KR101170651B1

KR101170651B1 - 알츠하이머 병의 진단 및 예측 방법

Info

Publication number: KR101170651B1
Application number: KR1020057024490A
Authority: KR
Inventors: 생드린 마세; 실뱅 리까르드; 엠마누엘 쿠신; 라우렌트 프라디에르; 헤서스 베나비데스; 쟝-프랑소아 델루츠
Original assignee: 아방티 파르마 소시에테 아노님
Priority date: 2003-06-20
Filing date: 2004-06-17
Publication date: 2012-08-03
Also published as: NO20060257L; PL1639139T3; ZA200509945B; FR2856409B1; TW200517502A; RU2380423C2; AU2004249919B2; IL172690A0; HRP20110778T1; WO2004113568A3; CA2529633A1; EP1639139B1; FR2856409A1; DK1639139T3; WO2004113568A2; RU2006101561A; JP2007515151A; AR044492A1; SI1639139T1; MXPA05012800A

Abstract

본 발명은 개체의 알츠하이머 병을 진단 또는 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 ABCA2 유전자의 rs908832 다형태의 부 대립유전자의 존재 여부를 검출하는 1 이상의 단계를 포함한다. ABCA2 유전자의 rs908832 다형태의 부 대립유전자의 존재는 그 개체가 알츠하이머 병에 걸려 있거나 또는 현재 알츠하이머 병이 발생될 위험률이 높다는 것을 시사한다.

알츠하이머 병, 다형태, 대립유전자, 부 대립유전자, ABCA2 유전자, rs908832 다형태

Description

알츠하이머 병의 진단 및 예측 방법{Methods for the diagnosis and prognosis of Alzheimer's disease}

본 발명은 알쯔하이머 병의 진단 또는 예측 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 알츠하이머 병의 진단 또는 예측용 키트에 관한 것이다.

알츠하이머 병은 노년층의 많은 이들에게 발병하는 신경퇴행성 질환이다. 임상적으로, 이 질환은 인식 기능의 상실을 특징으로 하며, 신경병리학적으로는 뇌 속에 세포내 신경섬유 침착물의 존재와 아밀로이드 플라크를 형성하는 β-아밀로이드(Aβ) 펩타이드의 세포외 침착물의 존재를 특징으로 한다. 아밀로이드 플라크는 β-아밀로이드 펩타이드 전구 단백질(APP)의 단백분해 과정에 의해 생성되는, 아미노산이 40개 또는 42개인 Aβ 펩타이드로 주로 구성된다. Aβ의 세포외 침착물은 알츠하이머 병에 특이적이다. 이 침착물은 가족 형태를 비롯하여 모든 형태의 알츠하이머 병에서 나타나는 불변의 초기 특징이다.

이 병의 가족 형태는 비교적 초기에 나타난다(40세에서 60세 사이). 이러한 형태는 적어도 부분적으로 APP 유전자 및 프리세닐린-1(PS1)과 프리세닐린-2(PS2) 유전자에서의 돌연변이 때문인 것으로 보인다. 이러한 세 유전자에서의 돌연변이는 APP 단백분해에 변화를 유도하여, Aβ의 과잉생산, 및 알츠하이머 병의 산발형과 유사한 병리 상태와 증상의 초기 양상을 일으킨다.

또한, 역학적 연구와 최근 생화학 및 세포생물학 연구의 결과로부터 콜레스테롤과 알츠하이머 병 사이의 연관성이 확인되었다[Hartmann, T.(2001) TINS 24: S45-48 참조]. 성인 연령에서의 높은 콜레스테롤 수치 및 높은 동맥 혈압 역시 알츠하이머 병의 위험을 크게 증가시킨다(Kivipelto et al., 2001 Br Med J. 322: 1447).

한편, 스타틴 형태의 콜레스테롤 강하제로 치료받은 집단에서 위험률의 현격한 감소가 기록되었다[Wolozin et al. (2000) Arch Neurol. 57 : 1439; Jick et al. (2000) Lancet 356 : 1627].

분자 연관성은 최근 확립된 것으로 생각된다. 시험관내 (in vitro) 및 생체내 (in vivo)에서 높은 콜레스테롤 수치는 Aβ 펩타이드의 생산을 증가시키고 아밀로이드 플라크의 출현을 가속화시키는 반면[Sparks et al. (1994) Exp. Neurol. 126 : 88-94; Refolo et al. (2000) Neurobiol. Dis. 7 : 321-331; Puglielli et al. (2001) Nat. Cell Biol. 3 : 905; Shie et al. (2002). Neuroreport 13 : 455], 콜레스테롤 합성 경로의 억제제는 상기 펩타이드 생산을 감소시킨다[Simons et al. (1998) PNAS USA 95: 6460-6464; Fassbender et al. (2001) PNAS USA 98 : 5856, Refolo et al., (2001) Neurobiol. Dis. 8 : 890-899].

이러한 현격한 발전에도 불구하고, 의학계는 여전히 알츠하이머 병에 실제로 효과적인 분자가 부족하다는 현실에 직면해 있다. 이러한 분자의 부족의 원인 중 하나는 이러한 질병에 대한 치료 작용을 발휘할 수 있는 분자의 선별에 효과적인 표적을 찾기가 어렵다는 점에 있다.

더욱이, 이러한 질병의 조기 검출은 환자를 심하게 불구로 만드는 1차 증상이 시작되어 분명해지기 전에 치료를 제공하기 위한 결정적인 요인으로 생각된다.

또한, 이 질병은 다양한 양상으로 인해, 첫째, 치료받는 개체의 함수 및 둘째, 치료에 사용될 수 있는 분자의 함수로서 치료의 목표를 세우는 것이 필수적인 것으로 생각된다. 이러한 약리게놈학적 접근 또는 약리유전학적 접근은 점차 중요한 것으로 생각되고 있다.

ABCA2 단백질은 ABC(ATP 결합 카세트)형 콜레스테롤 수송인자의 대 부류에 속하는 단백질이다. 이러한 수송인자는 뇌에서 특이적으로 발현된다.

ABCA2 유전자의 클로닝에 대해서는 2000년에 짜오 등(Biochem. J., 350, 865-872)에 의해 설명된 바 있다. 또한, 서열은 액티브패스 파마슈티컬스(ACTIVEPASS PHARMACEUTICALS) 사에서 기탁한 PCT 출원 WO 01/14414의 주제였다. 이 출원에는 ABCA2의 역할에 관한 다양한 가설들이 제기되고 있지만, 이러한 가설들을 지지하는 결과는 전혀 없다.

ABCA2 유전자의 다양한 다형태 (polymorphism)는 이미 확인되어 있다. 구체적으로, 이 다형태의 서열은 NCBI의 dbSNP 데이터베이스에서 입수가능하다. 이러한 데이터베이스에 올려져 있는 다양한 다형태 중에서, rs908832 다형태가 있다.

이 다형태는 서열번호 2의 서열 중 위치 348에 구아닌이 위치해 있는 코카서스인 집단의 주(major) 대립유전자 및 서열번호 1의 서열 중 위치 348에 아데닌이 위치해 있는 코카서스인 집단의 부(minor) 대립유전자를 특징으로 한다.

또는, 이 모노뉴클레오타이드 다형태가 서열번호 1 및 서열번호 2와 각각 부 분적으로 상보적인 서열번호 3 및 서열번호 4의 서열을 나타내는 것이다. 또한, 이 다형태는 서열번호 4의 서열 중 위치 201에 시토신이 위치해 있는 코카서스인 집단의 주 대립유전자, 및 서열번호 3의 서열 중 위치 201에 티미딘이 위치해 있는 코카서스인 집단의 부 대립유전자를 특징으로 한다.

이러한 다형태는 동의적(synonymous)이며, 즉 해독된 단백질의 서열을 변경시키지 않는다. 이러한 다형태의 두 대립유전자는 아스파르트산을 암호하는 코돈의 일부이다. 이러한 암호화 다형태는 서열번호 5로 표시되는 전사체의 엑손 14에서 위치 2185에 위치한 것이다.

놀랍게도, 본 출원인은 ABCA2 유전자의 rs908832 다형태의 부 대립유전자를 나타내는 개체가 알츠하이머 병의 조기 발생의 위험률이 높다는 것을 발견했다.

이러한 발견은 본 출원인의 견해로는 ABCA2 단백질, 특히 이 단백질을 암호화하는 유전자의 다형태와 알츠하이머 병과 같은 병리 상태와의 연계성의 증거를 최초로 제시하는 것이기 때문에 매우 중요하다고 생각한다.

이러한 발견은 알츠하이머 병의 진단을 이미 받은 환자인 경우 병의 중증도, 및 계획된 치료의 예상 효과도 확인 및/또는 예측할 수 있게 해 줄 것이며, 또한 진단이 확인된 환자와 관련이 있는 개체를 포함하여, 알츠하이머 병의 증상을 보이지 않는 개체인 경우 이 병의 출현의 위험률을 예측할 수 있게 해 줄 것이다.

또한, 알츠하이머 병의 생리병리학적으로 ABCA2의 주요 기능적 역할을 확인할 수 있게 하므로, 알츠하이머 병의 치료 용도로서 ABCA2 활성에 대해 자극 또는 억제 작용을 발휘할 수 있는 분자를 선별하는 검사법의 사용이 정당화된다.

따라서, 본 발명의 제1 과제는 개체의 알츠하이머 병을 진단 또는 예측하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 ABCA2 유전자의 다형태의 대립유전자를 검출하는 1 단계를 최소한 포함하는 것이다. 여기서, 다형태는 알츠하이머 병과 관련있는 다형태인 것이 유리하다. 즉, rs908832 다형태인 것이 바람직하지만, rs908832 다형태와 유전자 연관이 불균등성인 임의의 다른 다형태일 수 있다.

적당한 개체는 예컨대 다음과 같은 개체일 수 있다:

- 알츠하이머 병의 증상을 나타내지 않는 개체,

- 알츠하이머 병의 발생 위험률이 이미 검출되었지만, 이 질병의 증상이 아직 보이지 않는 개체, 및

- 알츠하이머 병에 걸린 것으로 이미 진단받고, 이 진단의 확인을 원하는 개체.

rs908832 다형태의 부 대립유전자의 존재 유무를 검출하는 단계(들) (동시적이거나 그렇지 않은 것)은 생물 시료를 사용하는 임의의 적당한 수단에 의해 직접 또는 간접적으로 수행된다.

따라서, 본 발명은 알츠하이머 병이 매우 발생하기 쉬운 개체를 검출하기 위하여, 개체, 특히 알츠하이머 병의 증상을 나타내지 않는 개체로부터 취한 생물 시료를 선별하는 방법에 관한 것이다. 이러한 선별 방법은 rs908832 다형태의 부 대립유전자의 존재에 대해 상기 생물 시료들을, 가능하게는 동시적으로 조사하는 것을 포함한다.

조사되는 DNA 또는 단백질을 함유하는 상기 시료는 다양한 기원의 시료일 수 있다. 예를 들어, 혈액 시료, 정액 시료 또는 모발 시료(모근 포함)일 수도 있고, 또는 유핵 세포를 함유한 임의의 다른 시료일 수도 있다. 분석되는 생물 시료는 혈액 시료인 것이 바람직하다. 이러한 경우에, 조사할 DNA는 백혈구에서 취한다.

본 발명에서, "생물 시료"란 용어는 진단이나 예측을 원하는 개체로부터 어떠한 다른 형질전환 없이 직접 얻은 시료, 또는 검출 단계에 유익한 분획만을 보존하기 위해 1 이상의 준비단계가 실시된 시료, 예컨대 미정제 세포 추출물을 의미하는 것으로 간주한다.

rs908832 다형태의 부 대립유전자를 수반하는 DNA의 존재 유무를 검출 또는 동정하는 기술은 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술, 하이브리드화 기술, 서던 블롯팅 기술, 뉴클레아제를 이용한 분해 기술, 제한효소 단편 길이 다형태(RFLP) 기술, 및 /또는 PCR 산물의 직접 서열분석 기술의 조합일 수 있다. 이러한 기술들은 모두 당업계에 공지되어 있다.

일반적으로, 본 발명에 있어서 사용될 수 있는 rs908832 다형태의 부 대립유전자를 수반하는 DNA를 동정하기 위한 기술들은 모두 동정할 DNA를 함유하는 생물 시료를 수거하는 사전 단계 및 당업계에 공지된 표준 기술에 따라 게놈 DNA를 추출하는 단계를 포함하며, 그러한 기술의 예에는 스미드 등 (Smith et al., The Lancet, 1992, 339, pp. 1375-7)의 방법이 있다.

이러한 동정 방법은 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다:

a) 상기 개체의 DNA를 추출하는 단계,

b) 이와 같이 분리된 DNA를, ABCA2 유전자의 rs908832 다형태의 대립유전자 각각에 상응하는 서열을 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용하여 증폭시키는 단계, 및

c) 증폭된 DNA 중에서, ABCA2 유전자의 rs908832 다형태의 대립유전자의 적어도 하나를 측정하는 단계.

유리한 양태에 따르면, PCR 기술이 사용된다. 즉, 단계 b)는 폴리머라제 연쇄 반응 단계를 포함하는 것이 유리하다. 이 기술은 먼저 증폭될 DNA 분절(프라이머)의 범위를 정하는 영역의 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 단계를 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 이 DNA 폴리머라제의 프라이머로서 작용한다. 그 다음, 두 DNA 가닥을 분리하기 위한 열 변성 단계(92 내지 95℃), 온도 감소(50 내지 55℃)를 통해 두 특이적 프라이머와 하이브리드를 형성하는 단계, 및 70 내지 72℃에서 DNA 폴리머라제에 의한 프라이머의 연장 단계를 수행한다.

이와 같이 ABCA2 유전자의 rs908832 다형태의 대립유전자 각각, 특히 부 대립유전자를 증폭시키는 상기 프라이머, 및 이에 상보적인 서열도 본 발명의 다른 과제이다. 이러한 서열은 DNA 분자와 하이브리드를 형성하는 각 지점 사이에 존재하는 염기의 수가 25 내지 2500 염기쌍, 바람직하게는 100 내지 500 염기쌍 사이인 것이 유리하다.

또한, 이러한 프라이머는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 약 15 내지 30개 사이의 연속 뉴클레오타이드를 보유한 것이 유리하다. 특히, 서열번호 6 및 서열번호 7의 서열을 가진 프라이머 쌍인 것이 바람직하다.

유리한 양태에 따르면, 본 발명의 과제는 rs908832 다형태의 부 대립유전자 를 수반하는 증폭된 DNA를, 두 형태의 다형태 중 한 형태에 각각 특이적인 두 프로브의 특이적인 하이브리드화에 의해 이 대립유전자를 수반하지 않는 증폭된 DNA와 구별하는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 프로브 및 이 프로브에 상보적인 서열 역시 본 발명의 다른 과제를 구성한다.

이러한 프로브는 각각 서열번호 3 또는 서열번호 4의 약 12개 내지 17개 연속 뉴클레오타이드로 이루어진 것이 유리하다. 바람직하게는, 이 서열은 각각 서열번호 8 및 서열번호 9을 갖는다.

rs908832 다형태의 부 대립유전자를 수반하는 증폭된 DNA는 DNA 폴리머라제 I(TaqMan)의 5' 뉴클레아제 활성을 이용하는 기술에 의해, 이 대립유전자를 수반하지 않는 증폭된 DNA와 구별될 수도 있다.

유리한 양태에 따라서, 본 발명의 과제는 제한효소 단편 다형태(RFLP) 분석을 통해 rs908832 다형태를 수반하는 증폭된 DNA와 이 다형태를 수반하지 않는 증폭된 DNA를 구별하는 방법을 제공하는 것이다. 유리하게는, 이러한 제한효소 단편은 증폭된 DNA를 제한효소로 분해한 후, 아가로스 겔에서 이동시키고, 막에 서던 블롯팅하고, 하이브리드화함으로써 수득된다.

보다 큰 민감도와 보다 우수한 특이성을 수득하기 위하여, 다른 두 쌍의 프라이머, 즉 통상적인 PCR에서와 같이 증폭된 DNA 단편을 수득할 수 있게 하는 외부 프라이머의 제1 쌍과 제1 PCR로부터 수득된 DNA 단편을 증폭시키기 위한 내부 프라이머의 제2 쌍을 사용하는 2회 연속 PCR("중첩(nested) PCR")을 수행할 수도 있다.

원하는 영역의 유전자 풋프린트(footprint)를 측정하기 위하여, PCR로 수득 한 DNA 단편은 전기영동을 통해 크기별로 분리한 뒤, ETB(에티디움 브로마이드) 및 자외선을 통해 가시화할 수 있다.

이러한 경우에 특히 유리한 방법은 3' 말단에 돌연변이된 뉴클레오타이드 서열을 보유하는 제1 프라이머와 3' 말단에 야생형 뉴클레오타이드 서열을 보유하는 제2 프라이머를 이용하여 PCR를 수행하는 것으로 구성된 방법이다. 이러한 두 경우의 변성(denaturation) 온도의 차이 및 이에 따른 증폭 효율의 차이는 돌연변이 DNA와 야생형 DNA를 구별할 수 있게 해 줄 것이다.

다른 양태에 따르면, 증폭된 DNA 단편은 PCR로부터 생산된 DNA 단편의 시료를 나일론 필터에 침착시키는 단계, DNA 단편을 변성시키는 단계, 변성된 DNA 단편을 방사능 특이적 프로브와 하이브리드를 형성시키는 단계, 부착되지 않은 과량의 방사능 산물을 제거하기 위해 세척하는 단계 및 자가방사선술을 수행하는 단계로 구성되는 점 블롯(dot blot) 기술로 직접 동정한다. 발현은 또한 방사능 표지 이외의 다른 표지, 예컨대 염료 또는 기타 형광성 표지를 포함한 특이적 프로브를 이용하는 다른 방법으로 수행할 수도 있다.

또 다른 대안 양태에 따르면, rs908832 다형태를 포함한 DNA에 돌연변이의 존재 여부는 증폭된 DNA 단편의 전체 또는 일부를 직접 서열분석하여 검출할 수도 있다. 이러한 방법은 rs908832 다형태에 있는 뉴클레오타이드 서열을 분석하는 것으로 구성되어진다. 이러한 서열분석은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 수행할 수 있으며, 그 예에는 생거법 (Sanger method) 또는 맥삼 및 길버트법 (Maxam and Gilbert method)이 있다.

또 다른 대안 양태에 따르면, rs908832 다형태를 수반하는 DNA의 존재 여부 는 서던 블롯팅 기술을 이용하여 검출할 수 있는데, 이 기술은 1종 이상의 제한효소로 처리한 후 수득되는 DNA 단편의 전기영동을 수행하는 것으로 이루어진다. 그 다음, 겔을 변성시킨 뒤, 나일론 막 위에 블롯팅을 수행한다. 이 막은 특이적 프로브와 하이브리드화시키기 위한 것이다. 부착되지 않은 과량의 방사능 산물을 제거하기 위한 세척 후, 막에 필름을 도포한다. 이로써, 프로브에 의해 인식되는 DNA 단편에 상응하는 1 이상의 밴드가 검출될 수 있다.

또한, rs908832 다형태의 존재 여부는 서던 블롯팅 및/또는 PCR 기술과 함께 RFLP 기술을 병용하여 검출할 수도 있다. RFLP는 다양한 개체의 DNA를 비교하고, 제한효소 부위를 나타나게 하거나 사라지게 하는 점 돌연변이(point mutation)의 발생 여부를 조사할 수 있게 해준다. 제한 효소로 처리된 동일 서열의 두 DNA는 동일한 단편을 제공하며, 이러한 단편에 의해 수득되는 서던 블롯은 역시 동일할 것이다. 한편, 돌연변이 후 제한효소 부위가 사라지거나, 또는 나타났다면, 단편은 더 이상 동일한 크기가 아니게 되어, 자가방사선상에서 가시화될 것이다. 돌연변이 후 새로운 제한 부위가 나타난 경우에도 마찬가지일 것이다.

또한, ABCA2 유전자의 rs908832 다형태는 ABCA2 단백질을 암호화하는 전사체의 위치 2185에 있는 뉴클레오타이드를 측정함으로써 검출할 수도 있다.

전술한 모든 기술은 당업자에게 공지된 것이다. 또한, rs908832 다형태의 존재 여부를 검출하기에 적당한 공지의 기타 다른 기술도 사용할 수 있다. 이러한 기술과 관련하여 리가제 연쇄 반응, 가닥 치환 증폭, 전사 기반 증폭 등을 예로 들 수 있다. 상기 검출 단계는 다음 문헌에 기술된 방법들에 따라 PCR, RFLP, 서던 블 롯팅 및/또는 이러한 기술의 조합으로 실시하는 것이 유리하다(Gough et al., Nature, 1990, 347, p.773; Kagimoto et al., J. Biol. Chem., 1990, 265, p. 17209; Wolf et al., The Lancet, 1990, 336, p. 1452; Hayashi et al., Nucleic Acids Res., 1991, 19, p. 4797; Daly et al., Pharmacogenetics, 1991, 1, p. 33; Spurr et al., Methods Enzymol., 1991, 206, p. 149; Armstrong et al., The Lancet, 1992, 339, p. 1017; Kurth et al., Am. J. of Med. Genet., 1993, 48, p. 16 6; McCann et al., J. Neurol. Sci., 1997, 153, p. 50; Stroombergen et al., Hum. & Exper. Toxicol., 1999, 18, p. 141).

이러한 검출 방법들은 모두 개체가 알츠하이머 병을 앓고 있는지 또는 알츠하이머 병의 발생 위험률의 증가 여부를 나타내는지를 측정할 수 있는 토대를 이루기 때문에 매우 유용하다.

따라서, 본 발명의 또 다른 과제는

a) 개체의 ABCA2 유전자의 유전자형을 측정하는 단계, 및

b) 개체의 알츠하이머 병의 발생 위험률에 대한 예측 및 이 질병에 대해 예상될 수 있는 치료요법적 조치의 효과를 제공하도록, 단계 a)에서 수득한 데이터를 전환시키는 단계를 포함하여, 개체로부터 채취한 생물 시료를 분석하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 개체의 알츠하이머 병을 진단 또는 예측하기 위한 세트 또는 키트에 관한 것이다.

이러한 키트는 바이알이나 튜브와 같은 다양한 용기를 수용할 수 있게 구획 화된 패키징 형태일 수 있다. 이러한 용기들은 각각 rs908832 다형태를 수반하는 DNA의 존재 여부의 검출을 수행하는데 필요한 다양한 성분을 포함하는 것이다.

검출 반응을 수행하는데 필요한 상기 성분은 전술한 것 중에서 선택된 것이다. 그 예를 들면, 다음과 같다:

- ABCA2 유전자의 일정한 영역과 하이브리드를 형성하는 한쌍의 프라이머 및 경우에 따라 증폭 반응의 수행에 필수적인 수단, 또는

- 경우에 따라 지지체에 고정화되고 검출가능한 표지를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 및 경우에 따라 하이브리드화 반응의 수행에 필수적인 시약.

본 발명의 또 다른 과제는

- 개체에 rs908832 다형태의 부 대립유전자의 존재를 검출하는 1 이상의 단계, 및

- rs908832 다형태의 부 대립유전자를 나타내는 개체에게, 알츠하이머 병에 대한 활성이 공지된 화합물 또는 화합물의 혼합물을 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머 병의 치료방법에 관한 것이다. 여기서, 질병은 초기 알츠하이머 병인 것이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 과제는 ABCA2 유전자의 rs908832 다형태의 부 대립유전자와 관련된 질병을 나타내는 개체로의 투여를 목적으로 하는 화합물을 선발하는 방법으로서,

a. 상기 개체로부터 채취한 생물 시료 내에서 ABCA2 유전자의 rs908832 다형태의 부 대립유전자의 존재를 측정하는 1 이상의 단계, 및

b. 상기 대립유전자가 존재한다면 적당한 화합물을 선발하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 과제는 알츠하이머 병을 나타내는 개체로의 투여를 목적으로 하는 화합물을 선발하는 방법으로서,

또한, 본 발명은, 치료 전 rs908832 다형태의 부 대립유전자의 존재가 검출된 알츠하이머 병을 앓고 있는 개체를 치료하기 위한 약물을 제조하는데 있어서의 알츠하이머 병에 대한 활성이 공지된 화합물 또는 화합물의 혼합물의 용도에 관한 것이다.

알츠하이머 병에 대한 활성이 공지된 상기 화합물에는, 아세틸콜린 에스터라제 억제제(AchEI, 예컨대 Donepezil(Aricept), Galantamine(Reminyl) 또는 Exelon(리바스티그민)), NMDA 수용체 채널 길항제(예컨대, Memantine(Ebixa)), 아밀로이드 펩타이드 생산 억제제, 예컨대 BMS 299897, 또는 장래의 ABCA2 활성 조절제를 예로 들 수 있다.

배합된 화합물은 동시 또는 별도로, 또는 경시적 제공 방식으로 경구, 비경구, 경피 또는 직장으로 투여할 수 있다.

화합물은 전술한 1종 이상의 화합물의 배합과 약제학적으로 허용되는 비히클 을 함유하는 약제학적 조성물 형태로 조제된다.

경구 투여용 고체 조성물인 경우, 정제, 환제, 산제(젤라틴 캡슐, 카세) 또는 과립제로서 사용될 수 있다. 이러한 조성물에서, 활성 성분은, 아르곤 기류 하에서 1종 이상의 불활성 희석제, 예컨대 전분, 셀룰로스, 슈크로스, 락토스 또는 실리카와 혼합된다. 이러한 조성물은 또한 희석제 외에 다른 물질, 예컨대 마그네슘 스테아레이트 또는 탈크와 같은 1종 이상의 윤활제, 염료, 코팅(당의정) 또는 바니시를 함유할 수 있다.

경구 투여용 액체 조성물인 경우, 용액제, 현탁제, 유탁액제, 시럽제 및 엘릭시르제로 제조될 수 있으며, 이러한 제제는 약제학적으로 허용되며, 물, 에탄올, 글리세롤, 식물유 또는 파라핀유와 같은 불활성 희석제를 함유한다. 이러한 조성물은 희석제 외에 다른 물질, 예컨대, 습윤제, 감미제, 증점제, 향미제 또는 안정화제를 함유할 수도 있다.

비경구 투여용 멸균 조성물은 바람직하게는 수용액 또는 비수용액, 현탁액 또는 유탁액일 수 있다. 용매 또는 매개제로는 물, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물유, 특히 올리브유, 주사용 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레이트, 또는 기타 다른 적당한 유기 용매가 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 보조제(adjuvant), 특히 습윤화제, 등장화제, 유화제, 분산제 및 안정화제를 함유할 수 있다. 멸균은 여러 가지 방식으로 수행할 수 있으며, 그 예에는 무균 여과, 조성물에 멸균화제의 첨가, 방사선조사 또는 가열이 있다. 또한, 멸균수 또는 임의의 다른 주사용 멸균 매질을 사용하는 경우에 용해될 수 있는 멸균 고체 조성물 형태로 제조할 수도 있다.

직장 투여용 조성물은 활성 산물 외에, 코코아 버터, 반합성 글리세라이드 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 부형제를 함유하는 좌약 또는 직장용 캡슐이다.

전술한 바와 같은 배합물을 함유하는 약제학적 조성물은 일반적으로 0.1 내지 500mg의 화합물을 함유한다.

이러한 용량은 원하는 효과, 치료 기간 및 사용된 투여 경로에 따라 달라지며, 성인의 경우 1일당 화합물 0.1 내지 500mg 범위의 경구 투여량이 일반적이다.

일반적으로, 의사는 치료받는 개체의 연령과 체중 및 그 개체에 특이적인 다른 모든 요인의 함수로서 적당한 투여량을 결정할 수 있다.

또한, 본 발명은 ABCA2 유전자의 기능이 변형되도록 rs908832 다형태의 부 대립유전자를 수반하는 1종 이상의 외인성 DNA 서열을 게놈에 삽입시킨 유전자전이된(transgenic) 동물에 관한 것이다.

"유전자전이된 동물"이란 용어는 게놈의 인위적 변형을 나타내는, 인간을 제외한 모든 동물을 의미하는 것으로 간주한다. 게놈의 변형은 1 이상의 유전자의 "녹인(knock-in)" 또는 "녹아웃(knock-out)" 변경 또는 변형의 결과(상동성 재조합에 의한 유전자의 불활성화/변형)이거나, 또는 마우스의 신경 세포 유형(예컨대, Thy1, PDGF 또는 프리온) 또는 신경아교 세포 유형(예컨대, GFAP)에 특이적인 프로모터의 조절하에서의 사람 유전자의 과잉발현의 결과일 수 있다. 이러한 변형은 통상적인 변형제 또는 돌연변이제의 작용에 의해 수행되거나 또는 하이브리드 유전자를 발현시키는 발현 카세트의 안정된 삽입에 의해 일어날 수 있다. 특히, 국제 특 허 출원 WO 01/02552 또는 WO 01/13176에 기술된 것과 동일하거나 유사한 방법에 따라 변형 절차를 수행할 수도 있다.

또한, 게놈의 변형은 유전자(들)의 삽입 또는 야생형 또는 돌연변이형 유전자(들)의 치환에 따른 결과일 수 있다.

변형은 복제 줄기 세포에서 수행되는 것이 유리하다.

현 시점에서, "녹인" 및 "녹아웃" 기술을 이용한 게놈의 변형은 하나의 모델로서 마우스에만 제한되고 있는데, 그 이유는 마우스 배아 유래의 배아세포주를 집락형성(colonization)시키는 능력이 있는 줄기 세포("ES" 세포라고 명명됨)만이 입수가능하기 때문이다. 다른 종 유래의 ES 세포주가 입수가능한 때에는, 당업자는 이러한 다른 종에도 상기 기술을 용이하게 적용하여 KO 및/또는 KI 모델을 제조할 수 있을 것이다. 또한, 올리고뉴클레오타이드(DNA, RNA 또는 하이브리드)를 단독 또는 DNA/RNA 변형 효소와 함께 사용하는 것을 기반으로 한 접근법은 게놈의 소정 위치에 일정한 변형/돌연변이를 도입시키는 데 사용할 수 있다. 심지어, 게놈에 무작위 변형을 유도하는 방사선조사 또는 화학적 돌연변이제도 효과적인 생물학적 마커 세트(표현형) 및 고 수율의 위치 클로닝 절차와 조합된다면 사용할 수 있다.

실험 동물(마우스, 래트, 소, 돼지, 양 등)의 게놈을 변형시키는 가장 직접적인 접근법은 단일 세포 단계에서 수정된 난모세포의 1 또는 2개의 전구핵에 선형화된 DNA를 미세주사하는 전이유전자(transgene)의 무작위 통합법이다(2 이상의 세포 단계에서의 주사도 사용될 수 있기는 하지만 키메라 동물의 생성을 피하기 위해서는 단일 세포 단계가 바람직하다). 대체로, 전이유전자는 다음과 같은 두 부분으 로 구성되어진다: DNA에 의해 암호화된 RNA 발현의 시공간 제어를 부과하는 조절 인자, 및 상기 병치된 DNA(cDNA 또는 게놈 단편). 이러한 두 성분(조절 인자 및 목적 단백질을 암호화하는 DNA)은 표적 게놈에 동종성이거나 이종성일 수 있다. 관련된 유전자전이된 동물은 일반적으로 인간을 제외한 포유동물 중에서 선택되는 것이다. 그 예에는, 쥐과 동물, 즉 마우스, 래트와 기니아 피그, 토끼, 고양이, 개, 양 또는 소과의 동물이 포함될 수 있다. 바람직하게는, 이들은 통상의 유전자전이 기술에 따라 수득되는 쥐과 동물, 래트 또는 토끼이다. 본 발명의 또 다른 과제는 rs908832 다형태의 부 대립유전자를 수반하는 1종 이상의 외인성 게놈 DNA 서열이 게놈에 삽입된, 줄기 세포주 및 이러한 줄기 세포주로부터 분화된 세포주이다.

간결하게 설명하면, 본 발명에 따른 유전자전이된 동물, 줄기 세포주 및 분화된 세포주의 제조는, ABCA2 단백질을 암호화하는 외인성 게놈 DNA를 동물의 상응하는 유전자에 상동성 재조합에 의해 삽입하여 유전자전이된 동물을 제조하는 방법(전이유전자의 삽입은 동물 유전자의 프로모터 바로 다음으로 표적화함으로써 전이유전자에 정확한 발현 프로필을 부과하고 동물의 내인성 유전자의 발현을 억제할 수 있다; 녹아웃), 또는 사람 ABCA2 유전자의 이소폼에 해당하는, 본 발명에 기술된 특정 돌연변이를 동물의 내인성 유전자에 삽입하는 방법(이 변형은 줄기세포의 상동성 재조합에 의해 유발되어진다: 녹인), 또는 rs908832 다형태의 부 대립유전자를 수반하는 ABCA2 유전자를 과잉발현시키는 방법으로 수행될 수 있다.

마우스인 경우에는, 알츠하이머형 돌연변이를 보유한 사람 APP 유전자를 수반하고 아밀로이드 플라크를 발생시키는 유전자전이된 마우스와 교배할 수도 있어 유리하다. 이러한 이중 유전자전이된 동물은 알츠하이머 병을 앓고 있는 환자 또는 위험성이 있는 환자에서 관찰되는 유전자형을 재현한다. 이와 같이 수득된 신생 동물의 rs908832 다형태 유전자형은 이미 전술한 기술, 특히 증폭 반응(PCR) 및/또는 서던 블롯팅을 사용하여 조절할 수 있다.

이와 같은 유전자전이된 동물은 특히 중요한데, 그 이유는 이러한 동물이 알츠하이머 병의 이해에 유리한 모델로서, 알츠하이머 병의 특징을 매우 충실하게 재현하기 때문이다. 공지 모델과 비교하면, 이 모델은 알츠하이머 병의 치료에 특히 적합한 화합물, 특히 사람에 대해 설명한 바와 같은 화합물의 입증을 특히 가능하게 한다. 이러한 화합물은 화학적 분자, 펩타이드 또는 단백질 분자, 항체, 키메라 분자 및 안티센스 DNA 또는 리보자임일 수 있다.

이와 같이 입증된 화합물은 단독으로 또는 약제학적 조성물을 제공할 수 있는, 약제학적으로 허용되는 비히클과 함께 약물로서 사용될 수 있다. 이러한 화합물은 특히 멸균된 등장성 식염수 용액(인산 일나트륨 또는 이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 염화마그네슘 등, 또는 이러한 염의 혼합물)이거나, 또는 적당하다면 멸균수 또는 생리식염수를 첨가하여 주사용 용질을 구성할 수 있는 건조, 특히 동결건조된 조성물일 수 있다. 주사는 정위, 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피 주사 등으로 수행될 수 있다.

전술한 화합물의 입증은, 본 발명의 동물 모델을 활성이 있는 것으로 추정되는 화합물 또는 화합물의 혼합물과 접촉, 특히 주사 등에 의한 투여를 통해 접촉시키는 단계, 및 그 다음 다양한 생화학적 및/또는 조직학적 변화에 미치는 상기 화 합물의 효과를, 특히 상기 모델의 뇌에서 나타나는 효과를 측정하는 단계를 기초로 한다.

알츠하이머 병을 예방하거나 약화시키거나 또는 치료하는 치료 화합물을 생체내에서 시험할 수 있다는 사실 외에도, 상기 유전자전이된 동물은 또한 발병기전을 유도하거나 가속화하는 환경 인자를 선별하거나, 또는 이 질병의 발생 동안의 반응을 연구하고 수반되는 다양한 생물학적 기작을 연구하기에, 예컨대 새로운 약물의 연구 또는 약물의 유효량 및 독성을 측정하는 목적에 유익한 알츠하이머 병의 동물 모델로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 과제는 알츠하이머 병의 예방 및/또는 치료를 목적으로 하는 화합물 또는 방법의 활성을 시험하는데 사용되는, 전술한 바와 같은 유전자전이된 동물, 줄기 세포주 또는 이의 분화 세포주의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 과제는 전술한 바와 같은 유전자전이된 동물로부터 추출된 세포, 및 알츠하이머 병의 치료용으로 예정된 화합물의 입증에 사용되는 상기 세포의 용도에 관한 것이다.

전술한 화합물의 입증은, 본 발명의 동물 모델에서 추출한 세포를 활성이 있는 것으로 추정되는 화합물 또는 화합물의 혼합물과 접촉, 특히 주사 등에 의한 투여를 통해 접촉시키는 단계, 및 그 다음 전(whole) 세포, 세포 균질액 또는 아세포 분획 및 세포 사멸과 같은 다양한 변수에 미치는 상기 화합물의 효과를 측정하는 단계를 기초로 한다.

이상의 구성 외에도, 본 발명은 이의 범위를 제한함이 없이 본 발명을 예시하는 것으로 간주되어야 하는 후속 실시예 및 도면으로부터 드러나는 다른 특징 및 장점도 포함하는 것이다.

실시예 1: 환자 시료에 존재하는 ABCA2 유전자의 rs908832 다형태의 유전자형 연구

알츠하이머 병을 앓고 있는 코카서스인 혈통의 환자 및 대조군 개체 유래의 DNA 수집물을, 이들의 동의를 구한 다음 사용했다.

다형태의 빈도는 코리엘 인스티튜트 (Coriell Institute, USA)에서 시판하는 패널 중 47개 개체 시료의 유전자형별화(genotyping)로 측정했다.

알츠하이머 병을 앓고 있는 환자 및 대조군의 유전자형별화를 위해, 유전자 내의 위치 및 그 빈도에 기초하여 10개의 다형태(rs908832 다형태 포함)를 선택했다.

5' 뉴클레아제 분석법 (어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems) (미국 포스터 시티 소재) 사의 대립유전자 식별 기술)을 사용하여 유전자형을 제조한 다음, 이들 각각의 마커와 알츠하이머 병과의 연계성을 시험(이종성 시험)하여 Chi2 통계 분석을 수행했다. 이 분석을 위해, 질병이 나타나는 연령에 따라 초기(65세 이하) 또는 후기(65세 초과)로 그룹을 나누고, 그 기원에 따라 산발성(최초로 알려진 경우) 또는 가족성(동일 가계에서 이미 알려진 바 있는 경우)으로 나누었다.

rs908832 다형태에 대해 수득된 결과는 다음과 같았다:

- 환자(440 유전자형) 중의 부 대립유전자(T)의 빈도: 7.4

- 대조군(519 유전자형) 중의 부 대립유전자(T)의 빈도: 3.4

환자 및 대조군에서 모두 하디바인베르크 비율이 확인되었다: 즉 어떠한 유의적 편차도 관찰되지 않는 바, 유전자형별의 오류가 없음을 알 수 있었다.

질병의 초기 형태(65세 이하)를 나타내는 환자에서 수행된 시험 결과는 다음과 같다:

- 산발성 증례 136명 대 대조군 272명:

- 이종성 시험: chi2(1dd1) = 22.69, p= 2x10^-6

- 대립유전자 시험(빈도(T) vs 빈도(C)): chi2(1dd1) = 21.27, p = 4x10^-6

- 가족성 증례 104명 대 대조군 272명:

- 이종성 시험: chi2(2dd1) = 7.80, p = 0.02

- 대립유전자 시험(빈도(T) vs 빈도(C)): chi2(1dd1) = 7.27, p 7x10^-3

초기 형태를 240명의 환자들에 대한 로지스틱 (logistic) 회귀분석으로 교차비(odd ratio)를 계산했다(성별 및 APOE-ε4 상태에 대해 조정을 수반한다). 그 결과는 유의적이었다: OR = 3.97, IC= [2.23-7.09].

수득된 값은 본페로니(Bonferroni)법에 의한 복수 시험의 보정 후에도 유의적인 상태를 유지했다(역치가 0.05로 고정됨).

이러한 결과는 ABCA2 유전자가 알츠하이머 병의 병인 관계에 중요한 유전자임을 시사한다.

위험률 측면에서, 이러한 결과는 지금까지 알츠하이머 병의 가장 일반적으로 공지된 위험 요소인 아포지방단백질 E4에 의해 부여되는 위험률과 동일한 정도였 다.

실시예 2: 유전자전이된 마우스의 제조

1. 사람 ABCA2 단백질을 발현하는 유전자전이된 마우스의 제조

사람 ABCA2 단백질의 돌연변이유발은 Sculptor™(Amersham, 프랑스)와 같은 시험관내 돌연변이유발 시스템을 사용하여 수행했다. ABCA2의 암호 영역을 Bluescript 타입(Stratagene)의 클로닝 벡터에 서브클로닝하고, 원하는 돌연변이를 함유한 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 돌연변이를 도입시켰다. 돌연변이된 서열은 서열분석을 통해 확인했다.

2. ABCA2 유전자전이된 마우스의 제조 및 확인

전이유전자의 작제를 위해, ABCA2를 암호화하고 사람 rs908832 다형태의 부 대립유전자를 나타내는 게놈 DNA를, 특정 조직/세포 유형에 특이적인 유전자전이된 발현용 벡터, 예컨대 신경세포 유형용 THYI(Luthi et al., J.Neuroscience, 17, pp. 4688-99), PDGF 또는 프리온, 또는 성상세포 유형용 GFAP 등의 폴리링커에 서브클로닝했다. 초나선형 DNA 제조를 위해 플라스미드 제조 키트(Qiagen)를 사용했다. 미세주사를 위해, 벡터 서열은 소정의 제한 효소로 분해하여 제거해야 하며, 전이유전자 전체는 본래 그대로 남겨서 클로닝 벡터의 불필요한 서열로부터 분리한다. 이러한 단편을 함유하는 발현 카세트를 그 다음 아가로스 겔 전기영동으로 정제한다.

미세주사할 분취량은 플로팅 필터(floating filter)(Millipore; 막 타입; VS; 0.025㎛) 상에서 TE 완충액(10mM Tris pH 7.4; 0.1mM EDTA)에 대해 투석한 뒤, 여과했다(Spin-X; Costar; 폴리아세테이트 막; 0.22㎛). DNA를 미세주사를 위한 최종 농도 1 내지 2ng/㎕으로 희석했다. 이와 같이 정제된 단편을 수정된 마우스 난모세포의 두 전구핵 중 하나로 주사했다. 생존한 배아를 양모 ("가임신")의 난관에 즉시 이식했다. 신생 마우스에 전이유전자의 존재는 특정 프로브/서열을 사용하여 PCR 또는 서던 블롯 분석으로 측정했다. 이러한 모든 분석에 의하면, 시조와 이의 자손에서 나타나는 전이유전자의 모든 주요 재배열 또는 결실을 배제하는 것이 가능하다.

3. 게놈에 사람 ABCA2 단백질을 함유하는 유전자전이된 동물의 제조

사람 rs908832 다형태의 부 대립유전자를 나타내는 ABCA2 유전자를, 원하는 소정 위치의 마우스 유전자에 도입시키기 위해 줄기 세포의 상동성 재조합 기술을 사용했다. 본 발명에 기술된 프라이머 및 시료는 상응하는 마우스 유전자의 분리 및 클로닝을 위한 동종인자형의 마우스 게놈 라이브러리(람다, BAC, YAC 등의 라이브러리)를 선별하는데 용이하게 사용될 수 있다. 상기 마우스 유전자는 당업자에게 공지된 표준 기술(제한효소 부위 지도화, 서열분석, 생체분석 장치)을 사용하여 게놈 조직과 서열에 대한 특성을 분석함으로써, 사람 DNA의 목적한 발현 프로필을 수득하면서 동시에 쥐과 동물 유전자의 발현을 결정적으로 중단시키기 위해 사람 DNA가 삽입되어야 하는 정확한 부위가 규명될 수 있다. 이와 같이 정확한 위치가 확인 되면, 줄기 세포용의 표준 표적화 벡터(즉, 목적한 사건의 선발용 마커를 보유한 벡터, 이러한 마커는 당해 분야의 전문 기술을 가진 자에게 공지되어 있다)를 작제한다. 선발된 삽입 부위 바로 다음에 위치한 쥐과 동물 ABCA2 유전자 서열의 3' 및 5' 연장부와 동일한, 마우스 게놈 DNA 단편(2 내지 6kb)의 3' 및 5' 말단의 경계에 선발용 카세트(항생제 내성 유전자)를 신속하게 위치시킨다.

마우스 유전자에 관한 정보를 토대로, 고 수율의 선별 절차를 최적화하고 유효하게 하기 위하여 재조합체 줄기 세포 선별용의 양성 대조군 벡터(이 벡터는 통합이 성공적으로 일어난 즉시 쥐과 동물 유전자의 유전자좌를 복제한다)를 제조했다.

DNA는 표적화 실험을 위해 표준 절차에 따라 정제했다. 이러한 표적화 벡터를 표준화된 전기천공 기술을 사용하여 줄기 세포로 도입시키고, 그 다음 줄기 세포 클론을 후속 선별 절차(항생제)로 처리하여 목적하는 재조합을 수반하는 줄기 세포 클론을 증식시켰다. 일반적으로, 선별에는 약 2주가 소요되었다. 내성의 줄기 세포 클론은 PCR 및/또는 서던으로 선별했다.

게놈에 임의의 다른 검출가능한 변형을 수반하지 않는 목적하는 재조합을 보유하는 줄기 세포의 클론을 성장시켜 충분한 세포를 수득했다. 이러한 세포를 그 다음 자연 배란시킨 암컷에서 수득한 3.5일 배아로 주사했다. 생존하는 배반포(줄기 세포 함유)를 암컷 수용체에 이식하여, 배반포를 출산일까지 성장시키면, 숙주 배반포와 줄기 세포 클론으로 부터 유래된 세포로 구성된 신생 마우스를 출산할 수 있다. 이러한 유형의 동물은 "키메라 동물"이라 부른다.

이러한 키메라(줄기 세포주의 대부분이 수컷 마우스에게서 수득되기 때문에 수컷인 것이 바람직하다)를 야생형 마우스와 "교미"시켜 변형이 이종접합성인 동물을 수득한다. 이종접합성 동물을 서로 교배시키면 동종접합성 동물을 수득할 수 있다.

4. 상응 유전자에 사람 ABCA2 유전자의 rs908832 다형태의 부 대립유전자를 포함하는 유전자전이된 동물의 제조

쥐과 동물 유전자를 전술한 바와 동일한 방식으로 분리하여 특성규명했다. 본 실시예 유형의 변형을 위해, 사람 유전자와 쥐과 동물 유전자를 비교하여 사람 유전자에서 발견되는 돌연변이 지점이 쥐과 동물 유전자에 도입되어야 하는 정확한 위치를 확인하는 것이 필수적이다. 이 단계에서 생체분석은 필수적이다. 마지막으로, 표적화 벡터는 전술한 바와 같은 방식으로 제조 및 조립한다. 성공적인 상동성 재조합 후, 쥐과 동물 유전자의 암호 서열에는 돌연변이의 목적 지점 이외에서 어떠한 변화도 일어나지 않았다. 일부 선발 마커는 인트론에 유지될 수 있지만, 이들은 일반적으로 유전자 발현에는 어떠한 영향도 미치지 않는다. 필요하다면, 이러한 마커는 재조합효소 인식 인자를 포함하는 표적화 벡터의 2차 제조를 사용하여 제거할 수도 있다. 작제물이 일단 조립되면, 이후 단계는 전술한 절차와 동일하다.

일반적으로, 이러한 ABCA2 유전자전이된 마우스는 아밀로이드 플라크 침착의 촉진을 위해 가족성 형태의 알츠하이머 병의 돌연변이를 수반하는 APP 유전자를 발현하는 유전자전이된 마우스와 교배하는 것이 유리하다.

5. 신경조직병리학

뇌 조직의 제조

마우스를 심부 마취(펜토바르비탈: 60mg/ml/kg i.p., 케타민: 40mg/ml/kg i.p.)한 뒤, 생리식염수와 그 다음 파라포름알데하이드(PBS 중에 4%)를 심장막을 통해 관류시켰다. 다음, 뇌를 분리한 후 동일한 고정화 용액에 4℃에서 24시간 동안 후고정시켰다. 고정화 후, 뇌를 우뇌와 좌뇌로 분리한 뒤, 파라핀 매립의 표준 프로토콜에 따라 처리했다.

유전자전이된 마우스 및 비-유전자전이된 마우스의 파라핀 매립된 좌측 반뇌, 및 알츠하이머 병을 앓고 있는 개체 및 대조군 개체로부터 수득한 사후 사람 뇌 조직(전두골 피질)의 블록을, 마이크로톰(LEICA RM 2155, 프랑스)을 사용하여 6㎛ 두께로 잘랐다(연속 절단). 유전자전이된 마우스 및 비-유전자전이된 마우스의 우측 반뇌에 해당하는 조직 블록은 25㎛ 두께로 잘랐다.

Aβ 아밀로이드 펩타이드에 대한 면역반응성을 당업계에 공지되어 있는 바와 같이 검출한다.

<110> AVENTIS PHARMA S.A. <120> Methods for the diagnosis and prognosis of Alzheimer's disease <130> PRJ03027 <150> FR 03/07,501 <151> 2003-06-20 <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 562 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ttcatcacct gcgggtgggc caggggcttg gggcaggccc cggggaggac gccgcccctc 60 cctgccagcc cgcgcctcca gggagagtcc cggcccgcgc acctccttga gccggtgctc 120 cttctccgcc acgatgtgct ggatggtcat ggccacggag tagacccagg agatcaccat 180 gcacagcggc atcatgtgct caatgacaaa caggaagctg cggggaggcc gcgctcaggc 240 gccactcagc cccagcccca gccccagccc cgggcgccca gcactcactc atcgcgtgtg 300 tagcaggggt aggggaacat ctgcacgtag ctgcctggct ccaccacatc gtgccccaca 360 aaagtgtcga tgatggcgcg ctccatcatg tctgtgggtg ggggcagcca tcaggtgccg 420 ggcaggccct ctcgtcctca cacctgtcct cccccatgaa tcctccagcc ggtcttccgg 480 gcctgctcct caccctggat ccagacgaag ccgtagagga agtagaagcg gccgccagta 540 ttgggcccag gccgccagta gg 562 <210> 2 <211> 562 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ttcatcacct gcgggtgggc caggggcttg gggcaggccc cggggaggac 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gggctggggc 300 tgagtggcgc ctgagcgcgg cctccccgca gcttcctgtt tgtcattgag cacatgatgc 360 cgctgtgcat ggtgatctcc tgggtctact ccgtggccat 400 <210> 4 <211> 400 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gggcccaata ctggcggccg cttctacttc ctctacggct tcgtctggat ccagggtgag 60 gagcaggccc ggaagaccgg ctggaggatt catgggggag gacaggtgtg aggacgagag 120 ggcctgcccg gcacctgatg gctgccccca cccacagaca tgatggagcg cgccatcatc 180 gacacttttg tggggcacga cgtggtggag ccaggcagct acgtgcagat gttcccctac 240 ccctgctaca cacgcgatga gtgagtgctg ggcgcccggg gctggggctg gggctggggc 300 tgagtggcgc ctgagcgcgg cctccccgca gcttcctgtt tgtcattgag cacatgatgc 360 cgctgtgcat ggtgatctcc tgggtctact ccgtggccat 400 <210> 5 <211> 8154 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ggggcggagc cagcgcggat cgggtcccgg acgcccgagc gccccgcccc cgcgcgggcg 60 atgcccagcg gcgcggcggg ctgcggggcc cggcggggcg cgcagaggag cgggccgcgg 120 cgctgaggcg gcggagcgtg gccccgccat gggcttcctg caccagctgc agctgctgct 180 ctggaagaac gtgacgctca aacgccggag cccgtgggtc ctggccttcg agatcttcat 240 ccccctggtg ctgttcttta tcctgctggg gctgcgacag aagaagccca ccatctccgt 300 gaaggaagtc cccttctaca cagcggcgcc cctgacgtct gccggcatcc tgcctgtcat 360 gcaatcgctg tgcccggacg gccagcgaga cgagttcggc ttcctgcagt acgccaactc 420 cacggtcacg cagctgcttg agcgcctgga ccgcgtggtg gaggaaggca acctgtttga 480 cccagcgcgg cccagcctgg gctcagagct cgaggcccta cgccagcatc tggaggccct 540 cagtgcgggc ccgggcacct cggggagcca cctggacaga tccacagtgt cttccttctc 600 tctggactcg gtggccagaa acccgcagga gctctggcgt ttcctgacgc aaaacttgtc 660 gctgcccaat agcacggccc aagcactctt ggccgcccgt gtggacccgc ccgaggtcta 720 ccacctgctc tttggtccct catctgccct ggattcacag tctggcctcc acaagggtca 780 ggagccctgg agccgcctag ggggcaatcc cctgttccgg atggaggagc tgctgctggc 840 tcctgccctc ctggagcagc tcacctgcac gccgggctcg ggggagctgg gccggatcct 900 cactgtgcct gagagtcaga agggagccct gcagggctac cgggatgctg tctgcagtgg 960 gcaggctgct gcgcgtgcca ggcgcttctc tgggctgtct gctgagctcc ggaaccagct 1020 ggacgtggcc aaggtctccc agcagctggg cctggatgcc cccaacggct cggactcctc 1080 gccacaggcg ccacccccac ggaggctgca ggcgcttctg ggggacctgc tggatgccca 1140 gaaggttctg caggatgtgg atgtcctgtc ggccctggcc ctgctactgc cccagggtgc 1200 ctgcactggc cggacccccg gacccccagc cagtggtgcg ggtggggcgg ccaatggcac 1260 tggggcaggg gcagtcatgg gccccaacgc caccgctgag gagggcgcac cctctgctgc 1320 agcactggcc accccggaca cgctgcaggg ccagtgctca gccttcgtac agctctgggc 1380 cggcctgcag cccatcttgt gtggcaacaa ccgcaccatt gaacccgagg cgctgcggcg 1440 gggcaacatg agctccctgg gcttcacgag caaggagcag cggaacctgg gcctcctcgt 1500 gcacctcatg accagcaacc ccaaaatcct gtacgcgcct gcgggctctg aggtcgaccg 1560 cgtcatcctc aaggccaacg agacttttgc ttttgtgggc aacgtgactc actatgccca 1620 ggtctggctc aacatctcgg cggagatccg cagcttcctg gagcagggca ggctgcagca 1680 acacctgcgc tggctgcagc agtatgtagc agagctgcgg ctgcaccccg aggcactgaa 1740 cctgtcactg gatgagctgc cgccggccct gagacaggac aacttctcgc tgcccagtgg 1800 catggccctc ctgcagcagc tggataccat tgacaacgcg gcctgcggct ggatccagtt 1860 catgtccaag gtgagcgtgg acatcttcaa gggcttcccc gacgaggaga gcattgtcaa 1920 ctacaccctc aaccaggcct accaggacaa cgtcactgtt tttgccagtg tgatcttcca 1980 gacccggaag gacggctcgc tcccgcctca cgtgcactac aagatccgcc agaactccag 2040 cttcaccgag aaaaccaacg agatccgccg cgcctactgg cggcctgggc ccaatactgg 2100 cggccgcttc tacttcctct acggcttcgt ctggatccag gacatgatgg agcgcgccat 2160 catcgacact tttgtggggc acgacgtggt ggagccaggc agctacgtgc agatgttccc 2220 ctacccctgc tacacacgcg atgacttcct gtttgtcatt gagcacatga tgccgctgtg 2280 catggtgatc tcctgggtct actccgtggc catgaccatc cagcacatcg tggcggagaa 2340 ggagcaccgg ctcaaggagg tgatgaagac catgggcctg aacaacgcgg tgcactgggt 2400 ggcctggttc atcaccggct ttgtgcagct gtccatctcc gtgacagcac tcaccgccat 2460 cctgaagtac ggccaggtgc ttatgcacag ccacgtggtc atcatctggc tcttcctggc 2520 agtctacgcg gtggccacca tcatgttctg cttcctggtg tctgtgctgt actccaaggc 2580 caagctggcc tcggcctgcg gtggcatcat ctacttcctg agctacgtgc cctacatgta 2640 cgtggcgatc cgagaggagg tggcgcatga taagatcacg gccttcgaga agtgcatcgc 2700 gtccctcatg tccacgacgg cctttggtct gggctctaag tacttcgcgc tgtatgaggt 2760 ggccggcgtg ggcatccagt ggcacacctt cagccagtcc ccggtggagg gggacgactt 2820 caacttgctc ctggctgtca ccatgctgat ggtggacgcc gtggtctatg gcatcctcac 2880 gtggtacatt gaggctgtgc acccaggcat gtacgggctg ccccggccct ggtacttccc 2940 actgcagaag tcctactggc tgggcagtgg gcggacagaa gcctgggagt ggagctggcc 3000 gtgggcacgc accccccgcc tcagtgtcat ggaggaggac caggcctgtg ccatggagag 3060 ccggcgcttt gaggagaccc gtggcatgga ggaggagccc acccacctgc ctctggttgt 3120 ctgcgtggac aaactcacca aggtctacaa ggacgacaag aagctggccc tgaacaagct 3180 gagcctgaac ctctacgaga accaggtggt ctccttcttg ggccacaacg gggcgggcaa 3240 gaccaccacc atgtccatcc tgaccggcct gttccctcca acgtcgggtt ccgccaccat 3300 ctacgggcac gacatccgca cggagatgga tgagatccgc aagaacctgg gcatgtgccc 3360 gcagcacaat gtgctctttg accggctcac ggtggaggaa cacctctggt tctactcacg 3420 gctcaagagc atggctcagg aggagatccg cagagagatg gacaagatga tcgaggacct 3480 ggagctctcc aacaaacggc actcactggt gcagacattg tcgggtggca tgaagcgcaa 3540 gctgtccgtg gccatcgcct tcgtgggcgg ctctcgcgcc atcatcctgg acgagcccac 3600 ggcgggcgtg gacccctacg cgcgccgcgc catctgggac ctcatcctga agtacaagcc 3660 aggccgcacc atccttctgt ccacccacca catggatgag gctgacctgc ttggggaccg 3720 cattgccatc atctcccatg ggaagctcaa gtgctgcggc tccccgctct tcctcaaggg 3780 cacctatggc gacgggtacc gcctcacgct ggtcaagcgg cccgccgagc cggggggccc 3840 ccaagagcca gggctggcat ccagcccccc aggtcgggcc ccgctgagca gctgctccga 3900 gctccaggtg tcccagttca tccgcaagca tgtggcctcc tgcctgctgg tctcagacac 3960 aagcacggag ctctcctaca tcctgcccag cgaggccgcc aagaaggggg ctttcgagcg 4020 cctcttccag cacctggagc gcagcctgga tgcactgcac ctcagcagct tcgggctgat 4080 ggacacgacc ctggaggaag tgttcctcaa ggtgtcggag gaggatcagt cgctggagaa 4140 cagtgaggcc gatgtgaagg agtccaggaa ggatgtgctc cctggggcgg agggcccggc 4200 gtctggggag ggtcacgctg gcaatctggc ccggtgctcg gagctgaccc agtcgcaggc 4260 atcgctgcag tcggcgtcat ctgtgggctc tgcccgtggc gacgagggag ctggctacac 4320 cgacgtctat ggcgactacc gccccctctt tgataaccca caggacccag acaatgtcag 4380 cctgcaagag gtggaggcag aggccctgtc gagggtcggc cagggcagcc gcaagctgga 4440 cggcgggtgg ctgaaggtgc gccagttcca cgggctgctg gtcaaacgct tccactgcgc 4500 ccgccgcaac tccaaggcac tcttctccca gatcttgctg ccagccttct tcgtctgcgt 4560 ggccatgacc gtggccctgt ccgtcccgga gattggtgat ctgcccccgc tggtcctgtc 4620 accttcccag taccacaact acacccagcc ccgtggcaat ttcatcccct acgccaacga 4680 ggagcgccgc gagtaccggc tgcggctatc gcccgacgcc agcccccagc agctcgtgag 4740 cacgttccgg ctgccgtcgg gggtgggtgc cacctgcgtg ctcaagtctc ccgccaacgg 4800 ctcgctgggg cccacgttga acctgagcag cggggagtcg cgcctgctgg cggctcggtt 4860 cttcgacagc atgtgtctgg agtccttcac acaggggctg ccactgtcca atttcgtgcc 4920 acccccaccc tcgcccgccc catctgactc gccagcgtcc ccggatgagg acctgcaggc 4980 ctggaacgtc tccctgccgc ccaccgctgg gccagaaatg tggacgtcgg caccctccct 5040 gccgcgcctg gtacgggagc ccgtccgctg cacctgctct gcgcagggca ccggcttctc 5100 ctgccccagc agtgtgggcg ggcacccgcc ccagatgcgg gtggtcacag gcgacatcct 5160 gaccgacatc accggccaca atgtctctga gtacctgctc ttcacctccg accgcttccg 5220 actgcaccgg tatggggcca tcacctttgg aaacgtcctg aagtccatcc cagcctcatt 5280 tggcaccagg gccccaccca tggtgcggaa gatcgcggtg cgcagggctg cccaggtttt 5340 ctacaacaac aagggctatc acagcatgcc cacctacctc aacagcctca acaacgccat 5400 cctgcgtgcc aacctgccca agagcaaggg caacccggcg gcttacggca tcaccgtcac 5460 caaccacccc atgaataaga ccagcgccag cctctccctg gattacctgc tgcagggcac 5520 ggatgtcgtc atcgccatct tcatcatcgt ggccatgtcc ttcgtgccgg ccagcttcgt 5580 tgtcttcctc gtggccgaga agtccaccaa ggccaagcat ctgcagtttg tcagcggctg 5640 caaccccatc atctactggc tggcgaacta cgtgtgggac atgctcaact acctggtccc 5700 cgctacctgc tgtgtcatca tcctgtttgt gttcgacctg ccggcctaca cgtcgcccac 5760 caacttccct gccgtcctct ccctcttcct gctctatggg tggtccatca cgcccatcat 5820 gtacccggcc tccttctggt tcgaggtccc cagctccgcc tacgtgttcc tcattgtcat 5880 caatctcttc atcggcatca ccgccaccgt ggccaccttc ctgctacagc tcttcgagca 5940 cgacaaggac ctgaaggttg tcaacagtta cctgaaaagc tgcttcctca ttttccccaa 6000 ctacaacctg ggccacgggc tcatggagat ggcctacaac gagtacatca acgagtacta 6060 cgccaagatt ggccagtttg acaagatgaa gtccccgttc gagtgggaca ttgtcacccg 6120 cggactggtg gccatggcgg ttgagggcgt cgtgggcttc ctcctgacca tcatgtgcca 6180 gtacaacttc ctgcggcggc cacagcgcat gcctgtgtct accaagcctg tggaggatga 6240 tgtggacgtg gccagtgagc ggcagcgagt gctccgggga gacgccgaca atgacatggt 6300 caagattgag aacctgacca aggtctacaa gtcccggaag attggccgta tcctggccgt 6360 tgaccgcctg tgcctgggtg tgcgtcctgg cgagtgcttc gggctcctgg gcgtcaacgg 6420 tgcgggcaag accagcacct tcaagatgct gaccggcgac gagagcacga cggggggcga 6480 ggccttcgtc aatggacaca gcgtgctgaa ggagctgctc caggtgcagc agagcctcgg 6540 ctactgcccg cagtgtgacg cgctgttcga cgagctcacg gcccgggagc acctgcagct 6600 gtacacgcgg ctgcgtggga tctcctggaa ggacgaggcc cgggtggtga agtgggctct 6660 ggagaagctg gagctgacca agtacgcaga caagccggct ggcacctaca gcggcggcaa 6720 caagcggaag ctctccacgg ccatcgccct cattgggtac ccagccttca tcttcctgga 6780 cgagcccacc acaggcatgg accccaaggc ccggcgcttc ctctggaacc tcatcctcga 6840 cctcatcaag acagggcgtt cagtggtgct gacatcacac agcatggagg agtgcgaggc 6900 gctgtgcacg cggctggcca tcatggtgaa cggtcgcctg cggtgcctgg gcagcatcca 6960 gcacctgaag aaccggtttg gagatggcta catgatcacg gtgcggacca agagcagcca 7020 gagtgtgaag gacgtggtgc ggttcttcaa ccgcaacttc ccggaagcca tgctcaagga 7080 gcggcaccac acaaaggtgc agtaccagct caagtcggag cacatctcgc tggcccaggt 7140 gttcagcaag atggagcagg tgtctggcgt gctgggcatc gaggactact cggtcagcca 7200 gaccacactg gacaatgtgt tcgtgaactt tgccaagaag cagagtgaca acctggagca 7260 gcaggagacg gagccgccat ccgcactgca gtcccctctc ggctgcttgc tcagcctgct 7320 ccggccccgg tctgccccca cggagctccg ggcacttgtg gcagacgagc ccgaggacct 7380 ggacacggag gacgagggcc tcatcagctt cgaggaggag cgggcccagc tgtccttcaa 7440 cacggacacg ctctgctgac cacccagagc tgggccaggg aggacacgct ccactgacca 7500 cccagagctg ggccagggac tcaacaatgg ggacagaagt cccccagtgc ctgccagggc 7560 ctggagtgga ggttcaggac caaggggctt ctggtcctcc agcccctgta ctcggccatg 7620 ccctgcggtc actgcggttg ccgcccctaa ttgtgccaaa ggctgacccg gcccgggctg 7680 cgtacaccct tgccctgctt tgccttaaag cctcggggtc tgcccggccc ctcgcccctg 7740 cctggcactg ctcaccgccc aaggcgacgc cggctggacc aggcactgct ggcctttctc 7800 ctgcccggcc tcggaaccag cttttctctc ttacgatgaa ggctgatgcc gagagcgggc 7860 tgtgggcgga gctgggtcag tcccgtattt attttgcttt gagaagaggc tcctctggcc 7920 ctgctctcct gcagggaggt ggctgtcccg cgggaagcca tcagcttggg ccagctggca 7980 ggtggcagga atggagaagc tgaccctgct ggccaggcaa ggggccagac cccccccaac 8040 ccccagctgc catcgctctc ccacccagct tggccccctg cccgcccacc tccctgggag 8100 ccgggcctgt acatagcgca cagatgtttg ttttaaataa ataaacaaaa tgtc 8154 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 agcgcgccat catcga 16 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 cactcatcgc gtgtgtagca 20 <210> 8 <211> 15 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 cacgatgtgg tggag 15 <210> 9 <211> 14 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 cacgacgtgg tgga 14 1

Claims

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rs908832 다형태의 부 대립유전자를 수반하는 DNA의 존재 여부를 검출하는데 필요한, ABCA2 유전자의 일정한 영역과 하이브리드를 형성하는 한쌍의 프라이머 및 올리고뉴클레오타이드 프로브를 포함하는, 알츠하이머 병의 진단 또는 예측용 키트.
제14항에 있어서, 상기 프라이머가 rs908832 다형태의 부 대립유전자를 증폭시키기 위한 것인 키트.
제15항에 있어서, 상기 프라이머가 서열번호 3의 서열 중 15 내지 30개 사이의 연속 뉴클레오타이드를 가지는 프라이머인 키트.
제16항에 있어서, 상기 프라이머가 서열번호 6의 서열을 가지는 것인 키트.
제15항에 있어서, 상기 프라이머가 서열번호 3에 상보적인 서열 중 15 내지 30개 사이의 연속 뉴클레오타이드를 가지는 프라이머인 키트.
제18항에 있어서, 상기 프라이머가 서열번호 7의 서열을 가지는 것인 키트.
ABCA2 유전자의 rs908832 다형태의 부 대립유전자를 수반하는 외인성 게놈 DNA 서열이 하나 이상 삽입된 게놈을 가진, 인간을 제외한 포유동물 중에서 선택되는 유전자전이된(transgenic) 동물, 줄기 세포주 또는 이 줄기 세포주로부터 분화된 세포주를 사용하여, 알츠하이머 병의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 목적으로 하는 방법의 활성, 또는 알츠하이머 병의 예방, 치료, 또는 예방 및 치료를 목적으로 하는 제제의 활성을 시험하는 방법.
알츠하이머 병을 나타내는 개체로부터 채취한 생물 시료 내에서 ABCA2 유전자의 rs908832 다형태의 부 대립유전자의 존재를 측정하는 1 이상의 단계를 포함하는, 알츠하이머 병을 나타내는 개체로의 투여를 목적으로 하는 화합물을 선발하는 방법.
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