras substancias que se unen a (y en algunos casos también pueden modificar la acción de) las diversas formas de proteína de MDR-1 que se codifican por los nuevos alelos de MDR-1. Los ejemplos que se presentan en la presente, para demostrar los principios de las pruebas de diagnóstico con reactivos derivados de las nuevas substituciones de nucleótido definidas en esta solicitud, se basan en métodos de PCR. Es obvio que, aplicar los reactivos específicos descritos, cualquiera de los otros métodos también trabajará para la diferenciación de alelos de MDR-1 . Ejemplo 4: Diagnóstico de Alelos de MDR-1 por PCR específica PCR específica de alelo es una técnica bien conocida por los expertos en el campo que permite la diferenciación de alelos de genes por la aplicación de la reacción de cadena de polimerasa con reactivos (combinaciones de carga de inicio) que se diseñan específicamente para la detección de secuencias de alelo únicas. El componente principal de tales pruebas, y el reactivo único que proporciona la especificad de tales pruebas, son los oligonucleótidos que se diseñan para contener las secuencias que distinguen específicamente diferentes alelos de genes. En este ejemplo, lo oligonucleotido específicos se diseñaron para distinguir diferentes alelos de MDR-1 debido a su eficacia de. hibridización diferencia para diferentes alelos y debido a su habilidad variable para servir como substratos para reacciones enzimáticas (la enzima en este ejemplo siendo una polimerasa termoestable). Los reactivos que se diseñan específicamente y son capaces de detectar la presencia y/o ausencia de los alelos de MDR-1 recientemente definidos en humanos individuales se listan como combinaciones de carga de inicio específicas para cada nuevo alelo en la Tabla 3. El diseño de estos reactivos se basa en estas secuencias de nucleótidos recientemente descubiertas y substituciones base en el gen de MDR-1 humano, que se presentan en el ejemplo 2 y se listan en la Tabla 2 y Figura 2. Además del diseño de reactivos específicos, la prueba de diagnóstico que se basa en el principio de reacción de cadena de polimerasa necesita la optimización de las condiciones de prueba , es decir, condiciones de PCR optimizadas. El resultado de prueba se encuentra en este caso dado como presencia o ausencia de fragmentos de ADN específicos obtenidos utilizando ADN genómico de humanos individuales como ingrediente probable (templado). La preparación del ADN genómico de la sangre de individuos se describe en el ejemplo 1 . PCRs se llevan a cabo para todos los fragmentos en un volumen de reacción de 20 µ\. 50 ng de templado de ADN se agrega a un regulador de PCR estándar que contiene 1 .5 mM de MgCI2, 250 µ? de dNTP's (Quiagen, Hilden), 1 x Q-solución (Quiagen , Hilden), 20 pMol de cada carga de inicio (Metabion , Munich; carga de inicio de ts específica + carga de inicio común y carga de inicio mut específica e) y 1 U Taq de polimerasa (Quiagen , Hilden). Todas las PCRs se realizan en un termociclador Perkin Elmer (modelo 9700) con una etapa de desnaturalización inicial de 3 min a 95°C y 30 ciclos de amplificación de desnaturalización a 94°C por 30 seg , el ablandamiento de la carga de inicio dependiendo de la temperatura de fusión de la carga de inicio (condiciones de PCR: A-E) por 30 seg , y 30 seg por 72°C seguidos por una extensión final de 72°C por 8 min. Para las condiciones de PCR únicas A-E se aplican las siguientes temperaturas de ablandamiento: A: 54°C; B: 58°C; C: 50°C; D: 61 °C; E: 53°C. La base desviante en la secuencia de carga de inicio específica, respectiva se subraya y se encuentra en negritas. La presencia o ausencia de fragmentos de ADN específicos en este análisis se traduce en presencia o ausencia del alelo probado. Ejemplos de tales lecturas, como resultados del diagnóstico de detección de alelo de MDR-1 , se muestran en la Figura 3. Es obvio a partir de estos ejemplos (Tab.3 Fig. 3) que estas pruebas son adecuadas para diferenciar la presencia de los alelos de MDR-1 en humanos. Los alelos homocigóticos así como heterocigóticos, frecuentes así como raros del gen de MDR-1 pueden detectarse. La especificad de estas pruebas yace solamente, y totalmente depende, de los reactivos de oligonucleótido específicos que se aplican. El diseño de estos reactivos a su vez depende de la información de secuencia de las variantes de MDR-1 descubiertas y nuevos alelos, que se presentan en el ejemplo 2 y Tabla 2. Ejemplo 5: Diagnóstico y correlación de diferentes polimorfismos con niveles de expresión y actividad in vivo de MDR-1 en pacientes. Para identificar correlaciones directas potenciales de polimorfismos de MDR-1 con fenotipos relevantes clínicos en humanos, las probandas de un estudio en el Instituto Dr. Margarete Fischer-Bosch para Farmacología Clínica en Stuttgart, se sometieron a la determinación de polimorfismos de MDR-1 como se describe en los ejemplos 2-4. Los niveles de expresión de MDR-1 en el colon e hígado de estos pacientes también se estimaron por detección inmunohistoquímica establecida de la proteína de MDR-1 . En la población de probanda, en adición a las medidas de los niveles de expresión de MDR-1 en el colon, mediciones de MDR-1 en la inducción del gen por rifampicina se realizaron. También, la actividad in vivo de MDR-1 bajo condiciones inducidas de rifampicina y no inducidas se determinó al medir las concentraciones de sangre de digoxin administrada oralmente (1 mg), que es un substrato de MDR-1 conocido y cuya concentración de sangre también depende de la actividad de MDR-1 en el colon. Los resultados de las mediciones de MDR-1, experimentos de inducción por rifampicina y experimentos de digoxin, así como también los resultados del análisis de detección de polimorfismo de MDR-1 en la población de probanda muestran correlaciones entre la expresión del gen de MDR-1 y la actividad in vivo de MDR-1 con ciertos polimorfismos. Niveles de proteína de MDR-1 Como se muestra en la tabla 4, el polimorfismo T/C en la posición 176 en Acc#M29445/J05168 en exon 26 se correlaciona con los niveles de expresión de MDR-1. La presencia del alelo T en esta posición indica niveles de expresión de MDR-1 más débiles en comparación con las muestras que tienen solamente el alelo C homocigótico, correspondiente. El promedio de niveles de MDR-1 inducidos por rifampicin de la población del alelo C es mucho más elevado que aquel de la población T (924 vs. 587 unidades relativas). En acuerdo total con eso, una probanda homocigótica para el alelo T tuvo el nivel de MDR-1 inducido y no inducido menos detectable mientras que una probanda homocigótica para el alelo C desplegó el nivel más elevado de todas las probandas probadas. La diferencia de niveles de expresión de MDR-1 inducidos entre estos individuos fue de 9 veces. Actividad in vivo de MDR-1 La tabla 5 muestra los resultados de las mediciones de la actividad in vivo de MDR-1 bajo condiciones inducidas de rifampicina y no inducidas. Esto se hace al medir las concentraciones de sangre de digoxin oralmente administrada que es un substrato de MDR-1 conocido y cuyas concentraciones de sangre también dependen de la actividad de MDR-1 en el colon. Consistente con la observación de que el polimorfismo en la posición 176 en Acc.#M29445/J05168 con exon T/C se correlaciona con los niveles de expresión de MDR-1, una correlación de este polimorfismo se observa con niveles sanguíneos de digoxin, que a su vez refleja la actividad de proteína de MDR-1 in vivo. Las probandas que alojan el alelo T (se correlacionan con la expresión de MDR-1 más débil, ver Tab. 4), contienen niveles sanguíneos más elevados de digoxin en comparación con las muestras que tienen solamente el alelo C homocigótico correspondiente. La razón para esto es que la toma de los substratos de MDR-1 tal como digoxin del colon a la sangre parece ser más eficaz en humanos con expresión de MDR-1 más baja. Esto es totalmente consistente con la función de MDR-1 en el colon, es decir, retransporte y eliminación de substratos de las células de toma en el lumen del colon. El promedio de la concentración no inducida así como también digoxin inducida por rifampicin en la sangre (se correlaciona inversa a la actividad de MDR-1) en la población del alelo C es consistentemente inferior a aquel de la población T (63.9 vs. 44.9 y 45 vs. 28.6 Díg AUC inducida). En acuerdo total con eso, una probanda con el alelo T homocigótico tuvo la concentración de degoxin altamente detectable en la sangre después de la inducción por rifampicina (57.3 Dig. AUC) y una probanda homocigótica para el alelo C desplegó el nivel más bajo de todas las probandas (12.3 Dig. AUC). La diferencia de los niveles sanguíneos de digoxin entre estos individuos fue más de 4 veces. MDR-1 en una población de pacientes: Los resultados de nuestros análisis de la correlación de los niveles de expresión de MDR-1, la actividad de la proteína de MDR-1 y el análisis de detección de polimorfismo de MDR-1 se corroboran además por un análisis de la expresión de MDR-1 y genotipación de MDR-1 de varios pacientes del Instituto Dr. Margarete Físcher-Bosch para Farmacología Clínica en Stuttgart. La inmunohistología se realiza en las diversas muestras de tejido del paciente, particularmente colon e hígado, y se compararon entre sí para permitir una comparación relativa de la proteína de MDR entre estas muestras. Dentro de cada conjunto de experimentos, las muestras del paciente se clasificaron de acuerdo con su intensidad de coloración de MDR-1, es decir, la 1er clasificación es igual a la intensidad de MDR más elevada y la última clasificación a la intensidad de MDR-1 más baja. La correlación de este análisis de clasificación con el genotipo de MDR-1 muestra que el alelo T en el polimorfismo en posición 176 en Acc.# M29445/J05168 en exon 26 se correlaciona con la expresión inferior del gen de MDR-1 cuando se compra con los pacientes que llevan el alelo C homocigótico en esta posición. En este análisis, dos otros polimorfismos mostraron alguna correlación con la expresión de MDR-1: Un genotipo T homocígótico en la posición 171466 en AC002457 (intron 4) puede correlacionarse con la expresión elevada y un polimorfismo (GA) en posición 101 en exon 11 (M29432/J05168) puede correlacionarse con expresión baja. Ejemplo 6: Validación de la correlación de genotipo/fenotipo del polimorfismo de exon 26 (C3435T) con números de muestra extendidos. Para validar además la correlación del polimorfismo de nucleótido único (SNP) T/C en la posición 176 en ACC.#M29445/J05168 descrito en los ejemplos previos y ahora también referido como exon 26 SNP C3435T de MDR-1, (posición corresponde a no. de acceso del Banco Genético de cADN de MDR-1 AF016535, Codon TTC exon 10, F335, falta en esta secuencia), con la primer base del codon de inicio ATG establecida en 1) con los niveles de expresión de MDR-1 intestinal (primeros resultados mostraos en el Ejemplo 5), los voluntarios adicionales de un estudio experimental adicional en el Instituto Dr. Margarete Fischer-Bosch para Farmacología Clínica en Stuttgart, se analizaron. Los niveles de expresión de MDR-1 en el intestino de estos voluntarios y pacientes se han determinado por inmunohistoquímica cuantitativa y Western blots de biopsias y preparaciones de enterocitos del duodeno. Para asegurar que este análisis refleja la expresión de PGP específica en enterocitos intestinales, una proteína marcadora adicional que se expresa en enterocitos, vilin, se analiza simultáneamente. Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 4. El genotipo T/T se asocia con los niveles de expresión de MDR-1 inferiores, significativos en comparación con el genotipo C/C. Los individuos con un genotipo C/T muestran un fenotipo intermedio. Para una validación adicional de la correlación del genotipo de MDR-1 con toma de digoxin intestinal, los voluntarios adicionales de otro estudio clínico en la Universidad del Centro Médico, Caridad en Berlín que dirigen los niveles sanguíneos de digoxin después de aplicación oral (sin inducción de rifampin y determinación de proteína PGP, Johne ef al., (1999) Clin, Pharmacol, Thr. 66, 338-345) se evaluaron para su genotípación de MDR-1 en exon 26. En este estudio, las concentraciones de plasma máximas (Cmax) se evaluaron durante las condiciones de estado fijo de digoxin. Este parámetro farmacocinético especialmente revela diferencias en la absorción de digoxin entre los diferentes grupos. La Figura 5 muestra una comparación de Cmax de digoxin de 7 voluntarios que llevan homocigóticamente el alelo T/T y 7 voluntarios con el genotipo C/C homocigótico en exon 26. Los voluntarios homocigóticos para el alelo T muestran niveles significativos elevados de digoxin en comparación con los voluntarios con un genotipo de C/C. La diferencia promedio de 38% en Cmax de digoxin entre los grupos es estadísticamente significativa (p=0.006, Mann Whitney U 2 prueba de muestra) y refleja el impacto de este polimorfismo en farmacocinéticas de digoxin. Figura 4: Correlación del exon 26 SNP con expresión de MDR-1 bajo condiciones no inducidas. El fenotipo de MDR (expresión y actividad) de 21 voluntarios y pacientes se determina por análisis de Western blot. El diagrama muestra la distribución de expresión de MDR-1 agrupada de acuerdo con el genotipo de MDR-1 en el exon relevante 26 SNP. La correlación de genotipo-fenotipo tiene un sig nificado de p=0.056 (N=21 ).

CC CT TT FIGURA 5: Correlación del genotipo de MDR-1 y toma de digoxin in vivo. El genotipo de MDR-1 en exon 26 se analizó en 14 voluntarios saludables q ue participaron en un estudio cl ínico que dirige los niveles sanguíneos de digoxin dura nte las condiciones de estado fijo (Johne er al., (1 999). Clin Pharmacol . Th r. 66, 338-345). Una d iferencia estad ísticamente significativa (p=0.006; Mann Whitney U2 prueba de muestra) se encontró en la comparación de concentraciones máximas (Cmax) de digoxin entre dos g rupos de 7 voluntarios saludables que alojan ya sea el genotipo T/T o C/C . La diferencia promedio del 38% en Cmax puede reflejar la importancia de genotipo en la absorción de digoxin después de la aplicación oral . Una dosis de 0.25 mg se aplica en el estado fijo de digoxin.

Ejemplo 7: Identificación de nuevos polimorfismos de MDR-1 por análisis de secuencia de una gran colección de varios individuos. Una búsqueda extendida de SNPs en el gen de MDR-1 humano reveló además de los nuevos polimorfismos de MDR-1 diferentes numerosos polimorfismos nuevos adicionales en el gen de MDR-1 que se listan en la Tabla 8. Dentro de la nueva selección, el número de muestras individuales se extiende para todos los exones de MDR-1, así como también para los fragmentos promotores de MDR-1, algunos de los cuales se han analizado de 236 individuos. Es posible que además del 26 de MDR-1 (C3435T) SNP que puede utilizarse para predecir la expresión de PGP, otros polimorfismos más raros en regiones del gen de MDR-1 también tienen algún efecto en la expresión. Por ejemplo, los polimorfismos del promotor y proteína que cambian SNPs son muy probable que tengan un efecto adicional en la expresión de MDR-1 y actividad. Además, todos estos nuevos polimorfismos pueden utilizarse para generar un genotipo de MDR-1 individual exacto, es decir, composición de alelo, que puede ser única para individuos y de esta manera muy útil para predecir MDR-1 individual dependiente de la respuesta al medicamento. Más polimorfismos se conocen en el gen de MDR-1 humano, los más completos y de esta manera los más útiles será una descripción de genotipo de MDR-1 individual. La identificación de estos nuevos 32 polimorfismos de MDR-1 es una etapa importante hacia lograr el objetivo de establecer muchos genotipos de MDR-1 diferentes que predicen el resultado y efectos secundarios de terapia de medicamento. Ejemplo 8: Determinación del polimorfismo de exon 26 de MDR-1 (C3435T) como un factor farmacogenético que influencia los niveles de medicamento en combinación con otros factores farmacogenéticos. La Fenitoin de medicamento anticonvulsivo se utiliza comúnmente en la terapia de epilepsia, supresión crónica o aguada de arritmias ventriculares y en intoxicación digitalis. El rango terapéutico estrecho con un número de efectos secundarios severos en combinación con un farmacocinético no lineal (es decir, Incremento sobreproporcional de niveles de plasma en respuesta a la elevación de dosis) hace desafiante al tratamiento de Fenitoin y los parámetros adecuados para predecir los niveles de una dosis dada altamente deseable con objeto de mejorar el rendimiento terapéutico y para evitar los efectos secundaros. Se sabe que las enzimas polimóricas 2C9 y 2C19 tienen un efecto en el metabolismo de Fenitoin (Mamiya et al., 1998, Epilepsia Dec; 39(12): 1317-23) y se ha mostrado que los defectos de 2C9 pueden conducir a niveles sanguíneos anormales que pueden causar efectos secundarios o ineficacia del medicamento (Aynacioglu et al., 1998, Br J Clin Pharmacol. Sep; 48(3):409-15). Sin embargo, también esta claro que la genotipación de 2C9 no permite hacer las predicciones del nivel sanguíneo deseadas de dosis dadas. Aún en individuos genotipados de 2C9, compensados para el genotipo de enzima respectivo, los niveles sanguíneos varían significativamente. La Tabla 6 muestra que el exon 26 de MDFM (C3435T) Son juega además de 2C9, un papel claro en niveles sanguíneos de fenitoin, y la genotipación de MDR-1 para este SNP permite una correlación más exacta entre la dosis de fenitoin, genotipo y niveles sanguíneos. Dentro de los grupos genotipados de enzima 2C9/19, la variación de los niveles puede explicarse por el genotipo de MDR-1, particularmente en los grupos de metabolizadores deficientes de 2C9/C19, que muestran ya niveles sanguíneos incrementados. Aquí, la genotipación de MDR-1 es capaz de identificar un subgrupo de pacientes que se encuentra en riesgo de mostrar niveles sanguíneos de fenitoin extraordinariamente altos: metabolizadores deficientes que tienen el genotipo MDR-1 T/T. Estos pacientes tienen un riesgo incrementado de encontrar efectos secundarios adversos relacionadas con sobredosis. Por ejemplo, dentro de un grupo de 100 pacientes que reciben fenitoin, un paciente deficiente de 2C9 con el genotipo (T/T) de PGP inferior muestra concentración sanguínea más elevada, que fue aproximadamente dos veces incrementada en comparación con la población "normal". La correlación entre el genotipo de Cyp 2C9 y niveles de plasma de Fenitoin es estadísticamente significativo, pero el significado incrementa al tomar en cuenta el genotipo T/T de MDR-1 como una covariante (p<0.001, ANCOVA). Tabla 6: Dependencia de niveles de Fenitoin en componentes farmacogenéticos. Genotipo de MDR-1 CC y CT TT PGP intestinal elevado/medio Bajo Niveles sanguíneos de fenitoin Metabolizadores de 2C9 normal Normal Metabolizadores débiles elevados MUY ELEVADOS de 2C9 y/o deficientes a. ? a. ta ea o ? «3 O en un es M ce <0 w <B se x' « tu CO ex.26 43323-43302 "Delantera: 5' GAT, CTG, TGA, ACT, CTT, GTT.T.TC, A 3' " A 43080-433QQ «Inversa: 5> G AA . GAG . AGA , CT , ACA , TTA , GGC 3· » ex.27 39992-39971 " Delantera: 51 CAT, GAA, CCA, TTC, TTA, GCT,TCT, G 3* " A 39543-39564 «Inversa: 5· TTG,TGT, CAT,CTT,TAC,TCT,CCT,G 3' ex.28 3B285-3B263 "Delantera: 5' ATG, TGA, TA, TGG, AAT, AGG, TTG, C 3· " A 38036-36058 -Inversa: 5. TAT, TTA, ACA, TCT, CAT, ACA, GTC, AG 3 ' para fragmentos promotores: (Acceso: AC002457) Promotor: fragmento 1 X38856-138876 "Prom lf (f) 5' CCA, AGG, ACT, GTT, GAA, AGT, AGC 3' " 139342-139322 "Prom 3r (r ) 5' TTG, CAT, ATG, CAA, GTG, AC, AGC 31 " fragmento 2 139285-13930 "Prom 2f (£) : 5' CAC, GG, GTT, GTT, GTT, AAG, CC 3' " 139858-139838 "Prom 5r (r) ; 5' TCT, GAG, GAT, GTT, TCC, ACT, TTC 3' *' fragmento 3 139809-139831 "Prom 4f (£) : 5' TTA, TGG, CTT, TGA, AGT, ATG, AGT, TA 3' " 140378-140358 "Prom 6 r (r) ; 5· GCA, TGC, TTG, ACA, GTT, TCT, GAG 3' " fragmento 4 140358-140378 "Proin 6f (f) í 5' CTC, ACA,AAC, TGT, CAA, GCA, TGC 3* t 140949-140931 "Prom 7r (r) : 5* TTG, GAA, CGG, CCA, CCA, AGA, C 3' " para fragmentos Intenslficadores: Intensificados "(Acceso: 57451, J05674)" fragmento 1 pos. 1-19 "|nt lf (f) : 5' CCC, TTC, TAA, CCA, GG, CCA, 6 3' " A 338-320 " Int 3r (r) : GTfi,CCT, CCT, GTC, AAT,GGT,G , 3* " fragmento 2 279-297 " Int 2f ) : 5· CTA, CTG, AAA.CCG.CAG, CAT, G 3' " A 694-676 " Int 4r (r) : 5» TTG, GAG, ACA, GTG, ACT, CAC, C 3" Tabla 2: nombre del Posición de frecuencia: frecuencia: secuencia ts secuencia mut y/o ts/mut fragmento de PCR la variación eteroclgotos mutante de homoclgotos para exones 1-7: (Acceso: AC0024S7) ts/mut: e* 1 140837 4.17% < 4 % 1: GCTCATTCGAGTAGCGGCTCT f: CTCATTCGAGT/CAGCGGCTCTT r: AGAGCCGCTACTCGAATGAG r. AGAGCCGCTA/GCTCGAATGAG rnirt f: CTCATTCGAGCAGCGGCTCTT n AGAGCCGCTGCTCGAATGAG ts mut: ex-2 141530 12.60% < 4 % 0.50% f: CTTCAGGTCG6GAT6GATCTTGA f: CTTCAGGTCGGG/AATGGATCTTGA r. CAAGATCCATCCCGACCTGA r: CAAGATCCATC TCCGACGTGA mut: fc CTTCAGGTCGGAATGGATCTTGA r. CAAGATCCATTCCGACCTGA -vi ts/mut: Ni ex.2 141590 15.50% 0.97% f: AAACTGÁACAATAAAAGGTA i: AAACTG AACA GATAAAAGGTA r: TACCTTTTATTGTTCAGTTTAA r: TACCTTTTA1T/CGTTCAGTTTAA rn ti f: AAACTGAACGATAMAGGTA YACCTTTTATCGTTCAGTTTAA ts/mut: · ß?·5 171466 26.08% 4.34% 2.90% f: GACATAAATGGTATGTTTGTTT f: AGACATAAATGG/TTATGTTTGT r: AACAAACATACCA'rTTATGTCT r. AACAAACATAC ACATTTATGTC rhufc <: AGACATAAATGTTATGTTTGT c. AACAAACATAACATTTATGTC ts/mut: ex.5 171512 < 2% . < 2% f: GATACAGGGTTCTTCATGAAT f. GATACAGGGTT/CCTTCATGAAT ? ATTCATGAA6AACCCTGTATC r' ATTCATG AAGAAGACCCTGTATC mut: f: GATACA6GGTCCTTCATGAAT G. ATTCATGAAGGACCGTGTATC ts/mut: 175068 36.36% 18.18% 12.90% f: TAAGCAGCAACAATGTCGTGTGC f: TAAGCAGCAAC/TAATGTCGTGTGC muí: ? AGCAGCAATAATGTCGTGT para exones 11+12: (Acceso: "M29432, J0S168") ts/mut: «¦11 101 13.64% < 4 % f: TTCACTTCAGTTACCCATC f. TCACTTCAG/ATTACCCATC r: ATGGGTAACTGAAGTGAA n ATGGGTAAC TTGAAGTGAA mut. f : TCACTTCAATTACCCATC . ts/mut: 83046 8.70% 0.16% f: TCAGCAGTCACATTGCA f: CAGCAGTCn- ACATTGCAC muí: f. CAGCAGTTACATTGCAC para exon 17: (Acceso: AC005068) ts/mut: 78170 45.83% 12.50% 12.90% r: CAAAAATTAGTAAAGGAATA r; ACAAAAATTA TGTAAAGGAAT mut mut: fi CAAAAATTTGTAAAGGMTA para exon 26 (Acceso: "M294 6, J05168") ts/mut: 176 54.16% 27% GAAGAGATCGTGAGGG f: GAAGAGATC TGTGAGGGC miifJmut: f: AAGAGATTGTGAGGGCA 3? v 1 3¾ n 3 O 5 o" V s H* ta o ID c o. a. c a a . ta «n t o «vi Tabla 4 I Tabla 5 muestras concentración de genotipo de MDR-1 digoxin en sangre probandas no inducidas 63.6 64.1 73.2 54.7 alelo T presente (T/T y probandas no inducidas, promedio 63.9 T/C) en la posición 176 en probandas inducidas por rifampicina 57.3 Acc.# 29445/J05168 39 en exon 26 45.8 37.7 probandas inducidas por rifampicina, 45 promedio probandas no i nducidas 55 30.8 48.3 alelo C ausente probandas no inducidas, promedio 44.9 (solamente C/C) en la probandas inducidas por rifam picina 39.6 posición 176 en 12.3 Acc.#M29445/J05168 33.9 probandas i nducidas por rifampicina, 28.6 promedio nivel sanguíneo de dig inducido por 57.3 T/T homocigótico en rif i nferior posición 176 en Acc.#M29445/J051 68 nivel sanguíneo de dig inducido por 12.3 C/C homocigótico en rif elevado posición 176 en Acc.#M29445/J05168 Tabla 8: NUEVOS SNPs de MDR-1 nombre del fragmento de PCR posición de frecuencia: frecuencia: frecuencia: secuencia ts secuencia mut vio ts/mut la variación heteroclgotos mulantes de homoclgotos mutante de homoclgotos Hardy-Welnberg, esperado) para fragmentos promotores 1-4 · v para exones 3-ß: (Acceso: AC002467 ts/mut: fragmento promotor 1 139015 3% V <1% * f: AACTTACTT ATATCTTTS A f: AACTTACTT AGTATCTTTQA * rrecuenclas en Africanos-Americanos ? TCAAAGATATAAQTAAQTT r. TCAAAQATABSAAGTAAQTT mut; l: AACTTACTTfiTATCTTTQA r. TCAAAGATASAA6TAAQTT fragmento promotor 1 139064 1.5% <1% 0.01% f: AGAAATAGTAJAATCAACA l?A¾AAÁTAGTAiTTAATCAACA r. TGTTGATTATACTATTTCT G. TGTTGATTAT/AACTATTTCT muí: f: AGAAATAGTJTAATCAACA r: TGTTG ATTA AACT ATTTCT ts/mut: fragmento promotor 1 1391 9 24.2% * 3% * 2.3% 1 1: TAGGGAGGGJTTAAGGCCA f: TAGGGAGGGE£TTAAGGCCA 'frecuencias en Africanos-Americanos r. TGGCCTTMACCCTCQCTA r. TGGCCTTAA A GCCCTCCCT A muí: I: TAGGGAGGQCTTAAGGCCA r. TGGCCTTA AgCCCTCCCT A ts/mut: fragmento promotor 1 139177 1:5% 1.5% 0.05% (: GAAAGGTGAGATAAAGCAA (: GAAAGGTGAG/AATAAAGCAA r: TTGCTTTATCTCACCTTTC r: TTGCTTTATCflJCACCTTTC f: GAAAGGTGAAATAAAGCAA r TTGCTTTATTTCACCTTTC nombre del fragmenta da PC Posición de frecuencia: frecuencia: frecuencia: la variación heterodgotos mutantes de homoclgotos secuencia ts secuencia mut v/o ts/mut mutante de homoclgotos Hardy-Welnberg, esperado) para fragmentos promotores 1-4 v para exones 3-6: (Acceso: AC002457 ts/mut; fragmento promotor 1 139276 6.7% * ^1 % · 0.1 % * f: CATTTACCCCAQATQQACC f: CATTTACCqCflAGATGGACC * frecuencias en Africanos-Americanos r. GGTCCATCTQGGGTAMTG r. GGTCCATCTgí^GQGTAAATQ Ü ÜI f: CATTTACCCIAGATGGACC r. GGTCCATCT fiGGGTAAATG fragmento promotor 2 139479 t aL 9.7% <1« 0.2% f: GAGGCQGGCSQATCAC3AG 1: GAGGCGGGCG/&GATCACGAG r. C CGTGATCgGCCCGCCTC n CTCGTQATCfiffGCCCGCCTC mut: I: GAGGCGGGCfiGATCACGAG n CTCGTGATCT[GCCCGCCTC ts mut: fragmento promotor 2 1396 f 9 12.1% <1 0.4 f: GGAGAATGGIGTGAACCCG 1: GQAGAATGGT/CQTGAACCCG r CGGGTTCACAfXATTCTCC r. CGGGTTCACAJBCCATTCTCC mut: 1: GGAGAATGG£GTGAACCCG r. CGGGT7CACQCCATTCTCC ts/mut: fragmento promotor 3 140118 1.5% <1 % 0.01% i: ATATG6 AA GGAAATTACA A f: ATATGQAAQG AAATTACAA r: TTQTAATTTgCTTCCATAT G. TTGTAATTTCffCTTCCAtAT. mut: f: ATATGGAAGAAAATTACAA r. TTGTAATTTICTTCCATAT ts/mut: fragmento promotor 3 140216 3.1% * 0.03% ' f: AACACGGGCA TGATCTGA I: AACACGGGCA/GTTGATCTGA 'frecuencias en Africanos-Americanos ? TCAGATCAAIGCCCGTGTT r: TCAGATCAAT/CaCCCQTGTT mut:- AACACQGGCSTTGATCTGA TCAGATCAACGCCCGTG7T nombre dal fragmento de PCR Pealclóq de la ?G ?"ß???ß; frecuencia: frecuencia; secuencia ts secuencia mut vio ts/mut v*€»i¿ ivii heterocigotos mutantes de homoclgotos mutarrte de homoclgotos Hardy-Welnberg, esperado) para fragmentos promotores 1-4 v para exones 3-6 (Acceso: AC002457) ts/mut: fragmento promotor 4 140490 5.9% * <t% * 0.08% f: TGTATTAAAIGC6AATCCC fc TGTATTAAAT7CG CGAATCCC * frecuencias en Africanos-Americanos r: GGGATTCGCAJTTAATACA p GGGATTCGCA/QTTT AATACA mut: f: TGTATTAAACGCGAATCCC r. GGGATTCGCGTTTAATACA fragmento promotor 4 40568 2.9% * <1% * 0.02% f: TTGAAAGACfiTGTCTACAT * frecuencias en Africanos-Americanos r. ATGTAGACAgGTCTTTCAA mut: f: TTGAAAGAC¿ STCTACAT r. ATGTAGACAÍGTCTTTCAA fragmento promotor 4 140576 10.2% » <1% * 0.3% * f: CGTGTCTACATAAGTTGAA f: CQTGTCTACA/TTAAGTTGAA * frecuencias en Africanos-Americanos r: TTCAACTTATGTAGACACG ? TTCAACTTAT/AGTAGACACG mut: I: CGTGTCTACJTAAGTTGAA r: TTCAACTTAAGTAGACACa ts/mut: ragmento promotor 4 j ¿j 0595 5% * <1% * 0.06% f: ATGTCCCCAATGATTCAGC f: ATGTCCCCAA/G GATTCAGC * frecuencias en Africanos-Americanos r. GCTGAATCArTSGGQACAT r. GCTQAATCAT/pTGGGQACAT . mut: 1: ATGTCCCCAQTGATTCAGC r. GCTGAATCAETGGGGACAT ts/mut: fragmento promotor 4 1 0727 3.1% * <1% · 0.03% * f: CCGG6CC6GGAGCAGTCAT f: CCGGGCCGGGJAAGCAGTCAT * frecuencias en Africanos-Americanos r: ATGACTGC CCCGGCCCGG r. ATQACTGCTC/TCCGGCCCGG mut: I: CCGGGCCGGAAGCAGTCAT r. ATGACTG0T1CCGGCCCGG a? Sí ^ 05» cá 03 ID in X o ?' s 99 41 X nombre del fragmento de PCR Posición de la frecuencia: frecuencia: » secuencia ta secuencia mut vio ts/mut variación mutantes de homocigotos mutante de homocigotos Hardy-Welnberg, esperado) para exones 10-26 (Acceso: AC005068) isimuti ex.10 84701 , 45.8% 25% 23% f: AAAATTGCTgTCACT ATCT I: AAAATrGCTg/ATCACTATCT r: AGATAGTGAfiAGCAATTTT n AGATAGTGACffAGC TTTT mut: f: AAAATTGCT ATC ACTATCT n AGATAGTGAIAGCAATTTT tt/mut; ex.12 84032 0.5% <1% 0.001% I: GAGCACAACfiGTCCAGCTG f: GAGCACAACA/gGTCCAGCTG r. CAGCTGGACIGTTGTGCTC r. CAGCTGGACECGTTqf GCTC mut: f : GAGCACAACgGTCCAGCTG r. CAGCTGGACCGTTGTGCTC Wmut: ex.12 00 84074 3.4% * <1% * 0.03% f: TGGGCAGACGGTGGCCCTG f: fGGGCAQACG/AGTGGCCCTQ . » * frecuencias en Africanos-Americanos r. CAGGGCCACfiGTCTGCCCA ? CAGGGCCACCÜGTCTGCCQA mut: f: TGGGCAGACAGTGQCCCTG G CAGGGCCACIGTCTGCCCA ts/mut: ex.12 84119 3.4% * ' <1% * 0.03% * fc CTCGTCCT GQTAGATCTTG f: CTC6TCCTGQ/.ATAGATCTTQ * frecuencias en Africanos-Americanos r. CAAGATCTACCAGGACOAG ? CAAGATCTACflrCAGGACGAG mut: 1: CTCGTCCTGATAGATCTTG r. CAAGATCTAICAGGACGAG ama ex.12 83973 3.4% * 1% * 0.03% * I: GACCCATGCfiAGCTAGACC f: GACCCATGCG/AAGCTAGACC * frecuencias en Africanos-Americanos r. GGTCTAGCTCGCATGGGTC r. GGTCTAGCTeffGCATGGGTC mut; (: GACCCATGCAAGCTAGACC r: GGTCTAGCTTGCATGGGTC _„„,,„,., M- r„„ pos|c|6n de fn?CMen,cla: frecuencia: frecuencia; · secuencia ta secuencia mut vio ts/mut variación heteroclgotos rnutantes de homoclgotos mutante de homoclgotos Hardy-Welnberg, esperado) para exones 10-26 (Acceso: AC00S068) ts/mut: ex.19 73252 8.3% <1 % 0.2% f: ACTTTGTCTfiATCTCCTGC f; ACTTTGTCTA GATCTCCTGC r: GCAGGAGATTAGACAAAGT n GCAGGAGATTnSAGACAAAG mut: 1: ACTTTGTCTfiAtCTCCTGC r. GCAGGAGATCAQACAAAGT ts/mut: ex.20 70371 3.8% * <1% * 0.04% ' f: AATCATTTT£TGTGCCACA f: AATCATTTTSaTGTGCCACA * frecuencias en Africanos-Americanos G. TGTGGCACASAAAATGATT G. TGTGGCACAQ TAAAATGATT mut: i: AATCATTTTATGTGCCACA G. TGTGGCACAIAAAATGATT ts/mut: .20 70253 22.2% <1% 1.2% I: TCTACTGGTQTTTGTCTTA f: TCTACTGGT6 ATTTGTCTTA 00 r. TAAGACAAASACCAGTAGA r. TAAGACAAASffACCAGTAGA ai mut: (: TCTACTGGTATTTGTCT A r: TAAGACAAAIACCAGTAGA ts/mut: ex.20 70237 16.7%' <1% 0.6% f: TTAATTGGCCATTTTGGAC f: TTAATTGQCCTATTTTGGAC v. GTCCAAAATfiGCCAATTAA r. GTCCAAAATG/AGCCAATTAA mut: I: TTAATTGQCTATTTTGQAC r. GTCCAAAATAGCCAATTAA ts/mut: ex.20 70204 16.7%. <:1% 0.6% f: AATTTTCTCeTTACGGaTG f: AATTrrCTCS¿ATTACGGGTG r. CACCCGTAAgGAGAAAATT r. CACCCGTAAC-TGAGAAAATT !B-tíl I: AATTTTCTCéTTACGGGTd c CACCCeTAAIGAGAAAATT rosicion ae ia frecuencia: frecuencia: variación secuencia t» secuencia mut v/o ts/mut v heteroclgotos mutantes de homoclgotos mutante de homoclgotos Hardy-Welnberg, esperado) para exones 10-26 (Acceso: AC005068) ex.20 ts/mut: 70200 4.2% <1 0.04% f: TTCTCCTTA£GGGTGTTAG f: TTCTCG TAQIGGGTGTTAG G. CTAACÁCCCGTAAGGAGM r. CTAACACCCG ATAAQGAGAA mut: f: TTCTCCTTATGGGTGTTAG n CTAACACCCATAAGGAGAA ts/mut: ex.26 43263 0.5% ¿1% , 0.001% 1: TGAATGTTCAGTGGCTCCG f: TGAATGTTCA CGTGSCTCCG r: CGGAGCCACTGAACATTCA G. CGGAGCCAqnSGAACATTCA mut: f: TGAATGTTCCGTGQCTCCG r: CGGAGCCACfiGAACATTCA ts/mut: 00 ex.26 43162 0.5% <1% 0.001% f: CGGGTGGTGTCACAGGAAG f: CGGGTGGTGTZACACAGGAAG r. OTCCTGTGACACCACCCG r: CTTCCTGTGAfTCACCACCCG mut: t CGGGTGGTGACACAGGAAG r. CTTCGTGTQICACCACCCe Leyenda para la Tabla 8: Nuevos SNP's de MDR-1 Variaciones de MDR1 y los aleles mutantes y de tipo silvestre respectivos: La frecuencia esperada de homoclgotos para el alelo mutante se calculan en la base de la dlsbtrlculón de Hardy-Welnberg. En la sección de secuencias las bases desviantes se subrayan y se encuentran en negritas LISTADO DE SECUENCIAS <110> EPIDAUROS Biotechnologie Aktiengesellschaft <120> POLIMORFISMOS EN EL GEN DE MDR-1 HUMANO Y SU USO EN APLICACIONES TERAPÉUTICAS Y DE DIAGNÓSTICO <130> D 1875 PCT <140> <141> <160> 376 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 1 cccttaacta cgtcctgtag 20 <210> 2 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 2 gaggacttca cactatccac <210> 3 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 3 tcttactgct ctctgggctt c <210> 4 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 4 ctcagccaac aaacttctgc 20 <210> 5 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 5 cactcagtga taaccacgta <210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 6 gcatctccat taacataccc <210> 1 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 7 gggtgtcttg gactaggttg <210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 8 tgcctcctac aggactaaac <210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 9 cacacagtca gcagagaagt <210> 10 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 10 actatcaaga gtattgttct ce <210> 11 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 11 ggaatgagtg gtctctttgg <210> 12 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 12 aaggcactgg gaacaaaagg 20 <210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 13 tectagtaga aacttctacc c 21 <210> 14 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 14 ttccgtaggg tgagagcag 19 <210> 15 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 15 cagattttgc tctacacatg c <210> 16 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 16 attagttatg ctgtaataca tcc <210> 17 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 17 catgtatatc acaggactga ac <210> 18 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 18 ctagtagtgc atatgtctgt ag <210> 19 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 19 gtgacagaat gagaacctgt c <210> 20 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 20 tggagagctg gataaagtga c <210> 21 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <40O> 21 aaattgatct gttagaagcc aag <210> 22 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <40O> 22 actaggttta aatatacatg cae <210> 23 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 23 gaacagtcag ttectatate c <210> 24 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 24 gggcaacatc agaaagatgt g <210> 25 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 25 cacatctttc tgatgttgcc c <210> 26 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 26 aagggcaaag ggcaaggac <210> 27 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 27 tgggttttct gtggtagaaa t 21 <210> 28 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 28 gttggtttga actaagcctc 20 <210> 29 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 29 aaatttctct ctctttaggc c 21 <210> 30 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 30 ttctgaagtt aaactatacc tg 22 <210> 31 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 31 ttcttattta ttttagacag cag <210> 32 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 32 gcatctccct tcataccag 19 <210> 33 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 33 cattgataag gaataaggat <210> 34 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 34 cctatcacaa accagactgc 20 <210> 35 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 35 atttccagcg tactaaggct c 21 <210> 36 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 36 acttggctgt tagtagccat g <210> 37 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 37 gtcacagaaa catagcaagc c <210> 38 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 38 caaccaatat aggagctagg c <210> 39 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 39 acatcctgag tactaaatgc ag <210> 40 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 40 aaagcatgtg atatattcgt agg <210> 41 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 41 tttctctaat ttgttttgtt ttgc <210> 42 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 42 tttagtttga ctcaccttcc c <210> 43 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 43 ccttccagat ccataactca g <210> 44 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 44 taccttctag ccaaagtaat ce <210> 45 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 45 aagtgtaaag tgaggaccaa ac <210> 46 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 46 ttcatgaggc ttcacagtag g <210> 47 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 47 ttcatgaggc ttcacagtag g <210> 48 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223 Descripción de Secuencia Artificial <400> 48 ttgaaaggaa tctatgatct agg <210> 49 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 49 ttcttctcat tgcagaacac a <210> 50 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 50 tgtgaaagtg tgctcaccac <210> 51 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 51 gatctgtgaa ctcttgtttt ca <210> 52 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 52 gaagagagac ttacattagg c <210> 53 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción' de Secuencia Artificial: sintética <400> 53 catgaaccat tcttagcttc tg 22 <210> 54 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 54 ttgtgtcatc tttactctcc tg <210> 55 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 55 atgtgattat ggaataggtt gtc 23 <210> 56 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 56 tatttaacat ctcatacagt cag 23 <210> 57 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 57 ccaaggactg ttgaaagtag c <210> 58 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 58 ttgcatatgc aagtgtacag c <210 59 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 59 cacagggttg ttgttaagcc <210> 60 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 60 tctgaggatg tttccacttt c <210> 61 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 61 ttatggcttt gaagtatgag tta <210> 62 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 62 gcatgcttga cagtttctga g <210> 63 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 63 ctcagaaact gtcaagcatg c <210> 64 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 64 ttggaacggc caccaagac <210> 65 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 65 cccttctaac catggccag <210> 66 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 66 gtgcctcctg tcaatggtg <210> 67 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 67 ctactgaaac cgcagcatg <210> 68 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 68 ttggagacag tgactcacc <210> 69 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 69 gctcattcga gtagcggctc t <210> 70 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=t o c <400> 70 ctcattcgag yagcggctct t <210> 71 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 71 agagccgcta ctcgaatgag <210> 72 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=a o g <400> 72 agagccgctr ctcgaatgag <210> 73 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 73 ctcattcgag cagcggctct t <210> 74 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 74 agagccgctg ctcgaatgag <210> 75 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 75 cttcaggtcg ggatggatct tga <210> 76 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=a o g <400> 76 cttcaggtcg gratggatct tga <210> 77 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 77 caagatccat cccgacctga 20 <210> 78 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <220> <223> y=c o t <400> 78 caagatccat yccgacctga <210> 79 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 79 cttcaggtcg gaatggatct tga <210> 80 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 80 caagatccat tccgacctga <210> 81 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 81 aaactgaaca ataaaaggta <210> 82 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=a o g <400> 82 aaactgaacr ataaaaggta <210> 83 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 83 taccttttat tgttcagttt aa <210> 84 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <220> <223> y=t o c <400> 84 taccttttat ygttcagttt aa <210> 85 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <220> <221> CDS <222> (1) .. (18) <400> 85 aaa ctg aac gat aaa agt ge Lys Leu Asn Asp Lys Ser 1 5 <210> 86 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 86 taccttttat cgttcagttt aa <210> 87 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 87 gacataaatg gtatgtttgt tt <210> 88 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> k=g o t <400> 88 agacataaat gktatgtttg t <210> 89 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 89 aacaaacata ccatttatgt ct <210> 90 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> m=a o c <400> 90 aacaaacata mcatttatgt c <210> 91 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 91 agacataaat gttatgtttg t <210> 92 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 92 aacaaacata acatttatgt c <210> 93 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 93 gatacagggt tcttcatgaa t <210> 94 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=c o t <400> 94 gatacagggt ycttcatgaa t <210> 95 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 95 attcatgaag aaccctgtat c <210> 96 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=a o g <400> 96 attcatgaag raccctgtat c <210> 97 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <221> CDS <222> (1) .. (21) <400> 97 gat acá ggg tcc ttc atg aat Asp Thr Gly Ser Phe Met Asn 1 5 <210> 98 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 98 attcatgaag gaccctgtat c <210> 99 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 99 taagcagcaa caatgtcgtg tgc <210> 100 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=c o t <400> 100 taagcagcaa yaatgtcgtg tgc <210> 101 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 101 agcagcaata atgtcgtgt <210> 102 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 102 ttcacttcag ttacccatc <210> 103 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=a o g <400> 103 tcacttcart tacccatc <210> 104 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 104 atgggtaact gaagtgaa <210> 105 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=c o t <400> 105 atgggtaayt gaagtgaa <210> 106 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <220> <221> CDS <222> (2) . .. (16) <40O> 106 t cae ttc aat tac cea His Phe Asn Tyr Pro 1 5 <210> 107 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 107 atgggtaatt gaagtgaa <210> 108 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 108 cttgaagggc ctgaacctga <210> 109 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=c o t <400> 109 tcttgaaggg yctgaacctg <210> 110 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 110 caggttcagg cccttcaaga <210> 111 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <220> <223> r=a o g <400> 111 tcaggttcag rcccttcaag a <210> 112 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 112 cttgaagggt ctgaacct <210> 113 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 113 ggttcagacc cttcaag <210> 114 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 114 tcagcagtca cattgca. <210> 115 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=c o t <400> 115 cagcagtyac attgcac <210> 116 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 116 cagcagttac attgcac <210> 117 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 117 caaaaattag taaaggaata <210> 118 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> w=a o t <400> 118 acaaaaatt gtaaaggaat <210> 119 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 119 caaaaatttg taaaggaata <210> 120 <211> 16 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 120 gaagagatcg tgaggg <210> 121 <211> 17 <212 ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <220> <223> y=c o t <400> 121 gaagagatyg tgagggc <210> 122 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 122 aagagattgt gagggca <210> 123 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 123 ggtttctctt caggtcggg <210> 124 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 124 cggtttctct tcaggtcgga <210> 125 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 125 ctcagccaac aaacttctgc <210> 126 <2 > 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 126 gaaacaagct agttaccttt tatt <210> 127 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 127 aaacaagcta gttacctttt ate <210> 128 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 128 tettactget ctctgggctt c 21 <210> 129 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 129 gaccaccaca aaacaaacat ac 22 <210> 130 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 130 gaccaccaca aaacaaacat aa <210> 131 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 131 cacacagtca gcagagaagt <210> 132 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 132 cttcctccag attcatgaag a <210> 133 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 133 cttcctccag attcatgaag g <210> 134 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 134 cacacagtca gcagagaagt <210> 135 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 135 aaaaggatgc acacgacatt g <210> 136 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 136 caaaaggatg cacacgacat ta <210> 137 <211> 20 <212> ADN . <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 137 ggaatgagtg gtctctttgg <210> 138 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 138 gaattcagaa atgttcactt cag <210> 139 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 139 gaattcagaa atgttcactt <210> 140 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 140 actaggttta aatatacatg cae <210> 141 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 141 cctggtagat cttgaagggc <210> 142 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 142 cctggtagat cttgaagggt <210> 143 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 143 gggcaacatc agaaagatgt g <210> 144 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 144 aggataggat atatteettt act <210> 145 <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 145 - 1 1 6 -aggataggat atattccttt 23 <210> 146 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 146 tgggcatcac acttacccc <210> 147 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 147 ctcctttgct gccctcacg <210> 148 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 148 ctcctttgct gccctcaca <210> 149 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 149 gatctgtgaa ctcttgtttt ca 22 <210> 150 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 150 gactaaagag acataaatg 19 <210> 151 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <220> <223> s=g o c <400> 151 gactaaagas acataaatg <210> 152 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 152 catttatgtc tctttagtc <210> 153 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <220> <223> s=c o g <400> 153 catttatgts tctttagtc <210> 154 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 154 gactaaagac acataaatg <210> 155 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 155 catttatgtg tctttagtc <210> 156 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 156 atcattaaat gaaatgagt <210> 157 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <220> <223> y=t o c <400> 157 atcattaaay gaaatgagt <210> 158 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 158 actcatttca tttaatgat <210> 159 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=a o g <400> 159 actcatttcr tttaatgat <210> 160 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 160 atcattaaac gaaatgagt <210> 161 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 161 actcatttcg tttaatgat <210> 162 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 162 caacaatgtc gtgtgcatc <210> 163 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=c o t <400> 163 caacaatgty gtgtgcatc <210> 164 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 164 gatgcacacg acattgttg <210> 165 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=g o a <400> 165 gatgcacacr acattgttg <210> 166 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 166 caacaatgtt gtgtgcatc <210> 167 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 167 gatgcacaca acattgttg 19 <210> 168 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 168 ggcttgaaga tgtaagaat 19 <210> 169 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=a o g <400> 169 ggcttgaagr tgtaagaat 19 <210> 170 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 170 attcttacat cttcaagcc <210> 171 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <220> <223> y=t o c <400> 171 attcttacay cttcaagcc <210> 172 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 172 ggcttgaagg tgtaagaat <210> 173 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 173 attcttacac cttcaagcc <210> 174 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 174 gaacattgcc tatggagac <210> 175 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=c o t <400> 175 gaacattgcy tatggagac <210> 176 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 176 gtctccatag gcaatgttc <210> 177 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=g o a <400> 177 gtctccatar gcaatgttc <210> 178 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 178 gaacattgct tatggagac <210> 179 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 179 gtctccataa gcaatgttc <210> 180 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 180 aacttactta tatctttga <210> 181 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <220> <223> r=a o g <400> 181 aacttacttr tatctttga <210> 182 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 182 tcaaagatat aagtaagtt <210> 183 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=t o c <400> 183 tcaaagatay aagtaagtt <210> 184 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 184 aacttacttg tatctttga <210> 185 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 185 tcaaagatac aagtaagtt <210> 186 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 186 agaaatagta taatcaaca 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Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=t o c <400> 193 tagggagggy ttaaggcca 19 <210> 194 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 194 tggccttaaa ccctcccta <210> 195 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <220> <223> r=a o g <400> 195 tggccttaar ccctcccta <210> 196 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 196 tagggagggc ttaaggcca <210> 197 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 197 tggccttaag ccctcccta <210> 198 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 198 gaaaggtgag ataaagcaa <210> 199 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <220> <223> r=g o a <400> 199 gaaaggtgar ataaagcaa <210> 200 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 200 ttgctttatc tcacctttc <210> 201 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <220> <223> y=c o t <400> 201 ttgctttaty tcacctttc <210> 202 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 202 gaaaggtgaa ataaagcaa <210> 203 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 203 ttgctttatt tcacctttc <210> 204 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 204 catttacccc agatggacc <210> 205 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=c o t <400> 205 catttacccy agatggacc <210> 206 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 206 ggtccatctg gggtaaatg 19 <210> 207 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Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=c o t <400> 213 ctcgtgatcy gcccgcctc <210> 214 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 214 gaggcgggca gatcacgag <210> 215 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 215 ctcgtgatct gcccgcctc <210> 216 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 216 ggagaatggt gtgaacccg <210> 217 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=t o c <400> 217 ggagaatggy gtgaacccg <210> 218 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 218 cgggttcaca ccattctcc <210> 219 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=a o g <400> 219 cgggttcacr ccattctcc <210> 220 <211> 19 . <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 220 ggagaatggc gtgaacccg <210> 221 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 221 cgggttcacg ccattctcc <210> 222 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 222 gaggcgggcg gatcacgag <210> 223 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=g o a <400> 223 gaggcgggcr gatcacgag <210> 224 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 224 ctcgtgatcc gcccgcctc <210> 225 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <220> <223> y=c o t <400> 225 ctcgtgatcy gcccgcctc <210> 226 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 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<223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 266 caaatttccg aagtatttt <210> 267 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=g o a <400> 267 caaatttccr aagtatttt <210> 268 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 268 aaaatacttt ggaaatttg <210> 269 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 269 caaatttcca aagtatttt <210> 270 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 270 gatacagggt tcttcatga <210> 271 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=t o c <400> 271 gatacagggy tcttcatga <210> 272 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 272 tcatgaagaa ccctgtatc <210> 273 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <220> <223> r=a o g <400> 273 tcatgaagar ccctgtatc <210> 274 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial: Sintética ADN <220> <221> CDS <222> (1) .. (18) <400> 274 gat acá ggg ctc ttc atg a Asp Thr Gly Leu Phe Met 1 5 <210> 275 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 275 tcatgaagag ccctgtatc <210> 276 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 276 gtgcacgatg ttggggagc <210> 277 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <22Q> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=g o a <400> 277 gtgcacgatr ttggggagc <210> 278 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 278 gctccccaac atcgtgcac <210> 279 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220 <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=c o t <400> 279 gctccccaay atcgtgcac <210> 280 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 280 gtgcacgata ttggggagc <210> 281 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 281 gctccccaat atcgtgcac <210> 282 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 282 cattaaatga aggactggg <210> 283 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=a o g <400> 283 cattaaatgr aggactggg <210> 284 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 284 cccagtcctt catttaatg <210> 285 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=t o c <400> 285 cccagtccty catttaatg <210> 286 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 286 cattaaatgg aggactggg <210> 287 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 287 cccagtcctc catttaatg <210> 288 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 288 tcctctgaga atgtgcagt <210> 289 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=a o g <400> 289 tcctctgagr atgtgcagt <210> 290 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 290 actgcacatt ctcagagga <210> 291 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=t o c <400> 291 actgcacaty ctcagagga <210> 292 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 292 tcctctgagg atgtgcagt <210> 293 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 293 actgcacatc ctcagagga <210> 294 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 294 aaaattgctg tcactatct <210> 295 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=g o a <400> 295 aaaattgctr tcactatct <210> 296 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 296 agatagtgac agcaatttt <210> 297 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=c o t <400> 297 agatagtgay agcaatttt <210> 298 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 298 aaaattgcta tcactatct <210> 299 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 299 agatagtgat agcaatttt <210> 300 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> ' <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 300 gagcacaaca gtccagctg <210> 301 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: <220> <223> r=a o g <400> 301 gagcacaacr gtccagctg <210> 302 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 302 cagctggact gttgtgctc <210> 303 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=t o c <400> 303 cagctggacy gttgtgctc <210> 304 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 304 gagcacaacg gtccagctg <210> 305 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 305 cagctggacc gttgtgctc <210> 306 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 306 tgggcagacg gtggccctg <210> 307 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=g o a <400> 307 tgggcagacr gtggccctg <210> 308 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 308 cagggccacc gtctgccca <210> 309 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=c o t <400> 309 cagggccacy gtctgccca <210> 310 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 310 tgggcagaca gtggccctg <210> 311 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 311 cagggccact gtctgccca <210> 312 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 312 ctcgtcctgg tagatcttg <210> 313 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=g o a <400> 313 ctcgtcctgr 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Secuencia Artificial: sintética <400> 320 ggtctagctc gcatgggtc <210> 321 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=c o t <400> 321 ggtctagcty gcatgggtc <210> 322 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 322 gacccatgca agctagacc <210> 323 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 323 ggtctagctt gcatgggtc <210> 324 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 324 actttgtcta atctcctgc <210> 325 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=a o g <400> 325 actttgtctr atctcctgc <210> 326 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 326 gcaggagatt agacaaagt <210> 327 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=t o c <400> 327 gcaggagaty agacaaagt <210> 328 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 328 actttgtctg atctcctgc <210> 329 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> 1 <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 329 gcaggagatc agacaaagt <210> 330 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 330 aatcattttc tgtgccaca <210> 331 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> m=c o a <400> 331 aatcattttm tgtgccaca <210> 332 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 332 tgtggcacag aaaatgatt <210> 333 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <220> <223> k=g o t 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Secuencia Artificial: sintética <400> 340 tctactggta tttgtctta <210> 341 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 341 taagacaaat accagtaga <210> 342 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 342 ttaattggcc attttggac <210> 343 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción dé Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=c o t <400> 343 ttaattggcy attttggac <210> 344 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 344 gtccaaaatg gccaattaa <210> 345 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=g o a <400> 345 gtccaaaatr gccaattaa <210> 346 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 346 ttaattggct attttggac <210> 347 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 347 gtccaaaata gccaattaa <210> 348 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 348 aattttctcc ttacgggtg <210> 349 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> m=c o a <400> 349 aattttctcm ttacgggtg <210> 350 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 350 cacccgtaag gaga <210> 351 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> k=g o t <400> 351 cacccgtaak gagaaaatt <210> 352 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 352 aattttctca ttacgggtg <210> 353 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 353 cacccgtaat gagaaaatt <210> 354 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 354 ttctccttac gggtgttag <210> 355 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> y=c o t <400> 355 ttctccttay gggtgttag <210> 356 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 356 ctaacacccg taaggagaa <210> 357 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> r=g o a <400> 357 ctaacaccck taaggagaa <210> 358 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 358 ttctccttat gggtgttag <210> 359 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial Descripción de Secuencia Artificial: sintética <4O0> 359 ctaacaccca taaggagaa <210> 360 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 360 tgaatgttca gtggctccg <210> 361 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> m=a o c <400> 361 tgaatgttcm gtggctccg <210> 362 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 362 cggagccact gaacattca <210> 363 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> k=t o g <400> 363 cggagccack gaacattca <210> 364 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 364 tgaatgttcc gtggctccg <210> 365 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 365 cggagccacg gaacattca <210> 366 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 366 cgggtggtgt cacaggaag <210> 367 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> w=t- o a <400> 367 cgggtggtgw cacaggaag <210> 368 <211> 19 <212> ADN ' <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 368 cttcctgtga caccacccg <210> 369 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <220> <223> w=a o t <400> 369 cttcctgtgw caccacccg <210> 370 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 370 cgggtggtga cacaggaag <210> 371 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 371 cttcctgtgt caccacccg <210> 372 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 372 Lys Leu Asn Asp Lys Ser 1 5 <210> 373 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 373 Asp Thr Gly Ser Phe Met Asn 1 5 <210> 374 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 374 His Phe Asn Tyr Pro 1 5 <210> 375 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <223> Descripción de Secuencia Artificial <400> 375 Asp Thr Gly Leu Phe Met 1 5 <210> 376 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: sintética <400> 376 aaactgaacg ataaaaggta

Claims

REIVINDICACIONES 1 . Un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste (a) un polinucleótido que tiene la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de SEQ ID NOs:73, 74, 79, 80, 85, 86, 91 , 92, 97, 98, 101 , 106, 107, 1 12, 1 13, 1 16, 1 19, 122, 154, 155, 160, 161 , 166, 167, 172, 173, 178, 179, 184, 185, 190, 191 , 196, 197, 202, 203, 208, 209, 214, 215, 220, 221 , 226, 227, 232, 233, 238, 239, 244, 245. 250, 251 , 256, 257, 262, 263, 268, 269, 274, 275, 280, 281 , 286, 287, 292, 293, 298, 299, 304, 305, 310, 31 1 , 316, 317, 322, 323, 328, 329, 334, 335, 340, 341 , 346, 347, 352, 353, 358, 359, 364, 365, 370, 371 o 376; (b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOs: 372, 373, 374 o 375; (c) un polinucleótido que codifica un polipéptido de Resistencia a Multi Medicamento (MDR-1 ) variante, molecular, en donde dicho polinucleótido se tiene en una posición que corresponde a la posición 140837, 141530, 141590, 171466, 171512 o 175068 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC002457), en una posición que corresponde a la posición 101 o 308 del gen de MDR-1 (No. de Acceso. M29432 o J05168), en una posición que corresponde a la posición 78170 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC005068), en una posición que corresponde a la posición 176 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: M2944 o J05168), en una posición que corresponde a la posición 171456, 171404 o 175074 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC002457), en una posición que corresponde a la posición 7781 1 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC005068) o en una posición que corresponde a la posición 137 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: M29445 o J05168) un intercambio de nucleótido, una eliminación de nucleótido , un nucleótido adicional o un nucleótido adicional y un intercambio de nucleótido; (d) un polinucleótido que codifica un polipéptido de MDR-1 de variante molecular, en donde dicho polinucleótido se tiene en una posición que corresponde a la posición 140837 , 17151 2, 1 71456 , 1 71404, 1 391 19, 139619, 140490 o 171 51 1 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC002457) una C, en una posición que corresponde a la posición 141530, 1 39177 , 139479, 1401 18, 140568, 140727 o 174901 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC002457) una A, en una posición que corresponde a la posición 141590, 13901 5 , 140216, 140595, 1 75142 o 1 75180 del gen de MDR-1 (No. de Acceso : AC002457) una G, en una posición que corresponde la posición 1 71466, 175068, 175074, 1 39064, 1 39276, 140576 o 145984 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC002457) una T; en una posición que corresponde a la posición 101 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: M29432 o J05168) una A, en una posición que corresponde la posición 308 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: M29432 o J051 68 una T, en una posición que corresponde a la posición 83946, 781 70, 70237 o 70200 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC005068) una T, en una posición que corresponde a la posición 7781 1 , 84032 o 73252 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC005068) una G, en una posición que corresponde a la posición 84701 , 84074, 841 19, 83973, 70371 , 70253, 70204 o 43162 del gel de MDR-1 (No. de Acceso: AC005068) una A, en una posición que corresponde a la posición 43263 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: AC005068 una C o en una posición que corresponde a la posición 176 o 1 37 del gen de MDR-1 (No. de Acceso: M29445 o J05168) una †; (e) un polinucleótido que codifica un péptido de MDR-1 variante, molecular, en donde dicho polipéptido comprende una substitución de aminoácido en la posición 21 , 103 o 400 del polipéptido de MDR- 1 (No. de Acceso: P08183); y (f) un polinucleótido que codifica un polipéptido de MDR-1 variante, molecular, en donde dicho polipéptido comprende una substitución de aminoácido de N en D en la posición 21 , F en S en la posición 103 , F en L en la posición 103 o S en N en la posición 400 del polipéptido de MDR-1 (No. de Acceso: P081 83). 2. El polinucleótido según la reivindicación 1 , caracterizado porque la eliminación , adición y/o substitución de nucleótido resulta en la expresión alterada del gen de MDR-1 variante en comparación con el tipo de gen de tipo silvestre correspondiente. 3. Un vector que comprende el polinucleótido según la reivindicación 1 o 2. 4. El vector según la reivindicación 3, caracterizado porque el polinucleótido se enlaza operativamente a secuencias de control de expresión que permite la expresión en células eucarióticas o procarióticas. 5. Una célula huésped formada con el polinucleótido según la reivindicación 1 o 2 o el vector de la reivindicación 3 o 4. 6. Un método para producir una proteína de MDR-1 variante molecular o fragmento de la misma que comprende (a) cultivar la célula huésped de la reivindicación 5; y (b) recuperar dicha proteína o fragmento del cultivo. 7. Un método para producir células capaces de expresar un gen de MDR-1 variante molecular que comprende formar genéticamente células con el polinucleótido según la reivindicación 1 o 2 o el vector según la reivindicación 3 o 4. 0 8. Una proteína de MDR-1 o fragmento de la misma codificada por el polinucleótido de la reivindicación 1 o 2 u obtenible por el método de la reivindicación 6 o de las células producidas por el método de la reivindicaicón 7. 9. Un anticuerpo que se une específicamente a la proteína £> de la reivindicación 8. 10. El anticuerpo según la reivindicación 9, que reconoce específicamente un epítopo q ue contiene una o más substituciones de aminoácido como se define en la reivindicación 1 o 2. 1 1 . Una molécula de ácido nucleico complementaria a un 0 polinucleótido de la reivindicación 1 o 2. 1 2 Una molécula de ácido nucleico capaz de reconocer y separar específicamente el polinucleótido de la reivindicación 1 o 2. 1 3. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 1 o 12. 5 14. Un animal no humano transgénico que comprende al menos un polinucleótido de la reivindicación 1 o 2 o el vector de la reivindicación 3 o 4. 1 5. El animal no humano transgénico según la reivindicación 14 que comprende además al menos un alelo de tipo silvestre inactivo del gen de MDR-1 , 16. El animal no humano transgénico según la reivindicación 14 o 1 5, que es un ratón o una rata. 17. Un método para identificar y obtener el inhibidor de MDR-1 capaz de modular la actividad de una variante molecular del gen de MDR-1 o su producto genético que comprende las etapas de: (á) contactar la proteína de la reivindicación 8 o una célula que expresa un gen de MDR-1 variante, molecular que comprende un polinucleótido de la reivindicación 1 o 2 en la presencia de componentes capaces de proporcionar una señal detectable en respuesta al transporte de medicamento, con un compuesto a seleccionarse bajo condiciones para permitir el transporte de medicamento mediado por MDR-1 , y (b) detectar la presencia o ausencia de una señal o incremento de una señal generada del transporte de medicamento, en donde la presencia o incremento de la señal es indicativa de un inhibidor putativo. 1 8. El método según la reivindicación 1 7, caracterizado porque dicha célula es una célula de la reivindicación 5, obtenida por el método de la reivindicación 7 o se comprende en el animal no humano i » - 169 - transgénico de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16. 1 9. Un método para identificar y obtener un inhibidor de MDR-1 capaz de modular la actividad de una vanante molecular del gen de MDR-1 o su producto genético que comprende las etapas de (a) contactar la proteína de la reivindicación 8 con una primer molécula conocida por unirse por la proteína MDR-1 para formar un primer complejo de dicha proteína y dicha primer molécula; (b) contactar dicho primer complejo con un compuesto por seleccionarse; y (c) medir si dicho compuesto desplaza dicha primer molécula de dicho primer complejo. 20. El método según la reivindicación 19, caracterizado porque dicha etapa de medición comprende medir la formación de un segundo complejo de dicha proteína y dicho compuesto . 21 . El método según la reivindicación 1 9 o 20 , caracterizado porque dicha etapa de medición comprende medir la cantidad de dicha primer molécula que no se une a dicha proteína. 22. El método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21 , caracterizado porque dicha primer molécula es Verapamil , Valspodar, Ciclosporin A o dexniguldipina . 23. El método según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, caracterizado porque dicha primer molécula se marca. 24. Un método para diagnosticar un desorden relacionado con la presencia de una variante molecular del gen de MDR-1 o susceptibilidad a tal desorden que comprende (a) determinar la presencia de un polinucleótido de la reivindicación 1 o 2 en una muestra de un sujeto y/o (b) determinar la presencia de una proteína de la reivindicación 8. 25. El método según la reivindicación 24, caracterizado porque dicho desorden es cáncer. 26. El método según la reivindicación 24 o 25 que cpmprende PCR, reacción de cadena de ligasa, digestión de restricción, secuenciación directa, técnicas de amplificación de ácido nucleico, técnicas de hibridización o inumnoanálisis. 27. El método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, que comprende además administrar a un sujeto un medicamento para abolir o aliviar dicho desorden . 28. El método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27 , que comprende además intriducir (i) un gen de DR-1 tipo silvestre expresable y funcional o (¡i) una molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 1 o 1 2 o el vector de la reivindicación 1 3 en las células. 29. Un método para la producción de una composición farmacéutica que comprende las etapas del método de cualquie'ra de las reivindicaciones 1 7 a 23; y (c) sintetizar y/o formular el compuesto identificado y obtenido en la etapa (b) o un derivado del mismo en una forma farmacéuticamente aceptable. 30. Un método para la preparación de una composición farmacéutica que comprende formular un medicamento o pro-medicamento en la forma adecuada para la aplicación terapéutica y evitar o mejorar el desorden del sujeto diagnosticado en el método de la reivindicación 24 o 25. 31 . El método según la reivindicación 29 o 30, caracterizado porque dicho promedicamento o medicamento de compuesto es un derivado de un medicamento como se define en la reivindicación 27. 32. Un inhibidor identificado u obtenible por el método de 0 cualquiera de las reivindicaciones 1 7 a 23. 33. El inhibidor según la reivindicación 32 que se une específicamente a la proteína de la reivindicación 8. 34. El uso de un oligo- o polinucleótido para la detección de un polinucleótido según la reivindicación 1 o 2 y/o para la genotipificación f¡ de alelos MDR-1 individuales. 35. El uso según la reivindicación 34, caracterizado porque dicho polinucleótido es un polinucleótido según la reivindicación 1 o 2 o una molécula de ácido nucléico según la reivindicación 1 1 o 12. 36. El uso según la reivindicación 34, caracterizado porque 0 dicho oligonucleotido es de aproximadamente 1 5 hasta 50 nucleótidos de longitud y comprende la secuencia nucleótida segpun cualquiera de las SEQ ID NOS: 1 a 1 79 o una secuencia de tipo silvestre ("wt") o tipo mutado ("mut") del promotor o de un exón del gen de MDR-1 ilustrado en la Tabla 8 o una secuencia complementaria de cualquiera de esas. 5 37. Una carga de inicio o sonda que consiste en un oligonucleótido según la reivindicación 36. 38. El uso de un anticuerpo o substancia capaz de enlazarse específicamente al producto genético de un gen de MDR-1 para la detección de la proteína según la reivindicación 8, comprendiendo la expresión de un gen de MDR-1 de variante molecular un polinucleótido según la reivindicación 1 o 2 y/o para distinguir los alelos de MDR-1 que comprenden un polinucleótido según la reivindicación 1 o 2. 39. Una composición caracterizada porque comprende el polinucleótido según la reivindicación 1 o 2, el vector según la 0 reivindicación 3 o 4 , la célula huésped según la reivindicación 5 u obtenida mediante el método según la reivindiación 7, la proteína según la reivindicación 8, el anticuerpo según la reivindicación 9 0 10, la molécula de ácido nucléico según la reivindicación 1 1 o 12, el vector según la reivindicación 1 3 , e! inhibidor según la reivindicación 32 o la carga de !) inicio o sonda según la reivindicación 37. 40. La composición según la reivindicación 39, caracterizada porque es una composición de diagnóstico o farmacéutica. 41 . El uso de una dosis eficaz de un fármaco o pro-droga para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento o 0 prevención de un desorden de un sujeto que comprende un polinucleótido segú n la reivind icación 1 o 2 en su genoma. 42. El uso según la reivindicación 41 , caracterizado porque dicho desorden es cáncer o una enfermedad cardiovascular, neuronal o de CNS . 5 43. El uso de un polimorfismo de nucleótido individual de gen de MDR-1 (SNP) como un factor farmacogenético para la predicción de niveles sanguíneos de un substrato de MDR-1 y/o inductor para la mejora de la seguridad y eficacia de fármaco, a fin de predecir y prevenir los efectos laterales e interacciones de fármacos y/o para incrementar la comodidad del paciente. 44. El uso según la reivindicación 43, caracterizado porque el substrato y/o inductor se seleccionan a partir de fármacos anticonvulsivos/antiepilépticos, glicósidos cardiacos, fármacos inmunosupresores, antibióticos macrólidos o antibióticos macrocíclicos. 45. El uso según la reivindicación 43 o 44, en donde el SNP es el exon de MDR-1 26 (C3435T) SNP.