NO330680B1

NO330680B1 - Fremgangsmate for diagnostisering av tilstedevaerelse av en variant av MDR-1 genet, in vitro anvendelse av et oligo- eller polynukleotid, en diagnostisk sammensetning samt en fremgangsmate for identifisering av en MDR-1 inhibitor

Info

Publication number: NO330680B1
Application number: NO20020470A
Authority: NO
Inventors: Ulrich Brinkmann; Sven Hoffmeyer; Michel Eichelbaum; Ivar Roots
Original assignee: Pgxhealth Llc
Priority date: 1999-07-30
Filing date: 2002-01-29
Publication date: 2011-06-06
Also published as: NO20020470D0; HRP20020093B1; BG106362A; AU1131901A; CA2697207A1; HRP20020093A2; HUP0201997A2; EE200200049A; US20050227249A1; KR100814188B1; PL354034A1; CA2376666C; CA2376666A1; NO20100798L; DE60036487T2; DK1232260T3; JP2003510021A; MXPA02001094A; KR20020059347A; WO2001009183A2

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår stort sett midler og fremgangsmåter for diagnostisering og behandling av det fenotypiske spektrum, så vel som de overlappende kliniske kjennetegn med flere fonner for arvet abnormal ekspresjon og/eller funksjon av multilegemiddel resistens-1 (Multi DrugResistance-1, MDR-1) genet.

Spesielt angår foreliggende oppfinnelse polynukleotider til molekylære varianter av MDR-1 gener, som for eksempel er forbundet med utilstrekkelig og/eller endret opptak av legemidler i en målcelle, samt vektorer som omfatter slike polynukleotider. Dessuten angår foreliggende oppfinnelse vertsceller som omfatter slike polynukleotider eller vektorer samt deres anvendelse til fremstilling av varianter av MDR-1 proteiner. I tillegg angår foreliggende oppfinnelse varianter av MDR-1 proteiner og antistoffer som spesifikt gjenkjenner slike proteiner. Foreliggende oppfinnelse angår ytterligere fremgangsmåter til påvisning og oppnåelse av legemiddelkandidater og inhibitorer til beliandling av sykdommer som er relatert til feilen i MDR-1 genet, så vel som fremgangsmåter til diagnostisering av statusen til slike sykdommer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer dessuten diagnostiske preparater som omfatter de ovenfor beskrevne polynukleotidene, vektorene, proteinene, antistoffene samt medikamenter og inhibitorer som er oppnåelige ved de ovenfor beskrevne fremgangsmåtene. Nevnte preparater er spesielt nyttige i diagnostisering og behandling av ulike sykdommer med medikamenter som er substrater, inhibitorer eller modulatorer av MDR-1 genet eller dets produkt.

Oppfinnelsens bakgrunn

Humant MDR-1 genet koder for et integral-membranprotein, hvis funksjon er den energi-avhengige transporten av ulike substanser fra innsiden av celler og cellemembraner til utsiden av cellen. Mens den normale fysiologiske funksjonen til MDR-1 høyst sannsynlig er å beskytte cellene mot toksiske substanser, er det også kjent at mange substrater for MDR-1 transportøren er medikamenter som er utviklet til behandlingen av sykdommer hos mennesker. På grunn av det, kan graden av ekspresjon og funksjonen til MDR-1 genproduktet direkte påvirke effektiviteten til ethvert medikament som tjener som substrat for MDR-1. For eksempel er det velkjent at ekspresjonsnivået og dermed graden av funksjonen til MDR-1, direkte påvirker effektiviteten til ethvert tumor-legemiddel i behandling av kreft. Gennavnet "MDR" står faktisk for "Multi-Drug-Resistance" (multi-legemiddel-resistens), og gjenspeiler observasjonen av at proteinet som er kodet av dette genet forårsaker at kreftceller blir og funksjonen til MDR-1 genproduktet direkte påvirke effektiviteten til ethvert medikament som tjener som substrat for MDR-1. For eksempel er det velkjent at ekspresjonsnivået og dermed graden av funksjonen til MDR-1, direkte påvirker effektiviteten til ethvert tumor-legemiddel i behandling av kreft. Gennavnet "MDR" står faktisk for "Multi-Drug-Resistance" (multi-legemiddel-resistens), og gjenspeiler observasjonen av at proteinet som er kodet av dette genet forårsaker at kreftceller blir upåvirkelige av behandlingen med mange legemidler som er substrater for MDR-1-tansportøren.

MDR-1 genet uttrykkes ikke bare på spesielle kreftceller hvor det direkte kan påvirke den terapeutiske effekten av legemidler ved å sørge for en beskyttende barriere mot legemiddel-inngang, men også på forskjellige ikke-maligne celler i ulike organer, f. eks. i tarmen og blod-hjeme barrieren. MDR-1 kan også påvirke aktiviteten og tilgjengeligheten av legemidler i disse cellene. For eksempel kan MDR-1 i tarmen kontrollere eller modulere graden av legemiddel-opptak fra tarmen etter oralt legemiddel-inntak. MDR-1 i blod-hjerne barrieren kan også påvirke eller kontrollere graden med hvilken MDR-1-substrater kan tas opp i hjernen. Her kan forhøyet MDR-1 aktivitet forhindre opptaket av tilstrekkelige mengder av ønskede hjerne-legemidler inn i hjernen eller vise versa, MDR-1 varianter med redusert aktivitet mot visse legemidler kan føre til abnormal økt akkumulering i hjernen, som fører til uønskede eller til og med farlige bivirlannger av medikamenter.

Fellesfaktoren som kontrollerer MDR-1-avhengig transport i maligne celler, så vel som normale celler og vev, er aktiviteten til MDR-1. MDR-1-aktiviteten som igjen er avhengig (i) av ekspresjonsnivåene av MDR-1 genet, som bestemmer mengden av MDR-1 proteinet som syntetiseres i cellene og (ii) av funksjonen til det syntetiserte MDR-1 proteinet, dvs. hvilke substrater som gjenkjennes og transporteres ut av cellen med hvilken effektivitet.

Den første av disse parameterne, nivået av MDR-1 ekspresjon, er dyptgående analysert, spesielt fordi tumorcellers sensitivitet for cancer-kjemoterapi ofte korrelerer omvendt med oppregulering av MDR-ekspresjon: høy MDR-1 ekspresjon korrelerer ofte med utilstrekkelig effektivitet av cancer-kjemoterapi. Selv om den observerte MDR-1 overekspressjonen delvis kan skyldes amplifiseringer av MDR-l genet, er det kjent at andre, foreløpig ubestemte grunner også må eksistere, blant dem mulige alleliske forskjeller. Små forskjeller i MDR-1 gensekvensene hos individer kan ligge til grunn for forskjellige nivåer av MDR-1 genekspresjon. Målområder i det humane genomet, hvor sekvensforskjeller kan eksistere som direkte virker inn på MDR-1 genekspresjon, kan være kontrollområdene for genekspresjon: promoter og enhancerområdene til MDR-1 og områder som innvirker på måten eller virkningsfullheten av spleising av MDR-1 pre-mRNA. I tillegg kan ekspresjonsnivåer påvirkes av strukturelle endringer i genomet, slik som metylering, generelle endringer i kromatinet og andre faktorer som er bundet til MDR-1 i området direkte på eller som omgir MDR-1 genet, Det er veldig vanskelig direkte å finne slike koblede faktorer eller sekvenser, og bevise deres mekanisme i genaktivering eller undertrykking. Den lineære strukturen til det humane genom på bestemte kromosomer åpner imidlertid muligheten til å utnytte identifisert polymorfisme, som i seg selv ikke direkte virker inn på ekspresjonsnivåer av gener, som markør for andre hittil uidentifiserte endringer i og rundt MDR-1 genet, som påvirker ekspresjonsnivåene. Denne effekten er kjent som kobling: bestemte alleler og base-variasjoner kan tjene som en markør for en viktig fenotype selv om disse endringene i seg selv ikke forårsaka- den fenotypen.

Den andre parameteren, funksjonen til det syntetiserte MDR-1 proteinet, dvs. hvilket substrater gjenkjennes og transporteres ut av cellen ved hvilken effektivitet, bestemmes hovedsakelig av aminosyresekvensen til proteinet som er kodet av MDR-1 allelet. Det er vel kjent at endringer i aminosyrene kan endre funksjonen til proteinene. Eksempler på naturlig forekommende varianter, dvs. forskjellige alleler som har en direkte irmvirkning på virkningen av ulike legemidler er f eks. cytokrom P450-polymorfismer eller polymorfismer i TPMT, APOE og mange forskjellige andre gener. Tumor-relaterte variasjoner, f. eks i p53 genet erkjent å mediere slike fenotyper. Hittil er kun noen polymorfismer i MDR-1 genet beskrevet og blitt korrelert med kliniske effekter (Mickley, Blood 91 (1998), 1749-1756). Et viktig spørsmål som gjenstår på dette området er om flere slik polymorfismer finnes og dersom de gjør det, kan de korreleres til legemiddel-aktivitet og/eller bivirkninger av legemidler. Forsøk med artifisielt introduserte mutasjoner i MDR-1 genet, viste tydelig at MDR-1 reagerer ganske sensitivt på aminosyreendrhiger. Det er vist at artifisielle mutasjoner i MDR-1 genet som oversettes til endringer i proteinet, kan endre substrat-spektrumet, effektiviteten av substrat-transport, kontroll av transport og også sensitiviteten til MDR-1 mot inhibering med spesifikke inhibitoriske substanser. Det er klart at naturlig forekommende mutasjoner, dersom de finnes, kan ha tilsvarende effekter. Det er imidlertid ukjent hvor mange slike varianter som finnes og med hvilken frekvens og i hvilke posisjoner i det humane MDR-1 genet. I overensstemmelse med dette er midler og fremgangsmåter for diagnostisering og behandling av mange forskjellige former for multi-legemiddel resistens som resultat av MDR-1 gen polymorfisme og sensitivitets-interferering, f. eks. ved kjemoterapeutisk behandling av sykdom, spesielt kreft, hittil ikke tilgjengelig, men er ikke mindre svært ønsket.

Chen et al., The Journal of Biological Chemistry Vol 272, No.9, February 28,1997, 5974-5982 beskriver transefeksjonsstudier av MDR-1 genet inn i medikament sensitive sarcoma celler som deretter utviser resistens.

Derfor er det tekniske problemet i foreliggende oppfinnelse å etterkomme behovene som er beskrevet over.

Løsningen på dette tekniske problemet oppnås ved å tilveiebringe utførelsesformene som erkarakteriserti kravene.

Oppsi lmmering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er basert på funnene av nye, hittil ukjente varianter i nukleotidsekvensene til det humane MDR-1 (multi legemiddel resistens) genet og distribusjonen av disse allelene i populasjonen. Basert på denne kunnskapen til disse nye sekvensene og MDR-1 genets base-awik, ble diagnostiske tester og reagenser for slike tester designet for spesifikk påvisning og genotyping av MDR-1 alleler i mennesker, inkludert homozygoter så vel som heterozygoter, hyppige så vel som sjeldne alleler av MDR-1 genet. Bestemmelsen av MDR-1 genets allel-status hos mennesker med slike tester er nyttig i behandling av ulike sykdommer med medikamenter som er substrater, inhibitorer eller modulatorer av MDR-1 genproduktet.

Foreliggende oppfinnelse omfatter fremgangsmåte for diagnostisering av en ervervet multiresistens eller multisensitivitet relatert til tilstedeværelse av en molekylær variant av MDR-1 genet, kjennetegnet ved at den omfatter å bestemme tilstedeværelsen, i en prøve fra et individ, av et polynukleotid valgt fra gruppen bestående av: (a) et polynukleotid som har nukleinsyresekvensen ifølge SEQ ID NO 122; (b) et polynukleotid som koder for en molekylær multiresistens (MDR)-1

polypeptidvariant, hvor nevnte polynukleotid har en polynukleotid utbytting i en posisjon som korresponderer til posisjon 176 i ekson 26 i MDR-1 genet

(aksesjonsnummer M29445 eller J05168);

(c) et polynukleotid som koder for en molekylær MDR)-1 polypeptidvariant, hvor nevnte polynukleotid har en T i en posisjon som korresponderer til posisjon 176 i

ekson 26 i MDR-1 genet (aksesjonsnummer M29445 eller J05168); og

(d) et nukelinsyremolekyl som er komplementær til polynukleotidet ifølge (a) til (c); anvendelse av et oligo- eller polynukleotid for diagnostisering av en ervervet multiresistens eller multisensitivitet relatert til tilstedeværelse av en molekylær variant av MDR-1 genet, som omfatter å bestemme tilstedeværelsen, i en prøve fra et individ, av et polynukleotid valgt fra gruppen bestående av: (a) et polynukleotid som har nukleinsyresekvensen ifølge SEQ ID NO 122; (b) et polynukleotid som koder for en molekylær multiresistens (MDR)-1

(aksesjonsnummer M29445 eller J05168);

ekson 26 i MDR-1 genet (aksesjonsnummer M29445 eller J05168); og

(d) et nukelinsyremolekyl som er komplementær til polynukleotidet ifølge (a) til (c); hvori tilstedeværelsen av nevnte polynukelotid er ansett å indikere nevnte ervervede multiresistens, eller multisensitivitet i nevnte anvendelse.

Diagnostisk sammensetning, kjennetegnet vet at den omfatter polynukleotidene som definert i krav 1 eller oligo- eller polynukleotidene definert i krav 7 er også omfattet av oppfinnelsen.

Videre omfattes anvendelse av MDR-1 genets enkel nukleotid polymorfisme som definert i krav l(a) eller (c), som en farmakogenetisk faktor, for fremstilling av en diagnostisk sammensetning for beregning av blodnivåer av et MDR-1 substrat og/eller induser for forbedring av legemiddelsikkerhet og effektivitet, for å forutsi og forhindre bivirkninger og legemiddelinteraksjoner og/eller for å øke pasientmedgjørlighet.

Til slutt omfattes av oppfinnelsen, fremgangsmåte for å identifisere og oppnå en MDR-1 inhibitor som er i stand til å modulere aktiviteten til en molekylær variant av MDR-1 genot, kjennetegnet ved at den omfatter trinnene med å (a) bringe en celle som utrykker en molekylær variant av MDR-1 genet, som omfatter et polynukleotid som definert i krav 1, i nærvær av komponenter som er istand til å tilveiebringe et detekterbart signal som respons på legemiddeltransport, i kontakt med en forbindelse som skal screenes under betingelse som tillater MDR-1 mediert

legemiddeltransport, og

(b) detektere tilstedeværelse eller fravær av et signal eller økning av et signal som er generert av legemiddeltransporten, hvori tilstedeværelsen eller økningen av signalet er indikativt på en antatt inhibitor. (a) bringe en celle som utrykker en molekylær variant av MDR-1 genet, som omfatter et polynukleotid som definert i krav 1, i nærvær av komponenter som er istand til å tilveiebringe et detekterbart signal som respons på legemiddeltransport, i kontakt med en forbindelse som skal screenes under betingelse som tillater MDR-1 mediert

legemiddeltransport, og

(b) detektere tilstedeværelse eller fravær av et signal eller økning av et signal som er generert av legemiddeltransporten, hvori tilstedeværelsen eller økningen av signalet er indikativt på en antatt inhibitor.

De nye variantene av MDR-1 genene tilveiebringer potensialet for utviklingen av en farmakodynamisk profil for legemidler og pro-legemidler for en gitt pasient.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Funnene og karakteriseringen av variantene i MDR-1 genet og diagnostiske tester for å skjelne forskjellige MDR-1 alleler i mennesker, tilveiebringer et svært mektig verktøy for å forbedre behandlingen av sykdommer med medikamenter som er mål for MDR-1 genproduktet, og hvis cellulære opptak derfor er avhengig av MDR-1. Diagnosen av den individuelle alleliske MDR-1 status tillater en mer fokusert behandling, f. eks. ved åpning av muligheten for å anvende individuelle dose-regimer av legemidler. Det kan også være nyttig som prognostisk-verktøy for utbytte av behandling, opplagt en forbedret fremgangsmåte over anvendelse av generell MDR-ekspresjon som prognostisk fremstiller. Dessuten vil diagnostiske tester for å genotype MDR-1 og nye MDR-1 varianter ikke bare forbedre behandlingsetablerte legemidler og hjelpe å korrelere genotyper med legemiddel aktivitet eller bivirkninger. Disse testene og sekvensene tilveiebringer også reagenser til utviklingen av nye inhibitorer som spesifikt modulerer aktiviteten til de individuelle MDR-1 typene. Gjennomførbarheten til å anvende spesifikke inhibitorer av individuelle (artifisielt fremstilte) MDR-varianter og deres potensielle terapeutiske anvendelse, har for eksempel nylig blitt vist i et modellsystem (Mascow I. A. et. al., Blood 94 (1999), 52-61, Dey S. et. aL, Biochemistry 38 (1999), 6630-6639).

Derfor tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en ny måte for å utnytte molekylærbiologi og farmakologisk forskning i legemiddelbehandling, ved omgåelse av deres potensielle skadelige effekter som skyldes ekspresjon av MDR-1 genvarianter.

I sammenheng med foreliggende oppfinnelse anvendes betegnelsen "molekylær variant" MDR-1 gen eller protein heri i betydningen av at nevnte MDR-1 gen eller protein er forskjellig fra villtype MDR-1 genet eller proteinet, (genomisk sekvens til MDR-1 genet er beskrevet for ekson 22: aksesjonsnummer M29441, J05168, AC005068,) gjennom nukleotid substitusjoner), addisjon(er) og/eller delesjon(er). Fortrinnsvis resulterer nevnte nukleotidsubstitusjon(er) i en korresponderende endring i aminosyresekvensen til MDR-1 proteinet.

Betegnelsen "korresponderer" som anvendt heri betyr at en posisjon ikke bare er bestemt av antall forangående henholdsvis nukleotider og aminosyrer. Posisjonen til et gitt nukleotid eller aminosyre i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse som kan deleteres, substitueres eller omfatte en eller flere ekstra nukleotid(er) kan variere på grunn av delesjoner eller ekstra aminosyrer på andre steder i genet eller polypeptidet. Derfor, med en "korresponderende posisjon" i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse skal det forstås at nukleotider eller aminosyrer kan være forskjellige i det angitte tallet, men kan fremdeles ha lignende nabo-nukleotider eller aminosyrer. Nevnte nukleotider eller aminosyrer som kan byttes ut, deleteres eller omfatte ekstra nukleotider eller aminosyrer er også omfattet av betegnelsen "korresponderende posisjon". Nevnte nukleotider eller aminosyrer kan for eksempel sammen med deres naboer danne sekvenser som kan være involvert i reguleringen av genekspresjon, stabilitet av den korresponderende RNA eller RNA redigering, så vel som kode for funksjonelle domener eller motiver til proteinet ifølge oppfinnelsen.

I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, er måte ogpopulasjon-distribusjon av nye, hittil ukjente genetiske variasjoner i MDR-1 genet analysert ved sekvensanalyse av relevante områder av det humane MDR-1 genet fra forskjellige individer. Det er et velkjent faktum at genomisk DNA i individer, som huser den individuelle genetiske sammensetningen av alle gener inkludert MDR-1, enkelt kan renses fra individuelle blodprøver. Disse individuelle DNA-prøvene anvendes så til analyse av selcvenssamniensetningen i MDR-1 genallelene som er tilstede i individet som blodprøven er fra. Sekvensanalysen ble utført med PCR-amplifisering av relevante områder av MDR-1 genet, påfølgende rensing av PCR-produkter, etterfulgt av automatisk DNA-sekvensering med etablerte fremgangsmåter (ABI dyeterminator syklus sekvensering). En viktig parameter som må tas i befraktning i forsøket på å bestemme den individuelle MDR-1 genotype samt påvise nye MDR-1 varianter ved direkte DNA-sekvensering av PCR-produkter fra genomisk DNA i humant blod, er det faktum at hvert menneske har (vanligvis, med svært få abnormale unntak) to genkopier av hvert autosomale gen (diploidi). På grunn av dette, må man vise stor omhyggelighet ved evalueringen av sekvensene, for å være istand til å påvise entydig ikke bare homozygote sekvensvairasjoner, men også heterozygote variasjoner. Detaljene i de forskjellige trinnene i identifiseringen og kai-akteirseringen av nye MDR-1 gen-polymorfismer (homozygote og heterozygote) er beskrevet i eksemplene 1 og 2 nedenfor.

Mutasjonene i MDR-1 genet som er påvist i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse er vist i figur 2 (vist med en pil). Fremgangsmåtene til mutasjonsanalysene fulgte standardprotokoller og er beskrevet i detalj i eksemplene. Stort sett omfatter slike fremgangsmåter som anvendes i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse til evaluering av fenotype-spektrumet, så vel som de overlappende kliniske kjennetegn med andre former for multilegemiddel resistens og endret toleranse for legemidler hos pasienter med mutasjoner i MDR-1 genet, for eksempel haplotype analyse, enkelttråd konformasjons polymorfisme-analyse (SSCA), PCR og direkte sekvensering, se også Mickley (1998) samt referanser som er angitt deri. På grunnlag av grundig klinisk karakterisering av mange pasienter kan fenotypene så korreleres til disse mutasjonene, så vel som til mutasjoner som er beskrevet tidligere.

Det er åpenbart for en fagmann på området at denne nye genetiske kunnskapen nå kan anvendes for nøyaktig å kartlegge genotypen til indekspasienten, når et gitt legemiddel gir en uvanlig virkning, samt av hans familie.

I løpet av de siste 20 årene har genetisk heterogenitet i økende grad blitt erkjent å være en signifikant kilde til variasjon i medikament-respons. Mange vitenskapelige meddelelser (Meyer, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37 (1997), 269-296 og West, J. Clin. Pharmacol. 37 (1997), 635-648) har klart vist at noen legemidler virker bedre eller kan til og med være mer toksiske i noen pasienter enn i andre, og at disse variasjonene i pasienters respons på legemidler kan relateres til molekylær basis. Dette "farmakogenomiske" konseptet oppdager korrelasjoner mellom responser på legemidler og genetiske profiler fra pasienter (Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997), 954-957, Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997), 1249-1252).

I denne sammenheng av populasjon-variabilitet med hensyn til legemiddel-terapi, har farmakogenornikk blitt foreslått som et nyttig verktøy i identifiseringen og seleksjonen av pasienter som kan respondere på et spesielt legemiddel uten bivirkninger. Denne identifiseringen/seleksjonen kan baseres på molekylær diagnose av genetisk polymorfisme ved å genotype DNA fra leukocytter i blodet til pasienten, for eksempel, og kartlegging av sykdom (Bertz, Clin. Pharmacokinet. 32 (1997), 210-256, Engel, J. Chromatogra. B. Biomed. Appl. 678 (1996), 93-103). For drivere av helsevesenet, slik som organisasjoner for helsebevaring i US og myndighetenes offentlige helsetilbud i mange europeiske land, kan denne farmakogenomiske fremgangsmåten representere en måte for både å forbedre helseomsorgen på samt å redusere adrninistrasjonskostnader, fordi det er store kostnader i forbindelse med unødvendige medikamenter, ineffektive medikamenter og medikamenter med bivirkninger.

Mutasjonene i variantene av MDR-1 genet resulterer noen ganger i delesjon(er), inserjon(er) og særlig i substitusjonar) av aminosyrer, enten alene eller i kombinasjon. Det er selvsagt også mulig å fremstille slike mutasjoner genetisk i villtypegener eller andre mutante fonner. Fremgangsmåter for å innføre slike modifiseiinger i DNA-sekvensen til MDR-1 genet er velkjent for en fagmann på området, se f. eks. Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y, I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen koder det ovenfor beskrevne polynukleotidet en variant av MDR-1 proteinet eller et fragment derav, f. eks. som omfatter en eller flere epitoper av aminosyresekvensen som er kodet av SEQ ID NO: 85, 97, 106 eller 274.

For å undersøke egenskapene til endringene i arnhiosyresekvensen til MDR-1 proteinet, kan dataprogram slik som BRASMOL som kan oppnås fra internettet, anvendes. Dessuten kan foldingssimulering og data-redesign av strukturelle motiver utføres ved anvendelse av andre hensiktsmessige dataprogrammer (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299, Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675-679). Datamaskiner kan anvendes til konformasjons og energetisk-analyse av detaljerte proteinmodeller (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012, Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37-45). Disse analysene kan anvendes til identifisering avhmvirkningen av en spesiell mutasjon på binding og/eller transport av legemidler.

Vanligvis skyldes nevnte aminosyredelesjon-, addisjon eller substitusjon i aminosyresekvensen til proteinet som er kodet av polynukleotidet ifølge oppfinnelsen, en eller flere nukleotidsubstitusjoner, insersjoner eller delesjoner eller enhver kombinasjon derav. Fortrinnsvis resulterer nevnte nukleotidsubstitusjon, insersjon eller delesjon i en aminoyresubstitusjon av Asn21 til Asp i ekson 2, Phel03 til Ser eller Leu i ekson 5 og/eller Ser400 til Asn i ekson lii MDR-1 genet.

Polynukleotidet kan videre omfatte minst et nukleotid og valgfri aminosyredelesjon, addisjon og/eller substitusjon, andre enn de som er spesifisert heri over, for eksempel de som er beskrevet i teknikkens stand, f. eks. Mickley (1998). Dette tillater studiet av synergistiske effekter av mutasjonene i MDR-1 genet på den farmakologiske profilen til legemidler i pasienter som bærer slike mutante former av genet eller lignende mutante former som kan etterlignes av de ovenfor beskrevne proteinene. Det er forventet at analysene av nevnte synergistiske effekter tilveiebringer dypere innsikt i inntreden av multilegemiddel-resistens fenotyper i spesielle former for kreft. Fra nevnte dypere innsikt vil utviklingen av diagnostiske og farmasøytiske preparater som er relatert til kreft, nyte svært godt av.

Derfor vil polynukleotider av molekylære varianter av MDR-1 gener, hvori nukleotiddelesjon, addisjon og/eller substitusjon resulterer i endret ekspresjon av MDR-1 genvarianten sammenlignet med det korresponderende villtype-genet.

Polynukleotidet kan være f. eks. DNA, cDNA, genomisk DNA, RNA eller syntetisk fremstilt DNA eller RNA eller et rekombinant fremstilt kimært nukleinsyremolekyl som omfatter hvilket som helst av de av polynukleotidene, enten alene eller i kombinasjon. Fortrinnsvis er nevnte polynukleotid del av en vektor, fortrinnsvis plasmider, cosmider, virus og bakteriofager som anvendes konvensjonelt i genetisk modifisering som omfatter et polynukleotid ifølge oppfinnelsen. Slike vektorer kan omfatte ytterligere gener slik som markørgener som tillater seleksjon av nevnte vektor i en egnet vertscelle og under egnede betingelser.

Polynukleotidet kan være opreativt bundet til ekspresjonskontrollsekvenser som tillater ekspresjon i prokaryote eller eukaryote celler. Ekspresjon av nevnte polynukleotid omfatter transkripsjon av polynukleotidet, fortrinnsvis til translaterbart mRNA. Regulatoriske elementer som sikrer ekspresjon i eukaryote celler, fortrinnsvis pattedyrceller, er velkjente for en fagmann på området. De omfatter vanligvis regulatoriske sekvenser som sikrer initiering av transkripsjon og valgfrie poly-A signaler som sikrer terminering av transkripsjon og stabilisering av transkriptet. Ekstra regulatoriske elementer kan omfatte transkripsjonene så vel som translasjonelle enhancere. Mulige regulatoriske elementer som tillater ekspresjon i prokaryote vertsceller omfatter f. eks. lac, trp eller tac promoteren i E. coli og eksempler på regulatoriske elementer som tillater ekspresjon i eukaryote vertsceller er AOX1 eller GALI promoteren i gjær eller CMV-, SV40-, RSV-promoteren (Rous sarcoma virus), CMV-enhanceren, SV40-enhanceren eller et globin intron i pattedyr og andre dyreceller. Ved siden av elementer som er ansvarlige for initieringen av transkripsjon, kan slike regulatoriske elementer også omfatte translcri<p>sjonstermmerings signaler, slik som SV40-polyA-setet eller tk-polyA-setet, nedstrøms for polynukleotidet. I denne sammenhengen er egnede ekspresjonsvektorer kjent innen fagområdet, slik som Okayama-Berg cDNA ekspresjonsvektor pcDVI (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNAl, pcDNA3 (In-vitrogene), pSPORTl (GIBCO BRL). Foilrinnsvis er nevnte vektor en ekspresjonsvektor og/eller en genoverførings eller målsøkende vektor. Ekspresjonsvektorer som er avledet fra virus slik som retrovirus, vacciniavirus, adenoassosiert virus, herpes virus eller bovint papiUomavirus, kan anvendes til avlevering av polynukleotidene eller vektoren ifølge oppfinnelsen inn i målcellepopulasjoneii. Fremgangsmåter som er velkjente for en fagmann på området, kan anvendes for å konstruere rekombinante virale vektorer, se for eksempel teknikkene som er beskrevet i Sambrook, Molecular Cloning A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory

(1989) N. Y. Og Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates og Wiley Interscience, N. Y. (1994). Alternativt kan polynukleotidene og vektorene ifølge oppfinnelsen rekonstitueres inn i liposomer for avlevering til målceller.

Vertsceller som er transformert med et polynukleotid eller en vektor, kan være en prokaryot eller eukaryot celle, se over. Polynukleotidet eller vektoren som er tilstede i vertscellen kan enten være integrert i genomet til vertscellen eller det kan opprettholdes ekstrakromosomalt. Med hensyn til dette skal det også forstås at det rekombinante DNA-molekylet ifølge oppfinnelsen kan anvendes til "gen målsøking" og/eller "gen-erstatning", for å gjenopprette et mutant gen eller for å lage et mutant gen via homolog rekombinasjon, se for eksempel Moellic, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 87 (1990), 4712-4716, Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Press.

Vertscellen kan være enhver prokaryot eller eukaryot celle, slik som en bakterie, insekt, sopp, plante, dyre eller human celle. Foretrukne soppceller er for eksempel de fra slekten Saccharomyces, spesielt de av arten S. cerevisiae. Betegnelsen "prokaryot" er ment å omfatte alle bakterier som kan transformeres eller transfekteres med et polynukleotid for ekspresjon av isn variant av MDR-1 proteinet eller fragment derav. Prokaryote verter kan inkludere gram negative så vel som gram positive bakterier, slik som for eksempel E. coli, S. t^himurium, Serratia marcescens og Bacillus subtilis. Et polynukleotid som koder for en mutant form av MDR-1 proteinvarianter kan anvendes til å transformere eller transfektere verten, ved å anvende enhver av teknikkene som er allment kjent for en fagmann på området. Fremgangsmåter for å fremstille fuserte, operabelt bundne gener samt å uttrykke dem i bakterier eller dyreceller er velkjent på fagområdet (Sambrook, over). De genetiske konstruksjonene og fremgangsmåtene som er beskrevet deri kan benyttes til ekspresjon av MDR-1 proteinvarianter i f. eks. prokaryote verter. Stort sett anvendes ekspresjonsvektorer som inneholder promotersekvenser som forenkler den effektive transkripsjonen av det innsatte polynukleotidet i forbindelse med verten. Ekspresjonsvektoren inneholder typisk et replikasjonsorigo, en promoter og en terminator, så vel som spesifikke gener som er istand til å gi fenotypisk seleksjon av den transformerte cellen. Den transformerte prokaryote verten kan dyrkes i fermentorer og kultiveres i henhold til teknikker som er velkjent innen fagområdet, for å oppnå optimal cellevekst. Proteinene ifølge oppfinnelsen kan så isoleres fra vekstmediumet, cellulære lysater eller cellulære membranfraksjoner. Isoleringen og rensingen av de mikrobielle eller på annen måte uttrykte polypeptidene ifølge oppfinnelsen kan være på en hver konvensjonell måte, slik som for eksempel preparative kromatografiske separasjoner og immunologiske separasjoner, slik som de som omfatter anvendelsen av monoklonale eller polyklonale antistoffer.

Derfor vil en fremgangsmåte til fremstUling av MDR-1 proteinvarianter og fragmenter derav, omfatte å dyrke en vertcelle slik som definert over under betingelser som tillater ekspresjon av proteinet og gjen vinning av det fremstilte proteinet eller fragmentet fra kulturen.

Fremstilling av celler som er istand til å uttrykke en MDR-1 genvariant som omfatter genetisk fremstilte celler med polynukleotidet eller vektoren ifølge oppfinnelsen er en mulighet. Cellene som kan oppnås, kan for eksempel anvendes for å teste legemidler ifølge fremgangsmåtene som er beskrevet i D. L. Spector, R. D. Goldman, L. A. Leinwand, Cells, a Lab manual, CHS Press 1998. Dessuten kan cellene anvendes for å studere kjente legemidler og ukjente derivater derav, for deres evne til å komplementere legemiddeltransport-manglen som er forårsaket av mutasjoner i MDR-1 genet. I disse utførelsesformene mangler vertscellen fortrinnsvis et villtype-allel, fortrinnsvis begge allelene i MDR-1 genet og/eller har minst en mutert form derav. Alternativt kan sterk overcksprcsjon av et mutert allel over det normale allelet og sammenligning med en rekombinant ceUelinje som overekspresserer det normale allelet på et tilsvarende nivå, anvendes som et sannings og analysesystem. Cellene som kan oppnåes ved de ovenfor-beskrevne fremgangsmåtene, kan også anvendes i screeningsfremgangsmåtene som er referert til heri nedenfor,

En variant av MDR-1 protein eller fragmenter derav som er kodet av et polynukleotid eller som kan oppnåes ved de ovenfor beskrevne fremgangsmåtene eller fra celler som er fremstilt ved fremgangsmåtene som er beskrevet over kan anvendes. I denne sammenhengen skal det også forstås at MDR-1 proteinvariantene kan modifiseres ytterligere ved konvensjonelle fremgangsmåter som er kjent innen fagområdet. Ved å tilveiebringe MDR-1 protein-variantene ifølge foreliggende oppfinnelse er det også mulig å bestemme de delene som er relevante for deres biologiske aktivitet eller inhibering av samme, nemlig deres medikamenttransport-aktivitet.

Antistoffer mot MDR-1 proteinvarianten kan fremstilles ved velkjente fremgangsmåter, ved anvendelse av et renset protein ifølge oppfinnelsen eller et (syntetisk) fragment derivert derfra som et antigen. Monoklonale antistoffer kan fremstilles for eksempel ved teknikker som opprinnelig er beskrevet av Kohler og Milstein, Nature 256 (1975), 495 og Galfré, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3, som omfatter fusjonen av musemyelomceller med miltceller som er avledet fra immuniserte pattedyr. Antistoffene kan være monoklonale antistoffer, polyklonale antistoffer eller syntetiske antistoffer, så vel som fragmenter av antistoffer, slik som Fab, Fv eller scFv fragmenter etc. Dessuten kan antistoffer eller fragmenter derav mot de tidligere nevnte polypeptidene oppnås ved anvendelse av fremgangsmåter som er beskrevet, f. eks. i Harlow og Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Disse antistoffene kan for eksempel anvendes til immunopresipitering og immunolokalisering av varianter av MDR-1 proteinet ifølge oppfinnelsen, så vel som for kontrolleringen av tilstedeværelsen av slike MDR-1 proteinvarianter, for eksempel i rekombinante organismer samt til påvisningen av forbindelser som interagerer med proteinene ifølge oppfinnelsen. For eksempel kan overflate plasmon-resomians som benyttet i BIAcore-systemet, anvendes for å øke effektiviteten til fag-antistoffer som binder til en epitope i proteinet ifølge oppfinnelsen (Schier, human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105, Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).

Nukleinsyremolekyler som representerer eller omfatter den komplementære tråden til hvilken som helst av de ovenfor beskrevne polynukleotidene eller deler derav, som derfor omfatter minst el nukleotid forskjell sammenlignet med det korresponderende villtype MDR-1 genets nukleotidsekvens som er spesifisert av de ovenfor beskrevne nukleotidsubstitusjonene, delesjonene og addisjonenekan anvendes. Et slikt molekyl kan enten være en deoksyribonukleinsyre eller en ribonukleinsyre. Slike molekyler omfatter for eksempel antisens RNA. Disse molekylene kan dessuten være bundet til sekvenser som, når de transkriberes, koder for et ribozym og derved fremstille et ribozym som spesifikt spalter transkripter av polynukleotider ifølge oppfinnelsen. Med variantene av MDR-1 polynukleotidene og proteinene og vektorene, er det nå mulig å studere effektiviteten av legemidler i forhold til spesielle mutasjoner i MDR-1 genet hos en pasient og den berørte fenotypen in vivo og in vitro. Dessuten kan variantene av MDR-1 proteinene anvendes for å bestemme den farmakologiske profilen til legemidler og til påvisningen og fremstillingen av ytterligere legemidler som kan være mer effektive i behandlingen av f. eks. kreft, særlig til forbedringen av visse fenotyper som er forårsaket av de respektive mutasjonene slik som de som er beskrevet over.

I en ytterligere utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å påvise samt å oppnå en MDR-1 inhibitor som er istand til å modulere aktiviteten til en molekylær variant av MDR-1 genet eller dets genprodukt, omfattende trinnene å (a) kontakte varianten av MDR-1 proteinet eller en celle som uttrykker en molekylær variant av MDR-1 genet som omfatter et polynukleotid ifølge oppfinnelsen, i nærvær av komponenter som er istand til å tilveiebringe et detekterbart signal som respons på legemiddel-transport, med en forbindelse som skal screenes under betingelser som tillater MDR-1 mediert legemiddeltransport,

og

(b) påvisning av tilstedeværelsen eller fraværet av et signal eller økning av et signal som er genereres fra legemiddeltransporten, hvori tilstedeværelsen eller økningen av signalet er tegn på en antatt inhibitor.

Betegnelsen "forbindelse" i en fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen inkluderer en enkelt substans eller et flertall av substanser som kan eller ikke kan være identiske. Nevnte forbindelse(r) kan syntetiseres kjemisk eller fremstilles via mikrobiell fermentering, men kan også være omfattet i for eksempel prøver, f. eks. celle-ekstrakter fra f. eks. planter, dyr eller mikroorganismer. Dessuten kan nevnte forbindelser være kjent innen fagområdet, men hertil henholdsvis ikke kjent å være nyttig som en hniibitor. Flertallet av forbindelser kan være f. eks. satt til kulturmediumet eller injisert i en celle eller ikkc-humant dyr ifølge oppfinnelsen. Dersom en prøve som inneholder (a) forbindelse(r) påvises ved fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, er det enten mulig å isolere forbindelsen fra utgangsprøven som ble påvist å inneholde den aktuelle forbindelsen eller man kan dele utgangsprøven videre, for eksempel dersom den består av et flertall av forskjellige forbindelser, for å redusere antallet forskjellige substanser pr. prøve og repetere fremgangsmåten med underinndelingene av utgangsprøven. Det kan bestemmes om nevnte prøve eller forbindelse viser de ønskede egenskapene, for eksempel ved fremgangsmåtene som er beskrevet heri eller i litteraturen (Spector et. al., Cells manual, se over). Avhengig av kompleksiteten til prøvene, kan trinnene som er beskrevet over utføres flere ganger, fortrinnsvis til prøven som er påvist ifølge fremgangsmåten i oppfinnelsen kun omfatter et begrenset antall av eller kun en substans(er). Fortrinnsvis omfatter nevnte prøve substanser av lignende kjemiske og/eller fysiske egenskaper og mest foretrukket er nevnte substanser identiske. Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også enkelt utføres og designes av en fagmann på området, for eksempel i overensstemmelse med andre celle-baserte målinger som er beskrevet i teknikkens stand eller ved å anvende og modifisere fremgangsmåtene som er beskrevet heri. Dessuten vil en fagmann på området lett gjenkjenne hvilke ytterligere forbindelser og/eller enzymer som kan anvendes for å utføre fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen, for eksempel enzymer dersom nødvendig, som omdanner en viss forbindelse til forløperen, som i tur representerer et substrat for MDR-1 proteinet. Slik tilpassning av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er godt innenfor ferdigheten til fagmannen på området og kan gjennomføres uten unødige forsøk.

Forbindelser som kan anvendes inkluderer peptider, proteiner, nukleinsyrer, antistoffer, små organiske forbindelser, ligander, peptidetterlignere, PNAer og lignende. Nevnte forbindelser kan også være funksjonelle derivater eller analoger av kjente legemidler slik som verapamil eller syklosporin. Fremgangsmåter til fremstilling av kjemiske derivater og analoger er velkjente for en fagmann på området, og er for eksempel beskrevet i Beilstein, Handbook og Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N. Y. 10010 USA og Organic Synthesis, Wiley, New York, USA. Dessuten kan nevnte derivater og analoger testes for sine effekter i overensstemmelse med fremgangsmåter som er kjent innen fagområdet eller slik som beskrevet. Dessuten kan peptidetterlignere og/eller data-assistert design av hensiktsmessige legemiddelderivater og analoger anvendes, for eksempel i overensstemmelse med fremgangsmåtene som er beskrevet nedenfor. Slike analoger omfatter molekyler sam har basis-strukturen til kjente MDR-substrater og/cllcr inhibitorer og/eller modulatorer, se nedenfor. Hensiktsmessige dataprogrammer kan anvendes til påvisning av de interaktive setene til en antatt inhibitor og MDR-1 proteinet til oppfinnelsen med data-assisterte søk etter strukturelle motiver (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120). Ytterligere hensiktsmessige datasystemer for data-assistert design av proteiner og peptider er beskrevet i teknikkens stand, for eksempel i Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036, Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sei. 501

(1987), 1-13, Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991. Resultatene som er oppnådd i de ovenfor beskrevne data-analysene kan anvendes sammen med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen til f. eks. å optimalisere kjente inhibitorer. Hensiktsmessige peptidetterlignere og andre inhibitorer kan også påvises ved syntetisering av peptidomimetiske kombinatoriske bibliotek gjennom suksessiv kjemisk modifisering og testing av de resulterende forbindelsene, f. eks. i overensstemmelse med fremgangsmåtene som er beskrevet heri. Fremgangsmåter for generering og anvendelse av peptidomimetiske kombinatoriske biblioteker er beskrevet i teknikkens stand, for eksempel i Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 og Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715. Dessuten kan den tiedimensjonale og/eller krystallstrukturen til inhibitorer og MDR-1 proteinet ifølge oppfinnelsen anvendes i design av peptidomimetiske legemidler (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944, Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).

Oppsummeringsvis tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter til påvisning og oppnåelse av forbindelser som kan anvendes i spesifikke doser til belimidling av spesifikke former for sykdommer, f. eks. ved kjemoterapi av kreft som kompliseres av feilfunksjon i MDR-1 genet, som ofte resulterer i en legemiddelresistens eller sensitiv fenotype.

I en utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte til påvisning og oppnåelse av en MDR-1 inhibitor som er istand til å modulere aktiviteten til en molekylær variant av MDR-1 genet.

I enda en ytterligere utførelsesform angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte til diagnostisering av en forstyrrelse som er relatert til tilstedeværelsen av en molekylær variant av MDR-1 genet eller mottakelighet for en slik forstyrrelse omfattende å (a) bestemme tilstedeværelsen av et polynukleotid ifølge oppfinnelsen i en prøve fra et

hidivid, og/eller

(b) bestemme tilstedeværelsen av en variantform av MDR-1 proteinet, for eksempel

med antistoffet ifølge oppfinnelsen.

I overensstemmelse med denne utførelsesformen av foreliggende oppfinnelse kan fremgangsmåten for å teste statusen av en forstyrrelse eller mottakeligheten for en slik forstyrrelse, skje ved anvendelse av et polynukleotid eller et nukleinsyremolekyl ifølge oppfinnelsen, f. eks. i form av Southern eller Northern blot eller in situ analyse. Nevnte nukleinsyresekvens kan hybridisere til et kodende område for et av genene eller til et ikke-kodende område, f. eks. intron. I tilfellet der en komplementær sekvens benyttes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan nevnte nukleinsyremolekyl igjen anvendes i Northern blots. I tillegg kan nevnte testing gjøres i forbindelse med en aktuell blokkering, f. eks. av transkripsjonen av genet og er derfor forventet å ha terapeutisk betydning. Dessuten kan en primer eller et oligonukleotid også anvendes til å hybridisere til et av de ovenfor nevnte MDR-1 genene eller korresponderende mRNA. Nukleinsyrene som anvendes til hybridisering kan selvsagt være passende merket ved inkorporering eller binding, f, eks. av en radioaktiv eller annen markør. Slike markører er velkjente innen fagområdet. Merkingen av nevnte nukleinsyre molekyler kan skje ved konvensjonelle fremgangsmåter. I tillegg kan tilstedeværelsen eller ekspresjonen av varianter av MDR-1 genene overvåkes ved anvendelse av et primerpar som spesifikt hybridiserer til en av de korresponderende nukleinsyresekvenser og ved å utføre en PCR-reaksjon i samsvar med standard fremgangsmåter. Spesifikk hybridisering av de ovenfor nevnte probene og primerene inntreffer fortrinnsvis ved stringente hybridiseringsbetingelser. Betegnelsen " stringente hybridiseringsbetingelser" er velkjent innen fagområdet, se for eksempel Sambrook et. al. "Molecular Cloiring, A Laboratory Manual", andre utgave, CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989, "Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach", Hames og Higgins eds., JRL Press, Oxford, 1985. Dessuten kan mRNA, cRNA, cDNA eller det genomiske DNA som er oppnådd fra individet, sekvenseres for å påvise mutasjoner som kan være kjennetegnende fingeravtrykk på mutasjoner i MDR-1 genet. Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåter hvori et slikt fingeravtrykk kan genereres av RFLP av DNA eller RNA som er oppnådd fra individet, valgfritt kan DNA eller RNA amplifiseres før analysering ved fremgangsmåter som er velkjente innen fagområdet. RNA fingeravtrykk kan utføres ved for eksempel å fordøye en RNA-prøve fra individet, med et egnet RNA-enzym, for eksempel RNase Ti, RNase T2eller lignende eller et ribozym, og for eksempel elektroforetisk separering og påvisning RNA-fragmentene slik som beskrevet over.

Ytterligere modifiseringer av den ovenfor nevnte utførelsesformen av oppfinnelsen kan enkelt tenkes ut av en fagmann på området, uten noen unødvendige forsøk, fra denne beskrivelsen, se f. eks. eksemplene. En ekstra utførelsesform ifølge foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte hvori nevnte bestemmelse kan skje ved å benytte et antistoff ifølge oppfinnelsen eller fragment derav. Antistoffet som anvendes i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan være merket med detekterbare merkelapper, slik som histidin-flagg eller et biotinmolekyl.

I en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse omfatter de ovenfor beskrevne fremgangsmåtene PCR, ligase kjedereaksjon, restriksjonsfordøying, direkte sekvensering, nukleinsyre amplifiseringsteknikker, hybridiseringsteknikker eller immunomålinger (Sambrook et. al., lok. sit. CSH cloning, Harlow og Lane lok. sit. CSH antibodies).

I en foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er nevnte sykdom kreft.

I denne sammenheng og som anvendt gjennom denne beskrivelsen menes med "funksjonelt'' MDR-1 gen et gen hvori det kodede proteinet har deler av eller hele den primære stnjkturkoiiformasjon til villtype MDR-1 proteinet, dvs. besitte den biologiske egenskapen å mediere legemiddeltransporten gjennom membranen. Denne utførelsesformen av foreliggende oppfinnelse er egnet til behandling av kreft, inflammatoriske sykdommer, neuronale, CNS sykdommer eller kardiovaskulære sykdommer, spesielt i mennesker. Påvisning av ekspresjonen av en variant av MDR-1 genet vil tillate konklusjonen at nevnte ekspresjon er innbyrdes forbundet med genereringen eller opprettholdelsen av en korresponderende fenotype av sykdommen. I overensstemmelse med dette vil det anvendes et trinn for å redusere ekspresjonsnivået til lave nivåer eller avskaffe det samme. Dette kan gjøres for eksempel ved minst delvis elirninering av ekspresjonen av det mutante genet på biologiske måter, for eksempel ved anvendelse av ribozymer, antisens nukleinsyremolekyler, intracellulære antistoffer eller de ovenfor beskrevne inhibitorene mot den variable formen av disse MDR-1 proteinene. Dessuten kan farmasøytiske produkter utvikles som reduserer ekspresjonsnivåene av de korresponderende mutante proteinene og genene.

Det er mulig å fremstille et farmasøytisk preparat som omfatter trinnene til hvilken som helst av de ovenfor beskrevne fremgangsmåtene og syntetisering og/eller formulering av forbindelsen som er påvist i trinn (b) eller et derivat eller homolog derav i en farmasøytisk akseptabel form. De terapeutisk nyttige forbindelsene som påvises i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan formuleres og admiiiistreres til en pasient slik som diskutert over. For at anvendelse og terapeutiske doser skal være riktige, må de bestemmes av en fagmann på området, se nedenfor.

Legemidler eller pro-legemidler metaboliseres etter deres in vivo administrering, for å elimineres enten ved ekskresjon eller ved metabolisme til et eller flere aktive eller inalctive metabolitter (Meyer, J. Pharmacokinet. Biopharm. 24 (1996), 449-459). Derfor, heller enn å anvende den aktuelle forbindelse eller inhibitor som er påvist og oppnådd i overensstemmelse med fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan en korresponderende formulering, slik som et pro-legmiddel, anvendes, som omdannes til sin aktive form i pasienten. Sikkerhetsmålinger som kan tas for anvendelse av pro-legemidler og legemidler er beskrevet i litteraturen, for en oversikt se Ozama, J. Toxicol. Sei. 21 (1996), 323-329).

Inhibitoren som er påvist eller oppnådd ved fremgangsmåten som er beskrevet heri tidligere binder fortrinns veis spesifikt til varianten av MDR-1 proteinet ifølge oppfinnelsen. Antistoffene, nukleinsyremolekylene og inhibitorer har fortrinnsvis en spesifisitet, i det minste vesentlig identisk med bindingdsspesifisiteten til den naturlige liganden eller bmdingspartneren til MDR-1 proteinet ifølge oppfinnelsen. Et antistoff eller inhibitor kan ha en bindingsaffinitet for MDR-1 proteinet ifølge oppfinnelsen på minstIO5M"<1>, fortrinnsvis høyere enn IO7M"<1>og fordelaktig opp til IO<10>M"<1>i tilfelle MDR-1 aktiviteten skulle bli undertrykt.

Dessuten angår foreliggende oppfinnelse anvendelsen av et oligo- eller polynukleotid til påvisning av et polynukleotid og/eller til genotyping av korresponderende individuelle MDR-1 alleler. Fortrinnsvis er nevnte oligo- eller polynukleotid et polynukleotid eller et nukleinsyi-emolekyl ifølge oppfinnelsen som er beskrevet tidligere.

Enkelte genetiske endringer fører til endrede proteinkonformasjoiis tilstander. For eksempel har noen varianter av MDR-1 proteiner en tertiærstruktur som gjør dem mye mindre istand til å lette transport av legemidler. Gjenoppretting av den normale eller regulerte konformasjonen av muterte proteiner er den mest elegante og spesifikke måten å korrigere disse molekylære defektene på, selv om det er vanskelig. Farmakologiske manipulasjoner hjelper derfor i gjenopprettingen av villtype konformasjonen til proteinet. Derfor kan polynukleotidene og de kodede proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse også anvendes for å designe og/eller identifisere molekyler som er istand til å aktivere villtype funksjonen til et MDR-1 gen eller protein.

NukleiiTsvreseksvens som koder for et funksjonelt og ekspresserbart viHtype MDR=1 protein for fremstillingen av et farmasøytisk preparat kan anvendes til behandling, forebygging og/eller forsinke en lidelse som er diagnostisert ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Et gen som koder for et funksjonelt og ekspresserbart MDR-1 protein kan introduseres i cellene, som i tur fremstiller proteinet av interesse. Genterapi som er basert på innføring av terapeutiske gener i celler ved hjelp av ex vivo eller in vivo-teknikker, er en av de viktigste anvendelsene av genoverføring. Egnede vektorer og fremgangsmåter for in vitro eller in vivo genterapi er beskrevet i litteraturen og er kjent for en fagmann på området, se f. eks. Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539, Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919, Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374, Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086, Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716, WO 94/29469, WO 97/00957 eller Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640 og referanser som er henvist til deri. Genet kan designes for direkte innføring eller for innføring via liposomer eller virale vektorer (f. eks. adenoviral, retroviral) inn i cellen. Fortrinnsvis er nevnte celle en stamcelle.

Det er åpenbart fra det ovenstående at i anvendelsen av oppfinnelsen er nukleinsyresekvensen operativt bundet til regulatoriske elementer som tillater ekspresjon og/eller målsøking av MDR-1 proteinet mot spesifikke celler. Egnede gen-leveringssystemer som kan benyttes i overensstemmelse med oppfinnelsen kan inkludere liposomer, reseptor-medierte leveringssystemer, nakent DNA og virale vektorer, slik som herpes virus, retrovirus, adenovirus og adenoassosiert virus blant andre. Levering av nukleinsyrer til et bestemt sted i kroppen for genterapi kan også utføres ved anvendelse av et biolistisk ("biolistic") leveringssystem, slik som det som er beskrevet av Williams (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 88 (1991), 2726-2729). Standard fremgangsmåter for transfektering av celler med rekombinant DNA er velkjent for en fagmann på området molekylærbiologi, se f. eks. WO 94/29469, se også over. Genterapi kan utføres ved direkte å administrere det rekombinante DNA molekylet eller vektoren ifølge oppfinnelsen til en pasient eller ved å transfektere celler med polynukleotidet eller vektoren ifølge oppfinnelsen ex vivo og infusere de transfekterte cellene til pasienten.

Som vist i eksempel 6 og 8 er polymorfismene som er påvist i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, spesielt enkel nukleotid polymorfisme (SNP) C3435T i ekson 26 i MDR-1 genet, nyttige som en farmakogenetisk faktor som muliggjør forutsigelse av blodnivåer av diverse MDR-1 substrater og fremkallere ("inducers") til forbedring av legemiddelsikkerheten og vi rkningsfullheten, dvs. å forutsi og forhindre bivirkninger og legemiddelinteraksjoner samt for å øke pasient funksjon. Slike substrater og indusere er for eksempel antikonvulsante/antiepileptiske medikamenter, slik som Phenytoin, kardiale glykosider slik som Digoxin, immuiiosupressive medikamenter slik som Cyclosporin A og FK506, makroUd-antibiotika, slik som Clarithromycin og Erythromycin og macrosykhsk-antibiotikum, somRifampin. Derfor angår foreliggende oppfinnelse også anvendelsen av de ovenfor beskrevne SNPer som en farmakogenetisk faktor i overensstemmelse med det ovennevnte. Fortrinnsvis er polymorfismen enten kun i MDR-1 ekson 26 (C3435T) eller sammen med hvilken som helst annen SNP slik som de som er beskrevet over.

Ytterligere anvendelse av polymorfismene som er påvist i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse samt midler og fremgangsmåter som kan anvendes i overensstemmelse med de ovenfor beskrevne utførelsesformene, kan finnes i den kjente teknikk, for eksempel som beskrevet i US-A-5 856 104, hvori de der beskrevne midler og fremgangsmåter til rettslig farskapstesting, korrelering av polymorfismer med fenotypiske trekk, genetisk kartlegging av fenotypiske trekk etc. i lik grad kan anvendes i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse.

Disse og andre utførelsesformer er beskrevet eller er åpenbare ut fra og omfattet av beskrivelsen og eksempler i foreliggende oppfinnelse. Ytterligere litteratur som angår en hvilken som helst av fremgangsmåtene, anvendelsene samt forbindelsene som kan benyttes i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, kan innhentes fra offentlige biblioteker, ved anvendelse av for eksempel elektroniske innretninger. For eksempel kan den offentlige databasen "Medline" som er tilgjengelig på internett, benyttes, f. eks. under http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/ PubMed/ medlme. html. Ytterligere databaser og adresser, slik som http:// www. ncbi- nlm-nih-g;ov/- http:// www. infobiogen. fr/, htlpV/ www. fniL. ch/ biology/ research tools. html http:// www. tigr. org/ er kjent for en fa gmann på området og kan også oppnås ved anvendelse av f. eks. http:// www. lycos. com. En oversikt over patentinformasjon i bioteknologi og et overblikk over relevante patentinformasjonskilder som er nyttig i retrospektive søk og for aktuell bevissthet, er gitt i Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

De farmasøytiske og diagnostiske preparatene, anvendelsene, fremgangsmåtene beskrevet heri, kan anvendes i diagnose og behandling av alle slags sykdommer som hittil er ukjent å være beslektet med eller avhengig av MDR-1 genvarianter. Preparatene, fremgangsmåtene og anvendelsene kan ønskelig benyttes i mennesker, selv om beharidling av dyr også er omfattet av fremgangsmåtene og anvendelsene som er beskrevet heri.

Beskrivelse av figurene

Figur 1: Gel av utvalgte PCR-fragmenter, før og etter rensing. Agarose (Appli Chem, Darmstadt) gelelektroforese (1.5 % agarosegel) av MDR-1 PCR-fragmenter før (A) og etter (B) rensetiinnet. M: molekylvekt markører, 1-28: PCR-fragmenter som inneholder sekvensene av eksoner 1-28 i det humane MDR-1 genet, inkludert relevante sekvenser som flankerer disse eksonene.

Figur 2: Eksempler på homozygote og heterozygote MDR-1 alleler. Sekvensene til PCR-fragmenter som inneholder sekvensene til eksonene 1-28 i det humane MDR-1 genet, inkludert relevante sekvenser som flankerer disse eksonene, ble bestemt med automatisk sekvensering ved anvendelse av ABI Dyeterrnrnator teknikker. Heterozygote og homozygote avvik fra den publiserte MDR-1 sekvensen kan påvises direkte i DNA sekvensprofiler. Figur 3: Eksempler på diagnose av homozygote og heterozygote MDR-1 alleler. Agarose (AppliChem, Darmstadt) gelelektroforese (1.5 % Agarosegel) av allel-spesifikke PCR-fragmenter fra ekson 2 (261 bp) og ekson 5 (180 bp). Figur 4: Korrelasjon av ekson 26 SNP med MDR-1 ekspresjon under ikke-induserte forhold. MDR-1 fenotypen (ekspresjon og aktivitet) i 21 frivillige og pasienter ble bestemt med Western blot analyser. Bloklcdiagrammet viser fordelingen av MDR-1 ekspresjon klynget ifølge MDR-1 genotype på det relevante ekson 26 SNP. Genotype-fenotype korrelasjonen har en signifikans på p = 0.056 (N = 21). Figur 5: Korrelasjon av MDR-1 genotype og dioxin opptak in vivo. MDR-1 genotypen i ekson 26 ble analysert i 14 friske frivillige som deltok i en klinisk studie som adresserer blodnivåer av digoxin iløpet av likevekts forhold (Johne et. al. (1999), Clin. Pharmacol. Thr. 66, 338-345). En statistisk signifikant forskjell (p = 0.006, Mann Whitney TJ 2 prøve test) ble funnet i sammenMgningen av maksimum konsentrasjoner (Cmax) av digoxin mellom to grupper av 7 friske frivillige som huser enten T/T eller C/C genotype. Gjennomsnittsforskjellen på 38% i Cmaxkan reflektere viktigheten av genotype på absorpsjonen av digoxin etter oral anvendelse. En 0.25 mg dose ble anvendt ved likevekt av digoxin.

Oppfinnelsen blir nå beskrevet ved referanse til de følgende biologiske eksemplene som kun er illustrerende.

Eksempler

Eksempel 1: Isolering av genomisk DNA fra humant blod, generering og rensing av MDR- 1 genfragmenter

Genomisk DNA ble oppnådd ved standard ionebytte kromatograif-teknikker (Quiagen kit til isolering av genomisk DNA fra blod). Blod fra alle individene som ble testet (frivillige fra Farmakologiavdelingen på Charitee Berlin) ble oppnådd med hensyn til alle rettslige, etiske og medisinske samt byråkratiske krav fra Charitee Clinicum i Berlin, Tyskland.

Spesifikke oligonukleotidprimere, 2 til kvert fragment, ble anvendt for å oppnå bestemte DNA-fragmenter som inneholdt spesifikke deler av det humane MDR-1 genet, ved polymerase kjedereaksjon (PCR). Disse spesifikke oligonukleoitdprimerene ble designet for å binde fil sekvenser oppstrøms og nedstrøms for de ulike eksonene i MDR-1 genet. De resulterende DNA-fragmentene skulle kode ikke bare eksonsekvenser, men også noen intronsekvenser i ekson-intron grensene. Slike intronsekvenser nær eksonene er kjent å være viktige for riktig prosessering og etterfølgende ekspresjon av proteinet som koder for mRNA, en prosess som er kjent som "spleising". Oligonukleotid-primerpar som er optimalisert for hvert av de 28 eksonene i det humane MDR-1 genet, og syntetisert og renset ved affinitetskromatografi (OPC patroner). Sekvensen til hver primer er listet i tabell 1.

Polymerase kjedereaksjoner ble utført ved betingelser som var optimalisert for hvert av fragmentene som dekker de 28 eksonene i det humane MDR-1 genet, så vel som kjernepromoteren og enhancerområdet. PCR ble utført i et reaksjons volum på 25 ul for alle eksonene. 50 ng DNA templater ble satt til standard PCR-buffer inneholdende 1.5 mM MgCl2(Quiagen, Hilden), 50 uM dNTP (Quiagen, Hilden), 25 pMol av hver primer (Metabion, Munchen) og 0.625 TJ Taq polymerase (Quiagen, Hilden). Alle PCRene ble utført på en Perkin Eimer thermocycler (model 9700) med et start denaturermgstrinn på 2 min ved 94<Q>C og 36 amplifiseringssykluser av denaturering 94°C i 45 sek, primer-annealing avhengig av primerens smeltetemperatur (PCR betingelser: A-H) i 45 sek og 45 sek ved 72°C, etterfulgt av en endelig forlengelse på 72°C i 5 rnin. For de enkelte PCR betingelsene A-H ble følgende annealingstemperaturer benyttet: A: 53°C, B: 56°C, C: 55 °C, D: 57.5 °C, E: 58 °C, F: 59 °C, G: 54°C,H: 60 °C.

PCR ble gjennomført i et reaksjons volum på 50 ul for alle fragmentene (promoter og enhancer). 50ng DNA-templat (unntak: 100 ng for promoter-fragmentene 1-3) ble satt til standard PCR-buffer inneholdende 1.5 mM MgCl2(Quiagen, Hilden), 200 uM dNTP (Quiagen, Hilden), 30 pMol av hver av primerene (Metabion, Munchen, unntak: 20 pMol av enhancer-fragment 1) og 1 U Taq polymerase (Quiagen, Hilden). All PCR ble utført på en Perkin Eimer thermocycler (model 9700) med et start denatureringstrinn på 3 min ved 94°C og forskjellige amplifiseringssykluser (30 for promoterfragment 2 + 4 og enhancerfragment 1,31 for promoterfragment 3, 32 for promoterfragment 1 og enhancerfragrnent 2) av denaturering 94°C i 30 sek, primer-anriealing avhengig av primerens smeltetemperatur (PCR betingelser A og B) i 30 sek og 30 sek ved 72°C, etterfulgt av en endelig forlengelse på 72°C i 2 min. For de enkelte PCR betingelsene A og B ble følgende annealingstemperaturer benyttet: A: 58°C, B: 56°C.

De optimale PCR-betingelsene og den resulterende størrelsen på de ønskede og oppnådde fragmentene er listet i tabell 1. Eksempler på de resulterende MDR-1 genfragmenter som ble anvendt i videre analyse av de individuelle genotypene er presentert i figur 1.

De bestemte DNA-fragmentene inneholdende spesifikke deler av det humane MDR-1 genet, ekson-sekvenser så vel som noen intronsekvenser i ekson-intron grensene, ble prosessert for å fjerne ikke-inkorporerte nukleotider og buffer-komponenter som ellers kunne interferere med den etterfølgende bestemmelsen av den individuelle MDR-1 genotypen ved direkte DNA-sekvensering. I denne rensingen ble standard ionebytte kromatograif-teknikker anvendt (Quiagen kit til PCR-fragment rensing). For alle fragmentene ble det oppnådd tilstrekkelige utbytter av rensede fragmenter, egnet til direkte DNA-sekvens analyser. Eksempler på rensede MDR-1 genfragmenter som ble anvendt til direkte sekvensanalyse av de individuelle MDR-1 genotypene, er presentert i figur 1.

Eksempel 2: Identifisering av forskjellige MDR- 1 genalleler ved sekvensbestemmelse i ulike individer

I sekvensanalysen av relevante områder i det humane MDR-1 genet fra mange forskjellige individer, ble PCR-amplifisering av de relevante områdene i MDR-1 genet utført (se tab. 1), og de rensede PCR-produktene deretter sekvensert med etablerte fremgangsmåter (ABI dyeterminator cycle sequencing). En svært viktig parameter som var nødvendig å ta hensyn til ved anvendelse av denne fremgangsmåten, var at alle normale menneske har to kopier av MDR-1 genet. På grunn av denne diploidien (av autosomale gener, og MDR-1 er autosomalt kodet), må man være meget forsiktig ved evalueringen av sekvensene, for å være i stand til å påvise entydig ikke bare homozygote sekvensvariasjoner, men også heterozygote variasjoner. På grunn av det, ble det aldri stolt på kun en bestemt sekvens, men alltid skaffet minst to sekvenser fra hvert bestemte MDR-1 genfragment hos hvert individ, ved å sekvensere begge de motsatte trådene.

I den initielle evalueringen av MDR-1 variasjoner i humane populasjoner, ble sekvensanalyse av de relevante områdene, inkludert alle eksoner, i det humane MDR-1 genet, utført fra genomisk DNA fra 24 forskjellige individer. Dette antallet av individuelle prøver ble så utvidet for utvalgte MDR-1 genfragmenter, hvor noen var analysert fra 127 individer. Sekvensene ble inspisert manuelt for forekomsten av DNA-sekvenser som var avvikende fra de publiserte MDR-1 sekvensene, som er ansett som villtype-sekvenser i alt dette arbeidet. På grunn av at populasjonsgenetikk muliggjør en kalkulering av den forventede frekvensen av homozygote versus heterozygote alleler for et bestemt gen (Hardy Weinberg-formelen, pe2 + 2pq + qe2 = 1), var det mulig å bekrefte den antatte (med formelen) fordelingen av homozygote versus heterozygote alleler og avvik, med funnene i forsøkene. Dette tjener som intern kontroll og bekreftelse på at et påvist sekvens-avvik faktisk representerer et nytt allel.

Flere nye MDR-1 sekvens variasjoner ble oppdaget og eksperimentelt bekreftet ved anvendelse av denne fremgangsmåten som er vist i figur 2. 8 polymorfismer forekommer i intronsekvenser som nært flankerer eksonene 5, 6,12 og 17 (SEQ ID NO: 91, 154 og 160 for ekson5), (SEQ ID NO: 101 og 166 for ekson 6), (SEQ ID NO: 116 for ekson 12) og (SEQ ID NO: 119 og 172 for ekson 17). 7 polymorfismer ble funnet i det kodende området, 2 i ekson 2 og 26 og en hver i eksonene 5,11 og 12 og en i ikke-kodende ekson 1 (henholdsvis SEQ ID NO: 79 og 85 (for ekson 2), 122 og 178 (for ekson 26), 97 (for ekson 5), 106 (for ekson 11), 112 (for ekson 12) og 73 (for ekson 1)). 3 variasjoner resulterer i endring i aminosyresekvensen til MDR-1 proteinet (henholdsvis SEQ ID NO: 85 (for N21D), 97 (for F103S) og 106 (for S400N)). Deres endringer vil endre MDR-1 proteinet. En endring som ikke endrer proteinet er lokalisert direkte foran ATG-translasjonsstart kodonet (SEQ ID NO: 79). Det er velkjent at denne posisjonen er svært viktig for ekspresjonsnivåene av proteiner ved å kontrollere effektiviteten av translasjon. Ytterligere polymorfismer endrer ikke aminosyresammensetningen til MDR-1, men de er allikevel nyttig verktøy i MDR-1 genotyping, fordi hver av disse variasjonene angir et nytt MDR-1 allel. Det er kjent at ekspresjonen av MDR-1 varierer svært i ulike individer, og en meget sannsynlig forklaring på denne variasjonen i ekspresjonsnivåer, er alleliske forskjeller i området som er direkte i og rundt MDR-1 genet. Derfor tjener alle nye og nærmere bestemte MDR-1 alleler som markører ved bestemmelsen av MDR-l-genstatusen i pasienter. Viktigheten av denne MDR-1 genotypingen i diagnose og behandling av sykdommer er velkjent for eksperter på området og det er også forklart i detalj over i det innledende kapittelet.

De eksakte posisjonene og ytterligere detaljer om det nye MDR-1 allelet, inkludert den eksakte nye sekvensen og sekvensawiket samt den homozygote versus heterozygote fordelingen av allelene i populasjonen, er listet i tabell 2. Den forventede frekvensen av homozygoter av variant-allelet ble kalkulert på bakgrunn av Hardy-Weiriberg fordelingen. Den avvikende basen i sekvensen er uthevet og understreket. Figur 2 viser eksempler på oppdagelsen og forekomsten av nye varianter i DNA-prøver fra homozygote eller heterozygote individer.

Eksem pel 3: Fremgan<g>småter til spesifikk påvisning og diagnose av MDR- 1 alleler Fremgangsmåter til påvisning av ulike MDR-1 alleler som er identifisert, utnytter prinsippet at spesifikke sekvensforskjeller kan translateres til reagenser for allel-differensiering. Disse reagensene tilveiebringer den nødvendige ryggraden for utviklingen av diagnostiske tester. Eksempler på slike reagenser inkluderer, men er ikke begrenset til oligonukleotider som avviker fra villtype MDR-1 sekvensen i den nylig identifiserte base-substitusjonen. Ofte inkluderer prinsippene i diagnostiske tester for bestemmelse av den individuelle MDR-1 genstatusen, men er ikke begrenset til, forskjeller i hybridiseringseffektivitet av slike reagenser til de ulike MDR-1 allelene. I tillegg kan forskjeller i styrken av slike reagenser i, eller som forskjellige substrater for, enzymatiske reaksjoner, f. eks. ligaser eller polymeraser eller restriksjonsenzymer, anvendes. Prinsippene i disse testene er velkjente for eksperter på området. Eksempler er PCR- og LCR-tekirikker, Chip-hybridiseringer eller MALDI-TOF analyser. Slike teknikker er beskrevet i teknikkens stand, f. eks. PCR-telcnikk: Newton, (1994) PCR, BIOS Scientific Publishers, Oxford, LCR-teknikk: Sliimer, Ligase chain reaction. Methods Mol. Biol. 46 (1995), 269-278, Chip hybridization, Ramsay, DNA chips: State-of-the-art. Nature Biotechnology 16 (1998), 40-44 og MALDI-TOF analyse: Ross, High level multiplex genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry, Nature Biotechnology 16 (1998), 1347-1351. Andre testprinsipper er basert på anvendelsen av reagenser som spesifikt gjenkjenner MDR-1 varianten som translatert, ekspresser! protein. Eksempler er allel-spesifikke antistoffer, peptider, substratanaloger, inhibitorer eller andre substanser som binder til (og i noen tilfeller kan også modifisere vir kningen av) de ulike MDR-1 proteinformene som er kodet av de nye MDR-1 allelene. Eksemplene som er tilstede her for å demonstrere prinsippene i diagnostiske tester med reagenser, som er avledet fra de nye nukleotidsubstitusjonene definert i denne søknaden, er basert på PCR-fremgangsmåter. Det er åpenbart at ved å anvende de beskrevne spesifikke reagensene, vil en hvilken som helst av de andre fremgangsmåtene også fungere til differensieringen av MDR-1 alleler.

Eksempel 4: Diagnose av MDR- 1 alleler med spesifikk PCR

Allel-spesifikk PCR er en teknikk som er velkjent for eksperter på området og som muliggjør differensieringen av alleler i gener ved anvendelse av polymerase kjedereaksjonen med reagenser (primer kombinasjoner) som er spesifikt designet for påvisningen av enkelt allel-sekvenser. Hovedkomponenten i slike tester og den eneste reagensen som tilveiebringer spesifisiteten i slike tester, er oligonukleotider som er designet til å inneholde sekvenser som spesifikt skjeiner forskjellige alleler i gener.

I dette eksemplet ble spesifikke oligonukleotider som kan skille forskjellige MDR-1 alleler på grunn av deres differensierte hybridiseringsstyrke til forskjellige alleler designet, og på grunn av deres varierende evne til å tjene som substrater for enzymreaksjoner (enzymet i dette eksemplet er en termostabil polymerase). Reagensene som ble spesifikt designet og istand til å påvise tilstedeværelsen og/eller fraværet av nylig definerte mdr-1 alleler i individuelle mennesker er listet som spesifikke primer kombinasjoner for hver nye allel i tabell 3. Designet til disse reagensene baserer seg på de nylig oppdagede nukleotidsekvensene og basesubstitusjonene i det humane MDR-1 genet, som er presentert i eksempel 2 og listet i tabell 2 og i figur 2.1 tillegg til designet av spesifikke reagenser, trenger diagnostiske tester som er basert på prinsippet til polymerase kjedereaksjon, optimalisering av testforhold, dvs. optimaliserte PCR-forhold. Resultatet av test er i dette tilfellet gitt som tilstedeværelse eller fravær av spesifikke DNA-fragmenter som er oppnådd ved anvendelse av genomisk DNA fra individuelle mennesker som testbar bestanddel (templat). Fremstillingen av genomisk DNA fra blodet til individer er beskrevet i eksempel 1.

PCR ble utført i et reaksjonsvolum på 20 ul for alle fragmentene. 50 ng DNA templat ble satt til standard PCR-buffer (Quiagen, Hilden) inneholdende 1.5 mM MgCl2,250 uM dNTP (Quiagen, Hilden), 1 x Q-løsning (Quiagen, Hilden), 20 pMol av hver primer

■(Metabion, Munchen, spesifikk wt-primer+vanlig primer og spesifikk mut-primer+ vanlig primer) og 1 U Taq polymerase (Quiagen, Hilden). Alle PCRene ble utført på en Perkin Eimer thermocycler (model 9700) med et start demturermgstrinn på 3 min ved 95°C og 30 amplifiseringssykluser av denaturering 94°C i 30 sek, primer-annealing avhengig av primerens smeltetemperatur (PCR betingelser: A-E) i 30 sek og 30 sek ved 72°C, etterfulgt av en endelig forlengelse på 72°C i 8 min. For de enkelte PCR betingelsene A-E, ble følgende annealingstemperaturer benyttet: A: 54°C, B: 58°C, C: 50°C,D: 61°C,E: 53 °C.

Den avvikende basen i de respektive spesifikke primerene er streket under og skrevet med tykk skrift. Tilstedeværelsen eller fraværet av spesifikke DNA-fragmenter i denne målingen translateres i nærvær eller fravær av det testede allelet.

Eksempler på slike tegn som resultater av påvisningen av MDR-1 allelet, er vist i figur 3. Det er åpenbart fra disse eksemplene (tab. 3, fig. 3) at disse testene er egnet for å differensiere tilstedeværelsen av de analyserte MDR-1 allelene i mennesker. Homozygote så vel som heterozygote, hyppige så vel som sjeldne alleler av MDR-1 genet kan påvises. Spesifisiteten til disse testene stoler utelukkende og avhenger fullstendig av de spesifikke oligonukleotid-reagensene som ble anvendt. Designet av disse reagensene var i tur avhengig av sekvensinformasjonen til dé oppdagede MDR-1 variantene og nye alleler som er tilstede i eksempel 2 og tabell 2.

Eksempel 5: Diagnose og korrelasjon av forskjellige MDR- 1 polymorfismer med ekspresionsnivåer og in vivo aktivitet av MDR- 1 i pasienter

For å påvise potensiell direkte korrelasjon av MDR-1 polymorfisme med klinisk relevante fenotyper i mennesker, ble proband fra en studie på Dr. Margarete Fischer-Bosch-Instituttet for klinisk farmakologi i Stuttgart underlagt bestemmelse av MDR-1 polymorfisme, slik som beskrevet i eksemplene 2-4. Ekspresjonsnivåene av MDR-1 i tarmen og i leveren hos disse pasientene ble også estimert med etablert irnmmiohistokjemisk-påvisning av MDR-1 proteinet. I proband-populasjonen ble, i tillegg til målinger av ekspresjonsnivåene til MDR-1 i tarmen, målinger av MDR-1 ved induksjon av genet med rifampicin utført. In vjvo-aktiviteten til MDR-1 under ikke-induserte og rifampicin-induserte forhold ble også bestemt ved måling av blodkonsentrasjonene av oralt administrert digoxin (1 mg), som er et kjent MDR-1 substrat, og hvis blodkonsentrasjon også avhenger av MDR-1 aktiviteten i tarmen.

Resultatene av MDR-1 målingene, rifampicin-induksjons forsøkene og digoxin-forsøkene, så vel som resultatene fra MDR-1 polymorfisme påvisnings-analysen i proband-populasjonen, viser korrelasjoner mellom MDR-1 genekspresjon og MDR-1 in vtvo-aktivitet med visse polymorfismer.

MDR- 1 protein- nivåer:

Som vist i tabell 4, korrelerer en T/C polymorfisme i posisjon 176 i Acc.#M29445/J05168 i ekson 26 med ekspresjonsnivåene til MDR-1. Tilstedeværelse av T-allelet i denne posisjonen indikerer svakere MDR-1 ekspresjonsnivåer sammenlignet med prøver som kun har det korresponderende homozygote C-allelet. Middelverdien til de rifampicin-induserte MDR-1 nivåene for C-allel populasjonen er mye høyere enn den for T-populasjonen (924 vs 587 relative enheter). I fullstendig overensstemmelse med dette, har et proband som er homozygot for T-allelet, det laveste påviselige ikke-induserte og induserte MDR-1 nivå, mens et proband som er homozygot for C-allelet viser det høyeste nivået av alle proband som er testet. Forskjellen på indusert MDR-1 ekspresjonsnivåer mellom disse individene var 9-ganger.

MDR- 1 in Vfvo- aktivitet:

Tabell 5 viser resultatene av målingene av in wvo-aktiviteten til MDR-1 under ikke-induserte og rifampicin-induserte betingelser. Dette ble gjort ved å måle blodkonsentrasjonene av oralt administrert digoxin, som er et kjent MDR-1 substrat, og hvis blodkonsentrasjon også avhenger av MDR-1 aktiviteten i tarmen. I overensstemmelse med observasjonen at polymorfismen i posisjon 176 i Acc.#M29445/J05168 i ekson 26 korrelerer T/C med ekspresjonsnivåene av MDR-1, ble en korrelasjon av denne polymorfismen observert med digoxin blodnivåer, som i tur reflekterer MDR-1 proteinaktiviteten in vivo. Proband som innehar T-allelet (korrelerer med svakere MDR-1 ekspresjon, se tabell 4), inneholder høyere blodnivåer av digoxin sammenlignet med prøver som kun har det korresponderende homozygote C-allelet. Grunnen til det er at opptaket av MDR-1 substrater, slik som digoxin, fra tarmen til blodet synes å være mer effektivt i mennesker med lavere MDR-1 ekspresjon. Dette er fullstendig i samsvar med funksjonen til MDR-1 i tarmen, dvs. retransport og eliminering av substrater fra de opptakende cellene inn i lumen i tarmen. Gjennomsnittsvei-dien av de ikke-induserte, så vel som rifampicin-induserte digoxin konsentrasjonene i blodet (korrelerer inverst med MDR-1-aktiviteten) i C-allel-populasjonen er konsekvent lavere enn de i T-populasjonen (63.9 vs 44.9 og 45 vs 28.6 Dig AUC-indusert). I fullstendig overensstemmelse med dette, hadde et proband med det homozygote T-allelet den høyeste påviselige digoxin konsentrasjonen i blodet etter rifampichi-induksjon (57.3 Dig. AUC), og et proband som var homozygot for C-allelet viste det laveste nivået av alle proband (12.3 Dig. AUC). Forskjellen i digoxin blodnivåer mellom disse individene var mer enn 4-ganger.

MDR- 1 i en pasientpopulasjon:

Resultatene av våre analyser av korrelasjonen av MDR-1 ekspresjonsnivåer, MDR-1 proteinaktivitet og MDR-1 polymorfisme påvisningsanalyse, er ytterligere styrket av analysen av MDR-1 ekspresjon og MDR-1 genotyping av ulike pasienter fra Dr. Margarete Fischer-Bosch-fnstituttet for klinisk farmakologi i Stuttgart. Immunohistologi ble utført på vevsprøver fra ulike pasient, særlig fra tarm og lever, og de ble sammenlignet med hverandre for å ta hensyn til en relativ sammenligning av MDR-proteinet mellom disse prøvene. Innen hver sett av forsøk, ble pasient-prøvene ranket etter deres MDR-1 farge-intensitet, dvs. første rankingen tilsvarer den høyeste MDR-intensiteten og siste rankingen den laveste MDR-1 intensiteten.

Korreleringen av denne ranking-analysen med MDR-1 genotypen viser at T-allelet i polymorfismen i posisjon 176 i Acc.#M29445/J05168 i ekson 26 korrelerer med lavere ekspresjon av MDR-1 genet når det sammenlignes med pasienter som homozygot bærer C-allelet i denne posisjonen. I denne analysen viste to andre polymorfismer noe korrelasjon med MDR-1 ekspresjon: En homozygot T-genotype i posisjon 171466 i AC002457 (intron 4) kan korrelere med høy ekspresjon, og en polymorfisme (GA) i posisjon 101 i ekson 11 (M29432(J05168) kan korrelere med lav ekspresjon.

Eksempel 6: Vurdering av genotype/ fenotype korrelasjonen i ekson 26 CC3435T) polymorfisme med utvidet prøveantall

For ytterligere å vurdere korrelasjonen av enkel nukleotid polymorfisme (SNP) T/C i posisjon 176 i Acc.#M29445/J05168 som er beskrevet i de foregående eksemplene og nå også referert til som MDR-1 ekson 26 SNP C3435T (posisjonene korresponderer til MDR-1 cDNA GenBank aksesjonsnummer AFOl6535, kodonTTC ekson 10, F335, mangler i den sekvensen), med den første basen i ATG start-kodonet satt til 1), med nivåene av tarm MDR-1 ekspresjon (første resultater er vist i eksempel 5), ble ekstra frivilhge, i et videre forsøk på Dr. Margarete Fischer-Bosch-Instituttet for klinisk farmakologi i Stuttgart, analysert. Ekspresjonsnivåene av MDR-1 i tarmen til disse frivillige og pasienter ble bestemt ved kvantitativ immunohistokjemi og Western blot av biopsier og enterocytt-preparater fra tolvfingertarmen. For å forsikre at denne analysen reflekterer den spesifikke PGP-ekspresjonen i tarmenterocytter, ble et ekstra markørprotein som uttrykkes i enterocytter, villin, analysert samtidig. Resultatene fra denne analysen er vist i figur 4. T/T genotypen er assosiert med signifikant lavere MDR= 1 ekspresj onsnivåer sammenlignet med C/C genotypen. Individer med en C/T genotype viser en mellomliggende fenotype.

For en ytterligere vurdering av korrelasjonen av MDR-1 genotype med digoxin-opptak

i tarmen, ble ekstra frivillige fra en annen klinisk studie på Charite-universitetets medisinske senter i Berlin, som adresserer digoxin-blodnivåer etter oral anvendelse (uten rifampicin-induksjon og PGP-proteinbestemmelse, Johne et. al. (1999), Clin. Pharmacol. Thr. 66, 338-345), evaluert for deres MDR-1 genotype i ekson 26.1 dette studiet, ble maksimum plasma konsentrasjoner (Cmax) evaluert iløpet av likevekts-

betingelser for digoxin. Denne farmakokinetiske parameteren avslører særlig forskjeller i absorpsjonen av digoxin mellom de forskjellige gruppene. Figur 5 viser en sammenligning av digoxin Cmaxfra 7 frivillige som homozygot bar T/T allelet og 7 frivillige med den homozygote C/C genotypen i ekson 26. Frivillige som er homozygote for T-allelet, viser signifikant høyere nivåer av digoxin sammenlignet med frivillige med en C/C genotype. Gjennomsnittsforskjellen på 38% i digoxin CmBxmellom gruppene er statistisk signifikant (p = 0.006, Mann Whitney U 2 prøve test) og reflekterer virkningen av denne polymorfismen på digoxin farmakokinetikk.

Eksempel 7: Påvisning av nye MDR- 1 polymorfismer ved sekvensanalyse av en stor samling av ulike individer

Et utvidet søk etter SNP i det humane MDR-1 genet avslørte i tillegg til de forskjellige nye MDR-1 polymorfismene, mange ytterligere nye polymorfismer i MDR-1 genet som er listet i tabell 8. Innen det nye screenet ble antallet utvidet for alle MDR-1 eksonene, så vel som for MDR-1 promoter-fragmentene, hvor noen er analysert fra 236 individer.

Det er mulig at i tillegg til MDR-1 ekson 26 (C3435T) SNP som kan anvendes for å forutsi PGP-ekspresjon, andre mer sjeldne polymorfismer i områder av MDR-1 genet også har noe påvirkning på ekspresjon. F. eks. promoter polymorfismer og protein som endrer SNPer har sannsynligvis en tilleggs effekt på MDR-1 ekspresjon og aktivitet. Dessuten kan alle disse nye polymorfismene nyttes for å generere en eksakt individuell MDR-1 genotype - dvs. allel sammensetning - som kan være unike for et individ og derfor veldig nyttige for å forutsi individuell MDR-1 avhengig medikament respons.

Jo flere polymorfismer som er kjent i det humane MDR-1 genet, desto mer fullstendige og derfor mer nyttig vil en individuell MDR-1 genotype beskrivelse være. Identifiseringen av disse 32 nye MDR-1 polymorfismene er et ytterligere viktig steg mot å oppnå målet om å etablere mange forskjellige MDR-1 genotyper som forutsier utbytte og bivirkninger av medikament terapi.

Eksempel 8: Bestemmelse av MDR- 1 ekson 26 ( C3435T) polymorfisme som en farmakogenetisk faktor som påvirker medikamentaivåer sammen med andre farmakogenetiske faktorer

Det antikonvulsive legmidlet Phenytoin er vanlig å anvende i behandling av epilepsi, akutt og kronisk undertrykking av ventrikulær arythmi og i digitalis intoksikering. Det smale terapeutiske området med et antall alvorlige bivirkninger sammen med en ikke-lineær farmakokinetikk (dvs. overproporsjonal økning av plasmanivåer som respons på forhøying av dosen), gjør Phenytoin-behandring utfordrende, og egnede parametere for å forutsi plasmanivåer ut fra en gitt dose, svært ønsket for å forbedre terapeutisk utbytte samt å forhindre bivirkninger.

Det er kjent at de polymorfe enzymene 2C9 og 2C19 har en effekt på metabolisme av Phenytoin (Mamiya et. al. 1998, Epilepsia Dec, 39 (12): 1317-23) og det er vist at 2C9 defekter kan føre til abnormale blodnivåer som kan forårsake bivirkninger eller virkningsløshet av legemidler (Aynacioglu et. al. 1999, Br. J. Clin. Pharmacol. Sep; 48 (3): 409-15). Det er imidlertid også klart at 2C9 genotyping ikke tillater å lage eksakte forutsigelser av blodnivåene fra gitte doser. Til og med i 2C9 genotypede individer som er kompensert for den respektive enzym-genotypen, varierer blodnivåene signifikant.

Tabell 6 viser at MDR-1 ekson 26 (C3435T) SNP spiller - i tillegg til 2C9 - en klar rolle i phenytoin-blodnivåer, og MDR-1 genotyping for denne SNP tillater en mer nøyaktig korrelering mellom phenytoin-dose, genotype og blodnivåer.

Innen 2C9/19 enzym genotypede grupper kan variasjon av nivåer forklares med MDR-1 genotypen, spesielt i gruppene av 2C9/C19 dårlige metabolitter, som allerede viser økte blodnivåer. Her er MDR-1 genotyping istand til å påvise en undergruppe av pasienter som har økt risiko for å utvise ekstraordinære høye phenytoin blodnivåer: dårlige metaboliserere som har MDR-1 T/T genotypen. Disse pasientene har en økt risiko for å treffe på overdose relaterte skadelige effekter av legemidler. For eksempel innen en gruppe på 100 pasienter som fikk phenytoin, viste en 2C9 manglende pasient med lav PGP (T/T) genotype, den høyeste blodkonsentrasjonen, som hadde økt omkring 2 ganger sammenlignet med den "normale" populasjonen. Korrelasjonen mellom Cyp 2C9 genotype og Phenytoin plasmanivåer er statistisk signifikant, men signifikansen øker ved å ta MDR-1 T/T genotypen i betraktning som en kovariant (p < 0.001,

ANCOVA).

Claims

1. Fremgangsmåte for diagnostisering av en ervervet multiresistens eller multisensitivitet relatert til tilstedeværelse av en molekylær variant av MDR-1 genet,karakterisert vedat den omfatter å bestemme tilstedeværelsen, i en prøve fra et individ, av et polynukleotid valgt fra gruppen bestående av: (a) et polynukleotid som har nukleinsyresekvensen ifølge SEQ ID NO 122; (b) et polynukleotid som koder for en molekylær multiresistens (MDR)-1 polypeptidvariant, hvor nevnte polynukleotid har en polynukleotid utbytting i en posisjon som korresponderer til posisjon 176 i ekson 26 i MDR-1 genet (aksesjonsnummer M29445 eller J05168); (c) et polynukleotid som koder for en molekylær MDR)-1 polypeptidvariant, hvor nevnte polynukleotid har en T i en posisjon som korresponderer til posisjon 176 i ekson 26 i MDR-1 genet (aksesjonsnummer M29445 eller J05168); og (d) et nukelinsyremolekyl som er komplementær til polynukleotidet ifølge (a) til (c); hvori tilstedeværelsen av nevnte polynukelotid er ansett å indikere nevnte, ervervede multiresistens eller multisensitivitet i nevnte fremgangsmåte.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nukleotidsubstitusjonen resulterer i endret ekspresjon av MDR-1 gen varianten sammenlignet med det korresponderende villtype genet.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisertv e d at nevnte ervervede multiresistens er i tumorer og andre sykdommer hvor terapi avhenger av medikament behandling.

4. Fremgangsmåte for diagnostisering av en lidelse relatert til tilstedeværelse av en MDR-1 genvariant eller motakelighet for en slik lidelse,karakterisertv e d at den omfatter å bestemme, i en prøve fra et individ, tilstedeværelse av et polynukleotid som definert i krav 1.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisert vedat nevnte lidelse er kreft.

6. Fremgangsmåte ifølge hvilket som helst av kravene 1-5,karakterisert vedat den omfatter PCR, ligase kjedereaksjon, restriksjonsfordøying, direkte sekvensering, nukleinsyreamplifiserings-teknikker, hybridiseringsteknikker eller immunoanalyser.

7. In vitro anvendelse av et oligo- eller polynukleotid for diagnostisering av en ervervet multiresistens eller multisensitivitet relatert til tilstedeværelse av en molekylær variant av MDR-1 genet, som omfatter å bestemme tilstedeværelsen, i en prøve fra et individ, av et polynukleotid valgt fra gruppen bestående av: (a) et polynukleotid som har nukleinsyresekvensen ifølge SEQ ID NO 122; (b) et polynukleotid som koder for en molekylær multiresistens (MDR)-1 polypeptidvariant, hvor nevnte polynukleotid har en polynukleotid utbytting i en posisjon som korresponderer til posisjon 176 i ekson 26 i MDR-1 genet (aksesjonsnummer M29445 eller J05168); (c) et polynukleotid som koder for en molekylær MDR)-1 polypeptidvariant, hvor nevnte polynukleotid har en T i en posisjon som korresponderer til posisjon 176 i ekson 26 i MDR-1 genet (aksesjonsnummer M29445 eller J05168); og (d) et nukelinsyremolekyl som er komplementær til polynukleotidet ifølge (a) til (c); hvori tilstedeværelsen av nevnte polynukelotid er ansett å indikere nevnte, ervervede multiresistens eller multisensitivitet i nevnte anvendelse.

8. Diagnostisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter polynukleotidene som definert i krav 1 eller oligo- eller polynukleotidene definert i krav 7.

9. Anvendelse av MDR-1 genets enkel nukleotid polymorfisme som definert i krav l(a) eller (c), som en farmakogenetisk faktor, for fremstilling av en diagnostisk sammensetning for beregning av blodnivåer av et MDR-1 substrat og/eller induser for forbedring av legemiddelsikkerhet og effektivitet, for å forutsi og forhindre bivirkninger og legemiddelinteraksjoner og/eller for å øke pasientmedgjørlighet.

10. Anvendelse ifølge krav 9, hvori substratet og/eller induseren er valgt fra anticonvulsiva/antiepileptiske legemidler, kardiale glykosider, immunosuppressive medikamenter, markolid-antibiotika eller makrosykliske anitbiotika.

11. Fremgangsmåte for å identifisere og oppnå en MDR-1 inhibitor som er istand til å modulere aktiviteten til en molekylær variant av MDR-1 genet,karakterisert vedat den omfatter trinnene med å (a) bringe en celle som utrykker en molekylær variant av MDR-1 genet, som omfatter et polynukleotid som definert i krav 1, i nærvær av komponenter som er istand til å tilveiebringe et detekterbart signal som respons på legemiddeltransport, i kontakt med en forbindelse som skal screenes under betingelse som tillater MDR-1 mediert legemiddeltransport, og (b) detektere tilstedeværelse eller fravær av et signal eller økning av et signal som er generert av legemiddeltransporten, hvori tilstedeværelsen eller økningen av signalet er indikativt på en antatt inhibitor.