JPH10503384A - ゲノム上不均一な細胞サンプルにおける形質転換細胞のクローン集団検出のための方法 - Google Patents
ゲノム上不均一な細胞サンプルにおける形質転換細胞のクローン集団検出のための方法Info
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Abstract
Description
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.生物から得られる生物学的サンプルにおいて、形質転換細胞のクローン亜集 団の存在を検出する方法であって、以下の工程: a) 該生物学的サンプルから、形質転換細胞の該亜集団において変異してい ない該生物のゲノム領域に特有な第1の野性型ポリヌクレオチドの数値Xを決定 する工程; b) 該生物学的サンプルから、形質転換細胞の該亜集団において変異してい ることが推測される該生物のゲノム領域において、第2の野性型ポリヌクレオチ ドの数値Yを決定する工程;および C) 数値Xと数値Yとの間に差異が存在するかどうかを決定する工程; を包含し、 ここで、統計学的有意差の存在は、該生物学的サンプルにおいて、形質転換細 胞のクローン亜集団を示唆する、方法。 2.前記形質転換細胞が悪性である、請求項1に記載の方法。 3.前記生物学的サンプルが、膿汁、痰、精液、尿、血液、唾液、髄液、および 生検組織からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。 4.前記生物学的サンプルが糞便サンプルである、請求項1に記載の方法。 5.前記工程a)が、前記生物学的サンプルを、前記第1のポリヌクレオチドの 少なくとも一部のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を有する、第1 のオリゴヌクレオチドプローブに曝す工程を包含する、請求項1に記載の方法。 6.前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが検出可能に標識される、請求項5 に記載の方法。 7.前記数値Xが、前記第1のポリヌクレオチドと二本鎖を形成する前記第1の オリゴヌクレオチドプローブの数に比例する、請求項5に記載の方法。 8.前記工程b)が、前記生物学的サンプルを、前記第2のポリヌクレオチドの 少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を有する、第2のオリゴヌクレオチ ドプローブに曝す工程を包含する、請求項1に記載の方法。 9.前記数値Yが、前記第2のポリヌクレオチドと二本鎖を形成する前記第2の オリゴヌクレオチドプローブの数に比例する、請求項8に記載の方法。 10.前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが検出可能に標識される、請求項 8に記載の方法。 11.哺乳動物組織または体液サンプルにおいて、直腸結腸ガンまたは前ガン病 巣の存在を検出する方法であって、以下の工程: (a) 該サンプルを、複数の第1のオリゴヌクレオチドプローブおよび複数 の第2のオリゴヌクレオチドプローブに、ハイブリダイゼーション条件下で曝す 工程であって、それによって、 (1) 該第1のオリゴヌクレオチドプローブを、生物の野性型細胞に特有 な第1のポリヌクレオチドセグメントのコピーとハイブリダイズさせ、そして (2) 該第2のオリゴヌクレオチドプローブを、結腸直腸ガン細胞におい て、欠失または変異したことが推測される、野性型ゲノム領域に特有な第2のポ リヌクレオチドセグメントのコピーとハイブリダイズさせる、工程; (b) 該第1のプローブと該第1のセグメントとの間で形成された第1の二 本鎖の数、および該第2のプローブと該第2のセグメントとの間で形成された第 2の二本鎖の数を検出する工程;および (c) 該第1のプローブと該第1のセグメントとの間で形成された二本鎖の 数と、該第2のプローブと該第2のセグメントとの間で形成された二本鎖の数と の間に差異があるかどうかを決定する工程; を包含し、 ここで、統計学的有意差の存在は、該サンプルにおいて、直腸結腸ガンまたは 前ガン病巣の存在を示唆する、方法。 12.前記第1および第2のオリゴヌクレオチドプローブのそれぞれが、個別に 検出可能な標識に結合される、請求項11に記載の方法。 13.前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが、1つの粒子に1つの第1のオ リゴヌクレオチドプローブの割合で、第1の粒子に付着され、そして前記第2の オリゴヌクレオチドプローブが、1つの第2の粒子に1つの第2のオリゴヌクレ オチドプローブの割合で、該第1の粒子とは区別して検出可能に第2の粒子に付 着され、ここで、 前記検出する工程が、ハイブリダイズしていない第1および第2のオリゴヌク レオチドプローブから、ハイブリダイズした第1および第2のオリゴヌクレオチ ドプローブを分離し、その後、ハイブリダイズした第1および第2のオリゴヌク レオチドプローブを検出器に通過させて、前記第1および第2の数を決定する工 程を包含する、 請求項11に記載の方法。 14.前記第1および第2の粒子が検出可能に異なるサイズの粒子である、請求 項13に記載の方法。 15.前記第1および第2の粒子が検出可能に異なる色の粒子である、請求項1 3に記載の方法。 16.前記工程a)の前に、前記サンプル中の二本鎖DNAを一本鎖DNAに変換し、 そして前記第1および第2のポリヌクレオチドセグメントに対する相補物を取り 出す工程をさらに包含する、請求項11に記載の方法。 17.前記取り出し工程が、前記相補物を、磁性粒子に付着される核酸プローブ にハイブリダイズさせる工程、およびその後、前記サンプルから該磁性粒子を取 り出す工程を包含する、請求項16に記載の方法。 18.生物学的サンプルにおいて、細胞の亜集団中の標的対立遺伝子における核 酸配列の変化を検出する方法であって、以下の工程: (a) (i) 該生物学的サンプル中の野性型標的対立遺伝子の量、 および (ii) 該生物学的サンプル中の対照対立遺伝子の量、 を決定1る工程;ならびに (b) 該生物学的サンプルにおいて、細胞の亜集団中の標的対立遺伝子にお ける核酸配列の変化を検出する工程; を包含し、 ここで、該決定する工程で得られる野性型標的対立遺伝子の量および対照対立 遺伝子の量における統計学的有意差が、核酸配列の変化を示唆する、方法。 19.前記決定する工程が、前記生物学的サンプルを、前記野性型対立遺伝子の 一部とハイブリダイズし得る第1のオリゴヌクレオチドプローブ、および前記対 照対立遺伝子の一部とハイブリダイズし得る第2のオリゴヌクレオチドプローブ に曝す工程、および該生物学的サンプルから、いずれかのハイブリダイズしてい ない第1または第2のオリゴヌクレオチドプローブを除去する工程を包含する、 請求項18に記載の方法。 20.前記生物学的サンプルが、糞便、膿汁、精液、血液、組織、および尿から なる群より選択される、請求項18に記載の方法。 21.前記標的対立遺伝子が腫瘍抑制対立遺伝子である、請求項18に記載の方 法。 22.前記腫瘍抑制対立遺伝子がp53対立遺伝子である、請求項18に記載の方 法。 23.細胞物質の不均一なサンプルにおいて、標的対立遺伝子の亜集団における ヌクレオチド配列の変化を検出する方法であって、以下の工程: a) 該不均一なサンプルを、ハイブリダイゼーション条件下で、複数の単離 プローブに曝す工程であって、ここで、該単離プローブのそれぞれが、該標的対 立遺伝子のコーディング鎖、および該標的対立遺伝子のコーディング鎖の相補物 からなる第1の群より選択されるただ1つのメンバーの少なくとも一部にハイブ リダイズし得る、工程; b) 該不均一なサンプルを、ハイブリダイゼーション条件下で、複数の第2 の単離プローブに曝す工程であって、ここで、該単離プローブのそれぞれは、対 照対立遺伝子のコーディング鎖、および該対照対立遺伝子のコーディング鎖の相 補物からなる第2の群より選択されるただ1つのメンバーの少なくとも一部にハ イブリダイズし得る、工程; c) 該不均一なサンプルを、ハイブリダイゼーション条件下で、複数の第1 のハイブリダイゼーションプローブに接触させる工程であって、ここで、該ハイ ブリダイゼーションプローブのそれぞれは、該第1の単離プローブがハイブリダ イズしない該第1のグループのメンバーの少なくとも一部にハイブリダイズし得 る、工程; d) 該不均一なサンプルを、ハイブリダイゼーション条件下で、複数の第2 のハイブリダイゼーションプローブに接触させる工程であって、ここで、該ハイ ブリダイゼーションプローブのそれぞれは、該第2の単離プローブがハイブリダ イズしない該第2のグループのメンバーの少なくとも一部にハイブリダイズし得 る、工程; e) 該不均一なサンプルから、ハイブリダイズしていない第1および第2の ハイブリダイゼーションプローブを除去する工程; f) 該除去する工程の後、該不均一なサンプル中に残存する該第1および第 2のハイブリダイゼーションプローブのそれぞれの量を決定する工程;および g) 該標的対立遺伝子の亜集団における対立遺伝子の消失を、該決定する工 程で得られる該第1のハイブリダイゼーションプローブおよび該第2のハイブリ ダイゼーションプローブの量における統計学的有意差として検出する工程; を包含する、方法。 24.前記第1および第2のハイブリダイゼーションプローブが特異的に標識さ れる、請求項23に記載の方法。 25.前記第1および第2のハイブリダイゼーションプローブが、それぞれ第1 および第2のハイブリダイゼーションビーズに、1つのビーズに1つのプローブ の割合で付着される、請求項23に記載の方法。 26.前記第1のハイブリダイゼーションビーズが、前記第2のハイブリダイゼ ーションビーズとは異なるサイズのビーズである、請求項25に記載の方法。 27.前記検出する工程が、前記第1および第2のハイブリダイゼーションビー ズをコールターカウンターに通過させる工程を包含する、請求項26に記載の方 法。 28.前記標的対立遺伝子が、その変異が疾患に関連している対立遺伝子である 、請求項23に記載の方法。 29.前記疾患がガンである、請求項28に記載の方法。 30.前記細胞物質のサンプルが、患者から得られる糞便サンプルである、請求 項28に記載の方法。 31.糞便サンプルの対立遺伝子消失が検出される患者において、内視鏡検査手 順を実施する工程をさらに包含する、請求項30に記載の方法。 32.生物学的サンプルにおいて、細胞の亜集団中の多形性遺伝子座における欠 失を検出する方法であって、以下の工程: a) 該生物学的サンプルにおいて、多形性遺伝子座での母系対立遺伝子の量 を検出する工程; b) 該生物学的サンプルにおいて、多形性遺伝子座での父系対立遺伝子の量 を検出する工程;および c) 該多形性遺伝子座での母系対立遺伝子の量と父系対立遺伝子の量との間 に統計学的有意差が存在するかどうかを決定する工程; を包含し、 ここで、統計学的有意差の存在が、該生物学的サンプルにおいて、細胞の亜集 団中の該多形性遺伝子座での欠失を示唆する、方法。 33.前記多形性遺伝子座が、単一塩基多形性であり、そして前記母系対立遺伝 子と父系対立遺伝子との間でヘテロ接合性である、請求項32に記載の方法。 34.前記検出する工程が、 a) プローブを、前記単一塩基多形性のすぐ隣にある母系対立遺伝子および 父系対立遺伝子の両方における前記多形性遺伝子座の一部にハイブリダイズさせ る工程; b) 前記サンプルを、検出可能に標識したジデオキシヌクレオシド三リン酸 の混合物に、該ジデオキシヌクレオシド三リン酸の該単一塩基多形性への適切な 結合を可能にする条件下で曝す工程; c) 該サンプルを洗浄する工程;および d) 該サンプルに対して残存する、それぞれの検出可能に標識されたジデオ キシヌクレオシド三リン酸の量を計測する工程; を包含する、請求項33に記載の方法。 35.前記検出可能な標識が、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、および粒子か らなる群より選択される、請求項34に記載の方法。 36.前記生物学的サンプルが、膿汁、血液、尿、痰、精液、唾液、髄液、生検 組織、および糞便からなる群より選択される、請求項32に記載の方法。 37.前記多形性遺伝子座がヌクレオチド配列のデータベースから同定される、 請求項32に記載の方法。 38.生物学的サンプルにおいて、単一ヌクレオチドの多形性遺伝子座でのヘテ ロ接合性を検出する方法であって、以下の工程: a) プローブを、単一塩基多形性のすぐ隣の配列にハイブリダイズさせる工 程; b) 該サンプルを、複数の異なる標識されたジデオキシヌクレオチドに曝す 工程; c) 該サンプルを洗浄する工程; d) 該ジデオキシヌクレオチドのいずれが該プローブに取り込まれるかを決 定する工程;および e) 該単一ヌクレオチドの多形性部位でのヘテロ接合性を、該プローブに取 り込まれている2つのジデオキシヌクレオチドの検出として検出する工程; を包含する、方法。
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