JP2001520895A - フローサイトメトリーを用いるｄｎａ多型の同定方法 - Google Patents
フローサイトメトリーを用いるｄｎａ多型の同定方法Info
- Publication number
- JP2001520895A JP2001520895A JP2000518119A JP2000518119A JP2001520895A JP 2001520895 A JP2001520895 A JP 2001520895A JP 2000518119 A JP2000518119 A JP 2000518119A JP 2000518119 A JP2000518119 A JP 2000518119A JP 2001520895 A JP2001520895 A JP 2001520895A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- base
- oligonucleotide primer
- dna
- identifying
- specific site
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
- C12Q1/6855—Ligating adaptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6862—Ligase chain reaction [LCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6869—Methods for sequencing
Abstract
(57)【要約】
ミクロスフェア上に固定されるように設計されたプライマーが、調査中のＤＮＡストランドにアニールされ、蛍光デオキシヌクレオチドを用いてＤＮＡポリメラーゼにより伸長されるか、または蛍光リポーターオリゴヌクレオチドへＤＮＡリガーゼによりライゲーションされる。固定されたプライマーに連結された、デオキシヌクレオチドか、またはリポーターオリゴヌクレオチドが、フローサイトメトリ−により測定され、それにより、ＤＮＡストランド上のヌクレオチド多型が同定される。
Description
【０００１】 本特許出願は、１９９７年１０月２８日に出願された仮特許出願Ｎｏ．６０／
０６３，６８５の優先権を主張する。
０６３，６８５の優先権を主張する。
【０００２】 ［技術の分野］ 本発明は、概して、ＤＮＡヌクレオチド塩基組成の決定のためのフローサイト
メトリーの用途、より詳しくは、ヌクレオチド多型、挿入および欠失を含む、１
ヌクレオチド多型の塩基を同定するためのフローサイトメトリーの用途に関する
。本発明は、米国エネルギー省によりカリフォルニア大学の評議員（Regent）に
与えられた契約Ｎｏ．Ｗ−７４０５−ＥＮＧ−３６において政府の支持によりな
された。
メトリーの用途、より詳しくは、ヌクレオチド多型、挿入および欠失を含む、１
ヌクレオチド多型の塩基を同定するためのフローサイトメトリーの用途に関する
。本発明は、米国エネルギー省によりカリフォルニア大学の評議員（Regent）に
与えられた契約Ｎｏ．Ｗ−７４０５−ＥＮＧ−３６において政府の支持によりな
された。
【０００３】 ［背景の技術］ ヒトゲノムのＤＮＡ塩基配列の決定は、次世紀における生物医学的科学に大き
な衝撃を与えるであろう。最初の完全なヒトＤＮＡの完成は、病気関連遺伝子の
遺伝子マッピングから病気感受性（disease susceptibility）および薬剤反応（
drug response）についての診断試験（diagnostic tests）までの適用範囲を向 上させるであろう。１ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）として知られる特定の変異
ＤＮＡ部位における塩基組成の決定は、とくに重要である。配列決定法の最近の
世代は、大規模ＳＮＰ分析の要求を満たすには遅すぎ費用がかかりすぎる。すな
わち、ＳＮＰｓの遺伝子配列を分析するための、より早くより効率的な方法が必
要である。
な衝撃を与えるであろう。最初の完全なヒトＤＮＡの完成は、病気関連遺伝子の
遺伝子マッピングから病気感受性（disease susceptibility）および薬剤反応（
drug response）についての診断試験（diagnostic tests）までの適用範囲を向 上させるであろう。１ヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ）として知られる特定の変異
ＤＮＡ部位における塩基組成の決定は、とくに重要である。配列決定法の最近の
世代は、大規模ＳＮＰ分析の要求を満たすには遅すぎ費用がかかりすぎる。すな
わち、ＳＮＰｓの遺伝子配列を分析するための、より早くより効率的な方法が必
要である。
【０００４】 ＳＮＰｓは、マッピング、病気遺伝子同定および診断検定（diagnostic assay
）において多くの用途を有する。これらの適用のすべてが、ＳＮＰ部位における
塩基組成の決定を含む。従来の配列決定はこの情報を提供することができるが、
多くの個体において多くの部位をスクリーニングするには非実用的である。効率
を増すために、複数の別の方法が開発されている。
）において多くの用途を有する。これらの適用のすべてが、ＳＮＰ部位における
塩基組成の決定を含む。従来の配列決定はこの情報を提供することができるが、
多くの個体において多くの部位をスクリーニングするには非実用的である。効率
を増すために、複数の別の方法が開発されている。
【０００５】 １部位における塩基組成を決定するために２つの技術、ミニ配列決定（たとえ
ば、「ミニ配列決定：ＤＮＡ分析に対する特異的手段（Tool）およびオリゴヌク
レオチドアレイにおける診断法（“Minisequencing：A Specific Tool For DNA
Analysis And Diagnostics On Oligonucleotide Arrays”）」、トミ・パスティ
ネン（Tomi Pastinen）ら、Genome Research ７巻、６０６頁（１９９７年）を 参照）およびオリゴライゲーション（ligation）（たとえば、「二色のエリザ（
ELISA）に基づくオリゴヌクレオチドライゲーション検定によるダイアレル（dia
llelic）配列異体（variation）の単式の適切な（Single-Well）遺伝子型決定（
“Single-Well Genotyping Of Diallelic Sequence Variations By A Two-Color
ELISA-Based Oligonucleotide Ligation Assay”）」、ビンセント・オー・ト ベ（Vincent O.Tobe）ら、Nuclear Acids Res. ２４巻、３７２８頁（１９９６ 年）を参照）が開発されている。ミニ配列決定において、プライマーは、サンプ
ル鋳型における特定の部位に応答するように設計され、ポリメラーゼが、標識化
ジデオキシヌクレオチドでプライマーを伸長するために用いられる。オリゴライ
ゲーションにおいては、同様のプライマーが設計され、目的の部位において可変
（variable）である下流オリゴを共有結合させるためにリガーゼが用いられる。
各場合において、プライマーへの標識の共有結合により明かにされる塩基を同定
するために、正しく塩基が組み合わされた基質に対する酵素の選択性が用いられ
る。大部分の適用において、これらの検定は、マイクロプレート、磁気ビーズ、
および最近では顕微鏡スライド上にマイクロアレイされた（microarrayed）オリ
ゴヌクレオチドを含む、固体基質上に固定されたプライマーを用いて行なわれる
。検出法は、蛍光検出による直接標識化、またはビオチンおよび標識化ストレプ
トアビジンを用いる蛍光、化学発光もしくは吸光検出による間接標識化を含む。
ば、「ミニ配列決定：ＤＮＡ分析に対する特異的手段（Tool）およびオリゴヌク
レオチドアレイにおける診断法（“Minisequencing：A Specific Tool For DNA
Analysis And Diagnostics On Oligonucleotide Arrays”）」、トミ・パスティ
ネン（Tomi Pastinen）ら、Genome Research ７巻、６０６頁（１９９７年）を 参照）およびオリゴライゲーション（ligation）（たとえば、「二色のエリザ（
ELISA）に基づくオリゴヌクレオチドライゲーション検定によるダイアレル（dia
llelic）配列異体（variation）の単式の適切な（Single-Well）遺伝子型決定（
“Single-Well Genotyping Of Diallelic Sequence Variations By A Two-Color
ELISA-Based Oligonucleotide Ligation Assay”）」、ビンセント・オー・ト ベ（Vincent O.Tobe）ら、Nuclear Acids Res. ２４巻、３７２８頁（１９９６ 年）を参照）が開発されている。ミニ配列決定において、プライマーは、サンプ
ル鋳型における特定の部位に応答するように設計され、ポリメラーゼが、標識化
ジデオキシヌクレオチドでプライマーを伸長するために用いられる。オリゴライ
ゲーションにおいては、同様のプライマーが設計され、目的の部位において可変
（variable）である下流オリゴを共有結合させるためにリガーゼが用いられる。
各場合において、プライマーへの標識の共有結合により明かにされる塩基を同定
するために、正しく塩基が組み合わされた基質に対する酵素の選択性が用いられ
る。大部分の適用において、これらの検定は、マイクロプレート、磁気ビーズ、
および最近では顕微鏡スライド上にマイクロアレイされた（microarrayed）オリ
ゴヌクレオチドを含む、固体基質上に固定されたプライマーを用いて行なわれる
。検出法は、蛍光検出による直接標識化、またはビオチンおよび標識化ストレプ
トアビジンを用いる蛍光、化学発光もしくは吸光検出による間接標識化を含む。
【０００６】 オリゴヌクレオチドマイクロアレイ（microarray）または「ＤＮＡチップ」は
、大規模平行分析への可能性により大きな注目をうみだしている。わずか数分で
小さなサンプルの数万の塩基を配列決定するという見込みは刺激的である。現在
では、この技術は、実質的なハードウエアおよび消費費用により、入手可能なほ
んの一握りの遺伝子を配列決定するためにアレイする際の利用性に制限されてい
る。さらに、ハイブリダイゼーションによる配列決定の一般的方法はとくに確固
たるものでなく、ハイブリダイゼーション条件のかなりの配列依存最適化が要求
される。それにもかかわらず、「アレイ」技術の平行関係（parallelism）はか なり有力であり、複数配列決定（multiplexed sequence determination）は、新
しいフローサイトメトリー法の重要な要素である。
、大規模平行分析への可能性により大きな注目をうみだしている。わずか数分で
小さなサンプルの数万の塩基を配列決定するという見込みは刺激的である。現在
では、この技術は、実質的なハードウエアおよび消費費用により、入手可能なほ
んの一握りの遺伝子を配列決定するためにアレイする際の利用性に制限されてい
る。さらに、ハイブリダイゼーションによる配列決定の一般的方法はとくに確固
たるものでなく、ハイブリダイゼーション条件のかなりの配列依存最適化が要求
される。それにもかかわらず、「アレイ」技術の平行関係（parallelism）はか なり有力であり、複数配列決定（multiplexed sequence determination）は、新
しいフローサイトメトリー法の重要な要素である。
【０００７】 したがって、本発明の目的は、塩基組成を識別するための酵素の特異性が蛍光
ミクロスフェアアレイの平行分析と組み合わされる、ミクロスフェアおよびフロ
ーサイトメトリーを用いるＤＮＡのストランドの特定の部位における塩基組成を
決定するための方法を提供することにある。
ミクロスフェアアレイの平行分析と組み合わされる、ミクロスフェアおよびフロ
ーサイトメトリーを用いるＤＮＡのストランドの特定の部位における塩基組成を
決定するための方法を提供することにある。
【０００８】 本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴は、一部は以下の説明に述べら
れ、一部は以下の実験において当業者に明らかとなり、または本発明の実施によ
りわかる。本発明の目的および利点は、添付の請求の範囲にとくに指摘されてい
る手段および組み合わせを用いて実現および達成することができる。
れ、一部は以下の実験において当業者に明らかとなり、または本発明の実施によ
りわかる。本発明の目的および利点は、添付の請求の範囲にとくに指摘されてい
る手段および組み合わせを用いて実現および達成することができる。
【０００９】 ［発明の要約］ 前記および他の目的をなし遂げるために、ならびに本明細書において具体化さ
れ広く記載されている本発明の目的にしたがって、ＤＮＡストランド上の特定の
部位における塩基組成を決定するための方法は、固定化または捕捉タグである蛍
光で標識化されたジデオキシヌクレオチドを運ぶオリゴヌクレオチドプライマー
を調製する工程、蛍光ジデオキシヌクレオチドとともにＤＮＡポリメラーゼを用
いてオリゴヌクレオチドプライマーを伸長する工程、タグを付けられたプライマ
ーをミクロスフェアに特異的に結合する工程、およびフローサイトメトリーによ
りミクロスフェア蛍光を測定する工程を含む。
れ広く記載されている本発明の目的にしたがって、ＤＮＡストランド上の特定の
部位における塩基組成を決定するための方法は、固定化または捕捉タグである蛍
光で標識化されたジデオキシヌクレオチドを運ぶオリゴヌクレオチドプライマー
を調製する工程、蛍光ジデオキシヌクレオチドとともにＤＮＡポリメラーゼを用
いてオリゴヌクレオチドプライマーを伸長する工程、タグを付けられたプライマ
ーをミクロスフェアに特異的に結合する工程、およびフローサイトメトリーによ
りミクロスフェア蛍光を測定する工程を含む。
【００１０】 好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは、ＤＮＡサンプル上のつぎのヌ
クレオチド塩基に応答するために、目的の部位に直に隣接する調査中のＤＮＡサ
ンプルにアニーリングするように設計される。
クレオチド塩基に応答するために、目的の部位に直に隣接する調査中のＤＮＡサ
ンプルにアニーリングするように設計される。
【００１１】 プライマーが、（ａ）ミクロスフェアへの共有結合に好適なアミノまたは他の
官能基、（ｂ）ミクロスフェア上に固定されているアビジンまたはストレプトア
ビジンへの結合に好適なビオチン基、または（ｃ）ミクロスフェア表面上に固定
されているオリゴヌクレオチド捕捉プローブに相補的なオリゴヌクレオチドタグ
のうちの１つを５′末端上に有することも好ましい。
官能基、（ｂ）ミクロスフェア上に固定されているアビジンまたはストレプトア
ビジンへの結合に好適なビオチン基、または（ｃ）ミクロスフェア表面上に固定
されているオリゴヌクレオチド捕捉プローブに相補的なオリゴヌクレオチドタグ
のうちの１つを５′末端上に有することも好ましい。
【００１２】 本発明の目的に基づくもう１つの側面においては、本明細書中のＤＮＡストラ
ンド上の特定の部位における塩基組成を決定するための方法は、固定化または捕
捉タグである蛍光で標識化されたジデオキシヌクレオチドを運ぶオリゴヌクレオ
チドプライマーを調製する工程、蛍光リポーターオリゴヌクレオチドを調製する
工程、蛍光リポーターオリゴヌクレオチドにオリゴヌクレオチドプライマーを酵
素的にライゲーションする工程、タグを付けられたプライマーをミクロスフェア
に特異的に結合する工程、およびフローサイトメトリーによりミクロスフェア蛍
光を測定する工程を含む。
ンド上の特定の部位における塩基組成を決定するための方法は、固定化または捕
捉タグである蛍光で標識化されたジデオキシヌクレオチドを運ぶオリゴヌクレオ
チドプライマーを調製する工程、蛍光リポーターオリゴヌクレオチドを調製する
工程、蛍光リポーターオリゴヌクレオチドにオリゴヌクレオチドプライマーを酵
素的にライゲーションする工程、タグを付けられたプライマーをミクロスフェア
に特異的に結合する工程、およびフローサイトメトリーによりミクロスフェア蛍
光を測定する工程を含む。
【００１３】 本発明の利益および利点は、特定部位におけるＤＮＡ塩基組成を決定するため
の感度のよい、均一で柔軟性のある方法を含む。
の感度のよい、均一で柔軟性のある方法を含む。
【００１４】 ［発明の詳細な説明］ 要するに、本発明は、ＤＮＡストランドの特定部位におけるＤＮＡ塩基組成を
決定するための、オリゴヌクレオチドプライマー、蛍光ジデオキシヌクレオチド
、ＤＮＡポリメラーゼ、ミクロスフェア、およびフローサイトメトリーの用途を
含む。タグをつけられたオリゴヌクレオチドプライマーはＤＮＡサンプルととも
にインキュベートされ、目的部位に直に隣接してアニールされる。蛍光ジデオキ
シヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼが添加され、プライマーが１塩基単位
だけ伸長され、それにより、ＤＮＡストランド中への１つの蛍光ジデオキシヌク
レオチドの酵素的組み込み時に、ＤＮＡストランドはフローサイトメーターによ
り検出されることができる。ＤＮＡポリメラーゼは、シーケナーゼ（Sequenase ）、サーモシーケナーゼ（Thermosequenase）、または任意の他の従来のもしく は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであってよい。
決定するための、オリゴヌクレオチドプライマー、蛍光ジデオキシヌクレオチド
、ＤＮＡポリメラーゼ、ミクロスフェア、およびフローサイトメトリーの用途を
含む。タグをつけられたオリゴヌクレオチドプライマーはＤＮＡサンプルととも
にインキュベートされ、目的部位に直に隣接してアニールされる。蛍光ジデオキ
シヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼが添加され、プライマーが１塩基単位
だけ伸長され、それにより、ＤＮＡストランド中への１つの蛍光ジデオキシヌク
レオチドの酵素的組み込み時に、ＤＮＡストランドはフローサイトメーターによ
り検出されることができる。ＤＮＡポリメラーゼは、シーケナーゼ（Sequenase ）、サーモシーケナーゼ（Thermosequenase）、または任意の他の従来のもしく は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであってよい。
【００１５】 本発明のもう１つの実施の態様は、この決定を行なうためにミクロスフェアお
よびフローサイトメトリーとともにオリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌク
レオチドリポーターおよびＤＮＡリガーゼを用いる。蛍光リポーターオリゴヌク
レオチドおよびＤＮＡリガーゼが添加され、プライマーをリポーターにライゲー
ションする。蛍光リポーターオリゴヌクレオチドは、サンプルＤＮＡの３′を直
接、アニールされているオリゴヌクレオチドプライマーに結合させるように設計
される。すなわち、サンプルＤＮＡ上の目的の部位に応答するためにリポーター
が可変であり、さらにフローサイトメトリーを用いる蛍光指示（signature）に より調査されることができる５′末端を除いて、配列リポーターオリゴヌクレオ
チドは、サンプルＤＮＡストランドの配列に相補的である。ＤＮＡリガーゼは、
任意の従来のまたは熱安定性（thermostable）リガーゼであってよい。プライマ
ーの伸長またはライゲーションは、熱安定性（heat-stable）ＤＮＡポリメラー ゼまたはリガーゼを用いる熱循環（thermal cycling）により促進させることが できる。
よびフローサイトメトリーとともにオリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌク
レオチドリポーターおよびＤＮＡリガーゼを用いる。蛍光リポーターオリゴヌク
レオチドおよびＤＮＡリガーゼが添加され、プライマーをリポーターにライゲー
ションする。蛍光リポーターオリゴヌクレオチドは、サンプルＤＮＡの３′を直
接、アニールされているオリゴヌクレオチドプライマーに結合させるように設計
される。すなわち、サンプルＤＮＡ上の目的の部位に応答するためにリポーター
が可変であり、さらにフローサイトメトリーを用いる蛍光指示（signature）に より調査されることができる５′末端を除いて、配列リポーターオリゴヌクレオ
チドは、サンプルＤＮＡストランドの配列に相補的である。ＤＮＡリガーゼは、
任意の従来のまたは熱安定性（thermostable）リガーゼであってよい。プライマ
ーの伸長またはライゲーションは、熱安定性（heat-stable）ＤＮＡポリメラー ゼまたはリガーゼを用いる熱循環（thermal cycling）により促進させることが できる。
【００１６】 オリゴヌクレオチドプライマーは、酵素による伸長またはライゲーションの前
またはあとにミクロスフェアに結合される。アミノ標識化プライマーは、ＥＤＡ
Ｃを用いてカルボキシル化ミクロスフェアに共有結合されることができる。ビオ
チン化プライマーは、アビジンまたはストレプトアビジン被覆ミクロスフェアに
結合されることができる。オリゴヌクレオチド配列タグを運ぶプライマーは、共
有結合によりまたはビオチン−アビジン相互作用によりミクロスフェア上に固定
されている相補的オリゴヌクレオチド捕捉配列にアニールされることができる。
ミクロスフェアは、ポリスチレン、セルロースまたは他の適当な材料からなり得
る。寸法の異なる、または異なる量の蛍光染料により染色されたミクロスフェア
は、複数配列分析に使用できる。
またはあとにミクロスフェアに結合される。アミノ標識化プライマーは、ＥＤＡ
Ｃを用いてカルボキシル化ミクロスフェアに共有結合されることができる。ビオ
チン化プライマーは、アビジンまたはストレプトアビジン被覆ミクロスフェアに
結合されることができる。オリゴヌクレオチド配列タグを運ぶプライマーは、共
有結合によりまたはビオチン−アビジン相互作用によりミクロスフェア上に固定
されている相補的オリゴヌクレオチド捕捉配列にアニールされることができる。
ミクロスフェアは、ポリスチレン、セルロースまたは他の適当な材料からなり得
る。寸法の異なる、または異なる量の蛍光染料により染色されたミクロスフェア
は、複数配列分析に使用できる。
【００１７】 本発明を一般的に説明したが、以下の実施例は、さらに明確なその詳細を提供
する。
する。
【００１８】 実施例１ 固定化プライマーを用いるフローサイトメトリーによるミニ配列決定 さて、添付の図面に説明するように本発明の好ましい実施の態様を詳細に言及
していく。図に戻って、図１ａは、ミクロスフェア上に固定されたプライマーが
、少なくともその１つが蛍光で標識化されているジデオキシヌクレオチドおよび
ポリメラーゼの存在下で、調査中のＤＮＡ配列とのハイブリダイズするために用
いられている、フローサイトメトリー用のミクロスフェアに基づくミニ配列決定
の略図である。プライマーは、ポリメラーゼの作用により、１塩基だけ伸長され
る。図１ｂは、その結果、フローサイトメトリーを用いて検出されることができ
る末端に結合した１つの蛍光ジデオキシヌクレオチドを有するプライマーの略図
であり、およびＤＮＡ上のＳＮＰに相補的な塩基を表わしている。サンプルＤＮ
Ａ鋳型は、まず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅され、得られる
産物は、消費されていないデオキシヌクレオチド三リン酸およびＰＣＲプライマ
ーをそれぞれ除去するために小エビ（shrimp）アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ
）およびエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）で処理される。調査中のＤＮＡスト
ランド上の特定の部位に応答するように設計されるミニ配列決定プライマーが、
架橋試薬（たとえば、カルボジイミド）を用いてカルボキシル化ポリスチレンミ
クロスフェア上の５′−アミノ基により固定される。プライマーを運ぶミクロス
フェア（５μｌ）を、増幅されたＤＮＡ（１μｌ、１ｎＭ）、ＤＮＡポリメラー
ゼ（１単位、サーモシーケナーゼ、アマシャム ライフ サイエンス（Amersham
Life Sciences）製、クリーブランド（Cleaveland）、オハイオ州（OH））、１
つの蛍光標識化ｄｄＮＴＰ（５μＭ）、他の３つの非蛍光ｄｄＮＴＰの各５μＭ
、および緩衝液（サーモシーケナーゼ緩衝液、アマシャム製）に添加し、合計容
量１０μｌとする。この工程は、４つの蛍光ｄｄＮＴＰのおのおのを用いて３回
繰り返された。その反応混合物は、サーマルサイクラー中で、９４℃で１０秒間
、および６０℃で１０秒間、９９回繰り返される。各反応混合物の２μｌをＴＥ
Ｂ緩衝液（５０ｍＭトリス（Tris）−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，０．５％（重量／容量）親ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）５００μｌに希釈
し、フローサイトメトリーを用いてミクロスフェアに結合された蛍光を測定する
。この手順を用いて、信号（signal）対バックグラウンド（background）比１０
０以上で、オリゴヌクレオチド鋳型上の特定部位について、正しいヌクレオチド
塩基が同定された。
していく。図に戻って、図１ａは、ミクロスフェア上に固定されたプライマーが
、少なくともその１つが蛍光で標識化されているジデオキシヌクレオチドおよび
ポリメラーゼの存在下で、調査中のＤＮＡ配列とのハイブリダイズするために用
いられている、フローサイトメトリー用のミクロスフェアに基づくミニ配列決定
の略図である。プライマーは、ポリメラーゼの作用により、１塩基だけ伸長され
る。図１ｂは、その結果、フローサイトメトリーを用いて検出されることができ
る末端に結合した１つの蛍光ジデオキシヌクレオチドを有するプライマーの略図
であり、およびＤＮＡ上のＳＮＰに相補的な塩基を表わしている。サンプルＤＮ
Ａ鋳型は、まず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅され、得られる
産物は、消費されていないデオキシヌクレオチド三リン酸およびＰＣＲプライマ
ーをそれぞれ除去するために小エビ（shrimp）アルカリホスファターゼ（ＳＡＰ
）およびエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）で処理される。調査中のＤＮＡスト
ランド上の特定の部位に応答するように設計されるミニ配列決定プライマーが、
架橋試薬（たとえば、カルボジイミド）を用いてカルボキシル化ポリスチレンミ
クロスフェア上の５′−アミノ基により固定される。プライマーを運ぶミクロス
フェア（５μｌ）を、増幅されたＤＮＡ（１μｌ、１ｎＭ）、ＤＮＡポリメラー
ゼ（１単位、サーモシーケナーゼ、アマシャム ライフ サイエンス（Amersham
Life Sciences）製、クリーブランド（Cleaveland）、オハイオ州（OH））、１
つの蛍光標識化ｄｄＮＴＰ（５μＭ）、他の３つの非蛍光ｄｄＮＴＰの各５μＭ
、および緩衝液（サーモシーケナーゼ緩衝液、アマシャム製）に添加し、合計容
量１０μｌとする。この工程は、４つの蛍光ｄｄＮＴＰのおのおのを用いて３回
繰り返された。その反応混合物は、サーマルサイクラー中で、９４℃で１０秒間
、および６０℃で１０秒間、９９回繰り返される。各反応混合物の２μｌをＴＥ
Ｂ緩衝液（５０ｍＭトリス（Tris）−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ，０．５％（重量／容量）親ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ）５００μｌに希釈
し、フローサイトメトリーを用いてミクロスフェアに結合された蛍光を測定する
。この手順を用いて、信号（signal）対バックグラウンド（background）比１０
０以上で、オリゴヌクレオチド鋳型上の特定部位について、正しいヌクレオチド
塩基が同定された。
【００１９】 実施例２ ビオチン化（biotinylated）プライマーを用いるフローサイトメトリーによるミ
ニ配列決定 図２ａは、ミクロスフェア上に予め固定されているプライマーの代わりに、可
溶性ビオチン化プライマーおよびアビジン被覆捕捉ミクロスフェアが用いられて
いる以外は、本明細書の図１ａおよび１ｂに記載されたものと同様のフローサイ
トメトリー用のミクロスフェアに基づくミニ配列決定の略図である。図２ｂは、
調査されるＤＮＡストランドへのビオチン化プライマーのハイブリダイゼーショ
ン、および溶液中に存在するＤＮＡポリメラーゼの結果としての、１つの蛍光Ａ
ジデオキシヌクレオチド（ＳＮＰはＴ塩基と仮定）によるこのプライマーの伸長
を示している。図２ｃは、ハイブリダイズされたＤＮＡストランドの溶解後の、
伸長されたビオチン化プライマーのアビジン被覆ミクロスフェア上の捕捉、およ
びそれに続くフローサイトメトリーを用いる蛍光分析を示す。サンプルＤＮＡ鋳
型は、ＰＣＲにより増幅され、得られる産物は、消費されていないデオキシヌク
レオチド三リン酸およびＰＣＲプライマーをそれぞれ除去するために小エビアル
カリホスファターゼ（ＳＡＰ）およびエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）で処理
される。鋳型ＤＮＡ上の特定部位に応答するように設計され、５′−ビオチン基
を運ぶミニ配列決定プライマーが調製される。ビオチン化プライマーを、鋳型Ｄ
ＮＡ（１μｌ、１ｎＭ）、ＤＮＡポリメラーゼ（１単位、サーモシーケナーゼ、
アマシャム製）、１つの蛍光標識化ｄｄＮＴＰ（５μＭ）、他の３つの非蛍光ｄ
ｄＮＴＰの各５μＭ、および緩衝液（サーモシーケナーゼ緩衝液、アマシャム製
）に添加し、合計容量１０μｌとする。この工程を、異なる蛍光ｄｄＮＴＰを用
いて３回繰り返す。その反応混合物は、サーマルサイクラー中で、９４℃で１０
秒間、および６０℃で１０秒間、９９回繰り返される。ビオチン化プライマーを
捕捉するために、アビジン被覆ミクロスフェア５μｌを反応混合物に添加する。
各反応混合物２μｌをＴＥＢ緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、
０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％（重量／容量）親ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ
）５００μｌに希釈し、フローサイトメトリーを用いてミクロスフェアに結合さ
れた蛍光を測定する。この手順を用いて、従来のＤＮＡ配列決定技術によって確
認されたように、３０個のＰＣＲ増幅サンプルのうち３０個において、正しいヌ
クレオチド塩基が同定された。
ニ配列決定 図２ａは、ミクロスフェア上に予め固定されているプライマーの代わりに、可
溶性ビオチン化プライマーおよびアビジン被覆捕捉ミクロスフェアが用いられて
いる以外は、本明細書の図１ａおよび１ｂに記載されたものと同様のフローサイ
トメトリー用のミクロスフェアに基づくミニ配列決定の略図である。図２ｂは、
調査されるＤＮＡストランドへのビオチン化プライマーのハイブリダイゼーショ
ン、および溶液中に存在するＤＮＡポリメラーゼの結果としての、１つの蛍光Ａ
ジデオキシヌクレオチド（ＳＮＰはＴ塩基と仮定）によるこのプライマーの伸長
を示している。図２ｃは、ハイブリダイズされたＤＮＡストランドの溶解後の、
伸長されたビオチン化プライマーのアビジン被覆ミクロスフェア上の捕捉、およ
びそれに続くフローサイトメトリーを用いる蛍光分析を示す。サンプルＤＮＡ鋳
型は、ＰＣＲにより増幅され、得られる産物は、消費されていないデオキシヌク
レオチド三リン酸およびＰＣＲプライマーをそれぞれ除去するために小エビアル
カリホスファターゼ（ＳＡＰ）およびエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）で処理
される。鋳型ＤＮＡ上の特定部位に応答するように設計され、５′−ビオチン基
を運ぶミニ配列決定プライマーが調製される。ビオチン化プライマーを、鋳型Ｄ
ＮＡ（１μｌ、１ｎＭ）、ＤＮＡポリメラーゼ（１単位、サーモシーケナーゼ、
アマシャム製）、１つの蛍光標識化ｄｄＮＴＰ（５μＭ）、他の３つの非蛍光ｄ
ｄＮＴＰの各５μＭ、および緩衝液（サーモシーケナーゼ緩衝液、アマシャム製
）に添加し、合計容量１０μｌとする。この工程を、異なる蛍光ｄｄＮＴＰを用
いて３回繰り返す。その反応混合物は、サーマルサイクラー中で、９４℃で１０
秒間、および６０℃で１０秒間、９９回繰り返される。ビオチン化プライマーを
捕捉するために、アビジン被覆ミクロスフェア５μｌを反応混合物に添加する。
各反応混合物２μｌをＴＥＢ緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、
０．５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％（重量／容量）親ウシ血清アルブミン、ＢＳＡ
）５００μｌに希釈し、フローサイトメトリーを用いてミクロスフェアに結合さ
れた蛍光を測定する。この手順を用いて、従来のＤＮＡ配列決定技術によって確
認されたように、３０個のＰＣＲ増幅サンプルのうち３０個において、正しいヌ
クレオチド塩基が同定された。
【００２０】 実施例３ タグを付けられているプライマーを用いるフローサイトメトリーによるミニ配列
決定 図３ａは、ＤＮＡストランド上に４つのＳＮＰが存在すると仮定されている以
外は、本明細書の図２ａおよび２ｂに説明されるミニ配列決定と同様の方法で、
可溶性の配列タグを付けられているプライマーおよび捕捉プローブを運ぶミクロ
スフェアを用いる、多様な（multiplexed）ミクロスフェアに基づくミニ配列決 定手順の略図である。図３ｂは、フローサイトメトリーを用いて分析されるミク
ロスフェアおよび捕捉された伸長プライマーを示している。サンプルＤＮＡ鋳型
はＰＣＲにより増幅され、得られる産物は、消費されていないデオキシヌクレオ
チド三リン酸およびＰＣＲプライマーをそれぞれ除去するために、小エビアルカ
リホスファターゼ（ＳＡＰ）およびエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）で処理さ
れる。鋳型ＤＮＡ上の特定部位に応答するように設計され、５′−配列タグを運
ぶミニ配列決定プライマーを調製する。捕捉プローブが、プライマーの５′−配
列タグに結合するように設計され、ミクロスフェア上に固定される。捕捉タグを
運ぶプライマーを、鋳型ＤＮＡ（１μｌ、１ｎＭ）、ＤＮＡポリメラーゼ（１単
位、サーモシーケナーゼ、アマシャム製）、１つの蛍光標識化ｄｄＮＴＰ（５μ
Ｍ）、他の３つの非蛍光ｄｄＮＴＰの各５μＭ、および緩衝液（サーモシーケナ
ーゼ緩衝液、アマシャム製）に添加し、合計容量１０μｌとする。この工程を、
異なる蛍光ｄｄＮＴＰを用いて３回繰り返す。その反応混合物は、サーマルサイ
クラー中で、９４℃で１０秒間、および６０℃で１０秒間、９９回繰り返される
。ビオチン化プライマーを捕捉するために、アビジン被覆ミクロスフェア５μｌ
を反応混合物に添加する。各反応混合物２μｌをＴＥＢ緩衝液（５０ｍＭ トリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％（重量／容量）親ウ
シ血清アルブミン、ＢＳＡ）５００μｌに希釈し、フローサイトメトリーを用い
てミクロスフェアに結合された蛍光を測定する。
決定 図３ａは、ＤＮＡストランド上に４つのＳＮＰが存在すると仮定されている以
外は、本明細書の図２ａおよび２ｂに説明されるミニ配列決定と同様の方法で、
可溶性の配列タグを付けられているプライマーおよび捕捉プローブを運ぶミクロ
スフェアを用いる、多様な（multiplexed）ミクロスフェアに基づくミニ配列決 定手順の略図である。図３ｂは、フローサイトメトリーを用いて分析されるミク
ロスフェアおよび捕捉された伸長プライマーを示している。サンプルＤＮＡ鋳型
はＰＣＲにより増幅され、得られる産物は、消費されていないデオキシヌクレオ
チド三リン酸およびＰＣＲプライマーをそれぞれ除去するために、小エビアルカ
リホスファターゼ（ＳＡＰ）およびエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）で処理さ
れる。鋳型ＤＮＡ上の特定部位に応答するように設計され、５′−配列タグを運
ぶミニ配列決定プライマーを調製する。捕捉プローブが、プライマーの５′−配
列タグに結合するように設計され、ミクロスフェア上に固定される。捕捉タグを
運ぶプライマーを、鋳型ＤＮＡ（１μｌ、１ｎＭ）、ＤＮＡポリメラーゼ（１単
位、サーモシーケナーゼ、アマシャム製）、１つの蛍光標識化ｄｄＮＴＰ（５μ
Ｍ）、他の３つの非蛍光ｄｄＮＴＰの各５μＭ、および緩衝液（サーモシーケナ
ーゼ緩衝液、アマシャム製）に添加し、合計容量１０μｌとする。この工程を、
異なる蛍光ｄｄＮＴＰを用いて３回繰り返す。その反応混合物は、サーマルサイ
クラー中で、９４℃で１０秒間、および６０℃で１０秒間、９９回繰り返される
。ビオチン化プライマーを捕捉するために、アビジン被覆ミクロスフェア５μｌ
を反応混合物に添加する。各反応混合物２μｌをＴＥＢ緩衝液（５０ｍＭ トリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％（重量／容量）親ウ
シ血清アルブミン、ＢＳＡ）５００μｌに希釈し、フローサイトメトリーを用い
てミクロスフェアに結合された蛍光を測定する。
【００２１】 実施例４ 固定化プライマーを用いるフローサイトメトリーによるオリゴヌクレオチドライ
ゲーション 図４ａは、プライマーが、ＳＮＰの領域において調査されるＤＮＡストランド
にハイブリダイズしているそのプライマーに、ライゲーションするための蛍光相
補的プライマーとともに、ミクロスフェア上に固定される、フローサイトメトリ
ーを用いるミクロスフェアに基づくオリゴヌクレオチドライゲーション検定の略
図である。図４ｂは、ＤＮＡが溶離されたのちに適当な蛍光相補体がライゲーシ
ョンされるミクロスフェア結合プライマーの略図であり、フローサイトメトリー
で決定されるミクロスフェアの蛍光がいずれの蛍光相補体がＤＮＡストランドに
結合されているのかを示す。サンプルＤＮＡ鋳型は、ＰＣＲにより増幅され、得
られる産物は、消費されていないデオキシヌクレオチド三リン酸およびＰＣＲプ
ライマーをそれぞれ除去するために、小エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）
およびエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）で処理される。鋳型ＤＮＡ上の特定の
部位に応答するように設計されたオリゴヌクレオチドライゲーションプライマー
が、カルボジイミドを用いてカルボキシル化ポリスチレンミクロスフェア上の５
′−アミノ基を介して固定される。目的の部位に直に隣接して結合するように設
計されているが、５′−末端が異なる４つの蛍光リポーターオリゴヌクレオチド
を調製する。プライマーを運ぶミクロスフェア（５μｌ）を、鋳型ＤＮＡ（１μ
ｌ、１ｎＭ）、ＤＮＡリガーゼ（１単位、サーモリガーゼ（Thermoligase）、エ
ピセンター テクノロジーズ（Epicentre Technologies）製、マジソン（Madiso
n）、ウィスコンシン州（ＷＩ））、１つの蛍光標識化リポーターオリゴヌクレ オチド（５μＭ）、および緩衝液（サーモリガーゼ緩衝液、エピセンター製）に
添加し、合計容量１０μｌとする。この工程を、４つの蛍光リポーターオリゴヌ
クレオチド（５μＭ）のおのおのを用いて３回繰り返す。その反応混合物は、サ
ーマルサイクラー中で、９４℃で１０秒間、および６０℃で１０秒間、９９回繰
り返される。各反応混合物２μｌをＴＥＢ緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、
ｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％（重量／容量）親ウシ血清アルブ
ミン、ＢＳＡ）５００μｌに希釈し、フローサイトメトリーを用いてミクロスフ
ェアに結合された蛍光を測定する。この手順を用いて、従来のＤＮＡ配列決定技
術によって確認されたように、３０個のＰＣＲ増幅サンプルのうち３０個におい
て、正しいヌクレオチド塩基が同定された。
ゲーション 図４ａは、プライマーが、ＳＮＰの領域において調査されるＤＮＡストランド
にハイブリダイズしているそのプライマーに、ライゲーションするための蛍光相
補的プライマーとともに、ミクロスフェア上に固定される、フローサイトメトリ
ーを用いるミクロスフェアに基づくオリゴヌクレオチドライゲーション検定の略
図である。図４ｂは、ＤＮＡが溶離されたのちに適当な蛍光相補体がライゲーシ
ョンされるミクロスフェア結合プライマーの略図であり、フローサイトメトリー
で決定されるミクロスフェアの蛍光がいずれの蛍光相補体がＤＮＡストランドに
結合されているのかを示す。サンプルＤＮＡ鋳型は、ＰＣＲにより増幅され、得
られる産物は、消費されていないデオキシヌクレオチド三リン酸およびＰＣＲプ
ライマーをそれぞれ除去するために、小エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）
およびエキソヌクレアーゼＩ（ＥｘｏＩ）で処理される。鋳型ＤＮＡ上の特定の
部位に応答するように設計されたオリゴヌクレオチドライゲーションプライマー
が、カルボジイミドを用いてカルボキシル化ポリスチレンミクロスフェア上の５
′−アミノ基を介して固定される。目的の部位に直に隣接して結合するように設
計されているが、５′−末端が異なる４つの蛍光リポーターオリゴヌクレオチド
を調製する。プライマーを運ぶミクロスフェア（５μｌ）を、鋳型ＤＮＡ（１μ
ｌ、１ｎＭ）、ＤＮＡリガーゼ（１単位、サーモリガーゼ（Thermoligase）、エ
ピセンター テクノロジーズ（Epicentre Technologies）製、マジソン（Madiso
n）、ウィスコンシン州（ＷＩ））、１つの蛍光標識化リポーターオリゴヌクレ オチド（５μＭ）、および緩衝液（サーモリガーゼ緩衝液、エピセンター製）に
添加し、合計容量１０μｌとする。この工程を、４つの蛍光リポーターオリゴヌ
クレオチド（５μＭ）のおのおのを用いて３回繰り返す。その反応混合物は、サ
ーマルサイクラー中で、９４℃で１０秒間、および６０℃で１０秒間、９９回繰
り返される。各反応混合物２μｌをＴＥＢ緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、
ｐＨ８．０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％（重量／容量）親ウシ血清アルブ
ミン、ＢＳＡ）５００μｌに希釈し、フローサイトメトリーを用いてミクロスフ
ェアに結合された蛍光を測定する。この手順を用いて、従来のＤＮＡ配列決定技
術によって確認されたように、３０個のＰＣＲ増幅サンプルのうち３０個におい
て、正しいヌクレオチド塩基が同定された。
【００２２】 実施例５ 非増幅ＤＮＡ上での多様な（multiplexed）オリゴヌクレオチドライゲーション 、およびその後のＰＣＲによる増幅 図５ａおよび５ｂは、相補塩基がＤＮＡストランド上に見られる場合および相
補塩基がＤＮＡストランド上に見られない場合それぞれについての、非増幅ＤＮ
Ａ上へのオリゴヌクレオチドのライゲーション、その後のＰＣＲによる増幅、ミ
クロスフェア上への捕捉、およびフローサイトメトリーによるミクロスフェア蛍
光の分析の略図である。
補塩基がＤＮＡストランド上に見られない場合それぞれについての、非増幅ＤＮ
Ａ上へのオリゴヌクレオチドのライゲーション、その後のＰＣＲによる増幅、ミ
クロスフェア上への捕捉、およびフローサイトメトリーによるミクロスフェア蛍
光の分析の略図である。
【００２３】 目的の部位に直に隣接する鋳型ＤＮＡの配列に相補的な１つのオリゴヌクレオ
チド（オリゴヌクレオチド１）、およびオリゴヌクレオチド１に直に隣接する鋳
型ＤＮＡの配列に相補的であり、目的の部位を含む４つのオリゴヌクレオチド（
オリゴヌクレオチド１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔ）からなる、１組のオリゴヌク
レオチドプライマーを設計する。４つのオリゴヌクレオチド（１Ａ、１Ｃ、１Ｇ
および１Ｔ）のおのおのは、４つの可能性のある塩基Ａ、Ｃ、ＧおよびＴのおの
おのに対応しており、他のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１）に隣接
するヌクレオチド塩基が異なる。オリゴヌクレオチド１は、いずれのオリヌクレ
オチドが目的の部位に相補的な塩基を含むかどうかに依存して、その他のオリゴ
ヌクレオチド（１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔ）の１つにライゲーションすること
を意図されている。さらに、可能性がある対（合計５個のオリゴヌクレオチド）
中の２つのオリゴヌクレオチドのおのおのは、ＰＣＲプライミング部位（PCR pr
iming site）からなる「テイル」を形成する付加的なヌクレオチドを含む。この
部位は、オリゴヌクレオチド１の場合と、オリゴヌクレオチド１Ａ、１Ｃ、１Ｇ
および１Ｔの場合で異なり、オリゴヌクレオチド１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔは
この群中において同じプライマー結合部位を有するが、オリゴヌクレオチド１の
ものとは異なる。４つの平行ライゲーション反応を、オリゴヌクレオチド１、そ
の他のオリゴヌクレオチド（１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔ）の１つ、およびＤＮ
Ａリガーゼ酵素を用いて行なう。すべてのオリゴヌクレオチドが鋳型にハイブリ
ダイズすることが予期されるが、完全に一致しているオリゴヌクレオチドだけが
オリゴヌクレオチド１にライゲーションされる。得られるライゲーション産物は
、オリゴヌクレオチド１中に導入されたテイルに相補的な１つのプライマー（プ
ライマー１）、およびオリゴヌクレオチド１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔのテイル
と相補的な配列を有する他のプライマー（プライマー２）を用いて、続くＰＣＲ
反応のための鋳型として作用する。プライマー１からのＰＣＲ増幅がライゲーシ
ョンされたフラグメントを超えて伸長したり、プライマー２に相補的な配列をつ
くることがなければ、オリゴヌクレオチド２に対するプライマー部位がないため
に、ライゲーションされていないオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ技術で増幅され
ることができない（図５ｂ）。増幅のあいだにＰＣＲフラグメントを標識化する
ために、ＰＣＲ工程のあいだに用いられる非標識化ｄＮＴＰに加えて、蛍光で標
識化されているｄＮＴＰを添加する。あるいはまた、プライマー２を蛍光染料で
標識化して、増幅を起こす染料標識化ＰＣＲ増幅産物を生成する。
チド（オリゴヌクレオチド１）、およびオリゴヌクレオチド１に直に隣接する鋳
型ＤＮＡの配列に相補的であり、目的の部位を含む４つのオリゴヌクレオチド（
オリゴヌクレオチド１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔ）からなる、１組のオリゴヌク
レオチドプライマーを設計する。４つのオリゴヌクレオチド（１Ａ、１Ｃ、１Ｇ
および１Ｔ）のおのおのは、４つの可能性のある塩基Ａ、Ｃ、ＧおよびＴのおの
おのに対応しており、他のオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド１）に隣接
するヌクレオチド塩基が異なる。オリゴヌクレオチド１は、いずれのオリヌクレ
オチドが目的の部位に相補的な塩基を含むかどうかに依存して、その他のオリゴ
ヌクレオチド（１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔ）の１つにライゲーションすること
を意図されている。さらに、可能性がある対（合計５個のオリゴヌクレオチド）
中の２つのオリゴヌクレオチドのおのおのは、ＰＣＲプライミング部位（PCR pr
iming site）からなる「テイル」を形成する付加的なヌクレオチドを含む。この
部位は、オリゴヌクレオチド１の場合と、オリゴヌクレオチド１Ａ、１Ｃ、１Ｇ
および１Ｔの場合で異なり、オリゴヌクレオチド１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔは
この群中において同じプライマー結合部位を有するが、オリゴヌクレオチド１の
ものとは異なる。４つの平行ライゲーション反応を、オリゴヌクレオチド１、そ
の他のオリゴヌクレオチド（１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔ）の１つ、およびＤＮ
Ａリガーゼ酵素を用いて行なう。すべてのオリゴヌクレオチドが鋳型にハイブリ
ダイズすることが予期されるが、完全に一致しているオリゴヌクレオチドだけが
オリゴヌクレオチド１にライゲーションされる。得られるライゲーション産物は
、オリゴヌクレオチド１中に導入されたテイルに相補的な１つのプライマー（プ
ライマー１）、およびオリゴヌクレオチド１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔのテイル
と相補的な配列を有する他のプライマー（プライマー２）を用いて、続くＰＣＲ
反応のための鋳型として作用する。プライマー１からのＰＣＲ増幅がライゲーシ
ョンされたフラグメントを超えて伸長したり、プライマー２に相補的な配列をつ
くることがなければ、オリゴヌクレオチド２に対するプライマー部位がないため
に、ライゲーションされていないオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ技術で増幅され
ることができない（図５ｂ）。増幅のあいだにＰＣＲフラグメントを標識化する
ために、ＰＣＲ工程のあいだに用いられる非標識化ｄＮＴＰに加えて、蛍光で標
識化されているｄＮＴＰを添加する。あるいはまた、プライマー２を蛍光染料で
標識化して、増幅を起こす染料標識化ＰＣＲ増幅産物を生成する。
【００２４】 最後の工程は、１端が可変ヌクレオチドで他端がプライミング部位（priming
site）である以外は、オリゴヌクレオチド１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔと同じ配
列を有するオリゴヌクレオチドが表面に固定されているミクロスフェアを、ＰＣ
Ｒ混合物に添加することを含む。標識化されているＰＣＲ産物が、ライゲーショ
ンされたオリゴヌクレオチド複合体の新しく合成された相補体にアニーリングす
ることによりＰＣＲ混合物中に存在する場合、このミクロスフェアは、標識化さ
れているＰＣＲ産物を捕捉することを意図されている。つぎに、ハイブリダイズ
されている断片のために、ビーズ蛍光はフローサイトメトリーにより分析される
。多くのセットのプライマーが、溶液中で同時に多くのＳＮＰｓのタイプを決め
る（type）ことができ、おのおのが多様な（multiplexed）セット中の異なるビ ーズ上に捕捉されると同時にフローサイトメーター中で読みとられる。
site）である以外は、オリゴヌクレオチド１Ａ、１Ｃ、１Ｇおよび１Ｔと同じ配
列を有するオリゴヌクレオチドが表面に固定されているミクロスフェアを、ＰＣ
Ｒ混合物に添加することを含む。標識化されているＰＣＲ産物が、ライゲーショ
ンされたオリゴヌクレオチド複合体の新しく合成された相補体にアニーリングす
ることによりＰＣＲ混合物中に存在する場合、このミクロスフェアは、標識化さ
れているＰＣＲ産物を捕捉することを意図されている。つぎに、ハイブリダイズ
されている断片のために、ビーズ蛍光はフローサイトメトリーにより分析される
。多くのセットのプライマーが、溶液中で同時に多くのＳＮＰｓのタイプを決め
る（type）ことができ、おのおのが多様な（multiplexed）セット中の異なるビ ーズ上に捕捉されると同時にフローサイトメーター中で読みとられる。
【００２５】 前記の本発明に関する記載は、図面（illustration）および発明の説明のため
のものであり、完全なものであると意図するものではなく、または本発明を開示
された厳密なものに制限すると意図するものではない。そして、前記教示を考慮
して、明かに多くの修飾および変型（variation）が可能である。たとえば、フ ローサイトメトリーを用いる分析のために、オリゴヌクレオチドプライマーをミ
クロスフェアに結合させるため、オリゴヌクレオチドプライマーは、ミクロスフ
ィア上に固定された、配列タグに相補的な捕捉プローブに、ハイブリダイズされ
る配列タグを含み、配列タグおよび捕捉プローブは非天然型塩基、イソ−Ｃおよ
び５−メチル−イソ−Ｇの少なくとも１つを含む。他の当業者が、種々の態様に
おいて、および熟考される特定の用途に適している種々の変更を行なって発明を
最も適切に利用できるように、本発明の原理および実際の適用を最も適切に明ら
かにするために、実施の態様は、選択および説明されたものである。
のものであり、完全なものであると意図するものではなく、または本発明を開示
された厳密なものに制限すると意図するものではない。そして、前記教示を考慮
して、明かに多くの修飾および変型（variation）が可能である。たとえば、フ ローサイトメトリーを用いる分析のために、オリゴヌクレオチドプライマーをミ
クロスフェアに結合させるため、オリゴヌクレオチドプライマーは、ミクロスフ
ィア上に固定された、配列タグに相補的な捕捉プローブに、ハイブリダイズされ
る配列タグを含み、配列タグおよび捕捉プローブは非天然型塩基、イソ−Ｃおよ
び５−メチル−イソ−Ｇの少なくとも１つを含む。他の当業者が、種々の態様に
おいて、および熟考される特定の用途に適している種々の変更を行なって発明を
最も適切に利用できるように、本発明の原理および実際の適用を最も適切に明ら
かにするために、実施の態様は、選択および説明されたものである。
明細書に組み込まれ一部をなす添付の図面は、本発明の１つの実施の態様を示
し、説明とともに本発明の原理を説明するのに役立つ。図面において：
し、説明とともに本発明の原理を説明するのに役立つ。図面において：
【図１】 図１ａは、ミクロスフェア上に固定されているプライマーが、少なくとも１つ
が蛍光で標識化されているジデオキシヌクレオチドおよびポリメラーゼの存在下
で、調査中のＤＮＡ配列とのハイブリダイズのために用いられ、それによりプラ
イマーは１塩基だけ伸長される、フローサイトメトリー用のミクロスフェアに基
づくミニ配列決定の略図である。一方、図１ｂは、その結果、フローサイトメト
リーを用いて検出されることができる末端に結合した１つの蛍光ジデオキシヌク
レオチドを有しているプライマー、およびＤＮＡ上のＳＮＰに相補的な塩基を表
わしている略図である。
が蛍光で標識化されているジデオキシヌクレオチドおよびポリメラーゼの存在下
で、調査中のＤＮＡ配列とのハイブリダイズのために用いられ、それによりプラ
イマーは１塩基だけ伸長される、フローサイトメトリー用のミクロスフェアに基
づくミニ配列決定の略図である。一方、図１ｂは、その結果、フローサイトメト
リーを用いて検出されることができる末端に結合した１つの蛍光ジデオキシヌク
レオチドを有しているプライマー、およびＤＮＡ上のＳＮＰに相補的な塩基を表
わしている略図である。
【図２】 図２ａは、ミクロスフェア上に予め固定されているプライマーの代わりに、可
溶性ビオチン化プライマーおよびアビジン被覆捕捉ミクロスフェア（apture mic
rospheres）が用いられている以外は、本明細書の図１ａおよび１ｂに記載され たものと同様のフローサイトメトリー用のミクロスフェアをに基づくミニ配列決
定の略図である。図２ｂは、調査されるＤＮＡストランドへのビオチン化プライ
マーのハイブリダイゼーション、および溶液中に存在するＤＮＡポリメラーゼの
結果としての蛍光Ａジデオキシヌクレオチド（ＳＮＰはＴ塩基と仮定）によるこ
のプライマーの伸長を示している。図２ｃは、ハイブリダイズされたＤＮＡスト
ランドの溶解後における、伸長されたビオチン化プライマーのアビジン被覆ミク
ロスフェア上への捕捉、およびそれに続くフローサイトメトリーを用いる蛍光分
析を示す。
溶性ビオチン化プライマーおよびアビジン被覆捕捉ミクロスフェア（apture mic
rospheres）が用いられている以外は、本明細書の図１ａおよび１ｂに記載され たものと同様のフローサイトメトリー用のミクロスフェアをに基づくミニ配列決
定の略図である。図２ｂは、調査されるＤＮＡストランドへのビオチン化プライ
マーのハイブリダイゼーション、および溶液中に存在するＤＮＡポリメラーゼの
結果としての蛍光Ａジデオキシヌクレオチド（ＳＮＰはＴ塩基と仮定）によるこ
のプライマーの伸長を示している。図２ｃは、ハイブリダイズされたＤＮＡスト
ランドの溶解後における、伸長されたビオチン化プライマーのアビジン被覆ミク
ロスフェア上への捕捉、およびそれに続くフローサイトメトリーを用いる蛍光分
析を示す。
【図３】 図３ａは、ＤＮＡストランド上に４つのＳＮＰｓが存在すると仮定されている
以外は、本明細書の図２ａおよび２ｂに記載されるミニ配列決定と同様の方法で
、可溶性の配列タグをつけられているプライマーおよび捕捉プローブを運ぶミク
ロスフェアを用いる、多様な（multiplexed）ミクロスフェアに基づくミニ配列 決定手順の略図である。一方図３ｂは、フローサイトメトリーを用いて分析され
るミクロスフェアおよび捕捉された伸長プライマーを示している。
以外は、本明細書の図２ａおよび２ｂに記載されるミニ配列決定と同様の方法で
、可溶性の配列タグをつけられているプライマーおよび捕捉プローブを運ぶミク
ロスフェアを用いる、多様な（multiplexed）ミクロスフェアに基づくミニ配列 決定手順の略図である。一方図３ｂは、フローサイトメトリーを用いて分析され
るミクロスフェアおよび捕捉された伸長プライマーを示している。
【図４】 図４ａは、ＳＮＰの領域において調査されるＤＮＡストランドにハイブリダイ
ズしているプライマーにライゲーションする（ligating）ための蛍光相補的プラ
イマーと、ミクロスフェア上に固定されているプライマーとの、フローサイトメ
トリーを用いるミクロスフェアに基づくオリゴヌクレオチドライゲーション検定
の略図である。一方図４ｂは、ＤＮＡが溶離されたのちに適当な蛍光相補体（co
mplement）がライゲーションされているミクロスフェア結合プライマー、フロー
サイトメトリーで決定されるミクロスフェアの蛍光がいずれの蛍光相補体がＤＮ
Ａストランドに結合されているのかを示す略図である。
ズしているプライマーにライゲーションする（ligating）ための蛍光相補的プラ
イマーと、ミクロスフェア上に固定されているプライマーとの、フローサイトメ
トリーを用いるミクロスフェアに基づくオリゴヌクレオチドライゲーション検定
の略図である。一方図４ｂは、ＤＮＡが溶離されたのちに適当な蛍光相補体（co
mplement）がライゲーションされているミクロスフェア結合プライマー、フロー
サイトメトリーで決定されるミクロスフェアの蛍光がいずれの蛍光相補体がＤＮ
Ａストランドに結合されているのかを示す略図である。
【図５ａ】 図５ａは、相補塩基がＤＮＡストランド上に見られる場合の、非増幅ＤＮＡ上
へのオリゴヌクレオチドのライゲーション、その後のＰＣＲによる増幅、ミクロ
スフェア上への捕捉、およびフローサイトメトリーによるミクロスフェア蛍光の
分析の略図である。
へのオリゴヌクレオチドのライゲーション、その後のＰＣＲによる増幅、ミクロ
スフェア上への捕捉、およびフローサイトメトリーによるミクロスフェア蛍光の
分析の略図である。
【図５ｂ】 図５ｂは、相補塩基がＤＮＡストランド上に見られない場合の、非増幅ＤＮＡ
上へのオリゴヌクレオチドのライゲーション、その後のＰＣＲによる増幅、ミク
ロスフェア上への捕捉、およびフローサイトメトリーによるミクロスフェア蛍光
の分析の略図である。
上へのオリゴヌクレオチドのライゲーション、その後のＰＣＲによる増幅、ミク
ロスフェア上への捕捉、およびフローサイトメトリーによるミクロスフェア蛍光
の分析の略図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ホワイト、ピー スコット アメリカ合衆国、87544 ニューメキシコ 州、ロス アラモス、オレンジ ストリー ト 2942 エー (72)発明者 ツァイ、ホン アメリカ合衆国、87544 ニューメキシコ 州、ロス アラモス、カンブレス パティ オ 1997
Claims (28)
- 【請求項１】 （ａ）調査中の塩基に直に隣接するＤＮＡストランドにアニ
ールできるオリゴヌクレオチドプライマーの合成工程； （ｂ）ミクロスフェア上へオリゴヌクレオチドプライマーを固定する工程； （ｃ）ＤＮＡストランドへのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング工程
； （ｄ）酵素の存在下で、固定されたオリゴヌクレオチドプライマーにＤＮＡスト
ランドがアニールしているミクロスフェアと、おのおのの蛍光リポーター分子が
反応しやすい（ｌａｂｉｌｅ）塩基を有する蛍光リポーター分子とをインキュベ
ートして、それによって、調査中の塩基に反応しやすい相補的な塩基を有する蛍
光リポーター分子が、固定されたオリゴヌクレオチドプライマーに共有結合し、
固定されたオリゴヌクレオチドプライマーが1塩基単位だけ伸長するインキュベ ート工程；および （ｅ）フローサイトメトリーを用いるミクロスフェアの蛍光の分析工程 からなる、ＤＮＡ上の特定の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項２】 蛍光リポーター分子が蛍光ジデオキシヌクレオチドを含み、
および酵素がＤＮＡポリメラーゼを含む請求項１記載のＤＮＡストランド上の特
定の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項３】 オリゴヌクレオチドプライマーがビオチン化され、およびミ
クロスフェアがアビジンで被覆されている請求項１記載のＤＮＡストランド上の
特定の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項４】 オリゴヌクレオチドプライマーがビオチン化され、およびミ
クロスフェアがストレプトアビジンで被覆されている請求項１記載のＤＮＡスト
ランド上の特定の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項５】 オリゴヌクレオチドプライマーがミクロスフェアに共有結合
されている請求項１記載のＤＮＡストランド上の特定の部位における塩基の同定
方法。 - 【請求項６】 オリゴヌクレオチドプライマーが、ミクロスフェア上に固定
されている相補的な捕捉プローブにハイブリダイズされる請求項１記載のＤＮＡ
ストランド上の特定の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項７】 オリゴヌクレオチドプライマーは、ミクロスフェア上に固定
された、配列タグに相補的な捕捉プローブに、ハイブリダイズされる配列タグを
含み、配列タグおよび捕捉プローブは非天然型塩基、イソ−Ｃおよび５−メチル
−イソ−Ｇの少なくとも１つを含む請求項１記載のＤＮＡストランド上の特定の
部位における塩基の同定方法。 - 【請求項８】 （ａ）調査中の塩基に直に隣接するＤＮＡストランドにアニ
ールできるオリゴヌクレオチドプライマーの合成工程； （ｂ）ミクロスフェア上へオリゴヌクレオチドプライマーを固定する工程； （ｃ）ＤＮＡストランドへのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング工程
； （ｄ）酵素の存在下で、固定されたオリゴヌクレオチドプライマーにＤＮＡスト
ランドがアニールしているミクロスフェアと、おのおのの蛍光リポーター分子が
反応しやすい塩基を有する蛍光リポーター分子とをインキュベートして、それに
よって、調査中の塩基に反応しやすい相補的なヌクレオチド塩基を有する蛍光リ
ポーター分子が、固定されたオリゴヌクレオチドプライマーに共有結合するイン
キュベーション工程； （ｅ）ライゲーションされたオリゴヌクレオチドプライマーからのＤＮＡストラ
ンドの溶解工程；および （ｆ）フローサイトメトリーを用いるミクロスフェアの蛍光の分析工程 からなる、ＤＮＡ上の特定の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項９】 リポーター分子が蛍光オリゴヌクレオチドを含み、および酵
素がＤＮＡリガーゼを含む請求項８記載のＤＮＡストランド上の特定の部位にお
ける塩基の同定方法。 - 【請求項１０】 オリゴヌクレオチドプライマーがビオチン化され、および
ミクロスフェアがアビジンで被覆されている請求項８記載のＤＮＡストランド上
の特定の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項１１】 オリゴヌクレオチドプライマーがビオチン化され、および
ミクロスフェアがストレプトアビジンで被覆されている請求項８記載のＤＮＡス
トランド上の特定の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項１２】 オリゴヌクレオチドプライマーがミクロスフェアに共有結
合されている請求項８記載のＤＮＡストランド上の特定の部位における塩基の同
定方法 - 【請求項１３】 オリゴヌクレオチドプライマーが、ミクロスフェア上に固
定されている相補的な捕捉プローブにハイブリダイズされる請求項８記載のＤＮ
Ａストランド上の特定の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項１４】 オリゴヌクレオチドプライマーは、ミクロスフェア上に固
定された、配列タグに相補的な捕捉プローブに、ハイブリダイズされる配列タグ
を含み、配列タグおよび捕捉プローブは非天然型塩基、イソ−Ｃおよび５−メチ
ル−イソ−Ｇの少なくとも１つを含む請求項８記載のＤＮＡストランド上の特定
の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項１５】 （ａ）調査中の塩基に直に隣接するＤＮＡストランドにア
ニールできるオリゴヌクレオチドプライマーの合成工程； （ｂ）ＤＮＡストランドへのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング工程
； （ｃ）酵素の存在下で、アニールされているＤＮＡストランドおよびオリゴヌク
レオチドプライマーと、おのおのの蛍光リポーター分子が反応しやすい塩基を有
する蛍光リポーター分子とをインキュベートして、それによって、調査中のオリ
ゴヌクレオチド塩基に、反応しやすい相補的な塩基を有する蛍光リポーター分子
が固定されたオリゴヌクレオチドプライマーに共有結合し、オリゴヌクレオチド
プライマーが1塩基単位だけ伸長するインキュベート工程； （ｄ）ミクロスフェア上へ伸長されたオリゴヌクレオチドプライマーを固定する
工程；および （ｅ）フローサイトメトリーを用いるミクロスフェアの蛍光の分析工程 からなる、ＤＮＡ上の特定の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項１６】 蛍光リポーター分子が蛍光ジデオキシヌクレオチドを含み
、および酵素がＤＮＡポリメラーゼを含む請求項１５記載のＤＮＡストランド上
の特定の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項１７】 オリゴヌクレオチドプライマーがビオチン化され、および
ミクロスフェアがアビジンで被覆されている請求項１５記載のＤＮＡストランド
上の特定の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項１８】 オリゴヌクレオチドプライマーがビオチン化され、および
ミクロスフェアがストレプトアビジンで被覆されている請求項１５記載のＤＮＡ
ストランド上の特定の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項１９】 オリゴヌクレオチドプライマーがミクロスフェアに共有結
合されている請求項１５記載のＤＮＡストランド上の特定の部位における塩基の
同定方法。 - 【請求項２０】 オリゴヌクレオチドプライマーが、ミクロスフェア上に固
定されている相補的な捕捉プローブにハイブリダイズされる請求項１５記載のＤ
ＮＡストランド上の特定の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項２１】 オリゴヌクレオチドプライマーは、ミクロスフェア上に固
定された、配列タグに相補的な捕捉プローブに、ハイブリダイズされる配列タグ
を含み、配列タグおよび捕捉プローブは非天然型塩基、イソ−Ｃおよび５−メチ
ル−イソ−Ｇの少なくとも１つを含む請求項１５記載のＤＮＡストランド上の特
定の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項２２】 （ａ）調査中の塩基に直に隣接するＤＮＡストランドにア
ニールできるオリゴヌクレオチドプライマーの合成工程； （ｂ）ＤＮＡストランドへのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング工程
； （ｃ）酵素存在下で、アニールされているＤＮＡストランドおよびオリゴヌクレ
オチドプライマーと、おのおのの蛍光リポーター分子が反応しやすい塩基を有す
る蛍光リポーター分子とをインキュベートして、それによって、調査中の塩基に
、反応しやすい相補的なヌクレオチド塩基を有する蛍光リポーター分子がオリゴ
ヌクレオチドプライマーに共有結合するインキュベート工程； （ｄ）ライゲーションされたオリゴヌクレオチドプライマーからのＤＮＡストラ
ンドの溶解工程； （ｅ）ミクロスフェア上へ伸長されたオリゴヌクレオチドプライマーを固定する
工程；および （ｆ）フローサイトメトリーを用いるミクロスフェアの蛍光の分析工程 からなる、ＤＮＡ上の特定の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項２３】 リポーター分子が蛍光オリゴクレオチドを含み、および酵
素がＤＮＡリガーゼを含む請求項２２記載のＤＮＡストランド上の特定の部位に
おける塩基の同定方法。 - 【請求項２４】 オリゴヌクレオチドプライマーがビオチン化され、および
ミクロスフェアがアビジンで被覆されている請求項２２記載のＤＮＡストランド
上の特定の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項２５】 オリゴヌクレオチドプライマーがビオチン化され、および
ミクロスフェアがストレプトアビジンで被覆されている請求項２２記載のＤＮＡ
ストランド上の特定の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項２６】 オリゴヌクレオチドプライマーがミクロスフェアに共有結
合されている請求項２２記載のＤＮＡストランド上の特定の部位における塩基の
同定方法。 - 【請求項２７】 オリゴヌクレオチドプライマーが、ミクロスフェア上に固
定されている相補的な捕捉プローブにハイブリダイズされる請求項２２記載のＤ
ＮＡストランド上の特定の部位における塩基の同定方法。 - 【請求項２８】 オリゴヌクレオチドプライマーは、ミクロスフェア上に固
定された、配列タグに相補的な捕捉プローブに、ハイブリダイズされる配列タグ
を含み、配列タグおよび捕捉プローブは非天然型塩基、イソ−Ｃおよび５−メチ
ル−イソ−Ｇの少なくとも１つを含む請求項２２記載のＤＮＡストランド上の特
定の部位における塩基の同定方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US6368597P | 1997-10-28 | 1997-10-28 | |
| US60/063,685 | 1997-10-28 | ||
| PCT/US1998/023143 WO1999022030A1 (en) | 1997-10-28 | 1998-10-28 | Dna polymorphism identity determination using flow cytometry |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2009291170A Division JP2010088454A (ja) | 1997-10-28 | 2009-12-22 | フローサイトメトリーを用いるｄｎａ多型の同定方法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001520895A true JP2001520895A (ja) | 2001-11-06 |
| JP2001520895A5 JP2001520895A5 (ja) | 2008-05-15 |
| JP4502502B2 JP4502502B2 (ja) | 2010-07-14 |
Family
ID=22050818
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000518119A Expired - Fee Related JP4502502B2 (ja) | 1997-10-28 | 1998-10-28 | フローサイトメトリーを用いるｄｎａ多型の同定方法 |
| JP2000518118A Pending JP2003502005A (ja) | 1997-10-28 | 1998-10-28 | フローサイトメトリーを用いるｄｎａ塩基ミスマッチ検出 |
| JP2009291170A Pending JP2010088454A (ja) | 1997-10-28 | 2009-12-22 | フローサイトメトリーを用いるｄｎａ多型の同定方法 |
Family Applications After (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000518118A Pending JP2003502005A (ja) | 1997-10-28 | 1998-10-28 | フローサイトメトリーを用いるｄｎａ塩基ミスマッチ検出 |
| JP2009291170A Pending JP2010088454A (ja) | 1997-10-28 | 2009-12-22 | フローサイトメトリーを用いるｄｎａ多型の同定方法 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6287766B1 (ja) |
| EP (3) | EP1040202B9 (ja) |
| JP (3) | JP4502502B2 (ja) |
| AT (1) | ATE419382T1 (ja) |
| AU (2) | AU1207799A (ja) |
| CA (2) | CA2306907A1 (ja) |
| DE (1) | DE69840416D1 (ja) |
| DK (1) | DK1040202T3 (ja) |
| ES (1) | ES2320604T3 (ja) |
| IL (2) | IL135852A0 (ja) |
| IS (2) | IS2699B (ja) |
| PT (1) | PT1040202E (ja) |
| WO (2) | WO1999022029A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006284231A (ja) * | 2005-03-31 | 2006-10-19 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 遺伝子断片中のヌクレオチドの種類の特定方法 |
| WO2007063807A1 (ja) * | 2005-11-29 | 2007-06-07 | Olympus Corporation | 核酸の一次構造変化の解析方法 |
Families Citing this family (64)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6287766B1 (en) * | 1997-10-28 | 2001-09-11 | The Regents Of The University Of California | DNA polymorphism identity determination using flow cytometry |
| US6913935B1 (en) * | 1997-12-04 | 2005-07-05 | Amersham Biosciences Uk Limited | Multiple assay method |
| WO2000056925A2 (en) * | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Aclara Biosciences, Inc. | Methods for single nucleotide polymorphism detection |
| JP3668075B2 (ja) | 1999-10-12 | 2005-07-06 | 光夫 板倉 | 遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰｓ高速スコアリング方法 |
| DE19958980A1 (de) * | 1999-11-18 | 2001-09-27 | Wolfgang Goehde | Verfahren zur Bestimmung von PCR-Produkten, sowie ein PCR-Detektions-Kit und eine Vorrichtung für ein solches Verfahren |
| AU2001238068A1 (en) * | 2000-02-07 | 2001-08-14 | Illumina, Inc. | Nucleic acid detection methods using universal priming |
| US6365355B1 (en) | 2000-03-28 | 2002-04-02 | The Regents Of The University Of California | Chimeric proteins for detection and quantitation of DNA mutations, DNA sequence variations, DNA damage and DNA mismatches |
| US6340566B1 (en) * | 2000-03-28 | 2002-01-22 | The Regents Of The University Of California | Detection and quantitation of single nucleotide polymorphisms, DNA sequence variations, DNA mutations, DNA damage and DNA mismatches |
| WO2001090417A2 (en) * | 2000-05-19 | 2001-11-29 | Eragen Biosciences, Inc. | Materials and methods for detection of nucleic acids |
| US6977161B2 (en) * | 2000-10-14 | 2005-12-20 | Eragen Biosciences, Inc. | Solid support assay systems and methods utilizing non-standard bases |
| US20030175689A1 (en) * | 2000-08-30 | 2003-09-18 | Mitsugu Usui | Gene detecting method |
| US7465540B2 (en) * | 2000-09-21 | 2008-12-16 | Luminex Corporation | Multiple reporter read-out for bioassays |
| US6592713B2 (en) | 2000-12-18 | 2003-07-15 | Sca Hygiene Products Ab | Method of producing a nonwoven material |
| US7083951B2 (en) * | 2001-02-14 | 2006-08-01 | The Regents Of The University Of California | Flow cytometric detection method for DNA samples |
| US20020115116A1 (en) * | 2001-02-22 | 2002-08-22 | Yong Song | Multiplex protein interaction determinations using glutathione-GST binding |
| US7153656B2 (en) * | 2001-09-11 | 2006-12-26 | Los Alamos National Security, Llc | Nucleic acid sequence detection using multiplexed oligonucleotide PCR |
| KR20040068122A (ko) | 2001-10-15 | 2004-07-30 | 바이오어레이 솔루션스 리미티드 | 공동 검색과 효소-매개된 탐지에 의한 다형성 좌위의 다중분석 |
| US7179598B2 (en) * | 2001-11-20 | 2007-02-20 | The Regents Of The University Of California | Early leukemia diagnostics using microsphere arrays |
| WO2003054232A2 (en) * | 2001-12-13 | 2003-07-03 | Blue Heron Biotechnology, Inc. | Methods for removal of double-stranded oligonucleotides containing sequence errors using mismatch recognition proteins |
| US7282355B2 (en) | 2002-03-13 | 2007-10-16 | Syngenta Participations Ag | Nucleic acid detection method |
| US7304128B2 (en) * | 2002-06-04 | 2007-12-04 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Carbon nanotube binding peptides |
| ATE489477T1 (de) * | 2002-06-28 | 2010-12-15 | Primeradx Inc | Verfahren zum nachweis von sequenzunterschieden |
| US20040224336A1 (en) * | 2003-03-11 | 2004-11-11 | Gene Check, Inc. | RecA-assisted specific oligonucleotide extension method for detecting mutations, SNPs and specific sequences |
| EP1606419A1 (en) | 2003-03-18 | 2005-12-21 | Quantum Genetics Ireland Limited | Systems and methods for improving protein and milk production of dairy herds |
| CA2521127C (en) * | 2003-04-01 | 2014-05-27 | Eragen Biosciences, Inc. | Polymerase inhibitor and method of using same |
| US20060134638A1 (en) * | 2003-04-02 | 2006-06-22 | Blue Heron Biotechnology, Inc. | Error reduction in automated gene synthesis |
| US8637650B2 (en) | 2003-11-05 | 2014-01-28 | Genovoxx Gmbh | Macromolecular nucleotide compounds and methods for using the same |
| ATE510928T1 (de) | 2004-02-19 | 2011-06-15 | Univ Alberta | Leptinpromotor-polymorphismen und verwendungen davon |
| DE102005008583B4 (de) * | 2005-02-24 | 2007-10-25 | Johannes-Gutenberg-Universität Mainz | Verfahren zur Typisierung eines Individuums mittels short tandem repeat (STR)-Loci der genomischen DNA |
| EP2489746B1 (en) | 2005-06-07 | 2016-02-03 | Luminex Corporation | Methods for detection and typing of nucleic acids |
| US7960116B2 (en) * | 2007-09-28 | 2011-06-14 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Nucleic acid sequencing methods and systems |
| US8871687B2 (en) * | 2007-09-28 | 2014-10-28 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Nucleic acid sequencing by single-base primer extension |
| US8093063B2 (en) | 2007-11-29 | 2012-01-10 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Assay for detecting genetic abnormalities in genomic nucleic acids |
| CN101445832B (zh) * | 2008-12-23 | 2011-09-14 | 广州益善生物技术有限公司 | Pik3ca基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法 |
| CN101487051B (zh) * | 2009-02-24 | 2011-07-20 | 广州益善生物技术有限公司 | Braf基因突变的检测探针、液相芯片及其检测方法 |
| EP2491146B1 (en) * | 2009-10-23 | 2017-09-20 | Luminex Corporation | Amplification primers with non-standard bases for increased reaction specificity |
| ITPV20100009A1 (it) * | 2010-07-15 | 2012-01-16 | Luca Lova | Rilevamento multiparametrico in sospensione per sequenze nucleotidiche |
| US9206418B2 (en) | 2011-10-19 | 2015-12-08 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing |
| CN104093890B (zh) | 2012-01-26 | 2016-04-20 | 纽亘技术公司 | 用于靶向核酸序列富集和高效文库产生的组合物和方法 |
| JP6181751B2 (ja) | 2012-06-18 | 2017-08-16 | ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド | 望まれない核酸配列のネガティブ選択のための組成物および方法 |
| US20150011396A1 (en) | 2012-07-09 | 2015-01-08 | Benjamin G. Schroeder | Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing |
| WO2014121091A1 (en) | 2013-02-01 | 2014-08-07 | The Regents Of The University Of California | Methods for genome assembly and haplotype phasing |
| US9411930B2 (en) | 2013-02-01 | 2016-08-09 | The Regents Of The University Of California | Methods for genome assembly and haplotype phasing |
| US9540699B2 (en) | 2013-03-13 | 2017-01-10 | William Beaumont Hospital | Methods of diagnosing increased risk of developing MRSA |
| US9822408B2 (en) | 2013-03-15 | 2017-11-21 | Nugen Technologies, Inc. | Sequential sequencing |
| EP3068883B1 (en) | 2013-11-13 | 2020-04-29 | Nugen Technologies, Inc. | Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read |
| CA2933387C (en) | 2013-12-11 | 2023-05-02 | The Regents Of The University Of California | Methods for labeling dna fragments to reconstruct physical linkage and phase |
| US9745614B2 (en) | 2014-02-28 | 2017-08-29 | Nugen Technologies, Inc. | Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors |
| WO2015191815A1 (en) * | 2014-06-13 | 2015-12-17 | Life Technologies Corporation | Multiplex nucleic acid amplification |
| EP3174980A4 (en) | 2014-08-01 | 2018-01-17 | Dovetail Genomics, LLC | Tagging nucleic acids for sequence assembly |
| JP6803327B2 (ja) | 2014-08-06 | 2020-12-23 | ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド | 標的化されたシークエンシングからのデジタル測定値 |
| EP3259696A1 (en) | 2015-02-17 | 2017-12-27 | Dovetail Genomics LLC | Nucleic acid sequence assembly |
| US11807896B2 (en) | 2015-03-26 | 2023-11-07 | Dovetail Genomics, Llc | Physical linkage preservation in DNA storage |
| CN108368542B (zh) | 2015-10-19 | 2022-04-08 | 多弗泰尔基因组学有限责任公司 | 用于基因组组装、单元型定相以及独立于靶标的核酸检测的方法 |
| AU2017223600B2 (en) | 2016-02-23 | 2023-08-03 | Dovetail Genomics Llc | Generation of phased read-sets for genome assembly and haplotype phasing |
| WO2017197300A1 (en) | 2016-05-13 | 2017-11-16 | Dovetail Genomics Llc | Recovering long-range linkage information from preserved samples |
| US10190155B2 (en) | 2016-10-14 | 2019-01-29 | Nugen Technologies, Inc. | Molecular tag attachment and transfer |
| DE102016124692B4 (de) * | 2016-12-16 | 2019-05-16 | Gna Biosolutions Gmbh | Verfahren und System zum Vervielfältigen einer Nukleinsäure |
| CN110612355B (zh) * | 2017-06-20 | 2024-01-12 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 用于定量pcr扩增的组合物及其应用 |
| CN109652499B (zh) * | 2017-10-12 | 2022-06-03 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 快速检测dna聚合酶3′-5′外切活性或错配的方法和试剂盒 |
| US11099202B2 (en) | 2017-10-20 | 2021-08-24 | Tecan Genomics, Inc. | Reagent delivery system |
| EP3746566A1 (en) | 2018-01-31 | 2020-12-09 | Dovetail Genomics, LLC | Sample prep for dna linkage recovery |
| US10768173B1 (en) * | 2019-09-06 | 2020-09-08 | Element Biosciences, Inc. | Multivalent binding composition for nucleic acid analysis |
| US11287422B2 (en) | 2019-09-23 | 2022-03-29 | Element Biosciences, Inc. | Multivalent binding composition for nucleic acid analysis |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03502041A (ja) * | 1987-10-07 | 1991-05-16 | アメリカ合衆国 | Ｄｎａおよびｒｎａの迅速塩基配列決定方法 |
| JPH0856700A (ja) * | 1994-07-16 | 1996-03-05 | Boehringer Mannheim Gmbh | 核酸の高感度検出方法 |
| JPH10503384A (ja) * | 1995-12-22 | 1998-03-31 | エグザクト ラボラトリーズ， インコーポレイテッド | ゲノム上不均一な細胞サンプルにおける形質転換細胞のクローン集団検出のための方法 |
| JP2000509608A (ja) * | 1996-06-04 | 2000-08-02 | ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション | Ｐｃｒ中のハイブリダイゼーションのモニタリング |
| JP2002508664A (ja) * | 1997-06-25 | 2002-03-19 | オーキッド・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド | 複数の単一ヌクレオチド多型を単一の反応で検出する方法 |
| JP2003502005A (ja) * | 1997-10-28 | 2003-01-21 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | フローサイトメトリーを用いるｄｎａ塩基ミスマッチ検出 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4770992A (en) * | 1985-11-27 | 1988-09-13 | Den Engh Gerrit J Van | Detection of specific DNA sequences by flow cytometry |
| US4988617A (en) * | 1988-03-25 | 1991-01-29 | California Institute Of Technology | Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids |
| US5512439A (en) * | 1988-11-21 | 1996-04-30 | Dynal As | Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof |
| US5629158A (en) * | 1989-03-22 | 1997-05-13 | Cemu Bitecknik Ab | Solid phase diagnosis of medical conditions |
| US5437976A (en) * | 1991-08-08 | 1995-08-01 | Arizona Board Of Regents, The University Of Arizona | Multi-domain DNA ligands bound to a solid matrix for protein and nucleic acid affinity chromatography and processing of solid-phase DNA |
| WO1993020233A1 (en) * | 1992-03-27 | 1993-10-14 | University Of Maryland At Baltimore | Detection of gene mutations with mismatch repair enzymes |
| US5681702A (en) * | 1994-08-30 | 1997-10-28 | Chiron Corporation | Reduction of nonspecific hybridization by using novel base-pairing schemes |
| WO1996015271A1 (en) * | 1994-11-16 | 1996-05-23 | Abbott Laboratories | Multiplex ligations-dependent amplification |
| US5736330A (en) * | 1995-10-11 | 1998-04-07 | Luminex Corporation | Method and compositions for flow cytometric determination of DNA sequences |
| EP0852004B1 (en) * | 1995-10-11 | 2011-01-19 | Luminex Corporation | Multiplexed analysis of clinical specimens |
| US5670325A (en) * | 1996-08-14 | 1997-09-23 | Exact Laboratories, Inc. | Method for the detection of clonal populations of transformed cells in a genomically heterogeneous cellular sample |
| WO1999067414A1 (en) | 1998-06-24 | 1999-12-29 | Glaxo Group Limited | Nucleotide detection method |
-
1998
- 1998-10-28 US US09/182,869 patent/US6287766B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-28 AU AU12077/99A patent/AU1207799A/en not_active Abandoned
- 1998-10-28 WO PCT/US1998/023142 patent/WO1999022029A1/en not_active Application Discontinuation
- 1998-10-28 DE DE69840416T patent/DE69840416D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-28 EP EP98955222A patent/EP1040202B9/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-28 IL IL13585298A patent/IL135852A0/xx unknown
- 1998-10-28 JP JP2000518119A patent/JP4502502B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-10-28 AU AU12078/99A patent/AU754849B2/en not_active Ceased
- 1998-10-28 PT PT98955222T patent/PT1040202E/pt unknown
- 1998-10-28 CA CA002306907A patent/CA2306907A1/en not_active Abandoned
- 1998-10-28 ES ES98955222T patent/ES2320604T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-10-28 DK DK98955222T patent/DK1040202T3/da active
- 1998-10-28 EP EP98955221A patent/EP1032701A1/en not_active Withdrawn
- 1998-10-28 EP EP08104631A patent/EP2034031A1/en not_active Withdrawn
- 1998-10-28 AT AT98955222T patent/ATE419382T1/de active
- 1998-10-28 JP JP2000518118A patent/JP2003502005A/ja active Pending
- 1998-10-28 IL IL13585198A patent/IL135851A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-10-28 CA CA2308599A patent/CA2308599C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-10-28 WO PCT/US1998/023143 patent/WO1999022030A1/en active IP Right Grant
-
2000
- 2000-04-14 IS IS5454A patent/IS2699B/is unknown
- 2000-04-14 IS IS5455A patent/IS5455A/is unknown
-
2001
- 2001-09-11 US US09/953,534 patent/US20020015962A1/en not_active Abandoned
-
2009
- 2009-12-22 JP JP2009291170A patent/JP2010088454A/ja active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH03502041A (ja) * | 1987-10-07 | 1991-05-16 | アメリカ合衆国 | Ｄｎａおよびｒｎａの迅速塩基配列決定方法 |
| JPH0856700A (ja) * | 1994-07-16 | 1996-03-05 | Boehringer Mannheim Gmbh | 核酸の高感度検出方法 |
| JPH10503384A (ja) * | 1995-12-22 | 1998-03-31 | エグザクト ラボラトリーズ， インコーポレイテッド | ゲノム上不均一な細胞サンプルにおける形質転換細胞のクローン集団検出のための方法 |
| JP2000509608A (ja) * | 1996-06-04 | 2000-08-02 | ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション | Ｐｃｒ中のハイブリダイゼーションのモニタリング |
| JP2002508664A (ja) * | 1997-06-25 | 2002-03-19 | オーキッド・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド | 複数の単一ヌクレオチド多型を単一の反応で検出する方法 |
| JP2003502005A (ja) * | 1997-10-28 | 2003-01-21 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | フローサイトメトリーを用いるｄｎａ塩基ミスマッチ検出 |
Non-Patent Citations (10)
| Title |
|---|
| JPN6008037466, Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４１ （１９８８） ｐ．１０７７−１０８０ * |
| JPN6008037468, ＧＡＴＡ．， ９［４］ （１９９２） ｐ．１０７−１１２ * |
| JPN6008037470, Ｈｕｍ Ｍｕｔａｔ．， ５ （１９９５） ｐ．１５３−１６５ * |
| JPN6008037472, Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ．， ４３ （１９９７ Ｓｅｐ） ｐ．１７４９−１７５６ * |
| JPN6009030493, 生物試料分析， １９［３］ （１９９６） ｐ．１５２−１５８ * |
| JPN6009030495, ＴＩＢＴＥＣＨ， １０ （１９９２） ｐ．５２−５５ * |
| JPN6009030496, ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ５ （１９９４） ｐ．１−８ * |
| JPN7008005868, Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２０５ （１９９２） ｐ．１−７ * |
| JPN7008005869, Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，３６［２１］ （１９９５） ｐ．３６０１−３６０４ * |
| JPN7009002999, Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．， ２０８ （１９９３） ｐ．３２１−３２６ * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006284231A (ja) * | 2005-03-31 | 2006-10-19 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 遺伝子断片中のヌクレオチドの種類の特定方法 |
| WO2007063807A1 (ja) * | 2005-11-29 | 2007-06-07 | Olympus Corporation | 核酸の一次構造変化の解析方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IS2699B (is) | 2010-11-15 |
| CA2306907A1 (en) | 1999-05-06 |
| IL135851A0 (en) | 2001-05-20 |
| IL135851A (en) | 2004-03-28 |
| US6287766B1 (en) | 2001-09-11 |
| IS5454A (is) | 2000-04-14 |
| DK1040202T3 (da) | 2009-04-14 |
| EP1032701A1 (en) | 2000-09-06 |
| JP2003502005A (ja) | 2003-01-21 |
| PT1040202E (pt) | 2009-03-26 |
| ATE419382T1 (de) | 2009-01-15 |
| JP4502502B2 (ja) | 2010-07-14 |
| EP1040202A1 (en) | 2000-10-04 |
| IL135852A0 (en) | 2001-05-20 |
| JP2010088454A (ja) | 2010-04-22 |
| WO1999022029A1 (en) | 1999-05-06 |
| DE69840416D1 (de) | 2009-02-12 |
| EP1040202A4 (en) | 2004-08-18 |
| EP1040202B9 (en) | 2009-09-23 |
| AU1207899A (en) | 1999-05-17 |
| CA2308599A1 (en) | 1999-05-06 |
| WO1999022030A1 (en) | 1999-05-06 |
| EP1040202B1 (en) | 2008-12-31 |
| IS5455A (is) | 2000-04-14 |
| AU1207799A (en) | 1999-05-17 |
| US20020015962A1 (en) | 2002-02-07 |
| EP2034031A1 (en) | 2009-03-11 |
| AU754849B2 (en) | 2002-11-28 |
| ES2320604T3 (es) | 2009-05-25 |
| CA2308599C (en) | 2012-05-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2001520895A (ja) | フローサイトメトリーを用いるｄｎａ多型の同定方法 | |
| US10837059B2 (en) | Multiplex nucleic acid reactions | |
| US6258539B1 (en) | Restriction enzyme mediated adapter | |
| US8003354B2 (en) | Multiplex nucleic acid reactions | |
| CA2379132C (en) | Method for multiplexed analysis of a plurality of target nucleic acid sequences in a sample | |
| JP4741079B2 (ja) | 拡大タグを使用したシークエンシング方法 | |
| DK2264189T3 (en) | Detection of nucleic acid reactions of bead - arrays | |
| JP2003521252A (ja) | ユニバーサルプライミングを用いる核酸検出方法 | |
| US20040091879A1 (en) | Nucleic acid sequence detection using multiplexed oligonucleotide PCR | |
| JP2001520895A5 (ja) | ||
| WO2001012856A2 (en) | Analysis of sequence tags with hairpin primers | |
| AU2005214329A1 (en) | Genetic analysis by sequence-specific sorting | |
| JP2002504812A (ja) | 核酸アレイ | |
| JP2001521398A (ja) | 性状検査用ｄｎａ | |
| JP3789317B2 (ja) | 特定の核酸を検出定量するための等長プライマー伸長法およびキット | |
| EP2246438A1 (en) | Multiplex nucleic acid reactions | |
| JP2002518024A (ja) | ポリメラーゼシグナル形成アッセイ | |
| WO2000009738A1 (en) | Rolling circle-based analysis of polynucleotide sequence | |
| JP2006109759A (ja) | 核酸配列を変換した後に検出および／または定量するためのプローブ及び方法 | |
| AU2003229125A1 (en) | A nucleic acid anchoring system comprising covalent linkage of an oligonucleotide to a solid support |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050913 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080328 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080729 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081028 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090623 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090917 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090929 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091022 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091029 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091120 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091130 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091222 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100413 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100420 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130430 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |