ES2349032T3

ES2349032T3 - Polimorfismos en el gen humano del polipéptido 2c8 citocromo p450 y su uso en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.

Info

Publication number: ES2349032T3
Application number: ES02776511T
Authority: ES
Inventors: Ulrich Brinkmann; Reimund Sprenger; Anja Penger
Original assignee: PGxHealth LLC
Current assignee: PGxHealth LLC
Priority date: 2001-06-01
Filing date: 2002-05-31
Publication date: 2010-12-22
Anticipated expiration: 2022-05-31
Also published as: WO2002099099A3; WO2002099099A2; EP1397486A2; DE60237154D1; AU2002344369A1; US20110131671A1; EP2290055A2; ATE475707T1; EP2290055A3; US7871767B2; US20060172291A1; EP1397486B1

Abstract

Polinucleótido CYP2C8 que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polinucleótido que tiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº: 132; (b) un polinucleótido capaz de hibridar con un gen de CYP2C8, en el que dicho polinucleótido tiene una sustitución de nucleótido en la posición correspondiente a la posición 1668 del gen de CYP2C8, según se depositó con el Nº de acceso de GeneBank: AF136830.1; y (c) un polinucleótido capaz de hibridar con un gen de CYP2C8, en el que dicho polinucleótido tiene una G en la posición correspondiente a la posición 1668 del gen de CYP2C8, según se depositó con el Nº de acceso de GeneBank: AF136830.1.

Description

[0001]La invención se refiere a un polinucleótido polimórfico de CYP2C8. Además, la invención se refiere a genes o vectores que comprenden el polinucleótido de la invención y a una célula hospedadora modificada por ingeniería genética con el polinucleótido o gen de la invención. [0002]Además, la invención se refiere a un animal transgénico no humano que comprende el polinucleótido, gen o vector de la invención. La invención también se refiere a un soporte sólido que comprende uno o una pluralidad de los polinucleótidos, genes, vectores o células hospedadoras mencionados anteriormente. Además, la invención se refiere a métodos de diagnóstico in vitro de efectos farmacológicos no deseados de fármacos que se metabolizan por el gen polimórfico de CYP2C8 de la invención. Además, la invención se refiere a un método de detección del polinucleótido de la invención. Además, la presente invención comprende una composición farmacéutica y de diagnóstico. Aún más, la invención se refiere a usos diagnósticos de los polinucleótidos, genes o vectores de la invención. Finalmente, la invención se refiere a un kit de diagnóstico. [0003]Las enzimas del citocromo P450 son enzimas metabólicas que se expresan de forma diferencial en varios tejidos. El ARNm de 2C del citocromo se detectó en abundancia en el tejido hepático, en menor medida en tejidos extrahepáticos, por ejemplo riñón, glándula adrenal, cerebro, útero, glándula mamaria, ovario y duodeno, pero ni en los testículos ni en el ovario (Klose, J. Biochem Mol Toxicol 13 (1999), 289-95). De la subfamilia CYP2C, agrupada en el cromosoma 10q24.1 (Gray, Genomics 28 (1995), 328-32), CYP2C9 y 2C19 son las que obtuvieron mayor interés debido a su papel destacado en la metabolización de fármacos terapéuticos. La degradación diferencial de sus sustratos conduce a la identificación de alelos de metabolizadores lentos (PM) o rápidos (EM). No obstante, la existencia de genes secundarios de CYP2C8 se conocía y se caracterizó que presentaban una homología de aminoácidos de aproximadamente el 90% (Goldstein, Pharmacogenetics 4 (1994), 285-99). Sólo recientemente se ha publicado la secuencia genómica del CYP2C8, que abarca una región de 31 kb. Curiosamente, el gen está implicado en el corte y empalme intergénico con CYP2C18 compuesto por 9 exones (Finta, Genomics 63 (2000), 433-8). [0004]El ácido araquidónico es un sustrato endógeno principal para CYP2C8 y específicamente epoxidado a formas equivalentes de 11, 12-y 14, 15-epóxidos. Respecto a sustratos xenobióticos, CYP2C8 representa la isoforma con la especificidad de sustrato más estrecha. Se sabe que el fármaco anticanceroso taxol (paclitaxel), que también se sabe bien que es un sustrato para MDR-1 (Mechetner, Clin Cancer Res. 4 (1998), 389-398), es el prototipo. Varios otros fármacos, por ejemplo verapamilo (Tracy, Br J Clin Pharmacol. 47 (1999), 542-52) y rosiglitazona (Malinowski, Clin Ther. 22 (2000), 1151-68) son sustratos preferibles para CYP2C8 en comparación con otros CYP2C o CYP3A. Los fármacos como la benzfetamina, ácido retinoico, tolbutamida, benzo(a)pireno, carbamazepina y R-ibuprofeno representan una contribución minoritaria de CYP2C8 (Wrighton, J Clin invest. 80 (1987), 1017-22; Relling, J. Pharmacol Exp Ther. 252 (1990), 4427; Hamman, Biochem Pharmacol, 54 (1197), 33-41; Kerr, Biochem Pharmacol. 47 (1994), 1969-79; Yun, Cancer Res. 52 (1992), 1868-74; Leo, Arch Biochem Biophys 159 (1987), 241-9). Hasta ahora, la inducción enzimática sólo se ha observado con fenobarbital y rifampicina (Morel, Eur J Biochem. 191 (1990), 437-44). Thum y Borlak (Thum y Borlak, Br J Pharmacol 130 (2000), 1745-52) descubrieron una fuerte correlación entre la expresión génica específica de tejido y la actividad enzimática. La expresión aumentada del ARNm de CYP2C8 dentro del ventrículo cardiaco derecho podría explicar la ausencia de eficacia de fármacos cardioselectivos como el verapamilo. En un sistema porcino, Fisslthaler (Fisslthaler, Nature 401 (1999), 493-7; Fisslthaler, Semin Perinatol 24 (2000), 15-9; Fisslthaler, Circ Res. 88 (2001), 44-51) pudo demostrar que CYP2C8 cumple todos los criterios para la sintasa del factor hiperpolarizante derivado del endotelio coronario que actúa sobre las células musculares lisas vasculares antes de la dilatación. [0005]Puesto que el ARNm se ha publicado, los primeros polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) en los exones 3, 5 y 8 se presentaron en un resumen (Goldstein, Microsomes and Oxidation, Stresa (2000), Italia): un intercambio en la posición 139 de Arg a Lys (exón 3) podía estar ligado a un SNP en el exón 8 (Lys399Arg), que aparece principalmente en caucásicos, y correlacionado con un fenotipo metabolizador lento (PM). El exón 5 presenta una mutación (iso296Phe) que está asociada con una enzima metabolizadora lenta restringida a afroamericanos. La regulación de los 2C se supone que está modificada por polimorfismos en la región no traducida. Respecto a CYP2C8, Goldstein y colaboradores (Golsdstein, Microsomes and Oxidation, Stresa Italy (2000), Italia) identificaron dos sitios no identificados previamente de factor de regulación de la transcripción para C/EBP y NPF-1, pero ningún SNP relevante en esa región. [0006]Sin embargo, aún no están disponibles medios y métodos para un diagnóstico y tratamiento fiable y mejorado de una diversidad de enfermedades y trastornos, o para predecir y superar los efectos o interacciones farmacológicas no deseadas, basados en disfunciones o malas regulaciones de variantes del citocromo 2C8 aunque son, no obstante, altamente deseables. Por tanto, el problema técnico subyacente a la presente invención es cumplir con las necesidades especificadas anteriormente. [0007]La solución a este problema técnico se consigue proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. [0008]Por consiguiente, la presente invención se refiere a un polinucleótido que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:

(a): un polinucleótido que tiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº 132;

(b): un polinucleótido capaz de hibridar con un gen de CYP2C8, en el cual dicho polinucleótido tiene una sustitución de nucleótido en una posición correspondiente a la posición 1668 del gen de CYP2C8 según se depositó con el Nº de acceso de GeneBank: AF136830.1; y

(c): un polinucleótido capaz de hibridar con un gen de CYP2C8, en el cual dicho polinucleótido tiene una G en una posición correspondiente a la posición 1668 del gen de CYP2C8 según se depositó con el Nº de acceso de GeneBank: AF136830.1.

[0009]En el contexto de la presente invención, el término “polinucleótidos” o el término “polipéptidos” se refiere a variantes diferentes de un polinucleótido o polipéptido. Dichas variantes comprenden una secuencia de referencia o de tipo salvaje de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención, así como variantes que difieren de los mismos en estructura o composición. Las secuencias de referencia o de tipo salvaje para los polinucleótidos tienen el Nº de acceso de GeneBank Nº: NM_000770.1 para el ARNm. La secuencia de referencia o de tipo salvaje para el nucleótido de la invención es para la 5’UTR: Nº de acceso de GeneBank: AF136830.1; para el exón 1: Nº de acceso de GeneBank: AF136831.1. Para el exón 2: Nº de acceso de GeneBank: AF136832.1 y AF136833.1; para el exón 3: Nº de acceso de GeneBank: AF136833.1; para el exón 4: Nº de acceso de GeneBank: AF136834.2 y AF136835.1; para el exón 5: Nº de acceso de GeneBank: AF136836.1 y AF136837.1; para el exón 6: Nº de acceso de GeneBank: AF136838.1 y AF136839.1; para el exón 7: Nº de acceso de GeneBank AF136840.1 y AF136841.1; para el exón 8: Nº de acceso de GeneBank: AF136842.1 y AF136843.1; para el exón 9/3’UTI: Nº de acceso de GeneBank: AF136844.1 y AF136845.1; se puede usar en parte en combinación con NM_000770.1 (ARNm). La secuencia de referencia o de tipo salvaje para el polipéptido del gen de CYP2C8 es el Nº de acceso de GeneBank: GI: 13787189. En el contexto de la presente invención, el término “5’UTR” se refiere a la región 5’ no traducida hasta el codón de inicio ATG incluyendo la región 5’ cadena arriba que abarca el promotor. El término “3’UTR” se refiere a la región 3’ no traducida hasta el codón de terminación. [0010]Las diferencias en estructura o composición normalmente se producen por medio de una o varias sustituciones, adiciones y/o deleciones de nucleótidos o aminoácidos. [0011]De acuerdo con la presente invención, una sustitución de T a G en una posición; correspondiente a la posición 1668 (Nº de acceso de GeneBank: AF136830.1) se ha producido en la 5’UTR del gen de CYP2C8. Se describen en la presente memoria otros polimorfismos encontrados en el gen de CYP2C8: una sustitución de G a A en una posición correspondiente a la posición 831 (Nº de acceso de GeneBank: AF136830.1), una sustitución de G a T en una posición correspondiente a la posición 309 (Nº de acceso de GeneBank: AF13638.1) y 232 (Nº de acceso de GeneBank: AF136840.1) del gen de CYP2C8. Las deleciones encontradas y descritas en la presente memoria son una deleción de AT en una posición correspondiente a la posición 1397 a 1398 (Nº de acceso de GeneBank: AF136830.1) y una deleción de al menos una A en una posición correspondiente a la posición 329 (Nº de acceso de GeneBank: AF136833.1) del gen de CYP2C8. [0012]También se ha encontrado que una deleción de nucleótido A en una posición correspondiente a la posición 329 (Nº de acceso de GeneBank: AF136833.1) del gen de CYP2C8 conduce a un C-terminal alterado de la proteína que codifica un polipéptido CYP2C8, en la cual dicho polipéptido comprende una sustitución de aminoácido de T a P en una posición correspondiente a la posición 159 del polipéptido CYP2C8 (Nº de acceso de GeneBank: GI: 13787189). [0013]Además, también se ha descubierto que una sustitución de una G a una T en una posición correspondiente a la posición 309 (Nº de acceso de GeneBank: AF136838.1) del gen de CYP2C8 conduce a un polipéptido en el cual dicho polipéptido comprende una sustitución de aminoácido de E a una terminación prematura (codón de terminación) en una posición correspondiente a la posición 274 del polipéptido CYP2C8 (Nº de acceso de GeneBank: GI: 13787189) y una sustitución del nucleótido G a una A en una posición correspondiente a la posición 1135 (Nº de acceso de GeneBank: NM_000770.1) del gen de CYP2C8 conduce a un polipéptido en el cual dicho polipéptido comprende una sustitución de aminoácido de G a S en una posición correspondiente a la posición 365 del polipéptido CYP2C8 (Nº de acceso de GeneBank: GI: 13787189). Esto alterará la estructura o confirmación de la proteína y suprimirá la actividad de la enzima metabolizadora de fármaco. [0014]Los polinucleótidos variantes de la invención también comprenden fragmentos de dichos polinucleótidos siempre y cuando estos fragmentos contengan el polimorfismo descrito en la presente memoria. Los polinucleótidos, así como los fragmentos de los mismos mencionados anteriormente de la presente invención, se caracterizan como asociados con una disfunción o mala regulación de CYP2C8 que comprende, por ejemplo, un metabolismo insuficiente y/o alterado. Dichas disfunciones o malas regulaciones mencionadas en la presente invención pueden provocar una enfermedad o trastorno o una prevalencia para dicha enfermedad o trastorno. Como se analizará a continuación en detalle, dicha enfermedad es una deficiencia en el metabolismo de ciertos fármacos que se metabolizan mediante CYP2C8, por ejemplo, Taxol, Verapamilo o cualquier otra enfermedad provocada por una disfunción o mala regulación debida a un polinucleótido de la invención, también mencionada como enfermedades asociadas al gen de CYP2C8 en lo siguiente. [0015]El término “hibridación”, como se usa en la presente memoria, se refiere a polinucleótidos que son capaces de hibridar con los polinucleótidos de la invención o partes de los mismos que están asociados con una disfunción o mala regulación de CYP2C8. Por tanto, dichos polinucleótidos de hibridación también están asociados con dichas disfunciones y malas regulaciones. Preferiblemente, dichos polinucleótidos capaces de hibridar con los polinucleótidos de la invención o partes de los mismos que están asociados con disfunciones o malas regulaciones de CYP2C8 son idénticos en al menos en el 70%, al menos el 80%, el menos el 95% o al menos el 100% a los polinucleótidos de la invención o partes de los mismos que están asociados con disfunciones o malas regulaciones de CYP2C8. Por lo tanto, dichos polinucleótidos pueden ser útiles como sondas en el análisis de transferencia de Northern o Southern de preparaciones de ARN o ADN, respectivamente, o se pueden usar como cebadores oligonucleotídicos en el análisis por PCR dependiendo de su tamaño respectivo. La invención también comprende polinucleótidos de hibridación que son útiles para analizar interacciones de ADN-Proteína mediante, por ejemplo, análisis de cambio de movilidad electroforética (EMSA). Preferiblemente, dichos polinucleótidos de hibridación comprenden al menos 10, más preferiblemente al menos 15 nucleótidos de longitud, mientras que el polinucleótido de hibridación de la presente invención que se va a usar como sonda preferiblemente comprende al menos 100, más preferiblemente al menos 200 o aún más preferiblemente al menos 500 nucleótidos de longitud. [0016]Se conoce bien en la técnica cómo realizar experimentos de hibridación con moléculas de ácido nucleico, es decir el experto en la materia conoce qué condiciones de hibridación tiene que usar de acuerdo con la presente invención. Estas condiciones de hibridación se mencionan en libros de texto convencionales tal como Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) Nueva York. De acuerdo con las presentes invenciones se prefieren polinucleótidos que son capaces de hibridar con los polinucleótidos de la invención o partes de los mismos que están asociados con una disfunción o mala regulación de CYP2C8 en condiciones de hibridación rigurosas, es decir, que no hibridan de manera cruzada con polinucleótidos no relacionados. [0017]El término “correspondiente” como se usa en la presente memoria, significa que una posición no sólo está determinada por el número de nucleótidos y aminoácidos precedentes, respectivamente. La posición de un nucleótido o aminoácido dado de acuerdo con la presente invención que puede delecionarse, sustituirse o comprender uno o más nucleótidos adicionales puede variar debido a deleciones o nucleótidos o aminoácidos adicionales en otro sitio en el gen o el polipéptido. Por tanto, con una “posición correspondiente” de acuerdo con la presente invención debe entenderse que los nucleótidos o aminoácidos pueden diferir en el número indicado pero pueden tener todavía nucleótidos o aminoácidos colindantes similares. Dichos nucleótidos o aminoácidos que pueden intercambiarse, delecionarse o comprender nucleótidos o aminoácidos adicionales también están comprendidos en la expresión “posición correspondiente”. Dichos nucleótidos o aminoácidos pueden, por ejemplo, junto con sus nucleótidos o aminoácidos colindantes, formar secuencias que pueden estar implicadas en la regulación de la expresión génica, la estabilidad del ARN correspondiente

o la edición del ARN, así como codificar motivos o dominios funcionales de la proteína de la invención. [0018]Mediante, por ejemplo, “posición 1271 a 1273” se entiende que dicho polinucleótido comprende uno o más nucleótidos delecionados que se delecionan entre la posición 1271 y la posición 1273 de la versión de tipo salvaje correspondiente de dicho polinucleótido. Lo mismo es aplicable, cambiando lo que se deba a cambiar, a todos los demás números de posición mencionados en la realización anterior que están redactados en el mismo formato. [0019]Mediante, por ejemplo, “posición 180/181” se entiende que dicho polinucleótido comprende uno o más nucleótidos adicionales que están insertados entre las posiciones 180 y 181 de la versión de tipo salvaje correspondiente de dicho polinucleótido. Lo mismo es aplicable, cambiando lo que se deba cambiar a todos los demás números de posiciones mencionados en la realización anterior que están redactados en el mismo formato, es decir, dos números de posición consecutivos separados por una barra (/). [0020]De acuerdo con la presente invención, el modo y la distribución en la población de las variaciones genéticas en el gen de CYP2C8 se ha analizado mediante análisis de secuencias de regiones relevantes de dicho gen humano a partir de muchos individuos diferentes. Es un hecho bien conocido que el ADN genómico de individuos, que alberga la composición genética individual de todos los genes, incluyendo el gen de CYP2C8, puede purificarse fácilmente a partir de muestras de sangre individuales. Estas muestras de ADN individuales se usan después para el análisis de la composición de secuencia de los alelos del gen de CYP2C8 que están presentes en el individuo que proporcionó la muestra de sangre. El análisis de secuencia se realizó por amplificación por PCR de regiones relevantes de dichos genes, la posterior purificación de los productos de PCR, seguida por la secuenciación de ADN automatizada con métodos establecidos (por ejemplo, secuenciación cíclica con terminadores marcados con colorante ABI). [0021]Un parámetro importante que tiene que considerarse en el intento de determinar los genotipos individuales e identificar nuevas variantes del gen de CYP2C8 mediante secuenciación directa del ADN de los productos de PCR a partir de ADN genómico de sangre humana es el hecho de que cada ser humano alberga (normalmente, con muy pocas excepciones anómalas) dos copias génicas de cada gen autosómico (diploidía). Debido a esto, debe tenerse mucho cuidado en la evaluación de las secuencias para ser capaz de identificar de forma inequívoca no sólo las variaciones de secuencia homocigotas, sino también las variaciones heterocigotas. Los detalles de las diferentes etapas en la identificación y caracterización de nuevos polimorfismos en el gen de CYP2C8 (homocigotos y heterocigotos) se describen en los ejemplos a continuación. [0022]Durante los últimos 20 años, cada vez se ha reconocido más la heterogeneidad genética como una fuente significativa de variación en la respuesta farmacológica. Muchas comunicaciones científicas (Meyer, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 37 (1997), 269-296 y West, J. Clin. Pharmacol. 37 (1997), 635-648) han demostrado claramente que algunos fármacos funcionan mejor o pueden ser incluso altamente tóxicos en algunos pacientes que en otros o pueden ser incluso altamente tóxicos en algunos pacientes, y que estas variaciones en las respuestas de los pacientes a los fármacos pueden estar relacionadas con bases moleculares. Este concepto “farmacogenómico” reconoce correlaciones entre las respuestas a fármacos y los perfiles genéticos de los pacientes (Marshall, Nature Biotechnology, 15 (1997), 954-957; Marshal, Nature Biotechnology, 15 (1997), 1249-52). En este contexto de variabilidad de población respecto a la terapia farmacológica, se ha propuesto la farmacogenómica como una herramienta útil en la identificación y selección de pacientes que puedan responder a un fármaco particular sin efectos secundarios. Esta identificación/selección se puede basar en el diagnóstico molecular de polimorfismos genéticos mediante el genotipado de ADN de leucocitos en la sangre del paciente, por ejemplo, y la caracterización de la enfermedad (Bertz, Clin. Pharmacokinet. 32 (1997), 210-256; Engel, J. Chromatogra. B. Biomed. Appl. 678 (1996), 93103). Para los fundadores de la asistencia sanitaria, tales como las organizaciones de mantenimiento de la salud en los Estados Unidos y los servicios de salud pública gubernamentales en muchos países europeos, este enfoque farmacogenómico puede representar una manera tanto de mejorar la asistencia sanitaria como de reducir los gastos generales ya que existe un gran coste de fármacos innecesarios, fármacos ineficaces y fármacos con efectos secundarios.

Las mutaciones en el gen de CYP2C8 se enumeran en la Tabla 2. [0023]Los métodos del análisis de mutaciones siguieron protocolos convencionales y se describen en detalle en los Ejemplos. En general, estos métodos han de usarse de acuerdo con la presente invención para la evaluación del espectro fenotípico, así como de las características clínicas solapantes de enfermedades o afecciones relacionadas con disfunciones o malas regulaciones y enfermedades relacionadas con el metabolismo lento o rápido (PM o EM) de ciertos fármacos. Ventajosamente, la caracterización de dichos mutantes puede formar las bases del desarrollo de un ensayo de diagnóstico que sea capaz de predecir una eficacia de los pacientes para metabolizar un fármaco, por ejemplo, en un tratamiento anticáncer (taxol) o deficiencias cardiovasculares (verapamilo). Dichos métodos abarcan, por ejemplo, el análisis de haplotipos, el análisis de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCA), la PCR y la secuenciación directa. Basándose en la caracterización clínica minuciosa de muchos pacientes, los fenotipos se pueden correlacionar después con estas mutaciones. [0024]También se comprende en el polinucleótido mencionado en la presente invención un polinucleótido que comprende al menos dos de los polinucleótidos especificados en la presente memoria anteriormente, es decir, polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que contiene las cuatro mutaciones comprendidas por los polinucleótidos anteriores o enumeradas en la Tabla 2 a continuación (haplotipo: posiciones 831, 1397 a 1398 del Nº de acceso de GeneBank: AF136830.1, posición 270 de Nº de acceso de GeneBank: AF136833.1 y la posición 206 de (Nº de acceso de GeneBank: AF136842.1). De acuerdo con la presente invención, también se prefiere detectar solamente uno de los polimorfismos del haplotipo mencionados anteriormente, siendo dicho polimorfismo indicativo de la presencia de los demás polimorfismos del haplotipo. Por lo tanto, para detectar la presencia del haplotipo mencionado anteriormente, es suficiente determinar la presencia de cualquiera de los polimorfismos comprendidos por dicho haplotipo. Además, los polinucleótidos mencionados anteriormente permiten el estudio de los efectos sinérgicos de dichas mutaciones en el gen de CYP2C8 y/o un polipéptido codificado por dicho polinucleótido en el perfil farmacológico de fármacos en pacientes que portan dichas formas mutantes del gen o formas mutantes similares, que pueden mimetizarse por las proteínas descritas anteriormente. Se espera que el análisis de dichos efectos sinérgicos proporcione una comprensión más profunda de la aparición de disfunciones o malas regulaciones de CYP2C8 o enfermedades relacionadas con un transporte de fármacos alterado, como se ha descrito anteriormente. A partir de dicha comprensión más profunda, el desarrollo de composiciones farmacéuticas y de diagnóstico relacionadas con disfunciones o malas regulaciones de CYP2C8 o enfermedades relacionadas con un metabolismo de fármacos alterado, será enormemente beneficioso. [0025]Como es evidente para el experto en la materia, el conocimiento genético deducido de la presente invención se puede usar ahora para caracterizar de manera exacta y fiable el genotipo de un paciente. Ventajosamente, las enfermedades o la prevalencia para una enfermedad que esté asociada con una disfunción o mala regulación de CYP2C8, por ejemplo, enfermedades asociadas con el metabolismo del ácido araquidónico mencionado en la presente memoria, se pueden predecir y, por consiguiente, se pueden aplicar medidas preventivas o terapéuticas. Además, de acuerdo con lo anterior, en casos donde un fármaco dado presenta un efecto inusual, se puede diseñar una terapia individual adecuada basándose en el conocimiento de la composición genética individual de un sujeto con respecto a los polinucleótidos de la invención y se pueden desarrollar terapias mejoradas, como se analizará adicionalmente a continuación. [0026]En general, el “estado” de CYP2C8, que se define por el nivel de expresión y actividad de la proteína CYP2C8, puede ser variable en tejido normal, debido a variaciones/polimorfismos genéticos. La identificación del polimorfismo descrito en la presente memoria y que está asociado con una expresión y/o actividad alterada de CYP2C8 es importante para la predicción del metabolismo del fármaco y, posteriormente, para la predicción del resultado de la terapia, incluyendo los efectos secundarios de las medicaciones. Por lo tanto, el análisis de las variaciones de CYP2CB indicativas de la función de CYP2C8 es una herramienta valiosa para la terapia con fármacos, que son sustratos de CYP2C8, y se ha hecho posible ahora gracias a la presente invención. En línea con lo anterior, preferiblemente, el polinucleótido de la presente invención está asociado con posibles efectos farmacológicos no deseados de fármacos que se metabolizan por CYP2C8. Los fármacos metabolizados por CYP2C8 pueden ser para el tratamiento de una enfermedad relacionada con el metabolismo del ácido araquidónico, cáncer o enfermedades cardiovasculares.

[0027]El término “cáncer” usado en la presente memoria se conoce y se caracteriza muy bien en la técnica. Existen varias variantes de cáncer y están comprendidas por dicho término como se entiende de acuerdo con la invención. Para una lista detallada de síntomas que son indicativos de cáncer se hace referencia a conocimientos de libros de texto, por ejemplo, Pschyrembel. La expresión “enfermedad cardiovascular”, como se usa en la presente memoria, se refiere a aquellas enfermedades conocidas en la técnica y descritas en detalle en libros de texto convencionales, tales como Pschyrembel o Stadman. Los ejemplos de enfermedades cardiovasculares son hipertensión o aterosclerosis. La ineficacia o pérdida completa de la epoxidación del ácido araquidónico se denomina enfermedad del metabolismo del ácido araquidónico. [0028]En una realización adicional la presente invención se refiere a un polinucleótido que es ADN o ARN. [0029]El polinucleótido de la invención puede ser, por ejemplo, ADN, ADNc, ADN genómico, ARN o ADN o ARN producidos sintéticamente, o una molécula de ácido nucleico quimérica producida de forma recombinante que comprende cualquiera de esos polinucleótidos solos o en combinación. Preferiblemente, dicho polinucleótido es parte de un vector, particularmente, plásmidos, cósmidos, virus y bacteriófagos usados convencionalmente en ingeniería genética, que comprende un polinucleótido de la invención. Dichos vectores pueden comprender genes adicionales tales como genes marcadores que permiten la selección de dicho vector en una célula hospedadora adecuada y en condiciones adecuadas. [0030]La invención además se refiere a un gen que comprende el polinucleótido de la invención. [0031]Se conoce bien en la técnica que los genes comprenden elementos estructurales que codifican una secuencia de aminoácidos así como elementos reguladores que están implicados en la regulación de la expresión de dichos genes. Los elementos estructurales están representados por exones que pueden codificar una secuencia de aminoácidos o que pueden codificar ARN que no codifica una secuencia de aminoácidos pero que no obstante está implicado en la función del ARN, por ejemplo, regulando la estabilidad del ARN o la exportación nuclear del ARN. [0032]Los elementos reguladores de un gen pueden comprender elementos promotores o elementos potenciadores, pudiendo ambos estar implicados en el control transcripcional de la expresión génica. Se conoce muy bien en la técnica que un promotor ha de encontrarse cadena arriba de los elementos estructurales de un gen. Los elementos reguladores tales como elementos potenciadores, sin embargo, se pueden encontrar distribuidos por todo el locus de un gen. Dichos elementos podrían residir, por ejemplo, en intrones, regiones de ADN genómico que separan los exones de un gen. Los elementos promotores o potenciadores corresponden a fragmentos de polinucleótidos que son capaces de atraer o unirse a los polipéptidos implicados en la regulación del gen que comprende dichos elementos promotores o potenciadores. Por ejemplo, los polipéptidos implicados en la regulación de dicho gen comprenden los denominados factores de transcripción. [0033]Dichos intrones pueden comprender elementos reguladores adicionales que son necesarios para una expresión génica adecuada. Los intrones se transcriben normalmente junto con los exones de un gen, dando como resultado un transcrito de ARN naciente que contiene secuencias tanto exónicas como intrónicas. Las secuencias de ARN codificadas por intrones normalmente se eliminan por un procedimiento conocido como corte y empalme del ARN. Sin embargo, dicho procedimiento también requiere que estén presentes secuencias reguladoras en un transcrito de ARN, dichas secuencias reguladoras pueden estar codificadas por los intrones. [0034]Además, aparte de su función en el control transcripcional y el control de un procesamiento y/o estabilidad del ARN adecuado, los elementos reguladores de un gen también podrían estar implicados en el control de la estabilidad genética de un locus génico. Dichos elementos controlan, por ejemplo, acontecimientos de recombinación o sirven para mantener una cierta estructura del ADN o la organización del ADN en un cromosoma. [0035]Por lo tanto, pueden producirse polimorfismos de un solo nucleótido en exones de un gen que codifica una secuencia de aminoácidos como se ha analizado anteriormente, así como en regiones reguladoras que estén implicadas en el procedimiento analizado anteriormente. El análisis de la secuencia de nucleótidos de un locus génico en su totalidad incluyendo por ejemplo intrones es, a la luz de lo anterior, deseable. El polimorfismo comprendido por el polinucleótido de la presente invención puede influir en el nivel de expresión de la proteína CYP2C8 mediante mecanismos que implican la transcripción aumentada o reducida del gen de CYP2C8, la estabilización de los transcritos de ARN del gen y la alteración del procesamiento de los transcritos primarios del ARN.

[0036]Por lo tanto, de acuerdo con la invención, una sustitución da como resultado una expresión alterada del gen variante en comparación con el gen de tipo salvaje correspondiente. [0037]En otra realización, la presente invención se refiere a un vector que comprende el polinucleótido de la invención o el gen de la invención. [0038]Dicho vector puede ser, por ejemplo, un fago, un plásmido, un vector viral o retroviral. Los vectores retrovirales pueden ser competentes para la replicación o de replicación defectuosa. En el último caso, la propagación viral se producirá generalmente sólo en el hospedador/células de complementación. [0039]Los polinucleótidos o genes de la invención pueden estar unidos a un vector que contiene marcadores de selección para la propagación en un hospedador. Generalmente, un vector plasmídico se introduce en un precipitado tal como un precipitado de fosfato cálcico, o en un complejo con un lípido cargado o en agrupaciones basadas en carbono. Si el vector fuera un virus, podría empaquetarse in vitro usando una línea celular de empaquetamiento adecuada antes de su aplicación a las células hospedadoras. [0040]En una realización más preferida del vector de la invención, el polinucleótido está unido operativamente a secuencias de control de la expresión permiten la expresión en células procariotas o eucariotas o fracciones aisladas de las mismas. [0041]La expresión de dicho polinucleótido comprende la transcripción del polinucleótido, preferiblemente en un ARNm traducible. Los elementos reguladores que aseguran la expresión en células eucariotas, preferiblemente células de mamífero, los conocen bien los expertos en la materia. Normalmente comprenden secuencias reguladoras que aseguran el inicio de la transcripción y, opcionalmente, señales poli-A que aseguran la terminación de la transcripción y la estabilización del transcrito. Otros elementos reguladores pueden incluir potenciadores de la transcripción así como de la traducción. Los posibles elementos reguladores que permiten la expresión en células hospedadoras procariotas comprenden, por ejemplo, el promotor lac, trp o tac en E. coli, y son ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresión en células hospedadoras eucariotas los promotores AOX1 o GAL1 en levadura o el promotor de CMV, SV40, RSV (virus del sarcoma de Rous), el potenciador de CMV, el potenciador de SV40

o un intrón de globina y otras células animales. Aparte de los elementos que son responsables del inicio de la transcripción, dichos elementos reguladores también pueden comprender señales de terminación de la transcripción, tales como el sitio poli-A de SV40 o el sitio poli-A de tk, cadena abajo del polinucleótido. En este contexto, se conocen en la técnica vectores de expresión adecuados tales como el vector de expresión de ADNc de Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogene), pSPORT1 (GIBCO BRL). Preferiblemente, dicho vector es un vector de expresión y/o un vector de dirección o de transferencia génica. Los vectores de expresión derivados de virus, tales como retrovirus, virus vaccinia, virus adenoasociados, virus herpes o virus del papiloma bovino, se pueden usar para el suministro de los polinucleótidos o del vector de la invención a poblaciones de células diana. Se pueden usar métodos que conocen bien los expertos en la materia para construir vectores virales recombinantes; véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook, Molecular Cloning a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989) Nueva York y Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates y Wiley Interscience, Nueva York (1994). Como alternativa, los polinucleótidos y vectores de la invención se pueden reconstituir en liposomas para el suministro a células diana. [0042]La expresión “fracciones aisladas de las mismas” se refiere a fracciones de células o tejidos procariotas o eucariotas que son capaces de transcribir o de transcribir y traducir ARN a partir del vector de la invención. Dichas fracciones comprenden proteínas que son necesarias para la transcripción del ARN o la transcripción del ARN y la traducción de dicho ARN en un polipéptido. Dichas fracciones aisladas pueden ser, por ejemplo, fracciones nucleares y citoplasmáticas de células eucariotas tales como reticulocitos. [0043]La presente invención además se refiere a una célula hospedadora modificada por ingeniería genética con el polinucleótido de la invención, el gen de la invención o el vector de la invención. [0044]Dicha célula hospedadora puede ser una célula procariota o eucariota; véase lo anterior. El polinucleótido o vector de la invención que está presente en la célula hospedadora puede estar integrado en el genoma de la célula hospedadora o puede mantenerse extracromosómicamente. En este sentido, también debe entenderse que la molécula de ADN recombinante de la invención se puede usar para “direccionamiento génico” y/o “sustitución génica”, para restaurar un gen mutante o para crear un gen mutante mediante recombinación homóloga; véase, por ejemplo Mouellic, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990), 4712-4716; Joyner, Gene Targeting,

A. Practical Approach, Oxford University Press. [0045]La célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariota, tal como una célula bacteriana, de insecto, fúngica, vegetal, animal, de mamífero o, preferiblemente, humana. Son células fúngicas preferidas, por ejemplo, aquellas del género Saccharomyces, en particular las de la especie S. cerevisiae. El término “procariotas” pretende incluir todas las bacterias que pueden transformarse o transfectarse con un polinucleótido para la expresión de un polipéptido variante de la invención. Los hospedadores procariotas pueden incluir bacterias gram negativas así como gram positivas tales como, por ejemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. Un polinucleótido que codifica una forma mutante de polipéptidos variantes de la invención se puede usar para transformar o transfectar el hospedador usando cualquiera de las técnicas comúnmente conocidas por los expertos en la materia. [0046]Se conocen bien en la técnica métodos para preparar genes fusionados, unidos operativamente, y expresarlos en células bacterianas o animales (Sambrook, anteriormente). Las construcciones genéticas y los métodos descritos en la misma se pueden utilizar para la expresión de polipéptidos variantes de la invención en, por ejemplo, hospedadores procariotas. En general, los vectores de expresión que contienen secuencias promotoras que facilitan la transcripción eficaz del polinucleótido insertado se usan en relación con el hospedador. El vector de expresión contiene típicamente un origen de replicación, un promotor y un terminador, así como genes específicos que son capaces de proporcionar la selección fenotípica de las células transformadas. Los hospedadores procariotas transformados pueden hacerse crecer en fermentadores y cultivarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica para conseguir un crecimiento celular óptimo. Después, las proteínas de la invención se pueden aislar del medio de cultivo, lisados celulares o fracciones de membrana celular. El aislamiento y la purificación de los polipéptidos de la invención expresados en organismos microbianos o de otra manera puede ser por cualquier medio convencional tal como, por ejemplo, separaciones cromatográficas preparativas y separaciones inmunológicas tales como las que implican el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales. [0047]Por tanto, la invención describe un método para producir una variante

molecular del polipéptido CYP2C8 o un fragmento del mismo, que

comprende el cultivo de la célula hospedadora descrita anteriormente; y la recuperación de dicha proteína o fragmento del cultivo. [0048]También, la invención describe un método para producir células capaces de expresar una variante molecular del polipéptido CYP2C8, que comprende células modificadas por ingeniería genética con el polinucleótido de la invención, el gen de la invención o el vector de la invención. [0049]Las células que pueden obtenerse por el método de la invención se pueden usar, por ejemplo, para ensayar fármacos de acuerdo con los métodos descritos en D. L. Spector, R. D. Goldman, L. A. Leinwand, Cells, a Lab manual, CSH Press 1998. Además, las células se pueden usar para estudiar fármacos conocidos y derivados desconocidos de los mismos respecto a su capacidad para complementar la deficiencia provocada por mutaciones en el gen de CYP2C8. Para estas realizaciones, las células hospedadoras carecen preferiblemente de un alelo de tipo salvaje, preferiblemente de ambos alelos del gen de CYP2C8 y/o tienen al menos una forma mutada de los mismos. Idealmente, el gen que comprende un alelo como el comprendido por los polinucleótidos de la invención se podría introducir en el locus de tipo salvaje por sustitución homóloga. Como alternativa, la marcada sobreexpresión de un alelo mutado por encima del alelo normal y la comparación con una línea celular recombinante que sobreexpresa el alelo normal a un nivel similar se puede usar como sistema de análisis y exploración. Las células que se pueden obtener mediante el método descrito anteriormente también se pueden usar para los métodos de exploración mencionados en la presente memoria a continuación. [0050]La invención también se refiere a un animal transgénico no humano que comprende al menos un polinucleótido de la invención, el gen de la invención o el vector de la invención como se ha descrito anteriormente. [0051]La presente invención también abarca un método para la producción de un animal transgénico no humano que comprende la introducción de un polinucleótido o vector de la invención en una línea germinal, una célula embrionaria, una célula madre o un óvulo o una célula derivada de las mismas. El animal no humano se puede usar de acuerdo con el método de la invención descrito a continuación y puede ser un animal sano no transgénico, o puede tener una enfermedad o trastorno, preferiblemente una enfermedad causada por al menos una mutación en el gen de la invención. Dichos animales transgénicos son adecuados para, por ejemplo, estudios farmacológicos de fármacos en relación con formas variantes de los polipéptidos variantes descritos anteriormente, puesto que estos polipéptidos

: o al menos sus dominios funcionales están conservados entre especies en eucariotas superiores, particularmente en mamíferos. La producción de embriones transgénicos y la exploración de estos se puede realizar, por ejemplo, como se describe por A. L. Joyner Ed., Gene Targeting, A Practical Approach (1193), Oxford University Press. El ADN de los embriones puede analizarse usando, por ejemplo, transferencias de Southern con una sonda adecuada o basándose en técnicas de PCR. Un animal transgénico no humano de acuerdo con la invención puede ser un ratón, rata, hámster, perro, mono, conejo, cerdo, rana, nematodo tal como Caenorhabditis elegans, mosca de la fruta tal como Drosophila melanogaster o pez tal como el pez torpedo o el pez cebra, transgénico, que comprende un polinucleótido

: o vector de la invención u obtenido por el método descrito anteriormente, preferiblemente en el cual dicho polinucleótido o vector está integrado establemente en el genoma de dicho animal no humano, preferiblemente de modo que la presencia de dicho polinucleótido o vector conduzca a la expresión del polipéptido variante de la invención. Puede comprender una o varias copias del mismo o diferentes polinucleótidos o genes de la invención. Este animal tiene numerosas utilidades, incluyendo como modelo de investigación para la investigación cardiovascular y, por lo tanto, ofrece un animal novedoso y valioso en el desarrollo de terapias, tratamientos, etc. para enfermedades causadas por enfermedades cardiovasculares. Por consiguiente, en este caso, el mamífero es preferiblemente un animal de laboratorio tal como un ratón o una rata. [0052]Por tanto, en una realización preferida el animal transgénico no humano de la invención es un ratón, una rata o un pez cebra. [0053]Numerosos informes pusieron de manifiesto que dichos animales son particularmente adecuados como organismos modelo para la investigación del metabolismo de fármacos y sus deficiencias o del cáncer. [0054]Ventajosamente, se pueden crear fácilmente animales transgénicos usando dichos organismos modelo, debido a la disponibilidad de diversas técnicas adecuadas bien conocidas en la materia. [0055]La invención también se refiere a un soporte sólido que comprende uno o una pluralidad de nucleótidos, genes, vectores o células hospedadoras de la invención en forma inmovilizada. [0056]La expresión “soporte sólido”, como se usa en la presente memoria,

se refiere a un soporte flexible o no flexible que es adecuado para llevar dichas dianas inmovilizadas. Dicho soporte sólido puede ser homogéneo o no homogéneo. Por ejemplo, dicho soporte sólido puede consistir en diferentes materiales que tienen propiedades iguales o diferentes respecto a la flexibilidad e inmovilización, por ejemplo, o dicho soporte sólido puede consistir en un material que presenta una pluralidad de propiedades, que también comprenden propiedades de inmovilización y flexibilidad. Dicho soporte sólido puede comprender microplacas de vidrio, polipropileno o silicona, perlas conjugadas con oligonucleótidos en membranas o matrices de perlas. [0057]El término “inmovilizado” significa que la especie molecular de interés está fijada a un soporte sólido, preferiblemente unida covalentemente al mismo. Este enlace covalente se puede conseguir por diferentes medios dependiendo de la naturaleza molecular de la especie molecular. Además, la especie molecular también puede fijarse sobre el soporte sólido por fuerzas electrostáticas, interacciones hidrófobas o hidrófilas o fuerzas de Van-der-Waals. [0058]Las interacciones físico-químicas descritas anteriormente se producen típicamente en interacciones entre moléculas. Por ejemplo, los polipéptidos biotinilados se pueden fijar sobre un soporte sólido recubierto con avidina debido a interacciones de los tipos descritos anteriormente. Además, polipéptidos tales como anticuerpos, se pueden fijar sobre un soporte sólido recubierto con anticuerpo. Además, la inmovilización depende de las propiedades químicas del soporte sólido. Por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico se pueden inmovilizar en una membrana por técnicas convencionales tales como el entrecruzamiento inducido por UV o calor. [0059]En una realización preferida de la invención, dicho soporte sólido es una membrana, una microplaca de vidrio o polipropileno o silicio, son perlas conjugadas con oligonucleótidos o una matriz de perlas, que se ensamblan en un sustrato de filtro óptico. [0060]La invención describe un método para identificar y obtener un profármaco o un fármaco capaz de modular la actividad de una variante molecular de un polipéptido CYP2C8, que comprende las etapas de:

(a): poner en contacto el soporte sólido de la invención, una célula que expresa una variante molecular de un gen que comprende un polinucleótido de la invención, el gen o el vector de la invención en presencia de componentes capaces de proporcionar una señal

detectable en respuesta a la actividad farmacológica, con un compuesto que se va a explorar para determinar su actividad como profármaco o fármaco; y

(b): detectar la presencia o ausencia de una señal o aumento o disminución de una señal generada a partir de la actividad del profármaco o del fármaco, en el cual la ausencia, presencia, aumento o disminución de la señal es indicativa de un posible profármaco o fármaco.

[0061]El término “compuesto” en un método de la invención incluye una sola sustancia o una pluralidad de sustancias que pueden o no ser idénticas. [0062]Dichos compuestos o compuestos pueden sintetizarse químicamente

o producirse por fermentación microbiana, pero también pueden estar contenidos en, por ejemplo, muestras, por ejemplo, extractos celulares de, por ejemplo, plantas, animales o microorganismos. Además, dichos compuestos pueden conocerse en la técnica pero hasta ahora no conocerse que sean útiles como inhibidores, respectivamente. La pluralidad de los compuestos puede, por ejemplo, añadirse al medio de cultivo o inyectarse en una célula o animal no humano de la invención. [0063]Si una muestra que contiene (a) un compuesto o compuestos se identifica en el método de la invención, entonces es posible aislar el compuesto a partir de la muestra original identificada como que contiene el compuesto en cuestión o se puede subdividir adicionalmente la muestra original, por ejemplo, si consiste en una pluralidad de diferentes compuestos, para reducir el número de sustancias diferentes por muestra, y repetir el método con la subdivisiones de la muestra original. Después, se puede determinar si dicha muestra o compuesto presenta las propiedades deseadas, por ejemplo, mediante los métodos descritos en la presente memoria o en la bibliografía (Spector et al., Cells manual; véase anteriormente). Dependiendo de la complejidad de las muestras, las etapas descritas anteriormente se pueden realizar varias veces, preferiblemente hasta que la muestra identificada de acuerdo con el método de la invención sólo comprenda un número limitado de o una sola sustancia. Preferiblemente, dicha muestra comprende sustancias de propiedades químicas y/o físicas similares y, más preferiblemente, dichas sustancias son idénticas. Los métodos de la presente invención se pueden diseñar y realizar fácilmente por el experto en la materia, por ejemplo, de acuerdo con otros ensayos basados en células descritos en la técnica anterior o usando y modificando los métodos como se describen en la presente memoria.

Además, el experto en la materia reconocerá fácilmente qué otros

compuestos se pueden usar para realizar los métodos de la invención, por ejemplo, enzimas, si es necesario, que convierten un determinado compuesto en un percusor. Esta adaptación del método de la invención está bien dentro de la experiencia del experto en la materia y se puede realizar sin una experimentación excesiva. [0064]Los compuestos que se pueden usar de acuerdo con la presente invención incluyen péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos, compuestos orgánicos pequeños, ligandos, peptidomiméticos, PNA y similares. Dichos compuestos pueden actuar como agonistas o antagonistas de la invención. Dichos compuestos también pueden ser análogos o derivados funcionales de fármacos conocidos. Los métodos para la preparación de análogos y derivados químicos los conocen bien los expertos en la materia y se describen en, por ejemplo, Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, Nueva York, N.

Y. 10010 Estados Unidos y Organic Synthesis, Wiley, Nueva York, Estados Unidos. Además, dichos derivados y análogos se pueden ensayar para determinar sus efectos de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica

o como se describen. Además, se pueden usar peptidomiméticos y/o el diseño asistido por ordenador de análogos y derivados de fármacos adecuados, por ejemplo, de acuerdo con los métodos descritos a continuación. Dichos análogos comprenden moléculas que pueden tener la estructura básica de sustratos, inhibidores y/o moduladores de CYP2C8 conocidos. [0065]Se pueden usar programas informáticos adecuados para la identificación de sitios interactivos de un supuesto inhibidor y los polipéptidos de la invención por búsquedas asistidas por ordenador para motivos estructurales complementarios (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114420). Se describen en la técnica anterior sistemas informáticos adecuados adicionales para el diseño asistido por ordenador de proteínas y péptidos, por ejemplo, en Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033-1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 59875991. Los resultados obtenidos a partir del análisis informático descrito anteriormente se pueden usar en combinación con el método de la invención para, por ejemplo, optimizar inhibidores, análogos, antagonistas o agonistas conocidos. También se pueden identificar peptidomiméticos y otros inhibidores adecuados mediante la síntesis de bibliotecas combinatorias de peptidomiméticos a través de modificaciones químicas sucesivas y el ensayo de los compuestos resultantes, por ejemplo, de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria. Se describen en la técnica anterior métodos para la generación y uso de bibliotecas combinatorias de peptidomiméticos, por ejemplo en Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220-234 y Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715. Además, la estructura tridimensional y/o cristalográfica de dichos compuestos y de los polipéptidos de la invención se puede usar para el diseño de fármacos peptidomiméticos (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996) 1545-9558). Se conoce muy bien cómo obtener dichos compuestos, por ejemplo, por técnicas convencionales químicas o bioquímicas. Por tanto, también el método de la invención comprende medios para preparar o producir dichos compuestos. En resumen, la presente invención proporciona métodos para identificar y obtener compuestos que se pueden usar en dosis específicas para el tratamiento de formas específicas de enfermedades asociadas con CYP2C8. [0066]Las definiciones anteriores son aplicables, cambiando lo que se deba cambiar, a todos los métodos descritos a continuación. [0067]La invención describe además un método para la producción de una composición farmacéutica que comprende las etapas del método como se ha descrito anteriormente; y la etapa adicional de formular el compuesto identificado y obtenido o un derivado del mismo en una forma farmacéuticamente aceptable. [0068]Los compuestos terapéuticamente útiles identificados de acuerdo con los métodos descritos en la presente memoria se pueden formular y administrar a pacientes como se ha analizado anteriormente. Para los usos y dosis terapéuticas que se ha determinado que son adecuadas por un experto en la materia, y para las definiciones de la expresión “composición farmacéutica”, véase a continuación. [0069]Además, la invención describe un método para la preparación de una composición farmacéutica que comprende las etapas de los métodos descritos anteriormente; y la formulación de un fármaco o profármaco en la forma adecuada para su aplicación terapéutica y la prevención o mejora del trastorno del sujeto diagnosticado en el método de la invención. [0070]Los fármacos o profármacos después de su administración in vivo se metabolizan para eliminarse por excreción o por metabolismo a uno o más metabolitos activos o inactivos (Meyer, J. Pharmacokinet. Biopharm. 24 (1996), 4469459). Por tanto, en lugar de usar el compuesto actual o inhibidor identificado y obtenido de acuerdo con los métodos de la presente invención, se puede usar una formulación correspondiente como profármaco que se convierte en su principio activo en el paciente. Las medidas de precaución que pueden adoptarse para la aplicación de profármacos y fármacos se describen en la bibliografía; véase, para una revisión, Ozama, J. Toxicol. Sci. 21 (1996), 323-329). [0071]En una realización preferida del método de la presente invención, dicho fármaco o profármaco es un derivado de un medicamento como se define en lo sucesivo. [0072]La presente invención también se refiere a un método para predecir efectos farmacológicos no deseados de fármacos que se metabolizan por CYP2C8, que comprende la determinación de la presencia de un polinucleótido o del gen de la invención en una muestra de un sujeto. [0073]De acuerdo con esta realización de la presente invención, el método puede efectuarse usando un ácido nucleico o gen polinucleotídico de la invención, por ejemplo, en forma de una transferencia de Southern o Northern o un análisis in situ. Dicha secuencia de ácido nucleico puede hibridar con una región codificante de cualquiera de los genes o con una región no codificante, por ejemplo, un intrón. En caso de que se emplee una secuencia complementaria en el método de la invención, dicha molécula de ácido nucleico puede usarse de nuevo en transferencias de Northern. Adicionalmente, dicho ensayo se puede hacer junto con un bloqueo real, por ejemplo, de la transcripción del gen y, por tanto, se espera que tenga una relevancia terapéutica. Además, se puede usar también un cebador u oligonucleótido para hibridar con uno de los genes de CYP2C8 mencionados anteriormente o sus ARNm correspondientes. Los ácidos nucleicos usados para la hibridación pueden, por ejemplo, marcarse convenientemente mediante la incorporación o unión, por ejemplo, de un marcador radiactivo o de otro tipo. Estos marcadores se conocen bien en la técnica. El marcaje de dichas moléculas de ácido nucleico se puede efectuar por métodos convencionales. [0074]Adicionalmente, la presencia o expresión del gen variante de CYP2C8 de la invención se puede controlar usando un par de cebadores que hibriden específicamente con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico correspondientes y realizando una reacción de PCR de acuerdo con procedimientos convencionales. La hibridación específica de los cebadores o sondas mencionadas anteriormente se produce preferiblemente en condiciones de hibridación rigurosas. La expresión “condiciones de hibridación rigurosas” se conoce bien en la técnica; véase, por ejemplo, Sambrook et al., “Molecular Cloning, A Laboratory Manual” segunda ed., CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989; “Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach”, ed. Hames y Higgins., IRL Press, Oxford, 1985. Además, los ARNm, ARNc, ADNc o ADN genómicos que se obtienen del sujeto pueden secuenciarse para identificar mutaciones que pueden ser huellas genéticas características de mutaciones en el polinucleótido o gen de la invención. La presente invención además comprende métodos en los cuales dicha huella genética puede generarse por RFLP de ADN o ARN obtenido del sujeto, opcionalmente el ADN o ARN se puede amplificar antes del análisis, cuyos métodos se conocen bien en la técnica. Las huellas genéticas del ARN pueden generarse mediante, por ejemplo, la digestión de una muestra de ARN obtenida del sujeto con una enzima de ARN adecuada, por ejemplo RNasa T1, RNasa T2 o similares o una ribozima y, por ejemplo, separación electroforética y detección de los fragmentos de ARN como se ha descrito anteriormente. [0075]Modificaciones adicionales de la realización de la invención mencionada anteriormente pueden concebirse fácilmente por el experto en la materia, sin ninguna experimentación excesiva a partir de esta descripción; véase, por ejemplo, los ejemplos. Una realización adicional de la presente invención se refiere a un método en el cual dicha determinación se efectúa empleando un anticuerpo de la invención o un fragmento del mismo. El anticuerpo usado en el método de la invención puede marcarse con marcadores detectables tales como histidina-Flag o una molécula de biotina. [0076]En una realización preferida de la presente de la invención, el método descrito anteriormente comprende PCR, reacción en cadena de la ligasa, digestión de restricción, secuenciación directa, técnicas de amplificación de ácidos nucleicos, técnicas de hibridación o inmunoensayos. Dichos procedimientos se conocen bien en la técnica. [0077]Además, la invención se refiere a un método de detección del polinucleótido o del gen de la invención en una muestra que comprende las etapas de

(a): poner en contacto el soporte sólido descrito anteriormente con la muestra en condiciones que permitan la interacción del polinucleótido o

del gen de la invención con las dianas inmovilizadas en un soporte sólido, y;

(b): determinar la unión de dicho polinucleótido o dicho gen a dichas

dianas inmovilizadas en un soporte sólido. [0078]La invención también se refiere a un método in vitro para predecir efectos farmacológicos no deseados de fármacos que se metabolizan por CYP2C8, que comprende las etapas del método descrito anteriormente, en el cual la unión de dicho polinucleótido o gen a dichas dianas inmovilizadas en dicho soporte sólido es indicativa de la presencia o ausencia de dichos efectos farmacológicos no deseados de fármacos que se metabolizan por CYP2C8. [0079]La invención se refiere además a una composición de diagnóstico que comprende el polinucleótido, el gen o el vector de la invención. [0080]Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido, el gen o el vector de la invención. Estas composiciones farmacéuticas se administran convenientemente por cualquiera de las vías usadas convencionalmente para la administración de fármacos, por ejemplo, por vía oral, tópica, parenteral o por inhalación. Las sales aceptables comprenden acetato, éster metílico, HCl, sulfato, cloruro y similares. Los compuestos pueden administrarse en formas de dosificación convencionales preparadas combinando los fármacos con vehículos farmacéuticos convencionales de acuerdo con procedimientos convencionales. Estos procedimientos pueden implicar la mezcla, granulación y compresión o disolución de los ingredientes según sea apropiado para la preparación deseada. Se apreciará que la forma y el carácter del diluyente o carácter farmacéuticamente aceptable se determina por la cantidad de ingrediente activo con el que debe combinarse, la vía de administración y otras variables bien conocidas. El vehículo o vehículos deben ser “aceptables” en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no perjudiciales para el receptor de la misma. El vehículo farmacéutico empleado puede ser, por ejemplo, sólido o líquido. Son ejemplares de vehículos sólidos la lactosa, terra alba, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, goma arábiga, estearato magnésico, ácido esteárico y similares. Son ejemplares de vehículos líquidos la solución salina tamponada con fosfato, jarabe, aceite tal como aceite de cacahuete y aceite de oliva, agua, emulsiones, diversos tipos de agentes humectantes, soluciones estériles y similares. De forma similar, el vehículo o diluyente puede incluir material retardante bien conocido en la técnica, tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo sólo o con una cera. [0081]El régimen de dosificación se determinará por el médico adjunto y otros factores clínicos; preferiblemente de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos anteriormente. Como bien se sabe en la técnica médica, las dosificaciones para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluyendo la talla del paciente, el área de superficie corporal, la edad, el compuesto particular a administrar, el sexo, el momento y la vía de administración, el estado general y otros fármacos que se estén administrando al mismo tiempo. El progreso se puede controlar por evaluación periódica. [0082]Gracias a la presente invención, la selección de fármaco particular, el régimen de dosificación y los pacientes correspondientes a tratar se pueden determinar de acuerdo con la presente invención. Las recomendaciones de dosificación se indicarán en la etiqueta del producto, permitiendo al que lo prescribe prever ajustes de dosis dependiendo del grupo de pacientes considerado, con información que evite prescribir el fármaco equivocado a pacientes equivocados o a la dosis equivocada. [0083]Finalmente, la presente invención se refiere a un kit de diagnóstico para la detección de un polimorfismo de un solo nucleótido, que comprende el polinucleótido, el gen, el vector, la célula hospedadora o el soporte sólido de la invención. [0084]El kit de la invención puede contener ingredientes adicionales tales como marcadores de selección y componentes para medios selectivos adecuados para la generación de células y animales transgénicos. El kit de la invención se puede usar para realizar un método de la invención y podría, entre otros, emplearse en una diversidad de aplicaciones, por ejemplo, en el campo del diagnóstico o como herramienta de investigación. Las partes del kit de la invención se pueden envasar individualmente en viales u otros medios adecuados dependiendo del ingrediente respectivo, o en combinación en recipientes adecuados o unidades multirrecipiente. Preferiblemente, la fabricación del kit sigue procedimientos convencionales que conocen los expertos en la materia. El kit se puede usar para métodos para detectar la expresión de una forma mutante de los polipéptidos, genes

o polinucleótidos de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención descritos anteriormente , empleando, por ejemplo, técnicas de inmunoensayo tales como el radioinmunoensayo o inmunoensayo enzimático o, preferiblemente, hibridación de ácidos nucleicos y/o técnicas de amplificación tales como las descritas en la presente memoria anteriormente y en los Ejemplos, así como estudios farmacocinéticos cuando se usan los animales transgénicos no humanos de la invención. [0085]Las figuras ilustran la invención:

Figura 1 [0086]Correlación del SNP C104G (Exón 5, I264M) con niveles de proteína reducidos de CYP2C8. Los niveles de expresión de 14 individuos se determinaron por análisis de transferencia Western y LC-MS usando verapamilo como sustrato específico. Los diagramas de cajas muestran la distribución de las muestras de acuerdo con el genotipo en la posición aminoacídica 264. La correlación genotipo-fenotipo es significativa (p = 0,0037, N = 14).

Figura 2 [0087]La correlación del SNP -370 en relación con el codón de inicio ATG con niveles de expresión aumentados como se detecta por transferencia de western, usando el fármaco taxol (paclitaxel) como sustrato específico. Como se muestra en los diagramas de cajas, la correlación genotipofenotipo es significativa entre muestras de tipo salvaje homocigotas y mutantes heterocigotas (p = 0,044, N = 20). (Se analizó una muestra homocigota y produjo niveles de expresión >400).

Figura 3 [0088]Correlación del SNP en la posición -370 en la región no traducida basada en desviaciones de los valores medios de los niveles de expresión de CYP2C8 a partir de dos colectivos de muestras independientes (N = 62). El fenotipo de los pacientes se determinó mediante LC/MS y Transferencia de Western. La correlación fenotipo-genotipo es significativa, como se muestra en los diagramas de cajas (p = 0,017 para homocigotos frente a tipo salvaje y p = 0,071 para heterocigotos frente a tipo salvaje).

Figura 4 [0089]Correlación del alelo que incluye los SNP ligados G-1207A, delAT640/41 (ambos en el promotor), G270A (exón 3) y A206G (exón 8) con un fenotipo metabolizador lento (PM). Sin embargo, hasta ahora no se ha podido fenotipar ningún individuo homocigotos para este alelo. Los datos que se muestran en el diagrama de cajas sólo muestran una tendencia (p = 0,071; N = 18) pero sin significación.

Figura 5 [0090]Transfección de células LS174T con una construcción de promotor de tipo salvaje de CYP2C8 o dos SNP que contienen fragmentos de promotor (G-1207A y -640 a 641 delAT o T-370G). Usando el vector de expresión eucariota pGL3, se analizaron los valores medios de seis ensayos de transfección independientes después de la normalización de la actividad de tipo salvaje de 2C8 al 100%.

Figura 6 [0091]Estructura enzimática de CYP2C8 modelada por ordenador de las variantes proteicas Thr 159 Pro (fase de lectura), Glu 274 Codón de terminación y Gly 365 Ser. El gris oscuro representa la estructura inalterada de la proteína variante, el gris claro representa los aminoácidos ausentes en la estructura variante de CYP2C8. El círculo indica el sitio activo de la enzima con el amino ácido alterado Gly 365 Ser en oscuro.

Figura 7 [0092]Secuencias de GeneBank de tipo salvaje o de referencia para los polinucleótidos, polipéptidos y ARNm de acuerdo con la presente invención. [0093]La invención se describirá ahora por referencia a los siguientes Ejemplos biológicos que son meramente ilustrativos y no deben interpretarse como una limitación del alcance de la presente invención.

Ejemplos Ejemplo 1: Aislamiento de ADN genómico a partir de sangre humana, generación y purificación de fragmentos génicos de CYP2C8 [0094]El ADN genómico se obtuvo por técnicas de cromatografía de intercambio iónico convencionales (kits de Qiagen para el aislamiento de ADN genómico a partir de la sangre). Se obtuvo sangre de todos los individuos ensayados (voluntarios de Parexel, Berlín y del Instituto de Farmacología Clínica, Stuttgart) teniendo en cuenta todos los requisitos legales, médicos y burocráticos. Se adquirieron muestras adicionales de otras poblaciones étnicas (por ejemplo, caucásicos, japoneses,

afroamericanos) de proveedores comerciales.

[0095]Usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores oligonucleotídicos específicos, dos para cada fragmento, se obtuvieron fragmentos de ADN definidos que contenían partes específicas del gen humano de CYP2C8. Estos cebadores oligonucleotídicos específicos se diseñaron para unirse a secuencias cadena arriba y cadena abajo de los diversos exones, así como en la región 5 prima del gen de CYP2C8. Los fragmentos de ADN resultantes no contenían sólo partes codificantes, sino también secuencias que abarcaban las partes intrónicas localizadas en los límites exón-intrón. Se conoce que estos sitios son importantes para el procesamiento correcto y la posterior expresión del ARNm codificante de proteína, un proceso denominado “corte y empalme”. Los pares de cebadores oligonucleotídicos sintetizados comercialmente que se purificaron por cromatografía de afinidad se optimizaron para cada uno de los 9 exones y 4 fragmentos de promotores del gen humano de CYP2C8. Las secuencias para cada cebador se enumeran en la tabla 1. [0096]Se realizaron reacciones en cadena de la polimerasa en condiciones que se optimizaron para cada uno de los nueve fragmentos y una región promotora que abarca aproximadamente 2kb cadena arriba del codón de inicio para la traducción del ARNm. Se realizaron PCR para todos los exones en un volumen de 50 l. Se añadieron 10-50 ng de ADN de molde a un tampón de PCR convencional que contenía MgCl2 1,5 mM, dNTP 200 My1 U de polimerasa Taq (todos de Qiagen, Hilden), así como 10-40 pMol de cebadores (MWG Biotech, Munich). Todas las reacciones de PCR se realizaron en condiciones idénticas en un termociclador de Perkin Elmer (Modelo 9700) con una etapa inicial de desnaturalización de 2 minutos a 94ºC, seguida de 34 ciclos para la generación de fragmentos de PCR con 45 s de desnaturalización a 94ºC, 45 s de hibridación a 62ºC y 1 min a 72ºC para la elongación. La localización exacta de los cebadores y el tamaño de los fragmentos deseados también se indican en la tabla 1. [0097]Los fragmentos de ADN definidos que contienen partes específicas del gen de CYP2C8, secuencias exónicas así como algunas intrónicas en los límites intrón-exón, se procesaron para eliminar los nucleótidos no incorporados y los componentes de tampón que de otra manera podrían interferir con la posterior determinación del genotipo de CYP2C8 individual mediante secuenciación cíclica directa. Para esta purificación, se usaron técnicas de cromatografía de intercambio iónico convencionales (kits de Qiagen para la purificación de fragmentos de PCR). Para todos los fragmentos se obtuvieron rendimientos suficientes de fragmentos purificados, adecuados para el análisis de secuenciación de ADN directo. Se sometieron a análisis de secuencia directo alícuotas de fragmentos purificados del gen de CYP2C8 en un secuenciador capilar ABI 3700.

Ejemplo 2: Identificación de alelos de CYP2C8 diferentes por determinación de secuencia en diversos individuos. [0098]Para el análisis de secuencia de regiones relevantes del gen de CYP2C8 humano de muchos individuos diferentes, se realizaron amplificaciones por PCR de las regiones relevantes del gen (véanse los cebadores en la tabla 1) después de la purificación de los productos de PCR y de la secuenciación con métodos establecidos (secuenciación cíclica con terminadores marcados con colorante ABI). Puesto que la composición genética individual está representada por dos copias de cualquier gen (diploidía), debe tenerse mucho cuidado en la evaluación de las secuencias para no sólo identificar inequívocamente variaciones de secuencia homocigotas, sino también heterocigotas. Por lo tanto, en los casos en los cuales no pudo detectarse una discriminación clara, se realizó una secuenciación directa e inversa. Además, para el descubrimiento de alelos definidos y completos, por ejemplo, en equilibrio de ligamiento, es necesario abarcar todos los exones, así como la región promotora para proporcionar una base completa para la predicción del fenotipo de SNP individuales. [0099]Para la evaluación de variaciones de CYP2C8 en la población humana, se realizaron análisis de secuencias de las regiones relevantes, incluyendo un fragmento promotor de 2kb y todos los exones del gen, a partir de ADN genómico de cada 48 individuos caucásicos, japoneses y afroamericanos. Las secuencias se sometieron a un programa de análisis informático (PhredphrapTM, Perkin Elmer) y se inspeccionaron manualmente para determinar la aparición de secuencias de ADN que se desviaban de secuencias de CYP2C8 publicadas recientemente que se consideró que representaban las secuencias “de tipo salvaje” en este trabajo. [0100]Debido a que la genética de poblaciones permite un cálculo de la frecuencia esperada de alelos homocigotos frente a heterocigotos de un gen definido (fórmula de Hardy Weinberg: 2p e2 + 2pq + 2q e2 = 1), fue posible confirmar las distribuciones esperadas de alelos homocigotos frente a heterocigotos y las desviaciones de los hallazgos experimentales. Esto sirve como control experimental de que una variación de secuencia detectada representa de hecho un nuevo alelo. [0101]Se descubrieron varias nuevas variaciones de secuencia de CYP2C8 y se confirmaron experimentalmente usando este enfoque que se muestra en la tabla 2. Se localizan 18 polimorfismos en la región no traducida 5’/promotora del gen (Nº de acceso de GeneBank: AF136830.1). Se pudo encontrar 22 nuevos polimorfismos en las secuencias de los intrones 1, 2, 3, 4 y 8 (Nº de acceso de GeneBank: AF136832.1, AF136833.1, AF136835.1, AF136843.1 y AF136844.1) y uno en la región no traducida 3’ del gen (Nº de acceso de GeneBank: AF136845.1). [0102]Además, se detectaron tres cambios de nucleótidos particulares en el exón 3 (posición 334 en el límite exón/intrón, Nº de acceso de GeneBank: 163833.1) y el exón 8 (posición 30 y 87, Nº de acceso de GeneBank: AF1368.43.4) que no cambian la secuencia de aminoácidos. En el exón 3 (posición 329, Nº de acceso de GeneBank: AF136833.1), exón 4 (posición 243, Nº de acceso de GeneBank: AF136842.2 y posición 13 de Nº de acceso de GeneBank: AF136835.1 ), exón 5 (posición 42, 101 y 104, Nº de acceso de GeneBank: AF136837.1), exón 6 (posición 309, Nº de acceso de GeneBank: AF136838.1) y 7 (posición 1135, Nº de acceso de GeneBank: NM_000770.1 y posición 232, Nº de acceso de GeneBank: AF136840.1) se pudo identificar nueve SNP que cambian la secuencia proteica, como se muestra en la tabla 4, donde el aminoácido de la desviación se escribe en negrita. Estos nuevos SNP de CYP2C8 y los ya publicados sirven como marcadores para la caracterización del estado de CYP2C8 en pacientes. [0103]Las posiciones de los nuevos SNP de CYP2C8, incluyendo el contexto exacto de secuencia nueva, se enumeran en la tabla 2. La base de la desviación en la secuencia se escribe subrayada y en negrita.

Ejemplo 3: Determinación del alelo de promotor de CYP2C8 que contiene G-1207A, delAT -640 a -641 como un factor farmacogenético que influye en los niveles de fármaco [0104]El fármaco anticanceroso taxol (paclitaxel) se puede considerar el prototipo para CYP2C8 y su isoforma 6-hidroxipaclitaxel el sustrato de diagnóstico. Además, el verapamilo representa otro sustrato específico para CYP2C8 que se metila a diferentes metabolitos, por ejemplo, D-702 y D-703,

o se desalquila a D-617 (es decir, un sustrato de CYP3A4). La generación de un metabolito específico usado para probar selectivamente la actividad funcional de CYP2C8 (LC-MS) se muestra en la figura 4. En paralelo, la cantidad de enzima se determina mediante transferencia de western (véase el ejemplo 9). [0105]Para validar una posible correlación de los polimorfismos de un solo nucleótido G-1207A, delAT -640 a 641 y/o T-370G (todos 5’UTR/Promotor) y/o C104G (exón 5) con un fenotipo determinado, se analizaron biopsias de pacientes de dos estudios diferentes. La caracterización funcional del gen de CYP2C8 se ha determinado a partir de preparaciones de enterocitos del duodeno y del hígado. [0106]Usando estas herramientas analíticas, se sometieron a genotipado muestras caracterizadas fenotípicamente que se habían tratado con taxol (N = 22) o verapamilo (N = 15, 44). [0107]Cualquiera de los grupos mostró que dos SNP, G-127A, delAT -640 a -641 de la región no traducida 5’ están en desequilibrio de ligamiento y, en combinación con los SNP G207A (exón 3) y A206G (exón 8), representan un nuevo alelo (haplotipo) que se define principalmente por la presencia de los dos nuevos SNP de promotor G-1207A y delAT -640 a -641. La Figura 4 muestra que este alelo es responsable del nivel reducido de sustrato metabolizado.

Ejemplo 4: Consecuencias funcionales de la identificación de polimorfismos del promotor de CYP2C8 [0108]La región promotora eucariota de un gen está compuesta por varios elementos reguladores, por ejemplo, potenciadores, silenciadores y otros elementos de respuesta. En la presente memoria, los polimorfismos de un solo nucleótido muestran una influencia significativa. Respecto a los mecanismos de inducción de enzimas del citocromo P450, por ejemplo, factores de transcripción como los sitios C/EBP, HPF o barbiebox identificados en CYP2C9 (Klose, J Biochem MolToxicol 13 (1999), 289-95) son importantes puesto que se requiere una expresión temporal. Los SNP cambian o interfieren con estos elementos y pueden alterar la acción del promotor y/o la actividad de transcripción. El nuevo SNP identificado en la posición -1207 muy probablemente suprime la unión del factor de transcripción que se ha mostrado selectivamente para la unión de la proteína de unión 1 al elemento regulador del esterol específica de tejido (SREBP-1, Vallett, J Biol Chem. 271 (1996), 12247-53). Se ha demostrado una expresión reducida si la posición -1207 no corresponde al tipo salvaje. La correlación de este nuevo alelo con la actividad enzimática de CYP2C8 se presenta en la figura 4. La unión con otros SNP no identificados más cadena abajo en la región promotora de CYP2C8 (delAT -640 a -641) confiere un nuevo valor al alelo respecto a las aplicaciones de diagnóstico.

Ejemplo 5: Determinación del polimorfismo del promotor de CYP2C8 T370G como un factor farmacogenético que influye en los niveles de fármaco [0109]Pudo identificarse que otro polimorfismo situado más cadena abajo en la posición 1668 en la región no traducida 5 prima (posición -370 en relación al codón de inicio ATG) aumentaba significativamente el nivel de expresión como se muestra en la figura 3. Este alelo se menciona como un fenotipo metabolizador rápido (EM) que se confirmó por investigación de muestras caracterizadas fenotípicamente. En varios casos, aparecen polimorfismos de un solo nucleótido G-1207A, delAT -640 a -641 en combinación con T-370G. Los resultados de LC-MS de estas muestras muestran que los individuos que portan solo el T-370G tienen una actividad aumentada de CYP2C8 en comparación con los heterocigotos para los polimorfismos de alelo G-1207A, delAT -640 a -641. Respecto a la aplicación en un ensayo de diagnóstico, estos datos muestran claramente la influencia de la posición de T-370G sobre los niveles de expresión de CYP2C8, es decir, el último SNP es responsable de un cambio de metabolismo lento (PM) a intermedio/rápido (IM/EM) como se demuestra en el ejemplo 9/tabla 6. [0110]Independientemente, se realizó una validación adicional mediante el genotipado de 22 muestras correspondientes a extractos hepáticos individuales, en los cuales se evaluó el metabolismo del taxol. Los datos confirman los resultados como se presenta en los ejemplos 8 y 9. La figura 2 muestra la correlación significativa entre un polimorfismo heterogéneo en la posición -370G y el aumento de los niveles de proteína CYP2C8. El extracto hepático de una muestra homogénea para la posición -370 presentó el nivel más alto de proteína CYP2C8 (>400 pmol/mg proteína). Esto es un resultado independiente adicional que respalda la correlación significativa de la figura

2.

Ejemplo de Referencia 6: Determinación del polimorfismo de CYP2C8 en la posición aminoacídica 264 (exón 5) como un factor farmacogenético que influye en los niveles de fármaco

[0111]En otra realización, la presente invención se refiere a un polimorfismo en el exón 5 en la posición C104G (Nº de acceso de GeneBank: AF136837.1). Este cambio se correlaciona con una concentración de proteína reducida analizada a partir de muestras genotipadas (figura 1) que podría deberse a proteínas o ARNm menos estables. Los polipéptidos codificados por los polinucleótidos de la invención pueden tener alteradas propiedades biológicas o inmunológicas debido a los polimorfismos mencionados de acuerdo con la presente invención. Son ejemplos de dichas propiedades alteradas la estabilidad de los polipéptidos que puede lograrse

o la incapacidad para metabolizar eficazmente ciertos fármacos.

Ejemplo 7: Uso del análisis de Polimorfismos de Longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP) para detectar SNP relevantes en la predicción fenotípica [0112]Se pueden detectar polimorfismos de CYP2C8 no sólo por secuenciación, sino también por diversos otros medios. Como alternativa a la metodología de secuenciación, se puede realizar el genotipado con los fragmentos de PCR que se van a procesar mediante una endonucleasa de restricción que corta específicamente en una región, compuesta por una secuencia única de 4-6 nucleótidos. Debido a la longitud limitada de un fragmento de PCR, a veces se puede aprovechar esta especificidad si discrimina el mutante y el tipo salvaje, es decir, dando como resultado fragmentos digeridos o no digeridos (Tabla 5). Respecto a la presente invención, éste era el caso para fragmentos de la región promotora 4 (posición -370, doble corte de AcsI para el tipo salvaje y único corte en el mutante), que indica el alelo respectivo, el exón 3 (posición 275, único corte de SapI para el mutante de CYP2C8), y el exón 5 (posición 104, único corte de ClaI para el tipo salvaje). Dependiendo de la región del SNP específico de los fragmentos, el patrón de restricción refleja inequívocamente el tipo salvaje, el mutante heterocigoto u homocigoto. Como se define por los cebadores enumerados en la tabla 1, los exones se exploraron dieron como resultado los siguientes fragmentos de RFLP:

Tabla 5:

Posición de SNP (fragmento de PCR): Enzima Longitud(pb) Genotipo

no cortado: wt/wt(pb) wt/mut (pb) mut/mut(pb)

Nº -370, (5'UTR): Acs1 483 33/150/33 33/150/183/300 183/300

Nº 270, (exón 3): SapI 328 328 149/179/328 149/179

Nº 104, (exón 5): ClaI 584 192/392 192/392/584 584

Ejemplo 7: Identificación de nuevos polimorfismos de CYP2C8

5 mediante análisis de secuencia de un grupo de diversos individuos de diferentes grupos étnicos [0113]La exploración para determinar SNP en el gen de CYP2C8 en los genomas de diferentes grupos étnicos produjo varios polimorfismos enumerados en la tabla 2. Se analizaron 48 muestras de cada una de las

10 poblaciones étnicas caucásica, japonesa y afroamericana, respectivamente. Dentro de este grupo, el gran número de SNP en la región no traducida podía considerarse que influía potencialmente en el nivel de proteína. [0114]Además, varios polimorfismos muestran amplias discrepancias interétnicas (Tabla 3) entre diversos grupos étnicos. Los 57 nuevos

15 polimorfismos identificados en el gen de CYP2C8 complementarán el conocimiento existente y contribuirán a un entendimiento más completo del gen, evitando problemas en la respuesta a fármacos y, con respecto a otros grupos étnicos, facilitando por tanto "estudios puente" que podrían ser de interés para sacar datos a partir de esta realización.

20 Ejemplo 8: Caracterización de SNP del promotor por transfección de plásmidos de promotor-indicador en células humanas [0115]Se ensayaron tres SNP de promotor respecto a su contribución a diferentes niveles de expresión mediante ensayos de transfección usando la

25 línea celular LS174T. Fragmentos de promotor que contenían el tipo salvaje

o los SNP en las posiciones correspondientes a las posiciones G-1207A y delAT -640 a -641 (Nº de acceso de GeneBank: AF136830.1) o en una posición correspondiente a la posición T-370G (Nº de acceso de GeneBank: AF136830.1) se introdujeron en un vector de expresión de mamíferos

30 comercial. El plásmido alberga secuencias convencionales para la propagación en células eucariotas incluyendo el gen indicador luciferasa, que está controlado por la secuencia promotora integrada. Después de la verificación de la secuencia de cada inserto de ADN, se cotransfectaron las células con -galactosidasa, se recogieron después de 48 h y se analizaron para la actividad luciferasa. Las actividades del promotor (%) se muestran en la figura 5 después de la normalización respecto a la eficacia de transfección, como se determina por detección de -galactosidasa. Los datos concuerdan totalmente con las observaciones de muestras caracterizadas fenotípicamente. Una construcción de ADN que contiene los polimorfismos delAT -640 a -641 y 1207G>A (figura 5) mostró una transcripción disminuida para los niveles de promotor de CYP2C8 en comparación con el tipo salvaje. Por el contrario, el plásmido indicador puso de manifiesto niveles crecientes de proteína luciferasa bajo el control de un promotor de CYP2C8 que contenía un polimorfismo correspondiente a la posición -370.

Ejemplo 9: Cuantificación de proteína de muestras que contenían SNP en la posición del promotor G-1207A, delAT -640 a -641, T-340G y C104G (exón 5, posición aminoacídica 264) de CYP2C8 [0116]Se habían preparado extractos de proteína a partir de muestras de hígado humano. Los niveles de proteínas CYP2C8 se analizaron mediante transferencia de Western usando muestras genotipadas para los SNP G1207A, delAT -640 a -641, T-370G (todos con Nº de acceso de GeneBank: AF136830.1) y C104G (Nº de acceso de GeneBank: AF136837.1). La Tabla 5 muestra los efectos de diferentes genotipos sobre los niveles de expresión de CYP2C8 (pmol/mg) normalizados para el tipo salvaje (=100%). Los resultados concuerdan totalmente con los datos funcionales descritos por los ensayos de promotor-indicador en el ejemplo 8. El SNP de promotor en la posición T-370G confiere niveles aumentados de la proteína CYP2C8 (150%), mientras que los polimorfismos G-1207A y delAT -640 a -641, por el contrario, muestran una expresión de proteínas reducida (72%). En combinación con los SNP G-1207A y delAT -640 a -641, o C104G solamente, el polimorfismo T-370G influye de forma diferencial en los niveles de proteína como se indica por la flecha. En la presente memoria, la presencia de dos SNP con una frecuencia significativa conduce a efectos combinados. Por lo tanto, las consideraciones para una predicción de fenotipo fiable como resultado del genotipado deben depender de múltiples análisis de SNP. Los datos indican que el SNP en la posición -370, que por sí mismo es responsable de la regulación positiva del nivel de proteína CYP2C8, no muestra un aumento significativo de CYP2C8 si se combina con los SNP G-1207A y delAT -640 a-641 (5'UTR), que por sí mismos reducen la expresión. El nivel de expresión combinada del 119% apenas es

5 superior al de la situación del tipo salvaje homocigoto. Al revés, en combinación con el alelo C104G (exón 5), la expresión aumentada debida al SNP en la posición -370 se compensa por el SNP C104G a niveles de expresión normales (97%) en comparación con el tipo salvaje. Esto refleja el fuerte impacto del SNP C104G sólo sobre el nivel de proteína (véase la

10 figura 1). El SNP C104G representa por lo tanto un alelo para la regulación negativa.

Tabla 6:

Genotipo (por detección de los SNPenumerados): Niveles de CYP 2C8 (%) Efectos

Tipo salvaje: 100 No

G-1207A, delAT -640 a -641 (5'UTR): 72 

T-370G (5'UTR): 150 

G-1207A, delAT -640 a -641 y T-370G (5'UTR): 119 

T-370G (5'UTR) y aa I264M (exón 5): 97 

No se detectó ninguna muestra con cambio aa I264M o G-1207A, delAT -640 a -641 (5'UTR) e I264M.

Ejemplo de Referencia 10:

15 Relevancia farmacogenética de los polimorfismos de CYP2C8 en la posición 329 (exón 3, Thr 159 Pro), 309 (exón 6, Glu 274 codón de terminación) y 1135 (exón 7, Gly 365 Ser) [0117]

Tabla 1 Secuencias de cebadores para la generación de fragmentos de PCR de CYP2C8

Todas las localizaciones de cebadores se refieren a cóntigos diferentes de la base de datos HTGS, Nº de Acceso de GeneBank AL359672.10. Los fragmentos de PCR en el

5'UTR son solapantes.

Nombre de fragmento de PCR

Cóntigo

5'UTR Fragm. 1

5'UTR Fragm. 2

5'UTR Fragm. 3

Cebador de secuenciación

5'UTR Fragm. 4

Exón 1

Exón 2

Exón 3

Cóntigo

Exón 4

Alternativo

Cóntigo

Exón 5

Cóntigo

Tamaño de Localización de fragmento de exón espec. de PCR (pb) cóntigo.

115244-120972 (5629 pb) 537 534

545

751

483 -2486

472 2487-2654

457 4198-4360

328 4532-4681

78619-85206 (6588 pb) 541 1378-1538

AF136834.2

138518-143654 (5137pb) 583 1319-1495

85307-115243 (29937pb)

Posición del: Secuencia del cebador

cebador: (5'-3')

120439-20416: ATT TTA GTC AAT

directo:: CTT GGT GGC CCG

TTC AAC AGA AGA

119902-119926: TGG AAC ACA GGGA

inverso:

120004-1199980: TCA TGA CCA TTG

directo:: ACT ATC AGT TCCC

119460-119483: TGA TAC CCA TTG

inverso:: GGG TTC ATT ACC

119576-119552: AAC AGA GTC AAG

directo:: GTG GCG TAT CTTC

118826-118854: CAA TAT TCT CAG

inverso:: ATT AAT GAC CAG

TTG GG

118938-118963: AGA CTT AGC CCT

TGA TAA CAA AAG

CC

119008-181982: GTT TAG GCA GCT

directo:: GTA TTT TAA GTG

AAC

118526-118550: ACT CCA AAG TTT

inverso:: TTA TAA CAC TCC

C

118687-118664: GGC ACT GGA AAG

directo:: AAG GAG TAG GAC

118216-118242: GAT CTA TTA TAA

inverso:: TAG TGT GCT TCC

AGG

116999-116978: TTG TGT ACC AAT

directo:: TGC CTG GGT C

116543-16566: TTT TTA GGG CTC

inverso:: TGT TTT CCA TCC

116531-116508: GAG CTT AGC CTA

directo:: TCT GCA TGG CTG

116204-116223: ACC TGG CCA CCC

inverso:: CTG AAA TG

83947-83970: TCC ATG CTG ATT

directo:: TTT TTT GGA CAC

44-67

83429-83450: CTG ACC CCT TGC

inverso:: ACT TCT GAT G

139593-139617: TGA CGA GTT ATT

directo:: GGG TGC AGT ACA

C

140176-140154: TTC CAT GAT GTT

inverso:: TAG TGC AGG CC

5'UTR son solapantes.

Nombre de Tamaño de fragmento de fragmento de PCR PCR (pb)

Exón 6 519

Exón 7 328

Exón 8 462

Exón 9/3'UTR 543

Localización de exón espec. de cóntigo.

8875-9016

11749-11936

15788-15929

17526 -17707

Posición del: Secuencia del cebador

cebador: (5'-3')

93884-93903: TTG AAG TAA GAC

directo:: AGG GCA TCG G

94402-93379: AGA AAC AAG GTG

inverso:: GAG GAT ACT GGC

96986-97009: GGC CAT GAA TTG

directo:: CTA TGA CAA ATG

97313-97290: GGT TGG AAC CAA

inverso:: ACC AGC ACT ATG

100976-100997: CTG GCT GGA CCT

directo:: GAG TTT CCT C

101437-101418: TTA ACT CCT GCA

inverso:: AGC CCC GC

102630-102652: GTA CAT TTG TTT

directo:: GTC CCA CCA TCC

103172-103149: TGC AGT GAC CTG

inverso:: AAC AAC TCT CCT

imagen1

Tabla 3 Comparación de las frecuencias alélicas (%) de las poblaciones

analizadas (cálculos basados en la ley de Hardy-Weinberg).

SNP (-: respecto a

ATG)

(Nº de Acceso de: Caucásico Japonés Afroamericano Localización

GeneBank véase,

texto s.)

(-1731) -(-1732): 1,3 n.d. 11,7 5'UTR

-1627: n.d. n.d. 16,6 5'UTR

-1478: n.d. n.d. 2 5'UTR

-1325: n.d. n.d. 1,4 5'UTR

-1221: n.d. 1,6 n.d. 5'UTR

-1214: 4,3 n.d. n.d. 5'UTR

-1207: 13,5 n.d. 3,75 5'UTR

-1159: n.d. n.d. 1,1 5'UTR

-1152: 3,05 n.d. n.d. 5'UTR

-980: n.d. n.d. 1,2 5'UTR

(-765) -(-767): n.d. n.d. n.d. 5'UTR

(-640)-(-641): 10,35 n.d. 4,5 5'UTR

-411: 14 37,8 17,4 5'UTR

-370: 19,2 29,7 3,2 5'UTR

-271: 23,3 5,7 3,2 5'UTR

-248: n.d. n.d. 3,2 5'UTR

-151: n.d. n.d. 1,6 5'UTR

-133: n.d. n.d. 2,2 5'UTR

-86: n.d. n.d. 1,2 5'UTR

171: 1,4 n.d. n.d. Intrón 1

258: n.d. n.d. 1,6 Intrón 1

122*: Intrón 2

150: n.d. n.d. 11,6 Intrón 2

180-181: 30,8 51,1 47,8 Intrón 2

182: n.d. n.d. 2,3 Intrón 2

270: 12 n.d. 4,5 Exón 3

334: n.d. n.d. 15,9 Exón 3

378: 14,6 n.d. 4,5 Intrón 3

87: 6,1 1,3 3,2 Intrón 3

162: 1,2 n.d. n.d. Intrón 3

163: 24,2 2,6 25,8 Intrón 3

243§: Exón 4

13: n.d. n.d. 1,6 Exón 4

180: 24,4 1,2 26,4 Intrón 4

116: 29,6 46,4 7,4 Intrón 4

132: 4,7 n.d. 7,4 Intrón 4

172: 24,6 51,2 24,1 Intrón 4

189: 2,6 n.d. n.d. Intrón 4

42: n.d. n.d. 1,9 Exón 5

101: n.d. 1,1 n.d. Exón 5

104: 5 n.d. 1,7 Exón 5

117: n.d. n.d. 14,2 Exón 5

1135: n.d. n.d. 1,2 Exón 7

206: 11,4 n.d. 3,2 Exón 8

30: n.d. 7,3 n.d. Exón 8

SNP (-: respecto a

ATG)

(Nº de Acceso de: Caucásico Japonés Afroamericano Localización

GeneBank véase,

texto s.)

87: n.d. n.d. 2,17 Exón 8

167: 6,3 n.d. 5,6 Intrón 8

197: 23 51,2 41,1 Intrón 8

212: 1,3 n.d. n.d. Intrón 8

221: n.d. 3,7 n.d. Intrón 8

255: n.d. n.d. 1,1 Intrón 8

271: 2,1 n.d. 1,7 Intrón 8

118: 26,4 n.d. 44,4 Intrón 8

44: 22,3 53 n.d. 3'UTR

* - se ha detectado en una muestra de una exploración previa (muestra caucásica). § - se ha detectado en una muestra fenotipada (muestra caucásica). n.d.-no detectado en las muestras analizadas.

Tabla 4 Lista de todos los cambios de aminoácidos en las regiones codificantes

Met Gly Lys Arg Ser Ile Glu: s001.txt Exón 3

Met Gly Lys Lys Ser Ile Glu: s002.txt

Glu Leu Arg Lys Thr Lys Ala: s376.txt Exón 3/4

Glu Leu Arg Lys Pro Arg Leu: s377.txt

Arg Lys Thr Lys Ala Ser Pro: s003.txt Exón 3/4

Arg Lys Thr Lys Ala Ser Pro: s004.txt

Ile Cys Ser Val Val Phe Gln: s005.txt Exón 3

Ile Cys Ser Ile Val Phe Gln: s006.txt

Ala Ile Leu Asn Ser Pro Trp: s007.txt Exón 4

Ala Ile Leu Ser Ser Pro Trp: s008.txt

Arg Ser Tyr Ile Arg Glu Lys: s009.txt Exón 5

Arg Ser Tyr Val Arg Glu Lys: s010.txt

Pro Arg Asp Phe Ile Asp Cys: s011.txt Exón 5

Pro Arg Asp Leu Ile Asp Cys: s012.txt

Arg Asp Phe Ile Asp Cys Phe: s013.txt Exón 5

Arg Asp Phe Met Asp Cys Phe s014.txt

Cys Phe Leu Ile Lys Met Glu: s015.txt Exón 5

Cys Phe Leu Phe Lys Met Glu: s016.txt

Met Glu Gln Glu Lys Asp Asn: s378.txt Exón 6

Met Glu Gln TERMINACIÓN: s379.txt

Val Pro Thr Gly Val Pro His: s017.txt Exón 7

Val Pro Thr Ser Val Pro His s018.txt Gln Asp Arg Ser His Met Pro s380.txt Exón 7 Gln Asp Arg Ile His Met Pro s381.txt

His Asp Asp Lys Glu Phe Pro s019.txt Exón 8

His Asp Asp Arg Glu Phe Pro s020.txt Phe Asp Pro Gly His Phe Leu s021.txt Exón 8 Phe Asp Pro Gly His Phe Leu s022.txt Met Pro Phe Ser Ala Gly Lys s023.txt Exón 8 Met Pro Phe Ser Ala Gly Lys s024.txt

LISTA DE SECUENCIAS

[0118]
5 <110> EPIDAUROS Biotechnologie AG PENGER, Anja SPRENGER, Reimund BRINKMANN, Ulrich
10 <120> Polimorfismos en el gen humano para el polipéptido 2C8 del citocromo P450 y su uso en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico
<130> F 1754 PCT
15 <150> EP 01 11 2899.8
<151> 01-06-2001
<160> 417
<170> Patentln Ver. 2.1 20
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REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patente citados en la descripción

imagen1

Bibliografía no relativa a patentes citada en la descripción

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Claims

Reivindicaciones

1. Polinucleótido CYP2C8 que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en:

(a)

un polinucleótido que tiene la secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº: 132;

(b)

un polinucleótido capaz de hibridar con un gen de CYP2C8, en el que dicho polinucleótido tiene una sustitución de nucleótido en la posición correspondiente a la posición 1668 del gen de CYP2C8, según se depositó con el Nº de acceso de GeneBank: AF136830.1; y

(c)

un polinucleótido capaz de hibridar con un gen de CYP2C8, en el que dicho polinucleótido tiene una G en la posición correspondiente a la posición 1668 del gen de CYP2C8, según se depositó con el Nº de acceso de GeneBank: AF136830.1.
2.

Polinucleótido de la reivindicación 1 que es ADN o ARN.
3.

Gen que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1.
4.

Gen de la reivindicación 3, en el que una sustitución de nucleótido da como resultado una expresión alterada del gen variante de CYP2C8 en comparación con el gen de tipo salvaje de CYP2C8 correspondiente.
5.

Vector que comprende un polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 o el gen de la reivindicación 3 ó 4.
6.

Vector de la reivindicación 5, en el que el polinucleótido está unido operativamente a secuencias de control de la expresión que permiten su expresión en células procariotas o eucariotas o fracciones aisladas de las mismas.
7.

Célula hospedadora modificada por ingeniería genética con el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2, el gen de la reivindicación 3 ó 4 o el vector de la reivindicación 5 ó 6.
8.

Animal transgénico no humano que comprende al menos un

polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2, el gen de la reivindicación 3 ó 4 o el vector de la reivindicación 5 ó 6.
9.

Animal transgénico no humano de la reivindicación 8, que es un ratón, una rata o un pez cebra.
10.

Soporte sólido que comprende uno o una pluralidad de polinucleótidos de la reivindicación 1 ó 2, el gen de la reivindicación 3 ó 4, el vector de la reivindicación 5 ó 6 o la célula hospedadora de la reivindicación 7 en forma inmovilizada.
11.

Soporte sólido de la reivindicación 10, en el que dicho soporte sólido es una membrana, un chip de vidrio o propileno o silicio, son perlas conjugadas con oligonucleótidos o una matriz de perlas, que se ensamblan sobre un sustrato de filtro óptico.
12.

Procedimiento in vitro para predecir efectos farmacológicos no deseados de fármacos que son metabolizados por CYP2C8, que comprende determinar la presencia de un polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 o del gen de la reivindicación 3 ó 4 en una muestra de un sujeto.
13.

Procedimiento de la reivindicación 12, que comprende técnicas de PCR, reacción en cadena de la ligasa, digestión de restricción, secuenciación directa, amplificación de ácido nucleico o técnicas de hibridación.
14.

Procedimiento de detección del polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 o el gen de la reivindicación 3 ó 4 en una muestra, que comprende las etapas de:

(a)

poner en contacto el soporte sólido de la reivindicación 10 u 11 con la muestra en condiciones que permitan la interacción del polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2 o del gen de la reivindicación 3 ó 4 con las dianas inmovilizadas en un soporte sólido; y

(b)

determinar la unión de dicho polinucleótido o dicho gen a dichas dianas inmovilizadas en un soporte sólido.
15.

Procedimiento in vitro para predecir efectos farmacológicos no deseados de fármacos que son metabolizados por CYP2C8, que comprende las etapas del procedimiento de la reivindicación 14, en el cual la unión de dicho polinucleótido o gen a dichas dianas inmovilizadas en dichos soportes sólidos es indicativa de la presencia o ausencia de dichos efectos farmacológicos no deseados de fármacos que son metabolizados por CYP2C8.
16.

Composición diagnóstica que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2, el gen de la reivindicación 3 ó 4 o el vector de la reivindicación 5 ó 6.
17.

Composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2, el gen de la reivindicación 3 ó 4 o el vector de la reivindicación 5 ó 6.
18.

Uso del polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2, el gen de la reivindicación 3 ó 4 o el vector de la reivindicación 5 ó 6 para la preparación de una composición diagnóstica para predecir efectos farmacológicos no deseados de fármacos que son metabolizados por CYP2C8.
19.

Kit de diagnóstico para la detección de un polimorfismo de un solo nucleótido, que comprende el polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2, el gen de la reivindicación 3 ó 4 o el vector de la reivindicación 5 ó 6, la célula hospedadora de la reivindicación 7 o el soporte sólido de la reivindicación 10 u 11.