BG106362A

BG106362A - Полиморфизми на човешкия mdr - 1 ген и тяхното диагностично и терапевтично приложение

Info

Publication number: BG106362A
Application number: BG06362A
Authority: BG
Inventors: Ulrich Brinkmann; Sven Hoffmeyer; Michel Eichelbaum; Ivar Roots
Original assignee: Epidauros Biotechnologie Aktiengesellschaft
Priority date: 1999-07-30
Filing date: 2002-01-29
Publication date: 2002-09-30
Also published as: AU1131901A; ATE373710T1; MXPA02001094A; HRP20020093B1; NO20020470L; WO2001009183A2; BG65988B1; NO20020470D0; NO330680B1; HRP20020093A2; SK1502002A3; PL354034A1; HUP0201997A2; CA2376666A1; DE60036487T2; NO20100798L; DE60036487D1; EP1232260B1; CZ2002329A3; CA2697207A1

Abstract

Изобретението се отнася до методи за диагностика и лечение на фенотипния спектър и до припокриващи се клинични характеристики с няколко форми на наследена абнормална експресия и/или функция на гена на многолекарствената резистентност-1 (MDR-1). По-специално то се отнася до полинуклеотиди на молекулярен вариант на MDR-1 гени, които са асоциирани с недостатъчен и/или променен прием на лекарствени средства чрез клетка мишена, и до вектори, съдържащи такива полинуклеотиди. Изобретението се отнася също до клетките гостоприемници, включващи такива полинуклеотиди или вектори, и до тяхното използванеза получаване на вариант на MDR-1 протеини, както и до вариант на MDR-1 протеини и специфични антитела, разпознаващи такива протеини, и до трансгенни животни, включващи полинуклеотида или векторите. Изобретението се отнася също така до методи за идентифициране и получаване на инхибитори за лечение на нарушения, свързани с лошото функциониране на MDR-1 гена, до методи за диагностициране статуса натакива нарушения, до фармацевтични и диагностични състави, включващи полинуклеотидите, векторите, протеините, антителата и инхибиторите от посочения метод. Съставите са изключително полезни за диагностициране и лечение на различни заболявания с лекарствени средства, които са субстрати, инхибитори илимодулатори на MDR-1 генния продукт.

Description

ОЛИМОРФИЗМИ НА ЧОВЕШКИ MDR-1 ГЕН И ТЯХНОТО ИЗПОЛЗУВАНЕ ЗА ДИАГНОСТИКА И ТЕРАПЕВТИЧНИ ПРИЛОЖЕНИЯ

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Настоящето изобретение се отнася най-обощо до начини и методи за диагностика и лечение на фенотипния спектър, така както и до припокриващите се клинични характеристики с няколко форми на наследена абнормална експресия и/или функция на гена за Много-Лекарствената-Резистентност (Multi Drug Resistance) (MDR-1). По-специално, настоящето изобретение се отнася до полинуклеотиди на молекулярен вариант на MDR-1 гени, които например, са асоциирани с недостатъчен и/или променен прием на лекарствени средства чрез клетка мишена, и вектори, съдържащи такива полинуклеотиди. Освен това се описват клетките гостоприемници, включващи такива полинуклеотиди или вектори и тяхното използуване за получаване на вариант на MDR-1 протеини. Настоящето изобретение се отнася, също така, и до варианти на MDR-1 протеини и специфични антитела, разпознаващи такива протеини. Настоящето изобретение се отнася, също така до трансгенни животни, които не са хора, включващи горе-описания полинуклеотид или Ф вектори. Описват се, също така, методи за идентифициране и получаване на кандидати за лекарствени средства и инхибитори за лечение на нарушения, свързани с лошото функиониране на MDR-1 гена, така както и методи за диагностициране статуса на такива нарушения. Предоставят се също фармацевтични и диагностични състави, включващи горе-описаните полинуклеотиди, вектори, протеини, антитела и лекарствени средства и инхибитори, които могат да се получат по горе-описания метод. Посочените състави са изключително полезни за диагностициране и лечение на различни ф заболявания с лекарствени средства, на които те са субстрати, инхибитори или модулатори на MDR-1 генния продукт.

В текста на описанието са цитирани някои документи. Всеки от тук-цитираните документи (включително и препоръките на производителите, инструкциите и др.) се включват в настоящето като литературна справка; въпреки това не може да се приеме, че който и да е от цитираните документи се явява предшестващо състояние на техниката на настоящото изобретение.

ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХТИКАТА

Човешкият MDR-1 ген кодира цялостния протеин на мемрбаната, чиято функция е енергозависимия транспорт на различни вещества от вътрешноста на клетките и клетъчните мембрани навън от клетката. Докато нормалното физиологично действие на MDR-1 е предимно да предпазва клетките от токсични вещства, известно е също така, че много вещества от MDR-1 транспортиращото средство са лекарствени средства, които са били разработени за ft лечението на болести по хората. Поради тази причина, степента на експресия и действието на MDR-1 генния продукт могат директно да засегнат ефективноста на което и да е лекарствено средство, което служи като субстрат на MDR-1. Например, добре известно е, че нивата на експресия, а следователно и степента на функциониране на MDR-1 директно засягат ефективонста на всяко противо-туморно лекарствено средство при лечението на рак. Всъщност, генът наречен “MDR” стои зад Много-Лекарствената-Резистентност, като отразява наблюдението, че протеинът кодиран от този ген ф причинява раковите клетки да станат упорити към лечението с многобройни лекарствени средства, всички които са субстрати на MDR-1 транспортиращото средство.

MDR-1 генът се експресира не само върху някои ракови клетки, където може директно да засегне ефективноста на лечението на лекарствените средства чрез предоставяне на предпазна бариера срещу навлизането на лекарственото средство, но също така и върху различни не злокачествени клетки в различни органи, например, в дебелото черво и кръвно-мозъчната бариера. В тези клетки, MDR-1 може, също така, да засегне активноста и достъпноста на лекарствените средства. Например, MDR-1 в дебелото черво може да контролира или да модулира степента на приемане на лекарственото средство от дебелото черво след орално приемане на лекарственото средство. MDR-1 при кръвномозъчната бариера може също да повлияе или да контролира степента до която MDR-1 субструтите могат да се поемат в мозъка. Тук, високата MDR-1 активност може да предотврати

приема на	достатъчни	количества	от	желаните	мозъчни
лекарствени	средства	в мозъка,	или	обратното,	MDR-1
варианти с	намалена	активност	към	някои лекарствени
средства, като може	да доведе	ДО	ненормално	високо

акумулиране в мозъка, което да доведе до нежелани или даже опасни странични действия на лекарствените средства.

Общият фактор, който контролира MDR-1-зависимият транспорт при злокачествени клетки, както и нормални клетки и тъкани е действието на MDR-1. На свой ред, MDR-1 активността е зависима от (i) нивото на експресия на MDR-1 гена, който определя количеството на MDR-1 протеин, който се синтезира в клетките, и (ii) функционалноста на синтезирания MDR-1 протеин, т.е. които сусбтрати се разпознават и се транспортират извън клетката и с каква ефективност.

Първият от тези параметри, нивото на експресия на MDR1 е бил интензивно анализиран, по-специално поради факта, че чувствителноста на туморните клетки към химиотерапията на рака често има обратна връзка с ир-регулирането на MDRекспресията: висока MDR-1 експресия често съответства на недостатъчна ефективност на химиотерапията на рака. Въпреки че свръхекспресията на MDR-1 може отчасти да се отдаде на MDR-1 генно амплифициране, известно е, че трябва да съществуват други, до сега не определени причини, между които, вероятно и алелни различия. Малки разлики в MDR-1 генната последователност при индивидите може да е причина за различните нива на MDR-1 генна експресия. Областите мишени в човешки геном където могат да съществуват разлики на последователностите, които директно влиаят на MDR-1 генната експресия би трябвало да са контролните области на генна експресия: промоторните и енхансерни области на MDRф 1 пре-иРНК-и. Освен това, нивата на експресия могат да се повлиаят от структурни промени в генома, като метилиране, общи изменения на хроматина и други фактори, които се свързват с MDR-1, в областта, директно при, или заобикаляща MDR-1 гена. Много трудно е директно да се открият такива свързани фактори или последователности и да се докаже тяхния механизъм за генно активиране и репресия. Въпреки това, линейната структура на човешкия геном върху определени хромозоми дава възможност за използуване на идентифицирани полиморфизми, които самите те влиаят ф директно върху нивата на експресия на гените, като маркери за други, не идентифицирани до сега, промени във и около MDR-1 гена, който засяга нивата на експресия. Този ефект е известен като свързванве: вариацията на определени алели и бази могат да служат като маркери за един важен фенотип, даже ако тези промени, сами по себе си, не са причина за този фенотип.

Вторият параметър, функционалноста на синтеза на MDR-1 протеин, т.е., кои субстрати се разпознават и се транспортират извън клетката, чиято ефективност се определя предимно от аминокиселинната последователност на протеина, който се кодира от MDR-1 алела. Добре известно е, че промените в аминокиселинната последователност могат да доведат до промяна във функионирането на протеините. Примери за естествено възникнали вариации, т.е., различни алели, които имат директно влияние върху действието на различни лекарствени средства са, например, цитохром Р450 полиморфиизми, или полиморфизми в ТРМТ, АРОЕ, и разнообразие от други гени. Също така, вариациите, свързани ф с тумори, например, в р53 гена са известни, че медиират такива фенотипове. До сега, единствено някои полиморфизми в MDR-1 гена са били описани и са били свързани с клинични ефекти (Mickley, Blood 91 (1998), 1749-1756). Основният въпрос в тази област остава дали съществуват повече такива полиморфизми и, ако е така, дали това може да е свързано с действието на лекарствените средства и/или страничното действие на лекарственото средство. Експерименти с изкуствено въведени мутации в MDR-1 гена показват недвусмислено, че MDR-1 реагира напълно на ф аминокиселинните промени. Показано е, че изкуствените мутации в MDR-1 гена, които се транслират в промени на протеина, могат да променят субстратния спектър, ефективноста или субстратния транспорт, контрола на транспорта, също и чувствителноста на MDR-1 към инхибиране със специфични инхибиращи субстрати. Ясно е, че естествено произтичащите в природата мутации, ако те съществуват, притежават подобно действие. Въпреки това, не е известно колко такива вариации съществуват, и с каква честота и на кои позиции в човешкия MDR-1 ген.

В съответствие, начини и методи за диагностика и лечение на многобройни форми на Много-ЛекарственатаРезистентност, която е следствие от полиморфизмите на MDR1 гена, и уврежда чувствствителноста, например с химиотерапевтично лечение на заболявания, по-специално рак, в настоящето не са представени, но въпреки това са изключително желателни.

И така, техническият проблем на настоящето изобретение е да се подчини на посочените по-долу необходимости.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящето изобретение се основава върху откритието на нови, неизвестни вариации в нуклеотидните последователности на човешкия MDR-1 ген (МногоЛекарствената-Резистентност) и разпределението на тези алели сред популацията. На основата на известното от тези нови последователности и отклонения на основата на MDR-1 гена, диагностични тестове и реагенти за такива тестове се проектират за специфично откриване и генотипизиране на MDR-1 алелите в хора, включително хомозиготни, както и хетерозиготни, често, както и рядко, алели на MDR-1 гена. Определянето на MDR-1 генния алелен статус на хора с такива тестове е полезно при терапията на различни заболявания с лекарствени средства, които са субтрати, инхибитори или модулатори на MDR-1 генния продукт.

При един първи вариант на изпълнение, настоящето изобретение предоставя полинуклеотиди на молекулярен вариант на MDR-1 гените и вариант за изпълнение, свързан с него, като вектори, клетки гостоприемници, варианти на MDR-1 протеини и методи за получаване на същите.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението предоставя методи за идентифициране и получаване на кандидати на лекарствени средства и инхибитори на лекарствени средства за лечение на нарушения, свързани с придобита Много-Лекарствената-Резистентност или чувствителност, така както и методи за диагностика на статуса на такива нарушения.

О При един друг вариант за изпълнение, изобретението предоставя фармацевтични и лекарствени състави, съдържащи горе-описаните полинуклеотиди, вектори, съдържащи същите, протеини, тяхни антитела и лекарствени средства и инхибитори, които могат да се получат по гореописания метод.

Фармацевтичните състави и състави за диагностика, методи и използуване на изобретението се използуват за диагностика и лечение на наследена лекарствена резистентност на туморни и други заболявания, лечението на ф които зависи от лекарствени средства за лечение. Новите вариантни форми на MDR-1 гените, съгласно изобретението, предоставят потенциал за развитие на фармакодинамичен профил на лекарствените средства за определен пациент.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Откриването и охарактеризирането на вариациите на MDR-1 гена, и тестовете за диагностика за дескриминиране на различни MDR-1 алели в отделните хора предоставя изключително мощно средство за подобряване лечението на заболявания с лекарствени средства, които са мишена на MDR-1 генния продукт, и чийто клетъчен прием следователно е зависим от MDR-1. Диагностицирането на индивидуалния алелен MDR-1 статус позволява по-фокусирано лечение, например, чрез отваряне на възможноста да се приложат индивидуални режими на дозиране на лекарствените средства. Също така, може да е полезно като прогностично средство за изхода от лечението, като се потвърждава едно подобряване на подхода при използуването на общата експресия на MDR като прогностик-мейкър. Освен това, диагностичните тестове за генотипния MDR-1, и новите MDR-1 варианти, няма единствено да подобрят установените лекарствени средства за провеждане на лечението, но също така ще спомогнат да се свържат генотиповете с активноста на лекарствените средства или тяхното странично действие. Тези тестове и последователности предоставят, също така, реагенти за развитието на нови инхибитори, които специфично модулират активноста на отделните типове MDR-1. Изпълнимоста на използуването на индивидуални (изкуствено създадени) варианти на MDR и тяхното потенциално терапевтично приложение, наскоро бе демонстрирано, например, в моделна система (Moscow J. A. et al., Blood 94 (1999), 52-61; Dey S. et al., Biochemistry 38 (1999), 6630-6639).

Следователно, настоящето изобретение предоставя нов начин за експлоатиране на молекулярната биология и фармакологичните изследвания за лекарствената терапия, като се заобикалят тяхните потенциални вредни ефекти, които се дължат на експресирането на варианти на MDR-1 гени.

В съответствие, изобретението се отнася до полинуклеотид, избран от група, състояща се от:

(а) полинуклеотид, притежаващ нуклеиновата последователност, на която и да е от SEQ ID NOs: 73, 74,

79, 80, 85, 86, 91, 92, 97, 98, 101, 106, 107, 112, 113, 116,

119,	122,	154,	155,	160,	161,	166,	167,	172,	173,	178,	179,
184,	185,	190,	191,	196,	197,	202,	203,	208,	209,	214,	215,
220,	221,	226,	227,	232,	233,	238,	239,	244,	245,	250,	251,
256,	257,	262,	263,	268,	269,	274,	275,	280,	281,	286,	287,
292,	293,	298,	299,	304,	305,	310,	311,	316,	317,	322,	323,
328,	329,	334,	335,	340,	341,	346,	347,	352,	353,	358,	359,

364, 365, 370 или 371;

(b) полинуклеотид, кодиращ полипептид, притежаващ аминокиселинната последователност от която и да е SEQ ID NOs: 372, 373 374 или 375;

полинуклеотид, кодиращ молекулярен вариант на МногоЛекарствената-Резистентност (MDR)-1 полипептид, като посоченият полинуклеотид притежава в позиция, съответстваща на позиция 140837, 141530, 141590, 171466, 171512 или 175068 на MDR-1 гена (Регистров No: АС002457), в позиция, съответстваща на позиция 101 или 308 на MDR-1 гена (Регистров No: М29432 или J05168), в позиция, съответстваща на позиция 83946 на MDR-1 гена (Регистров No: АС005068), в позиция, съответстваща на позиция 78170 на MDR-1 гена (Регистров No: АС005068), в позиция, съответстваща на позиция 176 на MDR-1 гена (Регистров No: М29445 или J05168), в позиция, съответстваща на позиция 171456, 171404 или 175074 на MDR-1 гена (Регистров No: АС002457), в позиция,

съответстваща на позиция 77811 на MDR-1 гена (Регистров No: АС005068) или в позиция, съответстваща на позиция 137 на MDR-1 гена (Регистров No: М29445 или J05168) нуклеотидна замяна, нуклеотидна делеция, прибавяне на нуклеотид или прибавяне на нуклеотид и нуклеотидна замяна;

(d) полинуклеитид, кодиращ молекулярен вариант на MDR-1 полипептид, където посоченият полинуклеотид притежава в позиция, съответстваща на позиция 140837, 171512, 171456, 171404, 139119, 139619, 140490 или 171511 на MDR-1 гена (Регистров No: АС002457) С, в позиция, съответстваща на позиция 141530, 139177, 139479, 140118, 140568, 140727 или 174901 на MDR-1 гена (Регистров No: АС002457) А, в позиция, съответстваща на позиция 141590, 139015, 140216, 140595, 175142 или 175180 на MDR-1 гена (Регистров No: АС002457) a G, в позиция, съответстваща на позиция 171466, 175068, 175074, 139064, 139276, 140576 или 145984 на MDR-1 гена (Регистров No: АС002457) Т, в позиция, съответстваща на позиция 101 на MDR-1 гена (Регистров No: М29432 или J05168) А, в позиция, съответстваща на позиция 308 на MDR-1 гена (Регистров No: М29432 или J05168) а Т, в позиция, съответстваща на позиция 83946, 78170, 70237 или 70200 на MDR-1 гена (Регистров No: АС005068) Т, в позиция, съответстваща на позиция 77811, 84032 или 73252 на MDR-1 гена (Регистров No: АС005068) G, в позиция, съответстваща на позиция 84701, 84074, 84119, 83973, 70371, 70253, 70204 или 43162 на MDR-1 гена (Регистров No: АС005068) А, в ι«-, -.· ---.¾.

позиция, съответстваща на позиция 43263 на MDR-1 гена (Регистров No: АС005068) С или в позиция, съответстваща на позиция 176 или 137 на MDR-1 гена (Регистров No: М29445 или J05168) Т;

(e) полинуклеотид, кодиращ молекулярен вариант на MDR-1 пептид, където посоченият полипептид включва аминокиселинно заместване в позиция 21, 103 или 400 на MDR-1 полипептида (Регистров No: Р08183); и (f) полинуклеотид, кодиращ молекулярен вариант на MDR-1 пептид, където посоченият полипептид включва аминокиселинно заместване на N в D в позиция 21, на F в

S в позиция 103, на F в L в позиция 103 или на S в N в позиция 400 на MDR-1 полипептида (Регистров No: Р08183).

В контекста на настоящето изобретение, терминът “молекулярен вариант” на MDR-1 гена или протеина, както се използува в настоящето, означава, че посоченият MDR-1 ген или протеин се различава от дивия тип MDR-1 ген или протеин (геномните последователности на MDR-1 гена са описани, на пример, за екзони 1-7: Регистров number АС002457; за екзон 8: Регистров number М29429, J05168, АС005068; за екзон 9: Регистров number М29430, J05168, АС005068; за екзон 10: Регистров number М29431, J05168, АС005068; за екзони 11 до 13: Регистров number М29432, J05168 и АС005068; за екзон 14: Регистров number М29433, J05168, АС005068; за екзон 15:

Регистров number М29434, J05168, АС005068; за екзон16:

Регистров number М29435, J05168, АС005068; за екзон17:

Регистров number М29436, J05168, АС005068; за екзон18:

Регистров number М29437, J05168, АС005068; за екзон19:

Регистров	number	M29438,	J05168,	AC005068;	за	екзон	20:
Регистров	number	M29439,	J05168,	AC005068;	за	екзон	21:
Регистров	number	M29440,	J05168,	AC005068;	за	екзон	22:
Регистров	number	M29441,	J05168,	AC005068;	за	екзон	23:
Регистров	number	M29442,	J05168,	AC005068;	за	екзон	24:
Регистров	number	M29443,	J05168,	AC005068;	за	екзон	25:
Регистров	number	M29444,	J05168,	AC005068;	за	екзон	26:
Регистров	number	M29445,	J05168,	AF016535,	АС005068;	за

екзон 27: Регистров number М29446, J05168, АС005068; за екзон 28: Регистров number М29447, J05168, АС005068) като нуклеотидни замествания, прибавяния и/или делеции. За предпочитане, посочените нуклеотидни замествания водят до съответната промяна на аминокиселинната последователност на MDR-1 протеина.

Терминът “съответен”, както се изпорлзува в настоящето, означава, че не само е определна позиция от номера на предходните нуклеотиди и аминокиселини, съответно. Позицията на даден нуклеотид или аминокиселина, в съответствие с настоящето изобретение, която може да бъде делетирана, заместена или включва един или повече допълнителни нуклеотида може да варира, което се дължи на делетираните или прибавените нуклеотиди или аминокиселини, където и да е в гена или полипептида. Следователно под “съответна позиция”, съгласно настоящето изобретение, трябва да се разбира, че нуклеотидите или аминокиселините могат да се различават по посочения номер, но въпреки това могат да имат подобни съседни нуклеотиди или аминокиселини. Посочените нуклеотиди или аминокиселини, които могат да са подменени, делетирани или да съдържат допълнителни нуклеотиди или аминокиселини също се обхващат от термина “съответна позиция”. Посочените нуклеотиди или аминокиселини могат, например, заедно с тяхните съседни последователности, да образуват последователости, които са включени в регулирането на генната експресия, стабилноста на съответната РНК или РНК редакция, така както и кодирането на функционални домени или мотиви на протеина от изобретението.

В съответствие с настоящето изобретение, начина и ® разпределението по населението на нови, досега неидентифицирани и генетични вариации на MDR-1 гена са били анализирани чрез секвенционен анализ на релевантни области на човешкия MDR-1 ген от многобройни различни индивиди. Добре известен факт е, че геномна ДНК на иднивидите, които са носители на индивидуалния генетичен “грим” на всички гени, включително MDR-1 лесно могат да се пречистят от индивидуални кръвни проби. Тези индивидуални ДНК проби след това се използуват за анализиране на състава на последователноста на MDR-1 гениите алели, които ф присъстват в индивидите, които предоставят кръвните проби.

Анализът на последователноста се провежда чрез PCR амплифициране на релевантни области на MDR-1 гена, последващато пречиставне на PCR продуктите, последвано от автоматично ДНК секвениране с установени методи (ABI оцветявящо терминатора (dyeterminator) циклично секвениране).

Един важен параметър, който трябва да се има предвид в опит да се опрдели индивидуалния MDR-1 генотип и идентифицирането на новите MDR-1 варианти чрез насочено

ДНК секвениране на PCR продукти на човешка кръвна геномна ДНК представлява факта, на който всеки човек е носител (обикновено с много малко абнормални изключения) две генни копия от всеки автозомален ген (диплоиен). Поради това, трябва много да се внимава при определянето на последователносите, които са способни да идентифицират недвусмислено, не само хомозиготни вариации на последователности, но също така и хетерозиготни вариации. Детайлите на различните етапи при идентифицирането и охарактеризирането на нови MDR-1 генни полиморфизми (хомозиготни и хетерозиготни) се описват в примери 1 и 2, подолу.

Мутациите в MDR-1 гена, определени в съответствие с настоящето изобретение, са илюстрирани на фигура 2 (означени чрез стрелка). Методите за анализ на мутацията следват стандарни протоколи и са описани в детайли в примерите за изпълнание. Най-общо, такива методи, които се използуват в съответствие с настоящето изобретеие, за определяне фетопния спектър, така както и на припокриващите се клинични характеристики с други форми на Много-Лекарствената-Резистентност и променена толерантност на лекарствени средства при пациенти с мутации в MDR-1 гена включват, например, анализ на хаплотипа, конформационен едноверижен анализ (SSCA), PCR и насочено секвениране; виж също Micley (1998), и цитираните литературни отпратки. Въз основа на пълното клинично охарактеризиране на много пациенти, фенотипите могат след това да съответстват с тези мутации така както с мутации, които са били описани по-рано. Къкго става ясно за специалиста в област, в областа на техниката, тези нови молекулярно генетични познания могат сега да се използуват за да се охарактеризира точно фенотипа на индекса на пациента, когато едно посочано лекарствено средство има необичайно действие, както и от неговото семейство.

През изминалите 20 години, генетичната хетерогенност е била нарастващо призната като значителен източник на вариации на отговора на лекарствените средства. Многобройни научни доклади (Meyer, Ann. Rev. Pharmacol.

• Toxicol. 37 (1997), 269-296 and West, J. Clin. Pharmacol. 37 (1997), 635-648) ясно са показали, че някои лекарствени средства действат по-добре или могат дори да бъдат силно токсични при някои пациенти отколкото при други, и че тези вариации при отговорите на пациентите на лекарствените средства могат да са свързани с молекулната основа. Тази “фармакогеномна” концепция нахвърля взаимовръзката между отговорите и генетичните профили на пациентите (Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997), 954-957; Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997), 1249-1252).

ф В този контекст на изменчивост в популацията с оглед на лечението с лекарствени средства, фармакогеномните средства се предлагат като полезно средство при идентифицирането и селекцията на пациенти, които могат да изработят отговор на определено лекарствено средство без странични действия. Това идентифициране/селекция може да се основава на молекулярната диагноза на генния полиморфизъм чрез генотипизиране на ДНК от левкоцити в кръвта на пациент, например, и охарактеризиране на заболяване (Bertz, Clin. Pharmacokinet. 32 (1997), 210-256;

Engel, J. Chromatogra. B. Biomed. Appl. 678 (1996), 93-103). 3a откривателите на здравеопазването, като една такава организация за поддържане на здравето в САЩ и правителствените организациии за здравеопазването в много Европейски държави, тези фармакогеномни подходи могат да представляват начин за подобряване на здравеопазването, както и за намаляване на разноските, тъй като съществува висока себестойност на ненужни лекарствени средства, неефективни лекарствени средства и лекарствени средства със странични ефекти.

Мутаците в вариантните на MDR-1 гени понякога водят до делеции не аминокиселини, инсерции и по-специално до замествания, или единични или в комбинация. Възможно е разбира се да се постигнат генноинженерни мутации в дивия тип гени или други форми на мутации. Добре известни са на специалистите в областа методи за въвеждане на такива модификации в ДНК последователноста на MDR-1 гена; виж Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.

При един предпочитан вариант за изпълнение на изобретението, горе-описаният полинуклеотид кодира вариант на MDR-1 протеин или негов фрагмент, например, включващ

един	или повече	епитопи	на	аминокиселинна
последователност, кодирана от SEQ	ID NOs:	85, 97, 106	или
274.
За	изследване	естеството	на	промените	в

аминокиселинната последователност на MDR-1 протеина могат да се използуват компютърни рограми като BRASMOL, които могат да се получат по Internet. Освен това могат да се проведат “сгъваемо” стимулиране и компютърно препроектиране на структурни мотиви, при използуване на други подходящи компютърни програми (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675679). Компютрите могат да се използуват за конформационен и енергетичен анализ на детайлните модели на протеина Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37-45). Този анализ може да се използува за идентифициране на влиянието на определена мутация върху • свързването и/или транспорта на лекарствени средства .

Обикновено, посочената аминокиселинна делеция, прибавяне или заместване в аминокиселинната последователност на протеина, кодиран от полинуклеотида на изобретението се дължи на едно или повече нуклеотидни замествания, инсерции или делеции, или на каквито и да е тяхни комбинации. За предпочитане, посочените замествания, инсерции или делеции водят до едно заместване на аминокиселина Asn21 в Asp в екзон 2, Phe103 в Ser или Leu в екзон 5 и/или Ser400 в Asn в екзон 11 на MDR-1 гена.

ф Полинуклеотидът на изобретението може, освен това, да включва поне един нуклеотид и при желание една аминокиселинна делеция, прибавяне и/или замяна, различни от посочените по-горе, например, посочените в състоянието на техниката; например, Mickley (1998). Настоящият варианта за изпълнение на изобретението позволява изследването на синергичните ефекти на мутациите в MDR-1 гена на фармакологичния профил на лекарствените средства при пациенти, които са носители на такива мутантни форми на гена или подобни мутантни форми, които могат да се наподобяват от горе-описаните протеини. Очква се анализът на посочените синергични ефекти да достави по-задълбочен поглед върху началто на фенотипите на Много-ЛекарственатаРезистентност на някои форми на рак. От този по-задълбочен поглед, развитието на диагностиката и фармацевтичните състави, свързани с рака ще получат голяма полза.

И така, при един предпочитан вариант за изпълнение, настящето изобретение се свързва с полинуклеотиди на молекулярен вариант на MDR-1 гените, при което нуклеотидните делеции, инсерции или замествания водят до променено експресиране на варианта на MDR-1 гена, в сравнение със съответния ген от див тип.

Полинуклеотидът от изобретението може да е, например, ДНК, геномна ДНК, РНК или синтетично получена ДНК или РНК или рекомбинантно получена химерна молекула на нуклеинова киселина, съдържаща който и да е от тези полинуклеотиди, било то самостоятелно или в комбинация. За предпочитане този полинуклеотид е част от вектор, по-специално плазмиди, козмиди, вируси и бактериофаги, конвенционно използувани в генното инженерство, които включват полинуклеотид от изобретението. Такива вектори могат да съдържат освен това, гени като маркерни гени, които позволяват селекционирането на посочения вектор в подходяща клетка гостоприемник и при подходящи условия.

При един друг предпочитан вариант за изпълнение, векторът от изобретението, полинуклеотидът от изобретението е операционно свързан към експресионните контролни последователности, позволяващи експресия в прокариотни или еукариотни клетки. Експресията на посочения полинуклеотид включва транскрипция на полинуклеотида, за предпочитане в РНК, способна на транслация. Регулаторните елементи осигуряващи експресия в еукариотни клетки, за предпочитане клетки от бозайник, са известни на специалистите в областа. Обикновено те включват регулаторни последователности, които осигуряват иницииране на транскрипцията и по желание, поли-А сигнали, осигуряващи терминацията на трансксрипцията и стабилизирането на транскрипта. Допълнителни регулаторни елементи могат да включват транскрипционни, както и транслационни енхансери. Възможните регулаторни елементи, позволяващи експресия в прокариотни клетки гостоприемници включват, например, lac, trp или tac промотор в Е. coli, а примери за регулаторни елемнти, позволяващи експресия в еукариотни клетки гостоприемници са АОХ1 или GAL1 промотор в дрожди или CMV-, SV40-, RSV-промотор (Rous sarcoma virus), CMVенхансер, SV40-eHxaHcep или глобинов интрон в клетки от бозайници, както и в други клетки. Вместо елементи, които отговарят за инициирането на транскрипцията, такива регулаторни елементи могат да съдържат сигнали за завършване на транскрипцията, като SV40-poly-A сайт или tkpoly-A сайт, в посока downstream от полинуклеотида. В този контескт, подходящи експресионни вектори са известни от състоянието на техниката като Okayama-Berg сДНК експресионен вектор pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAI, pcDNA3 (In-vitrogene), pSPORTI (GIBCO BRL). 3a предпочитане, посоченият вектор е експресионен вектор и/или вектор за трансфер на гени или за насочване на вектори. Експресионни вектори, произлизащи от вируси, като ретровируси, вакциния вирус, адено-асоциирани вируси, херпес вирус, или говежди папилома вирус, могат да се използуват за доставяне на полинуклеотидите или на веткор, съгласно изобретението, в популация на клетки гостоприемници. Методи, които са добре известни на специалистите в областа могат да се използуват за конструиране на рекомбинантин вирусни вектори; виж например, техниките, описани в Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. и φ Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing

Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994). Алтернативно, полинуклеотидите и векторите , съгласно изобретението, могат да бъдат възстановени в липозоми, за доставка в клетките мишени.

Настоящето изобретение, се отнася, освен това до клетки гостоприемници, трансформирани с полинуклеотид или вектор от изобретението. Посочената клетка гостоприемник може да бъде прокариотна или еукариотна клетка; виж по-горе. Полинуклеотидът или векторът от изобретението, който ф присъства в клетката гостоприемник могат или да са интегрирани в генома на клетката гостоприемник или може да се поддържа извънхромозомално. В това отношение, трябва да се разбира, че рекомбинантната ДНК молекула от изобретението може, също така, да се използува за “генно насочване” и/или “генно заместване”, за възстановяване на мутантен ген или за създаване на мутантен ген чрез хомоложно рекомбиниране; виж например, Mouellic, Proc. Natl.

Acad. Sci. USA, 87 (1990), 4712-4716; Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Press.

Клетката гостоприемник може да е която и да е прокариотна или еукариотна клетка, като бактериална клетка, клетка от насекомо, клетка от фунги, растения, животински или човешки клетки. Предпочитани клетки от фунги са, например, тези от род Saccharomyces, по-специално от вида S. cerevisiae. Терминът “прокариотен” означава, че включва всички бактерии, които могат да бъдат трансформирани или трансфектирани с полинуклеотид за експресиране на вариантен MDR-1 протеин или негов фрагмент. Прокариотните гостоприемници могат да включват Грам негативни, както и Грам позитивни бактерии, като например, Е. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens и Bacillus subtilis. Полинуклеотид, кодиращ мутантна форма на MDR-1 вариантни протеини могат да се използуват за трансформиране или трансфектиране на гостоприемник, при използуване на която и да е рутинно използувана техника, известна на специалистите в областа. Методи за получаване на сляти, операционно свързани гени и експресирането им в бактерии или животински клетки са добре известни от състоянието на техниката (Sambrook, по-горе). Генетичните структури и методи, описани там, могат да се използуват за експресиране на вариантини MDR-1 протеини в, например, прокарииотен гостоприемник. Най-общо, експресионните вектори, съдържащи промоторни последователности, които улесняват ефикасното транскрибиране на инсерирания полинуклеотид се използуват във връзка с гостоприемника. Експресионният вектор характерно съдържа начало на репликация, промотор и терминатор, така както и специфични гени, които са способни да осигурят фенотипна селекция на трансформираните клетки. Трансформираните прокариотни гостоприемници могат да се развиват във ферментатори и да се култивират съгласно техники, известни от състоянието на техниката, за да се осигури оптимален клетъчен растеж. Протеините от изобретението могат, след това, да се изолират от културалната среда, от клетъчни лизати, или от фракции на клетъчни мембрани. Изолирането и пречистването на микробно експресираните, или експресираните по друг начин полипептиди на изобретението, може да се извърши по който и да е конвенционален начин, като например, препаративна хроматография и имунологично разделяне, като това, включва използуването на моноклонални или поликлонални антитела.

Така, при един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до метод за получаване на вариант на MDR-1 протеини и тяхни фрагменти, включващ култивиране на клетка гостоприемник, както е дефинирано по-горе, при условия позволяващи експресирането на протеина и възстановяването на продуцирания протеин или негов фрагмент от културата.

При друг вариант за изпълнение, настоящето изобретение се отнася до метод за получаване на клетки, способни да експресират вариант на MDR-1 ген, включващ генно-инженерно получени клетки с полинуклеотид или с вектор от изобретението. Клетките, които могат да се получат по метода от изобретението могат да се използуват, например, за тестване на лекарствените средства, съгласно описаните методи в D. L. Spector, R. D. Goldman, L. A. Leinwand, Cells, a Lab manual, CSH Press 1998. Освен това, клетките могат да се използуват за изучаване на известни лекарствени средства и неизвестни тяхни производни за тяхната способност да допълнят недостатъчноста за транспортиране на лекарствените средства, причинена от мутации във вариант на MDR-1 гена. За тези варианти за изпълнение, обикновено клетките гостоприемник са с липса на алел от дивия тип, за предпочитане и двата алела на MDR-1 гена и/или най-малко един от тях е мутирал. Алтернативно, силна свръхекспресия на мутиралия алел над нормалния алел и сравняване със свръхекспресия на рекомбинантна клетъчна линия на нормалния алел при подобно ниво, може да се използува като система за скрининг и система за анализ. Клетките, които могат да се получат по горе-описания метод могат, също така, да се използуват за методи за скрининг, посочени по-долу.

Освен това, изобретението се отнася до вариант на MDR1 протеин или негови фрагменти, кодирани от полинуклеотид, съгласно изобретението, или които могат да се получат по горе-описаните методи или от клетки, продуцирани по гореописаните методи. В тази връзка, трябва да се разбира, че вариант на MDR-1 протеини, съгласно изобретението могат да бъдат допълнително модифицирани по конвенционални методи, известни от състоянието на техниката. Чрез предоставяне на вариантните MDR-1 протеини, съгласно настоящето изобретение, е възможно, също така да се определят релевантни участъци за тяхната биологична активност или инхибиране на същото, а имено, тяхната активност за транспортиране на лекарствени средства.

Настоящето изобретение, освен това се отнася до антитела, които специфично разпознават вариант на MDR-1 протеин, съгласно изобретението. С преимушество, антитялото специфично разпознава един епитоп, съдържащ едно или повече аминокиселинни замествания, както е дефинирано по-горе.

Антитела срещу вариант на MDR-1 протеин от изобретението могат да се получат чрез добре известни методи, при използуване на пречистен протеин, съгласно изобретението или на (синтетичен) фрагмент, произлизащ от него, като антиген. Моноклонални антитела могат да се получат, например, по техники, които първоначално са описани в Kohler and Milstein, Nature 256 (1975), 495, and Galfre, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3, който включва сливане на миши миеломни клетки с клетки от далак, произлизащи от имунизирани бозайници. Антителата могат да са моноклонални антитела, поликлонални антитела или синтетични антитела, така както и фрагменти от антитела, като Fab, Fv или scFv фрагменти и др. Освен това, антитела или тяхни фрагменти за горе-споменаните полипептиди могат да се получат при използуване на методи, които са описани, например в in Harlow and Lane Antibodies, A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Тези антитела могат да се използуват, например, за имуноутаяване и имунолокализиране на вариант на MDR-1 протеини от изобретението, така както и за следене присъствието на такъв вариант на MDR-1 протеини, например в рекомбинантни организми, и за идентифициране на съединения, които взаимодействат с протеините, съгласно изобретението. Например, резонанс на повърхностен плазмон, както се използува в BIAcore система, може да се използва за увеличаване ефикастноста на фагови антитела, които се свързват към един епитоп на протеина от изобретението (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).

Допълнително, настоящето изобретение се отнася до молекули нуклеинови киселини, които представляват или съдържат комплементарната верига на който и да е от гореописаните полинуклеотиди или части от тях, които включват най-малко един нуклеотид, различен в сравнение със съответния див тип нуклеотидна последователонст на MDR-1 гена, уточнена от горе-описаните нуклеотидни замествания, делеции и прибавяния. Една такава молекула може или да е дезоксирибонуклеинова киселина или рибонуклеинова киселина. Такива нуклеинови киселини включват, например, антисенс РНК. Тези молекули могат освен това да бъдат свързани към последователности, които, когато транскрибират код за рибозим, по този начин продуцират рибозим, който характерно разцепва транкриптите на полинуклеотидите, съгласно изобретението.

Настоящето изобретение се отнася, освен това, до вектор, съдържащ молекула на нуклеинова киселина, съгласно изобретението. Примери за такива вектори са описани по-горе.

За предпочитане, молекулата на нуклеиновата киселина, присъстваща във вектора е операционно свързана към регулаторни елементи, които позволавят експресиране в прокариотни или еукариотни клетки гостоприемници; виж погоре.

Настоящето изобртение се отнася освен това, до метод за получаване на трансгенно животно, което не е човек, за предпочитане трансгенна мишка, включващ въвеждане на полинуклеотида или вектора от изобретението в микробна ф клетка, ембрионална клетка, стволова клетка или яйце или клетка, произлизаща от тях. Животното, което не е човек, може да се използува съгласно метода от изобретението, описан подолу, и може да е не-трансгенно здраво животно, или може да има нарушение, за предпочитане нарушение, причинено от най-малко една мутация в MDR-1 гена. Такива трансгенни животни са много подходящи за, например, фармакологични изследвания на лекарствени средства във връзка с вариантни форми на горе-описаните вариантни MDR-1 протеини, щом тези протеини или поне тяхните функционални домени се ф запазват между видовете при висшите еукариоти, поспециално бозайници. Продуцирането на трансгенни ембриони и тяхното скриниране може да се проведе, например, както е описано от A. L. Joyner Ed., Gene Targeting, A Practical Approach (1993), Oxford University Press. ДНК-а на ембрионите може да се анализира при използуване на Southern блот анализ с подходяща проба.

Изобретението се отнася, също така до трансгенни животни, които не са хора, като трансгенни мишки, плъхове, хамстери, кучета, маймуни, зайци, прасета, С. elegans и риби, като електрическата риба, които съдържат полинуклеотид или вектор от изобретението или получен по метод, описан погоре, за предпочитане когато посочения полинуклеотид или вектор са стабилно интегрирани в генома на посочените трансгенни животни, които не са хора, за предпочитане, така че присъствието на посочения полинуклеотид или вектор да доведе до експресиране на вариант на MDR-1 протеина от изобретението. Може да има едно или повача копия на същия или на различни полинуклеотиди на вариантен MDR-1 ген. Ф Това животно има многобройни приложения, включително като модел за изследвания на Много-Лекарствената-Резистентност и следователно, представят ново и стойностно животно в развитието на терапии, лечения и др., за болести, причинени от недотатъчност или несполука за задържане на лекарствените средства в клетката. В съответствие, бозайникът е за предпочитане лабораторно животно, като мишка или плъх.

За предпочитане, трансгенното животно, което не е човек, от изобретението, съдържа освен това, най-малко един ф инактивиран алел от див тип на MDR-1 гена. Този вариант позволява например, изучаването на взаимодействията на различни вариантни форми на MDR-1 протеини. Желателно е, също така, да се инактивира MDR-1 генната експресия или функция, при определен етап от развитието и/или живота на трансгенното животно. Това може да се постигне при използуване, например, на тъканно специфични, от развитието и/или клетъчно регулирани и/или индуцируеми промотори, които насочват експресията на, например, една антисенс или рибозим насочена срещу РНК транскрипта на MDR-1 гена;

също виж по-горе. Подходяща индуцируема система е, например, тетрациклин-регулираща генна експресия, както е описано, например, от Gossen and Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. 89 USA (1992), 5547-5551) and Gossen et al. (Trends Biotech. 12 (1994), 58-62). Подобно, експресията на вариантния MDR-1 ген може да се контролира от такива регулаторни елементи.

С варианта на MDR-1 протеините и протеините и векторите от изобретението, вече е възможно да се изследва in vivo ефикастноста на лекарствените средства във връзка с определени мутации в MDR-1 гена на пациент и на засегнатия фенотип. Освен това, вариантните MDR-1 протеини от изобретението могат да се използуват за определяне на фармакологичния профил на лекарствените средства и за идентифициране и получаване на други лекарствени средства, които могат да са по-ефективни за лечението на, например, рак, по-специално за подобряване на някои фенотипове, причинени от съответни мутации, като описаните по-горе.

Следователно, характерна цел на настоящето изобретение се отнася до селекция на лекарствено средство/ пролекарствено средство и лекарствени форми на фармацевтични състави за лечение на болести, които са отговорни за химиотерапия, като се взимат предвид полиморфизмите на вариантната форма на MDR-1 гена, които се разграничават от засегнатия фенотип на пациента, който предстои да бъде лекуван. Това позволява безопасното и икономично прилагане на лекарствените средства, които, например, се разглеждат в настоящето като неподходящи за лечение на, например, рак, дължащ се или на странични действия в някои пациенти и/или тяхния ненанежден фармакологичен профил, като се има предвид същия или различни фенотипове на заболяването. Средствата и методите, описани в настоящето могат да се използуват, например, за да се подобрят препоръките за дозиране и да се позволи на предписващия да предвиди необходимото нагласяване на дозата спрямо разглежданата група от пациенти.

При един друг вариант за изпълнение на настоящето изобретение се представя метод за идентифициране и Ф получаване на MDR-1 инхибитор, способен да модулира активноста на молекулярния вариант на MDR-1 гена или на неговите генни продукти, който включва етапите на:

(a) привеждане в контакт на вариант на MDR-1 протеин или на клетка, експресираща молекулярен вариант на MDR-1 гена, включващ полинуклеотида от изобретението в присъствие на компоненти, способни да доставят сигнал, който може да се установи, в отговор на транспорта на лекарственото средство, със съединение, което трябва да се скринира при условия, които да ф позволяват MDR-1 медииран транспорт на лекарственото средство, и (b) откриване присъствието или липсата на сигнал или засилване на сигнала, генериран от транспорта на лекарственото средство, при което присъствието или засилването на сигнала е показател за предполагаем инхибитор.

Терминът “съединение” в метода от изобретението включва единично вещество или множество вещества, които могат да са или да не са идентични.

Посоченото съединение(я) може да е химически синтезирано или да е получено чрез микробно ферментиране, но също така може да се включи в, например, проби, например, клетъчни екстракти от, например, растения, животни или микроорганизми. Освен това, посоченото съединение(я) може да е известно от състоянието на техниката, но досега не е известно използуването му(им) като инхибитор, съответно. Множеството съединения може да е, например, прибавено към културалната среда или да се инжектира в животинска клетка, 9 която не е от човек.

Ако проба, съдържаща (а) съединение(я) се идентифицира при метода от изобретението, тогава е възможно или да се изолира съединението от изходната проба, идентифицирана като съдържаща въпросното съединение или може след това да се раздели първоначалната проба, например, ако е целесъобразно, на множество различни съединения, така че да се намали броя на различните вещества на проба, и се повтаря метода с подразделенията на изходната проба. След това може да се ф определи дали посочената проба или съединение проявява желаните качества, например, чрез методи, описани в настоящето или в литературата (Spector et al., Cells manual; виж по-горе). Според сложноста на пробите, етапите, описани по-горе могат да се проведат няколко пъти, за предпочитане докато пробата, идентифицирана, съгласно метода на изобретението, не съдържа вече единствено ограничен брой съединения или едно съединение. За предпочитане посочената проба съдържа съединения с подобни химически и/или физически свойства, и по-п ред почитано посочените съединения са идентични. Методите от настоящето изобретение лесно могат да се осъществят и да се проектират от специалист в областа, например, съгласно други изследвания, основаващи се на клетки, описани в предшестващото състояние на техниката или при използуване и модифициране на методите, както са описани в настоящето. Освен това, специалистът в областа лесно ще разпознае кои съединения и/или ензими могат да се използуват по нататък, с цел да се проведат методите на изобретението, например 9 ензими, ако необходимо, които превръщат някое съединение в неговия предшественик, който на свой ред представлява субстрат за MDR-1 протеина. Едно такова адаптиране на метода на изобретението се вписва добре в уменията на специалиста в областа и може да се проведе без ненужно експериментиране.

Съединения, които могат да се използуват съгласно настоящето изобретение, включват пептиди, протеини, нуклеинови киселини, антитела, малки органични съединения, лиганди, пептидомиметици, PNAs и други подобни. Посочените ф съединения могат, също така да са функционални производни на известни лекарствени средства, като верапамил и циклоспорин. Методи за получаване на химични производни и аналози са добре известни на специеалистите в областа и са описани в, например, Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A, and Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Освен това, посочените производни и аналози могат да се тестват, съгласно методи, известни от състоянието на техниката или както е описано. Също така могат да се използуват пептидомиметиците и/или проектираните с помоща на компютър подходящи производни на лекарствени средства и аналози, например, съгласно методите, описани по-долу. Подобни аналози включват молекули, притежаващи като основна структура на известни MDR-субстрати и/или инхибитори и/или модулатори; виж по-долу.

Подходящи компютърни програми могат да се използуват за идентифициране на взаимодействащи сайтове на предполагаем инхибитор и MDR-1 протеина на изобретението, чрез компютърно подпомогнато търсене за комплементарни мотиви (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120). Други подходящи компютърни системи за проектираните с помоща на компютър на протеини и пептиди са описани в предшестващото състояние на техниката, например, в Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. Ν. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 59875991. Резултатите, получени от горе-описания компютърен анализ могат да се използуват в комбинация с метод от изобретението за, например оптимизиране на известни инхибитори. Подходящи пептидомиметици и други инхибитори също могат да се идентифицират чрез синтез на пептидомиметични комбинирани библиотеки до последователни химични модификации и тестване на получените съединения, например, съгласно методите, описани в настоящето. Методи за генериране и използуване на пептидомиметични комбинирани библиотеки са описани в предшустващото състояние на техниката, например Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 and Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715. Освен това, триизмерната и/или кристалографска структура на инхибиторите и на MDR-1 протеина от изобретението може да се използуват за проектиране на лекарствени средства пептидомиметици (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).

В обобщение, настоящето изобретение предоставя методи за идентифициране и получаване на съединения, които могат да се използуват в специфични дози за лечение на специфични форми на заболявания, например, рак,

Ф химиотерапията на който се усложнява от лоша работа на

MDR-1 гена, което често довежда до устойчовост към лекарственото средство или чувствителен фенотип.

При един предпочитан вариант на метода от изобретението, посочената клетка е клетка на или, получена чрез метода на изобретението или е включена в гореописаните трансгенни животни, не хора.

При един друг вариант за изпълнение, настоящето изобретение се отнася до метод за идентифициране и получаване на MDR-1 инхибитор, способен да модулира ф активноста на молекулярния вариант на MDR-1 гена или на негов генен продукт, включващ етапите на :

(a) привеждане в контакт на вариант на MDR-1 протеин от настоящето изобретение с една първа молекула, известна с това, че се открива от MDR-1 протеина, за да образуват един първи комплекс на посочения протеин и посочената първа молекула;

(b) привеждане в контакт на посочения първи комплекс със съединение, което подлежи на скриниране; и (с) измерване дали посоченото съединение измества посочената първа молекула от посочения първи комплекс.

В посочения метод, с предимство, посоченият етап на измерване включва измерване на образуването на втори комплекс на посочения протеин и посочения кондидат инхибитор. За предпочитане, посоченият етап на измерване включва измерване на количеството на посочената първа молекула, която не е свързана към посочения протеин.

По-специално, предпочитан вариант на горе-описания метод на посочената първа молекула е Verapamil, Valspodar, Cyclosporin А или Dexniguldipine. Освен това, е предпочитан, поради това, че в метода на изобретението, посочената първа молекула се бележи, например с радиоактивен или флуоресцентен маркер.

При един друг вариант за изпълнение, настоящето изобретение се отнася до метод за диагностициране на нарушение, свързано с наличието на молекулярен вариант на MDR-1 гена или чувствителност към такова нарушение, включващ:

(а) определя се присъствието на полинукпеотид от изобретението в проба от субект; и/или (Ь| определя се присъствието на вариант на MDR-1 протеин, например, с антитялото от изобретението.

В съответствие с този вариант за изпълнение на настоящето изобретение, методът за тестване на статуса на нарушението или чувствителноста към такова нарушение може да се изпълни при използуване на полинуклеотид или на молекула на нуклеинова киселина от изобретението, например, под формата на Southern или Northern блотинг или in situ анализ. Посочената последователност на нуклеинова киселина може да хибридизира към кодираща област на който и да е от гените или към некодираща област, например, интрон. В този случай, когато се използува комплементарна последователност в метода на изобретението, посочената молекула на нуклеинова киселина може отново да се използува при Northern блотинг. Допълнително, посоченото тестване може да се проведе при конюгиране с действително блокиращо средство, например, на транскрипцията на гена, ф като по този начин се очаква да е терапевтично релевантен.

Освен това, може да се използува също така праймер или олигонуклеотид за хибридизиране към един от горе-посочените MDR-1 гени или съответните РНК-и. Нуклеиновите киселини, използувани за хибридизиране могат, разбира се, да бъдат конвенционално белязани чрез въвеждане или прикрепяне на, например, радиоактивен или друг маркер. Такива маркери са добре известни от състоянието на техниката. Белязането на посочените молекули на нуклеинови киселини може да се осъществи по конвенционални методи. Допълнително, ф присъствието или експресията на молекулярния варианти на

MDR-1 гени може да се проследи чрез използуване на праймерна двойка, която специфично хибридизира към всеки от съответните последователности на нуклеинови киселини и чрез провеждане на PCR реакцията, съгласно стандартните процедури. Специфично хибридизиране на горе-споменатите проби или праймери, за предпочитане се получава при строги условия на хибридизиране. Терминът “строги условия на хибридизиране е добре известен от състоянието на техниката;

виж например, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual second ed., CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989; Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach, Hames and Higgins eds., IRL Press, Oxford, 1985. Освен това, получени от субект иРНК, сРНК, сДНК или геномна ДНК, могат да се секвенират за да се идентифицират мутациите, които могат да са характерни отпечатаци за мутации на MDR-1 гена. Настоящето изобретение се отнася, освен това, да методи, при които могат да се генерират такива отпечатъци чрез RFLPs на ДНК или РНК, получени от субект, по желание ДНК или РНК могат да се амплифицират преди анализирането, чиито методи са добре известни от състоянието на техниката. РНК отпечатъкът може да се осъществи чрез, например, смилане на РНК проба, получена от субект с подходящ РНК-ензим, например РНаза Ъ, РНаза Т₂ или други подобни или рибозим, например, електрофоретично разделяне и определяне на РНК фрагментите, както е описано по-горе.

Други модификации на горе-посочения вариант за изпълнение на изобретението лесно могат да се създадат от специалистите в областа, без каквото и да е ненужно експериментиране на настоящето описание; виж например, примерите за изпълнение. Друг вариант за изпълнение на настоящето изобретение се отнася до метод, при който посоченото определяне се провежда при използуване на антитяло от изобретението или негов фрагмент. Използуваното антитяло от метода на изобретението може да се бележи с “отпуснати краища” (tags), които могат да се определят, като хистидинови “отпускания” (flags) или молекула биотин.

При един предпочитан вариант за изпълнение на настоящето изобретение, горе-описаните методи включват PCR, лигазна верижна реакция, рестрикционно смилане, директно секвениране, техники на амплифициране на нуклеинови киселини, техники на хибридизиране или имуноизследвания (Sambrook et al., loc. cit. CSH cloning, Harlow and Lane loc. cit. CSH antibodies).

При един предпочитан вариант за изпълнение на метода от настоящето изобретение посоченото нарушение е рак.

При един друг вариант за изпълнение на горе-описания метод, един друг етап, включващ прилагане върху субекта на лекарствено средство за премахване или облекчаване на посочените вариации в MDR-1 гена, съгласно всички прилагания на метода от изобретението, позволява лечение на определено заболяване преди появата на клиничните симптоми, дължащи се на фенотипния отговор, причинен от MDR-1 гена.

При един предпочитан вариант за изпълнение на метода от изобретението, посочените лекарствени средства са хемотерапевтични средства като adriamycin, doxorubicin, paclitaxol (taxol) and other MDR-substrates, Ambudkar SV. et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 39 (1999), 361-398.

При друг предпочитан вариант за изпълнение на гореописаните методи, посоченият метод включва освен това, въвеждане на:

(i) функционален и експресируем MDR-1 ген от див тип или (ii) молекула на нуклеинова киселина или вектор от изобретението в клетки.

В тази връзка, и както се използува в настоящето описание, “функционален” MDR-1 ген означава ген, където кодираният от него протеин има част от или цялата структурна конформация на MDR-1 протеина от див дип, т.е., който притежава биологичното свойство да медиира транспорта на лекарственото средство през мембраната. Варианта за изпълнение на настоящето изобретение е съобразен за лечение на рак, възпалителни заболявания, неврологични, заболявания на ЦНС или сърдечносъдови заболявания, поспециално при хора. Определянето на експресията на вариант на MDR-1 гена би позволило да се направи извода, че посочената експресия е взаимнообвързана с генерирането или поддържането на съответния фенотип на заболяването. В съответствие, трябва да се предприеме етап за намаляване нивото на експресиране до ниски нива или да се премахне това. Това може да се постигне, например, с поне частично елиминиране на експресията на мутантния ген чрез биологични средства, например, при използуване на рибозоми, молекули на антисенс нуклеинови киселини, вътреклетъчни антитела или горе-описаните инхибитори срещу вариантните форми на тези MDR-1 протеини. Освен това, могат да се развиват фармацевтичнти продукти, които да намаляват нивата на експресиране на съответния мутантен протеин и гени.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до метод за получаване на фармачевтичен състав, който метод включва етапите на който и да е от гореописаните методи, и за синтезиране и/или привеждане в лекарствен вид на съединението, идентифицирано в етап (Ь) или на негово производно или на негов хомолог, във фармацевтично приемлива форма. Използуваните за лечение съединения, идентифицирани съгласно методите на изобретението, могат да се приведат в лекарствена форма и да се прилагат на пациенти, както е разяснено по-горе. За използуване и терапевтични дози, определени, като подходящи от специалистите в областа, виж по-долу.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до метод за получаване на фармачевтичен състав, включващ етапите на горе-описаните методи; и привеждане във фармацевтична форма на лекарственото средство или пролекарственото средство под форма, подходяща за терапевтично прилагане и предпазване или подобряване на нарушения на субект, диагностициран по метода на изобретението.

Лекарствени средства или про-лекарствени средства, след тяхното прилагане in vivo се имобилизират, с цел да се елиминират, било то чрез екскретиране или чрез метаболизма, на един или повече активни или неактивни метаболита (Меуег, J. Pharmacokinet. Biopharm. 24 (1996), 449-459). Следователно, вместо да се използува същинското съединение или инхибитор, идентифициран и получен съгласно методите на настоящето изобретение, може да се използува съответната лекарствена форма като про-лекарствено средство, която в пациента се превръща в нейната активна форма. Предварителни измервания, които могат да се направят за прилагането на про-лекарствените средства и лекарствените средства са описани в литературата; виж прегледа, Ozama, J. Toxicol. Sci. 21 (1996), 323-329).

При един предпочитан вариант за изпълнение на метода от настоящето изобретение, посоченото лекарствено средство или про-лекарствено средство е производно на лекарствено средство, както е дефинирано по-горе в настоящето.

При един друг вариант за изпълнение, изобретението се отнася до инхибитор, идентифициран или получен по гореописания метод. За предпочитане, инхибиторът се свързва специфично към вариантен MDR-1 протеин от изобретението. Антителата, молекулите нуклеинови киселини и инхибиторите на настящето изобретение, за предпочитане имат специфичност най-малкото идентична на специфичноста на свързване на естествен лиганд или партньор за свързване на MDR-1 протеина от изобретението. Едно антитяло или инхибитор могат да притежават афинитет на свързване към MDR-1 протеина от изобретенито от поне 10⁵ М’¹, за предпочитане над 10⁷ М'¹ и с предимство над Ю¹⁰ М’¹ в случай, че MDR-1 активноста трябва да бъде подтисната. Следователно при един вариант за изпълнение на изобретението, подтискащо антитяло или инхибитор от изобретението притежава афинитет от най-малко приблизително 10'⁷ М, за предпочитане поне приблизително 10’⁹ М и най-предпочитано поне приблизително 10’¹¹ М.

Освен това, настоящето изобретение се отнася до използуването на олиго- или полинуклеотид за откриване на полинуклеотид от изобретението и/или за генотипизиране на съответните индивидуални MDR-1 алели. За предпочитане, посоченият олиго- или полинуклеотид е полинуклеотид или молекула на нуклеинова киселина от изобретението, описана по-горе.

При един изключително предпочитан вариант за изпълнение, посоченият олигонуклеотид е съставен от приблизително 10 до 100, по-предпочитано 15 до 50 нуклеотида и съдържа нуклеотидната последователност от коя да е от SEQ ID NOS: 1 до 179 или див тип (wt)последователност или мутирана (тиГ)-последователност на промотора или на екзон от MDR-1 гена, представен в таблица 8 или комплементарна последователност на от тях.

Следователно, при един друг вариант за изпълнение, настоящето изобретение се отнася до праймер или проба, състояща се от един олигонуклеотид, както е дефиниран погоре. В този смисъл, терминът “състоящ се от” означава, че нуклеотидната последователност, описана по-горе и използуван за праймер или проба от изобретението не притежава никакви други нуклеотидни последователности от MDR-1 гена, непосредствено прилежащи на неговия 5’ и/или 3’ край. Въпреки това, други частици, като маркери, например, молекули биотин, хистидинови отпускания), фрагменти на антитела, колоидално злато и други, както и нуклеотидни последователности, които не съответстват на MDR-1 гена, могат да присъстват в праймера и пробите на настоящето изобретение. Освен това е възможно, също така да се използуват горе-описаните характерни нуклеотидни последователности и да се комбинират с други нуклеотидни последователности, произлизащи от MDR-1 гена, при което тези допълнителни нуклеотидни последователности са разпръстнати между частици, различни от нуклеинови киселини или където нуклеиновата киселина не съответства на нуклеотидните последовотелности на MDR-1 гена.

Освен това, настоящето изобретение се отнася до използуване на антитяло или на вещество, способно да се свързва специфично към генния продукт на MDR-1 гена, за откриване на вариантния MDR-1 протеин на изобретението, като експресията на молекулярния вариант MDR-1 гена включва полинуклеотид от изобретението и/или за различаване на MDR-1 алели, съдържащи полинуклеотид от изобретението.

Освен това, настоящето изобретение се отнася до състав, за предпочитане фармацевтичен състав, който включва антитялото, молекулата на нуклеиновата киселина, вектора или инхибитора от настоящето изобретение, и по желание, фармацевтично приемлив носител. Тези фармацевтични състави, включващи например, инхибитора или тяхни фармацевтично приемливи соли, могат да бъдат приложени подходящо по който и да е известен път, който се използува конвенционално за прилагане на лекарствени средства, например, орално, локално, парентерално или чрез инхалиране. Приемливите соли включват ацетат, метилестер, HCI, сулфат, хлорид и други подобни. Съединенията могат да се прилагат в подходящи дозирани форми, изготвени чрез комбиниране на лекарствените средства със стандартни фармацевтични носители, съгласно конвенционални процедури. Тези процедури изискват смесване, гранулиране и компресиране или разтваряне на съставните части, както е подходящо за желания препарат. Ще бъде оценено, че формата и характера на фармацевтично приемливия носител или разтворител се диктува от количеството н активната съставка, с която трябва да се комбинира, пътя за прилагане и други добри известни променливи. Носителя(ите) трябва да са “приемливи”, в смисъл да са съвместими с други съставни части на лекарствената форма и да не са вредни за неговия реципиент. Изиползуваният фармацевтичен носител може да е, например, както твърд, така и течен. Примери за твърди носители са лактоза, бяла глина, захароза, талк, желатин, агар-агар, пактин, акация, магнезиев стеарат, стеаринова киселина и други подобни. Примери за течни носители са физиологичен разтвор с фосфатен буфер, меласа (захарен ф сироп), масло, като фъстъчено масло и маслинено масло вода, емулсии, различни видове омокрящи средства, стерилни разтвори и други подобни. Подобно, носителят или разредителят, може да включва продукт за отлагане във времето, добре известен от състоянието на техниката, като само глицерил моно-стеарат или глицерил дистеарат, или с парафин.

Режимът на дозиране се определя от наблюдаващия лекар и други клинични фактор; за предпочитане, съгласно с който и да е от горе-описаните методи. Както е добре известно ф от състоянието на медицинската литература, дозирането за всеки пациент зависи от множество фактори, включително ръст на пациента, площ на телесната повърхност, възраст, специфичното съединение, което ще се прилага, пол, време и път за прилагане, общо здравословно състояние, и други лекарствени средства, които се прилагат в същото време. Прогресирането може да се наблюдава чрез периодично оценяване.

Освен това, използуването на фармацевтични състави, които съдържат антисенс-олигонуклеотиди, които специфично хибридизират към РНК, кодираща мутантни версии на MDR-1 гена, съгласно изобретението, или които съдържат антитела, специфично разпознаващи мутантен MDR-1 протеин, но не или не съществено, функционалната форма от див тип, се предвижда в случаите, когато концентрацията на мутантната форма в клетките трябва да се намали.

Благодарности за настоящето изобретение, към отделното селекциониране на лекарствени средства, дозиране и съответните пациенти, които трябва да се лекуват, може да се определи съгласно настоящето изобретение. Препоръките за дозирането трябва да са посочени при етикетирането на продукта, като се позволява на предписалия лекарственото средство лекар да предвиди уточняването на дозата, според разглежданата група пациенти, с информация, която избягва предписването на грешното лекарствено средство на грешните пациенти при грешна доза.

Освен това, настоящето изобретение се отнася до диагностичен състав или комплект, който съдържа който и да е от горе-описаните полинуклеотиди, вектори, клетки гостоприемници, варианетн MDR-1 протеини, антитела, инхибитори, молекули нуклеинови киселини или съответните вектори от изобретенето, и по желание, подходящи средства за откриване. Комплектът от изобретението, може да съдържа, освен това, съставки, като маркери за селекция или съставки за селективна среда, подходящи за генериране на трансгенни клетки и животни. Комплектът от изобретението може, с предимство, да се използува за провеждане на метод от изобретението и може, между другото, да се използува за голям брой приложения, например, в областа на диагностиката или като изследователю средство. Частите на комплекта от изобретението могат да се пакетиран по отделно в ампули или в комбинация в контейнерни или мултиконтейнъпни единици. Производството на комплектите обикновено следва стандартни процедури, които са идвестни на специалистите в областа. Комплектите или диагностичните процедури могат да се използуват като методи за откриване на експресия на мутантната форма на MDR-1 гена, съгласно който и да е от горе-описаните методи на изобретението, като се използуват, например, техники за имуноизследване, като радиоимуноизследване или ензимноимуноизследване или за предпочитане, хибридизиране на нуклеинова киселина и/или техники на амплифициране, като описаните по-горе и в примерите за изпълнение.

Някои генетични промяни водят до променено конформационно състояние на протеина. Например, някои варианти на MDR-1 протеини притежават терциерна структура, която ги прави далеч по способни да улесняват транспорта на лекарствени средства. Възстановяването на нормалната или регулиранат конформация на мутантните протеини е найелегантния и специфичен начин да се коригират тези молекулярни дефекти, въпреки че е трудно. При фармакологичните манипулации, следователно може да се цели възстановяването на конформацията на протеина на дивия тип. Така, полинуклеотидите и кодираните протеини от настоящето изобретение също могат да се използуват за проектиране и/или идентифициране на молекули, които са способни да активират действието на MDR-1 гена или протеина от див тип.

При един друг вариант за изпълнение, настоящето изобретение се отнася до използуване на лекарствено средство или про-лекарствено средство за приготвяне на фармацевтични състави за лечение на или предпазване от нарушение, диагностицирано по метода, описан в настоящето.

Освен това, настоящето изобретение се отнася до използуване на ефективна доза от нуклеиновата киселина, кодираща функционален и експресируем MDR-1 протеин от див тип за получаване на фармацевтичен състав за лечение, ф предпазване и/или забавяне на нарушение, диагностицирано по метода на изобретението. Ген, кодиращ функционален и експресируем MDR-1 протеин може да се въведе в клетка, която на свой ред продуцира протеина, представляващ интерес. Генна терапия, която се основава на въвеждането на терапевтични гени в клетки чрез ex-vivo или in-vivo техники е едно от най-важните приложения на генния трансфер. Подходящи вектори и методи за ex-vivo или in-vivo генна терапия са описани в литуратурата и са идвестни на специалистите в областа; виж например Giordano, Nature ф Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO94/29469; WO 97/00957 или Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640, и цитираните в настоящето литературни отпратки. Генът може да се проектира за директно въвеждане в клетка или за въвеждане чрез липозоми, или вирусни вектори (например, аденовирусен, ретровирусен). За предпочитане, посочената клетка е микробна клетъчна линия, ембрионална клетка, или яйчна клетка или произлезли от тях, попредпочитано, посочената клетка е стволова клетка.

Както става ясно от горното, предпочита се при използуването на изобретението, последователноста на нуклеиновата киселина да е операционно свързана към регулаторни елементи, за да се позволи експресиране и/или насочване на MDR-1 протеина към специфични клетки. Подходяща система за доставка на гени, която може да се използува с изобретението включва липозоми, рецептор9 медиирана система за доставка, ДНК с една скъсана верига, и вирусни вектори измежду които, като херпес вируси, ретровируси, аденовируси, и адено-асоциирани вируси. Доставката на нуклеинови киселини на специфично място в тялото за генната терапия може, също така, да се проведе при използуване на биолистична система за доставка, като тази, описана от Williams (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 27262729). Стандартни методи за трансфектиране на клетки с рекомбинантна ДНК са добре известни на специалистите в областа на молекулярната биология, виж непример, ф WO 94/29469; виж също по-горе. Генната терапия може да се проведе чрез директно прилагане на рекомбинантна ДНК молекула или вектор от изобретението върху пациент или да се трансфектират клетки с полинукпеотид или вектор от изобретението ex vivo и да се влеят трансфектираните клетки в пациента.

При един предпочитан вариант за провеждане на използуването и методите от изобретението, посоченото нарушение е рак или заболяване нервно, на ЦНС или сърдечно съдово.

Както е показано в примери 6 и 8 полиморфизмите, идентифицирани, съгласно настоящето изобретение, поспециално единичният нуклеотиден полиморфизъм (SNP) С3435Т в екзон 26 на MDR-1 гена са полезни като фармакогенетичен фактор, който прави възможно предвиждането на кръвните нива на MDR-1 субстрати и индуцери за подобряване на сигурноста на лекарственото средство и неговата ефикастност, т.е., да се предвидят и да се предотвратят страничните ефекти и лекарствените взаимодействия и да се увеличи съгласието на пациента. Такива субстрати и индуцери са, например, противоконвулсанти/противоепилептични лекарствени средства, като Phenytoin; сърдечни гликозиди, като Digoxin; имуносупресивни лекарствени средства като Cyclosporin А и FK506; макролидни антибиотици, като Clarithromycin и Erythromycin; и макролидни антибиотици като Rifampin. Така, настоящето изобретение се отнася, също така, до гореописаното използуване на SNPs като фармакогенетичен фактор, съгласно предхождащото. За предпочитане, полиморфизмът е MDR-1 екзона 26 (С3435Т) SNP било то самостоятелно или конюгиран с който и да е друг SNP, като описаните по-горе.

Други приложения на полиморфизмите, идентифицирани, съгласно настоящето изобретение и средства, които могат да се използуват, съгласно горе-описаните варианти за изпълнение могат да се открият в предшестващото състояние на техниката, например, както е описано в US-A-5,856,104, където описанито средства и методи на съдебната медицина, тест за бащинство, връзка на полиморфизмите с фенотипните белези, генетично картиране на фенотипните белези, и др., могат равностойно да се прилагат, съгласно настоящето изобретение.

Тези, както и други варианти за изпълнение са описани или са очевидни от и са включени в описанието на изобретението и примерите за изпълнение на настоящето изобретение. Друга литература, отнасяща се до който и да е от методите, използуването и съединенията, които се използуват, съгласно настоящето изобретение, могат да се намерят в обществени библиотеки, като се ползуват, например електронни средства. Например, може да се използува обществена база данни “Medline”, към която има достъп чрез Internet, например под адрес http://www.ncbi.nlm.nih.QOv/PubMed/medline.html. Други бази данни и адреси, като http://www.ncbi.nlm.nih.qov/, http://www.infobiogen.fr/.

http://www.fmi.ch/bioloQv/research tools.html, http://www.tiQr.orq/. са известни на специалистите в областа и също могат да се получат при използуване на например, http://www.Ivcos.com. Преглед на патентната информация в областа на биотехнологията и преглед на релевантни източници на патентна информация, полезни за ретроспективно търсене и за текуща осведоменост е посочена в Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

Фармацевтичните и диагностични състави, иизползуване, методи на изобретението могат да се използуват за диагностициране и лечение на всички видове заболявания, даже и такива, за които е неизвестно, че са свързани с или са зависими от вариантните MDR-1 гени. Съставите, методи и използуване на настоящето изобретение могат да са желани за използуване при хора, въпреки че лечението на животни също се обхваща от методите и използуването, описани в настоящето.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

ФИГУРА 1 Гел на избрани PCR фрагменти, преди и след пречистване. Агарозна (Appli Chem, Darmstadt) гел електрофореза (1,5% Агарозен гел) на MDR-1 PCR фрагменти ft преди (А) и след (В) етапите на пречистване. М: маркери за молекулно тегло, 1-28: PCR фрагменти, съдържащи последователностите на екзоните 1-28 на човешки MDR-1 ген, включително релевантните последователности, които ограждат тези екзони.

ФИГУРА 2 Примери за хомозиготни и хетерозиготни MDR-1 алели. Последователностите на PCR фрагментите, съдържащи последователностите на екзоните 1-28 на човешки MDR-1 ген, включващи релевантни последователности, които ограждат тези екзони се определят чрез автоматично ф секвениране, при използуване на ABI Dyeterminator техники. В профилите на ДНК последователноста могат да се открият хетерозиготни и хомозиготни отклонения от публикуваната последователност на MDR-1 гена.

ФИГУРА 3 примери за диагностициране на хомозиготни и хетерозиготни MDR-1 алели. Агарозна (AppliChem, Darmstadt) гел електрофореза (1,5% Агарозен гел) на апелите, специфични за PCR фрагментите на екзон 2 (261 Ьр) и екзон 5 (180 Ьр).

Изобретението ще бъде сега описано чрез припратки към следните биологични примери, които са предимно илюстративни и не трябва да се считат като ограничаващи обхвата на настоящето изобретение.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

ПРИМЕР 1

Изолиране на геномна ДНК от човешка кръв, генериране и пречистване на фрагменти на MDR-1 гена

Геномна ДНК се получава чрез стандартни техники на йонообменна хроматография (Quiagen kits за изолиране на геномна ДНК от кръв). Кръв от всички индивиди се тества (доброволци от отделението по Фармакология при Charitee Berlin) се получава при спазване на всички легални, етични и медицински бюрократични изисквания както на Charitee Clinicum in Berlin, Germany.

Специфични олигонуклеотидни праймери, 2 за всеки фрагмент се прилагат за да се получат, чрез полимеразна верижна реакция (PCR), дефинирани ДНК фрагменти, съържащи специфични участъци на човешкия MDR-1 ген. Тези специфични олигонуклеотидни праймери се проектират така, че да се свързват към последователностите в посока upstream и downstream от различните екзони на MDR-1 гена. Получените ДНК фрагменти трябва да кодират не само последователностите на екзоните, но също така, и някои последователности на интрони при екзон-инторн връзките. Такива последователности на инторни, близки до екзоните, са известни с това, че са важни за правилния процесинг и последващата експресия на иРНК, кодираща протеина, процесът известен като “сплайсинг”. Олигонуклеотидните праймерни двойки, които са оптимизирани за всеки от 28-те екзона на човешкия MDR-1 ген, синтетизирани и пречистени чрез афинитетна хроматография (ОРС решетка). Последователността ва всеки от праймерите е посочена в таблица 1.

Полимеразните верижни реакции се провеждат при условия, които се оптимизират за всеки от фрагментите, които покриват 28-те екзона на човешкия MDR-1 ген, така както и промоторната област на сърцевината и енхансерната област. PCRs се провеждат за всички екзони в реакционен обем от 25 μΙ. 50 ng ДНК матрица се прибавят към стандартен PCR буфер, съдържащ 1,5mM MgCI₂ (Quiagen, Hilden), 50μΜ dNTP's (Quiagen, Hilden), 25 pMol от всеки праймер (Metabion, Munich) и 0,625 U Taq полимераза (Quiagen, Hilden). Всички PCRs се провеждат на Perkin Elmer термоциклер (модел 9700) с първоначален етап на разграждане от 2 минути на 94°С и 36 цикъла на разграждане при 94°С за 45 секунди, като хибридизирането на праймера зависи от температурата на топене на праймера (PCR условия: А-Н) за 45 секунди, и 45 секунди на 72°С, последвано от крайно удължаване при 72°С в продължение на 5 минути. За единичните PCR условия А-Н се прилагат следните температури на хибридизиране: А: 53°С; В: 56°С; С: 55°С D: 57,5°С; Е: 58°С; F: 59°С; G: 54°С; Н: 60°С.

PCRs се прилагат за всички фрагменти (промотори и епхансери) в реакционен обем от 50 μΙ. 50 ng DNA матрица (изключения: 100 ng за промоторни фрагменти 1-3) се прибавят към стандартен PCR буфер, съдържащ 1,5 mM MgCI₂(Quiagen, Hilden), 200 μΜ dNTP's (Quiagen, Hilden), 30 pMol всеки праймер (Metabion, Munich; изключение: 20 pMol за енхансерен фрагмент 1) и 1 U Taq полимераза (Quiagen, Hilden). Всички PCRs се провеждат на Perkin Elmer термоциклер (модел 9700) с начален етап на разграждане от 3 минути при 94°С и различни цикли на амплифициране (30 за промоторен фрагмент 2 + 4 и енхансерен фрагмент 1; 31 за промоторен фрагмент 3; 32 за промоторен фрагмент 1 и енхансерен фрагмент 2) при разграждане на 94°С за 30 секунди, като хибридизирането на праймера зависи от температурата на топене на праймера (PCR условия: А и В) за 30 секунди, и 30 секунди на 72°С, последвано от крайно удължаване при 72°С в продължение на 2 минути. За единичните PCR условия А и В се прилагат А: 58°С; В: 56°С.

Оптимизирането на PCR-условия и постигнатия размер на желаните и на получените фрагменти са посочени на таблица 1. Примери за получените фрагменти на MDR-1 гена, които се използуват при следващи анализи на индивидуалния генотип са посочени на фигура 1.

Дефинираните ДНК фрагменти, съдържащи специфични участъци на човешкия MDR-1 ген, последователности на екзон, така както и последователности на някои интрони при мястото на свързване на интрон-екзон се заставят да отстранят не инкорпорираните нуклеотиди и буферни съставки, които иначе биха увредили с последващото определяне на индивидуалния MDR-1 генотип чрез директно ДНК секвениране. За това пречистване се използуват стандартни техники на йонообменна хроматография (Quiagen комплекти за пречистване на PCR фрагменти). За всички фрагменти се получава достатъчен добив от пречистените фрагменти, подходящи за директен анализ чрез ДНК секвениране. Примери за пречистени MDR-1 генни фрагменти, които се използуват за директен анализ на последователностите на индивидуалния MDR-1 генотип са показани на фигура 1.

ПРИМЕР 2

Идентифициране на различни MDR-1 генни алели чрез определяне на последователноста на различни индивиди За секвенционния анализ на релевантните области на © човешкия MDR-1 ген на много различни индивиди, PCR амплифицирането на релевантните области на MDR-1 гена се провежда (виж таблица 1) и пречистените PCR продукти се секвенират в последствие по установени методи (ABI dyeterminator cycle sequencing). Много важен параметър, който трябва да се вземе предвид, при използуване на приближение е това, всеки нормален индивид да носи две копия на MDR-1 гена. Поради тази диплоидност (от автозомните гени, и MDR-1 се кодира автозомно), трябва да се полага голямо внимание при определянето на последователностите, за де сме в ф състояние да идентифицираме недвусмислено не единствено вариациите на хомозиготните последователности, но също така и хетерозиготните вариации. Поради това никога не разчитаме единствено на една определена последователност, а винаги се получават най-малко две последователности от всеки идентифициран MDR-1 генен фрагмент от всеки индивид, чрез секвениране и на двете противоположни ДНК вепиги.

За първоначалното определяне на MDR-1 вариаците в човешката популация, секвенционният анализ на релевантните

области, включително на всички екзони, на човешкия MDR-1 ген се провеждат от геномна ДНК на 24 различни индивида. Броят на индивидуалните проби се разширява след това за избраните MDR-1 генни фрагменти, някои от които са били анализирани от 127 индивида. Последователностите се инспектират ръчно за проявата на ДНК последователности, които се отклоняват от публикуваните MDR-1 последователности, които се считат за последователности от “див тип” по време на цялата работа. Тъй като генетичните Ф популации правят невъзможно изчисляването на очакваната честота на хомозиготни спрямо хетерозиготни алели на идентифицирания ген (Hardy Weinberg формула, р е2 + 2pq + q е2 = 1), възможно е, също така, да се потвърди предвиденото (с тази формула) разпределение на хомозиготни спрямо хетерозиготни алели и отклоненията, с експерименталните открития. Това служи като вътрешен контрол и потвърждение, че откритото отклонение на последователноста всъщност представлява нов алел.

Открити са някои нови вариации на MDR-1 ф последователности и са експериментално потвърдени при използуване на този подход, което е показано на фигура 2. Появяват се 8 полиморфизма в последователности на интрони, отблизо ограничаващи екзоните 5, 6, 12 и 17 (SEQ ID NOs: 91, 154 и 160 за екзон 5), (SEQ ID NOs: 101 и 166 за екзон 6), (SEQ ID NO: 116 за екзон 12) и (SEQ ID NOs: 119 и 172 за екзон 17). 7 полиморфизма са открити в кодиращата област, 2 в екзоните 2 и 26, и по един в екзони 5, 11 и 12 и един в некодиращия екзон 1 (SEQ ID NOs: 79 и 85 (за екзон 2), 122 и 178 (за екзон 26), 97 (за екзон 5), 106 (за екзон 11), 112 (за екзон 12) и 73 (за екзон 1), съответно). 3 вариации водят до промяна на аминокиселинните последователности на MDR-1 протеина (SEQ ID NOs: 85 (за N21D), 97 (за F103S) и 106 (за S400N), съответно). Тяхните промени ще променят и MDR протеина. Една промяна, която не води до промяна на протеина е локализирана директно преди ATG кодона за стартиране на транслацията (SEQ ID NO: 79). Добре известно е, че тази позиция е много важна за нивата на експресия на протеините, контролиращи ефективноста на транслацията. Други полиморфизми не променят аминокиселинния състав на MDR-1, но те все пак са полезни средства за MDR-1 генотипизиране, тъй като всяка от тези вариации дефинира нов MDR-1 алел. Известно е, че експресията на MDR-1 много варира между различните индивиди, и едно много вероятно обяснение за този вариабилитет в нивата на експресия са алелните разлики в областа директно във и около MDR-1 гена. Така всички нови и дефинирани MDR-1 алели служат като маркери за определяне на MDR-1 генния статус при пациентите. Важноста от това MDR-1 генотипизиране за диагностицирането и лечението на заболяването е добре известно на експертите в областа, и също бе обяснено подробно по-горе в стъпителната глава.

Точната позиция и други детайли от новите MDR-1 алели, включително и правилната нова последователност и отклонението на последователноста, и разпределението на хомозиготните спрямо хетерозиготните алели в популацията са посочени в таблица 2. очакваната честота на хомозиготните от вариантите на алелите се изчислява на основата на HardyWeinberg разпределението. Отклонената основа в последователноста е удебелена и подчертана. Фигура 2 показва примери от откритието и вида на новите варианти в ДНК пробите от хомозиготните или хетерозиготните индивиди.

ПРИМЕР 3

Методи за специфично откриване и диагностициране на MDR-1 алели

Методи за откриване на различни MDR-1 алели, които са били идентифицирани, използуват принципът, че ® специфичните разлики на последователностите могат да се транслират в реагенти за алелно диференцииране. Тези реагенти предоставят необходимия скелет за развитието на диагностични тестове. Примери за такива реагенти включват, но без да се огранимават от, олигонуклеотидите, които се отклоняват от MDR-1 последователноста от див тип в новоидентифицираното заместване на бази. Често, принципите на диагностичните тестове за определяне на статуса на индивидуалния MDR-1 ген включва, но без да се ограничава до, разлики в ефикастноста на хибридизиране на такива • реагенти към различните MDR-1 алели. Допълнително, могат да се приложат разликите в ефикастноста на тези реагенти в, или като различни субстрати за, ензимни реакции, например, лигазни или полимеразни или рестриктазни ензими. Принципите на тези тестове са добре известни на специалистите в областа. Примери са PCR- и LCR техники. Chip-хибридизиране или MALDI-TOF анализи. Такива техники са описани в предшестващото състояние на техниката, например PCR техника: Newton, (1994) PCR, BIOS Scientific Publishers, Oxford; LCR-technique: Shimer, Ligase chain reaction.

Methods Mol. Biol. 46 (1995), 269-278; Chip hybridization: Ramsay, DNA chips: State-of-the art. Natrue Biotechnology 16 (1998), 40-44; и MALDI-TOF analysis: Ross, High level multiplex genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry, Nature Biotechnology 16 (1998), 1347-1351. Други принципи при тестуването се основават на прилагането на реагенти, които специфично разпознават MDR-1 варианта като транслиран експресиран протеин. Примери са алел-специфичните антитела, пептиди, субстратни аналози, инхибитори, или други вещества, които се свързват към (и в някои случаи могат, също така да модифицират действието на) различните форми на MDR-1 протеина, които се кодират от новите алели. Тукпредставените примери, за демонстриране на принципите на диагностичните тестове с реагенти, произлезли от новите нуклеотидни замествания, дефинирани в настоящето изобретение, се основават на PCR методи. Очевидно е, че чрез прилагането на описаните специфични реагенти, всеки друг метод също би действал в посока за диференцииране на MDR-1 алели.

ПРИМЕР 4

Диагностициране на MDR-1 алели чрез специфичен PCR Алел-специфичен PCR представлява техника, добре известна на специалистите в областа, която позволява диференциирането на алели от гени чрез прилагане на полимеразна верижна реакция с реагенти (комбинации от праймери), които са специфично проектирани за откриване на единични алелни последователности. Главната компонента на такива тестове, и единствения реагент, който предоставя специфичност на тези тестове, са олигонуклеотиди, които са проектиране да съдържат последователности, които специфично разпознават различни алели на гени.

В този пример, специфични олигонуклеотиди се проектират така, че да могат да разпознават различни MDR-1 алели, поради тяхната диференциирана ефикастност на хибридизиране с различни алели, поради тяхната варираща способност да служат като субстрати за ензимни реакции (като ензимът в този случай е термостабилна полимераза). Реагентите, които са специфично проектирани и са способни да откриват присъствието и/или отсъствието на новодефинираните mdr-1 алели в индивиди хора, са посочени като специфични комбинации от праймери за всеки нов алел в таблица 3. Проектирането на тези реагенти, се основава на човешките ново-открити нуклеотидни последователности и замествания на бази в човешкия MDR-1 ген, който, както е представено в пример 2 и са посочени в таблица 2 и фигура 2, с едно допълнение към проектирането на специфичните реагенти, диагностичните тестове, които се базират на принципа на полимеразната верижна реакция се нуждаят от оптимизиране на условията за тестовете, т.е., оптимизиране на PCR условията. Резултатите от тестовете в този случай, дадени като присъствие или отсъствие на специфични ДНК фрагменти, получени при използуване на ДНК от индивиди хора, като съставки за тестване (матрица). Изготвянето на геномната ДНК от кръв на индивиди е описано в пример 1.

PC Rs се провеждат за всички фрагменти в реакционен обем от PCRs 20μΙ. 50ng DNA матрица се прибавя към стандартен PCR буфер (Qiagen, Hilden), съдържащ 1,5 mM

MgCI₂₎ 250μΜ dNTP's (Qiagen, Hilden), 1 x Q-разтвор (Qiagen, Hilden), 20 pMol всеки праймер (Metabion, Munich; специфичен wt праймер + обикновен праймер и специфичен ням праймер + обикновен праймер) и 1 U Taq полимераза (Qiagen, Hilden). Всички PCRs се провеждат на Perkin Elmer термоциклер (модел 9700) с етап на първоналано разграждане от 3 минути при 95°С и 30 амплифиционни цикъла на разграждане при 94°С за 30 секунди, като хибридизирането на праймера зависи от темепературата на топене на праймера (PCR условия: А-Е) ® за 30 секунди, и 30 секунди при 72°С, следвано от екстензия при 72°С в продължение на 8 минути. За условията на единичната PCR А-Е, се прилагат следните температури на хибридизиране: А: 54°С; В: 58°С; С: 50°С; D: 61 °C; Е: 53°С.

Примери за такива грешки при четенето, като резултати от определянето на диагностицирането на MDR-1 алела са показани на фигура 3. Става очевидно от тези примери (таблица 1, фигура 3), че тези тестове са подходящи за диференцииране присъствието на анализираните MDR-1 алели при хора. Може да се определят хомозиготните, както и ф хетерозиготните, често срещаните, както и по-рядко срещаните на MDR-1 гена. Специфичността на тези тестове се основава единствено, и зависи изцяло от специфичните олигонуклеотидни реагенти, които се прилагат. Проектирането на тези реагенти, на свой ред, зависи от информацията на последователностите на откритите MDR-1 варианти и нови алели, които са представени в пример 2 и таблица 2.

ПРИМЕР 5

Диагностициране и взаимовръзка на различните MDR-1 полиморфизми с нивата на експресия и in vivo активноста на MDR-1 в пациентите

За да могат да се идентифицират потенциално директните взаимовръзки на MDR-1 полиморфизмите с клинично релевантните фенотипове при хора, пробанд (първи изследван от група родственици с наследствено заболяване) от изследване в Dr. Margarete Fischer-Bosch-lnstitut за Клинична Фармакология, Щутгард, се подлагат на определяне на MDR-1 полиморфизмите, както е описано в примери 2-4. Нивата на експресия на MDR-1 в дебелото черво и черния дроб на тези пациенти също се определя чрез установено имунохистохимично определяне на MDR-1 протеина. В пробанд популацията, се провеждат в допълнение към измерванията на нивата експресия на MDR-1 в дебелото черво, измервания на MDR-1 при индуциране на гена чрез рифампицин. Също така, се определя in vivo активноста на MDR-1 при условия на неиндуциране и индуциране с рифампицин чрез измерване на кървните концентрации на приложен орално дигоксин (1 mg), който е известен като MDR-1 субстрат и, чиято концентрация в кръвта също зависи от активноста на MDR-1 в дебелото черво.

Резултатите от измерването на MDR-1, експериментите с индуциране с рифампицин и експериментите с дигоксин, така както и резултатите от анализа за определянето на MDR-1 полиморфизма при пробанд популация, показват взаимомръзка между MDR-1 генната експресия и MDR-1 in vivo активноста на някои полиморфизми.

Нива на MDR-1 протеини:

Както е показано в таблица 4, Т/С полиморфизмът при позиция 176 в Acc.#M29445/J05168 в екзон 26 е взаимообвързана с нивата на експресия на MDR-1. Наличието на Т алел при тази позиция показва по-слаба експресия на MDR-1 експресионните нива, в сравнение с проби, които имат единствено съответния С алел. Средната стойност на рифампицин-индуцираните MDR-1 нива на С-алелна популация е по-висока от тази на Т-популация (924 спрямо 587 относителни единици). В пълно съгласие с това, пробанд хомозиготност за Т-алела има по-ниска откриваемост на неиндуциран и индуциран MDR-1 ниво, докато пробанд хомозиготност за С алела проявява най-високите нива за тествани пробанд. Разликите на индуцирани нива на MDR-1 експресия между индивиди е 9 пъти.

Активност на MDR-1 in vivo

Таблица 5 показва резултатите от измерванията на in vivo активноста на MDR-1 при неиндуцирани и индуцирани с рифампицин условия. Това се извършва чрез измерване на концентрациите в кръвта на орално приложен дигоксин, който е известен субстрат на MDR-1 гена, и чиято концентрация в кръвта също зависи от активноста на MDR-1 в дебелото черво. В съответствие с наблюдението, че полиморфизми при позиция 176 в Acc.#M29445/J05168 на екзон 26 Т/С са взаимообвързани с нивата на експресия на MDR-1, взаимовръзката на този полиморфизъм се наблюдава при кръвните нива на дигоксин, които на свой ред отразяват активноста на MDR-1 протеина in vivo. Пробанд индивид, който е носител на Т алел (в взаимовръзка с по-слабата експресия на MDR-1, виж таблица 4), съдържа по-високи нива в кръвта на дигоксин, в сравнение с проби, които имат единствено съответния хомозиготен С-алел. Причината за това е, че приемът на MDR-1 субстрати, като дигоксин от дебелото черво в кръвта, се явява да е по-ефективен при хора с по-ниска MDR1 експресия. Това е в пълно съответствие с функцията на MDR-1 в дебелото черво, т.е., ре-транспорт и елиминиране на субстрати от приема на клетки в лумена на дебелото черво. Ф Начинът с неиндуцираните, както и на индуцираните с дигоксин концентрации в кръвта (в съотвтствие с противоположната MDR-1 активност) на С-алел популация са в съответствие пониски от тези на Т-популация (63 спрямо 44,9 и 45 спрямо 28,6 Dig AUC индуцирани). В пълно съгласие с това, пробанд с хомозиготен Т алел има най-висока концентрация на откриване на дигоксин в кръвта след индуциране с рифампицин (57,3 Dig.AUG) и пробанд хомозиготен за С-алел проявява найниското ниво от всички пробанд (12,3 Dig.AUC). Разликата от нивата на дигоксин в кръвта и тези индивиди са повече от 4 А пъти.

MDR-1 в популация на пациенти:

Резултатите от нашия анализ на съответствие на нивата на експресия на MDR-1, активноста на MDR-1 протеина и анализа за откриване на MDR-1 полиморфизма след това се подлага на засилващо действие от анализа на MDR-1 експресията и MDR-1 генотипизирането на различни пациенти на Dr. Margarete Fischer-Bosch-lnstitut for Clinical Pharmacology in Stuttgart. Провежда се имунохистология върху различни тъканни проби на пациенти, по-специално от дебело черво и черен дроб, и се сравняват една с друга, за да се позволи относителното сравнение на MDR-1 протеина между тези проби. Във всеки един сет от експерименти, пробите от пациента са категоризират, съгласно тяхния интензитет на оцветяване на MDR-1, т.е., Г^ви степен се равнява на найвисокия интензитет на MDR-1, а последна степен на найниския интензитет на MDR-1.

Съответствието при този анализ на категоризиране с MDR-1 генотипа показва, че Т алелът от полиморфизма в позиция 176 в Acc.#M29445/J05168 в екзон 26 съответства на по-ниска експресия на MDR-1 гена, при сравнение с пациенти, които са носители на carry хомозиготен С алел в тази позиция. При този анализ, други два полиморфизма показват известна взаимовръзка с MDR-1 експресията: А хомозиготен Т генотип в позиция 171466 в АС002457 (интрон 4) може да съотвества на висока експресия, а полиморфизъм (GA) в позиция 101 в екзон 11 (M29432/J05168) може да съответства на ниска експресия.

ПРИМЕР 6

Валидизиране на генотип/фенотип съответствието на екзон 26 (С3435Т) полиморфизъм с разширен брой проби За допълнително валидизиране (потвърждение) на единичния нуклеотиден полиморфизъм (SNP) Т/С при позиция 176 в ACC.# M29445/J05168, описан в предходните примери, като сега се посочва също като MDR-1 екзон 26 SNP С3435Т, (позицията съответства на MDR-1 cDNA GenBank регистров по. AF016535, Кодон ТТС екзон 10, F335, липсва в тази последователност), с първата база при ATG стартовия кодон посочен като 1) с нивата на интестинална MDR-1 експресия (първия резултат, показан в пример 5), анализират се допълнителни доброволци за друго експериментално изследване при Dr. Margarete Fischer-Bosch-lnstitute for Clinical Pharmacology in Stuttgart. Нивата на MDR-1 в червата на тези доброволци и пациенти се определя чрез количествена имунохистохимия и Western блотинг на биопсии и ентероцитни препарати на дуоденум. Същевремено се анализира един допълнителен маркерен протеин, вилин, който се експресира в ентероцитите, за да се подосигури, че този анализ отразява специфичната PGP експресия в чревни ентероцити. Резултатите от този анализ са показани на фигура 4. ТЯ генотипът се асоциира със значително по-ниски нива на експресия, в сравнение с С/С генотипа. Индивиди с СЯ генотип показват един междинен генотип.

За допълнително валидизиране на взаимовръзката на MDR-1 генотипа с чревния прием на дигоксин, допълнителни доброволци от друго клинично изследване при University Medical Center, Charite in Berlin, които показват кръвни нива на дигоксин след орално прилагане (без индуциране с рифампицин и определяне на PGP протеина, Johne et al. (1999), Clin. Pharmacol. Thr. 66, 338-345) се определят за тяхния MDR-1 генотип в екзон 26. В настоящето изследване, максималната плазмена концентрация (С_тах) се определя по време на стабилни състояния на изследване на дигоксин. Този фармакокинетичен параметър по-специално отразява разликите в абсорбирането на дигоксин между различните групи. Фигура 5 показва сравнение на дигоксин С_тах на 7 доброволци, които са хомозиготни носители на ТЯ алел и 7 доброволци, с хомозиготния С/С генотип в екзон 26. Доброволците, които са хомозиготни за Т-алела, показават значително по-високи нива на дигоксин в сравнение с доброволците, с С/С генотип. Средната разлика от 38% в С_тахна дигоксин между групите, е статистически значима (р=0.006, Mann Whitney U 2 тест на проба) и отразява влиянието на този полиморфизъм върху фармакокинетиката на дигоксин.

ФИГУРА 4

Ф Взаимовръзка на екзон 26 SNP с MDR-1 експресията при неиндуцирани условия. MDR-фенотипът (експресия и активност) на 21 доброволци и пациенти се определя чрез Western блотинг анализ. Графиката показва разпределението на MDR-1 експресионния клъстер, съгласно MDR-1 генотипа при релевантния екзон 26 SNP. Генотип-фенотип взаимовръзката има значимост от р=0.056 (N=21).

*

сс ст тт

ФИГУРА 5 Взаимовръзка между MDR-1 генотип и in vivo прием на дигоксин. MDR-1 генотипът в екзон 26 се анализира при 14 здрави доброволци, които участват в клинично изследване, които показват кръвни нива на дигоксин по време на състояние на покой (Johne et al. (1999), Clin. Pharmacol. Thr. 66, 338-345). Статистически значима разлика (p=0.006; Mann Whitney U 2 тест на проби) се открива при сравняване на максималните концентрации (С_тах) на дигоксин между две групи от по 7 здави доброволци, носители или на Т/Т или на С/С генотип. Средната разлика от 38% в С_тах може да отразява значението на генотипа върху абсорбцията на дигоксин след орално прилагане. Доза от 0.25 mg се прилага при upon steadystate на дигоксин.

ПРИМЕР 7

Идентифициране на нови MDR-1 полиморфизъми чрез анализ на последователностите на голям брой различни индивиди

Едно разширено проучване за SNPs в човешкия MDR-1 ген разкрива, в допълнение към различните нови MDR-1 полиморфизъми, многобройни други нови полиморфизъми в MDR-1 гена, които са изброени в таблица 8. При новото скриниране, броят на индивидуалните проби се простира за Ф всички MDR-1 екзони, така както и за фрагмените на MDR-1 промотори, някои от които са били анализирани от 236 индивида.

Възможно е, в допълнение към MDR-1 екзон 26 (С3435Т) SNP, който може да се използува за предвиждане на PGP експресия, други по-рядко срещани полиморфизми в области на MDR-1 гена да имат също така известен ефект върху експресията. Наприемр, промоторни полиморфизми и промяна на протеините на SNPs е много вероятно да имат допълнителен ефект върху MDRI1 експресията и активноста. ф Освен това, всички тези нови полиморфизми могат да се използуват за генериране на един точен индивидуален MDR-1 генотип - т.е., алелен състав - който може да е уникален за индивидите, като по този начин и много полезен за предвиждане на индивидуалния MDR-1 отговор зависим на лекарствени средства.

Колкото повече полиморфизми са известни от човешкия ген, толкова по-пълни, и следователно по-полезно ще е описанието на индивидуалния MDRI1 генотип. Идентифицирането на тези 32 нови MDRI1 полиморфизми е

ΊΟ другия важен етап към постигането на целта да се установят много различни MDR-1 генотипове, които предвиждат изхода и страничните ефекти от лечението с лекарствени средства.

ПРИМЕР 8

Определяне на MDR-1 екзон 26 (С3435Т) полиморфизъм като фармакокинетичен фактор, който повлиява нивата на лекарствените средства в комбинация с други фармакокинетични фактори • Противконвулсивното лекарствено средство Phenytoin обикновено се използува за лечение на епилепсия, остро и хронично подтискане на вентрикулярните аритмии и при интоксикация с дигиталис. Тясните терапевтични граници, с голям брой тежки странични ефекти в комбинация с нелинейна фармакокинетика (т.е., свръхпропорционално нарастване на плазмените нива в отговор на повишаването на дозата) прави лечението с Phenytoin провокиращо и подходящи параметри за предвиждане на плазмените нива от дадената доза, твърдо желателно, с цел да се подобри терапевтичния изход и да се ф предотвратят страничните ефекти.

Известно е, че полиморфните ензими 2С9 и 2С19 имат ефект върху метаболизма на Phenytoin (Mamiya et al. 1998, Epilepsia Dec;39(12):1317-23), и е показано, че 2C9 дефектите могат да доведат до абнормени кръвни нива, които могат да причинят странични ефекти или неефикастност на лекарственото средство (Aynacioglu et al. 1999, Br J Clin Pharmacol. Sep;48(3):409-15). Въпреки това, все пак става ясно, че 2С9 генотипът не позволява, от дадена доза, да се направят точните предвиждания на нивата на кръвта. Даже в 2С9 генотипизирани индивиди, компенсирани за съответния ензимен фенотип, кръвните нива варират значително.

Таблица 6 показва, че MDR-1 екзон 26 (С3435Т) SNP играе, в допълнение към 2С9, ясна роля при кръвните нива на Phenytoin, и MDR-1 генотипизиране за този SNP позволява поточна взаимовръзка между дозата на Phenytoin, генотипа и кръвните нива.

В генотипизираните групи с 2С9/19 ензим, вариациите на нивата могат да се обяснят чрез MDR-1 генотипа, поспециално в групите на 2С9/19 бедни метаболити, които вече показват повишени кръвни нива. Тук, MDR-1 генотипизирането е способно да идентифицира подгрупа от пациенти, които са с повишен риск да проявят изключително високи кръвни нива на Phenytoin: бедни метаболити, които имат MDR-1 Т/Т генотип. Тази пациенти са с повишен риск да срещнат свързани с предозиране противоположни реакции на лекарствените средства. Например, в група от 100 пациенти, които получават Phenytoin, пациент с 2С9 недостатъчност показава найвисоките концентрации в кръвта, което е с приблизително два пъти увеличение, в сравнение с “нормалната” популация. Взаимовръзката между Сур 2С9 генотипа и нивата на Phenytoin в плазмате е статистически значима, но значимостта нараства като се взима предвид MDR-1 Т/Т генотипа като ковариант (р< 0.001, ANCOVA).

ТАБЛИЦА 6 Зависимост на нивата на Phenytoin от фармакокинетичните компоненти

MDR-1 генотип	ССиСТ	ТТ
чревен PGP	високо/средно	ниско

Phenytoin blood levels:

2С9 метаболити	нормално	нормално
Метаболити със слаб и/или с недостиг на 2С9	високо	Много високо

Таблица 1

Име на PCR фрагмента Позиция на PCR праймера Последователност на праймера Условия на PCR Размер на фрагмента

л.з: за екзони 1-7 (Accession: ЛС002457)

CL	CL	a	a	CL	CL
Δ	Q		Δ	0	£
CM	N	in	CM	co	04
r*		' ©	CM	m
©	И	cn	5F	on	чя·

х t*:

a	a	a
0.	Λ		Q.
	β			β
o	r-	10	CM	©
СЧ	0*>	C	CM	04
n	<n	4*		04

СС · <

£

s

2

s

2

m

2

.

•

o

n

-

•

m

•

*

»

*

•

n

m

П

ri

m

cn

n

•

u

G'

o

u

ΓΊ

g

. С“

u

<

o

G

c_

c

ζη

u

f*

n

Λ·

cn

*c

.<

E-

u

C-

u

E-

<

c

u

c

u

o

e

d

G*

U

C

d

C-

<

<ь.

e-

<

o Q

t»

C3

η

Ο“ί

G <

u

0

G

e

o

<

g

<

C^-1

s-

<

e-

r 4

С“

f

u

2-

<

E-

5-

g

Γ

<

c

e

o

b.

<

G'

<

o

υ u

<

o

GJ

g G'

< g

< E-

<

< u

c-

p

< u

c.

o

p

< r ·

< f Я 4*

? е

< е

G CJ

fj c.

C

G’

o

<

O

G

<

g

<

o

<

<c

<

E-

2»

F-

G

<

d G .<

< 4» <

u E-

< <

.< c. <

< J-

< f ·

g' < G

d G <

<

d e G

< ϋ

< < <

> s* ч-

<

< <

G <

•Я

G Γ_· <

w < <

< < C*

<

* ·

* 1

<

e

b.

<

d

G*

2«

• e

d

.· ^R

< b.

ζ*

<

CJ

t—

<

r

u

—

=—

C-

<

G'

<

c

—

•

c-

* X 4*

e

u

L?

G

<

o

e.

<

r ·

£.

CJ

F-

<

·_

<

c

C· .<

G <

g‘ o

< G

* I

e_ C

G

< G'

d

o’

< o

C <

c

o

c u

< O

c ь.

» A r Я

c r·

.< <

=—

E-

<

c—

=-

r-

G

<

G

Γ

Q

Γ

i-

<

&·

u

d

e-'

d

U

<

O

g'

C*

<

•j'

G*

, *

r-

<

♦л

<

c

6-

s~

u

<

G

S—

<

o

c

G

<

G

<

(J

•

**

—

E-

G

g

e

G

c.

G

<

G

<

e-

E-

<

(·

{·>

S-

G

J-

Г 1

Г

G

<

w

,·Λ

<

f-

<

IT.			in al	U-. -n	•П	«П in
	♦ ♦	• i ··	·· ·	·· ··	· ·«	·· ··
	0	~ Ф	c a	— Щ	— o	~ -a	—
1h	Ώ	U o	·- in	M n	u cr«	w «	u
<0	u	«7 M	*δ M	ιΌ U	<Q	C V(	Q
3	ΐ)	3 a)	3 1>	3 ϋ	3 Φ	3 0	5
Ц	>	k >	4 >	%l >	u >	u >	M
0	a>	C И	0 «	o Ш	Ο Φ	ο a>	o
u		ω a	G X	b. X	Cu S£	Cu cs	Cu

o

CM

04

F-!

cz

c*

Q

Г*

-*

o cn

04

ГП

04

40

•n.

c

₽-

c

04

n

C5 «

чу

С»

«П

c

C*

r*

o

Г)

m

10

Q

m

10

c

rr

un

in

10

r-

’r tn

tn

n

ЧС·

Ό»

*4·

*4*

in

r*

0*

O* 0*

r*

0·

o	-J	m	c	r-t 10	Ci		c	c	*4 O\|
	G	oi	Г“	Q ©	С»		c	©	© c
tn	O	FT	0*	© o	c	m	m	©	©
c				m ©	<n	©	»-!		’’T u*i
*4»				•7·	tn	tn	r*	Γ*	r* r*
r-t	ГЧ	еч	r·.	rx		·—	Ή	r-x	Ή ι-ί

см х χ·

©	©	r*
X	X	X
□	□	0

m λ	Λ			4Л
..	..	..	..	..			..
*ч5	Ф	?	0)	w	Ф	•c	Ш
*4	CO	λ	q	k	CQ	u	n
Q	k	<ч	u		k	<0
3	ω	3	Ф	3	0)	3	<u
k	>	« k	>	k	>	!4	>
„0	0)	i*	o	□	Ф	0	Ф
u	©	£	-M*		SC	b>	a
2	s	2	2	2	2	г	г

o on m c\ 1	o m o ·* Cl »	r«* r*. © 1	0* ©	© V G	© G •2· G	c c. r* ©	10 O 04 V © ♦
1 O-	I r·	1 ©	1 m	F·	1 C	1 un	i ΤΓ
04	m	in	in	©	40	fH	C
r*	Cl	G	<e»	G	*r	<·
tn	XT	r*	r*				4F
Cl	c.	e	G	G	a	C3	CO

сз ic

1)

7¾ ex.12 04103-04163 Forward: 5' GA А, GAG, ТСЛ, GTT,CCT, ATA,TCC 3' , 0 260bp

03919-039.39 Reverse: 5‘ GGG, CAA, CAT, GAG, AAA, GAT, GTG 3 ·

CL	c	Cl	CL	a	0. Λ
£	J3	X3	Δ	я
ci	ЯГ	Ci	Ci	r·	a
Ci	f-4	o	: o	cm	Ю
CM	CM	r4	CM		n

CL	Q. Δ	CL	• a XI	C. Λ	CL • X3	CL
Λ		Я				X2
Ci		Ci	CM	w	яг	c
CM	m	V	r·	Cl	in	<n
	n	CM	n	m	n	CM

o “tn o ·· c

s

:

-

r*.

n

s

n

s

-

m

•

—

-

•

e

2

n

cn

.

n

У,

n

c

<

G

D

<*Ί

r·.

ex

У

ΓΪ

y

a

t-

c n

<

G

ζ*

o

<

G·

y

u

e

G

У

¢.-

r A

u

<

U

<*

<

У

c

4j

<

лл

G

<

c

C3

e ·

o

<

o

c

<

a

<

g

C-

c

<

ε_

ζΠ

5

ex

<·

' У

<

O

a

У

c

<

f'

¢-

<

Cm

<

c

υ

<

G

e ·

f ·

<

*

Ί»

w

_w

•

C

<

y

<

g-w

<

G

<

e

Λ A

<

c

<

C*

y

£-

—

<

i-

<

G

'«J

У

y

<

t-

<

G

f n

.* 4

y

O

E-

··_*

<

s_

<3

<

У

<

У

CX

G

<

u

<

i-

J-l

<

Z->

£—

f 1

<

•

U

<x

t-

y

.<

C-

•A 4F

<

(J

y

’<

(X

<

У

y

*

4

·_

u

<

G

g”

<

J

<

c_

У

a

&.

G

<

CJ

<5

У

<

e_

f

·_

<

y

У

y

У

U

У

<

a

ex

<

*.·.

•

*

c_

o

У ’

g-

<

u.

<

У

a

G

<

c

У

ex

У

E-

e

c.

G

E-

fj

ex

.· 1

'.)

G

< ·

<

ex

C

w

y

У

E-

y

<

r*

y

<

o

u

*л

g

c

y

r-

•У

G

<

&·

f ·.

<

c

y

<

J-

E-

t X

<

£.

? X

t ·

r*

u

<

S

<

У

G

У

<

C¹

o

<

•

.

•

.

•

in

uO

in

m

an

ci

o

ci

Ci

Ш

..

··

·.

.·

·.

..

,,

ПЗ

o

*u

Ф

Φ

·□

ф

G

Ф

Ή

Φ

U

tn

k

7J

k

tn

k

<n

k

ω

k

cn

k

tn

k

ffl

k

Ш

k

Ш

k

to

k

<ϋ

k

a

o

Ц

3

Ф

3

0

3

Ф

3

Φ

3

Φ

2

Ф

3

Ф

3

□

>

Ц

>

k

>

k

>

k

>

k

>

k

>

k

>

P

Q

c

Ф

O

0)

0

Φ

C

Φ

0

c

1)

o

Φ

Сь

ci

Cu

c

Cju

cz

ω

K

ω

X

ω

X

Cu

X

Сь

X

ο σι

ΓΊ rr c

'J rM n G )

r- G Cl r*

x· G 43 C· r*

CM FA a G r·

<r X * G r*

Ci c

Γ4 a r*. Cl r* «

o ci c* 1

CN en r*

T) c\ O СЧ r*

Ci cn CD |

*S L3 m G |

c G r* *

c G C* r*

Ci

4S·

r4

m

1

1 Ю

1 r*

ГА

1 CM

1 O

1

1 У)

n

in

4·

40

43

r*i

CM

c

a

c

«7

c

r*

Ci

ЧС

cn

G

VO

a

40

CM

r-

xr

o

ex

ΓΊ

m

n

Г“.

Cl

o

G

a

G

r-

in

Ci

Π.

CM

X

G

a

G

r*

r-

r*

Γ*

r*

Γ-

r*

	ΓΊ	η	-	т --П	•
•			•			s
n			η	У	•
	G	У		е с	Г)	•
	*	«,		« *		.·*)
c	G	<		Е- <	<.
<	У	<	3	< г-	У	У
G	<	<	<	С G	fZ	<
У	<	\Χ	У	i_ &.		G'
u	у		ех	е <	iC	У
<	G	<	<	с. ς*	<	<
*	*	«		_ч *
<	<	«3	Ч.'	— ?-	G	G>
E-	<		<	< <		X.
<	<	<		G s-	r ·	ό
		ч			w
У	c		у	е у	c·	У
(’	G	У	у	< е-	У	Sm
s-	G	СХ	о	Е- <		u
			*		«.
<	<	<		с <	<	У
c	y	<		У w		ϋ
<	u	<	-<	г- С	J-	<
	X	4	•	« «>
	У	к		F <	c	ti
У	g-	G	J-	У <		<
c_	G	у	<	G <	y	У
*	w			* ' «		*
CL.	У	G		< У	У	X-
G	<	<	7-	* ' X.		У
C	t.	<	Е-		L.
	_e		_ш	. _	.
	in	m	W5	Ш С1	tn	ci
··	..	..	..	·· ··	,.	,,
•a	ΐ>	•ϋ	£	Ό Ф	•a	Ф
M	и	k	η	к сп	k	n
to	Ц	ф	к	<В к	П5	k
2	υ	3	е	з а	3	Ф
k	>	k	>	к >	k	>
0	<υ	0	<и	о е	0	a>
G	<4*		а	ь а.	Cu	a.

C	5?	c.	G	r*	Γ*	Ci	*4	cn m	CM	CM
40	Ci		f4	Ci	CM	У	40	r: y:		in
	FA	rj	r-i	G	Ci	T	c	U1 CM	CM
c	w	Ш	Ci		•5·	Ή		c c	Cl	Cl
Г“ I	r· I	40 \|	40 I	. ci t	in	in I	o	Ci Cl
cm	CM	CM	«	1 r*	40	1 40	r-	1 1 4· y	I CM	1 n
G	n	‘ *r	Ci	r*	c	n		Ci	40	m
V		m	c	G	m		c	Cl У	C4	o
c	o	m	o		че»	rj	c*J	c ©	c.	c.
Γ·	r*	43		Ci	m	Ci	Ci	Ci c.

in FA	40 У	r* У	G	e.	c CM	CN	CM CM	У, CM	9Г CM	in CM
:« Φ	•л ’t	X u		κ	x	X	X	_;ς	X	JF
					a	□	Φ	J		z

7K ex. 26 43323-43302 Forward: 5' GAT, CTG, TGA, ACT, CTT, GTT,TTC,A 3* A 244bp a

л гЧ

	^{1 s}	r .
•	rj m	П	d
•		cj	c?
	u c	e-	<
	w «·		*
u	— —*	cj	o
cj	u cj	c*
C2	r· U	e_	u
<	Е- E-		<
y-	cj c	cj
	C T-	<	<
<	< CJ		b.
	5- <	<	<
<	t- 5-	<	o
s-	O r	cj	s-
7»	C~ Г“	CT	o
u	5- CJ	С“
<	< 5-	<	<
•fl 4.	C <	r*
	G U	b	<
•fl	< 5-	<	<
<	< CJ	c?
CJ	C 5-	f	s-
<	е- CJ	r*
<	< Ξ-	6-	<
w	c t*	<

CL .	Q.	a.	CL
Xi	Λ	л	Λ
c—		c	CM
<55	r*	r*	e.
XT	Ifl	un	m

c.

Д

C9 d d <

г :	=	ΓΊ г
.	•	•	•	•	•
D		• m	< d	m
		m	c*		•
o	r»	CJ	E- CJ	Q	r⁴.			и
cj	cj	U 5-	e <	U
<	<	CJ b	< cj	t-	ςι		• CJ	C3
	cj	C f-	C Ϊ-	<	<	-		.*
cj	<	< cj	5“ CJ	CJ	o		f *.	Г“ c c
<	Ϊ-	< <	< =-	e	<		u c-
<	c	c- U	2_ X-	<	<		o* c s-	_w·
<	t·	=- CJ	c =-	<			·< <
c	c	cj l·-	< e·	fj	CJ
c-	<	Г“ Г	л <	6.	<
	<	5- J-	t· · 1	f Ί			CJ u
cj	.· 1	(£· O	=- <	5-	.· »		ό
f-	c	Г- 5	• · Я	c	ГЛ
cj	b-	=- <	5- y-	<				; .
<		C	w Γ-	<	••J		r·	<w' ZJ
CJ	2-	l^r O	cj c	<			CJ*
C	<	cj <	cj а	c	<		· ,
<	u	< а	S Г	<	•fl		Г“	w
		_w ч
<	а	C :-	«С <	□	CT		CJ*
c*	X-	«С CJ	E- CJ		X.	#
f I	&4	CJ “	. —	5			u	CJ
V*«	Λ	iH u“	•-n л	Λ				C:

«П

m

с*.

U

U-·

'ч

*«M

4

«Ч

P

..

··

Φ

•o

φ

ф

S Н X ф

ч-<

м

и

S-i

·<-»

и.

u

cn

P

<η

Μ

«

Г!

п

СМ

tn

•r

40

10

c*·

u

fl

υ

«

Φ >

$ M

φ τ>

3 U

<0 >

с 0

Е С

Е 0

a δ

E 0

e δ

С с

s 0

Ό

,0

φ

0

ф

Σ

μι

U

и

«4

!u

ц

u

25

Cu

Ου

ас

с га

0.

Си

CL

с.

&

й-

L·

e-

s

X

3

8

•

CL

V

-9-

ГЧ

S

ό

X

<

че

<м

тг

сз

I-*

cs

СЗ

CL

см

m

n

un

г*

ΠΊ

C

ί“⁴.

СЗ

о

··

сз

Г}

п

сз

ΓΓ

m

сг

O

c

Γ·

ЧС

1£

%п

н

с

25

О

σ\

σ«

o

с

c

r·

c*.

-Ω

CM

с

о

0

<П

сп

m

i·4_f

хг

n

o

σ\

C

сз

о

ч

Г“»

r-f

*>«

T

n 1

η I

cn 1

m 1

и tf)

1 10

1 см

1 ш

1

1 σ.

1 сз

1 СЗ

1 a⁴.

c-

CM

СП

in

сх

<и

1П

«с

S

Wi

c

ач»

1П

Ж

C3

ΤΓ

сз

и

с

и

СЗ

η

см

«23

C3

η

m

σ>

o

σ\

ιΛ

04

с

CO d

U

G*·

σι

O

σ.

с

o

n

σ\

€ϊ

с

сз

<с

п

η

n

*4·

5Г

η

d

Г“

ГЧ

r*

ГЧ

ГГ

,-fl

гч

см

n

XT

Р

4J

xJ

XJ

ф

£

c

4»'

Ф

Ξ

*;

Ф

r*

с

С

e

CM

Е

R

5

•7*.

7

*

•

0

fl

?5

X

·

W

и

ο

ф

U.

'4-J

fragment 2 279-257 Enh 2f (f) : 5’ OTA, CTG. AAA, CCG, CAG, CAT, G 3' Λ 416 bp

694-676 Enh 4r (r): S' TTG, GAG,ЛСЛ,GTG,ACT,CAC,C 3

ш ο §

Ο

	e
				2> CD X> c
ro	u		X Ш co 5x£	’(D
5	5 n	•E
h	O	ra	CO	1
ro	S o	£.	7 o	>4 TO
ΣΓ	X	S	3	k. ro r

с q с

q

СМ е“

СМ

V

<s« ·* bΟ c

	ro δ b CD ΖΓ	l_ X m O CL Φ §
	ГО X	a
	a	X
	x	J
	=r	ro
	X	X
	<n	Q.
	o	ro
	tz	m
CM	a: o	ro l_
Я	0.	£
ΣΤ x	ro X	ro s
Ц		l_
VO	a>	ro
ro	S	CL
H	S	•Θ·

>α «* b·

C q CM

cc CM <s e* CM

V

c n Ю	C a to	<c co	CM T·
Т“		ΤΓ	IO
V		r· b-	£

CM

M o

CM

X

£ $ СЗ 0 <

е < н r< < < < <

с ο сч

*4. CSi

s'

V

1Л

CM*

rr V

tfi Гч <c Π

G m

	c f**	—		n cc
	cc			tn 'TT	__ _
					/		«5
		Τ’			i CD		CC V·
CO C in c	cc V	i Й = S — ¹ S й a =	S' G G ΰ	C	: cm 1 o 2	Г ,£ « И Φ	c wO x·
o <	a r> cc	u co « co S,	5 u <	f*· cs	Φ CO CO	<J C <	O Σ •

X

C3

CM

X C

s c s s □

<o Ι-	u x	1—	X co ¢0
Ο	n	X
h	O	CO	CO
u ω	Σ o	£	7 o
3	X	Σ

<n co

C5

r<*

<0 I
X	a	1 V—	a c
K X	X 3·	X
ΣΓ	co	X	СЛ (/) <u
X	X	o
o	Q.	: Q	o
o	CO	i ΛΑ	Q
c:	CO	! Φ	<
		CO
		CO
Qi	CO l_
o
CL	X
(0 X	Φ 2 1—
Φ	CO
2	CL
S	θ’

cc r* f*·

V5

X o

X *

3S

•V с a

ь· cs

co co zr

Ю co H

tr ο 0.

»-

<D s i— ГО CL •a ra x

CL Ф s n co

CL

CL Ф s >x

CO CL C

c s ιοί s ct

CO X

Ф

L. co ex θα: o 0.

е

a.	c.	C.	Q.	c.
Δ	X	X	X	X
r-	o ’	a	1Л	C3
<o	a	e	CM	CM
CM		r	CM	V

C.

T* CO CM ci

0 <

F0

L-.

• ?n	s 03
O I	C5
p	•
	<
u
e	o
0	<
0'	0
H	<
0	u
b-	0
P	<
ΙΟ	d Ι-
0	Ο
H.	<
0 £	.0 <
	O < o
LC	in
04	cr.

•
cn	rt
1— 0	0
<	0
<	t
0	p
< 0 <	d cj
u' -	H
0	0
<	9.
0*	p·
H 0	0 <
< 0	0* b-
<	<
0’	<
< 0	0 0
л	LQ

Г)

CO n

o

c <r.

r>i

x o

IT,

X X

СЧ

X

Si·

P <

e <o

I

8«

Οί

X α

Таблица 4

Проби	PCR условия	MDR-1 генотип
Неиндуцирани пробанд средни неиндуцирани пробанд	55 39 276 376 212	Т-алел присъстващ: (ТЯ и T/C) в позиция 176 в Acc. #M29445/J05168 ‘ в екзон 26
Индуцирани с римфампицин пробанд средни неиндуцирани с рифампицин пробанд	142 1085 520 - -................... 601 587
Неиндуцирани пробанд средни неиндуцирани пробанд	96 302 291 230	T -алел липсващ: (С/С единствено) в позиция 176 в Acc. #M29445/J05168
Индуцирани с римфампицин пробанд средни индуцирани с римфампицин пробанд	423 1264 1086 924
Най-ниската rifиндуцирана активност	142,1	Хомозиготен ТЯ в позиция 176 в Acc. #M29445/J05168
Най-високата rifитдуцирана активност	1264,9	Хомозиготен С/С в позиция 176 в Acc. #M29445/J05168

Таблица 5

Проби	Концентрация на дигоксин в кръвта	MDR-1 генотип
Неиндуцирани пробанд	63,6 64.1 73.2
средни неиндуцирани пробанд	54,7 63,9	Т-алел присъстващ: (Т/ТиТ/С) в позиция 176 в Acc. #M29445/J05168
Индуцирани с римфампицин пробанд	57,3 39 ......- 45,8 37,7
средни неиндуцирани с рифампицин пробанд	45
Неиндуцирани пробанд Средни неиндуцирани пробанд	55,6 30.8 48,3 44.9	Т -апел липсващ: (С/С единствено) в позиция 176 в Acc. #M29445/J05168
Индуцирани с римфампицин пробанд	39,6 12,3 33,9
Средни индуцирани с римфампицин пробанд	28,6
Най-високото rifиндуцирано dig кръвно ниво	57,3	Хомозиготен T/T в позиция 176 в Acc. #M29445/J05168
Най-ниското rifитдуцирано dig кръвно ниво	12,3	Хомозиготен С/С в позиция 176 в Acc. #M29445/J05168

амин

s
« .	' X
O	re
s o X	£ s

	X Ql O	ч 1	• co X
	t	X	X
X	o	t	o
J	S	JU cu	s
re X	o CL	S u.	Φ
a.	c	re	re
CO	re	CL	Λ
10	<·>	e	X

o'

V

ромоторен фрагмент 1 139117 1,5%* 1,5%* 0,05%* Wl/lPAik

I: GAAAGGTGAGATAAAGCAA (; GAAAGGTGAG/AATAAAGCAA

r. TTGCTTTATCTCACCTTTC г: ТТвСТГГАТСЛПГСАССТТТС mut:

I: GAAAGGTGAGATAAAGCAA r: TTGCTTTATTTCACCTTTC

ЙЛЙИЙЙ

8?-

е н <

< ьсз

о

о	0		0
Ι-		0
ο	<	CJ	0
о	0	δ	ο
е	ϋ	(J	<
о и	< Ο	е	0
о CD	te /ч	ο υ ο	5

р:

SI

ГО 6 6 φ J-	X « ο 2 ο X	1X го £ 2	X го m bi го 7 s	’δ >> Έ го I	♦ χρ ο⁴ V ο’
го	ι_’ S	ί-			♦
• φ ΞΓ	η ο 2 Ο X	X го £ 2			T V

c Q	£
Й	•V
И	CJ
φ	C
w	O
w <<	O
•s	<

г? \|х	Ф . 7	δ⁴N-
CD*	i ’	σ>
co bCM 0> CO		0) N. Μ Ο)

	«	s ΖΓ
o⁴	XP o⁴	δ⁴CO	X ro
Μ^-	τΟ	O	X! X
o’	o’	o’	ex Φ
			2
			ro
/			s
			zr
			X
			ro
			bi
		«	X
V V	V	V	CL -θ-
	V	V	βΐ
			s
			Q.
			C
			ro
			Ι-
δ⁴	i		Ο
t— CM	ί чО o⁴' ^ю.	« 'S δ⁴	b φ Η
τ-		V	J
			φ φ
		CO	♦
Ο
T~	: ⁰⁰	CO
CO	V	Т“
CD	V	CM
CO	1 °	o
V“	; M·	τ
CM		Т“
t	CO	¢0
X Φ	b· X	£
2	Ф	0)
I— ro	2 l_	2 L.
ex	ro	Л
-θ-	CL	Q-
χ	•θ’	Θ·
φ	X	X
CL	Φ	Φ
O	CL	Ql
ίο	o ί-	O p
2	ο	O
o	2	2
CL	o	o
c	CL	Q.
	c	rr

го т

	о σ>
чг 1	<0 CO	= (·*· о 1Л a V : <Л СМ ;	ч· о ч-
S Ь	S X о	тФ
д. ф	<о	С С	Ь
ьс	О О	X
2	ф		ф
1— ГО Q.	го co	2 L. го
θ'	X		Q.
			θ’

х Ф QО н о 2 о о. с:

Г. см Г о Ч·

I

1	< < o	o Г“ ί CD	ο CJ S < < cj CD и CD· .-	, ,	CD CD CD 5
H	t-	(—	Ό	cd		rf·
cd	r	CJ	CD	CJ
<	o	CD	h	b		U
<	H	CJ	r·	<		CD
ei Q	H! CD	<1 <	CD,	CJI <		<1
O L-	CD CD	CD <	3	< CJ		CD h
	<	<	υ	CJ		<
	CJ	CD	<	CJ		<
<	<	(—	CJ	CJ		K L_
<	(-	<	CD	Ι-		C
<	<	U	>·	Ο		ζ
cj	CD	I—	¢3	CD		o
	—	w		u-

π С с с е' Гс

V?

О⁴

1Л

х$ с⁴η

wt/rniJlL

175160 46.9% 20.3% 19.4% (: TCCTCTGAGAATGTGCAGT I: TCCTCTGAGA/GATGTGCAGT ' r: ACTGCACATTCTCAGAGGA r: ACTGCACATT/CCTCAGAGGA

EHL'k

1:7CCTCTGAGGATGTGCAGT ' r: ACTGCACATCCTCAGAGGA

	lJ s
co Ι-	n O	K-
Ο	Q.	X
h	Φ	co
b φ	Φ	£.
□r	X	S

cd u < cd CD <

0^s“ C 04	g ό	vP o⁴CO o	x zr X co ьс X	« 0^sCO	X J X co it
				CL		O	X
			o	Φ 2 co 1		o'	Q. Φ 2 co
				X J X	t		1 X ΣΓ
				co bi			X CO
*-n		xO 0'	♦ *>5 o⁴	X CL e co X Q. c		«	it X Q. -θ-
04		’v	V		V V	co X CL c
				co Ι-			co
				Ο h			&
GS 1Л V		>o c^x1Л O	« ff⁴xr co	b Φ T «’		« г> •ч·co	b Φ T « '

co	C a*
X K	a X	s X		и <л	С2 С ui
X	CT	o		φ	с
ZT	co	D	eft	Q	о	С
X co o	X CL CO	Φ co	w CM 1 O	Ο < ч.»	О <	г*· V СЗ
c	m	ω	Т“

Cl

ΤΓ c:

d Γ*. Cl π c tr o D_ co x φ

S ro >X Φ S i— CO

Q.

•θx

ОНмнйШ

хО •X см

χ5 σ⁴	χ« 0*	5?

V	V	V

		S5	>»
СМ		Γχ	O' Γχ
σϊ Λ	'	(6	<c

го
X	<χ	X
α	X	X
X	ΖΤ	ο
zr	го	co
s	X		<0
η ο с	CL го m	Φ Ш co	CM I Ο

fx η ο |Χ η tn CJ ο |χ

IX σι CJ α (χ

V С σι С Γχ

Qi Ο Ol го

X φ sr го гго CL -Яс·.

С <Ν

С сл

X

< <

X
X о <0
hi ф	(0 см 1
ф
co	о Т

с tn

с о о

CO «а с Ш

О П.

го

X го

S

о < сз

U “! е; 3!

a: и

С^х

С

Q

5?	>в
▼“
V	V	V
о⁴	ч о^ч
04		Si
V	с	d

с	0?	см
с	co	<а
04	см
О	г?	co
0*	V	V

см х с

CS см

X с

‘4

о

изчислява на основата на Hardy- Weinberg разпределението. В секцията от последователноста изменчивите основи са подчертани и са удебелени.

Claims

1. Полинуклеотид, избран от група, състояща се от:

(а) полинуклеотид, притежаващ която и да е

поел !едовател! пост нукл< еинови ки сели ни от SEQ ID NOs : 73, 74, 79, 80, 85, 86, 91, 9 2, 97, 98, 101, 106, 107, 112, 113, 116, 119, 122, 154, 155, 160, 161, 166, 167, 172, 173, 178, 179, 184, 185, 190, 191, 196, 197, 202, 203, 208, 209, 214, 215, 220, 221, 226, 227, 232, 233, 238, 239, 244, 245, 250, 251, 256, 257, 262, 263, 268, 269, 274, 275, 280, 281, 286, 287, 292, 293, 298, 299, 304, 305, 310, 311, 316, 317, 322, 323, 328, 329, 334, 335, 340,

341, 346, 347, 352, 353, 358, 359, 364, 365, 370 или 371;

(b) полинуклеотид, кодиращ полипептид, притежаващ аминокиселинна последователност на коя да е от SEQ ID NOs: 372, 373, 374 или 375;

(c) полинуклеотид, кодиращ молекулярен вариант на полипептид на Много-Лекарствената-Резистентност-1 (MDR)-1, където посоченият полинуклеотид притежава в позиция, съответстваща на позиция 140837, 141530, 141590, 171466, 171512 или 175068 на MDR-1 гена (регистров No: АС002457), в позиция, съответстваща на позиция 101 или 308 на MDR-1 гена (Регистров No: М29432 или J05168), в позиция, съответстваща на позиция 83946 на MDR-1 гена (Регистров No: АС005068), в позиция, съответстваща на позиция 78170 на MDR-1 гена (Регистров No: АС005068), в позиция, съответстваща на позиция 176 на MDR-1 гена (Регистров No: М29445 или J05168), в позиция, съответстваща на позиция 171456, 171404 или 175074 на MDR-1 гена (Регистров No: АС002457), в позиция, съответстваща на позиция 77811 на MDR-1 гена (Регистров No: АС005068) или в позиция, съответстваща на позиция 137 на MDR-1 гена (Регистров No: М29445 или J05168) нуклеотидна замяна, нукпеотидна делеция, допълнителен нуклеотид или един допълнителен нуклеотид и нуклеотидна замяна;

(d) полинуклеотид, кодиращ молекулярен вариант на MDR-1 полипептид, където посоченият полинуклеотид притежава в позиция, съответстваща на позиция 140837, 171512, 171456, 171404, 139119, 139619, 140490 или 171511 на ф MDR-1 гена (Регистров No: АС002457) С, в позиция, съответстваща на позиция 141530, 139177, 139479, 140118, 140568, 140727 или 174901 на MDR-1 гена (Регистров No: АС002457) А, в позиция, съответстваща на позиция 141590, 139015, 140216, 140595, 175142 или 175180 на MDR-1 гена (Регистров No: АС002457) G, в позиция, съответстваща на позиция 171466, 175068, 175074, 139064, 139276, 140576 или 145984 на MDR-1 гена (Регистров No: АС002457) Т, в позиция, съответстваща на позиция 101 на MDR-1 гена (Регистров No: М29432 или J05168) А, в позиция, съответстваща на позиция ф 308 на MDR-1 гена (Регистров No: М29432 или J05168) Т, в позиция, съответстваща на позиция 83946, 78170, 70237 или 70200 на MDR-1 гена (Регистров No: АС005068) Т, в позиция, съответстваща на позиция 77811, 84032 или 73252 на MDR-1 гена (Регистров No: АС005068) G, в позиция, съответстваща на позиция 84701, 84074, 84119, 83973, 70371, 70253, 70204 или 43162 на MDR-1 гена (Регистров No: АС005068) А, в позиция, съответстваща на позиция 43263 на MDR-1 гена (Регистров No: АС005068) С или в позиция, съответстваща на позиция 176 или 137 на MDR-1 гена (Регистров No: М29445 или J05168) Т;

(e) по ли нуклеотид, кодиращ молекулярен вариант на MDR-1 полипептид, където посоченият полипептид включва аминокиселинно заместване в позиция, 21, 103 или 400 на MDR-1 полипептида (Регистров No: Р08183); и (f) полинуклеотид, кодиращ молекулярен вариант на MDR-1 полипептид, където посоченият полипептид включва аминокиселинно заместване на N в D в позиция 21, на F в S at в позиция 103, на F в L в позиция 103 или на S в N в позиция 400 на MDR-1 полипептида (Регистров No: Р08183).

0

2. Полинуклеотид, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че нуклеотидното делетиране, прибавяне и/или заместване водят до изменена експресия на варианта на MDR1 гена, в сравнение със съответния ген от див тип.

3. Вектор, съдържащ полинуклеотид, съгласно претенция 1 или 2.

4. Вектов, съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че полинуклеотидът е оперативно свързан с експресионна контролна последователност, позволяваща експресията в прокариотни или еукариотни клетки.

ф

5. Генно-инженерни клетки гостоприемници с полинуклеотид, съгласно претенция 1 или 2 или вектор, съгласно претенция 3 или 4.

6. Метод за получаване на молекулярен вариант на MDR1 протеин или негов фрагмент, характеризиращ се с това, че:

(a) клетките гостоприемници от претенция 5 се култивират; и (b) посоченият протеин или фрагмент се получава от културата.

7. Метод за получаване на клетки, способни да експресират молекулярен валиант на MDR-1 гена, характеризиращ се с това, че съдържа генно-инженерни клетки с полинуклеотид от претенция 1 или 2 или вектор от претенция 3 или 4.

8. MDR-1 протеин или негов фрагмент, кодиран от полинуклеотида от претенция 1 или 2 или, който може да се получи по метода от претенция 6 или от клетки, получени по метода на претенция 7.

9. Антитяло, което се свързва специфично към протеина от претенция 8.

10. Антитяло, съгласно претенция 9, характеризиращо се с това, че специфично разпознава епитоп, включващ едно или повече аминокиселинни замествания, както са дефинирани в претенция 1 или 2.

11. Молекула на нуклеинова киселина, комплементарна на полинуклеотида от претенция 1 или 2.

12. Молекула на нуклеинова киселина, характеризираща се с това, че е способна специфично да разпознава и да разцепва полинуклеотида от претенция 1 или 2.

13. Вектор, съдържащ молекула на нуклеинова киселина от претенция 11 или 12.

14. Трансгенно животно, което не е човек, съдържащо поне един полинуклеотид от претенция 1 или 2 или вектор от претенция 3 или 4.

15. Трансгенното животно, което не е човек, съгласно претенция 14, характеризиращо се с това, че съдържа поне един инактивиран алел от див тип на MDR-1 гена.

16. Трансгенното животно, което не е човек, съгласно претенция 14 или 15, характеризиращо се с това, че е мишка иби плъх.

17. Метод за идентифициране и получаване на MDR-1 инхибитор, способен да модулира активноста на молекулярния вариант на MDR-1 гена или на неговия генен продукт, характеризиращ се с това, че:

(a) протеинът от претенция 8 или клетка, експресираща молекулярен вариант на MDR-1 ген, съдържащ полинуклеотид

Ф от претенция 1 или 2 в присъствие на съставка, която е в състояние да осигури сигнал, който може да се установи, в отговор на транспорт на лекарствено средство, се привежда в контакт със съединение, което се скринира, при условия, които да позволят MDR-1 медииран транспорт на лекарствено средство, и (b) определя се присъствието или отсъствието на сигнал или нарастване на сигнала, генериран от транспорта на лекарствено средство, характеризиращ се с това, че наличието или увеличението на сигнала е показателно за предполагаем ф инхибитор.

18. Метод, съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че посочената клетка е клетка, съгласно претенция 5, получена по метода от претенция 7 или се съдържа в трансгенно животно, което не е човек от коята и да е претенция от 14 до 16.

19. Метод за идентифициране и получаване на MDR-1 инхибитор, способен да модулира активноста на молекулярния вариант на MDR-1 гена или на неговия генен продукт, характеризирашщ се с това, че:

(a) протеинът от претенция 8 се привежда в контакт с една първа молекула, известна с това, че е свързана с MDR-1 протоин за да образува един първи комплекс от посочения протеин и посочената първа молекула;

(b) посоченият първи комплекс се привежда в контаст със съединение, което трябва да се скринира; и (c) определя се дали посоченото съединение измества посочената първа молекула от посочения първи комплекс.

20. Метод, съгласно претенция 19, характеризиращ се с

Ф това, че посоченият етап на измерване включва измерване на образуването на втори комплекс на посочения протеин и посоченото съединение.

21. Метод, съгласно претенция 19 или 20, характеризиращ се с това, че посоченият етап на измерване включва измерване на количеството на посочената първа молекула, която не е свързана с посочения протеин.

22. Метод, съгласно коя да е претенция от 19 до 21, характеризиращ се с това, че посочената първа молекула е Verapamil, Valspodar, Cyclosporin А или Dexniguldipine.

ф

23. Метод, съгласно коя да е претенция от 19 до 22, характеризиращ се с това, че посочената първа молекула е белязана.

24. Метод за диагностициране на нарушение, свързано с наличието на молекулярен вариант на MDR-1 ген или податливост на подобно нарушение, характеризиращ се с това, че:

(a) определя се наличието на полинуклеотид от претенция 1 или 2 в проба от субект, и/или (b) определя се наличието на протеин от претенция 8.

25. Метод, съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че посоченото нарушение е рак.

26. Метод, съгласно претенция 24 или 25, характеризиращ се с това, че се включват PCR, лигазна верижна реакция, рестрикционно смилане, директно секвениране, техники на амплифициране на нуклеинови киселини, техники на хибридизиране или имуноизследвания.

27. Метод, съгласно коя да е претенция от 24 до 26, характеризиращ се с това, че освен това се прилага на субекта лекарствено средство за унищожаване или облекчаване на посоченото нарушение.

28. Метод, съгласно коя да е претенция от 24 до 27, характеризиращ се с това, че освен това в клетките се въвежда (i) функционален и експресируем MDR-1 ген от див тип или (Н) молекула на нуклеинова киселина от претенция 11 или 12 или вектор от претенция 13.

29. Метод за получаване на фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че включва етапите на метода от която и да е от претенции 17 до 23; и (с) синтезира се и/или се привежда във фармацевтична форма съединението идентифицирано и получено в етап (Ь) или негово производно във фармацевтично приемлива форма.

30. Метод за получаване на фармацевтичен състав, характеризиращ се с това, че се привежда във фармацевтична форма лекарственото средство или пролекарственото средство, във форма подходяща за терапевтично прилагане и предпазване или подобряване на нарушение на субект, диагностициран по метода от претенция 24 или 25.

ИайМ*»

31. Метод, съгласно претенция 29 или 30, характеризиращ се с това, че посоченото съединение лекарствено средство или про-лекарствено средство е производно на лекарствено средство, както е дефинирано в претенция 27.

32. Инхибитор, идентифициран или който може да бъде получен чрез която и да е претенция от 17 до 23.

33. Инхибитор, съгласно претенция 32, характеризиращ се с това, че се свързва специфично към протеина от

Ф претенция 8.

34. Използуване на олиго- или полинуклеотида за откриване на полинуклеотид от претенция 1 или 2 и/или за генотипизиране на индивидуални MDR-1 алели.

35. Използуване, съгласно претенция 34, характеризиращо се с това, че посоченият полеинуклеотид е полинуклеотида от претенция 1 или 2 или молекула нуклеинова киселина от претенция 11 или 12.

36. Използуване, съгласно претенция 34, характеризиращо се с това, че посоченият олигонуклеотид се ф състои от приблизително 15 до 50 нуклеотида дължина и съдържа нуклеотидната последователност на която и да е от SEQ ID NOS: 1 до 179 или див тип (wt)- или мутирана (mut)последователност на промотора или на екзон на MDR-1 гена, посочена в таблица 8 или комплементарна последователност на която и да е от тях.

37. Праймер или проба, състоящ се от олигонуклеотид, както е дефиниран в претенция 36.

38. Използуване на антитяло или на вещество, способно да се свързва специфично към генния продукт, за откриване на протеина от претенция 8, експресиране на молекулярен вариант на MDR-1 гена, включващ полинуклеотид от претенция 1 или 2 и/или за различаване на MDR-1 алел, включващ полинуклеотид от претенция 1 или 2.

39. Състав, характеризиращ се с това, че съдържа полинуклеотида от претенция 1 или 2, вектора от претенция 3 или 4, клетката гостоприемник от претенция 5 или който е получен по метода от претенция 7, протеина от претенция 8, антитялото от претенция 9 или 10, молекулата нуклеонива © иселина от претенция 11 или 12, вектора от претенция 13, инхибитора от претенция 32 или праймера от претенция 37.

40. Състав, съгласно претенция 39, характеризиращ се с това, че е диагностичен или фармацевтичен състав.

41. Използуване на една ефективна доза от лекарственото средство или пролекарственото средство за получаване на фармацевтичен състав за лечение или предотвратяване на нарушения при субект, включващо полинуклеотид от претенция 1 или 2 в неговия геном.

42. Използуване, съгласно хпретенция 41, ф характеризиращо се с това, че посоченото нарушение е рак или нервно заболяване, заболяване на ЦНС или сърдечносъдово заболяване.

43. Използуване на единичен нуклеотиден полиморфизъм (SNP) на MDR-1 ген, като фармакогенетичен фактор за предсказване на кръвните нива на MDR-1 субстрат и/или индуциращо средство за подобряване на лекарствената сигурност и ефикастност, за предсказване и предпазване от странични ефекти и лекарствени взаимодействия и/или за повишаване на съгласието на пациентите.

100

44. Използуване, съгласно претенция 43, характеризиращо се с това, че субстратът и/или индуциращото средство се избират измежду противоконвулсанти/противоепилептични лекарствени средства, сърдечни гликозиди, имуноподтискащи лекарствени средства, макролидни антиобитици.

антибиотици или макроциклени съгласно претенция 43 или 44, това, че SNP е MDR-1 екзон 26