DE10002446A1 - Genchip für ein Neugeborenen Screening - Google Patents

Abstract

Nukleotidträger mit einer Auswahl von Oligonukleotidsequenzen für den Nachweis von für mindestens zwei Phänotypen relevanten Referenzsequenzen, bzw. deren funktionell charakterisierten Mutationen, wobei die Oligonukleotidsequenzen identisch oder komplementär zu den Referenzsequenzen sind.

Description

Die Erfindung betrifft einen Nukleotidträger für kombinierte Oligonukleotide mit einer Auswahl von Oligonukleotiden zum Nachweis bestimmter Gense­ quenzen.

Hybridisierungstechniken, d. h. die gezielte Anlagerung zweier komplementä­ rer Nukleinsäuren aneinander, stellen einen wesentlichen Schritt in einer Vielzahl molekularbiologischer Verfahren dar. Mit diesen Techniken werden einzelne Gene oder Teile davon in einer Präparation genomischer DNA oder das Transkriptionsprodukt eines Genes (mRNA) nachgewiesen [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed., vol. 2, 1989, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 13.96-97; Constanzi C, Gillespie D: Fast blots: immobilization of DNA and RNA from cells. In: Guide to molecular cloning techniques. Edited by Berger SR and Kimmel AR, Academic Press Inc., San Diego: Methods in Enzymo­ logy 1987, 152: p582-87; Schena M et al.: Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 1995; 270: p467-470].

Eine der wichtigsten Anwendung der Hybridisierung ist die Untersuchung von Veränderungen oder Mutationen einzelner Gene [Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DE, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. (Hrsg.) Current protocols in molecular biology, 1998, John Wiley & Sons].

Üblicherweise wird eine Hybridisierung mit einer Nachweisreaktion und an­ schließender Identifizierung einer Nukleinsäuresequenz kombiniert. Dazu wird ein Nukleinsäurestrang beispielsweise durch Farbstoffe, Radioaktivität oder chemolumineszierende oder fluoreszierende Moleküle markiert, wäh­ rend der zweite an eine festen Phase gebunden ist. In den häufig ange­ wandten Southern-Blots für DNA-Analysen und Northern-Blots für RNA- Analysen wird die feste Phase meist entweder durch Nitrozellulose- oder Nylonmembranen gebildet.

In diesen herkömmlichen Blot-Systemen wird genomische DNA oder RNA, die sogenannten Targetsequenzen - über ein Agarosegel elektrophoretisch getrennt, auf die Nitro- oder Nylonmembran transferiert und mit einer be­ kannten DNA- bzw. RNA-Sequenz als Sonde hybridisert. Die Hybridisierung wird durch eine vorherige Markierung der Sonde nachgewiesen und ggf. quantifiziert. Diese Verfahren sind durch eine hohe Spezifität gekennzeich­ net. Sie besitzen aber den Nachteil, daß die Durchführung eines Blotvor­ gangs sehr arbeits- und zeitintensiv ist, und in einem Durchgang jeweils nur wenige Sequenzen gleichzeitig untersucht werden können.

Das Hybridisieren einer Sonde mit einem Target kann neuerdings auch durch sogenannte Genchips erfolgen [Lockhart DJ, Dong H, Byrne MC, Fol­ lettie MT, Gallo MV, Chee MS, Mittmann M, Wang C, Kobayashi M, Horton H and Brown EL. Expression Monitoring by Hybridization to High-Density Oli­ gonucleotide Arrays. Nature Biotechnology. 14: 1675-1680, 1996; Wodicka L, Dong H, Mittmann M, Ho MH, and Lockhart DJ. Genome-Wide Expression Monitoring in Saccharomyces Cerevisiae. Nature Biotechnology. 15: 1359-1367, 1997]. Genchips bestehen aus einem festen Träger aus bei­ spielsweise einem Kunstoff oder Glas, auf den bis zu mehrere tausend Oli­ gonukleotide als Sonden aufgebracht werden können. So wird die Oberflä­ che des nur wenige Quadratzentimeter großen Chips mit einem "Rasen" von Oligonukleotide bedeckt, mit denen die komplementären Nukleinsäurese­ quenzen einer DNA oder RNA-Probe hybridisieren können. Die Targetse­ quenzen werden zuvor markiert, um den späteren Nachweis der Hybridisie­ rung zu erbringen.

Die Verwendung von Genchips erlaubt die Untersuchung mehrerer tausend verschiedener Sequenzen zur gleichen Zeit und stellt gegenüber den her­ kömmlichen Blot-Verfahren somit eine Verbesserung dar. Weiterhin kann die Hybridisierung auf dem Chip über einen Scanner ausgewertet werden, so daß sich das Verfahren weitgehend automatisieren läßt.

Für die Herstellung von Genchips oder genkombinatorischen Untersu­ chungsmitteln sind verschiedene Techniken entwickelt worden, beispiels­ weise lithographische Verfahren, Siebdruck- oder Reaktionskanalverfahren, elektrochemische/-synthetische Verfahren, ink-jet-Systeme, micropin-Verfah­ ren oder open capillary tips. Auch ist die Verwendung von Microbeads be­ kannt [Lackner KJ et al. Multiplex DNA- und RNA-Analyse an fluoreszenten Microbeads als Alternative zum DNA-Array. Statusseminar Chiptechnologie für DNA-Diagnostik und Sequenzanalyse in Deutschland. DECHEMA 1999].

Mutationen in Genen können durch Sequenzierung der genetischen Information identifiziert werden (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463-5467, 1977). Die Sequenzierung von Nukleinsäuren ist in der Regel sehr aufwendig, so daß in der Praxis Mutationen meist indirekt, d. h. über die Untersuchung ihrer biochemischen und/oder physiologischen Auswirkungen durch biochemische (z. B. enzymgebundene Immunmessverfahren), analy­ tische (z. B. Hochleistungsflüßigkeitschromatographie, Gaschromatographie, oder Massenspektrometrie) oder bakteriologische (sog. Guthrie Wachstumsinhibitionstest) Verfahren nachgewiesen werden.

Diese Vorgehensweise hat den Nachteil, daß Mutationen oftmals erst nach dem Ausprägen der durch sie bedingten Stoffwechselstörungen oder Krank­ heitsbilder erkannt werden und infolgedessen mögliche therapeutische oder kurative Eingriffe erst zu einem späten Zeitpunkt gewählt und eingesetzt werden können. Unter Umständen sind dann bereits irreversible Schädigun­ gen entstanden.

Um das Ausbilden der Krankheitssymptome weitgehend zu vermeiden, muß die Zeitspanne zwischen der Diagnose des Gendefekts und dem Beginn der Therapie bzw. Präventionsmaßnahme möglichst kurz gehalten werden. Dies kann geschehen, indem die Mutationen direkt, d. h. auf der Ebene der Nu­ kleinsäuren, nachgewiesen werden. Dies sollte möglichst noch im frühen Kindesalter erfolgen.

Neben der Sequenzierung kann die Identifikation genetischer Aberrationen durch die - bereits dargestellte - Hybridisierung erfolgen. Diese hat den Vor­ teil, daß die Verwendung von Genchips möglich ist und so die Effekte der automatisierten Auswertetechniken genutzt werden können.

Aus der US-Patentschrift 5 837 832 ist ein DNA-Chip bekannt, mit dessen Hilfe bekannte Sequenzen auf mögliche Mutationen gesichtet werden kön­ nen. Dazu wird zunächst eine zu der in Frage stehenden sogenannten Refe­ renzsequenz komplementäre Sequenz - die sogenannte Wildtyp-Sequenz - in Abschnitten einer Länge von jeweils vorzugsweise 12 bis 18 Basenpaaren synthetisiert, sowie Sequenzen, die jeweils nur in einer einzigen Base von diesen Widtyp-Sequenzabschnitten abweichen. Die Anzahl dieser sog. Sub­ stitutionssequenzen entspricht der Anzahl der theoretisch möglichen Muta­ tionen durch je eine Basensubstitution.

Anschließend werden die Sequenzen in einem definierten Muster auf den Chip vorzugsweise derart aufgebracht, daß sie Blöcke mit je fünf nebenein­ ander liegenden Reihen bilden. Diese beinhalten je eine Wildtyp-Sequenz und in paralleler Anordnung dazu drei Substitutionssequenzen mit jeweils einer der ausgetauschten Base. Eine fünfte Sequenz entspricht wiederum der Wildtypsequenz. Demnach werden fünf Reihen und Sequenzen benötigt, um alle theoretisch möglichen Basenaustausche in einem einzigen Nukleotid innerhalb der Sequenz darzustellen.

In der US-Patentschrift 5 837 832 werden nach diesem Schema menschliche Gene auf Mutationen untersucht, beispielsweise bestimmte Exons des im Zusammenhang mit der Cystischen Fibrose diskutierten Gens CFTR oder des Tumorsurpressorgens p53, dessen Mutationen mit dem Entstehen von Krebserkrankungen assoziiert sind.

Der Nachteil dieser Vorgehensweise liegt darin, daß schon bei relativ kurz­ kettigen Genen mehrere 10.000 bis 100.000 verschiedene Sequenzen als potentielle Hybridisierungsstellen auf den Genchip aufgebracht werden müs­ sen, um das gesamte theoretisch mögliche Mutationsspektrum abzudecken. Mit der Erhöhung der Sequenzlänge des zu untersuchenden Gens oder Genabschnitts oder einer simultanen Untersuchung zweier oder mehrerer Gene bzw. Genabschnitte erreicht die für ein sinnvolles Screening erforderli­ che Anzahl von Hybridisierungsstellen eine die Herstellung und Umsetzung eines entsprechenden Genchips sprengende Größenordnung.

Sollten z. B. die derzeit ca. 40.000 für die genetische Untersuchung interes­ santen menschlichen Gene mit Hilfe des dargestellten Prinzips gesichtet werden, wäre ein Genchip mit wenigstens 4 × 10⁸ Hybridisierungsstellen er­ forderlich. Das Herstellen eines solchen Chips ist nach dem heutigem Stand der Technik und selbst mit den sich darin abzeichnenden Entwicklungen nicht realisierbar. Entsprechend läßt sich eine umfassende frühzeitige und schnelle Untersuchung von Gendefekten in praktisch relevantem Umfang nicht durchführen.

Der Erfindung liegt demnach die Aufgabe zugrunde, einen Nukleotidräger für kombinierte Oligonukleotide und eine Auswahl von Sequenzen für einen Nu­ kleotidräger für kombinierte Oligonukleotide oder ein ähnliches genkombi­ niertes Untersuchungsmittel, insbesondere für ein Neugeborenen Screening, bereitzustellen, durch das/die die Überprüfung des genetischen Zustandes einer definierten Kombination krankheitsrelevanter Gene bzw. Genabschnitte (Referenzsequenzen) möglich wird.

Die Aufgabe wird gelöst durch die in den unabhängigen Ansprüchen ange­ gebenen Merkmale. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteran­ sprüchen wiedergegeben.

Die Aufgabe wird im einzelnen gelöst durch einen Nukleotidträger (im fol­ genden "Genchip") mit einer Auswahl von Oligonukleotiden mit funktionell charakterisierten, bekanntermaßen bestimmte Phänotypen verursachenden Mutationen. Diese Oligonukleotide können identisch oder komplementär zu den Referenzsequenzen sein.

Die mutierten Oligonukleotide werden erfindungsgemäß gezielt aus dem Spektrum aller theoretisch möglichen Mutationen der Referenzsequenzab­ schnitte ausgewählt und kombiniert.

Die derart ausgewählten, einen spezifischen Phänotypen verursachende Mutationen sind mit mindestens einem zweiten Phänotypen begründenden Oligonukleotiden auf dem Genchip aufgebracht.

Der Begriff Phänotyp ist dabei weit definiert und bezieht sich auf alle Aus­ prägungen, Erscheinungsformen und Konsequenzen, die mit einer ausge­ wählten Referenzsequenz assoziiert sind oder über einen Nachweis dieser Sequenzen nachgewiesen werden können.

Den Phänotypen kann dabei beispielsweise eine Körperfunktion, eine phy­ siologische Funktion, z. B. eine Stoffwechselstörung, oder eine genetisch be­ dingte Disposition zu einer Krankheit im medizinischen Sinne, z. B. einer be­ stimmten Krebsform, darstellen.

Der erfindungsgemäße Chip hat den erheblichen Vorteil, daß jeweils nur eine begrenzte Anzahl von Hybridisierungsstellen erforderlich ist, so daß ein sinnvoller, in der medizinischen Praxis nutzbarer Einsatz des Genchips in den sich der Hybridisierungsreaktion anschließenden Analysen möglich ist.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Genchip besteht darin, daß eine schnelle, kostengünstige und vor allem zuverlässige Untersuchungsmethode bereitgestellt wird, deren Sensitivität diejenige herkömmlicher physiologi­ scher Methoden übersteigt.

Eine besonders bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung ermöglicht die Überprüfung genetischer Zustände im pränatalen und neonatalen Bereich.

Bei einem Screeningprogramm für Neugeborene lassen sich eine Vielzahl genetisch bedingter Stoffwechselerkrankungen unter Verwendung einer ge­ ringen Menge Bluts erfassen. Erfindungsgemäß kann eine Auswahl von Oli­ gonukleotiden für mindestens zwei oder mehr beispielsweise der folgenden Erkrankungen auf einem Chip zusammengestellt werden:
Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Galaktosämie, Homocystinurie, Bioti­ nidase-Mangel, Mittelkettiger Acyl-CoA-Dehydrogenase-Mangel, familiäre Hypercholesterinämie, familiär defektes Apolipoprotein-B, zystische Fibrose, Marfan-Syndrom, Smith-Lemli-Opitz-Syndrom, Adrenogenitales Syndrom.

Besonders bevorzugt ist ein Chip mit Oligonukleotiden für die Erkrankungen "Phenylketonurie" und "Galactosämie". Dieser wird vorzugsweise des weite­ ren kombiniert mit Oligonukleotiden für "Biotinidase-Mangel".

Die genannten Erkrankungen werden durch Mutationen auf insgesamt 21 definierten Genen verursacht, die inklusive der funktionell relevanten regu­ latorischen Bereiche etwa 150.000 Nukleotide umfassen. Da jedes Nukleotid jeweils mit einer der vier Basen Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin vorlie­ gen kann, und auch Insertionen, Deletionen oder Inversionen berücksichtigt werden müssen, ergeben sich etwa 900.000 verschiedene Mutationsmög­ lichkeiten. Werden des weiteren komplexere Mutationen, wie z. B. soge­ nannte kleine Indels (Insertionen/Deletionen) einbezogen, ergeben sich schnell mehrere Millionen verschiedener Mutationen.

Ein Genchip nach dem Stand der Technik müßte demnach mehrere Millio­ nen dazu korrespondierender Hybridisierungsstellen aufweisen. Eine solche Anzahl von Sequenzen kann auf den bekannten Genchips nicht sinnvoll un­ tergebracht und ausgewertet werden.

Durch die erfindungsgemäße Auswahl von Oligonukleotiden können die für den Nachweis der Erkrankungen auf einem Genchip erforderlichen Sequen­ zen, d. h. Hybridisierungsstellen auf etwa 5.000 reduziert werden. Damit ist eine simultane Mutationsdetektion auf nur einem einzigen Genchip möglich.

Es ist auch möglich, unter den für den Nachweis der oben aufgeführten Er­ krankungen erforderlichen Oligonukleotiden wiederum eine Auswahl zu tref­ fen und nur eine oder wenige der Erkrankungen zu diagnostizieren.

Bei diesen in dieser besonderen Ausführungsform diagnostizierten Erkran­ kungen handelt es sich um eine gezielte Auswahl der wichtigsten genetisch bedingten Erkrankungen des Menschen. Ihre Auswahl erfolgt des weiteren nach den Kriterien der Behandelbarkeit und der signifikanten Häufigkeit in der Bevölkerung. Ferner sind sie im wesentlichen auf bereits bekannte Mu­ tationen zurückzuführen. Es wurde dabei die funktionell charakterisierten Mutationen kombiniert, die jeweils 90 bis 95% der beobachteten tatsächli­ chen Erkrankungen verursachen.

Nach diesem Prinzip können jedoch auch weitere Erkrankungen, deren ge­ netische Ursachen bekannt sind, allein oder in Kombination nachgewiesen werden.

Ebenso ist es möglich, Krankheiten oder Phänotypen bei anderen Organis­ men, z. B. bei Tieren, zu identifizieren oder nachzuweisen.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Beispiels einer Auswahl von Erkrankungen des näheren erläutert:

Dem erfindungsgemäßen Genchip und der erfindungsgemäßen Auswahl liegen Oligonukleotide zum Nachweis von Referenzsequenzen, also auch dazu komplementären Sequenzen zugrunde, die auf 21 Genen des mensch­ lichen Genoms liegen. Es handelt sich dabei im einzelnen um folgende Se­ quenzen, die in ihrem Code der Genbank des National Center for Biotech­ nology Information (NCBI) angegeben sind. Die zu diagnostizierenden Er­ krankungen sind jeweils in Klammern angegeben:

• 1. Phenylalaninhydroxylase, PAH (Diagnose der Phenylketonurie) [GenBank-Nummern: K03020, NM 000277, L47726, U49897].
• 2. Quinoid Dehydropteridin Reduktase, QDPR (Diagnose der Phenylketonu­ rie) [GenBank-Nummern: NM 000320, M16447, X04882].
• 3. Mitochondriale verzweigtkettige alpha-Ketosäuredehydrogenase, α-Pep­ tid, BCKDHA (Diagnose der Ahornsirupkrankheit) [GenBank-Nummer: Z14093].
• 4. Mitochondriale verzweigtkettige alpha-Ketosäuredehydrogenase, β-Pep­ tid, BCKDHB (Diagnose der Ahornsirupkrankheit) [GenBank-Nummer: M55575].
• 5. Verzweigtkettige Dihydrolipoamid-Transacylase, DBT (Diagnose der Ahornsirupkrankheit) [GenBank-Nummer: X66785].
• 6. Galaktose-1-Phosphat Uridyltransferase, GALT (Diagnose der Galak­ tosämie) [GenBank-Nummern: M60091, NM 000155; L46354 bis 46365, L46691 bis 46724].
• 7. Galaktokinase, GALK1 (Diagnose der Galaktosämie) [GenBank-Num­ mern: NM 002044, NM 000154, L76927, U26401, M84443].
• 8. UDP-Galaktose-4-Epimerase, GALE (Diagnose der Galaktosämie) [GenBank-Nummer: L41668] (Diagnose von Galaktosämie).
• 9. Cystathion-beta-Synthase, CBS [GenBank-Nummern: NM 000071, L14577, X98810 bis X98823, X88562, X87815, X87816, X91910].
• 10. Methyltetrahydrofolat-L-Homocystein-S-Methyltransferase, MTR (Diagnose von Homocystinurie) [GenBank-Nummer: AF025794, NM 002454].
• 11. 5,10-Methylentetrahydrofolat Reduktase (NADPH), MTHFR (Diagnose von Homocystinurie) [GenBank-Nummern: U09806, AF105988 bis AF105998].
• 12. Biotinidase, BTD (Diagnose eines Biotinidase-Mangels) [GenBank-Num­ mern: U63274, U03274].
• 13. Mittelkettige Acyl-CoA-Dehydrogenase, ACADM (Diagnose eines Mittel­ kettigen Acyl-CoA-Dehydrogenase-Mangels) [GenBank-Nummern: M16827, M91422 bis M91432, NM 000016].
• 14. Low-Density-Lipoprotein Rezeptor, LDLR (Diagnose der familiären Hy­ percholesterinämie) [GenBank-Nummern: NM 000527, L00336 bis 00352, L29401].
• 15. Apolipoprotein B (Diagnose eines familiär defektem Apolipoprotein B) [GenBank-Nummern: X04506, M14162].
• 16. "Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator", CFTR (Diagnose einer zystischen Fibrose) [GenBank-Nummern: NM 000492, M55131].
• 17. Fibrillin-1, FBN1 (Diagnose eines Marfan-Syndroms) [GenBank-Num­ mern: NM 000138, X63556, L13923].
• 18. "Latent-transformierender Wachstumsfaktor", beta-Bindeprotein-2, LTBP2 (Diagnose eines Marfan-Syndroms) [GenBank-Nummern: Z37976].
• 19. Delta-7-Sterolreduktase, DHCR7 (Diagnose eines Smith-Lemli-Opitz- Syndroms) [GenBank-Nummer: AF034544].
• 20. Sterol 21-Hydroxylase, CYP21 (Diagnose eines Adrenogenitalen Sy­ droms) [GenBank-Nummern: M26856, M13935, M13936].
• 21. Sterol 17-Hydroxlase, CYP17 (Diagnose eines Adrenogenitalen Sy­ droms) [GenBank-Nummern: NM 000102, M14564, M31146].

Der erfindungsgemäße Genchip kann also Oligonukleotid-Sequenzen ent­ halten, die identisch mit den entsprechenden Abschnitten der Referenzse­ quenzen oder aber dazu komplementär sind. Des weiteren können Oligonu­ kleotide aufgebracht werden, die funktionell charakterisierte Mutationen oder dazu komplementäre Sequenzen enthalten. Bei den Mutationen kann es sich um Basensubstitutionen, Insertionen und Deletionen handeln. Ebenso sind komplexere Mutationen wie Inversionen und Indels (als Insertionen/Deletionen) möglich.

Die Länge der auf den Genchip aufgetragenen Oligonukleotide kann 16 bis 25 Nukleotide betragen. Vorzugsweise werden 15 bis 18-Mere verwendet.

Werden die zu den Abschnitten der Referenzsequenz identischen Oligonu­ kleotide auf den Genchip aufgebracht, können die dazu komplementären Sequenzen aus der zu untersuchenden Probe synthetisiert werden. Diese Synthese erfolgt während der für den späteren Nachweis der erfolgten Hy­ bridisierung notwendigen Markierungsreaktion.

Auf den erfindungsgemäße Genchip können sowohl DNA- als auch mit RNA- Sequenzen aufgetragen sein. Entsprechend können Nukleotide mit Uracil Verwendung finden. Ebenso können Basenanaloga eingesetzt werden.

Der erfindungsgemäße Genchip hat den Vorteil, daß er um zukünftig se­ quenzierte und funktionell charakterisierte Oligonukleotide ergänzt werden kann. Im folgenden wird die Erfindung anhand folgender Ausführungsbeispiele des näheren erläutert.

Beispiel 1 DNA-Chip zur Mutationsdetektion der Phenylketonurie (PKU)

Oligonukleotide, die zu Sequenzen der in Tabelle 1 aufgeführten Referenz­ sequenzen komplementär sind, werden mit Hilfe von Standardtechniken, wie sie beispielsweise in der deutschen Patentschrift 196 12 356 oder der US- Patentschrift 5 837 832 beschrieben sind, auf einen geeigneten Träger auf­ gebracht. Dieser besteht vorzugsweise aus mit Gold beschichteten Glas. Die Ologonukteotide weisen eine Länge von 15 Nukleotiden auf. Im Einzelfall sind auch Sequenzen von 16 bis 25 Nukleotiden möglich.

Der Träger wird in eine Vielzahl von Feldern aufgeteilt, die jeweils nur eine eine Mutation umfassende Sequenz enthalten. Dabei sind die Sequenzen innerhalb des Feldes derart positioniert, daß die Mutation relativ zu dem Referenzsequenzabschnitt möglichst zentral liegt.

Für die Diagnose der die Phenylketonurie verursachenden Mutationen im Phenylalaninhydroxylasegen (PHA-Gen) ergeben sich auf dem erfindungs­ gemäßen Genchip insgesamt 548 Felder. Dabei trägt z. B. das Feld 1.1 die Sequenz CAGTGGACATGCTGG, welche komplementär zu dem Referenz­ sequenzabschnitt CCAGCATGTCCACTG ist (Tabelle 1, Zeile 1, Spalte 2) und das Feld 1.2 das entsprechende, mutierte Oligonukleotid CAGTGGATATGCTGG, welches komplementär zu dem mutierten Referenz­ sequenzabschnitt CCAGCATATCCACTG (Tabelle 1, Zeile 1, Spalte 3; Muta­ tion unterstrichen) ist.

Für die Belegung der Felder 2.1 und 2.2 und alle weiteren wird die Sequenz­ information der Zeile 2 der Tabelle 1 fortlaufend entsprechend benutzt.

Tabelle 1

Liste der Nukleinsäuresequenzen, deren komplementäre Sequen­ zen auf den Chip aufgebracht werden. Um die Übersichtlichkeit zu wahren, wird lediglich der zentrale Bereich der 15- bis 25-mere als Ausschnitt ge­ zeigt. Die nicht aufgeführten Sequenzabschnitte sind zu der Referenzsequenz komplementär. Die Position relativ zu der Referenzsequenz ergibt sich aus der Angabe der Codon-Nummer.

Ein zu dem mutierten Referenzsequenzabschnitt komplementäres Oligonu­ kleotid wird an genau definierter Stelle auf den Träger aufgebracht. Die von der Referenzsequenz abweichenden Nukleotide ergeben sich aus der Spalte 3 der Tabelle.

Die in der Tabelle aufgeführten Sequenzinformationen beziehen sich auf die Referenzsequenz mit der GenBank-Nummer U49897. Es sind sowohl Mis­ sense oder Nonsens-Mutationen (Tabelle 1A) als auch Spleißvarianten (Tabelle 1B), Deletionen (Tabelle 1C und 1E); Insertionen (Tabelle 1D), In­ dels und komplexe Rearrangierungen ausgewählt.

A) Missense- oder Nonsense-Mutationen

Spalte 1 gibt die Nummer des von der Mutation betroffenen Kodons auf der Referenzsequenz an. Die letzte Spalte gibt den durch die Mutation codierten Aminosäureaustausch wieder.

B) Spleißvarianten

Die Lage der Oligonukleotide, abgeleitet aus der Referenzsequenz mit der GenBank-Nummer U49897, ergibt sich aus Spalten 1-3. Die Spalte 4 spezifi­ ziert die Mutation.

C) Kleine Deletionen

Die deletierten Nukleotide sind in Kleinbuchstaben dargestellt.

D) Kleine Insertionen

Indels (Insertionen/Deletionen)

55 GCTTATTTGAg_E2/I2_gTCAGTACTA

E) Größere Deletionen

Exon 3 plus flankierende Sequenzen
22 Bp, beginnend mit Nukleotid 593, Kodon 198
22 bp beginnend mit Nukleotid 586, Kodon 196
265 bp, betreffen Exone 5-6
Exone 1-5 plus flankierende Sequenzen
Exone 9-13 plus flankierende Sequenzen
22 bp beginnend mit Nukleotid 589, Kodon 197
Exone 9-11 plus flankierende Sequenzen

F) Komplexe Rearrangierungen

GA-AC Nukleotide 470-471 R157N

Beispiel 2 DNA-Chip für eine Neugeborenen Screening

Ein DNA-Chip wird in der Weise hergestellt wie in Beispiel 1 des näheren ausgeführt. Auch hier werden der 15- bis 18-mere Oligonukleotidsequenzen mit bekannten Techniken auf einen Träger gebracht. Die Oligonukleotide sind dabei komplementär zu den entsprechenden Abschnitten der Referenz­ sequenz bzw. zu den mutierten Sequenzbereichen.

Die Referenzsequenzen liegen auf folgenden Genen:

• 1. Phenylalaninhydroxylase, PAH (Diagnose der Phenylketonurie).
• 2. Quinoid Dehydropteridin Reduktase, QDPR (Diagnose der Phenylketo­ nurie).
• 3. Mitochondriale verzweigtkettige alpha-Ketosäuredehydrogenase, α-Pep­ tid, BCKDHA (Diagnose der Ahornsirupkrankheit).
• 4. Mitochondriale verzweigtkettige alpha-Ketosäuredehydrogenase, β-Pep­ tid, BCKDHB (Diagnose der Ahornsirupkrankheit).
• 5. Verzweigtkettige Dihydrolipoamidtransacylase, DBT (Diagnose der Ahornsirupkrankheit).
• 6. Galaktose-1-Phosphat Uridyltransferase, GALT (Diagnose der Galak­ tosämie).
• 7. Galaktokinase, GALK1 (Diagnose der Galaktosämie).
• 8. UDP-Galaktose-4-Epimerase, GALE (Diagnose der Galaktosämie).
• 9. Cystathion-beta-Synthase, CBS (Diagnose der Homocystinurie).
• 10. 5,10-Methylentetrahydrofolat Reduktase (NADPH), MTHFR (Diagnose der Galaktosämie).
• 11. Methyltetrahydrofolat-L-Homocystein-S-Methyltransferase, MTR (Diagnose der Galaktosämie).
• 12. Biotinidase, BTD (Diagnose eines Biotinidase-Mangels).
• 13. Mittelkettige Acyl-CoA-Dehydrogenase, ACADM (Diagnose eines Mittelkettigen Acyl-CoA-Dehydrogenase-Mangels).
• 14. Low-Density-Lipoprotein Rezeptor, LDLR (Diagnose der familiären Hy­ percholesterinämie).
• 15. Apolipoprotein B (Diagnose eines familiär defektem Apolipoprotein B).
• 16. "Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator", CFTR (Diagnose einer zystischen Fibrose).
• 17. Fibrillin-1, FBN1 (Diagnose eines Marfan-Syndroms).
• 18. "Latent-transformierender Wachstumsfaktor", beta-Bindeprotein-2, LTBP2 (Diagnose eines Marfan-Syndroms).
• 19. Delta-7-Sterolreduktase, DHCR7 (Diagnose eines Smith-Lemli-Opitz- Syndroms).
• 20. Sterol 21-Hydroxylase, CYP21 (Diagnose eines Adrenogenitalen Syn­ droms).
• 21. Sterol 17-Hydroxlase, CYP17 (Diagnose eines Adrenogenitalen Syn­ droms).

Aus diesen Genen sind die in der Tabelle 2 dargestellten Referenzsequen­ zen, die über ihre Codenummer der Genbank des National Center for Bio­ technology Information (NCBI) identifizierbar sind ausgewählt.

Auf den erfindungsgemäßen Genchip für ein Neugeborenen Screening wird eine Auswahl von zu funktionell charakterisierten Mutationen komplementä­ ren Oligonukleotiden aufgetragen. Diese Mutationen sind in den Tabellen 6.1.1. bis 6.12.5 in ihrer Lage auf der Referenzsequenz und den betroffenen Aminosäuren spezifiziert.

Insgesamt sind auf dem für das Neugeborenen Screening eingesetzten Genchip mindestens 3.348 Hybridisierungsstellen zur Diagnose der zwölf häufigsten, behandelbaren Erbkrankheiten vorhanden. Die gemeinsame Präsenz dieser Oligonukleotidsequenzen auf einem Träger erlaubt die si­ multane Diagnostik dieser Erkrankungen aus nur einer Patientenprobe. Des­ halb eignet sich dieser DNA-Chip insbesondere für den Einsatz in neonata­ len oder pränatalen Screeningprogrammen.

Aus Tabelle 4 sind weitergehende Informationen bezüglich der zu diagnosti­ zierenden Erkrankungen zu entnehmen.

Tabelle 2

Beispiel 3 DNA-Chip für die Diagnose eines Biotinidase-Mangels

In diesem Beispiel werden die in der Tabelle 3 aufgelisteten Olinukleotide der Referenzsequenz direkt mit Hilfe der bekannten Standardtechniken auf einen geeigneten Träger aufgebracht. Analog zu Beispiel 1 werden in der Regel 15-mere verwendet, im Einzelfall können jedoch auch 16- bis 25-mere Oligonukleotide zum Einsatz kommen.

Die Sequenzen werden dabei wiederum so gewählt, daß die in der mutierten Referenzsequenz vorhandene Sequenzabweichung relativ zu der Referenz­ sequenz etwa zentral liegt.

Auch hier wird jeweils nur eine Oligonukleotidsequenz auf je ein Feld des Trägers aufgebracht.

Für den Nachweis des Biotinidase-Mangels werden 28 funktionell charakteri­ sierte Mutationen auf den Chip aufgebracht, so daß sich 28 Felder ergeben. Dabei trägt z. B. das Feld 1.1 den Referenzsequenzabschnitt CCAGCATGTCCACTG (Tabelle 1, Zeile 1, Spalte 3), welcher aus der Gen­ sequenz mit der GenBank Nummer U63274 abgeleitet ist, und das Feld 1.2 die entsprechende mutierte Sequenz CAGTGGATATGCTGG (Tabelle 1, Zeile 1, Spalte 4; Mutation unterstrichen).

Für die Belegung der weiteren Felder sind die in der Tabelle 3 aufgeführten Sequenzinformationen der Zeilen 2 bis 14 der Tabelle 3 entsprechend her­ anzuziehen.

Durch Wahl geeigneter Primer aus dem zum kodierenden Strang der Refe­ renzsequenz (auch Sinnstrang genannt) komplementären Strang für die zum Nachweis der Hybridisierung notwendigen Markierungsreaktion wird sicher­ gestellt, daß die markierten Genabschnitte komplementär zu den auf dem Chip aufgebrachten Oligonukleotidsequenzen sind.

Tabelle 3

Die Tabelle 3 enthält eine Liste der Nukleinsäuresequenzen, die auf den Chip zur Diagnose des Biotinidase-Mangels aufgebracht werden. Zur ver­ besserten Übersichtlichkeit wird nur der zentrale Bereich der 15- bis 25-me­ ren Oligonukleotide gezeigt. Die Position ist relativ zu der Referenzsequenz durch die Angabe der Codon-Nummer spezifiziert. Zu jeder mutierten Refe­ renzsequenz wird an genau definierter Stelle auf dem Träger die aus der dritten Spalte ersichtliche normale Referenzsequenz aufgebracht. Die nicht dargestellten Sequenzabschnitte entsprechen der Referenzsequenz.

A) Missense- oder Nonsense-Mutationen

B) Spleißvarianten

Die Lage der Oligonukleotide auf der Referenzsequenz ergibt sich aus Spalten 2-4; Spalte 5 spezifiziert die mutierte Referenzsequenz; Spalte 1: Mutationsnummer)

C) Kleine Deletionen

D) Indels (Insertionen/Deletionen)

CTTTTCCTCTgcggctgTTACGTGGTT tcc

F) Komplexe Rearrangierungen

15 bp Deletion + 11 bp Ins. in Exon D

Claims (11)

1. Nukleotidträger mit einer Auswahl von Oligonukleotidsequenzen, die identisch oder komplementär zu Abschnitten von zu mindestens für zwei genetisch bedingte Phänotypen relevanten Referenzsequenzen sind.

2. Nukleotidträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Auswahl der Oligonukleotide einen signifikanten Anteil aller relevanten Erscheinungsformen eines Phänotypen bestimmt.

3. Nukleotidträger nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Referenzsequenzen aus der Gruppe der Sequenzen mit folgenden GenBank Nummern ausgewählt sind:

• - K03020, NM 000277, L47726, U49897;
• - NM 000320, M16447, X04882;
• - Z14093;
• - M55575;
• - X66785;
• - M60091, NM 000155; L46354 bis 46365, L46691 bis 46724;
• - NM 002044, NM 000154, L76927, U26401, M84443;
• - L41668;
• - NM 000071, L14577, X98810 bis X98823, X88562, X87815, X87816, X91910;
• - AF025794, NM 002454;
• - U09806, AF105988 bis AF105998;
• - U63274, U03274;
• - M16827, M91422 bis M91432, NM 000016;
• - NM 000527, L00336 bis 00352, L29401;
• - X04506, M14162;
• - NM 000492, M55131;
• - NM 000138, X63556, L13923;
• - Z37976;
• - AF034544;
• - M26856, M13935, M13936;
• - NM 000102, M14564, M31146.

4. Nukleotidträger nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Oligonukleotide aus der Gruppe der in den Tabellen 6.1.1 bis 6.12.5 spezifizierten Sequenzen ausgewählt sind.

5. Nukleotidträger nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Oligonukleotide eine Länge von 16 bis 25 Nukleoti­ den, vorzugsweise eine Länge von 15 bis 18 Nukleotiden, aufweisen.

6. Nukleotidträger nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Träger aus mit Gold beschichtetem Glas besteht.

7. Nukleotidträger nach einem oder mehreren der vorhergehenden An­ sprüche gekennzeichnet durch die Kombination von Oligonukleotiden für den Nachweis von Phenylketonurie und Galaktosämie.

8. Nukleotidträger nach Anspruch 7 gekennzeichnet durch Oligonukleotide für den Nachweis von Biotinidase-Mangel.

9. Verwendung des Nukleotidträgers nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur simultanen Diagnose mindestens zweier Erkrankungen aus der Gruppe folgender Erkrankungen:
Phenylketonurie;
Ahornsirupkrankheit;
Galaktosämie;
Homocystinurie;
Biotinidase-Mangel;
Mittelkettiger Acyl-CoA-Dehydrogenase-Mangel;
familiäre Hypercholesterinämie;
familiär defektes Apolipoprotein-B;
zystische Fibrose;
Marfan-Syndrom;
Smith-Lemli-Opitz-Syndrom;
Adrenogenitales Syndrom.

10. Verwendung des Nukleotidträgers nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur neonatalen Untersuchung.

11. Verwendung des Nukleotidträgers nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur pränatalen Untersuchung.