JP5686335B2 - 筋萎縮性側索硬化症の診断マーカー、及び、方法、並びに、筋萎縮性側索硬化症を発症するモデル動物、及び、モデル細胞 - Google Patents

筋萎縮性側索硬化症の診断マーカー、及び、方法、並びに、筋萎縮性側索硬化症を発症するモデル動物、及び、モデル細胞 Download PDF

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Description

本発明は、筋萎縮性側索硬化症を診断・治療するのに好適な筋萎縮性側索硬化症の診断マーカー、診断方法、及び、治療薬に関する。また、本発明は、筋萎縮性側索硬化症の治療薬や治療方法を開発するのに好適なモデル動物、及び、モデル細胞に関する。
筋萎縮性側索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis；以下「ＡＬＳ」という）は、脊髄、脳幹、及び、大脳皮質において運動ニューロンが次第に変性する致死性の疾患である。ＡＬＳには、遺伝性のタイプと、遺伝性が認められない後発的な孤発性のタイプと、が知られている。遺伝性のＡＬＳは症例の１０％程度であり、孤発性のＡＬＳは症例の９０％程度である。非特許文献１には、遺伝性のＡＬＳの原因とされる遺伝子（例えば、ＴＤＰ−４３、ＦＵＳ／ＴＬＳ）が開示されている。
Rethinking ALS: The FUS about TDP-43, Cell 136, March 20, 2009
しかしながら、遺伝性のＡＬＳのうち、ＴＤＰ−４３やＦＵＳ／ＴＬＳは、原因の２０〜３０％にとどまっており、また、孤発性のＡＬＳの原因とされる遺伝子についても、原因の探索が望まれている。このため、ＡＬＳの遺伝子診断を行うために好適な新たな手法が求められている。また、ＡＬＳを治療するための治療薬や治療方法を効率的に開発するのに好適なモデル動物、及び、モデル細胞が求められている。
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、筋萎縮性側索硬化症を診断・治療するのに好適な筋萎縮性側索硬化症の診断マーカー、診断方法、及び、治療薬を提供することを目的とする。また、本発明は、筋萎縮性側索硬化症の治療薬や治療方法を開発するのに好適なモデル動物、及び、モデル細胞を提供することも目的とする。
上記の課題を解決するために、本発明の第１の態様である、筋萎縮性側索硬化症の診断マーカーは、
ヒト１０番染色体 ＯＰＴＮ（Optineurin）遺伝子領域に変異を有する塩基配列からなる核酸を含むことを特徴とする。
前記ＯＰＴＮ遺伝子領域のうち、１３２０７９９５領域、及び／又は、１３２１４１０４領域に示される塩基が変異した塩基を有する、ことも可能である。
前記１３２０７９９５領域の塩基がシトシンからチミンに、また、前記１３２１４１０４領域の塩基がアデニンからグアニンに、変異している、ことも可能である。
本発明の第２の態様である、筋萎縮性側索硬化症の診断方法は、
被験者から試料を採取して、当該試料から核酸を単離する単離工程と、
前記単離された核酸から、ヒト１０番染色体 ＯＰＴＮ（Optineurin）遺伝子領域に示される塩基を検出する検出工程と、
前記検出された塩基が、変異しているか否かを判定する判定工程と、を備える、ことを特徴とする。
前記判定工程では、前記ＯＰＴＮ遺伝子領域のうち、１３２０７９９５領域においては、塩基がシトシンからチミンに変異しているか、又は、１３２１４１０４領域においては、塩基がアデニンからグアニンに変異しているか、を判定する、ことも可能である。
本発明の第３の態様である、筋萎縮性側索硬化症の治療薬は、
ヒト１０番染色体 ＯＰＴＮ（Optineurin）遺伝子領域に示される塩基が変異している際に、当該塩基のリードスルーを誘導することを特徴とする。
前記ＯＰＴＮ遺伝子領域のうち、１３２０７９９５領域に示される塩基のリードスルーを誘導する、ことも可能である。
本発明の第４の態様である、筋萎縮性側索硬化症の治療薬は、
ＮＦ−κＢ転写因子の活性化を抑制することを特徴とする。
本発明の第５の態様である、筋萎縮性側索硬化症の治療薬は、
細胞内におけるヒト１０番染色体 ＯＰＴＮ（Optineurin）遺伝子の局在化を適正化する、及び／又は、当該局在化によって果たされている機能の喪失を補填することを特徴とする。
前記細胞のうち、ゴルジ体に機能する、ことも可能である。
本発明の第６の態様である、筋萎縮性側索硬化症を発症するモデル動物は、
ヒト１０番染色体 ＯＰＴＮ（Optineurin）遺伝子領域に示される塩基が変異した塩基を含むＤＮＡ断片、及び／又は、発現ベクターを導入してなることを特徴とする。
本発明の第７の態様である、筋萎縮性側索硬化症を発症するモデル細胞は、
筋萎縮性側索硬化症を発症するモデル動物から採取されることを特徴とする。
本発明によれば、ＡＬＳの遺伝子診断を行うことができる。また、ＡＬＳの治療を行うことができる。さらに、ＡＬＳの治療薬や治療方法を開発することができる。
ＯＰＴＮ遺伝子領域の構造を模式的に示す図である。 ヒト１０番染色体 １３２０７９９２〜１３２０８０００領域における健常者とＡＬＳ患者との塩基配列の変異を比較した図である。 ヒト１０番染色体 １３２１４１００〜１３２１４１０８領域における健常者とＡＬＳ患者との塩基配列の変異を比較した図である。 遺伝性ＡＬＳと孤発性ＡＬＳとにおける共有するハプロタイプを示す図である。 健常者とＡＬＳ患者とのＯＰＴＮの発現を比較した図である。 ＲＴ−ＰＣＲにより増幅されたＯＰＴＮの発現量を比較した図である。 （ａ）〜（ｍ）は、封入体の免疫染色を示す図である。 （ａ）〜（ｈ）は、脊髄を示す図である。 （ａ）〜（ｄ）は、健常者とＡＬＳ患者との腰部の脊髄前角細胞の免疫染色を比較した図である。 ルシフェラーゼ活性を比較した図である。 （ａ）〜（ｌ）は、ＯＰＴＮの野生型及び変異型において細胞内局在性を比較した図である。
（ＡＬＳの診断マーカー）
発明の第１の態様であるＡＬＳの診断マーカーについて説明する。本診断マーカーは、特定の一塩基変異多型を検出して特定することにより、ＡＬＳの発症を予測、及び、診断する指標として使用される。
まず、一塩基変異多型（Single Nucleotide Polymorphism；以下「ＳＮＰ」という）について説明する。ＳＮＰは、ヒトゲノムの塩基配列を比較すると、一塩基が変異した多様性が見られ、個人毎に異なる箇所が存在する遺伝的変異である。
ＳＮＰ部位は、ヒトゲノム中に数百万箇所あると考えられている。これらのＳＮＰには、タンパク質の発現調節又は機能等に影響を与えるものがあり、体質や疾病に対する易罹患性等の個人差に関与しているものがあると知られている。従って、ＳＮＰに関する情報を得ることによって、個人の体質や遺伝病といった診断を行うことができる。
次に、ＡＬＳの診断マーカーとして使用されるＳＮＰについて示す。なお、塩基配列は、UCSC Genome Bioinformatics（UCSC Genome Browser on Human Mar. 2006 Assembly (hg18)）に基づくものである。
図１は、ＯＰＴＮ（Optineurin）遺伝子領域の構造を模式的に示す図である。ヒト１０番染色体 １３１８２０８８〜１３２２０２８２領域の塩基配列から構成されるＯＰＴＮ遺伝子は、同図に示すように、１から１６のエクソン（Exon）からなり、そのタンパク翻訳領域は４から１６のエクソンからなる。遺伝的変異（ＳＮＰ）は、１２から１４の間のエクソンに存在する。本診断マーカーとして使用されるＳＮＰは、当該ＯＰＴＮ内に存在する。
配列表の配列番号１は、健常者のヒト１０番染色体 １３２０７９９２〜１３２０８０００領域に示される塩基配列である。また、配列表の配列番号２は、ＡＬＳ患者のヒト１０番染色体 １３２０７９９２〜１３２０８０００領域（配列番号１と同一の領域）に示される塩基配列である。
これらの塩基配列のうち、１３２０７９９５領域の塩基が変異している場合、ＡＬＳを発症する可能性がある。１３２０７９９５領域の塩基は、配列番号１及び２に示すように、ＡＬＳ患者ではシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）に変異している。
次に、配列表の配列番号３は、健常者のヒト１０番染色体 １３２１４１００〜１３２１４１０８領域に示される塩基配列である。また、配列表の配列番号４は、ＡＬＳ患者のヒト１０番染色体 １３２１４１００〜１３２１４１０８領域（配列番号３と同一の領域）に示される塩基配列である。
これらの塩基配列のうち、１３２１４１０４領域の塩基が変異している場合、ＡＬＳを発症する可能性がある。１３２１４１０４領域の塩基は、配列番号１及び２に示すように、ＡＬＳ患者ではアデニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）に変異している。
当該塩基が変異すると、機能的なタンパク質が合成されないため、または異常なタンパク質が産生されるため、ＡＬＳが発症する原因の一つとなる。従って、１３２０７９９５領域の塩基、及び／又は、１３２１４１０４領域の塩基が、変異しているか否かを検出して特定することにより、ＡＬＳの発症を予測、及び、診断することができる。すなわち、当該塩基の変異は、ＡＬＳを診断するためのマーカーとして有用である。
なお、１３２０７９９５領域及び１３２１４１０４領域のうち、どちらか一方の塩基が変異している場合、また、両方の塩基が変異している場合であっても、ＡＬＳの診断マーカーとなり得る。
また、本診断マーカーは、遺伝性のＡＬＳと、遺伝性が認められない後発的な孤発性のＡＬＳと、の両方のＡＬＳを診断する指標となり得る。
また、本診断マーカーは、ヒト１０番染色体 １３２０７９９５領域の塩基または１３２１４１０４領域の塩基を同一染色体上に有するハプロタイプであってもよい。
また、１３２０７９９５領域及び／又は１３２１４１０４領域の遺伝子に基づく、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ類似体、ＲＮＡ類似体、アミノ酸、及び、タンパク質についても、ＡＬＳの診断マーカーとなり得る。
また、１３２０７９９５領域、及び、１３２１４１０４領域に示される塩基の変異は、ＯＰＴＮ内の遺伝子変異の一例であり、あらゆるＯＰＴＮの遺伝子変異が、ＡＬＳの診断マーカーとなり得る。
上記実施の形態により説明される診断マーカーは、本願発明を限定するものではなく、例示することを意図して開示されているものである。本願発明の技術的範囲は、特許請求の範囲の記載により定められるものであり、当業者は、特許請求の範囲に記載された発明の技術的範囲において種々の設計的変更が可能である。
（ＡＬＳの診断方法）
次に、本発明の第２の態様であるＡＬＳの診断方法について説明する。被験者から試料を採取して、上述の塩基の変異（ＳＮＰ）を検出して特定することにより、ＡＬＳの診断を行うことができる。
まず、被験者から試料が採取される。被験者から試料を採取する方法は、通常の公知の方法が用いられ、例えば、市販のＤＮＡを採取するためのキットを使用することもできる。採取方法は限定されず任意である。被験者の試料は、例えば、血液、髄液、唾液などの体液、又は、口腔粘膜、頭髪などの組織であり、上述のＳＮＰを検出することができる試料であれば任意である。また、試料の量は、上述のＳＮＰが検出できる量であれば任意である。
次に、被験者の試料から核酸が単離される。ここで、核酸とは、ＤＮＡもしくはＲＮＡであり、ＤＮＡを鋳型にＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法などにより目的の領域を増幅したＤＮＡ断片も含まれる。核酸を単離する方法は限定されず任意である。例えば、後述するＳＮＰの検出方法に適するように、ＤＮＡを単離することもできる。また、上述のＳＮＰは、図１に示すように、エクソンの１２から１４の間にあるため、当該間のＤＮＡのみを単離することもできる。
次に、ＤＮＡ等から上述のＳＮＰが検出される。ＳＮＰの検出方法は、上述のＳＮＰを検出して、特定できる方法であれば任意である。具体的には、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法、ＰＣＲ−ＳＳＰ（Sequence Specific Primers）法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism）法、ダイレクトシーケンス法、ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法、ＤＧＧＥ（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）法、ＲＮａｓｅＡ切断法、化学切断法、ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法、インベーダー法、ＴａｑＭａｎ（登録商標）−ＰＣＲ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time-of-Flight Mass Spectrometry）法、ＴＤＩ（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法、モレキュラー・ビーコン法、ダイナミック・アレルスペシフィック・ハイブリダイゼーション法、パドロック・プローブ法などをあげることができる。本実施形態においては、これらのＳＮＰの検出方法を単独で用いても、二つ以上を組み合わせて用いてもよい。
そして、１３２０７９９５領域においては、塩基がシトシンからチミンに変異しているか、また、１３２１４１０４領域においては、塩基がアデニンからグアニンに変異しているか、が判定される。当該塩基が変異している場合、機能的なタンパク質が合成されないため、または異常なタンパク質が産生されるため、ＡＬＳが発症する原因の一つとなる。
以上の処理により、ＡＬＳの発症を予測、及び、診断することができる。
（ＡＬＳの治療薬）
次に、本発明の第３〜第５の態様であるＡＬＳの治療薬について説明する。
上述のように、１３２０７９９５領域の塩基が、シトシンからチミンに変異した場合に、ＡＬＳが発症する可能性がある。１３２０７９９５領域の塩基は、対応するアミノ酸（とｔＲＮＡ）がなく、最終産物であるタンパク質の生合成を停止させるために使われている終止コドン（ナンセンスコドン）である。変異により遺伝子内で未熟終止コドンが生じると、機能的なタンパク質が合成されずに、遺伝子欠損症状を呈するようになる。
ＡＬＳの場合、たった１か所に未熟終止コドンが生じただけで、あたかも遺伝子全体が欠損したような致死的な症状を呈するようになる。このため、未熟終止コドンである当該チミンを選択的に読み飛ばすことによって、機能的なタンパク質合成が可能となる。すなわち、１３２０７９９５領域の塩基のリードスルーを誘導する薬剤をＡＬＳ患者に投与することにより、ＡＬＳを治療することができる。
ここで、リードスルーとは、ナンセンスコドンと終結因子との結合を弱め、ナンセンスコドンとどれかのｔＲＮＡとの結合を促し、新たにアミノ酸を伸長させて、タンパク質の合成を進行させることをいう。
ＡＬＳの治療薬としては、例えば、ＰＴＣ１２４、ゲンタマイシンがあげられるが、１３２０７９９５領域の塩基のナンセンスコドンを選択的に読み飛ばすことができるリードスルー活性を有する物質であれば任意である。
また、１３２０７９９５領域の塩基が、シトシンからチミンに変異した場合に、ＡＬＳが発症する可能性がある。１３２１４１０４領域においては、塩基がアデニンからグアニンに変異している場合に、ＡＬＳが発症する可能性がある。１３２０７９９５領域の変異は、ＲＩＰ１（Receptor Interacting Protein 1）の結合部位を失い、１３２１４１０４領域の塩基は、ユビキチン結合部位に変異を来し、ＲＩＰ１の結合が抑制される。１３２０７９９５領域と１３２１４１０４領域の変異は、ＲＩＰ１を介したＮＦ−κＢの抑制作用を失う。
ＮＦ−κＢは、免疫反応において中心的役割を果たす転写因子の一つであり、ＯＰＴＮとＲＩＰ１の結合が喪失または低下することにより、ＮＦ−κＢの抑制作用が失われる。すなわち、当該変異によって、ＮＦ−κＢは活性化される。
このため、ＮＦ−κＢ転写因子の活性化を調整（抑制）する薬剤をＡＬＳ患者に投与することにより、ＡＬＳを治療することができる。
ここで、ＮＦ−κＢ転写因子とは、Ｒｅｌホモロジードメインを有する５つのタンパク質（p50, p52, p65(RelA), c-Rel, RelB）のヘテロもしくはホモ２量体で構成される転写因子である。
ＡＬＳの治療薬としては、例えば、ＮＦ−κＢ転写因子阻害剤であるＰＤＴＣ（Pyrrolidine dithiocarbamate）、ボルテゾミブ、ＤＨＭＥＱ（Dehydroxymethylepoxyquinomicin）、があげられるが、ＮＦ−κＢ転写因子阻害作用を有する物質であれば任意である。
また、ＡＬＳは、細胞内においてＯＰＴＮの局在化の障害によって、機能喪失が起きることにより、発症する。変異ＯＰＴＮは、例えば、ゴルジ体に局在しないことにより、ゴルジ体が果たす機能を喪失させる。このため、細胞内におけるＯＰＴＮの局在化を適正化する、及び／又は、当該局在化によって果たされている機能の喪失を補填することにより、ＡＬＳを治療することができる。
ＡＬＳの治療薬の剤形は、内服薬、注射薬、座薬、吸入薬などを挙げることができる。当該治療薬は、常法に従って、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて、経口投与、組織内投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与など）、局所投与（経皮投与など）、経直腸的投与などに適した剤型に製剤化することができる。
また、上述の補助剤のほか、必要に応じて着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤などの補助剤、及び、他の医薬品を含有させることもできる。当該治療薬は、これらの投与方法に適した剤型で投与されることは当然である。治療薬の用量は任意であり、年齢、体重などの患者の状態、投与経路などを考慮した上で決定することができる。
（モデル動物・モデル細胞の作製）
次に、本発明の第６及び第７の態様である、ＡＬＳの治療法を確立及び評価するためのモデル動物、及び、モデル細胞の作製方法について説明する。なお、１３２０７９９５領域の変異を、「変異１」といい、１３２１４１０４領域の変異を、「変異２」という。
単離されたＡＬＳの原因遺伝子ＯＰＴＮの変異のうち、劣性変異である変異１については、ノックインマウス及びノックアウトマウスを作製して、ホモ接合の個体で評価を行う。一方、優性変異である変異２については、ノックインマウス及びトランスジェニックマウスを作製して、ヘテロ接合の個体で評価を行う。
なお、モデル動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ及びサル等を例示することができるが、実験動物としての汎用性や利便性を考慮してマウス、ラットであることが好ましく、マウスであることが特に好ましい。
また、マウスには特に限定はなく公知のマウスを使用することができるが、トランスジェニックマウスの作製が容易であること、汎用性があること、及び、遺伝子背景等の情報が豊富であること等の観点から、ＢＤＦ１／Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ系であることが特に好ましい。
（トランスジェニックマウス）
優性変異である変異２については、その発現量がＡＬＳの重症度に及ぼす影響を検討するため、トランスジェニックマウスの作製を行なう。遺伝子ＯＰＴＮ本来のプロモーターの基で、変異２を発現するトランスジェニックマウスについても作製を行う。
まず、遺伝子ＯＰＴＮのプロモーターを単離し、このプロモーターにヒトの変異２を有するヒトｃＤＮＡ及びｐｏｌｙＡをつないだコンストラクトを作製する。次に、当該コンストラクトをマウス受精卵に注入し、トランスジェニックマウスを作製する。神経特異的発現として、Ｔｈｙ−１プロモーターにヒトの変異２を有するヒトｃＤＮＡ及びｐｏｌｙＡをつないだコンストラクトを作製して、トランスジェニックマウスを作製する。
遺伝子のＯＰＴＮ変異はいずれもＮＦ−κＢ活性を上昇させることにより神経細胞死を誘導すると考えられる。このため、ＮＦ−κＢ活性を上昇させる変異を含むコンストラクト、たとえば、ＯＰＴＮ遺伝子のプロモーターにＩｋｋβの構成的活性突然変異体（constitutive active mutant）をつないだコンストラクトを作製してマウスに導入することにより、ＡＬＳを発症するマウスを作製する。
（ノックインマウス及びノックアウトマウス）
変異１及び変異２は、マウスＯＰＴＮ遺伝子のエクソン１０及びエクソン１２にあるため、上流のエクソンであるマウスエクソンで変異１または変異２を有するヒトＯＰＴＮ遺伝子ｃＤＮＡと組換えを行なう。このつなぎ換えた遺伝子をＥＳ細胞に相同組替えで導入する。マウスＥＳ細胞に電気穿孔法（Electroporation）により導入し、得られたＧ４１８耐性コロニーからＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ及びサザンブロット法により相同組換えクローンを選別する。Ｎｅｏ遺伝子の遺伝子Ｘへの発現の影響の可能性を避けるため、Ｎｅｏ遺伝子はあらかじめｌｏｘＰ遺伝子で挟んでおき、相同組換えクローンが得られた後に、Ｃｒｅリコンビナーゼにより除去する。このＥＳクローンをマウス受精卵胚盤胞にマイクロ・インジェクションし、キメラマウスを得て、通常マウスとの交配によりヘテロマウスを得る。変異２については優性変異と考えられるため、ヘテロマウスで観察を行なう。変異１については劣性変異と考えられるため、ヘテロマウス同士の交配によりホモマウスを作製し観察を行なう。劣性変異に関しては、ノックアウトマウスを作製する。マウスＯＰＴＮ遺伝子のエクソンを一部または全部欠損させたものをマウスＥＳ細胞に相同組替えで導入し、得られたＧ４１８耐性コロニーからＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ及びサザンブロット法により相同組換えクローンを選別する。このＥＳクローンをマウス受精卵胚盤胞にマイクロ・インジェクションし、キメラマウスを得て、通常マウスとの交配によりヘテロマウスを得る。ヘテロマウス同士の交配によりホモマウスを作製し観察を行なう。
なお、組み換え遺伝子をモデル動物へ導入する方法としては、特に限定はなく、例えば、誘導体の遺伝子を導入した発現ベクターを用いて、マイクロ・インジェクション法、リポフェクション法、又は、レトロウィルスベクターに外来遺伝子を組み込んで感染させる方法により遺伝子を導入することもできる。いずれの公知の方法によっても、該当遺伝子を受精卵に導入することができる。
突然変異を引き起こすエチルニトロソウレアなどをマウスに投与し、人為的に突然変異を誘発したマウスのライブラリーから、ＯＰＴＮ遺伝子の塩基配列に変異を持ったマウスを選び出し、長期飼育及び交配により、ＡＬＳを発症するマウスを作製する。
これらのマウスのＡＬＳの発症は、歩行、筋力などの行動評価及び生存率、病理評価で確認し、また、ＡＬＳに対する治療薬の開発、評価にも、同様な項目及び発症時期、病勢進行程度を評価し、ＡＬＳの発症、進展抑制にかかわる化学物質の評価を行う。またモデル動物より、運動神経細胞または組織標本（たとえば、脊髄）を取り出し、細胞培養、器官培養により、神経細胞死を評価し、薬物の効果を判定する。
（モデル細胞）
上記のモデル動物からとられた細胞、器官培養に加えて、患者皮膚からの線維芽細胞及びそれをＳＶ４０ウイルス及びテロメレースより不死化させた細胞株、末梢血よりＥＢウイルスにより不死化させたＢ細胞株等を用いて、アポトーシス、ネクローシス等の細胞死を引き起こす刺激（たとえば、ＴＮＦ−α及びそれに加えて、カスパーゼの抑制剤、またはＨ２０２のように活性化酸素、フリーラディカルを産生するもの）に対し、防御的に働く物質を、細胞の生存率を指標にして、評価・探索する。
また、患者皮膚等より得られた遺伝子変異を有する細胞に対して、公知の方法により、ｉＰＳ細胞を作製し、運動神経細胞に分化させ、運動神経細胞死を誘導する系を作製し、これを防御する物質を探索、評価する。
以上により、モデル動物及びモデル細胞にＡＬＳを発症させることができる。また、ＡＬＳを発症したモデル動物及びモデル細胞を利用することにより、有効な治療薬や治療方法を開発することができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
（ＡＬＳ患者の診断）
健常者、遺伝性のＡＬＳ患者及び孤発性のＡＬＳ患者について、ヒト１０番染色体 １３２０７９９５領域の塩基、及び、１３２１４１０４領域の塩基の変異を調べた。
まず、健常者及びＡＬＳ患者から、市販のＤＮＡを採取するためのキットを使用してＤＮＡを採取した後、GeneChip Human Mapping 500Kアレイセット（Affymetrix社製）を用いて、ゲノム探索を行った。
なお、所定のプライマーにより、エクソン４〜１６までのエクソンごとに、すべて増幅し塩基配列を決定することにより変異を同定したが、以下では、エクソン１２及び１４について記載する。
配列表の配列番号５〜８に示すプライマーにより、ＯＰＴＮを含むＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅した。増幅したＤＮＡ断片を直接塩基決定法で塩基配列を決定し、当該塩基の変異を同定した。同定した後は、エクソン１２に関しては、制限酵素ＭｓｅＩで切断して、２％アガロースゲル電気泳動により切断されたＤＮＡ断片の大きさを解析し、その長さの違いにより、当該塩基の変異を判定した。
なお、配列番号５及び７は、フォワードプライマーを示し、配列番号６及び８は、リバースプライマーを示すものである。配列番号５及び６のプライマーはエクソン１２側と、配列番号７及び８のプライマーはエクソン１４側と、反応して、ＯＰＴＮ遺伝子のエクソン１２とエクソン１４を含むＤＮＡ断片を増幅した。
図２は、健常者とＡＬＳ患者とにおけるヒト１０番染色体 １３２０７９９２〜１３２０８０００領域の塩基配列の変異を比較した図である。また、図３は、健常者とＡＬＳ患者とにおけるヒト１０番染色体 １３２１４１００〜１３２１４１０８領域の塩基配列の変異を比較した図である。なお、図２に示されるＡＬＳ患者は、常染色体劣性形質のある突然変異を有するＡＬＳ患者であり、図３に示されるＡＬＳ患者は、常染色体優性形質のある突然変異を有するＡＬＳ患者である。
図２に示すように、健常者（Normal）の１３２０７９９５領域の塩基は、シトシン（Ｃ）であり、遺伝性のＡＬＳ患者及び孤発性のＡＬＳ患者の当該塩基は、チミン（Ｔ）に変異していた。
また、図３に示すように、健常者（Normal）の１３２１４１０４領域の塩基は、アデニン（Ａ）であり、遺伝性のＡＬＳ患者の当該塩基は、グアニン（Ｇ）に変異していた。
以上の結果から、１３２０７９９５領域、及び、１３２１４１０４領域の塩基が変異している場合、ＡＬＳを発症することが判明した。また、当該塩基の変異を調べることにより、遺伝性及び孤発性のどちらのＡＬＳについても、診断することができた。
次に、図４は、遺伝性ＡＬＳと孤発性ＡＬＳとにおいて共有されるハプロタイプを示す図である。同図に示すように、遺伝性ＡＬＳ及び孤発性ＡＬＳそれぞれについて、ヒト１０番染色体の１３．０Ｍｂ〜１３．９Ｍｂ領域に共有のハプロタイプが存在した。
また、図３に示されるＡＬＳ患者において、ヒト１０番染色体 １１４６０９８５〜１３７０３０１７領域までの約２．３Ｍｂ領域に共有のハプロタイプが存在した。
ハプロタイプが、１．０Ｍｂ領域以上も偶然に共有されていることはまれである。このため、当該ハプロタイプ内における塩基の変異を調べることにより、遺伝性及び孤発性のどちらのＡＬＳについても、診断することができた。
（ＯＰＴＮの発現）
次に、１３２０７９９５領域の変異に関して、ウェスタンブロット法により、ＯＰＴＮと対応する７４ｋＤａを示す転写リンパ芽球の溶解物を用いて、ＯＰＴＮの発現を調べた。遺伝性ＡＬＳ患者については、ＥＢウイルスにより不死化させたＢリンパ球により細胞溶解物を処理した。また、健常者については、通常のプロトコルを用いた。
図５は、健常者とＡＬＳ患者とのＯＰＴＮの発現を比較した図である。同図では、左から、健常者（左から３番目に示される遺伝性ＡＬＳ患者の血縁者）、健常者（左から３番目に示される遺伝性ＡＬＳ患者の血縁者）、遺伝性ＡＬＳ患者、孤発性ＡＬＳ患者、健常者の順番で、各発現を示した。ＯＰＴＮ（Cayman Chemical社製）のＣ末端部分と抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（R&D Systems社製）とを認識するポリクローナル抗体を使用した。また、コントロールとして、ＧＡＰＤＨ（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）に対するポリクローナル抗体（IMGENEX社製）を使用した。
同図に示すように、遺伝性ＡＬＳ患者及び孤発性ＡＬＳ患者については、７４ｋＤａ領域に発現は見られなかった。一方、健常者については、発現が見られた。すなわち、ＡＬＳ患者は、１３２０７９９５領域の塩基の変異により、ＯＰＴＮが発現しないことが判明した。従って、ウェスタンブロット法により、ＡＬＳの診断を行うことができた。
また、図６は、健常者と孤発性ＡＬＳ患者の培養細胞において、シクロヘキシミドを加えた場合と加えない場合の、ＲＴ−ＰＣＲ（Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction）により増幅されたＯＰＴＮの発現量を比較した図である。同図では、左から順番に、シクロヘキシミドを加えないで培養した健常者のＯＰＴＮの発現量、シクロヘキシミドを加えて培養した健常者のＯＰＴＮの発現量、シクロヘキシミドを加えないで培養した孤発性ＡＬＳ患者のＯＰＴＮの発現量、シクロヘキシミドを加えて培養した孤発性ＡＬＳ患者のＯＰＴＮの発現量、について示している。
ＯＰＴＮｍＲＮＡを定量するために、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（東洋紡社製）及びABI 7900HT Fast Real Time PCR system（Applied Biosystems社製）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った。また、配列表の配列番号９及び１０に示されるプライマーを使用することにより、ＯＰＴＮを含むＤＮＡ断片をＲＴ−ＰＣＲで増幅した。また、ＲＮＡを抽出する前、ＥＢウイルスにより不死化させたＢリンパ球を、シクロヘキシミド（σ、100 μg/ml）により、２時間処理した。
同図に示すように、シクロヘキシミドを加えない場合、健常者と比較して孤発性ＡＬＳ患者では、ＯＰＴＮの発現量が１３．８％に減少していた。つまり、孤発性ＡＬＳ患者のｍＲＮＡには変異が存在するため、翻訳が早期に終了することにより、孤発性ＡＬＳ患者のＯＰＴＮの発現量が、健常者と比較して減少していた。従って、ＯＰＴＮの発現量を比較することにより、ＡＬＳの診断を行うことができた。
また、孤発性ＡＬＳ患者のように、ｍＲＮＡに変異が存在する場合では、リンパ芽球におけるナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（Nonsense-mediated mRNA decay；ＮＭＤ）の作動により、ｍＲＮＡが分解されるため、ＯＰＴＮの発現量が減少すると考えられる。そこで、アミノ酸配列に変異を伴うｍＲＮＡの減少を、正常な状態に戻すことができるシクロヘキシミドを加えて、ＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った。同図に示すように、孤発性ＡＬＳ患者において、シクロヘキシミドを加えた場合と加えない場合とでは、ＯＰＴＮの発現量が大きく違っていた。これは、シクロヘキシミドを加えることによりＮＭＤの作動が抑制されて、ｍＲＮＡの分解が阻害されたために、孤発性ＡＬＳ患者のＯＰＴＮが、健常者と同様に発現したためである。従って、シクロヘキシミドのようなＮＭＤ阻害薬は、ＡＬＳの治療薬となり得ることが示された。
（封入体の免疫染色）
次に、遺伝性及び孤発性ＡＬＳ患者における抗ＯＰＴＮ抗体によって免疫標識された細胞質内の封入体を調べた。図７（ａ）〜（ｍ）は、封入体の免疫染色を示す図である。
なお、ＯＰＴＮ−Ｃはマウス・モノクローナル抗体、ＯＰＴＮ−Ｉはウサギ・ポリクローナル抗体、ＴＤＰ−４３及びＳＯＤ１は、マウス・モノクローナル抗体及びウサギ・ポリクローナル抗体からなる抗体、Ｕｂはユビキチン、Ｈ＆Ｅはヘマトキシリン＆エオジンである。
図７（ａ）、（ｂ）、（ｄ）、及び（ｅ）に示すように、孤発性のＡＬＳ患者における好酸球性の硝子様封入体は、ＯＰＴＮ免疫活性を示した。また、図７（ｃ）及び（ｆ）に示すように、図７（ａ）及び（ｂ）と同一部位の封入体において、ユビキチン（Ｕｂ）活性を示した。また、図７（ｇ）に示すように、抗ＯＰＴＮ抗体で染まる異常線維構造が見られ、また、図７（ｈ）に示すように、抗ユビキチン抗体にも同様に、異常線維構造が染色された。また、図７（ｉ）及び（ｊ）に示すように、ＴＤＰ−４３抗体の免疫染色は、ＯＰＴＮ抗体の免疫染色より、異常線維構造がより明確に染色された。また、図７（ｋ）〜（ｍ）に示すように、ＳＯＤ１免疫活性陽性であるＬｅｗｙ小体類似硝子様封入体についても、ＯＰＴＮ免疫活性陽性であった。
また、図８（ａ）〜（ｈ）は、脊髄を示す図である。図８（ａ）及び（ｃ）に示すように、遺伝性のＡＬＳ患者における脊髄前角では運動ニューロンが消失していた。また、図８（ａ）及び（ｂ）に示すように、皮質脊髄路からミエリンが消失していた。また、図８（ｄ）に示すように、脊髄前角細胞のＯＰＴＮ免疫染色では、運動ニューロンの細胞質の染色強度が増加し、絡み合う神経突起は抗体に対して反応を示した。また、図８（ｅ）に示すように、運動ニューロンの細胞質には不定形の好酸性の領域があった。また、図８（ｆ）に示すように、図８（ｅ）と同一のニューロンでは、同じ部位が抗ＯＰＴＮ抗体で染色された。また、図８（ｇ）に示すように、このような好酸性の領域にヒアリン封入体を形成するものも見られた。また、図８（ｈ）に示すように、図８（ｇ）と同一のニューロンの封入体は、抗ＯＰＴＮ抗体で染色された。すなわち、図８（ｅ）及び（ｇ）では、運動ニューロンにおいて細胞質内に好酸性の封入体を認めた。また、図８（ｆ）及び（ｈ）では、封入体がＯＰＴＮ免疫活性を示した。
また、図９（ａ）〜（ｄ）は、健常者とＡＬＳ患者との腰部の脊髄前角細胞の免疫染色を比較した図である。図９（ａ）及び（ｃ）に示すように、健常者の脊髄前角細胞の細胞質は、抗ＯＰＴＮ抗体でかすかに標識された。一方、図９（ｂ）及び（ｄ）に示すように、孤発性のＡＬＳ患者では、脊髄前角細胞の細胞質及び神経突起においてＯＰＴＮの染色度が増加した。
ＡＬＳのような神経変性疾患では、封入体は疾患特異性がある。このため、ＡＬＳの封入体でＯＰＴＮが見いだされたこと、しかもこの遺伝子の変異をもたない孤発性のＡＬＳ患者の細胞において、さらに原因遺伝子が異なるＳＯＤ１遺伝子の変異が示されたＡＬＳ患者の細胞においても、ＯＰＴＮが見いだされたことは、ＡＬＳ一般におけるＯＰＴＮの異常を示すものである。
さらに、運動神経細胞の軸索、神経突起、細胞体において、ＯＰＴＮの発現上昇が見られた。
以上のことから、ＮＦ−κＢはＯＰＴＮの発現を誘導するので、ＮＦ−κＢのシグナルを制御することにより、ＯＰＴＮの発現を正常化できる。従って、ＮＦ−κＢ転写因子の活性化を抑制する薬剤は、ＡＬＳの治療薬となり得る。
（ＮＦ−κＢの活性抑制）
次に、ルシフェラーゼ検定によりＮＦ−κＢの活性を抑制するＯＰＴＮの機能について調べた。ｐＤＮＲベクター（クロンテック社製）にＡＬＳ患者のＯＰＴＮのｃＤＮＡを導入した。Lipofectamine 2000（インビトロジェン社製）を用いて、ＮＦ−κＢレポーター及びＯＰＴＮ導入のｐＤＮＲベクターを、ＮＳＣ−３４細胞に導入した。ルシフェラーゼ活性は、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（プロメガ社製）を用いて、ＰＢＳ又はＴＮＦ−αにより刺激し、５時間後、測定した。
ＴＮＦ−αによる刺激のあり、なしのそれぞれについて、ＮＦ−κＢの活性を抑制するＯＰＴＮの変異ごとのルシフェラーゼ活性を調べた。図１０は、ルシフェラーゼ活性を比較した図である。
なお、Ｑ３９８Ｘは、ＯＰＴＮの劣性の変異株であり、Ｅ４７８Ｇは、ＯＰＴＮの優性の変異株であり、Ｅ５０Ｋは、緑内障を引き起こす変異株である。
また、モック（Mock）は、ｐＤＮＲベクターである。
また、ＴＮＦ−は、ＴＮＦ−αの刺激なし、ＴＮＦ＋は、ＴＮＦ−αの刺激あり、を示す。
同図に示すように、野生型及びＥ５０Ｋは、ＮＦ−κＢの活性抑制効果を有した。一方、モック、Ｑ３９８Ｘ及びＥ４７８Ｇは、ＮＦ−κＢの活性抑制効果を有さなかった。
また、図１１（ａ）〜（ｌ）は、ＯＰＴＮの野生型及び変異型において細胞内局在性を比較した図である。野生型、Ｑ３９８Ｘ、Ｅ４７８Ｇ、及び、Ｅ５０Ｋのそれぞれについて、ＦＬＡＧタグ、及び、ゴルジ体の基質をマーカーするＧＭ１３０、により免疫蛍光染色を行った。
なお、ＦＬＡＧは、図１１（ａ）〜（ｄ）では白色、図１１（ｉ）〜（ｌ）では赤色で示した。ＧＭ１３０は、図１１（ｅ）〜（ｈ）では白色、図１１（ｉ）〜（ｌ）では緑色で示した。
また、図１１（ｉ）は、図１１（ａ）及び（ｅ）、図１１（ｊ）は、図１１（ｂ）及び（ｆ）、図１１（ｋ）は、図１１（ｃ）及び（ｇ）、図１１（ｌ）は、図１１（ｄ）及び（ｈ）、をそれぞれ重ね合わせて表示した図である。
図１１（ｉ）に示すように、野生型のＯＰＴＮでは、多くの顆粒状のＯＰＴＮがゴルジ体に局在化していた。一方、図１１（ｊ）及び（ｋ）に示すように、Ｑ３９８Ｘ及びＥ４７８ＧのＯＰＴＮでは、顆粒の数が野生型より減少し、ゴルジ体への局在化もあまり見られなかった。なお、図１１（ｌ）に示すように、Ｅ５０ＫのＯＰＴＮでは、顆粒のサイズが野生型より大きく、ゴルジ体に局在化していた。
ＯＰＴＮは、特に、ゴルジ体に局在化していた。ＡＬＳ患者の細胞内においては、ＯＰＴＮが局在化する障害により、機能喪失が起きていた。このため、ＯＰＴＮの局在化を適正化する、及び／又は、当該局在化によって果たされている機能喪失を補填することにより、ＡＬＳ疾患を治療することが可能であることが示された。
以上のことから、細胞内におけるＯＰＴＮの局在化を適正化し、当該局在化によって果たされている機能の喪失を補填する薬剤は、ＡＬＳの治療薬となり得る。
以上説明したように、本発明に係るＡＬＳの診断マーカー、及び、診断方法は、ＡＬＳの発症予測、及び、ＡＬＳの診断に適用することができる。また、本発明に係るＡＬＳの治療薬は、ＡＬＳの治療、及び、ＡＬＳの発症予防に適用することができる。また、本発明に係るモデル動物、及び、モデル細胞は、ＡＬＳの治療薬や治療方法を開発する際に適用することができる。

Claims (4)

  1. ヒト１０番染色体 ＯＰＴＮ（Optineurin）遺伝子領域に変異を有する塩基配列からなる核酸を含み、
    前記ＯＰＴＮ遺伝子領域のうち、１３２０７９９５領域の塩基がシトシンからチミンに、及び／又は、１３２１４１０４領域の塩基がアデニンからグアニンに、変異していることを特徴とする筋萎縮性側索硬化症の診断マーカー。
  2. 筋萎縮性側索硬化症の検出を補助する方法であって、
    被験者から試料を採取して、当該試料から核酸を単離する単離工程と、
    前記単離された核酸から、ヒト１０番染色体 ＯＰＴＮ（Optineurin）遺伝子領域に示される塩基を検出する検出工程と、
    前記検出された塩基が、前記ＯＰＴＮ遺伝子領域のうち、１３２０７９９５領域においては、塩基がシトシンからチミンに変異しているか、及び／又は、１３２１４１０４領域においては、塩基がアデニンからグアニンに変異しているか否かを判定する判定工程と、を備える、
    ことを特徴とする筋萎縮性側索硬化症の検出を補助する方法。
  3. ヒト１０番染色体 ＯＰＴＮ（Optineurin）遺伝子領域のうち、１３２０７９９５領域の塩基がシトシンからチミンに、及び／又は、１３２１４１０４領域の塩基がアデニンからグアニンに変異した塩基を含むＤＮＡ断片、及び／又は、発現ベクターを導入してなることを特徴とする筋萎縮性側索硬化症を発症するヒトを除くモデル動物。
  4. 請求項３に記載のヒトを除くモデル動物から採取されることを特徴とする筋萎縮性側索硬化症を発症するモデル細胞。
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