KR20020059347A - 인간 ｍｄｒ-1 유전자내 다형 및 진단 및 치료에 있어서그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 다중약물 내성-1(MDR-1) 유전자의 유전형 비정상 발현 및/또는 기능의 여러 형태를 갖는 중첩 임상 특성 뿐만 아니라 표현형 스펙트럼을 진단 및 치료하는 수단 및 방법, 특히, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 표적 세포 및 벡터에 의한 약물의 불충분한 및/또는 변형된 흡수와 관련된 분자변이체 MDR-1 유전자의 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주세포 및 변이체 MDR-1 단백질을 제조하기 위해 그들을 사용하는 것, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 트랜스제닉 비-인간 동물 뿐만 아니라 상기 단백질을 특이적으로 인식하는 항체 및 변이체 MDR-1 단백질, MDR-1 유전자의 기능부전과 관련된 질병을 치료하기 위한 억제물질을 확인 및 수득하는 방법 뿐만 아니라 상기 질병상황을 진단하는 방법, 상기 방법에 의한 폴리뉴클레오티드, 벡터, 단백질, 항체 및 억제물질을 포함하는 약학적 및 진단용 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 MDR-1 유전자 생성물의 기질, 억제물질 또는 조절인자인 약물에 의해 여러 질병들을 진단 및 치료하기 위해 사용할 수 있는 것을 특징으로 한다.
Description
인간 MDR-1 유전자는 세포내부 및 세포막으로부터 세포외부로 다른 물질들을 에너지 의존적으로 운반하는 기능을 갖는 내재성 막 단백질을 코딩한다. MDR-1의 정상적인 생리기능이 대부분 독소물질로부터 세포를 보호하는 것인 반면, 많은 MDR-1 운반체의 많은 기질들이 인간 질병을 치료하기 위해 개발된 약물이라는 것도 또한 알려져 있다. 그때문에, MDR-1 유전자 생성물의 발현정도 및 기능성이 MDR-1의 기질로서 제공하는 특정 약물의 효능에 직접 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 발현수준, 및 MDR-1의 기능 정도가 암치료법에서 항암 약물의 효능에 직접 영향을 미친다는 것이 잘 알려져 있다. 사실, 유전자명 "MDR"은 다중-약물-내성(Multi-Drug-Resistance)을 나타내며, 상기 유전자에 의해 코딩된 단백질로 인해 암세포가 많은 약물들에 의한 치료에 대해 내성물질이 되도록 하는 것을 의미하며, 상기 모두 MDR-1 운반체의 기질이다.
MDR-1 유전자는 약물이 들어가는 것에 대해 보호장벽을 제공함으로써 약물의 치료효능에 직접 영향을 미치는 특정 암세포상에서 뿐만 아니라 결장 및 혈뇌장벽과 같은 여러 기관내에서 발현된다. 또한, 상기 세포 MDR-1은 약물의 활성도 및 유용도에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 결장내 MDR-1은 경구 약물섭취후 결장으로부터 약물흡수도를 조절 또는 조정할 수 있다. 혈뇌장벽에서 MDR-1은 MDR-1 기질이 뇌로 흡수될 수 있는 정도에 영향을 미치거나 또는 조절할 수도 있다. 여기에서, 높아진 MDR-1 활성도는 뇌로 충분한 양의 원하는 뇌-약물이 흡수되는 것을 막거나, 또는 역으로도 마찬가지이며, 특정 약물에 대한 감소된 활성도를 갖는 MDR-1 변이체가 뇌안에 비정상적으로 많이 축적되어 원치않는 또는 위험한 약물부작용이 야기된다.
정상세포 및 조직 뿐만 아니라 악성세포내 MDR-1 의존성 운반을 조절하는 통상적인 요소는 MDR-1의 활성도이다. MDR-1 활성도는 (ⅰ)세포내에서 합성되는 MDR-1 단백질의 양을 결정하는 MDR-1 유전자의 발현수준, 및 (ⅱ)효능을 갖는 세포밖으로 기질이 인식 및 운반되는, 합성 MDR-1 단백질의 기능성에 따라 다르다.
특히 암 화학요법에 대한 종양세포의 민감도는 종종 MDR-발현의 상향조절과 역으로 상관관계가 있기때문에, 즉 높은 MDR-1 발현은 암 화학요법의 불충분한 효능과 상관관계가 있기때문에 상기 첫번째 변수인 MDR-1의 발현수준은 집중분석되어왔다. 관찰된 MDR-1 과잉발현은 MDR-1 유전자 증폭에 일부 기여할 수 있지만, 아직까지 예측되지 않은 이유들도 또한 존재한다는 것이 알려져 있으며, 이중에서도 대립유전자 차이가 가능하다. 각 MDR-1 유전자 서열내 적은 차이들이 다른 수준의 MDR-1 유전자 발현의 원인이 된다. MDR-1 유전자 발현에 직접 영향을 미치는, 서열차이가 존재하는 인간 게놈내 표적 영역은 유전자 발현의 조절영역: MDR-1 pre-mRNA의 스플라이싱 효능 또는 방법에 영향을 미치는 영역 및 MDR-1의 프로모터 및 증강제 영역이다. 그리고, 발현수준은 게놈내 구조변화, 가령 메틸화, 일반적인 크로마틴 변형 및 MDR-1 유전자를 둘러싸는 영역 또는 영역내에서 MDR-1과 직접 결합된 다른 요소들에 의해 영향을 받을 수 있다. 상기 결합요소들 또는 서열들을 직접 착아내고, 그들의 유전자 활성화 또는 억압을 증명하기는 매우 어렵다. 그러나, 정의된 염색체상 인간 게놈의 선형 구조는 확인된 다형(polymorphism)을 이용할 수 있는 가능성을 공개하며, 이들에 의해 발현수준에 영향을 미치는 MDR-1 유전자내 및 유전자 주위에서 확인되지 않은 변화에 대한 표지로서 유전자의 발현수준에 직접 영향을 미치지 않는다. 상기 효과는 결합으로서 알려져 있으며: 정의된 대립유전자 및 염기 변형은 상기 변화가 표현형의 원인이 되지 않는 경우에도 중요한 표현형에 대한 표지로서 제공할 수 있다.
두번째 변수, 즉 상기 효능을 갖는 세포외로 기질이 인식 및 운반되는 합성 MDR-1 단백질의 기능성은 MDR-1 대립유전자에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열에 의해 우선적으로 측정된다. 아미노산 변화가 단백질의 기능성을 변형시킨다는 사실은 잘 알려져 있다. 자연발생하는 변형에 대한 예, 가령 다양한 약물의 작용에 직접적인 영향을 미치는 다른 대립유전자는 시토크롬 P450 다형 또는 TPMT, APOE 및 다양한 다른 유전자들내 다형이다. 또한, p53 유전자내 종양관련 변형은 상기 표현형을 매개하는 것으로 알려져 있다. 아직까지 MDR-1 유전자내 일부 다형만 개시되어 있으며, 임상효과와 상호연관되어 있다(Micklev, Blood 91(1998), 1749-1756). 상기 이상의 다형이 존재하는지의 여부, 및 약물 활성도 및/또는 약물 부작용과 상호연관될 수 있는지의 여부에 대한 주요 문제점은 이 분야에 남아있다. MDR-1 유전자내에서 인위적으로 도입된 변형에 의한 실험은 MDR-1이 아미노산 교환에 매우 민감하게 반응하는 사실을 명백하게 보여준다. 단백질 변화로 해독하는 MDR-1 유전자내 인위 돌연변이 변화가 기질 스펙트럼, 기질 운반의 효능, 운반조절 및 특이적 억제물질에 의한 억제에 대한 MDR-1의 민감도를 변경시킬 수 있다는 것을 보여준다. 자연발생 돌연변이가 유사한 효과를 가질 수 있다는 사실은 분명하다. 그러나, 얼마나 많은 변이가 존재하고, 빈도가 어느 정도인지, 인간 MDR-1 유전자내 어느 위치에 존재하는지 알려져 있지 않다.
따라서, 암과 같은 질병의 화학요법 치료를 방해하는 MDR-1 유전자 다형 및 민감도로부터 야기되는 다양한 형태의 다중약물내성을 진단 및 치료하는 수단 및 방법이 지금까지는 사용할 수 없었지만 매우 원하고 있다.
그러므로, 본 발명의 기술적인 문제는 상기 필요성에 따르고 있다.
상기 기술적인 문제에 대한 해결방법은 청구범위에서 특징화되는 구체예를 제공함으로써 얻어진다.
발명의 요약
본 발명은 인간 MDR-1(Multi Drug Resistance) 유전자의 뉴클레오티드 서열내 아직까지 알려지지 않은 새로운 변이 및 상기 대립유전자의 집단분포를 발견하는것에 기초되어 있다. 상기 서열 및 MDR-1 유전자 염기 변형의 지식에 기초하여, 동종접합형성 뿐만 아니라 이종접합형성, 빈번할 뿐만 아니라 희박한 MDR-1 유전자의 대립유전자를 포함하는 인간내 MDR-1 대립유전자의 특이 검출 및유전형(genotyping)을 위해, 상기 시험용 진단시험 및 시약을 제조하였다. 상기 시험에 의해 인간의 MDR-1 유전자 대립유전자 상황을 결정하는 것은 약물, 즉 MDR-1 유전자 생성물의 기질, 억제물질 또는 조절인자에 의한 여러 질병 치료법에 유용하다.
첫번째 구체예에서, 본 발명은 분자변이체 MDR-1 유전자의 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 구체예는 벡터, 숙주세포, 변이체 MDR-1 단백질 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 후천성 다중약물 내성에 관한 질병을 치료하기 위한 MDR-1의 약물 후보물질 및 억제물질을 확인 및 수득하는 방법 뿐만 아니라 상기 질병의 상태를 진단하는 방법에 관한 것이다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드, 이를 함유하는 벡터, 단백질, 그에 대한 항체 및 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 약물 및 억제물질을 포함하는 약학적 및 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 및 진단용 조성물, 방법 및 용도는 약물치료에 의존하는 치료법에서, 종양 및 다른 질병내 유전된 약물내성의 진단 및 치료에 사용가능하다. 본 발명에 따른 새로운 변이형태의 MDR-1 유전자는 주어진 환자를 위한 약물 및 프로드럭의 약동학적 프로필을 개발하기 위한 퍼텐셜을 제공한다.
본 발명은 다중약물내성-1(Multi Drug Resistance-1)(MDR-1) 유전자의 여러 종류의 고유 이상발현 및/또는 기능으로 표현형 스펙트럼 뿐만 아니라 중복 임상특성을 진단 및 치료하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 표적세포에 의한 약물의 불충분 및/또는 변경된 흡수와 관련된 분자 변이체 MDR-1 유전자의 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 그리고, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 변이체 MDR-1 단백질을 제조하는데 있어서 그의 용도에 관한 것이다. 그리고, 본 발명은 변이체 MDR-1 단백질, 및 상기 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 트랜스제닉 비-인간 동물에 관한 것이다. 게다가 본 발명은 MDR-1 유전자의 기능부전과 연관된 질병을 치료하기 위한 약물 후보물질 및 억제물질을 확인 및 수득하는 방법 뿐만 아니라, 상기 질병상태를 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 수득가능한 억제물질, 및 상기 폴리뉴클레오티드, 벡터, 단백질, 항체 및 약물을포함하는 약학적 진단조성물을 제공한다. 상기 조성물은 MDR-1 유전자의 기질, 억제물질 또는 조절인자, 또는 그의 생성물인 약물로 여러 질병들을 진단 및 치료하는데 특히 유용하다.
본 명세서중에는 여러 문헌들이 전체적으로 인용되어 있다. 인용된 각 문헌(제조사의 명세서, 소개 등 포함)들은 이후에 참고문헌으로 통합될 것이지만, 인용된 문헌이 본 발명에 대한 종래 기술이라고는 인정되지 않는다.
도 1a 및 1b: 정제 전 및 후의 선택된 PCR 절편의 겔. 정제 단계 전(A) 및 후(B)의 MDR-1 PCR 절편의 아가로스(Appli Chem, Darmstadt) 겔 전기영동 (1.5% 아가로스 겔). M: 분자량 표시기, 1-28: 인간 MDR-1 유전자의 엑손 1-28의 서열을 포함하고, 상기 엑손에 플랭킹하는 관련 서열을 포함하는 PCR 절편.
도 2a-2e: 동종접합형 및 이종접합형 MDR-1 대립유전자에 대한 실시예. 인간 MDR-1 유전자의 엑손 1-28의 서열을 포함하고, 상기 엑손에 플랭킹하는 관련 서열을 포함하는 PCR 절편의 서열이 ABI Dyeterminator 기술을 사용하여 자동화 시퀀싱에 의해 결정된다. 공개된 MDR-1 서열로부터 이종접합형 및 동종접합형 편위(deviation)가 DNA 서열 프로필에서 직접 검출될 수 있다.
도 3: 동종접합형 및 이종접합형 MDR-1 대립유전자의 진단을 위한 실시예. 엑손 2(261 bp) 및 엑손 5(180 bp)의 대립유전자 특이 PCR 절편의 아가로스 (AppliChem, Darmstadt) 겔 전기영동 (1.5% 아가로스 겔).
본 발명은 하기 생물학적 실시예를 참고하여 기술될 것이며, 이는 단지 상술하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
MDR-1 유전자내 변이의 발견 및 특징화, 및 인간 각각내에서 다른 MDR-1 대립유전자를 식별하기 위한 진단시험은 MDR-1 유전자 생성물의 표적이 되고, 세포흡수가 MDR-1에 따라 다른 약물에 의한 질병치료법을 개선시키기 위한 매우 잠재적인 툴을 제공한다. 각 대립유전자 MDR-1 상황의 진단은 약물의 각 투여요법을 적용할 수 있는 가능성을 공개하는 것과 같은 보다 집중된 치료법을 허용한다. 또한, 예후표지로서 일반적인 MDR-1 발현을 사용하는 것에 관한 개선된 접근법인 치료결과를 위한 예후툴로서 사용할 수도 있다. 그리고, 유전형 MDR-1 및 새로운 MDR-1 변이체에 대한 진단시험은 약물요법을 개선시킬 뿐만 아니라, 약물활성도 또는 부작용과 유전형을 서로 관련시키는데 도움이 될 것이다. 상기 시험 및 순서는 각 종류의 MDR-1의 활성도를 특이적으로 조정하는 억제물질을 개발하기 위한 시약을 제공한다. 각 (인조) MDR-변이체의 특이적 억제물질을 사용할 수 있는 가능성 및 그의 잠재적인 치료용도는 예를 들어, 모델시스템(Moscow J.A. 외 다수, Blood 94 (1999), 52-61; Dey S. 외 다수, Biochemistry 38 (1999), 6630-6639)에 입증되어 있다.
따라서, 본 발명은 변이체 MDR-1 유전자의 발현으로 인한 그의 잠재적인 유해효과를 바이패스하면서 약물요법을 위한 분자생물학 및 약물학적 연구를 이루는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은:
(a)SEQ ID NOs: 73, 74, 79, 80, 85, 86, 91, 92, 97, 98, 101, 106, 107, 112, 113, 116, 119, 122, 154, 155, 160, 161, 166, 167, 172, 173, 178, 179, 184, 185, 190, 191, 196, 197, 202, 203, 208, 209, 214, 215, 220, 221, 226, 227, 232, 233, 238, 239, 244, 245, 250, 251, 256, 257, 262, 263, 268, 269,274, 275, 280, 281, 286, 287, 292, 293, 298, 299, 304, 305, 310, 311, 316, 317, 322, 323, 328, 329, 334, 335, 340, 341, 346, 347, 352, 353, 358, 359, 364, 365, 370 또는 371 중 어느 하나의 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드;
(b)SEQ ID NOs: 372, 373, 374 또는 375 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(c)MDR-1 유전자(Accession No: AC002457)의 위치 140837, 141530, 141590, 171466, 171512 또는 175068에 대응하는 위치, MDR-1 유전자(Accession No: M29432 또는 J05168)의 위치 101 또는 308에 대응하는 위치, MDR-1 유전자(Accession No: AC005068)의 위치 83946에 대응하는 위치, MDR-1 유전자(Accession No: AC005068)의 위치 78170에 대응하는 위치, MDR-1 유전자(Accession No: M29445 또는 J05168)의 위치 176에 대응하는 위치, MDR-1 유전자(Accession No: AC002457)의 위치 171456, 171404 또는 175074에 대응하는 위치, MDR-1 유전자(Accession N.:AC005068)의 위치 77811에 대응하는 위치 또는 MDR-1 유전자(Accession No: M29445 또는 J05168)의 위치 137에 대응하는 위치에서 뉴클레오티드 교환, 뉴클레오티드 결실, 추가의 뉴클레오티드 또는 추가의 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 교환을 가지며, 분자변이체 다중약물내성(MDR)-1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(d)MDR-1 유전자(Accession No: AC002457)의 위치 140837, 171512, 171456, 171404, 139119, 139619, 140490 또는 171511에 대응하는 위치에서 C를 갖고, MDR-1 유전자(Accession No: AC002457)의 위치 141530, 139177, 139479, 140118,140568, 140727 또는 174901에 대응하는 위치에서 A를 갖고, MDR-1 유전자(Accession No: AC002457)의 위치 141590, 139015, 140216, 140595, 175142 또는 175180에 대응하는 위치에서 G를 갖고, MDR-1 유전자(Accession No: AC002457)의 위치 171466, 175068, 175074, 139064, 139276, 140576 또는 145984에 대응하는 위치에서 T를 갖고, MDR-1 유전자(Accession No: M29432 또는 J05168)의 위치 101에 대응하는 위치에서 A를 갖고, MDR-1 유전자(Accession No: M29432 또는 J05168)의 위치 308에 대응하는 위치에서 T를 갖고, MDR-1 유전자(Accession No: AC005068)의 위치 83946, 78170, 70237 또는 70200에 대응하는 위치에서 T를 갖고, MDR-1 유전자(Accession No: AC005068)의 위치 77811, 84032 또는 73252에 대응하는 위치에서 G를 갖고, MDR-1 유전자(Accession No: AC005068)의 위치 84701, 84074, 84119, 83973, 70371, 70253, 70204 또는 43162에 대응하는 위치에서 A를 갖고, MDR-1 유전자(Accession No: AC005068)의 위치 43263에 대응하는 위치에서 C를 갖고, 또는 MDR-1 유전자(Accession No: M29445 또는 J05168)의 위치 176 또는 137에 대응하는 위치에서 T를 갖고, 분자변이체 MDR-1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
(e)폴리펩티드가 MDR-1 폴리펩티드(Accession No: P08183)의 위치 21, 103 또는 400에서 아미노산 치환을 포함하는, 분자변이체 MDR-1 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
(f)폴리펩티드가 MDR-1 폴리펩티드(Accession No: P08183)의 위치 21에서 N의 D로의 아미노산 치환, 위치 103에서 F의 S로의 아미노산 치환, 위치 103에서 F의 L로의 아미노산 치환, 또는 위치 400에서 S의 N으로의 아미노산 치환을 포함하는, 분자변이체 MDR-1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 명세서에서, "분자변이체" MDR-1 유전자 또는 단백질이라는 용어는 상기 MDR-1 유전자 또는 단백질이 뉴클레오티드 치환, 첨가 및/또는 결실에 의해 야생형 MDR-1 유전자 또는 단백질과 상이하다는 것을 의미한다(MDR-1 유전자의 게놈 서열은 예를 들어, 엑손 1-7에 대해: Accession number AC002457; 엑손 8에 대해: Accession number M29429, J05168, AC005068; 엑손 9에 대해: Accession number M29430, J05168, AC005068; 엑손 10에 대해: Accession number M29431, J05168, AC005068; 엑손 11 내지 13에 대해: Accessin number M29432, J05168 및 AC005068; 엑손 14에 대해: Accession number M29433, J05168 및 AC005068; 엑손 15에 대해: Accession number M29434, J05168, AC005068; 엑손 16에 대해: Accession number M29435, J05168, AC005068; 엑손 17에 대해: Accession number M29436, J05168, AC005068; 엑손 18에 대해: Accession number M29437, J05168, AC005068; 엑손 19에 대해: Accession number M29438, J05168, AC005068; 엑손 20에 대해: Accession number M29439, J05168, AC005068; 엑손 21에 대해: Accession number M29440, J05168, AC005068; 엑손 22에 대해: Accession number M29441, J05168, AC005068; 엑손 23에 대해: Accession number M29442, J05168, AC005068; 엑손 24에 대해: Accession number M29443, J05168, AC005068; 엑손 25에 대해: Accession number M29444, J05168, AC005068; 엑손 26에 대해: Accession numberM29445, J05168, AF016535, AC005068; 엑손 27에 대해: Accession number M29446, J05168, AC005068; 엑손 28에 대해: Accession number M29447, J05168, AC005068로 기술된다). 상기 뉴클레오티드 치환으로 인해 MDR-1 단백질의 아미노산 서열을 대응하게 변화시키는 것이 바람직하다.
본 명세서에서 "대응(corresponding)"이라는 용어는 위치가 이전 뉴클레오티드 및 아미노산의 번호에 의해 각각 결정된다는 것을 의미한다. 결실, 치환 또는 하나 또는 그 이상의 추가의 뉴클레오티드인, 본 발명에 따른 주어진 뉴클레오티드 또는 아미노산의 위치는 유전자 또는 폴리펩티드내 추가의 뉴클레오티드 또는 아미노산 또는 결실로 인해 다양하다. 따라서, 본 발명에 따른 "대응 위치"하에서, 뉴클레오티드 또는 아미노산이 지시번호내에서 상이하지만, 여전히 유사한 이웃 뉴클레오티드 또는 아미노산을 가질 수 있는 것으로 이해된다. 교환, 결실 또는 추가의 뉴클레오티드 또는 아미노산을 포함할 수 있는 상기 뉴클레오티드 또는 아미노산은 또한 "대응 위치"라는 용어에 포함될 수도 있다. 상기 뉴클레오티드 또는 아미노산은 본 발명의 단백질의 기능도메인 또는 모티프를 코딩할 뿐만 아니라, 대응하는 RNA 또는 RNA 편집의 안정성, 유전자 발현 조절에 포함되는 이웃형태 서열과 함께 있을 수 있다.
본 발명에 따라, MDR-1 유전자내 지금까지 확인되지 않은 유전적 변형의 방법 및 집단분포는 많은 다른 개인으로부터 인간 MDR-1 유전자의 관련영역을 서열분석함으로써 분석하였다. MDR-1을 포함하는, 모든 유전자의 각 유전적 제조를 숨기는 개인의 게놈 DNA가 각 혈액 샘플에서 쉽게 정제될 수 있다는 사실은 잘 알려져있다. 상기 각 DNA 샘플은 혈액 샘플이 제공되는 개인에 존재하는 MDR-1 유전자 대립유전자의 서열조성을 분석하기 위해 사용된다. 서열분석은 MDR-1 유전자의 관련 영역의 PCR 증폭, PCR 생성물의 정제, 확립방법에 의한 자동 DNA 시퀀싱(ABI 염색종결인자 주기 시퀀싱(dyeterminator cycle sequencing))에 의해 실시하였다.
인간 혈액 게놈 DNA로부터 PCR-생성물을 직접 DNA-시퀀싱함으로써 각각의 MDR-1 유전형을 결정하고, 새로운 MDR-1 변이체를 확인하기 위한 시도에 고려되어야 하는 한가지 중요한 변수는 (보통, 극소수의 비정상을 제외하고) 각 인간이 각 상염색체 유전자(두배수체)의 두개의 유전자 복제본을 숨기고 있다는 사실이다. 상기로 인해, 동종접합형 서열변이 뿐만 아니라 이종접합형 변이를 확실히 확인할 수 있기 위해 서열을 평가하는데 대단히 주의해야 하였다. MDR-1 유전자 다형(동종접합형 및 이종접합형)의 식별 및 특징화에서 다른 단계들의 상세한 내용은 하기의 실시예 1 및 실시예 2에 기술되어 있다.
본 발명에 따라 발견된 MDR-1 유전자의 돌연변이는 도 2a-2e에 상술되어 있다(화살표로 표지함). 돌연변이 분석방법은 표준 프로토콜후에 하며, 실시예에 상세히 기술되어 있다. 보통, 표현형 스펙트럼 뿐만 아니라 MDR-1 유전자내 돌연변이에 의해 환자내 약물에 대한 변형된 내성 및 다른 종류의 다중약물내성을 갖는 중복하는 임상특성을 평가하기 위해 본 발명에 따라 사용되는 상기 방법은 가령, 일배체형 분석, 단일-가닥 입체형태 다형 분석(SSCA), PCR 및 직접적인 시퀀싱을 포함하며; 또한, Mickley(1998)의 문헌을 참고한다. 많은 환자들의 전체적인 임상특징화에 기초하여, 그후 표현형은 종래의 돌연변이 뿐만 아니라 상기 돌연변이와상호연관될 수 있다. 당업자에게 분명한 바와 같이, 상기 새로운 분자유전학적 지식은 주어진 약물이 비정상적인 효과 및 그 계통을 취하는 인덱스 환자의 유전형을 정확하게 특징화하기 위해 사용될 수 있다.
지난 20년간, 유전적 이질성은 약물반응 변화의 중요한 원인으로서 점차 인식되어왔다. 많은 과학문헌(Meyer, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37 (1997), 269-296 및 West, J. Clin. Pharmacol. 37 (1997), 635-648)은 일부 약물이 더 잘 동작하거나, 또는 다른 환자들보다 일부 환자들에게서 매우 독성이 되는 사실과 약물에 대한 환자 반응의 변화가 분자 기초와 관련될 수 있다는 사실들을 명백하게 보여준다. 상기 "약리게놈학적(pharmacogenomic)" 개념은 환자의 유전적 프로필과 약물에 대한 반응사이의 상관관계에 중점을 두고 있다(Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997), 954-957; Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997), 1249-1252).
약물요법과 관련된 집단 변이성의 내용에서, 부작용없이 특정 약물에 대해 반응할 수 있는 환자를 확인하고 선별하는데 유용한 툴로서 약리게놈학이 제시되어 왔다. 상기 식별/선별은 환자의 혈액내 백혈구로부터의 유전형 DNA에 의해 유전적 다형을 분자진단하는 것 및 질병의 특징화에 기초될 수 있다(Bertz, Clin. Pharmacokinet. 32 (1997), 210-256; Engel, J. Chromatogra. B. Biomed. Appl. 678 (1996), 93-103). 많은 유럽국가내 정부공공 헬스서비스 및 미국내 건강유지기관과 같은 헬스 케어의 발기인들을 위해, 상기 약리게놈학 접근은 헬스 케어를 증진시키고, 불필요한 약물, 효과없는 약물 및 부작용있는 약물에 비용을 들이는것으로 인한 간접비용을 감소시키는 방법을 구현할 수 있다.
변이체 MDR-1 유전자내 돌연변이로 인해 아미노산 결실, 삽입 및, 둘 또는 조합의 치환이 일어난다. 물론, 당업자는 야생형 유전자 또는 다른 변이체 형태의 상기 돌연변이를 유전적으로 처리할 수도 있다. MDR-1 유전자의 DNA 서열내에 상기 변형을 도입하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며; Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y.를 참조한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 가령, SEQ ID NOs: 85, 97, 106 또는 274에 의해 코딩되는 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열의 에피토프를 포함하는, 변이체 MDR-1 단백질 또는 그의 절편을 코딩한다.
MDR-1 단백질의 아미노산 서열내 변형성질을 조사하기 위해, 인터넷에서 입수가능한 BRASMOL과 같은 컴퓨터 프로그램이 사용될 수 있다. 그리고, 다른 적당한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 구조 모티프의 중첩 시뮬레이션(folding simulation) 및 컴퓨터 재디자인을 수행할 수 있다(Olszewski, Proteins 25 (1996), 286-299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675-679). 상세한 단백질 모델의 구조적 및 활동적 분석을 위해 컴퓨터를 사용할 수 있다(Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 995-1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37-45). 상기 분석은 약물의 결합 및/또는 운반에 특정 돌연변이가 미치는 영향을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
보통, 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열내 상기 아미노산 결실, 첨가 또는 치환은 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드 치환, 삽입 또는 결실, 또는 그의 특정 조합에 의해 야기된다. 상기 뉴클레오티드 치환, 삽입 또는 결실은 MDR-1 유전자의 엑손 2에서 Asn21의 Asp로의 아미노산 치환, 엑손 5에서 Phe103의 Ser 또는 Leu로의 치환 및/또는 엑손 11에서 Ser400의 Asn으로의 치환을 야기하는 것이 바람직하다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 Mickley (1998)과 같은 종래 문헌에 기술된 것과 같이 상기 명시된 것과 다른 적어도 하나의 뉴클레오티드 및 선택적으로 아미노산 결실, 첨가 및/또는 치환을 추가로 포함한다. 본 발명의 구체예는 상기 단백질에 의해 의태될 수 있는 유사한 변이형태 또는 유전자의 상기 변이형태를 갖는 환자내 약물의 약리학적 프로필에 MDR-1 유전자내 돌연변이가 상승효과를 미치는지에 대한 연구를 실시하였다. 상기 상승효과로 인해 특정 종류의 암의 다중약물 내성 표현형 발병을 보다 심층연구할 수 있을 것이라고 기대하고 있다. 상기 심층연구가, 암과 관련된 진단적 및 약학적 조성물을 개발하는데 많은 도움이 될 것이다.
따라서, 바람직한 구체예에서, 본 발명은 뉴클레오티드 결실, 첨가 및/또는 치환으로 인해 대응하는 야생형 유전자에 비해 변이체 MDR-1 유전자의 변형발현이 일어나는 분자변이체 MDR-1 유전자의 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 가령, DNA, cDNA, 게놈 DNA, RNA 또는 합성제조된 DNA 또는 RNA 또는, 상기 폴리뉴클레오티드를 단독으로 또는 조합하여 포함하는 재조합제조된 키메릭 핵산분자이다. 바람직하게, 상기 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 유전공학에서 종래 사용된 벡터, 특히 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지이다. 상기 벡터는 적당한 숙주세포 및 적당한 조건하에서 상기 벡터를 선택하기 위한 표지 유전자(marker gene)와 같은 추가의 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터의 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 원핵세포 또는 진핵세포내 발현시키는 발현조절서열에 조작결합된다. 상기 폴리뉴클레오티드의 발현은 해독가능한 mRNA로 폴리뉴클레오티드를 전사하는 것을 포함한다. 진핵세포, 바람직하게는 포유류 세포내 발현시키는 조절요소는 당업자에게 잘 알려져 있다. 이들은 보통, 전사를 개시하는 조절서열 및 전사물의 전사 및 안정화를 종결시키는 폴리-A 시그널을 포함한다. 추가의 조절요소는 해독가능할 뿐만 아니라 전사가능한 증강제를 포함한다. 원핵 숙주세포내에서 발현시키는 가능한 조절요소는 E.coli내lac,trp또는tac프로모터를 포함하며, 및 진핵 숙주세포내에서 발현시키는 조절요소에 대한 예로는 효모내AOX1또는GAL1프로모터 또는 CMV-프로모터, SV40-프로모터, RSV-프로모터(라우스 육종 바이러스), CMV-증강제, SV40-증강제 또는 포유류내 글로빈 인트론 및 다른 동물세포가 있다. 전사를 개시하기 위해 반응하는 요소외에, 상기 조절요소는 또한, 전사종결시그널, 가령 SV40-폴리-A 위치 또는 tk-폴리-A 위치를 폴리뉴클레오티드의 하류에 포함할 수도 있다. 본 명세서에서, Okayama-Berg cDNA 발현벡터 pcDV1(Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3(In-vitrogene), pSPORT1(GIBCO BRL)과 같은 적당한 발현벡터가 당 분야에 알려져 있다. 바람직하게는, 상기 벡터는 발현벡터 및/또는 유전자 운반 또는 표적화 벡터이다. 레트로바이러스, 백신 바이러스, 아데노-관련 바이러스,헤르페스 바이러스 또는 소유두종 바이러스와 같은 바이러스로부터 유도된 발현벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 표적화된 세포군집에 운반하기 위해 사용될 수 있다. 재조합 바이러스 벡터를 제조하기 위해서는 당업자에게 잘 알려진 방법들이 사용될 수 있으며; 예를 들어, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. 및 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)에 기술된 방법을 참조한다. 선택적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 표적 세포에 운반하기 위해 리포좀으로 재구조될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다. 상기 숙주세포는 원핵세포 또는 진핵세포이며; 위를 참조한다. 숙주세포내에 존재하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 숙주세포의 게놈으로 통합되거나, 또는 염색체외에서 유지될 수 있다. 상기 관점에서, 동종 재조합을 통해 변이체 유전자를 복구하거나, 또는 변이체 유전자를 제조하기 위해 본 발명의 재조합 DNA 분자가 "유전자 타겟팅" 및/또는 "유전자 치환"에 사용될 수 있다고 이해되며; 예를 들어, Mouellic, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990), 4712-4716; Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Press를 참조한다.
숙주세포는 세균, 곤충, 균류, 식물, 동물 또는 인간 세포와 같은 원핵 또는 진핵세포일 수 있다. 바람직한 균류 세포는 예를 들어, 사카로마이세스속, 특히사카로마이세스 세레비지애종(species S. cerevisiae)이다. "원핵"이라는 용어는 변이체 MDR-1 단백질 또는 그의 절편을 발현하기 위해 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환 또는 트랜스펙션(transfection)될 수 있는 모든 세균을 포함하여 의미한다. 원핵 숙주는 그람양성 세균 뿐만 아니라 그람음성 세균, 가령 예를 들어, E.coli, 에스. 티피무리움(S. typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 및 바실루스 수브틸리스(Bacillus subtilis)를 포함한다. MDR-1 변이체 단백질의 변이형태를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 당업자에게 통상적으로 알려져 있는 방법중 하나를 사용하여 숙주를 형질전환 또는 트랜스펙션시키는데 사용될 수 있다. 융합, 조작결합된 유전자를 제조하고, 그들을 세균 또는 동물세포내에서 발현하는 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다(상기 Sambrook 참조). 본 명세서내 유전적 구조물 및 방법은 원핵숙주내에서 변이체 MDR-1 단백질을 발현하기 위해 사용될 수 있다. 보통, 삽입된 폴리뉴클레오티드의 유효한 전사를 용이하게 하는 프로모터 서열을 함유하는 발현벡터는 숙주와 연계되어 사용된다. 발현벡터는 형질전환된 세포를 표현형 선별할 수 있는 특정 유전자 뿐만 아니라 복제 기원, 프로모터 및 종결자를 함유한다. 형질전환된 원핵숙주는 발효조내에서 성장하고, 당분야에 잘 알려진 방법에 따라 배양되어 최적의 세포성장을 이룰 수 있다. 본 발명의 단백질은 성장배지, 세포여액 또는 세포막 프랙션으로부터 분리될 수 있다. 본 발명의 미생물적으로 또는 다르게 발현된 폴리펩티드의 분리법 및 정제법은 종래의 방법, 가령 예를 들어, 모노클론 또는 다중클론 항체를 사용하는 것과 같은 면역학적 분리법 및 제조적 크로마토그래피 분리법이다.
따라서, 또다른 구체예에서 본 발명은 단백질을 발현하고, 제조된 단백질 또는 절편을 배지로부터 추출하는 조건하에서 상기와 같은 숙주세포를 배양하는 것을 포함하는 변이체 MDR-1 단백질 및 그의 절편을 제조하는 방법에 관한 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드에 의해, 유전조작세포를 포함하는 변이체 MDR-1 유전자를 발현할 수 있는 세포를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 얻을 수 있는 세포는 D.L. Spector, R.D. Goldman, L.A. Leinwand, Cells, a Lab manual, CSH Press 1998에 기술된 방법에 따라 약물을 시험하기 위해 사용될 수 있다. 그리고, 상기 세포들은 MDR-1 유전자내 돌연변이에 의해 야기된 약물운반결핍을 보충할 수 있는 능력을 위해 공지 약물 및 그의 비공지 유도체를 연구하기 위해 사용될 수 있다. 상기 구체예를 위해, 숙주세포에는 야생형 대립유전자, 바람직하게는 MDR-1 유전자의 대립유전자 모두가 결여되어 있으며/또는 그로부터 돌연변이된 적어도 하나를 가진다. 선택적으로, 정상 대립유전자이상으로 돌연변이 대립유전자의 강한 과잉발현 및 유사한 수준에서 정상 대립유전자를 과잉발현하는 재조합 세포주와의 비교는 선별 및 분석시스템으로서 사용될 수 있다. 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 세포는 하기의 선별방법을 위해 사용될 수도 있다.
그리고, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된, 또는 상기 방법에 의해 얻을 수 있는, 또는 상기 방법에 의해 제조된 세포로부터 얻은 변이체 MDR-1 단백질 또는 그의 절편에 관한 것이다. 본 명세서에서, 본 발명에 따른 변이체 MDR-1 단백질은 당 분야에 알려져 있는 공지방법으로 추가변형될 수있다는 것도 이해되고 있다. 본 발명에 따른 변이체 MDR-1 단백질을 제공함으로써, 그의 생물학적 활성 또는 그의 억제 활성, 즉 그의 약물운반활성과 관련된 비율을 측정할 수도 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 변이체 MDR-1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체에 관한 것이다. 상기 항체는 상기에서와 같이 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 함유하는 에피토프를 특이적으로 인식하는 것이 유리하다.
본 발명의 변이체 MDR-1 단백질에 대한 항체는 본 발명에 따른 정제단백질 또는 항원으로서 그로부터 유도된 (합성) 절편을 사용하여 잘 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 모노클론 항체는 Koehler and Milstein, Nature 256 (1975), 495 및 Galfre, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3에 기술된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 여기에는 면역화 포유류로부터 유도된 비장세포에 마우스 골수세포를 융합시키는 것이 포함된다. 항체로는 모노클론 항체, 다중클론 항체 또는 합성 항체 뿐만 아니라 항체 절편, 가령 Fab, Fv 또는 scFv 절편 등이 있을 수 있다. 그리고, 상기 폴리펩티드에 대한 항체 또는 그의 절편은 Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988에 기술된 방법을 사용하여 얻을 수 있다. 상기 항체들은 예를 들어, 본 발명의 변이체 MDR-1 단백질을 면역침전 및 면역집적하기 위해, 재조합 유기체내에 상기 변이체 MDR-1 단백질이 존재하는 지를 검사하기 위해, 및 본 발명에 따른 단백질과 상호반응하는 화합물을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, BIAcore 시스템에 사용되는 표면 플라즈몬 공명은 본 발명의 단백질의 에피토프에 결합하는 파지 항체의 효율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다(Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13).
그리고, 본 발명은 상기 뉴클레오티드 치환, 결실 및 첨가에 의해 명시된 대응하는 야생형 MDR-1 유전자 뉴클레오티드 서열과 비교되는 적어도 하나의 뉴클레오티드 차이를 포함하는, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 일부의 상보가닥을 나타내거나 또는 포함하는 핵산분자에 관한 것이다. 상기 분자는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산이다. 상기 분자는 예를 들어, 안티센스 RNA를 포함한다. 상기 분자는 리보자임을 위한 코드를 전사할때 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 전사물을 특이적으로 절단하는 리보자임을 제조함으로써 서열에 결합될 수 있다.
그리고, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 상기 벡터의 예는 상기에 예시되어 있다. 벡터내에 존재하는 핵산분자는 원핵 또는 진핵 숙주세포내에서 발현하는 조절요소에 조작결합되는 것이 바람직하며; 상기를 참조한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 생식세포, 배세포, 간세포 또는 난 또는 그로부터 유도된 세포에 도입하는 것을 포함하는 트랜스제닉 비-인간 동물, 바람직하게는 트랜스제닉 마우스를 제조하는 방법에 관한 것이다. 비-인간 동물은 하기 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있으며, 비-트랜스제닉 건강한 동물이거나, 또는 MDR-1 유전자내 적어도 하나의 돌연변이에 의해 야기된 질병을 가진다. 상기 트랜스제닉 동물은 포유류와 같은 고급 원핵종사이에서 상기 단백질 또는 적어도 그의 기능도메인이 보존되기때문에, 상기 변이체 MDR-1단백질의 변형물과 연관된 약물을 약물학적으로 연구하는데 매우 적합하다. 트랜스제닉 배아를 제조하고, 그들을 선별하는 것은 A.L. Joyner Ed., Gene Targeting, A Practical Approach (1993), Oxford University Press에 따라 수행될 수 있다. 배아의 DNA는 적당한 프로브에 의한 서던 블롯을 사용하여 분석될 수 있다.
본 발명은 또한, 트랜스제닉 비-인간 동물, 가령 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하거나 또는 상기 방법에 의해 얻은 트랜스제닉 마우스, 쥐, 햄스터, 개, 원숭이, 토끼, 돼지, C. 엘리건 및 어류, 가령 토르페도(torpedo) 어류에 관한 것이며, 여기에서 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 존재로 인해 본 발명의 변이체 MDR-1 단백질을 발현하도록 상기 비-인간 동물의 게놈으로 안정하게 통합되는 것이 바람직하다. 변이체 MDR-1 유전자의 같거나 또는 다른 폴리뉴클레오티드의 한개 또는 여러개의 복제본을 가질 수 있다. 상기 동물은 다중약물 내성을 위한 연구모델로서 포함하여 매우 유용하며, 세포내 약물보유 부족 또는 실패에 의해 야기되는 질병을 위해 치료법, 처리법을 개발하는데 있어서 가치있는 동물이 존재한다. 따라서, 일례로, 마우스 또는 쥐와 같은 실험실 동물과 같은 포유류가 바람직하다.
바람직하게는, 본 발명의 트랜스제닉 비-인간 동물은 MDR-1 유전자의 적어도 하나의 비활성화 야생형 대립유전자를 추가로 포함한다. 상기 구체예에서 MDR-1 단백질의 여러 변이형태의 상호작용을 연구한다. 트랜스제닉 동물의 발달 및/또는 일생중 특정 단계에서 MDR-1 유전자 발현 또는 기능을 불활성화시키는 것이 또한 바람직하다. 이는 MDR-1 유전자의 RNA 전사물에 대한 안티센스 또는 리보자임을발현시키는 조직특이적, 개발가능한 및/또는 세포조절된 및/또는 유도가능한 프로모터를 사용함으로써 이뤄질 수 있으며; 상기를 참조한다. 적당한 유도시스템은 Gossen and Bujard(Proc. Natl. Acad. Sci. 89 USA (1992), 5547-5551) 및 Gossen 외 다수의 (Trends Biotech. 12 (1994), 58-62)에 기술된 테트라사이클린-조절식 유전자 발현이다. 유사하게, 변이체 MDR-1 유전자의 발현은 상기 조절요소에 의해 조절될 수 있다.
본 발명의 변이체 MDR-1 폴리뉴클레오티드 및 단백질 및 벡터에 의해, 환자의 MDR-1 유전자내 특정 돌연변이 및 감염된 표현형과 관련된 약물의 생체내 및 시험관내 효능을 연구할 수 있다. 그리고, 본 발명의 변이체 MDR-1 단백질은 암을 치료하기 위해, 가령 상기와 같은 각 돌연변이에 의해 야기된 특정 표현형을 개선시키기 위해, 보다 유효한 약물을 추가로 확인 및 제조하기 위해 약물의 약물학적 프로필을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 특정 목적은 치료받는 환자의 감염된 표현형에 의해 동시분리하는 변이형태의 MDR-1 유전자의 다형을 고려하면서 화학요법에 적용할 수 있는 질병을 치료하기 위해 약물/프로-드럭을 선별하고 약학적 조성물을 제조하는 것에 관한 것이다. 이는 일부 환자의 부작용 및/또는 질병의 같거나 다른 표현형에 관한 그들의 신뢰할 수 없는 약물학적 프로필로 인해 암을 치료하기에 부적당한 것으로 간주되는 약물을 안전하고 경제적으로 적용할 수 있게 한다. 상기 수단 및 방법은 투여 권유사항을 개선시키기 위해 사용될 수 있으며, 환자군에 따라 다른 필요투여량 조정을 예측하기 위해 규정하도록 한다.
다른 구체예에서, 본 발명은
(a)약물운반에 반응하는 검출가능한 시그널을 제공할 수 있는 성분의 존재하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분자변이체 MDR-1 유전자를 발현하는 세포 또는 변이체 MDR-1 단백질을 MDR-1 매개된 약물운반을 허용하는 조건하에서 선별되는 화합물과 반응시키는 단계, 및
(b)약물운반으로부터 발생되는 시그널의 존재 또는 부재 또는 증가를 검출하는 단계(시그널의 존재 또는 증가는 가능성있는 억제물질에 대한 지시표지임)로 이루어진 MDR-1 유전자 또는 그의 유전자 생성물의 분자변이활성을 조절할 수 있는 MDR-1 억제물질을 확인 및 수득하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에서 "화합물"이라는 용어는 동일하거나 또는 동일하지 않은 다수의 물질 또는 단일 물질을 의미한다.
상기 화합물들은 미생물 발효를 통해 생성 또는 화학합성될 수 있지만, 식물, 동물 또는 미생물로부터 세포 추출물과 같은 샘플내에 포함될 수도 있다. 그리고, 상기 화합물은 당 분야에 알려져 있지만, 억제물질로서 사용가능한 것으로 지금까지 알려지지는 않았다. 다수의 화합물들이 배양배지에 첨가되거나, 또는 본 발명의 세포 또는 비-인간 동물에 주입될 수 있다.
화합물을 함유하는 샘플이 본 발명의 방법에서 확인되면, 화합물을 함유하는 것으로 확인된 원래 샘플로부터 화합물을 분리할 수 있거나, 또는 다수의 다른 화합물로 구성된다면 원래 샘플을 보다 세분화할 수 있어서 샘플당 다른 물질의 수를 감소시키고, 원래 샘플의 세분방법을 반복한다. 그후, 본 명세서 및 문헌(Spector 외 다수, Cells manual; 위 참조)에 기술된 방법에 의해 상기 샘플 또는 화합물이 원하는 성질을 나타내는지를 측정할 수 있다. 샘플의 복잡도에 따라, 상기 단계들은 본 발명의 방법에 따라 확인된 샘플이 제한된 수 또는 1개의 물질만 포함할때까지 여러 회 수행될 수 있다. 상기 샘플은 유사한 화학적 및/또는 물리적 성질의 물질을 포함하는 것이 바람직하며, 상기 물질은 동일한 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 방법은 종래 문헌에 기술된 세포계 분석에 따라 또는 본 명세서의 방법을 사용하고 변형시켜서 당업자에 의해 쉽게 수행 및 디자인될 수 있다. 그리고, 당업자는 추가의 화합물 및/또는 효소, 가령 MDR-1 단백질에 대한 기질을 차례로 재현하는 전구물질로 특정 화합물을 변환하는 효소가 본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있다는 것을 쉽게 알 것이다. 상기 본 발명의 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 과도한 실험없이도 수행될 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 화합물로는 펩티드, 단백질, 핵산, 항체, 소기관 화합물, 리간드, 펩티도미메틱(peptidomimetic), PNA 등이 있다. 상기 화합물은 베라파밀(verapamil) 또는 시클로스포린(cyclosporin)과 같은 알려져 있는 약물의 기능유도체 또는 유사체일 수도 있다. 화학적 유도체 및 유사체의 제조방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10010 U.S.A. 및 Organic Synthesis, Wiley, New York, USA에 기술되어 있다. 그리고, 상기 유도체 및 유사체는 당 분야에 잘 알려진 방법 또는 개시되어 있는 방법에 따라 그들의 효능에 대해 시험될 수 있다. 그리고, 적당한 약물 유도체 및유사체의 펩티드 미메틱스 및/또는 컴퓨터 보조 디자인은 하기 방법에 따라 사용될 수 있다. 상기 유사체는 알려져 있는 MDR-기질 및/또는 억제물질 및/또는 조절인자의 기본구조로서 갖는 분자를 포함하며; 아래를 참조한다. 적당한 컴퓨터 프로그램은 상보구조 모티프에 대한 컴퓨터 보조연구에 의해 본 발명의 MDR-1 단백질 및 추정 억제물질의 상호작용 위치를 확인하기 위해 사용될 수 있다(Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114-120). 단백질 및 펩티드의 컴퓨터 보조 디자인을 위한 또다른 적당한 컴퓨터 시스템은 종래 문헌, 가령 Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N.Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987-5991에 기술되어 있다. 상기 컴퓨터 분석에서 얻은 결과는 알려져 있는 억제물질을 최적화하기 위해 본 발명의 방법과 조합하여 사용될 수 있다. 적당한 펩티도미메틱 및 다른 억제물질은 하기 방법에 따른 결과 화합물을 시험하고 연속적 화학변형을 통해 펩티도미메틱 조합라이브러리를 합성함으로써 확인될 수도 있다. 펩티도미메틱 조합라이브러리를 생성하고 사용하는 방법은 종래 문헌, 가령 Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 및 Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715에 기술되어 있다. 그리고, 본 발명의 MDR-1 단백질 및 억제물질의 3차원 구조 및/또는 결정학적 구조는 펩티도미메틱 약물을 디자인하기 위해 사용될 수 있다(Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 1545-1558).
요컨대, 본 발명은 특정 종류의 질병, 가령 암을 약물내성 또는 민감성 표현형을 종종 야기하는 MDR-1 유전자의 기능부전에 의해 악화되는 화학요법으로 치료하기 위해 특정 투여량으로 사용될 수 있는 화합물을 확인하고 수득하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 세포는 본 발명의 방법에 의해 얻은 세포 또는 상기 트랜스제닉 비-인간 동물내에 포함된 세포이다.
추가의 구체예에서, 본 발명은
(a)본 발명의 변이체 MDR-1 단백질을 MDR-1 단백질에 의해 결합된 것으로 알려진 제1 분자와 반응시켜서 상기 단백질 및 상기 제1 분자의 제1 복합체를 형성하는 단계;
(b)상기 제1 복합체를 선별되는 화합물과 반응시키는 단계; 및
(c)상기 화합물이 상기 제1 복합체로부터 상기 제1 분자를 치환하는지를 측정하는 단계로 이루어지는 MDR-1 유전자 또는 그의 유전자 생성물의 분자변이체 활성을 조정할 수 있는 MDR-1 억제물질을 확인 및 수득하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법에서, 상기 측정단계는 상기 단백질과 상기 억제물질 후보물질의 제2 복합체의 형성을 측정하는 단계를 포함하는 것이 유리하다. 상기 측정단계는 상기 단백질에 결합하지 않는 상기 제1 분자의 양을 측정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 방법의 특히 바람직한 구체예에서, 상기 제1 분자는 베라파밀(Verapamil), 발스포다(Valspodar), 시클로스포린(Cyclosporin) A 또는 덱스니굴디핀(dexniguldipine)이다. 그리고, 본 발명의 방법에서, 상기 제1 분자는 방사성 또는 형광 표지에 의해 표지되는 것이 바람직하다.
또다른 구체예에서, 본 발명은
(a)한 개체로부터의 샘플내에 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 존재하는지를 측정하는 단계; 및/또는
(b)본 발명의 항체에 의해 MDR-1 단백질의 변이형태가 존재하는 지를 측정하는 단계로 이루어지는 분자변이체 MDR-1 유전자의 존재와 연관된 질병 및 상기 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 구체예에 따라, 상기 질병에 대한 질병 또는 감수성 상태를 시험하는 방법은 서던 블롯 또는 노던 블롯 또는 원위치 분석의 형태로 본 발명의 핵산분자 또는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 실시될 수 있다. 상기 핵산서열은 인트론과 같은 비-코딩 영역, 또는 유전자의 코딩영역으로 교잡될 수 있다. 상보서열이 본 발명의 방법에 사용되는 경우에, 상기 핵산분자는 노던 블롯에 다시 사용될 수 있다. 또한, 상기 시험은 유전자의 전사와 같은 실제 블로킹과 조합하여 실시될 수 있으며, 따라서 치료관련능력을 가지는 것으로 기대된다. 그리고, 프라이머 또는 올리고뉴클레오티드는 또한 상기 MDR-1 유전자 또는 대응 mRNA중 하나에 교잡하기 위해 사용될 수도 있다. 교잡하기 위해 사용되는 핵산은 방사성 또는 다른 표지를 부착 또는 첨가함으로써 편리하게 표지될 수 있다. 상기 표지는 당 분야에 잘 알려져 있다. 상기 핵산분자의 표지는 종래방법에 의해 실시될 수 있다. 그리고, 변이체 MDR-1 유전자의 존재 또는 발현은 대응 핵산서열중 하나에 특이적으로 교잡하는 프라이머 쌍을 사용함으로써, 및 표준방법에 따라 PCR 반응을 실시함으로써 검측될 수 있다. 상기 프로브 또는 프라이머의 특이적 교잡화는 엄격한교잡화 조건에서 일어나는 것이 바람직하다. "엄격한 교잡화 조건"이라는 용어는 당 분야에 잘 알려져 있으며; 예를 들어, Sambrook 외 다수, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual" second ed., CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989; "Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach", Hames and Higgins eds., IRL Press Oxford, 1985를 참조한다. 그리고, 개체에서 얻은 mRNA, cRNA, cDNA 또는 게놈 DNA는 MDR-1 유전자의 돌연변이의 특징적인 지문이 될 수 있는 돌연변이를 확인하기 위해 시퀀싱될 수 있다. 본 발명은 또한, 상기 지문이 개체로부터 얻은 DNA 또는 RNA의 RFLP에 의해 발생되고, 선택적으로 DNA 또는 RNA가 분석하기 전에 증폭되는 방법을 추가로 포함하며, 이 방법은 당 분야에 잘 알려져 있다. RNA 지문은 예를 들어, 개체로부터 얻은 RNA 샘플을 적당한 RNA-효소, 가령 RNase T1, RNase T2등 또는 리보자임으로 소화시키고, 및 상기와 같은 RNA 절편을 전기영동분리 및 검출함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 상기 구체예는 실시예와 같은 상기 개시로부터 과도한 실험없이 당업자에 의해 쉽게 변형될 수 있다. 본 발명의 추가 구체예는 상기 측정이 본 발명의 항체 또는 그의 절편을 사용하여 실시되는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 사용되는 항체는 히스티딘 플래그 또는 비오틴 분자와 같은 검출가능한 꼬리로 표지된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 PCR, 리가아제 연쇄반응, 제한소화, 직접 시퀀싱, 핵산증폭기술, 교잡기술 또는 면역검정을 포함한다(Sambrook외 다수, loc. cit. CSH Cloning, Harlow and Lane loc. cit. CSH antibodies).
본 발명의 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 질병은 암이다.
상기 방법의 또다른 구체예에서, 본 발명의 방법을 모두 적용함에 따라 MDR-1 유전자내 상기 변이를 없애거나 또는 경감시키기 위해 약제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 추가단계로 인해, MDR-1 유전자에 의해 야기된 표현형 반응으로 인한 임상증후개시전에 질병을 치료한다.
본 발명의 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 약제는 아드리아마이신, 독소루비신, 파클리탁솔(탁솔) 및 다른 MDR-1 기질과 같은 화학요법제이다. Ambudkar SV 외 다수, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 39 (1999), 361-398.
상기 방법의 다른 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 (ⅰ)기능 및 발견가능한 야생형 MDR-1 유전자 또는 (ⅱ)본 발명의 핵산 분자 또는 벡터를 세포에 도입시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 명세서에서, "기능적" MDR-1 유전자는 막을 통해 약물운반을 매개하는 생물학적 성질을 갖는, 야생형 MDR-1 단백질의 일차 구조변형체중 일부 또는 전체를 코딩된 단백질이 갖는 유저자를 의미한다. 본 발명의 본 구체예는 인간의 암, 염증질병, 신경세포성 질병, CNS 질병 또는 심혈관계 질병을 치료하기에 적합하다. 변이체 MDR-1 유전자의 발현 검출로 인해, 상기 발현이 질병의 해당 표현형의 발생 또는 유지와 서로 관계가 있다는 결론을 낼 수 있었다. 따라서, 발현수준을 낮은 수준으로 감소시키거나 또는 없애기 위한 단계를 적용하였다. 이는 생물학적 수단에 의해, 가령 리보자임, 안티센스 핵산분자, 세포내 항체 또는, 상기 MDR-1 단백질의 변이형태에 대한 상기 억제물질을 사용함으로써 돌연변이 유전자의 발현을 적어도 일부 절단함으로써 실시될 수 있다. 그리고, 대응 돌연변이 단백질 및 유전자의 발현수준을 감소시키는 약학적 생성물이 개발되었다.
다른 구체예에서, 본 발명은 상기 방법중 어느 하나의 단계 및, 단계 (b)에서 확인된 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 형태의 그의 유도체 또는 동종체를 합성 및/또는 배합하는 단계로 이루어진 약학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따라 확인된 치료적으로 유용한 화합물은 상기에서와 같이 배합되고, 환자에게 투여될 수 있다. 당업자에 의해 적당하게 측정되는 치료적 투여량 및 용도는 하기를 참조한다.
그리고, 본 발명은 상기 방법의 단계; 및 치료적 용도에 적합한 형태의 약물 또는 프로-드럭을 배합하는 단계 및 본 발명의 방법에서 진단되는 개체의 질병을 예방 또는 개선시키는 단계로 이루어진 약학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
생체내 투여후 약물 또는 프로-드럭은 분비에 의해, 또는 하나 또는 그 이상의 활성 또는 불활성 대사산물에 의해 절단되기 위해 물질대사된다(Meyer, J. Pharmacokinet. Biopharm. 24 (1996), 449-459). 따라서, 본 발명의 방법에 따라 확인되고 얻은 실제 화합물 또는 억제물질을 사용하기 보다는, 환자체내에서 활성으로 전환되는 프로드럭으로서 해당 배합물이 사용될 수 있다. 프로-드럭 및 약물을 사용하기 위해 취해지는 선제 측정은 문헌에 기술되어 있으며; Ozama, J. Toxicol. Sci. 21 (1996), 323-329를 참조한다.
본 발명의 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 약물 또는 프로드럭은 상기에서와 같은 약제의 유도체이다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 상기 방법에 의해 확인 또는 수득된 억제물질에 관한 것이다. 억제물질은 본 발명의 변이체 MDR-1 단백질에 특이적으로 결합하는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체, 핵산분자 및 억제물질은 자연 리간드의 결합특이성 또는 본 발명의 MDR-1 단백질의 결합 파트너와 적어도 실질적으로 동일한 특이성을 가지는 것이 바람직하다. 항체 또는 억제물질은 MDR-1 활성이 억제되어야 하는 경우에 적어도 105M-1, 바람직하게는 107M-1이상 및 유리하게는 1010M-1이하의 본 발명의 MDR-1 단백질에 대한 결합친화도를 가질 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 억제 항체 또는 억제물질은 적어도 약 10-7M, 바람직하게는 적어도 약 10-9M 및 가장 바람직하게는 적어도 약 10-11M의 친화도를 가진다.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 검출하고/또는 대응하는 개별 MDR-1 대립유전자의 유전형을 위해 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 사용하는 것에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 상기 기술된 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자이다.
특히 바람직한 구체예에서 상기 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 10 내지 100, 더 바람직하게는 15 내지 50 뉴클레오티드이고 SEQ ID NOS: 1 내지 179 또는 표 8에 기재된 MDR-1 유전자의 프로모터 또는 엑손(exon)의 야생형("wt") 또는 변이형("mut") 서열 또는 그것의 상보 서열을 포함한다.
그러므로, 추가의 구체예에서, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 올리고뉴클레오티드를 구성하는 프라이머 또는 프로브에 관한 것이다. 본 명세서에서, "를 구성하는"이라는 용어는 상기 기술되고 본 발명의 프라이머 또는 프로브에 대해 사용된 뉴클레오티드 서열이 그것의 5' 및/또는 3' 말단에 바로 인접한 MDR-1 유전자의 추가 뉴클레오티드 서열을 갖지 않는다는 것을 의미한다. 그러나, MDR-1 유전자에 대응하지 않는 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라 다른 성분, 가령 라벨, 예를 들면 비오틴 분자, 히스티딘 플래그, 항체 절편, 콜로이드 질금 등이 본 발명의 프라이머 및 프로브에 존재한다. 또한, 상기 기술된 뉴클레오티드 서열을 사용할 수 있고, 및 MDR-1 유전자에서 유도된 다른 뉴클레오티드 서열과 조합할 수도 있으며, 상기 추가의 뉴클레오티드 서열은 핵산 외의 성분들과 함께 산재되어 있거나 또는 상기 핵산은 MDR-1 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대응하지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명의 변이체 MDR-1 단백질의 검출, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분자변이체 MDR-1 유전자의 발현 및/또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 MDR-1 대립유전자를 구별하기 위해, MDR-1 유전자의 유전자 생성물에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 물질을 사용하는 것에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 조성물, 특히 항체, 핵산 분자, 본 발명의 벡터 또는 억제물질을 포함하는 약학 조성물 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 운반체에 관한 것이다.
예를 들면, 억제물질을 포함하는 상기 약학조성물 또는 그의 약리학적으로허용가능한 염은 약물 투여에 종래에 사용된 경로, 예를 들면 경구, 국소, 비경구 또는 흡입에 의해 편리하게 투여될 수 있다. 허용가능한 염은 아세테이트, 메틸에스테르, HCl, 황산염, 염화물등을 포함한다. 화합물은 종래 방법에 따른 표준 약학 운반체와 약물을 조합하여 제조된 종래 투여 형태로 투여된다. 상기 방법은 원하는 제조법에 적당하게 성분을 혼합, 조립(granulating) 및 압착 또는 용해하는 것을 포함한다. 약학적으로 허용가능한 형질 또는 희석제의 형태 및 성질이 조합되는 유효성분의 양, 투여 경로 및 다른 잘 알려진 변수들에 의해 설명되는 것으로 평가될 것이다. 운반체(들)는 제형의 다른 성분과 비교되고 이를 받아들이는 사람에 유독하지 않다는 의미에서 "허용가능"해야 한다. 사용된 약학 운반체는 예를 들면, 고체 또는 액체이다. 고체 운반체의 예로는 락토스, 테라알바(terra alba), 수크로스, 탈크, 겔라틴, 한천(agar), 펙틴, 아카시아, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등이 있다. 액체 운반체의 예로는 인산완충식염수, 시럽, 땅콩유 및 올리브유와 같은 오일, 물, 에멀젼, 여러 종류의 습윤제, 멸균액 등이 있다. 유사하게, 운반체 또는 희석제는 당 분야에 잘 알려진 시간 지연 물질, 가령 글리세릴 모노-스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로 또는 왁스와 함께 포함한다.
투여량 섭생(dose regimen)은 주치의 및 다른 임상 요소; 바람직하게는 상기 기술된 방법 중 어느 하나에 따라 결정될 것이다. 의학 분야에 잘 알려져 있는 바와 같이, 특정 환자에 대한 투여량은 환자의 신장, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 일반적인 건강 및 현재 투여되는 다른 약물을포함하는 많은 요소에 따라 다르다. 주기적인 검사로 추이를 모니터할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 MDR-1 유전자의 RNA 변이체를 인코딩하는 RNA에 특이적으로 교잡하는 안티센스-올리고뉴클레오티드, 또는 기능적 야생형 외에 변형된 MDR-1 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 약학 조성물을 사용하는 것은 세포에서 변형된 형태의 농도가 감소되는 경우에 생각할 수 있다.
본 발명때문에 특정 약물 선택, 투여 섭생 및 치료받을 해당 환자가 본 발명에 따라 결정될 수 있다. 투여량 권장사항은 잘못된 투여량으로 잘못된 환자에 잘못된 약을 처방하는 것을 피하는 정보와 함께 처방자가 신중히 고려된 환자 그룹에 따른 투여 적합을 예기함으로써 제품 라벨링에 표시될 것이다.
또한, 본 발명은 앞에서 기술된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 숙주 세포, 변이체 MDR-1 단백질, 항체, 억제물질, 핵산 분자 또는 본 발명의 대응하는 벡터를 포함하는 진단 조성물 또는 키트 및 선택적으로 검출에 적당한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 또한 트랜스제닉 세포 및 동물의 발생에 적당한 선별배지를 위한 선별표지기 또는 성분과 같은 추가의 성분들을 함유한다. 본 발명의 키트는 본 발명의 방법을 실시하는데 유리하게 사용되고 특히 다양한 용도, 예를 들면 진단 분야 또는 연구도구로서 사용될 수 있다. 본 발명 키트의 일부는 바이알에 개별적으로 또는 용기 또는 멀티 용기 유닛에 조합하여 포장될 수 있다. 키트의 제조는 바람직하게 당업자에게 알려져 있는 표준 방법을 따른다. 키트 또는 진단 조성물은 예를 들면 방사면역검정 또는 효소면역검정과 같은 면역검정기술 또는 바람직하게 핵산 교잡화 및/또는 상기 실시예에 기술된 것과 같은 증폭 기술에 적용하는 본 발명의 상기 방법에 따른 MDR-1 유전자의 변이 형태의 발현을 검출하는 방법에 사용된다.
일부 유전자 변화로 인해 변형된 단백질 형태적 상태가 변형된다. 예를 들면, 일부 변이체 MDR-1 단백질은 약물 운반을 용이하게 할 수 없게 하는 3차 구조를 갖는다. 변형된 단백질의 정상 또는 규정된 형태로 되돌리는 것은 비록 어렵지만, 상기 분자의 결점을 고치기 위한 가장 정밀하고 정확한 방법이다. 따라서 약리학적 조작은 단백질의 야생형 형태의 회복을 목표로 한다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 인코딩된 단백질은 MDR-1 유전자 또는 단백질의 야생형 기능을 활성화할 수 있는 분자를 디자인 및/또는 확인하는데 또한 사용된다.
또 다른 구체예에서 본 발명은 위에 기술된 방법으로 진단된 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물을 제조하기 위한 약물 또는 프로드럭을 사용하는 것에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 진단된 질병을 치료, 예방 및/또는 지연하는 약학조성물을 제조하기 위한 기능적이고 발현 가능한 야생형 MDR-1 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 효과적인 투여량으로 사용하는 것에 관한 것이다. 기능적이고 발현 가능한 MDR-1 단백질을 인코딩하는 유전자는 주 단백질을 차례로 생성하는 세포에 주입될 수 있다. 생체외 또는 생체내 기술에 의해 세포 내에 치료 유전자를 주입하는 것에 기초하는 유전자 치료법은 유전자 운반의 가장 중요한 용도 중 하나이다. 시험관내 또는 생체내 유전자 치료법에 대한 적당한 벡터 및 방법은 문헌에 기술되고 당 분야의 기술자에게 잘 알려져 있다; 예를 들면Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813; Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086; Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716; WO94/29469; WO 97/00957 또는 Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996) 635-640 및 거기에서 인용된 참고문헌을 참조한다. 유전자는 세포에 직접 주입하거나 또는 리포솜 또는 바이러스성 벡터 (예를 들면, 아데노바이러스, 레트로바이러스)를 통해 주입하기 위해 디자인된다. 바람직하게, 상기 세포는 생식계열 세포, 배아 세포 또는 난 세포 또는 이들로부터 유도된 것이고, 가장 바람직하게 상기 세포는 간세포이다.
상기로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 용도에서 핵산 서열은 특정 세포에 대한 MDR-1 단백질을 발현 및/또는 표적화하는 조절요소에 조작결합된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 적당한 유전자 운반 시스템은 다른 것들 중에서도 리포솜, 수용체-매개 운반 시스템, 네이키드(naked) DNA 및 바이러스성 벡터 가령 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스를 포함한다. 유전자 치료를 위해 체내 특정 위치에 핵산을 운반하는 것은 Williams (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726-2729)에 의해 기술된 것과 같은 바이오리스틱(biolistic) 운반 시스템을 사용하여 또한 이루어진다. 재조합 DNA로 세포를 트랜스팩션하는 표준 방법은 분자 생물학 분야의 기술자에게 잘 알려져 있고, 예를 들면 WO 94/29469를 참조하고; 또한 상기를 참조하라. 유전자 치료법은 재조합 DNA 분자 또는 벡터를 환자에게 직접 투여하거나, 또는 생체외에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 세포를 트랜스펙션하고 환자에게 트랜스펙션된 세포를 주입함으로써 실시된다.
본 발명의 용도 및 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 질병은 암 또는 신경세포성, CNS 또는 심장혈관계 질환이다.
실시예 6 및 8에서 보여진 바와 같이 본 발명에 따라 확인된 다형, 특히 MDR-1 유전자의 엑손 26내 단일 뉴클레오티드 다형(SNP) C3435T는 약물의 안정성 및 효능을 향상시키기 위한 다양한 MDR-1 기질 및 유도 물질의 혈액 수준을 예상, 즉 부작용 및 약물 상호작용을 예측하고 예방하는 것 및 환자 순응을 향상시킬 수 있는 약동유전학적(pharmacogenetic) 요소로 유용하다. 상기 기질 및 유도 물질은 예를 들면, 페니토인(Phenytoin)과 같은 항경련/항간질 약; 디곡신과 같은 강심배당체; 시클로스포린(Cyclosporin) A 및 FK506과 같은 면역억제물질; 클라리트로마이신(Clarithromycin) 및 에리트로마이신(Erythromycin)과 같은 마크롤리드-항생제(macrolid-antibiotics) 및 리팜핀(Rifampin)과 같은 거대고리형-항생제이다. 따라서, 본 발명은 상기에 따른 약동유전학적 요소로 상기 기술된 SNP의 용도에 또한 관한 것이다. 바람직하게, 다형은 MDR-1 엑손 26 (C3435T) SNP 단독 또는 상기 기술된 것과 같은 다른 SNP와 결합되어 있다.
본 발명에 따라 확인된 다형의 적용 및 상기 기술된 구체예에 따라 사용될 수 있는 수단 및 방법은 예를 들면, US-A-5,856,104에 기술된 바와 같이, 당 분야에서 알려질 수 있고, 여기서 법의학, 친자검정, 다형과 표현형 특성의 상호관계, 표현형질의 유전자 지도작성등에 대해 기술된 수단 및 방법이 본 발명에 따라 동일하게 적용될 수 있다.
상기 구체예 및 다른 구체예가 본 발명의 명세서 및 실시예에 의해 나타내어지고 또는 분명해지고 완성된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 방법, 용도 및 화합물과 관련된 문헌이 예를 들면 전자 장치를 사용하여 공공 도서관으로부터 검색된다. 예를 들면 공공 데이타염기 "Medline"은 예를 들면, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html 하의 인터넷에서 유용하게 이용된다. 추가의 데이타염기 및 주소는 가령 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/, http://www.infobiogen.fr/, http://www.fmi.ch/biology/research_tools.html, http://www.tigr.org/가 당 분야의 기술자에게 알려져 있고 예를 들면, http://www.lycos.com.을 이용하여 얻을 수도 있다. 생물공학에서 특허 정보의 개관 및 소급 조사 및 현황 자각에 유용한 특허 정보의 관련 공급원 조사가 Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364에서 제공된다.
본 발명의 약학적 및 진단 조성물, 용도, 방법은 지금까지 변이체 MDR-1 유전자에 관련되거나 의존하는 것으로 알려지지 않은 모든 종류의 질병을 진단 및 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물, 방법 및 용도는 비록 동물 치료가 여기 기술된 방법 및 용도에 의해 또한 이루어지지만, 인간에 적용되는 것이 바람직하다.
실시예 1: 인간 혈액으로부터 게놈 DNA의 분리, MDR-1 유전자 절편의 생성 및 정제
게놈 DNA를 표준 이온 교환 크로마토그래피 기술(혈액으로부터 게놈 DNA를 분리하기 위한 Quiagen 키트)에 의해 얻었다. 치료받은 모든 개체들(Charitee Berlin의 약리학부의 지원자)의 혈액을 독일 베를린의 Charitee Clinicum의 모든 법적, 윤리적 및 의학적 및 관료적 필요의 고려하에 얻었다.
인간 MDR-1 유전자의 특정 부분을 함유하는 DNA 절편을 정의한 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 각 절편에 대해 2개의 특정 올리고뉴클레오티드 프라이머를 가했다. 상기 특정 올리고뉴클레오티드 프라이머는 MDR-1 유전자의 다양한 엑손의 서열 상류 및 하류를 결합하기 위해 디자인되었다. 결과의 DNA 절편은 엑손 서열 뿐만 아니라 엑손-인트론 경계에서 일부 인트론 서열을 인코딩하였다. 엑손과 가까운 상기 인트론 서열은 보정 처리 후 단백질 인코딩 mRNA의 발현, 즉 "스플라이싱(splicing)"으로 알려진 방법에 중요하다고 알려져 있다. 인간 MDR-1 유전자의 28개의 엑손 각각에 대해 최적화되는 올리고뉴클레오티드 프라이머 쌍을 친화도 크로마토그래피 (OPC 카트리지)에 의해 합성 및 정제하였다. 각 프라이머에 대한 서열은 표 1에 개시된다.
중합효소 연쇄반응을 코어(core) 프로모터 및 증강제 영역 뿐만 아니라 인간 MDR-1 유전자의 28개의 엑손을 덮는 절편 각각에 대해 최적화되는 조건하에서 실시하였다. 25㎕의 반응 부피에서 모든 엑손에 대해 PCR을 실시하였다. DNA 주형 50ng을 1.5mM MgCl2(Quiagen, Hilden), 50μM dNTP's (Quiagen, Hilden), 25pMol의 각 프라이머 (Metabion, Munich) 및 0.625 U Taq 중합효소 (Quiagen, Hilden)을 포함하는 표준 PCR 완충액에 첨가하였다. 모든 PCR은 94℃에서 2분의 초기변성단계 및 94℃에서 45초동안 변성의 36개의 증폭 주기, 프라이머의 용융온도(PCR 조건: A-H)에 따른 프라이머 어닐링에서 45초간 및 72℃에서 45초동안 그리고 72℃에서 5분동안 최종 팽창에 의해 Perkin Elmer thermocycler(모델 9700)에서 실시하였다. 단일 PCR 조건 A-H에 대해 하기 어닐링 온도를 적용하였다: A: 53℃; B: 56℃; C: 55℃; D: 57.5℃; E:58℃; F: 59℃; G:54℃; H: 60℃.
50㎕의 반응 부피에서 모든 절편 (프로모터 및 증강제)에 대해 PCR을 실시하였다. DNA 주형 50ng(제외: 프로모터 절편 1-3에 대해 100ng)을 1.5mM MgCl2(Quiagen, Hilden), 200μM dNTP's (Quiagen, Hilden), 30 pMol의 각 프라이머 (Metabion, Munich; 제외: 증강제 절편 1에 대해 20 pMol) 및 1 U Taq 중합효소 (Quiagen, Hilden)를 포함하는 표준 PCR 완충액에 첨가하였다. 모든 PCR은 94℃에서 3분의 초기변성단계 및 94℃에서 30초동안 변성의 다른 증폭주기(프로모터 절편 2 + 4 및 증강제 절편 1에 대해 30; 프로모터 절편 3에 대해 31; 프로모터 절편 1 및 증강제 절편 2에 대해 32)에 의한 Perkin Elmer thermocycler(모델 9700)에서 실시하였고, 프라이머는 30초동안 프라이머의 용융온도(PCR 조건: A 및 B)에서 30초간, 및 72℃에서 30초간, 그리고 72℃에서 2분동안 최종 팽창에 따라 다르게 어닐링된다. 단일 PCR 조건 A 및 B에 대해 하기 어닐링 온도를 적용하였다: A: 58℃; B: 56℃.
최적화 PCR-조건 및 요구되고 얻어진 절편의 결과 크기는 표 1에 개시된다. 개별 유전형의 추가 분석에 사용된 결과의 MDR-1 유전자 절편의 예는 도 1a 및 1b에 나타낸다.
인간 MDR-1 유전자의 특정 부분을 포함하는 정의된 DNA 절편, 엑손-인트론 경계의 일부 인트론 서열 뿐만 아니라 엑손 서열을 처리하여 혼합되지 않은 뉴클레오티드 및 완충 성분을 절단하였으며, 그렇지 않으면 직접 DNA 시퀀싱하여 개별 MDR-1 유전형의 결정을 간섭하였다. 상기 정제를 위해, 표준 이온 교환 크로마토그래피 기술을 사용하였다(PCR 절편 정제용 Quiagen 키트). 모든 절편에 대해, 직접 DNA 서열 분석에 적당한 정제된 절편의 충분한 수득량을 얻었다. 개별 MDR-1 유전형의 직접 서열 분석에 사용된 정제된 MDR-1 유전자 절편의 예는 도 1a 및 1b에 나타낸다.
실시예 2: 여러 개체에서 서열 결정에 의한 다른 MDR-1 유전자 대립유전자의 확인
많은 다른 개체로부터 인간 MDR-1 유전자의 관련한 영역을 서열 분석하기 위해, MDR-1 유전자의 관련영역의 PCR 증폭을 실시하였고(표 1 참조), 정제된 PCR 생성물을 그 후 확립된 방법(ABI 염색종결인자(dyeterminator) 주기시퀀싱)으로 시퀀싱하였다. 상기 방법을 사용하여 고려해야할 필요가 있는 매우 중요한 변수는 각 정상 인간 각각이 2개의 MDR-1 유전자 복제본을 숨긴다는 것이다. (상염색체 유전자 및 MDR-1이 상염색체적으로 인코딩된) 상기 이배성때문에, 동종접합형 서열 변이 뿐만 아니라 이종접합형 변이를 명백하게 확인할 수 있는 서열의 평가에 많은 주의를 기울여야만 한다. 상기때문에, 하나의 결정된 서열에만 의존하였지만, 항상 반대의 DNA 가닥 모두를 시퀀싱하여 각 개인의 각각 정의된 MDR-1 유전자 절편으로부터 적어도 2개의 서열을 얻었다.
인간 집단에서 MDR-1 변이의 초기 평가에 대해, 인간 MDR-1 유전자의 모든 엑손을 포함하는 관련영역의 서열 분석을 24명의 다른 개인의 게놈 DNA으로부터 실시하였다. 각 샘플수는 선택된 MDR-1 유전자 절편에 대해 확장하였으며, 그후 일부는 127명의 개인으로부터 분석하였다. 서열은 상기 모든 작업에서 "야생형" 서열로 고려된 공개된 MDR-1 서열에서 벗어난 DNA 서열의 발생에 대해 조작조사되었다. 집단 유전학이 정의된 유전자의 동종접합형 대 이종접합형 대립유전자의 예측빈도를 계산할 수 있기때문에(Hardy Weinberg 식, pe2 + 2pq + qe2 = 1), 동종접합형 대 이종접합형 대립유전자 및 실험결과의 편차의 예측(상기 식) 분포를 또한 확인할 수 있었다. 이는 검출된 서열 일탈이 새로운 대립유전자를 나타낸다는 사실은 내부 조절 및 확인하는 것이다.
여러 MDR-1 서열 변이를 발견하였고 도 2a-2e의 상기 방법을 사용하여 실험적으로 확인하였다. 8개 다형이 엑손 5, 6, 12 및 17(엑손 5에 대한 SEQ ID NOs: 91, 154 및 160), (엑손 6에 대한 SEQ ID NOs: 101 및 166), (엑손 12에 대한 SEQ ID NO: 116) 및 (엑손 17에 대한 SEQ ID NOs: 119 및 172)에 가깝게 플랭킹하는 인트론 서열에서 나타났다. 7개 다형이 코딩 영역에서, 엑손 2 및 26에서 2개, 엑손 5, 11 및 12에서 각각 하나 및 비코딩 엑손 1에서 하나(각각, SEQ ID NOs: 79 및 85(엑손 2에 대해), 122 및 178(엑손 26에 대해), 97(엑손 5에 대해), 106(엑손 11에 대해), 112(엑손 12에 대해) 및 73(엑손 1에 대해))가 발견되었다. 3개 변이에 의해, MDR-1 단백질의 아미노산 서열에서 변화를 일으킨다(각각, SEQ ID NOs: 85(N21D에 대해), 97(F103S에 대해) 및 106(S400N에 대해)). 그들의 변화가 MDR 단백질을 변경시킬 것이다. 단백질을 변경시키지 않는 변화는 ATG 해독개시코돈(SEQ ID NO: 79) 앞에 직접 위치되어 있다. 상기 위치가 해독의 효과를 조절하여 단백질의 발현 수준에 매우 중요하다는 것이 잘 알려져 있다. 추가의 다형은 MDR-1의 아미노산 조성을 변화하지 않지만, 상기 각 변이가 새로운 MDR-1 대립유전자를 정의하기때문에 여전히 MDR-1 유전형에 유용한 도구이다. MDR-1의발현은 다른 개인들 사이에 매우 다양하고, 발현 수준에서 상기 변이성에 대한 하나의 매우 비슷한 설명은 MDR-1 유전자의 내부 및 주위에서 영역에 있어서 직접적인 대립유전자 차이이다. 따라서 모든 MDR-1 대립유전자는 환자들의 MDR-1 유전자 상태를 결정하기 위한 표지기를 제공한다. 질병을 진단 및 치료하기 위한 상기 MDR-1 유전형의 중요성이 당 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있고, 서론에서 또한 상기를 상세히 설명하였다.
정확한 새로운 서열 및 서열 일탈을 포함하는 새로운 MDR-1 대립유전자의 정확한 위치 및 추가의 설명 및 집단에서 대립유전자의 동종접합형 대 이종접합형 분포가 표 2에 개시되어 있다. 변이 대립유전자의 동종접합형체에 대한 예측빈도를 Hardy-Weinberg 분포에 기초하여 계산하였다. 서열에서 벗어난 염기는 굵은 글씨체이며, 밑줄그어져 있다. 도 2a-2e는 동종접합형 또는 이종접합형 개인의 DNA 샘플에서 새로운 변이의 발견 및 외형의 예를 도시한다.
실시예 3: MDR-1 대립유전자의 특정 검출 및 진단 방법
확인된 다양한 MDR-1 대립유전자의 검출방법은 특정 서열 차이가 대립유전자 구별을 시약으로 해독될 수 있다는 원리를 이용한다. 상기 시약은 진단 시험의 개발을 위해 필요한 백본을 제공한다. 상기 시약의 예로는 새롭게 확인된 염기 치환에서 야생형 MDR-1 서열에서 벗어난 올리고뉴클레오티드가 있지만 이에 제한되지는 않는다. 종종, 개별 MDR-1 유전자 상태를 측정하기 위한 진단 시험의 원리는 다양한 MDR-1 대립유전자에 대한 상기 시약의 교잡효과의 차이를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 또한, 효소 반응에서 상기 시약 또는 다른 기질로써, 예를 들면리가아제 또는 중합효소 또는 제한 효소의 효과차이가 적용될 수 있다. 상기 시험의 원리는 당 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 그 예로는 PCR-기술 및 LCR 기술, Chip-교잡화 또는 MALDI-TOF 분석이 있다. 상기 기술은 당 분야, 예를 들면 PCR 기술: Newton, (1994) PCR, BIOS Scientific Publishers, Oxford; LCR-기술: Shimer, Ligase chain reaction. Methods Mol. Biol. 46 (1995), 269-278; Chip 교잡화: Ramsay, DNA chips: State-of-the art. Nature Biotechnology 16 (1998), 40-44; 및 MALDI-TOF 분석: Ross, MALDI-TOF 질량 분광법에 의한 High level multiplex genotyping, Nature Biotechnology 16 (1998), 1347-1351에 기술된다. 다른 시험 원리는 해독발현된 단백질로써 MDR-1 변이체를 특이적으로 인식하는 시약의 적용에 기초한다. 예로는 대립유전자-특이 항체, 펩티드, 기질유사체, 억제물질 또는 새로운 MDR-1 대립유전자에 의해 인코딩된 다양한 MDR-1 단백질 형태(의 작용을 변형시키는)에 결합하는 다른 물질이다. 본 출원에서 정의된 새로운 뉴클레오티드 치환에서 유도된 시약에 의한 진단 시험 원리를 증명하기 위해, 여기에 나타낸 실시예는 PCR-방법에 기초한다. 기술된 특정 시약을 적용할 때, 다른 방법들 중 특정한 것은 MDR-1 대립유전자의 구별을 위해 또한 작용할 것이 분명하다.
실시예 4: 특정 PCR에 의한 MDR-1 대립유전자의 진단
대립유전자-특이 PCR은 단일 대립유전자 서열을 검출하기 위해 특별하게 디자인된 시약 (프라이머 조합)으로 중합효소 연쇄반응을 적용하여 유전자의 대립유전자를 구별시키는 분야에서 숙련가에 잘 알려져 있는 기술이다. 상기 시험의 주된 성분 및 상기 시험의 특이성을 제공하는 시약은 유전자의 다른 대립유전자를 특이적으로 구별하는 서열을 포함하도록 디자인된 올리고뉴클레오티드이다.
본 실시예에서, 다른 대립유전자에 대한 그들의 구별되는 교잡효능 및 효소 반응(상기 실시예에서 효소는 내열성 중합효소임)에 대한 기질로써 제공할 수 있는 그들의 다양한 능력때문에 특정 올리고뉴클레오티드는 다른 MDR-1 대립유전자를 구별할 수 있도록 디자인되었다. 특별히 디자인되고 각 인간내 새롭게 정의된 mdr-1 대립유전자의 존재 및/또는 부재를 검측할 수 있는 시약이 표 3에서 각 새로운 대립유전자에 대한 특정 프라이머 조합으로 개시되어 있다. 상기 시약의 디자인은 실시예 2에 나타나고 표 2 및 도 2a-2e에 개시되어 있는 인간 MDR-1 유전자에서 새롭게 발견된 뉴클레오티드 서열 및 염기 치환에 기초한다. 특정 시약의 디자인에 추가하여, 중합효소 연쇄반응의 원리에 기초한 진단 시험은 시험 조건의 최적화, 즉 최적화된 PCR-조건이 필요하다. 시험결과는 시험가능한 성분(주형)으로서 각 인간의 게놈 DNA를 사용하여 얻어진 특정 DNA 절편의 존재 또는 부재로 제공된다. 개인의 혈액으로부터 게놈 DNA를 제조하는 것은 실시예 1에 기술되어 있다.
20㎕의 반응 부피에서 모든 절편에 대해 PCR을 실시하였다. DNA 주형 50ng을 1.5mM MgCl2, 250μM dNTP's (Qiagen, Hilden), 1 ×Q-용액 (Qiagen, Hilden), 20pMol 각 프라이머(Metabion, Munich; 특정 야생형 프라이머 + 보통 프라이머 및 특정 변이체 프라이머 + 보통 프라이머) 및 1 U Taq 중합효소 (Qiagen, Hilden)를 포함하는 표준 PCR 완충액 (Qiagen, Hilden)에 첨가하였다. 모든 PCR을 95℃에서 3분의 초기변성단계 및 30초동안 94℃ 변성의 30회 증폭주기에 의해 Perkin Elmer thermocycler (모델 9700)에서 실시하였고, 프라이머 어닐링은 프라이머의 용융온도(PCR 조건: A-E)에서 30초동안 및 72℃에서 30초동안 그리고 72℃에서 8분동안 최종 팽창에 따라 다르다. 단일 PCR 조건 A-E에 대해 하기 어닐링 온도를 적용하였다: A: 54℃; B: 58℃; C: 50℃; D: 61℃; E:53℃.
각 특정 프라이머 서열에서 벗어난 염기는 밑줄그어져 있고 굵은 글씨체이다. 상기 분석에서 특정 DNA 절편의 존재 또는 부재는 시험된 대립유전자의 존재 또는 부재하에 해독한다.
MDR-1 대립유전자 검출 진단에 대한 결과로써 상기 정보에 대한 실시예는 도 3에 개시되어 있다. 상기 시험이 인간에서 분석된 MDR-1 대립유전자의 존재를 구별시키는데 적당하다는 것이 상기 실시예(표 3, 도 3)로부터 분명하다. 이종접합형 뿐만 아니라 동종접합형, MDR-1 유전자의 대립유전자가 드물게 뿐만 아니라 자주 검출될 수 있다. 상기 시험의 특이성은 적용된 특정 올리고뉴클레오티드 시약에 단독으로 및 전체적으로 의존한다. 상기 시약의 디자인은 차례로, 실시예 2 및 표 2에 나타낸 발견된 MDR-1 변이체 및 새로운 대립유전자의 서열 정보에 따라 다르다.
실시예 5: 환자내 MDR-1의 발현 수준 및 생체내 활성에 의한 다른 MDR-1 다형의 진단 및 상호관계
인간에서 임상 관련 표현형과 MDR-1 다형의 잠재적 직접적인 상호관계를 확인하기 위해, 슈튜트가르트의 Dr. Margarete Fischer-Bosch-Institut for Clinical Pharmacology의 연구로부터의 발단자(proband)가 실시예 2-4에 기술된 바와 같이 MDR-1 다형을 측정하기 위해 적용되었다. 상기 환자의 결장 및 간내 MDR-1의 발현수준은 MDR-1 단백질의 확립된 면역조직화학적 검출에 의해 또한 평가하였다. 발단자 집단에서, 결장내 MDR-1의 발현 수준을 측정하는데 더해, 리팜피신 (rifampicine)에 의한 유전자 유도시에 MDR-1을 측정하였다. 또한, 비유도 조건 및 리팜피신 유도조건 하에서, 공지의 MDR-1 기질이고 그의 혈액 농도가 또한 결장내 MDR-1 활성에 따라 다른 경구투여 디곡신(1㎎)의 혈액 농도를 측정함으로써, MDR-1의 생체내 활성을 측정하였다.
발단자 집단에서 MDR-1 다형 검측분석의 결과 뿐만 아니라 MDR-1 측정, 리팜피신 유도실험 및 디곡신-실험의 결과가 MDR-1 유전자 발현과 특정 다형의 MDR-1 생체내 활성 사이의 상호관계를 보여준다.
MDR-1 단백질 수준:
표 4에 보여진 바와 같이, 엑손 26의 Acc.#M29445/J05168내 위치 176의 T/C 다형은 MDR-1의 발현 수준과 상관관계에 있다. 상기 위치에서 T 대립유전자의 존재가 대응하는 동종접합형 C-대립유전자만을 갖는 샘플과 비교할 때 더 약한 MDR-1 발현 수준을 나타낸다. C-대립유전자 집단의 리팜피신-유도 MDR-1 수준의 평균은 T-집단보다 더 높다(924 대 587 상대 단위). 상기와 전적으로 일치하여, T-대립유전자에 대한 발단자 동종접합형은 최저의 검출가능한 비유도성 MDR-1 수준 및 유도성 MDR-1 수준을 갖지만 반면 C 대립유전자에 대한 발단자 동종접합형은 시험된 모든 발단자의 최고수준을 나타냈다. 상기 개인 사이의 유도성 MDR-1 발현 수준의 차이는 9배였다.
MDR-1 생체내 활성:
표 5는 비유도성 조건 및 리팜피신 유도성 조건 하에 MDR-1의 생체내 활성의 측정결과를 보여준다. 상기는 알려져 있는 MDR-1 기질이고 그의 혈액 농도가 결장내 MDR-1 활성에 따라 다른, 경구투여된 디곡신의 혈액 농도를 측정함으로써 실시되었다. 엑손 26 T/C의 Acc.#M29445/J05168내 위치 176의 다형은 MDR-1의 발현 수준과 상관간계가 있다는 관찰과 일치하여, 상기 다형의 상호관계는 디곡신 혈액 수준으로 관찰되고, 이는 차례로 MDR-1 단백질의 생체내 활성을 반영한다. T 대립유전자를 숨기는 발단자(더 약한 MDR-1 발현과 상관관계 있음, 표 4를 참조)는 대응하는 동종접합형 C-대립유전자만을 갖는 샘플과 비교할 때 디곡신의 더 높은 수준의 혈액을 함유한다. 상기에 대한 이유는 결장에서 혈액까지 디곡신과 같은 MDR-1 기질의 흡수가 더 낮은 MDR-1 발현을 갖는 인간에서 더 효과적이라는 것이다. 이는 전체적으로 결장내 MDR-1의 기능, 즉 흡수하는 세포로부터 결장의 루멘(lumen)으로 기질의 재이동 및 절단과 일치한다. C-대립유전자 집단의 혈액(MDR-1 활성에 역으로 상관관계있음)내 리팜피신-유도 디곡신 농도 뿐만 아니라 비유도 디곡신 농도의 평균은 T-집단보다 더 낮다(63.9 대 44.9, 및 45 대 28.6 Dig AUC 유도). 상기와 전체 일치하여, 동종접합형 T 대립유전자를 갖는 발단자는 리팜피신 유도후 혈액내 최고의 검출가능한 디곡신 농도(57.3 Dig.AUC)를 갖고 C-대립유전자에 대한 발단자 동종접합형은 모든 발단자의 최저 수준을 나타냈다(12.3 Dig.AUC). 상기 개인 사이의 디곡신 혈액수준의 차이는 4배 이상이었다.
환자 집단에서 MDR-1:
MDR-1 발현 수준, MDR-1 단백질 활성 및 MDR-1 다형 검출 분석의 상관관계분석결과는 슈튜트가르트의 Dr. Margarete Fischer-Bosch-Institut for Clinical Pharmacology로부터 다양한 환자의 MDR-1 발현 및 MDR-1 유전형을 분석함으로써 추가 확인된다. 면역조직학은 다양한 환자 조직샘플, 특히 결장 및 간에서 실시하였고, 상기 샘플사이의 MDR-단백질을 상대비교하였다. 각 실험세트에서, 환자 샘플을 MDR-1 착색강도, 즉 제1급은 최고의 MDR-강도 및 마지막급은 최저의 MDR-1 강도에 따라 등급을 정했다.
MDR-1 유전형과 상기 등급분석의 상관관계는 엑손 26의 Acc.#M29445/J05168내 위치 176의 다형에서 T 대립유전자가 상기 위치에서 동종접합형 C 대립유전자를 운반하는 환자들과 비교할 때 MDR-1 유전자의 더 낮은 발현과 상관관계가 있다는 것을 보여준다. 상기 분석에서, 2개의 다른 다형은 MDR-1 발현과 일부 상관관계를 보였다: AC002457(인트론 4)의 위치 171466에서 동종접합형 T 유전형은 높은 발현과 상관관계가 있으며, 엑손 11(M29432/J05168)내 위치 101에서 다형(GA)은 낮은 발현과 상관관계가 있다.
실시예 6: 엑손 26(C3435T) 다형과 확장된 샘플 수의 유전형/표현형 상관관계의 확인
상기 실시예에 기술되고 1)의 ATG 개시코돈의 제1 염기와 함께 MDR-1 엑손 26 SNP C3435T, (MDR-1 cDNA GenBank accession no. AF016535, 코돈 TTC 엑손 10, F335에 대응된 위치는 상기 서열에 없음)로서 언급되는 ACC.#M29445/J05168의 위치 176에서 단일 뉴클레오티드 다형 (SNP) T/C와 소장 MDR-1 발현의 수준(실시예 5에 나타낸 1차 결과)의 상관관계를 추가확인하기 위해, 슈튜트가르트의 Dr. MargareteFischer-Bosch-Institute for Clinical Pharmacology에서 추가 실험연구의 추가 지원자를 분석하였다. 상기 지원자 및 환자의 장내 MDR-1의 발현 수준은 십이지장의 생검법 및 장세포 제법의 웨스턴 블롯(Western blot) 및 정량적 면역조직화학에 의해 측정하였다. 상기 분석이 소장내 장세포에서 특정 PGP 발현을 반영한다는 것을 확신하기 위해, 장세포에서 발현된 추가의 표지기 단백질, 빌린(villin)을 동시에 분석하였다. 상기 분석의 결과는 도 4에 도시되어 있다. T/T 유전형은 C/C 유전형과 비교되는 중요한 더 낮은 MDR-1 발현 수준과 연관된다. C/T 유전형의 개인은 중간 표현형을 나타낸다.
MDR-1 유전형과 소장 디곡신 흡수와 상관관계를 추가 확인하기 위해, (리팜신 유도 및 PGP 단백질 측정없이, Johne외 (1999), Clin. Pharmacol. Thr. 66, 338-345) 경구 적용 후 디곡신의 혈액 수준을 어드레스하는 베를린의 University Medical Center, Charite에서 또 다른 임상연구의 추가 지원자를 엑손 26에서 그들의 MDR-1 유전형에 대해 평가하였다. 상기 연구에서, 최대 혈장농도(Cmax)를 디곡신의 정상상태 조건에서 평가하였다. 상기 약물동력학 변수가 다른 그룹사이에서 디곡신의 흡수에 차이를 특히 나타낸다. 도 5는 T/T 대립유전자를 동종접합형으로 운반하는 7명의 지원자 및 엑손 26에서 동종접합형 C/C 유전형을 갖는 7명 지원자의 디곡신 Cmax비교를 도시한다. T-대립유전자에 대한 동종접합형인 지원자는 C/C 유전형을 갖는 지원자와 비교할 때 상당히 높은 디곡신 수준을 나타낸다. 그룹 사이의 디곡신 Cmax에서 38%의 평균차이는 통계적으로 중요하고(p=0.006, MannWhitney U 2 샘플 시험), 디곡신 약물 동력학에서 상기 다형이 미치는 효과를 반영한다.
실시예 7: 다양한 개인의 많은 군의 서열 분석에 의한 새로운 MDR-1 다형의 확인
인간 MDR-1 유전자내 SNP에 대한 확장된 연구는 표 8에 개시된 MDR-1 유전자내 다른 새로운 MDR-1 다형에 더해 다수의 새로운 다형을 나타냈다. 새로운 스크린내에서, MDR-1 프로모터 절편에 대해서 뿐만 아니라 모든 MDR-1 엑손에 대해 각 샘플수를 증가시켰고, 이 중 일부를 236명에서 분석하였다.
PGP 발현을 예측하는데 사용될 수 있는 MDR-1 엑손 26 (C3435T) SNP에 더해, MDR-1 유전자의 영역내 다른 보다 드문 다형이 또한 발현에 영향을 줄 수도 있다. 예를 들면 프로모터 다형 및, SNP를 변화시키는 단백질은 MDR-1 발현 및 활성에 추가의 영향을 줄 수 있다. 또한, 상기 모든 새로운 다형은 개인에 유일한 정확한 개인 MDR-1 유전형 - 즉, 대립유전자 조성 - 을 생성하는데 이용할 수 있고 따라서 개인 MDR-1 의존성 약물반응을 예측하는데 매우 유용하다.
다형이 인간 MDR-1 유전자에 알려질수록, 개인 MDR-1 유전형 설명이 더 완전하고 유용해질 것이다. 상기 32개의 새로운 MDR-1 다형의 확인은 약물 치료법의 결과 및 부작용을 예측하는 많은 다른 MDR-1 유전형을 확립하는 목표를 이루는 추가의 중요한 단계이다.
실시예 8: 다른 약물유전학 요소의 조합하여 약물 수준에 영향을 주는 약물유전학 요소로서 MDR-1 엑손 26(C3435T) 다형의 결정
항경련약 페니토인은 간질, 급성 및 만성 심실성 부정맥 억제의 치료법 및 디기탈리스(digitalis) 중독에 흔히 사용된다. 비선형 약물 동력학과 조합하여 다수의 심각한 부작용을 갖는 좁은 치료 범위(즉, 투여량 증가와 반응하는 혈장수준의 과잉비례 증가)에 의해, 치료 결과를 개선하고 부작용을 막기 위해 매우 바람직한 주어진 투여량으로부터 혈장 수준을 예상하는 적당한 변수로 페니토인 치료를 했다.
다형의 효소 2C9 및 2C19는 페니토인의 물질 대사에 영향을 준다는 사실(Mamiya외 1998, Epilepsia Dec;39(12):1317-23)이 알려져 있고, 2C9 결핍으로 인해 부작용 또는 약물 무효력을 일으키는 비정상 혈액 수준을 이끌 수 있다는 사실(Aynacioglu외 1999, Br J Clin Pharmacol. Sep;48(3):409-15)을 보여줬다. 그러나, 2C9 유전형이 주어진 투여량으로부터 정확한 혈액 수준 예측을 허용하지 않는 것이 또한 분명하다. 각 효소 유전형에 대해 상보적인, 2C9 유전형 개인에서조차 혈액 수준은 매우 다양하다.
표 6은 2C9에 더해, MDR-1 엑손 26 (C3435T) SNP가 페니토인 혈액 수준에서 분명한 역할을 한다는 사실과, 상기 SNP에 대한 MDR-1 유전형이 페니토인 투여량, 유전형 및 혈액 수준 사이의 더 정확한 상관관계를 허용한다는 것을 보여준다.
2C9/19 효소 유전형 그룹내에서, 수준의 변화는 높아진 혈액수준을 이미 보여준, 특히 2C9/C19 불충분한 대사체(metabolizer)의 그룹에서 MDR-1 유전형에 의해 설명될 수 있다. 여기서 MDR-1 유전형은 매우 높은 페니토인 혈액 수준: MDR-1 T/T 유전형을 갖는 불충분한 대사체를 나타내는, 위험한 환자의 소집단을 확인할수 있다. 상기 환자들은 과잉투여관련 약물 부작용에 직면하는 높은 위험을 갖는다. 예를 들면, 페니토인을 수용한 100명의 환자 그룹내에서, 낮은 PGP (T/T) 유전형을 갖는 2C9 결핍 환자는 가장 높은 혈액 농도를 보였고, 이는 "정상" 집단과 비교할 때 약 2배 증가되었다. Cyp 2C9 유전형 및 페니토인 혈장 수준 사이의 상관관계는 통계적으로 중요하지만, 중요성은 공변량으로 MDR-1 T/T 유전형을 고려함으로써 높아진다(p<0.001, ANCOVA).
| MDR-1 유전형 | CC 및 CT | TT |
| 소장 PGP | 높음/중간 | 낮음 |
| 페니토인 혈액 수준: | ||
| 2C9 대사체 | 정상 | 정상 |
| 2C9 약한 및/또는 결핍 대사체 | 높음 | 매우 높음 |
| 샘플 | PGP 농도 | MDR-1 유전형 |
| 비유도성 발단자비유도성 발단자, 평균 | 5539276376212 | T-대립유전자는(T/T 및 T/C)엑손 26내Acc.#M29445/J05168내위치 176에 존재함. |
| 리팜피신-유도성 발단자리팜피신-유도성 발단자, 평균 | 1421085520601587 | |
| 비유도성 발단자비유도성 발단자, 평균 | 96302291230 | T-대립유전자는(C/C만)Acc.#M29445/J05168내위치 176에 존재하지 않음. |
| 리팜피신-유도성 발단자리팜피신-유도성 발단자, 평균 | 42312641086924 | |
| 최저 rif-유도성 활성 | 142.1 | 동종접합형 T/T는Acc.#M29445/J05168내위치 176에 존재함. |
| 최고 rif-유도성 활성 | 1264.9 | 동종접합형 C/C는Acc.#M29445/J05168내위치 176에 존재함. |
| 샘플 | 혈액내 디곡신 농도 | MDR-1 유전형 |
| 비유도성 발단자비유도성 발단자, 평균 | 63.664.173.254.763.9 | T-대립유전자는(T/T 및 T/C)Acc.#M29445/J05168내위치 176에 존재함. |
| 리팜피신-유도성 발단자리팜피신-유도성 발단자, 평균 | 57.33945.837.745 | |
| 비유도성 발단자비유도성 발단자, 평균 | 55.630.848.344.9 | T-대립유전자는(C/C만)Acc.#M29445/J05168내위치 176에 존재하지 않음. |
| 리팜피신-유도성 발단자리팜피신-유도성 발단자, 평균 | 39.612.333.928.6 | |
| 최고 rif-유도성dig 혈액수준 | 57.3 | 동종접합형 T/T는Acc.#M29445/J05168내위치 176에 존재함. |
| 최저 rif-유도성dig 혈액수준 | 12.3 | 동종접합형 C/C는Acc.#M29445/J05168내위치 176에 존재함. |
표 8에 대한 설명: MDR-1 SNP
MDR1 변이 및 각 야생형 및 돌연변이체 대립유전자: 돌연변이체 대립유전자에 대한 기대되는 동종접합빈도는 Hardy-Weinberg 분포에 기초하여 계산하였다. 서열부분에서, 비정상적인 염기는 밑줄그어져 있으며, 굵은 글씨체로 되어 있다.
Claims (45)
- (a)SEQ ID NOs: 73, 74, 79, 80, 85, 86, 91, 92, 97, 98, 101, 106, 107, 112, 113, 116, 119, 122, 154, 155, 160, 161, 166, 167, 172, 173, 178, 179, 184, 185, 190, 191, 196, 197, 202, 203, 208, 209, 214, 215, 220, 221, 226, 227, 232, 233, 238, 239, 244, 245, 250, 251, 256, 257, 262, 263, 268, 269, 274, 275, 280, 281, 286, 287, 292, 293, 298, 299, 304, 305, 310, 311, 316, 317, 322, 323, 328, 329, 334, 335, 340, 341, 346, 347, 352, 353, 358, 359, 364, 365, 370, 371 또는 376중 어느 하나의 핵산서열을 갖는 폴리뉴클레오티드;(b)SEQ ID NOs: 372, 373, 374 또는 375 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;(c)MDR-1 유전자(Accession No: AC002457)의 위치 140837, 141530, 141590, 171466, 171512 또는 175068에 대응하는 위치, MDR-1 유전자(Accession No: M29432 또는 J05168)의 위치 101 또는 308에 대응하는 위치, MDR-1 유전자(Accession No: AC005068)의 위치 83946에 대응하는 위치, MDR-1 유전자(Accession No: AC005068)의 위치 78170에 대응하는 위치, MDR-1 유전자(Accession No: M29445 또는 J05168)의 위치 176에 대응하는 위치, MDR-1 유전자(Accession No: AC002457)의 위치 171456, 171404 또는 175074에 대응하는 위치, MDR-1 유전자(Accession N.:AC005068)의 위치 77811에 대응하는 위치 또는 MDR-1 유전자(Accession No: M29445 또는 J05168)의 위치 137에 대응하는 위치에서 뉴클레오티드 교환, 뉴클레오티드 결실, 추가의 뉴클레오티드 또는 추가의 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 교환을 가지며, 분자변이체 다중약물내성(MDR)-1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;(d)MDR-1 유전자(Accession No: AC002457)의 위치 140837, 171512, 171456, 171404, 139119, 139619, 140490 또는 171511에 대응하는 위치에서 C를 갖고, MDR-1 유전자(Accession No: AC002457)의 위치 141530, 139177, 139479, 140118, 140568, 140727 또는 174901에 대응하는 위치에서 A를 갖고, MDR-1 유전자(Accession No: AC002457)의 위치 141590, 139015, 140216, 140595, 175142 또는 175180에 대응하는 위치에서 G를 갖고, MDR-1 유전자(Accession No: AC002457)의 위치 171466, 175068, 175074, 139064, 139276, 140576 또는 145984에 대응하는 위치에서 T를 갖고, MDR-1 유전자(Accession No: M29432 또는 J05168)의 위치 101에 대응하는 위치에서 A를 갖고, MDR-1 유전자(Accession No: M29432 또는 J05168)의 위치 308에 대응하는 위치에서 T를 갖고, MDR-1 유전자(Accession No: AC005068)의 위치 83946, 78170, 70237 또는 70200에 대응하는 위치에서 T를 갖고, MDR-1 유전자(Accession No: AC005068)의 위치 77811, 84032 또는 73252에 대응하는 위치에서 G를 갖고, MDR-1 유전자(Accession No: AC005068)의 위치 84701, 84074, 84119, 83973, 70371, 70253, 70204 또는 43162에 대응하는 위치에서 A를 갖고, MDR-1 유전자(Accession No: AC005068)의 위치 43263에 대응하는 위치에서 C를 갖고, 또는 MDR-1 유전자(Accession No: M29445 또는 J05168)의 위치 176 또는 137에 대응하는 위치에서 T를 갖고, 분자변이체 MDR-1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;(e)폴리펩티드가 MDR-1 폴리펩티드(Accession No: P08183)의 위치 21, 103 또는 400에서 아미노산 치환을 포함하는, 분자변이체 MDR-1 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및(f)폴리펩티드가 MDR-1 폴리펩티드(Accession No: P08183)의 위치 21에서 N의 D로의 아미노산 치환, 위치 103에서 F의 S로의 아미노산 치환, 위치 103에서 F의 L로의 아미노산 치환, 또는 위치 400에서 S의 N으로의 아미노산 치환을 포함하는, 분자변이체 MDR-1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드.
- 제 1 항에 있어서,상기 뉴클레오티드 결실, 첨가 및/또는 치환에 의해, 해당 야생형 유전자와 비교되는 변이체 MDR-1 유전자가 변형발현되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제 3 항에 있어서,상기 폴리뉴클레오티드는 원핵세포 또는 진핵세포에서 발현하는 발현조절서열에 작동하도록 결합되는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제 3 항 또는 제 4 항의 벡터에 의해 유전조작되는 숙주세포.
- (a)제 5 항의 숙주세포를 배양하는 단계; 및(b)배지로부터 상기 단백질 또는 절편을 추출하는 단계로 이루어진 분자변이체 MDR-1 단백질 또는 그의 절편의 제조방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제 3 항 또는 제 4 항의 벡터에 의해 세포를 유전조작하는 것을 포함하는 분자변이체 MDR-1 유전자를 발현할 수 있는 세포의 제조방법.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되거나, 또는 제 6 항의 방법에 의해 얻을 수 있거나, 또는 제 7 항의 방법에 의해 제조된 세포로부터 얻을 수 있는 MDR-1 단백질 또는 그의 절편.
- 제 8 항의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체.
- 제 9 항에 있어서,상기 항체는 제 1 항 또는 제 2 항에서 정의된 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 가지는 에피토프를 특이적으로 인식하는 것을 특징으로 하는 항체.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리뉴클레오티드에 대해 상보적인 핵산분자.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 인식하고, 절단할 수 있는 핵산분자.
- 제 11 항 또는 제 12 항의 핵산분자를 포함하는 벡터.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 또는 제 3 항 또는 제 4 항의 벡터를 포함하는 트랜스제닉 비-인간 동물.
- 제 14 항에 있어서,MDR-1 유전자의 적어도 하나의 비활성화된 야생형 대립유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비-인간 동물.
- 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,상기 동물은 마우스 또는 쥐인 것을 특징으로 하는 트랜스제닉 비-인간 동물.
- (a)약물운반에 반응하여 검출가능한 시그널을 제공할 수 있는 성분의 존재하에서 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분자변이체 MDR-1 유전자를 발현하는 세포 또는 제 8 항의 단백질을 MDR-1 매개된 약물운반을 허용하는 조건하에서 선별되는 화합물과 반응시키는 단계, 및(b)약물운반로부터 발생되는 시그널의 존재 또는 부재 또는 증가를 검출하는 단계(시그널의 존재 또는 증가는 가능성있는 억제물질을 표시함)로 이루어진 MDR-1 유전자 또는 그의 유전자 생성물의 분자변이체 활성을 조절할 수 있는 MDR-1 억제물질을 확인 및 수득하는 방법.
- 제 17 항에 있어서,상기 세포는 제 7 항의 방법에 의해 얻거나, 또는 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 트랜스제닉 비-인간 동물내에 포함되는 제 5 항의 세포인 것을 특징으로 하는 MDR-1 억제물질의 확인 및 수득방법.
- (a)제 8 항의 단백질을 MDR-1 단백질에 의해 결합된 것으로 알려진 제1 분자와 반응시켜서 상기 단백질 및 상기 제1 분자의 제1 복합체를 형성하는 단계;(b)상기 제1 복합체를 선별되는 화합물과 반응시키는 단계; 및(c)상기 화합물이 상기 제1 복합체로부터의 상기 제1 분자를 치환하는지를 측정하는 단계로 이루어지는 MDR-1 유전자 또는 그의 유전자 생성물의 분자변이체 활성을 조정할 수 있는 MDR-1 억제물질을 확인 및 수득하는 방법.
- 제 19 항에 있어서,상기 측정단계는 상기 단백질과 상기 화합물의 제2 복합체를 형성여부를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 MDR-1 억제물질의 확인 및 수득방법.
- 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,상기 측정단계는 상기 단백질에 결합하지 않는 상기 제1 분자의 양을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 MDR-1 억제물질의 확인 및 수득방법.
- 제 19 항 또는 제 21 항에 있어서,상기 제1 분자는 베라파밀, 발스포다, 시클로스포린 A 또는 덱스니굴디핀인 것을 특징으로 하는 MDR-1 억제물질의 확인 및 수득방법.
- 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 제1 분자가 표지되는 것을 특징으로 하는 MDR-1 억제물질의 확인 및 수득방법.
- (a)한 개체로부터의 샘플내에 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리뉴클레오티드가 존재하는지를 측정하는 단계; 및/또는(b)제 8 항의 단백질이 존재하는 지를 측정하는 단계로 이루어지는 MDR-1 유전자의 분자변이체의 존재와 연관된 질병 또는 상기 질병에 대한 감수성을 진단하는 방법.
- 제 24 항에 있어서,상기 질병은 암인 것을 특징으로 하는 진단방법.
- 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서,PCR, 리가아제 연쇄반응, 제한 소화, 직접 시퀀싱, 핵산증폭기술, 교잡기술 또는 면역검정을 포함하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
- 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 질병을 치료 또는 경감시키기 위해 약제를 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
- 제 24 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 진단방법은 (ⅰ)기능 및 발현가능한 야생형 MDR-1 유전자 또는 (ⅱ)제 11 항 또는 제 12 항의 핵산 분자 또는 제 13 항의 벡터를 세포에 도입시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 진단방법.
- 제 17 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항의 방법단계; 및(c)(b)단계에서 확인 및 수득된 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 형태의 그의 유도체를 합성 및/또는 배합하는 단계를 포함하는 약학적 조성물의 제조방법.
- 치료 용도에 적합한 형태의 약물 또는 프로-드럭을 배합하는 단계, 및 제 24 항 또는 제 25 항의 방법으로 진단된 개체의 질병을 예방 또는 경감시키는 단계로 이루어진 약학적 조성물의 제조방법.
- 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서,상기 화합물 약물 또는 프로드럭은 제 27 항에서와 같은 약제의 유도체인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물의 제조방법.
- 제 17 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 확인 또는 수득할 수 있는 억제물질.
- 제 8 항의 단백질에 특이적으로 결합하는 제 32 항의 억제물질.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리뉴클레오티드의 검출 및/또는 각 MDR-1 대립유전자의 유전형을 알기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 용도.
- 제 34 항에 있어서,상기 폴리뉴클레오티드는 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제 11 항 또는 제 12 항의 핵산분자인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 용도.
- 제 34 항에 있어서,상기 올리고뉴클레오티드는 약 15 내지 50개의 뉴클레오티드 길이이며, 표 8에 개시된 MDR-1 유전자의 엑손 또는 프로모터의 돌연변이 ("mut")-서열 또는 야생형("wt")-서열 또는 SEQ ID NOS: 1 내지 179중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열 또는 상기중 어느 하나의 상보서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 용도.
- 제 36 항의 올리고뉴클레오티드로 구성된 프로브 또는 프라이머.
- 제 8 항의 단백질을 검출하기 위한, 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분자변이체 MDR-1 유전자를 발현하기 위한, 및/또는 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 MDR-1 대립유전자를 구별하기 위한, MDR-1 유전자의 유전자 생성물에 특이적으로 결합할 수 있는 물질 또는 항체의 용도.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리뉴클레오티드, 제 3 항 또는 제 4 항의 벡터,제 5 항의 숙주세포 또는 제 7 항의 방법에 의해 얻은 숙주세포, 제 8 항의 단백질, 제 9 항 또는 제 10 항의 항체, 제 11 항 또는 제 12 항의 핵산분자, 제 13 항의 벡터, 제 32 항의 억제물질 또는 제 37 항의 프로브 또는 프라이머를 포함하는 조성물.
- 제 39 항에 있어서,상기 조성물은 진단용 또는 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리뉴클레오티드를 그의 게놈내에 포함하는, 개체의 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약학적 조성물을 제조하기 위해 사용하는 것을 특징으로 하는 유효량의 약물 또는 프로드럭의 용도.
- 제 41 항에 있어서,상기 질병은 암 또는 신경세포성, CNS 또는 심혈관계 질병인 것을 특징으로 하는 용도.
- 부작용 및 약물 상호작용을 예측 및 예방하고/또는 환자 순응을 높이기 위해 약물 안정성 및 효능을 향상시키기 위해, MDR-1 기질 및/또는 유도물질의 혈액수준을 예측하기 위한 약리유전학적 인자로서 사용하는 것을 특징으로 하는 MDR-1 유전자 단일 뉴클레오티드 다형(SNP)의 용도.
- 제 43 항에 있어서,상기 기질 및/또는 유도물질은 항경련약/항간질약 약물, 심배당체, 면역억제 약물, 마크롤리드-항생제 또는 거대고리형-항생제로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 43 항 또는 제 44 항에 있어서,SNP는 MDR-1 엑손 26 (C3435T) SNP인 것을 특징으로 하는 용도.
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