DE69632252T2

DE69632252T2 - Verfahren zur erkennung von klonalen populationen von transformierten zellen in einer genomisch heterogenen zellulären probe

Info

Publication number: DE69632252T2
Application number: DE69632252T
Authority: DE
Inventors: N. Stanley LAPIDUS; P. Anthony SHUBER; M. Kevin ULMER
Original assignee: Exact Sciences Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1995-12-22
Filing date: 1996-12-20
Publication date: 2005-04-14
Anticipated expiration: 2016-12-21
Also published as: JP3325270B2; CA2211702A1; WO1997023651A1; JPH10503384A; ATE264922T1; EP0815263B1; AU711754B2; DE69632252D1; ES2220997T3; AU1430797A; CA2211702C; EP0815263A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft für Krankheitsdiagnostik verwendbare Verfahren durch den Nachweis des Vorkommens genetischer Mutationen, einschließlich Deletionen, in Zellproben mit einem kleinen Bestand von mutiertem Genmaterial, welches in einem größeren Bestand von diagnostisch irrelevantem (normalen) Genmaterial verstreut ist. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind insbesondere beim Nachweis von für Krebs charakteristischen Genmutationen einsetzbar.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Krebs ist eine für genomische Instabilität charakteristische Krankheit. Im allgemeinen charakterisiert eine genomische Instabilität ein weites Spektrum von Brüchen in genomischen Nucleotidsequenzen. Solche Brüche umfassen den Verlust von Heterozygotie (gewöhnlich durch massiven Verlust von chromosomaler DNA gekennzeichnet), Mikrosatelliteninstabilität (gewöhnlich ein Anzeichen für Defekte im DNA-Reparaturmechanismus) sowie Mutationen (welche Insertionen, Deletionen, Substitutionen, Duplikationen, Umlagerungen oder Modifikationen umfassen). Zahlreiche Genominstabilitäten sind mit Krebs in Zusammenhang gebracht worden. Beispielsweise sind Mutationen in einer Anzahl von Onkogenen sowie Tumor-Suppressorgenen in die Tumorentstehung einbezogen worden. Duffy, Clin. Chem., 41: 1410–1413 (1993). Zusätzlich ist der Verlust von Heterozygotie am p53-Tumorsuppressorort mit verschiedenen Krebsarten in Verbindung gebracht worden. Ridanpaa, et al., Path. Res. Pract., 191: 399–402 (1995). Der Verlust oder eine andere Mutation des apc- und dcc-Tumorsuppressorgens ist ebenfalls mit der Tumorentwicklung in Zusammenhang gebracht worden. Blum, Europ. J. Cancer, 31A: 1369–372 (1995). Schließlich wurde die Tumorentstehung auch mit einer Mikrosatelliteninstabilität in Zusammenhang gebracht.
Für Genominstabilität charakteristische genetische Veränderungen können theoretisch als Marker für die Frühphasen von beispielsweise Dickdarmkrebs dienen und lassen sich in DNA, die von biopsiertem Dickdarmepithel und in einigen Fällen aus in die Fäzes ausgeschiedenen transformierten Zellen isoliert wurde, nachweisen. Sidransky, et al., Science, 256: 102–105 (1992).
Die im Stand der Technik vorgeschlagenen Nachweisverfahren sind zeitaufwendig und teuer. Duffy, siehe oben. Darüber hinaus lassen sich die Verfahren gemäß dem Stand der Technik nicht einsetzen, um einen Verlust an Heterozygotie oder eine Mikrosatelliteninstabilität in kleinen Subpopulationen von Zellen zu identifizieren, wenn sich die Zellen in einer heterogenen (d. h. klonal unreinen) Probe befinden. Beispielsweise wird im US-Patent 5,527,676 festgehalten, dass Gewebeproben, in denen eine Mutation nachgewiesen werden soll, auf Tumorzellen hin angereichert werden sollten, um den Verlust an Heterozygotie in einem p53-Gen nachzuweisen.
Techniken, wie die PCR, sind verwendet worden, um einen Verlust an Heterozygotie nachzuweisen, der von massiven Deletionen herrührt, welche für Adenome im Spätstadium charakteristisch sind. Siehe z. B. US-Patent 5,330,892. Solche Techniken erfordern im allgemeinen den Einsatz einer großen Zahl von Primerpaaren und sie funktionieren in einer heterogenen Probe überhaupt nicht. Eine jüngere Veröffentlichung berichtet vom Einsatz von PCR und ELISA-Techniken zur Durchführung quantitativer Analysen von Mutationen in Tumoren im Frühstadium. US-Patent 5,512,441. Die Identifizierung einer anomalen Subpopulation von Zellen in einer heterogenen Probe von zumeist normalen Zellen und Zelltrümmern, welche Subpopulation durch den Verlust von Heterozygotie und eine Mikrosatelliteninstabilität gekennzeichnet ist, ist sogar noch schwieriger, weil ein solcher Nachweis die Identifizierung einer Subpopulation von Nucleotidfragmenten erfordert, welche von dem Meer von heterogenem normalem Zellmaterial, in welchem sie vorkommen, nur schwer zu unterscheiden sind. Ein weiteres Problem ist darin zu sehen, dass eine Mutation an jedem beliebigen Ort einer wachsenden Zahl von unterschiedlichen Onkogenen oder Tumor-Suppressorgenen Krebs hervorrufen kann, und ein Screening, welches alle oder auch nur die meisten der Stellen in diesen Genen durchforsten kann, steht derzeit nicht zur Verfügung. Eine Mikrosatelliteninstabilität kann ebenfalls einen Hinweis auf Krebs darstellen. Mikrosatelliten sind über das gesamte Genom mit einer mittleren Häufigkeit von ca. 1 unter 100.000 Basenpaaren verteilt. Sie umfassen Tandem- oder Trinucleotid-Repeats, die normalerweise stabil vererbt werden. Siehe z. B. Charlesworth, et al., Nature, 371: 215–220 (1994). Während diese Sequenzen keine bekannte Funktion im Genom ausüben, sind viele von ihnen kartiert und auf Grund ihres Polymorphismus in der Sequenzlänge als Marker verwendet worden. Es wird angenommen, dass mit Defekten in den Stoffwechselwegen für die Reparatur von Mismatches einhergehende klonale Veränderungen in Mikrosatelliten-DNA geeignete Marker für das kolorektale Karzinom HNPCC (hereditary nonpolyposis colorectal cancer) sind. Beispielsweise wurde in HNPCC-Tumorproben gefunden, dass Mikrosatelliten mehrfache Insertionen und/oder Deletionen aufweisen. Eine Mirosatelliteninstabilität kann ein wirksamer Hinweis auf das Fehlen einer Mismatch-Reparatur in Onkogenen oder in Tumor-Suppressorgenen sein. Während eine Mikrosatelliteninstabilität selbst noch kein Anzeichen für einen Krebs ist, ist sie doch ein Anzeichen dafür, dass in Abschnitten, die kritisch für den Ausbruch von Krebs sind, Mutationen vorkommen können. Daraus folgt, dass der Nachweis einer Mikrosatelliteninstabilität darauf hinweist, dass der Patient dem Risiko unterliegt, eine klonale Subpopulation von Krebszellen zu entwickeln.
Kolorektaler Krebs ist eine weitverbreitete Todesursache in der westlichen Welt. Jeder Tumor oder präkanzeröse Polyp, der sich entlang dem Kolon oder Rektum ausbildet, stößt Zellen oder DNA aus Zellen in das Lumen des Kolons ab. Abgestoßene Zellen oder zelluläre DNA werden beim Durchgang des Kots durch das Kolon im allgemeinen vom Kot aufgenommen. Im Frühstadium von Krebs stellen kanzeröse oder präkanzeröse Zellen einen sehr kleinen Anteil der abgestoßenen Epithelzellen oder DNA im Kot dar. Die derzeitigen Verfahren zum Nachweis von kolorektalem Krebs sind nicht auf den Nachweis von kanzerösen oder präkanzerösen Zellen im Kot ausgerichtet. Eher sind solche Verfahren typischerweise auf extrazelluläre Hinweise für das Vorkommen von Krebs ausgerichtet, wie z. B. auf das Vorkommen von fäkalem okkulten Blut oder von im Serum zirkulierendem karzinoembryonalem Antigen.
Es ist jedoch bekannt, dass sowohl sporadischer als auch erbbedingter kolorektaler Krebs von Mutationen in Onkogenen und Tumor-Suppressorgenen herrührt. Solche Mutationen scheinen zu einem Zeitpunkt in der Ätiologie von Krankheiten aufzutreten, der viel früher liegt als der Zeitpunkt, zu welchem extrazelluläre Hinweise oder klinische Anzeichen für Krebs beobachtet werden. Wird Kolonkrebs frühzeitig erkannt, kann er durch chirurgische Entfernung des kanzerösen Gewebes wirksam behandelt werden. Eine chirurgische Entfernung eines Kolonkrebses im Frühstadium ist gewöhnlich erfolgreich, da Kolonkrebs in Zellen des Kolonepithels beginnt und von der allgemeinen Zirkulation bis zum Auftreten einer Invasion durch die Epitheldeckschicht isoliert ist. Somit würde der Nachweis von frühen Mutationen in kolorektalen Zellen die Überlebensrate drastisch erhöhen.
Die derzeitigen nicht-invasiven Verfahren zum Nachweis von Darmkrebs bestehen im Nachweis von okkultem Blut im Kot und von karzinoembryonalem Antigen. Diese Screening-Verfahren versagen entweder beim Nachweis von kolorektalem Krebs oder sie weisen kolorektalen Krebs nur dann nach, nachdem er bis zu einem unbehandelbaren Zustand fortgeschritten ist. Darüber hinaus wird angenommen, dass karzinoembryonales Antigen keine effektive Voraussage von Krebs gestattet, sondern lediglich einen Indikator für rezidivierenden Krebs darstellt.
Während invasive Techniken wie die Endoskopie zwar effektiv sind, sind sie andererseits teuer und schmerzhaft und genießen bei Patienten nur geringe Akzeptanz. Demgemäß sind die derzeitigen Screening-Verfahren für Darmkrebs nicht für das Screenen großer Bevölkerungsgruppen geeignet. Siehe z. B. Blum, Europ. J. Cancer, 31A: 1369–1372 (1995).
Im Stand der Technik besteht daher eine Nachfrage nach einfachen und wirkungsvollen nichtinvasiven Verfahren zu einem zuverlässigen großflächigen Screening, um Personen mit Darmkrebs im Frühstadium zu erkennen. Derartige Verfahren werden mit der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweise des Vorkommens einer Subpopulation von Zellen in einer aus einem Organismus erhaltenen biologischen Probe in den Schritten:

a) Bestimmen einer aus der biologischen Probe ermittelten Zahl X für ein erstes Wildtyp-Polynucleotid, welches in der Subpopulation von Zellen charakteristisch für eine nicht mutierte Region ist,
b) Bestimmen einer aus der biologischen Probe ermittelten Zahl Y für ein zweites Wildtyp-Polynucleotid, welches in der Subpopulation von Zellen mutmaßlich mutiert ist, und
c) Bestimmen, ob zwischen der Zahl X, wobei die Zahl X auf die Menge eines Referenzallels in der Probe hinweist, und der Zahl Y, wobei die Zahl Y auf die Menge des Wildtyp-Zielallels in der Probe hinweist, eine statistisch signifikante Differenz existiert, wobei das Vorhandensein einer statistisch signifikanten Differenz auf die Anwesenheit einer Subpopulation von Zellen in der biologischen Probe hinweist.

Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Nachweis einer Subpopulation von genomisch transformierten Zellen oder Zelltrümmern zur Verfügung. Solche Verfahren weisen in einer biologischen Probe das Vorkommen einer Subpopulation von Zellen nach, welche sich vom Wildtyp unterscheiden sowie von bakteriellen, parasitischen oder kontaminierenden Organismen, welche ebenfalls in der Probe vorkommen können. Beispielsweise lassen sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Spuren von DNA nachweisen, welche von kanzerösen oder präkanzerösen Zellen in einer biologischen Probe stammen, die überwiegend „normale" DNA oder ganze Zellen enthält. Eine bevorzugte Verwendung der Verfahren besteht darin, in einer von einem Patienten ausgeschiedenen Fäzesprobe die Gegenwart von Spuren von Zellen und/oder Zelltrümmern zuverlässig nachzuweisen, welche DNA enthalten, die am Ort einer asymptomatischen präkanzerösen oder kanzerösen Läsion in das Kolon abgegeben wurden. Die Erfindung nutzt einige bedeutende Einsichten aus, mit welchen sich beispielsweise eine DNA-Deletion an einem bekannten für einen bekannten Typ von Krebszellen charakteristischen Genomort zuverlässig nachweisen lässt.
Die Erfindung umfasst allgemein die vergleichende Messung von zwei Genomsequenzen. Eine Genomsequenz ist während der Transformation stabil (d. h. sie ist sowohl in malignen Zellen als auch Wildtypzellen in der Probe identisch). Eine zweite Genomsequenz unterliegt typischerweise im Verlauf der Transformation einer Veränderung (d. h. sie mutiert während der Ausbildung maligner Vorläuferzellen). Zum Nachweis des Vorkommens einer jeweiligen Genomsequenz werden Hybridisierungssonden eingesetzt. Falls sich die Zahl der Hybridisierungsereignisse bei den beiden Genomsequenzen voneinander unterscheidet, kann der Unterschied auf einem unbedeutenden Hintergrund beruhen oder auf einem statistisch signifikanten Unterschied in der Häufigkeit der beiden Genomsequenzen in der Population, aus der die Probe entnommen wurde. Im letzteren Fall kann der Unterschied bis zu einem Grad mit definierter statistischer Wahrscheinlichkeit mit dem Vorkommen einer Subpopulation von Zellen in der Probe in Zusammenhang gebracht werden, welche eine veränderte Genomsequenz (d. h. keinen Wildtyp) aufweisen.
Die Erfindung lässt sich in drei allgemeine Ausführungsformen unterteilen. (1) In einer ersten allgemeinen Ausführungsform wird eine definierte Menge (Anzahl von Kopien) eines betreffenden Gens oder Genfragments in einer Probe (d. h. ein Gen, dessen Mutation bekannt ist oder das vermutlich mit Krebs in Zusammenhang steht) mit einer definierten Menge eines Referenzgens oder Referenzgenfragments in der Probe verglichen, wobei das Referenzgen ein Gen ist, das normalerweise nicht mit Krebs in Verbindung gebracht wird und das normalerweise eine geringe Mutationshäufigkeit aufweist. Ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den beiden definierten Mengen stellt ein Anzeichen für eine genomische Instabilität in einer Subpopulation von Zellen in der Probe dar. (2) In einer zweiten allgemeinen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine definierte Menge eines Abschnitts auf dem maternalen Allel mit einer definierten Menge des entsprechenden Abschnitts auf einem paternalen Allel verglichen. Ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den beiden definierten Mengen stellt ein Anzeichen für eine genomische Instabilität dar. (3) In einer dritten allgemeinen Ausführungsform wird die Anzahl der Mikrosatelliten-Repeats an einem bestimmten Genort zwischen maternalen und paternalen Allelen verglichen. Ein statistisch signifikanter Unterschied in den Häufigkeiten ist ein Anzeichen für einen Fehler im Mismatch-Reparaturmechanismus bei einer Subpopulation von Zellen in der Probe oder kann ein Anzeichen dafür sein, dass ein Verlust von Allelen stattgefunden hat. Wie oben ausgeführt können Fehler bei der Mismatch-Reparatur zu Mutationen in Tumor-Suppressorgenen oder Onkogenen führen. Ein Nachweis von Krebs in jeder der drei erfindungsgemäßen Ausführungsformen wird erhalten, indem die Häufigkeit der Hybridisierungen zwischen mindestens zwei unterschiedlichen Nucleotidsonden und ihren entsprechenden Genomsequenzen ermittelt wird.
Ein Hauptpunkt der Erfindung ist in der Erkenntnis zu sehen, dass Zellmaterialien, die auf der Innenseite des Kolons sitzen (z. B. ein Polyp oder eine Läsion), sich auf sich bildender Fäzes nur auf einem einen Längsstreifen längs der Fäzes umfassenden Abschnitt absondern. Wenn daher die zu untersuchende Kotprobe nicht die gesamte Fäzes oder zumindest einen Querschnitt derselben umfasst, enthält die Probe die relevante diagnostische Information nur durch Zufall. Der Darm weist über seine gesamte Länge zahlreiche Biegungen und Faltungen auf. Siehe die mit gleichem Datum eingereichte US-Anmeldung _____ Die das Kolon auskleidenden Epithelzellen wandern normalerweise von einer basalen Position in den Darmkrypten, wo sich Stammzellen über Mitose teilen, zu den Spitzen der Krypten und werden sodann in das Darmlumen abgesondert. Infolge der schnellen Fluktuationsrate des Epithels unterliegen Darmepithelzellen, welche das Lumen des Verdauungstrakts auskleiden, alle 4 bis 5 Tage einer Regeneration. Entsprechend werden abgeschilferte Epithelzellen oder deren DNA ständig in die sich bildende Fäzes beim Durchgang durch das Lumen abgegeben. Nähern sich die Fäzes dem Rektum und werden zunehmend fester (aus anfänglich flüssigem Zustand), werden Epithelzellen nur auf den Teil der Fäzes abgeschilfert, welcher mit dem Abschnitt des Darmlumens in Kontakt kommt, welcher diese Zellen zuvor in seiner Epithelauskleidung aufwies. Die Epithelzellen eines Polypen (ein Polyp ist ein präkanzeröses Wachstumsgebilde; während nicht alle Polypen kanzerös werden, stammen fast alle Krebsarten von Polypen ab) unterliegen dem gleichen schnellen Lebenszyklus und einer Abschilferung, wie sie oben für normale Epithelzellen des Darmes beschrieben wurde. Demgemäß werden von Polypen abgeschilferte Zellen typischerweise nur von der Oberfläche der sich bildenden Fäzes absorbiert, die mit dem Polypen in Kontakt kommt. Sind die Fäzes in flüssigem Zustand, erfolgt das Durchmischen der abgeschilferten Zellen des Polypen mit der gesamten Fäzes automatisch.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zum Nachweis genomischer Veränderungen in einer Zell-Subpopulation einer Probe biologischen Materials zur Verfügung. Die erfindungsgemäßen Verfahren dienen dem Nachweis von Veränderungen in der Nucleotidsequenz eines Allels in einer kleinen Subpopulation von Zellen, die in einer großen heterogenen Probe von diagnostisch irrelevantem Material vorkommen. Die erfindungsgemäßen Verfahren dienen dem Nachweis und der Diagnose einer genetischen Anomalie, wie z. B. der Verlust von Heterozygotie, oder, allgemeiner, einer Mutation, die sich mit einer Krankheit, wie z. B. Krebs, in Verbindung bringen lässt. Wenn der Kontext keine andere Interpretation erfordert, sind für die Zwecke der vorliegenden Erfindung unter „Mutation" Modifikationen, Umlagerungen, Deletionen, Substitutionen und Additionen in einem Abschnitt genomischer DNA oder der ihr entsprechenden mRNA zu subsumieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung Verfahren zum Nachweis einer klonalen Subpopulation von transformierten Zellen zur Verfügung, welche in einer aus einem Organismus wie dem Menschen erhaltenen biologischen Probe enthalten sind oder von denen vermutet wird, dass sie dort enthalten sind. Die Verfahren umfassen den Schritt, von der biologischen Probe eine Zahl X eines ersten Wildtyp-Polynucleotids zu bestimmen, von welchem bekannt ist oder vermutet wird, dass es weder in Wildtyp-Zellen noch in transformierten Zellen mutiert ist. Ein weiterer Schritt besteht darin, von der biologischen Probe eine Zahl Y eines zweiten Wildtyp-Polynucleotids zu bestimmen, das in der Subpopulation von Zellen in der biologischen Probe mutmaßlich mutiert ist. Sodann wird ermittelt, ob zwischen X und Y eine statistisch signifikante Differenz besteht. In einer normalen Probe gibt es keine Mutation und somit keine statistisch signifikante Differenz zwischen der Anzahl der jeweiligen somatischen Gene in normalen Zellen. Als Folge davon unterscheiden sich X und Y in statistisch signifikantem Sinne nicht voneinander. Im Gegensatz dazu stellt das Auftreten eines statistisch signifikanten Unterschieds zwischen X und Y ein Anzeichen für das Vorkommen einer klonalen Subpopulation von transformierten Zellen in der biologischen Probe dar, in welcher sich eine Mutation ereignete. Eine statistische Signifikanz lässt sich nach jedem im Stand der Technik bekannten Verfahren nachweisen. In Verbindung mit jedem vorgegebenen Assay braucht jedoch keine formale Bestimmung einer statistischen Signifikanz zu erfolgen. Die Essays sind vielmehr so angelegt, dass sie eine genügend große Anzahl von Bindungsereignissen nachweisen, so dass es mit beliebiger Gewissheit zumindest ein auf das Vorkommen einer mutierten Zell-Subpopulation hinweisender Differenzen-Grenzwert zwischen den Zahlen gibt.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die mit den erfindungsgemäßen Verfahren nachzuweisenden transformierten Zellen auch maligne Zellen. Die gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren nachgewiesenen transformierten Zellen können induzierte Transformanten sein, welche beispielsweise von einem Virus, mittels Strahlung oder mittels chemischer oder anderer Karzinogene transformiert wurden. Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich mit jeder biologischen Probe durchführen, einschließlich Gewebeproben und Körperflüssigkeiten. Besonders bevorzugte biologische Proben sind Eiter, Sputum, Samen, Blut, Speichel, Liquor cerebrospinalis und Urin. In einer wichtigen erfindungsgemäßen Ausführungsform besteht die Probe aus Kot, welcher analysiert wird, um kolorektales Karzinom und Präkanzerose festzustellen. Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich in der Praxis so durchführen, dass die biologische Probe einer oder mehreren Oligonucleotidsonden ausgesetzt wird, um die Zahl X für ein erstes Polynucleotid und die Zahl Y für ein zweites Oligonucleotid zu bestimmen. Die erfindungsgemäß eingesetzten Sonden sind für ihren Nachweis markiert. Bevorzugte Marker umfassen Fluoreszenzmarker, welche beispielsweise mittels affiner Bindungspaare (wie z. B. Kohlenhydrat/Lectin oder Avidin/Biotin) angeheftet werden. Besonders bevorzugte Marker stellen mikroskopische Teilchen dar, welche mittels eines Detektors gezählt werden, vorzugsweise ein elektronisches High-Speed-Gerät, wie es in der vorliegenden Beschreibung offenbart wird. Die Zahlen X und Y sind vorzugsweise proportional zu und am meisten bevorzugt gleich der Zahl der in der biologischen Probe auftretenden Wahrnehmungstreffer für das Zielpolynucleotid.
Die erfindungsgemäßen Verfahren sind insbesondere für den Nachweis von kolorektalem Karzinom und präkanzerösen Zellen im Menschen geeignet. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind präkanzeröse Zellen solche, die eine mit Krebs in Verbindung gebrachte Mutation aufweisen und dafür anfällig sind, kanzerös zu werden. Solche Verfahren umfassen den Schritt, zu ermitteln, ob Zellen oder Nucleotid-Trümmer in einer Fäzesprobe eine Deletion eines Polynucleotids aufweisen, welches normalerweise in einem Wildtyp-Genom eines Menschen oder Säugetieres vorkommt. Die Probe kann einer Vielzahl von ersten und zweiten Oligonucleotidsonden unter Hybridisierungsbedingungen ausgesetzt werden, um eine Hybridisierung von (i) der ersten Sonde an Kopien eines ersten Polynucleotid-Segements zu erzielen, welches charakteristisch für einen Wilttyp-Genomabschnitt ist, von dem bekannt ist oder vermutet wird, dass er in den Zellen der Probe keine Deletion erfahren hat, sowie von (ii) der zweiten Sonde an Kopien eines zweiten Polynucleotidsegments zu erzielen, das charakteristisch für den Wilttyp-Genomabschnitt ist, von dem vermutet wird, dass er in der Probe mutiert ist. Die Anzahl der mit jeder der ersten und zweiten Sonden gebildeten Duplices wird sodann ermittelt und ausgezählt. Das Auftreten eines statistisch signifikanten Unterschieds zwischen den beiden Zahlen ist ein Anzeichen dafür, dass in der Probe eine Mutation vorkommt, welche charakteristisch für ein kolorektales Karzinom sein kann. Dann sind eine Endoskopie oder andere visuelle Untersuchungsverfahren angezeigt.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Sonden mit Perlen oder Teilchen markiert. In dieser Ausführungsform werden die zum Nachweis eines genomischen Polynucleotidsegments in einer Probe eingesetzten Sonden an solche Perlen im Verhältnis 1 : 1 (1 Sonde pro Perle) gebunden, und die mit den ersten und zweiten Sonden verbundenen Perlen unterscheiden sich voneinander, z. B. über ihre Größe. Die Verwendung solcher Hybridisierungsperlen oder -teilchen erleichtert die quantitative Bestimmung der genomischen Polynucleotidsegmente in der Probe, indem z. B. ein Impedanz-Zähler, wie z. B. ein „Counter-Counter", eingesetzt wird.
Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich auch für den Nachweise eines Verlusts von Heterozygotie bei einem Allel verwenden, indem die Menge an maternalen und paternalen Allelen ermittelt wird, welche einen genetischen Lokus mit mindestens einem Single-Base-Polymorphismus aufweisen. Ein statistisch signifikanter Unterschied in der Häufigkeit eines jeweiligen Allels ist ein Anzeichen für eine Mutation in einem einen Single-Base-Polymorphismus aufweisenden Allelabschnitt. In diesem Verfahren wird ein Abschnitt eines Allels mit Single-Base-Polymorphismus identifiziert, indem z. B. eine Datenbank, wie z. B. GenBank, eingesetzt wird oder mittels anderer im Stand der Technik bekannten Verfahren. Die Sonden sind so gestaltet, dass sie, wie in 3 gezeigt, unmittelbar am 3'-Ende zum Single-Base-Polymorphismus an die entsprechenden Abschnitte von sowohl paternalen als auch maternalen Allelen hybridisieren. Nach der Hybridisierung wird eine Mischung von mindestens zwei der vier gemeinsamen, jeweils mit einem unterschiedlichen nachweisbaren Marker markierten Didesoxynucleotide zu der Probe gegeben. Eine DNA-Polymerase wird ebenfalls zugesetzt. Unter Verwendung der an das polymorphe Nucleotid angrenzenden allelen DNA als Matrize wird die hybridisierte Sonde durch Zusatz eines einzelnen, als Bindungspartner für das polymorphe Nucleotid dienenden Didesoxynucleotids verlängert. Nach dem Waschen zur Entfernung nicht eingebauter Didesoxynucleotide werden die in die verlängerte Sonde eingebauten Didesoxynucleotide nachgewiesen, indem die Anzahl der gebundenen, verlängerten, jeweils die beiden Didesoxynucleotide tragenden Sonden beispielsweise in einem Flusscytometer oder Impedanzzähler ermittelt wird. Das Auftreten einer fast gleichen Zahl von zwei unterschiedlichen Merkern bedeutet, dass im polymorphen Nucleotid eine normale Heterozygotie auftritt. Das Vorkommen eines statistisch signifikanten Unterschieds in der ermittelten Zahl für die beiden Marker bedeutet, dass in einem der Allele eine Deletion des die polymorphen Nucleotide enthaltenden Abschnitts aufgetreten ist.
Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich verwenden, um zu bestimmen, ob ein Patient für nachfolgende invasive diagnostische oder andere Verfahren, wie z. B. eine Endoskopie, in Frage kommt. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Verfahren dazu verwendet werden, eine Mutation in einem Tumor-Suppressorgen oder einem Onkogen in einer Subpopulation von Zellen in einer von einem Patienten gewonnenen Fäzes-Probe nachzuweisen. An Patienten mit einer diagnostizierten Mutation kann sodann eine Endoskopie durchgeführt werden. Auf ein positives Endoskopieergebnis kann sodann eine Polypektomie, ein chirurgischer Eingriff oder eine andere Behandlung folgen, um kanzeröses oder präkanzeröses Gewebe zu entfernen.
Demgemäß besteht eine Aufgabe der Erfindung darin, Verfahren zum Nachweis einer genomischen Instabilität von Zellen in einer Zellprobe zur Verfügung zu stellen. Eine weitere erfindungsgemäße Aufgabe besteht darin, Verfahren zum Nachweis einer genomischen Veränderung in einer Subpopulation von Zellen zur Verfügung zu stellen, wobei die genomische Veränderung ein Anzeichen für Krebs ist. Eine andere erfindungsgemäße Aufgabe besteht darin, einen Verlust an Heterozygotie in einem mit Krebs assoziierten Genomabschnitt, wie z. B. einem Tumor-Suppressorabschnitt, nachzuweisen. Noch eine andere erfindungsgemäße Aufgabe besteht darin, Verfahren zum Nachweis von Heterozygotie und deren Verlust bei Nucleinsäuren mit Single-Base-Polymorphismus zur Verfügung zu stellen. Schließlich besteht eine erfindungsgemäße Aufgabe darin, Verfahren für den Nachweis von Krebs, insbesondere eines kolorektalen Karzinoms, zur Verfügung zu stellen, indem in einer heterogenen Probe, wie z. B. einer Fäzes-Probe, Zellen oder Zelltrümmer nachgewiesen werden, die auf Krebs hinweisen.
Weitere Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich bei Berücksichtigung der folgenden genauen Beschreibung und der Zeichnungen.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Fließdiagramm, das die aufeinanderfolgenden Schritte in den erfindungsgemäßen Verfahren zeigt.
2 ist eine Schemazeichnung eines erfindungsgemäß verwendbaren Impedanzzählers mit mehreren Öffnungen zum Zählen der Hybridisierungsereignisse, wobei das Bezugszeichen 1 die Richtung des Flusses durch die Säule angibt, Bezugszeichen 2 ein Kolbenmittel anzeigt, um Material in der Säule nach unten zu zwingen; die Bezugszeichen 3 und 4 sind Hybridisierungsperlen unterschiedlicher Größe; das Bezugszeichen 5 ist ein optionaler Filter, um unerwünschte Teilchen auszufiltern; das Bezugszeichen 6 zeigt ein Feld von Öffnungen zur Messung von Impedanzunterschieden; und das Bezugszeichen 7 stellt einen Sammelbehälter dar.
3 zeigt vier mögliche Haftstellen für Sonden auf allelen Abschnitten, die durch Single-Base-Polymorphismus gekennzeichnet sind. In 3 stellt M1 die SEQ ID NO: 1 dar; die Sequenz M2 ist SEQ ID NO: 2; die Sequenz M3 ist SEQ ID NO: 3; die Sequenz M4 ist SEQ ID NO: 4; die Sequenz F1 ist SEQ ID NO: 5; die Sequenz F2 ist SEQ ID NO: 6; die Sequenz F3 ist SEQ ID NO: 7; die Sequenz F4 ist SEQ ID NO: 8.
Die 4A und 4B sind Gauß'sche Verteilungskurven, welche Abschnitte mit niedriger statistischer Wahrscheinlichkeit zeigen.
5 ist eine graphische Darstellung, welche die wahrscheinlichen Werte von N für eine heterogene Zellpopulation anzeigt, in welcher 1% der Zellen mutiert sind.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich für den Nachweis einer genomischen Instabilität in einer heterogenen Probe von Zellen einsetzen, in denen die genomische Instabilität nur in einer kleinen Subpopulation von Zellen in der Probe auftritt. Bei Verwendung herkömmlicher Nachweisverfahren ließe sich eine solche Subpopulation nur schwierig wenn nicht gar unmöglich nachweisen – insbesondere, wenn die für die genomische Instabilität ursächliche Mutation zum Zeitpunkt des Nachweises nicht bekannt ist oder eine klonisch verunreinigte Zellpopulation verwendet wird. Siehe, z. B.: US-Patent 5,527,676 (worin berichtet wird, dass eine klonische Zellpopulation verwendet werden soll, um in einem p53-Gen eine Deletion nachzuweisen). Herkömmliche Verfahren zum Nachweis von bei der Krebsentstehung eine Rolle spielenden Mutationen beruhen auf der Verwendung klonisch reiner Zellpopulationen und derartige Verfahren arbeiten am besten beim Nachweis von Mutationen, die bei der Krebsentstehung an bekannten „Hot Spots", wie z. B. k-ras, auftreten. Siehe oben: Sidransky. Bei Einsatz von Verfahren des Standes der Technik auf Grundlage der PCR müsste eine äußerst große Zahl von Primern entworfen werden und die Probe müsste viele Male untersucht werden, um in einer Zellprobe eine genetische Instabilität nachzuweisen, welche klonisch verunreinigt ist (d. h. eine heterogene Probe wie z. B. Fäzes) und in welcher die nachzuweisende Mutation nicht bekannt ist und nur in einer sehr kleinen Zahl von Zellen vorkommt. Darüber hinaus ist die PCR nicht geeignet, das Fehlen einer Gensequenz nachzuweisen, wie dies bei den vorliegenden Verfahren zum Nachweis des Verlusts von Heterozygotie der Fall ist. Selbst nach solchen wiederholten Versuchen kann ein auf der PCR basierendes Verfahren bei einer kleinen Zahl von Zellen mit klonisch verunreinigter Population keine Mutation nachweisen, falls z. B. keine Primer eingesetzt werden, welche die Stelle der Mutation einrahmen. Somit sind im Adenom-Frühstadium (wenn die Population von mutierten Zellen sehr klein ist) die Verfahren des Standes der Technik bestenfalls unpraktisch und können auf keinen Fall funktionieren.
Im Gegensatz dazu sind die erfindungsgemäßen Verfahren in der Lage, bei einer kleinen Zahl von Zellen in einer verunreinigten Zellpopulation eine genomische Instabilität nachzuweisen, weil solche Verfahren nicht auf die Kenntnis darauf zurückgreifen, welche Mutation vorkommt, und weil solche Verfahren durch das Auftreten von heterogener DNA in der Probe beeinflusst werden. Beispielsweise treten beim Verlust von Heterozygotie über große Abschnitte des Genoms Deletionen auf und es können ganze Allele fehlen (oder es kann zumindest genug von einem Allel fehlen, um das Allel funktionsunfähig zu machen). Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen den Schritt, die Anzahl eines Gens, von dem vermutet wird, dass es mutiert ist, auszuzählen und diese Zahl mit der Anzahl eines Gens zu vergleichen, von dem bekannt ist, dass es in derselben Probe nicht mutiert ist. Alles was man an Kenntnis benötigt ist mindestens ein Abschnitt aus der Sequenz eines Wildtyp-Gens, in welchem das Auftreten der Mutation erwartet wird und mindestens ein Abschnitt aus der Wildtyp-Sequenz eines Referenzgens, in welchem kein Auftreten einer Mutation erwartet wird.
Dementsprechend sind die erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von Veränderungen in genomischen Nucleotidsequenzen geeignet, welche in einer Probe in einer Zellsubpopulation oder deren Zelltrümmern vorkommen. Solche Veränderungen treten im allgemeinen als eine Mutation (d. h. eine Substitution, Modifikation, Deletion, Addition oder Umlagerung) bei einer Wildtyp-Allelsequenz in einer Zellsubpopulation auf. Im Falle eines Tumor-Suppressorgens erscheint die Mutation typischerweise in Form einer massiven Deletion, die für den Verlust von Heterozygotie charakteristisch ist. Oft treten, wie im Falle gewisser Krebsformen, krankheitsverursachende Mutationen am Anfang nur in einer einzelnen Zelle auf, welche sodann eine kleine Subpopulation von mutierten Zellen hervorbringt. Zu dem Zeitpunkt, wo dann das Auftreten der Mutation nachgewiesen wird, kann die Krankheit dann bereits bis zu einem unheilbaren Zustand fortgeschritten sein. Mit den erfindungsgemäßen Verfahren lässt sich eine Mutation bereits nachweisen, wenn die Mutation nur einen geringen Prozentsatz der gesamten Zellen oder Zelltrümmer in einer Probe befallen hat.
Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen einen Vergleich von zwei Wildtypsequenzen, von denen erwartet wird, dass sie in der Probe in gleicher Anzahl in normalen (nicht mutierten) Zellen vorkommen. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Vergleich zwischen (1) einer Anzahl eines genomischen Polynucleotidsegments, von dem bekannt ist oder vermutet wird, dass es in den Zellen der Probe nicht mutiert ist (die „Referenz") und (2) der Anzahl eines (nicht mutierten) genomischen Wildtyp-Polynucleotidsegments, von dem Vermutet wird, dass es in der Probe (dem „Ziel") zu einer Subpopulation von Zellen mutiert ist. Eine statistisch signifikante Differenz zwischen den Zahlen für die beiden genomischen Polynucleotidsegmente ist ein Anzeichen dafür, dass eine Mutation stattgefunden hat. Speziell im Falle einer Deletion in einem Tumor-Suppressorgen ist die ermittelte Zahl für das Referenzgen signifikant größer als die ermittelte Zahl für das Zielgen. Ist das Zielgen amplifiziert, wie im Falle bestimmter Onkogenmutationen, ist die ermittelte Zahl für das Ziel um einen statistisch signifikanten Betrag größer als die ermittelte Zahl für das Referenzgen.
Die Verfahren im Stand der Technik erfordern im allgemeinen zum Nachweis einer Deletion oder Punktmutation den Einsatz zahlreicher Sonden, gewöhnlich in Form von PCR-Primern und/oder Hybridisierungssonden. Da jedoch die erfindungsgemäßen Verfahren mit einem quantitativen Nachweis von Nucleotidsequenzen und quantitativen Vergleichen zwischen Sequenzen arbeitet, von denen bekannt ist, dass sie stabil sind und solchen, von denen vermutet wird, dass sie instabil sind, brauchen nur einige wenige Sonden eingesetzt zu werden, um das Krebsrisiko genau einzuschätzen. In der Tat ist ein einziger Satz (Paar) von Sonden alles, was erforderlich ist. Das Krebsrisiko wird durch das Auftreten einer Mutation in einem Genabschnitt angezeigt, von dem bekannt ist oder vermutet wird, dass er bei der Krebsentstehung eine Rolle spielt. Patienten, die auf Grundlage von mit den erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführten Tests als Risikopatienten erkannt werden, werden daraufhin zur Bestätigung und/oder Behandlung der Krankheit anderen, typischerweise invasiven Verfahren, unterzogen.
Die quantitative Stichprobenerhebung einer Nucleotidsequenz, die in einer Probe gleichmäßig verteilt ist, folgt typischerweise einer Poisson-Verteilung. Für große Populationen, wie die typische Anzahl genomischer Polynucleotidsegmente in einer biologischen Probe, gleicht die Poisson-Verteilung der (Gauß'schen) Normalverteilung mit einem Mittelwert N und einer Standardabweichung, die sich näherungsweise als Quadratwurzel von N ausdrücken lässt.
Die statistische Signifikanz zwischen der aus einer biologischen Probe erhaltenen Zahl der Ziel- und Referenzgene lässt sich nach jedem geeigneten Verfahren bestimmen. Siehe z. B. Steel, et al., Principles and Procedures of Statistics, A Biometrical Approach (McGraw-Hill, 1980). Basierend auf einem erwünschten Spezifitäts- (Toleranz von falsch positiven) und Sensitivitätsniveau (Toleranz der falsch negativen) und innerhalb einer ausgewählten Höhe für statistische Sicherheit besteht ein beispielhaftes Verfahren darin, die Differenz zwischen der Anzahl der Ziel- und Referenzgene zu ermitteln, die man erhalten muss, um ein ausgewähltes statistisches Signifikanzniveau zu erzielen. Ein Grenzproblem in einer solchen Bestimmung stellt die kleinste Zahl N von Genen dar (jeweils für das Ziel und die Referenz), die in einer Population vorhanden sein muss, um eine Bestimmung der statistischen Signifikanz zu erlauben. Die Zahl N hängt ab von der Annahme einer kleinsten Zahl von mutierten Allelen in einer mutierte Allele enthaltenden Probe (es wird hierbei angenommen, dass sie mindestens 1% betragen) sowie der weiteren Annahme, dass normale Proben keine mutierten Allele enthalten. Es wird ebenfalls angenommen, dass für einen Schluss, dass in einer Zellsubpopulation in der Probe eine Mutation aufgetreten ist, die Schwellendifferenz zwischen der Anzahl von Referenz- und Zielgenen mindestens 0,5% betragen muss. Auf der Grundlage der obigen Annahmen ist es möglich zu bestimmen, wie groß N sein muss, so dass eine ermittelte Differenz zwischen der Anzahl der mutierten Allele und der Renferenzallele von unter 0,5% über 99,9% der Zeit ein richtiges negatives Ergebnis darstellt (d. h., dass in der Probe keine mutierte Subpopulation enthalten ist).
Die Berechnung von N für die Spezifität beruht sodann auf der Wahrscheinlichkeit, dass eine Messung der Probe in den Bereich der Gauß'schen Verteilungskurve zu liegen kommt, welcher die niedrigsten 3,16% der Population abdeckt (der in 4A als „A" bezeichnete Bereich) sowie auf der Wahrscheinlichkeit, dass die Messung der anderen Probe in den Bereich der Gauß'schen Verteilungskurve zu liegen kommt, welcher die höchsten 3,16% der Population abdeckt (der in 4B als „B" bezeichnete Bereich). Da die beiden Probenmessungen voneinander unabhängige Ereignisse sind, ist die Wahrscheinlichkeit, dass beide Ereignisse gleichzeitig auftreten näherungsweise 0,001 oder 0,1%. Somit liegen 93,68% der Gauß-Verteilung (100% – 2 × 3,16%) zwischen den in 5A mit A und B bezeichneten Bereichen. Statistiktabellen zeigen, dass ein solcher Bereich gleich einer Standardabweichung von 3,72 ist. Entsprechend sind 0,5% N gleich 3,72 Sigma. Da Sigma (die Standardabweichung) gleich √N ist, ergibt sich N aus der Gleichung zu 553,536. Dies bedeutet, dass, falls die die Referenz und das Ziel wiedergebende kleinere der beiden Zahlen mindestens 553.536 beträgt und es sich um einen normalen Patienten handelt, die Differenz zwischen den Zahlen über 99,9% der Zeit kleiner als 0,5% ist.
Zur Bestimmung des für 99% Sensitivität erforderlichen kleinsten N wird eine ähnliche Analyse durchgeführt. Diesmal zeigen Tabellen für die Gaußsche Standardnormalverteilung, dass eine Standardabweichung (Sigma) von 1,28 vom Mittelwert 90% der Gaußverteilung abdecken. Darüber hinaus besteht eine 10% (Quadratwurzel von 1%) Wahrscheinlichkeit, dass eine der Zahlen (Referenz oder Ziel) entweder in dem in 5 mit „A" bezeichneten Bereich oder in dem in 5 mit „B" bezeichneten Bereich liegt. Falls sich die beiden Populations-Mittelwerte um insgesamt 1% voneinander unterscheiden und falls eine Differenz von 0,5% zwischen der Zahl für die Ziel- und Referenzgene auftreten soll, ist der Abstand eines jeweiligen Mittelwerts zur Schwelle für statistische Signifikanz bei einer Sensitivität von 99% gleich 0,25% N (siehe 5). Wie in 5 gezeigt, entsprechen 0,25% N ca. 40% einer Seite der Gaußschen Verteilungskurve. Aus Tabellen für die Gaußsche Standardnormalverteilung ist zu entnehmen, dass 40% der Gauß-Verteilung Standardabweichungen von 1,28 entsprechen. Daher sind 1,28 Sigma gleich 0,0025N und N ist gleich 262.144. Daher ist für anomale Proben über mindestens 99% der Zeit die Differenz größer als 0,5%, fass die niedrigere der beiden Zahlen mindestens 262.144 ist. Umgekehrt wird unter diesen Bedingungen eine irrtümliche negative Aussage nur bei 1% der Zeit getroffen.
Um sowohl eine 99,9% Spezifität (Vermeidung von falsch Positiven) als auch eine 90% Sensitivität (Vermeidung von falsch Negativen) zu haben, sollte eine Probe mit mindestens 553.536 (oder annähernd größer 550.000) für sowohl Ziel- als auch Referenzallele eingesetzt werden. Eine Differenz von mindestens 0,5% zwischen den erhaltenen Zahlen ist bei einem Konfidenzniveau von 99,0% signifikant für die Sensitivität und ein Unterschied von unter 0,5% zwischen den Zahlen ist bei einem Konfidenzniveau von 99,9% signifikant für die Spezifität. Wie oben angeführt, können andere statistische Standardtests verwendet werde, um die statistische Signifikanz zu ermitteln und das Vorstehende stellt einen solchen Test dar.
Auf Grundlage der vorgehenden Ausführungen wird der Fachmann erkennen, dass sich die erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von Mutationen in einer Subpopulation von Polynucleotiden in jeder biologischen Probe einsetzen lassen. Beispielsweise lassen sich die offenbarten Verfahren zum Nachweis eines Allelverlustes (Verlust von Heterozygotie) verwenden, welcher mit Krankheiten wie Krebs einhergeht. Darüber hinaus lassen sich die erfindungsgemäßen Verfahren verwenden, um eine Deletion oder eine auf Basensubstitution beruhende Mutation aufzuspüren, welche einen Stoffwechselfehler, wie z. B. einen vollständigen oder teilweisen Verlust von Enzymaktivität, verursachen. In den folgenden Ausführungen werden beispielhaft Details für die Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren beim Nachweis von Darmkrebs beschrieben. Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich insbesondere zum frühen Nachweis einer Mutation (und insbesondere einer für den Verlust von Heterozygotie typischen großen Deletion) in einem Tumor-Suppressorgen.
Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Verfahren eine von drei Arten von Nachweis. In einem bevorzugten Nachweis wird eine Menge eines Polynucleotids, von dem bekannt ist oder angenommen wird, dass es mutiert ist, mit einer Menge eines Referenzpolynucleotids verglichen, von dem bekannt ist oder angenommen wird, dass es nicht mutiert ist. In einem zweiten bevorzugten Nachweis wird eine Menge eines polymorphen Nucleotids auf einem maternalen Allel mit der Menge des entsprechenden polymorphen Nucleotids auf dem entsprechenden paternalen Allel verglichen. Schließlich umfasst ein dritter Nachweis einen Vergleich eines Mikrosatelliten-Repeatabschnitts in einem normalen Allel mit dem entsprechenden Mikrosatellitenabschnitt in einem Allel, von dem bekannt ist oder angenommen wird, dass es mutiert ist. In allen drei beispielhaften Nachweismethoden wird ermittelt, ob zwischen den Anteilen einer jeweils gemessenen Nukleinsäure eine Differenz besteht. Das Vorliegen einer statistisch signifikanten Differenz ist ein Anzeichen dafür, dass in einer der gemessenen Nukleinsäuren eine Mutation aufgetreten ist. Somit lassen sich die unten beschriebenen Verfahren allgemein auf alle Formen der Erfindung anwenden, von denen die Varianten in 1 dargestellt sind.
I. Herrichtung einer Fäzes-Probe
Eine Probe, die von der von einem Patienten entleerten Fäzes hergerichtet wurde, sollte zumindest einen Querschnitt der entleerten Fäzes enthalten. Wie oben bereits ausgeführt ust Kot in Bezug auf abgeschilferte Zellen nicht homogen. Wenn die Fäzes das Kolon passieren absorbieren sie abgeschilferte Zellen aus Abschnitten des Darmepithels, mit welchem sie in Kontakt kommen. Somit werden von einem Polypen abgeschilferte Zellen nur auf einer Oberfläche der sich bildenden Fäzes absorbiert (außer in der Nähe des Zäkums, wo die Fäzes noch flüssig und durch die Peristaltik der Eingeweide homogenisiert sind). Eine repräsentative Probenahme der Fäzes (d. h. zumindest ein Querschnitt) und Homogenisieren derselben stellt sicher, dass abgeschilferte Zellen von allen Epitheloberflächen des Kolons für eine Analyse in der verarbeiteten Fäzesprobe vorhanden sind. Die Fäzes werden in einen Behälter entleert, der vorzugsweise klein genug ist, um ihn zu einem Testlabor transportieren zu können. Der Behälter kann an einer herkömmlichen Toilette angebracht werden, so dass der Behälter nach herkömmlicher Art und Weise entleerte Fäzes aufnimmt. Der Behälter kann ein Gitter oder Sieb von genügender Größe und Anordnung enthalten, so dass die Fäzes zurückgehalten werden, während der Urin durch das Gitter oder Sieb hindurchtreten und in die Toilette gelangen kann. Der Behälter kann zusätzlich Mittel zum Homogenisieren der entleerten Fäzes aufweisen. Darüber hinaus kann der Behälter Mittel zum Einbringen eines Homogenisierungspuffers oder eines oder mehrerer Konservierungsmittel, wie Alkohol oder eine hochkonzentrierte Salzlösung, aufweisen, um in der Fäzesprobe enthaltene Bakterien zu neutralisieren und den Abbau von DNA zu hemmen.
Gleichgültig, ob der Behälter geeignet ist, an einer Toilette angebracht zu werden oder lediglich die entleerte Fäzesprobe aufzunehmen, weist er vorzugsweise Dichtungsmittel auf, die ausreichen, die entleerte Fäzesprobe und jede zugesetzte Flüssigkeit einzuschließen und das Entweichen von Geruch zu verhindern. Der Behälter kann einen Stützrahmen aufweisen, der direkt über eine Toilettenschüssel plaziert wird. Am Stützrahmen ist eine mit einem Gelenk versehene Abdeckung angebracht, welche zum Ablegen einer Probe aufgeklappt oder geschlossen (nicht gezeigt) sein kann, um entleerte Fäzes im Behälter abzudichten. Der Stützrahmen weist zusätzlich eine zentrale Öffnung auf, welche von der Oberseite durch den Rahmen bis zur Unterseite des Stützrahmens verläuft. Die Unterseite steht direkt mit einer Oberseite der Toilette in Verbindung. Ein Mittel zur Aufnahme entleerten Stuhls erstreckt sich von der Oberseite des Stützrahmens und nimmt den gesamten Umfang der zentralen Öffnung ein. Das Mittel zur Aufnahme entleerten Stuhls kann fest am Stützrahmen angebracht oder auch entfernbar sein, um nach dem Ablegen des Stuhls abgenommen zu werden.
Nach dem Einsammeln der Fäzes wird die Stuhlprobe in einem geeigneten Puffer, wie z. B. phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder chaotroper Salzlösung, homogenisiert. Das Homogenisieren und die Mittel und Materialien zum Homogenisieren sind im Stand der Technik allgemein bekannt. Siehe z. B. US-Patent 4,101,279. Somit kann der Fachmann besondere Homogenisierungsverfahren auswählen. Verfahren zur weiteren Verarbeitung und Analyse einer biologischen Probe, wie z. B. einer Fäzesprobe, werden weiter unten angegeben.
II. Verfahren zum Nachweis von Darmkrebs oder Präkanzerose
A. Referenzziel
Zur Erläuterung werden die erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis einer Deletion oder einer anderen Mutation im p53-Tumor-Suppressorgen von aus einer repräsentativen Fäzesprobe erhaltenen Zellen eingesetzt. Das p53-Gen ist eine gute Wahl, da der Verlust von Heterozygotie in p53 oft mit einem kolorektalen Karzinom einhergeht. Eine dem DNA-kodierenden Abschnitt von p53 entsprechende mRNA-Sequenz ist als GenBank mit der Hinterlegungsnummer M92424 angemeldet. Der Fachmann erkennt, dass die hier beschriebenen Verfahren dazu verwendet werden können, Mutationen in jedem Gen nachzuweisen und dass der Nachweis einer p53-Deletion beispielhaft für solche Verfahren ist. Wie unmittelbar zuvor beschrieben, wird mindestens ein Querschnitt einer entleerten Stuhlprobe erhalten und hergerichtet. Wahlweise lassen sich RNA oder DNA aus der Probe nach im Stand der Technik bekannten Verfahren isolieren. Siehe, Smith-Ravin, et al., Gut, 36: 81–86 (1995). Die erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich jedoch an unverarbeiteter Fäzes durchführen.
Nucleinsäuren können abgeschert oder beispielsweise mittels Restriktionsverdau in kleine Fragmente zerschnitten werden. Die Größe der Nucleinsäurefragmente ist nicht von Bedeutung und unterliegt den unten beschriebenen Einschränkungen. Es werden ein Zielallel, von dem erwartet wird, dass es mutiert ist (p53 in diesem Beispiel) sowie ein Referenzallel ausgewählt. Das Referenzallel kann jedes Allel sein, von dem bekannt ist oder erwartet wird, das es in Darmkrebszellen nicht mutiert ist. Einsträngige Nucleinsäurefragmente lassen sich unter Einsatz bekannter Verfahren herstellen. Siehe z. B. Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1969).
Mit den erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich entweder die Abschnitte eines kodierenden Stranges oder sein komplementärer Strang nachweisen. Zur Veranschaulichung werden der Nachweis des kodierenden Strangs für p53 sowie des Referenzallels beschrieben. Die Komplementärstränge zu sowohl p53 als auch dem Referenzallel werden mittels Hybridisierung an Anti-Komplementaritäts-Oliginucleotidsonden (Isolierungssonden) und die nachfolgende Entfernung der damit gebildeten Duplices beseitigt. Verfahren zur Entfernung von Komplementärsträngen aus einer Mischung von Einzelstrang-Oligonucleotiden sind im Stand der Technik bekannt und schließen Techniken wie die Affinitätschromatographie mit ein. Nach Überführung der Doppelstrang-DNA in Einzelstrang-DNA wird die Probe durch eine Affinitätssäule mit Isolierungssonden laufen gelassen, die komplementär zu der aus der Probe zu entfernenden Sequenz sind. Eine herkömmliche Säulenchromatographie ist zur Isolierung von Komplementärsträngen geeignet. Eine mit Sepharose oder jedem anderen geeigneten Material bepackte Affinitätssäule mit angehefteten komplementären Nucleotiden kann zur Isolierung von komplementärer DNA in der Säule verwendet werden, während die zu isolierende DNA über die Säule laufen gelassen wird. Siehe Sambrook, oben. Als Alternative können Isolierungsperlen verwendet werden, um, wie im Detail weiter unten beschrieben, Komplementärstränge auszusondern.
Nach Entfernung der komplementären Stränge erhält man erste Oligonucleotidsonden, die an mindestens einen Teil des p53-Allels hybridisieren und zweite Oligonucleotidsonden, die an mindestens einen Teil des Referenzallels hybridisieren. Die Sonden werden mit einem nachweisbaren Marker, wie z. B. Fluorescein oder nachweisbaren Teilchen, markiert. Unterschiedliche Marker für die Sonden sind bevorzugt.
Die markierten Sonden werden sodann der Probe unter Hybridisierungsbedingungen ausgesetzt. Solche Bedingungen sind im Stand der Technik gut bekannt. Siehe z. B. Wallace, et al., Nucleic Acids Res., 6: 3643–3557 (1979). Die ersten und zweiten Oligonucleotidsonden, welche unterschiedlich markiert sind (d. h. mit unterschiedlichen radioaktiven Isotopen, Fluoreszenzmitteln, oder mit Perlen verschiedener Größe; siehe weiter unten), werden mit gleichen Aliquots an Proben eingesetzt. Nachdem die Sonden unter Hybridisierungsbedingungen der Probe ausgesetzt worden waren, wird die Probe zur Entfernung sämtlicher nicht-hybridisierten Sonden gewaschen. Danach werden die hybridisierten Sonden getrennt nach p53-Hybriden und Referenzallel-Hybriden nachgewiesen. Standards werden zur Ermittlung des Hintergrunds und zum Ausgleichen der Ergebnisse eingesetzt. Falls unterschiedliche Fluoreszenzmarker verwendet werden, lässt sich die Zahl der Sonden auch durch Zählen der unterschiedlichen Fluoreszenzereignisse in einer Probe ermitteln, die genügend verdünnt worden war, damit einzelne Fluoreszenzereignisse in der Probe nachgewiesen werden können. Um die Genauigkeit der erhaltenen Ergebnisse abzusichern, können doppelte Proben analysiert werden.
Falls ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen der Menge von nachgewiesenem p53 und der Menge von nachgewiesenem Referenzallel auftritt, kann angenommen werden, dass in p53 eine Mutation stattgefunden hat und ein Risiko für den Patienten besteht, dass er entweder einen Darmkrebs bekommt oder sich ein solcher bereits ausgebildet hat. Eine statistische Signifikanz lässt sich mit jedem bekannten Verfahren nachweisen. Ein bevorzugtes Verfahren ist oben angegeben.
Mit dem Nachweis einer p53-Mutation kann der klinische Arzt für eine weitere Diagnose eine klinische Behandlung, wie z. B. endoskopische Verfahren, empfehlen und, falls nötig, das Befinden des Patienten behandeln. Die folgenden Beispiele veranschaulichen die erfindungsgemäßen Verfahren, mit denen sich Hybridisierungsereignisse direkt quantitativ angeben lassen.
1. Verfahren zur besseren Quantitätsbestimmung von Ziel- und Referenz-Polynucleotiden
Eine gesteigerte Quantitätsbestimmung von Bindungsereignissen zwischen den Hybridisierungssonden und dem Ziel oder der Referenz wird erreicht, indem die Hybridisierungssonden an Teilchen, wie z. B. Perlen (Hybridisierungsperlen) gekoppelt werden.
Um, ein genaues quantitatives Maß für den Polynucleotidgehalt in einer Probe zu erhalten, werden die Hybridisierungsperlen vor Durchführung der Hybridisierungen hergestellt, so dass an jeder Perle ein einzelnes Oligonucleotid angeheftet ist.
a. Verfahren zur Herstellung von Sonde/Perle-Kombinationen
Eine einzelne Sonde wird an eine Perle angeheftet, indem ein großer Überschuss an Hybridisierungsperlen mit Oligonucleotidsonden eines vorgegebenen Typs (d. h. entweder erste oder zweite Oligonucleotidsonden) inkubiert wird. Das Anheften einer Sonde an eine Perle erfolgt unter Verwendung eines Affinitätsbindungs-Paars. Beispielsweise können zum Anheften einer Sonde an eine Perle die Perlen mit Avidin oder Streptavidin beschichtet und die Sonden können mit Biotin markiert sein. Die Mischung der Perlen und Sonden wird heftig geschüttelt, so dass praktisch 100% der Sonden an Perlen gebunden werden. Die Mischung wird sodann einer Matrix ausgesetzt, wie z. B. einer Affinitätssäule oder einer Membran, die mit zur Sonde komplementären Oligonucleotiden beschichtet ist. Nur Perlen mit angehefteter Sonde bleiben an der Matrix haften, der Rest wird ausgewaschen. Die Perlen mit angehefteter Sonde werden sodann von der Matrix entfernt, indem die Hybridisierungen zwischen den Sonden und der Komplementärstruktur mittels Wärme aufgebrochen werden. Ein mehrmaliges Auftragen auf die Matrix und Vorwaschen der Säule reduziert unspezifische Bindungen. Darüber hinaus können nackte Perlen (d. h. ohne eine angeheftete Sonde) auf die Matrix aufgetragen werden, um eine Zahl für einen Blindwert von Perlen zu ermitteln, von denen erwartet werden kann, dass sie sich auch ohne Sonde an die Matrix anheften.
Dadurch dass, wie oben beschrieben, ein großer Überschuss an Perlen im Vergleich mit den Sonden eingesetzt wird, kann erwartet werden, dass die große Mehrheit der wiedergewonnenen Perlen nur eine angeheftete Sonde aufweist. Weist z. B. eine Mischung ein Verhältnis von 1 Sonde zu 1000 Perlen auf, kann erwartet werden, dass ungefähr nur 1 Perle unter einer Million zwei angeheftete Sonden aufweist und sogar weniger als 1 Perle unter einer Million mehr als zwei angeheftete Sonden enrhält. Dementsprechend werden die Hybridisierungsperlen mit einem effektiven Verhältnis von 1 : 1 mit einer Sonde versehen, womit sich eine genaue Quantitätsbestimmung von Ziel- und Referenz-Polynucleotid erzielen lässt, wie dies weiter unten beschrieben wird.
Für jeden der unten beschriebenen Versuche werden zwei unterschiedliche Hybridisierungsperlen verwendet. An eine erste Hybridisierungsperle ist eine einzige erste Oligonucleotidsonde angeheftet, die komplementär zu mindestens einem Abschnitt eines Zielpolynucleotids (z. B. einem p53-Allel) ist. An eine zweite Hybridisierungsperle mit einer sich von der ersten Hybridisierungsperle unterscheidenden Größe ist eine einzige zweite Oligonucleotidsonde angeheftet, die komplementär zu mindestens einem Abschnitt eines Referenzpolynucleotids (d. h. eines, von dem bekannt ist oder erwartet wird, dass es in der Probe nicht mutiert ist) ist.
b. Verwendung von Perlen zur quantitativen Bestimmung von Ziel- und Referenz-Polynucleotiden
Die DNA wird nach bekannten Verfahren geschmolzen (denaturiert, um einzelsträngige DNA zu bilden). Siehe z. B. Gyllensten, et al., in Recombinant DNA Methodology II, 565–578 (Wu, Hrg., 1995). Nach den erfindungsgemäßen Verfahren kann entweder ein kodierender Strang oder sein Komplementärstrang nachgewiesen werden, um die Ziel- und/oder Referenz-Polynucleotide quantitativ zu bestimmen. Zur Veranschaulichung wird im folgenden Beispiel der kodierende Strang nachgewiesen.
2. Entfernung der Komplementärstruktur
Die einsträngigen Komplementärstrukturen des Ziel- (z. B. p53) und Referenz-Polynucleotids werden aus der Probe entfernt, indem sie an Oligonucleotidsonden gebunden werden, welche komplementär zur Komplementärstruktur von Ziel und Referenz sind. Solche Sonden, im Folgenden als Isolierungssonden bezeichnet, werden vor ihrem Einsetzen in die Probe an die Isolierungsperlen angeheftet. Die Perlen können magnetisch sein. Werden somit die magnetischen Isolierungsperlen [mit angehefteten Isolierungssonden] in die Probe eingetragen, hybridisieren die angehefteten Isolierungssonden an den Komplementärstrang des Ziels oder der Referenz (oder umgekehrt). Die Isolierungsperlen werden vorzugsweise in großem Überschuss eingetragen, um die Bindung an die Komplementärstrukturen abzusättigen. Ist die Hybridisierung vollständig, wird ein Magnetfeld an die Probe angelegt, welches somit die magnetischen Isolierungsperlen (sowohl mit als auch ohne anhybridisierte Komplementärstrukturen) aus der Probe herauszieht. Unter der Annahme, dass genügend Isolierungsperlen in die Probe eingetragen worden waren, werden mit Entfernung der Isolierungsperlen auch alle Komplementärstrukturen des Ziels und der Referenz aus der Probe entfernt. In einer alternativen Ausführungsform zur Entfernung der Komplementärstrukturen wird ein Überschuss der Oligonucleotidsonde mit angeheftetem Biotin unter Hybridisierungsbedingungen der dehybridisierten Probe ausgesetzt. Ist die Hybridisierung vollständig, wird die Probe auf eine mit Avidin beschichtete Säule aufgetragen. Ob frei oder an die Komplementärstruktur gebunden, wird die an Biotin gebundene Sonde durch das Avidin auf der Säule gebunden. Die restliche DNA, einschließlich der nachzuweisenden kodierenden Stränge von Ziel und Referenz, passiert die Säule. Im Unterschied zur obigen Beschreibung zu den Hybridisierungsperlen werden die Perlen zur Entfernung von Komplementärstrukturen so hergestellt, dass an eine einzelne Perle zahlreiche Oligonucleotide gebunden sind.
3. Nachweis und quantitative Bestimmung von Ziel und Referenz
Zwei Sätze von Hybridisierungsperlen werden wie oben beschrieben hergestellt. An jedem Vertreter des ersten Satzes von Hybridisierungsperlen (von denen alle untereinander identisch sind) ist eine einzelne Oligonucleotidsonde angeheftet, welche zu mindestens einem Abschnitt des Zielpolynucleotids komplementär ist. An jedem Vertreter des zweiten Satzes von identischen Hybridisierungsperlen (von denen alle untereinander identisch sind, jedoch nicht mit dem ersten Satz)) ist eine einzelne Oligonucleotidsonde angeheftet, welche zu mindestens einem Abschnitt des Referenzpolynucleotids komplementär ist. Die Vertreter des zweiten Satzes von Hybridisierungsperlen unterscheiden sich in Größe und Farbe von den Vertretern des ersten Satzes von Hybridisierungsperlen. Die ersten und zweiten Hybridisierungsperlen können sich auch in anderen Merkmalen unterscheiden. Beispielsweise können an die Perlen Fluoreszenzmarker angeheftet sein, die sich durch Fluoreszenz bei verschiedenen Wellenlängen unterscheiden. Es lassen sich auch Perlen mit unterschiedlichen elektrochemischen Ladungen verwenden. Die genaue Ausführungsart, die zur Unterscheidung der Perlen eingesetzt wird, ist für die Erfindung nicht wesentlich, solange die Möglichkeit besteht, zwischen den ersten und zweiten Sonden auf der Grundlage von Unterschieden zwischen den angehefteten ersten und zweiten Perlen zu unterscheiden.
Beide Sätze von Hybridisierungsperlen mit angehefteten Sonden werden unter Hybridisierungsbedingungen der Probe zugesetzt, wobei dann die angeheftete Sonde an die Referenz oder das Ziel hybridisieren kann. Nach vollständiger Hybridisierung wird die Probe gewaschen, Um nicht hybridisierte Kombinationen von Perle/Sonde zu entfernen. Nicht hybridisierte Kombinationen von Perle/Sonde werden entfernt, indem man z. B. die Probe über eine Säule laufen lässt, welche DNA enthält, die zur Sequenz der Sonde komplementär ist. Somit werden alle nicht hybridisierten Kombinationen von Perle/Sonde auf der Säule zurückgehalten, während ein Duplex die Säule passiert. Danach wird die Probe einem Mittel zugeführt, welches die Differenz der Hybridisierungsperlen auszählt, um die ersten und zweiten Hybridisierungssonden, welch Duplices gebildet haben, quantitativ zu erfassen. Die erhaltenen Zahlen geben eine genaue Schätzung für die Zahl der Kopien von Referenz- und Ziel-Polynuclotiden in der Population, da das Mittel zum Zählen der Differenz einzelne Perlen zählt. Eine Perle ist gleich einer Sonde, welche ihrerseits eine Kopie der gemessenen Nucleinsäure darstellt.
Ein Beispiel für ein Mittel zur Differenzmessung ist ein Impedanzmessgerät, wie z. B. ein Coulter-Counter (Coulter Electronics, Inc., Miami, Florida). Die Probe wird durch das Gerät passieren gelassen, welches die beiden Arten von Hybridisierungsperlen unterschiedlich wahrnimmt, indem er ihre unterschiedliche Impedanz eines elektrischen Stromes misst. Alternativ kann das gerät die Fluoreszenz, Farbe oder andere Abweichungen messen. Um die Schnelligkeit des Tests zu erhöhen, kann ein Gerät mit mehreren Öffnungen eingesetzt werden. Ein Impedanzzähler mit mehreren Öffnungen ist schematisch in 2 wiedergegeben. Am einen Ende der Säule. die mit einer elektrisch leitenden Flüssigkeit, z. B. Saline, gefüllt ist, wird ein Array mit mehreren Öffnungen angebracht. Am entgegengesetzten Ende der Säule werden die Hybridisierungsperlen mit entweder hybridisierten Ziel- oder Referenzabschnitten aufgetragen. Jede Öffnung ist genügend groß, um gleichzeitig immer nur eine Hybridisierungsperle durchzulassen und genügend breit, um zuverlässige Impedanzmessungen zu ermöglichen. An jede Öffnung ist eine elektrische Spannung angelegt. Jede Hybridisierungsperle (die nicht leitend ist) tritt durch eine der Öffnungen hindurch, verdrängt ein Volumen an Saline, wodurch eine kurze Impedanzänderung hervorgerufen wird, welche zur Größe der Perle proportional ist. Diese verursacht ihrerseits einen messbaren Stromabfall, welcher direkt mit der Perlengröße korreliert ist. Durch Kompilieren der Zahl für jede der beiden unterschiedlichen Impedanzereignisse, erhält man eine genaue Abschätzung der Anzahl der Hybridisierungsperlen und daher die Zahl für die Sonden von jeder Art in der Population.
Nach der quantitativen Messung der ersten und zweiten Hybridisierungsperlen werden die Daten, wie oben beschrieben, analysiert, um zu bestimmen, ob irgend ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Mengen für die ersten und zweiten Hybridisierungsperlen (mit angehefteter hybridisierter Sonde) auftritt. Eine statistisch signifikante Verringerung in der Zielmenge ist ein Anzeichen für eine Mutation im Zielallel. Wo das p53-Gen das Zielallel ist, ist solch eine Mutation ein Anzeichen für ein kanzeröses oder präkanzeröses Befinden. Einem klinischen Arzt können solche Befunde als Grundlage dienen, eine weitere Behandlung, wie z. B. eine Endoskopie und polypektomische Verfahren zu verschreiben.
B. Nachweis von Mutationen bei Single-Base-Polymorphismus
Das oben beschriebene grundlegende Verfahren kann auch eingesetzt werden, um einen Verlust von Heterozygotie oder eine andere Mutation an einem Ort mit Single-Base-Polymorphismus zwischen maternalen und paternalen Allelen nachzuweisen. Typischerweise ist ein solcher Nachweis ein Anzeichen für eine größere Deletion oder eine andere Mutation. Eine Mutation an einem einzigen polymorphen Nucleotid kann jedoch alles sein, was für die Hemmung der Genfunktion in einem der beiden Allele nötig ist. Eine mit dem Verlust von Heterozygotie einhergehende Deletion kann auf Grund der jüngst entdeckten Erscheinung, die komplementäre Reduplikation genannte wird, schwierig nachzuweisen sein. Bei einer komplementären Reduplikation ergibt sich aus dem Verlust von einem oder zwei Allelen an einem besonderen Lokus eine „Reduplikation" des überlebenden Allels. Eine Reduplikation findet gewöhnlich auf dem Chromosom statt, welches das überlebende Allel enthält und betrifft die Produktion von einer oder mehreren Kopien des überlebenden Allels auf dem Chromosom in enger Nachbarschaft zur Position des überlebenden Allels. Im Falle eines Lokus, der eine oder mehrere allele Single-Base-Polymorphismen (d. h. die Heterozygotie an dem Lokus wird in Folge eines oder mehrerer Single-Base-Unterschiede in einem oder mehreren Abschnitten des Lokus ermittelt) ausbildet, resultiert die komplementäre Reduplikation auf dem das überlebende Allel enthaltenden Chromosom in der Insertion eines Duplikats von der Sequenz, die der entspricht, die zerstört wurde. Selbst unter den stringentesten Hybridisierungsbedingungen binden einige der Vertreter einer Sonde, die gegen die zerstörte Sequenz gerichtet ist, an die reduplizierte Sequenz am Lokus eines Single-Base-Polymorphismus. Demgemäß lasst sich unter solchen Umständen die Deletion nicht nachweisen, da jede wahre Differenz in der Zahl der Sonden, die an die polymorphe Stelle binden (d. h. an den den Single-Base-Polymorphismus aufweisenden Allelabschnitt) von einem Zuwachs überdeckt sein kann, der vom reduplizierten Abschnitt des anderen Allels herrührt.
Die mit komplementärer Reduplikation und mit der unspezifischen Bindung von Sonden im allgemeinen einhergehenden Probleme werden mit den erfindungsgemäßen Verfahren gelöst.
Mit diesen Verfahren lässt sich eine Deletion nachweisen, die in einem oder zwei Allelen an einem spezifischen Lokus in einer Subpopulation von in einer biologischen Probe enthaltenen Zellen auftritt. Zahlreiche Allele, einschließlich Tumor-Suppressorallele enthalten einzelne polymorphe Nucleotide im Kontext eines konstanten Nucleinsäureabschnitts. Individuen können normalerweise für ein bestimmtes polymorphes Nucleotid entweder homozygot oder heterozygot sein. Da in den meisten Allelen zahlreiche Nucleotidorte mit Single-Base-Polymorphismus vorkommen, ist die Wahrscheinlichkeit groß, dass ein vorgegebenes Individuum an mindestens einem der Orte mit Single-Base-Polymorphismus hetrozygot ist. Eine statistisch signifikante Verminderung in einem der beiden Nucleotide an einer Stelle mit Single-Base-Polymorphismus (an welcher das Individuum heterozygot ist) wird als Marker für eine Deletion in dem die Stelle aufweisenden Allel verwendet.
Genomabschnitte mit bekannten Single-Base-Polymorphismen werden mit Hilfe einer Nucleotiddatenbank identifiziert, wie z. B. GenBank, EMBL oder jeder anderen geeigneten Datenbank. Für die Zwecke der Erfindung soll ein Single-Base-Polymorphismus ein einzelnes polymorphes Nucleotid sein, das an einen nicht polymorphen Abschnitt des Allels anschließt, unabhängig davon, ob das einzelne polymorphe Nucleotid Teil einer größeren polymorphen Stelle ist (d. h. der Single-Base-Polymorphismus kann das terminale Nucleotid eines größeren Polynucleotid-Polymorphismus sein). Für einen Krebsnachweis sind die in Frage kommenden Abschnitte solche, wo Heterozygotie vorherrscht, wie. z. B. Tumor-Suppressorgene. Ein vorgegebenes Individuum kann für ein polymorphes Nucleotid in jedem identifizierten Abschnitt mit Single-Base-Polymorphismus homozygot oder heterozygot sein. Ist entsprechend eine Anzahl von Abschnitten mit Single-Base-Polymorphismus identifiziert worden, wächst die Wahrscheinlichkeit, dass in einer Probe mindestens ein heterozygoter Abschnitt mit Single-Base-Polymorphismus gefunden wird.
Sind die Orte mit Single-Base-Polymorphismus erst einmal identifiziert, wird vom Patienten eine Probe entnommen, um zu ermitteln, welche dieser Orte in normalen (d. h. nicht kanzerösen oder präkanzerösen) Zellen herterozygot ist. Sodann wird die Probe wie oben beschrieben hergerichtet. Doppelsträngige DNA in der Probe wird in einsträngige DNA überführt. Dann wird entweder der kodierende Strang oder der Strang mit den Anticodons für beide Allele aus der Probe isoliert. Wie aus den folgenden Ausführungen ersichtlich, spielt es für die in Frage stehenden Verfahren keine Rolle, ob der kodierende Strang oder der Strang mit den Anticodons in der Probe verbleibt.
Eine Oligonucleotidsonde wird so konstruiert, dass sie zu einem Teil des Abschnitts mit Single-Base-Polymorphismus komplementär ist, wobei dieser Teil mit dem Nucleotid endet, das sich unmittelbar in 3'-Richtung an das polymorphe Nucleotid anschließt, unabhängig davon, ob der 5'-3'-Strang (kodierender Strang) oder der 3'-5'-Strang (Anticodonstrang) als Matrize verwendet wird. 3 zeigt vier mögliche Sonden, die, wie oben beschrieben, unmittelbar in 3'-Richtung von jedem der vier möglichen Matrizenstränge hybridisieren (die Sequenzen in 3 sind hypothetisch und sollen keine aktuellen Sequenzen wiedergeben). Während jeder Strang als Matrize zum Anbinden einer Sonde verwendet werden kann, um eine Heterozygotie und/oder einen Verlust derselben zu ermitteln, sind die Sequenzen der Sonden, die an die Matrize hybridisiert werden je nach verwendetem Strang unterschiedlich. Die Sonden können von jeder Länge sein, die eine wirksame und spezifische Hybridisierung der Sonde an das Ziel erlaubt. 3 zeigt die vier Sonden, die zur Hybridisierung an die gezeigte hypothetische Sequenz taugen. Für jeden zu analysierenden Genomabschnitt lässt sich die geeignete Länge der Sondensequenzen ermitteln. Eine bevorzugte Länge liegt zwischen etwa 10 und 100 Nucleotiden. Die Größe einer Sonde hängt auch von der Größe des den Single-Base-Polymorphismus umgebenden Abschnitts ab (d. h. der in 5'- oder 3'-Richtung bis zum nächsten angrenzenden Polymorphismus gelegene Abschnitt, falls es einen solchen gibt). Die Details zum Aufbau und der Hybridisierung von Oligonucleotidsonden sind im Stand der Technik bekannt.
Wenn erst einmal konstruiert, hybridisieren einheitliche Sonden für jeden polymorphen Abschnitt an die Abschnitte von sowohl maternalen als auch paternalen Allelen bis zu, ausschließlich, dem polymorphen Nucleotid, das in einer Heterozygote in maternalen und paternalen Allelen unterschiedlich ist. 3 veranschaulicht das vorausgehende Hybridisierungsverfahren. 3 zeigt nur einen kleinen Ausschnitt des das polymorphe Nucleotid umgebenden Abschnitts. Die in 3 gezeigten Allele sind an der polymorphen Stelle heterozygot (in 3 fett gedruckt).
Die Sonde wird an ihre spezifische Matrizen-DNA (siehe oben) mittels im Stand der Technik bekannter Standardverfahren hybridisiert. Die Probe kann zur Entfernung nicht hybridisierter Sonden wahlweise gewaschen werden. Um zu bestimmen, ob jeder Abschnitt mit Single-Base-Polymorphismus, an welchen sich die Sonde gebunden hat, am polymorphen Nucleotid heterozygot oder homozygot ist, wird eine Modifikation des bei Sanger, Proc. Nat'l-Acad. Sci. (USA), 74: 5463–540? (1977) beschriebenen Didesoxy-Kettenabbruchverfahrens verwendet. In dem Verfahren werden mindestens zwei der vier gemeinsamen 2',3'-Didesoxy-Nucleosidtriphosphate (ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP) verwendet. Nach den Verfahren im Stand der Technik wird an die Didesoxy-Nucleosidtriphosphate (ddNTP) jeweils ein unterschiedlich nachweisbarer Marker angeheftet. Unterschiedlich markierte ddNTPs sind von der Perkin Elmer Corporation (Katalog-Nr. 401456) erhältlich. Jede Probe mit einer, wie oben beschrieben, an maternale und paternale Alle anhybridisierten Sonde wird sodann mit mindestens zwei markierten ddNTPs versetzt. Die Auswahl, welche zwei ddNTPs eingesetzt werden, hängt von den Nucleotiden an der heterozygoten polymorphen Stelle ab. Der Probenmischung wird auch eine DNA-Polymerase, wie z. B. Sequenase^TM (Perkin Elmer) zugesetzt. Unter Verwendung der Allelstränge als Primer fügt die Polymerase ein ddNTP an das 3'-Ende der Sonde an, wobei das eingebaute ddNTP komplementär zu dem an der Stelle mit Single-Base-Polymorphismus vorkommenden Nucleotid ist. Weil die ddNTPs an ihrer 3'-Position keine Hydroxylgruppe aufweisen, kann eine weitere Verlängerung der hybridisierten Sonde nicht stattfinden. Daraufhin wird die Probe zur Entfernung überschüssiger ddNTPs gewaschen. In jeder Probe werden sodann die Marker ausgezählt. Das Vorkommen von zwei unterschiedlich markierten ddNTPs in einer Probe ist ein Anzeichen für Heterozygotie an der polymorphen Stelle. In den oben beschriebenen Verfahren kann jedes an der 3'-Position modifizierte Nucleosidtriphosphat eingesetzt werden, sofern diese Modifikation an der 3'-Position die Bindung weiterer Nucleotide an das 3'-Ende (d. h. eine Sondenverlängerung) verhindert und die Anbindung des modifizierten Nucleotids an das 3'-Ende der Sonde nicht unterbindet.
Es ist nicht nötig, die Menge von jeder in der Probe enthaltenen Markierung zu bestimmen, um Heterozygotie oder Homozygotie nachzuweisen. Es lassen sich beispielsweise unterschiedlich markierte Desoxynucleosidtriphosphate für einen Nachweis von Heterozygotie oder Homozygotie einsetzen. Die bloße Tatsache, dass zwei unterschiedlich markierte Didesoxynucleotide in die Probe eingebaut werden bedeutet, dass die analysierte Stelle mit Single-Base-Polymorphismus heterozygot ist. Der Nachweis von Stellen, wo ein Patient polymorph ist, ist jedoch nützlich, um das grundsätzliche Muster von Polymorphismus nachzuweisen, was in späteren Tests genutzt werden kann, um Veränderungen an den polymorphen Stellen aufzuspüren, welche ein Anzeichen für Krebs sein können. Das Auftreten von Polymorphismus lässt sicht mit der in der vorliegenden Beschreibung wiedergegebenen Lehre, mit einer Gelelektrophorese oder mit anderen Verfahren nachweisen.
In dem Falle, wo Heterozygotie an einem polymorphen Ort vorkommt, lässt sich durch Auszählen der Mengen für die beiden jeweils unterschiedlich markierten ddNTPs der Nachweis führen, ob ein Verlust von Heterozygotie (d. h. eine Deletion) in einer Subpopulation von Zellen in der Probe auftritt. In einer normalen (d. h. nicht kanzerösen) Probe mit Zellen, die am Ort des Single-Base-Polymorphismus heterozygot sind, wird erwartet, dass die ermittelte Menge von jeder der beiden der Probe zugesetzten ddNTPs identisch ist (innerhalb der ausgewählten Grenzen für statistische Signifikanz). Ist jedoch eine Deletion in einem der beiden Allele bei der Subpopulation von Zellen in der Probe aufgetreten, wird über die eingebauten (markierten) ddNTPs ein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Mengen für jedes der beiden Allele ermittelt. Der Nachweis eines solchen Unterschieds ist ein Anzeichen für genomische Instabilität in der Probe. Eine solche genomische Instabilität weist auf die Möglichkeit von kanzerösen oder präkanzerösen Zellen in der Probe hin.
Um die Fähigkeit zu verbessern, Allele mit angehefteten ddNTPs genau zu zählen, werden die ddNTPs, wie oben beschrieben, mit Hybridisierungsperlen unterschiedliche Größe markiert. Allele mit einer angehefteten Sonde, die eine ddNTP-Markierung aufweist, werden, wie oben beschrieben mit einem Zählgerät, wie z. B. einem Coulter Counter, gezählt. Wie ebenfalls oben beschrieben, werden unterschiedliche Fluoreszenzmarker oder andere Zählvorrichtungen eingesetzt, um eingebaute ddNTPs separat zu ermitteln.
Der Nachweis von Heterozygotie an Stellen mit Single-Base-Polymorphismus sowie der Nachweis des Verlustes von Heterozygotie kann in getrennten Schritten erfolgen. Beispielsweise können, wie oben beschrieben, Sonden in unmittelbarer Nachbarschaft, aber nicht einschließlich, an das als polymorph erkannte Nucleotid hybridisiert werden. Die vier ddNTPs können dann der Probe zugesetzt werden, die sodann gewaschen wird und dann kann das das Vorkommen oder Fehlen jedes der Marker ermittelt werden. Der Nachweis nur einer Markierung zeigt an, dass das Individuum, von dem die Probe gewonnen wurde, an der Stelle des polymorphen Nucleotids homozygot ist. Der Nachweis von zwei Markern bedeutet, dass das Individuum heterozygot ist. Die heterozygoten Loci werden notiert. Wie oben angeführt, können Basisbestimmungen von Heterozygotie durch den Einsatz von Standard-Desoxynucleotiden erfolgen. Ist erst eine Basismuster erstellt, können an diesem Individuum spätere Test auf Heterozygotie durchgeführt werden, um, wie unmittelbar zuvor beschrieben, einen Verlust an Heterozygotie nachzuweisen. Für den Nachweis von Krebs sind die herozygoten Loci typischerweise Tumor-Suppressorgene, wie p53, dcc, apc und andere. Bei Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren lässt sich ein „Fingerabdruck" der heterozygoten Tumor-Suppressor-Loci erstellen. Eine spätere Abweichung vom Fingerabdruck (d. h. von den Deletionen) liefert wertvolle Information zur Entwicklung von Krebs.
Eine bevorzugte Verwendung der vorstehenden Verfahren liegt im Nachweis von Dickdarmkrebs. Eine repräsentative Fäzesprobe wird, wie oben beschrieben, hergerichtet. In den Puffer wird zumindest ein Querschnitt der Fäzesprobe eingetragen und homogenisiert. Doppelsträngige DNA wird in einsträngige DNA überführt und die Komplementärstruktur des nachzuweisenden Stranges wird nach jedem der oben beschriebenen Verfahren aus der Probe entfernt. Die verbleibende Einstrang-DNA wird Mehrfachkopien einer Sonde ausgesetzt, die auf Grundlage von bekannten Single-Base-Polymorphismen in einem mit Krebs assoziierten Allel, wie z. B. einem Tumor-Suppressor-Allel, entworfen ist, so dass die Sonde mit einer gewünschten Anzahl von unmittelbar an das polymorphe Nucleotid angrenzenden Nucleotiden, wie oben beschrieben, hybridisiert. Nach Abschluss der Hybridisierung wird die Probe gewaschen und unterschiedlich markierten ddNTPs sowie einer DNA-Polymerase ausgesetzt. Die Probe wird sodann gewaschen, um nicht eingebaute ddNTPs zu entfernen. Das Vorkommen von jedem markierten ddNTP wird ermittelt. Werden zwei Markierungen nachgewiesen, ist das Individuum, von dem die Probe stammt, am polymorphen Nucleotid heterozygot. Die Heterozygotie des Alles und die Sondensequenz, die zu der unmittelbar an das polymorphe Allel angrenzenden Stelle passt, werden für Referenzzwecke in späteren Tests auf Verlust von Heterozygotie notiert. Wurde bei einem Patienten nachgewiesen, dass er an einem Lokus heterozygot ist, kann eine Untersuchung unmittelbar in der oben beschriebenen Weise durchgeführt werden, um einen aufgetreten Verlust an Heterozygotie in einer Zellsubpopulation in der Probe zu ermitteln.
C. Analyse einer Mikrosatelliteninstabilität
Mikrosatelliten sind im gesamten Genom aufgefundene Di- oder Trinucleotid-Repeats. Ein spezieller Bereich von Mikrosatelliten-Repeats ist oft mit einer speziellen Genomsequenz assoziiert und wird unter normalen Bedingungen stabil vererbt. Erhöhungen bei der Anzahl von Kopien von Mirosatelliten gehen typischerweise mit Defekten bei der Mismatch- Reparatur einher. Demgemäß weisen Veränderungen in Mikrosatelliten-Bereichen darauf hin, dass der Patient Gefahr läuft, dass auch in anderen Genomabschnitten Mutationen auftreten, die zu Krebs führen können.
Um eine Mikrosatelliteninstabilität als Indikator für eine Mutation in einem mit Krebs in Verbindung stehenden Gen aufzufinden, muss zunächst ein Mikrosatelliten-Abschnitt, der mit dem in Frage kommenden Gen assoziiert ist, identifiziert werden. Solche Abschnitte werden typischerweise mit einer Datenbank, wie z. B. GenBank; EMBL und anderen, identifiziert. Ist ein mit beispielsweise dem p53-Tumor-Suppressorgen assoziierter Wildtyp-Mikrosatellitenabschnitt erst einmal identifiziert, wird eine Oligonucleotid-Sonde konstruiert, welche den Mikrosatellitenabschnitt sowie die sich unmittelbar in 5'- und 3'-Richtung zum Mikrosatellitenabschnitt anschließenden Abschnitte überspannt. Die genaue Länge der Sonden kann vom Experimentator bestimmt werden. Es werden Sonden konstruiert, die sowohl auf den maternalen als auch paternalen Allelen, in denen der Mikrosatellit beispielsweise mit p53 assoziiert ist, an den Satellitenabschnitt einschließlich der 5'- und 3'-Erweiterungen hybridisieren.
Eine geeignete Probe von Körpergewebe oder -flüssigkeit wird, wie in der Beschreibung angegeben, gewonnen und weiterverarbeitet. Doppelsträngige DNA wird denaturiert und ein Überschuss an maternalen und paternalen Sonden, wie oben beschrieben, in die Probe unter Hybridisierungsbedingungen eingetragen. Die Sonden werden, wie oben beschrieben, nachweisbar markiert. Komplementärstrukturen zu den nachzuweisenden Strängen können wahlweise mit den oben beschriebenen Verfahren entfernt werden. Die Probe wird sodann gewaschen, um nicht hybridisierte Sonden zu entfernen und der Anteil hybridisierter Sonden wird ermittelt.
Der quantitative Nachweis kann mit jedem der in dieser Beschreibung angegebenen Verfahren erfolgen. Beispielsweise können Sonden an Hybridisierungsperlen so angeheftet werden, dass Sonden, die sich an maternale Allele anbinden, an Perlen einer ersten Größe angeheftet sind und Sonden, die sich an paternale Allele anbinden an Perlen einer zweiten Größe angeheftet sind, welche sich von den Perlen der ersten Größe unterscheiden. Perlen mit angehefteten Sonden lassen sich wie oben beschrieben auszählen.
Der Nachweis eines statistisch signifikanten Unterschieds zwischen der Menge von Sonden, die an das maternale Allel anbinden und der Menge von Sonden, die an das paternale Allel anbinden ist ein Anzeichen für Mikrosatelliteninstabilität. Wie zuvor erwähnt, ist Mikrosatelliteninstabilität ein Anzeichen für eine Mutation an dem Lokus, wo der Mikrosatellit sitzt. Falls der Mikrosatellitenabschnitt mit einem Tumor-Suppressorgen oder einem Onkogen assoziiert ist, ist der Nachweis von Mikrosatelliteninstabilität auf einem Allel in einer Subpopulation von Zellen in einer biologischen Probe ein Anzeichen für Krebsanfälligkeit, oder dafür, dass sich Krebs oder Präkanzerose bereits entwickelt haben können. Es kann sodann, wie in der vorliegenden Beschreibung ausgeführt, eine weitere Untersuchung (entweder mit invasiven oder nicht-invasiven Mitteln) erfolgen.
In einer alternativen Ausführungsform wird ein „Fingerabdruck" von Mikrosatelliten aus Abschnitten genommen, die in einer einem Patienten entnommenen Probe mit Krebs verursachenden Genen assoziiert sind. Der Fingerabdruck umfasst die Sequenz von Wildtyp-Mikrosatelliten, die mit dem Krebs verursachenden Gen oder Genen assoziiert sind. Ein genommener Fingerabdruck wird aufbewahrt und in späteren Tests von Proben, die vom demselben Patienten stammen, verwendet, um Veränderungen in den Mikrosatellitenabschnitten (d. h. eine Mikrosatelliteninstabilität) festzuhalten, die mit der Ausbildung von Krebs in Zusammenhang stehen können. Zeitliche Veränderungen in der Mikrosatellitenlänge und/oder -sequenz können herangezogen werden, um weitere Tests und/oder eine Behandlung zu verschreiben, damit kanzeröses Gewebe im Frühstadium der Krebsentstehung aufgespürt und entfernt wird.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Detektion der Anwesenheit einer Subpopulation von Zellen in einer aus einem Organismus erhaltenen biologischen Probe, bei dem man: a) von der biologischen Probe eine Zahl X eines ersten Wildtyp-Polynukleotids bestimmt, welches in der Subpopulation von Zellen charakteristisch für eine nicht mutierte Region ist, b) von der biologischen Probe eine Zahl Y eines zweiten Wildtyp-Polynukleotids bestimmt, das in der Subpopulation von Zellen mutmaßlich mutiert ist, und c) bestimmt, ob zwischen der Zahl X, wobei die Zahl X auf die Menge eines Referenzallels in der Probe hinweist, und der Zahl Y, wobei die Zahl Y auf die Menge des Wildtyp-Zielallels in der Probe hinweist, eine statistisch signifikante Differenz existiert, wobei das Vorhandensein einer statistisch signifikanten Differenz auf die Anwesenheit einer Subpopulation von Zellen in der biologischen Probe hinweist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem man in Schritt a) die Probe weiterhin einer Vielzahl einer ersten Oligonukleotidsonde aussetzt, die mindestens zu einem Teil der Nukleotidsequenz des ersten Polynukleotids komplementär ist, und einer Vielzahl einer zweiten Oligonukleotidsonde aussetzt, die mindestens zu einem Teil der Nukleotidsequenz des zweiten Polynukleotids unter Hybridisierungsbedingungen komplementär ist, um dadurch eine erste Anzahl von Duplexen zu hybridisieren und detektieren, die zwischen der ersten Sonde und dem ersten Segment gebildet werden, und eine zweite Anzahl von Duplexen, die zwischen der zweiten Sonde und dem zweiten Segment gebildet werden, wobei die Anzahl von Duplexen, welche zwischen der ersten Sonde und dem ersten Polynukleotid und zwischen der zweiten Sonde und dem zweiten Polynukleotid gebildet werden, auf die Zahl X und die Zahl Y hinweist, und die Probe wahlweise ein Säugergewebe ist.
Verfahren gemäß den vorangehenden Ansprüchen zur Detektion eines allelischen Verlusts eines Zielallels in der Subpopulation, worin die biologische Probe eine heterogene Probe zellulären Materials ist, worin die Vielzahl einer ersten Oligonukleotidsonde eine Vielzahl erster Isolationssonden ist, von denen jede nur an mindestens einen Teil hybridisieren kann von entweder: einem kodierenden Strang des Referenzallels oder einem Komplementär eines kodierenden Strangs des Referenzallels, und worin die Vielzahl einer zweiten Oligonukleotidsonde eine Vielzahl zweiter Isolationssonden ist, von denen jede nur an mindestens einen Teil hybridisieren kann von entweder: einem kodierenden Strang des Zielallels oder einem Komplementär eines kodierenden Strangs des Zielallels.
Verfahren gemäß den vorangehenden Ansprüchen zur Detektion einer Deletion in einem polymorphen Lokus in der Subpopulation von Zellen, worin entweder die Zahl X oder die Zahl Y auf die Menge von maternalem Allel an einem polymorphen Lokus hinweist und worin die andere Zahl X oder Y auf die Menge von paternalem Allel an einem polymorphen Lokus hinweist und worin die Differenz auf eine Deletion an dem polymorphen Lokus in der Subpopulation von Zellen hinweist.
Verfahren gemäß den vorangehenden Ansprüchen, worin die Subpopulation von Zellen bösartig ist.
Verfahren gemäß den vorangehenden Ansprüchen, worin die Probe ein Gewebe oder eine Körperflüssigkeit eines Säugers ist und worin das Vorhandensein der statistisch signifikanten Differenz auf das Vorhandensein eines kolorektalen Krebs oder einer präkanzerösen Wunde in der Probe hinweist.
Verfahren gemäß den vorangehenden Ansprüchen, worin die biologische Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Eiter, Sputum, Sperma, Urin, Blut, Speichel, Cerebrospinalflüssigkeit, Stuhl und Biopsiegewebe.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 2–7, worin die erste Oligonukleotidsonde mit einem ersten Kennzeichen detektierbar gekennzeichnet ist und worin die zweite Oligonukleotidsonde mit einem zweiten Kennzeichen detektierbar gekennzeichnet ist.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 2–8, bei dem man von der biologischen Probe weiterhin jegliche unhybridisierte erste oder zweite Oligonukleotidsonde entfernt.
Verfahren gemäß den vorangehenden Ansprüchen, bei dem man weiterhin vor dem Schritt a) doppelsträngige DNA in der Probe in einzelsträngige DNA konvertiert und das Komplementär zu den ersten und zweiten Polynukleotidsegmenten entfernt.
Verfahren gemäß Anspruch 10, worin die Entfernung des Komplementärs die Hybridisierung des Komplementärs an eine Nukleinsäuresonde, die an ein magnetisches Partikel gebunden ist, und das anschließende Entfernen des magnetischen Partikels von der Probe umfasst.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 2–11, worin die ersten Oligonukleotide im Verhältnis von einer ersten Oligonukleotidssonde zu einem Partikel an ein erstes Partikel gebunden sind und die zweiten Oligonukleotidsonden im Verhältnis von einer zweiten Oligonukleotidsonde zu einem zweiten Partikel an ein zweites Partikel gebunden sind, das detektierbar verschieden von dem ersten Partikel ist, und worin der Detektionsschritt umfasst, dass man hybridisierte von unhybridisierten ersten und zweiten Oligonukleotidsonden trennt und anschließend hybridisierte erste und zweite Oligonukleotidsonden durch einen Detektor leitet, um X und Y zu bestimmen, wobei wahlweise entweder die erste und zweite Sonde von detektierbar verschiedener Farbe sind oder die ersten und zweiten Partikel von detektierbar verschiedener Größe sind.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 3–12, worin das Zielallel ein Tumorsuppressorallel ist, und wahlweise das Tumorsuppressorallel ein p53 Allel ist.
Verfahren gemäß den Ansprüchen 5–12, bei dem der polymorphe Lokus aus einer Datenbank von Nukleotidsequenzen identifiziert wird.