ES2397345T3 - Método para detectar polimorfismos en el gen de la ABCB1 asociados con una falta de respuesta a un medicamento activo en el SNC y medicamento que comprende un agente inhibidor de la ABCB1 para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el SNC - Google Patents

Método para detectar polimorfismos en el gen de la ABCB1 asociados con una falta de respuesta a un medicamento activo en el SNC y medicamento que comprende un agente inhibidor de la ABCB1 para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el SNC Download PDF

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Abstract

Un método in vitro para determinar el pronóstico de una respuesta clínica en un paciente humano a unmedicamento activo en el sistema nervioso central (SNC) que es un substrato de la proteína ABCB1, en el que sedetermina la presencia de por lo menos un polimorfismo en el gen de la ABCB1 de dicho paciente, en el que dichopolimorfismo está asociado con una respuesta clínica retrasada, parcial, sub-óptima o ausente a dichomedicamento, en el que el polimorfismo está situado dentro del exón 29, del intrón 5, 13, 21, 22 o 23 o de lasecuencia 3'UTR del gen de la ABCB1 humana.

Description

Método para detectar polimorfismos en el gen de la ABCB1 asociados con una falta de respuesta a un medicamento activo en el SNC y medicamento que comprende un agente inhibidor de la ABCB1 para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el SNC
El presente invento se refiere a unos métodos para determinar el pronóstico de una respuesta clínica en un paciente humano a un medicamento que actúa en el sistema nervioso central (SNC, acrónimo de central nervous system) y que es un substrato de la proteína ABCB1. Además, el invento se refiere a una composición terapéutica y a un estuche terapéutico destinado a usarse en el tratamiento de pacientes humanos que tienen unos polimorfismos específicos en el gen de la ABCB1.
La depresión es un trastorno médico muy corriente, con prevalencias durante toda una vida de hasta 14 %, afectando de esta manera a millones de personas por todo el mundo. Mientras que los antidepresivos constituyen el tratamiento más efectivo para trastornos depresivos, todavía hay una necesidad sustancial de mejoramiento de la terapia. Hasta ahora, no hay criterios objetivos para la elección del tratamiento óptimo con antidepresivos para un paciente individual. Los pacientes deprimidos son tratados por lo tanto sobre una base de tanteo, dando como resultado una tasa de fallo de un único intento de tratamiento en hasta un 30-40 %, incluso en la presencia de unos niveles en plasma suficientemente altos 1. Sin embargo, unos niveles de fármacos en plasma, que se consideran como que incitan una respuesta clínica pueden, sin embargo, no traducirse en unos adecuados niveles intracerebrales de fármacos en todos los pacientes a causa de unas actividades de moléculas transportadoras expresadas junto a la membrana luminal de las células endoteliales que revisten a los pequeños capilares sanguíneos que forman la barrera hematoencefálica. Una de las moléculas más estudiadas de esta última clase es una glicoproteína p 2,3. Una glicoproteína p es un miembro de la superfamilia altamente conservada de proteínas transportadoras 4 de una casete de fijación de ATP (ABC). En seres humanos, esta glicoproteína p de 170 kDa es codificada en el cromosoma 7 por el gen de la ABCB1, también conocido como el gen de resistencia a múltiples fármacos (MDR1, acrónimo de multidrug resistance 1) 5,6. Esta proteína de membrana plasmática transporta activamente sus substratos frente a un gradiente de concentraciones. Una glicoproteína p actúa como una bomba de eflujo activa para compuestos xenobióticos, así como para substratos endógenos tales como algunos esteroides 7,8.
Se encontró que la proteína ABCB1 está implicada en la asimilación de citalopram y trimipramina dentro del cerebro de ratones. Se especuló sobre que unas diferencias interindividuales en la actividad del gen de la ABCB1 puede responder en parte de la gran variación en la respuesta clínica a antidepresivos en pacientes psiquiátricos, incluso con unos comparables niveles en plasma 26. Sin embargo, no hay ninguna sugerencia de que existan en el gen de la ABCB1 unos polimorfismos que están asociados con una falta de respuesta clínica a ciertos medicamentos. Un estudio adicional mostró una diferente intensificación de la penetración de los antidepresivos doxepina, venlafaxina y paroxetina en el cerebro de ratones con una mutación de supresión de la respuesta inmune (knockout) abcb1ab 29. Sin embargo, no se describen unos polimorfismos en el gen de la ABCB1 con una respuesta clínica a ciertos medicamentos.
Una investigación de polimorfismos en el gen de la ABCB1 y de una manía inducida por antidepresivos mostró que no había ninguna asociación entre una manía inducida por antidepresivos y unos alelos o genotipos de la ABCB1 30. Parece ser que estos resultados indican que unos polimorfismos en el gen de la ABCB1 no tienen importancia clínica. Además, un reciente artículo recopilativo indica que los efectos anteriormente informados de los polimorfismos en el gen de la ABCB1 han resultado ser inconsistentes y en algunos casos conflictivos 31.
El documento de solicitud de patente internacional WO 01/09183 describe unos polimorfismos en el gen de la ABCB1 humana destinados a su uso en ensayos de diagnóstico con el fin de mejorar una terapia con fármacos consagrados y ayudar a correlacionar unos genotipos con la actividad de un fármaco y efectos colaterales del mismo. Este documento no describe unos polimorfismos asociados con la respuesta clínica a antidepresivos. El documento de solicitud de patente de los EE.UU. US 2001/0034023 se refiere generalmente a unos métodos para identificar unas variaciones de secuencias en diferentes genes con el fin de averiguar la eficacia y la seguridad de unas terapias médicas. Aunque se mencionan unos SNPs en el gen de la ABCB1, no existe ninguna evidencia de polimorfismos específicos que estén asociados con la respuesta clínica a antidepresivos.
Por lo tanto, hasta ahora, no se han identificado en el gen de la ABCB1 unos polimorfismos que tengan una asociación manifiesta y significativa con la respuesta clínica a ciertos medicamentos que actúan en el sistema nervioso central y que son substratos para la proteína ABCB1.
En este estudio se ensayó si tres antidepresivos corrientemente usados son substratos de una glicoproteína p, usando unos ratones transgénicos que carecen de los homólogos de la ABCB1 y sus crías de la misma camada de tipo salvaje. Luego, se investigó la asociación de polimorfismos de nucleótidos únicos (SNPs, acrónimo de single nucleotide polymorphisms) en el gen de la ABCB1 con la respuesta clínica a fármacos antidepresivos en 255 pacientes deprimidos.
Sorprendentemente, se identificaron en el gen de la ABCB1 unos polimorfismos, situados particularmente en los intrones de los genes, que tienen una asociación manifiesta y estadísticamente relevante con una respuesta clínica insuficiente, p.ej. un estado de alivio de las seis semanas de tratamientos con los antidepresivos citalopram, paroxetina y/o venlafaxina. La determinación de los genotipos de estos polimorfismos permite predecir la respuesta clínica a un substrato de la ABCB1 con una certidumbre de más de un 75 %, abriendo una ruta hacia el diagnóstico y unos métodos terapéuticos basados en los genotipos.
Un primer aspecto del invento se refiere a un método in vitro para determinar el pronóstico de una respuesta clínica en un paciente humano a un medicamento activo en el sistema nervioso central (SNC), que es un substrato de la proteína ABCB1, en el que se determina la presencia de por lo menos un polimorfismo en el gen de la ABCB1 de dicho paciente, en el que dicho polimorfismo está asociado con una respuesta clínica retrasada, parcialmente subóptima o ausente a dicho medicamento, y en el que el polimorfismo está situado dentro del exón 29, del intrón 5, 13, 21, 22 o 23 o de la secuencia 3’UTR del gen de la ABCB1 humana.
También se describe una composición o un estuche de diagnóstico para el pronóstico de una respuesta clínica en un paciente humano a un medicamento activo en el SNC, que es un substrato de la proteína ABCB1, que comprende por lo menos un cebador o una sonda para determinar por lo menos un polimorfismo en el gen de la ABCB1 en dicho paciente, en el que dicho polimorfismo está asociado con una respuesta clínica retrasada, parcialmente subóptima o ausente a dicho medicamento.
Además se describe una micromatriz para el pronóstico de una respuesta clínica en un paciente humano a un medicamento activo en el SNC, que es un substrato de la proteína ABCB1 que comprende un vehículo que tiene inmovilizada en el por lo menos una sonda para determinar por lo menos un polimorfismo en el gen de la ABCB1 en dicho paciente, en la que dicho polimorfismo está asociado con una respuesta clínica retrasada, parcialmente subóptima o ausente a dicho medicamento.
Además, se describe un cebo o una sonda para el pronóstico de una respuesta clínica en un paciente humano a un medicamento activo en el SNC, que es un substrato de la proteína ABCB1 que comprende un vehículo que tiene inmovilizado en él por lo menos una sonda para determinar por lo menos un polimorfismo en el gen de la ABCB1 en dicho paciente, en el o la que dicho polimorfismo está asociado con una respuesta clínica retrasada, parcialmente sub-óptima o ausente a dicho medicamento.
Finalmente, un aspecto adicional del invento se refiere a una composición terapéutica o un estuche terapéutico como se definen en la reivindicación 14.
El presente invento describe por primera vez en el gen de la ABCB1 humana unos polimorfismos, que tienen una asociación estadísticamente significativa con una respuesta clínica retrasada, parcialmente sub-óptima o ausente a ciertos medicamentos que actúan en el sistema nervioso central y que son substratos de la proteína ABCB1. Una asociación estadísticamente significativa es preferiblemente p < 0,05, más preferiblemente p < 0,01 y de modo sumamente preferible p < 0,001. Los polimorfismos son preferiblemente unos polimorfismos de un único nucleótido (SNPs). Sorprendentemente, se encontró que unos polimorfismos asociados con una respuesta clínica retrasada, parcialmente sub-óptima o ausente a dicho medicamento pueden presentarse en exones, intrones y/o la secuencia 3’UTR del gen de la ABCB1 humana, a saber en el exón 29, en el intrón 5, 13, 21, 22 ó 23 y/o en la secuencia 3’UTR del gen de la ABCB1 humana.
Preferiblemente, los polimorfismos se seleccionan entre el conjunto que consiste en rs 2235015, rs 2235040, rs 2235067, rs 2032583, rs 17064, rs 2032588, rs 1055302 y combinaciones de los mismos. Más preferiblemente, el polimorfismo es el rs 2235015 o rs 2235040. De manera sumamente preferible, el polimorfismo es el rs 2235015. La secuencia del gen de la ABCB1 humana que incluye los intrones se describe en la secuencia de referencia humana del National Center for Biotechnology Information (NCBI) [Centro Nacional de Información sobre Biotecnología]. La secuencia es accesible en bases de datos de genes tales como las del NCBI, o del Genomics Browser [Navegador Genómico] (UCSC) que usa el reg. Sep # = ONM.000927 o el gen ID de la ABCB1. Con respecto a la nomenclatura de los polimorfismos se hace referencia a la ABCB1 en la casete de fijación a ATP chr7:86731406-86940797 -(NM_000927) ATP, sub-familia B (MDR/TAP), NM # es = Número de la Secuencia de Referencia, Localización en el genoma de acuerdo con la secuencia de referencia humana de Abril de 2003 (UCSC versión hg15) basada en NCBI Build 33. Todos los polimorfismos han sido seleccionados a partir de la base pública de datos de SNP (www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP). La situación de los SNPs dentro de la ABCB está de acuerdo con la secuencia de referencia humana de Abril de 2003 (UCSC versión mg 15; www.genome.ucsc.edu). Los polimorfismos más preferidos, que se han enumerado anteriormente, se describen en la Tabla 1.
Tabla 1. Polimorfismos en la ABCB1 humana
Los medicamentos activos en el SNC se seleccionan preferiblemente entre el conjunto que consiste en antidepresivos, ansiolíticos, hipnóticos, intensificadores cognitivos, antipsicóticos, agentes neuroprotectores, antieméticos, antiepilépticos, antibióticos, agentes contra el cáncer, antimicóticos, agentes contra la enfermedad de Parkinson, agentes antivíricos, glucocorticoides, inmunosupresores, estatinas, neurolépticos, y opioides. Una clase preferida de medicamentos la constituyen los antidepresivos. Ejemplos de medicamentos activos en el SNC se describen en la cita de Schatzberg y Nemeroff, “The American Psychiatric Publishing Textbook of Psychopharmacology” [Libro de texto de psicofarmacología de La Editorial Psiquíátrica Americana] Amer Psychiatric Pr, 2004.
Una clase preferida de medicamentos la constituyen los antidepresivos. Unos ejemplos de antidepresivos son imipramina, amitriptilina, óxido de amitriptilina, bupropiona, citalopram, clomipramina, doxepina, desipramina, flesinoxano, fluoxetina, fluvoxamina, maprotilina, mirtazepina, mianserina, moclobemida, nefazodona, nortriptilina, paroxetina, selegilina, sertralina, tranilcipromina, trazodona, trimipramina y venlafaxina. Ejemplos preferidos de antidepresivos que son substratos de la proteína ABCB1, son amitriptilina, citalopram, doxepina, flesinoxano, nortriptilina, paroxetina, trimipramina y venlafaxina. Unos ejemplos especialmente preferidos de antidepresivos son citalopram, venlafaxina o paroxetina.
Unos medicamentos para el SNC adicionalmente preferidos son ansiolíticos, hipnóticos, intensificadores cognitivos y antipsicóticos. Ejemplos de ansiolíticos incluyen pero no se limitan a alprazolam, bromazepam, clonazepam, diazepam, lorazepam, halazepam, clorodiazepóxido, buspirona, azapirona, pagoclone, prazosina, biperideno y kava kava. Unos ejemplos de medicamentos hipnóticos son secobarbital, pentobarbital, metacualona, etclorovinol, hidrato de cloral y meprobamato. Unos ejemplos de medicamentos intensificadores cognitivos son acetil L-carnitina (ALCAR), adrafinilo, aniracetam, deprenilo, galantamina, hidergina, idebenona, modafinilo, picamilon, piracetam, piritinol, vasopresina y vinpocetina. Unos ejemplos de medicamentos antipsicóticos son risperidona, olanzapina, quetiapina y ziprasidona, cloropromazina, flufenazina, trifluoperazina, perfenazina, tioridazina, haloperidol, tiotixeno, molindona, loxapina, clozapina, olanzapina, quetiapina, risperidona, sertindol, ziprasidona, amisulpida, aripriprazol, benperidol, cloropromazina, clorprotixeno, flupentixol, fluspirileno, levomepromazina, benperidol, melperona, perazina, perfenazina, pimozida, pipamperona, sulpirida, triflupromazina, zotepina y zuclopentixol.
Unos ejemplos adicionalmente preferidos de substratos de la proteína ABCB1 son medicamentos antieméticos tales como domperidona u ondansetrona, medicamentos antiepilépticos tales como carbamazepina, felbamato, lamotrigina, fenobarbital y fenitoína, agentes contra la enfermedad de Parkinson tales como budipina o L-Dopa, compuestos neurolépticos tales como olanzapina, quetiapina, risperidona y sulpirida, o medicamentos opioides tales como fentanil o morfina.
Los pacientes que se han de ensayar son unos pacientes humanos que padecen de un trastorno que puede ser tratado con un medicamento activo en el SNC, p.ej. un trastorno psiquiátrico. Particularmente, los pacientes tienen un trastorno depresivo, una distimia y/o un trastorno bipolar.
El presente invento se refiere a la determinación del pronóstico de una respuesta clínica en un paciente humano. El término “una respuesta clínica” en la presente solicitud con respecto a antidepresivos se refiere a un estado de alivio después de seis semanas de tratamiento. Unos métodos para averiguar un estado de alivio son bien conocidos en la especialidad. Por ejemplo, un alivio puede ser evaluado de acuerdo con la Escala de Calificación de Depresiones de Hamilton (HAM-D; Hamilton, Br. J. Soc. Clin. Psychol. 6 (1967) 278-296). Una calificación HAM-D de 10 o por debajo es considerada como un alivio de los síntomas depresivos. Un alivio puede ser también averiguado de acuerdo con una normalización del eje hipotalámico, pituitario y adrenocortical (HPA). El desarrollo y el curso de una depresión están vinculados causalmente con perjuicios en la regulación central del eje HPA. Unas anormalidades en el eje HPA pueden ser medidas usando el ensayo de supresión con dexametasona (DST) o el ensayo combinado con dexametasona y con la hormona liberadora de corticotropina (Dex/CRH). Unos cambios en las mediciones de cortisol y/o de la hormona adrenocorticotrópica (ACTH) durante el ensayo DST o Dex/CRH, son indicativos de una disfunción del HPA mientras que una normalización del cortisol y/o de la ACTH es indicativa de un alivio (Heuser y colaboradores J. Psychiat. Res. 28 (1994) 341-356; Rybakowski y Twardowska, J. Psychiat. Res. 33 (1999) 363-370; Zobel y colaboradores J. Psychiat. Res. 35 (2001) 83-94; Künzel y colaboradores Neuropsychopharmacology (Neuropsicofarmacología) 28 (2003) 2169-2178). Los métodos y las condiciones para realizar los ensayos DST y Dex/CRH son bien conocidos en la especialidad, véanse, por ejemplo, las citas de Heuser y colaboradores J. Psychiat. Res. 28 (1994) 341-356; y de Künzel y colaboradores Neuropsychopharmacology 28 (2003) 2169-2178. Dicho brevemente, unos individuos pueden ser previamente tratados a las 23:00 con una administración por vía oral de 1,5 mg de dexametasona. Para el ensayo DST, una muestra de sangre puede ser extraída a las 8:00 antes de una administración de dexametasona (es decir pre-dexametasona) y a las 8:00 de la mañana siguiente a una administración de dexametasona (es decir post-dexametasona). Para el ensayo Dex/CRH, un catéter venoso puede ser introducido a las 14:30 del día que sigue a la administración de dexametasona y se puede recoger sangre a las 15:00, 15:30, 15:45, 16:00 y 16:15 dentro de unos tubos que contienen EDTA y trasilol (Bayer Inc., Alemania). A las 15:02, se pueden administrar por vía intravenosa 100 mg de CRH humana (Ferring Inc., Alemania). Una medición de las concentraciones de cortisol en plasma se puede hacer de acuerdo con métodos conocidos, p.ej. usando un estuche de radioinmunoensayo comercial (de ICN Biomedicals, EE.UU.). Las concentraciones de ACTH en plasma pueden también ser medidas de acuerdo con métodos conocidos, p.ej. usando un ensayo inmunométrico comercial (de Nichols Institute, EE.UU.). Con respecto a otras clases de medicamentos, el término “respuesta clínica” puede ser definido como una reducción de la gravedad de los síntomas en más de un 50 % con respecto a la gravedad de los síntomas al comienzo de un tratamiento.
La presencia de un polimorfismo asociado con una respuesta clínica retrasada, parcialmente sub-óptima o ausente a un medicamento se determina preferiblemente con un análisis de determinación del genotipo del paciente humano. Este análisis de determinación del genotipo comprende frecuentemente el uso de unos cebadores y/o unas sondas que son específicos/as de un polimorfismo, capaces de hibridarse con el gen de la ABCB1 humana y que permiten realizar una discriminación entre polimorfismos, particularmente SNPs en una posición predeterminada. Por ejemplo, el análisis de determinación del genotipo puede comprender una primera reacción de elongación usando unos cebadores específicos para un polimorfismo tal como se describe en los Ejemplos. La determinación de polimorfismos individuales se puede llevar a cabo mediante un análisis por espectrometría de masas tal como se describe en los Ejemplos. Una forma de realización adicionalmente preferida comprende un análisis de micromatrices, que es particularmente apropiado para la determinación paralela de varios polimorfismos. Unos apropiados dispositivos de micromatrices están disponibles comercialmente.
Basándose en los resultados de una determinación de un polimorfismo, se puede hacer un pronóstico de una respuesta clínica en un paciente humano a un medicamento activo en el SNC, que es un substrato de la proteína ABCB1. Por lo tanto, por una parte, si el paciente que se ha de ensayar no tiene un polimorfismo que está asociado con una respuesta clínica insuficiente al medicamento, se puede dar un pronóstico favorable para una respuesta clínica y el medicamento para obtener la respuesta clínica puede ser producido, prescrito y administrado en una dosis normalizada con lo que se puede esperar con una alta probabilidad una respuesta clínica suficiente. Por otro lado, el paciente que se ha de ensayar puede tener un polimorfismo o una pluralidad de polimorfismos que está(n) asociado(s) con un pronostico desfavorable para una respuesta clínica del medicamento. Si se da dicho pronóstico desfavorable para una respuesta clínica, se puede usar un régimen terapéutico modificado para el paciente. Por ejemplo, el medicamento puede ser administrado en una dosis que es más alta que la dosis norma, p.ej. aumentando la fuerza de una dosis y/o el número de dosis que se han de administrar por intervalo de tiempo. Además, se puede producir y administrar la formulación del medicamento que muestra una permeación aumentada a través de la barrera hematoencefálica, p.ej. incluyendo un medio auxiliar de la permeación a través de la barrera hematoencefálica, tal como los que se indican en la Tabla 2.
Tabla 2. Agentes inhibidores y moduladores de la ABCB1
Antiácidos
Maprotilina Estatinas Ginsenoide
Lansoprazol
Nefazodona Atorvastatina Pomelo
Omeprazol
Paroxetina Lovastatina Té verde
Pantoprazol
Reboxetina Simvastatina Lidocaína
Antiarrítmicos
Sertralina Neurolépticos Lonafarnib (SC66336)
Amilorida
Trimipramina Cloropromazina Loratadina
Amiodarona
Venlafaxina Droperidol Mefloquina
Barnidipina
Antieméticos Flupentixol Midazolam
Benidipina
Antiepilépticos Flufenazina Nobilitina
Bepridilo
Agentes antihipertensivos Haloperidol Zumo de naranja -Sevilla
Digitoxina
Carvedilol Fenotiazina Piperina
Digoxina
Doxazosina Pimozida Probenecida
Efonidipina
Felodipina Proclorperazina Progesterona
Niguldipina
Mibefradilo Prometazina Quinacrina
Nilvadipina
Nifedipina Tioridazina Quinina
Propafenona
Nicardipina Trifluoperazina RU 486
Propranolol
Nitrendipina Triflupromazina Espironolactona
Quinidina
Reserpina Opioides Terfenadina
Verapamil
Antimicóticos Alfentanilo Tetrandrina
Antibióticos
Itraconazol Fentanil Hormonas de la tiroides
Ceftriaxona
Ketoconazol Metadona TNF alfa
Claritromicina
Antiparkinson Pentazocina Vandato
Eritromicina
Agentes antivíricos Sufentanilo XR9576
Fucidina
Indinavir Tensioactivos Yohimbina
Josamicina
Lopinavir Cremophor EL Zosuquidar.3 HCl
Ofloxacina
Nelfinavir Triton X-100 Rifampina
Agentes anticancerosos
Ritonavir Tween 80 GG918
Azidopina
Saquinavir Otros usos Topotecán
Gramicidina
Esteroides Anticuerpo anti-CD 19 Puromicina
Mitomicina C
Progesterona Azelastina Mitramicina
Quercetina
Inmunosupresores Bromocriptina Mitomicina C
Valinomicina
Ciclosporina A Cloroquina Inhibidores de calmodulina
Antidepresivos
FK 506 Colesterol Indometacina
Amitriptilina
Rapamicina Ciproheptadina Quinina
Citalopram
Sirolimus Dipiridamol Melfalán
Desipramina
Tacrolimus E6 Econazol
Fluoxetina
Tamoxifeno Emetina Colquicina
Fluvoxamina
Valspodar (PSC833) EP 51389 Actinomicina
Imipramina
Vinblastina Flavonoides Taxonas
Ajo
Antraciclinas
GF120918
5’MHC
Reversina
JS-2190
PGP-4008
WP631
Dihidropiridina
Quinolinas
VX-710
S-9788
Adicionalmente, la producción y la administración del medicamento se pueden combinar con la producción y la administración de un medicamento adicional que es un inhibidor de la proteína ABCB1. Unos inhibidores apropiados de la proteína ABCB1 son conocidos y se describen por ejemplo en el documento US 2003/0073713 A1. Otros inhibidores de la ABCB1 se describen en la cita de Marzolini C, y colaboradores (2004), Clin Pharmacol Ther. Enero de 2004; 75(1):13-33. Los inhibidores mencionados en estos documentos son incorporados en la presente divulgación por su referencia.
Tal como se ha bosquejado anteriormente, el presente documento describe también unas composiciones y unos estuches de diagnóstico para el pronóstico de una respuesta clínica en un paciente humano a un medicamento 5 activo en el SNC, que es un substrato de la proteína ABCB1. Una composición o un estuche de diagnostico comprende preferiblemente por lo menos un cebador y/o una sonda para determinar por lo menos un polimorfismo que está asociado con una falta de respuesta clínica al medicamento activo en el SNC. Los cebadores y/o las sondas pueden ser unas moléculas de ácido nucleico tales con un ADN, un ARN o compuestos análogos a ácidos nucleicos tales como ácidos nucleicos peptídicos (PNA) o unos ácidos nucleicos bloqueados (LNA). El cebador y/o 10 las sondas se seleccionan de manera tal que él o ellas pueden discriminar entre polimorfismos en la posición que se ha de analizar. Usualmente, los cebadores y las sondas tienen una longitud de por lo menos 10, preferiblemente de por lo menos 15 hasta 50, más preferiblemente hasta 30 bloques de construcción de ácidos nucleicos, p.ej. nucleótidos. La composición o el estuche puede comprender por lo menos un cebador que se hibrida con el gen de la ABCB1 humana en unas condiciones previamente determinadas, p.ej. de temperatura, tampón, fuerza y/o
15 concentración de un disolvente orgánico, y que permite una determinación específica del polimorfismo que se ha de ensayar. Unos ejemplos preferidos de dichos cebadores se indican en la Tabla 3 y en la Tabla 4 para determinar el genotipo con un sistema de matriz de masas y en la Tabla 5 para determinar el genotipo rs 2235015 con unas sondas de hibridación.”
Tabla 3. Secuencia de cebadores para la amplificación y la secuenciación de SNPs
Tabla 4. Secuencia de cebadores para sistemas de extensión de cebadores (Mez. Det. = abreviatura de Mezcla de Detención del inglés Stop Mix)
Tabla 5. Cebadores usados para determinar el genotipo con unas sondas de hibridación para el rs 2235015
Descripción
Sondas de hibridación
Sonda de PCR hacia delante
ABCB1 CAATTAAAACTgAgTCAgTTCg
Sonda de PCR inversa
ABCB1 TTTTAAACATTTCTACAACTTgATg
Sonda de ancla
rs 2235015 TgTATCATTgATATCACCTAgACCACCAC-FL
Sonda de sensor
Sensor [G] LCRed640-AAACAAACATACCATTTATgTCTCT--PH
El uso de las sondas de hibridación descritas en la Tabla 5 hace posible una detección de productos de PCR (acrónimo de Polymerase Chain Reaction = reacción en cadena de la polimerasa) que es específica para una 5 secuencia. Estas sondas de hibridación consisten en dos diferentes oligonucleótidos que se hibridan con una secuencia interna del fragmento amplificado durante la fase de reanillado de una PCR. Una sonda es marcada en el extremo 5’ con un fluoróforo. La otra sonda es marcada en el extremo 3’ p.ej. con fluoresceína. Después de una hibridación con la secuencia diana, las dos sondas producen una transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET, acrónimo de Fluorescence Resonance Energy Transfer). La fluorescencia emitida es medida.
10 Esta técnica se puede usar para una cuantificación y una determinación del genotipo. Por ejemplo la determinación del genotipo puede ser realizada con un análisis de curvas de fusión. La Tabla 5 muestra el cebador de la PCR y las sondas de hibridación marcadas con tintes para un ensayo de determinación del genotipo de rs 2235015.
La composición o el estuche comprende preferiblemente además una enzima para la elongación de cebadores tales como una polimerasa de ADN, nucleótidos, p.ej. nucleótidos de elongación de cadenas tales como desóxido
15 nucleósido trifosfatos (dNTPs) o nucleótidos de terminación de cadenas tales como didesoxinuleósido trifosfatos (ddNTPs) y/o grupos de marcación, p.ej. grupos de marcación fluorescentes o cromógenos.
Una micromatriz para el pronóstico de una respuesta clínica a un medicamento activo en el SNC comprende un vehículo, p.ej. un vehículo plano o un dispositivo con microcanales, que tiene inmovilizadas en él por lo menos una sonda que permite una determinación de un polimorfismo que se ha de ensayar. Preferiblemente, la sonda de 20 micromatriz tiene inmovilizada en ella una pluralidad de diferentes sondas situadas en diferentes zonas en el vehículo, que están diseñadas de manera tal que ellas pueden fijar moléculas de ácidos nucleicos, p.ej. moléculas de ARN o moléculas de ADN, productos de amplificación, productos de elongación de cebadores, etc., que contienen la secuencia en la que está situado el polimorfismo que se ha de ensayar. Por lo tanto, se puede realizar una identificación del polimorfismo que se ha de analizar por detección de unos sucesos de fijación, específicos para
25 ciertos sitios de la molécula de la muestra de ácido nucleico, a la sonda inmovilizada sobre el vehículo.
Finalmente, el presente invento se refiere a una composición terapéutica o a un estuche terapéutico como se definirá en la reivindicación 14, que comprende un medicamento activo en el SNC, que es un substrato de la proteína ABCB1 en una dosis terapéuticamente efectiva y otro medicamento adicional que es un inhibidor de la proteína ABCB1 en una dosis terapéuticamente efectiva para tratar a un paciente humano que tiene por lo menos un
30 polimorfismo en el gen de la ABCB1, que está asociado con una falta de respuesta clínica a dicho medicamento activo en el SNC. Los medicamentos pueden estar presentes como una única formulación o como formulaciones separadas, si se desea. Se pueden incluir vehículos, diluyentes o coadyuvantes farmacéuticamente aceptables. La composición o el estuche se puede administrar por cualquier ruta apropiada, p.ej. por administración por vía oral o parenteral o por cualquier otro medio apropiado.
35 El esquema de administración y dosis de un medicamento activo en el SNC tal como, por ejemplo, un fármaco antidepresivo, puede variar entre pacientes y se conocen bien en la especialidad médica, véase, por ejemplo, la cita de Benkert e Hippius, “Kompendium der Psychiatrischen Pharmakotherapie” [Compendio de la farmacoterapia psiquiátrica], editorial Springer Verlag Publishing, 2000; Albers, “Handbook of Psychiatric Drugs: 2001-2002 Edition” [Manual de fármacos psiquiátricos edición de 2001-2002], Current Clinical Strategies Publishing, 2000. Para los
40 antidepresivos hay tres posibilidades terapéuticas para los individuos cuyo genotipo se ha determinado con SNPs en el gen de la ABCB1.
1. La dosificación de un antidepresivo que es un substrato de la ABCB1 sería aumentada. Unos ejemplos de dichos antidepresivos son: entre 10 mg y 100 mg por día, preferiblemente 40 mg, de citalopram; entre 10 mg y 80 mg por día, preferiblemente 20 mg, de paroxetina; entre 50 mg y 500 mg por día, preferiblemente 150 mg, de venlafaxina;
45 entre 25 mg y 300 mg por día, preferiblemente 75 mg, de amitriptilina; entre 25 mg y 400 mg por día, preferiblemente 75 mg, de nortriptilína; entre 50 mg y 400 mg por día, preferiblemente 200 mg, de fluvoxamina; entre 2 mg y 15 mg por día, preferiblemente 10 mg, de reboxetina.
2. Se administraría un antidepresivo alternativo que no es un substrato de la ABCB1. Unos ejemplos preferidos
incluyen entre 15 mg y 100 mg por día, preferiblemente 30 mg, de mirtazapina; entre 5 mg y 80 mg por día, 50 preferiblemente 20 mg, de fluoxetina.
3. Se combinaría un antidepresivo que es un substrato de la ABCB1 con un inhibidor o modulador de la ABCB1. Ejemplos de inhibidores o moduladores de la ABCB1 se describen en la Tabla 2 y la dosificación se determinaría de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Además, el presente invento será explicado por las siguientes Tablas y Figuras así como por los Ejemplos.
5 Tabla y leyendas de las Figuras
Tabla 6
Situación de acuerdo con la secuencia de referencia humana de Abril de 2003 (versión UCSC hg15) (http://genome.ucsc.edu/), heterocigosidad y valores de p del equilibrio según Hardy-Weinberg de SNPs de la 10 ABCB1. * La frecuencia del tercer alelo raro A = 4,8 %, presente o bien como GA (3,2 %) o como TA (1,6 %), la frecuencia del genotipo GT es de 49,2 %.
SNP ID
Situación dentro del gen Función Situación hg15 Heterocigosidad Valor de p según HWE
rs 1055305
3’ 3’ 86730918 0,00 NA
rs 1055302
3’ 3’ 86731143 0,23 0,79
rs 17064
exón 29 3’UTR 86731697 0,11 0,71
rs 2235051
exón 29 3’UTR 86731882 0,00 NA
rs 1045642
exón 27 Ile/Ile 86736872 0,50 1,00
rs 2235045
intrón intrónica 86743871 0,00 NA
rs 2235044
exón 25 Pro/Pro 86744052 0,00 NA
rs 2235067
Intrón 23 intrónica 86748149 0,20 0,53
rs4148744
intrón intrónica 86749001 0,08 1,00
rs4148743
intrón intrónica 86749317 0,53 0,049
rs 2032583
Intrón 22 intrónica 86758788 0,18 0,34
rs 2032582
exón 22 Ala/Ser/Thr* 86758845 0,54 0,53
rs 2032581
intrón intrónica 86759037 0,00 NA
rs 2235040
Intrón 21 intrónica 86763977 0,20 0,57
rs 2235039
exón 21 Val/Met 86764081 0,00 NA
rs 1922242
intrón intrónica 86771894 0,53 0,06
rs 2235035
intrón intrónica 86777313 0,47 0,67
rs 2032588
Intrón 13 intrónica 86777670 0,1 1,00
rs 2229109
exón 12 Ser/Asn 86778036 0,1 0,69
rs 2235030
intrón intrónica 86778153 0,00 NA
rs 2235029
intrón intrónica 86778162 0,00 NA
rs 2235023
intrón intrónica 86788679 0,13 0,51
rs 2235022
exón 9 Glu/Glu 86788904 0,00 NA
rs 1202168
intrón intrónica 86794189 0,48 0,75
rs 1202167
intrón intrónica 86795286 0,51 0,32
rs 2235019
intrón intrónica 0,02 1,00
rs 2235018
intrón intrónica 86797592 <0,01 1,00
rs 2235017
intrón intrónica 86797600 <0,01 1,00
rs 2235016
intrón intrónica 86797639 0,00 NA
rs 2235015
intrón 5 intrónica 86797791 0,28 1,00
rs 2235014
intrón intrónica 86797842 0,00 NA
rs 1202179
intrón intrónica 86802506 0,44 0,41
rs 1989831
intrón intrónica 86803706 0,43 0,34
rs 1202172
intrón intrónica 86809201 0,39 1,00
rs 1202171
intrón intrónica 86809272 0,43 0,41
rs4148733
intrón intrónica 86811459 0,27 0,12
rs 1202186
intrón intrónica 86811485 0,45 0,41
rs 1202185
intrón intrónica 86811611 0,43 0,42
rs 1202183
exón 5 Asn/Ser 86813210 0,00 NA
rs 1202182
intrón intrónica 86813531 0,44 0,42
rs 1202181
intrón intrónica 86814377 0,42 0,89
rs 2235074
intrón intrónica 86823273 0,08 0,34
rs 2214102
exón 3 TLI 86827728 0,13 0,26
rs3213619
exón 2 5’UTR 86828420 0,00 NA
rs 2188524
intrón intrónica 86828662 0,00 NA
SNP ID
Situación dentro del gen Función Situación hg15 Heterocigosidad Valor de p según HWE
rs4148731
intrón intrónica 86837556 0,06 1,00
rs4148730
intrón intrónica 86837578 0,06 0,49
rs4604363
intrón intrónica 86852423 0,00 NA
rs 2157928
intrón intrónica 86856631 0,00 NA
rs4148729
intrón intrónica 86860613 0,06 0,041
rs 2157926
intrón intrónica 86868727 0,12 1,00
rs4148728
intrón intrónica 86869044 0,00 NA
rs916715
intrón intrónica 86925156 0,00 NA
rs 2188529
intrón intrónica 86930698 0,04 0,33
rs3747802
promotor intrónica 86940813 0,00 NA
rs3747802
promotor promotor 86942971 0,06 0,041
Tabla 7
Valores de p de la asociación de SNPs de la ABCB1 con un estado de alivio después de 6 semanas de tratamiento en todos los pacientes, los pacientes tratados con citalopram/venlafaxina/paroxetina y los pacientes tratados con mirtazapina (Abreviatura: n.s. = no significativo)
SNP ID
Todos los pacientes Pacientes tratados con citalopram/venlafaxina/ paroxetina Pacientes tratados con mirtazapina
*rs 1055302
n.s 0.045 n.s
* rs 17064
n.s 0,025 n.s
rs 1045642
n.s n.s n.s
*rs 2235067
n.s 0,009 n.s
rs4148744
n.s n.s n.s
rs4148743
n.s n.s. n.s.
*rs 2032583
n.s 0,017 n.s
rs 2032582
n.s n.s. n.s.
rs 2235040
n.s 0,002 n.s
rs 1922242
n.s n.s. n.s.
rs 2235035
n.s n.s. n.s.
rs 2032588
n.s 0,028 n.s
rs 2229109
n.s n.s. n.s.
rs 2235023
n.s n.s. n.s.
rs 1202168
n.s n.s. n.s.
rs 1202167
n.s n.s. n.s.
rs 2235019
n.s n.s. n.s.
rs 2235018
n.s n.s. n.s.
rs 2235017
n.s n.s. n.s.
rs 2235015
0.015 0.00007 n.s
rs 1202179
n.s n.s. n.s.
rs 1989831
n.s n.s. n.s.
rs 1202172
n.s n.s. n.s.
rs 1202171
n.s n.s. n.s.
rs4148733
n.s n.s. n.s.
rs 1202186
n.s n.s. n.s.
rs 1202185
n.s n.s. n.s.
rs 1202183
n.s n.s. n.s.
rs 1202182
n.s n.s. n.s.
rs 1202181
n.s n.s. n.s.
rs 2235074
n.s n.s. n.s.
rs 2214102
0,02 n.s. n.s.
rs3213619
n.s n.s. n.s.
rs 2188524
n.s n.s. n.s.
rs4148731
n.s n.s. n.s.
rs4148730
n.s n.s. n.s.
rs4604363
n.s n.s. n.s.
rs 2157928
n.s n.s. n.s.
rs4148729
n.s n.s. n.s.
rs 2157926
n.s n.s. n.s.
SNP ID
Todos los pacientes Pacientes tratados con citalopram/venlafaxina/ paroxetina Pacientes tratados con mirtazapina
rs4148728
n.s n.s. n.s.
rs916715
n.s n.s. n.s.
rs 2188529
n.s n.s. n.s.
rs3747802
n.s n.s. n.s.
rs4728711
n.s n.s. n.s.
* Para estos SNPs la asociación se realizó en una muestra de mayor tamaño (284 pacientes en total; 98 tratados con citalopram/venlafaxina/paroxetina, 74 tratados con mirtazapina)
Tabla 8
Descripción de los procesos experimentales de los experimentos con animales
Citalopram
Mirtazapina Venlafaxina
Animales
Género
Masculino Masculino Masculino
Tamaño del grupo [n]
8 9 8
Edad [semanas]
16-24 15-17 12-15
Peso de la ABCB1 ab(-/-)
31,2 ± 0,6 28,6 ± 0,3 30,6 ± 0,5
Peso de la ABCB1 ab(+/+)
29,8 ± 1,0 28,3 ± 0,6 29,9 ± 1,0
Procesos experimentales
Administración s.c. mediante bombas osmóticas
60 μg/día 60 μg/día 300 μg/día
Proceso de extracción
Alcohol isoamílico (extracción de plasma)
0 % 0 % 0,5 %
Alcohol isoamílico (extracción de órganos)
0 % 0 % 0,5 %
Cromatografía de fase líquida de alto rendimiento
Gradiente de la fase móvil [% B]
5-25 0-25 0-30
Detección de UV [nm]
214 214 214
Detección de fluorescencia ex/em [nm]
230/300 295/370 225/305
Figura 1
Relaciones de las concentraciones en cerebro/plasma de fármacos en ratones abcb1ab (-/-), comparadas con testigos de tipo salvaje.
10 Después de una administración subcutánea continua durante 11 días de venlafaxina, mirtazapina y citalopram, no se encontraron diferencias en los niveles en plasma de estos fármacos, incluyendo la d-venlafaxina que es el metabolito principal de la venlafaxina, entre un mutante abcb1ab (-/-) y sus crías de la misma camada de tipo salvaje. Las concentraciones de fármacos y metabolitos no eran tampoco diferentes entre el mutante y las crías de la misma camada de tipo salvaje en aquellos órganos que no tienen una barrera entre sangre y órgano. Estos
15 incluyen hígado, bazo, riñón y pulmón (datos no mostrados). Habían, sin embargo, unas diferencias significativas en las relaciones en cerebro/plasma de citalopram, venlafaxina y su metabolito d-venlafaxina, pero no en las relaciones en cerebro/plasma de mirtazapina. Para el citalopram (F6,9 = 39,1; p < 0,001) había una concentración 3 veces más alta en el cerebro del mutante de la ABCB1ab (-/-) en comparación con animales de tipo salvaje. Para la venlafaxina (F6,9 = 32,1; p <0,001) y su metabolito d-venlafaxina (F6,9 = 3,8; p = 0,035) el mutante abcb1ab (-/-) presentó unas
20 concentraciones 1,7 y 4,1 veces más altas en el cerebro. Para la mirtazapina, no se observaron diferencias significativas en las relaciones en cerebro/plasma. Se observaron para testículos, que son otro órgano con una barrera de sangre/órgano (datos no mostrados), unas diferencias dependientes del fármaco significativas pero más pequeñas, similares a las que había en el cerebro.
* = p<0,05; ** = p<0,001.
25 Figura 2
Representación de la estructura del desequilibrio de vinculación (LD, acrónimo de linkage disequilibrium) en la ABCB1 usando D’ como una medida para la intensidad del LD.
Figura 3
% de pacientes aliviados (barras de color gris) y no aliviados (barras de color blanco) de acuerdo con el genotipo rs 30 2235015 para pacientes tratados con citalopram/venlafaxina/paroxetina (substratos) (3B) y con mirtazapina (3A).
Figura 4
Dosis de fármaco y niveles en plasma de antidepresivos de acuerdo con el genotipo rs 2235015.
Parte A: dosis media de fármaco administrado, que se había administrado en las semanas 4-6 de tratamiento con antidepresivos en mg.
Parte B: niveles medios en plasma de antidepresivos administrados para las semanas 4-6 de un tratamiento con antidepresivos en ng/ml. Para homocigotos GG, los niveles de venlafaxina en plasma fueron de 356,5 ng/ml (error típico de la media = SEM = 51,6). Mirtazapina N = 65, citalopram N = 35, paroxetina N = 29, venlafaxina N = 22.
1. Métodos
1.1 Experimentos que usan animales transgénicos
Materiales La venlafaxina y la o-desmetilvenlafaxina (d-venlafaxina) se obtuvieron de Wyeth-Pharma GmbH (Münster, Alemania). La mirtazapina se obtuvo de Thiemann Arzneimittel GMBH (Waltrop, Alemania) y el citalopram se obtuvo de Lundbeck (Copenhagen, Dinamarca). La protriptilina se adquirió de RBI (Massachusetts, EE.UU.). Todos los otros productos químicos se obtuvieron en la calidad más pura disponible de Merck (Darmstadt, Alemania).
Animales
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Guide for the Care and Use of Laboratory Animals [Guía para el cuidado y el uso de animales de laboratorio] del Gobierno de Baviera, Alemania.
Unos ratones abcb1ab(-/-) y unos ratones FVB/N de tipo salvaje machos fueron alojados individualmente y mantenidos en un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 h (las lámparas se conectaron a las 07:00), con pienso y agua ad libitum. Unos ratones abcb1ab doblemente desprovistos de inmunidad, creados originalmente por A. Schinkel por dirección secuencial hacia genes en células madre embrionarias 129/Ola E1428 y retrocruzados siete veces (N7) con los FVB/N procedentes de la quimera C57BL/6 x 129, y unos ratones FVB/N de tipo salvaje fueron recibidos de Taconic (Germantown, EE.UU; FVB/Tac-[KO]Pgy2 N7). Una colonia homocigótica es mantenida en el Max-Planck Institute of Psychiatry sobre el fondo de FVB/N N7 mediante entrecruzamiento de ratones homocigóticos. La edad, el peso y el tamaño del grupo de los ratones usados se muestran en la Tabla 3.
1.2 Procesos experimentales y de extracción
Los procesos experimentales y de extracción se realizaron tal como se ha descrito más arriba 12,26. El citalopram, la mirtazapina y la venlafaxina disueltas en cloruro de sodio al 0,9 % y en etanol al 0,5 % se administraron por vía subcutánea en la nuca del cuello por medio de unas bombas de infusión osmótica implantadas quirúrgicamente (bomba micro-osmótica Alzet®, de Alza Corporation, Palo Alto, EE.UU.), que suministraban de un modo continuo los fármacos en las concentraciones calculadas (Tabla 1). Después de 11 días, los ratones fueron anestesiados y sacrificados. Los órganos disecados fueron homogeneizados y se ha llevado a cabo un proceso de extracción líquido-líquido con n-hexano/alcohol isoamílico (Tabla 3) en la primera etapa y con ácido fosfórico en la segunda etapa. Las recuperaciones por extracción fueron > 90 % para citalopram, mirtazapina y venlafaxina y de 36 % para d-venlafaxina.
1.3 Cromatografía de fase líquida de alto rendimiento
Las mediciones por HPLC (cromatografía de fase líquida de alto rendimiento) se realizaron tal como se ha descrito más arriba 12,26. Una bomba de gradiente de Beckman, un autoinyector, un detector de rayos UV y un detector de fluorescencia de Merck se usaron para el análisis por cromatografía de fase líquida de alto rendimiento. Las separaciones se hicieron en una columna Luna 5μ C18(2) 250 x 4,6 mm de fase inversa (de Phenomenex, Torrance, EE.UU.), a 60ºC, con un caudal de la fase móvil de 1 ml/min. Se usó un gradiente de la fase móvil con acetonitrilo para el análisis por cromatografía (Tabla 3). Las sustancias fueron determinadas por absorción de UV y por fluorescencia en la longitud de onda descrita (Tabla 3).
1.4 Genética humana
Pacientes 255 pacientes admitidos en nuestro hospital psiquiátrico para el tratamiento de un trastorno depresivo, que se presentaban con un episodio depresivo principal, distimia o trastorno bipolar único o recurrente como sus diagnósticos psiquiátricos primarios fueron reclutados para el estudio. Los pacientes fueron incluidos en el estudio dentro de los 1-3 días desde la admisión en nuestro hospital y el diagnóstico fue averiguado por psiquiatras entrenados de acuerdo con los criterios del Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM) IV. Unos trastornos depresivos debidos a una condición médica o neurológica fueron un criterio de exclusión. La etnicidad fue registrada usando una hoja de auto-informe normalizado en cuando a la nacionalidad y el lenguaje materno y la etnicidad que se percibieron del individuo propiamente dicho y de los 4 abuelos. Todos los pacientes incluidos eran caucásicos y un 92 % de ellos eran de origen alemán. El estudio ha sido aprobado por el comité ético local. Se obtuvo un consentimiento informado por escrito de todos los individuos.
Testigos 339 testigos sanos emparejados en cuanto a la salud, la edad, el sexo y la etnicidad fueron seleccionados aleatoriamente a partir de una muestra de comunidad con base en Múnich y sus genotipos usados en la construcción de un mapa del desequilibrio de vinculación de la ABCB1. El reclutamiento de los testigos fue también aprobado por el comité ético local y se obtuvo de todos los individuos un consentimiento informado por escrito.
Psicopatología y definición de la respuesta a un tratamiento con fármacos antidepresivos En 255 pacientes se averiguó la gravedad de una psicopatología usando la escala de calificación de depresiones de Hamilton (HAM-D) de 21 artículos por calificadores entrenados. Las calificaciones fueron realizadas en el transcurso de los 3 días a partir de la admisión y luego a intervalos semanales hasta el despido. El alivio de los síntomas depresivos fue definido como que se había alcanzado una calificación HAM-D global : 8. Los pacientes fueron subdivididos de acuerdo con su estado de alivio después de una hospitalización durante 6 semanas. Todos los pacientes fueron tratados con fármacos antidepresivos en el transcurso de unos pocos días desde la admisión. La medicación antidepresiva tipo no fue influida por la participación en el estudio, sino que se escogió libremente por el psiquiatra responsable. Para todos los pacientes se vigiló la concentración en plasma de la medicación antidepresiva con el fin de asegurar unos niveles de fármacos clínicamente eficientes. Para unos pacientes tratados con citalopram, paroxetina, venlafaxina o mirtazapina se calcularon las dosis medias en mg del fármaco administrado y la concentración del fármaco en plasma en ng/ml durante las semanas de tratamiento 4-6.
Concentración en plasma de fármacos antidepresivos: El citalopram, la mirtazapina, y la paroxetina en plasma se extrajeron con un proceso de extracción liquido-liquido y luego se midieron después de una HPLC con absorción de rayos UV y fluorescencia. Para esto se añadieron a
1.000 μl de plasma 100 μl de un patrón interno (protriptilina 2 μg/ml), 1.000 μl de hidrógenocarbonato de sodio (2 M, pH 10,5), y 5 ml de n-hexano con 1,5 % de alcohol isoamílico. Después de haber agitado durante 20 min y centrifugado durante 15 min a 4000 r.p.m. (revoluciones por minuto) las fases orgánicas fueron transferidas a 250 μl de ácido fosfórico al 0,85 %. Las muestras fueron agitadas de nuevo durante 20 min, centrifugadas durante 15 min a 4000 r.p.m., y la fase acuosa inferior fue analizada en la HPLC.
Nosotros usábamos una columna Luna 5μ C18(2) 250 x 4,6 mm de fase inversa (de Phenomenex, Torrance, EE.UU.), a 60ºC, caudal de fase móvil 1 ml/min. Un gradiente de la fase móvil con acetonitrilo y ácido fosfórico, (1,5 ml de H3PO4/l al 85 %, pH = 3,5, ajustado con NaOH) se usó para el análisis por cromatografía (mirtazapina con 533 % de acetonitrilo en 30 min; citalopram y paroxetina con 28-35 % de acetonitrilo en 45 min). Las sustancias se determinaron por absorción de rayos UV (214 nm) y por fluorescencia a la longitud de onda apropiada (el citalopram a 235/300 nm, la mirtazapina a 295/370 nm, la paroxetina a 295/365 nm y la protriptilina a 295/420 nm). La recuperación por extracción fue de > 90 %, y el coeficiente de variación dentro de un día y entre dos días fue de < 10 %.
Preparación de ADN: Al efectuarse el alistamiento en el estudio, se extrajeron 40 ml de sangre con EDTA de cada paciente y el ADN se extrajo a partir de una sangre reciente usando el estuche de extracción de ADN de sangre entera Puregene® (de Gentra Systems Inc; MN).
Selección de los SNPs y determinación del genotipo 26 SNPs de la ABCB1 fueron seleccionados a partir de dbSNP (http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/). La herramienta de investigación de los SNPs en hftp://ihg.gsf.de/ihg/snps.html se usó para descargar secuencias de SNP a partir de bases de datos públicas. La determinación del genotipo se realizó en un espectrómetro de masas MALDI-TOF (sistema MassArray®) empleando el software Spectrodesigner (de Sequenom®; CA) para la selección y el multiplexado de cebadores y el proceso para extensión homogénea de masas (hMe) para producir productos de extensión de cebadores. Todas las secuencias de cebadores están disponibles a petición. El SNP tri-alélico rs 2032582 fue medido en el dispositivo ciclador de luz usando unas sondas hybe (de hibridación) específicas para alelos (las secuencias de cebadores están disponibles a petición).
1.3 Análisis estadístico
Experimentos con animales: El análisis estadístico se llevó a cabo con el software estadístico SPSS 10.0 para windows (Chicago, Illinois). La significancia fue ensayada mediante unos análisis de la varianza multivariantes de un factor (MANOVAs). Siguieron unos ensayos F univariantes para identificar las variables cuyas diferencias entre los dos grupos contribuían significativamente al efecto global de los grupos. Como un nivel nominal de significancia se aceptó el de a = 0,05 y se corrigió (se redujo de acuerdo con el procedimiento de Bonferroni) para todos los ensayos “a posteriori” (ensayos F univariantes) con el fin de mantener al error del tipo I menor que o igual a 0,05.
Genética humana: Todos los análisis para resultados binarios se realizaron usando una regresión logística mediante uso tanto de R como de SPSS (versión 11), así como por análisis de tablas de contingencia exacta usando el SPSS. Las tablas se construyeron como ensayos por genotipo, es decir para un resultado binario dado y un único SNP habíamos analizado una tabla 2*3 con 2 d.f. Para el SNP tri-alélico rs 2032582 (G/T/A) se usó una tabla 2*5 con 4 d.f. Para detectar cualesquiera diferencias dependientes del genotipo en la dosis o en el nivel en plasma de un antidepresivo habíamos usado un ANOVA de una vía con el genotipo de rs 2235015 como factor.
Para los análisis de haplotipos se determinaron asignaciones de haplotipos individuales usando el SNPHAP (hftp://wwwgene.cimr.cam.ac.uk/clayton/software/snphap.txt). Solamente se incluyeron en los análisis unas asignaciones de haplotipos con un grado de incertidumbre de menos que cinco por ciento y con una frecuencia de por encima de cinco por ciento. Para el análisis del patrón de LD y el cómputo de valores de D’ por pares a partir de datos de genotipos de nuestra muestra de casos y testigos, hemos usado el paquete R “genetics” (http://lib.stat.cmu.edu/R/CRAN/). La definición de bloques de haplotipos se hizo usando el método |D’| (Lewontin R.C., On Measures of Gametic Disequilibrium [Acerca de mediciones del desequilibrio gamético], Genetics 120: 849852 (Noviembre, 1988)) con un umbral de 0,75. Para la representación gráfica de una LD hemos usado el GOLD (http://www.sph.umich.edu/csg/abecasis/publications/10842743.html) recopilación gráfica GOLD del desequilibrio de vinculación. Abecasis GR y Cookson WO. Bioinformatics (2000) 16:182-3). Los SNPs con una frecuencia del alelo menor de menos que 0,1 se omitieron de los análisis de la LD.
2. Resultado
2.1 Regulación diferencial de niveles intracerebrales de mirtazapina, venlafaxina y citalopram en ratones doblemente desprovistos de inmunidad abcb1a y abcb1b.
Mientras que una glicoproteína p es codificada por un único gen en seres humanos (ABCB1) hay dos homologías en ratones, los genes abcb1a (también denominado mdr1a o mdr3) y abcb1b (también denominado1 mdr1b o mdr1) 9. Aunque los abcb1a y abcb1b no son siempre expresados en los mismos órganos, la distribución global de estos genes en un tejido de ratón coincide aproximadamente con la del gen único de la ABCB1 en seres humanos, sugiriendo que los abcb1a y abcb1b conjuntamente funcionan de la misma manera que una ABCB1 humana 10.11. Habríamos podido mostrar previamente que varios antidepresivos son substratos de una glicoproteína p a continuación de la administración de un único fármaco 12,26,27. Habíamos seleccionado tres de ellos para ensayar si esta especificidad para un substrato permanece después de un tratamiento subcrónico, que es más relevante para la situación clínica. Usando unos ratones transgénicos que carecen de los abcb1a y abcb1b, podríamos mostrar que a continuación de una administración durante 11 días, las concentraciones intracerebrales de los fármacos antidepresivos citalopram (que pertenece a la clase de los inhibidores selectivos de la resorción de serotonina) y venlafaxina (un inhibidor combinado de la resorción de serotonina y norepinefrina) y su metabolito activo desmetilvenlafaxina, son reguladas por una glicoproteína p. Este no es el caso para la mirtazapina, que es un fármaco antidepresivo que se dirige principalmente a receptores de serotonina (5-HT)2C y alfa2A-adrenérgicos (véase la Figura 1).
2.2 Los SNPs de la ABCB1 están asociados con un alivio al tratamiento con un antidepresivo
Puesto que una glicoproteína p regula el acceso al cerebro para algunos antidepresivos, los polimorfismos funcionales en este gen pueden influir sobre la concentración intracerebral de los antidepresivos y por lo tanto sobre la respuesta clínica a fármacos antidepresivos. Si ciertos polimorfismos alterasen las concentraciones intracerebrales de antidepresivos específicos, el conocimiento previo de los genotipos de una glicoproteína p relevantes para un paciente podría impedir la administración de un fármaco que no fuese capaz de alcanzar unos niveles intracerebrales terapéuticos a pesar de una concentración en plasma que es considerada como clínicamente suficiente. Para ensayar esta hipótesis, en primer lugar hemos investigado si los SNPs en el gen de la ABCB1 están asociados con una respuesta clínica a un fármaco. En segundo lugar, hemos analizado si la asociación de los genotipos de SNPs de la ABCB1 con una respuesta a antidepresivos depende de sí el fármaco es o no un substrato del producto del gen de la ABCB1. La última distinción estaba basada en unas concentraciones cerebrales de un fármaco en ratones que carecen de los respectivos genes codificadores de los transportadores de fármacos. El citalopram, la venlafaxina y la paroxetina pero no la mirtazapina se consideraron como substratos de una glicoproteína p (véanse los datos presentados en este manuscrito y en 12 donde la paroxetina es identificada como un substrato de una glicoproteína p).
De 56 SNPs investigados en la ABCB1, 38 resultaron ser polimórficos en nuestra muestra (Tabla 6). Los SNPs fueron espaciados inicialmente con una distancia media entre marcadores de 8,3 kb que franquean 209 kb del gen desde la región de promotor hasta el exón 29. La distancia media entre marcadores de los SNPs informativos fue de 11,7 kb que franquean 199 kb del gen (desde el intrón 1 al exón 29). Todos los SNPs polimórficos fueron ensayados luego en cuanto a una asociación con un estado de alivio a las 6 semanas en la totalidad de los 255 pacientes deprimidos. Un alivio fue definido como haberse alcanzado una calificación total menor o igual que 8 en la escala de Calificación de Depresiones de Hamilton (véase el método para más detalles). Hemos encontrado una asociación significativa con un alivio (p < 0,05) para 7 SNPs: los rs 1055302, rs 17064, rs 2235067, rs 2032583, rs 2235040, rs 2032588 y rs 2235015 (véase la Tabla 7). Para investigar si la asociación con un estado de alivio depende de sí el fármaco antidepresivo recibido por los pacientes era un substrato potencial de la ABCB1 humana, hemos repartido a los pacientes en subgrupos de acuerdo con su medicación antidepresiva en las primeras 6 semanas del tratamiento. El primer grupo de pacientes había recibido unos substratos de abcb1ab: citalopram, paroxetina o venlafaxina como tratamiento con antidepresivos dentro de las primeras 6 semanas (n = 86) y el segundo grupo había recibido mirtazapina (n = 65), cuya concentración intracerebral no se encontró que sea regulada por el abcb1ab en el modelo de ratón desprovisto de inmunidad. Un análisis de la asociación con el estado de alivio en el primer grupo de pacientes reveló unas asociaciones significativas con los rs 2235015, rs 2235040, rs 2235067, rs 2032583, rs 17064, rs 2032588 y rs 1055302, mostrando el primer SNP la más fuerte asociación (p < 0,00008). En el grupo de pacientes que recibieron mirtazapina no se podría detectar ninguna asociación significativa con ninguno de los SNPs ensayados (véase la Tabla 7). Las relaciones desiguales para la asociación en cuanto a un alivio dentro de seis semanas con el genotipo rs 2235015, fueron de 2,056 (una Cl de 95 % = 1,27-3,32) para todos los pacientes, de 6,15 (una Cl de 95 % = 2,54-14,67) para los pacientes tratados con citalopram/paroxetina/venlafaxina y de 1,83 (una Cl de 95 % = 0,73-4,55) para los pacientes tratados con mirtazapina,
2.3 Análisis de los haplotipos y determinación del desequilibrio de vinculación
Hemos construido entonces todos los haplotipos posibles para los SNPs polimórficos con el genotipo determinado dentro la ABCB1 y hemos repetido el análisis de la asociación con el estado de alivio para los tres grupos de pacientes (todos los pacientes, los pacientes que recibieron substratos de la abcb1ab y los pacientes que recibieron mirtazapina). Incluso aunque algunos haplotipos mostraron un valor de OR más alto en los primeros grupos de dos pacientes, la asociación no era diferente de manera estadísticamente significativa respecto con respecto del rs 2235015, puesto que los intervalos de confianza se solapaban, sugiriendo que la mayor parte de la asociación es llevada por este SNP. Disponiendo paralelamente los datos de SNPs individuales, no se encontró ninguna asociación de haplotipos en el grupo de pacientes que habían recibido mirtazapina. Con el fin de estrechar posiblemente la región de la ABCB1 que contenía la variante causal, habíamos analizado la estructura de bloques del desequilibrio de vinculación (LD) de los SNPs investigados dentro de la ABCB1 usando los genotipos de todos los casos así como de 339 testigos sanos. De manera similar a los informes anteriores en la bibliografía 13,14 , habíamos detectado solamente un bloque de haplotipos, que franquea la región examinada de la ABCB1 (véase la Figura 2). Por lo tanto es difícil identificar el rs 2235015 o cualquier otro SNP como la mutación causal potencial. Unas cuidadosas caracterizaciones de las secuencias funcionales de los SNPs investigados y de los resultantes haplotipos in vitro e in vivo son garantizadas con el fin de estrechar el polimorfismo causal potencial o la combinación de polimorfismos.
2.4 Uso del genotipo rs 2235015 para la predicción de un alivio frente al tratamiento con un antidepresivo
Para evaluar si el conocimiento de los genotipos de SNPs en la ABCB1 podría permitir la predicción de un alivio después de seis semanas de tratamiento, se empleó un análisis discriminante del genotipo rs 2235015 (variable de grupo) y el estado de alivio a las seis semanas (variable independiente) en unos pacientes tratados con citalopram/ paroxetina/venlafaxina, que mostró un poder discriminante significativo global de este SNP; Wilks lambda = 0,792; X2 = 19,4; df = 1; p = 1,0 x 10-5. Usando este polimorfismo, un 75,6 % de los pacientes que recibieron substratos de la ABCB1 fueron clasificados correctamente en aliviados y no aliviados; siendo definido un alivio como haberse alcanzado una calificación HAM-D igual a o menor que 8 después de 6 semanas de tratamiento. En el grupo de pacientes tratados con mirtazapina, no se podría detectar ningún poder discriminante significativo de este SNP. Para ensayar si el poder discriminante podría ser aumentado añadiendo los genotipos de rs 2235040, que es el segundo SNP asociado más fuerte, hemos incluido este polimorfismo en el análisis. Mientras que ambos SNPs contribuían significativamente al poder discriminante (rs 2235015: Wilks lambda = 0,792, p = 1,0 3 10-5 y rs 2235040: Wilks lambda = 0,875, p = 0,0008), la adición del segundo genotipo no aumenta el número de pacientes correctamente clasificados en el grupo tratado con citalopram/paroxetina/venlafaxina. Esto indicaría que la determinación del genotipo de rs 2235015 es suficiente para predecir un estado de alivio con un grado de certidumbre de más de 75 % en unos pacientes que recibían substratos de la ABCB1. La Figura 3 muestra una distribución del genotipo rs 2235015 entre aliviados y no aliviados para los pacientes tratados con mirtazapina en comparación con los tratados con citalopram/paroxetina/venlafaxina.
2.5 El genotipo rs 2235015 no está asociado con diferencias en los niveles en plasma de fármacos
Se ha informado que los SNPs en la ABCB1 influyen sobre la asimilación intestinal y por lo tanto sobre los niveles en plasma de fármacos 15,16. Unas diferencias en los niveles en plasma pueden conducir también a unas diferencias en la tolerancia del fármaco y por lo tanto potencialmente a unas diferencias en la dosificación del fármaco. Para excluir que el efecto que estamos viendo está basado solamente en diferencias en la asimilación intestinal, hemos comparado los niveles en plasma y las dosis administradas de citalopram (N = 35), de paroxetina (N = 29), de venlafaxina (N = 22) y de mirtazapina (N = 65) de acuerdo con el genotipo de rs 2235015. En el curso del estudio, una evaluación rutinaria de los niveles de venlafaxina en plasma estaba disponible solamente después de que hubieran sido reclutados la mitad de los pacientes, de manera tal que para este fármaco se midieron solamente niveles en plasma para homocigotos GG. No se podría encontrar ninguna significativa diferencia dependiente de un genotipo para los niveles medios en plasma y la dosis administrada de la totalidad de los cuatro antidepresivos durante las primeras seis semanas de tratamiento (véanse las Figuras 4A y 4B). Se puede rechazar por lo tanto la posibilidad de que la asociación del estado de alivio con el genotipo rs 2235015 esté relacionada con unas diferencias en los niveles en plasma, apoyando así la hipótesis de que las diferencias en la respuesta a un tratamiento, relacionadas con un genotipo, están vinculadas con unas diferencias en las concentraciones intracerebrales de los fármacos. Además, no hemos observado ninguna diferencia en la distribución del genotipo rs 2235015 entre los cuatro fármacos, indicando que el genotipo no influye sobre la elección del antidepresivo administrado.
3. Discusión
Este estudio muestra por primera vez que un alivio de síntomas depresivos inducido por un antidepresivo puede ser predicho por un SNP, particularmente por el rs 2235015 en el gen de la ABCB1. Esta asociación entre un curso clínico y el polimorfismo de la ABCB1 es encontrada en pacientes deprimidos tratados con fármacos que son un substrato de una glicoproteína p codificada por la ABCB1. Para identificar si los antidepresivos administrados a pacientes son o no substratos de una glicoproteína p, se estudiaron unos mutantes de ratón que carecían de los homólogos en ratón de la ABCB1. Estos hallazgos subrayan la necesidad de clasificar los antidepresivos de acuerdo con su propiedad como substratos de una glicoproteína p.
Hasta ahora, no ha sido posible predecir la afinidad de un substrato para una glicoproteína p a partir de la estructura química, ni a partir de la hidrofobicidad, de la lipofilicidad o de la carga. No han sido identificadas unas características estructurales que permitan explicar porqué la venlafaxina, el citalopram y la paroxetina son substratos, pero la mirtazapina no lo es. Por lo tanto, un modelo con animales, en este caso con mutantes de ratones que carecen de homólogos de la ABCB1 es útil para averiguar si un antidepresivo dado es un substrato de una glicoproteína p. Estos resultados sugieren una similar especificad para un substrato entre un ratón y un ser humano, apoyando que las mutaciones nulas de abcb1a y de abcb1b son unos modelos apropiados para la pérdida de función de la ABCB1 humana.
Numerosos artículos describen polimorfismos en esta ABCB1 17-24 y se enumeran más de 230 SNPs en bases de datos públicas de SNPs para la ABCB1. El polimorfismo mas estudiado es un SNP silencioso, el rs 1045642 en el exón 26 (27 de acuerdo con la secuencia de referencia humana; UCSC versión hg15), con frecuencia citado como C3435T 14,16 encontraron una asociación entre este polimorfismo C3435T y una epilepsia resistente a fármacos, sugiriendo unos posibles efectos de este polimorfismo sobre las concentraciones intracerebrales de fármacos antiepilépticos. En este estudio, sin embargo, no se hizo ninguna distinción de acuerdo con el estado del substrato de una glicoproteína p de los anticonvulsivos usados. Solamente un estudio investigó unos polimorfismos de la ABCB1, más específicamente del C3435T, en relación con los efectos clínicos inducidos por antidepresivos 25. En este estudio, los pacientes fueron tratados con nortriptilina, que es un substrato de una glicoproteína p, o con fluoxetina, que no es un substrato de una glicoproteína p 26,27. No se encontró ninguna asociación significativa entre el genotipo C3435T y la respuesta antidepresiva a cualquiera de los fármacos, lo que está en concordancia con la falta de asociación con un estado de alivio a las 6 semanas, que hemos observado con este mismo polimorfismo.
En conclusión, el hallazgo aquí informado de que la determinación de genotipos de polimorfismos específicos, tal como el rs 2235015, podría permitir predecir una respuesta clínica a una clase distinta de antidepresivos es una etapa adicional hacia una terapia diferencial de acuerdo con un fondo genético individual. Los substratos de una glicoproteína p podrían ser el fármaco a elegir en pacientes con los genotipos GT o TT de rs 2235015 (véase la Figura 3). Además, los pacientes con el genotipo GG, asociados presumiblemente con unas concentraciones intracerebrales insuficientes de substratos antidepresivos de una glicoproteína p pueden beneficiarse de una medicación concomitante con un fármaco que mediante un bloqueo del transportador de la ABCB1 intensifica las concentraciones intracerebrales de antidepresivos. Junto al beneficio para el paciente individual que recibe unos fármacos ajustados a medida de su(s) genotipo(s), la predicción de una respuesta por un genotipo plantea importantes cuestiones para el reclutamiento y enrolamiento de participantes en las pruebas. Una vez que una diferencia en la especificidad para un substrato para una glicoproteína p ha sido establecida para dos fármacos comparativos, los actuales hallazgos requieren una estratificación apropiada de las muestras de estudios clínicos, para evitar unos sesgos en el muestreo. Un tal sesgo puede tener graves consecuencias puesto que los perfiles de respuestas a fármacos no reflejarán a los de la población general.
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LISTA DE SECUENCIAS
<110> Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V.
<120> Polimorfismos en una ABCB1 asociada con una falta de respuesta clínica a ciertos medicamentos
<130> 32791PUS
<140> US 60/570,085
<141> 2004-05-12
<160> 32
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 31
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> característica variada
<222> (6) .. (9)
<223> NM_000927; 86797791 n = a o c o g o t, desconocido, u otro w = a o t
<400> 1
aacacnnnna gaattwtgaa gaggtatctg t 31
<210> 2
<211> 31
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> característica variada
<223> NM_000927; 86763977 r = g o a
<400> 2
ctcctttcta ctggtrtttg tcttaattgg c 31
<210> 3
<211> 31
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> característica variada
<223> NM_000927; 86748149 r = g o a
<400> 3
aaagtacaag accctraact aaggcaggga c 31
<210> 4
<211> 31
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> característica variada
<223> NM_000927; 86758788 y = t o c
<400> 4
tagagtaaag tattcyaatc agtgttattt t 31
<210> 5
<211> 31
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> característica variada
<222> (6) .. (9)
<223> NM_000927; 86731697 n = a o e o g o t, desconocido, u otro w = a o t
<400> 5
aacacnnnna gaattwtgaa gaggtatctg t 31
<210> 6
<211> 31
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> característica variada
<223> NM_000927; 86777670 y = t o c
<400> 6
gcggtgatca gcagtyacat tgcacatctt t 31
<210> 7
<211> 31
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> característica variada
<223> NM_000927; 86731143 r = g o a
<400> 7
cccaaaacac agatcratat aagattttag g 31
<210> 8
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 2235015; PCR Cebador hacia Delante
<400> 8
acgttggatg cacctagacc accacaaaac 30
<210> 9
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 2235015; PCR Cebador Inverso
<400> 9
acgttggatg aaaaetgagt cagttcgacc 30
<210> 10
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 2235040; PCR Cebador hacia Delante
<400> 10
acgttggatg actggagcat tgactaccag 30
<210> 11
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 2235040; PCR Cebador Inverso
<400> 11
acgttggatg ttagtttcat gctggggtcc 30
<210> 12
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 2235067; PCR Cebador hacia Delante <400> 12
acgttggatg agtggagaaa gtgctcgaag 30
<210> 13
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 2235067; PCR Cebador Inverso
<400> 13
acgttggatg ttctacctca gagatgtccc 30
<210> 14
<211> 29
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 2032583; PCR Cebador hacia Delante
<400> 14
acgttggatg ctgggaaggt gagtcaaac 29
<210> 15
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 2032583; PCR Cebador Inverso
<400> 15
acgttggatg gcatagtaag cagtagggag 30
<210> 16
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 17064; PCR Cebador hacia Delante
<400> 16
acgttggatg gactctgaac ttgactgagg 30
<210> 17
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 17064; PCR Cebador Inverso
<400> 17
acgttggatg gtgaactctg actgtatgag 30
<210> 18
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 2032588; PCR Cebador hacia Delante
<400> 18
acgttggatg tgatgcagag gctctatgac 30
<210> 19
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 2032588; PCR Cebador Inverso
<400> 19
acgttggatg ggcaaeatca gaaagatgtg 30
<210> 20
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 1055302; PCR Cebador hacia Delante
<400> 20
acgttggatg tccacattaa ggtggctctc 30
<210> 21
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial <220>
<221> característica variada
<223> rs 1055302; PCR Cebador Inverso
<400> 21
acgttggatg tcataattgt gcctcacccc 30
<210> 22
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 2235015; Cebador de Extensión
<400> 22
accaccacaa aacaaacata 20
<210> 23
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 2235040; Cebador de Extensión
<400> 23
tgcctccttt ctactggt 18
<210> 24
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 2235067; Cebador de Extensión
<400> 24
agagaaagta caagaccct 19
<210> 25
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 2032583; Cebador de Extensión
<400> 25
aattaagtag agtaaagtat tc 22
<210> 26
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 17064; Cebador de Extensión
<400> 26
aatgttaaac agatacctct tca 23
<210> 27
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 2032588; Cebador de Extensión
<400> 27
ctgcggtgat cagcagt 17
<210> 28
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 1055302; Cebador de Extensión
<400> 28
caaacccaaa acacagatc 19
<210> 29
<211> 22
<223> ABCB1; PCR Cebador hacia Delante
<400> 29
caattaaaac tgagtcagtt cg 22
<210> 30
<211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> ABCB1; PCR Cebador Inverso
<400> 30 ttttaaacat ttctacaact tgatg
<210> 31
<211> 29
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> rs 2235015; Sonda de ancla
<400> 31
tgtatcattg atatcaccta gaccaccac 29
<210> 32
<211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<221> característica variada
<223> Sensor [G); Sonda de Sensor
<400> 32
aaacaaacat accatttatg tctct 25

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un método in vitro para determinar el pronóstico de una respuesta clínica en un paciente humano a un medicamento activo en el sistema nervioso central (SNC) que es un substrato de la proteína ABCB1, en el que se determina la presencia de por lo menos un polimorfismo en el gen de la ABCB1 de dicho paciente, en el que dicho
    5 polimorfismo está asociado con una respuesta clínica retrasada, parcial, sub-óptima o ausente a dicho medicamento, en el que el polimorfismo está situado dentro del exón 29, del intrón 5, 13, 21, 22 o 23 o de la secuencia 3’UTR del gen de la ABCB1 humana.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, en el que el polimorfismo se selecciona entre el conjunto que consiste en
    los rs 2235015, rs 2235040, rs 2235067, rs 2032583, rs 17064, rs 2032588, rs 1055302, y combinaciones de los 10 mismos.
  3. 3.
    El método de la reivindicación 2, en el que el polimorfismo es el rs 2235015 o rs 2235040.
  4. 4.
    El método de la reivindicación 3, en el que el polimorfismo es el rs 2235015.
  5. 5.
    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el polimorfismo es determinado por un análisis de determinación de genotipos.
    15 6. El método de la reivindicación 5, en el que el análisis de determinación de genotipos comprende el uso de cebadores y/o sondas que son específicos/as para un polimorfismo.
  6. 7. El método de la reivindicación 6, en el que el análisis de determinación de genotipos comprende una reacción de extensión de un cebador.
  7. 8. El método de la reivindicación 6 o 7, en el que los cebadores y/o las sondas comprenden por lo menos una 20 secuencia como se muestra en las Tablas 3, 4 y 5.
  8. 9.
    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que el análisis de determinación de genotipos comprende un análisis de micromatrices.
  9. 10.
    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que el análisis de determinación de genotipos comprende un análisis por espectrometría de masas.
    25 11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el medicamento se selecciona entre el conjunto que consiste en antidepresivos, ansiolíticos, hipnóticos, intensificadores cognitivos, antipsicóticos, agentes neuroprotectores, antieméticos, antiepilépticos, antibióticos, agentes anticancerosos, antimicóticos, agentes contra la enfermedad de Parkinson, agentes antivíricos, glucocorticoides, inmunosupresores, estatinas, neurolépticos y opioides.
    30 12. El método de la reivindicación 11, en el que el medicamento es un antidepresivo.
  10. 13.
    El método de la reivindicación 12, en el que el antidepresivo es citalopram, venlafaxina y/o paroxetina.
  11. 14.
    Una composición terapéutica o un estuche terapéutico para usarse en un método de tratamiento de un paciente humano que tiene por lo menos un polimorfismo en el gen de la ABCB1, que está asociado con una respuesta retrasada, parcial, sub-óptima o ausente a un medicamento activo en el SNC y en el que el polimorfismo está
    35 situado dentro del exón 29, del intrón 5, 13, 21-23 o de la secuencia 3’UTR del gen de la ABCB1 humana, y en el que el método de tratamiento comprende: determinar el pronóstico de una respuesta clínica en el paciente humano de acuerdo con el método de la reivindicación 1, en el que la composición terapéutica o el estuche terapéutico comprende:
    40 (a) un medicamento activo en el SNC, que es un substrato de la proteína ABCB1, seleccionado entre antidepresivos, ansiolíticos, hipnóticos, intensificadores cognitivos, antipsicóticos, antieméticos, antiepilépticos, agentes contra la enfermedad de Parkinson, neurolépticos y opioides; y
    (b) un medicamento adicional que es un inhibidor de la proteína ABCB1.
  12. 15. La composición terapéutica o el estuche terapéutico de acuerdo con la reivindicación 14, en la/el que los antidepresivos se seleccionan entre amitriptilina, citalopram, doxepina, flesinoxano, nortriptilina, paroxetina, trimipramina y venlafaxina, los ansiolíticos se seleccionan entre alprazolam, bromazepam, clonazepam, diazepam, lorazepam, halazepam, clorodiazepóxido,
    5 buspirona, azapirona, pagoclone, prazosina, biperideno y kava kava, los hipnóticos se seleccionan entre secobarbital, pentobarbital, metacualona, etoclorovinol, hidrato de cloral y meprobamato, los intensificadores cognitivos se seleccionan entre acetil L-carnitina, adrafinilo, aniracetam, deprenilo, galantamina, hidergina, idebenona, modafinilo, picamilon, piracetam, piritinol, vasopresina y vinpocetina, los antipsicóticos se seleccionan entre risperidona, olanzapina, quetiapina, ziprasidona, cloropromazina, flufenazina, trifluoparazina, perfenazina,
    10 tioridazina, haloperidol, tiotixeno, molindona, loxapina, clozapina, olanzapina, quetiapina, risperidona, sertindol, ziprasidona, amisulpida, aripriprazol, benperidol, cloropromazina, clorprotixeno, flupentixol, fluspirileno, levomepromazina, benperidol, melperona, perazina, perfenazina, pimozida, pipamperona, sulpirida, triflupromazina, zotepina y zuclopentixol, los ntieméticos se seleccionan entre domperidona y ondansetrona, los antiepilépticos se seleccionan entre carbamazepina, felbamato, lamotrigina, fenobarbital y fenitoína, los agentes contra la enfermedad
    15 de Parkinson se seleccionan entre budipina y L-Dopa, los neurolépticos se seleccionan entre olanzapina, quetiapina, risperidona y sulpirida, y/o los opioides se seleccionan entre fentanil y morfina.
ES05748517T 2004-05-12 2005-05-12 Método para detectar polimorfismos en el gen de la ABCB1 asociados con una falta de respuesta a un medicamento activo en el SNC y medicamento que comprende un agente inhibidor de la ABCB1 para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con el SNC Active ES2397345T3 (es)

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